JP2001507937A

JP2001507937A - 腫瘍壊死因子レセプター６αおよび腫瘍壊死因子レセプター６β

Info

Publication number: JP2001507937A
Application number: JP53103798A
Authority: JP
Inventors: エル．ゲンツ，ライナー; ニ，ジアン; エブナー，ラインハルト; ユ，グオ−リアン; エム．ルーベン，スティーブン; フェン，ピン
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-01-14
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2001-06-19
Also published as: WO1998030694A2; CN1247567A; ES2286843T3; BR9806954A; ATE365796T1; EP1007659A2; US8003386B1; EP1007659B1; DE69837996T2; AU5815798A; AU729062C; WO1998030694A3; KR20000070174A; CA2277925A1; US7186800B1; DE69837996D1; AU729062B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な腫瘍壊死因子レセプタータンパク質に関する。詳細には、ヒトTNFR-αおよびTNFR-6βタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドもまた、ベクター、宿主細胞、およびそれらを生成するための組換え方法と同様に提供される。本発明はさらに、TNFR-6αおよびTNFR-6β活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。免疫系関連障害を検出するための診断的方法、および免疫系関連障害を処置するための治療的方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍壊死因子レセプター６αおよび腫瘍壊死因子レセプター６β 発明の分野本発明は、TNFレセプターファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝子に関連する。より詳細には、腫瘍壊死因子レセプター-6α および-6βと称され、本明細書では以後たびたび、「TNFR-6αおよびTNFR-6β」または包括的に「TNFRポリペプチド」として言及されるヒトポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。TNFRポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製するための組換え方法が提供されるのと同様に提供される。さらに本発明はTNFRポリペプチド活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。またこのような組成物を使用するための診断方法および治療方法が提供される。発明の背景多くの生物学的作用（例えば、特定の刺激および天然の生物学的プロセスに対する応答）は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカインは、レセプターと連動し、そして細胞内応答を生じることによりレセプターを介して作用する。例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αおよび腫瘍壊死因子βは、多数の生物学的プロセス（ショックおよび炎症性疾患の感染および誘発に対する防御を含む）を制御するためのTNFレセプターを介して作用するサイトカインである。TNF分子は「 TNFリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプターまたは対のリガンド（「TNFレセプター」スーパーファミリー）と共に作用する。現在までに、TNFリガンドスーパーファミリーの９種のメンバーが同定されており、そしてTNFレセプタースーパーファミリーの10種のメンバーが特徴付けられている。リガンドの中には、TNF-α、リンホトキシン-α(TNF-βとしてまた公知である LT-α)、LT-β(複合体ヘテロトリマーLT-α2-β中に見出される)、FasL、CD40 L、CD27L、CD30L、4-1BBL、OX40L、および神経成長因子(NGF)が含まれる。TNFレセプターのスーパーファミリーは、p55TNFレセプター、p75TNFレセプター、TNF レセプター関連タンパク質、FAS抗原またはAPO-1、CD40、CD27、CD30、4-1BB、O X40、低親和性p75、およびNGFレセプター(Meager，A.，Biologicals，22:291-29 5(1994))を含む。 TNFリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞により発現される。これは、これらのメンバーが細胞個体発生および機能の根底にある他の細胞型とのＴ細胞の相互作用に必要であることを意味する(Meager，A.、前出) 。 TNFレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についてのかなりの洞察が、これらのタンパク質の発現を消滅させる変異体の同定および作製により得られている。例えば、FAS抗原およびそのリガンド中の天然に存在する変異は、リンパ球増殖疾患を生じ(Watanabe-Fukunaga，R.ら、Nature 356:314(1 992))、これはおそらく、プログラムされた細胞死の失敗を反映する。CD40リガンドの変異は、血漿中の高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧにより特徴付けされるＸ連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全なＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化を意味する(Allen，R.C.ら、Science 259:990(1993)) 。低親和性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な知覚神経支配(innovation)により特徴付けられた障害を生じる(Lee，K.F.ら、Ce ll 69:737(1992))。 TNFおよびLT-αは、２つのTNFレセプター（55kdおよび75kdのTNFレセプター）へ結合し得る。それらのレセプターを通して作用するTNFおよびLT-αにより誘発される多くの生物学的効果は、移植された腫瘍の出血性壊死、細胞傷害性、エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線の有害な効果に対する防御を含む。TNFおよびLT-αは、エンドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、エイズ、および移植片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因に関与する(Beutler，B.およびVon Huff el，C.，Science 264:667-668(1994))。p55レセプター中の変異は、微生物感染に対して増加された感受性を生じる。さらに、TNFR１(p55)およびFasのC-末端付近の約80アミノ酸ドメインが、プログラムされた細胞死についてのシグナルを伝える原因である「死ドメイン」として報告された(Tartagliaら、Cell 74:845(1993))。アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達またはホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである(H．Steller，Scien ce 267，1445-1449(1995))。アポトーシスの撹乱は、ガン、神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病因に寄与する(C.B.Thomp son，Science 267，1456-1462(1995))。最近、多くの注目が、シグナル伝達および２つの細胞表面死レセプター（Fas/APO-1およびTNFR-1）の生物学的機能に集中している(J.L．