JP4156238B2 - 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンドレセプターについて選択的な抗体、およびそれらの使用 - Google Patents

腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンドレセプターについて選択的な抗体、およびそれらの使用 Download PDF

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Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍壊死因子（本明細書中で以降「ＴＮＦ」として参照される）関連アポトーシス誘導リガンド（本明細書中で以降「ＴＲＡＩＬ」として参照される）レセプターの単一の型に特異的に結合し得る抗体に関し、より詳細には、単一の型のレセプターを発現する細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体、ならびにそれらに基づく治療に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦファミリータンパク質のメンバーであり、これはまた、ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドを含む（１）。これらのタンパク質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。現在までに、ＴＲＡＩＬについて５つのレセプターが同定されており、これらのうち２つ（ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２））（２〜７）は、アポトーシスシグナルを伝達し得、他の３つ（ＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）およびオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＯＰＧ））は、アポトーシスシグナルを伝達しない（８〜１２）。ＴＲＡＩＬについての全ての５つのレセプターは、その細胞外リガンド結合ドメインにおいて有意な相同性を共有する。ＦａｓおよびＴＮＦレセプターＩ（本明細書中で以降「ＴＮＦＲＩ」として参照される）についても同様であり、ＤＲ４およびＤＲ５の両方の細胞内セグメントはデスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含み、そしてＦａｓ関連デスドメインタンパク質（本明細書中で以降「ＦＡＤＤ」として参照される）およびカスパーゼ８を含む経路を通ってアポトーシスシグナルを伝達する（６、７）。アポトーシスシグナルを伝達することに加えて、ＤＲ４およびＤＲ５レセプターはまた、ＮＫκｂを含む経路を活性化し得る（６、７）。
【０００３】
実証されてきたＴＲＡＩＬの生物学的機能としては、形質転換された腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導するＴＲＡＩＬの能力が挙げられ、正常な細胞は、ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスに比較的耐性である（１３〜１５）。この選択性は、動物モデルにおける重大な毒性の誘導を伴わないＴＲＡＩＬの全身投与によって実証されるように、Ｆａｓリガンドと対照的に、ＴＲＡＩＬの投与は非常に低い毒性のレベルに関連するということを示唆する（１３）。従って、ＴＲＡＩＬは、癌および異常な細胞増殖に関連する他の疾患の処置のための適切な治療剤である強力なアポトーシス誘導因子として、提案される。ＴＲＡＩＬはまた、自己免疫疾患または炎症疾患の処置のために適切である強力なアポトーシス誘導因子として、提案される。ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスは、Ｔ細胞の活性化−誘導細胞死に関与し、それによって、Ｆａｓリガンドに対する代替的な機構として役立つことが実証されている（１６、１７）。ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスはまた、Ｔ細胞および他の炎症性細胞のアポトーシスの誘導において機能し（１８）、そしてＮＫ細胞の殺傷活性において（１９〜２１）、および樹状細胞の免疫調節機能において（２２、２３）役割を果たす。従って、ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスはまた、免疫学的寛容（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅ）および免疫監視（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）において機能し得る。
【０００４】
ＴＲＡＩＬレセプター系は複雑であり、そして少なくとも２つのデスレセプター（ＤＲ４およびＤＲ５）、ならびに少なくとも２つの非アポトーシスレセプター（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）を含む。これらのレセプターの全てがアミノ酸配列の高い相同性を共有しているだけでなく、ＴＲＡＩＬに対する同様の結合親和性も示す（２〜１２）。アポトーシスを誘導することなしにＴＲＡＩＬの結合について競合する、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２レセプターの能力は、ＴＲＡＩＬリガンドの活性をブロックまたは調節するおとり（ｄｅｃｏｙ）レセプターとして作用し得ることを示唆する。さらに、形質転換されていない細胞は、形質転換された細胞が発現するよりも高いレベルのおとりレセプターを発現することが報告されている。従って、デスレセプターおよびおとりレセプターの発現の差示的調節は、ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスに対する細胞の感受性を決定するが、レセプター特異的抗体の欠損に起因する重要な調節機構を示し得ることが提唱されている（２）。ＤＲ４およびＤＲ５の発現ならびに機能が広範に研究されているが、レセプター特異的モノクローナル抗体が無いので、進歩が阻害されている。ＤＲ５の細胞表面の発現は、実証されていない。架橋を促進するために、インビトロにおいて黒色腫細胞のアポトーシスを誘導し得る抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体（ただし、その抗体の固定化の際にのみであり、そしていくつかの場合、この細胞はアクチノマイシンＤでの培養を必要とする）のパネルが生成されることが、報告されている（２４）。いくつかの抗ＤＲ５抗体が産生されている（２４）。しかし、これらの以前に生成された抗ＤＲ５モノクローナル抗体は、架橋条件下でさえ、インビトロで低いアポトーシス誘導活性を有する。インビボの活性は報告されていない。これらの抗体は、ＴＲＡＩＬレセプターの細胞表面発現を試験するために使用されていない（２４）。従って、架橋または固定化を必要とすることなく、インビボおよびインビトロの両方で、細胞表面レセプターに結合し得るだけでなく種々の型の異常な細胞（腫瘍細胞を含む）のアポトーシスを強力に誘導する、それぞれの特異的なＴＲＡＩＬレセプターについて選択的なモノクローナル抗体の必要性が存在する。このような抗体は、強力な治療的因子だけでなく、ＴＲＡＩＬレセプターの機能的分析のための診断ツールをも提供する。死誘導レセプターＤＲ４およびＤＲ５のそれぞれに対する特異的な抗体についての特別な必要性が存在する。
【０００５】
多くの疾患の発生または進行において、しばしば細胞が欠損しない場合がある。多くの自己免疫疾患および炎症状態において、生存する活性化細胞は、正常な組織または細胞を攻撃する。さらに、腫瘍形成の進行および慢性関節リウマチの増殖性のパンヌス（ｐａｎｕｓ）形成は、細胞の抑制されない増殖によって特徴化される。従って、不十分なアポトーシスは、疾患の進展を引き起こし、そしてアポトーシスを増強するためのアポトーシス誘導リガンドまたはアゴニストのモノクローナル抗体の使用は、これらの所望ではない細胞を排除するための強力な治療的ストラテジーと考えられる。
【０００６】
例えば、慢性関節リウマチ（本明細書中で以降「ＲＡ」として参照される）は、一般的なヒト自己免疫疾患である。ＲＡの病態生理学の現在の理解は、自己免疫性のＴ細胞およびＢ細胞が、合わさって炎症応答を開始し、これが滑膜細胞の過増殖を駆動するということである。滑膜細胞の過増殖の結果として、メタロプロテイナーゼ（本明細書中で以降「ＭＭＰ」として参照される）が過剰生産され、それがさらに、ＲＡの特徴である軟骨および骨の侵食性の破壊を引き起こす（２５）。従って、炎症性滑膜細胞の過増殖の制御は、ＲＡの処置において重要な工程である。滑膜細胞の過増殖を引き起こす分子機構は未だに知られていない。過増殖性の滑膜細胞は悪性ではなく、そして形質転換されていないが、多くの研究が、これらの滑膜細胞は、形質転換された細胞といくつかの共通の特徴を共有していることを示唆する（４６）。これらの細胞（いわゆる「形質転換したらしい（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ−ａｐｐｅａｒｉｎｇ）滑膜細胞」）は、高密度で粗い小胞体、多くの不規則な核、および正常な紡錘形態の細胞骨格における変化によって特徴付けられる。癌遺伝子およびウイルス由来遺伝子の取り込みが、ＲＡ滑膜細胞の形質転換の出現についての一次トリガーであり得ることが提唱されている（４６）。
【０００７】
ＲＡの少なくとも２つの局面が、調節不全のアポトーシスが疾患のプロセスに寄与し得ること、およびアポトーシスの治療的な誘発が効果的な処置であり得ることを示唆する：活性化されたＴ細胞の欠失の失敗は、これらのＴ細胞の不完全な活性化誘導の細胞死が存在し、これはＦａｓ介在アポトーシスおよびＴＲＡＩＬ介在アポトーシスを含むプロセスであり、そしてＲＡ滑膜細胞の過増殖の性質はＲＡ病態生理学の後期ステージにおいて寄与する因子であることを示唆する。実際に、抗Ｆａｓ抗体の炎症性関節中への投与が、ｔａｘトランスジェニックマウス（これはヒトＲＡについての動物モデルである）において慢性関節炎の発生を阻害することを示す（２６）。さらに、アデノウイルスベクターによるｆａｓリガンド遺伝子での局在化された形質導入が、コラーゲン誘導関節炎の予防において効果的である（２７）。Ｆａｓ介在アポトーシスの増強による炎症性滑膜細胞の増殖の阻害が、両方の場合において観察される。ＦａｓリガンドはＲＡ滑膜細胞における強力なアポトーシス誘導因子であるが、ヒトのための治療としてＦａｓリガンド介在アポトーシスを適用することは、致死的な肝臓毒性によって制限される。従って、ＴＲＡＩＬレセプター誘導アポトーシスは、Ｆａｓリガンド誘導アポトーシスよりも、ＲＡの処置のためのより安全で、かつより効果的な治療を示す。
【０００８】
ＴＲＡＩＬレセプター誘導アポトーシスはまた、Ｆａｓリガンド誘導アポトーシスよりも、癌の処置のためのより安全で、かつより効果的な治療を示す。ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスは、正常な細胞に影響することなく、形質転換された腫瘍細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが知られている。三量体化された可溶性ＴＲＡＩＬの全身投与は、実験動物において毒性を引き起こさなかったが、移植された腫瘍の退行を誘導し得たことが示された（１３、２８）。伝統的な処置のための付属的な治療としてのその可能性は、ＤＲ５の発現および乳癌細胞のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する感受性が放射線によって増強され、放射線と組み合せることでＴＲＡＩＬの効果が癌治療において増加されることを示唆するという最近の知見によって強調された（２９）。
【０００９】
さらに、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５をコードする遺伝子が、染色体８ｐ２１−２２（いくつかの癌細胞において高い頻度の変異を有する遺伝子座）にマッピングされた（３０）。少なくとも２種類の腫瘍細胞（小肺癌（３１）および頭頚部癌（３２））が、ＤＲ５遺伝子のデスドメインにおいて変異を示すことが報告された。従って、癌の発生および進行に対するレセプターエピトープのバリエーションの効果を決定するための癌研究における、抗ＤＲ５抗体についての必要性が存在する。さらに、ＴＲＡＩＬレセプター変異の機能性は、癌の早期検出における他の生体マーカーと組み合されそして腫瘍攻撃性の予測物として使用される場合、有用な臨床的診断ツールであることが証明される。
【００１０】
（発明の要旨）
ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を認識する抗体およびインビボでＤＲ５発現細胞においてアポトーシスを誘導する抗体が開示される。ＤＲ４でも、ＤｃＲ１でもＤｃＲ２でもなく、ＤＲ５を認識する抗体が、さらに開示される。ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が、具体的に詳述される。
【００１１】
本発明によって提供される方法は、ＤＲ５に結合し得る治療的な量の抗体に対して細胞を曝露することによって、細胞の増殖を阻害することを可能にする。ＤＲ５に対して活性な治療的な量のモノクローナル抗体、薬学的に受容可能なキャリア、およびこの抗体およびこのキャリアを含む容器を含む薬理学的な組成物もまた、開示される。異常な細胞または調節不能な細胞の選択的アポトーシスのための治療剤を調製するための、ＤＲ５を認識する抗体の使用が、本発明によってさらに提供される。
【００１２】
本発明の抗体は、腫瘍壊死因子リガンドレセプター（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２またはＯＰＧ）と相互作用し、このようなレセプターを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する。アゴニストな腫瘍壊死因子リガンドレセプターエピトープまたはアンタゴニストな腫瘍壊死因子リガンドレセプターエピトープを選択的に結合し得る本発明の抗体が、開示される。
【００１３】
本発明は、治療的な量の本発明の抗体に、アポトーシス関連疾患を有する標的組織を曝露する工程を包含する方法によって、アポトーシス関連疾患を処置することが提供される。
【００１４】
被験体中で免疫応答を誘発し得る免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントに結合する、少なくとも１０塩基を有する抗原性のＴＲＡＩＬレセプターアミノ酸配列を含む融合タンパク質がさらに記載される。
【００１５】
本発明は、標的細胞が発現ベクター中のＴＲＡＩＬレセプター核酸配列でトランスフェクトされ、そのためにＴＲＡＩＬレセプターは標的細胞中で発現される、遺伝子治療の方法を提供する。次いでこの標的細胞は、ＴＲＡＩＬレセプターに選択的に結合する抗体に曝露される。
【００１６】
ＤＲ５について選択的な抗体の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列およびアミノ酸配列が提供される。本発明の核酸配列を含むベクターおよび本発明のベクターで形質転換された宿主細胞も、詳述される。
【００１７】
本発明は、ヒト化ＴＲＡ−８を産生する宿主細胞を提供する。
【００１８】
宿主が、ヒト化免疫グロブリン軽鎖およびヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列で形質転換され、その後この形質転換された宿主は所定の期間インキュベートされる、ヒト化ＤＲ５抗体を産生するプロセスが記載される。
【００１９】
標的細胞を、薬学的に有効な量のヒト化ＤＲ５抗体と接触する工程を包含する、細胞増殖を阻害するためのプロセスもまた記載される。
【００２０】
ＤＲ５について選択的なヒト化ＴＲＡ−８抗体を含み；使用のための説明書と共に適切な容器にパッケージングされている、細胞死を誘導するための市販のキットが提供される。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
細胞の排除ができないということは、欠損と関連するアポトーシス誘導系（例示的に、リガンド、レセプター、または細胞内調節因子およびエフェクター分子の発現または機能を含む）における欠陥に起因する。本発明は、欠陥アポトーシス誘導系を補正するための方法ならびに所定の欠陥アポトーシス誘導系に固有の特異的な欠損を解明するための方法を提供する。
【００２２】
本発明は、特異的ＴＲＡＩＬレセプター（ＤＲ５、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２を含む）に対する選択的インビボアポトーシス誘導活性および選択的インビトロアポトーシス誘導活性を有する、モノクローナル抗体の新規クラスに関する。本発明は、アポトーシスシグナル伝達研究のための試薬として、ならびにＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞（例示的に、広範なクラスの癌細胞、アポトーシス系の調節不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および自己免疫疾患の異常に増殖する滑膜細胞が挙げられる）に対して有効な治療剤としての有用性を有する。本発明に従う抗体は、ＴＲＡＩＬレセプター間の相同性にもかかわらず、ＴＲＡＩＬレセプターの特定の型の結合に特異的である。本発明の抗体は、標的ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞のみの標的化されたアポトーシスを与えるか、あるいは、標的レセプターを発現する細胞のＴＲＡＩＬアポトーシスのブロッキングを提供する。
【００２３】
本発明の抗ＤＲ５モノクローナル抗体は、インビトロにおいてＤＲ５を発現する細胞におけるアポトーシスの強力な誘導因子として、およびインビボにおいてアポトーシスの強力な誘導因子として作用する。ヒト化抗体骨格に接がれたヒト化フラグメントＣＤＲ配列および本発明の融合タンパク質抗ＤＲ５抗体は、類似のアポトーシス特性を示す。
【００２４】
現在のところ、細胞表面ＤＲ５に結合し、そして架橋剤の非存在下でインビトロおよびインビボの両方でＤＲ５を発現する細胞のアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体は、利用可能ではない。本発明は、疾患の動物モデル（例えば、異種移植動物）、すなわちインビボにおいて治療剤として作用する抗ＤＲ５抗体を含む。可溶性ＴＲＡＩＬは、インビボにおいて腫瘍細胞のアポトーシス誘導に有効であることが示されているが、その殺傷活性は、大量かつ反復した投与（これは頻繁に必要とされる）を伴なっても非常に低いようである（１３）。本発明に従う一連の抗ＤＲ５抗体のうちの１つであるＴＲＡ−８は、ヒトＤＲ５導入遺伝子を保有する動物において薬学的に有効であり、そしてまた、ＤＲ５およびＴＲＡＩＬの役割の調査のためのモデルを確立する際に有用性を有する。
【００２５】
ＴＲＡＩＬレセプターに対して惹起された本発明に従う抗体は、実験動物から本発明に従って収集される。ヒト被験体内での減少され、そして治療的に許容できる免疫応答を誘発しながらレセプター結合活性を維持するために、本発明に従う抗体をヒト化することによって、本発明に従うヒト化抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、所定のＴＲＡＩＬレセプターに対する治療アゴニストまたは治療アンタゴニストとして使用される。抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の二次的な架橋は必要とされないので、本発明は、インビボ治療剤として作用する。
【００２６】
本発明は、アゴニスト性アポトーシス効果またはアンタゴニスト性アポトーシス効果を有する単一抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を超えた範囲にわたる。むしろ、２つ以上の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を、インビトロにおいて細胞培養物と、またはインビボにおいて被験体の体組織と接触させて、相乗作用的な処置を引き起こす。例えば、神経膠腫細胞株Ｕ８７および造血細胞株Ｕ９３７およびＭｏｌｔ−４は、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体およびアゴニスト性抗ＤＲ５抗体に対する相乗作用的曝露への曝露に応答性であり、一方、アゴニスト性抗ＤＲ５抗体単独への曝露では、アポトーシスの誘導に限られた成果しか示さない。
【００２７】
さらに、アンタゴニスト性抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、抗体がおとりレセプターＤｃＲ１、ＤｃＲ２またはＯＰＧのうちの１つへの結合に特異的である場合、本発明において特別の有用性を有する。本発明に従う抗体を用いたおとりレセプターの選択的ブロッキングは、おとりレセプターを発現する細胞型においてＴＲＡＩＬ結合平衡から、アポトーシスシグナルを伝達し得るＴＲＡＩＬレセプターに向かってシフトする際に、効果を有する。従って、本発明に従う別の併用治療において、おとりレセプター結合抗体は、発現細胞を、アゴニスト性アポトーシスシグナルを伝達するＴＲＡＩＬレセプター結合に向かって感作させる。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、所定のＴＲＡＩＬレセプターのアゴニスト性エピトープおよびアンタゴニスト性エピトープを解明する方法を提供する。さらに、所定のＴＲＡＩＬレセプターと関連する個体間の多型が、モノクローナル抗体（各々が異なる可変領域またはＣＤＲ領域を有する）のパネルの使用を介して、本発明に従って解明される。モノクローナル抗体の特徴付けられたパネルは、アゴニスト性およびアンタゴニスト性のエピトープおよび多型を規定する能力を提供する。従って、本発明に従うモノクローナル抗体のパネルは、薬物探索および／または疾患の傾向についての被験体スクリーニングにおいて有用性を有する。
【００２９】
本発明のなお別の実施形態は、免疫グロブリンタンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合したＴＲＡＩＬレセプターの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を含む。被験体の細胞表面上に発現されるネイティブなＴＲＡＩＬレセプターに対する免疫原性応答を誘発するのに十分な数の塩基を含むとして規定される、ＴＲＡＩＬレセプターフラグメント。少なくとも１０アミノ酸を含む、ＴＲＡＩＬレセプター融合フラグメント。免疫グロブリン融合タンパク質またはそのフラグメントは、本明細書中、被験体内の免疫原性カスケード応答を活性化するための十分な数のアミノ酸塩基を有する、ネイティブまたは合成のタンパク質セグメントまたはポリペプチドセグメントを含むことが規定される。免疫グロブリンフラグメントに結合したＴＲＡＩＬレセプターフラグメントの融合を含む本発明の免疫原は、被験体内でインサイチュで抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を誘発するインビボ治療剤としての有用性を有する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、遺伝子治療として作用する。本発明の遺伝子治療の局面において、標的細胞は、ＴＲＡＩＬレセプターに対応する発現可能な配列を保有するベクターでトランスフェクトされる。ベクターは、慣用的であり、そしてこのベクターへの標的細胞感受性に基づいて選択される。遺伝子治療ベクターとしては、例示的に、アデノウイルス、ｐＡｄＣＭＶ５が挙げられる。標的化細胞または組織がトランスフェクトされたＴＲＡＩＬレセプターを発現する際、この細胞または組織は、トランスフェクトされたＴＲＡＩＬレセプターの結合に特異的な本発明に従う抗体に曝露される。抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体が、所望される治療結果と一致して、それらに対するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであることが理解される。
【００３１】
本発明の抗体はまた、感作物質と組合わせて作用する。本明細書中に使用される場合、感作物質は、アポトーシスを誘導する任意の刺激物質（紫外線、有機分子（詳細には、ビスインドールマレイミドのクラスが挙げられる）、重金属および遊離ラジカル種を含む）を含むことを規定する。
【００３２】
悪性疾患治療の状況において、ＴＲＡ−８が、二次的な架橋剤の非存在下で、カスパーゼ依存様式でほとんどのＴＲＡＩＬ感受性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し得る。ＴＲＡ−８は、インビボにおいて強い殺腫瘍性活性を示す。ほとんどのＴＲＡＩＬ感受性細胞のアポトーシスを誘導するＴＲＡ−８の能力は、ＤＲ５単独が、アポトーシスを誘引するのに十分であることを確認する。本明細書中に詳述される腫瘍細胞の大多数は、細胞表面にＤＲ５を発現し、ＴＲＡＩＬに対するその感受性と平行したＴＲＡ−８誘導細胞死に対するその感受性を発現し、このことは、ＤＲ５が、ほとんどの腫瘍細胞においてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの主な死のレセプターであることを示す。従って、正常細胞および癌細胞によるＤＲ５の異なる発現は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの選択性に作用する。ＴＲＡ−８は、おとりレセプターを迂回して、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを誘導する。しかし、少数のＴＲＡＩＬ耐性腫瘍細胞のみが、ＴＲＡ−８に感受性であり、これは、おとりレセプターが、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性に主要な役割を果たしてはいないようであることを示す。
【００３３】
以前の研究は、動物への可溶性形態のＴＲＡＩＬの全身投与が毒性を引き起こすことなく腫瘍退縮を誘導したことを示した３、４、２２が、膜結合型のヒトＴＲＡＩＬは、本明細書中に示されるように、マウスにおいて肝傷害を引き起こした。しかし、ＴＲＡＩＬの肝毒性は、Ｆａｓリガンドと比較したＴＲＡＩＬ誘導傷害に対する正常な肝細胞のより低下した感受性によって、およびインビボにおいてＴＲＡＩＬは致死を欠くことによって実証されるように、Ｆａｓリガンドの肝毒性よりもそれほど強力ではない。従って、ＴＲＡＩＬの滴定は、癌治療において有用性を有する。
【００３４】
本明細書中に詳述されるように、正常肝細胞によるＤＲ５タンパク質発現の有意なレベルが存在しないことが示され、これは、ＴＲＡ−８誘導アポトーシスに対する肝細胞耐性と関連する。ＤＲ５とモノクローナル抗体との架橋は、アポトーシスを誘引し得る死のレセプターのホモポリマー形態を組織化するのに不十分である。マーモセットにおける実験は、ＴＲＡ−８投与の肝毒性の証拠を示さない。従って、アゴニスト性モノクローナル抗ＤＲ５抗体は、治療剤として可溶性ＴＲＡＩＬよりも、より選択的かつ安全なようである。
【００３５】
スクリーニングアッセイの場合、本発明は、正常細胞形態をなおも示し得る悪性細胞の小さなクラスターを検出するのに十分に適している。本発明に従う標識抗体を用いた、肺癌、前立腺癌および肝臓癌を含むヒト癌細胞の、インサイチュ細胞切片染色は、癌性細胞を容易に同定する。これらの癌細胞は、同じ型の正常細胞と比較した場合、非常に高いレベルのＤＲ５を発現することが観察される。従って、本発明は、少なくとも肺、前立腺および肝臓を含む組織内の初期段階の悪性疾患についての選択的スクリーニング方法として有用性を有する。疾患（例示的に、悪性癌およびリンパ性白血病）と関連する異常な細胞増殖の阻害のための治療プロセスが、本明細書中に詳述される。
【００３６】
本発明は、特に、ＴＲＡ−８と称される抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１４２８を有する）に関して本明細書において詳述する。アゴニスト性抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＴＲＡ−８に関して詳述される技術および結果が、アンタゴニスト性ＤＲ５抗体について完全に延長可能かつ適用可能であり、そしてアゴニスト性様式およびアンタゴニスト性様式の両方で作用するＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対して惹起された抗体についても同様であることが、認識される。
【００３７】
アポトーシスレセプター（例えば、Ｆａｓ）の発現レベルは、細胞のアポトーシスに対する感受性と必ずしも相関する必要はない。ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに関して、ＴＲＡＩＬについてのおとりレセプターの発現が、細胞の感受性に影響を与えることが示唆されている。さらに、ＦＡＤＤおよびカスパーゼ８経路を介したアポトーシスシグナルの有効な伝達のために、ＤＲ５は、ＤＲ４と結合しなければならないことが示唆されている。アゴニスト性モノクローナル抗ＤＲ５抗体の利用可能性は、ＤＲ５シグナル伝達の調節およびＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスにおけるその相対的な役割の評価を可能にした。ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対する細胞の感受性と、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するそれらの感受性との比較は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスにおけるＤＲ５の役割および感受性に影響を与え得る機構への洞察を提供する。
【００３８】
この利点は、一般的に、本発明のヒト化抗ＤＲ５抗体に及ぶ。ＤＲ−５に対する抗体の分子クローンは、以下の実施例に関して詳述されるように公知の技術によって調製される。組換えＤＮＡ方法論（３３）は、本明細書において、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するために作用する。
【００３９】
本発明は、ヒト抗マウス抗体（本明細書の以後、「ＨＡＭＡ」と呼ぶ）応答（３４）はおそらく誘導しないが、有効な抗体エフェクター機能をなおも有する、ヒト化抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の構築が、可能である。本明細書中に使用される場合、用語「ヒト」および「ヒト化」は、抗体に関連して、ヒト被験体において治療的に寛容可能な弱い免疫原性応答を誘発することが予測される任意の抗体に関する。
【００４０】
本発明は、抗ＤＲ５抗体、ヒト化抗ＤＲ５抗体、ＴＲＡ−８重鎖免疫グロブリンおよびＴＲＡ−８軽鎖免疫グロブリンならびにヒト化重鎖免疫グロブリンおよびヒト化軽鎖免疫グロブリンを提供する。これらのタンパク質または遺伝子の特定の短縮は、全長配列のタンパク質または遺伝子の調節機能または酵素機能を発揮する。従って、例えば、コードする核酸配列は、置換、付加、欠失または多重結合発現によって変更され得、これらの発現は、機能的に等価なタンパク質または遺伝子を提供する。核酸コード配列の縮重に起因して、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列が、本発明の実施に使用され得る。これらとしては、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、ゆえにサイレントな変更を生じる、上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含む核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従う免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、そのような改変形態がＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を認識する作用する抗体を形成する限り、標準的な方法（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２７−１４９頁，１９９８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）によって算出されたように、２５％までの配列相同性バリエーションを許容する。例えば、ポリペプチド配列内の１つ以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得、サイレントな変更を生じる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸残基としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。翻訳の間または翻訳の後に、例えば、グリコシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子もしくは他の細胞性リガンドへの連結などによって差次的に修飾された、タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もまた、本発明の範囲内に含まれる。さらに、本発明の抗ＤＲ５抗体の核酸配列をコードする組換えベクターが、ベクターのプロセシングまたは発現を改変するように操作され得る。
【００４１】
さらに、核酸配列をコードするインヒビターが、インビトロまたはインビボで変異されて、翻訳配列、開始配列および／もしくは終結配列を作製および／もしくは破壊するか、またはコード領域におけるバリエーションを作製するか、および／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を作製もしくは既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊し得、インビトロ改変をさらに促進し得る。当該分野で公知の変異誘発に関するいずれかの技術が使用され得る（インビボ部位指向型変異誘発（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、Ｔａｂリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが挙げられるが、これらに限定されない）。
【００４２】
Ｘ線結晶学のデータは、抗体免疫グロブリンの折り畳みが、一般的に、逆平行βシートの２層（この各々は、３個または４個のβ鎖からなる）を含む長い円筒構造を形成することを示す。可変領域において、Ｈ鎖およびＬ鎖のＶドメインの各々由来の３つのループは、一緒に密集して、抗原結合部位を形成する。これらのループの各々は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。このＣＤＲは、抗体とアミノ酸配列において最も高い可変性を有する。ＣＤＲの一部ではない可変領域の部分は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」領域）と呼ばれ、一般的に、ＣＤＲ構造の維持において役割を果たす。好ましくは、所定の抗体由来のＣＤＲ全てが、ＴＲＡＩＬレセプターエピトープ領域に対する結合領域を保存するために、受容抗体に移植される。ＣＤＲ総量のうちの一部のドナーへの移植が、本明細書中において作用することが認識される。移植は、一般的に、１つのアミノ酸の残基から別のアミノ酸の残基への置換または１つの領域の残基から別の領域の残基への置換を含むことが、理解される。しかし、その結果時折、特に領域の移動に関して、１つ以上の残基が、所望される場合に、付加または削除または置換され得、そしてこのような欠失および挿入ならびに適切な置換および反転は、当業者の範囲内である。
【００４３】
本発明の抗体は、例えば、抗ＴＲＡＩＬレセプターモノクローナル抗体のＬ鎖サブユニットおよびＨ鎖サブユニットの各ＣＤＲを、ヒト抗体の対応するＣＤＲ領域に移植し、それによって、ＴＲＡＩＬレセプターに対する有効なマウスモノクローナル抗体をヒト化することによって、得られる。
【００４４】
この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントがまた、公知の技術を使用して、作製され、そして本明細書中において作用する。例えば、このようなフラグメントは、例示的に、抗体分子のペプシン消化によって産生され得る抗ＴＲＡＩＬレセプター（ＡＢ’）２フラグメント、ＴＲＡＩＬレセプター（ＡＢ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元を介して作製されるＴＲＡＩＬレセプター抗体ＡＢ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって作製される抗体フラグメントが挙げられる。
【００４５】
詳細には、抗ＤＲ５モノクローナル抗体ＴＲＡ−８は、ハイブリドーマを培養することによって入手し得、次にこのハイブリドーマは、マウスをヒトＤＲ５で免疫し、続いてマウス骨髄腫細胞を有するマウス由来の脾細胞またはリンパ節細胞を融合することによって獲得され得る。
【００４６】
モノクローナル抗体の調製は、例示的に以下の工程を包含する：
ａ）抗原として使用するための生体高分子の精製；
ｂ）抗体産生細胞の調製であって、抗原の注射を用いた動物の最初の免疫後に、いつ脾臓を取り出すかを決定するために、動物を採血し、そして抗体力価をアッセイする；
ｃ）骨髄腫細胞の調製；
ｄ）抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる；
ｅ）所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択する；
ｆ）単一細胞クローンを調製する（クローニング）；
ｇ）必要に応じて、モノクローナル抗体の大量調製のために、ハイブリドーマ細胞を培養するかまたはハイブリドーマ細胞が移植された動物を成長させる；そして
ｈ）このようにして調製されるモノクローナル抗体の生物学的活性および特異性を試験するか、またはこの抗体の特性に対するマーカーをアッセイする。
【００４７】
抗ＤＲ５モノクローナル抗体の調製手順は、上記の工程を参照して以下に詳述されている。本発明の抗体の調製のためのこの方法は、調製方法の例示であることのみが意図され、それに限定されない。例えば、脾臓細胞および骨髄腫以外の抗体産生細胞を用いることにより、他の公知の手順に従い得るか、または以下の方法が改変され得る。
【００４８】
（（ａ）抗原の調製）
抗原として有効な組換えタンパク質（本明細書中以下、「組換えヒトＤＲ５」といわれる）は、ＱＢＩ−２９３Ａ細胞を、ヒトＤＲ５の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体（本明細書中以下、「ＩｇＧ」といわれる）のＦｃ領域を含む融合タンパク質についての発現ベクターｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧ（ＰＴＡ−１４２８を参照のこと）でトランスフェクトし、ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔキット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）を用いてこれを発現させ、そして発現産物を収集し、そして部分精製することによって入手される。プラスミドｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧは、ヒトＤＲ５およびヒトＩｇＧ融合タンパク質をコードするＤＮＡをｐＡｄＣＭＶ５（これは、動物細胞のための発現ベクターである）中に挿入することによって構築される。他の物質（例えば、ＤＲ５をコードするＤＮＡ、ベクターおよび宿主）は本明細書において有効である。
【００４９】
ベクターｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧでトランスフェクトされたＱＢＩ−２９３Ａ細胞の培養上清中に産生されるヒトＤＲ５およびＩｇＧ融合タンパク質は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーもしくはＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィー、またはＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（商標名；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって部分精製され得る。
【００５０】
あるいは、ヒト細胞株の細胞膜から入手された精製されたＤＲ５は、抗原として使用される。さらに、ＤＲ５の一次構造が公知である（ＰＴＡ−１４２８を参照のこと）ので、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｓａｎｇｅｒ法のような公知の方法によって化学的に合成され得、そして抗原として使用され得る。
【００５１】
（（ｂ）抗体産生細胞の調製）
マウスは、アジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバントもしくはＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバントまたはミョウバン）と混合された、工程（ａ）において産生された免疫原で免疫される。他の適切な実験動物としては例示的に、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられる。
【００５２】
実験動物を免疫するための適切な投与経路としては、皮下、腹腔内、静脈内、皮内および筋肉内の注射経路が挙げられ、皮下注射および腹腔内注射が好ましい。
【００５３】
免疫は、単回用量によって、または適切な間隔（好ましくは１〜５週間）を置いた何回かの反復用量によって、必要に応じて実施される。免疫された動物は、それらの血清における抗体力価についてモニタリングされ、そして充分に高い抗体力価を有する動物は、抗体産生細胞の供給源として選択される。高い抗体力価を有する動物を選択することによって、その後のプロセスがより効率的になる。その後の融合のための細胞は一般に、最終免疫の３日後〜５日後にその動物から収集される。
【００５４】
抗体力価をアッセイするための方法としては、以下のような種々の周知の技術が挙げられる：放射免疫アッセイ（本明細書中以下、「ＲＩＡ」という）、固相酵素免疫アッセイ（本明細書中以下、「ＥＬＩＳＡ」という）、蛍光抗体アッセイおよび受動血球凝集アッセイ。ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡは、検出感度、迅速性、精度および自動化の可能性という理由から好ましい。
【００５５】
抗体力価の決定は、例えば、ＥＬＩＳＡによって以下の通りに行われ得る。最初に、精製したまたは部分精製したＤＲ５は、固相（例えば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート）の表面に吸着され、続いて、ＤＲ５が結合していないあらゆる残りの表面は、この抗原に無関係なタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を用いてブロッキングされる。洗浄後、ウェルの表面を、連続希釈したマウス血清サンプルと接触させて、この抗原へのこのサンプル中の抗ＤＲ５抗体の結合を可能にする。二次抗体として、酵素標識抗マウス抗体が添加されて、このマウス抗体へ結合させる。洗浄後、酵素基質が添加され、そして抗体力価は、基質の変化などによって引き起こされた発色に起因した吸光度の変化を決定することによって評価される。
【００５６】
（（ｃ）骨髄腫細胞の調製）
確立されたマウス細胞株由来の細胞は、骨髄腫細胞の供給源として役立つ（例えば、８−アザグアニン耐性マウス、ＢＡＬＢ／ｃ骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）（３５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（３６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（３７）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（３８）およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（３９）から誘導された）。選択される細胞株は、適切な培地（例えば、８−アザグアニン培地）中に逐次移される。８−アザグアニン培地としては、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（本明細書中以下、「ＩＭＤＭ」といわれる）またはＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（本明細書中以下、「ＤＭＥＭ」といわれる）が挙げられる。ＲＰＭＩ−１６４０培地には、グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ウシ胎児血清（本明細書中以下、「ＦＣＳ」といわれる）および８−アザグアニンが補充される。次いで、細胞は、少なくとも２×１０７細胞が融合当日に利用可能であることを確実にするために、融合の３日前〜４日前に１０％ ＦＣＳを含む正常な培地（例えば、ＡＳＦ１０４培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．）に移される。
【００５７】
（（ｄ）細胞融合）
動物の任意の適切な部分から入手されたリンパ球および形質細胞は、抗体を産生する前駆細胞である。リンパ球または形質細胞の供給源としては例示的に、脾臓、リンパ節、末梢血またはその任意の適切な組合せが挙げられ、脾臓細胞が最も普通の供給源である。
【００５８】
最後の追加免疫注射後、抗体産生細胞が存在する組織は、所定の抗体力価を有するマウスから取り出される。脾臓細胞を工程ｃ）において調製された骨髄細胞と融合するための現在好都合な技術は、ポリエチレングリコールを用いる。
【００５９】
融合技術としては、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、脾臓細胞の、骨髄腫細胞に対する数の比が約５：１と１０：１との間であるように無血清培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０）またはリン酸緩衝化生理食塩水（本明細書中以下、「ＰＢＳ」といわれる）で洗浄し、次いで遠心分離することが挙げられる。上清が棄てられ、そしてペレット化した細胞が充分にほぐされ、５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ｍ．ｗ．１，０００〜４，０００）を含有する１ｍｌの無血清培地が、混合しながら滴下される。続いて、１０ｍｌの無血清培地がゆっくりと添加され、次いで遠心分離される。上清は再度棄てられ、そしてペレット化した細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（本明細書中以下、「ＨＡＴ」といわれる）ならびにマウスインターロイキン−２（本明細書中以下、「ＩＬ−２」といわれる）の溶液を含む適切な量のＨＡＴ培地中に懸濁される。次いで、懸濁物は、培養プレート（本明細書中では単に「プレート」ともいわれる）のウェルに分配され、そして５％ ｖ／ｖ ＣＯ２の存在下で３７℃で約２週間にわたってインキュベートされ、必要に応じてＨＡＴ培地が補充添加される。
【００６０】
（（ｅ）ハイブリドーマの選択）
使用される骨髄腫株が８−アザグアニンに対して耐性である場合、すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素が欠損している場合、あらゆる未融合の骨髄腫細胞およびあらゆる骨髄腫−骨髄腫融合物は、ＨＡＴ培地中で生存することができない。一方、抗体産生細胞の相互の融合物ならびに抗体産生細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、生存し得、前者のみが限られた寿命を有する。従って、ＨＡＴ培地中でのインキュベーションを続けると、所望のハイブリドーマのみが選択される。
【００６１】
得られるハイブリドーマは増殖してコロニーになり、次いでこのコロニーはアミノプテリンを欠くＨＡＴ培地（ＨＴ培地）に移される。その後、培養上清のアリコートが取り出されて、抗Ｆａｓ抗体力価が例えばＥＬＩＳＡによって決定される。上記の融合タンパク質がＥＬＩＳＡ抗原として使用される場合、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを除去することもまた必要である。このようなクローンの存在または非存在は、例えば、Ｆａｓ−ＩｇＧ１またはＩｇＧ１を抗原として用いるＥＬＩＳＡによって立証され得る。
