KR20000070174A - 종양 괴사 인자 수용체 6α 및 6β - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 종양 괴사 인자 수용체 단백질에 관한 것이다. 사람 TNFR-6α 및 -6β 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드, 벡터, 숙주 세포 및 이를 제조하기 위한 재조합 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 발명은 TNFR-6α 및 -6β 활성에 대한 효능제 및 길항제를 분리하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 면역계-관련 질환을 검출하기 위한 진단 방법 및 면역계-관련 질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다.

Description

종양 괴사 인자 수용체 6α 및 6β{Tumor necrosis factor receptors 6α and 6β}
수많은 생물학적 작용, 예를 들어 특정 자극에 대한 반응 및 천연 생물학적 과정은 사이토킨 같은 인자들에 의해 조절된다. 수많은 사이토킨들이 수용체에 결합하여 세포내 반응을 생성시킴으로써, 수용체를 통해 작용한다.
예를 들어, 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타는, TNF 수용체를 통해 감염 예방 및, 쇼크 및 염증 질환의 유도를 포함하는 수많은 생물학적 과정을 조절하는 사이토킨이다. TNF 분자는 "TNF-리간드 슈퍼패밀리"에 속하며, 이의 수용체 또는 대-리간드, 즉 "TNF-수용체" 슈퍼패밀리와 함께 작용한다. 지금까지, TNF 리간드 슈퍼패밀리의 9개 구성원이 분리되었으며 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 10개 구성원이 특성화되었다.
리간드 중에는, TNF-α, 림포톡신-α(LT-α, 또는 TNF-β로 공지됨), LT-β(이형삼중체 LT-α2-β 복합체에서 발견됨), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L 및 신경 성장 인자(NGF)가 포함된다. TNF 수용체의 슈퍼패밀리는 p55TNF 수용체, p75TNF 수용체, TNF 수용체-관련 단백질, FAS 항원 또는 APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, 저 친화도 p75 및 NGF-수용체[Meager, A., Biologicals, 22:291-295 (1994)]를 포함한다.
TNF-리간드 슈퍼패밀리의 수 많은 구성원들은 활성화 T-세포에 의해 발현되며, 이는 이들이 T-세포와 세포 원종양성 및 세포 기능에 기초가 되는 기타 세포 유형과의 상호작용에 필요함을 의미한다.[상기 Meager, A.].
TNF 수용체 패밀리 중 수 개의 구성원의 필수적인 기능에 대한 상당한 통찰력은 이러한 단백질의 발현을 억제시킨 돌연변이체의 분리 및 작제로부터 수득되었다. 예를 들어, FAS 항원 및 이의 리간드에서의 천연 돌연변이는 임파구 증식성 질환을 야기하며[Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356:314 (1992)], 이는 아마도 프로그램된 세포 사멸의 실패를 반영하는 것으로 보인다. CD40 리간드의 돌연변이는 혈장 중 높은 수치의 면역글로불린 M 및 낮은 수치의 면역글로붙린 G로 특성화되는 X-관련된 면역결핍 상태를 야기하며, 이는 비정상적인 T-세포-의존성 B-세포 활성화를 의미한다[Allen, R.C. et al., Science 259: 990 (1993)]. 낮은 친화도의 신경 성장 인자 수용체의 의도된 돌연변이는 비정상적인 말초 구조의 감각 혁신에 의해 특성화되는 질환을 야기한다[Lee, K.F. et al., Cell 69: 737 (1992)].
TNF 및 LT-α는 두 개의 TNF 수용체(55- 및 75-kd TNF 수용체)에 결합할 수 있다. 수용체를 통해 작용하는 TNF 및 LT-α에 의해 유도되는 수많은 생물학적 효과들은 이식된 종양의 출혈성 괴사, 세포독성, 내독성 쇼크, 염증, 면역조절, 증식 및 항-바이러스성 반응에서의 역할 뿐만 아니라 이온화 방사능의 유해 효과로부터의 보호를 포함한다. TNF 및 LT-α는 내독성 쇼크, 뇌성 말라리아, 종양, 자가면역 질환, AIDS 및 이식물-숙주 거부 반응을 포함하는, 광범위한 질환의 발병에 관여한다[Beutler, B. and Von Huffel, C., Science 264: 667-668 (1994)]. p55 수용체에서의 돌연변이는 미생물 감염에 대한 감수성 증가를 초래한다.
추가로, TNFR1(p55) 및 Fas의 C-말단 인접한 약 80개 아미노산 도메인은 "사멸 도메인(death domain)"으로 공지되어 있으며, 이는 프로그램된 세포 사멸을 위한 신호 전달에 관여한다[Tartaglia et al., Cell 74: 845 (1993)].
어팝토시스(apoptosis), 즉 프로그램된 세포 사멸은 다세포 유기체의 정상적인 발달 및 항상성에 필수적인 생리적 과정이다[H. Steller, Science 267, 1445-1449 (1995)]. 어팝토시스의 교란은 암, 신경퇴행성 질환, 및 후천성 면역결핍증을 포함하는 수 개의 사람 질환의 발병에 관여한다[C.B. Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)]. 최근에, 많은 관심들이 두 개의 세포 표면 사멸 수용체, Fas/APO-1 및 TNFR-1의 신호 전달 및 생물학적 기능에 집중되고 있다[J.L. Cleveland, J.N. Ihle, Cell 81, 479-482 (1995); A. Fraser, G. Evan, Cell 85, 781-784 (1996); S. Nagata, P. Golstein, Science 267, 1449-56 (1995)]. 둘 모두는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이며, 상기 패밀리는 또한 그외에, TNFR-2, 낮은 친화도 NGFR, CD40 및 CD30을 포함한다[C.A. Smith, et al., Science 248, 1019-23 (1990); M. Tewari, V.M. Dixit, in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl, Ed.(Chapman and Hall, London, 1995)]. 상기 패밀리 구성원들은 이들의 세포외 도메인에서 시스테인-풍부 반복체의 존재로서 정의되는 반면, Fas/APO-1 및 TNFR-1은 또한 "사멸 도메인"으로 적합하게 명명된, 세포내 상동성 영역을 공유하며, 이는 독특하게 초파리(Drosophila) 자살 유전자인, reaper와 관련이 있다[P. Golstein, D. Marguet, V. Depraetere, Cell 81, 185-6 (1995); K. White et al., Science 264, 677-83 (1994)]. 이러한 공유된 사멸 도메인은 두 수용체 모두가 최근까지 미확인된 채로 남아 있는, 관련된 신호 전달 분자 세트와 상호작용함을 제시한다. Fas/APO-1의 활성화는 사멸 도메인-함유 어댑터 분자 FADD/MORT1을 보강하고[A.M. Chinnaiyan, K. O'Rourke, M. Tewari, V.M. Dixit, Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin, et al., J. Biol Chem 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14, 5579-5588 (1995)], 상기 분자는 차례로 프로-어팝토시스성 프로테아제의 ICE/CED-3 패밀리 중 한 구성원인, FLICE/MACH1에 결합하여 이를 활성화시키는 것으로 보인다[M. Muzio et al., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, T.M. Goncharov, Y.V. Goltsev, D. Wallach, Cell 85, 803-815 (1996)]. Fas/APO-1의 중심 역할이 세포 사멸을 촉진하는 것인데 반해, TNFR-1은 NF-kB를 활성화시키는 이의 능력으로부터 주로 기인하는, 다양한 생물학적 활성을 전달할 수 있다[L.A. Tartaglia, D.V. Goeddel, Immunol Today 13, 151-3 (1992)]. 따라서, TNFR-1은 다가 어댑터 분자 TRADD를 보강하며, 이는 FADD와 마찬가지로, 또한 사멸 도메인을 함유한다[H. Hsu, J. Xiong, D.V. Goeddel, Cell 81, 495-504 (1995); H. Hsu, H.-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308 (1996)]. FADD, TRAF2 및 RIP를 포함하는 수많은 신호 전달 분자들과의 결합을 통해, TRADD는 어팝토시스 및 NF-kB 활성화 모두에 신호를 전달할 수 있다[H. Hsu, H.-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308 (1996); H. Hsu, J. Huang, H.-B. Shu, V. Baichwal, D.V. Goeddel, Immunity 4, 387-396 (1996)].
TNF 패밀리 리간드 및 TNF 패밀리 수용체의 효과들은 포유동물 시스템의 생물학적 과정에서 다양하며, 정상적인 및 비정상적인 수 많은 기능들에 영향을 미친다. 따라서, 정상적으로 및 질병 상태 모두에서 생물학적 활성에 영향을 미치는 이러한 수용체 및 리간드를 분리하고 특성화하는 것이 매우 필요하다. 특히, TNF 수용체 패밀리의 신규한 구성원들을 분리하고 특성화하는 것이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 각각, 서열 2 및 4로 나타낸 완전한 아미노산 서열, 또는 각각, ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호로서 플라스미드 DNA로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드의 한 부분 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 분리된 핵산 분자를 제공한다. 기탁된 TNFR-6α 및 -6β 클론을 서열 분석함으로써 결정된 상기 뉴클레오타이드 서열은 도 1 및 2에서 나타내며(각각, 서열 1 및 3), 이는 각각, 서열 1 및 3에서 뉴클레오타이드 25 내지 27 위치 및 73 내지 75 위치에서 N-말단 메티오닌을 암호화하는 개시 코돈을 포함하는, 각각 300개 및 170개의 아미노산 잔기의 완전한 폴리펩타이드를 암호화하는 전사 해독 프레임을 함유한다.
본 발명의 TNFR 단백질은 기타 TNF 수용체들과 서열 상동성을 갖는다. 스플라이스 변이체(splice variant) TNFR-6α 및 -6β는 또한 다중 보존된 시스테인-풍부 도메인을 포함하는 TNFR-I 및 -II(도 3)(각각, 서열 5 및 6)에 대한 사람 mRNA의 해독 생성물과 높은 수준의 서열 상동성을 나타낸다.
TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드는 각각 30개의 아미노산의 예견된 리더 서열을 가지며; 예견된 성숙한 TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 각각, 아미노산 잔기 31 내지 300 위치(서열 2) 및 31 내지 170 위치(서열 4)로서 도 1 및 도 2에서 또한 나타낸다.
따라서, 본 발명의 한가지 양태는 (a) 서열 2 또는 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치에서 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치에의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오타이드 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오타이드 중 어느 하나에 대해 90% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드화하는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 T 잔기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에는 하이브리드화하지 않는다. 본 발명의 부가적인 핵산 양태는 상기 (a), (b) 또는 (c)의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터, 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 벡터 및 숙주 세포를 작제하는 방법 및 재조합 기술들로 TNFR 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 2 또는 4에서 나타낸 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; 또는 (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 TNFR 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 상기 (a), (b) 또는 (c)에서 기술된 것에 대해 80% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일한, 보다 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 상기한 것들에 대해 90% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 상기 양태의 부가적인 양태는 상기 (a), (b) 또는 (c)에서 기술된 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기된 본 발명의 폴리펩타이드의 전체 아미노산 서열 이하의 임의의 길이 또는 전체 아미노산 서열을 포함하는 에피토프-형성 폴리펩타이드가 본 발명에 또한 포함되기는 하지만, 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 6 내지 7개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 및 보다 바람직하게는 약 30개 내지 약 50개 이상의 아미노산을 갖는 그러한 폴리펩타이드의 부분을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 (a), (b) 또는 (c)에서 기술된 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에서 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 항체들은 이하에서 기술하는 바와 같이 진단 또는 치료학적으로 유용하다.
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 리간드는 세포독성, 항-바이러스 활성, 면역조절 활성 및 수 개의 유전자에 대한 전사 조절을 포함하는, 수많은 세포성 반응을 유도하는, 가장 다발성인 사이토킨에 속하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명은 또한 TNFR 폴리펩타이드, 특히 사람 TNFR 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 이는 예를 들어, HIV 감염, 내독성 쇼크, 암, 자가면역 질환, 이식물 대 숙주 질환, 급성 이식 거부, 만성 이식 거부, 신경퇴행성 질환, 척수이형성 증후군, 허혈성 손상, 독소-유도된 간 질환, 패혈성 쇼크, 악액질 및 식욕 불량을 포함하는 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. TNFR 폴리펩타이드를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 추가로 시험관내에서, 생체외에서 및 생체내에서 세포에, 또는 다세포 유기체에 투여하기 위한 TNFR 뉴클레오타이드 또는 TNFR 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 양태의 보다 특히 바람직한 양태에서, 조성물은 질환을 치료하기 위해서 숙주 유기체내에서 TNFR 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 TNFR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여 TNFR 폴리펩타이드의 비정상적인 내인성 활성과 관련된 기능 이상을 치료하기 위한 사람 환자에서의 발현이 특히 바람직하다.
또 다른 양태에서, TNFR-패밀리 리간드에 결합하는 TNFR 폴리펩타이드 상에서 후보 화합물이 갖는 효능을 결정하는 것과 관련이 있는, 효능제 및 길항제에 대한 스크리닝 분석법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 TNFR-패밀리 리간드와 TNFR 폴리펩타이드 및 후보 화합물을 접촉시키고 후보 화합물의 존재로 인해 TNFR 폴리펩타이드의 TNFR 패밀리 리간드에 대한 결합이 증가하는지 또는 감소하는지를 결정하는 것과 관련된다. 이러한 분석법에서, 표준 결합에 대해 TNFR 폴리펩타이드의 결합 증가는 후보 화합물이 TNFR 폴리펩타이드 결합 활성에 대한 효능제임을 나타내며 표준에 비해 TNFR 폴리펩타이드 결합의 감소는 상기 화합물이 TNFR 폴리펩타이드 결합 활성의 길항제임을 나타낸다.
TNFR-6α 및 -6β는 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 정상적인 전립선 및 전립선 종양 조직에서 발현된다. 상기 조직 또는 세포의 수 많은 질환, 특히 면역계 질환에 있어서, "표준" TNFR 유전자 발현 수준, 즉, 면역계 질환이 없는 개체로부터의 건강한 조직에서 TNFR 발현 수준에 비교해서, TNFR 유전자 발현의 현저하게 높거나 낮은 수준이 상기 질환에 걸린 개체로부터 취해진 특정 조직(예를 들어, 암 조직) 또는 체액(예를 들어, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) 개체의 세포 또는 체액에서 TNFR 유전자 발현 수준을 분석하고; (b) 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 상기 TNFR 유전자 발현 수준을 비교하는 것(이때, 표준 발현 수준과 비교해서 분석된 TNFR 유전자 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 면역계 질환에 대한 지표이다)과 관련되는, 상기 질환의 진단에서 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 부가적인 양태는 치료학적으로 유효량의 본 발명의 분리된 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 효능제를 포함하는 조성물을 체내에서 TNFR 폴리펩타이드 활성의 증가된 수준이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또한 추가의 양태는 치료학적으로 유효량의 TNFR 길항제를 포함하는 조성물을 TNFR 폴리펩타이드 활성의 감소된 수준이 필요한 개체에게 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하는데 바람직한 길항제는 TNFR-특이적인 항체이다.
본 발명은 TNF 수용체 패밀리의 구성원인 폴리펩타이드를 암호화하는 신규한 사람 유전자들에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 하기에서 종종 "TNFR-6α, 및 -6β" 또는 일반적으로 "TNFR 폴리펩타이드"로 인용되는 종양 괴사 인자 수용체-6α 및 -6β로 불리는 사람 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자들이 제공된다. TNFR 폴리펩타이드는 또한 벡터, 숙주 세포 및 이를 제조하는 재조합 방법으로서 제공된다. 본 발명은 추가로 TNFR 폴리펩타이드 활성에 대한 효능제 및 길항제를 분리하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 조성물을 사용하는 진단 방법 및 치료 방법이 제공된다.
도 1은 TNFR-6α의 뉴클레오타이드 서열(서열 1) 및 유추된 아미노산 서열(서열 2)을 나타낸다.
도 2는 TNFR-6β의 뉴클레오타이드 서열(서열 3) 및 유추된 아미노산 서열(서열 4)을 나타낸다.
도 3은 DNA스타 수트(DNAstar suite)에서 메가라인 프로그램(Megaline program)을 사용하는 클러스탈 방법(Clustal method)에 의해 작제된, TNFR-6α("TNFR-6a") 및 TNFR-6β("TNFR-6b")의 아미노산 서열을 하기와 같은 기타 TNF 수용체와 비교하는 배열도이다: TNFR1(서열 5); TNFR2(서열 6); NGFR(서열 7); LTbR(서열 8); FAS(서열 9); CD27(서열 10); CD30(서열 11); CD40(서열 12); 4-1BB(서열 13); OX40(서열 14); VC22(서열 15); 및 CRMB(서열 16).
도 4 및 5는 각각, TNFR-6α 및 -6β 아미노산 서열에 대한 개별적인 분석을 나타낸다. 알파, 베타, 턴(turn) 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양친매성(amphipathic) 영역; 유연성 영역; 항원 지수 및 표면 확률이 표시되어 있다. "제임슨-울프 항원 지수(Antigenic Index-Jameson-Wolf)" 그래프에서, 단백질의 높은 항원성 영역의 위치, 즉 본 발명의 에피토프-형성 펩타이드가 이로부터 수득될 수 있는 영역을 나타낸다.
