ES2281126T3 - Receptor 5 que contiene un dominio de muerte. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas proteínas de receptor 5 que contienen un dominio de muerte (DR5) que son miembros de la familia de receptores de la necrosis tumoral (TNF), y que se ha mostrado ahora que se unen a TRAIL. En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas DR5 humanas. Se proporcionan también polipéptidos DR5, así como vectores, células huésped y procedimientos recombinantes para la producción de los mismos. La invención se refiere también a procedimientos de cribado para la identificación de antagonistas y a antagonistas de la actividad DR5.

Description

Receptor 5 que contiene un dominio de muerte.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo miembro de la familia de receptores que integran el factor de necrosis tumoral. Más concretamente, se proporcionan moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican el receptor 5 que contiene el dominio de muerte, o simplemente "DR5".También se proporcionan polipéptidos DR5, así como vectores, células anfitrionas y métodos recombinantes para producirlos. La invención se refiere además a métodos de escrutinio para identificar agonistas y antagonistas de actividad DR5.

Técnica anterior

Numerosas acciones biológicas, por ejemplo, la respuesta a ciertos estímulos y procesos biológicos naturales, son controladas por factores, tales como las citocinas. Muchas citocinas actúan a través de receptores involucrando al receptor y produciendo una respuesta intracelular.

Por ejemplo, los factores de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta son citocinas, que actúan a través de receptores de TNF para regular numerosos procesos biológicos, incluidas la protección contra las infecciones y la inducción de choque y enfermedad inflamatoria. Las moléculas de TNF pertenecen a la superfamilia de "ligandos-TNF", y actúan junto con sus receptores o contra-ligandos, la superfamilia de "receptores-TNF". Hasta ahora, se han identificado nueve miembros de la superfamilia de ligandos-TNF y diez miembros de la superfamilia de receptores-TNF.

Entre los ligandos, se incluyen TNF-\alpha, linfotoxina-\alpha (LT-\alpha, también conocido como TNF-\beta), LT-\beta (encontrado en el heterotrímero complejo LT-\alpha2-\beta), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L y factor de crecimiento nervioso (NGF). La superfamilia de receptores TNF incluye el receptor p55TNF, receptor p75TNF, proteína relacionada con receptores TNF, antígeno FAS o APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, p75 de baja afinidad y receptor-NGF (Meager, A., Biologicals, 22:291-295 (1994)).

Muchos miembros de la superfamilia de ligandos TNF son expresados por células T activadas, lo que implica que son necesarios para las interacciones entre células T y otros tipos de células, que explican la ontogenia y las funciones celulares. (Meager, A., supra).

Con la identificación y la creación de mutantes que abolen la expresión de estas proteínas, se ha adquirido un conocimiento bastante profundo de las funciones esenciales de varios miembros de la familia de receptores TNF. Por ejemplo, las mutaciones espontáneas en el antígeno FAS y su ligando causan enfermedades linfoproliferativas (Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356:314 (1992)), lo que quizá refleje un fallo de la muerte celular programada. Las mutaciones del ligando de CD40 causan un estado de inmunodeficiencia vinculada al cromosoma X, caracterizado por altos niveles de inmunoglobulina M y bajos niveles de inmunoglobulina G en plasma, indicando una activación defectuosa de células B dependiente de células T (Allen, R.C. et al., Science 259:990 (1993)). Las mutaciones dirigidas del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad causan un trastorno caracterizado por una inervación sensorial defectuosa de las estructuras periféricas (Lee, K.F. et al., Cell 69:737 (1992)).

TNF y LT-\alpha son capaces de unirse a dos receptores TNF (los receptores TNF de 55 y 75 kd). Un gran número de efectos biológicos suscitados por TNF y LT-\alpha, actuando a través de sus receptores, incluyen necrosis hemorrágica de tumores trasplantados, citotoxicidad, un papel en el choque endotóxico, inflamación, inmunorregulación, proliferación y respuestas antivirales, así como protección contra los efectos deletéreos de la radiación ionizante. TNF y LT-\alpha están implicados en la patogénesis de un amplio espectro de enfermedades, incluidos el choque endotóxico, la malaria cerebral, los tumores, las enfermedades autoinmunitarias, el SIDA y el rechazo de injertos (Beutler, B. and Von Huffel, C., Science 264:667-668 (1994)). Las mutaciones en el Receptor p55 causan un aumento de la susceptibilidad a la infección microbiana.

Además, se dio a conocer como "dominio de muerte" un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos cerca del extremo C-terminal de TNFR1 (p55) y Fas, dominio que es responsable de transducir señales para la muerte celular programada (Tartaglia et al., Cell 74:845 (1993)).

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso fisiológico esencial para el normal desarrollo y homeostasis de los organismos pluricelulares (H. Steller, Science 267:1445-1449 (1995)). Los trastornos de la apoptosis contribuyen a la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluidos el cáncer, los trastornos neurodegenerativos y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (C.B. Thompson, Science 267:1456-1462 (1995)). Recientemente, se ha puesto mucha atención en la transducción de señales y la función biológica de los dos receptores de muerte de la superficie celular, Fas/APO-1 y TNFR-1 (J.L. Cleveland et al., Cell 81:479-482 (1995); A. Fraser, et al., Cell 85:781-784 (1996); S. Nagata et al., Science 267:1449-56 (1995)). Ambos son miembros de la familia de receptores TNF que también incluye TNFR-2, NGFR de baja afinidad, CD40, y CD30, entre otros (C.A. Smith et al., Science 248:1019-23 (1990); M. Tewari et al., en Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl, Ed. (Chapman y Hall, Londres, 1995). Aunque los miembros de la familia se definen por la presencia de repeticiones ricas en cisteína en sus dominios extracelulares, Fas/APO-1 y TNFR-1 también comparten una región de homología intracelular, designada adecuadamente "dominio de muerte", que está distantemente relacionada con el gen suicida de Drosophila, el gen reaper (P. Golstein, et al., Cell 81:185-186 (1995); K. White et al., Science 264:677-83 (1994)). Este dominio de muerte compartido sugiere que ambos receptores interaccionan con un conjunto relacionado de moléculas transductoras de señales que, hasta hace poco, permanecían sin identificar. La activación de Fas/APO-1 recluta la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte FADD/MORT1 (A.M. Chinnaiyan et al., Cell 81: 505-12 (1995); M. P. Boldin et al., J. Biol Chem 270:7795-8 (1995); F.C. Kischkel et al., EMBO 14:5579-5588 (1995)), que a su vez une y presumiblemente activa FLICE/MACH1, un miembro de la familia ICE/CED-3 de proteasas proapoptóticas (M. Muzio et al., Cell 85:817-827 (1996); M.P. Boldin et al., Cell 85:803-815 (1996)). Si bien el papel central de Fas/APO-1 es desencadenar la muerte celular, TNFR-1 puede señalizar un abanico de actividades biológicas diversas, muchas de las cuales provienen de su capacidad de activar NF-kB (L.A. Tartaglia et al., Immunol Today 13:151-3 (1992)). Por consiguiente, TNFR-1 recluta la molécula adaptadora polivalente TRADD, que como FADD, también contiene un dominio de muerte (H. Hsu et al., Cell 81:495-504 (1995); H. Hsu, et al., Cell 84:299-308 (1996)). A través de sus asociaciones con varias moléculas señalizadoras incluyendo FADD, TRAF2, y RIP, TRADD puede señalizar tanto la apoptosis como la activación de NF-kB (H. Hsu et al., Cell 84:299-308 (1996); H. Hsu, et al., Immunity 4:387-396 (1996)).

Recientemente se ha descubierto un nuevo TNF ligando que induce apoptosis. S.R. Wiley et al. (Immunity 3:673-682 (1995)) llamaron a la molécula - "ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF" o simplemente "TRAIL". La molécula también se ha llamado "ligando de Apo-2" o "Apo-2L". R.M. Pitt et al., J. Biol. Chem. 271:12687-12690 (1996). Esta molécula también fue descrita en la solicitud provisional de patente de EE.UU. nº60/013,405 correspondiente a solicitud de patente internacional WO 97/33899, en tramitación con la presente. Por motivos prácticos, la molécula se denominará aquí TRAIL.

A diferencia del ligando de FAS, cuyos transcritos parecen estar limitados en gran medida a las células T estimuladas, se detectan niveles significativos de TRAIL en muchos tejidos humanos (p. ej. bazo, pulmón, próstata, timo, ovarios, intestino delgado; colon, linfocitos de sangre periférica, placenta, riñón) y es constitutivamente transcrito por algunas líneas celulares. Se ha demostrado que TRAIL actúa independientemente del ligando de FAS (Wiley et al., supra). También se ha demostrado que TRAIL activa la apoptosis rápidamente, dentro de un periodo de tiempo que es similar a la señalización de muerte por Fas/Apo-1L, pero mucho más deprisa que la apoptosis inducida por TNF. S.A. Marsters et al., Current Biology 6:750-752 (1996). La incapacidad de TRAIL para unirse a TNFR-1, Fas, o DR3 identificado recientemente, sugiere que TRAIL puede interaccionar con uno o más receptores únicos.

Ya se han identificado varios receptores únicos para TRAIL. En la solicitud de patente provisional de EE.UU., en tramitación con la presente, nº 60/035,722 correspondiente a solicitud de patente internacional WO 98/32856, DR4, se describió un nuevo dominio de muerte que contiene el receptor para TRAIL. Véase, Pan et al., Science 276,111-113 (abril 1997). Ahora se ha demostrado que el receptor TR5, el objeto de la solicitud de patente provisional de EE.UU., en tramitación con la presente, nº 60/035,496 correspondiente a la solicitud de patente internacional WO 98/30693, se une a TRAIL. En la solicitud de patente provisional de EE.UU., en tramitación con la presente, nº 60/050,36 correspondiente a la solicitud de patente internacional WO 98/54202, se predijo que el receptor TR10 también se uniría a TRAIL, debido a la homología de secuencia con DR4.

Los efectos de los ligandos de la familia TNF y los receptores de la familia TNF son variados y tienen influencia sobre numerosas funciones, tanto normales como anómalas, en los procesos biológicos del sistema mamífero. Por lo tanto, existe una clara necesidad de identificar y caracterizar estos receptores y ligandos que influyen en la actividad biológica, tanto en estado de normalidad como en estado de enfermedad. En particular, existe necesidad de aislar y caracterizar nuevos receptores adicionales que se unan a TRAIL.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada en Fig. 1 (SEQ ID NO:2) o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado como ATCC nº de depósito 97920 el 7 de marzo de 1997.

La presente invención proporciona también vectores recombinantes, que incluyen las moléculas aisladas de ácidos nucleicos de la invención, y células anfitrionas que contienen los vectores recombinantes, así como métodos de fabricación de tales vectores y células anfitrionas y métodos para usarlos para producir péptidos o polipéptidos DR5 por técnicas recombinantes.

La invención proporciona además un polipéptido DR5 aislado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido escrito en la presente memoria.

También se describen en la presente memoria ensayos de diagnóstico tales como ensayos cuantitativos y de diagnóstico para detectar los niveles de proteína DR5. Así, por ejemplo, se puede usar un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la expresión excesiva de DR5, o una forma soluble del mismo, comparada con muestras tisulares de control normales para detectar la presencia de tumores.

Se sabe que los ligandos de la familia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) están entre las citocinas más pleyotrópicas, que inducen gran número de respuestas celulares, que incluyen citotoxicidad, actividad anti-viral, actividades inmunorreguladoras, y la regulación transcripcional de varios genes. La respuesta celular a los ligandos de la familia TNF incluyen no sólo respuestas fisiológicas normales, sino también enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis o una inhibición de la apoptosis. La apoptosis - muerte programada de las células - es un mecanismo fisiológico implicado en la deleción de linfocitos T periféricos del sistema inmunitario, y su disregulación puede conducir a cierto número de procesos patógenos diferentes. Las ..enfermedades asociadas con el aumento de la supervivencia celular, o con la inhibición de la apoptosis, incluyen cánceres, trastornos autoinmunitarios, infecciones virales, enfermedad del injerto contra el receptor, rechazo agudo del injerto y rechazo crónico del injerto. Las enfermedades asociadas con el aumento de apoptosis incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos, síndromes mielodisplásicos, lesiones isquémicas, enfermedad hepática inducida por toxinas, choque séptico, caquexia y anorexia.

Así, se prevé el uso de un agonista capaz de incrementar la señalización mediada por DR5 para la preparación de una composición farmacéutica para intensificar la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que implica administrar a una célula que expresa el polipéptido DR5 una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 se incrementa para tratar una enfermedad en la que se presenta una disminución de la apoptosis.

En un aspecto adicional, se prevé el uso de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada por DR5 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que implica administrar a una célula que expresa el polipéptido DR5 una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 se disminuye para tratar una enfermedad en la que se presenta un aumento de la apoptosis.

Usando ensayos de respuesta celular del receptor a un ligando de la familia TNF conocidos, incluidos los descritos más abajo en detalle, se puede determinar si un "agonista" o "antagonista" candidato, como se describe en esta memoria, puede intensificar o inhibir la apoptosis. Así, en un aspecto adicional, se describe un método de escrutinio para determinar si un agonista o antagonista candidato es capaz de intensificar o disminuir una respuesta celular a un ligando de la familia TNF. El método implica poner en contacto células que expresan el polipéptido DR5 con un compuesto candidato y un ligando de la familia TNF, analizar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular patrón, siendo analizado el patrón cuando entra en contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, con lo que un aumento de la respuesta celular en relación con el patrón indica que el compuesto candidato es un agonista de la ruta de señalización por el ligando/receptor y una disminución de la respuesta celular comparada con la del patrón indica que el compuesto candidato es un antagonista de la ruta de señalización por el ligando/receptor. Por la invención, se puede poner en contacto una célula que expresa el polipéptido DR5 con un ligando de la familia TNF, bien endógeno o bien administrado exógenamente.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 indica la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2) de DR5. Se predice que los aminoácidos 1-51 (subrayados) constituyen el péptido señal (restos de aminoácidos de aproximadamente -51 a aproximadamente -1 en SEQ ID NO:2); los aminoácidos 52-184 constituyen el dominio extracelular (restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 133 en SEQ ID NO:2); los aminoácidos 185-208 (subrayados) constituyen el dominio transmembranario (restos de aminoácidos de aproximadamente 134 a aproximadamente 157 en SEQ ID NO:2); y los aminoácidos 209-411 constituyen el dominio intracelular (restos de aminoácidos de aproximadamente 158 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2), de los que los aminoácidos 324-391 (en cursiva) constituyen el dominio de muerte (restos de aminoácidos de aproximadamente 273 a aproximadamente 340 en SEQ ID NO:2).