【００６２】
（（ｆ）クローニング）
抗体力価を決定するための工程ｂ）において記載された方法と類似の方法を用いて特異抗体を産生することが示されたハイブリドーマは次いで、クローニングのために別のプレートに移される。適切なクローニング方法としては以下が挙げられる：限界希釈法（ここでは、ハイブリドーマは、プレートの１ウェルあたり１細胞を含むように希釈され、次いで培養される）；軟寒天培地中での培養後にコロニーが回収される、軟寒天法；培養のために単細胞を分離するためにマイクロマニピュレータを使用する方法；および「クローン選別」（ここでは、セルソータによって単細胞が分離される）。
【００６３】
例えば、限界希釈法によるクローニング手順は、抗体力価を示す各ウェルについて２〜４回反復され、そして安定した抗体力価を有するクローンが、抗ＤＲ５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択される。抗マウスＤＲ５抗体を産生するハイブリドーマは、抗ＤＲ５モノクローナル抗体産生細胞株を得るための類似の方法によって選択される。
【００６４】
本発明の抗体の基礎であるマウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２０００年３月１日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ−１４２８を有する。従って、マウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８または任意の他の確立されたハイブリドーマを用いて抗体を調製する場合、調製は、以下の工程（ｇ）から始まる、工程（ａ）〜工程（ｆ）が省略された手順に従って行われ得る。
【００６５】
（（ｇ）モノクローナル抗体を調製するためのハイブリドーマの培養）
次いで、クローニングによって得られるハイブリドーマは、ＨＴ培地中ではなく正常培地中で培養される。大規模培養は、回転瓶培養によって、大規模の瓶を用いて、または攪拌培養によって行われる。次いで、大規模培養からの上清は収集され、そして当業者に周知である適切な方法（例えば、ゲル濾過）によって精製されて、本発明の抗体の基礎である抗ＤＲ５モノクローナル抗体が得られる。このハイブリドーマはまた、同系マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはｎｕ／ｎｕマウス）において腹腔内で増殖されて、抗ＤＲ５モノクローナル抗体を大量に含む腹水が入手され得る。市販のモノクローナル抗体の精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩ Ｋｉｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は便利に使用されて、回収された抗体が精製される。
【００６６】
上記の通りに調製されたモノクローナル抗体は、ヒトＤＲ５についての高い特異性を有する。
【００６７】
（（ｈ）モノクローナル抗体のアッセイ）
モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの適切な同定方法としては、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡが挙げられる。好ましくは、商業的キット（例えば、Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ Ｋｉｔ（商標名；ＢｉｏＲａｄ））は、同定のために用いられる
タンパク質の定量は、Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法によって、または２８０ｎｍでの吸光度（１．４（ＯＤ２８０）＝免疫グロブリン１ｍｇ／ｍｌ）に基づく算出によって行われ得る。
【００６８】
このモノクローナル抗体が認識するエピトープの同定は、以下の通りに行われる。最初に、このモノクローナル抗体が認識する分子の種々の部分構造が調製される。この部分構造は、この分子の種々の部分ペプチドが公知のオリゴペプチド合成技術によって合成的に調製される方法によって、または所望の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡが適切な発現プラスミド中に組み込まれ、そして適切な宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現されてこのペプチドが産生される方法によって調製される。一般に、両方の方法は、上記の目的のために組み合わされて頻繁に用いられる。例えば、抗原タンパク質のＣ末端またはＮ末端から徐々に進む、適切に低下させた長さを有する一連のポリペプチドは、確立された遺伝子操作技術によって調製され得る。どのフラグメントがこの抗体と反応するかを確立することによって、エピトープ部位のおよその知識が得られる。
【００６９】
エピトープは、確立されたオリゴペプチド合成技術を用いて、それらに対応する種々のより小さなオリゴペプチドまたはそのペプチドの変異体を合成して、本発明の抗体の調製のための基礎である抗ＤＲ５モノクローナル抗体に対するこのペプチドの結合特性およびこのモノクローナル抗体を用いた抗原に対するこのペプチドの結合の競合阻害を決定することによって、より綿密に同定される。
市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））およびマルチピン（ｍｕｌｔｉｐｉｎ）合成法（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）に基づく一連のマルチピンペプチド合成キットは便利に使用されて、広範な種々のオリゴペプチドが入手され得る。
【００７０】
本発明の抗体は、下記のａ）〜ｆ）の種々の機能的特性を有し、これらの各々は、例えば、本明細書中以下に記載される方法によって立証される。
【００７１】
（ａ）ヒトＤＲ５を発現する細胞へのＴＲＡ−８の特異的結合）
本発明の独特の特徴は、細胞表面ＤＲ５を結合する能力である。これは、ＤＲ５を発現する細胞のフローサイトメトリー分析によって実証される。最初に、ＤＲ５の特異的細胞表面結合が、ヒトＤＲ５をコードする全長ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞によって確認される。特に、ＴＲＡ−８のみが、ＤＲ５でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を認識し、空のコントロールベクターもＤＲ４をコードするベクターもこの細胞を認識しない。第二に、３つの異なる起源：造血、神経膠腫および前立腺癌のヒト悪性腫瘍細胞が試験される。トランスフォームされたこれらの腫瘍細胞の大多数は、顕著なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現したが、発現レベルは大いに変動した。第三に、ＲＡ患者およびＯＡ患者由来のヒト原発性滑膜線維芽細胞の２つのパネルが調べられる。全てのＲＡ滑膜細胞は、ＯＡ細胞と比較して有意により高いレベルのＤＲ５を発現した。
【００７２】
（ｂ）架橋の非存在下でのインビトロでのヒト悪性腫瘍細胞のアポトーシスの誘導）
本発明に従って惹起された抗体が、ＴＲＡＩＬレセプターを認識し、そして悪性ヒト腫瘍細胞のアポトーシスを直接的に誘導する能力は、種々の濃度の抗体（特にＴＲＡ−８）を用いて、細胞のインビトロ培養の間に細胞生存率アッセイ（ＡＴＰＬｉｔｅ）によって決定される。大多数の腫瘍細胞は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに感受性である。いくつかの細胞については、ＴＲＡ−８は、強力なアポトーシス誘導活性を示し、例えば、ＴＲＡ−８は、ｐｇ／ｍｌのレベルでヒトＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導し得る。重要なことに、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスは、架橋を必要とせず、そして大部分の細胞において、ＴＲＡ−８は、エンハンサーの存在下で、組換え可溶性ＴＲＡＩＬよりも強力なアポトーシス誘導活性を示した。
【００７３】
（ｃ）ＴＲＡ−８のインビボでの殺腫瘍活性）
ＴＲＡ−８の殺腫瘍活性は、２つのＳＣＩＤ／ヒト腫瘍細胞モデルにおいて評価される。第一に、ＳＣＩＤマウスは、ヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞が静脈内接種され、そして単回用量（１００μｇ）のＴＲＡ−８で処理される。結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析およびインサイチュ免疫組織化学的染色によって決定されるように、大多数の移植Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＴＲＡ−８を用いた処理によって末梢血および脾臓から除去されることを示す。第二に、ヒト星状細胞腫細胞１３２１Ｎ１は、ＳＣＩＤマウスに皮下接種され、そして腫瘍保有マウスは、単回用量のＴＲＡ−８で処置される。腫瘍の大きさおよび組織学的分析によって決定されるように、移植された１３２１Ｎ１細胞の増殖は、ＴＲＡ−８処置マウスにおいて顕著に阻害される。
【００７４】
（ｄ）ＴＲＡ−８によるＲＡ滑膜細胞の同定）
８人のＲＡ患者および４人のＯＡ患者から単離された初代滑膜細胞は、ＤＲ５の細胞表面発現について試験される。ＴＲＡ−８は、全てのＲＡ細胞を正に染色（ｓｔｒａｉｎ）し得るが、全てのＯＡ細胞を負に染色し得る。従って、ＲＡは、ＴＲＡ−８によって検出されるように、ＤＲ５の表面発現によってＯＡから識別される。
【００７５】
（ｅ）ＴＲＡ−８による、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるアポトーシスの誘導） ＴＲＡ−８がＲＡ滑膜細胞のアポトーシスを誘導する能力は、種々の濃度のＴＲＡ−８の存在下でのインビトロ培養の間の細胞生存率アッセイによって決定される。全てのＲＡ細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８に対して高レベルから中間レベルの感受性を示した。対照的に、全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して本質的に耐性である。重要なことに、ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞に対して、エンハンサーを伴った可溶性ＴＲＡＩＬよりも良好なアポトーシス誘導活性を示した。さらに、抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）と比較して、ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞に対して、より良好な選択性を示した。
【００７６】
（ｆ）ＴＲＡ−８はＲＡ滑膜細胞においてＭＭＰの産生を誘導しない）
ＴＲＡ−８は、ＴＮＦ−ａとしてＲＡ滑膜細胞におけるＮＦ−ｋｂ活性化を誘導し得るので、滑膜細胞のＭＭＰ１およびＭＭＰ３の産生に対するＴＲＡ−８の効果が決定される。ＴＮＦ−ａはＭＭＰの用量依存性増加を誘導したが、ＴＲＡ−８は、ＭＭＰの産生を全く誘導できず、そしていくつかの濃度では、ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞におけるＭＭＰの産生をわずかに減少させた。
【００７７】
（ｇ）ＴＲＡ−８は複数のカスパーゼ活性化を誘導する）
カスパーゼはアポトーシスの誘導において重大な役割を果たすので、ＴＲＡ−８がカスパーゼ活性を誘導する能力は、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞において決定される。Ｊｕｒｋａｔ細胞が低用量（５０ｎｇ／ｍｌ）のＴＲＡ−８とともにインキュベートされる場合、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ３の活性化は、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析およびカスパーゼ切断アッセイによって実証されるように、インキュベーションの１５分後という早期に観察される。カスパーゼ活性化のタイミング、数および強さに関しては、例証となる抗体ＴＲＡ−８を含めて本発明の抗体は、他のあらゆる公知のアポトーシス誘導抗体（例えば、抗ヒトＦａｓ抗体（ＣＨ−１１））よりもずっと良好な活性を示した。
【００７８】
従って、本発明の抗体は、効果（ａ）および（ｇ）において示すように、病原性細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する特性を有する物質である。従って、本発明の抗体は、細胞の不適切な生存または細胞の不適切な増殖に関連した疾患（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系を含めたアポトーシス系の調節不全に起因し得る疾患）についての予防的および治療的な薬剤として有用である。
【００７９】
本発明の抗体がアポトーシスを誘導する能力は、ヒト白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ番号ＴＩＢ−１５２）および星状細胞腫細胞株１３２１Ｎ１のような細胞を、試験サンプルが添加された培地中で培養し、そして例えば、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって生存率を決定することによって確認される。
【００８０】
ヒト抗体のヒトに対する免疫原性とほぼ同じ、ヒトに対する免疫原性を有する本発明の抗体（特に抗ＤＲ５抗体）は、細胞の不適切な生存または増殖に関連した疾患（以下を例示的に含む、自己免疫疾患におけるアポトーシス系の調節不全に起因し得る疾患を含む）の予防または処置のための薬剤として使用される：全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アディソン病、強皮病、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｐｅｎｉａ ｐｕｒｐｕｒａ）、インスリン依存性糖尿病、アレルギー；アトピー性疾患；動脈硬化症；心筋炎；心筋症；糸球体腎炎；低形成貧血；器官移植後の拒絶ならびに肺、前立腺、肝臓、卵巣、リンパ組織および乳房組織の多数の悪性疾患。
【００８１】
このような予防剤または治療剤は、種々の形態で投与され得る。投与の適切な様式としては、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、およびシロップなどによる経口投与、または注射、点滴、および坐剤などによる非経口投与が挙げられる。
【００８２】
抗体または治療剤は、経口的に、直腸的に、槽内に、心室内に、頭蓋内に、髄腔に、膣内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、または皮下に）、局所的に（粉末、軟膏、またはドロップ）、複腔内注射によって、経皮的に、吸入によって、または頬内もしくは経鼻スプレーとして、投与され得る。必要な抗体または治療剤の正確な量は、被験体の年齢、体重、および全身状態、処置されている疾患の重篤度、腫瘍の位置およびサイズ、用いられる特定の化合物、投与の様式、などによって被験体間で変化する。本明細書において教示が与えられる慣用的な実験のみを用いて、当業者によって適切な量が決定され得る。抗体の代表的な単回投薬量は、０．１〜１０，０００マイクログラム、好ましくは１〜１００マイクログラムの範囲にわたる。キャリア中の代表的な抗体濃度は、送達された１ミリリットルあたり、０．２〜２０００ナノグラムの範囲にわたる。
【００８３】
投与の意図される様式に依存して、抗体または治療剤は、固体、半固体、または液体投薬量形態（例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、または懸濁物など）で、好ましくは正確な投薬量の単回投与に適切な単位投薬形態で、薬学的組成物中に存在し得る。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、有効量の選択された基質を含み、そしてさらに、他の医薬、薬剤、キャリア、または希釈剤を含み得る。「薬学的に受容可能な」とは、重大な所望されない生物学的影響を生じることも、含まれる薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することもなく、選択された基質とともに個体に投与され得る、生物学的でない（さもなければ所望されない）物質を意味する。
【００８４】
非経口注射に適切な組成物は、生理学的に受容可能な滅菌水溶液または非水溶液、分散剤、懸濁物、またはエマルジョン、および滅菌注射溶液または分散剤中での再構成のための滅菌粉末を含み得る。適切な水性キャリアおよび非水性キャリア、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、など）、これらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、およびオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルが挙げられる。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【００８５】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の活動を防止することは、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、などによって確保され得る。等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことがまた所望され得る。注射可能な薬学的形態の長期にわたる吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００８６】
経口投与のための固体投薬形態は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒を含む。このような固体投薬形態において、活性な化合物を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムのような少なくとも１つの不活性な慣用的賦形剤（すなわちキャリア）と、または（ａ）充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、（ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアなど）、（ｃ）湿潤剤（例えば、グリセロールなど）、（ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合シリケート、および炭酸ナトリウム）、（ｅ）溶液凝固遅延剤（例えば、パラフィンなど）、（ｆ）吸収促進剤（例えば、４級アンモニウム化合物など）、（ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコール、およびモノステアリン酸グリセロールなど）、（ｈ）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトなど）、ならびに（ｉ）潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、など）またはそれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、投薬形態はまた、緩衝化剤を含み得る。
【００８７】
類似の型の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて軟性および硬性の充填されたゼラチンカプセル中に充填剤として用いられ得る。
【００８８】
錠剤、糖衣錠、丸剤、および顆粒のような固体投薬形態は、腸溶性コーティングおよび当該分野で周知の他のコーティングのような、コーティングおよびシェルで調製され得る。これらは、不透明化剤を含み得、そしてまた遅延型様式で腸管の特定の部分に活性化合物を放出するような組成物であり得る。用いられ得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびロウ（ワックス）である。活性化合物はまた、適切な場合、上記の賦形剤の１つ以上とともに、マイクロカプセル形態中に存在し得る。
【００８９】
経口投与のための液体投薬形態は、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、当該分野で通常用いられる不活性希釈剤（例えば、水、または他の溶媒、安定化剤、および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特には、綿実油、ラッカセイ油、コーン胚油、オリーブ油、キャスターオイル（ヒマシ油）、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物））などを含み得る。
【００９０】
このような不活性な希釈剤に加えて、この組成物はまた、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味料、および香料）を含み得る。
【００９１】
懸濁液は、活性化化合物に加えて、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、これらの物質の混合物など）などを含み得る。
【００９２】
直腸投与のための組成物は、好ましくは、通常の温度では固体であるが、体温では流体であり、従って、直腸および膣の腔内では溶融して、活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤用ワックスのような、適切な非刺激性賦形剤またはキャリアとともに、本発明の化合物を混合することによって調整され得る坐剤である。
【００９３】
本発明の化合物の局所投与のための投薬形態としては、軟膏、粉末、スプレー、および吸入が挙げられる。活性成分は、必要とされ得る場合、生理学的に受容可能なキャリアおよび任意の保存剤、緩衝液、または噴霧剤とともに無菌条件下で混合される。眼科の処方物、眼の軟膏、粉末、および溶液はまた、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００９４】
用語、「薬学的に受容可能な塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ」とは、本明細書において用いる場合、本発明の化合物のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ（これらは、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、患者の組織と接触して用いるのに適切であり、合理的な利益／危険性の比と釣り合っており、そして意図する使用に有効である）、ならびに本発明の化合物の可能性のある両性イオン性形態をいう。用語、「塩」とは、本発明の化合物の、比較的、非毒性の、無機および有機の酸付加塩をいう。これらの塩は、この化合物の最終単離および精製の間、インサイチュで、または適切な有機酸または無機酸を用いてその遊離塩基形態で精製した化合物を別々に反応させ、このように形成した塩を単離することによって、調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシラート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオネート、メタンスルホネート、およびラウリルスルホネートなどが挙げられる。これらは、アルカリおよびアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど）、ならびに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミン陽イオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれに限定されない）に基づく陽イオンを含み得る。（例えば、本明細書において参考として援用されている、Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６：１〜１９を参照のこと）。
【００９５】
用語、「プロドラッグ」とは、例えば、血液中での加水分解によって、インビボで迅速に転換されて、上記の式の親化合物を生じる、化合物をいう。全体的な考察は、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＳｅｒｉｅｓのＴ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ、「Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」第１４巻、および「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に提供されている。
【００９６】
標的細胞は、代表的に、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、マーモセット、およびフェレットを含む動物の細胞である。
【００９７】
さらに、本発明の抗体または治療剤は、非溶媒和形態および溶媒和形態で（水、エタノールなどのような薬学的に受容可能な溶媒とともに）存在し得る。一般に、溶媒和形態は、本発明の目的のための非溶媒和形態と等価であると考えられる。
【００９８】
抗体分子は、代表的に、アミノ吸着もしくはアミノ親和性クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー技術、またはそれらの組み合わせを含む公知の技術で精製される。
【００９９】
本発明の別の局面は、生物学的に活性な抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体またはヒト化抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を脊椎動物に送達するにおける使用のための薬学的生成物を含む。この薬学的生成物は、薬学的に有効な量の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、またはそのフラグメント、薬学的に受容可能なキャリアを含み、そして容器は滅菌様式でこのキャリアおよび抗体を含む。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態において、薬学的に有効な量の抗ＤＲ５抗体は、標的細胞との接触によって細胞増殖を阻害する。ＤＲ５を認識する抗体またはＤＲ５を認識するヒト化抗体の薬学的に有効な量は、個体に投与されて所望の効果を生じるのに十分な量である。ＤＲ５認識抗体の薬学的に有効な量の投与による所望の効果としては、標的細胞の死、標的細胞の増殖阻害、ＤＲ５の刺激、ＤＲ５への結合、および標的細胞におけるＮＦｋＢレベルの活性の増大が挙げられる。標的細胞は、ＤＲ５を発現する細胞であり、そして例示的には、異常に増殖する細胞および腫瘍（例えば、乳頭種およびイボ）；乳癌、結腸癌、肝臓癌、白血病、肺癌、黒色腫、骨髄腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部の癌、甲状腺癌、子宮癌および脳腫瘍（例えば、星状細胞種）が挙げられる。インビボにおいて、標的細胞は、病理的状態（細胞増殖が異常であるかまたは調節不全である状態（例えば、悪性または良性の癌、および慢性関節リウマチ）を含む）を有する個体の細胞である。
【０１０１】
別の好ましい実施形態において、標的細胞はまた、治療剤と接触させられる。
【０１０２】
治療剤は、病理的状態を緩和するのに有効な化合物または組成物である。治療剤の代表例としては、抗癌化合物が挙げられる。
【０１０３】
抗癌化合物は、異常に増殖する細胞の増殖を阻害または停止するのに有効な化合物または組成物である。抗癌化合物の薬学的に有効な量は、個体に投与されて異常に増殖する細胞の増殖の阻害または停止を引きおこすのに十分な量である。抗癌化合物の代表的な例としては以下が挙げられる：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロフォスファミド、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド、６−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチン。抗癌化合物および治療剤のさらなる例は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．およびＳｌａｄｅｋら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，１９８７，Ｐｏｗｉｓら、編、Ｔａｙｌｏｒ およびＦｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に見出される。
【０１０４】
本発明の抗体は、悪性疾患の処置において、他の治療（例えば、化学療法および放射線療法）とさらに組み合わせられ得、そして治療効力は、ビシンドリルマレイミドＶＩＩＩのようなアポトーシス誘導性化合物によって増強され得る。
【０１０５】
以前に公開された抗ＤＲ５抗体（２４）と比較して、本発明の代表的ＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導性活性は非常に強力であり、そしてインビトロにおいてｐｇ／ｍｌのレベルでＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導でき、そして以前に報告された可溶性ＴＲＡＩＬと比較して優れたインビボの殺腫瘍活性を実証する。ＴＲＡ−８の単回用量の静脈内投与は、固体腫瘍および造血腫瘍細胞の両方の増殖を阻害するのに十分であるが、可溶性ＴＲＡＩＬでのインビボ腫瘍後退（退縮）の誘導には、かなり高用量（毎日５００μｇで１０日間）が必要である。本発明の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、可溶性ＴＲＡＩＬと同じ程度に安全であるようである。なぜなら、例示的な抗体ＴＲＡ−８は、非トランスフォーメーション線維芽細胞のアポトーシスを誘導しないからである。
【０１０６】
本発明のベクターは、プロモーターまたはエンハンサーのような調節エレメントに作動可能に連結された抗ＤＲ５抗体の重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む。「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列を、その通常の機能を果たすように構成した整列をいう。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントは、このポリペプチドの転写、複製、および／または翻訳を指向し得る。単一のベクターは必要に応じて、抗ＤＲ５抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンの両方のコード配列を含むことが、当業者に認識される。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明による方法および結果を例示するために以下に示される。これらの実施例は、本発明の全ての局面の包括を意図するものではなく、代表的な方法および結果を例示するにすぎない。これらの実施例は、当業者に明白である本発明の等価物およびバリエーションを排除するとは意図されない。
【０１０８】
（実施例１．ＤＲ５抗原の調製）
１．１ ＤＲ５ ｃＤＮＡのクローニング
以下を用いるＲＴ−ＰＣＲ方法によって、ヒトＤＲ５タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする：
ａ）テンプレート
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて、ＨｅＬａ細胞の総ＲＮＡを抽出する。ＰＣＲ反応のためのテンプレートとしては、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに提供された指示マニュアルに従って、このキットを用いて得たｃＤＮＡを用いた。
【０１０９】
ｂ）ＰＣＲプライマー
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ用に合成する：
５’−ｇａｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｃｔａｃｔｔｔａａｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ１：配列番号１）；
５’−ｃｃａｃｔｇｇｇｔｇａｔｇｔｔｇｇａｔｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ２：配列番号２）；
他に特定しない限り、これらの実施例における全てのオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。蒸留水中に溶解した後、全てのオリゴヌクレオチドを−２０℃で保存する。
【０１１０】
ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応溶液の組成：
テンプレートｃＤＮＡ、全量で３３μｌの反応物のうち５μｌ
プライマーＤＲ５ｐ１、１０ｐｍｏｌ；
プライマーＤＲ５ｐ２，１０ｐｍｏｌ；
１０×濃縮ＰＣＲ緩衝液（キットに添付）、１０μｌ；
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、４μｌ；および
Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５単位。
【０１１１】
滅菌蒸留水をこの溶液に加えて総量１００μｌにする。他に特定しない限り、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの等モル混合物（各２．５ｍＭ）である。
【０１１２】
ＰＣＲ反応を以下のように行う。溶液をまず、９４℃で２分加熱し、その後、９４℃３０秒、５２℃１分、および７２℃３分の加熱サイクルを４０回繰り返す。この手順終了後、この反応溶液を７２℃で１０分間加熱する。
【０１１３】
このようにして得た増幅したＤＮＡフラグメントを、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルで分離する。所望のＤＮＡフラグメントを含むと確認したバンドをカミソリの刃を用いて切り出し、そしてＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ キット（ＢＩＯ１０１）を用いて、これからＤＮＡを回収する。ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いてＤＮＡフラグメントをクローニングする。これは、以下のようにおこなう。
【０１１４】
ＰＣＲ反応溶液から回収したＤＮＡフラグメントを、５０ｎｇのｐＣＲ２．１ベクター（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに添付）とともに、１μｌの１０×リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ 塩化ナトリウム、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と混合し、ここに４単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）を添加した。混合物の総量を、滅菌蒸留水を用いて１０μｌに調節し、そして得られたリガーゼ溶液を１４℃で１５時間インキュベートする。この後、２μｌのリガーゼ反応溶液を５０μｌのコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ１０Ｆ’（ＴＡクローニングキットに添付、指示マニュアルに従ってコンピテントにされた）に添加し、ここに２μｌの０．５Ｍ β−メルカプトエタノールを添加し、そして得られた混合物を氷上で３０分間、次いで４２℃で３０秒間、そして再度氷上で５分間保持する。次に、２（ｖ／ｖ）％トリプトン、０．５（ｗ／ｖ）％酵母抽出物、０．０５（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、および２０ｍＭグルコースを含有する５００μｌの培地（本明細書中において、以降は「ＳＯＣ」培地とよぶ）を、この培養物に添加し、そしてこの混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。この後、この培養物を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む、Ｌブロス寒天プレート（１（ｖ／ｖ）％トリプトン、０．５（ｗ／ｖ）％酵母抽出物、０．５（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、０．１（ｗ／ｖ）％グルコース、および０．６（ｗ／ｖ）％ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ））上に広げる。このプレート上で出現するアンピシリン耐性コロニーを選択し、そして白金移植ループでかきとり、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬブロス中で３７℃で一晩、２００ｒｐｍで振盪しながら培養する。インキュベーション後、この細胞を遠心分離によって収集し、これからアルカリ法によってプラスミドＤＮＡを調製する。このようにして得たプラスミド由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＲ５ｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にサブクローニングする。ｐｃＤＮＡ３中の全長ＤＲ５遺伝子を配列決定し、そして公開された配列と適合させる。このようにして得たプラスミドをプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＤＲ５と名付ける。
【０１１５】
（１．２ ＤＲ５−ＩｇＧ発現ベクターの構築）
膜貫通ドメインを欠くヒトＤＲ５の可溶性形態を得るために、発現プラスミドベクターを構築した。このベクターは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＮＡ（４１）に融合されたヒトＤＲ５の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするように設計される。膜貫通ドメインを欠くヒトＤＲ５をコードするＤＮＡは、以下のＰＣＲ反応によって得られる。
【０１１６】
ａ）鋳型
ＰＣＲ反応の鋳型は、ｐｃＤＮＡ３−ＤＲ５を使用した。
【０１１７】
ｂ）ＰＣＲプライマー
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成した：
５’−ｇａｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｃｔａｃｔｔｔａａｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ１：配列番号１）；
５’−ｇｇａｔｃｃｇｔｇｇａｃａｃａｔｔｃｇａｔｇｔｃ−３’（ＤＲ５ｐ３：配列番号３）；
他に特定されない限り、これらの実施例における全てのオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、滅菌水に希釈後、−２０℃で保存する。
【０１１８】
ｃ）ＰＣＲ反応
実施例１．１（ｃ）のように、ＰＣＲ反応を行ない、そして単離したＤＮＡを増幅した。
【０１１９】
このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐＣＲ−ΔＤＲ５と命名する。ｐｍＦａｓ−ｈＩｇＧ１Ｆｃから回収された、ヒトＦｃフラグメントをコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩマルチクローニング部位にサブクローニングする。このようにして得られたプラスミドを、ｐｃＤＮＡＦｃと命名する。さらに、ｐＣＲ−ΔＤＲ５から回収された、ヒト可溶性ＤＲ５領域をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡＦｃプラスミドのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングする。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐｃＤＮＡΔＤＲ５−Ｆｃと命名する。ｐｃＤＮＡΔＤＲ５−Ｆｃプラスミドから回収されたヒト可溶性ＤＲ−５ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域をコードするＥｃｏＲＩフラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を使用して平滑末端化し、次いでＢａｍＨＩによる切断後に平滑末端となっているシャトルベクターｐＡｄＣＭＶ５（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）にサブクローニングする。このようにして得られたプラスミドをｐＡｄΔＤＲ５−Ｆｃと命名する。
【０１２０】
（１．３ ヒトＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の発現および精製）
ＱＢＩ−２９３Ａ細胞（ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ Ｋｉｔで提供される）を、取扱説明書に従って、ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔキット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ｐＡｄΔＤＲ５−ＦｃおよびＱＢＩウイルスＤＮＡ（ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ Ｋｉｔで提供される）を用いて同時トランスフェクトする。組換えウイルスプラークを培養し、そして、上清のＥＬＩＳＡ分析によってＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質の発現についてスクリーニングする。陽性プラークを、ＱＢＩ−２９３Ａ細胞中で増殖し、そしてウイルスストックとして−８０℃で保存する。５０個のシャーレ（１５０ｍｍ）のＱＢＩ−２９３Ａ細胞を、１０ｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）で、ｐＡｄΔＤＲ５−Ｆｃ組換えウイルスを用いてトランスフェクトする。培養培地を、４８時間のトランスフェクション後に収穫する。
【０１２１】
ＤＲ５−ＩｇＧ遺伝子を有するトランスフェクトした細胞を、５％ｖ／ｖ ＣＯ２の雰囲気下で３７℃で２日間、１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含む、５００ｍｌのＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地中でのインキュベーションによって１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖する。次いで培養物を遠心分離し（１，０００ｒ．ｐ．ｍ．、５分）そして上清を回収する。上清からのＤＲ５−ＩｇＧの精製は、以下の条件下で、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して達成する：
カラム：プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（カラムサイズ２ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；
溶出緩衝液：０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ；
中和緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）。
【０１２２】
全ての上清をカラムに適用した後、２０ｍｌのＰＢＳを用いて３回洗浄し、次いで１ｍｌの溶出緩衝液を１０回添加する。各溶出画分（１ｍｌ）の吸光度を測定する。２回目の画分から５回目の画分（ＯＤ２８０≧０．１を有する）を回収し、そして１００μｌの中和緩衝液の添加後、溶出液を別々に透析チュービングに配置し、そして溶出液を、４℃で、１リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して透析する。透析緩衝液は、２度交換する。
【０１２３】
次いで、溶出液を、ＥＬＩＳＡによってＤＲ５−ＩｇＧ遺伝子産物の発現についてアッセイする。まず、１００μｌの各画分を、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏａｔａｒ）のウェルに別々に配置し、そして３７℃で１時間インキュベートする。この時間後、ウェル中の溶液を除去し、そしてプレートを、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０（以下に「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」として称する）を含む１００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて３回洗浄する。洗浄後、２％ ｗ／ｖウシ血清アルブミン（以下に「ＢＳＡ」として称する）を含むＰＢＳを、１００μｌ／ウェルの量で添加し、次いでこのプレートを、３７℃で１時間インキュベートする。この時間後、ウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄し、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０００倍希釈した抗ヒトＩｇＧＩモノクローナル抗体の１００μｌ／ウェルの溶液を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートをもう１度、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、ウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄する。次いで、３，３’５，５’−テトラメチル−ベンジジン（以下で「ＴＭＢ」として称される）液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェルの量で添加し、そしてプレートを、５分間室温で静置し、次いで、１００μｌ／ウェルの０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止する。コントロールの読み取りとして６５０ｎｍの吸光度を使用して、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取り、結合した抗体の濃度を推定する。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定する。ＤＲ５−ＩｇＧ１の生成は、このＥＬＩＳＡ方法を使用して確認する。発現されたＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の分子量を、抗ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を使用してゲル上の抗体を検出するウエスタンブロッティング分析を使用して、決定する。発現されたＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の分子量は、約５０ｋＤａの分子量を有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析およびクマシーブルー染色によるタンパク質の検出によって評価されるように、９０％を超える純度が達成される。
【０１２４】
（実施例２．ヒトＤＲ５に対するモノクローナル抗体の生成）
（２．１ 免疫化）