도 6은 서열 1 및 3과 관련있는 HELDI06R 및 HCEOW38R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
본 발명은 클론된 cDNA를 서열 분석함으로써 결정된, 각각 서열 2 및 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드, 일반적으로 "TNFR 폴리펩타이드(들)"을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1 및 도 2에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)은 HPHAE52 및 HTPCH84 클론을 서열 분석하여 수득되며, 이는 미국 메릴랜드주 20852 록크빌 파크 로운 드라이브 12301에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 1996년 11월 22일에 기탁되어, 각각 수탁 번호 ATCC 제97810호 및 제97809호를 받았다. 상기 기탁된 클론들은 플라스미드 pBluescript SK(-)(제조원: 스트라타진(Stratagene)사, 캘리포니아주 라 졸라)내에 함유되어 있다.
본 발명의 TNFR-6α 및 -6β 단백질은 각각의 단백질의 N-말단 142개 잔기에 대해 동일한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 공유하는 스플라이스 변이체이다. 이러한 단백질들의 아미노산 서열은 사람 TNFR-2 mRNA(도 3)(서열 6)의 해독 생성물과 약 23% 유사성을 가지며 다수의 보존된 시스테인 풍부 도메인을 공유한다. 중요하게도, 이들 단백질은 유의한 서브유니트 내부의 상동성을 갖는 4개의 반복되는 시스테인 풍부 모티프를 포함하는 이들의 세포외 도메인에 대해서 실질적인 서열 유사성을 공유한다. TNFR-2는 TNF에 의한 사람 T-세포 증식을 배타적으로 중개하는 것으로 사료된다[PCT 제WO/94/09137호].
핵산 분자
특별한 언급이 없는 한, 본원에서 DNA 분자의 서열 분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열은 자동화 DNA 서열 분석기(예를 들어, 모델 373, 제조원: Applied Biosystems, Inc., 캘리포니아주 포스터시)를 사용하여 결정된 것이며, 본원에서 결정된 DNA 분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 모든 아미노산 서열은 상기 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 예상되는 것이다. 따라서, 이러한 자동화된 방법에 의해 결정된 모든 DNA 서열에 있어서 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열은 일부 오류를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 분석된 DNA 분자의 정확한 뉴클레오타이드 서열에 대해 전형적으로 약 90% 이상, 보다 전형적으로 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 정확한 서열은 당해 분야에 널리 공지된 수동 DNA 서열 분석법을 포함하는 기타 방법으로 보다 정확하게 결정할 수 있다. 당해 분야에서 또한 공지된 바와 같이, 정확한 서열에 필적하는 결정된 뉴클레오타이드 서열에서 단 하나의 삽입이나 결실도 뉴클레오타이드 서열의 해독에서 프레임 이동(frame shift)를 야기하여 결과적으로 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 예견된 아미노산 서열은 그러한 삽입 또는 결실이 일어난 시점부터, 서열 분석된 DNA 분자에 의해 실질적으로 암호화되는 아미노산 서열과는 완전히 상이하게 될 것이다.
핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 "뉴클레오타이드 서열"이란 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드, 즉 데옥시리보뉴클레오타이드 서열, 및 RNA 분자 또는 폴리뉴클레오타이드, 즉 리보뉴클레오타이드(A, G, C 및 U)(이때, 구체화된 데옥시리보뉴클레오타이드 서열에서, 각각의 티미딘 데옥시리보뉴클레오타이드(T)는 리보뉴클레오타이드 우리딘(U)에 의해 교체된다)의 상응하는 서열을 의미한다.
도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 뉴클레오타이드 서열과 같이, 본원에서 제공되는 정보를 사용하여, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하기 위한 방법 같은, 표준 클로닝 및 스크리닝 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명을 예증하는, TNFR-6α 및 -6β 클론(각각, 도 1 및 도 2)은 다음 조직들로부터의 cDNA 라이브러리에서 분리된다: 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 정상적인 전립선 조직 및 전립선 암 조직.
도 1 및 도 2의 TNFR cDNA의 결정된 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)은 각각, 도 1 및 도 2의 뉴클레오타이드 서열(서열 1 및 3)의 25 내지 27 위치 및 73 내지 75 위치에서 개시 코돈을 갖는, 300 및 170개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 전사 해독 프레임을 함유한다.
TNFR-6α 및 -6β 유전자의 전사 해독 프레임은 각각, 서열 2의 31 내지 283 잔기 및 서열 4의 31 내지 166 잔기의 가용성 세포외 도메인을 포함하는, 사람 TNFR-2의 mRNA의 해독 생성물과 서열 상동성을 공유한다.
통상의 숙련자가 인식하는 바와 같이, 상기 언급된 서열 분석의 오류의 가능성으로 인해, 약 300 및 170개 아미노산을 포함하는, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 실질적으로 완전한 TNFR 폴리펩타이드는 다소 더 길거나 더 짧을 수 있다. 보다 일반적으로, 실질적인 전사 해독 프레임은 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 N-말단으로부터 첫 번째 메티오닌 코돈으로부터 예견되는 ±20개 아미노산의 범위내에, 보다 유망하게는 ±10개 아미노산의 범위내에 있을 수 있으며, 이는 각각의 도면에서 나타내는 해독된 서열과 함께 프레임내에 존재한다. 추가로, 다양한 기능성 도메인을 분리하게 위해 사용되는 분석학적 기준에 따라서, TNFR 폴리펩타이드의 세포외 및 트랜스막 도메인의 정확한 "주소"가 상기 예견된 위치로부터 다소간의 차이가 있을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 서열 2에서 세포외 도메인의 정확한 위치는 도메인을 정의하기 위해 사용된 기준에 따라 다소간 다양할 수 있다(예를 들어, 상기 주소는 약 1 내지 약 20개 잔기, 보다 유망하게는 약 1 내지 약 5개 잔기 정도 "이동"할 수 있다). 하여튼, 하기에 추가로 언급되는 바와 같이, 본 발명은 추가로 TNFR-6α 및 -6β 단백질의 세포외 도메인의 가용성 형태를 구성하는, 본원에 기술된 세포외 도메인의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산이 결핍되는 폴리펩타이드를 포함하여, 완전한 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 다양한 잔기들이 결실된 폴리펩타이드를 제공한다.
리더 서열 및 성숙한 서열
완전한 TNFR 단백질의 아미노산 서열은 서열 2 및 4에서 나타낸 바와 같이, 리더 서열 및 성숙한 단백질을 포함한다. 보다 특히, 본 발명은 TNFR 단백질의 성숙한 형태를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 신호 가설에 따라서, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 방출이 개시되면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 신호 또는 분비성 리더 서열을 가지며, 이는 완전한 폴리펩타이드로부터 절단되어 상기 단백질의 분비된 "성숙한" 형태를 생성한다. 대부분의 포유동물 세포 및 곤충 세포도 동일한 특이성을 갖는 분비성 단백질을 절단한다. 그러나, 특정의 경우에, 분비성 단백질의 절단은 완전히 동일한 형태는 아니며, 상기 단백질의 두 개 이상의 성숙한 종류를 초래한다. 추가로, 분비성 단백질의 절단 특이성은 궁극적으로 완전한 단백질의 1차 구조에 의해 결정되며, 즉 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 내재하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호로서 동정되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. "ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호로서 동정되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드"란 기탁된 벡터내에 함유된 상기 클론의 사람 DNA 서열에 의해 암호화되는 완전한 전사 해독 프레임의 포유동물 세포내(예를 들어, 하기되는 바와 같은 COS 세포)에서의 발현에 의해 생성되는 상기 단백질의 성숙한 형태(들)을 의미한다.
추가로, 단백질이 분비성 리더 서열뿐만 아니라 리더 서열에 대한 절단 부위를 갖는지를 예견하기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어, 문헌[McGeoch, Virus Res. 3: 271-286 (1985)]의 방법은 완전한(비절단된) 단백질의 짧은 N-말단 하전된 영역 및 후속적인 비하전된 영역으로부터의 정보를 활용한다. 문헌[von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986)]의 방법은 절단 부위 주변의 잔기들, 전형적으로 -13 내지 +2 잔기들(이때, +1은 성숙한 단백질의 아미노 말단을 나타낸다)로부터의 정보를 활용한다. 이러한 방법들의 각각에 있어서공지된 포유동물 분비성 단백질의 절단 부위를 예견하는 정확도는 75 내지 80%의 범위이다[상기, von Heinje]. 그러나, 상기 두 개의 방법이 항상 주어진 단백질의 동일한 예견된 절단 부위를 생성하는 것은 아니다.
본원의 경우, 완전한 TNFR 폴리펩타이드의 유추된 아미노산 서열을 쿄토대학교 화학연구소(Institute for Chemical Research, Kyoto University)의 나카이 겐타(Kenta Nakai) 박사로부터 제공받은, 컴퓨터 프로그램 "PSORT"를 사용하여 분석하며[참조: K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992)], 상기 프로그램은 아미노산 서열에 기초하여 단백질의 세포내 위치를 예견하는 전문 시스템이다. 위치화의 이러한 계산에 의한 예견의 일부로서, McGeoch와 von Heinje의 방법을 혼용한다. 상기 프로그램에 의한 TNFR 아미노산 서열의 분석은 하기 결과를 제공한다: TNFR-6α 및 -6β는 각각, 서열 2 및 4의 잔기 31 내지 300 위치 및 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한다.
나타낸 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA 같은 RNA의 형태, 또는 예를 들어, 클로닝 또는 합성적으로 작제된 cDNA 및 게놈성 DNA를 포함하는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 이중-쇄 또는 단일-쇄일 수 있다. 단일-쇄 DNA 또는 RNA는 암호화 쇄(또는, 센스 쇄로 공지됨)이거나, 비-암호화 쇄(또한, 안티-센스 쇄로 인용됨)일 수 있다.
"분리된" 핵산 분자(들)이란 이의 천연 환경으로부터 절단된, 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터내에 함유되는 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가의 예는 이형 숙주 세포내에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자는 추가로 합성적으로 작제된 상기 분자를 포함한다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 각각, 서열 1 및 3에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 25 내지 27 위치 및 73 내지 75 위치에서 개시 코돈을 갖는 전사 해독 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
또한, 각각 서열 2 및 4의 31 내지 300 위치 및 31 내지 170 위치에서 나타낸 예견된 성숙한 TNFR 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
추가로, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 상기한 것과는 실질적으로 상이한 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 또한 TNFR 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전자 코드 및 종-특이적인 코돈 선호도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련자가 예를 들어, 특정 숙주에서 코돈 발현을 최적화하기 위해서(예를 들어, 사람 mRNA의 코돈을 이. 콜라이 같은 세균 숙주에 의해 선호되는 것으로 변화시키는 것), 상기 기술한 축퇴성 변이체를 생성시키는 것은 일상적인 일이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호 같은 기탁된 플라스미드내에 포함되는 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 핵산 분자는 상기-기술된 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하게 된다.
본 발명은 추가로 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열 또는 상기-기술된 기탁된 클론에 함유된 TNFR cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자, 또는 상기 서열 중 하나에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체를 사용한 원위치 하이브리드화(in situ hybridization)에 의한 유전자 맵핑 및 예를 들어, 노던 블롯 분석에 의한 사람 조직에서 TNFR 유전자의 발현 검출을 위한 탐침으로서 유용하다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열의 부분들을 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라 본원에 기술된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각각, 서열 1 및 3의 25 내지 924 위치 및 73 내지 582 위치로 이루어지는 서열 1 또는 3의 일부분을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 각각, 28 내지 924 위치 및 76 내지 582 위치로 이루어지는 서열 1 및 3의 일부분을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 아미노 말단 메티오닌이 결핍된 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 또한 제공되며, 이러한 폴리펩타이드는 각각, 서열 2 및 4의 2 내지 300 위치 및 2 내지 170 위치의 아미노산 서열을 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 다음과 같이 서열 1 및 3의 광범위한 부분과 관련된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다: HELDI06R(서열 17) 및 HCEOW38R(서열 18)은 서열 1 및 3 모두에 관련된다. 서열 19 또는 20, 또는 서열 19 또는 20의 서브 단편이 아닌 서열 1 및 3의 폴리펩타이드 단편이 바람직하다. HELDI06R 및 HCEOW38R의 서열은 도 6에 나타낸다.
보다 일반적으로, 기탁된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자의 단편이란 본원에서 언급된 바와 같이 진단용 탐침 및 프라이머로서 유용한 약 15nt 이상, 보다 바람직하게는 약 20nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30nt 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 약 40nt 이상의 길이의 단편을 나타낸다. 물론, 기탁된 cDNA, 또는 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 대부분에, (전부는 아니더라도), 상응하는 단편들인 경우, 본 발명에 따르는 50 내지 300nt 이상 길이의 보다 큰 단편도 또한 유용하다. 서열 1에 나타낸 500개의 연속한 뉴클레오타이드에 95% 이상 동일한 500개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 단편이 특히 바람직하다. 예를 들어, 20nt 이상의 단편이란 기탁된 cDNA의 뉴클레오타이드 서열, 또는 도 1 및 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열로부터 20개 이상 연속한 염기를 포함하는 단편을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 도 4 및 도 5에서 분리되고 하기에서 보다 상세히 기술되는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 엄격한 조건하에서 상기된 본 발명의 핵산 분자, 예를 들어, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유되는 cDNA 클론 중 폴리뉴클레오타이드 부분에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"이란 용액(50% 포름아미드, 5x SSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산 삼나트륨), 50mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20㎍/㎖ 변성, 전단된 연어 정자 DNA)중에서 42℃에서 밤새 항온처리하고, 약 65℃에서 0.1x SSC에서 필터를 세척하는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오타이드의 "일부분"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드란 참고 뉴클레오타이드의 약 15 뉴클레오타이드(nt) 이상, 보다 바람직하게는 약 20nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30nt 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 30 내지 70(예를 들어, 50)nt에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 중 하나)를 나타낸다. 이들은 상기 기술되었고 하기에 보다 상세히 기술되는 진단용 탐침 및 프라이머로서 유용하다.
"20nt 이상 길이"의 폴리뉴클레오타이드의 일부분이란, 예를 들어, 참고 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 기탁된 cDNA 또는, 도 1 또는 도 2(서열 1 또는 3)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열)의 뉴클레오타이드 서열로부터의 20개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 나타낸다. 물론, 폴리 A 서열(TNFR cDNA의 3' 말단 폴리(A) 영역) 또는 상보적인 T(또는 U) 잔기들의 연속물에만 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산의 일부분에 하이브리드화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중에 포함되지 않으며, 그러한 폴리뉴클레오타이드는 폴리(A) 연속물 또는 이의 상보적인 연속물(예를 들어, 실제적으로 모든 이중-쇄 cDNA 클론)을 포함하는 모든 핵산 분자에 하이브리드화하기 때문이다.
나타낸 바와 같이, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 그 자체로, 성숙한 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자; 성숙한 폴리펩타이드, 및 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열 같은 약 26 내지 35개 아미노산의 리더 또는 분비성 서열을 암호화하는 것과 같은 부가적인 서열들을 암호화하는 서열; 전술한 부가적인 암호화 서열과 함께 또는 이들 없이, 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따르는 핵산은 전사, 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 mRNA 가공, 예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정화에서 역할을 수행하는, 전사되지만 해독되지 않는 서열들과 같은, 예를 들어, 인트론 및 비암호화 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 부가적인 비-암호화 서열; 및 부가적인 기능성을 부여하는 것과 같은 부가적인 아미노산을 암호화하는 부가적인 암호화 서열을 함께 갖는 상기 단백질 서열을 또한 암호화한다.
따라서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 융합된 폴리펩타이드의 정제를 촉진하는 펩타이드를 암호화하는 서열 같은, 표지 서열(marker sequence)에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 양태의 특정한 바람직한 양태에서, 표지 아미노산 서열은 pQE 벡터(제조원: 퀴아젠, 인코포레이티드사(QIAGEN, Inc.), 캘리포니아주 91311, 차트스워드, 이톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그(tag) 같은 헥사-히스티딘 펩타이드이며, 다른 것들 중에, 다수가 시판중이다. 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 또 다른 펩타이드로서 정제에 유용하며, 문헌[Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)]에 기술되어 있다. 하기에서 언급되는 바와 같이, 기타 이러한 융합 단백질은 N- 또는 C-말단에서 Fc에 융합된 TNFR-5, -6α 및 -6β를 포함한다.
변이체 및 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 추가로 TNFR 폴리펩타이드의 부분들, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체들은 천연 대립유전자 변이체(allelic variant) 같이 천연적으로 발생할 수 있다. "대립유전자 변이체"란 유기체의 염색체 상의 주어진 좌위를 차지하는 한 유전자의 수 개의 대체 형태 중 하나를 나타낸다[Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 비-천연적으로 발생하는 변이체는 당해 분야에 공지된 돌연변이 유발 기술로 작제할 수 있다.
이러한 변이체는 뉴클레오타이드 치환, 결실 및 부가에 의해 작제된 것을 포함한다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오타이드와 연관될 수 있다. 변이체들은 암호화 영역, 비-암호화 영역 또는 둘 모두에서 변형될 수 있다. 암호화 영역에서의 변형은 보존적인 또는 비-보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 초래할 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 침묵(silent) 치환, 부가 및 결실이며, 이는 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 부분들의 특성 및 활성을 변형시키지 않는다. 또한 이와 관련하여, 특히 바람직한 것은 보존적 치환이다.
서열 2 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 성숙한 단백질 또는 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 TNFR 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 분자가 매우 바람직하다.
서열 2 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포외 도메인 또는 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 TNFR 아미노산 서열의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 분자가 가장 바람직하다.
