KR100527638B1

KR100527638B1 - 사망 도메인을 보유하는 수용체 5

Info

Publication number: KR100527638B1
Application number: KR10-1999-7008466A
Authority: KR
Inventors: 지안 니; 라이너 엘 겐츠; 궈-량 유; 크레이그 에이 로젠
Original assignee: 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-03-17
Publication date: 2005-11-23
Also published as: US20020098550A1; CA2644454A1; CA2285040A1; DE69836956T2; CA2285040C; EP0970213A2; AU747635B2; ES2281126T3; WO1998041629A2; ATE352618T1; JP2008081503A; PT970213E; EP0970213B1; CN1184315C; KR20000076364A; DE69836956D1; HK1025352A1; CN1275162A; AU6763598A; CN1624128A

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체군의 종이며, TRAIL에 결합하는 것으로 나타난 신규의 사망 도메인 보유 수용체-5(DR5)에 관한 것이다. 구체적으로는, 인체 DR5 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. DR5 폴리펩티드 역시 이들을 제조하기 위한 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법과 함께 제공된다. 본 발명은 또한 DR5 활성의 작동 물질 및 길항 물질을 확인하기 위한 검색 방법에 관한 것이다.

Description

사망 도메인을 보유하는 수용체 5{DEATH DOMAIN CONTAINING RECEPTOR 5}

본 발명은 종양 괴사 인자 수용체군의 신규 종에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 인간의 사망 도메인(death domain) 보유 수용체 5, 즉 간단히 "DR5"를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 DR5 폴리펩티드도 제공하며, 이들의 제조에 사용되는 벡터, 숙주 세포 및 이들 폴리펩티드를 제조하는 재조합 방법도 제공한다. 본 발명은 또한 DR5 활성의 작동 물질 및 길항 물질을 확인하기 위한 검색 방법에 관한 것이다.

여러 가지 생물학적 작용, 예컨대, 특정 자극에 대한 반응 및 자연적인 생물학적 과정은 시토킨과 같은 인자에 의해 제어된다. 다수의 시토킨은 수용체를 끌어들여 세포내 반응을 일으킴으로써 수용체를 통해 작용한다.

예컨대, 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타가 시토킨인데, 이들은 TNF 수용체를 통해 작용하여 다수의 생물학적 과정, 예컨대, 쇼크와 염증성 질환의 유도 및 감염에 대한 보호를 조절한다. TNF 분자는 "TNF-리간드" 대형군(superfamily)에 속하며, 그들의 수용체 또는 짝리간드인 "TNF-수용체" 대형군과 함께 작용한다. 지금까지, TNF 리간드 대형군의 9개 종이 확인되었고, TNF-수용체 대형군의 10개 종이 특성 분석되었다.

리간드들 중에는, TNF-α, 림포톡신-α(LT-α, TNF-β로도 알려져 있음), LT-β(복합 이종삼량체 LT-α2-β에서 확인됨), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L 및 신경 성장 인자(NGF)가 포함된다. TNF 수용체 대형군에는 p55TNF 수용체, p75TNF 수용체, TNF 수용체 관련 단백질, FAS 항원 또는 APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, 저친화도 p75 및 NGF-수용체가 포함된다(Meager, A., Biologicals, 22:291-295(1994)).

TNF-리간드 대형군의 다수 종은 활성화된 T-세포에 의해 발현되는데, 이것은 이들이 세포의 개체 발생 및 기능의 기초가 되는 다른 세포형과의 T-세포 상호작용에 필수적임을 시사하는 것이다(상기 Meager, A.의 문헌 참조).

TNF 수용체군의 여러 가지 종들의 필수 기능은 이들 단백질의 발현 능력이 제거된 돌연변이를 확인하고 생성시킴으로써 알아낼 수 있었다. 예컨대, FAS 항원과 그 리간드에서의 자연 발생적 돌연변이는 계획된 세포 사망의 실패를 의미하는 것으로 추정되는 임파구 증식성 질환을 일으킨다(Watanabe-Fukunaga, R. 등, Nature 356:314 (1992)). CD40 리간드의 돌연변이는 혈장내 면역글로불린 M의 레벨이 높고, 면역글로불린 G의 레벨이 낮은 것을 특징(불완전한 T-세포 의존성 B-세포의 활성화를 나타냄)으로 하는 X와 관련된 면역 결핍 상태를 일으킨다(Allen, R.C. 등, Science 259:990 (1993)). 저친화도의 신경 성장 인자 수용체를 표적으로 한 돌연변이는 말초 구조의 불완전한 감각 쇄신을 특징으로 하는 질환을 일으킨다(Lee, K.F. 등, Cell 69:737(1992)).

TNF 및 LT-α는 두개의 TNF 수용체(55-kd TNF 수용체 및 77-kd TNF 수용체)에 결합할 수 있다. TNF 및 LT-α가 그들의 수용체 작용을 통해 유도하는 다수의 생물학적 효과에는 이식된 종양의 출혈성 괴사, 세포 독성, 내독소 쇼크에서의 역할, 염증, 면역 조절, 증식 및 항비루스 반응, 뿐만 아니라, 이온화 방사선의 유해 효과에 대한 보호가 있다. TNF 및 LT-α는 내독소 쇼크, 뇌성 말라리아, 종양, 자가 면역 질병, AIDS 및 이식체-숙주 거부 반응을 비롯한 광범위한 질병의 병인론에 관여한다(Beutler, B. 및 Von Huffel, C., Science 264:667-668(1994)). p55 수용체에서의 돌연변이는 미생물 감염에 대한 민감성을 증가시킨다.

더욱이, TNFR1(p55) 및 Fas 부근의 약 80개 아미노산 도메인은 "사망 도메인(death domain)"으로 보고되었는데, 이 도메인은 계획된(programmed) 세포 사망에 대한 신호를 전달하는 작용을 한다(Tartaglia 등, Cell 74:845(1993)).

아폽토시스(appotosis) 또는 계획된 세포 사멸은 다세포 생물의 정상 발육 및 항상성에 필수적인 생리학적 과정이다(H. Steller, Science 267:1445-1449(1995)). 아폽토시스의 이상은 암, 신경 퇴행성 질환 및 후천성 면역 결핍증을 비롯한 다수의 인간 질병의 병인론에 영향을 끼친다(C.B. Thompson, Science 267:1456-1462(1995)). 최근에, 두개의 세포 표면 사망 수용체 Fas/APO-1 및 TNFR-1의 신호 전달 및 생물학적 기능에 관심이 집중되고 있다(J.L. Cleveland 등, Cell 81:479-482(1995); A. Fraser 등, Cell 85:781-784(1996); S. Nagata 등, Science 267:1449-56(1995)). 이들은 둘다 TNFR-2, 저친화도 NGFR, CD40 및 CD30도 포함하는 TNF 수용체군의 종들이다(C.A. Smith 등, Science 248:1019-23(1990); M. Tewari 등, Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl 편집(Chapman and Hall, 런던, 1995)). 수용체군의 종들은 그들의 세포외 도메인에 시스테인이 풍부한 반복 서열의 존재에 의해 정의되지만, Fas/APO-1 및 TNFR-1은 또한 세포내 상동성이 있는 영역을 공유하는데, 이 영역은 "사망 도메인"으로 적절히 명명된 것으로서, 초파리 자살 유전자인 reaper와는 관계가 적다(P. Golstein 등, Cell 81:185-186(1995); K. White 등, Science 264:677-83(1994)). 상기 공유된 사망 도메인은 두 수용체가 최근까지도 확인되지 않고 있는 신호 전달 분자의 관련 세트와 상호작용한다는 것을 시사한다. Fas/APO-1의 활성화에 의해 사망 도메인 보유 어댑터 분자 FADD/MORT1(A.M. Chinnaiyan 등, Cell 81:505-12(1995); M.P. Boldin 등, J. Biol. Chem. 270:7795-8(1995); F.C. Kischkel 등, EMBO 14:5579-5588(1995))가 점증하고, 상기 분자는 다시 전아폽토시스성 (pro-apoptotic) 프로테아제의 ICE/CED-3군의 일종인 FLICE/MACH1에 결합하고 아마도 그것을 활성화시킬 것이다(M. Muzio 등, Cell 85:817-827(1996); M.P. Boldin 등, Cell 85:803-815(1996)). Fas/APO-1의 중심적인 역할은 세포 사망을 유발하는 것이지만, TNFR-1은 다양한 생물학적 활성의 어레이를 신호할 수 있는데, 이 활성중 다수는 TNFR-1이 NF-kB를 활성화하는 능력으로부터 유래한다(L.A. Tartaglia 등, Immunol Today 13:151-3(1992)). 따라서, TNFR-1은 다가의 어댑터 분자 TRADD를 점증시키는데, 이 TRADD는 FADD처럼 역시 사망 도메인을 보유하는 것이다(H. Hsu 등, Cell 81:495-504(1995); H. Hsu 등, Cell 84:299-308(1996)). FADD, TRAF2 및 RIP를 비롯한 다수의 신호작용성 분자와의 연합을 통해, TRADD는 아폽토시스 및 NF-kB 활성화를 신호할 수 있다(H. Hsu 등, Cell 84:299-308(1996); H. Hsu 등, Immunity 4:387-396(1996)).

최근에, 새로운 아폽토시스 유도 TNF 리간드가 발견되었다. S.R. Wiley 등의 문헌(Immunity 3:673-682 (1995))에서는 이 분자를 "TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드" 또는 간단히 "TRAIL"로 명명하였다. 이 분자는 "Apo-2 리간드" 또는 "Apo-2L"로 불리기도 했다(R.M. Pitt 등, J. Biol. Chem. 271:12687-12690(1996)). 이 분자는 또한 동시 계류중인 미국 가명세서 출원 제60/013,405호에도 개시되어 있다. 편의상, 이 분자는 이하 TRAIL로 지칭하고자 한다.

그 전사체가 자극된 T-세포로만 주로 제한되는 것으로 보이는 FAS 리간드와는 달리, TRAIL은 다수의 인체 조직(예컨대, 비장, 폐, 전립선, 흉선, 난소, 소장, 결장, 말초혈 임파구, 태반, 신장)에서 상당한 레벨로 검출되며, 일부 세포주에 의해 구성성으로 전사된다. TRAIL은 Fas 리간드와는 독립적으로 작용하는 것으로 알려졌다(Wiley 등의 상기 문헌 참조). TRAIL이 FAS/Apo-1L에 의한 사멸 신호작용과 유사한 시간 구조내에서 신속히, 그러나 TNF-유도된 아폽토시스보다는 훨씬 더 빠르게 아폽토시스를 활성화한다는 것도 알려졌다(S.A. Masters 등, Current Biology 6:750-752(1996)). TRAIL이 TNFR-1, Fas 또는 최근에 확인된 DR3에 결합할 수 없다는 것은 TRAIL이 특이 수용체(들)와 상호작용할 수 있음을 시사하는 것이다.

TRAIL에 대한 몇 가지 특이 수용체가 이미 확인되어 있다. 동시 계류중인 미국 가명세서 특허출원 제60/035,722호에, TRAIL에 대한 새로운 사망 도메인 보유 수용체인 DR4가 개시되어 있다. 문헌[Pan 등, Science 276, 111-113(1997년 4월)] 참조. 동시 계류중인 미국 가명세서 특허출원 제60/035,496호의 대상인 TR5 수용체가 현재 TRAIL에 결합하는 것으로 알려져 있다. 동시 계류중인 미국 가명세서 특허 출원 제60/XXXXXX호에는, TR10 수용체가 또한 DR4와 서열 상동성으로 인해 TRAIL에 결합할 것으로 예측되어 있다.

TNF군 리간드와 TNF군 수용체의 효과는 포유류 시스템의 생물학적 과정에서 정상 및 비정상의 다수의 기능에 영향을 끼치며 변화된다. 그러므로, 정상적으로 및 질병 상태에서 생물학적 활성에 영향을 끼치는 그러한 수용체 및 리간드의 확인 및 특성 분석이 명백히 요구된다. 구체적으로, TRAIL에 결합하는 추가의 신규 수용체를 분리하고 특성 분석할 필요가 있다.

발명의 요약 본 발명은 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열 또는 ATCC 기탁 번호 제97920호(1997. 03. 07)로 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 재조합 벡터를 보유하는 숙주 세포, 뿐만 아니라, 그러한 벡터 및 숙주 세포의 제조 방법 및 재조합 기법에 의한 DR5 폴리펩티드 또는 펩티드의 제조에 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재한 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 아미노산 서열을 가진 분리된 DR5 폴리펩티드도 제공한다.

본 발명은 또한 DR5 단백질의 레벨을 검출하기 위한 정량 분석법 및 진단 분석법을 제공한다. 따라서, 예컨대, 본 발명에 따라 정상 대조군 조직 시료에 비해 DR5 또는 이것의 가용성 형태의 과다 발현을 검출하는 진단 분석법을 사용하여 종양의 존재를 검출할 수 있다.

종양 괴사 인자(TNF)군 리간드는 다수의 세포 반응, 예컨대, 세포 독성, 항비루스 활성, 면역 조절 활성 및 여러 가지 유전자의 전사 조절을 유도하는 최고의 다형질 발현성 시토킨으로 알려져 있다. TNF군의 리간드에 대한 세포 반응은 정상의 생리학적 반응을 포함할 뿐만 아니라, 증가된 아폽토시스 또는 아폽토시스의 저해와 관련된 질병을 포함한다. 아폽토시스(계획된 세포 사망)는 면역계의 말초 T 임파구의 결실과 관련된 생리학적 메카니즘이고, 그 조절 이상은 다수의 상이한 발병 과정을 초래할 수 있다. 증가된 세포 생존율 또는 아폽토시스의 저해와 관련된 질병으로는 암, 자가 면역 질환, 비루스 감염, 염증, 이식체에 대한 숙주의 질병, 급성 이식 거부 및 만성 이식 거부 등이 있다. 증가된 아폽토시스와 관련된 질병으로는 AIDS, 신경 퇴행성 질환, 골수 형성 이상 증후군, 허혈성 손상, 독소 유도된 간 질환, 패혈성 쇼크, 악액질 및 식욕부진 등이 있다.

따라서, 본 발명은 또한 TNF군 리간드에 의해 유도된 아폽토시스를 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 DR5가 매개하는 신호 작용을 증가시킬 수 있는 작동 물질의 유효량을 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 투여하는 것을 포함한다. 감소된 아폽토시스가 나타나는 질병을 치료하기 위해서는 DR5가 매개하는 신호작용을 증가시키는 것이 바람직하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 TNF-군 리간드가 유도하는 아폽토시스를 저해하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 DR5가 매개하는 신호작용을 감소시킬 수 있는 길항 물질의 유효량을 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 투여하는 것을 포함한다. 증가된 아폽토시스가 나타나는 질병을 치료하기 위해서는 DR5가 매개하는 신호작용을 감소시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 임의의 후보 "작동 물질" 또는 "길항 물질"이 아폽토시스를 증가 또는 저해하는지 여부는 당해 분야에 알려진 TNF군 리간드/수용체 세포 반응 분석법(아래에서 상세히 설명하는 분석법을 포함)을 사용하여 측정할 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서는, 후보 작동 물질 또는 길항 물질이 TNF-군 리간드에 대한 세포 반응을 증가 또는 저해할 수 있는지 여부를 측정하는 검색 방법을 제공한다. 이 방법은 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 피검 화합물 및 TNF-군 리간드와 접촉시키는 단계, 세포 반응을 분석하는 단계 및 세포 반응을 표준 세포 반응과 비교하는 단계를 포함하는데, 이 때, 표준 반응이란 피검 화합물의 부재하에 리간드를 사용하여 접촉시킬 때 분석하는 것이며, 따라서, 표준 반응에 비해 증가된 세포 반응은 피검 화합물이 리간드/수용체 신호작용 경로의 작동 물질임을 나타내고, 표준 반응에 비해 감소된 세포 반응은 피검 화합물이 리간드/수용체 신호작용 경로의 길항 물질임을 나타낸다. 본 발명에 의하면, DR5 폴리펩티드를 발현하는 세포는 내인성 TNF-군 리간드 또는 외부로부터 투여된 TNF-군 리간드와 접촉시킬 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 DR5의 뉴클레오티드(서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다. 아미노산 1-51(밑줄)은 신호 펩티드(서열번호 2에서 아미노산 잔기 -51 부근에서 -1 부근까지)를 구성하며; 아미노산 52-184는 세포외 도메인(서열번호 2에서 아미노산 잔기 1 부근에서 133 부근까지)을 구성하고; 아미노산 185-208(밑줄)은 경막 도메인(서열번호 2에서 아미노산 잔기 134 부근에서 157 부근까지)을 구성하며; 아미노산 209-411은 세포내 도메인(서열번호 2에서 아미노산 잔기 158 부근에서 360 부근까지)을 구성하는데, 그 중 아미노산 잔기 324-391(이탤릭체)은 사망 도메인(서열번호 2에서 아미노산 잔기 273 부근에서 340 부근까지)을 구성한다.

도 2는 DR5(HLYBX88), 인체 종양 괴사 인자 수용체 1(h TNFR1)(서열번호 3), 인체 Fas 단백질(서열번호 4) 및 사망 도메인 보유 수용체 3(서열번호 5)의 아미노산 서열들 사이의 유사 영역을 도시한 것이다. 클러스털(Clustal) 방법을 사용하여 프로그램의 DNA 스타 수트(Star suite)에 포함된 멕얼라인(Megalign) 프로그램으로 비교하였다.

도 3은 DR5 아미노산 서열의 분석을 도시한 것이다. 알파, 베타, 회전 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양친매성 영역; 가요성 영역; 항원성 지수 및 표면 확률을 도시하였다. "항원성 지수-제임슨 울프" 그래프에서, 도 1에 도시한 아미노산 잔기 62 부근에서 110 부근까지, 119 부근에서 164 부근까지, 224 부근에서 271 부근까지, 275 부근에서 370 부근까지는 DR5 단백질의 항원성이 높은 것으로 나타난 영역에 해당한다. 도 1에서 항원성이 높은 이들 단편은 서열번호 2에서 각각 다음 단편에 해당한다: 아미노산 잔기 11 부근에서 59 부근까지, 68 부근에서 113 부근까지, 173 부근에서 220 부근까지, 224 부근에서 319 부근까지.

도 4는 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열과 관련된 두 개의 cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열(HAPBU13R 및 HSBBU76R)을 도시한 것이다.