６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、アフィニティー精製したヒトＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質を用いて免疫する。初回のフットパッド（ｆｏｏｔ−ｐａｄ）免疫のために、融合タンパク質（５０μｇ）を、フロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で乳化する。次いで、マウスを１日おきにアジュバントなしで投与された５０μｇの融合タンパク質の４回の注射で追加免疫する。最後の注射の３日後、局所的なリンパ節由来のリンパ球を、ＮＳ−１黒色腫細胞と融合させ、そしてハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清を用いて補充したＦ１０４培地中で培養する。陽性のハイブリドーマを、プレートが１μｇ／ｍｌ ＤＲ５／ｈＩｇＧ１またはコントロールとして同じ量のＦａｓ／ｈＩｇＧ１のいずれかを用いてコーティングされた、ＥＬＩＳＡによって選択する。ハイブリドーマのアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイプ特異的ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）のパネルを使用するＥＬＩＳＡによって決定する。モノクローナル抗体を、免疫抗マウスＩｇＧ１またはプロテインＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【０１２５】
（２．２ 細胞融合）
追加免疫注入後、３日目に、局所的リンパ節を、マウスから取り出し、５０ユニット／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、および３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸を含む１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に配置し、そしてスパチュラを使用して器官をメッシュ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｆａｌｃｏｎ）を通過させることによって破壊する。得られた細胞懸濁液を、遠心分離して局所的リンパ節細胞をペレット化し、次いで、これらの細胞を、無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄する。次いで、洗浄した細胞を、無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、そしてカウントした。
【０１２６】
合間に、黒色腫ＮＳ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴＩＢ−１８）を、５％ｖ／ｖ ＣＯ２下３７℃で、１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＡＳＦ１０４培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．）（「血清を含むＡＳＦ培地」）で、１×１０８細胞／ｍｌを超えない細胞密度まで増殖させ、そしてこれらを同様に、破壊、洗浄、再懸濁および計数した。
【０１２７】
３×１０７細胞を含むように計算されたＮＳ１細胞懸濁液の量を、３×１０８細胞を含むように計算された脾臓細胞懸濁液の量と混合する。得られた混合物を遠心分離し、そして上清を捨てる。以下の細胞融合の工程を、ペレットを含むプラスチックチューブを、温水のビーカー中で常時３７℃に維持する間に、行なう。
【０１２８】
次いで、１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を、ピペットの先端を使用してペレットを撹拌する間中、ゆっくりとチューブに添加する。引き続き、１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地（３７℃に予め温められている）を、２回に分けてゆっくりと添加し、その後、さらに７ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地を添加する。次いで、得られた混合液を遠心分離し、上清を捨て、そして１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含む１０ｍｌのＨＡＴ培地を、ピペットの先端でゆっくりと撹拌しながら、添加する。１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含む２０ｍｌのＨＡＴ培地をさらに添加し、そして上清を、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養マイクロプレートに分配し、そして５％ ｖ／ｖ ＣＯ２の雰囲気下で３７℃でインキュベートする。７または８日後、１００μｌ／ウェルの新しいＨＡＴ培地を使用して、黄色がかった色を示す任意のウェルにおいて培地を交換する。これらのウェル由来の融合細胞を、以下に記載されるように限界希釈によってクローニングする。
【０１２９】
（２．３ 限界希釈によるクローニング）
４〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）由来の胸腺を取り出し、上記のようにメッシュ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｆａｌｃｏｎ）で破壊し、そして破壊された細胞を、１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含むＨＴ培地で２回洗浄する。一匹のマウスに由来する胸腺細胞の量に対応する量を、１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含む３０ｍｌのＨＴ培地中に懸濁し、フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞懸濁液を生成する。上の実施例２．２において得られた融合細胞調製物を、このフィーダー細胞懸濁液を用いて１０〜１００倍に希釈し、そして、フィーダー細胞懸濁液を用いてさらに連続希釈し、５細胞／ｍｌ、１細胞／ｍｌおよび０．５細胞／ｍｌの融合細胞密度を有する懸濁液を作製する。このようにして調製したサンプルを、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルに分配し、そして５％ ｖ／ｖ ＣＯ２下３７℃で５日間インキュベートする。
【０１３０】
（２．４ スクリーニング）
増殖するハイブリドーマ由来の培養物上清を、１μｇ／ｍｌ ＤＲ５／ｈＩｇＧ１またはコントロールとしての同じ量のＦａｓ／ｈＩｇＧ１（４１）のいずれかでコーティングしたプレートを使用するＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。結合した抗体を、基質としてＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗マウス免疫グロブリン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用して検出する。１μｇ／ｍｌの濃度の精製されたＤＲ５−ＩｇＧ１または同じ量のＦａｓ−ｈＩｇＧ１を、９６ウェルＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ ＳＴＲＩＰ ＰＬＡＴＥ（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ）のウェルに導入する。プレートを、４℃で一晩静置させ、タンパク質のウェル表面への吸着を可能にする。この時間後、ウェル中の溶液を捨て、そして各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄する。次いで、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ａ３８０３；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．）を含む１００μｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、そしてプレートを、１時間３７℃でインキュベートする。次いで、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いてさらに３回洗浄し、次いで、増殖するハイブリドーマ由来の５０μｌの各培養物上清を、各ウェルに添加する。次いで、プレートを、１時間３７℃でインキュベートし、そしてウェルを再び、ＢＰＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄する。洗浄後、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）（ＰＢＳで１０００倍希釈した）をウェル毎に添加し、そしてプレートを再び３７℃で１時間インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄する。次いで、３，３’５，５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェルの量で添加し、そしてプレートを、５分間室温で静置し、次いで、１００μｌ／ウェルの０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止する。４５０ｎｍ（コントロール６５０ｎｍ）での各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、融合細胞を、融合細胞上清が添加されていないもの（ＯＤ値；約０．０３）より明らかに高い吸光度（４５０ｎｍ−６５０ｎｍ、ＯＤ値；＞０．５）を有したサンプルから選択する。さらに、増殖するハイブリドーマからの培養物上清はまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用するアポトーシス誘導活性を測定することによって機能的にスクリーニングされる。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ウェル当り１０００細胞）および５μＭ ビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ，Ａｌｅｘｉｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む５０μｌのＲＰＭＩ培地を、増殖するハイブリドーマ由来の５０μｌの培養物上清の存在下で、９６ウェルプレートに添加する。細胞を、３７℃の一晩加湿インキュベーター中で、インキュベートする。アポトーシスは、製造業者（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって指示されるようにＡＴＰＬｉｔｅキットを使用する細胞生存率によって決定し、そしてサンプルを、ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して計数する。
【０１３１】
（２．５ ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８のレセプターへのＥＬＩＳＡ結合）
ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌのＤＲ４−ＩｇまたはＤＲ５−Ｉｇ融合タンパク質を用いて一晩コーティングする。３％ＢＳＡを用いてブロッキングした後、可溶性ＴＲＡＩＬ−ＦＬＡＧまたはＴＲＡ−８を示された濃度で添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の結合を、それぞれ、ＨＲＰ結合体化抗Ｆｌａｇ抗体（Ａｌｅｘｉｓ）またはＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出する。反応は、ＴＭＢ基質緩衝液によって発生し、そしてＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定する。Ｋｄ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する、１部位結合モデルの非線形回帰によって推定する。競合的ＥＬＩＳＡについて、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡＩＬ−ＦＬＡＧを添加し、そして種々の濃度のＴＲＡ−８の存在下でインキュベートする。ＴＲＡＩＬの結合を、上のように決定する。
【０１３２】
（２．６ クローニング）
上の実施例２．３および２．４に記載される工程を、２．４において選択される細胞について５回繰り返す。それにより、いくつかのハイブリドーマクローンの選択を可能にし、クローンの各々は、ＤＲ５−ＩｇＧに結合するがＦａｓ−ＩｇＧに結合しない単一抗体を産生した。この選択手順の結果として、マウス−マウスハイブリドーマ（ＴＲＡ−８と命名され、ＤＲ５−ＩｇＧに結合するがＦａｓ−ＩｇＧに結合しない抗体を産生する）を得る。このハイブリドーマ（ＴＲＡ−８）は、２０００年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして登録番号ＰＴＡ−１４２８が割り当てられている。
【０１３３】
マウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８（以下に簡単に「ＴＲＡ−８」として称される）によって産生される抗体のサブクラスは、モノクローナル抗体アイソタイプ決定（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる試験後、ＩｇＧ１、κであることが示されている。
【０１３４】
免疫原として本発明者らのヒトＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質を使用して、７つのハイブリドーマクローンを、最初のＥＬＩＳＡスクリーニングによって得、それらの全ては、ＤＲ５−ＩｇＧについて強力に陽性であるが、Ｆａｓ−ＩｇＧ融合タンパク質についてはそうでなかった。このことは、得られたハイブリドーマは、ＤＲ５の細胞外部分を認識するが、ＩｇＧ１のＦｃ部分は認識しない（データは示されていない）抗体を産生することを示す。
【０１３５】
（２．７ ウエスタンブロット分析）
正常なヒト組織および癌組織のホモジネートのウエスタンブロット分析のためのフィルターを、Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入する。各レーンを、抗β−アクチン抗体によって決定されるように、当量のタンパク質でロードする。ブロットを、１μｇ／ｍｌ ＴＲＡ−８を用いて一晩プローブし、次いで室温で１時間、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によってプローブし、そして化学発光によって現像した。
【０１３６】
（２．８ インサイチュ免疫組織化学）
ヒト組織を、Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ＵＡＢから得る。凍結した切片を、７０％エタノール中で固定し、ＰＢＳ中の１０％ウマ血清でブロックし、次いで室温で６０分間、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ＴＲＡ−８と共にインキュベートする。比色基質としてのジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に、抗マウスＩｇＧ ＡＢＣキットを使用して、反応性を可視化する。
【０１３７】
（２．９ カスパーゼ活性化の分析）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０６／ｍｌ）を、５００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡ−８と共にインキュベートする。細胞溶解物のアリコート（３０μｇのタンパク質）を、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ナイロン膜上にブロットし、そしてブロットを、抗カスパーゼ８抗体、抗カスパーゼ９抗体、および抗カスパーゼ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてプローブし、その後ＨＲＰ結合体化二次抗体および切断産物の化学発光の可視化が続く。これらのカスパーゼインヒビターセットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入する。各カスパーゼインヒビターを、示された濃度で培養物に添加する。
【０１３８】
（実施例３．ＴＲＡ−８モノクローナル抗体の精製）
マウス−マウスハイブリドーマ（ＴＲＡ−８）を、５％ ｖ／ｖ ＣＯ２下３７℃で５日間、１０％ ｖ／ｖ ＦＣＳを含む５００ｍｌのＡＳＦ培地中でのインキュベーションによって、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖する。次いで培養物を遠心分離し（１，０００ｒ．ｐ．ｍ．、５分）そして上清を回収する。上清からのＴＲＡ−８の精製は、以下の条件下で、プロテインＧ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して達成する：
カラム：プロテインＧ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（カラムサイズ２ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；
溶出緩衝液：０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ；
中和緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）。
【０１３９】
全ての上清をカラムに適用した後、２０ｍｌのＰＢＳを用いて３回洗浄し、次いで１ｍｌ容積の溶出緩衝液を１０回添加する。各溶出画分（１ｍｌ）の吸光度を測定する。２回目の画分から５回目の画分（＞ＯＤ２８０＝０．１）を別々に回収する。
【０１４０】
１００μｌの中和緩衝液の添加後、溶出液を別々に透析チュービングに配置し、そして溶出液を、４℃で、１リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して透析する。透析緩衝液は、２度交換する。このサンプルを、上記の技術を使用して、上で調製されたヒトＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって、抗ＤＲ５抗体活性についてアッセイする。
【０１４１】
（実施例４．ＤＲ４抗原の調製、ＤＲ４−ＩｇＧ発現ベクターおよび抗ＤＲ４モノクローナル抗体）
実施例１〜３の手順を、実施例１において詳細に説明されたものの代わりに、ＤＲ４鋳型ｃＤＮＡおよびプライマーを用いて繰り返し、ＤＲ４抗原を得る。この抗原を、実施例１．２〜３に利用されるように利用して、ＤＲ４に特異的なモノクローナル抗体を得る。
【０１４２】
（実施例５．ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対するモノクローナル抗体）
モノクローナル抗体を、実施例１のようなそれぞれの抗原を作製するために対応するｃＤＮＡおよびプライマーを交換することによって、おとりレセプターＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対して惹起する。免疫グロブリンＧとのＤｃＲ１融合物またはＤｃＲ２融合物についての発現ベクターおよび得られた精製モノクローナル抗体を、実施例２および３のように作製する。
【０１４３】
（実施例６．モノクローナル抗体の特異性）
ＴＲＡＩＬに対するレセプターの全てと、ＴＮＦＲファミリーの他のタンパク質とは、有意な相同性を共有するので、ＤＲ５に対する例示的な抗体ＴＲＡ−８の特異性は、２つの異なるヒトＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質、および他の関連するタンパク質の可溶性組換え形態を使用する、ウェスタンブロット分析によって決定される。第１のＤＲ５−Ｉｇ融合タンパク質は、ＤＲ５の細胞外部分の残基１〜１８０由来のｃＤＮＡと、ヒトＩｇＧ１の定常領域をコードするｃＤＮＡとを融合させることによって、構築される。融合ｃＤＮＡを、組換えアデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）にクローニングする。発現したＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質（これは、５０ｋＤａの相対分子量を有した）を、抗ヒトＩｇＧアフィニティーカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して精製する。特異性のウェスタンブロット分析のために、第２の組換えヒトＤＲ５／ＩｇＧ１融合タンパク質（アミノ酸５２〜２１２）、ならびにＴＲＡＩＬ−Ｒ１融合タンパク質、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３融合タンパク質およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４融合タンパク質を、Ａｌｅｘｉｓから購入する。ヒトＦａｓおよびＴＮＦＲ１の可溶性形態は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡのＤｒ．Ｃａｒｌ Ｅｄｗａｒｄｓから寄贈された。使用した可溶性の組換えヒトＤＲ４分子、ＤｃＲ１分子、ＤｃＲ２分子、ＴＮＦＲ１分子、Ｒ４分子、およびＦａｓ分子は、ヒトＩｇＧ１融合タンパク質である。０．５μｇの各タンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロース膜にブロットする。これらのブロットを、ＰＢＳ中５％ドライミルクで室温で１時間ブロックし、そして１μｇ／ｍｌの精製モノクローナル抗ＤＲ５抗体（クローン：ＴＲＡ−８）または０．１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧで、４℃で一晩プローブする。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧを、二次抗体として使用して、結合したＴＲＡ−８を検出する。これらのブロットを、化学発光によって現像する。
【０１４４】
全長ＤＲ５またはＤＲ４を含むｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）あるいは空のベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞を、フローサイトメトリー分析に使用する。ヒトＴＲＡＩＬまたはマウスＦａｓリガンドをコードする全長ｃＤＮＡを、テトラサイクリン制御プロモーターの下流で、ｐＴＲＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングする。ｐＴＲＥ−ｈＴＲＡＩＬまたはｐＴＲＥ−ｍＦａｓＬのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、アデノウイルスシャトルベクターｐＡｄＢＮ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にさらにクローニングする。２９３宿主細胞を、線形化ｐＡｄ−ＴＲＥ−ｈＴＲＡＩＬまたはｐＡｄ−ＴＲＥ−ｍＦａｓＬおよびアデノウイルスのラージフラグメントＤＮＡで同時トランスフェクトする。機能的なヒトＴＲＡＩＬリガンドまたはマウスＦａｓリガンドの、組換えウイルスプラークからの発現を、標的としてＪｕｒｋａｔを用いる５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、スクリーニングする。
【０１４５】
ＴＲＡ−８は、図１ａのＤＲ５，＃１に示すように、ＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質（約５０ｋＤａ）（これは、免疫のために使用される）と強く反応し、そして図１ａのＤＲ５，＃２に示すように、第２のＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質（約６０ｋＤ）と弱く反応した。ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、Ｆａｓ（ＣＤ９５）またはＴＮＦＲＩに対するＴＲＡ−８の顕著な結合は、存在しない。これらの結果は、ＴＲＡ−８が、ＤＲ５に対しては特異的であるがこのファミリーの他のメンバーによっては共有されないエピトープを認識することを示す。
【０１４６】
ＴＲＡ−８は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの他のメンバー（例えば、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびＴＮＦレセプターＩ）と反応せず、そしてＴＲＡ−８はまた、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍに対する光学吸光度比（ここで、下側のパネルに１〜７の番号を付ける）によって示されるように、ＤＲ５のマウスホモログと交差反応しない（図１Ａ、下側のパネルの列８）。可溶性のＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８は、不動化されたＤＲ５に同等に結合した（図１ｂ、左側のパネル）。対照的に、ＴＲＡＩＬはＤＲ４に結合したが、ＴＲＡ−８はＤＲ４に対するいかなる結合活性をも示さなかった（図１ｂ、中央のパネル）。ＤＲ５に対するＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８の結合に関するＫｄ値を、それぞれ５９ｎＭおよび３ｎＭで推定する。重要なことには、競合ＥＬＩＳＡにおいて示されるように、ＴＲＡ−８は、ＤＲ５への結合に関してＴＲＡＩＬと効率的に競合するが、ＤＲ４への結合に関しては競合しない（図１ｂ、右側のパネル）。これらの結果は、ＴＲＡ−８のヒトＤＲ５に対する特異性を立証する。
【０１４７】
ＴＲＡ−８は、全長ヒトＤＲ５でトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の細胞表面への特異的結合を示すが、ＤＲ４または空のベクターでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の細胞表面への特異的結合を示さない、フローサイトメトリー分析を用いて、ＤＲ５の細胞表面発現を検出し得る（図１ｃ）。同様に、ＴＲＡ−８を用いるインサイチュ免疫組織化学は、全長ＤＲ５ ＤＮＡでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞との反応性を実証したが、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞との反応性を示さなかった（図１ｄ）。ＴＲＡ−８は、トランスフェクトされていないＣｏｓ−７細胞のアポトーシスを誘導せず、そしてＣｏｓ−７細胞由来のＲＮＡの、ヒトＤＲ５をコードするプライマー対を用いるＲＴ−ＰＣＲは、特異的なＰＣＲ産物を示さなかった。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を標的として使用する、さらなる機能的分析は、架橋の非存在下においては、ＴＲＡ−８は細胞死を「強く」誘導することを示した。このことは、ＡＴＰＬｉｔｅ、ＭＴＴおよびＰＩの排除を含む、細胞の生存力に関する３つの異なるアッセイによって実証される（図１ｅ）。ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって示される場合に、５０％より多くのＪｕｒｋａｔ細胞が、ナノグラムのレベルのＴＲＡ−８によって殺傷される。ＴＲＡ−８の殺傷活性は、ＤＲ５に対して特異的である。なぜなら、これはＤＲ５−Ｉｇによってブロックされ得たが、ＤＲ４−Ｉｇ融合タンパク質によってはブロックされ得なかったからである（データは示さない）。カスパーゼ８、９、および３の切断は、ウェスタンブロット分析によって、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＲＡ−８処理の３０分後ほどに早期に（図１ｆ）検出され得、そしてＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死は、一般的なカスパーゼインヒビター（Ｚ−ＶＡＤ）によって完全に阻害される（図１ｇ）。カスパーゼ８、３、６、および１０に対する個々のカスパーゼインヒビターは、細胞死を部分的に阻害した。このことはさらに、ＴＲＡ−８によって媒介される細胞死が、主としてカスパーゼ依存性のアポトーシス機構を介することを示す。
【０１４８】
（実施例７．細胞表面ＤＲ５の発現のフローサイトメトリー分析：多くの腫瘍細胞に存在するが正常細胞には存在しない、主要な死レセプター）
次いで、ＴＲＡ−８が、細胞表面において発現されたＤＲ５を結合する能力、およびこの反応の特異性を、全長ヒトＤＲ５もしくはＤＲ４ ｃＤＮＡを含む発現ベクターまたはコントロールとして空のベクターでトランスフェクトされた、ＣＯＳ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）細胞を使用して、評価する。フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、第２の抗体として使用して、結合したＴＲＡ−８を検出する。１×１０４の細胞の蛍光を、以下の条件下で、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）を使用して測定する：
励起波長：４８８ｎｍ；
検出波長：６００ｎｍ。
【０１４９】
フローサイトメトリー分析は、図１ｃの塗りつぶされたヒストグラムに示すように、ＴＲＡ−８が、ＤＲ５でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の約３０％を染色したことを示した。この割合は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用するトランスフェクションの分析によって決定されるトランスフェクション効率と平行である（データは示さない）。ＴＲＡ−８は、ＤＲ４（白抜きのヒストグラム）またはコントロールベクター（点描ヒストグラム）のいずれかでトランスフェクトされた細胞を顕著には染色しなかった。このことは、ＴＲＡ−８が、細胞表面ＤＲ５に対して特異的であることを示す。
【０１５０】
腫瘍細胞におけるＤＲ５発現は、ｍＲＮＡレベルで広範に研究されてきたが（Ｒｉｅｇｅｒ Ｊ．ら、１：ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９８ ５月１日；４２７（１）：１２４−８）、ＤＲ５の表面発現は、十分には理解されていない。Ｇｉｂｓｏｎ Ｓ．Ｂ．ら、１：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０００年１月；２０（１）：２０５−１２；Ｋｉｍ Ｋ．ら、１：Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００年２月；６（２）：３３５−４６。従って、モノクローナル抗ＤＲ５抗体のアベイラビリティーは、ＤＲ５の表面レベルを試験すること、およびこの発現を細胞のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する感受性と相関付けることを可能にする。細胞（１×１０６）の引き続くパネルを、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したＴＲＡ−８と共に、室温で３０分間インキュベートし、次いでＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、さらに３０分間染色する。１０，０００の生存可能な細胞を、ＦＡＣＳバンテージフローサイトメーターを使用して、以下の条件下で分析する。
【０１５１】
励起波長：４８８ｎｍ；
検出波長：６００ｎｍ。
【０１５２】
試験された５つの造血細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＥＭ−６細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、Ｈ−９細胞、およびＵ９３７細胞である。ＤＲ５発現は、図２ａおよび２ａ’に示すように、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＥＭ−６細胞、Ｈ−９細胞、およびＵ９３７細胞の表面において検出可能であるが、Ｍｏｌｔ−４細胞においてはほとんど検出不可能である。高レベルのＤＲ５ ＲＮＡ発現が、以前に記載されたが（４３）、ＦＡＣｓ分析は、これらの細胞が高レベルの表面ＤＲ５を発現しないことを示した。これらの結果は、ＤＲ５の細胞表面発現が、ＤＲ５の転写発現と相関しないことを示し、このことは、このようなレセプターに関しては予測されないことではない。ＤＲ５の細胞表面発現のレベルは、細胞株特異的であり得る。なぜなら、造血起源の細胞の大部分は、低レベルのＤＲ５を発現し、一方で大部分の神経膠腫細胞および前立腺細胞は、高レベルのＤＲ５を発現したからである。
【０１５３】
ＴＲＡ−８モノクローナル抗体を使用して、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの誘導におけるＤＥ５の役割を、その細胞表面発現を異なる型のヒト腫瘍細胞のパネル間およびＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対するこれらの細胞の感受性を試験することによって、決定する。始原末梢血液Ｔ細胞は、有意なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現しなかった。そしてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して抵抗性である（図２ａ、２ａ’、および３ａ’）。試験されたヒトＴ白血病細胞株の５つ全てが、検出可能であるが比較的低レベルの細胞表面ＤＲ５を発現したが、これらの２つ（ＪｕｒｋａｔおよびＣＥＭ−６）は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して、高度に感受性である。このことは、ＤＲ５単独で、これらの細胞のアポトーシスを誘導するために十分であることを示す。Ｍｏｌｔ−４細胞およびＵ９３７細胞は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して部分的に感受性であるが、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対しては比較的抵抗性である。このことは、他のＴＲＡＩＬレセプターが、アポトーシスシグナルの伝達に関与し得ることを示唆する。Ｈ−９細胞は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して抵抗性である。このことは、細胞内抗アポトーシス経路によって媒介されるブロックを暗示する。
【０１５４】
細胞のパネルは、ヒト悪性神経膠腫細胞株、Ｈｓ６８３、Ｕ２５１ＭＧ、Ｄ３７ＭＧ、Ｄ５４ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、ＣＨ２３５ＭＧ、Ｕ８７および正常なヒト星状細胞を含み、これらは、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌａｂａｍａのＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔのＤｒ．Ｙａｎｃｅｙ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅにより寄贈された。ヒト前立腺癌細胞株Ｄｕ１５４、ＰＣ３およびＬｎＣａｐは、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌａｂａｍａのＰａｔｈｏｌｏｇｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔのＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｇｒｉｚｚｌｅにより寄贈された。この博士は、これらの細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ヒト白血病Ｔ細胞株、Ｂ細胞株リンパ腫、ＨｅｐＧ２ Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴＩＢ−１５２）およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ ＣＥＭ−６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＣＬ−１１９）；単球細胞株、Ｕ９３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ−２３６７）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。上記細胞株の全てを、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養する。ヒト星状細胞株１３２１Ｎ１は、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌａｂａｍａのＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔのＤｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊｏｐｅから寄贈され、これを５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１５５】
可溶性組換えヒトＴＲＡＩＬ（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した）は、ＦＬＡＧタグにＮ末端で融合したヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン（アミノ酸残基９５〜２８１）および８アミノ酸のリンカーペプチドからなる融合タンパク質である。以前に報告されたＨｉｓタグＴＲＡＩＬとは異なり、ＴＲＡＩＬのこの調製物は単独では、Ｊｕｒｋａｔ細胞において強いアポトーシス応答を誘導せず、そしてアポトーシスを増強するための架橋剤として、抗ＦＬＡＧ抗体を必要とする。抗ＦＬＡＧ抗体もまた、Ａｌｅｘｉｓから購入した。
【０１５６】
試験した１０のヒト悪性神経膠腫細胞の全ては、細胞表面において、検出可能なレベルのＤＲ５を発現した。大部分が、図２ｂに示すように、中レベルから高レベルのＤＲ５を発現した。３つの株Ｄ−５４ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧおよびＣＨ−２３５ＭＧは、高レベルのＤＲ５を発現し、一方で６つの株Ｈｓ−６８３、Ｕ２５１−ＭＧ、Ｄ３７−ＭＧ、Ｕ８７、ＳＭＫ１および１３２１Ｎ１は、中レベルのＤＲ５を発現した。１つのみの細胞株Ｈ−４６５は、低レベルのＤＲ５を発現した。３つ全ての前立腺癌細胞株は、図２ｃに示すように、高レベルのＤＲ５を発現した。
【０１５７】
正常な始原Ｔ細胞のように、始原Ｂ細胞は、有意なレベルのＤＲ５を発現せず、そしてＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれでの処理の後にも、アポトーシスを起こさなかった（図２ｄ）。試験した４つのＢリンパ球細胞株のうちの３つ（ＳＫＷ６．４、ＥＢ−３、およびＲａｊｉ）が、比較的高レベルのＤＲ５を発現し、そしてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して、非常に感受性である。第４の細胞株Ｄａｕｄｉは、非常に低レベルのＤＲ５を発現し、そしてＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８によって媒介されるアポトーシスに対してさほど感受性ではない。始原星状細胞は、検出可能なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現しなかったが（図２ｂ’）、試験した４つ全ての神経膠腫細胞株は、高レベルのＤＲ５を発現した。Ｔ細胞またはＢ細胞においてより高レベルの、神経膠細胞におけるＤＲ５の発現は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスおよびＤＲ５媒介アポトーシスに対する有意により大きな感受性を付随せず、このことは、ＤＲ５の細胞表面発現のレベルが、腫瘍細胞のアポトーシスのレベルと必ずしも相関しないことを示唆する。ＤＲ４、ＤＲ５およびＤｃＲ２のメッセージレベルを決定するために実施されるＲＴ−ＰＣＲは、試験した全ての細胞におけるメッセージを検出した（表１）。しかし、一般に、始原正常細胞は、形質転換した腫瘍細胞と比較して、比較的低レベルのＤＲ５を発現した。
【０１５８】
【表１】
Figure 0004156238
＊全ＲＮＡを細胞から単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲを、方法に記載されるように実施した。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで分離し、そしてＦｌｏｕｒ−Ｓ ＭＡＸ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって分析した。これらの値は、β−アクチンに対する比として表される。
【０１５９】
（実施例８．悪性細胞におけるインビトロでのアポトーシスの誘導）
ＴＲＡ−８が形質転換された細胞においてインビトロでアポトーシスを誘導するか否かを決定するために、全てのＤＲ５陽性腫瘍細胞を、ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬのいずれかによって誘導されるアポトーシスに対するこれらの感受性に関して試験した。
【０１６０】
標的細胞（１ウェルあたり１×１０３）を、９６ウェルプレートにおいて、示される濃度の可溶性ＴＲＡＩＬおよび架橋剤（Ａｌｅｘｉｓ）またはＴＲＡ−８の存在下で、３７℃で一晩培養する。細胞の生存力を、（１）製造業者（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）の指示に従って、ＡＴＰＬｉｔｅキット；（２）ＭＴＴ Ｃｅｌｌ増殖／生存力キット（Ｓｉｇｍａ）；または（３）死細胞のＰＩ染色およびフローサイトメトリーによる分析を使用して、決定する。培養の終了時に、細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＩで染色し、そしてＰＩ陰性細胞を、生存可能な細胞としてゲートする。肝細胞の濃縮した核の分析のために、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３５２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析する。
【０１６１】
ＴＲＡ−８抗体は、悪性ヒト神経膠腫細胞株の大部分（９／１０）、３つの前立腺癌細胞株のうちの２つ、および４つのＤＲ５陽性造血細胞株のうちの２つにおいて、アポトーシスを誘導し得る。この抗体は、ほとんど検出不可能な細胞表面レベルのＤＲ５を発現したＭｏｌｔ−４細胞株においては、アポトーシスを誘導しなかった。しかし、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対する細胞の感受性のレベルは、細胞株間で顕著に変動した。
【０１６２】
ＴＲＡ−８抗体誘導アポトーシスに対する細胞の感受性の変動性は、ＤＲ５の最低レベルの細胞表面発現が必要とされるが、ＤＲ５の細胞表面発現のレベルは、必ずしも、感受性およびこのプロセスに影響を与える他の因子の主要な決定因子ではないことを示唆する。神経膠腫細胞の全てが、一般に、造血細胞が発現したより有意に高レベルの表面ＤＲ５を発現したが、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対する神経膠腫細胞の感受性は、造血細胞と比較して、比例的には増加しない。図３ｂに示すように、ＴＲＡ−８誘導アポトーシスに対する５つの神経膠腫細胞株（Ｄ−３７ＭＧ、Ｄ５４−ＭＧ、Ｕ３７３−ＭＧ、ＣＨ２３５−ＭＧおよび１３２１Ｎ１）の感受性は高く、そしてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するこれらの感受性と等価である。神経膠腫細胞株のうちの２つ（Ｈ−４５６およびＳＭＫ１）は、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対してさほど感受性ではない。Ｈ−４５６細胞の場合には、ＤＲ５の表面発現が低い；しかし、ＳＭＫ１におけるＤＲ５の表面発現は、より感受性の細胞株と類似であり、このことは、他の機構が、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する感受性を決定する際に、役割を果たし得ることを示唆する。図３ｃに示すように、３つ全ての前立腺癌細胞株が、高レベルのＤＲ５を発現したが、Ｄｕ１４５細胞が、ＴＲＡ−８誘導アポトーシスに対して最も感受性であり、ＰＣ３細胞は、部分的に感受性であり、一方でＬｎＣＡＰ細胞は、完全に抵抗性である。図２ａに示すように、造血細胞のうちで、ＪｕｒｋａｔおよびＣＥＭ−６が、ＴＲＡ−８アポトーシスに対して非常に感受性であることが見出されたが、これらの細胞の両方が、低レベルのＤＲ５を発現することが見出されている。ＤＲ５は、Ｕ９３７細胞において検出可能であるが、これらの細胞は、ＴＲＡ−８誘導アポトーシスに対して抵抗性である。同様に、Ｈ−９細胞は、検出可能なレベルのＤＲ５を発現したが、Ｈ−９細胞は、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対して抵抗性である。これらの結果は、ＤＲ５媒介アポトーシスに影響を与える調節機構の存在を暗示した。
【０１６３】
さらなる表面結合抗ＤＲ５抗体を、実施例１〜３の手順に従って生成する。２つのさらなる抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−１およびＴＲＡ−１０と示される）を、ＴＲＡ−８と共に研究して、アポトーシスを誘導する比較能力、および従ってＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するアゴニストとして作用するかまたは逆にブロックし、これによってアンタゴニストとして作用する比較能力を、決定する。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を、３つの抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−１、ＴＲＡ−８およびＴＲＡ−１０と示される）のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト活性を決定するための標的として、使用する。図４に示すように、細胞の生存力は、１ｍｌあたり２．５μｇで一晩インキュベートした場合に、ＴＲＡ−１０、ＴＲＡ−１およびＴＲＡ−８についてそれぞれ約９０％、７０％および２０％である。ＴＲＡ−８は、用量依存性の様式で、強いアポトーシス応答を誘導し、一方で、ＴＲＡ−１は、中程度のアポトーシス応答のみを誘導し、そしてＴＲＡ−１０は、弱い応答のみを誘導した。従って、ＴＲＡ−８は、アゴニスト抗ＤＲ５抗体と分類される。図４において、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の生存力は、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスの用量依存性関数として示される。ＴＲＡ−１０は、低用量のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス研究において、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを、有意な程度までブロックした。従って、ＴＲＡ−１０は、アンタゴニスト抗ＤＲ５抗体と分類される。ＴＲＡ−１は、登録番号ＰＴＡ−１７４１のもとで、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。ＴＲＡ−１０も同様に、登録番号ＰＴＡ−１７４２のもとで、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。
【０１６４】
ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する、グリオーム細胞株のうちの５種、Ｄ−３７ＭＧ、Ｄ５４−ＭＧ、Ｕ３７３−ＭＧ、ＣＨ２３５−ＭＧおよび１３２１Ｎ１の感受性は、図３ｂに示されるように、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対するそれらの感受性に等しく、このことは、これらの細胞におけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスが、主にＤＲ５によって媒介されることを示す。さらに、これらのグリオーム細胞株のうちの２種、Ｈｓ６８３およびＵ２５１−ＭＧは、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して抵抗性であるが、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して部分的に感受性であり、このことは、おとりレセプターがこれらの細胞において機能し、そしてＴＲＡ−８抗体の使用がこの調節機構をバイパスしていることを示す。前立腺癌細胞株において、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対する様々な感受性にもかかわらず、これはＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスに対する細胞の感受性に匹敵し、このことはまた、ＤＲ５が、前立腺癌細胞におけるＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの主な役割を果たしていることを示唆する。造血細胞の中で、ジャーカットおよびＣＥＭ−６は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスおよびＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの両方に対して非常に感受性であることが見出されている。ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスのレベルは、図２ａおよび３ａ’に示されるように、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスのレベルに匹敵する。グリオーム細胞株のうちのただ１種のＵ８７、ならびに２種の造血細胞株のＵ９３７およびＭｏｌｔ−４は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対する感受性を示したが、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してそれほど感受性ではないか、またはＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して抵抗性であった。１種の細胞株、Ｈ−９細胞株は、検出可能なレベルのＤＲ５を発現したが、ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬのいずれかによって誘導されるアポトーシスに対して抵抗性である。最小レベルのＲ５の発現は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに必要であるが、ＤＲ５の発現レベルは、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対するこの細胞の感受性を必ずしも予測せず；おとりレセプターは、いくつかの細胞におけるＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの調節において役割を果たすが、現在まで試験された細胞のほとんどにおいて、主な役割を果たさないようであり；予測されるように、ＴＲＡ−８抗体は、おとりレセプターの影響をバイパスし；ＤＲ５レセプターの機能的変異は、形質転換細胞において生じ得；そして最後に、細胞内調節機構は、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスおよびＤＲ５媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性を規定する際に、重要であるか、またはおとりレセプターより重要であり得る。
【０１６５】
以前の研究により、ＤＲ５のｍＲＮＡは、正常な組織に広範に分布していることが示された７。タンパク質レベルでＤＲ５の発現を評価するために、正常なヒト組織ホモジネート（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のパネルを、ウエスタンブロット分析において、ＴＲＡ−８抗体でプローブする。９種の正常なヒト組織の中で、脳組織はわずかに陽性である（図５ａ、レーン２）。ＤＲ５タンパク質は、肝臓（レーン１）、肺（レーン３）、腎臓（レーン４）、脾臓（レーン５）、精巣（レーン６）、卵巣（レーン７）、心臓（レーン８）、または前立腺（レーン９）のいずれにおいても、ＴＲＡ−８反応性によって検出可能ではない。対照的に、全１３種のヒト癌組織（卵巣（レーン１）、肺（レーン２）、肝臓（レーン３）、直腸（レーン４）、頸部（レーン５）、皮膚（レーン６）、精巣（レーン７）、甲状腺（レーン８）、子宮（レーン１０）、胃（レーン１１）、咽喉頭（レーン１２）および膵臓（レーン１３）の癌を含む）は、ＴＲＡ−８で陽性染色した（図５ｂ）。さらに、ＴＲＡ−８を用いる正常組織および癌組織のインサイチュ免疫組織化学研究により、脾臓に散在するわずかな陽性細胞を除いて、正常な乳房、肺および脾臓組織におけるＤＲ５の発現は、検出可能ではないことが確認された（図５ｃ）。対応する癌組織（乳房浸潤性腺管癌、小細胞肺癌およびリンパ腫を含む）は、ＴＲＡ−８とポジティブに反応した（図５ｄ）。試験した合計２２種の癌組織の中で、５／６の乳癌、２／２の頸部癌、４／５の肝臓癌、５／８のリンパ腫、２／２の肺癌、および２／２の前立腺癌が、ＴＲＡ−８とポジティブに反応した。これらの結果は、フローサイトメトリー分析の結果と一致し、そして癌組織が、正常な組織が発現するより高レベルのＤＲ５タンパク質を発現することを示す。
【０１６６】
（実施例９．インビボにおけるＴＲＡ−８の殺腫瘍活性）
種々の理由のために、インビトロ研究において有望な多くの因子は、インビボにおいて効力を示さない。従って、インビトロ動物モデルにおいてＴＲＡ−８の効力を試験することが重要である。これを達成するために、このＴＲＡ−８抗ヒトＤＲ５抗体を、ヒトＤＲ５分子を発現するヒト異種移植片を有するマウスに投与する。使用するマウスは、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であり、これらに、ヒト星状細胞腫１３２１Ｎ１細胞（１×１０７）を皮下接種するか、またはヒト白血病ジャーカット細胞（１×１０６）を静脈内接種する。腫瘍接種の２日後、マウスに、ＴＲＡ−８（１００μｇ）を静脈内接種する。ＴＲＡ−８での処置の５日後、１３２１Ｎ１腫瘍増殖を、腫瘍塊のサイズおよび重量によって決定する。ジャーカット細胞の増殖を、脾臓の重量および接種した動物の脾臓中のヒトＣＤ３陽性ジャーカット細胞の割合によって決定する。腫瘍組織の生検を採取し、組織学的に試験する。
【０１６７】
腫瘍接種の１日後における、１００μｇの単回静脈内用量のＴＲＡ−８を用いる早期の処置は、１３２１Ｎ１細胞が固形腫瘍を形成するのを完全に阻害した（図６ａ）。腫瘍接種の１週間後における、１００μｇの用量のＴＲＡ−８を３回用いる後期の処置は、腫瘍重量を４分の１以下に減少させた（図６ｂ）。腫瘍形成は、早期の時点では、ＴＲＡ−８で処置した動物において現れない（図６ｃ、上パネル）。組織学的分析は、ＴＲＡ−８で処置した動物における劇的に生成した腫瘍組織を示した（図６ｃ、下パネル）。同様に、ＴＲＡ−８処置は、脾臓におけるＣＤ３陽性ジャーカット細胞の欠乏により示されるように、ジャーカット細胞による脾臓の集団を阻害した（図６ｄ、６ｅ）。移植した腫瘍の組織学的分析により、わずかな腫瘍細胞が、ＴＲＡ−８で処置した動物の軟部組織中に散在することが示され、一方、コントロールは、図６ｃに示されるように、固形腫瘍の形成を示した。ジャーカット細胞モデルにおいて、ＴＲＡ−８で処置した動物の脾臓中のジャーカット細胞の数は、図６ａに示されるようなフローサイトメトリー分析、および図６ｃのインサイチュＣＤ３染色により実証されるように、コントロール動物の脾臓における約１０％と比較して、２％未満である。
【０１６８】
これらの結果は、架橋組換えＴＲＡＩＬの全身投与が、インビボにおいて腫瘍の増殖を阻害するという最近の証明を確証する（１３）。これらの結果は、単回用量のＴＲＡ−８が、インビボにおける腫瘍細胞の除去に非常に有効であることを示す。
【０１６９】
抗ヒト抗体がマウスモデルに使用される場合、ＴＲＡ−８処置の毒性は、評価し得なかった。しかし、ＴＲＡＩＬのインビボ投与の研究が、有意な毒性は、この処置とは関係ないことを示した（１３）。
【０１７０】
（実施例１０．ＲＡ滑膜細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して感受性である）
ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの先行技術の研究のほとんどは、悪性細胞に集中していた。本発明に従うＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスはまた、自己免疫状態および炎症状態（例えば、ＲＡ）において治療的である。
【０１７１】
（１０．１ ＲＡ滑膜細胞における細胞表面ＤＲ５の発現のフローサイトメトリー分析）
ＲＡを有する患者由来の８個の一次培養滑膜細胞のパネルにおけるＤＲ５の発現を、変形性関節症（本明細書中以下、「ＯＡ」と呼ぶ）を有する患者由来の８個の一次培養滑膜細胞におけるＤＲ５の発現と比較する。この８個のヒト一次ＲＡ滑膜細胞培養物、ＲＡ−１０１４、ＲＡ−１０１６、ＲＡ−１０２１、ＲＡ−５１２、ＲＡ−７０７、ＲＡ−８１１、ＲＡ−７１６、およびＲＡ−９２９は、Ｄｒ．Ｍ．Ｏｈｔｓｕｋｉ（Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により心よく提供され、そして１０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養する。７個のＯＡ滑膜細胞の一次細胞培養物を、標準的なコラゲナーゼ法によってＯＡ患者の滑膜組織から単離し、そして同じ条件下で培養する。全ての一次細胞の継代数は、１０以下である。ＤＲ５の発現は、実施例５に記載されるように、ＦＡＣ分析により決定する。
【０１７２】
ＲＡ細胞の一次培養物の全ては、高レベルの表面ＤＥ５を発現し、図７ａに示されるように、異なる患者から単離したこれらの滑膜細胞の間の発現レベルにおける変化はほとんどなかった。対照的に、ＯＡ患者から単離した滑膜細胞の表面における表面ＤＲ５の発現は、非常に低いか、または検出不可能である（図７ｂ）。ＳＶ４０形質転換滑膜細胞は、ＲＡ細胞により示される発現レベルと比較して高レベルのＤＲ５を発現することが見出される。対照的に、非トランスフォーメーション線維芽細胞は、図７ｂのＯＡ細胞により示される発現レベルと比較して低レベルのＤＲ５を発現した
（１０．２ ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬにより媒介されるアポトーシスに対するＲＡ滑膜細胞の感受性）
一般的に、ＲＡ患者から単離した全ての滑膜細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよび抗ＤＲ５抗体誘導性アポトーシスの両方に対して感受性であり、そして全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよび抗ＤＲ５抗体誘導性アポトーシスに対して抵抗性である（図８ａ、ｂ）。これらの研究により、ＴＲＡ−８抗体は、正常な細胞よりむしろ改変した細胞を標的化することが示される。さらに、ＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスに対する感受性または抵抗性のパターンは、抗ＤＲ５抗体により誘導されるアポトーシスに対する感受性または抵抗性と相関し、このことは、この滑膜細胞が、主にＤＲ５を使用してＴＲＡＩＬアポトーシスを誘導することを示す。
【０１７３】
悪性細胞について記載したように、ＴＲＡＩＬまたは抗ＤＲ５抗体により誘導されるアポトーシスに対する感受性は、ＲＡ滑膜細胞の間で変動したが、同様のレベルのＤＲ５、ＲＡ−５１２およびＲＡ−７０７を発現する細胞は最も感受性である。なぜなら、８０％を越える細胞は、２０ｎｇ／ｍｌより低い濃度のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８により殺されるからである。中でも、ＲＡ−１０１４、ＲＡ−８１１、ＲＡ−７１６およびＲＡ９２９は、ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８に対して中程度の感受性を有し、ほぼ１００％の細胞死が、高濃度（＞５０ｎｇ／ｍｌ）のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下で生じる。ＲＡ−１０１６およびＲＡ１０２１細胞において、大部分（６０％より多く）の細胞は、低用量のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８により殺されるが、一部の細胞は、高濃度のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下で生存し、このことは、細胞の亜集団が、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対して抵抗性であることを示す。対照的に、全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してはるかに感受性が小さい。６０％未満の細胞は、高濃度のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下でさえＯＡ５２ＦおよびＯＡ６９Ｆ中で殺される。ＯＡ７２Ｍ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスまたはＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して完全に抵抗性である。ＳＶ４０形質転換滑膜細胞はまた、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して感受性である（データは示さず）。対照的に、非トランスフォーメーション線維芽細胞は、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８に対して抵抗性のようである。
【０１７４】
ＤＲ５は、ＦＡＤＤ／カスパーゼ８依存性経路を使用して、アポトーシスを誘導することが以前に示されている（４４）。ＲＡ滑膜細胞のＤＲ５媒介性アポトーシスのカスパーゼ依存性を決定するために、ＲＡ細胞を、特定のカスパーゼインヒビターの存在下で、ＴＲＡＩＬまたは抗ＤＲ５抗体と共に培養する。図９に示されるように、試験した８種のカスパーゼインヒビターの中で、カスパーゼ６、８および１０インヒビターが、ＴＲＡＩＬおよびＤＲ５の両方により誘導されるＲＡ滑膜細胞のアポトーシスを阻害し得、このことは、これら３種のカスパーゼがＤＲ５媒介性アポトーシスに関与していることを示す。
【０１７５】
（１０．３ ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬは、ＭＭＰの放出を増加することなく、ＲＡ滑膜細胞中でのＮＦ−κｂの活性を誘導する）
アポトーシスのシグナル伝達と増殖のシグナル伝達との間に密接な関連が存在するという概念を支持するためのかなりの証拠が存在する（４５）。ＤＲ５は、アポトーシスシグナル伝達に加えて、ＮＦ−κｂ経路を活性化し得、そしてＮＦ−κｂの活性化は、抗アポトーシスシグナルを伝達し得るということが、確立されている。従って、ゲルシフトアッセイが実行される。細胞を、指示時間の間、１ｍｇ／ｍｌのエンハンサーまたは５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８の存在下で、５０ｎｇ／ｍｌの組換え可溶性ＴＲＡＩＬ（Ｆａｓリガンド）を用いて刺激する。この核抽出物を調製し、二重に染色した［３２Ｐ］標識オリゴ−ＤＮＡプローブと共にインキュベートする。この結果を、サイクロンホスファ画像装置（ｐｈｏｓｐｈａ−ｉｍａｇｅｒ）（ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＣＴ）を使用して分析する。ＲＡ滑膜細胞を、ＴＮＦ−αまたはＴＲＡＩＬと共にインキュベートして、ＮＦ−κｂを、時間依存性様式で活性化した。ＴＲＡ−８抗体は、ＮＦ−κｂを強力に活性化し得る。対照的に、Ｆａｓリガンドは、図１０ａに示されるように、ＮＦ−κｂ活性化を誘導し得ない。
【０１７６】
従って、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８抗体は、ＲＡ滑膜細胞中で強力なアポトーシス応答を誘導するが、このＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８抗体はまた、ＮＦ−κｂを活性化し、そしてＮＦ−κｂ活性化は、ＲＡ中のＴＮＦ−αの炎症誘発性の役割に寄与すると考えられている。従って、ＴＮＦ−αのようなＴＲＡＩＬは、炎症誘発性サイトカインとして役立ち得る可能性がある。ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ−αによって誘導されたＮＦ−κｂ活性化の同様の生物学的結果が存在するかどうかを決定するために、ＭＭＰの産生を、ＥＬＩＳＡによって決定する。滑膜細胞を、単独で、または５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン１ｂ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ、もしくは５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８と共に、培地中で一晩培養する。培養上清中のＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３のレベルを、ＥＬＩＳＡキットによって決定する。
【０１７７】
ＲＡ滑膜細胞を、炎症誘発性サイトカイン、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１ｂと共にインキュベートする場合、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、およびＭＭＰ−１３の産生は、図１０ｂ、ｃに示されるように、培地コントロールと比較して増加する。対照的に、ＴＲＡＩＬまたは抗−ＤＲ５抗体での処理は、これらのＭＭＰの増加した放出と関係しない。
【０１７８】
（実施例１１Ａ．肝細胞性毒素を誘導しない）
２４時間の細胞生存率アッセイのために、９６ウェルプレート中の正常なヒトの新鮮な肝細胞を、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から購入した。この肝細胞を、１μｇ／ｍｌの可溶性のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれかを含む、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養する。６時間の細胞生存率アッセイにために、正常な肝細胞または肝臓癌細胞を、ＵＡＢ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒから収集された新鮮な外科試料から単離する。ヒトの肝細胞の単離のための全ての試薬（肝細胞灌流緩衝液、消化培地、洗浄培地、および結合培地を含む）を、Ｇｉｂｃｏから購入した。この組織スライドを、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｄｉｇｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ（３７℃）中で、振盪（５０ｒｐｍ）しながら１時間消化する。この単離した肝細胞を、低速遠心分離（５０ｇ、３分）により収集し、そしてＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いて６回洗浄する。肝細胞の単一の細胞懸濁物を、９６ウェルＭａｔｒｉｇｅｌプレート（ＢＰ）中に１０％のＦＣＳを含むＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ中で６時間培養する。結合されていない肝細胞を、予め温めた結合培地で２回洗浄することによって除去する。結合された肝細胞を、架橋剤の存在下で、種々の濃度の可溶性ＴＲＡＩＬもしくはＦａｓＬ、またはＴＲＡ−８もしくはＣＨ１１と共にさらに６時間インキュベートする。
【０１７９】
ＴＲＡＩＬは、アポトーシスを誘導し得る少なくとも２種のレセプター（ＤＲ４およびＤＲ５）を有する。ＤＲ５のみの架橋で、正常な肝細胞のアポトーシスを誘導するに十分である否かを決定するために、ＴＲＡ−８を使用する。ＴＲＡ−８をインサイチュで免疫組織化学的に使用することによって、タンパク質レベルでのＤＲ５発現を、正常なヒトの５種の肝臓組織および５種の肝臓癌組織中で最初に試験した。正常な肝臓組織由来の切片は、ＴＲＡ−８とＤＲ５とで陽性反応性を示すことなく（図１１ａ、左下のパネル）、Ｈ ＆ Ｅ染色において（図１１ａ、左上のパネル）、正常な構造および細胞形態を示した。対照的に、ヒト肝細胞癌組織は、癌性細胞におけるＤＲ５の細胞膜および細胞質の両方の存在と一致するパターンで、ＴＲＡ−８と陽性反応した。ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２はまた、ＤＲ５に対して陽性である。これらの結果は、正常な肝臓組織と一致し、そして５種の肝臓癌組織のうちで１種のみ（肝臓腺腫）がＤＲ５陰性である。これらの結果は、図５ａに示されるウエスタンブロットデータと一致し、他の正常な組織と同様に、正常なヒト肝臓組織は、ＤＲ５タンパク質の有意なレベルを発現しない。さらに、ＴＲＡ−８でプローブした、単離した正常なヒト肝細胞のウエスタンブロット分析は、検出可能なレベルのＤＲ５を示さない。
【０１８０】
フローサイトメトリー分析によって、ヒトの肝細胞上でのＤＲ５の細胞表面発現は、新たに調製された正常な肝細胞が検出可能なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現しないことを実証した（図１１ｂ、左上のパネル）。この発現は、低温保存された正常なヒトの肝細胞でも、短期間の培養中に配置した正常なヒトの肝細胞でも検出されない。対照的に、新たに単離した肝細胞の癌細胞およびＨｅｐＧ２細胞は、細胞表面ＤＲ５を発現する。比較としてＦａｓの使用により、正常な肝細胞、肝細胞の癌細胞、およびＨｅｐＧ２細胞の全ては、等価なレベルのＦａｓを発現した（図１１ｂ、下のパネル）。これらの結果は、インサイチュで免疫組織化学およびウエスタンブロットを使用して得られた結果と一致し、そして細胞表面のＤＲ５は、肝臓癌細胞において高度に発現するが、正常な肝細胞では発現しないことを示す。ヒトの肝細胞中において、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対する、ｍＲＮＡレベルの存在は、ＲＴ−ＰＣＲ２３によって実証され、このことは、ヒト肝細胞が非常に低いレベル（このレベルは、ＴＲＡ−８による検出に関する閾値よりも低い）のＤＲ５タンパク質を発現し得ることを示唆する。
【０１８１】
ＴＲＡ−８が肝細胞毒性を誘導するか否かを決定するために、ＴＲＡ−８によりならびに可溶性ＴＲＡＩＬおよび架橋剤により誘導された、アポトーシスに対する正常なヒトの肝細胞の感受性を、試験する。正常な肝細胞を、高濃度のＴＲＡＩＬの存在下で培養する場合、細胞生存率の時間依存による減少を、ＡＴＰＬｉｔｅ（図１２ａ）およびＭＴＴアッセイにより観察する。正常な肝細胞のＴＲＡＩＬ媒介細胞死は、ＴＲＡＩＬの添加後の４時間程度早く見られ得る。２４時間の培養の最後に、８０％より多い肝細胞が、ＴＲＡＩＬにより殺傷される。対照的に、同一の培養期間の間に、ＴＲＡ−８は、正常な肝細胞中で有意な細胞死を誘導しなかった。Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した、濃縮核（アポトーシスの特性）は、ＴＲＡＩＬで処理した肝細胞で増加するが、ＴＲＡ−８で処理した肝細胞では増加しない（図１２ｂ）。アポトーシス肝細胞の数は、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定されるように、減少した細胞の生存率と十分に相関し、肝細胞のＴＲＡＩＬにより誘導された細胞死がアポトーシスによって媒介されることを示唆する。このことを、肝細胞のＴＲＡＩＬ媒介毒性を阻害するＺ−ＶＡＤの能力によって確認する。シクロへキシイミドは、強力なアポトーシスエンハンサーであるので、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８で処理した肝細胞に対するこの化合物の効果を調査する。４時間の培養の間に、シクロへキシイミドは、ＴＲＡＩＬによって誘導された肝細胞の細胞死を有意に増強し、７０％より多くの肝細胞は、シクロへキシイミドの存在下でＴＲＡＩＬによって殺傷される（図１２ｃ）。しかし、シクロへキシイミド処理は、肝細胞でのＴＲＡ−８により媒介される細胞死を増強し得ない。肝細胞中で、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスの特性と、ＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスの特性とを比較するために、正常の肝細胞おおよび癌細胞を、架橋剤またはＴＲＡ−８を含む、種々の濃度の可溶性ＴＲＡＩＬと共にインキュベートする。６時間の培養期間の間に、ＴＲＡＩＬは、正常な肝細胞において中程度のアポトーシス応答を誘導した。２０％を超える肝細胞を、５００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で殺傷する（図１２ｄ、左上）。正常な肝細胞のＴＲＡ−８での処理は、同一の時間にわたって、有意な細胞死が惹起しなかった。正常な肝細胞と対照的に、一次肝細胞癌細胞（図１２ｄ、上側中央）およびＨｅｐＧ２細胞（図１２ｄ、右上）は、ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれかによって媒介されるアポトーシスに対して高度に感受性である。８０％を超える肝細胞の癌細胞およびほぼ１００％のＨｅｐＧ２細胞を、８時間の培養期間に殺傷する。これらの結果は、正常な肝細胞がＴＲＡ−８により媒介されるアポトーシスに対して完全に耐性であり、そして肝臓癌細胞よりも、ＴＲＡＩＬによって媒介されるアポトーシスに対してかなり低い感受性であることを示す。Ｆａｓリガンドおよび抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）を使用する際、正常な肝細胞、肝細胞の癌細胞、およびＨｅｐＧ２細胞間で、Ｆａｓにより媒介されるアポトーシスに対する感受性において顕著な差異は存在しない（図１２ｄ、下側のパネル）。
【０１８２】
（比較例１１Ｂ．インビボでの肝炎のヒト膜結合型ＴＲＡＩＬ誘導）
８〜１０週齢の雌性Ｂ６マウスに、１０９ｐｆｕのＡｄ/ｈＴＲＡＩＬを同数のＡｄ／Ｔｅｔ−ｏｎと共に静脈内注射する。マウスに、アデノウイルスベクターの接種直後に、マウスの飲料水中で異なる濃度のテトラサイクリンを与える。肝臓損傷を、ＡＳＴ診断キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＡＳＴの血清レベルによって決定する。ＴＲＡＩＬの発現を、ノーザンブロット分析によって決定する。
【０１８３】
ＴＲＡＩＬの膜結合形態がインビボで肝臓損傷を誘導するか否かを決定するために、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬ）を構築する。この発現は、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある。Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬをＢ６マウスに静脈内接種して２４時間後、ヒトＴＲＡＩＬのテトラサイクリン誘導性発現は、ノーザンブロット分析によって実証した場合に、用量依存性様式で肝臓中に観察される（図１３ａ）。ＴＲＡＩＬの発現レベルは、トランスアミナーゼの血清レベルにおけるテトラサイクリン依存性の増加によって示されるように、肝臓損傷と十分相関され、これもまた、用量依存様式にある（図１３ｂ）。アデノウイルスベクター自体の接種は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する肝細胞の感受性を増加し得るので、Ａｄ／ＴＲＡＩＬを接種したマウス由来の肝細胞を単離し、そしてＴＲＡＩＬ媒介細胞死について試験する。コントロールマウスからの細胞死と比較して、Ａｄ／ＴＲＡＩＬ感染肝細胞の細胞死の有意な増加は存在しない（図１３ｃ、左パネル）。さらに、Ａｄ／ＴＲＡＩＬ接種マウスは、可溶性ヒトＴＲＡＩＬの静脈内注射後に、肝臓損傷の増加を示さなかった。従って、Ａｄ／ＴＲＡＩＬによって誘導された肝炎は、その膜形態での高レベルのＴＲＡＩＬ発現によって媒介されるはずである。肝臓切片の組織学的分析は、肝細胞に対する損傷が、ベクター接種後２４時間ほどの早い時間で明らかであり（図１３ｄ）、そして少なくとも７日間持続される（図１３ｅ）ことを明らかにした。肝臓におけるこれらの病理学的変化はまた、テトラサイクリン依存性であり、そして用量依存様式で生じる。ＴＲＡＩＬ誘導性の肝臓損傷の初期（処置の２４時間以内）は、壊死の病巣によって特徴付けられる。炎症性細胞の浸潤は、この段階で観察されないが、出血が生じた。接種後７日目までに、散在性の肝臓損傷が、顕著な小葉の乱れ、不規則に凝集された細胞質および大きい空き空間を伴う肝細胞の重篤な変性、ならびに顕著なアポトーシスおよび壊死と共に明らかである。単核細胞の広範な浸潤は、この段階の特徴的な特性である。これらの結果は、膜結合形態のヒトＴＲＡＩＬが、インビボで肝臓損傷を誘導し得ることを示す。マウスにおいて重篤な肝炎を引き起こすヒトＴＲＡＩＬの傾向にも拘わらず、それは、致死的な応答を誘導しなかった。対照的に、Ｆａｓリガンドをコードする類似のテトラサイクリンコントロールベクターを接種したマウスは、肝細胞の大量のアポトーシスおよび壊死を有する劇症肝炎を発症し、重篤な出血および死を伴い、これらは、接種の７２時間以内にテトラサイクリン用量依存的に生じた。死亡率は、３ｍｇ／ｍｌ以上のテトラサイクリンを受けたそれらの部分群において、４８時間以内で１００％に達した。対照的に、Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬを受けたマウスの全ては、テトラサイクリンの用量に関係なく、接種後４週間なお生存している。従って、インビボにおいて、ＴＲＡＩＬの膜結合形態は、Ｆａｓリガンドよりも強力ではない肝細胞の損傷の誘導因子であるはずである。これらはさらに、ＴＲＡＩＬが、Ｆａｓリガンドの毒性の根底を成す機構とは異なる機構を介して肝臓損傷を誘導し得ることを示唆する。
【０１８４】
（実施例１２．活性化ヒトＴ細胞およびＢ細胞は増加したレベルのＤＲ５を発現する）
ＤＲ５が活性化Ｔ細胞およびＢ細胞のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスにおいて役割を果たすか否かを決定するために、静止および活性化Ｔ細胞およびＢ細胞上でのＤＲ５の表面発現を、ＴＲＡ−８を使用して試験する。ＰＢＭＣにおける未刺激ヒトＴ細胞は、有意なレベルのＤＲ５を発現しなかった（図１４）。抗ＣＤ３刺激またはＣｏｎ−Ａ刺激のいずれかの４８時間後、細胞表面ＤＲ５発現は、有意に増加する。同様に、未刺激Ｂ細胞は、非常に低いレベルのＤＲ５を発現した。抗μでの刺激は、ＤＲ５の細胞表面発現の増加を生じたが、ＬＰＳでの刺激では生じなかった。これらの結果は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞の両方が、より高いレベルの細胞表面ＤＲ５を発現することを示す。細胞を、２０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８およびＰＥ抗マウスＩｇＧ１で染色する。
【０１８５】
（実施例１３．活性化Ｔ細胞およびＢ細胞はＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対して感受性になる）
活性化Ｔ細胞およびＢ細胞がＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対して感受性であるか否かを決定するために、ヒトＰＢＭＣのＴ細胞およびＢ細胞を、それぞれ、インビトロで４８時間抗ＣＤ３または抗μで刺激する。生存細胞および増殖している芽細胞を、勾配遠心分離によって収集し、そして種々の濃度のＴＲＡ−８共にインキュベートする。未刺激Ｔ細胞およびＢ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対して感受性ではない（図１５）。刺激Ｔ細胞およびＢ細胞の全ては、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対する感受性の穏やかな増加を示し、２０％の細胞が、一晩培養後にＴＲＡ−８によって殺傷された。高度に増殖している芽細胞Ｔ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対してさらにより感受性である。７０％より多い芽細胞性Ｔ細胞が、ＴＲＡ−８によって殺傷され得る。芽細胞性Ｂ細胞もまた、他と比較して、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対してより感受性である。これらの結果は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞がＤＲ５媒介アポトーシスに対して感受性であることを示す。
【０１８６】
（実施例１４．ＴＲＡ−８はヒト／ＳＣＩＤマウスにおける活性化Ｔ細胞を枯渇する）
ＴＲＡ−８のインビボ抗Ｔ細胞効力を決定するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、１×１０８個のヒトＰＢＭＣを静脈内注射する。通常、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＴ細胞は、異種刺激に応答して迅速に活性化される。ヒトＰＢＭＣ／ＳＣＩＤマウスに、移入の日から３日間毎日繰り返して、１００μｇのＴＲＡ−８またはコントロールＩｇＧ１を腹腔内注射する。移入後５日目に、単核細胞を、脾臓から単離し、そして抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、そしてリンパ球集団を、フローサイトメトリー分析によってゲート（ｇａｔｅ）し、そしてＣＤ３陽性ヒトＴ細胞を分析する。コントロールで処理したマウスにおける抗ヒトＣＤ３染色によって決定されるように、約３０％の脾臓リンパ球は、ヒトＴ細胞である。しかし、ＴＲＡ−８処理したマウス中の脾臓リンパ球においては、わずかなヒトＴ細胞（３％未満）しか観察されなかった（図１６）。インサイチュでの組織学的研究は、コントロールマウスの脾臓において、ヒトＴ細胞が脾臓において再増殖されることを明らかにし、ＴＵＮＥＬ染色によって実証されるように、わずかなアポトーシス細胞のみが観察される。対照的に、生存ヒトＴ細胞を用いた再増殖は、ＴＲＡ−８処置マウスの脾臓において観察されず、むしろ多くのアポトーシス細胞が観察される（図１７）。これらの結果は、ＴＲＡ−８がインビボで抗Ｔ細胞活性を有することを実証し、そしてＧＶＨ疾患の処置のための本発明の抗体の有用性を示す。
【０１８７】
（実施例１５．ＴＲＡ−８の抗癌治療活性）
（１５．１ ヒト癌組織および細胞株におけるＤＲ５の発現および機能）
ｉ）ＴＲＡ−８でのインサイチュ染色によるヒト癌組織におけるＤＲ５発現
癌細胞および癌組織がより高いレベルのＤＲ５を差示的に発現するか否かを決定するために、２０種を超える乳癌、６種の卵巣癌、５種の結腸癌および５種の前立腺癌を含むヒト癌組織のパネルを、免疫組織化学のためにＴＲＡ−８で染色する。これらの癌組織の大部分は、検出可能なＤＲ５を発現した。これらの癌組織におけるＤＲ５の発現レベルは、異なった。一般に、癌組織は、関与されない組織よりも高いレベルのＤＲ５を発現した。さらに、ＤＲ５発現は、ｐ５３の変異と明らかに相関されない。
【０１８８】
ｉｉ）ヒト癌細胞株におけるＤＲ５の発現および機能（表２）
９種のヒト乳癌細胞株、３種の卵巣癌株、３種の結腸癌株および３種の前立腺癌株を、ＤＲ５の細胞表面発現およびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する感受性についてインビトロで試験する。９種の乳癌株のうちの７種、３種の卵巣癌株のうちの３種、３種の結腸癌株のうちの３種および３種の前立腺癌株のうちの３種が、種々のレベルで細胞表面ＤＲ５を発現した。９種の乳癌株のうち、３種がＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対して非常に感受性であり、３種が中程度であり、そして３種が耐性である。３種の全ての卵巣癌株は、非常に感受性である。３種の結腸癌株のうち１種は、非常に感受性であるが、２種は、中程度の感受性を有する。３種の前立腺癌株のうち２種は、中程度の感受性を有し、そして１種が、耐性である。
【０１８９】
表２．ヒト癌細胞におけるＤＲ５の発現および機能
【０１９０】
【表２】
Figure 0004156238
注：１フローサイトメトリーによって決定し、細胞を２０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８で染色し、そしてコントロール抗体に対して比較する。２ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定する。＋＋＋＋：８０％を超える殺傷；＋＋＋：６０〜８０％の間の殺傷；＋＋：４０〜６０％の間の殺傷；＋：２０〜４０％の間の殺傷、−殺傷なし。
【０１９１】
ｉｉｉ）アドリアマイシンとのＴＲＡ−８の組み合わせの細胞傷害性
いくつかの乳癌株において、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するアドリアマイシンの効果を試験する。高用量のアドリアマイシンは、相加効果を示した。しかし、ＴＲＡ−８耐性株のいくつかにおいて、低用量のアドリアマイシンが、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスを相乗的に増大する。
【０１９２】
ｉｖ）ヒト癌細胞に対するＴＲＡ−８のインビトロおよびインビボ結合活性
放射標識したＴＲＡ−８を使用する。乳癌株に対するＴＲＡ−８の結合活性を、腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスにおいてインビトロおよびインビボで試験する。癌細胞に対するインビトロ結合活性は、３ｎＭのＫｄ値と推測され（これは、ＥＬＩＳＡを使用する本発明者らの以前の推測と一致する）、そして可溶性ＴＲＡＩＬよりも少なくとも５０倍高い。インビボでは、ＴＲＡ−８は、移植された腫瘍組織に局在した。
【０１９３】
（１５．２．ＴＲＡ−８でのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける慢性リンパ球性白血病の治療）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂ細胞の悪性疾患の一般的な形態である。ＣＬＬにおけるほとんどの悪性Ｂ細胞は、成熟表現型のＢ細胞であり、これは、多くのアポトーシス刺激に対して耐性である。ＣＬＬを患う５人の患者のＢ細胞におけるＤＲ５の発現および機能を試験する。全ての患者は、ＰＢＭＣ中の９５％を超えるＣＤ１９＋Ｂ細胞によって示されるように、高い数値の末梢血Ｂ細胞を有した。正常な一次Ｂ細胞と比較して、全ての患者のＣＬＬ Ｂ細胞は、より高いレベルの細胞表面ＤＲ５を有し、そしてインビトロでのＴＲＡ−８誘導性アポトーシスにより感受性である。興味深いことに、ＣＬＬ Ｂ細胞はまた、ビスインドールマレイミドＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）誘導性細胞傷害性に対しても感受性である。ＴＲＡ−８およびＢｉｓＶＩＩＩでの組み合わせの処理後、約５０％のＣＬＬ Ｂ細胞が殺傷され、一方、正常Ｂ細胞は、非応答性のままであった（図１８）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＣＬＬ Ｂ細胞の移入は、移入後５日目で、レシピエントマウスの脾臓において再増殖された約２５％〜３０％のＣＤ１９＋Ｂ細胞を生じた。しかし、３用量の１００μｇ ＴＲＡ−８の処理は、このレシピエントＳＣＩＤマウスの脾臓における５人の患者中の４人の患者のＣＬＬ Ｂ細胞を完全に排除した。従って、単独または他の物質との組み合わせたＴＲＡ−８は、慢性リンパ球性白血病のための治療薬剤として活性である。
【０１９４】
（実施例１６．ｃＤＮＡクローニング）
（（１）ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列の決定）
ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを得るために、ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列、ならびにクローニングしたＴＲＡ−８遺伝子を、公知の技術によって決定する。
【０１９５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８を含む１０μｇの溶液を、１２％ ｗ／ｖのゲル濃度を使用する、１００Ｖの定電圧で１２０分間での、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）に供する。電気泳動後、ゲルを、転写緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２０％メタノール、０．０２％ ｖ／ｖ ＳＤＳ）中に５分間浸す。この時間の後、ゲルのタンパク質内容物を、転写緩衝液に予め浸漬したポリビニリデンジフルオリド膜（「ＰＶＤＦ膜」；孔サイズ０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｊａｐａｎ）に、１０Ｖの定電圧、４℃、１４時間の条件下で、ブロッティング装置（ＫＳ−８４５１；Ｍａｒｙｓｏｌ）を使用して、転写する。
【０１９６】
この時間の後、ＰＶＤＦ膜を、洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、次いで、染色溶液（５０％ ｖ／ｖ メタノール、２０％ ｖ／ｖ 酢酸および０．０５％ ｗ／ｖ クーマシーブリリアントブルー）中で５分間染色し、タンパク質バンドを位置付ける。次いで、ＰＶＤＦ膜を、９０％ ｖ／ｖ 水性エタノールで脱色し、そしてＰＶＤＦ膜上に先に位置付けた重鎖に対応するバンド（より低い移動度を有するバンド）および軽鎖に対応するバンド（より高い移動度を有するバンド）を切り出し、そして脱イオン水で洗浄する。
【０１９７】
重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を、気相タンパク質配列決定装置（ＰＰＳＱ−１０；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｅｉｓａｋｕｓｙｏ，Ｋ．Ｋ．）を使用して、エドマン自動化法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．ら、（１９６７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１，８０）によって決定する。
【０１９８】
重鎖に対応するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、以下：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号４）
であると決定され、そして軽鎖に対応するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、以下：
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（配列表の配列番号５）
であると決定される。
【０１９９】
Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ．ＩＩ」，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）によって作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースとのこれらのアミノ酸配列の比較は、ＴＲＡ−８の重鎖（γ１鎖）および軽鎖（κ鎖）が、それぞれ、サブタイプ３ｄおよび１に属することを明らかにした。
【０２００】
（２）ｃＤＮＡクローニング
上記の知見に基づき、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子の５’非翻訳化領域の部分および３’翻訳領域の最末端とハイブリダイズすることが予測される、オリゴヌクレオチドプライマーを合成する。次いで、ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、以下の逆転写およびＰＣＲの組み合わせ（ＲＴ−ＰＣＲ）によってクローニングする。
【０２０１】
ａ）テンプレート
ＴＲＡ−８ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１４２８）の総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を使用して抽出する。このＰＣＲ反応のためのテンプレートには、ｃＤＮＡを使用し、このｃＤＮＡは、第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、そのキットと共に提供される手順マニュアルに従って使用することによって得られる。
【０２０２】
ｂ）ＰＣＲプライマー
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲのために合成する：
５’−ｃａｇｃａｃｔｇａａ ｃａｃｇｇａｃｃｃｃ−３’（Ｈ５ＮＣＳ１：配列表の配列番号６）；
５’−ａａａｇｇｔａａｔｔ ｔａｔｔｇａｇａａｇ−３’（Ｈ５ＮＣＳ２：配列表の配列番号７）；
５’−ｃｃｔｃａｃｃａｔｇ ａａｃｔｔｃｇｇｇｃ−３’（Ｈ５ＳＳ１：配列表の配列番号８）；
５’−ｃｔｇｔｔｇｔａｔｇ ｃａｃａｔｇａｇａｃ−３’（Ｈ５ＳＳ２：配列表の配列番号９）；
５’−ｇａａｇｔｇａｔｇｃ ｔｇｇｔｇｇａｇｔｃ−３’（Ｈ５ＣＳ１：配列表の配列番号１０）；
５’−ａｇｔｇｔｇａａｇｔ ｇａｔｇｃｔｇｇｔｇ−３’（Ｈ５ＣＳ２：配列表の配列番号１１）；
５’−ｔｔｔａｃｃａｇｇａ ｇａｇｔｇｇｇａｇａ ｇ−３’（Ｈ３ＣＲ：配列表の配列番号１２）；
５’−ｔｇｃａｇａｇａｃａ ｇｔｇａｃｃａｇａｇ−３’（Ｈ３ＶＲ：配列表の配列番号１３）；
５’−ｔｇｔｔｃａｇｇａｃ ｃａｇｃａｔｇｇｇｃ−３’（Ｌ５ＮＣＳ１：配列表の配列番号１４）；
５’−ａａｇａｃａｔｔｔｔ ｇｇａｔｔｃｔａａｃ−３’（Ｌ５ＮＣＳ２：配列表の配列番号１５）；
５’−ｔａｔｃａｔｇａａｇ ｔｃｔｔｔｇｔａｔｇ−３’（Ｌ５ＳＳ１：配列表の配列番号１６） ；
５’−ｇａｔｇｇａｇａｃａ ｃａｔｔｃｔｃａｇｇ−３’（Ｌ５ＳＳ２：配列表の配列番号１７）；
５’−ｇａｃａｔｔｇｔｇａ ｔｇａｃｃｃａｇｔｃ−３’（Ｌ５ＣＳ：配列表の配列番号１８）；
５’−ｔｔａａｃａｃｔｃａ ｔｔｃｃｔｇｔｔｇａ−３’（Ｌ３ＣＲ：配列表の配列番号１９）；および
５’−ｇａｃｔｇｇｇｔｃａ ｔｃａｃａａｔｇｔｃ−３’（ＬＣＳＲ：配列表の配列番号２０）。
【０２０３】
他に示されない限り、これらの実施例の全てのオリゴヌクレオチドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドは、蒸留水に溶解した後−２０℃で保存する。
【０２０４】
ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応溶液の組成：
テンプレートｃＤＮＡ、総量３３μｌの反応液の５μｌ
プライマー１、１０ｐｍｏｌ；
プライマー２、１０ｐｍｏｌ；
１０×濃縮ＰＣＲ緩衝液（キットと共に提供される）、１０μｌ；
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、４μｌ；および
Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ユニット。
【０２０５】
滅菌蒸留水を溶液に添加して、１００μｌの総量にする。他に示されない限り、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの等モル混合物（各２．５ｍＭ）である。
【０２０６】
ＰＣＲ反応を、以下のように行う。溶液を、最初に９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間および７２℃で３分間の加熱のサイクルを、４０回繰り返す。この手順の完了後、反応溶液を、７２℃で１０分間加熱する。
【０２０７】