Fig. 2 indica las regiones de similitud entre las secuencias de aminoácidos de DR5 (HLYBX88), el receptor 1 del factor de necrosis tumoral humano (h TNFR1) (SEQ ID NO:3), la proteína Fas humana (SEQ ID NO:4), y el dominio de muerte que contiene el receptor 3 (SEQ ID NO:5). La comparación se creó con el programa Megalign que está contenido en el juego de programas DNA Star, usando el método Clustal.

Fig. 3 indica un análisis de la secuencia de aminoácidos de DR5. Regiones alfa, beta, vuelta y hélice; hidrofilia e hidrofobia; regiones ambipáticas; regiones flexibles; Se indica el índice antigénico y probabilidad superficial. En la gráfica de "Indice antigénico - Jameson-Wolf", los restos de aminoácidos de aproximadamente 62 a aproximadamente 110, de aproximadamente 119 a aproximadamente 164, de aproximadamente 224 a aproximadamente 271, y de aproximadamente 275 a aproximadamente 370 representados en la Figura 1 corresponden a las regiones altamente antigénicas indicadas de la proteína DR5. Estos fragmentos altamente antigénicos de la Figura 1 corresponden a los siguientes fragmentos, respectivamente en SEQ ID N0:2: restos de aminoácidos de aproximadamente 11 a aproximadamente 59, de aproximadamente 68 a aproximadamente 113, de aproximadamente 173 a aproximadamente 220, y de aproximadamente 224 a aproximadamente 319.

La Fig. 4 indica las secuencias de nucleótidos (HAPBU13R y HSBBU76R) de dos moléculas de cDNA que están relacionadas con la secuencia de nucleótidos indicada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1).

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La Fig. 5A es una gráfica de barras que indica la expresión excesiva de apoptosis inducida por DR5 en células de carcinoma de mama humano MCF7. La Fig. 5B es una gráfica de barras que indica la expresión excesiva de apoptosis inducida por DR5 en células de carcinoma epiteloide humano (HeLa). La Fig. 5C es una gráfica de barras que indica que la apoptosis inducida por DR5 fue bloqueada por inhibidores de caspasa, CrmA y z-VAD-fmk, pero FADD negativo dominante no tenía efecto alguno. La Fig. 5D es una inmunotransferencia que indica que, al igual que DR4, DR5 no interaccionó con FADD ni TRADD in vivo. La Fig. 5E es una gráfica de barras que indica que una versión negativa dominante de una molécula similar a FLICE, FLICE2, identificada recientemente (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272:6578 (1997)), bloqueó eficientemente la apoptosis inducida por DR5, mientras que FLICE negativo dominante tenía sólo un efecto parcial en las condiciones de bloqueo. También indica que TNFR-1 bloqueó la apoptosis eficazmente.

La Fig. 6A es una inmunotransferencia que indica que DR5-Fc (así como DR4 y TRID) se unían específicamente a TRAIL, pero no al ligando citotóxico relacionado TNF\alpha. El cuadro inferior de la Fig. 6A indica las funciones-Fc de entrada presentes en los ensayos de unión. La Fig. 6B es una gráfica de barras que indica que DR5-Fc bloqueaba la capacidad de TRAIL de inducir apoptosis. Los datos (valor medio \pm DT) indicados en la Fig. 6B son el porcentaje de núcleos apoptóticos del total de nucleos contados (n=4). La Fig. 6C es una gráfica de barras que indica que DR5-Fc no tenía ningún efecto sobre la muerte celular inducida por TNF\alpha, apoptosis, en condiciones en las que TNFR1-Fc abolía completamente la muerte por TNF\alpha.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en Fig. 1 (SEQ ID NO:2), o un fragmento del polipéptido. El polipéptido DR5 de la presente invención comparte homología de secuencia con otros dominios de muerte conocidos que contienen receptores de la familia TNFR, que incluye TNFR-I, DR3 y Fas (Fig. 2). La secuencia de nucleótidos indicada en Fig. 1 (SEQ ID NO:1) se obtuvo secuenciando clones de cDNA tales como HLYBX88, que se depositó el 7 de marzo de 1997 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se le otorgó el número de acceso 97920. El clon depositado está contenido en el plásmido pSport 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Moléculas de ácido nucleico

A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de DNA en la presente invención se determinaron utilizando un secuenciador automático de DNA (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por moléculas de DNA determinadas aquí fueron predichas por traducción de una secuencia de DNA determinada como se ha indicado más arriba. Por lo tanto, como es conocido en la técnica para cualquier secuencia de DNA determinada por este método automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente invención puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente de al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia real de nucleótidos de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real se puede determinar de modo más preciso por otros métodos, incluyendo los métodos de secuenciación manual de DNA bien conocidos en la técnica. Como es también conocido en la técnica, una sola inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada comparada con la secuencia real causará un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de DNA secuenciada, empezando en el punto de dicha inserción o deleción.

Usando la información proporcionada aquí, tal como la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO:1, se puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido DR5 usando procedimientos clásicos de clonación y escrutinio, tales como los destinados a clonar cDNA usando mRNA como material de partida. Ilustrativo de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención ha sido identificada en colecciones de cDNA de los siguientes tejidos: células dendríticas primarias, tejido endotelial, bazo, leucemia linfocítica crónica y células estromales de timo humano.

La secuencia de nucleótidos determinada del cDNA de DR5 de SEQ ID NO:1 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de aproximadamente 411 restos de aminoácidos cuyo codón de iniciación está en la posición 130-132 de la secuencia de nucleótidos indicada en la Fig. 1 (SEQ ID NO. 1), con una secuencia líder de aproximadamente 51 restos de aminoácidos. De los miembros conocidos de la familia de receptores de TNF, el polipéptido DR5 de la invención comparte el mayor grado de homología con los polipéptidos humanos TNFR1, FAS y DR3 indicados en la Fig. 2, incluyendo una homología de secuencia significativa a lo largo de los dominios múltiples ricos en cisteínas. La homología de DR5 con otros receptores que contienen dominios de muerte indica firmemente que DR5 también es un receptor que contiene dominios de muerte con la capacidad de inducir apoptosis. Ahora también se ha indicado que DR5 se une a TRAIL.

Como se ha indicado, la presente invención también proporciona la forma o las formas maduras de la proteína DR5 de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células mamíferas tienen una señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de la proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. La mayoría de las células mamíferas, e incluso de las células insectiles, escinden proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la escisión de una proteína secretada no es enteramente uniforme, lo que da como resultado dos o más especies madura en la proteína. Además, se sabe desde hace tiempo que la especificidad de escisión de una proteína secretada está determinada en último caso por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es inherente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el anfitrión identificado por el nº de depósito en ATCC 97920, y que se indica en la Figura 1 (SEQ ID NO:2). Por la proteína DR5 madura que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los clones de cDNA contenidos en el anfitrión identificado por el nº de depósito en ATCC 97920, se entiende la forma o formas maduras de la proteína DR5 producida por expresión en una célula mamífera (p. ej., células COS, como se describe más abajo) del marco de lectura abierto completo codificado por la secuencia de DNA humano del clon contenido en el vector en el anfitrión depositado. Como se indica más abajo, la proteína DR5 madura que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920, puede o no diferir de la proteína DR5 "madura" predicha indicada en SEQ ID NO:2 (aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 360) dependiendo de la exactitud del sitio de escisión predicho basado en el análisis informático.

Hay disponibles métodos para predecir si una proteína tiene una secuencia líder así como el punto de escisión para esa secuencia líder. Por ejemplo, se pueden usar los métodos de McGeoch (Virus Res. 3:271-286 (1985)) y von Heinje (Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986)). La exactitud de la predicción de los puntos de escisión de proteínas secretoras mamíferas conocidas para cada uno de estos métodos está en el intervalo de 75-80%. von Heinje, supra. Sin embargo, los dos métodos no siempre producen el mismo o los mismos puntos de escisión predichos para una proteína dada.

En el presente caso, la secuencia predicha de aminoácidos del polipéptido DR5 completo de la presente invención se analizó por un programa informático ("PSORT"). Véase, K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992). PSORT es un sistema experto para predecir la localización celular de una proteína basándose en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción computacional de la localización, se incorporan los métodos de McGeoch y von Heinje. El análisis por el programa PSORT predijo los sitios de escisión entre los aminoácidos 51 y 52 en la Figura 1 (-1 y 1 en SEQ ID NO:2). Después de esto, se analizaron adicionalmente las secuencias completas de aminoácidos por inspección visual, aplicando una forma simple de la regla (-1,-3) de von Heinje. von Heinje, supra. Así, se predice que la secuencia líder para la proteína DR5 consiste en los restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 51, subrayados en la Figura 1 (correspondientes a aproximadamente -51 a aproximadamente 1 en SEQ ID NO:2), mientras que la proteína DR5 madura predicha consiste en los restos de aproximadamente 52 a aproximadamente 411 en la Figura 1 (correspondientes a los restos aproximadamente 1 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2).

Como se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de RNA, tal como mRNA, o en forma de DNA, incluyendo, por ejemplo, cDNA y DNA genómico obtenido por clonación o producido por síntesis. El DNA puede ser monocatenario o bicatenario. El DNA monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también llamada cadena antisentido.

Por molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)" se entiende una molécula de ácido nucleico, DNA o RNA que ha sido sacada de su entorno natural. Por ejemplo, las moléculas de DNA recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA recombinante mantenidas en células anfitrionas heterólogas o moléculas de DNA purificadas (parcial o sustancialmente) en disolución. Las moléculas de RNA aisladas incluyen transcritos de RNA in vivo o in vitro de las moléculas de DNA de la presente invención. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos según la presente invención incluyen además tales moléculas producidas por síntesis.

Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen moléculas de DNA de DR5 que comprenden un marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) indicado en SEQ ID NO:1; las moléculas de DNA que comprenden la secuencia codificante para la proteína DR5 madura; y las moléculas de DNA que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas más arriba, pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican la proteína DR5. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Así, sería rutinario para un experto en la técnica generar dichas variantes degeneradas.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido DR5 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el plásmido depositado como nº de depósito en ATCC 97920 el 7 de marzo de 1997. En una realización adicional, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido DR5 maduro o el polipéptido DR5 de longitud completa que carece de la metionina N-terminal. La invención proporciona además una molécula aislada de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA de DR5 contenida en el clon depositado que se ha descrito anteriormente, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores. Tales moléculas aisladas, en particular las moléculas de DNA aisladas, son útiles como sondas para hacer mapas génicos por hibridación in situ con cromosomas, y para detectar la expresión del gen DR5 en tejido humano, por ejemplo, por análisis por transferencia Northern.

La presente invención se refiere además a fragmentos de las moléculas aisladas de ácidos nucleicos descritas aquí. Por fragmento de una molécula de DNA aislada que tiene la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado, la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1, o la cadena complementaria de esta, se entiende fragmentos de DNA de al menos aproximadamente 15 nt, y más preferiblemente al menos 20 nt, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, o 500 nt de longitud. Estos fragmentos tienen muchos usos que incluyen, pero no se limitan a, sondas y cebadores para diagnóstico que se describen aquí. Por supuesto, también son útiles de acuerdo con la presente invención fragmentos de DNA más largos, de 500-1500 nt de longitud, como son los fragmentos correspondientes a la mayor parte, si no la totalidad, de la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado o indicada en SEQ ID NO:1. Por un fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se entiende fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos del DNA depositado o la secuencia de nucleótidos que está indicada en SEQ ID NO:1.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende el dominio extracelular de DR5 (restos de aminoácidos de aproximadamente 52 a aproximadamente 184 en Fig. 1 (de aproximadamente 1 a aproximadamente 133 en SEQ ID NO:2)); un polipéptido que comprende el dominio transmembranario de DR5 (restos de aminoácidos de aproximadamente 185 a aproximadamente 208 en Fig. 1 (de aproximadamente 134 a aproximadamente 157 en SEQ ID NO:2)); un polipéptido que comprende el dominio intracelular de DR5 (restos de aminoácidos de aproximadamente 209 a aproximadamente 411 en Fig. 1 (de aproximadamente 158 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2)); un polipéptido que comprende el dominio de muerte de DR5 (restos de aminoácidos de aproximadamente 324 a aproximadamente 391 en Fig. 1 (de aproximadamente 273 a aproximadamente 340 en SEQ ID NO:2)); Ya que la localización de estos dominios ha sido predicha por gráficas obtenidas por ordenador, el experto en la técnica apreciará que los restos de aminoácidos que constituyen estos dominios pueden variar ligeramente (p. ej., en aproximadamente 1 a 15 restos) dependiendo de los criterios usados para definir cada dominio.

Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos de la invención codifican un polipéptido DR5 de longitud completa que carece de los nucleótidos que codifican la metionina del extremo amino-terminal (nucleótidos 130-131 en SEQ ID NO:1) ya que se sabe que la metionina se escinde espontáneamente y tales secuencias pueden ser útiles en vectores de expresión de DR5 construidos por ingeniería genética. Los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos también están contemplados por la invención.

Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos de la presente invención incluyen además moléculas de ácidos nucleicos que codifican las porciones que llevan el epítopo de la proteína DR5. En particular, tales fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos de aproximadamente 62 a aproximadamente 110 en la Figura 1 (aproximadamente 11 a aproximadamente 59 en SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos de aproximadamente 119 a aproximadamente 164 en la Figura 1 (aproximadamente 68 a aproximadamente 113 en SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos de aproximadamente 224 a aproximadamente 271 en la Figura 1 (aproximadamente 173 a aproximadamente 220 en SEQ ID NO:2); y un polipéptido que comprende los restos de aminoácidos de aproximadamente 275 a aproximadamente 370 en la Figura 1 (aproximadamente 224 a aproximadamente 319 en SEQ ID NO:2). Los autores de la invención han determinado que los anteriores fragmentos polipeptídicos son regiones antigénicas de la proteína DR5. Los métodos para determinar otras porciones de esta clase que llevan epítopos de la proteína DR5 se describen detalladamente más abajo.

Además, las moléculas de ácidos nucleicos que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas con extensas porciones de SEQ ID NO:1 que han sido determinadas a partir de los siguientes clones de cDNA relacionados: HAPBU13R. (SEQ ID NO:6) y HSBBU76R (SEQ ID NO:7) se describen aquí. Las secuencias de nucleótidos de HAPBU13R y HSBBU76R son las indicadas en la Figura 4.

Además, la invención incluye un polinucleótido que comprende cualquier porción de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de SEQ ID NO:1 del resto 284 al 1.362, preferiblemente del 284 al 681.