도 5a는 MCF7 인간 유방암 세포에서 DR5 유도된 아폽토시스의 과다 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5b는 인간 상피암(Hela) 세포에서 DR5 유도된 아폽토시스의 과다 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5c는 DR5-유도된 아폽토시스가 카스파제 저해제인 CrmA 및 z-VAD-fmk에 의해 차단되었으나, 우성의 음성 FADD는 효과가 없었음을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5d는 DR4와 같이 DR5가 생체내에서 FADD 및 TRADD와 상호작용하지 않았음을 나타내는 면역블롯이다. 도 5e는 새로이 확인된 FLICE 유사 분자의 우성의 음성 분자인 FLICE2(Vincenz, C. 등, J. Biol. Chem. 272:6578 (1997))가 DR5-유도된 아폽토시스를 효율적으로 차단한 반면에, 우성의 음성 FLICE는 그것이 차단되는 조건하에서 단지 부분적인 효과만을 나타냈다는 것을 보여주는 막대 그래프이다. 도 5e는 TNFR-1이 아폽토시스를 효과적으로 차단하였음도 나타낸다.

도 6a는 DR5-Fc(및 DR4 및 TRID)가 TRAIL에 특이적으로 결합되었으나, 관련된 세포 독성의 리간드 TNFα에는 결합하지 않았음을 나타내는 면역블롯이다. 도 6a의 아래 패널은 결합 분석에 존재하는 유입 Fc-융합을 나타낸다. 도 6b는 DR5-Fc가 TRAIL이 아폽토시스를 유도하는 능력을 차단하였음을 나타내는 막대 그래프이다. 도 6b에 나타낸 데이터(평균±SD)는 계수된 총핵수(n=4)중 아폽토시스된 핵의 비율이다. 도 6c는 TNFR1-Fc가 TNFα사멸작용을 완전히 제거한 조건하에 DR5-Fc가 아폽토시스 TNFα-유도된 세포 사망에 아무런 영향을 미치지 않았음을 나타내는 막대 그래프이다.

바람직한 실시 양태에 관한 상세한 설명

본 발명은 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열을 가진 DR5 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 DR5 폴리펩티드는 인간 TNFR-1, DR3 및 Fas(도 2)를 포함하는 TNFR군의 기타 공지된 사망 도메인 보유 수용체와의 서열 상동성을 공유한다. 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열은 매릴랜드주 록빌 파크 론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 1997년 3월 7일자로 기탁되어 수탁번호 제97920을 부여 받은 HLYBX88과 같은 cDNA 클론을 서열 분석하여 얻었다. 기탁된 클론은 pSport 1 플라스미드(매릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스)에 포함되어 있다.

핵산 분자

다른 언급이 없으면, 본원에서 DNA 분자를 서열 분석하여 결정되는 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 시퀀서(예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드의 모델 373)를 사용하여 결정하였으며, 본원에서 결정된 DNA 분자가 암호화하는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정되는 DNA 서열의 해독에 의해 예측하였다. 그러므로, 상기 자동화된 방법으로 결정된 임의의 DNA 서열에 대해서는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 일부 착오를 보유할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 통상 서열 결정된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상, 보다 통상적으로는 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당해 분야에 널리 알려진 수동식 DNA 서열 결정 방법을 포함하는 다른 방법으로 보다 정확히 결정할 수 있다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 실제 서열에 비해 결정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일의 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독에 있어 해독틀의 변경을 야기하여, 결정된 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 예측된 아미노산 서열은 그러한 삽입 또는 결실 지점에서 시작하여 서열 결정된 DNA 분자가 실제로 암호화하는 아미노산 서열과는 완전히 상이할 수 있다.

본원에서 제시하는 정보, 예컨대, 서열번호 1에 제시한 핵산 서열을 사용하면, DR5 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하는 것과 같은 표준 클로닝 및 검색 절차를 사용하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일례인 본 발명의 핵산 분자는 다음 조직의 cDNA 라이브러리에서 확인되었다: 1차 수상 세포, 내피 조직, 비장, 만성 임파구 백혈병 및 인간 흉선 스트로마 세포.

서열번호 1의 DR5 cDNA의 결정된 뉴클레오티드 서열은 약 411개 아미노산 잔기를 가진 단백질을 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는데, 이 해독틀은 개시 코돈이 도 1(서열번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열의 130 내지 132 위치에 존재하며, 51개 아미노산 잔기로 이루어진 리더 서열을 포함한다. TNF 수용체군의 알려진 종중에서, 본 발명의 DR5 폴리펩티드는 다수의 시스테인-풍부 도메인에 비해 상당한 서열 상동성을 포함하여 도 2에 도시한 인체 TNFR1, FAS 및 DR3 폴리펩티드와 고도의 상동성을 나타낸다. DR5가 다른 사망 도메인 보유 수용체에 대해 나타내는 상동성은 DR5가 아폽토시스를 유도하는 능력을 가진 사망 도메인 보유 수용체이기도 함을 강하게 암시하는 것이다. DR5는 또한 TRAIL에 결합하는 것으로도 알려졌다.

나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 DR5 단백질의 성숙한 형태(들)를 제공한다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포가 분비하는 단백질은 성장하는 단백질쇄가 조면 내형질세망을 가로질러 배출되기 시작하면, 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 또는 분비성 리더 서열을 가진다. 대부분의 포유류 세포 및 심지어 곤충 세포는 동일한 특이성을 가지고 분비되는 단백질을 절단한다. 그러나, 일부 경우에, 분비된 단백질의 절단은 완전히 균일하지는 않아서 단백질상에 2개 이상의 성숙한 종을 생성시킨다. 또한, 분비된 단백질의 절단 특이성은 궁극적으로 완전한 단백질의 1차 구조에 의해 결정된다는 것, 즉 그것은 폴리펩티드의 아미노산 서열에 내재한다는 것은 오래전부터 알려져 왔다.

그러므로, 본 발명은 ATCC 수탁번호 제97920호로 확인되고 도 1(서열번호 2)에 도시한 숙주에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. ATCC 수탁번호 제97920호로 확인된 숙주에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 DR5 단백질이란 기탁된 숙주의 벡터에 포함된 클론의 인체 DNA 서열이 암호화하는 완전한 개방형 해독틀을 가진 포유류 세포(예컨대, 후술하는 바와 같은 COS 세포)에서의 발현에 의해 생성된 성숙한 형태(들)의 DR5 단백질을 의미한다. 후술하는 바와 같이, ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 DR5는 컴퓨터 분석에 기초하여 예측된 절단 부위의 정확도에 따라 서열번호 2에 도시한 예측된 "성숙" DR5 단백질(아미노산 1 부근에서 360 부근까지)과는 상이하거나 또는 상이하지 않을 수 있다.

단백질이 분비성 리더 및 이 리더 서열을 위한 절단 지점을 가지는지 여부를 예측하는 방법은 알려져 있다. 예컨대, 멕제오치(McGeoch)(Virus Res. 3:271-286(1985)) 및 폰 헤인지(von Heinje)(Nucleic Acids Res. 14:4683-4690(1986))의 방법을 사용할 수 있다. 이들 각각의 방법에 대해 알려진 포유류 분비성 단백질의 절단 지점을 예측하는 정확도는 폰 헤인지(상기 참조)의 방법의 경우에는 75 내지 80%의 범위이다. 그러나, 이들 두 방법은 반드시 주어진 단백질에 대해 항상 동일한 예측 지점(들)을 산출하지는 않는다.

이 경우에, 본 발명의 완전한 DR5 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램("PSORT")에 의해 분석하였다(참조 문헌: K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics 14:897-911(1992)). PSORT는 아미노산 서열에 기초한 단백질의 세포내 위치를 예측하기 위한 전문 시스템이다. 이러한 컴퓨터에 의한 위치 예측의 일부로서, 멕제오치 및 폰 헤인지의 방법을 도입하였다. PSORT 프로그램에 의한 분석은 도 1의 아미노산 51과 52(서열번호 2의 -1과 1) 사이의 절단 부위를 예측하였다. 그후, 완전한 아미노산 서열은 폰 헤인지의 단순한 형태의 (-1, -3) 규칙을 적용하여 시각적으로 검사하여 추가로 분석하였다(상기 폰 헤인지의 문헌 참조). 따라서, DR5 단백질의 리더 서열은 도 1에 밑줄친 아미노산 잔기 1 부근에서 51 부근까지(서열번호 2에서 -51 부근에서 1 부근까지)로 구성되는 것으로 예측된 반면에, 예측된 성숙한 DR5 단백질은 도 1의 아미노산 잔기 52 부근에서 411 부근까지(서열번호 2에서 1 부근에서 360 부근까지)로 구성된다.

나타낸 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA 형태, 또는 클로닝에 의해 얻거나 또는 합성에 의해 제조한 cDNA 및 게놈 DNA와 같은 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있다. 1본쇄 DNA는 센스 가닥으로도 알려진 암호 가닥이거나, 또는 안티-센스 가닥으로도 지칭되는 비암호 가닥일 수 있다.

"분리된" 핵산 분자(들)는 그 자연 환경으로부터 제거된 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예컨대, 벡터내에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가의 예로는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자가 있다. 분리된 RNA 분자로는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 생체외 RNA 전사체가 있다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자로는 또한 합성법으로 제조한 분자가 있다.

본 발명의 분리된 핵산 분자로는 서열번호 1에 도시한 개방형 해독틀(ORF)을 포함하는 DR5 DNA 분자; 성숙한 DR5 단백질에 대한 암호 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 전술한 것들과 실질적으로 상이하지만 유전 암호의 축퇴성으로 인해 여전히 DR5 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자가 있다. 물론, 유전 암호는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 따라서, 당업자에게는 그러한 축퇴성 변형체를 생성시키는 일은 통상적인 일이다.

또 하나의 측면에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제97920호로 1997년 3월 7일자로 기탁된 플라스미드에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 가진 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 추가 실시 양태로, N-말단 메티오닌이 결핍된 전길이의 DR5 폴리펩티드 또는 성숙 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 상기 기탁된 클론에 포함된 DR5 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 서열중 하나와 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 그러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체와의 동일계 하이브리드화에 의한 유전자 지도 작성용 프로브로서 및 인체 조직에서, 예컨대, 노던 블롯 분석에 의한 DR5 유전자의 발현 검출용 프로브로서 유용하다.

본 발명은 또한 본원에 기재한 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열 또는 이들에 상보적인 가닥을 갖는 분리된 DNA 분자의 단편이란 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 및 훨씬 더 바람직하게는 약 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 DNA 단편을 의미한다. 이들 단편은 본원에서 논의한 진단용 프로브 및 프라이머(이들에 국한되지 않음)를 포함하는 다양한 용도를 가진다. 물론 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열의 대부분(전부는 아니더라도)에 상응하는 단편과 마찬가지로, 길이가 500 내지 1500개 뉴클레오티드인 보다 큰 DNA 단편도 역시 본 발명에 따라 유용하다. 길이가 뉴클레오티드 20개 이상의 단편이란 예컨대, 기탁된 DNA의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열로부터 20개 이상의 인접 염기를 포함하는 단편을 의미한다.

본 발명의 바람직한 핵산 단편으로는 DR5 세포외 도메인(도 1에서 아미노산 잔기 52 부근에서 184 부근까지(서열번호 2에서 1 부근에서 133 부근까지))을 포함하는 폴리펩티드; DR5 경막 도메인(도 1에서 아미노산 잔기 185 부근에서 208 부근까지(서열번호 2에서 134 부근에서 157 부근까지))을 포함하는 폴리펩티드; DR5 세포내 도메인(도 1에서 아미노산 잔기 209 부근에서 411 부근까지(서열번호 2에서 158 부근에서 360 부근까지))을 포함하는 폴리펩티드; 및 DR5 사망 도메인(도 1에서 아미노산 잔기 324 부근에서 391 부근까지(서열번호 2에서 273 부근에서 340 부근까지))을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 상기 도메인들의 위치는 컴퓨터 그래픽으로 예측되었기 때문에, 당업자라면 이들 도메인을 구성하는 아미노산 잔기는 각 도메인을 정의하는 데 사용된 기준에 따라 약간씩(예컨대, 약 1 내지 15개 잔기) 변화될 수 있음을 이해할 것이다.

메티오닌은 자연적으로 절단되고, 그러한 서열은 DR5 발현 벡터를 유전공학적으로 제조하는 데 유용할 수 있기 때문에, 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 아미노 말단 메티오닌(서열번호 1의 뉴클레오티드 130-132)을 암호화하는 뉴클레오티드가 결핍된 전길이의 DR5 폴리펩티드를 암호화한다. 그러한 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 바람직한 핵산 단편은 또한 DR5 단백질의 에피토프 보유부를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 그러한 핵산 단편으로는 도 1에서 62 부근에서 110 부근까지의 아미노산 잔기(서열번호 2에서 11 부근에서 59 부근까지)를 포함하는 폴리펩티드; 도 1에서 119 부근에서 164 부근까지의 아미노산 잔기(서열번호 2에서 68 부근에서 113 부근까지)를 포함하는 폴리펩티드; 도 1에서 224 부근에서 271 부근까지의 아미노산 잔기(서열번호 2에서 173 부근에서 220 부근까지)를 포함하는 폴리펩티드; 및 도 1에서 275 부근에서 370 부근까지의 아미노산 잔기(서열번호 2에서 224 부근에서 319 부근까지)를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본원 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 DR5 단백질의 항원성 영역이라는 것을 측정하였다. DR5 단백질의 기타 그러한 에피토프 보유부를 측정하는 방법은 후술한다.

또한, 본 발명은 다음과 같은 관련된 cDNA 클론으로부터 측정된 서열번호 1의 광범위한 부분과 관련된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다: HAPBU13R(서열번호 6) 및 HSBBU76R(서열번호 7). HAPBU13R 및 HSBBU76R의 뉴클레오티드 서열은 도 4에 도시한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 잔기 284 내지 1,362, 바람직하게는 284 내지 681의 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에 전술한 본 발명의 핵산 분자내 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대, ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 변성되고 전단된 연어 정자 DNA 20 g/㎖를 함유하는 용액중에서 42℃하에 하루밤 동안 항온처리한 다음 약 65℃에서 0.1x SSC에서 필터를 세척하는 조건을 의미한다.

폴리뉴클레오티드의 "부분"에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드란 약 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 바람직하게는 약 20개 이상의 nt, 보다 바람직하게는 약 30개 이상의 nt, 더 바람직하게는 약 30 내지 70개 또는 80 내지 150개 nt 또는 전길이의 기준 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 상기 논급한 바와 같이, 그리고 상세히 후술하는 바와 같이 진단용 프로브 및 프라이머로서 유용하다.

"길이가 20개 이상의 nt"의 폴리뉴클레오티드의 부분이란 예컨대, 기준 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(예컨대, 기탁된 cDNA 또는 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열)로부터 20개 이상 인접한 뉴클레오티드를 의미한다.

물론, 폴리 A 서열(예컨대, 도 1(서열번호 1)에 도시한 DR5 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 부분)에 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적인 연장부에만 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 부분에 하이브리드화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 그 이유는 그러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 연장부를 보유하는 임의의 핵산 분자 또는 이것의 상보체(예컨대, 실제로 임의의 2본쇄 cDNA 클론)에 하이브리드화될 것이기 때문이다.

나타낸 바와 같이, DR5 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자로는 성숙 폴리펩티드를 자체적으로 암호화하는 암호 서열; 성숙 폴리펩티드에 대한 암호 서열 및 추가 서열, 예컨대, 리더 또는 분비성 서열(예컨대, 프리단백질, 프로단백질 또는 프리프로단백질 서열)을 암호화하는 암호 서열; 전술한 추가 암호 서열의 존부와 무관하게 추가의 비암호 서열, 예컨대, 인트론 및 비암호성 5' 및 3' 서열(예컨대, 전사, mRNA 프로세싱(mRNA의 안정성 및 리보좀 결합과 같은 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 포함)에서 역할을 하는 전사되고 비해독되는 서열)을 함께 보유하는 성숙 폴리펩티드의 암호 서열; 추가의 기능을 제공하는 것들과 같은 추가 아미노산을 암호화하는 추가의 암호 서열을 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 예컨대, 폴리펩티드는 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 펩티드와 같은 마커 서열에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시 양태에서, 마커 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대, pQE 벡터(퀴아젠 인코포레이티드)에 제공된 표지인데, 이중 다수는 시판되고 있다. 문헌[Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86:821-824(1989)]에 기재된 바와 같이, 예컨대, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제 수단을 제공한다. "HA" 표지는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응하는 정제에 유용한 또 다른 펩티드인데, 이는 문헌[Wilson 등, Cell 37:767-778(1984)]에 기재되어 있다. 아래에서 논의하는 바와 같이, 기타 그러한 융합 단백질에는 N-말단 또는 C-말단에서 Fc에 융합된 DR5 수용체가 포함된다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자의 변형체에 관한 것인데, 이것은 DR5 수용체의 부분, 유사물 또는 유도체를 암호화한다. 변형체는 자연적 대립인자 변형체와 같이 자연적으로 발생할 수 있다. "대립인자 변형체(allelic variant)"란 유기체의 염색체상에 일정한 위치를 차지하는 유전자의 여러 가지 대체 형태중의 하나를 의미한다(Genes II, Lewis, B. 편집, 존 와일리 앤드 선즈, 뉴욕(1985)). 비자연 발생적 변형체는 당해 분야에 알려진 돌연변이 유발 기법을 사용하여 제조할 수 있다.

그러한 변형체는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가에 의해 제조되는 것들이 있다. 변형체는 암호 영역 또는 비암호 영역 또는 그 둘다에서 변형될 수 있다. 암호 영역에서의 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 일으킬 수 있다. 이중 특히 바람직한 것은 침묵성 치환, 첨가 및 결실인데, 이들은 DR5 수용체 또는 그 부분의 성질 및 활성을 변화시키지는 않는 것들이다. 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 또한 보존적 치환이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖지만, 아미노 말단 메티오닌이 결핍된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 서열번호 2에서 위치 1 부근 내지 360 부근의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (e) ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (f) 서열번호 2에서 위치 1 부근 내지 133 부근의 아미노산 서열을 갖는 DR5 세포외 도메인 또는 ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA가 암호화하는 DR5 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (g) 서열번호 2에서 위치 134 부근 내지 157 부근의 아미노산 서열을 갖는 DR5 경막 도메인 또는 ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA가 암호화하는 DR5 경막 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (h) 서열번호 2에서 위치 158 부근 내지 360 부근의 아미노산 서열을 갖는 DR5 세포내 도메인 또는 ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA가 암호화하는 DR5 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (i) 서열번호 2에서 위치 273 부근 내지 340 부근의 아미노산 서열을 갖는 DR5 사망 도메인 또는 ATCC 수탁번호 제97920호에 포함된 cDNA가 암호화하는 DR5 사망 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (j) 상기 (a) 내지 (i)의 뉴클레오티드 서열중 어느 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 분리된 핵산 분자를 포함한다.