このように得られた増幅されたＤＮＡフラグメントは、０．２５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル上で分離する。所望のＤＮＡフラグメントを含むことが決められたバンドを、カミソリの刃を使用して切り取り、そしてＤＮＡを、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を使用してそこから回収する。ＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングする。これは以下のように行う。
【０２０８】
ＰＣＲ反応溶液から回収したＤＮＡフラグメントを、５０ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（キット共に提供される）と一緒に、４単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）が添加されている、１μｌの１０×リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と混合する。この混合物の全容積を、滅菌脱イオン水で１０μｌに調節し、そして得られたリガーゼ溶液を１５時間１４℃でインキュベートする。この時間の後、２μｌのリガーゼ反応溶液を、２μｌの０．５Ｍ β−メルカプトエタノールが添加されている、５０μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（キット共に提供され、そして取扱説明書に従ってコンピテンスにされる）に添加し、そして得られた混合物を３０分間氷上で維持し、次いで４２℃で３０秒間、そして再び氷上で５分間維持する。次に、５００μｌの培地（２％ｖ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．０５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、および２０ｍＭグルコースを含む）（本明細書中、後において「ＳＯＣ」培地と呼ばれる）を培養物に添加し、そしてこの混合物を１時間３７℃で振盪しながらインキュベートする。この時間の後に、培養物を、Ｌ−ブロス寒天プレート（１％ｖ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、０．１％ｗ／ｖグルコース、および０．６％ｗ／ｖ バクト−アガー（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ））上に広げ、これは、１００μｇ／ｍｌを含む。プレート上に現れるアンピシリン耐性コロニーを選択し、そして白金移動ループを用いてこすりとり、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地中で、３７℃で一晩、２００ｒ．ｐ．ｍで振盪させながら培養する。インキュベーション後、細胞を遠心分離によって集め、これから、プラスミドＤＮＡをアルカリ法によって調製する。得られたプラスミドを、ＴＲＡ−８の重鎖についてのプラスミドｐＨ６２と、またはＴＲＡ−８の軽鎖についてのプラスミドｐＬ２８と呼ぶ。これらのプラスミドを保有する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨ６２およびＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＬ２８と呼ばれる）を、微生物の寄託に関するブタペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ １ ｃｈｏｍｅ Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに寄託し、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６０およびＦＥＲＭ ＢＰ−７５６１が与えられた。ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認した。
【０２０９】
ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列表の配列番号２１および２２として与える。ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列表の配列番号２３および２４として与える。上で確立したＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列は、完全に一致した。さらに、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較する場合、重鎖について、配列番号２１のヌクレオチド番号５８〜４１４が可変領域を構成し、一方、配列番号２１のヌクレオチド番号４１５〜１３９２が定常領域を構成したことが確立される。軽鎖について、配列番号２２のヌクレオチド番号６４〜３８７が可変領域を構成し、一方、配列番号２２のヌクレオチド番号３８８〜７０２が定常領域を構成したことが確立される。ＣＤＲの位置および配列がまた、相同性をデータベースと比較することによって明かにされる。ＴＲＡ−８の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２５、２６および２７に示される。ＴＲＡ−８の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２８、２９および３０に示される。
【０２１０】
（実施例１７．ＴＲＡ−８抗体のヒト化バージョンの設計）
（（１）ＴＲＡ−８の可変領域の分子モデリング）
ＴＲＡ−８の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行される。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８，２３５−２４２（２０００））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定されたＴＲＡ−８のフレームワーク領域と比較する。結果として、１ＮＣＤおよび１ＨＩＬが、それぞれ、ＴＲＡ−８の軽鎖および重鎖のフレームワーク領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択される。フレームワーク領域の三次元構造は、ＴＲＡ−８の軽鎖および重鎖に対応する１ＮＣＤおよび１ＨＩＬの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製される。Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義される分類を使用して、ＴＲＡ−８のＣＤＲが以下のように分類される；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２は、それぞれ標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）分類２、１、１、３に属するが、一方、ＣＤＲＬ３は、いずれの特定の標準的な分類にも属さない。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２のＣＤＲループは、それらのそれぞれの標準的な分類に固有のコンホメーションに固定され、フレームワークモデルに組み込まれる。ＣＤＲＬ３は、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，（１９９６））の分類に従って、クラスター８Ａのコンホメーションが割り当てられ、そしてＣＤＲＨ３は、Ｈ３ルール（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ ４５５，１８８−１９７（１９９９））を使用して、ｋ（８）Ｃに分類される。次いで、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３についての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれる。
【０２１１】
最後に、エネルギーの点でＴＲＡ−８の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くために、エネルギー計算を行う。上記手順を、市販の共通分子モデリングシステムＡＢＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｃ．）を使用して行う。得られた分子モデルについて、構造の正確さを、さらに、ソフトウェアＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（１９９３），２６，２８３−２９１）を使用して評価する。
【０２１２】
（（２）ヒト化ＴＲＡ−８に対するアミノ酸配列の設計）
ヒト化ＴＲＡ−８抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行う。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択される。ＴＲＡ−８のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較する。結果として、ｍＡＢ５８’ＣＬ抗体を、フレームワーク領域についての８０％の最も高い配列相同性に起因して、アクセプターとして選択する。ｍＡＢ５８’ＣＬについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ＴＲＡ−８についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定する。これらの残基の位置は、上で構築されるＴＲＡ−８の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択される。ヒト化ＴＲＡ−８配列を、いくつかのドナー残基をアクセプター抗体ｍＡＢ５８’ＣＬに移入することによって、以下の実施例に記載されるように構築する。
【０２１３】
（実施例１８．ヒト化抗体の重鎖に対する発現ベクターの構築）
（（１）ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有するプラスミドの構築） ヒト化ＴＲＡ−８の活性を決定するために、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖を有するプラスミドを以下のように構築する。しかし、ＴＲＡ−８のヒト化は、これらの実施例に限定されないことが理解される。
【０２１４】
配列表の配列番号３１に示されるように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のヒト化は、１３位アミノ酸（リジン）、１９位アミノ酸（リジン）、４０位アミノ酸（トレオニン）、４２位アミノ酸（グルタミン酸）、４４位アミノ酸（アルギニン）、８４位アミノ酸（セリン）、８８位アミノ酸（セリン）、９３位アミノ酸（メチオニン）、１１４位アミノ酸（トレオニン）、１１５位アミノ酸（ロイシン）を、それぞれ、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシン、およびバリンに置き換えることを伴う。
【０２１５】
ヒト化ＴＲＡ−８（配列表の配列番号３１）の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを有するプラスミドを以下のように構築する。
【０２１６】
ＰＣＲを使用して以下のＤＮＡ配列を構築し、これらのそれぞれが、上記を含んだ：
以下の１２のオリゴヌクレオチドが合成される：
５’−ｔｔｇｇａｔａａｇｃ ｔｔｇｇｃｔｔｇａｃ ｃｔｃａｃｃａｔｇｇ ｇａｔｇｇａｇｃｔｇ ｔａｔｃａｔｃｃｔｃ ｔｔｃｔｔｇｇｔａｇ ｃａａｃａｇｃｔａｃ ａｇｇｔｇｔｃｃａｃ−３’（Ａ；配列番号３２）；
５’−ｔｃｔｇａａｇｔａａ ｔｇｃｔｇｇｔｇｇａ ｇｔｃｔｇｇｇｇｇａ ｇｇｃｔｔａｇｔａｃ ａｇｃｃｔｇｇａｇｇ ｇｔｃｃｃｔｇａｇａ ｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇ ｃａｇｃｃｔｃｔｇｇ−３’（Ｂ；配列番号３３）；
５’−ａｔｔｃａｃｔｔｔｃ ａｇｔａｇｔｔａｔｇ ｔａａｔｇｔｃｔｔｇ ｇｇｔｔｃｇｇｃａｇ ｇｃａｃｃａｇｇｇａ ａｇｇｇｔｃｔｇｇａ ｇｔｇｇｇｔｔｇｃａ ａｃｃａｔｔａｇｔａ−３’（Ｃ；配列番号３４）；
５’−ｇｔｇｇｔｇｇｔａｇ ｔｔａｃａｃｃｔａｃ ｔａｔｃｃａｇａｃａ ｇｔｇｔｇａａｇｇｇ ｃｃｇａｔｔｃａｃｃ ａｔｃｔｃｃａｇａｇ ａｃａａｔｇｃｃａａ ｇａａｃａｃｃｃｔｇ−３’（Ｄ；配列番号３５）；
５’−ｔａｔｃｔｇｃａａａ ｔｇａａｃａｇｔｃｔ ｇａｇａｇｃａｇａｇ ｇａｃａｃｇｇｃｔｇ ｔｔｔａｔｔａｃｔｇ ｔｇｃａａｇａａｇｇ ｇｇｔｇａｃｔｃｔａ ｔｇａｔｔａｃｇａｃ−３’（Ｅ；配列番号３６）；
５’−ｇｇａｃｔａｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇｇａ ｃｃｃｔｇｇｔｃａｃ ａｇｔｃｔｃｃｔｃａ ｇｃｃｔｃ ｃａｃｃ ａａｇｇｇｃｃｃａｔ ｃｇｇｔｃ−３’（Ｆ；配列番号３７）；
５’−ｃｔａｃｃａａｇａａ ｇａｇｇａｔｇａｔａ ｃａｇｃｔｃｃａｔｃ ｃｃａｔｇｇｔｇａｇ ｇｔｃａａｇｃｃａａ ｇｃｔｔａｔｃｃａａ−３’（Ｇ；配列番号３８）；
５’−ｔｃｔｃａｇｇｇａｃ ｃｃｔｃｃａｇｇｃｔ ｇｔａｃｔａａｇｃｃ ｔｃｃｃｃｃａｇａｃ ｔｃｃａｃｃａｇｃａ ｔｔａｃｔｔｃａｇａ ｇｔｇｇａｃａｃｃｔ ｇｔａｇｃｔｇｔｔｇ−３’（Ｈ；配列番号３９）；
５’−ｔｃｃａｇａｃｃｃｔ ｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃ ｃｔｇｃｃｇａａｃｃ ｃａａｇａｃａｔｔａ ｃａｔａａｃｔａｃｔ ｇａａａｇｔｇａａｔ ｃｃａｇａｇｇｃｔｇ ｃａｃａｇｇａｇａｇ−３’（Ｉ；配列番号４０）；
５’−ｃｔｃｔｇｇａｇａｔ ｇｇｔｇａａｔｃｇｇ ｃｃｃｔｔｃａｃａｃ ｔｇｔｃｔｇｇａｔａ ｇｔａｇｇｔｇｔａａ ｃｔａｃｃａｃｃａｃ ｔａｃｔａａｔｇｇｔ ｔｇｃａａｃｃｃａｃ−３’（Ｊ；配列番号４１）；
５’−ｃｃｔｔｃｔｔｇｃａ ｃａｇｔａａｔａａａ ｃａｇｃｃｇｔｇｔｃ ｃｔｃｔｇｃｔｃｔｃ ａｇａｃｔｇｔｔｃａ ｔｔｔｇｃａｇａｔａ ｃａｇｇｇｔｇｔｔｃ ｔｔｇｇｃａｔｔｇｔ−３’（Ｋ；配列番号４２）；および
５’−ｇａｃｃｇａｔｇｇｇ ｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇ ａｇｇｃｔｇａｇｇａ ｇａｃｔｇｔｇａｃｃ ａｇｇｇｔｃｃｃｔｔ ｇｇｃｃｃｃａｇｔａ ｇｔｃｃｇｔｃｇｔａ ａｔｃａｔａｇａｇｔ ｃａｃｃ−３’（Ｌ；配列番号４３）。
【０２１７】
以下の２つのＰＣＲプライマーを、上記のように合成する：
５’−ｔｔｇｇａｔａａｇｃ ｔｔｇｇｃｔｔｇａｃ−３’（Ｐ１；配列番号４４）；および
５’−ｇａｃｃｇａｔｇｇｇ ｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇ ａ−３’（Ｐ２；配列番号４５）。
【０２１８】
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端において８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＤＮＡの合成は、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して行う。
【０２１９】
ＤＮＡ
フラグメントは、以下のように調製する。
【０２２０】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
５０μｌの最終容量までの再蒸留水。
【０２２１】
ＰＣＲ反応を以下のように行う。溶液を最初に９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃１０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃１分間のサイクルを７回繰り返す。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０２２２】
等量のフェノール−クロロホルム（５０％ｖ／ｖ水飽和フェノール、４８％クロロホルム、２％ｖ／ｖイソアミルアルコール）を、２００μｌのそれぞれのＰＣＲ産物に加え、そして激しく１分間混合する。この時間の後に、この混合物を１０，０００×ｇで遠心分離し、そして水層を回収し、そして等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（９６％クロロホルムおよび４％ｖ／ｖイソアミルアルコール）と混合し、これを再び激しく１０，０００×ｇで混合し、そして水層を回収する。この段落に記載される一連の工程は、本明細書中、後において「フェノール抽出」と呼ぶ。
【０２２３】
次いで、エタノール沈殿を、回収された水層で行う。本明細書中で使用され、そして言及されるように、「エタノール沈殿」は、混合しながら、１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容量の１００％エタノールを処理される溶液に添加し、そしてドライアイスを使用してこの混合物を凍結することからなる。次いで、得られる混合物を、１０，０００×ｇで遠心分離して沈殿としてＤＮＡを回収する。
【０２２４】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後に、得られるＤＮＡ沈殿を、減圧乾燥し、最小量の再蒸留水に溶解し、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動の後に、ゲルを１μｇ／ｍｌ水溶液のエチジウムブロマイドで染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＴＲＡ−８ ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り取り、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してゲルから溶出する。次いで、フェノール抽出の後に、溶出されたＤＮＡを７，５００×ｇで遠心分離によって濃縮し、続いて、エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解する。
【０２２５】
得られたそれぞれの抽出されたＤＮＡを、以下のように、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングする：
ＰＣＲ反応から回収されたＤＮＡフラグメント、５μｌ；
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１μｌ；
ｄＮＴＰ混合物、１μｌ；
Ｔａｑポリメラーゼ（５単位／ｍｌ）、１μｌ；および
最終容量１０μｌまでの再蒸留した水。
【０２２６】
上記それぞれの溶液を７０℃で３０分間反応させた後、それぞれのＤＮＡ溶液およびｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、製造業者のプロトコルを使用して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して連結する。
【０２２７】
１５℃での４時間のインキュベーションの後に、２μｌのインキュベートされた反応溶液を、１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９と、１〜２×１０９細胞／ｍｌで混合し（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、そしてこの混合物を氷上で３０分間維持し、次いで、４２℃で３０秒間維持し、そして再び１分間氷上で維持する。次いで、５００μｌのＳＯＣ培地（２％ｖ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．０５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、２．５ｍＭｗ／ｖ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、および２０ｍＭグルコース）をこの混合物に加え、これをさらに１時間振盪しながらインキュベートする。次いで、形質転換株を単離し、そしてプラスミドＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」において記載されるようにこの株から調製する。ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするこれらのＤＮＡヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０２２８】
得られたプラスミドを、ｐＨＢ１４（ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）と呼ぶ。これらのプラスミド（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨＢ１４と呼ばれる）を有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株を、微生物の寄託に関するブタペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ １ ｃｈｏｍｅ Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５５６を与えられた。
【０２２９】
（（２）ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有する発現プラスミドの構築）
動物細胞についての組換え発現ベクターを、以下のように、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするＤＮＡ（上記においてクローン化された）を挿入することによって構築する。
【０２３０】
ヒト化抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを有する、１μｇのプラスミドｐＳＲＨＨＨ３（欧州特許出願ＥＰ０−９０９−８１６−Ａ１）（哺乳動物細胞に対する発現ベクター）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩを用いて消化し、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動の後に、ゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域を有さないヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを含むベクターＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り取り、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してゲルから溶出する。次いで、フェノール抽出の後に、溶出されたＤＮＡを７，５００×ｇで遠心分離によって濃縮し、続いて、エタノール沈降し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解し、次いで、ＣＩＰを使用して脱リン酸する。得られた、消化された、脱リン酸されたプラスミド（１００ｎｇ）を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して、１μｇのｐＨＢ１４ ＤＮＡフラグメント（ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含み、これはまた、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化されている）に連結する。次いで、連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、次いでこれを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に配置する。
【０２３１】
この方法によって得られる形質転換体を、３７℃で一晩、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌの液体ＬＢ培地中で培養し、続いてプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法によって得られた培養物から抽出する。
【０２３２】
抽出されたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして３％ｗ／ｖアガロースゲル電気泳動に供して、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの挿入物の存在および非存在を確認する。ベクターにおける所望のＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析機（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＮＡ配列決定によって確認する。ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを有する得られた発現プラスミドを、ｐＨＢ１４−１と呼ぶ。
【０２３３】
（実施例１９．ヒト化抗体の軽鎖のための発現ベクターの構築）
（（１）ＴＲＡ−８抗体のヒト化バージョンの軽鎖についてベクターの構築）
配列表の配列番号４６に示されるように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列のヒト化において、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端から第８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、第９番目のアミノ酸（リジン）、第１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、第１１番目のアミノ酸（メチオニン）、第１３番目のアミノ酸（スレオニン）、第２０番目のアミノ酸（セリン）、第４２番目のアミノ酸（グルタミン）、第４３番目（セリン）、第６０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、第６３番目のアミノ酸（スレオニン）、第７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、第７８番目のアミノ酸（バリン）、第８０番目のアミノ酸（セリン）、第８３番目のアミノ酸（ロイシン）、第８５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、第８７番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、および第９９番目のアミノ酸（グリシン）、第１０３番目のアミノ酸（ロイシン）および第１０８番目のアミノ酸（アラニン）は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られる配列を、ＬＭ２と名付ける。
【０２３４】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８のヒト化軽鎖アミノ酸のこの型を保有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０２３５】
（１）ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ２ポリペプチド鎖（配列表の配列番号４６）をコードするＤＮＡ（この各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合物である）は、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して合成される。
【０２３６】
さらに７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ（配列番号４８）について、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
５’−ｇｔｃｃｃｃｃａｃａ ｇａｔｇｃａｇａｃａ ａａｇａａｃｔｔｇｇ ａｇａｔｔｇｇｇｔｃ ａｔｃａｃａａｔｇｔ ｃａｃｃａｇｔｇｇａ−３’（ＨＫＳＰＲ１１；配列番号４９）；
５’−ｃｃａａｇｔｔｃｔｔ ｔｇｔｃｔｇｃａｔｃ ａｇｔａｇｇａｇａｃ ａｇｇｇｔｃａｃｃａ ｔｃａｃｃｔｇｃ−３’（ＨＫＣＤＦ１１；配列番号５０）；
５’−ａｇｔｇｔｇｃｃｇｇ ｇｔｇｇａｔｇｃｃｃ ａｇｔａａａｔｃａｇ ｔａｇｔｔｔａｇｇａ ｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇ ｇｔｔｔｃｔｇ−３’（ＨＫＣＤＲ１２；配列番号５１）；
５’−ｔｇｇｇｃａｔｃｃａ ｃｃｃｇｇｃａｃａｃ ｔｇｇｇｇｔｃｃｃａ ａｇｃａｇｇｔｔｔａ ｇｔｇｇｃａｇｔ−３’（ＨＫＣＤＦ２２；配列番号５２）；
５’−ａｔａａｃｔａｃｔａ ｔａｔｔｇｃｔｇａｃ ａｇｔａａｔａｇｇｔ ｔｇｃａａａａｔｃｃ ｔｃｃｇｇｃｔｇｃａ ｇａｃｔａｇａｇａｔ ｇｇｔ−３’（ＨＫＣＤＲ２２；配列番号５３）；および
５’−ｃａｇｃａａｔａｔａ ｇｃａｇｃｔａｔｃｇ ｇａｃｇｔｔｃｇｇｔ ｃａａｇｇｃａｃｃａ ａｇｇｔｇｇａａａｔ ｃａａａｃｇｇａｃｔ ｇｔｇ−３’（ＨＫＣＦ１２；配列番号５４）。
【０２３７】
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／Ｍ２−１の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖のクローニング））
配列表の配列番号４６に規定されるアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号５５に記載されるＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを、２段階のＰＣＲを行うことよって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニングする。
【０２３８】
（ａ）第１段階ＰＣＲ）
分泌シグナル配列および５’末端に付加されたＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素切断部位を有するＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド、ｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＰＤＨＨを、欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１の記載に従って入手する。
【０２３９】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１），２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＳＰＲ１１，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ），２．５単位。
【０２４０】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって最終容量５０μｌに調整し、そしてＰＣＲで使用する。
【０２４１】
ＰＣＲの熱的条件：９４℃で２分間加熱、その後９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱。
【０２４２】
ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、およびＣＤＲＬ２の一部をコードするＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２４３】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＬ２８ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＦ１１，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＲ１２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０２４４】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって最終容量５０μｌに調整し、そしてＰＣＲで使用する。
【０２４５】
ＰＣＲの熱的条件：９４℃で２分間加熱、その後９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱。
【０２４６】
ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＣＤＲＬ３の一部をコードするＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２４７】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１），２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＦ２２，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＲ２２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０２４８】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって最終容量５０μｌに調整し、そしてＰＣＲで使用する。
【０２４９】
ＰＣＲの熱的条件：９４℃で２分間加熱、その後９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱。
【０２５０】
ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および３’末端に付加されたＥｃｏＲ Ｉ制限酵素切断部位を有する定常領域をコードするＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２５１】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＦ１２，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０２５２】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって最終容量５０μｌに調整し、そしてＰＣＲで使用する。
【０２５３】
ＰＣＲの熱的条件：９４℃で２分間加熱、その後９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱。
【０２５４】
ＰＣＲ後の増幅したＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで染色して、生成したＤＮＡをＵＶ光下で検出する。このように検出したそれぞれのＤＮＡバンドを、カミソリの刃で切除する。
【０２５５】
（ｂ）第２段階ＰＣＲ）
ＬＭ２−ＤＮＡ（ここで、上記のＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡ、ＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡ、ＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡおよびＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントは融合している）を、以下の条件下で調製する。
【０２５６】
反応溶液の組成：
第１段階ＰＣＲで調製したＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡのＧｅｌフラグメント、
第１段階ＰＣＲで調製したＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡのＧｅｌフラグメント、
第１段階ＰＣＲで調製したＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡのＧｅｌフラグメント、
第１段階ＰＣＲで調製したＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡのＧｅｌフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０２５７】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって最終容量５０μｌに調整し、そしてＰＣＲで使用する。
【０２５８】
ＰＣＲの熱的条件：９４℃で２分間加熱、その後９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱。
【０２５９】
このように調製したＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを、製造者のプロトコルに従ってＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、そしてこのキットに含まれるコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用してジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら，（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０２６０】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／Ｍ２−１と名付ける（このプラスミドは、ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードｃＤＮＡを保有する）。
【０２６１】
ＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを含むこの得られたプラスミドｐＣＲ３．１／Ｍ２−１を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化する。
【０２６２】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いでＣＩＰで脱リン酸する。得られた脱リン酸ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡおよびＬＭ２−ＤＮＡフラグメント（これらは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化されている）を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡで形質転換し、そして０．１ｍＭのＩＰＴＧ、０．１％のＸ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に広げる。得られた白色の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリＳＤＳ法に従って得られた培地から抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いでＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを有するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。
【０２６３】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ２ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４が得られる。これらのプラスミドを含む形質転換体Ｅ ｃｏｌｉ菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５０α／ｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４と名付ける）を、微生物の寄託に関するブタペスト条約に従って、２００１年４月２０日にＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ １ ｃｈｏｍｅ Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに寄託し、そして登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６３を得た。
【０２６４】
（３）プラスミドｐＳＲ／Ｍ２−１（ヒト化ＬＭ２ ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
ヒト化ＬＭ２ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保有する得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化する。
【０２６５】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０−９０９−８１６−Ａ１）を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いでＣＩＰで脱リン酸する。得られた脱リン酸ｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡおよびｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４から得られるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結ＤＮＡで形質転換し、そしてＬＢ寒天上に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、得られた培養物からアルカリＳＤＳ法に従って抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および配向を、遺伝子配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０２６６】
ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを保有する得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／Ｍ２−１と名付ける。
【０２６７】
（実施例２０．ヒト化抗体の産生）
ＣＯＳ−７細胞（すなわち、サルの腎臓由来の細胞株）の、上記で得られたヒト化ＴＲＡ−８重鎖およびヒト化ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミドを用いるトランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）によってこのキットと共に提供される取扱説明書に従って行う。
【０２６８】
ＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）を、１０％ウシ胎仔血清（本明細書中以下では、「ＦＣＳ」と省略する；Ｍｏｒｅｇａｔｅ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（本明細書中以下で、「Ｄ−ＭＥＭ」と呼ぶ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む培養皿（培養面積：５７ｃｍ２；Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）で、半コンフルエント（３×１０６細胞／ディッシュ）まで増殖する。
【０２６９】
一方、アルカリＳＤＳ法および塩化セシウム密度勾配遠心分離によって調製した１０μｇ／ディッシュ（合計５ディッシュ）のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ１５−１）および１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡを混合し、次いでエタノールで沈殿させ、続いて５μｌ／ディッシュのｄＨ２Ｏ中に懸濁した。
【０２７０】
１５μｌ／ディッシュのＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を、ＦＣＳなしの１８０μｌ／ディッシュのＤ−ＭＥＭと混合した後、このＦＵＧＥＮＥ溶液（１８５μｌ／ディッシュ）を、１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡおよび１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡを含む５μｌ／ディッシュのＤＮＡ溶液と混合する。室温で１５分間のインキュベーション後、得られたプラスミド懸濁液（２００μｌ）を、以前に調製したＣＯＳ−７プレートに添加する。３７℃で５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした後、この培養培地をＦＣＳなしのＤ−ＭＥＭと交換する。３７℃で５％ＣＯ２中で７２時間インキュベートした後、培養上清を回収して、上清流体中の発現産物を精製する。上記の方法によって、ＣＯＳ−７細胞を、以下のプラスミドの組み合わせの各々でトランスフェクトする：
（Ａ）：プラスミドＤＮＡなし
（Ｂ）：ｐＨＢ１４−１およびｐＳＲ／Ｍ２−１の同時トランスフェクション。
【０２７１】
次いで、この培養物を遠心分離（１，０００ｒ．ｐ．ｍ．，５分間）し、そして上清を集める。この上清を再び遠心分離（９，８００ｒ．ｐ．ｍ．，１５分間）し、そして０．４５μｍのフィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹＯ ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ，Ｃａｔ＃２５ＣＳ０４５ ＡＳ）で濾過する。この濾液からのＩｇＧの精製を、以下の条件下でのタンパク質Ｇ−ＰＯＲＯＳアフィニティークロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって達成する：
ＨＰＬＣ：ＢｉｏＣＡＤ ７００Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
カラム：ＰｒｏｔｅｉｎＧ−ＩＤセンサカートリッジ（カラムサイズ：２．１ｍｍＩＤ×３０ｍｍＬＤ、吸着床の容量：０．１ｍｌ；Ｃａｔ＃２−１００２−００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
溶出緩衝液：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）
中和緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
検出：２８０ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
画分サイズ：０．５ｍｌ／０．５分
画分チューブ：１．５ｍｌのポリプロピレンマイクロチューブ
温度：４℃。
【０２７２】
全ての濾液をカラムに適用した後、３０ｍｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃１０００−３）を使用してカラムを洗浄する。溶出緩衝液を適用するときに、画分収集器を開始する。各画分マイクロチューブは、ＰＢＳ中の５５μｌの１Ｍ ＮａＣｌ、１１０μｌの中和緩衝液および７４μｌの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ａ−７０３０）を予め含んだ。Ｎｏ．８〜Ｎｏ．１０の画分を集め、そしてＳｌｉｄｅ−Ａ ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃６６４５０）を使用して４℃で１リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して１日透析する。透析緩衝液を、２回交換する。
【０２７３】
調製した培養物の上清流体中のヒト化抗体の発現の確認および発現産物の定量的アッセイを、抗ヒトＩｇＧに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡによって行う。
【０２７４】