También se describe aquí una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibrida en condiciones estrictas de hibridación a una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente, por ejemplo, los clones de cDNA contenidos en el nº de depósito en ATCC 97920. Por "condiciones estrictas de hibridación" se entiende incubación durante una noche a 42ºC en una disolución que comprende: 50% de formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 g/ml de DNA de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC.

Por polinucleótido que se hibrida a una "porción" de un polinucleótido se entiende un polinucleótido (o bien DNA o RNA) que se hibrida a por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente a por lo menos aproximadamente 20 nt, todavía más preferiblemente a por lo menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente a aproximadamente 30-70 o 80-150 nt, o a la longitud completa del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como sondas y cebadores para diagnóstico como se ha discutido anteriormente y como se discute con más detalle más abajo.

Por porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (p. ej., el cDNA depositado o la secuencia de nucleótidos que se indica en SEQ ID NO:1).

Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida sólo a una secuencia poli A (tal como el tramo poli(A) 3' terminal del cDNA de DR5 indicado en la Figura 1 (SEQ ID NO:1)), o a un tramo complementario de T (o U), no estaría incluido en un polinucleótido de la invención usado para hibridarse a una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que tal polinucleótido se hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli (A) o el complemento del mismo (p. ej., prácticamente cualquier clon de cDNA bicatenario).

Como se indica, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido DR5 pueden incluir, pero no se limitan a, la secuencia codificante para el polipéptido maduro, por sí mismo; la secuencia codificante para el polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, tal como una secuencia pre-, pro-, o preppro-proteína; la secuencia codificante del polipéptido maduro, con o sin secuencias codificantes adicionales mencionadas antes, junto con secuencias no codificantes, adicionales, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas, que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del mRNA - incluida la maduración por corte y empalme y las señales de poliadenilación, por ejemplo - la unión a los ribosomas y la estabilidad de mRNA; una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Así, por ejemplo, el polipéptido puede estar fusionado a una secuencia marcadora, tal como un péptido, lo que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales son obtenibles en el mercado. Como se describe en Gents et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, hexa-histidina proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza, que ha sido descrito por Wilson et al., Cell 37:767-778(1984). Como se discute más adelante, estas otras proteínas de fusión incluyen el receptor DR5 fusionado a Fc en el extremo N- o C-.

Además, en esta memoria se describen variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican porciones, análogos, o derivados del receptor DR5. Las variantes pueden ocurrir de forma espontánea, tal como una variante alélica espontánea. Por "variante alélica" se entiende una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica se pueden producir variantes no espontáneas.

Tales variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones nucleotídicas, que pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones codificantes o no codificantes o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones conservadas o no conversadas de aminoácidos. Entre éstas, se prefieren especialmente las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del receptor DR5 o porciones del mismo. También son especialmente preferidas a este respecto las sustituciones conservadas.

Realizaciones adicionales de la invención incluyen moléculas aisladas de ácidos nucleicos que son al menos 95% idénticas, y más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98% o 99% idénticas, a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, pero que carece de la metionina amino terminal; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aproximadamente 1 a aproximadamente 360 de SEQ ID NO: 2; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aproximadamente 1 a aproximadamente 133 en SEQ ID NO:2, o el dominio extracelular de DR5 codificado por el cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio transmembranario de DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aproximadamente 134 a aproximadamente 157 en SEQ ID NO:2, o el dominio transmembranario de DR5 codificado por el cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; (h) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular de DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aproximadamente 158 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2, o el dominio intracelular de DR5 codificado por el cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; (i) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de muerte de DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aproximadamente 273 a aproximadamente 340 de SEQ ID NO:2, o el dominio de muerte de DR5 codificado por el cDNA contenido en el nº de depósito en ATCC 97920; y (j) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencia de nucleótidos en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), o (i)
anteriores.

Por polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido DR5 se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido DR5. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir por otro nucleótido, o se puede insertar hasta un 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (consulta) puede ser la secuencia de nucleótidos de DR5 completa, indicada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) o cualquier fragmento polinucleotídico descrito aquí.

Como norma práctica, el que una molécula de ácido nucleico particular sea al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1 o a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA depositado se puede determinar convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de consulta la presente invención, los parámetros se fijan, como es lógico, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos en consulta y que se permiten huecos (gaps) de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de consulta.

En una realización específica, la identidad entre una secuencia de referencia (consulta) (query) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de la base de datos, también llamado alineamiento global de secuencia, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados en una alineación FASTBD de secuencias de DNA para calcular la identidad porcentual son: Matriz=Unitaria, k-tuplo=4, penalización por falta de coincidencia=1, penalización por unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0, Puntuación por corte=1, penalización por corte=5, penalización por tamaño del hueco (gap) 0,05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos de la base de datos, la que sea más corta. De acuerdo con esta realización, si la secuencia de la base de datos es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones 5' o 3', y no a causa de deleciones internas, se hace una corrección manual en los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no explica las truncaciones 5' y 3' de la secuencia de la base de datos cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias de la base de datos truncadas en los extremos 5' o 3', respecto de la secuencia de consulta, la identidad porcentual se corrige calculando el número de bases de la secuencia de consulta que están en 5' y 3' de la secuencia de la base de datos, que no presentan coincidencia/alineamiento, como porcentaje de las base totales de la secuencia de consulta. Según los resultados del alineamiento de secuencias FASTBD, se determina si un nucleótido presenta coincidencia/alineamiento. Después, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llevar a una puntuación final de la identidad en tanto por ciento. Esta puntuación corregida es la que se utiliza para los fines de esta realización. Sólo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia de la base de datos, mostradas en el alineamiento FASTDB, que no presentan coincidencia/alineamiento con la secuencia de consulta, se calculan para los fines del ajuste manual de la puntuación de identidad porcentual. Por ejemplo, una secuencia de la base de datos de 90 bases se alinea con una secuencia de consulta de 100 bases para determinar la identidad porcentual. Las deleciones ocurren en el extremo 5' de la secuencia de la base de datos y, por lo tanto, el alineamiento FASTBD no presenta ninguna coincidencia/alineación de las 10 primeras bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' que no presentan coincidencia/número total de bases en la secuencia de la base de datos) de modo que se resta un 10% de la puntuación de identidad en tanto por ciento calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes fueran perfectamente coincidentes, la identidad porcentual final sería 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de la base de datos de 90 bases con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez las deleciones son deleciones internas de manera que no hay bases en las posiciones 5' o 3' de la secuencia de la base de datos que no presentan coincidencia/alineamiento con la secuencia de consulta. En este caso, la identidad porcentual calculada por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las bases en 5' o 3' de la secuencia de la base de datos que no presentan coincidencia/alineamiento con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. Para los fines de esta realización no se hace ninguna otra corrección manual.

La presente solicitud se refiere a moléculas de ácido nucleico al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO:1, la secuencia de ácidos nucleicos de los cDNA depositados, o fragmentos de los mismos, independientemente de si codifican un polipéptido que tiene actividad DR5. Esto es debido a que incluso cuando una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene actividad DR5, un experto en la técnica aún así sabría como usar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o como un cebador para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido con actividad DR5 incluyen, inter alia: (1) aislamiento del gen DR5 o de sus variantes alélicas en una colección de cDNA; (2) hibridación in situ (p. ej., "FISH") a extensiones cromosómicas en metafase para proporcionar la ubicación cromosómica precisa del gen DR5, como describe Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y (3) análisis por transferencia Northern para detectar la expresión del mRNA de DR5 en tejidos específicos.

Sin embargo, se prefieren moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO:1, la secuencia de ácidos nucleicos de los cDNA depositados, o fragmentos de los mismos, que, en efecto, codifican un polipéptido que tiene actividad de la proteína DR5. Por "un polipéptido que tiene actividad DR5" se entiende polipéptidos que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína DR5 de la invención (ya sea la proteína de longitud completa o, preferiblemente, la proteína madura), como se mide en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, la actividad de la proteína DR5 se puede medir usando los ensayos de muerte celular realizados esencialmente como se ha descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, et al., Cell 81:505-12 (1995); M. P. Boldin et al., J. Biol Chem 270:7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14:5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, et al., J Biol Chem 271:4961-4965 (1996)) y como se indica en el ejemplo 5, más adelante. En células MCF7, los plásmidos que codifican DR5 de longitud completa o un receptor candidato que contiene el dominio de muerte se co-transfectan con la construcción indicadora pLantern que codifica la proteína fluorescente verde. Los núcleos de las células transfectadas con DR5 presentarán morfología apoptótica como se evalúa por tinción DAPI. De forma similar a TNFR-1 y Fas/APO-1 (M. Muzio, et al., Cell 85:817-827 (1996); M. P. Boldin, et al., Cell 85:803-815 (1996); M. Tewari, et al., J Biol Chem 270:3255-60 (1995)), la apoptosis inducida por DR5 es bloqueada preferiblemente por los inhibidores de proteasas similares a ICE, CrmA y z-VAD-fmk.

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos del cDNA depositado, la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO:1, o fragmentos de la misma, codificará un polipéptido "que tiene actividad de proteína DR5". En efecto, ya que todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, en muchos casos, esto será evidente para los expertos en la técnica incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito anteriormente. Además se reconocerá en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido con actividad de proteína DR5. Esto se debe a que el experto en la técnica conoce perfectamente las sustituciones de aminoácidos que tienen poca o ninguna probabilidad de efectuar significativamente la función de una proteína (p. ej., reemplazar un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático).

Por ejemplo, se proporciona una guía sobre cómo hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican qué proteínas son sorprendentemente tolerantes de sustituciones de aminoácidos.

Ensayos con polinucleótidos

En esta memoria se describe también el uso de los polinucleótidos DR5 para detectar polinucleótidos complementarios, tales como, por ejemplo, como reactivo para diagnóstico. La detección de una forma mutada de DR5 asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadir o definir un diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad que es el resultado de una infra-expresión, sobre-expresión o expresión alterada de DR5 o una forma soluble del mismo, tal como, por ejemplo, tumores o enfermedades autoin-
munes.

Los individuos portadores de mutaciones en el gen DR5 pueden ser detectados a nivel de DNA por diversas técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico pueden ser obtenidos a partir de las células de un paciente, tal como de sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia. El DNA genómico puede ser usado directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente usando PCR antes del análisis. (Saiki et al., Nature 324:163-166 (1986)). También se puede utilizar el RNA o el cDNA de la misma manera. Como ejemplo, los cebadores de la PCR complementarios al ácido nucleico que codifica DR5 pueden ser usados para identificar y analizar la expresión de DR5 y sus mutaciones. Por ejemplo, pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales por hibridación de DNA amplificado a secuencias de RNA de DR5 radiomarcada, o alternativamente, a secuencias de DNA antisentido de DR5 radiomarcada. Se pueden distinguir secuencias perfectamente coincidentes de dúplices no coincidentes por digestión con RNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión.

Las diferencias en las secuencias entre un gen de referencia y genes con mutaciones también puede ser revelada por secuenciación directa de DNA. Además, se pueden emplear segmentos de DNA clonados como sondas para detectar segmentos de DNA específicos. La sensibilidad de tales métodos se puede intensificar considerablemente por uso apropiado de PCR u otro método de amplificación. Por ejemplo, un cebador de la secuenciación se usa con un producto PCR bicatenario o una molécula molde monocatenaria generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia se realiza por procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o por procedimientos de secuenciación automáticos con etiquetas fluorescentes.

Puede realizarse un análisis genético basado en diferencias en las secuencias de DNA por detección de la alteración de la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles, con o sin agentes desnaturalizantes. Las deleciones e inserciones pequeñas en la secuencia se pueden visualizar por electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de DNA de secuencias diferentes se pueden distinguir en geles de gradientes de formamida desnaturalizantes en los que se retardan las movilidades de los diferentes fragmentos de DNA en el gen en diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión específicas o sus temperaturas de fusión parciales (véase, p. ej., Myers et al., Science 230:1242 (1985)).

Los cambios de secuencia en ubicaciones específicas también pueden ser revelados por ensayos de protección con nucleasas, tal como el método de protección con RNaas y S1 o el método de escisión química (p. ej., Cotton et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1985)).

Así, la detección de una secuencia de DNA específica se puede realizar por métodos que incluyen, sin limitarse a ello, hibridación, protección con RNasa, escisión química, secuenciación directa de DNA o el uso de enzimas de restricción (p. ej., polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción ("RFLP") y transferencia Southern del DNA genómico).

Además de las más convencionales electroforesis en gel y secuenciación de DNA, también se pueden detectar las mutaciones por análisis in situ.

Vectores y células anfitrionas

La presente invención se refiere también a vectores que incluyen moléculas de DNA de la presente invención, a células anfitrionas que están genéticamente modificadas con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Las células anfitrionas pueden modificarse por ingeniería genética para que incorporen moléculas de ácidos nucleicos y expresen polipéptidos de la presente invención. Los polinucleótidos se pueden introducir en solitario o con otros polinucleótidos. Estos otros polinucleótidos se pueden introducir independiente, co-introducir o introducir junto con los polinucleótidos de la invención.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector fago mono o bicatenario, un vector viral de RNA o DNA mono o bicatenario. Tales vectores pueden ser introducidos en células como polinucleótidos, preferiblemente como DNA, por técnicas bien conocidas para introducir DNA y RNA en células- Los vectores virales pueden ser competentes o defectuosos en cuanto a su replicación. En el último caso, generalmente ocurrirá propagación viral sólo en células anfitrionas complementarias.

En ciertos aspectos, entre los vectores preferidos están aquellos para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención. En general, tales vectores comprenden las regiones de control que actúan en cis, eficaces para la expresión en un anfitrión operativamente unido al polinucleótido que ha de expresarse. Los factores que actúan en trans apropiados o bien son suministrados por el anfitrión, o por el vector complementario o por el propio vector al introducirlo en el anfitrión.

Se puede utilizar una amplia variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido de la invención. Tales vectores incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriofagos, de episomas de levadura, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudovirus de la rabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los anteriores, tales como los derivados de elementos genéticos plasmídicos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos, y todos ellos pueden ser utilizados para expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. En general, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un polipéptido en un anfitrión puede ser utilizado para expresión en este sentido.

La secuencia de DNA en el vector de expresión está operativamente unida a una o más secuencias apropiadas de control de la expresión, incluyendo, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción del mRNA. Representantes de tales promotores incluyen promotor de fago lambda PL, los promotores de E. coli lac, trp y tac, los promotores precoces y tardíos de SV40, y promotores de LTR retrovirales, por nombrar unos cuantos promotores bien conocidos. En general, las construcciones de expresión contendrán sitios para transcripción, iniciación y terminación, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirán un codón de iniciación de la traducción, AUG, al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) ubicadas adecuadamente al final del polipéptido a traducir.