DR5 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열과 예컨대, 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 폴리뉴클레오티드 서열이 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열의 100개 뉴클레오티드마다 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 뉴클레오티드의 5%까지를 결실시키거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환하거나 또는 기준 서열의 총 뉴클레오티드의 5%까지의 다수의 뉴클레오티드를 기준 서열내로 삽입시킬 수 있다. 기준(문제의) 서열은 도 1(서열번호 1)에 도시한 전체 DR5 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재한 임의의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 핵산 분자가 예컨대 서열번호 1에 도시한 뉴클레오티드 서열과 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지 여부는 베스트핏 프로그램(위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8, 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재의 유닉스사의 제네틱스 컴퓨터 그룹)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 베스트핏은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)]의 국부적 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 상동성의 최선의 분절을 찾아낸다. 특정 서열이 예컨대, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 측정하는 베스트핏 또는 임의의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용할 때는, 물론 매개변수를 조정하여 동일성 비율이 전길이의 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 계산될 수 있고, 기준 서열의 뉴클레오티드의 총수의 5%까지의 상동성의 차이가 허용될 수 있다.

구체적 실시 양태에서, 기준(문제의) 서열(본 발명의 서열)과 당해 서열 사이의 동일성은 전체적 서열 정렬이라고도 지칭하는 것으로, 문헌[Brutlag 등, Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정한다. 동일성 비율을 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 배열에 사용된 바람직한 매개변수는 행렬=단위 행렬, k-튜플=4, 부정합 페널티=1, 결합 페널티=30, 무작위화군 길이=0, 커트오프 스코어=1, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 당해 뉴클레오티드 서열의 길이(더 짧은 것은 어느 것이든지)이다. 이 실시 양태에 따르면, 당해 서열이 내부 결실로 인해서가 아니라, 5' 또는 3' 결실로 인해 문제의 서열보다 더 짧다면, FASTDB 프로그램이 동일성 비율을 계산할 때 당해 서열의 5' 및 3' 절두를 설명하지는 못한다는 사실을 고려하여 결과를 수동으로 보정한다. 문제의 서열에 상대적으로 5' 또는 3' 말단에서 절두된 당해 서열의 경우, 동일성 비율은 당해 서열(일치되지 않거나/정렬되지 않은)의 5' 및 3'인 문제의 서열의 염기수를 계산하여 문제 서열의 총 염기의 비율로서 보정한다. 뉴클레오티드가 일치되거나/정렬되는지 여부에 관한 측정은 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 측정한다. 이 비율은 지정된 매개변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성 비율로부터 공제하여 최종 동일성 비율 스코어를 얻는다. 이 보정된 스코어는 상기 실시 양태의 목적을 위해 사용되는 스코어이다. 문제 서열과 일치되지 않거나/정렬되지 않는 FASTDB 정렬법으로 나타나는 당해 서열의 5' 및 3' 염기 외부의 염기만이 동일성 비율 스코어를 수동으로 조정할 목적으로 계산된다. 예컨대, 90개 염기의 당해 서열을 100개 염기의 문제 서열에 정렬시켜 동일성 비율을 측정한다. 결실은 당해 서열의 5' 말단에서 발생하며, 따라서, FASTDB 정렬법은 5' 말단에서 최초 10개 염기의 일치/정렬을 나타내지 않는다. 염기쌍을 이루지 않은 10개의 염기는 서열의 10%(일치되지 않은 5' 및 3' 말단에서의 염기수/문제 서열의 염기의 총수)를 나타내며, 따라서, FASTDB 프로그램으로 계산한 동일성 비율 스코어로부터 10%를 공제한다. 나머지 90개 염기가 완벽하게 일치되면, 최종 동일성 비율은 90%가 된다. 또 다른 예에서는, 90개 염기의 당해 서열을 100개 염기의 문제 서열과 비교한다. 이 때 결실은 내부 결실이어서 문제 서열과 일치되지 않거나/정렬되지 않는 당해 서열의 5' 또는 3'상에는 염기가 없게 된다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산되는 동일성 비율은 수동으로 보정하지 않는다. 다시 말하면, 문제 서열과 일치되지 않거나/정렬되지 않는 당해 서열의 5' 및 3' 염기만이 수동으로 보정된다. 이 실시 양태의 목적상 다른 수동 보정은 이루어지지 않았다.

본 출원은 서열번호 1에 도시한 핵산 서열, 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 그 단편과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것인데, 이 때, 이들 서열은 DR5 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는지 여부와는 관계 없다. 이것은 구체적인 핵산 분자가 DR5 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에도, 당업자라면 여전히 핵산 분자를 예컨대, 하이브리드화용 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 사용하는 방법을 알 것이기 때문이다. DR5 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는 (1) cDNA 라이브러리에서 DR5 유전자 또는 이것의 대립인자 변형체를 분리하는 용도; (2) 문헌[Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, 퍼거몬 프레스, 뉴욕(1998)]에 기재된 바와 같이 중기 염색체에 동일계 하이브리드화(예컨대, "FISH")에 의해 DR5 유전자의 정확한 염색체 위치를 얻는 용도; 및 (3) 특정 조직에서의 DR5 mRNA 발현 검출용의 노던 블롯 분석법을 들 수 있다.

그러나, 서열번호 1에 도시한 핵산 서열, 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 실제로 DR5 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 그 서열들의 단편과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 핵산 분자가 바람직하다. "DR5 활성을 갖는 폴리펩티드"란 구체적인 생물학적 분석법으로 측정하여 본 발명의 DR5 단백질(전길이의 단백질 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 활성과, 반드시 동일하지는 않지만, 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예컨대, DR5 단백질 활성은 문헌에 기재된 바와 같이, 그리고 하기 실시예 5에 제시한 바와 같이 실시한 세포 사망 분석법을 사용하여 측정할 수 있다(A.M. Chinnaiyan 등, Cell 81:505-12(1995); M.P. Boldin 등, J Biol Chem 270:7795-8(1995); F.C. Kischkel 등, EMBO 14:5579-5588(1995); A.M. Chinnaiyan 등, J Biol Chem 271:4961-4965(1996)). MCF7 세포에서는, 전길이의 DR5 또는 피험 사망 도메인 보유 수용체를 암호화하는 플라스미드를 녹색 형광의 단백질을 암호화하는 pLantern 리포터 구성체로 동시 형질감염시킨다. DR5로 형질감염시킨 세포의 핵은 DAPI 염색법에 의해 평가하면 아폽토시스된 형태를 나타낸다. TNFR-1 및 Fas/APO-1(M. Muzio 등, Cell 85:817-827(1996); M.P. Boldin 등, Cell 85:803-815(1996); M.Tewari 등, J Biol Chem 270:3255-60(1995))와 유사하게, DR5-유도된 아폽토시스는 ICE-유사 프로테아제인 CrmA 및 z-VAD-fmk의 저해제에 의해 차단되는 것이 바람직하다.

물론 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 당업자라면 기탁된 cDNA의 핵산 서열, 서열번호 1에 도시한 핵산 서열 또는 이들의 단편들과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 다수의 핵산 분자가 "DR5 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호화하는 것을 즉시 인지할 수 있다. 실제로, 이들 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변형체는 대부분의 경우에는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이것은 전술한 비교 분석을 실시하지 않고도 당업자라면 명확히 알 수 있는 사항인 것이다. 당해 분야에서는, 축퇴성 변형체가 아닌 그러한 핵산 분자의 경우에, 합당한 갯수의 축퇴성 변형체도 DR5 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 것임을 인지할 수 있다. 이것은 당업자라면 단백질 기능에 상당한 영향을 끼치는 경향이 있거나 영향을 끼칠 것 같지 않은 아미노산 치환(예컨대, 하나의 지방족 아미노산을 또 다른 지방족 아미노산으로 대체하는 치환)을 잘 알고 있기 때문이다.

예컨대, 표현형상 침묵성인 아미노산 치환을 일으키는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310(1990)]에 제시되어 있으며, 여기서, 저자는 단백질들이 놀랍게도 아미노산 치환을 인용할 수 있음을 시사하고 있다.

폴리뉴클레오티드 분석

본 발명은 또한 DR5 폴리뉴클레오티드를 상보적 폴리뉴클레오티드의 검출용으로, 예컨대, 진단 시약으로서 사용하는 용도에 관한 것이다. 기능 이상과 관련된 DR5의 돌연변이된 형태를 검출하는 것은 DR5 또는 이것의 가용성 형태의 과소 발현, 과다 발현 또는 변화된 발현으로부터 기인하는 질병, 예컨대, 종양 또는 자가 면역 질병에 대한 민감성 또는 질병의 진단법을 확립하거나 추가할 수 있는 진단 수단을 제공한다.

DR5 유전자에서의 돌연변이를 보유하는 개체는 다양한 기법으로 DNA 레벨로 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예컨대, 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 및 검시 물질로부터 얻을 수 있다. 게놈 DNA를 직접 사용하여 검출하거나 분석전에 PCR을 사용하여 게놈 DNA를 효소적으로 증폭시킬 수 있다(Saiki 등, Nature 324: 163-166(1986)). RNA 또는 cDNA를 동일한 방법으로 사용할 수도 있다. 일례로서, DR5를 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 DR5 발현 및 돌연변이를 확인하고 분석할 수 있다. 예컨대, 결실 및 삽입은 정상 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기의 변화에 의해 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 방사성 표지된 DR5 RNA 또는 방사성 표지된 DR5 안티센스 DNA 서열에 하이브리드화하여 확인할 수 있다. RNase A 처리에 의해 또는 융점 온도차에 의해 완전히 정합된 서열을 부정합된 이중 가닥과 구별할 수 있다.

기준 유전자와 돌연변이를 가진 유전자 사이의 서열의 차이는 직접 DNA 서열 분석법에 의해서도 밝힐 수 있다. 또한, 클로닝된 DNA 분절은 특이 DNA 분절을 검출하기 위한 프로브로서 이용할 수 있다. 이러한 방법의 감도는 PCR 또는 다른 증폭 방법을 적합하게 사용하여 크게 증가시킬 수 있다. 예컨대, 서열 분석용 프라이머를 2본쇄 PCR 생성물 또는 변형된 PCR에 의해 생성된 1본쇄의 주형 분자와 함께 사용한다. 서열 결정은 형광 표지를 사용한 자동 서열 분석 절차에 의해 또는 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 통상의 절차에 의해 실시한다.

DNA 서열 차이에 근거한 유전자 시험은 변성제의 존부와 관계없이 겔내 DNA 단편의 전기영동에서의 이동성의 변화를 검출하여 수행할 수 있다. 소규모의 서열 결실 및 삽입은 고해상도 겔 전기영동에 의해 가시화할 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 변성성 포름아미드 구배 겔상에서 구별할 수 있는데, 이 겔에서 상이한 DNA 단편의 이동성은 그 특이적 융점 또는 부분적 용융 온도에 따라 상이한 위치에서 겔에서 지연된다(예컨대, 문헌[Myers 등, Science 230:1242(1985)] 참조).

특이 위치에서의 서열 변화는 또한 뉴클레아제 보호 분석법, 예컨대, RNase 및 S1 보호법 또는 화학적 절단 방법에 의해 나타낼 수 있다(예컨대, 문헌[Cotton 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 85:4397-4401(1985)] 참조).

따라서, 특이 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접 DNA 결정법 또는 제한 효소의 사용(예컨대, 제한 단편 길이의 다형태성 ("RFLP") 및 게놈 DNA의 서던 블로팅)과 같은 방법들(이들에 국한되는 것은 아님)로 수행할 수 있다.

보다 통상적인 겔 전기영동 및 DNA 서열 결정법 외에도, 돌연변이는 동일계 분석에 의해 검출할 수도 있다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 도입하여 그 폴리펩티드를 발현하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 도입할 수 있다. 그러한 다른 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 도입하거나, 동시에 도입하거나 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 연결하여 도입할 수 있다.

본 발명의 상기 측면에 따르면, 벡터는 예컨대, 플라스미드 벡터, 1본쇄 또는 2본쇄 벡터, 1본쇄 또는 2본쇄 RNA 또는 DNA 비루스 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 DNA 및 RNA를 세포내로 도입하는 널리 알려진 기법으로 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA로서 세포내로 도입할 수 있다. 비루스 벡터는 복제 경쟁적이거나 또는 복제 결함적인 것일 수 있다. 후자의 경우에, 비루스의 전파는 일반적으로 숙주 세포를 보충하는 경우에만 일어날 것이다.

특정 관계에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현용 벡터가 바람직한 벡터이다. 일반적으로, 그러한 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 숙주에서 발현되기에 효과적인 시스-작용성 제어 영역을 포함한다. 적합한 트란스-작용성 인자 역시 숙주에 의해 제공되거나, 보충성 벡터에 의해 또는 숙주내로 도입시에 벡터 자체에 의해 제공된다.

다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 그러한 벡터로는 염색체 유래 벡터, 에피좀 유래 벡터 및 비루스 유래 벡터가 있는데, 예컨대, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피좀, 효모 염색체 요소, 비루스(예컨대, 바쿨로비루스, 파포바 비루스(SV40), 백시니아 비루스, 아데노비루스, 가금 천연두 비루스, 가광견병 비루스 및 레트로비루스)로부터 유래한 벡터, 및 이들의 조합물에서 유래한 벡터, 예컨대, 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소에서 유래한 것들(예컨대, 코스미드 및 파지미드)이 있다. 이들은 모두 본 발명의 상기 측면에 따라 발현시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이와 관련하여 숙주내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 폴리뉴클레오티드를 유지하거나, 전파하거나 또는 발현시키는데 적합한 벡터라면 어느 것이나 발현용으로 사용할 수 있다.

발현 벡터중의 DNA 서열은 적합한 발현 제어 서열(들), 예컨대, mRNA 전사를 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 그러한 프로모터의 대표적인 예로는 파지 람다 PL 프로모터, 이.콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로비루스 LTR 프로모터가 있는데, 이들은 널리 알려진 프로모터중 단지 몇가지를 예로 든 것이다. 일반적으로, 발현 구성체는 전사, 개시 및 종결용 부위를 보유하고, 전사된 영역에서 해독용 리보좀 결합 부위를 보유한다. 그 구성체가 발현시키는 성숙 전사체의 암호부는 개시부의 해독 개시용 AUG 및 해독될 폴리펩티드의 말단에 적합하게 위치하는 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함한다.

또한, 상기 구성체는 발현을 일으킬 뿐만 아니라 조절하기도 하는 제어 영역을 보유할 수 있다. 일반적으로, 그러한 영역은 리프레서 결합 부위 및 인핸서와 같이 전사를 제어함으로써 작용한다.

전파 및 발현용 벡터는 일반적으로 선별 마커를 포함한다. 그러한 마커는 또한 증폭에 적합하거나 또는 벡터는 이 목적으로 추가 마커를 보유할 수 있다. 이와 관련하여 발현 벡터는 하나 이상의 선별용 마커 유전자를 보유하여 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위해 표현 형질을 제공하는 것이 바람직하다. 그러한 마커로는 진핵세포 배양의 경우 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성이 있고, 이.콜리 및 기타 박테리아 배양의 경우 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자가 있으나, 이들에 국한되지 않는다.

본원에 기재하는 적합한 DNA 서열, 뿐만 아니라 적합한 프로모터 및 기타 적합한 제어 서열을 보유하는 벡터는 목적 폴리펩티드의 발현에 적합한 널리 알려진 다양한 기술을 사용하여 적합한 숙주내로 도입할 수 있다. 적합한 숙주의 대표예로는 이.콜리, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리엄 세포와 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포가 있다. 전술한 숙주 세포에 적합한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 알려져 있다.

박테리아에 사용하기에 바람직한 벡터로는 퀴아젠에서 시판되는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진에서 시판되는 pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아에서 시판되는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 있다. 바람직한 진핵세포 벡터로는 스트라타진에서 시판되는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 파마시아에서 시판되는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL가 있다. 이들 벡터는 다수가 시판되고 당업자에게는 널리 알려진 벡터를 단지 예시할 목적으로 나열한 것이다.

숙주 세포에서의 발현용으로 적합한 벡터 및 프로모터의 선별은 널리 알려진 절차이고, 발현 벡터의 제작, 이 벡터의 숙주내로의 도입 및 숙주에서의 발현을 위한 필수 기법은 당업자에게는 통상적인 것들이다.

본 발명은 또한 전술한 구성체를 보유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포이거나, 또는 박테리아와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 균주로는 삽입된 유전자 서열의 발현을 조절하거나, 목적하는 특이적 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 균주를 선택할 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도자의 존재하에 증가할 수 있으며; 따라서, 유전자 조작된 폴리펩티드의 발현을 제어할 수 있다. 또한, 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독후의 프로세싱 및 변형(예컨대, 인산화, 절단)에 대한 특성과 특이적 메카니즘을 가진다. 적합한 세포주를 선택하여 발현되는 외래 단백질의 목적 변형 및 프로세싱을 얻을 수 있다.

구성체를 숙주 세포내로 도입하는 과정은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개의 형질감염, 양이온성 지질-매개의 형질감염, 일렉트로포레이션, 형질도입, 감염 또는 기타 방법으로 수행할 수 있다. 그러한 방법들은 다수의 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대, 문헌[Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology(1986)]에 기재되어 있다.