추가의 양태는, (a) 서열 2 또는 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 각각, 서열 2 또는 4의 31 내지 300 위치 또는 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (c) 각각, 서열 2 및 4의 31 내지 283 위치 및 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)에서의 뉴클레오타이드 서열중 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는, 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에서 뉴클레오타이드 서열중 하나에 90% 이상, 및 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드화하는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기로만 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에는 하이브리드화하지 않는다. 본 발명의 부가적인 핵산 양태는 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에서 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 벡터 및 숙주 세포의 제조방법 및 재조합 기술에 의해 TNFR 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 참고 뉴클레오타이드 서열에 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드란, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이, TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 참고 뉴클레오타이드 서열의 각 100개 뉴클레오타이드 당 5개 미만의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 참고 서열과 동일함을 나타낸다. 다시 말해서, 참고 뉴클레오타이드 서열에 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해서는, 참고 서열 중 뉴클레오타이드의 5% 미만이 결실되거나 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 참고 서열 중 전체 뉴클레오타이드의 5% 미만의 수 많은 뉴클레오타이드가 참고 서열내로 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이러한 돌연변이들은 참고 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 참고 서열내 뉴클레오타이드 중에 상기 양 말단 사이의 임의의 위치에 개별적으로 산재하거나 참고 서열내에 하나 이상의 연속적인 그룹으로 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정한 핵산 분자가 예를 들어, 도 1 또는 도 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열에 대해 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한가 하는 것은 베스트피트 프로그램(Bestfit program)(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트피트 프로그램은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)]의 국부적인 상동성 알고리즘을 사용하여 두 개의 서열 사이의 상동성이 가장 높은 단편을 찾아낸다. 베스트피트 또는 기타 서열 배열 프로그램을 사용하여, 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따르는 참고 서열에 95%의 동일성이 있는지를 결정하는 경우, 물론 변수들이 설정되며, 결과적으로 동일성의 퍼센트는 참고 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 대해 계산되며 참고 서열 중 전체 뉴클레오타이드 수의 5% 미만의 상동성 차이는 허락된다.
본 출원은, 이들이 TNFR 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는지에 관계 없이, 도 1 또는 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열에 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이는, 특정한 핵산 분자가 TNFR 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는다 해도, 당해 분야의 숙련자는 예를 들어, 하이브리드화 탐침 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 상기 핵산 분자를 사용하는 방법을 공지하고 있기 때문이다. TNFR 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도는, 무엇보다도, 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); and Northern Blot analysis for detecting TNFR mRNA expression in specific tissues]에 기술된 바와 같이, (1) cDNA 라이브러리에서 TNFR 유전자 또는 이의 대립유전자 변이체의 분리; (2) TNFR 유전자의 정확한 염색체상 위치를 제공하기 위한 유사분열 중기 염색체 판에 대한 원위치 하이브리드화 (예를 들어, "FISH")를 포함한다.
그러나, 사실상, TNFR 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 도 1 또는 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열에 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 핵산 분자가 바람직하다. "TNFR 활성을 갖는 폴리펩타이드"란 특정 생물학적 분석법에서 측정되는 바와 같이, 본 발명의 TNFR-6α 또는 -6β 단백질의 성숙한 형태 또는 세포외 형태의 활성에 대해 유사한 활성을 나타내지만, 필수적으로 동일하지는 않은 폴리펩타이드를 나타낸다. TNF 패밀리 리간드는 본 발명의 TNFR-6α 및 -6β를 포함하는, TNF-패밀리 수용체에 결합함으로써 다양한 세포성 반응을 유도한다. TNFR 단백질을 발현하는 세포들은 B 임파구(CD19+), CD4 및 CD8+ T 임파구, 단핵구 및 내피 세포를 포함하는 TNFR-I 수용체 리간드에 잠재적인 세포성 반응을 하는 것으로 인식되고 있다. "TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응"이란 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 세포, 세포주, 조직, 조직 배양물 또는 환자에 대한 유전형적, 표현형적 및/또는 형태학적 변화를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 이러한 세포성 반응은 TNF-패밀리 리간드에 대한 정상적인 생리학적 반응 뿐만 아니라 증가된 세포 증식 또는 어팝토시스의 억제에 의한 것과 같은 증가된 세포 증식의 억제와 연관된 질병을 포함한다.
전술한 것에 대한 스크리닝 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. 한 가지 그러한 스크리닝 분석법은 예를 들어, 문헌[Science 246:181-196 (October 1989)]에서 기술된 바와 같이, 수용체 활성화에 의해 야기된 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템에서 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, 형질감염된 CHO 세포)의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, TNF-패밀리 리간드는 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 발현시키는 세포와 접촉할 수 있고, 2차 메신저 반응, 예를 들어, 신호 전달 또는 pH 변화를 측정하여 TNFR 폴리펩타이드가 활성인지를 결정할 수 있다.
물론, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 당해 분야의 통상의 숙련자는, 기탁된 cDNA의 핵산 서열, 또는 도 1 또는 도 2(서열 1 및 3)에서 나타낸 핵산 서열에 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 수많은 핵산 분자가 "TNFR 단백질 활성을 갖는" 폴리펩타이드를 암호화할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 사실, 이러한 뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체 모두가 동일한 폴리펩타이드를 암호화하기 때문에, 이는 당해 분야의 숙련자에게 상기 기술된 비교 분석법을 수행해보지 않고도 명백할 것이다. 추가로, 축퇴성 변이체가 아닌 그러한 핵산 분자에 있어서, 합리적인 수가 TNFR 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드를 또한 암호화할 것이라는 것은 당해 분야에서 인식될 것이다. 이는, 하기에서 추가로 기술되는 바와 같이, 당해 분야의 숙련자는 단백질 기능에 거의 또는 완전히, 현저하게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환(예를 들어, 지방족 아미노산의 제2 지방족 아미노산으로의 대체)에 대해 완전히 숙지하고 있기 때문이다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터를 사용하여 유전자 조작한 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 TNFR 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 제조에 관한 것이다. 상기 벡터는 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스성 또는 레트로바이러스성 벡터일 수 있다. 레트로바이러스성 벡터는 복제 수용성 또는 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보충성 숙주 세포에서만 일어난다.
폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 증식을 위한 선택성 표지(selectable marker)를 함유하는 벡터에 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 칼슘 포스페이트 침전물 같은 침전물로 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 이는 적합한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징한 후 숙주 세포내로 형질도입할 수 있다.
DNA 삽입물은, 몇 개를 언급하자면, 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜라이 lac, trp, phoA 및 tac 프로모터, SV40 early 및 late 프로모터 및 레트로바이러스성 LTR의 프로모터 같은, 적합한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 기타 적합한 프로모터는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
발현 작제물은 추가로 전사 개시 부위, 전사 종결 부위 및, 전사된 영역에서, 해독을 위한 리보솜 결합 부위를 함유한다. 상기 작제물에 의해 발현된 전사체의 암호화 부분은 바람직하게는 시작 부위에서 해독 개시 코돈 및 해독되는 폴리펩타이드의 말단에 적합하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 표지를 포함한다. 이러한 표지는 진핵 세포 배양에 있어서, 디하이드로폴레이트 리덕타제, G418 또는 네오마이신 내성 및 이. 콜라이 및 기타 세균에 배양에 있어서, 테트라사이클린, 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적합한 숙주의 대표적인 예는 이. 콜라이, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포 같은 세균 세포; 효모 세포 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 같은 곤충 세포; CHO, COS, 293 및 보웨스 흑색종 세포 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기-기술된 숙주 세포를 위한 적합한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 공지되어 있다. 세균에서 사용되는 바람직한 벡터 중에는 pQE70, pQE60, pQE-9(제조원: 퀴아젠사, 상기됨); Phagescript 벡터, Bluscript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(제조원: 스트라진사(Stratagene)); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(제조원: 파마시아사(Pharmacia))가 포함된다. 바람직한 진핵 벡터 중에는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(제조원: 스트라타진사); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(제조원: 파마시아사)가 포함된다. 기타 적합한 벡터는 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명백할 것이다. 작제물을 숙주 세포로 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질감염법, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염법, 양이온성 지질-매개된 형질감염법, 전기천공법, 형질도입법, 감염 또는 기타 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 많은 표준 실험 매뉴얼[예를 들어, Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)]에 기술되어 있다. 폴리펩타이드는 융합 단백질 같은 개질된 형태로 발현될 수 있으며, 분비성 신호 뿐만 아니라 부가적인 이형성 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부가적인 아미노산의 영역, 특히 하전된 아미노산을 폴리펩타이드의 N-말단에 부가하여 정제 또는 후속적인 처리 및 저장 동안, 숙주 세포내에서의 안정성 및 지속성을 개선시킬 수 있다. 또한, 펩타이드 잔기들을 폴리펩타이드에 부가하여 정제를 촉진할 수 있다. 이러한 영역은 폴리펩타이드의 최종 제조 단계에 앞서 제거할 수 있다. 분비 및 배출을 유도하고, 안정성을 개선시키며 정제를 촉진하기 위해서 펩타이드 잔기를 폴리펩타이드에 부가하는 것은 당해 분야에서는 친숙하고 일상적인 기술들이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 안정화시키고 정제하는데 유용한 면역글로불린 기원의 이형 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[EP-A-O 제464 533호(캐나다 특허 제2045869호)]는 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분과 사람의 다른 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 융합 단백질을 기술하고 있다. 수많은 경우에서, 융합 단백질 중 Fc 부분은 치료 및 진단에서의 용도로 매우 유리하며, 결과적으로 예를 들어, 약동학적 특성의 개선을 초래한다[EP-A 제0232 262호]. 한편, 특정 용도에 있어서, 융합 단백질이 기술된 유리한 방식으로 발현되고, 검출되고 정제된 후 Fc 부분을 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 이는 Fc 부분이 치료 및 진단에서 사용시 방해가 되는 경우, 예를 들어, 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용되는 경우이다. 약제 개발에서, 예를 들어, hIL-5 같은 사람 단백질은 hIL-5의 길항제를 분리하기 위한 고-원료 처리량 스크리닝 분석법(high-throughput screening assay)의 목적을 위해 Fc 부분과 융합된다. 문헌 참조[D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) and K. Johnson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)].
TNFR 단백질은 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록시라파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는, 널리-공지된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 가장 바람직하게는, 고 성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제를 위해 사용된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 체액, 조직 및 직접적으로 분리되거나 배양된 세포를 포함하는 천연 공급원으로부터 정제된 생성물; 화학적 합성 방법의 생성물; 및 예를 들어, 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 방법에 사용된 숙주에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실화되거나 되지 않을 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 특정의 경우에, 숙주-매개된 가공의 결과로서, 개질된 개시 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 및 단편
본 발명은 추가로, 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 서열 2 및 4의 아미노산 서열을 갖는 분리된 TNFR 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드의 일부를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다.
변이체 및 돌연변이체 폴리펩타이드
TNFR 폴리펩타이드의 특성을 개선하거나 변형시키기 위해서, 단백질 공학을 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 단독 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 융합 단백질을 포함하는 신규한 돌연변이 단백질, 즉 "뮤테인(mutein)"을 제조할 수 있다. 이러한 개질된 폴리펩타이드는 예를 들어, 강화된 활성 및 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 부가적으로, 이들은 특정 정제 및 저장 조건하에서 고수율로 정제되며 상응하는 천연 폴리펩타이드 보다 향상된 가용성을 나타낼 수 있다.
N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이체
예를 들어, 막 결합 단백질 또는 분비된 단백질의 성숙한 형태의 세포외 도메인을 포함하는 많은 단백질에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 N-말단 또는 C-말단으로부터 실질적인 생물학적 기능의 손실없이 결실될 수 있다는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993)]은 3, 8 또는 27개 아미노 말단 아미노산이 결실되어도 헤파린 결합 활성을 갖는 개질된 KGF 단백질을 보고하고 있다. 본원의 경우, 본 발명의 단백질이 TNFR 폴리펩타이드 패밀리의 구성원이기 때문에, 서열 2 및 4(TNFR-6α 및 -6β)의 49번 위치의 시스테인 전까지의 N-말단 아미노산 결실은 증식 조절 및 임파구 세포의 어팝토시스 같은 특정 생물학적 활성을 유지시킬 수 있다. 서열 2 및 4의 C49 잔기를 포함하는 추가의 N-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드는 이러한 생물학적 활성을 유지하리라고 예견될 수 없으며, 이는, TNFR-관련 폴리펩타이드에서 이러한 잔기들은 수용체 결합 및 신호 전달에 필요한 구조적인 안정성을 제공하는 이황화 결합을 형성하는데 필요한 것으로 공지되어 있기 때문이다.
그러나, 단백질의 N-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능의 손실이라는 변형을 초래한다고 해도, 기타 생물학적 활성은 여전히 유지될 수 있다. 따라서, 완전한 단백질 또는 세포외 도메인의 대다수 잔기가 N-말단으로부터 제거되지 않는 경우라면, TNFR 단백질의 완전한 또는 세포외 도메인을 인식하는 항체를 유도하고/하거나 결합하는 상기 단축된 단백질의 능력은 일반적으로 유지될 것이다. 완전한 단백질의 N-말단 잔기가 결핍된 특정 폴리펩타이드가 이러한 면역 활성을 유지하는가 하는 것은 본원에 기술되고 그렇지 않은 경우 당해 분야에 공지된 일상적인 방법으로 용이하게 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 서열 2 및 4에 나타낸 TNFR의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 (49번 위치의 시스테인 잔기 전까지 결실된) 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특히, 본 발명은 각각, 서열 2 및 4의 잔기 m 내지 300 및 n 내지 170의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-5 폴리펩타이드를 제공하며, 이때 m 및 n은 1 내지 49 범위의 정수이며, 49는 TNFR-6α 및 -6β 단백질의 활성에 필요한 것으로 간주되는 완전한 TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드(각각, 서열 2 및 4로 나타냄)의 N-말단으로부터의 첫 번째 시스테인 잔기의 위치이다.
보다 특히, 본 발명은 하기 잔기의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다: 서열 2의 1 내지 300, 2 내지 300, 3 내지 300, 4 내지 300, 5 내지 300, 6 내지 300, 7 내지 300, 8 내지 300, 9 내지 300, 10 내지 300, 11 내지 300, 12 내지 300, 13 내지 300, 14 내지 300, 15 내지 300, 16 내지 300, 17 내지 300, 18 내지 300, 19 내지 300, 20 내지 300, 21 내지 300, 22 내지 300, 23 내지 300, 24 내지 300, 25 내지 300, 26 내지 300, 27 내지 300, 28 내지 300, 29 내지 300, 30 내지 300, 31 내지 300, 32 내지 300, 33 내지 300, 34 내지 300, 35 내지 300, 36 내지 300, 37 내지 300, 38 내지 300, 39 내지 300, 40 내지 300, 41 내지 300, 42 내지 300, 43 내지 300, 44 내지 300, 45 내지 300, 46 내지 300, 47 내지 300, 48 내지 300, 및 49 내지 300; 및 서열 4의 1 내지 170, 2 내지 170, 3 내지 170, 4 내지 170, 5 내지 170, 6 내지 170, 7 내지 170, 8 내지 170, 9 내지 170, 10 내지 170, 11 내지 170, 12 내지 170, 13 내지 170, 14 내지 170, 15 내지 170, 16 내지 170, 17 내지 170, 18 내지 170, 19 내지 170, 20 내지 170, 21 내지 170, 22 내지 170, 23 내지 170, 24 내지 170, 25 내지 170, 26 내지 170, 27 내지 170, 28 내지 170, 29 내지 170, 30 내지 170, 31 내지 170, 32 내지 170, 33 내지 170, 34 내지 170, 35 내지 170, 36 내지 170, 37 내지 170, 38 내지 170, 39 내지 170, 40 내지 170, 41 내지 170, 42 내지 170, 43 내지 170, 44 내지 170, 45 내지 170, 46 내지 170, 47 내지 170, 48 내지 170및 49 내지 170. 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다.
유사하게, 생물학적으로 기능성 C-말단 결실 뮤테인의 수 많은 예가 공지되어 있다. 예를 들어, 인터페론 감마는 단백질의 카복실 말단으로부터 8 내지 10개 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 10배까지의 보다 높은 활성을 나타낸다[Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)]. 본원의 경우, 본 발명의 단백질이 TNFR 폴리펩타이드 패밀리의 구성원이기 때문에, 각각, 서열 2 및 4의 193 및 132 위치의 시스테인 전까지의 C-말단 아미노산의 결실은 증식 조절 및 임파구 세포의 어팝토시스 같은 특정 생물학적 활성을 유지시킬 수 있다. 각각, 서열 2 및 4의 193 및 132번 위치의 시스테인을 포함하는 추가의 C-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드는 이러한 생물학적 활성을 유지하리라고 예견되지 않으며, 이는, TNF 수용체-관련 폴리펩타이드에서 이러한 잔기들은 수용체 결합에 필요한 구조적 안정성을 제공하는 이황화 결합을 형성하는 필요하다고 공지되어 있기 때문이다.
그러나, 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실이 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능의 개질을 초래한다고 해도, 기타 생물학적 활성은 여전히 유지될 수 있다. 따라서, 단백질의 완전한 또는 성숙한 형태의 대다수의 잔기가 C-말단으로부터 제거되지 않는 한, 단백질의 완전한 또는 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 항체에 결합하는 단축된 단백질의 능력은 유지될 것이다. 완전한 단백질의 C-말단 잔기가 결핍된 특정 폴리펩타이드가 그러한 면역학적 활성을 유지하는가 하는 것은 본원에서 기술되고, 그밖의 당해 분야에서 공지된 일상적인 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 각각, 서열 2 및 4에 나타낸 TNFR-6α 및 -6β의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 서열 2 및 4의 193 및 132 위치의 시스테인까지의 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특히, 본 발명은 각각 서열 2 및 4의 아미노산 서열의 1 내지 y 및 1 내지 z 잔기의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공하며, 이때 y는 193 내지 300 범위내의 임의의 정수이며 z는 132 내지 170의 범위내의 임의의 정수이다. 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다.