Además, las construcciones pueden contener regiones de control que regulan y además engendran expresión. En general, tales regiones operarán controlando la transcripción, tal como sitios de unión represores y potenciadores, entre otros.

Los vectores para la propagación y expresión generalmente incluirán marcadores seleccionables. Tales marcadores también pueden ser adecuados para amplificación, o los vectores pueden contener marcadores adicionales para este propósito. En este sentido, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células anfitrionas transformadas. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a,dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivos de células eucarióticas y a los genes de resistencia a tectraciclina o ampicilina para cultivo de E. coli y otras bacterias.

El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada, que se describe aquí en otras páginas, así como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, pueden introducirse en un anfitrión apropiado usando una variedad de técnicas bien conocidas adecuadas para la expresión de un polipéptido deseado e él. Ejemplos representativos de anfitriones adecuados incluyen las células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tal como las células de melanoma CHO, COS y Bowes; y células vegetales. Los medios de cultivo adecuados y las condiciones para las células anfitrionas son conocidos en la técnica.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias están pQE70, pQE60 y pQE-9, obtenibles de Qiagen; los vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, obtenibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 obtenibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL obtenibles de Pharmacia. Estos vectores se citan sólo a modo de ilustración de los muchos vectores disponibles en el mercado y bien conocidos que están disponibles para los expertos en la técnica.

La selección de vectores y promotores apropiados para expresión en una célula anfitriona es un procedimiento bien conocido y las técnicas requeridas para la construcción del vector de expresión, la introducción del vector en el anfitrión y la expresión en el anfitrión son habilidades rutinarias en la técnica.

La presente invención también se refiere a células anfitrionas que contienen las construcciones descritas anteriormente y discutidas más arriba. La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula mamífera, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula anfitriona puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La cepa anfitriona se puede elegir para que module la expresión de las secuencias génicas insertadas, o para que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de ciertos inductores; así, se puede controlar la expresión del polipéptido construido por ingeniería genética. Además, las diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccionales y post-traduccionales (p. ej., fosforilación, escisión) de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares apropiadas que garanticen las modificaciones deseadas y el procesamiento de la proteína foránea expresada.

La introducción de la construcción en la célula anfitriona se puede efectuar por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en manuales clásicos de laboratorio, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986).

El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión (que comprende el polipéptido unido mediante un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga (de una proteína diferente)), y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Dicha proteína de fusión se puede hacer ligando entre sí los polinucleótidos de la invención y la secuencia deseada de ácidos nucleicos que codifica la secuencia deseada de aminoácidos por métodos conocidos en la técnica, en el marco de lectura adecuado, y expresando la proteína de fusión producida por métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, tal proteína de fusión se puede producir por técnicas de síntesis de proteínas, p. ej., mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Así, por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos con carga, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula anfitriona, durante la purificación o durante la posterior manipulación y el almacenamiento. Aún más, también se puede añadir una región al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden separar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a polipéptidos para engendrar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica.Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, el documento de patente europea EP-A-0 464 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es completamente ventajosa para uso en terapia y diagnosis y así, por ejemplo, da como resultado una mejora en las propiedades farmacocinéticas(patente europea EP-A 0232 262). Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder delecionar la parte Fc una vez que la proteína de fusión ha sido expresada, detectada y purificada de la manera ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fc resulta ser un impedimento para uso en terapia y diagnosis, por ejemplo, cuando la proteína de fusión va a utilizarse como antígeno para inmunizaciones. Por ejemplo, en el descubrimiento de fármacos, se han fusionado proteínas humanas, tales como el receptor hIL5, con porciones Fc con el fin de realizar ensayos de escrutinio de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase, D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270:9459-9471 (1995).

Los polipéptidos DR5 se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos clásicos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción en medio ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Lo más preferiblemente, se emplea la cromatografía de líquidos de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Se pueden emplear técnicas bien conocidas para replegar proteínas con el fin de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de forma natural, productos obtenidos en procedimientos de síntesis química y productos productos por técnicas recombinantes a partir de un anfitrión procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, plantas superiores, de insectos y mamíferos. Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glucosilados no no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto inicial de metionina modificado, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por un anfitrión.

Los polinucleótidos y polipéptidos DR5 se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención para diversas aplicaciones, en particular las que hacen uso de las propiedades químicas y biológicas de DR5. Entre éstas, están las aplicaciones en el tratamiento de tumores, resistencia a parasitos, bacterias y virus, para inducir la proliferación de células T, las células endoteliales y ciertas células hematopoyéticas, para tratar restenosis, enfermedad de injerto frente a anfitrión (rechazo inverso), para regular las respuestas antivirales y para prevenir ciertas enfermedades autoinmunitarias después de la estimulación de DR5 por un agonista. Las aplicaciones adicionales se refieren a diagnosis y a tratamiento de trastornos de células, tejidos y organismos. Estos aspectos de la invención se discuten más detalladamente a continuación.

Polipéptidos DR5 y fragmentos

La invención proporciona además un polipéptido DR5 aislado que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o un polipéptido o péptido que comprende una porción de los polipéptidos anteriores.

Se reconocerá en la técnica que alguna secuencia de aminoácidos de DR5 puede vararse sin efecto significativo sobre la estructura o función de la proteína. Si se contemplan estas diferencias de secuencia, debe recordarse que habrá unas regiones críticas en la proteína que determinan la actividad. Tales regiones comprenden habitualmente los restos que constituyen el sitio de unión para el ligando o el dominio de muerte, o que forman estructuras terciarias que afectan a estos dominios.

Así, la invención incluye además variaciones de la proteína DR5 que presentan actividad proteica DR5 sustancial o que incluyen regiones de DR5, tales como las porciones proteicas discutidas anteriormente. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo. Como se ha indicado anteriormente, se puede encontrar una pauta concerniente a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos en Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990).

Así, el fragmento, derivado, o análogo del polipéptido de SEQ ID NO:2, o el codificado por el cDNA depositado, puede ser (i) uno en el que al menos uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente uno o más restos de aminoácidos conservados, y más preferiblemente al menos uno pero menos de diez restos de aminoácidos conservados) y tal resto de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto que incrementa la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como un péptido de la región de fusión de IgG Fc o una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia pro-proteína. Se considera que estos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la técnicas en virtud de las enseñanzas presentadas en esta memoria.

Tienen especial interés las sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados y por aminoácidos neutros o cargados negativamente. Esto último da como resultado proteínas con carga positiva más baja para mejorar las características de la proteína DR5. La prevención de agregación es sumamente deseable. La agregación de proteínas no sólo da como resultado una pérdida de actividad sino que también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, debido a que pueden ser inmunogénicas. (Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al. Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).

El intercambio de aminoácidos también puede modificar la selectividad de la unión a receptores en la superficie de la célula. Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993) describe ciertas mutaciones que dan como resultado la unión selectiva de TNF-alfa a sólo uno de los tipos conocidos de receptores de TNF. Así, el receptor DR5 de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, ya sea de mutaciones espontáneas o por manipulación humana.

Como se ha indicado, preferiblemente los cambios tienen una naturaleza minoritaria, tales como sustituciones conservadas de aminoácidos que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad de la proteína (véase la Tabla 1).

TABLA 1 Sustituciones conservadas de aminoácidos

1

Los aminoácidos en la proteína DR5 de la presente invención que son esenciales para su función se pueden identificar por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Éste último procedimiento introduce mutaciones de alanina en solitario en cada resto de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se someten seguidamente a ensayo para determinar su actividad biológica tal como la unión a receptores o in vitro, o su actividad proliferativa in vitro. También se pueden determinar los sitios que son críticos para la unión ligando-receptor mediante análisis estructurales tales como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcación por fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos et al. Science 255:306-312 (1992)).

Preferiblemente los polipéptidos de la presente invención se proporcionan en una forma aislada. Por "polipéptido aislado" se entiende un polipéptido separado de su entorno natural. Así, un polipéptido producido y/o contenido dentro de una célula anfitriona recombinante se considera aislado por los fines de la presente invención. También se entiende por "polipéptido aislado" los polipéptidos que han sido purificados, parcial o sustancialmente, a partir de una célula anfitriona recombinante. Por ejemplo, una versión del polipéptido DR5 producida por técnicas recombinantes puede purificarse sustancialmente por el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen el polipéptido codificado por el cDNA depositado incluyendo el líder, el polipéptido maduro codificado por el cDNA depositado menos el líder (i.e., la proteína madura); un polipéptido que comprende los aminoácidos aproximadamente - 51 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2; un polipéptido que comprende los aminoácidos aproximadamente - 50 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2; un polipéptido que comprende los aminoácidos aproximadamente 1 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2; un polipéptido que comprende el dominio extracelular; un polipéptido que comprende el dominio transmembranario; un polipéptido que comprende el dominio intracelular; un polipéptido que comprende los dominios extracelular e intracelular con todo o parte del dominio transmembranario delecionado; y un polipéptido que comprende el dominio de muerte; así como polipéptidos que son al menos 90% o 95% idénticos, aún más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idénticos a los polipéptidos descritos anteriormente, y también incluyen porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido DR5 se entiende que la secuencia de aminoácidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia del polipéptido DR5. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos de aminoácidos de la secuencia de referencia puede ser delecionados o sustituidos por otro aminoácido, o varios aminoácidos cuando constituyen hasta el 5% de los restos de aminoácido totales de la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otro sitio entre estas posiciones terminales, interpuesta ya sea individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, si cualquier polipéptido particular es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), la secuencia de aminoácidos codificada por clones de cDNA depositados, o g¡fragmentos de los mismos, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos tales como el programa Bestfir (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de consulta la presente invención, los parámetros se fijan, como es lógico, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos en consulta y que se permiten huecos (gaps) de homología de hasta el 5% del número total de restos de aminoácido en la secuencia de consulta.

En una realización específica, la identidad entre una secuencia de referencia (consulta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de la base de datos, también llamado alineamiento global de secuencia, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos que se usan en una alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuplo=2, penalización por falta de coincidencia=1, penalización por unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0, Puntuación por corte=1, tamaño de ventana=longitud de secuencia, penalización por hueco=5, penalización por tamaño del hueco 0,05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos de la base de datos, la que sea más corta. De acuerdo con esta realización, si la secuencia de la base de datos es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones en los extremos N- o C-terminales, y no a causa de deleciones internas, se hace una corrección manual en los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no explica las truncaciones N- y C-terminales de la secuencia de la base de datos cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias de la base de datos truncadas en los extremos N- y C-terminales, respecto de la secuencia de consulta, la identidad porcentual se corrige calculando el número de restos de la secuencia de consulta que están en los extremos N- y C-terminales de la secuencia de la base de datos, que no presentan coincidencia/alineamiento, con un resto correspondiente de la base de datos, como porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Según los resultados del alineamiento de secuencias FASTBD, se determina si un resto presenta coincidencia/alineamiento. Después, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el prograna FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llevar a una puntuación final de la identidad en tanto por ciento. Esta puntuación de la identidad porcentual final es la que se utiliza para los fines de esta realización. Sólo los restos en los extremos N- y C-terminales de la secuencia de la base de datos que no presentan coincidencia/alineación con la secuencia de consulta, se consideran para el fin de ajustar manualmente la puntuación de identidad porcentual. Es decir, sólo las posiciones de restos de consulta fuera de los restos N y C-terminales más alejados de la secuencia de la base de datos. Por ejemplo, una secuencia de la base de datos de 90 restos de aminoácido se alinea con una secuencia de consulta de 100 restos para determinar la identidad porcentual. La deleción ocurre en el extremo N-terminal de la secuencia de la base de datos y, por lo tanto, el alineamiento FASTBD no presenta ninguna coincidencia/alineamiento de los 10 primeros restos en el extremo N-terminal. Los 10 restos no apareados representan el 10% de la secuencia (número de restos en los extremos N y C-terminales que no presentan coincidencia/número total de restos en la secuencia de la base de datos) de modo que se resta un 10% de la puntuación de identidad en tanto por ciento calculada por el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes fueran perfectamente coincidentes, la identidad porcentual final sería 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de la base de datos de 90 restos con una secuencia de consulta de 100 restos. Esta vez las deleciones son deleciones internas de manera que no hay restos en las posiciones N o C-terminales de la secuencia de la base de datos que no presentan coincidencia/alineamiento con la secuencia de consulta. En este caso, la identidad porcentual calculada por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las posiciones de los restos que están situadas fuera de los extremos N y C-terminales de la secuencia de la base de datos, como se muestra en el alineamiento FASTDB, que no presentan coincidencia/alineamiento con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. Para los dines de esta realización no se hace ninguna otra corrección manual.

El polipéptido de la presente invención se podría utilizar como marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de tamiz molecular usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los autores de la presente invención han descubierto que el polipéptido DR5 es una proteína de 411 restos que presenta tres dominios estructurales principales. Primero, el dominio para la unión del ligando se identificó dentro de los restos de aproximadamente 52 a aproximadamente 184 en la Fig. 1 (restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 133 en SEQ ID NO:2). Segundo, el dominio transmembranario se identificó dentro de los restos de aproximadamente 185 a aproximadamente 208 en la Fig. 1 (restos de aminoácidos de aproximadamente 134 a aproximadamente 157 en SEQ ID NO:2). Tercero, el dominio intracelular se identificó dentro de los restos de aproximadamente 209 a aproximadamente 411 en la Fig. 1 (restos de aminoácido de aproximadamente 158 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2). Es importante que el dominio intracelular incluye un dominio de muerte en los resto de aproximadamente 324 a aproximadamente 391 (restos de aminoácidos de aproximadamente 273 a aproximadamente 340 en SEQ ID NO:2). Los fragmentos preferidos adicionales del polipéptido indicado en la Fig. 1 incluyen la proteína madura de los restos aproximadamente 52 a aproximadamente 411 (restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 360 en SEQ ID NO:2), y los polipéptidos solubles que comprenden todo o parte de los dominios extracelular e intracelular pero que carecen del dominio transmembranario.

La invención proporciona además polipéptidos DR5 codificados por el clon de cDNA depositado que incluye los framentos líder y polipéptido DR5 seleccionados entre la proteína madura, el dominio extracelular, el dominio transmembranario, el dominio intracelular, el dominio de muerte y todas sus combinaciones.

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de epítopo de un polipéptido descrito aquí. El epítopo de esta porción polipeptídica es un epítopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que incita la respuesta de un anticuerpo cuando proteína completa es el inmunógeno. Por otro lado, una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo se define como un "epítopo antigénico". El número de epítopos inmunogénicos de una proteína generalmente es menor que el número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998- 4002 (1983).