폴리펩티드는 융합 단백질(펩티드 결합을 통해 이종성 단백질 서열(상이한 단백질의)에 결합된 폴리펩티드를 포함)과 같이 변형된 형태로 발현시킬 수도 있으며, 분비 신호 뿐만 아니라 추가의 이종성 기능 영역을 포함할 수 있다. 그러한 융합 단백질은 적합한 해독틀로 당해 분야에 알려진 방법으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 목적 아미노산 서열을 암호화하는 목적 핵산 서열을 서로 결찰시키고, 당해 분야에 알려진 방법으로 융합 단백질 생성물을 발현시켜 제조할 수 있다. 한편, 그러한 융합 단백질은 단백질 합성 기법, 예컨대, 펩티드 합성기를 사용하여 제조할 수도 있다. 따라서, 예컨대, 추가 아미노산의 영역, 특히 충전된 아미노산은 폴리펩티드의 N-말단에 첨가하여 정제중에 또는 후속 취급 및 보관중에 숙주 세포내에서 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하는 영역을 폴리펩티드에 첨가할 수도 있다. 그러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조전에는 제거할 수 있다. 펩티드부를 폴리펩티드에 첨가하여 분비 또는 배출을 일으키고, 안정성을 향상시키며, 정제를 용이하게 하는 것은 당해 분야에서는 친숙하고 통상적인 기법이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 용해시키는 데 유용한 면역글로불린으로부터 유래한 이종성 영역을 포함하는 것이다. 예컨대, EP-A-0 464 533호(카나다 대응 특허출원 제2045869호)에는 면역글로불린 분자의 불변부의 다양한 부분을 또 다른 인체 단백질 또는 그 부분과 함께 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 다수 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단용으로 매우 유용하며, 따라서, 향상된 약리역학적 성질을 산출한다(EP-A 0232262호). 한편, 일부 용도의 경우, 전술한 유리한 방법으로 융합 단백질을 발현시키고, 검출하고, 정제한 후에, Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직하다. 이것은 Fc 부분이 치료 및 진단에 사용하기에 장애가 되는 것으로 입증되는 경우, 예컨대, 융합 단백질을 면역화용 항원으로 사용하고자 하는 경우에 그러하다. 약제 개발에서, 예컨대, hIL5-수용체와 같은 인체 단백질을 다처리량 검색 분석 목적으로 Fc 부분과 융합하여 hIL-5의 길항 물질을 확인하였다(문헌[D. Bennett 등, Journal of Molecular Recognition, 8:52-58(1995) and K. Johanson 등, The Journal of Biological Chemistry, 270: 9459-9471(1995)] 참조).

DR5 폴리펩티드는 표준 방법으로 재조합 세포 배양으로부터 회수하고 정제할 수 있는데, 표준 방법의 예로는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 정제에는 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 단백질의 리폴딩에 대한 널리 알려진 기법을 이용하면 분리 및/또는 정제중에 폴리펩티드가 변성될 때 활성이 있는 모양을 재생시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 자연에서 정제한 생성물, 화학 합성 절차의 생성물 및 원핵세포 또는 진핵세포 숙주, 예컨대, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 세포 및 포유류 세포로부터 재조합 기법으로 제조한 생성물이 있다. 재조합 제조 절차에 이용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 숙주가 매개하는 과정의 결과로서 일부 경우에는 초기의 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수도 있다.

DR5 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 다양한 용도에, 특히 DR5의 화학적 및 생물학적 성질을 이용하는 용도에 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 그러한 용도의 예로는 종양의 치료, 기생충, 박테리아 및 비루스에 대한 내성 유도, T-세포, 내피 세포 및 특정 조혈 세포의 증식 유도, 재발협착증, 이식체 대 숙주 질병의 치료, 항비루스 반응의 조절 및 작동 물질에 의한 DR5의 자극후의 특정 자가 면역 질병의 예방이 있다. 추가의 용도는 세포, 조직 및 유기체 질병의 진단 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면은 이하에서 논의한다.

DR5 폴리펩티드 및 단편

본 발명은 기탁된 cDNA가 암호화하는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 DR5 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 일부를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 제공한다.

DR5의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 유의 수준의 효과를 끼치지 않고도 변화시킬 수 있다는 것은 당해 분야에서 인지되고 있는 사실이다. 서열에서의 그러한 차이를 고려하면, 활성을 결정하는 것은 단백질상의 중요 영역이라는 것을 상기하여야 한다. 그러한 영역은 통상 리간드 결합 부위 또는 사망 도메인을 구성하거나 또는 이들 도메인에 영향을 끼치는 3차 구조를 형성하는 잔기를 포함한다.

따라서, 본 발명은 또한 상당한 DR5 단백질 활성을 나타내거나 또는 후술하는 단백질 부분과 같이 DR5의 영역을 포함하는 DR5 단백질의 변형 방법을 포함한다. 그러한 돌연변이 유형으로는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 종류 치환이 있다. 상기한 바와 같이, 아미노산 변화가 표현형상 침묵성일 것으로 추측하는 것과 관련한 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, Science 247:1306-1310(1990)]에 기재되어 있다.

따라서, 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기(들) 및 보다 바람직하게는 하나 이상 10개 미만의 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 그러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드가 암호화하는 것이거나 또는 아닐 수도 있는 것, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, (iii) 성숙 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예컨대, 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예컨대, IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비성 서열, 또는 성숙 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제에 이용되는 서열에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 개시 사항으로부터 당업자라면 재현할 수 있는 것들이다.

전하를 띤 아미노산을 전하를 띤 또 다른 아미노산으로 및 중성 또는 음전하를 띤 아미노산으로 치환하는 것이 특별한 관심을 끈다. 후자의 경우 양전하가 감소된 단백질을 생성시켜 DR5 단백질의 특성을 개선시킨다. 응집을 방지하는 것이 매우 바람직하다. 단백질의 응집은 활성의 손실을 초래할 뿐만 아니라, 약학 제제의 제조시에 문제가 될 수 있는데, 그 이유는 이들 단백질은 면역원성을 가질 수 있기 때문이다(Pinckard 등, Clin Exp. Immunol. 2:331-340(1967); Robbins 등, Diabetes 36:838-845(1987); Cleland 등, Crit. Rev. Therapeutics Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)).

아미노산의 대체는 또한 세포 표면 수용체에의 결합 선택도를 변화시킬 수도 있다. 문헌[Ostade 등, Nature 361:266-268(1993)]에는 두 개의 공지된 유형의 TNF 수용체중 하나에만 TNF-알파가 선택적으로 결합하도록 하는 특정 돌연변이에 관해 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 DR5 수용체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 자연적인 돌연변이 또는 인간의 조작에 의한 것으로서 포함할 수 있다.

전술한 변화는 성질을 최소한으로 변화시키는 것이 바람직한데, 예컨대, 단백질의 폴딩 또는 활성에 유의 수준의 영향을 끼치지는 않는 보존적 아미노산 치환이 있다(표 1 참조).

보존적 아미노산 치환

방향족	페닐알라닌 트립토판 티로신
소수성	로이신 이소로이신 발린
극성	글루타민 아스파라긴
염기성	아르기닌 리신 히스티딘
산성	아스파라긴산 글루탐산
소형	알라닌 세린 트레오닌 메티오닌 글리신

기능에 필수적인 본 발명의 DR5 단백질의 아미노산은 당해 분야에 알려진 방법, 예컨대, 부위 지향적 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발법으로 확인할 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)). 후자의 방법은 분자내 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입시킨다. 생성되는 돌연변이 분자를 수용체 결합이나 또는 생체외 또는 생체내 증식 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험하였다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정화, 핵자기 공명 또는 광친화도 표지법과 같은 구조적 분석에 의해 측정할 수도 있다(Smith 등, J. Mol. Biol. 224:899-904(1992) and de Vos 등, Science 255:306-312(1992)).

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로 제공하는 것이 바람직하다. "분리된 폴리펩티드"란 그 자연적 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 재조합 숙주 세포내에서 생성되고/되거나 포함된 폴리펩티드는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. "분리된 폴리펩티드"란 또한 재조합 숙주 세포로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 의미하기도 한다. 예컨대, 재조합에 의해 생성된 DR5 폴리펩티드는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40(1988)]에 기재된 1 단계 방법으로 실질적으로 정제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에는 또한 리더를 포함하는 기탁된 cDNA가 암호화하는 폴리펩티드; 기탁된 cDNA에서 리더를 제외한 서열이 암호화하는 성숙 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질); 서열번호 2의 아미노산 -51 부근 내지 360 부근을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2의 아미노산 -50 부근 내지 360 부근을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2의 아미노산 1 부근 내지 360 부근을 포함하는 폴리펩티드; 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 경막 도메인의 전부 또는 일부가 결실되고 세포외 및 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 사망 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 뿐만 아니라, 전술한 폴리펩티드와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드가 포함되며, 또한 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 가진 상기 폴리펩티드의 부분도 포함된다.

DR5 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예컨대, 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 폴리펩티드 서열이 DR5 폴리펩티드의 기준 아미노산의 100개 아미노산 마다 5개까지의 아미노산 변형을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위하여는, 기준 서열내 아미노산 잔기의 5%까지를 결실시키거나 또는 또 다른 아미노산으로 대체하거나, 또는 기준 서열의 총 아미노산 잔기의 5%까지의 다수의 아미노산을 기준 서열내로 삽입할 수 있다. 기준 서열의 이러한 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치 또는 이들 말단 위치중 어디에서든지(기준 서열내 잔기중에 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접기중에 혼재함) 일어날 수 있다.

실제적인 문제로, 임의의 특정 폴리펩티드가 예컨대, 도 1(서열번호 2)에서 도시한 아미노산 서열, 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열 또는 이들의 단편과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 베스트핏 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지 버젼 8, 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재의 유닉스의 제네틱스 컴퓨터 그룹)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 베스트핏 또는 임의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예컨대, 95% 이상 동일한지 여부를 측정하고자 할 때는, 물론 기준 아미노산 서열의 전길이에 대해 동일성의 비율이 측정되고, 기준 서열의 아미노산 잔기의 총수의 5%까지의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 조정한다.

구체적인 실시 양태에서, 기준(문제의) 서열(본 발명의 서열)과 당해 서열 사이의 동일성(전체 서열 정렬이라고도 함)은 문헌[Brutlag 등, Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)]에 기재된 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정한다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 매개 변수는 다음과 같다: 행렬=PAM 0, k-튜플=2, 부정합 페널티=1, 결합 페널티=20, 무작위화 군 길이=0, 커트오프 스코어=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 피험 아미노산 서열의 길이(보다 짧은 것). 이 실시 양태에 따르면, 당해 서열이 내부 결실 때문이 아니라 N-말단 또는 C-말단 결실로 인해 문제 서열보다 더 짧다면, 총 동일성 비율을 계산할 때 FASTDB 프로그램이 당해 서열의 N-말단 및 C-말단 절두를 설명하지 못한다는 사실을 고려하여, 결과에는 수동 보정이 행해진다. 문제의 서열에 비하여 N-말단 및 C-말단에서 절두된 당해 서열의 경우, 동일성의 비율은 상응하는 당해 잔기와 정합되지 않거나/정렬되지 않는 당해 서열의 N-말단 및 C-말단인 문제 서열의 잔기수를 계산하여 문제 서열의 총염기 비율로서 보정된다. 특정 잔기가 정합되거나/정렬되는 잔기인지 여부의 측정은 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 확인된다. 이러한 비율을, 지정된 매개변수를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산되는 동일성 비율로부터 공제하여, 최종 동일성 비율 스코어를 얻는다. 이러한 최종 동일성 비율 스코어는 상기 실시 양태의 목적상 사용되는 것이다. 문제 서열과 정합되지 않거나/정렬되지 않는 당해 서열의 N-말단 및 C-말단에 대한 잔기만이 동일성 비율 스코어를 수동 조정할 목적으로 고려된다. 즉, 문제의 잔기만이 당해 서열의 가장 먼 거리의 N-말단 및 C-말단 잔기 외부에 위치한다. 예컨대, 90개의 아미노산 잔기의 당해 서열을 100개의 잔기의 문제 서열과 정렬시켜 동일성 비율을 측정한다. 당해 서열의 N-말단에서 결실이 일어나며, 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 최초 10개 잔기의 정합/정렬을 나타내지 못한다. 염기쌍을 이루지 않은 10개 잔기는 서열의 10%(문제 서열의 잔기의 총수당 정합되지 않은 N-말단 및 C-말단에서의 잔기수)를 차지하며, 따라서, 10%는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 비율 스코어로부터 공제된다. 나머지 90개 잔기가 완전히 정합되면, 최종 동일성 비율은 90%가 되는 것이다. 또 다른 실시예에서, 90개 잔기의 당해 서열을 100개 잔기의 문제 서열과 비교한다. 이 경우 결실은 내부 결실이며, 따라서, 문제 서열과 정합되지 않거나/정렬되지 않은 당해 서열의 N-말단 또는 C-말단에서의 잔기는 없는 것이다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산되는 동일성의 비율은 수동으로 보정되지 않는다. 다시 말하면, FASTDB 정렬법에서 나타나는 바와 같이 문제 서열과 정합되지 않거나/정렬되지 않는 당해 서열의 N-말단 및 C-말단 외부의 잔기 위치만이 수동으로 보정되는 것이다. 본 실시 양태의 목적상 다른 수동 보정은 행하지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게는 널리 알려진 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 또는 분자 체 겔 여과 칼럼상에서 분자량 마커로서 사용할 수 있다.

본원 발명자들은 DR5 폴리펩티드가 3개의 주요 구조 도메인을 나타내는 411개 잔기의 단백질이라는 것을 발견하였다. 첫째, 리간드 결합 도메인은 도 1의 잔기 52 부근 내지 184 부근(서열번호 2의 아미노산 잔기 1 부근 내지 133 부근)에서 확인되었다. 둘째, 경막 도메인은 도 1의 잔기 185 부근 내지 208 부근(서열번호 2의 아미노산 잔기 134 부근 내지 157 부근)에서 확인되었다. 셋째, 세포내 도메인은 도 1의 잔기 209 부근 내지 411 부근(서열번호 2의 아미노산 잔기 158 부근 내지 360 부근)에서 확인되었다. 세포내 도메인이 잔기 324 부근 내지 391 부근(서열번호 2의 아미노산 잔기 273 부근 내지 340 부근)에 사망 도메인을 포함한다는 사실이 중요하다. 도 1에 도시한 폴리펩티드의 또 다른 바람직한 단편으로는 잔기 52 내지 411(서열번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 360)의 성숙 단백질, 및 세포외 도메인 및 세포내 도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만 경막 도메인은 없는 가용성 폴리펩티드가 있다.

본 발명은 또한 성숙 단백질, 세포외 도메인, 경막 도메인, 세포내 도메인,사망 도메인 및 이들의 조합으로부터 선택되는 DR5 폴리펩티드 단편 및 리더를 포함하는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 DR5 폴리펩티드를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재하는 폴리펩티드의 에피토프 보유부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"란 전체 단백질이 면역원일 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부로서 정의한다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로 정의한다. 단백질의 면역원성 에피토프의 갯수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 더 적다(문헌[Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 81:3998-4002(1983)] 참조).

항원성 에피토프를 보유하는(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 보유하는) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선별과 관련하여, 단백질의 서열의 일부와 유사한 상대적으로 짧은 합성 펩티드가 통상 부분적으로 유사한 단백질과 반응하는 항혈청을 유도할 수 있다는 것은 당해 분야에 널리 알려진 사실이다(문헌 [Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A., "Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins," Science 219:660-666(1983)] 참조). 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열에 자주 표현되며, 일단의 단순 화학적 규칙으로 특징지워지며, 천연 단백질의 면역 우세 영역에 한정되지도 아미노 또는 카르복실 말단에 한정되지도 않는다.

그러므로, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(단일클론 항체 포함)를 형성하는데 유용하다(문헌[Wilson 등, Cell 37:767-778(1984) at 777] 참조). 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열중에 포함된 아미노산을 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 이상 내지 약 30개 포함한다.

DR5-특이 항체를 생성시키는데 사용할 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비한정적인 예로는 도 1의 아미노산 잔기 62 부근 내지 110 부근(서열번호 2의 11 부근 내지 59 부근)을 포함하는 폴리펩티드; 도 1의 아미노산 잔기 119 부근 내지 164 부근(서열번호 2의 68 부근 내지 113 부근)을 포함하는 폴리펩티드; 도 1의 아미노산 잔기 224 부근 내지 271 부근(서열번호 2의 173 부근 내지 220 부근)을 포함하는 폴리펩티드; 및 도 1의 아미노산 잔기 275 부근 내지 370 부근(서열번호 2의 224 부근 내지 319 부근)을 포함하는 폴리펩티드가 있다. 상기한 바와 같이, 본원 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 DR5 단백질의 항원성 영역이라고 결론지었다.

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 어떠한 통상적인 수단을 사용하여서도 제조할 수 있다(Hougthen, R.A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Syhthesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:5131-5135(1985)). 이러한 "동시 다발적 펩티드 합성(SMPS: Simultaneous Multiple Peptide Synthesis)" 방법은 미국 특허 제4,631,211호 (Hougthen 등, 1986)에 더 상세히 기재되어 있다.

당업자라면 이해할 수 있듯이, 본 발명의 DR5 폴리펩티드 및 전술한 이들의 에피토프 보유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 결합시켜 키메라 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고, 증가된 생체내 반감기를 나타낸다. 이것은 예컨대, 포유류의 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 도메인 및 인간의 CD4-폴리펩티드의 처음 두 도메인으로 구성되는 키메라 단백질의 경우에 나타났다(EPA 제394,827호; Traunecker 등, Nature 331:84-86(1988)). IgG 부분으로 인해 이황화물 결합된 이량체 구조를 갖는 융합 단백질은 또한 단량체성 DR5 단백질 또는 단독 단백질 단편보다 기타 분자에 결합하고 중화시키는데 있어 더 효율적일 수도 있다(Fountoulakis 등, J Biochem 270:3958-3964(1995)).

폴리펩티드 분석

본 발명은 세포 및 조직에서 DR5 단백질 또는 이들의 가용성 형태의 레벨을 검출하기 위한 정량적 및 진단적 분석법(정상 및 비정상 레벨의 측정을 포함)과 같은 진단 분석법에 관한 것이다. 따라서, 예컨대, 정상의 대조군 조직 샘플에 비해 DR5 또는 그 가용성 형태의 과다 발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 진단 분석법을 사용하여 예컨대, 종양의 존재를 검출할 수 있다. 숙주로부터 유래한 시료에서 본 발명의 DR5 단백질과 같은 단백질 또는 그 가용성 형태의 레벨을 측정하는 데 사용할 수 있는 분석 기법은 당업자에게는 널리 알려진 것이다. 그러한 분석 방법으로는 방사성 면역 분석법, 경쟁적 결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 분석법 등이 있다.