９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）の各ウェルに、吸着緩衝液（０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中に最終濃度０．５μｌ／ｍｌで溶解した１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｋａｐｐｅｌ）を添加し、そしてこのプレートを３７℃で２時間インキュベートして、抗体を吸着させる。次いで、このプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＢｉｏＲａｄ）を含む３５０μｌのＰＢＳ（−）（本明細書中以降、「ＰＢＳ−Ｔ」と呼ぶ）で５回洗浄する。洗浄後、このウェルに、１０％のＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで希釈した培養物上清を添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔで再び洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈した１００μＩのアルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．）を各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔで再び洗浄した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｂｉｏ Ｒａｄ）から入手したｐ−ニトロフェニルホスフェートの基質溶液を、このキットと共に提供される取扱説明書に従って添加する。３７℃で０．５〜１時間インキュベートした後、４０５ｎｍでの吸光度を測定する。本実験において、１０％のＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで特定の濃度まで希釈したヒト血漿免疫グロブリンＧサブクラス１（ＩｇＧ１）（Ｂｉｏｐｕｒｅ ＡＧ）を、この培養物の上清流体に含まれるヒト化ＤＲ５抗体の濃度参照サンプルとして使用する。
【０２７５】
結果として、培養物の上清中の発現産物および精製産物を、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて特異的に検出する。ヒトＩｇＧ抗体の量は、８．９６μｇ（８００μｌ）である。
【０２７６】
（実施例２１．ヒト化抗体のアポトーシス誘導活性）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）を使用して、精製ヒト化ＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導活性を試験する。
【０２７７】
５％ＣＯ２の存在下で３７℃で３日間、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を、１ウェル当たり５０μｌで、９６ウェルのマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに分配する。実施例２０において調製したヒト化ＴＲＡ−８を、実施例２０に記載の方法に従ってその流体におけるその濃度を評価することによって、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、１００ｎｇ／ｍｌの目的の最終産物濃度を有するように調整する。このように１００ｎｇ／ｍｌに調節された発現産物の各溶液を使用して、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０での連続的な２倍希釈を繰り返すことによって、連続的な希釈物を生成する。各希釈ヒト化ＴＲＡ−８溶液を、１ウェル当たり５０μｌで各ウェルに添加する。３７℃で１２時間の反応後、１ｍｇ／ｍｌ ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内部塩；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む、２５μＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の５０μｌを添加する（ＸＴＴについて最終濃度２５０μｇ／ｍｌ、ＰＭＳについて最終濃度５μＭ）。３時間のインキュベーション後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定して、指標としてミトコンドリアの還元能力を使用することによって、細胞生存率を算定する。
【０２７８】
各ウェルにおける細胞生存率を、以下の式に従って算定する：
生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
ここで、「ａ」は、試験ウェルの測定値であり、「ｂ」は、細胞のないウェルの測定値であり、そして「ｃ」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
【０２７９】
結果として、実施例２０で調製された発現産物（ヒト化ＴＲＡ−８）は、ヒトＤＲ５抗原を発現するＴリンパ腫細胞株の細胞において、アポトーシスを誘導することが実証される。
【０２８０】
（実施例２２．種々のＤＲ５分子に対するＴＲＡ−８の反応性）
種々のＤＲ５分子に対するＴＲＡ−８の反応性を決定するために、ＴＲＡ−８の反応性を、以下のように活性化リンパ球を使用して試験する。
【０２８１】
第一に、末梢血サンプルを、ヒト（３０ｍｌ）、マーモセット（３ｍｌ）およびカニクイザル（２０ｍｌ）から採取する。この血液サンプルには１ｍｌのヘパリン（Ｎｏｖｏｈｅｐａｒｉｎ；Ｎｏｖｏ）が添加されており、次いで、これらのサンプルを、等容量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ溶液（（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）１．０７２の比重を有したカニクイザル以外は、全てについて比重１．０７７）上にゆっくりと重層し、そして末梢血単核細胞の画分を得るために、１，７００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離する。この単核細胞画分を、ハンクスバランス化塩溶液で２回洗浄し、次いで、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁する。植物性血液凝集素−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏ．）を、得られた懸濁液に最終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加し、そしてこのサンプルを、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で３７℃で２４時間インキュベートする。この時間の後、細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、そして１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁する。次いで、回収された細胞を活性化するために、インターロイキン−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｓｃｈ．）を、１０単位／ｍｌの最終濃度になるように懸濁液に添加し、そしてこれを５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で３７℃で７２時間インキュベートする。
【０２８２】
１×１０６の活性化リンパ球細胞を含むと算定された量の活性化調製物を、試験管に配置し、そしてＰＢＳ中の０．５、１、５、１０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８の５０μｌ、またはＰＢＳのみの５０μｌのいずれかに懸濁する。得られた懸濁液を、氷上に１時間静置し、その後、細胞を５００μｌのＰＢＳのアリコートで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ）の５０μｌに懸濁する。コントロールとして５００μｌのＰＢＳ中に懸濁した細胞を使用して、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、蛍光強度を測定する。
【０２８３】
蛍光強度によって細胞数の分布を得、そして総細胞の数に対する染色細胞の数の割合を算定する。さらに、各Ｋｄ値を、ＴＲＡ−８の濃度および総細胞の数に対する染色細胞の数の割合を使用して算定する。ヒト、マーモセットおよびカニクイザルの活性化リンパ球に対する反応性の各頻度は、ほぼ同じである。従って、ＴＲＡ−８は、ヒトを含む広範な霊長類ＤＲ５（ＴＲＡ−８は、このＤＲ５に対して元々調製される）に結合し得る。
【０２８４】
（実施例２３．マーモセットにおけるＴＲＡ−８の漸増用量研究）
ＴＲＡ−８の漸増用量の予備的毒性研究を、１匹の雄性マーモセットおよび１匹の雌性マーモセットを使用して実施する。７日間の中断期間によって隔てられた３セットの単一の静脈内投与を実行する。ＴＲＡ−８の用量は、一体当たり、５０、２５０および１２５０μｇと設定される。各処置の４８時間後、血液を大腿静脈から収集し、そして血漿を調製する。血漿のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの活性を、分析器（ＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ：Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して測定する。全ての血液を麻酔なしで採取する。結果として、肝障害を示す証拠は、各処置後の血漿生化学的試験において見られない。
【０２８５】
（実施例２４．癌細胞に対するＴＲＡ−８のインビトロおよびインビボの薬理学的研究）
ＴＲＡ−８が抗癌治療において治療的効力を有するか否かを決定するために、種々の癌細胞株を使用する、ＴＲＡ−８のインビトロ殺傷活性を以下のように試験する。
【０２８６】
３７℃で５％ＣＯ２の存在下で、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから得るＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊｕｒｋａｔ用に）、ＤＭＥＭ培地（ＨＣＴ−１１６用に）、ＭＥＭ−Ｒ（ＷｉＤｒ用に）またはＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＣＯＬ２−Ｊｃｋ用に）中で培養した種々の癌細胞（２〜８×１０３細胞／５０μｌ）を、９６ウェルのマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに分配する。ＴＲＡ−８を、１０％ＦＣＳを含む培地を用いて、１００ｎｇ／ｍｌの目的の最終産物濃度を有するように調整する。ＴＲＡ−８溶液（１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して、１０％ＦＣＳを含む培地で連続する２倍希釈を繰り返すことによって、連続的な希釈物を生成する。希釈された各ＴＲＡ−８溶液を、１ウェル当たり５０μｌで各ウェルに添加し、そして３７℃でインキュベートする。３７℃で７２時間の反応後、１ｍｇ／ｍｌ ＸＴＴを含む２５μＭ ＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の５０μｌを添加する（ＸＴＴについて最終濃度２５０μｇ／ｍｌ、ＰＭＳについて最終濃度５μＭ）。３時間のインキュベーション後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定して、指標としてミトコンドリアの還元能力を使用することによって、細胞生存率を算定する。
【０２８７】
各ウェル中の細胞生存率を、以下の式に従って算定する：
生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
ここで、「ａ」は、試験ウェルの測定値であり、「ｂ」は、細胞のないウェルの測定値であり、そして「ｃ」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
【０２８８】
これらの結果を、以下の表３に示す。
【０２８９】
【表３】
Figure 0004156238
種々の癌細胞株は、インビトロ条件下でＴＲＡ−８によってアポトーシスを強く誘導される。
【０２９０】
さらに、ＷｉＤｒ細胞を移植されたヌードマウスにおけるＴＲＡ−８のインビボの抗腫瘍効果を決定する。なぜなら、ＴＲＡ−８はマウスＤＲ５と交差反応しないからである。
【０２９１】
ＴＲＡ−８抗ヒトＤＲ５抗体を、ヒトＤＲ５分子を発現するヒト異種移植片を保持するヌードマウスに投与する。使用するマウスは、６週齢のＢＡＬｂ／ｃヌード／ヌードマウス（雌性、Ｃｌｅａ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．から）であり、これは、ヒト結腸癌細胞株ＷｉＤｒ（５ｍｍ３）を移植された。腫瘍移植後１日目に、これらの移植されたマウスを、ＴＲＡ−８（一体当たり５μｇ）の関節内注射で、１４回まで毎日処置する。ＷｉＤｒ腫瘍増殖を、腫瘍塊のサイズによって毎日決定する。これらの結果を、以下の表４に示す。
【０２９２】
【表４】
Figure 0004156238
処置した動物における腫瘍増殖は、腫瘍のサイズによって実証されるように、阻害される。この結果は、ＴＲＡ−８がインビボの腫瘍細胞の排除において有効であることを示した。
【０２９３】
（実施例２５．ＴＲＡ−８の組み合わせ研究）
ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得て、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％Ｌ−グルタミン−２００ｍＭ（２５０３０−１４９、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および０．５％ペニシリン ストレプトマイシン溶液（Ｐ−７５３９、Ｓｉｇｍａ）を含むＦ−１２Ｋ栄養混合物（２１１２７−０２２、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中に維持する。１０％ＦＢＳおよび０．５％ペニシリン ストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＥＤ−００８、ＩＷＡＫＩ）を、以下の実験に使用する。指数関数的に増殖するＰＣ−３細胞をトリプシン処理によって収集し、そして新鮮な培地で２回洗浄する。次いで、これらの細胞を計数し、５×１０４細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に再懸濁し、そして実験開始の１日前に、１００μｌ／ウェルの総容積で、平底の９６ウェルプレート（３５９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔｅｒ）中に三連で分配する。ジメチルスルフォキシド（１０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解させた、代表的な抗癌薬物であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌ（１６９−１６８１１、Ｗａｋｏ）を新鮮な培地で希釈し、次いで、５０μｌ／ウェルで細胞を含む９６ウェルのプレートに添加する。ジメチルスルフォキシドの最終濃度は、０．１％未満である。５％ＣＯ２雰囲気における３７℃での２４時間のインキュベーション後、新鮮な培地で希釈したＴＲＡ−８を、これらのウェルに添加する。さらに２４時間のインキュベーション後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴおよび２５ｍＭのＰＭＳを含む最少必須培地（１１０９５−０９８、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の５０μｌをこれらのウェルに添加し、そしてこのプレートを６時間インキュベートする。次いで、ＯＤ４５０を、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定し、そして細胞生存率を以下のように算定する。
【０２９４】
細胞生存率（％）＝（Ｔａｘｏｌおよび／またはＴＲＡ−８（因子）で処置した細胞を含むウェルについてのＯＤ４５０−細胞も因子も含まないウェルについてのＯＤ４５０）×１００／（細胞を含み因子を含まないウェルについてのＯＤ４５０−細胞も因子も含まないウェルについてのＯＤ４５０）。
【０２９５】
代表的な抗癌薬物であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌと組み合わせたＴＲＡ−８についての上記のアッセイの結果は、以下である。Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌは、ＰＣ−３細胞の細胞生存率を減少させたが、生存癌細胞を示す４０％より高いシグナルは、２００ｎＭまでの濃度でなお維持された。特に、０．１ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８の添加は、この濃度でのＴＲＡ−８の一回の適用後に細胞生存率に減少が見られなくても、癌細胞の細胞生存率を１０％まで大きく減少させた。この結果は、明らかに、他の抗癌薬物と組み合わせた場合に、ＴＲＡ−８が相乗的に抗癌活性を示したことを示す。
【０２９６】
（実施例２６．ＴＲＡ−８の他の型のヒト化抗体の分析）
（（１）ヒト化抗体の設計）
ＴＲＡ−８のヒト化バージョンの構築を、ＣＤＲグラフト化として一般に公知の方法によって実施する。ｍＡＢ５８’ＣＬ抗体を、参照実施例２に記載のようにアクセプターとして使用し、そして、ＴＲＡ−８抗体のＣＤＲ領域を、このアクセプター上にグラフト化する。フレームワーク領域において、いくつかのアミノ酸を、Ｑｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられた規準によって、ＴＲＡ−８またはヒトコンセンサス配列のいずれか由来のアクセプター上にグラフト化し、そしてヒト化ＴＲＡ−８配列を、本明細書中以下に記載のように構築する。
【０２９７】
（（２）他の型のヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有するプラスミドの構築）
配列表の配列番号５６に示すように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のＨ１型ヒト化は、３番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、４０番目のアミノ酸（スレオニン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン酸）、４４番目のアミノ酸（アルギニン）、８４番目のアミノ酸（セリン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシンおよびバリンによる置換を伴った。
【０２９８】
配列表の配列番号５９に示すように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のＨ３型ヒト化は、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、４０番目のアミノ酸（スレオニン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン酸）、４４番目のアミノ酸（アルギニン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびバリンによる置換を伴った。
【０２９９】
配列表の配列番号６０に示すように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のＨ４型ヒト化は、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、アルギニン、アラニン、バリン、ロイシンおよびバリンによる置換を伴った。
【０３００】
配列表の配列番号６１に示すように、キメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有するプラスミドを、「Ｍ型」と名付ける。さらに、実施例１７および１８に記載のヒト化ＴＲＡ−８を、「Ｈ２型」と名付ける。
【０３０１】
ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを有するプラスミドを、以下のように構築する。
【０３０２】
ＰＣＲを使用して、以下のＤＮＡ配列を構築する。これらの配列の各々は、上記を含んだ：
以下の２４個のオリゴヌクレオチドを合成する：
【０３０３】
【化１】
Figure 0004156238
【０３０４】
【化２】
Figure 0004156238
【０３０５】
【化３】
Figure 0004156238
以下の２つのＰＣＲプライマーを、上記のように合成する：
【０３０６】
【化４】
Figure 0004156238
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域、およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端で８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＨ１型ＤＮＡの合成を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して実行する。
【０３０７】
Ｈ１型ＤＮＡフラグメントを以下のように調製する。
【０３０８】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容積５０μｌまでの再蒸留水。
【０３０９】
ＰＣＲ反応を、以下のように行なう。この溶液を、最初９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間加熱するサイクルを７回繰り返す。この手順の完了後、この反応溶液を、７２℃で１５分間加熱する。
【０３１０】
フェノール抽出およびエタノール沈殿後、得られたＤＮＡ沈殿物を、真空乾燥し、最小の再蒸留水に溶解し、そして３％のアガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。Ｈ１型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇで遠心分離、その後エタノール沈殿によって濃縮し、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解する。
【０３１１】
分泌シグナル配列（ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端における８個のアミノ酸残基）を含むポリペプチド鎖をコードするＨ３型ＤＮＡの合成を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３１２】
Ｈ３型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３１３】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰ ｍｉｘ、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
５０μｌの最終容積になるような再蒸留水。
【０３１４】
このＰＣＲ反応を、以下のように行なう。この溶液を、最初９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間加熱するサイクルを７回繰り返す。この手順の完了後、この反応溶液を、７２℃で１５分間加熱する。
【０３１５】
フェノール抽出およびエタノール沈殿後、得られたＤＮＡ沈殿物を、真空乾燥し、最小の再蒸留水に溶解し、そして３％のアガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。Ｈ３型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇで遠心分離、その後エタノール沈殿によって濃縮し、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解する。
【０３１６】
分泌シグナル配列（ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端における８個のアミノ酸残基）を含むポリペプチド鎖をコードするＨ４型ＤＮＡの合成を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３１７】
Ｈ４型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３１８】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰ ｍｉｘ、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
５０μｌの最終容積になるような再蒸留水。
【０３１９】
ＰＣＲ反応を、以下のように行なう。この溶液を、最初９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間加熱するサイクルを７回繰り返す。この手順の完了後、この反応溶液を、７２℃で１５分間加熱する。
【０３２０】
フェノール抽出およびエタノール沈殿後、得られたＤＮＡ沈殿物を、真空乾燥し、最小の再蒸留水に溶解し、そして３％のアガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。Ｈ４型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇで遠心分離、その後エタノール沈殿によって濃縮し、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解する。
【０３２１】
分泌シグナル配列（キメラＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端における８個のアミノ酸残基）を含むポリペプチド鎖をコードするＭ型ＤＮＡの合成を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３２２】
Ｍ型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３２３】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰ ｍｉｘ、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
５０μｌの最終容積になるような再蒸留水。
【０３２４】
ＰＣＲ反応を、以下のように行なう。この溶液を、最初９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間加熱するサイクルを７回繰り返す。この手順の完了後、この反応溶液を、７２℃で１５分間加熱する。
【０３２５】
フェノール抽出およびエタノール沈殿後、得られたＤＮＡ沈殿物を、真空乾燥し、最小の再蒸留水に溶解し、そして３％のアガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。Ｍ型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇで遠心分離、その後エタノール沈殿によって濃縮し、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解する。
【０３２６】
得られた、各抽出されたＤＮＡ（Ｈ１型、Ｈ３型、Ｈ４型およびＭ型）を、以下のようにｐＧＥＴ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングする：
ＰＣＲ反応物から回収されたＤＮＡフラグメント（Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４またはＭ）、５μｌ；
１０×Ｔａｑ ポリメラーゼ緩衝液、１μｌ；
ｄＮＴＰ混合物、１μｌ；
Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット／ｍｌ）、１μｌ；および、
１０μｌの最終容積になるような再蒸留水。
【０３２７】
上の各溶液を７０℃で３０分間反応した後、各ＤＮＡ溶液およびｐＧＥＴ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、製造者のプロトコルを使用してＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用して連結する。
【０３２８】
１５℃で４時間のインキュベーション後、２μｌのインキュベートした反応溶液を、１〜２×１０９細胞／ｍｌの細胞密度で１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）と混合し、そしてこの混合物を、３０分間氷上に置き、次いで３０秒間４２℃にし、そして再び氷上に１分間置く。次いで、５００μｌのＳＯＣ培地（２％ ｖ／ｖのトリプトン、０．５％ ｗ／ｖの酵母抽出物、０．０５％ｗ／ｖの塩化ナトリウム、２．５ｍＭ ｗ／ｖの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび２０ｍＭのグルコース）を混合物に添加し、これを、攪拌しながら、さらに１時間インキュベートする。次いで、形質転換した株を、単離し、そしてプラスミドＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」に記載されるようにこの株から調製する。ヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の重鎖をコードするこのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ分析機（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、それぞれ、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０３２９】
この得られたプラスミドを、ｐＨＡ１５（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ１型重鎖をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド）、ｐＨＣ１０（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ３型重鎖をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド）、ｐＨＤ２１（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ４型重鎖をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド）およびｐＭ１１（キメラＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド）と命名する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨＡ１５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨＣ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＨＤ２１およびＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭ１１と命名された、これらのプラスミドを有する形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、２００１年４月２０日、微生物の寄託のためのブタペスト条約に従って、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ １ ｃｈｏｍｅ Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに寄託し、そして登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５５５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７５５７、ＦＥＲＭ ＢＰ−７５５８およびＦＥＲＭ ＢＰ−７５５９を、それぞれ与えられた。
【０３３０】
（（３） 幾つかの型のヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有する発現プラスミドの構築）
動物細胞のための組換え発現ベクターを、以下のようにＨ１型ヒト化ＴＲＡ−８、Ｈ３型ヒト化ＴＲＡ−８およびＨ４型ヒト化ＴＲＡ−８またはＭ型キメラＴＲＡ−８（上でクローニングした）の重鎖をコードするＤＮＡを挿入することによって構築する。
【０３３１】
１μｇのヒト化抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７ＡおよびヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡの重鎖可変領域を有するプラスミドｐＳＲＨＨＨ３（ヨーロッ特許登録番号ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１）（哺乳動物細胞のための発現ベクター）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩを用いて消化し、そして３％のアガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、このゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの水溶液で染色して、ＵＶ光下でＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域を含まず、ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを含むベクターＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇで遠心分離、その後エタノール沈殿によって濃縮し、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解し、次いでＣＩＰを使用して脱リン酸化する。この得られた、消化した脱リン酸化プラスミド（１００ｎｇ）を、ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むｐＨＡ１５、ｐＨＣ１０、ｐＨＤ２１またはｐＭ１１の１μｇのＤＮＡフラグメントと連結する。これらをまた、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化する。次いで、この連結混合物を、使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、次いでこれを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢアガープレート上にプレートする。
【０３３２】
この方法によって得られた形質転換物を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、次いでプラスミドＤＮＡを、アルカリＳＤＳ法によって得られた培養物から抽出する。
【０３３３】
この抽出されたプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして３％ ｗ／ｖのアガロースゲル電気泳動に供して、ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの挿入物の存在または非存在を確認する。ベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析機（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＤＮＡ配列決定によって確認する。このヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを有する得られた発現プラスミドを、それぞれ、ｐＨＡ１５−１、ｐＨＣ１０−３、ｐＨＤ２１−１およびｐＭ１１−１と命名した。
【０３３４】
（（４）ヒト化軽鎖に関するベクターの構築）
（（４．１）ヒト化抗体（ＬＭ１型）の軽鎖に関する発現ベクターの構築）
配列表の配列番号７２に示されるように、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端から、３番目のアミノ酸（バリン）、８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、９番目のアミノ酸（リジン）、１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、１１番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（スレオニン）、２０番目のアミノ酸（セリン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン）、４３番目のアミノ酸（セリン）、６０番目のアミノ酸（アルパラギン酸）、６３番目のアミノ酸（スレオニン）、７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、７８番目のアミノ酸（バリン）、８０番目のアミノ酸（セリン）、８３番目のアミノ酸（ロイシン）、８５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、８７番目のアミノ酸（フェニルアラニン）および９９番目のアミノ酸（グリシン）、１０３番目のアミノ酸（ロイシン）ならびに１０８番目のアミノ酸（アラニン）の置換を必要としたマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化（ＬＭ１型）は、それぞれ、グルタミン、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。この得られた配列を、ＬＭ１と命名する。
【０３３５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８のヒト化軽鎖アミノ酸配列（ＬＭ１型、配列表の配列番号７２）のこの型を有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０３３６】
（１）ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１型）の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ１ポリペプチド鎖（配列表の配番号７２）をコードするＤＮＡ（これらのそれぞれは、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖（ＬＭ１型）の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合体である）を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用して合成する。
【０３３７】
さらに７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）、７ＡＬＣＮ（配列番号４８）、ＨＫＣＤＦ１１（配列番号５０）、ＨＫＣＤＲ１２（配列番号５１）、ＨＫＣＤＦ２２（配列番号５２）、ＨＫＣＤＲ２２（配列番号５３）およびＨＫＣＦ１２（配列番号５４）を合成する。
【０３３８】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
５’−ｇｔｃｃｃｃｃａｃａ ｇａｔｇｃａｇａｃａ ａａｇａａｃｔｔｇｇ ａｇａｔｔｇｇｇｔｃ ａｔｃｔｇａａｔｇｔ ｃａｃｃａｇｔｇｇａ−３’（ＨＫＳＰＲ１２；配列番号７７）。
【０３３９】
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖型ＬＭ１のクローニング））
同一の配列番号７２に定義されるようなアミノ酸をコードするＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施することによって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉにクローニングする。
【０３４０】
（ａ）第１工程のＰＣＲ）
分泌シグナル配列をコードするＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントおよび５’末端に添加されたＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を有するＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド、ｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＰＤＨＨを、欧州特許出願番号ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１における説明に従って得る。
【０３４１】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー ７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー ＨＫＳＰＲ１２ ５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），２．５ユニット。
【０３４２】
上の組成を有する反応溶液に、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調節し、そしてＰＣＲに使用する。
【０３４３】
ＰＣＲ熱条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、その後７２℃で１０分間加熱する。
【０３４４】
ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２の一部をコードするＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０３４５】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＬ２８ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー ＨＫＣＤＦ１１，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー ＨＫＣＤＲ１２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５ユニット。
【０３４６】
上の組成を有する反応溶液に、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調節し、そしてＰＣＲに使用する。
【０３４７】
ＰＣＲ熱条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰り返し、その後７２℃で１０分間加熱する。
【０３４８】
ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３およびＣＤＲＬ３の一部をコードするＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０３４９】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー ＨＫＣＤＦ２２，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー ＨＫＣＤＲ２２ ５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５ユニット。
【０３５０】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３５１】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３５２】
ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および３’末端に付加されたＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を有する定常領域をコードするＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件で調製する。
【０３５３】
反応溶液組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＦ１２、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０３５４】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３５５】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３５６】
ＰＣＲ後の増幅したＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで電気泳動後のゲルを染色し、紫外線下で、生成したＤＮＡを検出する。このようにして検出されたＤＮＡバンドを、カミソリの刃で摘出する。
ｂ）第２工程のＰＣＲ
上記のＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを融合したＬＭ１−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５．０μｌ
ｌ０×ＰＣＲ緩衝液、５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、２．５単位。
【０３５７】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３５８】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３５９】
このように調製したＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、製造者のプロコトルに従ってＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡの中に挿入し、そしてこのキットに含まれるコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’の中へ導入する。ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１タイプ）の軽鎖をコードしたこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用し、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７）で確認する。
【０３６０】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２（ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１タイプ）の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド）として指定した。
【０３６１】
ＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０３６２】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した、得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ バーション２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをこの連結したＤＮＡで形質転換し、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に播く。得られた白色の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ方法に従って得られた培養物から抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いでＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを保持するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動で選択する。