En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que portan un epítopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteína a la que se puede unir un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de una secuencia proteica son rutinariamente capaces de incitar un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. y Learner, R.A., "Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins", Science 219:660-666 (1983). Los péptidos capaces de incitar sueros reactivos con proteínas se representan frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, se pueden caracterizar por un conjunto de reglas químicas sencillas y no se confinan a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopos inmunogenicos) ni a los extremos amino o carboxi terminales.

Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos antigénicos son útiles para generar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) en 777. Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos antigénicos preferiblemente contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve, y lo más preferiblemente entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención.

Ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos que se pueden usar para general anticuerpos específicos frente a DR5 incluyen: un polipéptido que comprende restos de aminoácidos de aproximadamente 62 a aproximadamente 110 en la Figura 1 (aproximadamente 11 a aproximadamente 59 en SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende restos de aminoácidos de aproximadamente 119 a aproximadamente 164 en la Figura 1 (aproximadamente 68 a aproximadamente 113 en SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende restos de aminoácidos de aproximadamente 224 a aproximadamente 271 en la Figura 1 (aproximadamente 173 a aproximadamente 220 en SEQ ID NO:2); y un polipéptido que comprende restos de aminoácidos de aproximadamente 275 a aproximadamente 370 en la Figura 1 (aproximadamente 224 a aproximadamente 319 en SEQ ID NO:2). Como se ha indicado más arriba, los autores de la invención han determinado que los anteriores fragmentos polipeptídicos son regiones antigénicas de la proteína DR5.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos se pueden producir por medios convencionales. Hougthen, R.A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Este método de "síntesis simultánea de péptidos múltiples (SMPS)" se describe además en la Patente de los EE.UU No. 4,631,211 expedida a Hougthen et al. (1986).

Como apreciarán los expertos en la técnica, los polipéptidos DR5 de la presente invención y los fragmentos portadores de epítopos de los mismos, descritos anteriormente, se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultados polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación e indican una semivida in vivo más elevada. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que constan de los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas mamíferas (EPA 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84- 86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura mimética con puentes disulfuro debido a la parte IgG también pueden ser más eficientes que la proteína DR5 monomérica o un fragmento proteico en solitario fijando y neutralizando otras moléculas (Fountoulakis et al., J Biochem 270:3958-3964 (1995)).

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Ensayos con los polipéptidos

Los ensayos diagnósticos tales como los ensayos cuantitativos y diagnósticos para detectar niveles de proteína DR5, o su forma soluble, en células y tejidos, incluyendo la determinación de niveles normales y anómalos se describen aquí. Así, por ejemplo, se puede usar un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la expresión excesiva de DR5, o de una forma soluble del mismo, frente a muestras normales de tejido control para detectar, por ejemplo, la presencia de tumores. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar los niveles de una proteína, tal como la proteína DR5 de la presente invención, o una forma soluble de la misma, en una muestra derivada de un anfitrión son bien conocidas para los expertos en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis por transferencia Western y ensayos ELISA.

El ensayo de los niveles de proteína DR5 en una muestra biológica se puede hacer usando cualquier método conocido en la técnica. Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de una línea celular o cultivo de tejido individual, u otra fuente que contiene proteína receptora DR5 o mRNA. Se prefieren las técnicas basadas en anticuerpos para ensayar los niveles de proteína DR5 en una muestra biológica. Por ejemplo, la expresión de proteína DR5 en tejidos se puede estudiar con métodos inmunohistológicos clásicos. (Jalkanen, M. et al., J. Cell Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos, útiles para detectar la expresión génica de proteína DR5, incluyen los inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

Los marcadores adecuados son conocidos en la técnica e incluyen marcadores enzimáticos tales como glucosa oxidasa, radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In), y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

Terapéutica

Se sabe que los ligandos de la familia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) están entre las citocinas más pleyotrópicas, que inducen gran número de respuestas celulares, que incluyen citotoxicidad, actividad anti-viral, actividades inmunorreguladoras, y la regulación transcripcional de varios genes (Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities", Symp. Quant. Biol. 51:597-609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., y Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57:505-518 (1988); Old, L.J., Sci. Am. 258:59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285:199-224 (1991)). Los ligandos de la familia TNF inducen varias respuestas celulares de este tipo por unión a receptores de la familia TNF, incluyendo el DR5 de la presente invención. Las células que expresan el polipéptido DR5 y que se cree que tienen una respuesta celular potente a ligandos DR5 incluyen las células dendríticas primarias, el tejido endotelial, el bazo, leucemia linfocítica crónica y células estromales de timo humano. Por "una respuesta celular a un ligando de la familia TNF" se entiende cualquier cambio genotípico, fenotípico y/o morfológico a una célula, línea celular, tejido, cultivo tisular o paciente que es inducido por un ligando de la familia TNF. Como se ha indicado, tales respuestas celulares incluyen no sólo respuestas fisiológicas normales a los ligandos de la familia TNF, sino también enfermedades asociadas con aumento de apoptosis o inhibición de apoptosis. La apoptosis (muerte celular programada) es un mecanismo fisiológico implicado en la deleción de linfocitos T periféricos del sistema inmunitario, y su disregulación puede conducir a cierto número de diferentes procesos patógenos (Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213 (1994); Krammer, P.H. et al., Curr. Opin. Immunol. 6:279-289 (1994)).

Las enfermedades asociadas con un aumento de la supervivencia celular, o con la inhibición de la apoptosis, incluyen cánceres/tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53 y tumores dependientes de hormonas, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovarios); trastornos autoinmunitarios (tales como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide que cursa con glomerulonefritis de origen inmunitario) e infecciones virales (tales como las ocasionadas por virus herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación; enfermedad del injerto contra el anfitrión, rechazo agudo de injertos y rechazo crónico de injertos. Las enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis incluyen el SIDA; los trastornos neurodegenerativos (tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la retinitis pigmentosa, la degeneración cerebelar); síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, ictus y lesión por reperfusión), enfermedad hepática inducida por toxinas (tal como la causada por el alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Así, se prevé el uso de un ligando, análogo o agonista de DR5 capaz de incrementar la señalización mediada por DR5 para la preparación de una composición farmacéutica para intensificar la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que implica administrar a una célula que expresa el polipéptido DR5 una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 aumenta para tratar una enfermedad en la que se presenta una disminución de la apoptosis o de la expresión de citocinas y moléculas de adhesión. Un agonista puede incluir formas solubles de DR5 y anticuerpos monoclonales directamente contra el polipéptido DR5.

En un aspecto adicional, se prevé el uso de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada por DR5 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que implica administrar a una célula que expresa el polipéptido DR5 una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 se disminuye para tratar una enfermedad en la que se presenta un aumento de la apoptosis o de la expresión de NFkB. Un antagonista puede incluir formas solubles de DR5 y anticuerpos monoclonales directamente contra el polipéptido DR5.

Por "agonista" se entiende compuestos naturales y sintéticos capaces de intensificar o potenciar la apoptosis. Por "antagonista" se entiende compuestos naturales y sintéticos capaces de inhibir la apoptosis. Usando ensayos de respuesta celular del receptor a un ligando de la familia TNF conocidos, incluidos los descritos más abajo en detalle, se puede determinar si un "agonista" o "antagonista" candidato, como se describe en esta memoria, puede intensificar o inhibir la apoptosis.

Un procedimiento de escrutinio de esta clase implica el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor de la presente invención. Dicha técnica de escrutinio se describe en PCT WO 92/01810, publicada el 6 de febrero de 1992. Dicho ensayo se puede emplear, por ejemplo, para escrutar un compuesto que inhibe (o intensifica) la activación del polipéptido receptor de la presente invención poniendo en contacto células melanóforas que codifican el receptor con un ligando de la familia TNF y además con el antagonista (o agonista) candidato. La inhibición o intensificación de la señal generada por el ligando indica que el compuesto es un antagonista o agonista de la ruta señalizadora de ligandos/receptores.

Otras técnicas de escrutinio incluyen el uso de células que expresan el receptor (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide cambios de pG extracelular causados por activación del receptor. Por ejemplo, los compuestos se pueden poner en contacto con una célula que expresa el polipéptido receptor de la presente invención y puede medirse una respuesta del segundo mensajero, p. ej., cambios de pH o transducción de señales, para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe el receptor.

Otra de estas técnicas de escrutinio implica introducir RNA que codifica el receptor en oocitos de Xenopus para expresar el receptor de forma pasajera. Los oocitos del receptor pueden entrar en contacto después con el ligando para el receptor y un compuesto que va a someterse a escrutinio, seguido de detección de inhibición o activación de una señal de calcio en el caso de escrutar compuestos que se cree que inhiben la activación del receptor.

Otra técnica de escrutinio implica expresar en células una construcción en la que el receptor está ligado a una fosfolipasa C o D. Tales células incluyen células endoteliales, células de los músculos lisos, células de riñón en fase embrionaria, etc. El escrutinio se puede conseguir como se ha descrito aquí anteriormente por detección de la activación del receptor o la inhibición de la activación del receptor a partir de la señal de fosfolipasa.

Otro método implica escrutar compuestos (antagonistas) que inhiben la activación del polipéptido receptor de la presente invención determinando la inhibición de la unión del ligando marcado a células que tienen el receptor sobre la superficie de las mismas. Dicho método implica transfectar una célula eucariótica con DNA que codifica el receptor tal que la célula expresa el receptor sobre su superficie y poner en contacto la célula con un compuesto en presencia de una forma marcada de un ligando conocido. El ligando se puede marcar, p. ej. por radiactividad. La cantidad de ligando marcado unido a los receptores se mide, p. ej., midiendo la radiactividad de los receptores. Si el compuesto se une al receptor, lo que se determina por una disminución del ligando marcado que se une a los receptores, la unión del ligando marcado al receptor se inhibe.

Otros ensayos de escrutinio para agonistas y antagonistas de la presente invención están descritos en Tartaglia, L.A., y Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267:4304-4307(1992).

Así, en un aspecto adicional, se describe un método de escrutinio para determinar si un agonista o antagonista candidato es capaz de intensificar o disminuir una respuesta celular a un ligando de la familia TNF. El método implica poner en contacto células que expresan el polipéptido DR5 con un compuesto candidato y un ligando de la familia TNF, analizar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular patrón, siendo analizado el patrón cuando se hace contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, con lo que un aumento de la respuesta celular en relación con el patrón indica que el compuesto candidato es un agonista de la ruta señalizadora del ligando/receptor y una disminución de la respuesta celular comparada con la del patrón indica que el compuesto candidato es un antagonista de la ruta señalizadora del ligando/receptor. Por "ensayar una respuesta celular" se entiende medir cualitativa o cuantitativamente una respuesta celular a un compuesto candidato y/o un ligando de la familia TNF (p. ej., determinar o estimar un aumento o una disminución en la proliferación de células T o marcación con timidina tritiada). Por la invención, se puede poner en contacto una célula que expresa el polipéptido DR5 con un ligando de la familia TNF o bien endógeno o administrado exógenamente.

Agonista, como se describe aquí, incluye compuestos naturales y sintéticos tales como, por ejemplo, fragmentos peptídicos de ligandos de la familia TNF, factor de crecimiento transformante, neurotransmisores (tales como glutamato, dopamina, N-metil-D-aspartaro), supresores de tumores (p53), células T citolíticas y antimetabolitos. Los agonistas preferidos incluyen los fármacos quimioterapéuticos tales como, por ejemplo, cisplatino, doxorrubicina, bleomicina, citosina arabinosido, mostaza nitrogenada, metotrexato y vincristina. Otros incluyen el etanol y péptido amiloideo. (Science 267:1457-1458 (1995)). Agonistas preferidos adicionales incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales generados contra el polipéptido DR5 o un fragmento del mismo. Tales anticuerpos agonistas generados contra un receptor de la familia TNF están descritos en Tartaglia, L.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9292-9296 (1991); y Tartaglia, L.A., y Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267 (7):4304-4307 (1992) Véase, también, la solicitud de patente internacional WO 94/09137.

Antagonista, como se describe aquí, incluye compuestos naturales y sintéticos tales como, por ejemplo, el ligando CD40, aminoácidos neutros, zinc, estrógenos, andrógenos, genes víricos (tales como Adenovirus EIB, Baculovirus p35 y IAP, virus de la viruela vacuna crmA, virus de Epstein-Barr BHRF1, LMP-1, virus de la fiebre porcina africana LMW5-HL, y Herpesvirus yl 34.5), inhibidores de calpaína, inhibidores de cisteína proteasa y promotores de tumores (tales como PMA, Fenobarbital, y alfa-hexaclorociclohexano).

Otros antagonistas potenciales incluyen las moléculas antisentido. La tecnología antisentido se puede utilizar para controlar la expresión génica a través del DNA o RNA antisentido o a través de la formación de la triple hélice. Las técnicas antisentido se discuten, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). La formación de la triple hélice se discute, por ejemplo, en Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un DNA o RNA complementario.

Por ejemplo, la porción codificante en 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención se puede utilizar para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de DNA que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción, con lo que se impide la transcripción y la producción del receptor. El oligonucleótido de RNA antisentido se hibrida al mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA en el polipéptido receptor.

El ácido nucleico antisentido DR5 se puede producir intracelularmente por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, se transcribe un vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico (RNA) antisentido de la invención. Tal vector contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido DR5. Dicho vector puede permanecer episómico o llegar a integrarse en el cromosoma, con tal que pueda transcribirse para producir el RNA antisentido deseado. Tales vectores se pueden construir por métodos de tecnología de DNA recombinante, clásicos en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica DR5, o fragmentos de la misma, puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica que actúa en células de vertebrados, preferiblemente humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero sin limitarse a ellos, la región promotora precoz de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor timidina del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)), etc.

Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria de al menos una porción de un transcrito de RNA de un gen de DR5. Sin embargo, no se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefiera. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un RNA", referida aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido DR5 bicatenarios, puede ensayarse de este modo una sola cadena del DNA dúplex, o puede ensayarse la formación tríplex.d. La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto más largo es el ácido nucleico que se hibrida, más faltas de coincidencias con un RNA de DR5 puede contener y formar todavía un dúplex estable (o tríplex, en caso de que sea posible). Un experto en la técnica puede averiguar un grado tolerable de faltas de coincidencia por el uso de procedimientos clásicos para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los antagonistas potenciales incluyen RNA catalítico, o una ribozima (véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente internacional WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et al, Science 247:1222-1225 (1990). Aunque se pueden utilizar ribozimas que escinden el mRNA en secuencias de reconocimiento específicas para un sitio para destruir mRNA de DR5, se prefiere el uso de ribozimas "cabeza de martillo". Los ribozimas cabeza de martillo escinden mRNAs en lugares dictados por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con mRNA diana. El único requisito es que el mRNA diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describe con más detalle en Haseloff y Gerlach, Nature 334:585-591 (1988). Hay numerosos sitios potenciales para la escisión con ribozimas cabeza de martillo dentro de la secuencia nucleótídica de DR5 (Fig. 1). Preferiblemente, el ribozima se construye por ingeniería genética de manera que el sitio de reconocimiento para la escisión esté ubicado cerca del extremo 5' del mRNA de DR5; es decir, para aumentar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de transcritos no funcionales de mRNA. Las construcciones de DNA se pueden introducir en la célula de la misma manera que se ha descrito anteriormente para la introducción de DNA codificante antisentido. Ya que los ribozimas, a diferencia de las moléculas antisentido, son catalíticos, se requiere una concentración intracelular más baja para que resulten eficientes.

Antagonistas adicionales incluyen las formas solubles de DR5, es decir, fragmentos que incluyen el dominio de unión al ligando de la región extracelular del receptor de longitud completa. Tales formas solubles del receptor, que pueden ser naturales o sintéticas, antagonizan la señalización mediada por DR5 compitiendo con el DR5 de la superficie de la célula para unirse a ligandos de la familia TNF. Así, las formas solubles del receptor que incluyen el dominio de unión al ligando son nuevas citocinas capaces de inhibir la apoptosis inducida por ligandos de la familia TNF. Estos se pueden expresar como monómeros, pero, preferiblemente se expresan como dímeros o trímeros, ya que se ha demostrado que éstos son superiores a las formas monoméricas del receptor soluble como antagonistas, por ejemplo, fusiones de IgGFc-familia de receptores TNF. Otras citocinas de este estilo son conocidas en la técnica e incluyen Fas B (una forma soluble del receptor Fas de ratón) que actúa fisiológicamente para limitar la apoptosis inducida por el ligando Fas (Hughes, D.P. y Crispe, I.N., J. Exp. Med 182:1395-1401 (1995)).

El término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se emplea en esta memoria pretende incluir moléculas intactas así como fragmentos de las mismas (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}) que son capaces de unirse a un antígeno. Los fragmentos Fab, Fab', y F (ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más fácilmente de la circulación y pueden tener menos unión no específica a los tejidos que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Los anticuerpos según la presente invención pueden prepararse por cualquier variedad de métodos clásicos usando inmunógenos DR5 de la presente invención: Como se ha indicado, tales inmunógenos DR5 incluyen el polipéptido DR5 de longitud completa (que puede o no incluir la secuencia líder) y fragmentos del polipéptido DR5 tales como el dominio de unión al ligando, el dominio transmembranario, el dominio intracelular y el dominio de muerte.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y actividad de las secuencias polipeptídicas de la invención, p. ej., para formar imágenes de estos polipéptidos, medir sus niveles en muestras fisiológicas apropiadas, etc. Los anticuerpos también tienen uso en inmunoensayos y en terapéutica como agonistas y antagonistas de DR5.

Las proteínas y otros compuestos que se unen a los dominios DR5 son también agonistas y antagonistas candidatos. Tales compuestos de unión pueden "capturarse" usando el sistema del doble híbrido en levadura (Field y Song, Nature 340:245-246 (1989)). Una versión modificada del sistema del doble híbrido en levadura ha sido descrito por Roger Brent y sus colegas (Gyuris, J. et al., Cell 75:791-803 (1993); Zervos, A.S. et al., Cell 72:223-232 (1993)). preferiblemente, el sistema del doble híbrido en levadura se utiliza de acuerdo con la presente invención para capturar compuestos que se unen a bien al dominio de unión al ligando de DR5 o bien al dominio intracelular de DR5. Tales compuestos son buenos agonistas y antagonistas candidatos de la presente invención.

Por "ligando de la familia TNF" se entiende ligandos naturales, recombinantes y sintéticos que son capaces de unirse a un miembro de la familia de TNF receptores e inducir la ruta señalizadora de ligando/receptor. Los miembros de la familia de TNF ligandos incluyen, pero sin limitarse a ellos, ligandos DR5, TRAIL, TNF-\alpha, linfotoxina-\alpha (LT-\alpha, también conocida como TNF-\beta), LT-\beta (encontrado en el heterotrímero complejo LT-\alpha2-\beta), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40 y factor de crecimiento nervioso (NGF). Un ejemplo de un ensayo que se puede realizar para determinar la capacidad de DR5 y sus derivados (incluidos fragmentos) y y análogos para fijar TRAIL se describe más adelante en el Ejemplo 6.

Más adelante, se describen detalladamente aplicaciones terapéuticas representativas de la presente invención. El estado de inmunodeficiencia que define SIDA es secundario a una disminución en el número y la función de los linfocitos TCD4^{+}. Informes recientes estiman que la pérdida diaria de células T CD4^{+} está entre 3,5 X 10^{7} y 2 X 10^{9} células (Wei X. et al., Nature 373:117-122 (1995)). Se cree que una causa del agotamiento de las células T CD4^{+} en el marco de una infección por VIH es la apoptosis inducida por el VIH. De hecho, se ha demostrado muerte celular apotótica inducida por VIH no sólo in vitro sino también, y más importante, en individuos infectados (Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213 (1994) ; Finkel, T.H., y Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615 (1995); Muro-Cacho, C.A. et al., J. Immunol. 154:5555-5566 (1995)). Además, la apoptosis y el agotamiento de linfocitos T CD4^{+} está estrechamente correlacionado en diferentes modelos animales de SIDA (Brunner, T., et al., Nature 373:441-444 (1995); Gougeon, M.L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)) y, no se observa apoptosis en los modelos animales en los que la replicación viral no da como resultado SIDA (Gougeon, M.L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)). Datos adicionales indican que los linfocitos T no infectados pero cebados o activados de individuos infectados con VIH experimentan apoptosis después de encontrar el ligando Fas de la familia TnF. Usando líneas celulares monocíticas que dan como resultado la muerte tras una infección por VIH, se ha demostrado que la infección de células U937 cib VIH da como resultado la expresión de novo de FasL y que FasL media la apoptosis inducida por HN (Badley, A.D. et al., J. Virol. 70:199-206 (1996)). Además, el ligando de la familia TNF era detectable en macrófagos no infectados y su expresión era regulada en ascenso después de la infección por VIH, dando como resultado la muerte selectiva de linfocitos T CD4 no infectados (Badley A.D et al., J. Virol., 70:199-206 (1996)). Así, se considera un uso de un antagonista para reducir la muerte selectiva de linfocitos T CD4 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar individuos HIV^{+}. Los modos de administración y las dosis se discuten detalladamente más abajo.

En el rechazo de un aloinjerto, el sistema inmunitario del animal receptor no a sido cebado previamente para responder porque el sistema inmunitario en su mayor parte sólo es cebado por antígenos medioambientales. Los tejidos de otros miembros de la misma especia no han sido presentados del mismo modo que, por ejemplo, virus y bacterias. En el caso del rechazo de aloinjertos, los regímenes inmunosupresores están diseñados para impedir que el sistema inmunitario alcance la etapa efectora. Sin embargo, el perfil inmunológico del rechazo de un xenoinjerto puede parecerse a la recurrencia de la enfermedad más que al rechazo del aloinjerto. En el caso de recurrencia de enfermedad, el sistema inmunitario ya ha sido activado previamente, como lo demuestra la destrucción de las células de los islotes nativos. Por lo tanto, en la recurrencia de la enfermedad el sistema inmunitario ya está en la etapa efectora. Los agonistas de la presente invención son capaces de suprimir la respuesta inmunitaria tanto a los aloinjertos como a los xenoinjertos debido a que los linfocitos activados y diferenciados en células efectoras expresarán el polipéptido DR5 y, por ello, son susceptibles a los compuestos que intensifican la apoptosis. Así, se considera un uso para crear tejidos privilegiados inmunitariamente.

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Los antagonistas de DR5 pueden ser útiles para tratar enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, septicemia e enfermedad inflamatoria intestinal.

Además, debido a la expresión linfoblástica de DR5, se pueden usar anticuerpos monoclonales frente al agonista o antagonista de DR5 soluble para tratar esta forma de cáncer. Además, se pueden usar anticuerpos monoclonales (AnMo) neutralizantes o DR5 soluble para tratar varias formas crónicas y agudas de inflamación tal como artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, septicemia e enfermedad inflamatoria intestinal.

Modos de administración

El agonista o los antagonistas descritos aquí se pueden administrar in vitro, ex vivo, o in vivo a células que expresan el receptor de la presente invención. Por administración de una "cantidad eficaz" de un agonista o antagonista se entiende una cantidad del compuesto que es suficiente para intensificar o inhibir la respuesta celular a un ligando de la familia TNF e incluye polipéptidos. En particular, por administración de una "cantidad eficaz" de un agonista o antagonista se entiende una cantidad eficaz para intensificar o inhibir la apoptosis mediada por DR5. Por supuesto, si se desea que la apoptosis sea intensificada, se puede administrar un agonista de acuerdo con la presente invención junto con un ligando de la familia TNF.Un experto normal en la técnica apreciará que las cantidades eficaces de agonista o antagonista pueden ser determinadas empíricamente y pueden emplearse en forma pura o en forma de sal, éster o profármaco farmacéuticamente aceptable. El agonista o antagonista se puede administrar en composiciones combinado con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (es decir, portadores).

Se entenderá que, cuando se administra a un paciente humano, el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invención será decidido por el médico que trata al paciente dentro del alcance del juicio médico responsable. El nivel específico de la dosis terapéuticamente eficaz para cualquier paciente particular dependerá de factores bien conocidos en las ciencias médicas.

Como propuesta general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz de polipéptido DR5 administrada parenteralmente en cada dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se ha indicado anteriormente, esto estará sujeto a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 0,01 mg/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se dan continuamente, los agonistas o antagonistas de DR5 se administran típicamente a un ritmo de aproximadamente 1 \mug/kg/hora a aproximadamente 50 \mug/kg/hora, ya sea en 1-4 inyecciones al día o por infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una mini-bomba. También se puede emplear una solución en bolsa intravenosa.

La dosificación a un paciente también se puede disponer de una manera específica que aporte una concentración predeterminada de un agonista o antagonista en la sangre, como se determina por la técnica RIA. La dosificación al paciente se puede ajustar para conseguir unos niveles plasmáticos mínimos, regulares y continuados, medidos por RIA del orden de 50 a 1000 ng/ml, preferiblemente 150 a 500 ng/ml.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Además, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista o un antagonista (incluyendo polinucleótidos y polipéptidos DR5) y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, que se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como polvos, pomadas, gotas o parches transdérmicos), bucal, o como un spray oral o nasal. . Es importante que por administración conjunta de un agonista y un ligando de la familia TNF, los efectos secundarios clínicos pueden reducirse usando dosis más bajas de ambos, ligando y agonista. Se entenderá que el agonista se puede "administrar conjuntamente" ya sea antes, después o simultáneamente con el ligando de la familia TNF, dependiendo de las exigencias de la aplicación terapéutica particular. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende una carga sólida, semisólida o líquida, un diluyente, un material encapsulante o una formulación auxiliar de cualquier tipo, todos ellos no tóxicos. En una realización específica, "farmacéuticamente aceptable" significa autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un gobierno estatal o citado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y más particularmente en seres humanos. Ejemplos no limitantes de portadores farmacéuticos adecuados según esta realización se proporcionan en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, e incluyen líquidos estériles tales como agua y aceites, incluidos los derivados de petróleo y de origen animal, vegetal y sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y la dextrosa acuosa y las soluciones de gliceral se pueden emplear como portadores líquidos, en particular para las soluciones inyectables.

El término "parenteral" como se emplea en esta memoria se refiere a modos de administración que incluyen la inyección y la infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para inyección parenteral pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles y farmacéuticamente aceptables, así como polvos para reconstituirlos en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso.

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Además de polipéptidos DR5 solubles, también se puede utilizar un polipéptido DR5 que contiene la región transmembranaria cuando se solubiliza apropiadamente mediante inclusión de detergentes tales como CHAPS o NP-40, con tampón.

Ensayos con cromosomas

Las molécula de ácido nucleico de la presente invención son también útiles para la identificación de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente y se puede hibridar a un lugar particular en un cromosoma humano individual. El cartografiado de DNA a cromosomas según la presente invención es una primera etapa importante en la correlación de esas secuencias con genes asociados con enfermedades.

En este sentido, en ciertas realizaciones preferidas, el cDNA y/o los polinucleótidos descritos en esta memoria se usan para clonar DNA genómico de un gen DR5. Esto se puede efectuar usando una gama de técnicas y bancos de DNA bien conocidos y que, en general, están disponibles en el mercado. El DNA genómico después se usa para el cartografiado cromosómico in situ usando técnicas bien conocidas para este fin.

Además, las secuencias pueden ser cartografiadas a cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente 15-25 pb) a partir del cDNA. El análisis informático de la región no traducida en 3' del gen se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no se extienden más allá de un exón en el DNA genómico, complicando así el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan luego para escrutar por PCR híbridos celulares somáticos que contienen cromosomas humanos individuales.

La hibridación in situ con fluorescencia ("FISH") de un clon de cDNA a una extensión cromosómica en metafase se puede usar para proporcionar un lugar cromosómico preciso en una etapa. Esta técnica se puede usar con cDNA de tan sólo 50 o 60 pb de longitud. Para un repaso de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Una vez que una secuencia se ha cartografiado a un lugar cromosómico preciso, se puede correlacionar la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponibles on line a través de Johns Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre genes y enfermedades que han sido cartografiados en la misma región cromosómica se identifican a continuación mediante análisis de vínculos (herencia conjunta de genes físicamente adya-
centes).

Seguidamente, es necesario determinar las diferencias en el cDNA o en la secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados, que no se observa en ningún individuo sano, entonces la mutación probablemente es el agente causante de la enfermedad.

Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionar a modo de ilustración y no se deben interpretar como limitantes.

Ejemplo 1 Expresión y purificación en E. coli

La secuencia de DNA que codifica la proteína DR5 madura en el clon de cDNA depositado (ATCC No. 97920) se amplifica utilizando cebadores oligonucleotídicos para PCR específicos para las secuencias amino terminales de la proteína DR5 y para secuencias vector en 3' del gen. Se añaden nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción para facilitar la clonación a las secuencias 5' y 3' respectivamente.