생물학적 시료중의 DR5 단백질 레벨의 분석에는 당해 분야에 알려진 방법이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. "생물학적 시료"란 개인, 세포주, 조직 배양 또는 DR5 수용체 단백질 또는 mRNA를 함유하는 기타 공급원으로부터 얻은 임의의 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료중의 DR5 단백질 레벨을 분석하는 데는 항체계 기법이 바람직하다. 예컨대, 조직내에서의 DR5 단백질 발현은 고전적인 면역 조직학적 방법을 사용하여 연구할 수 있다(Jalkanen, M. 등, J. Cell Biol. 101: 976-985(1985); Jalkanen, M. 등, J. Cell Biol. 105: 3087-3096(1987)). DR5 단백질 유전자 발현의 검출에 유용한 기타 항체계 방법으로는 면역 분석법, 예컨대, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 방사성 면역 분석법(RIA)이 있다.

적합한 표지들이 당해 분야에 알려져 있는데, 예컨대, 글루코스 옥시다제와 같은 효소 표지, 요오드(¹²⁵I, ¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 트리튬(³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬(^99mTc)과 같은 방사성 동위원소, 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광성 표지, 및 비오틴 등이 있다.

치료학

종양 괴사 인자(TNF)군 리간드는 대부분의 다형질 발현성 시토킨 중에서도 다수의 세포 반응, 예컨대, 세포 독성, 항비루스 활성, 면역 조절 활성 및 여러 가지 유전자의 전사 조절을 유도하는 것으로 알려져 있다(Goeddel, D.V. 등, "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities," Symp. Quant. Biol. 51:597-609(1986), 콜드 스프링 하버; Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57:505-518(1988); Old, L.J., Sci. Am. 258:59-75(1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285:199-224(1991)). TNF군 리간드는 본 발명의 DR5를 포함하는 TNF-군 수용체에 결합함으로써 그러한 다양한 세포 반응을 유도한다. DR5 폴리펩티드를 발현시키며 DR5 리간드에 대한 강력한 세포 반응을 갖는 것으로 생각되는 세포로는 1차 수상 세포, 내피 조직, 비장, 만성 임파구 백혈병 및 인간 흉선 스트로마 세포 등이 있다. "TNF 군 리간드에 대한 세포 반응"이란 TNF군 리간드에 의해 유도되는 세포, 세포주, 조직, 조직 배양 또는 환자에 대한 임의의 유전자형, 표현형 및/또는 형태학적 변화를 의미한다. 그러한 세포 반응은 TNF군 리간드에 대한 정상의 생리학적 반응 뿐만 아니라, 증가된 아폽토시스 또는 아폽토시스의 저해와 관련된 질병을 포함한다. 아폽토시스(계획적인 세포 사망)는 면역계의 말초 T 임파구의 검출에 관여하는 생리학적 메카니즘이며, 그 기능 이상은 다수의 상이한 병원 과정을 초래할 수 있다(Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213(1994); Krammer, P.H. 등, Curr. Opin. Immunol. 6:279-289(1994)).

증가된 세포 생존율 또는 아폽토시스의 저해와 관련된 질병으로는 암(예컨대, 여포성 임파종, p53 돌연변이를 가진 암 및 호르몬 의존성 종양, 예컨대, 유방암, 전립선암, 카포시 육종 및 난소암); 자가면역 질환(예컨대, 전신 홍반성 루프스 및 면역 관련 사구체신염 및 류머티스성 관절염) 및 비루스 감염(예컨대, 허피스 비루스, 천연두 비루스 및 아데노비루스), 염증; 이식체 대 숙주 질병, 급성 이식 거부 및 만성 이식 거부 등이 있다. 증가된 아폽토시스와 관련된 질병으로는 AIDS; 신경 퇴행성 질환(예컨대, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 변성); 골수 형성 부전증(예컨대, 재생 불량성 빈혈), 허혈성 손상(예컨대, 심근 경색, 발작 및 재관류 손상에 의해 야기되는 것), 독소 유도된 간 질환(예컨대, 알콜에 의해 야기된 것), 패혈증성 쇼크, 악액질 및 식욕부진이 있다.

따라서, 한 가지 측면에서 본 발명은 TNF군 리간드에 의해 유도된 아폽토시스를 증가시키는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 DR5 매개의 신호 작용을 증가시킬 수 있는 DR5 리간드, 유사체 또는 작동 물질의 유효량을 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 투여하는 단계를 포함한다. DR5 매개의 신호 작용은 감소된 아폽토시스 또는 감소된 시토킨 및 접착 분자 발현이 나타나는 질병의 치료시에 증가하는 것이 바람직하다. 작동 물질은 DR5 폴리펩티드에 대해 형성된 DR5 및 단일클론 항체의 가용성 형태를 포함한다.

또 하나의 측면에서, 본 발명은 TNF군 리간드가 유도하는 아폽토시스를 저해하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 DR5 매개의 신호 작용을 감소시킬 수 있는 길항물질의 유효량을 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 투여하는 단계를 포함한다. DR5 매개의 신호 작용은 증가된 아폽토시스 또는 NFkB 발현이 나타나는 질병의 치료시에 감소하는 것이 바람직하다. 길항 물질은 DR5 폴리펩티드에 대해 형성된 DR5 및 단일클론 항체의 가용성 형태를 포함할 수 있다.

"작동 물질(agonist)"이란 아폽토시스를 증가 또는 강화시킬 수 있는 자연 발생적 화합물 및 합성 화합물을 의미한다. "길항 물질(antagonist)"이란 아폽토시스를 저해할 수 있는 자연 발생적 화합물 및 합성 화합물을 의미한다. 본 발명의 임의의 후보 "작동 물질" 또는 "길항 물질"이 아폽토시스를 증가시키는 지 또는 저해하는 지 여부는 당해 분야에 알려진 TNF 군 리간드/수용체 세포 반응 분석, 예컨대, 아래에서 더 상세히 설명하는 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.

그러한 검색 방법중 하나는 본 발명의 수용체를 발현시키기 위해 형질 감염되는 멜라닌 보유세포를 사용하는 방법이다. 그러한 검색 기법은 1992년 2월 6일자로 공개된 PCT WO92/01810호에 기재되어 있다. 그러한 분석법은 예컨대, 본 발명의 수용체 폴리펩티드의 활성화를 저해(또는 증가)시키는 화합물의 검색에 이용할 수 있는데, 검색은 그 수용체를 암호화하는 멜라닌 보유세포를 TNF군 리간드 및 피험 길항 물질(또는 작동 물질)과 접촉시켜 수행한다. 리간드가 생성시키는 신호의 저해 또는 증가는 그 화합물이 리간드/수용체 신호 작용 경로의 길항 물질인지 또는 작동 물질인지를 나타낸다.

다른 검색 기법으로는 수용체 활성화에 의해 야기되는 세포외 pH 변화를 측정하는 계에서 수용체를 발현시키는 세포(예컨대, 형질감염된 CHO 세포)를 사용하는 기법이 있다. 예컨대, 화합물은 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 발현시키는 세포와 접촉시키고, 제2의 메신저 반응(예컨대, 신호 전달 또는 pH 변화)을 측정하여 유력한 화합물이 수용체를 활성화하는지 또는 저해하는지 여부를 알 수 있다.

또 다른 검색 기법으로는 수용체를 암호화하는 RNA를 제노푸스 난모세포내로 도입하여 수용체를 일시적으로 발현시키는 기법이 있다. 그 후, 수용체의 활성화를 저해하는 것으로 생각되는 화합물을 검색하는 경우에는 수용체 난모세포를 수용체 리간드 및 검색할 화합물과 접촉시킨 다음, 칼슘 신호의 저해 또는 활성화를 검출할 수 있다.

또 다른 검색 기법으로는 수용체가 포스포리파제 C 또는 D에 연결되어 있는 구성체를 세포에서 발현시키는 기법이 있다. 그러한 세포로는 내피 세포, 평활근 세포, 배의 신장 세포 등이 있다. 검색은 전술한 바와 같이 포스포리파제 신호로부터 수용체의 활성화의 저해 또는 수용체의 활성화를 검출함으로써 수행할 수 있다.

또 다른 방법은 표지된 리간드가 그 표면에 수용체를 가지는 세포에 결합하는 것을 저해하는지를 측정함으로써 본 발명의 수용체 폴리펩티드의 활성화를 저해하는 화합물(길항 물질)을 검색하는 방법이다. 이러한 방법은 세포가 그 표면상에 수용체를 발현시키도록 수용체를 암호화하는 DNA로 진핵세포를 형질감염시키고, 이 세포를 표지된 형태의 기지의 리간드의 존재하에 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 리간드는 예컨대, 방사 활성으로 표지할 수 있다. 수용체에 결합된 표지된 리간드의 양은 예컨대, 수용체의 방사능을 측정함으로써 측정한다. 화합물이 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 수용체에 결합하는 경우, 표지된 리간드가 수용체에 결합하는 것은 저해된다.

본 발명의 작동 물질 및 길항 물질에 대한 추가의 검색 분석법은 문헌 [Tartaglia, L.A. and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267:4304-4307(1992)]에 기재되어 있다.

따라서, 또 다른 측면에서, 피험 작동 물질 또는 길항 물질이 TNF군 리간드에 대한 세포 반응을 증가 또는 저해할 수 있는 지 여부를 측정하는 검색 방법이 제공된다. 이 방법은 DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 피험 화합물 및 TNF군 리간드와 접촉시키고, 세포 반응을 분석하며, 세포 반응을 표준 세포 반응과 비교하는 단계들을 포함하는데, 여기서, 표준 반응은 피험 화합물의 부재하에 리간드와 접촉시켜 분석하며, 따라서, 표준 반응에 비해 증가된 세포 반응은 피험 화합물이 리간드/수용체 신호 작용 경로의 작동 물질임을 나타내고, 표준 반응에 비해 감소된 세포 반응은 피검 화합물이 리간드/수용체 신호 작용 경로의 길항 물질임을 나타낸다. "세포 반응을 분석한다"는 것은 피험 화합물 및/또는 TNF군 리간드에 대한 세포 반응을 정성적 또는 정량적으로 측정하는 것(예컨대, T 세포 증식 또는 3중수소화된 티미딘 표지화의 증가 또는 감소를 측정 또는 평가하는 것)을 의미한다. 본 발명에 의하면, DR5 폴리펩티드를 발현시키는 세포는 내인성 또는 외부에서 투여된 TNF군 리간드중 하나와 접촉시킬 수 있다.

본 발명에 따른 작동 물질로는 자연 발생적 화합물 및 합성 화합물, 예컨대, TNF군 리간드 펩티드 단편, 형질전환성 성장 인자, 신경 전달 물질(예컨대, 글루타메이트, 도파민, N-메틸-D-아스파르테이트), 종양 억제제(p53), 세포 용해성 T 세포 및 항대사물질 등이 있다. 바람직한 작동 물질로는 화학 요법적 약제, 예컨대, 시스플라틴, 독소루비신, 블레오마이신, 시토신 아라비노사이드, 질소 머스타드, 메토트렉세이트 및 빈크리스틴 등이 있다. 다른 예로는 에탄올 및 아밀로이드 펩티드가 있다(Science 267:1457-1458(1995)). 또 다른 바람직한 작동 물질로는 DR5 폴리펩티드 또는 그 단편에 대해 형성된 다클론 및 단일클론 항체가 있다. TNF군 수용체에 대해 형성된 그러한 작동 물질 항체는 문헌[Tartaglia, L.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 88:9292-9296(1991); Tartaglia, L.A. and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307(1992), PCT 출원 WO94/09137호]에 개시되어 있다.

본 발명에 따른 길항 물질로는 자연 발생적 화합물 및 합성 화합물, 예컨대, CD40 리간드, 중성 아미노산, 아연, 에스트로겐, 안드로겐, 비루스 유전자(예컨대, 아데노비루스 ElB, 바쿨로비루스 p35 및 IAP, 우두 비루스 crmA, 엡스타인-바 비루스 BHRF1, LMP-1, 아프리카 돼지 열병 비루스 LMW5-HL 및 허피스비루스 yl34.5), 칼파인 저해제, 시스테인 프로테아제 저해제 및 종양 촉진제(예컨대, PMA, 펜토바르비탈 및 알파-헥사클로로시클로헥산) 등이 있다.

다른 유력한 길항 물질로는 안티센스 분자들이 있다. 안티센스 기법을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 3중 나선 형성을 통해 유전자 발현을 제어할 수 있다. 안티센스 기법은 예컨대, 문헌[Okano, J. Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 플로리다주 보카 라톤(1988)]에 논의되어 있다. 3중 나선 형성은 예컨대, 문헌[Lee 등, Nucleic Acids Research 6:3073(1979); Cooney 등, Science 241:456(1988); 및 Dervan 등, Science 251:1360(1991)]에 논의되어 있다. 이 방법은 폴리뉴클레오티드가 상보적 DNA 또는 RNA에 결합하는 것을 근거로 하고 있다.

예컨대, 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호부를 사용하여 길이 약 10 내지 40개 염기쌍의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역과 상보적이어서 수용체의 전사 및 생성을 방해하도록 디자인한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드화하고, mRNA 분자의 수용체 폴리펩티드로의 해독을 차단한다.

일 실시 양태에서, 본 발명의 DR5 안티센스 핵산은 외래 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생성된다. 예컨대, 벡터 또는 그 일부는 전사되어 본 발명의 안티센스 핵산(RNA)을 생성시킨다. 그러한 벡터는 DR5 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 포함한다. 그러한 벡터는 전사되어 목적 안티센스 RNA를 생성시킬 수 있는 한, 에피좀 상태로 존재하거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 그러한 벡터는 당해 분야에서는 표준인 재조합 DNA 기법으로 제작할 수 있다. 벡터로는 플라스미드, 비루스 또는 당해 분야에 알려진 다른 것들이 있으며, 척추 동물 세포에서 복제 및 발현에 사용할 수 있다. DR5 또는 그 단편을 암호화하는 서열의 발현은 척추 동물, 바람직하게는 인체 세포에서 작용하는 것으로 당해 분야에 알려진 임의의 프로모터에 의해 수행할 수 있다. 그러한 프로모터로는 SV40 초기 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310(1981), 로우스 육종 비루스의 3'의 긴 말단 반복 서열에 포함된 프로모터(Yamamoto 등, Cell 22:787-797(1980), 허피스 티미딘 프로모터(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)) 등이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 안티센스 핵산은 DR5 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대적인 상보성은 바람직하지만, 필수적인 것은 아니다. 본원에서 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열이란 RNA와 하이브리드화할 수 있는 충분한 상보성을 가지며, 안정한 2중 나선을 형성하는 서열을 의미하며, 2본쇄의 DR5 안티센스 핵산의 경우에, 2중 나선 DNA의 1본쇄를 시험하거나 또는 3중 나선 형성을 분석할 수 있다. 하이브리드화하는 능력은 안티센스 핵산의 상보성의 정도 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로는, 하이브리드화하는 핵산이 클 수록 그것이 보유하고 여전히 안정한 2중 나선(또는 경우에 따라서는 3중 나선)을 형성하는 DR5 RNA와의 염기 부정합이 더 많아진다. 당업자라면 표준 방법을 사용하여 부정합의 허용 가능한 정도를 확인하여 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 유력한 길항 물질로는 또한 촉매성 RNA 또는 리보자임(예컨대, PCT 국제공개 WO90/11364호, 1990, 10, 4 공개; Sarver 등, Science 247:1222-1225(1990) 참조)이 있다. 부위 특이적 인지 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임을 사용하여 DR5 mRNA를 파괴할 수 있는 반면에, 해머 머리형 리보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 해머 머리형 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 인접 영역에 의해 지시되는 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 요건은 표적 mRNA는 두 개 염기로 이루어진 서열 5'-UG-3'을 가져야 한다는 것이다. 해머 머리형 리보자임의 제작 및 생성 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 문헌[Haseloff and Gerlach, Nature 334:585-591(1988)]에 보다 상세히 설명되어 있다. DR5의 뉴클레오티드 서열(도 1)내에는 다수의 유력한 해머 머리형 리보자임 절단 부위가 있다. 절단 인지 부위가 DR5 mRNA의 5' 말단 근처에 위치하여 효율을 증가시키고 비기능성 mRNA 전사체의 세포내 축적을 최소화하도록 리보자임을 유전공학적으로 조작하는 것이 바람직하다. 리보자임을 암호화하는 DNA 구성체는 DNA를 암호화하는 안티센스의 도입을 위해 전술한 것과 동일한 방법으로 세포내로 도입할 수 있다. 안티센스 분자와는 달리 리보자임은 촉매성이기 때문에, 보다 낮은 세포내 농도가 효율을 위해 필요하다.

본 발명에 따른 추가의 길항 물질로는 DR5의 가용성 형태, 즉 전길이의 수용체의 세포외 영역으로부터 리간드 결합 도메인을 포함하는 DR5 단편이 있다. 수용체의 그러한 가용성 형태는 자연 발생적이거나 합성된 것으로서 TNF 군 리간드에의 결합에 있어 세포 표면 DR5와 경쟁함으로써 DR5 매개의 신호 작용을 길항한다. 따라서, 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 가용성 형태는 TNF 군 리간드가 유도하는 아폽토시스를 저해할 수 있는 신규의 시토킨이다. 이들은 단량체로서 발현될 수 있으나, 이량체 또는 삼량체로서 발현되는 것이 바람직한데(예컨대, IgGFc-TNF 수용체군 융합체), 그 이유는 이들이 길항 물질로서 가용성 수용체의 단량체 형태보다 우월한 것으로 나타났기 때문이다. 그러한 기타 시토킨은 당해 분야에 알려져 있으며, 생리적으로 작용하여 Fas 리간드가 유도하는 아폽토시스를 제한하는 Fas B(마우스 Fas 수용체의 가용성 형태)가 있다(Hughes, D.P. and Crispe, I.N., J. Exp. Med. 182:1395-1401(1995)).

본원에 사용된 "항체"(Ab) 또는 "단일클론 항체"(mAb)는 항원에 결합할 수 있는 천연 분자 뿐만 아니라, 그 단편(예컨대, Fab 및 F(ab')₂단편)을 포함하는 개념이다. Fab, Fab' 및 F(ab')₂단편은 천연 항체의 Fc 단편이 부재하고, 순환계로부터 보다 신속히 제거되며, 천연 항체의 보다 적은 비특이적 조직 결합력을 가질 수 있다(Wahl 등, J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)).