본 발명은 또한, 아미노 말단 및 카복실 말단으로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 제공하며, 이는 일반적으로 서열 2의 m 내지 y 잔기 및 서열 4의 n 내지 z 잔기를 갖는 것으로서 기술될 수 있고, 이때 m, n, y 및 z는 상기한 바와 같은 정수이다.
또한, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 일부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드가 포함되며, 이때 이러한 일부분은 각각, ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터의 1 내지 약 49개 아미노산 또는 각각, ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터의 1 내지 약 107개 또는 58개 아미노산, 또는 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열의 상기 아미노 말단 및 카복시 말단 결실의 혼합물을 제외한다. 상기 결실 돌연변이체 폴리펩타이드 형태 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다.
기타 돌연변이체
상기 언급된 단백질의 말단 결실 형태에 부가하여, TNFR 폴리펩타이드의 특정 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 현저한 영향을 주지 않고 다양할 수 있다는 것은 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 또한 인식될 것이다. 서열에서의 이러한 차이점이 의도된 경우, 활성을 결정하는 단백질 상의 중요한 영역이 있을 것이라는 것을 상기해야만 한다.
따라서, 본 발명은 추가로 실질적인 TNFR 폴리펩타이드 활성을 나타내거나 하기 언급되는 바와 같은 단백질 부분들과 같은 TNFR 단백질의 영역들을 포함하는 TNFR 폴리펩타이드의 변형들을 포함한다. 이러한 돌연변이체들은 활성에 거의 영향을 미치지 않는 한, 당해 분야에 공지된 일반 법칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역위, 반복 및 유형 치환을 포함한다. 예를 들어, 표현형적으로 침묵 아미노산 치환을 제조하는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Sustitutions", Science 247:1306-1310 (1990)]에서 제공되며, 상기 문헌의 저자들은 아미노산 서열 변화에 대한 내성을 연구하는 두 가지 주요한 방법이 있음을 지적한다. 제1 방법은 진화 과정에 따른 것으로, 돌연변이는 자연 선택에 의해 수용되거나 거부된다는 것이다. 제2 방법은 유전공학을 이용하여 클론된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하고, 기능성을 유지하는 서열을 분리하기 위해서 선택 및 스크리닝을 사용하는 것이다. 또한, 저자들의 주장과 같이, 이러한 연구들은 단백질이 아미노산 치환에 대해 놀라울 정도의 내성이 있음을 밝혀냈다. 저자들은 추가로 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서는 허용되기도 한다는 것을 지적한다. 예를 들어, 대부분의 내부 아미노산 잔기들은 비극성 측쇄를 요구하는 반면, 표면 측쇄의 특성은 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 기타 이러한 표현형적으로 침묵 치환은 문헌[상기, Bowie, J.U. et al]에 기술되어 있으며, 본원에 참조로 인용된다. 전형적으로 나타나는 보존성 치환은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 사이의 서로간의 교체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향성 잔기 Phe 및 Tyr 사이의 교체이다. 따라서, 서열 2, 4 또는 6의 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는, (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되거나 되지 않는 것일 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (iii) 성숙한 또는 가용성 세포외 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜) 같은 기타 화합물과 융합되는 것, 또는 (iv) IgG Fc 융합 영역 펩타이드, 리더 서열, 분비 서열, 또는 폴리펩타이드 또는 프로-단백질 서열의 상기 형태의 정제를 위해 사용되는 서열 같은, 부가적인 아미노산이 상기 폴리펩타이드에 융합되는 것일 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 단편, 유도체 및 동족체가 본원의 교시의 범위내에 있는 것으로 생각할 것이다.
따라서, 본 발명의 TNFR는 천연 돌연변이 또는 사람의 조작에 의한, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 나타낸 바와 같이, 변화는 단백질의 폴딩(folding) 또는 활성에 현저한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환 같은, 보다 작은 특성이 바람직하다(표 1 참조).
보존성 아미노산 치환
방향성 페닐알라닌, 트립토판, 티로신
소수성 루이신, 이소루이신, 발린
극성 글루타민, 아스파라긴
염기성 아르기닌, 리신, 히스티딘
산성 아스파르트산, 글루탐산
소형 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글리신
본 발명의 TNFR 단백질에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위-지시된 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발 같은 당해 분야에서 공지된 방법으로 분리할 수 있다[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]. 후자의 방법은 분자내 잔기 마다 단독 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이후, 수득되는 돌연변이체 분자를 수용체 결합 또는 생체내 또는 시험관내 증식 활성에 대해 시험한다.
특히 흥미로운 것 중에는 하전된 아미노산을, 보다 낮은 응집 같은 매우 바람직한 개선된 특성을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 다른 하전된 또는 중성 아미노산으로 치환하는 것이다. 응집체는 면역원성일 수 있기 때문에, 응집은 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 약제학적 제형을 제조하는 경우 문제가 유발될 수 있다[Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Theapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)].
아미노산 교체는 또한 리간드의 세포 표면 수용체에 대한 결합의 선택도를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993)]은 두 개의 공지된 유형의 TNFR 수용체 중 하나에만 TNF-α의 선택적인 결합을 초래하는 특정 돌연변이를 기술하고 있다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화도 표지화 같은 구조적 분석으로 결정할 수 있다[Smith et al.,J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)].
TNFR-6α 및 -6β는 TNF 수용체-관련 단백질 패밀리의 구성원이기 때문에, TNFR의 생물학적 활성을 완전히 제거하기 보다는 개질시키기 위해서는, 바람직하게는 돌연변이는 TNFR 보존된 세포외 도메인, 보다 바람직하게는 TNFR 수용체 패밀리의 구성원 사이에서 보존되지 않는 이러한 영역내의 잔기에서 아미노산을 암호화하는 서열 중에서 수행된다. 또한, 본 발명의 일부를 형성하는 것은 상기 TNFR 돌연변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 실질적으로 정제된다. 재조합적으로 생성된 TNFR 폴리펩타이드는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)]에 기술된 1-단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 당해 분야에서 단백질 정제에 대해 널리 공지된 방법들로 항-TNFR-6α 및 -6β 항체를 사용하여 천연 또는 재조합 공급원으로부터 정제할 수 있다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 2 또는 4에 나타낸 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치에서 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; 또는 (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 TNFR 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 추가의 폴리펩타이드는 상기 기술된 것에 대해 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 및 보다 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 유사성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 서열 2 또는 4의 폴리펩타이드에 대해 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 것을 포함하며, 또한 30개 이상 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상 아미노산을 갖는 상기 폴리펩타이드의 일부분을 포함한다.
두 개의 폴리펩타이드에 있어서 "% 유사성"이란 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 및 유사성을 결정하기 위한 디폴트 셋팅(default setting)을 사용하여 두 개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 비교함으로써 생성되는 유사성 점수를 나타낸다. 베스트피트는 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981]의 국부적인 상동성 알고리즘을 사용하여 두 개의 서열 사이의 상동성이 가장 높은 단편을 찾아낸다.
TNFR 폴리펩타이드의 참고 아미노산 서열에 대해, 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 아미노산을 갖는 폴리펩타이드란, TNFR 폴리펩타이드의 참고 아미노산의 100개 아미노산 당 5개 미만의 아미노산 변형이 포함될 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 참고 서열과 동일함을 나타낸다. 다시 말해서, 참고 아미노산 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해서는, 참고 서열 중 5% 미만의 아미노산 서열 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 참고 서열 중 전체 아미노산 잔기의 5% 미만의 아미노산 수가 참고 서열에 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이러한 변형은 참고 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단에서, 또는 참고 서열 중 잔기들 사이에서 개별적으로 산재하여 또는 참고 서열 중 하나 이상의 연속적인 그룹으로서 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩타이드가 서열 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대해 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한가 하는 것은 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트피트 또는 임의의 기타 서열 배열 프로그램을, 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 참고 서열에 대해 95% 동일한가를 결정하는데 사용하는 경우, 물론, 변수들이 설정되며, 결과적으로 동일성에 대한 퍼센트가 완전한 길이의 참고 아미노산 서열에 대해 계산되며 참고 서열 중 전체 수의 아미노산에 5% 미만의 상동성에서의 차이는 허락된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 당해 분야에서 숙련자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 또는 분자 체 겔 여과 컬럼 상에서 분자량 표지로서 사용할 수 있다.
하기 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용할 수 있으며, 이들 항체는 하기 기술되는 바와 같은 TNFR 단백질 발현 또는 TNFR 단백질 기능을 강화시키거나 억제하는 효능제 및 길항제를 검출하는 분석법에서 유용하다. 추가로, 이러한 폴리펩타이드는 효모의 2-하이브리드 시스템에서, 또한 본 발명에 따른 후보 효능제 및 길항제일 수 있는 TNFR 단백질에 결합하는 단백질을 "찾아내는데" 사용할 수 있다. 효모 2-하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Mature 340:245-246 (1989)]에 기술되어 있다.
에피토프-형성 부분
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 폴리펩타이드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부분으로서 정의된다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로서 정의된다. 하나의 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수 보다 더 적다. 예를 들어, 문헌 참조[Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)].
항원성 에피토프를 형성하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 한 영역을 포함하는 것)를 선택하는데 있어서, 단백질 서열의 일부를 모방하는 상대적으로 짧은 합성 펩타이드가 부분적으로 모방된 단백질과 반응하는 항-혈청을 일반적으로 유도할 수 있다는 것은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 참조[Sutcliffe, J. G., Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A.(1983) "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science, 219:660-666]. 단백질-반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩타이드는 종종 단백질의 1차 서열로서 나타내고, 일련의 단순한 화학적 법칙으로 특성화될 수 있으며, 온전한 단백질의 면역 우위 영역(즉, 면역원성 에피토프)나 아미노 또는 카복실 말단에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프-형성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체를 포함하는, 항체들을 생성시키는데 유용하다. 예를 들어, 문헌 참조[Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) at 777].
본 발명의 항원성 에피토프-형성 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중에 포함된 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상 및 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 아미노산의 서열을 포함한다. TNFR-특이적인 항체를 생성하는데 사용할 수 있는 항원성 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 무제한적인 예는, 서열 2의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 및 약 Ala-283 내지 약 Pro-298; 및 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 약 Glu-86 내지 약 His-106, 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 약 His-129 내지 약 Val-138, 및 약 Gly-142 내지 약 Pro-166으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드 단편들은 상기 도 4 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 제임슨-울프 항원 지수(Jameson-Wolf antigenic index)의 분석에 의해, TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드의 항원성 에피토프를 형성하는 것으로 확인된다.
본 발명의 에피토프-형성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 임의의 통상적인 수단으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 참조[Houghten, R.A. (1985) "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135]; 상기 "동시 다중 펩타이드 합성(SMPS)" 방법은 추가로 문헌[Houghten 등, 미국 특허 제4,631,211호 (1986)]에서 기술된다.
본 발명의 에피토프-형성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 따라서 항체를 유도하는데 사용된다. 예를 들어, 문헌 참조[상기, Sutcliffe et al.; 상기, Wilson et al.; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; and Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)]. 본 발명의 면역원성 에피토프-형성 펩타이드, 즉, 전체 단백질이 면역원인 경우 항체 반응을 유도하는 단백질의 상기 부분은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 분리된다. 예를 들어, 문헌 참조[상기, Geysen et al.]. 추가로, 문헌[미국 특허 제5,194,392호, Geysen (1990)]은 관심있는 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프(즉, "미모토프")에 대한 위상학적 등가물인 단량체(아미노산 또는 기타 화합물)의 서열을 검출하고 결정하는 일반적인 방법을 기술하고 있다. 보다 일반적으로, 문헌[미국 특허 제4,333,092호, Geysen (1989)]은 관심있는 특정 수용체의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 위상학적 등가물인 단량체의 서열을 검출하고 결정하는 방법을 기술하고 있다. 유사하게, 문헌[미국 특허 제5,480,971호, Houfhten, R.A. et al. (1996) on peralkylated Oligopeptide Mixtures]은 선형 C1-C7-알킬 과알킬화 올리고펩타이드 및 이러한 펩타이드의 세트 및 라이브러리 뿐만 아니라 관심있는 수용체 분자에 우선적으로 결합하는 과알킬화 올리고펩타이드의 서열을 결정하기 위한 상기 올리고펩타이드 세트 및 라이브러리의 사용 방법을 기술하고 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프-형성 펩타이드의 비-펩타이드성 동족체도 또한 이러한 방법에 의해 일상적으로 제조될 수 있다.
융합 단백질
당해 분야의 숙련자는, 상기 기술된 본 발명의 TNFR 폴리펩타이드 및 이의 에피토프-형성 단편이 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부분과 혼합되어, 키메라 폴리펩타이드를 형성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 융합 단백질은 정제를 촉진하고 생체내에서 반감기를 증가시킨다. 이는 예를 들어, 사람 CD40-폴리펩타이드의 첫 번째 두 개의 도메인 및 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 도메인으로 이루어지는 키메라 단백질에서 나타난다[EP A 제394,827호; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)]. IgG 부분으로 인해 이황화-결합된 이중체 구조를 갖는 융합 단백질은 또한, 단량체성 TNFR 단백질 또는 단백질 단편 단독에 비해 기타 분자에 결합하고 이를 중화하는데 있어서 보다 효과적일 수 있다[Fountoulakis et al., J. Biolchem. 270:3958-3964 (1995)].
항체
본 발명에서의 용도를 위한 TNFR-단백질 특이적인 항체는 온전한 TNFR-6α 및 -6β 단백질 또는 이의 항원성 폴리펩타이드 단편에 대해 생성될 수 있으며, 이는 알부민 같은 담체 단백질과 함께, 또는 충분히 긴 경우(약 25 아미노산 이상), 담체 없이, 동물계(예를 들어, 래빗 또는 마우스)에 도입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"(Ab) 또는 "모노클로날 항체"(Mab)는 온전한 분자뿐만 아니라, TNFR 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍된 것으로, 순환계에서 보다 빨리 제거되며, 온전한 항체의 비-특이적인 조직 결합이 보다 적어질 수 있다[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)]. 따라서, 이러한 단편이 바람직하다.
본 발명의 항체는 임의의 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, TNFR 단백질 또는 이의 항원성 단편을 발현하는 세포를 동물에 투여하여 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생성을 유도할 수 있다. 바람직한 방법에서, TNFR 단백질의 제조물을 제조하고 정제하여 실질적으로 천연 오염물이 비함유되도록 정제한다. 이후, 이러한 제조물을 동물에 도입하여 보다 큰 특이적인 활성의 폴리클로날 항혈청을 생성한다.
가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다[Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., (1981) pp. 563-681]. 일반적으로, 이러한 방법들은 TNFR 단백질 항원 또는, 보다 바람직하게는 TNFR 단백질-발현 세포를 사용하여 동물(바람직하게는 마우스)을 면역화시키는 것과 관련된다. 적합한 세포는 항-TNFR-6α 또는 -6β 단백질 항체에 결합하는 이의 수용능에 의해 인식될 수 있다. 이러한 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다; 그러나, 10% 송아지 태아 혈청(약 56℃에서 불활성화시킴), 비필수 아미노산 10g/l, 페니실린 약 1,000U/㎖ 및 스트렙토마이신 약 100㎍/㎖를 보충시킨, 얼스 개질된 이글스 배지(Earle's modified Eagle's medium)에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 상기 마우스의 비장 세포를 추출하고 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 임의의 적합한 골수종 세포주를 본 발명에 따라 사용할 수 있다; 그러나, 메릴랜드주 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수 가능한, 모 골수종 세포주(SP20)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 수득되는 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선택적으로 유지시킨 후, 문헌[Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)]에 기술된 바와 같이 희석도를 제한함으로써 클론화시킨다. 상기 선택을 통해 수득된 하이브리도마 세포를 바람직한 TNFR 항원과 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 분리하기 위해서 분석한다.
대안적으로, TNFR 항원에 결합할 수 있는 부가적인 항체를 항-유전자형 항체를 사용하는 2-단계 방법으로 제조할 수 있다. 상기 방법은 항체 그 자체가 항원이며, 따라서 제2 항체에 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 사실을 활용한다. 상기 방법에 따라서, TNFR 단백질 특이적인 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킨다. 상기 동물의 비장 세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 제조한 후 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 TNFR 단백질-특이적인 항체에 결합하는 이의 능력이 TNFR 단백질 항원에 의해 차단될 수 있는 항원을 생성하는 클론을 분리한다. 상기 항체는 TNFR 단백질-특이적인 항체에 대한 항-유전자형 항체를 포함하며 동물을 면역화하여 추가로 TNFR 단백질-특이적인 항체의 형성을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 Fab, F(ab')2 및 기타 단편들이 본원에 기술된 방법에 따라서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 단편들은 전형적으로, 파파인(Fab 단편을 제조하기 위해서) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 제조하기 위해서) 같은 효소를 사용하여 단백질 가수분해적인 절단으로 제조된다. 대안적으로, TNFR 단백질-결합 단편들은 재조합 DNA 기술 또는 합성 화학을 적용하여 제조할 수 있다.