Se utilizan los siguientes cebadores para la expresión del dominio extracelular de DR5 en E. coli: El cebador 5' tiene la secuencia 5'-CGCCCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3' (SEQ ID NO:8) y contiene el sitio NcoI subrayado; y el cebador 3' tiene la secuencia 5'-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTC TTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO:9) y contiene el sitio HindIII subrayado.

Los sitios de restricción son convenientes para los sitios de las enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE60, que se usan para la expresión bacteriana en este ejemplo. (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codifica resistencia al antibiótico ampicilina ("Amp"') y contiene un origen bacteriano de replicación ("ori"), un promotor inducible IPTG, y un sitio de unión al ribosoma ("RBS").

El DNA de DR5 amplificado y el vector pQE60, ambos, se difieren con NcoI y HindIII y los DNA digeridos se ligan entre sí a continuación. La inserción de DNA de proteína DR5 en el vector pQE60 vector pone la región codificante de la proteína DR5 después del extremo 3' de y operablemente unida al promotor inducible por IPTG del vector y en marco con un AUG de iniciación apropiadamente situado para la traducción de la proteína DR5.

La mezcla de ligación se transforma en células E. coli competentes usando procedimientos clásicos. Tales procedimientos están descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Para llevar a cabo el ejemplo ilustrativo descrito aquí, se usa la cepa de E. coli M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y confiere resistencia a kanamicina("Kan'"). Esta cepa, que es tan sólo una de las muchas que son adecuadas para expresar la proteína DR5, es obtenible en el mercado a partir de Qiagen, supra.

Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer sobre placas LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El DNA plasmídico se aísla a partir de colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma por análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA.

Los clones que contienen las construcciones deseadas se hacen crecer durante una noche ("O/N") en cultivo liquido en medio LB enriquecido con ampicilina (100 \mug/ml) y con kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande, a una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:250. Las células se hacen crecer a una densidad óptica de 600 nm ("OD600") entre 0,4 y 0,6. Después se añade isopropil-B-D-tiogalactopiranósido ("IPTG") a una concentración final de 1 mM para inducir la transcripción de promotores sensibles al promotor lac, por inactivación del represor lacI. Seguidamente, se incuban las células durante 3 a 4 horas.

Después, las células se recogen por centrifugación y se lisan por métodos clásicos. Los cuerpos de inclusión se purifican a partir de las células lisadas utilizando técnicas de recolección rutinarias, y la proteína se solubiliza a partir de los cuerpos de inclusión en urea 8M. La solución de urea 8 M que contiene la proteína solubilizada se hace pasar a través de una columna PD-10 en 2X solución salina tamponada con fosfato (PBS), con lo que se separa la urea, se intercambia el tampón y se repliega la proteína. La proteína se purifica por una etapa adicional de cromatografía para separar la endotoxina. Después, se filtra estéril. La preparación de proteína filtrada estéril se almacena en 2X PBS a una concentración de 95 \mu/ml.

Ejemplo 2 Expresión en células mamíferas

Un vector de expresión en células mamíferas típico contiene el elemento promotor, que media la iniciación de la transcripción del mRNA, la secuencia codificante de la proteína, y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación del transcrito. Elementos adicionales incluyen los intensificadores, las secuencias Kozak y las secuencias interpuestas flanqueadas por los sitios donantes y aceptores para la maduración del RNA por corte y empalme. Se puede efectuar una transcripción altamente eficiente con los promotores precoz y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de Retrovirus, p. ej. RSV, HTLVI, HIVI y el promotor precoz del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden usar señales celulares (p. ej. el promotor de actina humana). Los vectores de expresión adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC67109). Las células anfitrionas mamíferas que se pueden usar incluyen las células Hela 293, H9 y Jurkat humanas, las células NIH3T3 y C 127 de ratón, las células Cos 1, Cos 7 y CV 1, las células QC1-3 de codorniz, las células L de ratón y las células de ovario de hámster chino (CHO).

Alternativamente, el gen de interés se puede expresar en líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado también se puede amplificar para expresar grandes cantidades de la proteína purificada. El marcador de dihidrofolato reductasa(DHFR) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); K. White et al., Science 10:169-175 (1992)). Usando estos marcadores, las células mamíferas se hacen crecer en medio selectivo y las células con la resistencia más alta son seleccionadas. Estas líneas celulares contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. A menudo se usan células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción de proteínas.

Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5:438-447 (marzo 1985)), más un fragmento del intensificador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiples, p. ej. con los sitios de escisión para enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además el intrón en 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata.

Clonación y expresión en células CHO

Se utiliza el vector pC4 para la expresión del polipéptido DR5. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (ATCC nº de acceso 37146). El plásmido contiene el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor precoz de SV40. Las células de ovario de hámster chino u otras células que carecen de actividad dihidrofolato que son transfectadas con estos plásmidos se pueden seleccionar cultivándolas en un medio selectivo (alfa minus MEM, Life Technologies) enriquecido con el agente quimioterapéutico metotrexato (MTX). La amplificación de los genes DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien ducumentada (véase, p. ej., Alt, F. W., Kellems, R. M., Bertino, J. R., y Schimke, R. T., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); Page, M. J. y Sydenham, M. A. 1991, Biotechnology 9:64-68(1991)). Las células que han crecido en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco por sobreproducción de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificación del gen DHFR. Si se une un segundo gen al gen DHFR, habitualmente se co-amplifica y sobre-expresa. Se sabe en la técnica que se puede usar esta estrategia para desarrollar líneas celulares que portan más de 1.000 copias del gen o de los genes amplificados. Seguidamente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o más cromosomas de la célula anfitriona.

El plásmido pC4 contiene, para expresar el gen de interés, el promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5:438-447(marzo 1985), más un fragmento aislado del intensificador del gen precoz inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Después del extremo 3' del promotor están los siguientes sitios de escisión para enzimas de restricción individuales que permiten la integración de los genes: BamHI, Xba I, y Asp718. Detrás de estos sitios de clonación el plásmido contiene el intrón en 3' y el sitio de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. Otros promotores altamente eficientes también pueden ser usados para expresión, p. ej., el promotor de \beta-actina, los promotores precoz o tardío de SV40 o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, p. ej. HIV y HTLVI. Se pueden utilizar los sistemas de expresión de genes de Clontech, Tet-Off y Tet-On, y sistemas similares para expresar el polipéptido DR5 de un modo regulado en células mamíferas (Gossen, M., & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992). Para la poliadenilación del mRNA, también se pueden usar otras señales, p. ej., del gen de la hormona de crecimiento humana o de globina.

Las líneas celulares estables portadoras de un gen de interés integrado en los cromosomas también se pueden seleccionar por co-transfección con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más de un marcador seleccionable al principio, p. ej., G418 más metotrexato.

El plásmido pC4 se digiere con la enzima de restricción BamHI y después se desfosforila usando los fosfatos intestinales de ternera por procedimientos conocidos en la técnica. Después, el vector se aísla en gel de agarosa al 1%.

La secuencia de DNA que codifica el polipéptido completo se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR correspondientes a las secuencias en 5' y en 3' de la porción deseada del gen. El cebador 5' que contiene el sitio BamHI subrayado, una secuencia Kozak, y un codón de iniciación AUG, tiene la siguiente secuencia:

5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO:10).

El cebador 3', que contiene el sitio Asp718 subrayado, tiene la siguiente secuencia: 5'-CGCGGTACCT TAGGACATGGCAGAGTC-3' (SEQ ID NO:11).

El fragmento amplificado se digiere con la endonucleasa BamHI y Asp718 y después se purifica de nuevo en gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con T4 DNA ligasa. Después se transforman células de E. coli HB 101 o XL-1 Blue y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 usando, por ejemplo, análisis con enzimas de restricción.

Para la transfección, se usan células de ovario de hámster chino que carece de un gen DHFR activo. Cinco \mug del plásmido de expresión pC4 se cotransfectan con 0,5 \mug del plásmido pSVneo usando el método de la lipofectina (Felgner et al., supra). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluido G418. Las células se siembran EN alfa minus MEM enriquecido con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las célula se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Germany) en alfa minus MEM enriquecido con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml G418. Después de aproximadamente 10-14 días, los clones individuales se tripsinizan y luego se siembran en placas petri de 6 pocillos o frascos de 10 ml utilizando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones aún más altas de metotrexato (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 - 200 \muM. Se analiza la expresión del producto génico deseado, por ejemplo, por SDS-PAGE e inmunotransferencia Western o por análisis HPLC en fase inversa.

Clonación y expresión en células COS

El plásmido de expresión, pDR5-HA, se prepara por clonación de un cDNA que codifica el dominio extracelular soluble de la proteína DR5 en el vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que se puede obtener de Invitrogen, Inc.). El vector de expresión pcDNAI/amp contiene: (1) un origen E. coli de replicación eficaz para la propagación en E. coli y otras células procarióticas; (2) un gen de resistencia a ampicilina para la selección de células procarióticas que contienen plásmidos; (3) un origen SV40 de replicación para la propagación en células eucarióticas; (4) un promotor de CMV, un polienlazador, un SV40 y una señal de poliadenilación colocada de manera que un cDNA se puede poner convenientemente bajo el control de expresión del promotor CMV y operablemente unido al intrón de SV40 y la señal de poliadenilación por medio de sitios de restricción en el polienlazador. Un fragmento de DNA que codifica el dominio extracelular del polipéptido DR5 y una etiqueta HA fusionada en marco a su extremo 3' se clona en la región del polienlazador del vector de modo que la expresión de la proteína recombinante es dirigida por el promotor CMV. La etiqueta HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza descrita por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). La fusión de la etiqueta HA a la proteína diana permite la fácil detección y recuperación de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo de HA.

La estrategia de construcción del plásmido es la siguiente. El cDNA de DR5 del clon depositado se amplifica usando cebadores que contienen los sitios de restricción convenientes, tal como se ha descrito anteriormente para la construcción de vectores para la expresión de DR5 en E. coli. Para facilitar la detección, la purificación y la caracterización del DR5 expresado, uno de los cebadores contiene una etiqueta de hemaglutinina ("etiqueta HA") como se ha descrito anteriormente.

Los cebadores adecuados incluyen los siguientes, que se usan en este ejemplo. El cebador 5', que contiene el sitio BamHI subrayado, tiene la siguiente secuencia: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO:10). El cebador en 3', que contiene la secuencia de restricción Asp718 subrayada tiene la siguiente secuencia: 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3' (SEQ ID NO:12).

El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector, pcFNAI/Amp, se digieren con BamHI y Asp718 y después se ligan. La mezcla de ligación se transforma en la cepa de E. coli SURE (obtenible a partir de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado se cultiva sobre placas con medio de ampicilina que después se incuban para permitir el crecimiento de las colonias resistentes a ampicilina. El DNA plasmídico se aísla a partir de colonias resistentes y se examina por análisis de restricción u otros medios en busca de la presencia del fragmento que codifica el dominio extracelular del polipéptido DR5.

Para la expresión de DR5 recombinante, las células COS se transfectan con un vector de expresión, como se ha descrito anteriormente, usando DEAE-DEXTRANO, como se ha descrito, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Las células se incuban en condiciones para la expresión de DR5 por el vector.

La expresión de la proteína de fusión DR5-HA se detecta por radiomarcado e inmunoprecipitación, usando métodos descritos en, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988). Para este fin, dos días después de la transfección, las células se marcan por incubación en medio que contiene 35S-cisteína durante 8 horas. Las células y los medios se recogen, y las células se lavan y después se lisan con tampón RIPA que contiene detergente: 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,5% de DOC, 50 mM de TRIS, pH 7,5, como han descrito Wilson et al., citado anteriormente. Las proteínas se precipitan del lisado celular y del medio de cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan luego por SDS-PAGE y autoradiografía. En el lisado celular, se ve un producto de expresión del tamaño esperado, que no se ve en los controles negativos.

Los conjuntos de cebadores usados para la expresión en este ejemplo son compatibles con pC4 usado para la expresión en CHO en este ejemplo, pcDNAI/Amp usado para la expresión en COS en este ejemplo, y pA2 usado para la expresión en baculovirus en el ejemplo siguiente. Así, por ejemplo, el fragmento codificante de DR5 completo amplificado para la expresión en CHO también se podría ligar en pcDNAI/Amp para la expresión en COS o pA2 para la expresión en baculovirus.

Ejemplo 3 Clonación y expresión del dominio extracelular soluble de DR5 en un sistema de expresión de baculovirus

En este ejemplo ilustrativo, se usa el vector lanzadera plasmídico pA2 para insertar el DNA clonado que codifica la proteína completa, incluyendo su secuencia señal asociada espontáneamente, en un baculovirus para expresar la proteína DR5, usando métodos clásicos, tales como los descritos en Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987). Este vector de expresión contiene el promotor polihédrico fuerte del virus de la polihedrosis nuclear Autograph californica (ACMNPV) seguido de los sitios de restricción convenientes. Para la sencilla selección del virus recombinante, el plásmido contiene el gen de beta-galactosidasa de E. coli bajo el control de un promotor débil de Drosophila en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos lados por secuencias víricas para recombinación homóloga mediada por la célula con el DNA viral de tipo salvaje para generar virus viable que expresa el polinucleótido clonado. Se podrían utilizar otros muchos vectores de baculovirus en lugar de pA2, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1 siempre que, como apreciaría fácilmente un experto en la técnica, la construcción proporcione señales localizadas apropiadamente para la transcripción, traducción, secreción y similares, tales como un AUG en marco y un péptido señal, según se requiera. Tales vectores se describen, por ejemplo, en Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989).

La secuencia de cDNA que codifica el dominio extracelular soluble de la proteína DR5 en el clon depositado (ATCC nº 97920) se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen:

El cebador en 5' para DR5 tiene la secuencia 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGA ACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO:10) que contiene el sitio para la enzima de restricción BamHI subrayado. Como se describe más abajo, insertado en un vector de expresión, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica DR5 proporciona un péptido señal de escisión eficiente. Una señal eficiente para la iniciación de la traducción en células eucarióticas,como describe Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987) se sitúa apropiadamente en la porción vector de la construcción.

El cebador 3' para DR5 tiene la secuencia 5'-CGCGGTACCTTAGCCT GATTCTTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO:12) que contiene la restricción Asp718 subrayada seguida de nucleótidos complementarios a la secuencia de nucleótidos de DR5 en la Fig. 1, seguida del codón de parada.

El fragmento amplificado se aísla de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) Después, el fragmento amplificado se digiere con la endonucleasa BamHI y Asp718 y se purifica de nuevo en gel de agarosa al 1%. Este fragmento se designa "Fl".