본 발명에 따른 항체는 본 발명의 DR5 면역원을 사용하는 다양한 표준 방법중 어느 하나에 의해 제조할 수 있다. 그러한 DR5 면역원으로는 전길이의 DR5 폴리펩티드(리더 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있음) 및 DR5 폴리펩티드 단편, 예컨대, 리간드 결합 도메인, 경막 도메인, 세포내 도메인 및 사망 도메인이 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드 서열의 활성 및 위치 확인과 관련하여 당해 분야에서 알려진 방법, 예컨대, 상기 폴리펩티드의 영상화, 적합한 생리학적 시료에서 그 레벨의 측정 등에 사용할 수 있다. 항체들은 또한 DR5의 작동 물질 및 길항 물질로서 면역 분석법 및 치료학에서 용도를 가지기도 한다.

DR5 도메인에 결합하는 단백질 및 기타 화합물 역시 본 발명에 따른 피험 작동 물질 및 길항 물질이다. 그러한 결합 화합물은 효모의 2-하이브리드 계를 사용하여 "포집(capture)"할 수 있다(Fields and Song, Nature 340:245-246(1989)). 효모의 2-하이브리드 계의 변형계는 문헌[Roger Brent 및 그 공동 연구자, Gyuris, J. 등, Cell 75:791-803(1993); Zervos, A.S. 등, Cell 72:223-232(1993)]에 기재되어 있다. 효모의 2-하이브리드 계를 본 발명에 따라 사용하여 DR5 리간드 결합 도메인 또는 DR5 세포내 도메인중 하나에 결합하는 화합물을 포집하는 것이 바람직하다. 그러한 화합물은 본 발명의 양호한 피험 작동 물질 및 길항 물질이다.

"TNF군 리간드"란 TNF 수용체군의 일종에 결합하고, 리간드/수용체 신호 작용 경로를 유도할 수 있는 자연 발생적 리간드, 재조합 리간드 및 합성 리간드를 의미한다. TNF 리간드 군의 종들로는 DR5 리간드, TRAIL, TNF-α, 림포톡신-α(LT-α, TNF-β로도 알려짐), LT-β(이종이량체 LT-α2-β복합체에서 발견됨), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-lBB, OX40 및 신경 성장 인자(NGF)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. DR5 및 유도체(단편 포함) 및 그 유사체가 TRAIL에 결합하는 능력을 측정하기 위해 실시할 수 있는 분석의 실례는 아래 실시예 6에서 설명한다.

본 발명의 대표적인 치료 용도는 이하에서 보다 상세히 논의한다. AIDS를 정의하는 면역결핍증의 상태는 CD4⁺ T-임파구의 수 및 기능의 감소에 기인한다. 최근의 보고에서는 CD4⁺T 세포의 일일 손실량이 3.5 ×10⁷ 및 2 ×10⁹ 세포인 것으로 평가되었다(Wei X. 등, Nature 373:117-122(1995)). HIV 감염의 환경에서 CD4⁺ T 세포 고갈의 한 가지 원인은 HIV-유도 아폽토시스인 것으로 생각된다. 실제로, HIV-유도 아폽토시스성 세포 사멸은 생체외에서 뿐만 아니라, 보다 중요하게는 감염된 개체에서 증명되었다(Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213(1994); Finkel, T.H. and Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615(1995); Muro-Cacho, C.A. 등, J. Immunol. 154: 5555-5566(1995)). 또한, 아폽토시스 및 CD4⁺ T-임파구 고갈은 AIDS의 상이한 동물 모델에서 밀접한 상관 관계가 있으며(Brunner, T. 등, Nature 373:441-444(1995); Gougeon, M.L. 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563(1993)), 아폽토시스는 비루스 복제가 AIDS를 야기하지 않는 그러한 동물 모델에서는 관찰되지 않는다(Gougeon, M.L. 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563(1993)). 추가의 데이터는 HIV-감염 개체로부터 비감염이지만 초기 면역 자극되거나 또는 활성화된 T 임파구가 TNF군 리간드 FasL과 조우한 후에 아폽토시스를 일으킨다는 것을 나타낸다. HIV 감염후 사망을 초래하는 단핵구 세포주를 사용하여, HIV에 의한 U937 세포의 감염은 FasL의 신규 발현을 야기하고, FasL은 HIV-유도된 아폽토시스를 매개한다는 것을 입증하였다 (Badley, A.D. 등, J. Virol. 70:199-206(1996)). 또한 TNF군 리간드는 감염되지 않은 대식세포에서 검출 가능하였고, 그 발현은 HIV 감염후 상승 조절되어 비감염된 CD4 T-임파구의 선택적인 사멸을 초래하였다(Badley, A.D. 등, J. Virol. 70:199-206(1996)). 따라서, 본 발명에 의하면, HIV⁺개체를 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본 발명의 길항 물질을 투여하여 CD4 T-임파구의 선택적인 사멸을 감소시키는 단계를 포함한다. 투여 방식 및 투여량은 아래서 상세히 논의한다.

동종 이식편의 거부시에, 수용 동물의 면역계는 반응하도록 미리 면역 자극되지 않았는데, 왜냐하면, 면역계는 환경적 항원에 의해서만 초기 자극되기 때문이다. 동일한 종의 다른 동물의 조직은 예컨대, 비루스 및 박테리아가 제공된 것과 동일한 방법으로 제공되지는 않았다. 동종 이식편 거부의 경우, 면역억제성 규제는 면역계가 효과기 단계에 도달하는 것을 방지하도록 의도한다. 그러나, 이종 이식편의 면역 프로필은 동종 이식편 거부 이상으로 질병 재발을 나타낼 수 있다. 질병 재발의 경우에, 면역계는 천연 섬 세포의 파괴에 의해 나타나는 바와 같이, 이미 활성화되었다. 그러므로, 질병 재발의 경우에 면역계는 이미 효과기 단계에 있다. 본 발명의 작동 물질은 동종 이식편 및 이종 이식편에 대한 면역 반응을 억제할 수 있는데, 왜냐하면, 효과기 세포내로 활성화되고 분화된 임파구는 DR5 폴리펩티드를 발현시키고, 따라서 아폽토시스를 증가시키는 화합물에 민감하기 때문이다. 따라서, 본 발명은 면역 특권이 있는 조직을 생성시키는 방법을 추가로 제공한다.

DR5 길항 물질은 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 패혈증 및 장염 질환과 같은 염증성 질병의 치료에 유용할 수 있다.

또한, DR5의 임파아세포 발현으로 인해, 가용성 DR5 작동 물질 또는 길항 물질 mAB를 사용하여 이런 유형의 암을 치료할 수 있다. 또한, 가용성 DR5 또는 중화성 mAB를 사용하여 다양한 만성 및 급성형의 염증, 예컨대, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 패혈증 및 장염 질환을 치료할 수 있다.

투여 방식

본원에 기재하는 작동 물질 또는 길항 물질은 본 발명의 수용체를 발현시키는 세포에 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 투여할 수 있다. 작동 물질 또는 길항 물질의 "유효량"의 투여란 TNF군 리간드에 대한 세포 반응을 증가 또는 저해하기에 충분한 화합물, 예컨대, 폴리펩티드의 양을 의미한다. 구체적으로, 작동 물질 또는 길항 물질의 "유효량"의 투여란 DR5 매개의 아폽토시스를 증가 또는 저해시키기에 효과적인 양을 의미한다. 물론, 아폽토시스를 증가시키고자 하는 경우에, 본 발명에 따른 작동 물질은 TNF군 리간드와 함께 투여할 수 있다. 당업자는 유효량의 작동 물질 또는 길항 물질을 경험적으로 결정할 수 있고, 순수한 형태로 또는 약학적 허용 가능한 염, 에스테르 또는 프로드러그 형태로 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 작동 물질 또는 길항 물질은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(즉, 담체)와 함께 조성물에 투여할 수 있다.

인간 환자에게 투여하는 경우에, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 용량은 건전한 의학적 판단의 범위내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 수 있다. 특정 환자에 대한 치료학적으로 유효한 용량 레벨은 의학 분야에 널리 알려진 인자에 따라 달라진다.

일반적인 명제로서, 1회 투여당 비경구적으로 투여되는 DR5 폴리펩티드의 약학적으로 유효한 총량은 전술한 바와 같이 그것은 치료적 재량에 따라 달라질 것이지만, 환자의 체중 1 ㎏당 하루에 1 ㎍ 내지 10 ㎎의 범위를 가질 것이다. 이 용량은 0.01 ㎎/㎏/일 이상이 보다 바람직하며, 인간의 경우 이 호르몬의 용량은 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏/일이 가장 바람직하다. 연속적으로 제공하는 경우, DR5 작동 물질 또는 길항 물질은 통상 미니-펌프를 사용하여 하루에 1 내지 4회 주사에 의해 약 1 ㎍/㎏/시간 내지 약 50 ㎍/㎏/시간의 투여 속도로 투여한다. 정맥낭 용액을 이용할 수도 있다.

투여량은 환자 특이적인 방식으로 조절하여 RIA 기법에 의해 측정할 때 혈액내 작동 물질 또는 길항 물질의 소정의 농도를 제공할 수도 있다. 따라서, 환자의 투여량을 조정하여 RIA에 의한 측정시에 규칙적인 진행성 구의 혈액 레벨을 50 내지 1000 ng/㎖, 바람직하게는 150 내지 500 ng/㎖의 크기로 얻을 수 있다.

작동 물질 또는 길항 물질(본 발명의 DR5 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하고, 경구적으로, 직장내로, 비경구적으로, 조내로, 질내로, 복강내로, 국소적으로(분말, 연고, 적제 또는 경피용 패치), 구강내로, 또는 경구용 또는 비강용 스프레이로 투여할 수 있는 약학 조성물이 제공된다. 작동 물질 및 TNF군 리간드를 동시 투여함으로써, 리간드와 작동 물질의 보다 낮은 투여량을 사용하여 임상적 부작용을 감소시킬 수 있다는 것이 중요하다. 작동 물질은 특정 치료 용도의 긴급성에 따라 TNF군 리간드 투여전, 투여후 또는 동시에 "함께 투여"할 수 있음을 이해할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 비독성의 고형, 반고형 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 모든 유형의 제제 보조제를 의미한다. 구체적 실시 양태에서, "약학적으로 허용 가능하다"는 것은 미국의 약전 또는 동물 및 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위한 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되거나 연방정부 또는 주정부의 관리 기관에 의해 승인된 것을 의미한다. 이러한 양태에 따른 적합한 약학적 담체의 비한정적 예는 E.W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 제시되어 있으며, 예컨대, 물 및 오일과 같은 멸균액으로서, 석유, 동물, 야채 또는 합성에 의해 얻은 것들이 있으며, 그 예로는 땅콩유, 두유, 광유, 참깨유 등이 있다. 약학 조성물을 정맥내 투여할 경우에는 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액체 담체, 특히 주사 용액으로 이용할 수 있다.

본원에서 "비경구적"이란 용어는 정맥내, 근내, 복막내, 흉골내, 피하 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식에 관한 것이다.

비경구 주사용의 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 유탁액 뿐만 아니라, 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액내로 재구성되는 멸균 분말을 함유할 수 있다.

가용성 DR5 폴리펩티드 외에도, 경막 영역을 보유하는 DR5 폴리펩티드는 CHAPS 또는 NP-40과 같은 세제를 완충제와 함께 포함함으로써 적합하게 용해되는 경우에 사용할 수도 있다.

염색체 분석

본 발명의 핵산 분자는 또한 염색체 확인에 유용하기도 하다. 서열은 개인의 염색체상의 특정 위치를 특이적으로 지향하여 그와 하이브리드화할 수 있다. 본 발명에 따라 염색체상에 DNA의 지도를 작성하는 것은 이들 서열을 질병과 관련된 유전자와 상호 관련시키는 중요한 제1단계이다.

이와 관련하여 특정의 바람직한 실시 양태에서, 본원에 개시한 cDNA 및/또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 DR5 유전자의 게놈 DNA를 클로닝한다. 이것은 일반적으로 시판되는 라이브러리 및 널리 알려진 다양한 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 게놈 DNA는 이러한 목적으로 널리 알려진 기법을 사용하여 동일계 염색체 지도 작성에 사용한다.

또한, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25 bp)를 준비하여 서열을 염색체에 지도화할 수 있다. 유전자의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA중 하나 이상의 엑손에는 미치지 않아서 증폭 과정을 복잡하게 하는 프라이머를 신속히 선택한다. 이들 프라이머는 개인의 염색체를 보유하는 체세포 하이브리드의 PCR 검색에 사용한다.

cDNA클론을 중기 염색체에 형광 동일계 하이브리드화("FISH")를 사용하여 정확한 염색체 위치를 1 단계로 제공할 수 있다. 이 기법은 50 또는 60 bp만큼 짧은 cDNA와 함께 사용할 수 있다. 이 기법에 대해서는 문헌[Verma 등, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, 퍼거몬 프레스, 뉴욕(1988)]에 검토되어 있다.

일단 정확한 염색체 위치에 서열을 지도화하면, 염색체상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이타와 상호 관련시킬 수 있다. 그러한 데이타는 예컨대, 존스 홉킨스 대학교의 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온라인으로 이용 가능한 것으로, 예컨대, 논문[V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man]에서 확인된다. 동일한 염색체 영역에 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계는 연관 분석(물리적으로 인접한 유전자의 동시 유전)을 통해 확인된다.

다음으로, 감염 개체와 비감염 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 결정할 필요가 있다. 돌연변이가 임의의 정상 개체에서가 아니라, 감염된 개체의 일부 또는 전부에서 관찰되는 경우, 돌연변이는 질병의 원인제일 가능성이 크다.

지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본 발명의 범위를 제한할 의도 없이 단지 예시용으로 제시하는 하기 실시예를 참조하면 본 발명은 보다 용이하게 이해될 것이다.

실시예 1

이. 콜리에서의 발현 및 정제

기탁된 cDNA 클론(ATCC No. 97920)에서 성숙 DR5 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 DR5 단백질의 아미노 말단 서열에 및 유전자의 3' 벡터 서열에 특이적인 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 클로닝을 촉진하기 위해 제한 부위를 보유하는 추가의 뉴클레오티드를 각각 5' 및 3' 서열에 추가하였다.

이. 콜리에서 DR5 세포외 도메인의 발현에는 하기 프라이머를 사용한다: 5' 프라이머는 서열 5'-CGCCCATGGAGTCTGCTCTGATCAC-3'(서열번호 8)을 가지며, 밑줄친 NcoI 부위를 가지며; 3' 프라이머는 서열 5'-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3'(서열번호 9)을 가지며, 밑줄친 HindIII 부위를 보유한다.

제한 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE60에서 제한 효소 부위에 편리한 것으로, 본 실시예에서 박테리아 발현용으로 사용된다(퀴아젠 인코포레이티드, 캘리포니아주 91311 채츠워스 이턴 애비뉴 9259). pQE60은 암피실린 항생물질 내성("Amp^r")을 암호화하며, 박테리아의 복제 기점("ori"), IPTG 유도성 프로모터 및 리보좀 결합 부위("RBS")를 보유한다.

증폭된 DR5 DNA 및 벡터 pQE60은 둘다 NcoI 및 HindIII로 효소 처리하고, 처리된 DNA는 함께 결찰시켰다. DR5 단백질 DNA를 제한된 pQE60 벡터내로 삽입하여 DR5 단백질 암호 영역을 벡터의 IPTG-유도성 프로모터에 작동 가능하게 하류에 연결시키고, DR5 단백질의 해독을 위해 적절하게 위치한 개시용 AUG와의 해독틀로 위치시켰다.

결찰 혼합물은 표준 절차를 사용하여 경쟁적 이. 콜리 세포내로 형질전환시킨다. 그러한 절차는 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2판; 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1989)]에 기재되어 있다. lac 리프레서를 발현시키고 카나마이신 내성("Kan^r")을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다수 사본을 보유하는 이. 콜리 균주 M15/rep4를 본원에 기재한 예시용 실시예를 수행하는 데 사용하였다. 이 균주는 DR5 단백질을 발현시키는 데 적합한 다수 균주중 하나로서 상기 퀴아젠사에서 시판된다.

형질전환체는 암피실린 및 카나마이신의 존재하에 LB 평판상에서 그들이 성장하는 능력에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA는 내성 콜로니로부터 분리하고, 클로닝된 DNA의 동일성은 제한 분석, PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.

목적 구성체를 보유하는 클론을 암피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)으로 보충된 LB 배지의 액체 배양물내에서 하루밤("O/N") 동안 증식시켰다. O/N 배양물을 사용하여 대형 배양물을 약 1:100 내지 1:250의 희석률로 접종하였다. 세포들을 600 ㎚에서의 광학 밀도("OD600")가 0.4 내지 0.6이 되도록 증식시켰다. 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드("IPTG")를 첨가하여 최종 농도를 1 mM로 만들고, lacI 리프레서를 불활성화함으로써 lac 리프레서로부터 전사를 유도하였다. 이어서 세포들을 추가로 3 내지 4 시간 동안 항온배양하였다.

세포들을 원심분리에 의해 수집하고 표준 방법으로 파괴하였다. 봉입체는 통상의 수집 기법을 사용하여 파괴된 세포로부터 정제하고, 단백질을 봉입체로부터 8M 우레아내로 용해시켰다. 용해된 단백질을 함유하는 8M 우레아 용액을 2X 인산염 완충 염수("PBS")내 PD-10 칼럼 위로 통과시켜 우레아를 제거하고, 완충액을 교환하고 단백질을 리폴딩시켰다. 단백질을 크로마토그래피의 추가 단계에 의해 정제하여 내독소를 정제하였다. 그 후, 그것을 멸균 여과하였다. 멸균 여과된 단백질 제제는 2X PBS 중에서 농도 95 μ/㎖로 보관하였다.

실시예 2

포유류 세포에서의 발현

통상의 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사의 개시를 매개하는 프로모터 요소, 단백질 암호 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 보유한다. 추가의 요소로는 인핸서, 코작 서열 및 RNA 스플라이싱용 공여 및 수용 부위가 인접한 간섭 서열이 있다. 고효율의 전사는 SV40의 초기 및 후기 프로모터, 레트로비루스의 긴 말단 반복 서열(LTR), 예컨대, RSV, HTLVI, HIVI 및 사이토메갈로비루스(CMV)의 초기 프로모터를 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 세포성 신호를 사용할 수도 있다(예컨대, 인간 액틴 프로모터). 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 발현 벡터로는 예컨대, pSVL 및 pMSG(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC37146) 및 pBC12MI(ATCC67109)와 같은 벡터가 있다. 사용할 수 있는 포유류 숙주 세포로는 인간 Hela 293, H9 및 저캣(Jurkat) 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV1, 메추라기의 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포가 있다.