사람에서 항-TNFR의 생체내 용도를 위해서, "사람 면역화된" 키메라 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 상기 기술된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유도되는 유전자 작제물을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 벙법은 당해 분야에 공지되어 있다. 문헌 참조[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)].
면역계-관련 질환
진단
본 발명자들은 TNFR-6α 및 -6β가 조혈 조직 및 형질전환된 조직에서 발현된다는 것을 발견하였다. 수많은 면역계-관련 질환에 있어서, TNFR 유전자 발현의 실질적으로 변화된(증가된 또는 감소된) 수준은, "표준" TNFR 유전자 발현 수준, 즉, 면역계 질환에 걸리지 않은 개인로부터의 면역계 조직 또는 체액에서의 TNFR 발현 수준에 비해, 상기 질환에 걸린 개체로부터 취한 면역계 조직, 기타 세포 또는 체액(예를 들어, 혈청 및 혈장)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 면역계 질환의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공하며, 이는 개체로부터의 면역계 조직, 기타 세포 및 체액에서 TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 유전자 발현 수준을 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 비교하는 것과 관련되며, 이때, 표준과 비교하여 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 면역계 질환의 지표가 된다.
특히, 암에 걸린 포유류에서 특정 조직들은 상응하는 "표준" 수준과 비교해 볼 때, TNFR 단백질 및 TNFR 단백질을 암호화하는 mRNA의 현저하게 감소된 수준을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 추가로, TNFR 단백질의 감소된 수준은 암에 걸리지 않은 동일 종의 포유류로부터의 혈청과 비교하여, 암에 걸린 포유류로부터의 특정 체액(예를 들어, 혈청 및 혈장)에서 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 암을 포함하는 면역계 질환의 진단 동안 진단 방법을 제공하며, 이는 개체로부터의 면역계 조직, 기타 세포 또는 체액에서 TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 유전자 발현 수준을 표준 TNFR 유전자 발현 수준과 비교하는 것과 관련되며, 이때, 표준과 비교해서 상기 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 면역계 질환의 지표가 된다.
종양 진단을 포함하는 면역계 질환의 진단이 통상적인 방법들에 따라서 수행되는 경우, 본 발명은 예후 지표(prognostic indicator)로서 유용하며, 이에 따라 감소된 유전자 발현을 나타내는 환자는 표준 수준에 보다 근접한 수준으로 상기 유전자를 발현하는 환자에 비해 보다 나쁜 임상적 결과를 경험하게 될 것이다.
"TNFR 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 분석하는 것"이란 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하고 평가함으로써) 또는 간접적으로 (예를 들어, 제2 생물학적 샘플에서의 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준과 비교함으로써), 제1 생물학적 샘플에서 TNFR-6α 및/또는 -6β 단백질 수준 또는 TNFR-6α 및/또는 -6β 단백질을 암호화하는 mRNA 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하고 평가하는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 제1 생물학적 샘플에서 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하고 표준 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준과 비교하며, 이때, 표준은 면역계 질환에 걸리지 않은 개체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플로부터 수득된 또는 면역계 질환에 걸리지 않은 개체 집단으로부터의 수준을 평균하여 측정된 것이다. 당해 분야에서 인식될 수 있는 바와 같이, 표준 TNFR 단백질 수준 또는 mRNA 수준이 공지되면, 이를 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.
"생물학적 샘플"이란 개체, 체액, 조직 배양물, 또는 TNFR 단백질 또는 mRNA를 함유하는 기타 공급원으로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 생물학적 샘플은 TNFR 단백질의 유리된 세포외 도메인(들)(또는 가용성 형태(들))을 함유하는 체액(혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 수액), 면역계 조직, 및 TNFR의 완전한 또는 세포외 도메인을 발현하는 것으로 확인된 기타 조직 공급원을 포함한다. 포유동물로부터 조직 절편 및 체액을 수득하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 생물학적 샘플이 mRNA을 포함하는 경우, 조직 절편이 바람직한 공급원이다.
본 발명은 또한 TNFR 유전자 돌연변이를 진단하기 위한 본 발명의 유전자의 용도를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이가 본 발명의 유전자 중 하나에 존재하는 경우, 조건들은 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 생성의 결핍으로부터 기인하게 된다. 추가로, 수용체 폴리펩타이드 활성을 강화시키는 돌연변이는 수용체 폴리펩타이드의 과발현과 관련된 질환, 예를 들어, 내독소 쇼크를 초래한다. 상기 유전자들에서의 돌연변이는 정상 유전자 서열과 결함 유전자 서열을 비교함으로써 검출할 수 있다. 후속적으로 돌연변이 유전자가 질환 상태 또는 질환 상태에 대한 감수성과 관련이 있다는 것을 입증할 수 있다. 즉, 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 과발현을 초래하는 돌연변이 유전자가 종양 성장을 억제시키는 TNF의 불활성화와 관련이 있을 것이다.
전술한 분석법에 의해 진단될 수 있는 기타 면역계 질환은 과감작화, 알레르기, 감염 질환, 이식 대 숙주 질환, 면역결핍, 자가면역 질환 등을 포함한다.
본 발명의 유전자 돌연변이를 가진 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다. 진단에 사용되는 핵산은 혈액, 뇨, 타액 및 기타 조직 사이의 조직 절편 같은 환자의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈성 DNA는 검출에 직접적으로 사용되거나 분석에 앞서 PCR[Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)]을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA도 또한 동일한 목적에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 본 발명의 사람 유전자 중 돌연변이를 분리하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실물 및 삽입물은 정상적인 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 본 발명의 방사능 표지된 RNA 또는 대안적으로, 안티센스 DNA 서열에 하이브리드화시킴으로써 분리할 수 있다. 완전히 일치하는 서열은 RNase A 절단 또는 융점 온도 차이에 의해 일치하지 않는 이중체로부터 구별할 수 있다. 이러한 진단은 출생전 또는 신생아 테스트에 특히 유용하다.
참고 유전자 및 "돌연변이체" 사이의 서열 차이는 직접적인 DNA 서열 분석법으로 결정할 수 있다. 부가적으로, 클론된 DNA 단편을 탐침으로 사용하여 특정한 DNA 단편을 검출할 수 있다. 이러한 방법의 민감성은 PCR과 혼용하는 경우 크게 향상된다. 예를 들어, 제1 서열 분석은 이중쇄 PCR 생성물 또는 개질된 PCR 생성물에 의해 생성된 단일쇄 주형 분자를 사용한다. 서열 결정은 방사능 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 통상적인 방법 또는 형광성 태그를 사용하는 자동화 서열 분석법으로 수행한다.
특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호 같은 뉴클레아제 보호 분석법 또는 화학적 절단 방법[예를 들어, Cotton et al., PNAS, 85:4397-4401 (1985)] 으로 결정할 수 있다.
생물학적 샘플에서 TNFR 단백질 수준의 분석은 항체-기초 기술들을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 조직에서의 TNFR 단백질 발현은 전통적인 면역조직학 방법으로 연구할 수 있다[Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)]. TNFR 유전자 발현을 검출하기 위한 기타 항체-기초 방법들은 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA) 및 방사성면역분석법(RIA) 같은 면역분석법을 포함한다. 적합한 항체 분석 표지는 당해 분야에 공지되어 있으며 글루코스 옥시다제 같은 효소 표지, 및 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc) 같은 방사성 동위원소, 및 플루오레세인 및 로다민 같은 형광성 표지, 및 바이오틴을 포함한다.
개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TNFR 단백질 수준을 분석하는 것에 부가적으로, TNFR 단백질은 또한 영상화에 의해 생체내에서 검출될 수 있다. TNFR 단백질의 생체내 영상화를 위한 항체 표지(antibody label) 또는 표지(marker)는 X-방사선 사진술, NMR 또는 ESR에 의해 검출할 수 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, X-방사선 사진술에 있어서, 적합한 표지는 바륨 또는 세슘 같은 방사선 동위원소를 포함하여, 이들은 검출할 수 있는 방사선을 방출하지만, 피사체에 명백히 유해하지는 않다. NMR 및 ESR을 위한 적합한 표지는 중수소(deuterium) 같은 검출할만한 특징적인 각운동량(spin)을 갖는 것들을 포함하며, 이는 관련 하이브리도마를 위한 영양소를 라벨링시킴으로써 항체내로 도입할 수 있다.
방사선 동위원소(예를 들어,131I,112In,99mTc), 방사성-불투명 물질, 또는 핵 자기 공명으로 검출할 수 있는 물질 같은 적합한 검출할 수 있는 영상화 잔기로 표지된 TNFR-특이적인 항체 또는 항체 단편을 면역계 질환에 대해 시험하고자 하는 포유류에 도입(예를 들어, 비경구적으로, 피하내로, 또는 복강내로)한다. 사용되는 피사체 및 영상화 시스템의 크기는 진단성 영상을 생성하는데 필요한 영상화 잔기의 양을 결정하게 된다는 것은 당해 분야에서 이해될 것이다. 방사성 동위원소 잔기의 경우, 사람 피사체에 있어서, 주입되는 방사능의 양은 일반적으로99mTc 약 5 내지 20 밀리퀴리(mCμ)의 범위이다. 이후, 표지된 항체 또는 항체 단편은 TNFR 단백질을 함유하는 세포의 위치에서 우선적으로 축적된다. 생체내 종양 영상화는 문헌[S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments"(Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기술되어 있다.
처리
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 리간드는 세포독성, 항-바이러스 활성, 면역조절 활성, 및 수 개의 유전자의 전사 조절을 포함하는, 가장 다발성인 사이토킨에 속하는 것으로 공지되어 있다[Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities," Symp. Quant. Biol. 51:597-609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., and Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57:505-518(1988); Old, L.J., Sci. Am. 258:59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285:199-224 (1991)]. TNF-패밀리 리간드는 TNFR-패밀리 수용체에 결합함으로써 상기 다양한 세포성 반응을 유도한다. TNFR 폴리펩타이드를 발현하고 TNFR-6α 및 -6β 리간드에 대한 잠재적인 세포성 반응을 하는 세포는 임파구, 내피 세포, 케라틴 생성 세포 및 전립선 조직을 포함한다. "TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응"이란 TNFR-패밀리 리간드에 의해 유도되는 세포, 세포주, 조직, 조직 배양물 또는 환자에 대한 임의의 유전자형, 표현형, 및/또는 형태학적 변화를 의미한다. 나타낸 바와 같이, 이러한 세포성 반응은 TNFR-패밀리 리간드에 대한 정상적인 생리학적 반응 뿐만 아니라 증가된 어팝토시스 또는 어팝토시스의 억제와 관련된 질환을 포함한다.
증가된 세포 생존, 즉 어팝토시스의 억제와 관련된 질환은 암(여포 임파종, p53 돌연변이 관련 암, 및 유방암, 전립선암, 카포시 유종 및 난소암 같은 호르몬-의존성 종양); 자가면역 질환(전신계 홍반성 적혈구종증, 면역-관련 사구체신염 및 류마티스성 관절염) 및 바이러스 감염(포진 바이러스, 두진 바이러스 및 아데노바이러스), 이식 대 숙주 질환, 급성 이식 거부 및 만성 이식 거부를 포함한다. 증가된 어팝토시스 관련 질환은 AIDS; 신경 퇴행성 질환(알츠하이머 질환, 파킨슨씨 질환, 근위축성 측색 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 퇴화); 척수 이형성 증후군(재생불량성 빈혈증), 허혈성 손상(심근경색, 쇼크 및 재관류 손상에 의해 야기되는 질환), 독소-유도된 간 질환(알콜에 의해 야기되는 질환), 패혈성 쇼크, 악액질 및 식욕부진을 포함한다.
따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 어팝토시스를 강화시키는 방법에 관한 것이며, 이는 TNFR 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 유효량의 TNFR 폴리펩타이드, 동족체 또는 TNFR 매개된 신호전달을 증가시키는 능력이 있는 효능제를 투여하는 것과 관련이 있다. 바람직하게는, TNFR 매개된 신호전달은 감소된 어팝토시스가 나타나는 질환을 치료하기 위해서 증가된다. 길항제는 TNFR의 가용성 형태 및 TNFR 폴리펩타이드에 대해 지시되는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다.
"효능제"란 어팝토시스를 증가시키거나 강화시킬 수 있는 천연 및 합성 화합물을 나타낸다. "길항제"란 어팝토시스를 억제시킬 수 있는 천연 및 합성 화합물을 나타낸다. 임의의 본 발명의 "효능제" 또는 "길항제"가 어팝토시스를 강화시키거나 억제할 수 있는가 하는 것은 하기에 보다 상세히 기술되는 것을 포함하여, 당해 기술 분야-공지된 TNFR-패밀리 리간드/수용체 세포성 반응 분석법을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 한 가지 스크리닝 방법은 본 발명의 수용체를 발현시키기 위해서 형질감염시킨 흑색소 세포의 사용과 관련이 있다. 상기 스크리닝 기술은 문헌[PCT WO 92/01810, published February 6, 1992]에 기술되어 있다. 상기 분석법은 예를 들어, 수용체를 암호화하는 흑색소 세포를 TNF-패밀리 리간드 및 후보 길항제(또는 효능제) 둘 모두와 함께 접촉시킴으로써 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제(또는 강화)하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 리간드에 의해 생성되는 신호의 억제 또는 강화는 상기 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 효능제임을 나타낸다.
기타 스크리닝 기술은 예를 들어, 문헌[Science 246:181-296, October 1989]에 기술된 바와 같이, 수용체 활성화에 의해 야기되는 세포외 pH 변화를 측정하는 시스템 내에서 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, 형질감염된 CHO 세포)를 사용하는 것과 관련이 있다. 예를 들어, 화합물을 본 발명의 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 접촉시키고, 제2 메신저 반응, 예를 들어, 신호 전달 또는 pH 변화를 측정하여, 잠재적인 화합물이 수용체를 활성화시키거나 억제하는지를 결정할 수 있다.
또 다른 스크리닝 기술은 수용체를 암호화하는 RNA를 제노푸스(Xenopus) 난소 세포에 도입하여 일시적으로 수용체를 발현시키는 것과 관련이 있다. 이후, 수용체 난소 세포를 수용체 리간드 및 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시키고, 수용체 활성을 억제하리라 생각되는 화합물의 스크리닝의 경우, 칼슘 신호의 억제 또는 활성화를 검출할 수 있다.
또 다른 스크리닝 기술은 수용체를 포스포리파제 C 또는 D에 결합시킨 작제물을 세포에서 발현시키는 것과 관련이 있다. 상기 세포는 내피 세포, 평활근 세포, 신장 배아 세포 등을 포함한다. 스크리닝은 포스포리파제 신호로부터 수용체의 활성화 또는 활성화의 억제를 검출함으로써 상기 기술된 바와 같이 달성할 수 있다.
또 다른 방법은 표면에 수용체를 갖는 세포에 표지된 리간드가 결합하는 것을 억제하는지를 결정함으로써 본 발명의 수용체 폴리펩타이드의 활성화를 억제하는 길항제 화합물을 스크리닝하는 것과 관련된다. 상기 방법은 진핵 세포에 수용체를 암호화하는 DNA를 형질감염시키고, 결과적으로 세포가 이의 표면에 수용체를 발현하게 한 후 세포를 공지된 리간드의 표지된 형태의 존재하에 화합물과 접촉시키는 것과 관련이 있다. 리간드를 예를 들어, 방사능으로 표지할 수 있다. 수용체에 결합된 표지된 리간드의 양을 예를 들어, 수용체의 방사능을 측정함으로써 측정한다. 수용체에 결합하는 표지된 리간드의 감소에 의해 측정되는 바와 같이, 화합물이 수용체에 결합하는 경우, 표지된 리간드의 수용체에 대한 결합은 억제된다.
본 발명의 효능제 및 길항제에 대한 추가의 스크리닝 분석법은 문헌[Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992)]에 기술되어 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 스크리닝 방법은 후보 효능제 또는 길항제가 TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응을 강화시키거나 억제시킬 수 있는지를 결정하기 위해서 제공된다. 상기 방법은 TNFR 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 후보 화합물 및 TNF-패밀리 리간드와 접촉시키고, 세포성 반응을 분석한 후, 세포성 반응을 표준 세포성 반응과 비교하는 것과 관련되고, 표준 세포성 반응은 후보 화합물의 부재하에 리간드와 접촉시켜 분석되며, 이때, 표준에 비해 증가된 세포성 반응은 후보 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 효능제임을 나타내며 표준에 비해 감소된 세포성 반응은 후보 화합물이 리간드/수용체 신호전달 경로의 길항제임을 나타낸다. "세포성 반응을 분석하는 것"이란 후보 화합물 및/또는 TNF-패밀리 리간드에 대한 세포성 반응을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것(예를 들어, T 세포 증식 또는 3중수소화된 티미딘 표지화에서 증가 또는 감소를 결정하거나 평가하는 것)을 의미한다. 본 발명에 의해, TNFR 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 내인성 또는 외인성으로 투여되는 TNF-패밀리 리간드와 접촉할 수 있다.