El plásmido se digiere con las enzimas de restricción Bam HI y Asp718 y Opcionalmente se puede desfosforilar usando fosfatasa intestinal de ternera, utilizando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica.Después, el DNA se aísla de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el mercado ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) El DNA vector se designa aquí "V1".

El fragmento F1 y el plásmido desfosforilado V 1 se ligan entre sí con T4 DNA ligasa. Las células E. coli HB 101, u otros anfitriones E. coli adecuados tales como las células XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), se transforman con la mezcla de ligación y se extienden en placas de cultivo. Se identifican bacterias que contienen el plásmido con el DR5 humano usando el método PCR, en el que uno de los cebadores que se usa para amplificar el gen y el segundo cebador está bien dentro del vector de modo que sólo las colonias bacterianas que contienen el fragmento del gen DR55 presentarán amplificación del DNA. La secuencia del fragmento clonado se confirma por secuenciación del DNA. Este plásmido se designa aquí pBac DR5.

5 \mug del plásmido pBac DR5 se co-transfectan con 1,0 \mug de un DNA de baculovirus linealizado disponible en el mercado ("DNA de baculovirus BaculoGold™", Pharmingen, San Diego, CA.), usando el método de la lipofectina descrito por Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). 1 \mug de DNA de virus BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pBac DR5 se mezclan en un pocillo estéril de una placa de microtítulo que contiene 50 \mul de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después de esto, se añaden 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de medio Grace, se mezcla y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla de transfección e añade gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se somete balanceo para mezclar la solución recién añadida. Después, la placa se incuba durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, la solución de transfección se retira de la placa y se añade 1 ml de medio insectil de Grace enriquecido con un 10% de suero de ternera fetal. La placa se vuelve a poner en la incubadora y se sigue cultivando a 27ºC durante 4 días.

Después de cuatro días, el sobrenadante se recoge y se realiza un ensayo en placas, como describen Summers y Smith, citado anteriormente. Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) para permitir la identificación sencilla y el aislamiento de clones que expresan gal, que producen placas coloreadas de azul. (También se puede encontrar una descripción detallada de un "ensayo en placas" de este tipo en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, páginas 9-10). Después de una incubación apropiada, las placas de color azul se recogen con la punta de una micropipeta (p. ej., Eppendorf). El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende después en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 \mul de medio de Grace y la suspensión que contiene el baculovirus recombinante se utiliza para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, los sobrenadantes de estas placas de cultivo se recogen y después se guardan a 4ºC. El virus recombinante se denomina V-DR5.

Para verificar la expresión del gen DR5, se hacen crecer células Sf9 en medio de Grace enriquecido con 10% de FBS inactivado por calor. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-DR5 a una multiplicidad de infección ("MOI") de aproximadamente 2 (aproximadamente 1 a aproximadamente 3). Seis horas más tarde, el medio se separa y se reemplaza por medio SF900 II menos metionina y cisteína (obtenible de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Si se desean las proteínas radiomarcadas, 42 horas más tarde se añaden 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (obtenible de Amersham). Las células se incuban adicionalmente durante 16 horas y después se recogen por centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas intracelulares se analizan por SDS-PAGE seguida de autoradiografía (si están radiomarcadas). La microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del terminal amino de la proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia amino terminal de la proteína madura y, de este modo, el punto de escisión y la longitud del péptido señal secretor.

Ejemplo 4 Distribución tisular de la expresión del gen DR5

Se llevó a cabo un análisis por transferencia Northern para examinar la expresión del gen DR5 en tejidos humanos, usando métodos descritos por, entre otros Sambrook et al., citado más arriba. Una sonda de cDNA que contiene la secuencia nucleotídica completa de la proteína DR5 (SEQ ID NO:1) se marcó con ^{32}P usando el sistema de marcación de DNA rediprime™ (Amersham Life Science), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la marcación, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), de acuerdo con el protocolo del fabricante nº PT1200-1. Luego se usó la sonda marcada purificada para examinar varios tejidos humanos para mRNA de DR5.

Las transferencias Northern de tejidos múltiples (MTN) que contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos de sistema inmunitario humano (IM) se obtuvieron de Clontech (Palo Alto, CA) y se examinaron con la sonda marcada usando la solución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante número PT1190-1. Después de la hibridación y el lavado, se montaron las transferencias y se expusieron a película a -70ºC durante una noche. Las películas se revelaron de acuerdo con procedimientos clásicos. Se detecto la expresión de DR5 en corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, útero, intestino delgado, colon, leucocitos de sangre periférica (PBL), ganglios linfáticos, médula ósea e hígado fetal.

También se estimó expresión de DR5 por transferencia Northern en las siguientes líneas celulares cancerosas, HL60 (leucemia promielocítica), células Hela S3, K562 (leucemia mielógena crónica), MOLT4 (leucemia linfoblástica Raji (linfoma de Burkitt), SW480 (adenocarcimona colorrectal), A549 (carcinoma de pulmón), y G361 (melanoma), y se detectó en todas las líneas celulares ensayadas.

Ejemplo 5 Apoptosis inducida por DR5 en células mamíferas

La sobreexpresión de Fas/APO-1 y TNFR-1 en células mamíferas mimetiza la activación del receptor (M. Muzio et al., Cell 85: 817-827 (1996); M. P. Boldin et al., Cell 85:803-815 (1996)). Así, se utilizó este sistema para estudiar el papel funcional de DR5 en la inducción de la apoptosis. Este ejemplo demuestra que la sobreexpresión de DR5 indujo apoptosis tanto en células de carcinoma de mama humano MCF7 como en células de carcinoma epiteloide humano (HeLa).

Diseño experimental

Se realizaron ensayos de muerte celular esencialmente como se ha descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, et al., Cell 81:505-12 (1995); M.P. Boldin, et al., J Biol Chem 270: 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14:5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, et al., J Biol Chem 271: 4961-4965 (1996)). Brevemente, líneas de células clonales de carcinoma de mama humano MCF-7 y células HeLa se co-transfectaron con vector, DR5, DR5\Delta (52-411), o TNFR-1, junto con una construcción indicadora de beta-galactosidasa.

Las células MCF7 y Hela se transfectaron usando el procedimiento de la lipofectamina (GIBCO-BRL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron 293 células usando precipitación con CaPO_{4}. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se fijaron y tiñeron con X-Gal como se ha descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, et al., Cell 81:505-12 (1995); M.P. Boldin, et al., J Biol Chem 270:7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14:5579-5588 (1995)), y se examinaron al microscopio. Los datos (valores medios \pm DT) presentados en la Figura 5 representan el porcentaje de células apoptóticas, redondas, en función de las células positivas en beta-galactosidasa totales (n=3). La sobreexpresión de DR5 indujo apoptosis tanto en células MCF7 (Fig. 5A) como en células Hela
(Fig. 5B).

Las células MCF7 también se transfectaron con una construcción de expresión de DR5 en presencia de z-VAD-fmk (20 \mul)(Enzyme Systems Products, Dublin, CA) o se cotransfectaron con un exceso del triple de CrmA (M. Tewari et al., J Biol Chem 270:3255-60 (1995)), o construcción de expresión FADD-DN, o vector en solitario. Los datos presentados en la Fig. 5C indican que la apoptosis inducida por DR5 se atenuaba por inhibidores de caspasa, pero no por FADD negativo dominante.

Como se representa en la Fig. 5D, DR5 no se asoció con FADD o TRADD in vivo. Se cotransfectaron 293 células con las construcciones de expresión indicadas usando precipitación con fosfato de calcio. Después de la transfección (a las 40 horas), se prepararon lisados celulares que se inmunoprecipitaron con gel de afinidad para el anticuerpo Flag M2 (IBI, Kodak), y se detectó la presencia de FADD o TRADD etiquetado con myc (myc-TRADD) por inmunotransferencia con anticuerpo policlonal frente a FADD o anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante frente a myc (BMB)(Baker, S.J. et al., Oncogene 12:1 (1996); Chinnaiyan, A.M. et al., Science 274:990 (1996)).

Como se indica en la Fig. 5E, FLICE 2-DN bloquea la apoptosis inducida por DR5. Se cotransfectaron 293 células con la construcción de expresión de TNFR-1 o DR5 y un exceso del cuádruple de CrmA, FLICE-DN, FLICE 2-DN, o vector en solitario en presencia de una construcción indicada por beta-galactosidasa, como se ha indicado. Las células se tiñeron y examinaron 25-30 horas más tarde.

Resultados

La sobreexpresión de DR5 indujo apoptosis tanto en células de carcinoma de mama MCF7 (Fig. 5A) como en células de carcinoma epiteloide (Hela) (Fig. 5B). La mayor parte de las células transfectadas mostraron cambios morfológicos característicos de células que experimentan apoptosis (Earnshaw, W.C., Curr. Biol. 7:337 (1995)), haciéndose redondeadas, condensadas y despegándose de la placa. La deleción del dominio de muerte abolió la capacidad de matar. La apoptosis inducida por DR5, como por DR4, fue bloqueada por inhibidores de caspasa, CrmA y z-VAD-fmk, pero FADD negativo dominante no tenía efecto alguno (Fig. 5C). En concordancia con esto, DR5 no interacciona con FADD ni TRADD in vivo (Fig. 5D). Una versión negativa dominante de una molécula similar a FLICE, FLICE2, identificada recientemente (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272:6578 (1997)), bloqueó eficientemente la apoptosis inducida por DR5, mientras que FLICE negativo dominante tenía sólo un efecto parcial en las condiciones de bloqueo. TNFR-1 indujo apoptosis de forma eficaz (Fig. 5E). Tomada en conjunto, las pruebas sugieren que DR5 emprende un programa apoptótico que implica la activación de FLICE2 y después del extremo 3' de caspasas, pero es independiente de FADD.

Ejemplo 6 El dominio extracelular de DR5 se une al ligando citotóxico-TRAIL, y bloquea la apoptosis inducida por TRAIL

Como se ha discutido más arriba, TRAIL/Apo2L es un ligando citotóxico que pertenece a la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral(TNF) e induce muerte celular rápida de muchas líneas celulares transformadas, pero no de tejidos sanos, a pesar de que su receptor que contiene el dominio de muerte, DR4, está siendo expresado en ambos tipos de células. Este ejemplo indica que el presente receptor, DR5, también se une a TRAIL.

Dada la similitud de los dominios ricos en cisteína que se unen a los ligandos extracelulares de DR5 and DR4, los autores de la invención supusieron que DR5 también se uniría a TRAIL. Para confirmar esto, los dominios que se unen al ligando extracelular soluble de DR5 se expresaron como fusiones a la porción Fc de la inmunoglobulina humana (IgG).

Como se indica en la Fig. 6A, DR5-Fc se unió específicamente a TRAIL, pero no al ligando citotóxico relacionado TNF\alpha. En este experimento, los dominios extracelulares-Fc de DR5, DR4, TRID, o TNFR1 y los correspondientes ligandos fueron preparados y los ensayos de unión fueron realizados como se describe en Pan et al., Science 276:111 (1997). Las respectivas fusiones-Fc se precipitaron con proteína G-Sepharose y los ligandos solubles co-precipitados se detectaron por inmunotransferencia con anti-Flag (Babco) o anti-myc-HRP (BMB). El cuadro inferior de la Fig. 6A indica las funciones-Fc de entrada presentes en los ensayos de unión.

Aún más, DR5-Fc bloqueó la capacidad de TRAIL de inducir apoptosis (Fig. 6B). Células MCF7 se trataron con TRAIL soluble (200 ng/ml) en presencia de cantidades iguales de fusiones-FC o Fc en solitario. Seis horas más tarde, las células se fijaron y examinaron como se ha descrito en Pan et al., Id. Los datos (valores medios \pm DT) indicados en la Fig. 6B son el porcentaje de núcleos apoptóticos entre núcleos totales contados (n=4).

Finalmente, DR5-Fc no tenía ningún efecto sobre la muerte celular inducida por TNF\alpha, apoptosis, en condiciones en las que TNFR1-Fc abolía completamente la muerte por TNF\alpha (Fig. 6C). Las células MCF7 se trataron con TNF\alpha (40 ng/ml; Genentech, Inc.) en presencia de cantidades iguales de fusiones-Fc o Fc en solitario. Los núcleos se tiñeron y examinaron 11-15 horas más tarde.

La nueva identificación de DR5 como receptor para TRAIL añade aún más complejidad a la biología de la transducción de señales iniciada por TRAIL.

Será evidente que la invención se puede llevar a la práctica de manera distinta a la descrita de modo particular en la descripción y los ejemplos anteriores.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Ni, Jian

\hskip3.9cm

Gentz, Reiner

\hskip3.9cm

Yu, Guo-Liang

\hskip3.9cm

Su, Jeffrey

\hskip3.9cm

Rosen, Craig A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor 5 que contiene el Dominio de Muerte

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Human Genome Sciences, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 Key West Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rockville

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MD

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: con la presente en EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/054,021

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-JUL-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/040,846

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-MAR-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hoover, Kenley

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.302

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: PF366

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 3013098504

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 3013098439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1600 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 130..283

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 130..1362

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido maduro

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 284..1362

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 411 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 455 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 417 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 507 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 226 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCCATGGA GTCTGCTCTG ATCAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAAGCTTT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCG CCATCATGGA ACAACGGGGA CGAAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGTACCT TAGGACATGG CAGAGTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGTACCT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC

\hfill

30

17

18

Claims (12)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos -51 a 360 en SEQ ID NO: 2;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 360 en SEQ ID NO: 2;

(c)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 133 en SEQ ID NO:2 y

(d)

una primera secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos como se ha definido en uno cualquiera de (a) a (c), en donde dicha primera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que induce apoptosis;

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 que es DNA o RNA.

4. Un método para producir un vector recombinante, que comprende insertar una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vector.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un método para producir una célula anfitriona recombinante, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de la reivindicación 5 en una célula anfitriona.

7. Una célula anfitriona recombinante, que comprende el vector de la reivindicación 5.

8. Un método para producir un polipéptido aislado que tiene una secuencia de ácidos nucleicos codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 7 en condiciones tales que dicho polipéptido es expresado, y recuperar dicho polipéptido.

9. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 9, donde dicho polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos -51 a 360 en SEQ ID NO:2;

(b)

la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 360 en SEQ ID NO:2;

(c)

la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 133 en SEQ ID NO:2; y

(d)

una secuencia de aminoácidos que es codificada por una primera secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se ha definido en uno cualquiera de (a) a (c), en donde un polipéptido que consiste en dicha secuencia de aminoácidos codificada induce apoptosis.

11. El anticuerpo de la reivindicación 10, donde dicho anticuerpo es capaz de intensificar la apoptosis.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 10 o 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.