한편, 당해 유전자는 염색체내로 통합되는 유전자를 보유하는 안정한 세포주에서 발현시킬 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신과 같은 선별용 마커와 동시에 형질감염시키면 형질감염된 세포의 확인 및 분리가 가능하다.

형질감염된 유전자를 증폭시켜 다량의 암호화된 단백질을 발현시킬 수도 있다. 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 마커는 수백개 또는 심지어 수천개의 당해 유전자 사본을 보유하는 세포주를 발육시키는데 유용하다. 또 다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 신타제(GS)이다(Murphy 등, Biochem. J. 227;277-279(1991); Bebbington 등, Bio/Technology 10:169-175(1992)). 이들 마커를 사용하여 포유류 세포를 선택 배지에서 증식시키고, 최고의 내성을 가진 세포를 선별하였다. 이들 세포주는 염색체내로 증폭된 유전자(들)를 보유한다. 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포는 종종 단백질의 생산에 사용한다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 비루스(Cullen 등, Molecular and Cellular Biology 5:438-447(March 1985))의 강력 프로모터(LTR)와 CMV-인핸서의 단편(Boshart 등, Cell 41:521-530(1985))를 보유한다. 다중 클로닝 부위, 예컨대 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 가진 부위는 당해 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 또한 쥐의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 신호 및 종결 신호를 보유한다.

CHO 세포에서의 클로닝 및 발현

벡터 pC4를 DR5 폴리펩티드의 발현에 사용하였다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr의 유도체(ATCC 수탁번호 제37146호)이다. 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 제어하에 마우스 DHFR 유전자를 보유한다. 이들 플라스미드로 형질감염된 디히드로폴레이트 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포 또는 기타 세포를, 화학요법제인 메토트렉세이트(MTX)로 보충된 선별 배지(알파 마이너스 MEM, 라이프 테크놀로지)에서 세포를 증식시켜 선별할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성이 있는 세포에서 DHFR 유전자의 증폭에 관해서는 문헌에 널리 보고되어 있다(Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., and Schmke, R.T., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370(1978); Hamlin, J.L. and Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143(1990); Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68(1991)). MTX의 농도를 증가시키면서 증식시킨 세포는 DHFR 유전자의 증폭의 결과로서 표적 효소 DHFR을 대량 생산함으로써 약제에 대한 내성을 발현한다. 제2의 유전자를 DHFR 유전자에 연결시키면, 그것은 통상 동시 증폭되고 과다 발현된다. 이 방법을 사용하여 증폭된 유전자(들)의 1,000개 사본수 이상을 보유하는 세포주를 성장시킬 수 있다는 것은 당해 분야에 알려진 사실이다. 이어서, 메토트렉세이트를 배출시키면, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체(들)내로 증폭된 유전자를 보유하는 세포주를 얻는다.

플라스미드 pC4는 당해 유전자를 발현시키기 위해 라우스 육종 비루스 (Cullen 등, Molecular and Cellular Biology 5:438-447(March 1985))의 강력 프로모터(LTR)와 인간의 시토메갈로비루스(CMV)의 직초기 유전자의 인핸서로부터 분리한 단편(Boshart 등, Cell 41:521-530(1985))의 강력 프로모터(LTR)를 보유한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 통합을 허용하는 단일의 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718이 있다. 플라스미드는 이들 클로닝 부위뒤에 쥐의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 보유한다. 다른 고효율 프로모터를 발현에 사용할 수도 있는데, 예컨대, 인간 β-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 기타 레트로비루스(예컨대, HIV 및 HTLVI)로부터 유래한 긴 말단 반복 서열이 있다. 클론테크의 Tet-오프 및 Tet-온 유전자 발현계 및 유사계를 사용하여 포유류 세포에서 조절되는 방식으로 DR5 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다(Gossen, M., & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89:5547-5551 (1992)). mRNA의 폴리아데닐화의 경우, 기타 신호, 예컨대, 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자를 사용할 수도 있다.

염색체내로 통합되는 당해 유전자를 보유하는 안정한 세포주 역시 gpt, G418 또는 하이그로마이신과 같은 선별용 마커로 동시 형질감염시켜 선별할 수 있다. 처음에 하나 이상의 선별용 마커, 예컨대, G418과 메토트렉세이트를 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pC4는 제한효소 BamHI로 처리한 다음, 당해 분야에 알려진 절차에 의해 송아지 장 포스페이트를 사용하여 탈인산화시킨다. 그 다음, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.

완전한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 유전자의 목적부의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 밑줄친 BamHI 부위, 코작 서열 및 AUG 개시 코돈을 보유하는 5' 프라이머 서열은 다음과 같다: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3'(서열번호 10).

밑줄친 Asp718 부위를 보유하는 3' 프라이머의 서열은 다음과 같다:

5'-CGCGGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3'(서열번호 11).

증폭된 단편은 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 효소 처리한 다음, 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제하였다. 분리된 단편 및 탈인산화된 벡터는 T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 이.콜리 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전환시키고, 예컨대, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4내로 삽입된 단편을 보유하는 박테리아를 동정하였다.

활성 DHFR 유전자가 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 발현 플라스미드 pC4 5 ㎍을 리포펙틴 방법을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5 ㎍으로 동시 형질감염시켰다(Felgner 등의 상기 문헌 참조). 플라스미드 pSV2-neo는, 우세한 선별 마커로, G418을 포함하는 항생제 군에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5에서 유래한 neo 유전자를 보유한다. G418 1 ㎎/㎖으로 보충한 알파 마이너스 MEM에 세포들을 파종하였다. 2일후에, 트립신 처리하고, 메토트렉세이트 10, 25 또는 50 ng/㎖와 G418 1 ㎎/㎖로 보충한 알파 마이너스 MEM중에서 하이브리도마 클로닝 평판(독일 그라이너)에 상기 세포들을 파종하였다. 약 10일 내지 14일후에, 단일 클론을 트립신 처리한 다음, 메토트렉세이트를 상이한 농도(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)로 사용하여 6-웰 페트리 접시 또는 10 ㎖ 플라스크에 파종하였다. 그 후, 메토트렉세이트의 최고 농도에서 증식하는 클론을 훨씬 더 높은 농도(1 μM, 2 μM, 5 μM , 10 mM, 20 mM)의 메토트렉세이트를 함유하는 새로운 6-웰 평판으로 옮겼다. 농도 100 μM 내지 200 μM에서 증식하는 클론을 얻을 때까지 동일한 절차를 반복하였다. 목적 유전자 생성물의 발현은 예컨대, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 또는 역상 HPLC 분석법으로 분석하였다.

COS 세포에서의 클로닝 및 발현

DR5 단백질의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 발현 벡터 pcDNAI/Amp 또는 pcDNAIII(인비트로겐 인코포레이티드에서 입수할 수 있음)내로 클로닝함으로써 발현 플라스미드 pDR5-HA를 제조하였다. 발현 벡터 pcDNAI/amp는 (1) 이.콜리 및 기타 원핵 세포에서 전파하기에 효과적인 이.콜리 복제기점; (2) 플라스미드-보유 원핵세포의 선별용 암피실린 내성 유전자; (3) 진핵 세포에서의 전파를 위한 SV40 복제기점; (4) cDNA가 CMV 프로모터의 발현 제어하에 통상적으로 배치되고, 폴리링커내 제한 부위에 의해 SV40 인트론 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결되도록 배열된 CMV 프로모터, 폴리링커, SV40 및 폴리아데닐화 신호를 보유한다. DR5 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 DNA 단편과 그 3' 말단에 해독틀내에 융합된 HA 표지를 벡터의 폴리링커 영역내로 클로닝하여 재조합 단백질 발현이 CMV 프로모터에 의해 유도되도록 하였다. HA 표지는 문헌[Wilson 등, Cell 37:767(1984)]에 기재된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응한다. HA 표지를 표적 단백질에 융합시키면, HA 에피토프를 인지하는 항체를 사용하여 재조합 단백질을 용이하게 검출 및 회수할 수 있다.

플라스미드 제작 과정은 다음과 같다. 기탁된 클론의 DR5 cDNA는 이.콜리에서 DR5의 발현용 벡터의 제작에 대해 전술한 바와 같이 통상의 제한 부위를 보유하는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 발현된 DR5의 검출, 정제 및 특성 분석을 용이하게 하기 위해, 프라이머중 하나는 전술한 바와 같이 헤마글루티닌 표지("HA 표지")를 보유한다.

적합한 프라이머로는 본 실시예에 사용된 다음과 같은 것이 있다. 밑줄친 BamHI 부위를 보유하는 5' 프라이머의 서열은 다음과 같다:

5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3'(서열번호 10).

밑줄친 Asp718 제한 서열을 보유하는 3' 프라이머의 서열은 다음과 같다:

5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3'(서열번호 12).

PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNAI/Amp는 BamHI 및 Asp718로 효소 처리하고, 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 이.콜리 균주 SURE(캘리포니아주 라 졸라 노스 토리 파인즈 로드 11099 소재의 스트라타진 클로닝 시스템스에서 시판됨)내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물은 앰피실린 배지 평판상에 도말한 다음, 항온 배양하여 앰피실린 내성 콜로니를 증식시켰다. 플라스미드 DNA는 내성 콜로니로부터 분리하고, 제한 분석에 의해 또는 DR5 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 단편의 존재에 대한 기타 수단에 의해 검사한다.

재조합 DR5의 발현을 위해, COS 세포는 DEAE-DEXTRAN을 사용하여 예컨대, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 콜드 스프링 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1989)]에 기재된 바와 같이 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 그 벡터에 의한 DR5의 발현을 위한 조건하에 세포들을 항온 배양하였다.

DR5-HA 융합 단백질의 발현은 문헌[Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, 2판; 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1988)]에 기재된 방법을 사용하여 면역 표지법 및 면역 침전법으로 검출하였다. 이 목적으로, 형질감염 2일후, 세포들은 ³⁵S-시스테인 함유 배지에서 8 시간 동안 항온 배양하여 표지하였다. 세포 및 배지를 수집하고, 세포를 세척하고, 세제-함유 RIPA 완충액(상기 인용한 Wilson 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5)으로 용해시켰다. HA-특이 단일 클론 항체를 사용하여 세포 용해물 및 배양 배지로부터 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질은 SDS-PAGE 및 자동 방사선 사진법으로 분석하였다. 예상된 크기의 발현 생성물이 세포 용해물에 나타났지만 음성 대조군에서는 나타나지 않았다.

본 실시예에서 발현에 사용된 프라이머 세트는 본 실시예에서 CHO 발현에 사용된 pC4, 본 실시예에서 COS 발현에 사용된 pcDNAI/Amp 및 다음 실시예에서 바쿨로비루스 발현에 사용된 pA2와 상용성이 있었다. 따라서, 예컨대, CHO 발현을 위해 증폭된 완전 DR5 암호 단편을 COS 발현용 pcDNAI/Amp 또는 바쿨로비루스 발현용 pA2내로 결찰시킬 수도 있다.

실시예 3

바쿨로비루스 발현계에서 DR5의 가용성 세포외 도메인의 클로닝 및 발현

본 실시예에서는, 플라스미드 셔틀 벡터 pA2를 사용하고, 문헌[Summers 등, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, 텍사스 농업 실험국 고시번호 1555(1987)]에 기재된 것과 같은 표준 방법을 사용하여, 완전 단백질을 암호화하는 클로닝된 DNA(그 자연적으로 연합된 신호 서열을 포함)를 바쿨로비루스내로 삽입하여 DR5 단백질을 발현시켰다. 이 발현 벡터는 오토그래프 캘리포니카 핵 다면증 비루스(ACMNPV: Autograph californica nuclear polyhedrosis virus)의 강력 폴리헤드론 프로모터와 그에 이어 통상의 제한 부위를 보유한다. 재조합 비루스의 용이한 선별을 위해, 플라스미드는 동일한 배향으로 드로소필라의 약한 프로모터와 그에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호의 제어하에 있는 이.콜리에서 유래한 베타-갈락토시다제 유전자를 보유한다. 삽입된 유전자는 야생형 비루스 DNA와 세포 매개의 상동 재조합을 위한 비루스 서열에 의해 양쪽에 인접되어 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 생비루스를 생성시킨다. 당업자라면, 벡터 구성체가 전사, 해독, 분비 등에 대해 적합하게 위치하는 신호, 예컨대, 필요에 따라 해독틀내 AUG 및 신호 펩티드를 제공한다는 것을 쉽게 이해할 것이기 때문에, 다수의 기타 바쿨로비루스 벡터를 pA2 대신에, 예컨대, pAc373, pVL941 및 pAcIM1을 사용할 수 있다. 그러한 벡터는 예컨대, 문헌[Luckow 등, Virology 170:31-39(1989)]에 기재되어 있다.

기탁된 클론(ATCC No. 97920)에서 DR5 단백질의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA 서열은 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

DR5에 대한 5' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한효소 부위를 보유하는 서열 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3'(서열번호 10)을 가진다. 후술하는 바와 같이, 발현 벡터내로 삽입되면, DR5를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 말단은 효과적인 절단 신호 펩티드를 제공한다. 문헌[Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기재된 바와 같이 진핵 세포에서의 해독 개시에 효율적인 신호를 구성체의 벡터부에 적합하게 위치시켰다.

DR5에 대한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한효소 부위와, 그에 이어 도 1의 DR5 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드와, 그에 이은 정지 코돈을 보유하는 서열 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3'(서열번호 12)을 가진다.

증폭된 단편은 시판용 키트("제네클린," BIO 101 인코포레이티드, 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리하였다. 그 다음 단편을 BamHI 및 Asp718로 효소 처리하고, 다시 1% 아가로스 겔상에서 정제하였다. 이 단편을 "F1"로 명명하였다.

플라스미드는 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 처리하고, 송아지 장 포스파타제를 사용하고 당해 분야에 알려진 통상의 절차를 사용하여 임의로 탈인산화할 수 있다. 그 다음, DNA를 시판용 키트("제네클린," BIO 101 인코포레이티드, 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리하였다. 이 벡터 DNA를 본원에서 "V1"로 명명하였다.

단편 F1 및 탈인산화된 플라스미드 V1을 T4 DNA 리가제와 함께 결찰시켰다. 이.콜리 HB101 세포 또는 기타 적합한 이.콜리 숙주, 예컨대, XL-1 블루(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진 클로닝 시스템스) 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시키고, 배양 평판상에 도말하였다. PCR 방법을 사용하여 인간의 DR5를 가진 플라스미드를 보유하는 박테리아를 동정하였는데, 이 방법에서는 프라이머중의 하나를 유전자 증폭에 사용하고, 두번째 프라이머는 벡터내부 웰로부터 유래한 것으로서, DR5 유전자 단편을 보유하는 이들 박테리아 콜로니만이 DNA의 증폭을 나타낼 것이다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 이 플라스미드는 본원에서 pBac DR5로 명명하였다.

문헌[Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:7413-7417(1987)]에 기재된 리포펙틴 방법을 사용하여, 플라스미드 pBac DR5 5㎍을 시판되는 선형 바쿨로비루스 DNA("바쿨로골드^TM 바쿨로비루스 DNA," 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 파르미노겐) 1.0 ㎍과 동시 형질감염시켰다. 바쿨로골드^TM 비루스 DNA 1 ㎍ 및 플라스미드 pBac DR5 5 ㎍을 무혈청 그레이스 배지(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드, 매릴랜드주 게이더스버그 소재) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰에서 혼합하였다. 그 후, 리포펙틴 10 ㎕와 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가하고 혼합하고, 실온에서 15분 동안 항온 배양하였다. 그 후, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1 ㎖를 함유한 35 ㎜ 조직 배양판에 파종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 그 후, 그 평판을 전후로 흔들어서 새로이 첨가된 용액을 혼합하였다. 그 평판을 27℃에서 5 시간 동안 항온 배양하였다. 5 시간후에, 형질감염 용액을 평판으로부터 제거하고, 10% 태내 송아지 혈청으로 보충한 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 이 평판을 인큐베이터내로 다시 넣고, 27℃에서 4일 동안 배양을 계속하였다.

4일후, 상청액을 수집하고, 상기 인용한 Summers 및 Smith의 문헌에 기재된 대로 플라크 분석을 실시하였다. "블루 갈"(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드, 매릴랜드주 게이더스버그 소재)을 가진 아가로스 겔을 사용하여 청색 염색된 플라크를 생성시키는 gal-발현 클론을 용이하게 동정하고 분리하였다. (이런 유형의 "플라크 분석"에 관한 상세한 사항은 또한 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 배포한, 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학에 관한 사용자 지침 9-10면에서 발견할 수 있다.). 적합한 항온 배양후, 청색 염색된 플라크를 미세피펫(예컨대, 에펜도르프) 끝으로 채집하였다. 재조합 비루스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하는 미세 원심분리관에 재현탁시키고, 재조합 바쿨로비루스를 함유하는 현탁액을 사용하여 35 ㎜ 접시에 파종된 Sf9 세포를 감염시켰다. 4일후, 이들 배양 접시의 상청액을 수집한 다음, 이들을 4℃에서 보관하였다. 이 재조합 비루스를 V-DR5로 칭한다.

DR5 유전자의 발현을 입증하기 위해, 10% 열 불활성화된 FBS로 보충된 그레이스 배지에서 Sf9 세포를 증식시켰다. 세포들을 재조합 바쿨로비루스 V-DR5와 다중 감염도("MOI") 약 2(약 1 내지 약 3)로 감염시켰다. 6일후, 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인을 뺀 SF900 II 배지(매릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 시판됨)로 대체하였다. 방사성 표지된 단백질을 의도한다면, 42 시간후에 ³⁵S-메티오닌 5 μCi 및 ³⁵S-시스테인 5 μCi(아머샴에서 시판)를 첨가하였다. 세포들을 16 시간 동안 더 항온 배양하고, 이들을 원심분리에 의해 수집하였다. 세포내 단백질 뿐만 아니라 상청액내 단백질은 SDS-PAGE로 분석한 다음 자동 방사성 사진법(방사성 표지하는 경우)으로 분석하였다. 정제된 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열의 미세 서열 분석법을 사용하여 성숙 단백질의 아미노 말단 서열을 결정하고, 따라서, 분비성 신호 펩티드의 절단점 및 길이를 결정할 수 있다.