본 발명에 따른 효능제는 예를 들어, TNF-패밀리 리간드 펩타이드 단편, 형질전환성 성장 인자, 신경전달물질(글루타메이트, 도파민, N-메틸-D-아스파르테이 트), 종양 억제 인자(p53), 세포용해성 T 세포 및 항-대사산물 같은 천연 및 합성 화합물을 포함한다. 바람직한 효능제는 예를 들어, 시스플라틴, 독소루비신, 블레오마이신, 시토신 아라비노사이드, 질소 머스타드, 메톡트렉세이트 및 빈크리스틴 같은 화학요법 약제를 포함한다. 기타는 에탄올 및 -아밀로이드 펩타이드를 포함한다[Science 267:1457-1458 (1995)]. 추가로 바람직한 효능제는 TNFR 폴리펩타이드에 대해 지시된 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 TNF-패밀리 수용체에 대해 지시된 효능제 항체는 문헌[Tartaglia, L.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9292-9296 (1991); and Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992)]]에 기술되어 있다. 또한, 문헌 참조[PCT 출원 WO 제94/09137호].
본 발명에 따른 길항제는 예를 들어, CD40 리간드, 중성 아미노산, 아연, 에스트로겐, 안드로겐, 바이러스성 유전자(아데노바이러스 ElB, 배쿨로바이러스 p35 및 IAP, 우두 바이러스 crmA, 엡스타인-바르 바이러스 BHRF1, LMP-1, 아프리카 돼지 열병 바이러스 LMW5-HL, 및 포진 바이러스 yl 34.5), 칼페인 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 및 종양 프로모터(PMA, 페노바비탈, 및 -헥사클로로사이클로헥산) 같은 천연 및 합성 화합물을 포함한다. 기타 길항제는 TNFR 폴리펩타이드 및 이의 단편에 대해 지시된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 이의 단편을 포함한다. TNF-패밀리 수용체에 대해 지시된 상기 길항제 항체는 문헌[Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992) and Tartaglia, L.A. et al., Cell 73:213-216 (1993)]에 기술되어 있다. 또한, 문헌 참조[PCT 출원 WO 제94/09137호].
기타 잠재적인 길항제는 안티센스 분자를 포함한다. 안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 3중체-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들어, 문헌[Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]에 기술되어 있다. 3중체-나선 형성은 예를 들어, 문헌[Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); and Dervan et al., Science 251:1360 (1991)]에 기술되어 있다. 상기 방법들은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드의 결합에 기초하고 있다.
예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 암호화 부분을 사용하여 길이 약 10 내지 40 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오타이드를 전사와 관련된 유전자의 영역에 상보적으로 디자인하여 수용체의 전사 및 생성을 예방한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 생체내에서 mRNA와 하이브리드화시켜 mRNA 분자의 수용체 폴리펩타이드로의 해독을 차단한다. 상기한 올리고뉴클레오타이드를 또한 세포내로 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 수용체 생성을 억제하도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 추가의 길항제는 TNFR의 가용성 형태, 즉, 완전한 길이의 수용체의 세포외 영역으로부터의 리간드 결합 도메인을 포함하는 TNFR 단편을 포함한다. 수용체의 상기 가용성 형태는 천연 또는 합성적으로 형성될 수 있으며, TNF-패밀리 리간드에 대한 결합에 있어서 세포 표면 TNFR과 경쟁함으로써 TNFR 매개된 신호전달을 길항한다. 따라서, 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 가용성 형태는 TNF-패밀리 리간드에 의해 유도되는 종양 괴사를 억제할 수 있는 신규한 사이토킨이다. 기타 상기의 사이토킨은 당해 분야에 공지되어 있으며 Fas 리간드에 의해 유도되는 어팝토시스를 억제하는 생리학적 활성이 있는 Fas B(마우스 Fas 수용체의 가용성 형태)를 포함한다[Hughes, D.P. and Crispe, I.N., J. Exp. Med. 182:1395-1401 (1995)].
나타낸 바와 같은 본 발명에 따른 폴리클로날 및 모노클로날 항체 효능제 또는 길항제는 문헌[Tartaglia, L.A., and Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304-4307 (1992); Tartaglia, L.A. et al., Cell 73:213-216(1993), and PCT 출원 WO 제94/09137호]에 기재된 방법에 따라 생성시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체"(Ab) 또는 "모노클로날 항체"(mAb)는 온전한 분자 뿐만 아니라 항원과 결합할 수 있는 이의 단편들(예를 들어, Fab 및 F(ab')2)을 포함함을 의미한다. Fab 및 F(ab')2단편들은 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍되어 있고, 순환계로부터 보다 빨리 제거되며, 온전한 항체의 비-특이적인 조직 결합이 보다 적어질 수 있다[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)].
본 발명에 따른 항체는 상기 기술되고, 당해 분야에 공지된 다양한 방법 중 하나로 제조할 수 있다.
세포외 도메인에 결합하는 단백질 및 기타 화합물도 또한 본 발명에 따른 후보 효능제 및 길항제이다. 상기 결합하는 화합물은 효모 2-하이브리드 시스템을 사용하여 "찾아낼" 수 있다[Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989)]. 효모 2-하이브리드 시스템의 개질된 방법이 문헌[Roger Brent and his colleagues, Gyuris, J. et al., Cell75:791-803 (1993); Zervos, A.S. et al., Cell 72:223-232 (1993)]에 기술되어 있다.
"TNF-패밀리 리간드"란 TNF 수용체 패밀리의 한 구성원에 결합하여 리간드/수용체 신호전달 경로를 유도할 수 있는 천연, 재조합 및 합성 리간드를 나타낸다. TNF 리간드 패밀리의 구성원은 TNFR-6α 및 -6β 리간드, TNF-α(LT-α, 또한 TNF-β로도 공지됨), LT-β, FasL, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, TRAIL 및 신경 성장 인자(NGF)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 대표적인 치료학적 적용은 하기에 보다 상세히 언급된다. AIDS로 정의되는 면역결핍 상태는 CD4+T-임파구의 수 및 기능 감소에 따르는 속발성이다. 최근 보고들은 매일 3.5X 107및 2X 109세포 정도의 CD4+T 세포가 손실되는 것으로 평가하고 있다[Wei X., et al., Nature 373:117-122 (1995)]. HIV 감염시 CD4+T 세포의 고갈의 한 가지 원인은 HIV-유도된 어팝토시스인 것으로 인식된다. 진정, HIV-유도된 어팝토시스성 세포 사멸은 시험관내에서 뿐만 아니라 보다 중요하게는, 감염된 개체에서 입증되었다[Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213 (1994); Finkel, T.H., and Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615 (1995); Muro-Cacho, C.A. et al., J. Immunol. 154:5555-5566 (1995)]. 추가로, 어팝토시스 및 CD4+T-임파구 고갈은 AIDS의 상이한 동물 모델에서 밀접하게 상관 관계가 있으며[Brunner, T., et al., Nature 373:441-444 (1995); Gougeon, M.L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)], 어팝토시스는, 바이러스 복제가 AIDS를 초래하지 않는 동물 모델에서는 관찰되지 않는다[Gougeon, M.L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)]. 추가의 데이터는 감염되지는 않았지만 HIV-감염된 개체로부터 프라임되거나 활성화된 T-임파구는 TNF-패밀리 리간드 FasL과 조우한 후 어팝토시스를 진행한다는 것을 나타낸다. HIV 감염에 이어 사멸에 이르는 단핵구 세포주를 사용하여, HIV에 의한 U937 세포의 감염은 FasL의 신규 발현을 초래하며 FasL은 HIV-유도된 어팝토시스를 매개한다는 것을 입증되었다[Badley, A.D. et al., J. Virol. 70:199-206 (1996)]. 추가로, TNF-패밀리 리간드는 비감염된 대식 세포에서 검출할 수 있으며 HIV 감염 후, 상승 조절되어 비감염된 CD4 T-임파구의 선택적인 파괴를 초래한다[Badley, A.D. et al., J. Virol. 70:199-206 (1996)]. 따라서, 본 발명에 의해, HIV+개체를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 본 발명의 길항제를 투여하여 CD4 T-임파구의 선택적인 파괴를 감소시키는 것과 관련이 있다. 투여 방식 및 투여량은 하기 보다 상세히 기술한다.
이인자형 이식 거부에서, 수혜자 동물의 면역계는 이전에 프라임되어 있지 않으며, 이는 대부분에 있어서 면역계는 주위 항원에 의해서만 프라임되기 때문이다. 동일 종의 다른 구성원들로부터의 조직은 예를 들어, 바이러스 및 세균이 나타나는 것과 같은 동일한 방식으로 나타나지 않는다. 이인자형 이식 거부의 경우, 면역억제 식이를 디자인하여 면역계가 효과기 단계에 도달하는 것을 예방한다. 그러나, 이종이식 거부의 면역 특성은 이인자형 이식 거부 보다 질환 재발을 닮을 수 있다. 질환 재발의 경우, 면역계는 천연 섬 세포의 파괴에 의해 입증되는 바와 같이, 이미 활성화되어 있다. 따라서, 질환 재발에서 면역계는 이미 효과기 단계에 있게 된다. 활성화되어 효과기 세포로 분화된 임파구는 TNFR 폴리펩타이드를 발현하게 되고, 결과적으로 TNFR 활성을 강화시키는 화합물에 감수성이 되기 때문에, 본 발명의 효능제는 이인자형 이식 및 이종 이식 모두에 대해 면역계를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 면역 특권 조직을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 길항제는 추가로 염증성 장 질환의 치료에 사용될 수 있다.
제형
TNFR 폴리펩타이드 조성물은 적합한 의료 업무와 일관된 방식으로, 개체 환자의 임상적 조건(특히, TNFR-6α 또는 -6β 폴리펩타이드 단독 처리의 부작용), TNFR 폴리펩타이드 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 개업의에게 공지된 기타 요인들을 고려하면서, 제형화되고 투여된다. 따라서, 본원의 목적상 "유효량"의 TNFR 폴리펩타이드는 상기 사항들에 의해 결정된다.
일반 명제로서, 투여량 당 비경구적으로 투여되는 전체 약제학적으로 유효량의 TNFR 폴리펩타이드는, 상기 한 바와 같이, 치료학적 재량에 따르지만, 환자 체중의 약 1㎍/㎏/일 내지 10㎎/㎏/일의 범위이다. 보다 바람직하게는, 상기한 바와 같이, 0.01㎎/㎏/일 이상이며, 가장 바람직하게는, 사람에 있어서, 상기 호르몬에 대해서 약 0.01 및 1㎎/㎏/일의 범위이다. 연속적으로 공급되는 경우, TNFR 폴리펩타이드는 전형적으로, 1일 당 1 내지 4회의 주입 또는 예를 들어, 소형 펌프를 사용한 지속적인 피하 주입물에 의해 약 1㎍/㎏/시간 내지 약 50㎍/㎏/시간의 투여 속도로 투여된다. 정맥내 백 용액(bag solution)을 또한 사용할 수 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 반응에 대한 치료 후 간격은 목적하는 효과에 따라 다양하게 나타난다.
본 발명의 TNFR 함유 약제학적 조성물은 경구적으로, 직장내로, 비경구적으로, 조내로, 질내로, 복막내로, 국부적으로(산제, 연고제, 점적제 또는 경피 첩포제로서), 구강으로, 또는 경구 또는 비내 분무제로서 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"란 임의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 제피 물질 또는 제형화 보조제를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "비경구적"은 정맥내, 근육내, 복막내, 흉골내, 피하내 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여의 형태를 나타낸다.
TNFR 폴리펩타이드는 또한 서방성 시스템에 의해 적합하게 투여된다. 서방성 조성물의 적합한 예는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 반-투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 폴리락타이드[미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제58,481호], L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)], 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)[R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), and R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트[R. Langer et al., Id.] 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산[EP 제133,988호]를 포함한다. 서방성 TNFR 폴리펩타이드 조성물은 또한 리포좀 결합된 TNFR 폴리펩타이드를 포함한다. TNFR 폴리펩타이드를 함유하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법들에 의해 제조된다[DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허원 제83-118008호; 미국 특허 제4,4485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호]. 통상적으로, 리포좀은, 지질 함량이 최적의 TNFR 폴리펩타이드 치료를 위해 조절되는 선택된 비율인, 콜레스테롤 약 30몰% 이상인 작은(약 200 내지 800Å) 단일막 유형이다.
비경구적 투여에 있어서, 한 가지 양태에서, TNFR 폴리펩타이드는 이를 바람직한 순도로 단위 투여량 주사 가능한 형태(용제, 현탁제 또는 에멀션화제)로, 약제학적으로 허용되는 담체, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며 제형의 기타 성분과 적합성이 있는 것과 혼합함으로써 제형화된다. 예를 들어, 제형은 바람직하게는 산화제 및 폴리펩타이드에 유해한 것으로 공지된 기타 화합물을 포함하지 않는다.
일반적으로, 제형은 TNFR 폴리펩타이드를 균일하게 및 친밀하게 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이 둘 모두와 접촉시킴으로써 제조된다. 이후, 경우에 따라, 상기 생성물을 바람직한 제형으로 성형시킨다. 바람직하게는 담체는 비경구적 담체이며, 보다 바람직하게는 수혜자의 혈액과 등장성인 용액이다. 상기 담체 비히클의 예는 물, 염수, 링게르액, 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 리포좀 뿐만 아니라 비휘발성유 및 에틸 올레에이트 같은 비수성 비히클이 또한 본원에서 유용하다.
담체는 적합하게 등장성 및 화학적 안정성을 강화시키는 물질 같은 소량의 부가제를 포함한다. 상기 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 석시네이트, 아세트산 같은 완충액, 및 기타 유기산 또는 이의 염; 아스코르브산 같은 산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩타이드; 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨 같은 당 알콜; 나트륨 같은 대이온; 및/또는 폴리솔베이트, 폴록사머, 또는 PEG 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
TNFR 폴리펩타이드는 전형적으로 상기 비히클 중에서, pH 약 3 내지 8에서, 약 0.1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 10㎎/㎖의 농도에서 제형화된다. 전술한 부형제, 담체, 또는 안정화제의 특정 용도는 TNFR 폴리펩타이드 염의 형성을 초래한다는 것을 이해할 것이다.
치료학적 투여를 위해서 사용되는 TNFR 폴리펩타이드는 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과막(예를 들어, 0.2미크론 막)을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료학적 TNFR 폴리펩타이드 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트(access port)를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 분용할 수 있는, 마개를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알내에 보관된다.
TNFR 폴리펩타이드는 일반적으로 단독 또는 다수-투여 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 또는 바이알내에, 수용액 또는 재구성을 위한 동결 건조된 제형으로서 저장된다. 동결 건조된 제형의 한 예로써, 10-㎖ 바이알을 멸균-여과된 1%(w/v) TNFR 폴리펩타이드 수용액 5㎖로 채우고, 생성되는 혼합물을 동결 건조시킨다. 주입 용액은 동결 건조된 TNFR 폴리펩타이드를 미생물 생장 억제된 주사용수를 사용하여 재구성함으로써 제조한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩(pack) 또는 키트를 제공한다. 상기 용기들과 관련하여, 약제 또는 생물학적 생성물의 제조원, 사용 또는 시판을 규제하는 정부기관에 의해 규정된 형태의 통지가 있을 수 있으며, 상기 통지는 사람 대상 투여를 위한 제조원, 사용 또는 시판에 대한 상기 기관의 승인을 반영한다. 부가적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 기타 치료학적 화합물과 혼용할 수 있다.
염색체 분석법
본 발명의 핵산 분자는 또한 염색체 분리에 유용하다. 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되거나 하이브리드화할 수 있다. 추가로, 염색체 상의 특정 부위를 분리하고자 하는 최근 필요성이 있다. 현재 염색체 위치 표지를 위해 유용한 실질적인 서열 데이터(반복 다형성) 상에 기초한 염색체 표지 제제는 거의 없다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNA 맵핑은 질환 관련 유전자와 상기 서열을 상호연계시키는 첫 번째 중요한 단계이다.
이와 관련하여 특정한 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 cDNA는 TNFR 단백질 유전자의 게놈성 DNA를 클로닝하는데 사용된다. 이는 널리 공지된 다양한 기술 및 라이브러리를 사용하여 달성되며, 상기 기술 및 라이브러리는 상업적으로 시판중이다. 이후, 게놈성 DNA를 상기 목적을 위한 널리 공지된 기술을 사용하여 원 위치 염색체 맵핑에 사용한다.
부가적으로, 특정한 경우, 서열을 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는, 15 내지 25bp)를 작제함으로써 염색체에 맵핑할 수 있다. 상기 유전자의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여, 게놈성 DNA에서 엑손 하나 보다 더 길지 않은 프라이머들을 선택하며, 따라서 증폭 방법을 복잡하게 만든다. 이후, 이들 프라이머들을 개개의 사람 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 유사분열 중기판에 대한 cDNA의 형광 원 위치 하이브리드화("FISH")를 사용하여 한번의 단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 내지 60bp 정도의 짧은 cDNA로부터의 탐침과 함께 사용할 수 있다. 상기 기술의 문헌 참조[Verma et al., Human Chromosomes: A manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)].
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 맵핑 데이터와 함께 상호 관련될 수 있다. 상기 데이터는 예를 들어, 존스 홉킨스 대학교, 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온-라인으로 유용한 문헌[V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man]에서 발견된다. 동일한 염색체 영역에 맵핑되는 유전자와 질환 사이의 상호관계는 연관 분석(물리적으로 인접한 유전자들의 공 유전성)을 통해 이후에 확인된다.
다음, 병에 걸린 개체 및 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈성 서열에서 차이점을 결정할 필요가 있다. 돌연변이가 병에 걸린 개체의 일부 또는 전부로부터 관찰되지만 정상적인 개체에서는 관찰되지 않는 경우, 상기 돌연변이가 상기 질환의 원인일 수 있다.