【０３６３】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ１ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇＫ鎖定常領域の融合フラグメントを保持するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２を得る。これらのプラスミドを保有した形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２として表される）を、微生物寄託に関するブタベスト条約に従って、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に、２００１年４月２０日に寄託し、登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６２が与えられた。
【０３６４】
（ ３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ１−２ （ヒト化ＬＭ１ ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
ヒト化ＬＭ１ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保持する、得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化する。
【０３６５】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１）を、制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いでＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化したｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ、およびｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ バージョン２．０ （Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ， Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを連結したＤＮＡで形質転換し、ＬＢ寒天に播種する。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って得られた培養物から抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中にある所望のＤＮＡフラグメントの挿入と方向づけを、遺伝子配列アナライザーを使用してＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０３６６】
ヒト化ＬＭ１ ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを保持する得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ１−２として表す。
【０３６７】
（（４．２）ヒト化抗体（ＬＭ３タイプ）の軽鎖についての発現ベクターの構築）
配列表の配列番号７３に示されているように、ＴＲＡ−８軽鎖アミノ酸配列のＮ末端から、第８位アミノ酸（ヒスチジン）、第９位アミノ酸（リジン）、第１０位アミノ酸（フェニルアラニン）、１１位アミノ酸（メチオニン）、第１３位アミノ酸（スレオニン）、第２０位アミノ酸（セリン）、第４２位アミノ酸（グルタミン）、第４３位アミノ酸（セリン）、第７７位アミノ酸（アスパラギン）、第７８位アミノ酸（バリン）、第８０位アミノ酸（セリン）、第８３位アミノ酸（ロイシン）、第８５位アミノ酸（アスパラギン酸）、第８７位アミノ酸（フェニルアラニン）、第９９位アミノ酸（グリシン）、第１０３位アミノ酸（ロイシン）および第１０８位アミノ酸（アラニン）を置きかえること伴った、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸の他のヒト化（ＬＭ３タイプ）は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置き換えられる。得られた配列を、ＬＭ３として表す。
【０３６８】
抗ヒトＤＲ５ 抗体ＴＲＡ−８のヒト化軽鎖アミノ酸配列のこのタイプ（ＬＭ３タイプ、配列表の配列番号７３）を保持する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０３６９】
１）ヒト化ＬＭ３ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ３ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７３）をコードするＤＮＡ（各々は、ヒト化抗ＤＲ５ 抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域の融合である）を、ＰＣＲを組み合わせて使用してそれぞれ合成する。
【０３７０】
さらに、７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ （配列番号４８）について、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０３７１】
【化５】
Figure 0004156238
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖タイプＬＭ３のクローニング）の構築）
配列表の配列番号７３で定義されるアミノ酸配列をコードするＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを使用して調製し、プラスミドベクター中へ挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉにクローニングする。
ａ）第１工程のＰＣＲ
５’末端に付加されたＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を有する分泌シグナル配列領域、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４ならびに定常領域部分をコードするＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡフラグメントを以下の条件で調製する。
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
ｌ０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、２．５単位。
【０３７２】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３７３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３７４】
３’末端に付加されたＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を有する定常領域の部分をコードするＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを以下の条件で調製する。
【０３７５】
テンプレートプラスミド、ｐＳＲＰＤＨＨを以下の欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１の記載に従って得る。
【０３７６】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
ｌ０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、２．５単位。
【０３７７】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３７８】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３７９】
ＰＣＲ後の増幅したＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後のゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色し、生成したＤＮＡを紫外線下で検出する。このようにして検出されたＤＮＡバンドをカミソリの刃で摘出する。
ｂ）第２工程のＰＣＲ
上記のＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡフラグメント、およびＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを融合したＬＭ３−ＤＮＡを、以下の条件で調製する：
反応溶液の組成：
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程のＰＣＲで調製されたＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ， ５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ， ５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５．０μｌ
ｌ０×ＰＣＲ緩衝液、５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、２．５単位。
【０３８０】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終体積となるように調節し、そしてＰＣＲにおいて用いる。
【０３８１】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、熱サイクル（９４℃を１分間、５５℃で１分間そして７２℃で２分間）を、３０回繰り返し、その後、７２℃で１０分間加熱する。
【０３８２】
このようにして調製したＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、製造者のプロコトルに従ってＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡの中に挿入し、そしてこのキットに含まれるコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’の中へ導入する。ヒト化ＬＭ３ ＴＲＡ−８の軽鎖をコードしたこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用し、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７）で確認する。
【０３８３】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４（ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド）として指定する。
【０３８４】
ＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０３８５】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡフラグメントおよび制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ バーション２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをこの連結したＤＮＡで形質転換し、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に播く。得られた白色の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ方法に従って、得られた培養物から抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いでＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを保持するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動で選択する。
【０３８６】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ３ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保持するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２を得る。これらのプラスミドを保有した形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２として表される）を、微生物寄託に関するブタベスト条約に従って、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に、２００１年４月２０日に寄託し、登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６４が与えられた。
【０３８７】
（３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０ （ヒト化ＬＭ３ ＴＲＡ−８軽鎖に対する発現プラスミド）の構築）
ヒト化ＬＭ１ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを保持する、得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０３８８】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いでＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化したｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡおよびｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ バージョン２．０ （Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ， Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを連結したＤＮＡで形質転換し、ＬＢ寒天に播種する。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って得られた培養物から抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中にある所望のＤＮＡフラグメントの挿入と方向づけを、遺伝子配列アナライザー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０３８９】
ヒト化ＬＭ３ ＴＲＡ−８軽鎖をコードするｃＤＮＡを保持する得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０として表す。
【０３９０】
（（４．３）ヒト化抗体（ＬＭ４型）の軽鎖についての発現ベクターの構築） 配列表の配列番号７４に示されるように、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端から８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、９番目のアミノ酸（リジン）、１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、１１番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（スレオニン）、２０番目のアミノ酸（セリン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン）、４３番目のアミノ酸（セリン）、７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、７８番目のアミノ酸（バリン）、８０番目のアミノ酸（セリン）、８３番目のアミノ酸（ロイシン）、８５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、９９番目のアミノ酸（グリシン）、１０３番目のアミノ酸（ロイシン）および１０８番目のアミノ酸（アラニン）を置換する必要があるマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化（ＬＭ４型）は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られた配列を、ＬＭ４と表記する。
【０３９１】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ４型）のこの型のヒト化軽鎖アミノ酸配列（配列表の配列番号７４）を有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０３９２】
（１）ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ４ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７４）をコードするＤＮＡ（この各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合である）を、各々、ＰＣＲの組合せを使用することによって合成する。
【０３９３】
さらに、７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）、７ＡＬＣＮ（配列番号４８）、ＭＯＤ１Ｆ１（配列番号７８）、ＭＯＤ１Ｒ１（配列番号７９）、ＭＯＤ１Ｆ２２（配列番号８０）、ＭＯＤ１Ｒ２２（配列番号８１）、ＭＯＤ１Ｆ３（配列番号８２）、ＭＯＤ１Ｒ３（配列番号８３）、ＭＯＤ１Ｆ４２（配列番号８４）、ＭＯＤ１Ｒ４（配列番号８５）、ＭＯＤ１Ｆ５（配列番号８６）、ＭＯＤ１Ｒ５２（配列番号８７）、ＭＯＤ１Ｆ７（配列番号９０）、およびＭＯＤ１Ｒ７（配列番号９１）、ＬＲ１７（配列番号１０１）に対する、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０３９４】
【化６】
Figure 0004156238
(２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ４型のクローニング））
配列表の配列番号７４に規定されるようなアミノ酸配列をコードするＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施することによって調製し、プラスミドべクアーに挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ中でクローニングする。
【０３９５】
ａ）第一工程のＰＣＲ
５’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素切断部位が付加された分泌シグナル配列領域、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、およびＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４、ならびに定常領域の一部分をコードするＬＭ４−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０３９６】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終容積に調節し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０３９７】
ＰＣＲ熱条件：９４℃で２分間の加熱、次いで９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰返し、次いで、７２℃で１０分間の加熱。
【０３９８】
３’末端にＥｃｏ Ｒ Ｉ制限酵素切断部位が付加された定常領域の一部分をコードするＬＭ４−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０３９９】
テンプレートプラスミド（ｐＳＲＰＤＨＨ）を、欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１における記載に基づいて得た。
反応溶液の組成：
プラスドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０４００】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終容積に調節し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４０１】
ＰＣＲ熱条件：９４℃で２分間の加熱、次いで９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰返し、次いで、７２℃で１０分間の加熱。
【０４０２】
ＰＣＲ後の増幅したＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後のゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色して、ＵＶ光下で、生成したＤＮＡを検出する。次いで、このように検出された各ＤＮＡバンドを、かみそりの刃で切断する。
【０４０３】
ｂ）第二の工程のＰＣＲ
上記のＬＭ４−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡおよびＬＭ４−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡフラグメントが融合されたＬＭ４−ＤＮＡを、以下の条件下で調節する。
反応溶液の組成：
第一工程のＰＣＲで調製されたＬＭ４−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第一工程のＰＣＲで調製されたＬＭ４−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０４０４】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留した水を添加することによって５０μｌの最終容積に調節し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４０５】
ＰＣＲ熱条件：９４℃で２分間の加熱、次いで９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の熱サイクルを３０回繰返し、次いで、７２℃で１０分間の加熱。
【０４０６】
このように調製されたＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡクローニングキット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコルに従って、プラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、そしてこのキットに含まれる成分Ｅ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−４の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０４０７】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３（ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域とヒトＩｇ軽鎖定常領域とをコードするｃＤＮＡを有するプラスミド）と表記する。
【０４０８】
ＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化する。
【０４０９】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡおよびＬＭ４−ＤＮＡフラグメント（これらは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化されている）を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ、Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結されたＤＮＡで形質転換し、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％ Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地に広げる。得られた白色の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地において培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って、得られた培養物から抽出する。この抽出したプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いでＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを有するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。
【０４１０】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１を得る。これらのプラスミドを有するこの形質転換体Ｅ ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１と表記される）を、微生物に寄託に関するブタベスト条約に従って、２００１年４月２０日に、（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（３０５−５４６６、日本国茨城県つくば市東１町目１番地１号）に寄託して、登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６５を得た。
【０４１１】
（３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３（ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを有する、得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化する。
【０４１２】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１）を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。ｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１から得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ、Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結されたＤＮＡで形質転換し、そしてＬＢ寒天に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地において培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って、得られた培養物から抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクターへの所望のＤＮＡフラグメントの挿入および配向を、遺伝子配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０４１３】
ヒト化ＬＭ４ ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを有する、得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３と表記する。
【０４１４】
（（４．４）ヒト化抗体（ＬＭ５型）の軽鎖についての発現ベクターの構築） 配列表の配列番号７５に示されるように、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端から８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、９番目のアミノ酸（リジン）、１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、１１番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（スレオニン）、２０番目のアミノ酸（セリン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン）、４３番目のアミノ酸（セリン）、７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、７８番目のアミノ酸（バリン）、８０番目のアミノ酸（セリン）、８３番目のアミノ酸（ロイシン）、１０３番目のアミノ酸（ロイシン）および１０８番目のアミノ酸（アラニン）を置換する必要があるマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化（ＬＭ５型）は、各々、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、バリンおよびスレオニンで置換される。得られた配列をＬＭ５と表記する。
【０４１５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ５型）のこの型のヒト化軽鎖アミノ酸配列）（配列表の配列番号７５）を有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０４１６】
１）ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成
ＬＭ５ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７５）をコードするＤＮＡ（その各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合物である）を、それぞれＰＣＲの組み合わせを用いて合成する。
【０４１７】
さらに、７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）、７ＡＬＣＮ（配列番号４８）、ＭＯＤ１Ｆ１（配列番号７８）、ＭＯＤ１Ｒ１（配列番号７９）、ＭＯＤ１Ｆ２２（配列番号８０）、ＭＯＤ１Ｒ２２（配列番号８１）、ＭＯＤ１Ｆ３（配列番号８２）、ＭＯＤ１Ｒ３（配列番号８３）、ＭＯＤ１Ｆ４２（配列番号８４）、ＭＯＤ１Ｒ４（配列番号８５）、ＭＯＤ１Ｒ５２（配列番号８７）、ＭＯＤ１Ｆ７（配列番号９０）、およびＬＲ１７（配列番号１０１）に対して、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０４１８】
【化７】
Figure 0004156238
２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖型ＬＭ５のクローニング）
配列表の配列番号７５に規定されたアミノ酸配列をコードするＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを行うことにより調製し、プラスミドベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングする。
【０４１９】
ａ）第１工程ＰＣＲ
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位が付加された分泌シグナル配列領域、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および定常領域の一部分をコードするＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡフラグメントを以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５ユニット。
【０４２０】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより最終容量５０μｌに調節し、ＰＣＲで用いる。
【０４２１】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて、７２℃で１０分間加熱。
【０４２２】
３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位が付加された定常領域の一部分をコードするＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミドｐＳＲＰＤＨＨを欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１における記載に従うことにより得る。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５ユニット。
【０４２３】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより最終容量５０μｌに調節し、ＰＣＲで用いる。
【０４２４】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて、７２℃で１０分間加熱。
【０４２５】
ＰＣＲ後に増幅されたＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色して、生成したＤＮＡをＵＶ光下で検出する。このようにして検出されたそれぞれのＤＮＡバンドを、カミソリの刃で切り出す。
【０４２６】
ｂ）第２工程ＰＣＲ
上記のＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡフラグメントが融合したＬＭ５−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲで調製したＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント
第１工程ＰＣＲで調製したＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５ユニット
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより最終容量５０μｌに調節し、ＰＣＲで用いる。
【０４２７】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて、７２℃で１０分間加熱。
【０４２８】
このようにして、調製したＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡクローニングキット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、そしてキット中に含まれるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＤＮＡ分析器を用いて、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）により確認する。
【０４２９】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２（このプラスミドは、ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを有する）と名付ける。
【０４３０】
ＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４３１】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡおよびＬＭ５−ＤＮＡフラグメント（これらは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化された）を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、連結したＤＮＡで形質転換し、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％ Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール（終濃度）を含むＬＢ寒天培地に播種する。得られた白色の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地で培養し、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法（ａｌｋａｌｉｎｅ−ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ）に従って、得られた培養物から抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを保有するクローンを１％アガロースゲル電気泳動により選択する。
【０４３２】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７が得られる。
【０４３３】
３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１（ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築
ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４３４】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａｌ）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡおよびｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、連結したＤＮＡで形質転換し、そしてＬＢ寒天に播種する。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法に従って、得られた培養物から抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および配向を、遺伝子配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＤＮＡ配列決定することにより確認する。
【０４３５】
ヒト化ＬＭ５ ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを保有する、得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１と名付ける。
【０４３６】
（４．５）ヒト化抗体（キメラ型）の軽鎖についての発現ベクターの構築
配列表の配列番号７６に示される配列（キメラ型ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列）を、ＬＭ６と名付ける。
【０４３７】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ６型）のこの型のヒト化軽鎖アミノ酸配列（配列表の配列番号７５）を保有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０４３８】
１）ヒト化ＬＭ６ ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成
ＬＭ６ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７５）をコードするＤＮＡ（その各々は、マウス抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖（ＬＭ６型）の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合物である）を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを用いることにより合成する。
【０４３９】
さらに、７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ（配列番号４８）に対して、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０４４０】
【化８】
Figure 0004156238
２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ６型のクローニング）
配列表の配列番号７５に規定されるアミノ酸配列をコードするＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを行うことにより調製し、プラスミドベクターに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローニングする。
【０４４１】
ａ）第１工程ＰＣＲ
分泌シグナル配列、および５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位が付加されたＦＲＬ１領域の一部分をコードするＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを、以下の条結下で調製する。テンプレートプラスミドｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＰＤＨＨを、欧州特許出願ＥＰ ０ ９０９ ８１６ Ａ１における記載に従って得る。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７ ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＳＰＲ１３、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、２．５ユニット。
【０４４２】
上記の組成物を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより最終容量５０μｌに調節し、ＰＣＲで用いる。
【０４４３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間加熱し、この後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の温度サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４４４】
ＦＲＬ１の一部、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４、および定常領域の一部をコードする、ＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＬ２８ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＶＦ１１，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＶＲ１２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０４４５】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積５０μｌに調整し、そしてＰＣＲにて使用する。
【０４４６】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間加熱し、この後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の温度サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４４７】
ＦＲＬ４の一部および定常領域をコードし、ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を３’末端に付加された、ＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＣＦ１１，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０４４８】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積５０μｌに調整し、そしてＰＣＲにて使用する。
【０４４９】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間加熱し、この後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の温度サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４５０】
ＰＣＲ後の増幅されたＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色して、生じたＤＮＡをＵＶ光の下で検出する。そのようにして検出したそれぞれのＤＮＡバンドを、かみそりの刃を用いて切り出す。
【０４５１】
ｂ）第２工程ＰＣＲ
上記のＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡフラグメント、およびＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントが融合された、ＬＭ６−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲにて調製されたＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程ＰＣＲにて調製されたＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程ＰＣＲにて調製されたＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位。
【０４５２】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積５０μｌに調整し、そしてＰＣＲにて使用する。
【０４５３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間加熱し、この後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の温度サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４５４】
このようにして調製したＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用することによって、プラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡ中に挿入し、そしてこのキットに含まれるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ １０Ｆ’中に導入する。ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＤＮＡ分析器を使用してジデオキシ法によって確認する。
【０４５５】
生じたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６と名付ける（このプラスミドは、マウスＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードする、ｃＤＮＡを保有する）。
【０４５６】
ＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを含む得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化する。
【０４５７】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後、ＣＩＰを用いて脱リン酸化する。生じた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９ ＤＮＡと、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化したＬＭ６−ＤＮＡフラグメントとを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。その後、Ｅ，ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡを用いて形質転換し、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％ Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に広げる。得られる白色形質転換体を、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養し、そして得られる培養物から、アルカリ−ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後、ＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを保有するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動により選択する。