실시예 4

DR5 유전자 발현의 조직 분포

상기 인용한 Sambrook 등의 문헌에 기재된 방법을 사용하여 노던 블롯 분석법을 수행하여 인체 조직에서의 DR5 유전자 발현을 검사하였다. DR5 단백질(서열번호 1)의 전체 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 프로브를 제조자의 지시에 따라 레디프라임(rediprime^TM) DNA 표지 계(아머샴 라이프 사이언스)를 사용하여 ³²P로 표지하였다. 표지후, 프로브를 제조자의 프로토콜 번호 PT1200-1에 따라 크로마 스핀(CHROMA SPIN)-100^TM 칼럼(클론테크 래보러토리즈 인코포레이티드)을 사용하여 정제하였다. 정제되고 표지된 프로브를 사용하여 DR5 mRNA에 대해 다양한 인체 조직을 검사하였다.

다양한 인체 조직(H) 또는 인체 면역계 조직(IM)을 함유하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯은 클론테크(캘리포니아 팔로 알토)에서 입수하였고, 제조자의 프로토콜 번호 PT1190-1에 따라 익스프레스하이브(ExpressHyb^TM) 하이브리드화 용액(클론테크)을 사용하여 표지된 프로브로 검사하였다. 하이브리드화 및 세척후, 블롯을 착상시켜 -70℃에서 하루밤 동안 필름에 노출시켰다. 필름을 표준 절차에 따라 현상하였다. DR5의 발현은 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 자궁, 소장, 결장, 말초혈 백혈구(PBL), 임파절, 골수 및 태아의 간에서 검출하였다.

DR5의 발현은 또한 암세포주들, 즉 HL60(전골수세포 백혈병), Hela 세포 S3, K562(만성 골수형성성 백혈병), MOLT4(임파아세포 백혈병), Raji(버키트 임파종), SW480(결장 직장 선암), A549(폐암) 및 G361(흑색종)에서 노던 블롯에 의해 평가하였으며, 시험한 모든 세포주에서 검출되었다.

실시예 5

포유류 세포에서의 DR5 유도된 아폽토시스

포유류 세포에서의 Fas/APO-1 및 TNFR-1의 과다 발현은 수용체 활성화(M. Muzio 등, Cell 85:817-827(1996); M.P. Boldin 등, Cell 85:803-815(1996))와 유사하였다. 따라서, 이 계를 이용하여 아폽토시스 유도에 있어서의 DR5의 기능적 역할을 연구하였다. 이 실시예는 MCF7 인체 유방암 세포에서 및 인체 상피암(Hela) 세포에서 DR5 유도된 아폽토시스의 과다 발현을 입증하는 것이다.

실험 디자인

세포 사망 분석은 전술한 바와 거의 동일하게 실시하였다(A.M. Chinnaiyan 등, Cell 81:505-12(1995); M.P. Boldin 등, J. Biol Chem 270; 7795-8(1995); F.C. Kischkel 등, EMBO 14:5579-5588(1995); A.M. Chinnaiyan 등, J. Biol Chem 271:4961-4965(1996)). 간략히 언급하면, MCF-7 인체 유방암 클론 세포주 및 Hela 세포를 베타-갈락토시다제 리포터 구성체와 함께 벡터, DR5, DR5Δ(52-411) 또는 TNFR-1로 동시 형질감염시켰다.

제조자의 지시에 따라 리포펙트아민 절차(GIBCO-BRL)를 사용하여 MCF7 및 Hela 세포를 형질감염시켰다. CaPO₄침전법을 사용하여 293개 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간후에, 세포를 고정시키고, 전술한 바와 같이(A.M. Chinnaiyan 등, Cell 81:505-12(1995); M.P. Boldin 등, J. Biol Chem 270; 7795-8(1995); F.C. Kischkel 등, EMBO 14:5579-5588(1995)), X-Gal로 염색하고, 현미경으로 검사하였다. 도 5에 제시된 자료(평균±SD)는 총 베타-갈락토시다제 양성 세포(n=3)의 함수로서 둥근 아폽토시스성 세포의 비율을 나타낸다. DR5의 과다 발현은 MCF7(도 5a) 및 Hela 세포(도 5b)에서 모두 아폽토시스를 유도하였다.

MCF7 세포 역시 z-VAD-fmk(20㎕)(엔자임 시스템스 프로덕츠, 캘리포니아주 더블린 소재)의 존재하에 DR5 발현 구성체로 형질감염시키거나 또는 3배 과량의 CrmA(M. Tewari 등, J Biol Chem 270:3255-60(1995)) 또는 FADD-DN 발현 구성체 또는 벡터 단독으로 동시 형질감염시켰다. 도 5c에 제시한 자료는 DR5가 유도하는 아폽토시스가 카스파제 저해제에 의해 약독화되지만 우성의 음성 FADD에 의해서는 약독화되지 않았음을 나타내는 것이다.

도 5d에 도시한 바와 같이, DR5는 FADD 또는 TRADD와 생체내에서 결합하지 않았다. 인산칼슘 침전법을 사용하여 지시된 발현 구성체와 함께 293개 세포를 동시 형질감염시켰다. 형질감염 후(40 시간에), 세포 용균물을 준비하고, Flag M2 항체 친화도 겔(IBI, 코닥)로 면역 침전시키고, FADD 또는 myc-표지된 TRADD(myc-TRADD)의 존재는 FADD에 대한 다클론 항체 또는 myc(BMB)에 대한 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합 항체(Baker, S.J. 등, Oncogene 12:1(1996); Chinnaiyan, A.M. 등, Science 274:990(1996))로 면역 블로팅하여 검출하였다.

도 5e에 도시한 바와 같이, FLICE 2-DN은 DR5 유도 아폽토시스를 차단하였다. 293개 세포는 전술한 베타-갈락토시다제 리포터 구성체의 존재하에 DR5 또는 TNFR-1 발현 구성체 및 4배 과량의 CrmA, FLICE-DN, FLICE 2-DN 또는 벡터 단독으로 동시 형질감염시켰다. 세포를 염색하고 25 내지 30 시간후에 검사하였다.

결과

DR5의 과다 발현은 MCF7 인간 유방암 세포(도 5a) 및 인체 상피암(Hela) 세포(도 5b)에서 아폽토시스를 유도하였다. 대부분의 형질감염된 세포는 아폽토시스를 진행하는 세포의 형태학적 변화 특성을 나타내어(Earnshaw, W.C., Curr. Biol. 7:337 (1995)), 구형화되고 수축되며, 접시로부터 탈착되었다. 사망 도메인의 결실에 의해 사멸 능력이 제거되었다. DR4와 같이, DR5 유도 아폽토시스는 카스파제 저해제, CrmA 및 z-VAD-fmk에 의해 차단되었으나, 우성의 음성 FADD는 효과가 없었다(도 5c). 이와 일치되게, DR5는 생체내에서 FADD 및 TRADD와 상호작용하지 않았다(도 5d). 새로이 확인된 FLICE-형 분자의 우성의 음성 분자인 FLICE2(Vincenz, C. 등, J. Biol. Chem. 272:6578(1997))는 효과적으로 DR5 유도된 아폽토시스를 차단한 반면에, 우성의 음성 FLICE는 그것이 차단된 조건하에 단지 부분적인 효과만을 나타냈다. TNFR-1은 아폽토시스를 효율적으로 유도하였다(도 5e). 증거를 종합하면, DR5가 FLICE2의활성화와 관련되는 아폽토시스 프로그램 및 하류의 카스파제에 관여하지만, FADD와는 무관한 것임을 알 수 있다.

실시예 6

DR5의 세포외 도메인은 세포 독성 리간드-TRAIL에 결합하고, TRAIL-유도 아폽토시스를 차단함

상기 논급한 바와 같이, TRAIL/Apo2L이 종양 괴사 인자(TNF) 리간드군에 속하며, 사망 도메인 보유 수용체인 DR4가 두 세포형에서 발현됨에도 불구하고, 다수의 형질전환된 세포주의 급속한 세포 사망을 유도하지만, 정상 조직의 사망은 유도하지 않는 세포 독성 리간드이다. 본 실시예는 본 발명의 수용체 DR5 역시 TRAIL에 결합한다는 것을 보여준다.

DR5 및 DR4의 세포외 리간드 결합 시스테인 풍부 도메인의 유사성을 얻음으로써, 본원 발명자들은 DR5가 TRAIL에도 결합하는 것으로 이론화하였다. 이를 확인하기 위하여, DR5의 가용성 세포외 리간드 결합 도메인은 인체 면역글로불린(IgG)의 Fc 부분에의 융합체로서 발현시켰다.

도 6a에 도시한 바와 같이, DR5-Fc는 TRAIL에는 특이적으로 결합하였지만, 관련 세포독성 리간드 TNFα에는 결합하지 않았다. 이 실험에서, DR5, DR4, TRID 또는 TNFR1의 Fc-세포외 도메인 및 그 상응하는 리간드를 제조하고, 문헌[Pan 등, Science 276:111(1997)]에 기재된 바와 같이 결합 분석을 실시하였다. 각각의 Fc 융합물은 단백질 G-세파로스로 침전시키고, 동시 침전된 가용성 리간드는 항-Flag (Babco) 또는 항-myc-HRP(BMB)로 면역 블로팅하여 검출하였다. 도 6a의 아래 패널은 결합 분석에 존재하는 유입 Fc-융합체를 나타낸다.

또한, DR5-Fc 는 TRAIL이 아폽토시스를 유도하는 능력을 차단하였다(도 6b). MCF7 세포는 동등량의 Fc-융합체 또는 단독의 Fc 존재하에 가용성 TRAIL(200 ng/㎖)로 처리하였다. 6 시간후에, 세포를 고정시키고, Pan 등의 상기 문헌에 기재된 바와 검사하였다. 도 6b에 도시한 자료(평균±SD)는 계수한 총 핵수(n=4)중에서 아폽토시스성 핵의 비율이다.

최종적으로, DR5-Fc는 TNFR1-Fc가 TNFα사멸 능력을 완전히 제거한 조건하에서는 아폽토시스 TNFα유도 세포 사망에는 영향을 미치지 않았다(도 6c). MCF7 세포는 동등한 양의 Fc-융합체 또는 단독 Fc 존재하에 TNFα(40 ng/㎖; 제넨테크 인코포레이티드)로 처리하였다. 핵들을 염색하고 11 내지 15 시간후에 검사하였다.

TRAIL에 대한 수용체로서 DR5의 새로운 확인은 TRAIL에 의해 개시되는 신호 전달의 생물학에 또 다른 복잡성을 부가하였다.

상기 상세한 설명 및 실시예에 구체적으로 기재된 것과 다르게도 본 발명을 실시할 수 있다는 것은 명백하다.

상기 교시 내용에 비추어 본 발명의 다양한 개조예 및 변형예가 가능하며, 따라서, 그들 역시 본 발명의 특허 청구의 범위내에 속한다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 공개문헌들은 본원에 참고로 인용한 것들이다.

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(B) STREET: 9410 Key West Avenue (C) CITY: Rockville (D) STATE: MD (E) COUNTRY: US (F) ZIP: 20850 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US herewith (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 60/054,021 (B) FILING DATE: 29-JUL-1997 (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 60/040,846 (B) FILING DATE: 17-MAR-1997 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Hoover, Kenley (B) REGISTRATION NUMBER: 40,302 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: PF366 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 3013098504 (B) TELEFAX: 3013098439 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1600 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE: (A) 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Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser 15 20 25 GAG GGA TTG TGT CCA CCT GGA CAC CAT ATC TCA GAA GAC GGT AGA GAT 408 Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp 30 35 40 TGC ATC TCC TGC AAA TAT GGA CAG GAC TAT AGC ACT CAC TGG AAT GAC 456 Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp 45 50 55 CTC CTT TTC TGC TTG CGC TGC ACC AGG TGT GAT TCA GGT GAA GTG GAG 504 Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu 60 65 70 CTA AGT CCC TGC ACC ACG ACC AGA AAC ACA GTG TGT CAG TGC GAA GAA 552 Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu 75 80 85 90 GGC ACC TTC CGG GAA GAA GAT TCT CCT GAG ATG TGC CGG AAG TGC CGC 600 Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg 95 100 105 ACA GGG TGT CCC AGA GGG ATG GTC AAG GTC GGT GAT TGT ACA CCC TGG 648 Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp 110 115 120 AGT GAC ATC GAA TGT GTC CAC AAA GAA TCA GGC ATC ATC ATA GGA GTC 696 Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val 125 130 135 ACA GTT GCA GCC GTA GTC TTG ATT GTG GCT GTG TTT GTT TGC AAG TCT 744 Thr Val Ala Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser 140 145 150 TTA CTG TGG AAG AAA GTC CTT CCT TAC CTG AAA GGC ATC TGC TCA GGT 792 Leu Leu Trp Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly 155 160 165 170 GGT GGT GGG GAC CCT GAG CGT GTG GAC AGA AGC TCA CAA CGA CCT GGG 840 Gly Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly 175 180 185 GCT GAG GAC AAT GTC CTC AAT GAG ATC GTG AGT ATC TTG CAG CCC ACC 888 Ala Glu Asp Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr 190 195 200 CAG GTC CCT GAG CAG GAA ATG GAA GTC CAG GAG CCA GCA GAG CCA ACA 936 Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr 205 210 215 GGT GTC AAC ATG TTG TCC CCC GGG GAG TCA GAG CAT CTG CTG GAA CCG 984 Gly Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro 220 225 230 GCA GAA GCT GAA AGG TCT CAG AGG AGG AGG CTG CTG GTT CCA GCA AAT 1032 Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 235 240 245 250 GAA GGT GAT CCC ACT GAG ACT CTG AGA CAG TGC TTC GAT GAC TTT GCA 1080 Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala 255 260 265 GAC TTG GTG CCC TTT GAC TCC TGG GAG CCG CTC ATG AGG AAG TTG GGC 1128 Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly 270 275 280 CTC ATG GAC AAT GAG ATA AAG GTG GCT AAA GCT GAG GCA GCG GGC CAC 1176 Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His 285 290 295 AGG GAC ACC TTG TAC ACG ATG CTG ATA AAG TGG GTC AAC AAA ACC GGG 1224 Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly 300 305 310 CGA GAT GCC TCT GTC CAC ACC CTG CTG GAT GCC TTG GAG ACG CTG GGA 1272 Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly 315 320 325 330 GAG AGA CTT GCC AAG CAG AAG ATT GAG GAC CAC TTG TTG AGC TCT GGA 1320 Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly 335 340 345 AAG TTC ATG TAT CTA GAA GGT AAT GCA GAC TCT GCC ATG TCC 1362 Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 TAAGTGTGAT TCTCTTCAGG AAGTGAGACC TTCCCTGGTT TACCTTTTTT CTGGAAAAAG 1422 CCCAACTGGA CTCCAGTCAG TAGGAAAGTG CCACAATTGT CACATGACCG GTACTGGAAG 1482 AAACTCTCCC ATCCAACATC ACCCAGTGGA TGGAACATCC TGTAACTTTT CACTGCACTT 1542 GGCATTATTT TTATAAGCTG AATGTGATAA TAAGGACACT ATGGAAAAAA AAAAAAAA 1600 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 411 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys -51 -50 -45 -40 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro -35 -30 -25 -20 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu -15 -10 -5 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 1 5 10 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 15 20 25 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 30 35 40 45 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 50 55 60 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 65 70 75 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 80 85 90 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 95 100 105 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 110 115 120 125 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala 130 135 140 Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp 145 150 155 Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly 160 165 170 Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp 175 180 185 Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro 190 195 200 205 Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn 210 215 220 Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala 225 230 235 Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp 240 245 250 Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val 255 260 265 Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp 270 275 280 285 Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr 290 295 300 Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala 305 310 315 Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu 320 325 330 Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met 335 340 345 Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 455 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys 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Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 275 280 285 Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300 Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp 340 345 350 Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro 355 360 365 Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 370 375 380 Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415 Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430 Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 450 455 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 335 amino acids (B) 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Val Trp Val Lys Arg 180 185 190 Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly 195 200 205 Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu 210 215 220 Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met 225 230 235 240 Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu 245 250 255 Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu 260 265 270 Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys 275 280 285 Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys 290 295 300 Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser 305 310 315 320 Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val 325 330 335 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 417 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala 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220 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile 355 360 365 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 375 380 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met 385 390 395 400 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 Pro (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) 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Claims

(a) 서열번호 2에서 -51 내지 360 위치의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(b) 서열번호 2에서 -50 내지 360 위치의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;

(c) 서열번호 2에서 1 내지 360 위치의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및

(d) 서열번호 2에서 1 내지 133 위치의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열

로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것인 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 것인 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 성숙 DR5 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것인 분리된 핵산 분자.
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서열번호 2에서 11 내지 59 위치의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드; 서열번호 2에서 68 내지 113 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 173 내지 220 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드; 및 서열번호 2에서 224 내지 319 위치의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드로 구성되는 군에서 선택된 DR5 폴리펩티드의 에피토프 보유부를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 서열번호 2에서 1 내지 133 위치의 아미노산을 암호화하는 것인 분리된 핵산 분자.
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제1항의 분리된 핵산 분자를 벡터내로 삽입하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조 방법.
제14항의 방법에 의해 제조된 재조합 벡터.
제1항의 분리된 핵산 분자를 숙주 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
제16항의 방법에 의해 제조된 재조합 숙주 세포.
DR5 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 제17항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, DR5 폴리펩티드를 제조하기 위한 재조합 방법.
(a) 서열번호 2에서 -51 내지 360 위치의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 2에서 -50 내지 360 위치의 아미노산 서열;

(c) 서열번호 2에서 1 내지 360 위치의 아미노산 서열; 및

(d) 서열번호 2에서 1 내지 133 위치의 아미노산 서열

로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 분리된 DR5 폴리펩티드.
DR5 단백질의 에피토프 보유부로 구성되는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 보유부는 서열번호 2에서 11 내지 59 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 68 내지 113 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 173 내지 220 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드; 및 서열번호 2에서 224 내지 319 위치의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군에서 선택된 것인 분리된 폴리펩티드.
제19항의 DR5 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
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이종성 폴리펩티드에 융합된 제19항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
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제21항에 있어서, 단일 클론 항체인 것인 분리된 항체.
제21항에 있어서, 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것인 분리된 항체.