본 발명을 전반적으로 기술하면서, 상기 내용은 다음의 실시예들을 참고로 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 예증을 위한 수단으로 제공되며 이에 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 이. 콜라이에서 TNFR-6α 및 -6β의 발현 및 정제
세균 발현 벡터 pQE60을 본 실시예에서 세균 발현을 위해 사용한다(제조원: 퀴아젠, 인코포레이티드사, 캘리포니아주 91311, 차트스워드, 이톤 애비뉴 9259). pQE60은 암피실린 항생제 내성("Ampr")을 암호화하며 세균성 복제 오리진("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위("RBS"), 상기 퀴아젠, 인코포레이티드사가 판매하는 니켈-니트릴로-트리-아세트산("Ni-NTA") 친화도 수지를 사용하는 친화도 정제를 가능하게 하는 히스티딘 잔기를 암호화하는 6개 코돈, 및 적합한 단일 제한 효소 절단 부위들을 포함한다. 이러한 요소들은 배열되어 결과적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편이, 상기 폴리펩타이드의 카복실 말단에 공유결합적으로 연결된 6개 His 잔기(즉, "6X His 태그")를 갖는 폴리펩타이드를 생성하는 방식으로 삽입될 수 있다. 그러나, 본 실시예에서, 폴리펩타이드 암호화 서열이 삽입되어 결과적으로 6개의 His 코돈의 해독이 방해되며, 따라서, 상기 폴리펩타이드는 어떠한 6X His 태그를 사용하여 제조할 수 없다.
TNFR-6α 및 -6β 아미노산 서열의 성숙한 형태를 포함하는 TNFR-6α 및 -6β 단백질의 바람직한 부분들을 암호화하는 DNA 서열을, TNFR-6α 및 -6β 단백질의 바람직한 부분의 아미노 말단 서열 및 cDNA 암호화 서열에 대해 기탁된 3' 작제물 중 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 기탁된 cDNA 클론으로부터 증폭시킨다. pQE60 벡터 중에 클로닝을 촉진하는 제한 부위를 함유하는 부가적인 뉴클레오타이드를 각각, 5' 및 3' 서열에 부가한다.
TNFR-6α 단백질의 성숙한 형태를 클로닝하기 위해서, 5' 프라이머는 밑줄친 NcoI 제한 부위를 함유하는 서열 5' CGCCCATGGCAGAAACACCCACCTAC 3'(서열 19)를 갖는다. 물론, 당해 분야의 통상의 숙련자는, 5' 프라이머가 시작하는 단백질 암호화 서열의 위치는 성숙한 형태보다 더 짧거나 보다 더 긴 완전한 단백질의 바람직한 부분을 증폭하기 위해서 다양할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 3' 프라이머는 밑줄친 HindIII 제한 부위를 함유하는 서열 5'CGCAAGCTTCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 20)을 갖는다. TNFR-6β 단백질의 성숙한 형태를 클로닝하기 위해서, 5' 프라이머는 상기 서열 19의 서열을 갖고, 3' 프라이머는 밑줄친 HindIII 제한 부위를 함유하는 서열 5' CGCAAGCTTCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3'(서열 21)을 갖는다.
증폭된 TNFR-6α 및 -6β DNA 단편 및 벡터 pQE60은 NcoI 및 HindIII로 절단한 후, 함께 연결시킨다. TNFR-6α 및 -6β DNA의 제한 절단된 pQE60벡터내로의 삽입은 이와 관련된 종결 코돈을 포함하는 TNFR-6α 및 -6β 단백질 암호화 영역을 IPTG-유도성 프로모터 및 개시하는 AUG를 갖는 틀로부터 하류에 위치시킨다. 관련된 종결 코돈은 삽입 지점의 하류의 6개 히스티딘 코돈의 해독을 방해한다.
상기 연결 혼합물을 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 기술된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 수용능 이. 콜라이에 형질전환시킨다. lac 리프레서를 발현하고 카나마이신 내성("Kanr")을 주는 다수의 플라스미드 pREP4를 함유하는, 이. 콜라이 균주 M15/rep4는 본원에 기술된 예증적인 실시예를 수행하는데 사용된다. 상기 균주는 TNFR-6α 및 -6β 단백질을 발현하는데 적합한 수 많은 균주 중 하나이며, 상기 퀴아젠, 인코포레이티드사로부터 상업적으로 구입 가능하다. 형질전환체는 암피실린 및 카나마이신의 존재하에 LB 플레이트에서 성장하는 이의 능력에 의해 분리된다. 플라스미드 DNA는 내성 클론으로부터 분리되며 클론된 DNA의 동정은 제한 분석, PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 확인된다.
바람직한 작제물을 함유하는 클론은 암피실린(100㎍/㎖) 및 카나마이신(25㎍/㎖) 모두로 보충된 LB 배지에서 액체 배양으로 밤새("O/N") 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 약 1:25 내지 1:250의 희석으로, 큰 배양에 접종한다. 세포는 600㎚에서 흡광도("OD600") 0.4 내지 0.6까지 성장시킨다. 이후, 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노사이드("IPTG")를 최종 농도 1mM로 부가하여, lacI 리프레서를 불활성화시킴으로써, lac 리프레서 민감성 프로모터로부터의 전사를 유도한다. 세포를 후속적으로 추가로 3 내지 4시간 동안 배양한다. 이후, 세포를 원심분리시켜 수득한다.
TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드를 정제하기 위해서, 이후, 세포를 4℃에서 pH 8의 6M 구아니딘-HCl 중에서 교반시킨다. 세포 분쇄물을 원심분리시켜 제거하고, TNFR-6α 및 -6β를 함유하는 상등액을 200mM NaCl를 보충시킨, pH 6의 50mM Na-아세테이트 완충액으로 투석한다. 대안적으로, 상기 단백질을 연속적으로, 프로테아제 억제제를 함유하는 500mM NaCl, 20% 글리세롤, 25mM Tris/HCl(pH 7.4)로 투석시켜 다시 폴딩(folding)시킬 수 있다. 탈변성 후, 단백질을 이온 교환, 소수성 상호작용 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 대안적으로, 항체 컬럼 같은 친화도 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제된 TNFR-6α 및 -6β 단백질을 수득할 수 있다. 정제된 단백질을 4℃에 보관하거나 -80℃에서 냉동시킨다.
하기 대안적인 방법을 사용하여, TNFR-6α 및 -6β가 봉입체 형태로 존재하는 경우, 이. 콜라이에서 발현된 상기 단백질을 정제할 수 있다. 특별히 구체화하지 않는 한, 모든 하기 단계들은 4 내지 10℃에서 수행된다.
이. 콜라이 발효의 생산 단계를 완료한 후, 세포 배양물을 4 내지 10℃로 냉각시키고, 세포를 15,000rpm에서 지속적인 원심분리로 수득한다(Heraeus Sepatech). 세포 페이스트 단위 중량 당 예견되는 단백질 수율 및 요구되는 정제된 단백질의 양에 기초하여, 중량 당 적합한 세포 페이스트의 양을 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 함유하는 완충액 용액 중에 현탁시킨다. 세포를 고 전단 혼합기를 사용하여 균질한 현탁액으로 분산시킨다.
이후, 4000 내지 6000psi에서 미세유동화기(제조원: Microfuidics, Corp. 또는 APV Gaulin, Inc.)를 통해 2회 용액을 통과시킴으로써 세포를 용출시킨다. 균질화물을 최종 농도 0.5M NaCl로 NaCl 용액과 혼합한 후, 15분 동안, 7000 xg로 원심분리한다. 생성되는 펠렛을 0.5M NaCl, 100mM Tris 및 50mM EDTA(pH 7.4)를 사용하여 다시 세척한다.
생성된 세척한 봉입체를 2 내지 4시간 동안 1.5M 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)로 용해시킨다. 15분 동안 7000 xg로 원심분리한 후, 펠렛을 제거하고, TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드-함유 상등액을 4℃에서 밤새 항온처리하여 추가의 GuHCl 추출이 가능하도록 한다.
고속 원심분리(30,000 xg)로 불용성 입자를 제거한 후, GuHCl 용해된 단백질은, GuHCl 추출물을 50mM 나트륨,450mM NaCl, 2mM EDTA(pH 4.5)를 함유하는 완충액 20용적과 함께 격렬히 교반하여 신속하게 혼합함으로써 다시 폴딩된다. 재 폴딩된 희석된 단백질 용액을 추가의 정제 단계에 앞서 12시간 동안 혼합없이 4℃에서 유지시킨다.
재 폴딩된 TNF 수용체 폴리펩타이드 용액을 투명하게 만들기 위해서, 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)를 평형시킨, 적합한 표면 영역을 가진 0.16㎛ 막 필터(예를 들어, 필트론(Filtron))가 장착된 미리 제조된 접선 여과 단위를 사용할 수 있다. 여과된 샘플을 양이온 교환 수지(예를 들어, Poros HS-50, 제조원: Perseptive Biosystems)상에 로딩(loading)한다. 상기 컬럼을 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)로 세척하고, 단계적인 방식으로 동일한 완충액 중에서 250mM, 500mM, 1000mM, 및 1500mM NaCl로 용출시킨다. 분획을 수거하고 추가로 SDS-PAGE로 분석한다.
이후, TNF 수용체 폴리펩타이드를 함유하는 분획을 모으고 물 4용적과 혼합한다. 이후, 희석된 샘플을 이전에 제조된 강한 음이온(Poros HQ-50, 제조원: Perseptive Biosystems) 및 약한 음이온(Poros CM-20, 제조원: Perseptive Biosystems)의 직렬 컬럼상에 로딩한다. 컬럼들을 40mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)로 평형시킨다. 이후, CM-20 컬럼을 0.2M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트(pH 6,0) 내지 1.0M NaCl, 50mM 나트륨 아세테이트(pH 6.5)의 범위의 10개 컬럼 용적의 선형 구배를 사용하여 용출시킨다. 유출액을 지속적인 A280모니터링하에, 분획을 수거한다. 이후, TNFR-6α 또는 -6β를 함유하는 분획(예를 들어, 16% SDS-PAGE로 결정함)을 모은다.
생성되는 TNF 수용체 폴리펩타이드는 상기 재 폴딩 및 정제 단계 후, 95% 이상의 순도를 나타낸다. 정제된 단백질 5㎍을 로딩하는 경우, 쿠마시 블루 염색한 16% SDS-PAGE로부터 어떠한 중요 오염물 밴드도 관찰되지 않는다. 정제된 단백질은 또한 내독소/LPS 오염에 대해서도 테스트하며, 전형적으로 LPS 함량은 LAL 분석법에 따라 0.1ng/㎖ 미만이다.
실시예 2: 배쿨로바이러스 발현 시스템에서 TNFR-6α 및 -6β 단백질의 클로닝 및 발현
본 예증적인 실시예에서, 플라스미드 셔틀 벡터 pA2는, 문헌[Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)]에 기술된 바와 같은 표준 방법을 사용하여, 이의 천연적으로 관련된 분비 신호(리더) 서열을 포함하는 완전한 단백질을 암호화하는 클론된 DNA를 배쿨로바이러스에 삽입하여 성숙한 TNFR-6α 또는 -6β 단백질을 발현하는데 사용된다. 상기 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터와 뒤 이은 BamHI, XbaI 및 Asp718 같은 편리한 제한 부위를 포함한다. 원숭이 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위는 효과적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선택을 위해서, 플라스미드는 동일한 방향으로 약한 드로소필라 프로모터의 조절하에 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제 유전자 및 뒤 이은 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 삽입된 유전자는 야생형 바이러스 DNA와 세포-매개된 상동 재조합을 위한 바이러스 서열에 의해 양 쪽에서 플랭킹되어 클론된 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 생존할 수 있는 바이러스를 생성한다.
당해 분야의 숙련자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 작제물이 신호 펩타이드 및 경우에 따라 AUG 틀을 포함하는, 전사, 해독, 분비 등을 위한 적합하게 위치된 신호를 제공하는 한, pAc373, pVL941 및 pAcIM1 같은, 수많은 기타 배쿨로바이러스 벡터를 상기 벡터 대신에 사용할 수 있다. 이러한 벡터들은 예를 들어, 문헌[Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989)]에 기술되어 있다.
서열 2 또는 4에서 나타낸 AUG 개시 코돈 및 천연 관련 리더 서열을 포함하는, 기탁된 클론 중 완전한 길이의 TNFR-6α 또는 -6β 단백질을 암호화하는 cDNA 서열을 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. TNFR-6α 또는 -6β를 위한 5' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3'(서열 24)를 갖는다. 상기한 모든 프라이머들은 문헌[Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기술된 바와 같이, 진핵 세포에서 해독을 개시하는 유효한 신호를 암호화한다. TNFR-6α을 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5'CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 25)을 갖는다. TNFR-6β를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5'CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCGCAGTG 3'(서열 27)을 갖는다.
증폭된 단편을 상업적으로 시판중인 키트("진클린(Geneclean)", 제조원: BIO 101 Inc., 캘리포니아주 라 졸라)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 이후, 단편을, 상기 구체적으로 기술한 바와 같이, 사용된 프라이머 각각에 대해 적합한 제한 효소를 사용하여 절단하고, 다시 1% 아가로스 겔 상에서 정제한다.
상기 플라스미드를 동일한 제한 효소로 절단하고 임의로, 당해 분야에 공지된 일상적인 기술을 사용하여, 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킬 수 있다. 이후, DNA를 상업적으로 시판중인 키트("진클린", 제조원: BIO 101 Inc., 캘리포니아주 라 졸라)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
단편 및 탈인산화된 플라스미드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루(제조원: 스트라타진 클로닝 시스템사, 캘리포니아주 라 졸라)같은 기타 적합한 이. 콜라이 숙주를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고 배양 플레이트 상에 도말한다. 상기에서 사용된 효소를 사용하여 각각의 클론들로부터 DNA를 절단한 후 겔 전기영동으로 절단 생성물을 분석함으로써 사람 TNF 수용체 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 세균을 분리한다. 클론된 단편의 서열은 DNA 서열 분석법으로 확인한다. 이러한 플라스미드를 본원에서는 pA2-TNFR-6α 또는 pA2TNFR-6β(통틀어, pA2-TNFR)라고 명명한다.
플라스미드 pA2-TNFR 5㎍을 문헌[Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987)]에 기술된 리포펙션 방법(lipofection method)을 사용하여, 상업적으로 시판중인 선형화된 배쿨로바이러스 DNA("BaculoGoldTM배쿨로바이러스 DNA", 제조원: Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고) 1.0㎍과 공-형질감염시킨다. BaculoGoldTM바이러스 DNA 1㎍ 및 플라스미드 pA2-TNFR 5㎍을 혈청-비함유 그레이스 배지(Grace's medium)(제조원: Life Technologies Inc., 매릴랜드주 가이테스버그) 50㎕를 함유하는 미세적정 플레이트의 멸균된 웰에서 혼합한다. 이후, 리포펙틴 10㎕를 그레이스 배지 90㎕와 함께 부가하고, 혼합한 후 실온에서 15분 동안 항온 처리한다. 이후, 형질감염 혼합물을 혈청 비함유 그레이스 배지 1㎖로 35mm 조직 배양 플레이트에 시딩된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 이후, 상기 플레이트를 27℃에서 5 시간 동안 배양한다. 이후, 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고 10% 송아지 태아 혈청으로 보충된 그레이스 곤충 배지 1㎖를 가한다. 배양을 4일 동안 27℃에서 계속한다.
4일 후, 문헌[상기, Summers and Smith]에 기술된 바와 같이, 상등액을 수거하고 플라크 분석을 수행한다. "블루 갈(Blue Gal)"(제조원: Life Technologies Inc., 가이테스버그)을 사용한 아가로스 겔을 사용하여 gal-발현 클론을 동정하고 분리하며, 상기 클론은 푸른색-염색된 플라크를 생성한다. (이러한 유형의 "플라크 분석법"에 대한 상세한 기술은 제조원(Life Technologies Inc., 가이테스버그)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 배쿨로바이러스학을 위한 사용자 안내서, 제9면 및 제10면에서 발견할 수 있다). 적당히 배양한 후, 푸른색 염색된 플라크를 마이크로피펫터(예를 들어, 에펜도르프사 제품)의 팁(tip)으로 찍어 올린다. 이후, 재조합 바이러스가 함유된 상기 아가를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 미세원심분리 튜브에 재현탁시키고, 재조합 배쿨로바이러스를 함유하는 현탁액을 사용하여 35mm 플레이트에 시딩된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후, 이러한 배양 플레이트의 상등액을 수거한 후 이들을 4℃에 저장한다.
TNF 수용체 유전자의 발현을 입증하기 위해서, Sf9 세포를 10% 가열-불활성화시킨 FBS로 보충시킨 그레이스 배지에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도("MOI") 약 2에서 재조합 배쿨로바이러스로 감염시킨다. 방사능 표지된 단백질이 바람직한 경우, 6시간 후, 배지를 제거하고 SF900II 배지(메티오닌 및 시스테인 비함유)(제조원: Life Technologies Inc., 매릴랜드 록크빌)로 교체한다. 42시간 후,35S-메티오닌 5μCi 및35S-시스테인 5μCi(제조원: Amersham)를 부가한다. 추가로 세포를 16시간 동안 배양한 후 원심분리시켜 수거한다. 세포내 단백질 뿐만 아니라 상등액 중 단백질을 SDS-PAGE를 수행한 후 방사능 사진술(방사능 표지된 경우)로 분석한다.