【０４５８】
上記の手順の結果として、マウスＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ６−１−４−１を、得る。これらのプラスミドを保有する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ６−１−４−１と名付けた）を、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、２００１年４月２０日付けで寄託し、そして受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６６を与えられた。
【０４５９】
（３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６（キメラ型ＬＭ６ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
マウスＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られたプラスミドｐＨＳＧ／ＬＭ６−１−４−１を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化する。
【０４６０】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後、ＣＩＰを用いて脱リン酸化する。生じた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ ＤＮＡと、ｐＨＳＧ／ＬＭ６−１−４−１から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｔａｋａｒａ Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。その後、Ｅ，ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡを用いて形質転換し、そしてＬＢ寒天培地上に広げる。得られる形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、そして得られる培養物から、アルカリ−ＳＤＳ法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出する。ベクター中に所望のＤＮＡフラグメントが挿入されたことおよびその方向を、遺伝子配列分析機を使用して、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０４６１】
ＴＲＡ−８の軽鎖（キメラ型）をコードするｃＤＮＡを保有する、得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６と名付ける。
【０４６２】
（５）いくつかの型−ヒト化ＴＲＡ−８抗体またはキメラＴＲＡ−８抗体−の生成）
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）により、このキットに備え付けられた指示マニュアルに従って、行う。
【０４６３】
ＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）を、１０％ウシ胎仔血清（本明細書中で以後「ＦＣＳ」と短縮する；Ｍｏｒｅｇａｔｅ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（本明細書中で以後「Ｄ−ＭＥＭ」と呼ぶ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む培養皿（培養面積：５７ｃｍ２；Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）中で、セミコンフルエント（３×１０６細胞／皿）になるまで増殖させる。
【０４６４】
一方、アルカリ−ＳＤＳ法および塩化セシウム密度勾配遠心分離により調製した、１０μｇ／皿（全５皿）のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ１５−１）と１０μｇ／皿のヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡとを混合し、その後、エタノールを用いて沈殿させ、その後、５μｌ／皿のｄＨ２Ｏ中に懸濁させる。
【０４６５】
１５μｌ／皿のＦＵＧＥＮＥ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬を、ＦＣＳを含まない１８０μｌ／皿のＤ−ＭＥＭと混合した後、このＦＵＧＥＮＥ溶液（１８５μｌ／皿）を、１０μｇ／皿のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡと１０μｇ／皿のヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡとを含む５μｌ／皿のＤＮＡ溶液と、混合する。室温で１５分間インキュベートした後、得られたプラスミド懸濁物（２００μｌ）を、以前に調製したＣＯＳ−７プレートに添加する。３７℃にて５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした後、その培養培地を、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭと交換する。３７℃にて５％ＣＯ２中で７２時間インキュベートした後、その培養上清を、その上清液中の発現産物を精製するために回収する。上記のような方法によって、ＣＯＳ−７細胞を、以下のプラスミドの組み合わせ各々を用いてトランスフェクトする：
（Ａ）：ｐＨＡ１５−１とｐＳＲ／ＬＭ１−２との同時トランスフェクション（Ｈ１Ｌ１）
（Ｂ）：ｐＨＢ１４−１とｐＳＲ／ＬＭ２−１との同時トランスフェクション（Ｈ２Ｌ２）
（Ｃ）：ｐＨＢ１４−１とｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０との同時トランスフェクション（Ｈ２Ｌ３）
（Ｄ）：ｐＨＢ１４−１とｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３との同時トランスフェクション（Ｈ２Ｌ４）
（Ｅ）：ｐＨＣ１０−３とｐＳＲ／ＬＭ２−１との同時トランスフェクション（Ｈ３Ｌ２）
（Ｆ）：ｐＨＣ１０−３とｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０との同時トランスフェクション（Ｈ３Ｌ３）
（Ｇ）：ｐＨＣ１０−３とｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３との同時トランスフェクション（Ｈ３Ｌ４）
（Ｈ）：ｐＨＤ２１−１とｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１との同時トランスフェクション（Ｈ４Ｌ５）
（Ｉ）：ｐＭ１１−１とｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６との同時トランスフェクション（キメラ）。
【０４６６】
その後、その培養物を遠心分離（３，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１５分間）し、そしてその上清を収集する。その上清を、０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹＯ ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、カタログ番号２５ＣＳ０４５ ＡＳ）を用いて濾過する。その濾液からＩｇＧを精製することを、以下の条件下でＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ＰＯＲＯＳアフィニティークロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して達成する：
ＨＰＬＣシステム：ＢｉｏＣＡＤ ７００Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
カラム：ＰｒｏｔｅｉｎＧ−ＩＤセンサーカートリッジ
（カラムサイズ：２．１ｍｍ ＩＤ×３０ｍｍ ＬＤ、ベッド体積：０．１ｍｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
溶出緩衝液：０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）
中和緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
検出：２８０ｎｍ
流量：１ｍｌ／分
フラクションサイズ：０．５ｍｌ／０．５分
フラクションチューブ：１．５ｍｌポリプロピレンマイクロチューブ
温度：４℃。
【０４６７】
その濾液すべてをカラムにアプライした後、５０ｍｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０００−３）を使用して、カラムを洗浄する。この溶出緩衝液をアプライしたときに、フラクションコレクターを開始させる。各フラクションマイクロチューブは、事前に、１Ｍ ＮａＣｌを５５μｌ、中和緩衝液を１１０μｌ、およびＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−７０３０）を７４μｌ含んだ。７番から８番までのフラクションを収集する。
【０４６８】
ヒト化抗体の発現の確認および調製した培養上清液中の発現産物の定量アッセイを、抗ヒトＩｇＧに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡによって実施する。
【０４６９】
９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）の各ウェルに、吸着緩衝液（０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中に最終濃度０．５μｇ／ｍｌに溶解したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｋａｐｐｅｌ）１００μｌを添加し、そしてそのプレートを、３７℃で２時間インキュベートして、その抗体を吸着させる。その後、そのプレートを３５０μｌのＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄する。洗浄した後そのウェルに、１０％ ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで希釈した培養上清を添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔで再度洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．）１００μｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔを用いて再度洗浄した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｂｉｏ Ｒａｄ）から得られるｐ−ニトロフェニルホスフェートの基質溶液を、そのキットに備え付けられた指示マニュアルに従って添加する。３７℃で０．５時間から１時間インキュベートした後、４０５ｎｍでの吸光度を測定する。この実験において、１０％ ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭを用いて特定の濃度に希釈したヒト血清免疫グロブリンＧサブクラスＩ（ＩｇＧ１）（Ｂｉｏｐｕｒｅ ＡＧ）を、その培養上清液中に含まれるヒト化ＤＲ５抗体の濃度参照サンプルとして使用する。
【０４７０】
結果として、培養上清中の発現および精製された生成物は、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて特異的に検出される。ヒトＩｇＧ抗体の最終濃度は、それぞれ４４．０３μｇ／ｍｌ（Ｈ１Ｌ１）、３９．８μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ２）、２６．７μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ３）、４１．０μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ４）、３９．３μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ２）、２４．７μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ３）、２１．５μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ４）、１６．７μｇ／ｍｌ（Ｈ４Ｌ５）および１８．３μｇ／ｍｌ（キメラ）である。
【０４７１】
（６）いくつかの型のヒト化抗体またはキメラ抗体のアポトーシス誘導活性
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−１５２）を使用して、精製されたヒト化ＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導活性を調べた。
【０４７２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養し、９６ウェルのマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに５０μｌ／ウェルで分配した。本明細書中の実施例２６で調製されたヒト化ＴＲＡ−８を、実施例２６に記載された方法に従って液体中のこれらの濃度を推定することによって、目的の最終生成物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含むように、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で調整する。このように１００ｎｇ／ｍｌに調整された発現生成物の各溶液を使用して、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で連続的に２倍希釈を繰り返すことによって連続的な希釈液を生成する。希釈された各ヒト化ＴＲＡ−８溶液（Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４またはＨ４Ｌ５）を、各ウェルに５０μｌ／ウェルで添加する。３７℃で１２時間の反応後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴを含む２５μＭのＰＭＳ ５０μｌを添加する（最終濃度は、ＸＴＴについて２５０μｇ／ｍｌ、そしてＰＭＳについて５μＭ）。３時間のインキュベート後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ミトコンドリアの能力（ａｂｉｌｉｔｙ）の減少を指標として使用することによって細胞の生存率を算出する。
【０４７３】
各ウェルでの細胞の生存率は、以下の式に従って算出される：
生存率（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
ここで、「ａ」は、試験ウェルの測定値、「ｂ」は、細胞の入っていないウェルの測定値、そして「ｃ」は、抗体が添加されていないウェルの測定値である。
【０４７４】
結果として、試験されたヒト化抗体は、ヒトＤＲ５抗原を発現するＴリンパ腫細胞株の細胞でアポトーシスを誘導することが実証される。
【０４７５】
さらに、ＰＣ−３に対するヒト化ＴＲＡ−８のアポトーシス誘導活性を、実施例２５に記載された方法に従ってタキソールを添加することによって調べる。
【０４７６】
ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４３５）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手され、そして以下を含むＦ−１２Ｋ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２１１２７−０２２、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で維持される：１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％のＬ−グルタミン ２００ｍＭ（２５０３０−１４９、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および０．５％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐ−７５３９、Ｓｉｇｍａ）。１０％のＦＢＳおよび０．５％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＥＤ−００８、ＩＷＡＫＩ）を、以下の実験で使用する。対数増殖しているＰＣ−３細胞を、トリプシン処理によって収集し、そして新しい培地で２回洗浄する。次いで、この細胞を計数し、５×１０４細胞／ｍｌの密度で新しい培地に再懸濁し、そして実験開始１日前に、平らな底面の９６ウェルのプレート（３５９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔｅｒ）に、総容量１００μｌ／ウェル、３連で、分配する。代表的な抗癌剤である、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（１６９−１８６１１、Ｗａｋｏ）をジメチルスルホキシド（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、これを新しい培地で希釈し、次いで５０μｌ／ウェルで細胞を含む９６ウェルのプレートに添加する。ジメチルスルホキシドの最終濃度は、０．１％未満である。５％のＣＯ２環境下で、３７℃、２４時間のインキュベーション後、新しい培地で希釈したヒト化ＴＲＡ−８抗体（Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４またはＨ４Ｌ５）をウェルに添加する。さらに２４時間のインキュベーション後、５０μｌのＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（１１０９５−０９８、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）（１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴおよび２５ｍＭのＰＭＳを含む）をウェルに添加し、そしてこのプレートを６時間培養する。次いで、ＯＤ４５０をＡＲＶＯ ＨＴＳ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定し、そして細胞の生存率を以下のように算出する。
【０４７７】
細胞生存率（％）＝（タキソールで処理された細胞およびヒト化ＴＲＡ−８（薬剤）を含むウェルのＯＤ４５０−細胞も薬剤も含まないウエルのＯＤ４５０）×１００／（薬物を含まず、細胞を含むウェルのＯＤ４５０−細胞も薬剤も含まないウェルのＯＤ４５０）。
【０４７８】
結果として、試験されたヒト化抗体は、ヒトＤＲ５抗原を発現するヒト前立腺癌細胞におけるアポトーシスを誘導することが実証される。
【０４７９】
本明細書中に言及される全ての特許または刊行物は、本発明が関連する当業者のレベルを示している。これらの特許および刊行物は、その各々の刊行物が、具体的に、そして個別に参考として援用されることが示されるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０４８０】
本発明は、上に参照される寄託物または実施例で開示される実施形態によって範囲を限定されない。これらの実施形態は、本発明の少しの局面の例示として意図され、機能的に等価なすべての実施形態は、本発明の範囲内である。本明細書中で示されかつ記載された本発明に加えて、本発明の種々の改変が、当業者に明らかになり、そして添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０４８１】
【表５】
Figure 0004156238
Figure 0004156238
Figure 0004156238
Figure 0004156238

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（ＴＲＡ−８の結合特異性）を示す。ウエスタンブロット分析（上パネル）：ＴＲＡ−８または抗ヒトＩｇＧを用いてプロービングされるＴＮＦＲファミリーの組換え融合タンパク質。レーン１：ＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質（免疫原）；レーン２：ＤＲ４／ｈＩｇＧ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）；レーン３：ＤＲ５／ｈＩｇＧ１；レーン４：ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ−１）／ｈＩｇＧ１；レーン５：ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ−２）／ｈＩｇＧ１；レーン６、ＣＤ９５／ｈＩｇＧ１；レーン７：可溶性ＴＮＦＲ１。ＥＬＩＳＡ分析（下パネル）：ウェル番号は、ウェル８（マウスＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質）を除いてウエスタンブロットの番号に一致する。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（可溶性ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８のＤＲ５およびＤＲ４に対する結合活性）を示す。ＥＬＩＳＡプレートをＤＲ５／ｈＩｇＧ１（上パネル）またはＤＲ４／ｈＩｇＧ１（中央パネル）を用いてコートし、次いでＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８とともにインキュベートした。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（ＤＲ５の表面発現のフローサイトメトリー分析）を示す。全長ＤＲ５ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞（黒塗りヒストグラム）、ＤＲ４ ｃＤＮＡ（白抜きヒストグラム、実線）、または空ベクターを用いてトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞（白抜きヒストグラム、点線）。トランスフェクト後４８時間で、細胞をＴＲＡ−８で染色し、続いてＰＥ結合抗マウスＩｇＧ１で染色した。
【図１Ｄ】 図１Ｄは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（ＤＲ５に対するインサイチュ免疫組織化学反応性）を示す。ＤＲ５発現ベクターまたはコントロールベクターを用いてトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞のサイトスピンスライドを、トランスフェクト後４８時間でＴＲＡ−８で染色した。
【図１Ｅ】 図１Ｅは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（ＴＲＡ−８の殺活性）を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を示された濃度のＴＲＡ−８と共にインキュベートした。一晩の培養の後、細胞生存能をＡＴＰＬｉｔｅアッセイ、ＭＴＴアッセイ、およびＰＩ排除アッセイによって測定した。ＡＴＰＬｉｔｅアッセイおよびＭＴＴアッセイの結果を培地コントロールの割合として表し、ＰＩアッセイをＰＩ陰性細胞の割合として表す。
【図１Ｆ】 図１Ｆは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（カスパーゼ活性化のウエスタンブロット分析）を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、示された時間の間、５００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡ−８とともにインキュベートした。細胞溶解物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、抗カスパーゼ抗体を用いて、プロービングした。矢印は、各カスパーゼの切断されたサブユニットを示す。
【図１Ｇ】 図１Ｇは、ＴＲＡ−８の特徴づけ（カスパーゼ阻害アッセイ）を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度の示されるカスパーゼインヒビターの存在下で一晩、５０ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡ−８とともにインキュベートした。細胞濃度をＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより測定した。
【図２Ａ】 図２Ａは、ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ−５媒介性アポトーシスに対する感受性を示す。正常Ｔ細胞および正常Ｂ細胞（末梢血から新しく単離されたもの）、Ｔ細胞（図２Ａおよび図２Ａ’）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートし、続いて、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１と共にインキュベートした。白抜きヒストグラムは、アイソタイプ抗体コントロールを示し、黒塗りヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色を示す。図２Ａに示すように、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって、アポトーシスを測定した。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ−５媒介性アポトーシスに対する感受性を示す。神経膠腫（図２Ｂおよび図２Ｂ’）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートし、続いて、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１と共にインキュベートした。白抜きヒストグラムは、アイソタイプ抗体コントロールを示し、黒塗りヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色を示す。図２Ｂに示すように、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって、アポトーシスを同定した。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ＤＲ５の細胞表面発現を示す。前立腺癌細胞細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートし、続いて、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１と共にインキュベートした。白抜きヒストグラムは、アイソタイプ抗体コントロールを示し、黒塗りヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色を示す。
【図２Ｄ】 図２Ｄは、ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ−５媒介性アポトーシスに対する感受性を示す。Ｂ細胞細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートし、続いて、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１と共にインキュベートした。白抜きヒストグラムは、アイソタイプ抗体コントロールを示し、黒塗りヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色を示す。図２Ｄに示すように、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって、アポトーシスを測定した。
【図３Ａ’】 図３Ａ’は、Ｔ細胞株Ｕ９３７をＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートしたものである。可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによってアポトーシスを測定した。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、神経膠腫細胞株をＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートしたものである。可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによってアポトーシスを測定した。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、前立腺癌細胞株をＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体と共にインキュベートしたものである。可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒塗り丸）と共に一晩インキュベートした後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによってアポトーシスを測定した。
【図４】 図４は、示された濃度の（Ａ）ＴＲＡ−１、ＴＲＡ−８、ならびにＴＲＡ−１０の抗体系統に曝露した後、および（Ｂ）固定された濃度の図４Ａに示される本発明の抗体系統の存在下でＴＲＡＩＬに曝露した後の、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞についての細胞生存率を示す一連のグラフである。
【図５】 図５は、正常組織および癌組織におけるＤＲ５の発現を示す。正常組織および癌組織のホモジネートをＴＲＡ−８を用いてプロービングし、化学発光によって発色した。（ａ）正常組織におけるＤＲ５タンパク質のウエスタンブロット分析：レーン１：肝、レーン２：脳、レーン３：肺、レーン４：腎臓、レーン５：脾臓、レーン６：精巣、レーン７：卵巣、レーン８：心臓、レーン９：膵臓。（ｂ）癌組織におけるＤＲ５タンパク質のウエスタンブロット分析：以下に由来する癌を含む癌組織のブロットをプロービングした：卵巣（レーン１）、肺（レーン２）、肝臓（レーン３）、直腸（レーン４）、頸部（レーン５）、皮膚（レーン６）、精巣（レーン７）、甲状腺（レーン８）、子宮（レーン１０）、胃（レーン１１）、咽頭喉頭部（レーン１２）、および膵臓（レーン１３）。正常ヒト組織のインサイチュ免疫組織化学（ｃ）および癌組織のインサイチュ免疫組織化学（ｄ）。凍結切片をＴＲＡ−８を用いて免疫染色した。
【図６】 図６は、ＴＲＡ−８の殺腫瘍性活性を示す。ＳＣＩＤマウスに１３２１Ｎ１細胞を皮下接種した。マウスに、腫瘍接種後２日目に、１００μｇ ＴＲＡ−８の単回用量を静脈内注射するか（ａ）、または腫瘍接種後７日目から始めて、１００μｇ ＴＲＡ−８の３回用量を静脈内注射した（ｂ）。腫瘍増殖を重量により測定し、そしてＨ＆Ｅ染色により組織学的に調べた。腫瘍の写真（ｃ．上パネル）は、コントロールマウスにおいては腫瘍増殖が可能であるが、ＴＲＡ−８処理されたマウスにおいては、可能でないこと、およびＨ＆Ｅ染色（ｃ．下パネル）を示す。ＳＣＩＤマウスに、１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を静脈内注射し、そしてそのマウスを注射後２日目にＴＲＡ−８の単回用量で処理した。７日後に、膵臓細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて分析するか（ｄ）、または免疫組織化学によって分析した（ｅ）。
【図７】 図７は、ＲＡ滑膜細胞（Ａ）および（Ｂ）ＯＡ滑膜細胞（Ｂ）におけるＤＲ５の細胞表面発現を示す。１×１０６個の初代培養滑膜細胞を、アフィニティー精製されたＴＲＡ−８を用いて染色し、その後ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体を用いて染色した。１０，０００個の生存細胞をＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅで分析した。
【図８Ａ】 図８Ａは、代表的系統のＲＡ滑膜細胞の細胞生存率を、ＴＲＡＩＬ濃度およびＴＲＡ−８濃度に誘導されたアポトーシスの関数として種々の濃度の組換え可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはアフィニティー精製されたＴＲＡ−８（黒塗り丸）を用いて示す一連のグラフである。細胞生存率は、未処理細胞のｃｐｍに対する処理された細胞のｃｐｍの割合である。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、代表的系統のＯＡ滑膜細胞の細胞生存率を、ＴＲＡＩＬ濃度およびＴＲＡ−８濃度に誘導されたアポトーシスの関数として種々の濃度の組換え可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはアフィニティー精製されたＴＲＡ−８（黒塗り丸）を用いて示す一連のグラフである。細胞生存率は、未処理細胞のｃｐｍに対する処理された細胞のｃｐｍの割合である。
【図９】 図９は、ＲＡ滑膜細胞のＤＲ５−媒介アポトーシスのカスパーゼ依存性を示す一連のグラフである。ＲＡ滑膜細胞（ＲＡ５１２）を、可変濃度のカスパーゼインヒビターの存在下において、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性Ｆａｓリガンド（白四角）、抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）（黒四角）、可溶性ＴＲＡＩＬ（白丸）、または抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−８）（黒丸）と共にインキュベートする。一晩の培養後、細胞生存率をＡＴＰＬｉｔｅによって決定する。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、ＮＦｋｂ活性を示す電気泳動ゲルシフトアッセイである。ＲＡ１０１６細胞を、電気泳動に供する前の表示される時間、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＴＲＡＩＬまたは５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８と共にインキュベートする。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＭＭＰ−１の産生を示すグラフである。１×１０６／ｍｌの表示されるＲＡ滑膜細胞を、表示される濃度のＴＮＦ−α（白丸）、ＴＲＡＩＬ（白三角）またはＴＲＡ−８（黒丸）と共にインキュベートする。一晩の培養後、この培養上清を収集する。この培養上清中のＭＭＰレベルを、ＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１０Ｃ】 図１０Ｃは、ＭＭＰ−３の産生を示すグラフである。１×１０６／ｍｌの表示されるＲＡ滑膜細胞を、表示される濃度のＴＮＦ−α（白丸）、ＴＲＡＩＬ（白三角）またはＴＲＡ−８（黒丸）と共にインキュベートする。一晩の培養後、この培養上清を収集する。この培養上清のＭＭＰレベルをＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１１Ａ】 図１１Ａは、ＴＲＡ−８が肝細胞毒性を誘導しないことを示す図である。正常な肝臓組織は、ＤＲ５を発現しない。２つの正常な肝臓組織、１つの肝細胞癌組織、およびＨｅｐＧ２細胞のサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物のパラフィン切片を、Ｈ＆Ｅ染色のために調製し、そして対応する凍結切片を、ＴＲＡ−８で染色した。
【図１１Ｂ】 図１１Ｂは、ＴＲＡ−８が肝細胞毒性を誘導しないことを示す図である。ＤＲ５の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。２つの正常な肝臓組織および肝細胞癌の症例の組織から単離された肝細胞、ならびにＨｅｐＧ２細胞を、ＴＲＡ−８、抗Ｆａｓ抗体（ＤＸ２）またはアイソタイプコントロール抗体で染色した。ソリッド（ｓｏｌｉｄ）ヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色またはＤＸ２染色を示し、そしてオープン（ｏｐｅｎ）ヒストグラムは対応するアイソタイプコントロールである。
【図１２Ａ】 図１２Ａは、ＴＲＡ−８ではなくＴＲＡＩＬが肝細胞毒性を示すことを示す図である。新鮮な正常ヒト肝細胞を、肝細胞培養培地中で維持した。肝細胞のアポトーシスを、表示される時間、１μｇ／ｍｌの可溶性ＴＲＡＩＬおよび架橋剤またはＴＲＡ−８と共にインキュベートした。細胞生存率を、ＡＴＰＬｉｔｅによって決定した。結果を、培地コントロールと比較した生細胞の割合として表す。斜線のバーは、ＴＲＡＩＬを示し、そして黒いバーは、ＴＲＡ−８を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、ＴＲＡ−８ではなくＴＲＡＩＬが肝細胞毒性を示すことを示す。新鮮な正常ヒト肝細胞を、肝細胞培養培地中で維持した。肝細胞の凝縮核（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｎｕｃｌｅｉ）を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３５２で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【図１２Ｃ】 図１２Ｃは、ＴＲＡ−８ではなくＴＲＡＩＬが肝細胞毒性を示すことを示す図である。新鮮で正常なヒト肝細胞を、肝細胞培養培地中で維持した。肝細胞アポトーシスに対するシクロヘキシミドの効果を示す。肝細胞をコントロール培地中、または１μｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬもしくはＴＲＡ−８と共に、１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドの存在下（黒いバー）または非存在下（白いバー）で８時間培養した。細胞生存率を、ＡＴＰＬｉｔｅによって決定した。結果を、２つの実験の３連の培地の平均±ＳＥＭとして表す。
【図１２Ｄ】 図１２Ｄは、ＴＲＡ−８ではなくＴＲＡＩＬが肝細胞毒性を示すことを示す図である。新鮮な正常ヒト肝細胞を、肝細胞培養培地中で維持した。正常な肝細胞の感受性とＤＲ５およびＦａｓ媒介アポトーシスとの比較を示す。新鮮な単離された肝細胞を、表示される濃度の可溶性ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡ−８、可溶性ＦａｓＬまたは抗Ｆａｓ ｍＡｂ ＣＨ１１と共に６時間インキュベートした。細胞生存率を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。結果を、培地コントロールと比較した生細胞の割合として表す。正常な肝細胞については、４つの正常な個体の平均±ＳＥＭを表す。１人の患者由来の肝細胞癌細胞およびＨｅｐＧ２細胞の結果を、３連の培地の平均として表す。
【図１３Ａ】 図１３Ａは、ＴＲＡＩＬが肝炎を誘導することを示す図である。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−ｏｎ」転写エレメントの制御下で、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、テトラサイクリンの表示される用量によって誘導した。肝臓におけるヒトＴＲＡＩＬ発現のノーザンブロット分析を示す。ベクターの接種およびテトラサイクロンでの誘導の２４時間後、総ＲＮＡを、肝臓から単離し、そしてヒトＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡまたはβ−アクチンを用いて精査した。
【図１３Ｂ】 図１３Ｂは、ＴＲＡＩＬが肝炎を誘導することを示す図である。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−ｏｎ」転写性エレメントの制御下で、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、テトラサイクリンの表示される用量によって誘導した。ＡＴＳの血清レベルを示す。ＴＲＡＩＬの形質導入の２４時間後に、ＡＳＴの血清レベルを決定した。
【図１３Ｃ】 図１３Ｃは、ＴＲＡＩＬが肝炎を誘導することを示す図である。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−ｏｎ」転写性エレメントの制御下で、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、テトラサイクリンの表示される用量によって誘導した。アデノウイルスベクターに感染した肝細胞のＴＲＡＩＬ媒介細胞死を示す。Ｂ６マウスに、テトラサイクロンを誘導可能なアデノウイルスベクターを静脈内接種した。接種の４８時間後に、接種したマウスかまたは接種していないコントロールマウス由来の肝細胞を、単離しそして表示される濃度のＴＲＡＩＬと共に８時間インキュベートした（左側パネル）。肝細胞の細胞生存率を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。上記のようにアデノウイルスベクターを接種したマウスに、１０μｇの可溶性ヒトＴＲＡＩＬを４８時間後に静脈内注射した。ＡＳＴの血清レベルを、ＴＲＡＩＬ注射の２４時間後に測定した（右側パネル）。
【図１３Ｄ】 図１３Ｄは、ＴＲＡＩＬが肝炎を誘導することを示す図である。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−ｏｎ」転写性エレメントの制御下で、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、テトラサイクリンの表示される用量によって誘導した。ＴＲＡＩＬによって誘導される肝臓損傷の組織学分析を示す。肝臓を、ＴＲＡＩＬでの形質導入の２４時間後に収集した。パラフィン切片をＨ＆Ｅ染色し、１００×（上側パネル）および４００×（下側パネル）で撮影した。
【図１３Ｅ】 図１３Ｅは、ＴＲＡＩＬが肝炎を誘導することを示す図である。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−ｏｎ」転写性エレメントの制御下で、全長ヒトＴＲＡＩＬをコードする１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、テトラサイクリンの表示される用量によって誘導した。ＴＲＡＩＬによって誘導される肝臓損傷の組織学分析を示す。肝臓を、ＴＲＡＩＬでの形質導入の７日後に収集した。パラフィン切片をＨ＆Ｅ染色し、１００×（上側パネル）および４００×（下側パネル）で撮影した。
【図１４】 図１４は、ヒトＰＢＭＣから精製された活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞が、休止細胞（実線；ｕｎｆｉｌｌｅｄ）および活性化細胞（斜線；ｓｈａｄｅｄ）についてのフローサイトメトリーによって決定される場合に、増加したレベルのＤＲ５を発現することを示す一連のグラフである。
【図１５】 図１５は、抗ＣＤ３または抗−μ、異なる密度のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅによって収集された活性化細胞および芽細胞と共に４８時間刺激された、図１４に示される精製されたＴ細胞およびＢ細胞についてのＴＲＡ−８濃度の関数としての生存率グラフである。生存率をＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定する。
【図１６】 図１６は、ヒトＰＢＭＣおよびＴＲＡ−８またＩｇＧ（コントロール）を注射された、ＮＫ細胞の無いＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスについてのゲート（ｇａｔｅｄ）リンパ球集団におけるＣＤ３発現を示す、ヒストグラムおよびフローサイトメトリープロットである。
【図１７】 図１７は、実施例１３に詳述されるマウス脾臓組織についてのＣＤ３およびＴＵＮＥＬ染色された細胞の顕微鏡写真を示す。
【図１８】 図１８は、ＴＲＡ−８、ＢＩＳＶＩＩＩおよびそれらの組み合わせの存在下での、慢性リンパ性白血病（ＣＣＬ）のヒトおよび正常Ｂ細胞のヒトについての細胞毒性プロットを示す。
【配列表】
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Claims (9)

  1. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有するマウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８によって産生されるモノクローナル抗体。
  2. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有するマウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８によって産生されるモノクローナル抗体のヒト化抗体であって、この抗体が、配列番号５６のアミノ酸残基１〜１１９を含む可変領域を含む重鎖と、配列番号７２のアミノ酸残基１〜１０８を含む可変領域を含む軽鎖とを含む、抗体。
  3. 前記重鎖がヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の定常領域を含み、前記軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項２記載の抗体。
  4. 以下の工程：
    （ａ）前記標的細胞を、発現可能なＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５をコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトする工程；
    （ｂ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を前記細胞上で発現させる工程；および
    （ｃ）前記細胞を抗体と接触させる工程
    を包含する、標的細胞において細胞死を選択的に誘導する方法の前記工程（ｃ）において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
  5. 細胞を有効量の抗体と接触させる工程を含む、細胞中のＮＦκＢレベルを上昇させる方法において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
  6. 標的細胞を治療量の抗体と接触させる工程を含む、ＤＲ５を発現する標的細胞の選択的な細胞死を誘導する方法において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
  7. 標的細胞を治療量の抗体と接触させる工程を含む、ＤＲ５を発現する標的細胞の増殖を阻害する方法において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
  8. 容器内に請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体を含む、アポトーシスを誘導するための商業的キット。
  9. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有するハイブリドーマＴＲＡ−８。
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