정제된 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열에 대한 미세 서열 분석을 사용하여 TNF 수용체 단백질의 성숙 형태의 아미노 말단 서열을 결정할 수 있다.
실시예 3: 포유 동물 세포에서 TNFR-6α 및 -6β의 클로닝 및 발현
전형적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사를 매개하는 프로모터 인자, 단백질 암호화 서열, 및 전사 종결 및 전사체의 폴리아데닐화를 위해 필요한 신호를 포함한다. 부가적인 요소들은 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여체 및 수용체 부위에 의해 플랭킹되는 간섭 서열을 포함한다. 고효율 전사는 SV40의 early 및 late 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어, RSV, HTLVI, HIVI로부터의 장 말단 반복 서열(LTRs), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 early 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 세포성 요소들(예를 들어, 사람 액틴 프로모터)이 또한 사용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pSVL 및 pMSG(제조원: Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC 제37152호), pSV2dhfr(ATCC 제37146호) 및 pBC12MI(ATCC 제67109호) 같은 벡터들을 포함한다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포는 사람 Hela, 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, COS 1, COS 7 및 CV1, 모츠래기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.
대안적으로, 상기 유전자는 염색체에 통합된 상기 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신 같은 선택성 표지와 함께 공-형질감염시켜 형질감염된 세포를 동정 및 분리할 수 있다.
형질감염된 유전자는 또한 대량의 암호화된 단백질을 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제) 표지는 흥미있는 유전자의 수백 내지 수천개의 복사체를 갖는 세포주를 제조하는데 유용하다. 또 다른 유용한 선택 표지는 효소 글루타민 신타제(GS)이다[Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1922)]. 상기 표지들을 사용하여, 포유동물 세포들을 선택성 배지에서 성장시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선택한다. 이들 세포주는 염색체내로 통합된 증폭된 유전자(들)을 함유한다. 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 및 NSO 세포는 종종 단백질 생산용으로 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March, 1985)] 및 CMV-인핸서의 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 포함한다. 예를 들어, 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 갖는 다중 클로닝 부위는 관심있는 유전자의 클로닝을 촉진시킨다. 벡터는 부가적으로 랫트의 프리프로인슐린의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.
실시예 3(a): COS 세포에서 클로닝 및 발현
발현 플라스미드, pTNFR-α-HA 및 -6β-HA는 TNF 수용체 단백질의 성숙한 형태를 암호화하는 cDNA의 일부를 발현 벡터 pcDNAI/Amp 또는 pcDNAIII(이는 제조원: Invitrogen, Inc.로부터 수득할 수 있다)내로 클로닝함으로써 작제된다.
발현 벡터 pcDNAI/amp는 (1) 이. 콜라이 및 기타 원핵 세포에서의 증식에 유효한 이. 콜라이 복제 오리진; (2) 플라스미드-함유 원핵 세포의 선택을 위한 암피실린 내성 유전자; (3) 진핵 세포에서의 증식용 SV40의 복제 오리진; (4) CMV 프로모터, 폴리링커, SV40 인트론; (5) 배열된 종결 코돈 및 폴리아데닐화 신호가 뒤를 따르는 헤마글루티닌 단편(즉, 정제를 촉진하는 "HA" 태그)을 암호화하는 수 개의 코돈을 포함하며, 결과적으로 cDNA는 폴리링커 중 제한 부위들을 수단으로 CMV 프로모터의 발현 조절하에 위치되며 작동적으로 SV40 인트론 및 폴리아데닐화 신호에 연결될 수 있다. HA 태그는 문헌[Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]에 기술된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다. HA 태그의 표적 단백질에 대한 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 재조합 단백질의 용이한 검출 및 회수를 가능하게 한다. 부가적으로, pcDNAIII은 선택성 네오마이신 표지를 포함한다.
완전한 TNF 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝함으로써 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터에 의해 지시된다. 플라스미드 작제 전략은 하기와 같다. 이. 콜라이에서 TNF 수용체의 발현을 위한 벡터의 작제를 위해서 상기 기술한 바와 같이, 기탁된 클론의 TNF 수용체 cDNA를 편리한 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 적합한 프라이머는 당해 분야의 통상의 숙련자에 의해 용이하게 디자인될 수 있다.
PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp를 XbaI 및 EcoRI으로 절단한 후 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(스트라타진 클로닝 시스템스 시판중, 캘리포니아주 92037 라 졸라, 노쓰 토레이 파인스 로오드 11099)내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트에 플레이팅한 후 암피실린 내성 콜로니가 성장하도록 배양한다. 플라스미드 DNA를 내성 콜로니로부터 분리하고, TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드를 암호화하는 단편의 존재에 대해 내성 분석 및 기타 수단으로 실험한다.
재조합 TNFR-6α 및 -6β의 발현을 위해서, COS 세포를 상기한 바와 같이, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이, DEAE-덱스트란을 사용하여, 발현 벡터로 형질감염시킨다. 벡터에 의한 TNFR의 발현을 위한 조건하에서 세포를 배양한다.
TNFR-6α-HA 및 -6β-HA 융합 단백질의 발현은 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboraory Manual, 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)]에 기술된 방법들을 사용하여, 방사능 표지화 및 면역침전시킴으로써 검출된다. 이러한 목적을 위해서, 형질감염 2일 후,35S-시스테인 함유 배지에서 8시간 동안 배양시킴으로써 세포들을 표지화시킨다. 세포 및 배지를 수거하고, 세포를 세척하고, 문헌[상기 인용된 Wilson et al.]에 의해 기술된 바와 같이, 세제-함유 RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM TRIS, pH 7.5)으로 용해시킨다. HA-특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 단백질을 세포 용출물 및 배양 배지로부터 침전시킨다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 및 방사선 사진술로 분석한다. 예견된 크기의 발현 생성물이 세포 용출물에서 나타나며, 이는 네가티브 대조군에서는 나타나지 않는다.
실시예 3(b): CHO 세포에서의 클로닝 및 발현
벡터 pC4는 TNFR-6α 및 -6β 폴리펩타이드의 발현을 위해서 사용한다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 기탁 번호 제37146호)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 early 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드로 형질감염된, 디하이드로폴레이트 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 기타 세포들은 화학요법제 메토트렉세이트로 보충된 선택성 배지(알파 마이너스 MEM, 제조원: Life Technolofies)에서 세포를 성장시킴으로써 선택될 수 있다. 메토트렉세이트(MTX) 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 널리 공지되어 있다[문헌 참조: Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et BioPhys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68]. 증가된 농도의 MTX에서 성장시킨 세포는, DHFR 유전자의 증폭의 결과로서, 표적 효소인 DHFR을 과생성시킴으로써 상기 약제에 대한 내성이 증진된다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되는 경우, 이는 일반적으로 공-증폭되어 과-발현된다. 이러한 방법은 증폭된 유전자(들) 1000개 이상의 복사체를 갖는 세포주를 제조하는데 사용될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 후속적으로, 메토트렉세이트를 제거하는 경우, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체내로 통합된 증폭된 유전자를 함유하는 세포주가 수득된다.
관심있는 유전자의 발현을 위해서 플라스미드 pC4는 라우스 육종 바이러스의 장 말단 반복 서열(LTR)의 프로모터[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985: 438-447] 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 immediate early 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)]을 포함한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 통합을 가능케 하는 다음의 단독 제한 효소 절단 부위가 따른다: BamHI, XbaI, 및 Asp718. 상기 클로닝 부위에 뒤 이어, 상기 플라스미드는 랫트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 기타 고효율 프로모터로는 또한 발현을 위해서, 예를 들어, 사람 β-액틴 프로모터, SV40의 early 또는 late 프로모터 또는 기타 레트로바이러스 예를 들어, HIV 및 HTLVI로부터의 장 말단 반복 서열이 사용될 수 있다. 클론텍(Clontech)사의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사 시스템을 사용하여 포유동물에서 조절된 방식으로 TNF 수용체 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다[Gossen, M., & Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551]. mRNA의 폴리아데닐화를 위해서, 기타 신호, 예를 들어 사람 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 신호를 또한 사용할 수 있다. 염색체내에 통합된 관심있는 유전자를 갖는 안정한 세포주는 gpt, G418 또는 하이그로마이신 같은 선택성 표지를 사용하여 공-형질감염시켜 또한 선택할 수 있다. 시작부터, 예를 들어, G418 + 메토트렉세이트 같이 하나 이상의 선택성 표지를 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC4를 하기 개략한 바와 같이 선택된 TNF 수용체를 증폭하기 위해서 사용된 특정한 프라이머에 적합한 제한 효소로 절단한 후, 당해 분야에 공지된 방법으로 소 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킨다. 이후, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
TNF 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 상기 유전자의 바람직한 부분의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. TNFR-6α 및 -6β를 위한 밑줄친 BamHI 부위를 포함하는 5' 프라이머는 하기 서열 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3'(서열 25)을 갖는다. TNFR-6α를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3'(서열 26)을 갖는다. TNFR-6β를 위한 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 포함하는 서열 5' CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3'(서열 27)을 갖는다.
증폭된 단편을 작제된 제한 부위를 절단하는 엔도뉴클레아제로 절단한 후 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제한다. 이후 분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 이후, 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루 세포들을 형질전환시키고 예를 들어, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4내로 삽입된 단편을 포함하는 세균을 분리한다.
활성 DHFR 유전자가 결핍된 중국산 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 발현 플라스미드 pC4 5㎍을 리포펙신[상기, Felgner et al.]을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5㎍과 함께 공-형질감염시킨다. 플라스미드 pSV2-neo는 우세한 선택성 표지, 즉 G418을 포함하는 항생제 그룹에 내성을 주는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 neo 유전자를 포함한다. 세포를 G418 1㎎/㎖로 보충된 알파 마이너스 MEM 배지에 시딩한다. 2일 후, 세포를 트립신으로 처리하고 메토트렉세이트 10, 25, 또는 50ng + G418 1㎎/㎖로 보충된 알파 마이너스 MEM 배지 중 하이브리도마 클로닝 플레이트(제조원: Greiner, 독일)에 시딩한다. 약 10 내지 14일 후, 단독 클론을 트립신 처리한 후 상이한 농도(50nM, 100nM, 200nM, 400nM, 800nM)의 메토트렉세이트를 사용하여 6-웰 페트리 디쉬 또는 10㎖ 플레이트에 시딩한다. 메토트렉세이트의 최고 농도에서 성장하는 클론을 보다 더 높은 농도(1μM, 2μM, 5μM, 10mM, 20mM)의 메토트렉세이트를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 동일 방법을 100 내지 200μM의 농도에서 성장하는 클론이 수득될 때까지 반복한다. 바람직한 유전자 생성물의 발현을, 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해서 또는 역상 HPLC 분석에 의해 분석한다.
실시예 4: TNF 수용체 mRNA 발현의 조직 분포
노던 블롯 분석을, 기타 방법 중 문헌[상기 인용된 Sambrook et al.]에 기술된 방법을 사용하여 수행하여 사람 조직에서 TNFR-6α 및 -6β 유전자 발현을 조사한다. TNF 수용체 단백질의 완전한 뉴클레오타이드 서열(서열 1 또는 3)을 포함하는 cDNA 탐침을 rediprimeTMDNA 표지 시스템(제조원: Amersham Life Science)을 사용하여 제조원의 지침에 따라32P로 표지한다. 표지 후, 탐침을 CHROMA SPIN-100TM컬럼(제조원: Clontech Laboratories, Inc.)을 사용하여 제조원의 프로토콜 번호 PT1200-1에 따라서 정제한다. 이후, 정제한 표지된 탐침을 TNF 수용체 mRNA에 대해 다양한 사람 조직을 조사한다.
다양한 사람 조직(H) 또는 사람 면역계 조직(IM)을 포함하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯은 제조원(Clontech)으로부터 수득하며 ExpressHybTM하이브리드화 용액(제조원: Clontech)을 사용하여 제조원의 프로토콜 번호 PT1190-1에 따라 표지된 탐침으로 조사한다. 하이브리드화 및 세척 후, 상기 블롯을 -70℃에서 필름에 올려 밤새 노출시키고, 표준 방법에 따라 필름을 현상한다.
본 발명은 상기 기술 및 실시예에서 특별히 기술한 것과 다르게 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 발명에 대한 수 많은 변형과 변화가 상기 교시하에 가능하며, 따라서, 첨부된 청구의 범위내에 표함된다.
본원에서 인용된 모든 출판물(특허, 특허원, 잡지 기사, 실험 매뉴얼, 책, 또는 기타 문헌을 포함)은 본원에 참조로 포함된다.
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기탁 기관의 주소 (우편 번호 및 국가를 포함)미국 메릴랜드주 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301
기탁일: 1996년 11월 22일 수탁 번호: 97809
C. 추가 정보 (미적용시 공백으로 함) 상기 정보는 다음장에 포함된다 □
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■ 본 서류를 국제 출원 명세서와 함께수령하였다. □ 본 서류를 국제사무국에서 일자로 수령하였다.
공인관 공인관
양식 PCT/RO/134(1992년 7월)
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Claims (23)

  1. (a) 서열 2 또는 서열 4의 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 각각, 서열 2 또는 서열 4의 31 내지 300 위치 또는 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (c) 각각, 서열 2 및 서열 4의 31 내지 283 위치 또는 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (d) (a), (b), 또는 (c)에서의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 1 및 서열 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완전한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2 및 서열 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2의 약 31 내지 약 300 위치 또는 서열 4의 약 31 내지 약 170 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 서열 2의 약 31 내지 약 283 위치 또는 서열 4의 약 31 내지 약 166 위치의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  6. (a) 서열 2의 잔기 m 내지 300의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이때, m은 1 내지 49 범위의 정수이다);
    (b) 서열 4의 잔기 n 내지 170의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이때, n은 1 내지 49 범위의 정수이다);
    (c) 서열 2의 잔기 1 내지 y의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이때, y는 193 내지 300 범위의 정수이다);
    (d) 서열 4의 잔기 1 내지 z의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이때, z는 132 내지 170 범위의 정수이다); 및
    (e) 서열 2의 잔기 m 내지 y 또는 서열 4의 잔기 n 내지 z로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이때, m, n, y 및 z는 (a), (b), (c) 및 (d)에서 정의한 바와 같다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  7. (a) ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 1 내지 약 48개의 아미노산을 제외한, 당해 완전한 아미노산 서열의 일부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 각각, ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 1 내지 약 170개 및 1 내지 약 38개의 아미노산을 제외한, 당해 완전한 아미노산 서열의 일부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (c) (a) 및 (b)에서의 각각의 클론에 있어서 아미노 말단 및 카복시 말단 결실물의 혼합물을 포함하는, ATCC 수탁 번호 제97810호 및 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 TNFR 아미노산 서열의 일부분으로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 서열.
  8. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
  11. 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하지 않고, 제1항의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  12. 제1항의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 서열 2의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 2의 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 서열 2의 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 서열 2의 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 서열 2의 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 서열 2의 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 서열 2의 약 Ala-283 내지 약 Pro-298; 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 4의 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 서열 4의 약 Glu-86 내지 약 His-106, 서열 4의 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 서열 4의 약 His-129 내지 약 Val-138, 및 서열 4의 약 Gly-142 내지 약 Pro-166으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 TNFR 폴리펩타이드의 에피토프-형성 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  14. 제1항의 분리된 핵산 분자를 벡터내로 삽입함을 포함하는 재조합 벡터의 제조 방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 작제된 재조합 벡터.
  16. 제15항의 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입함을 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
  17. 제16항의 방법에 의해 제조된 재조합 숙주 세포.
  18. TNFR 폴리펩타이드가 발현되게 하는 조건하에서 제17항의 재조합 숙주 세포를 배양하고 당해 폴리펩타이드를 수거함을 포함하는, TNFR 폴리펩타이드를 제조하기 위한 재조합 방법.
  19. (a) 서열 2 또는 서열 4에서 나타낸 완전한 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 완전한 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열;
    (b) 서열 2의 31 내지 300 위치 또는 서열 4의 31 내지 170 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 TNFR 폴리펩타이드의 아미노산 서열; 또는
    (c) 서열 2의 31 내지 283 위치 또는 서열 4의 31 내지 166 위치의 아미노산 서열을 갖거나, ATCC 수탁 번호 제97810호 또는 제97809호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 TNFR 폴리펩타이드의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 TNFR 폴리펩타이드.
  20. 서열 2의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 2의 약 Phe-57 내지 약 Thr-117, 서열 2의 약 Cys-132 내지 약 Thr-175, 서열 2의 약 Gly-185 내지 약 Thr-194, 서열 2의 약 Val-205 내지 약 Asp-217, 서열 2의 약 Pro-239 내지 약 Leu-264, 서열 2의 약 Ala-283 내지 약 Pro-298; 서열 4의 약 Ala-31 내지 약 Thr-46, 서열 4의 약 Phe-57 내지 약 Gln-80, 서열 4의 약 Glu-86 내지 약 His-106, 서열 4의 약 Thr-108 내지 약 Phe-119, 서열 4의 약 His-129 내지 약 Val-138, 및 서열 4의 약 Gly-142 내지 약 Pro-166의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택된, TNFR 단백질의 에피토프-형성 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  21. 제19항의 TNFR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  22. TNFR 폴리펩타이드 활성이 필요한 환자에게 제19항의 TNFR 폴리펩타이드를 투여함을 포함하는, 환자의 치료 방법.
  23. TNFR 폴리펩타이드 활성이 필요한 환자에게 제1항의 핵산을 투여함을 포함하는, 환자의 치료 방법.
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