Cleveland，J．N．Ihle，Cell 81，479-482(1995);A．Fraser ，G．Evan，Cell 85，781-784(1996);S．Nagata，P.Golstein，Science 267，14 49-56(1995))。両方は、とりわけ、TNFR-2、低親和性NGFR,CD40、およびCD30もまた含むTNFレセプターファミリーのメンバーである(C.A.Smithら、Science 248 ，1019-23(1990);M.Tewari，V.M．Dixit，Modular Texts in Molecular and Cel l Biology M．Purton，Heldin，Carl編(Chapman and Hall，London，1995)。ファミリーのメンバーはこれらの細胞外ドメイン中のシステインリッチ反復の存在により定義されるが、Fas/APO-1およびTNFR-1はまた、ショウジョウバエ自殺遺伝子reaper(P．Golstein，D．Marguet，V．Depraetere，Cell 81，185-6(1995); K．Whiteら、Science 264，677-83(1994))の遠縁にあたる、細胞内相同性の領域である、適切に命名された「死ドメイン」を共有する。この共有された死ドメインは、両レセプターが最近まで未同定のままであった関連する対のシグナル伝達分子と相互作用することを示唆する。Fas/APO-1の活性化は、死ドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1(A.M．Chinnaiyan，K．O'Rourke，M．Tewari，V.M．D ixit，Cell 81，505-12(1995);M.P.Boldinら、J．Biol Chem 270，7795-8(1995) ;F.C．Kischkelら、EMBO 14，5579-5588(1995))を補強し、死ドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1は次いで、プロアポトーシスプロテアーゼのICE/CED-3 ファミリーのメンバーであるFLICE/MACH1へ結合し、そしておそらく活性化する( M.Muzioら、Cell 85，817-827(1996);M.P.Boldin,T.M．Goncharov，Y.V．Goltse v，D．Wallach，Cell 85，803-815(1996))。Fas/APO-1の中心的役割は細胞死を誘発することであるが、TNFR-1は、整然とした多様な生物学的活性（その多くは、NF-kBを活性化する能力に由来する）の信号を送り得る(L ．A．Tartaglia，D.V．Goeddel，Immunol Today 13，151-3(1992))。従って、TN FR-1は、多価アダプター分子TRADD（FADDを好む）を補強し、また死ドメインを含む(H．Hsu，J．Xiong，D.V．Goeddel，Cell 81，495-504(1995);H．Hsu，H.-B ．Shu，M.-P．Pan，D.V．Goeddel，Cell 84，299-308(1996))。FADD、TRAF2、およびRIPを含む多くのシグナル伝達分子との会合を通して、TRADDは、アポトーシスおよびNF-kB活性化の両方へ信号を送り得る(H．Hsu，H.-B．Shu，M.-P．Pan， D．V．Goeddel，Cell 84，299-308(1996);H．Hsu，J．Huang，H.-B．Shu，V．Ba ichwal，D．V．Goeddel，Immunity 4，387-396(1996))。 TNFファミリーリガンドおよびTNFファミリーレセプターの効果は変化し、哺乳動物システムの生物学的プロセス中で、正常および異常の両方の多数の機能に影響を与える。従って、正常状態および疾患状態の両方の生物活性に影響を与えるようなレセプターおよびリガンドの同定ならびに特徴付けについての明確な必要性が存在する。詳細には、TNFレセプターファミリーの新規のメンバーを単離および特徴付けする必要性がある。発明の要旨本発明は、それぞれ配列番号２および４中に示される完全なアミノ酸配列、またはそれぞれATCC受託番号97810および97809のプラスミドDNAとして寄託されるc DNAクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列を有するTNFR-6αまたはTNF R-6βポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１および２（それぞれ、配列番号１および３）に示される寄託されたTNFR-6αおよびTNFR-6βクローンを配列決定することにより決定されたヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および３中のヌクレオチド 25〜27位およびヌクレオチド73〜75位にＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む、それぞれ300および170アミノ酸残基の完全なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。本発明のTNFRタンパク質は、他のTNFレセプターと配列相同性を共有する。スプライス改変体であるTNFR-6αおよびTNFR-6βは、複数の保存されたシステインリッチドメインもまた含むTNFR-Iおよび-II（図３）(それぞれ、配列番号５および６)についてのヒトmRNAの翻訳産物と最大の程度の配列相同性を示す。 TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドは、それぞれ30アミノ酸の推定リーダー配列を有し；そして推定成熟TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドのアミノ酸配列はまた、それぞれアミノ酸残基31〜300（配列番号２）および31〜170（配列番号４）として図１および２に示される。従って、本発明の１つの局面は、(a)配列番号２もしくは４の完全なアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810または97809に含まれるcDNAクローンによりコードされるような完全なアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(b)配列番号２中の31〜300位もしくは配列番号４中の31〜170位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809中に含まれるcDNAクローンによりコードされるようなアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(c)配列番号２中の31〜283位もしくは配列番号４中の31〜166位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809中に含まれるcDNAクローンによりコードされるようなアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および(d)上記(a) 、(b)、または(c)中の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。本発明のさらなる実施態様は、上記の(a)、(b)、（c）および(d)のヌクレオチド配列のいずれかに、少なくとも90％同一、より好ましくは少なくとも95％、96 ％、97％、98％、もしくは99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の(a)、(b) 、（c）または(d)のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の(a)、(b)または(c)のアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターに関連し、そして組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法および組換え技術によるTNFRポリペプチドまたはペプチドの産生のための方法に関連する。本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたTNFR ポリペプチドをさらに提供する：(a)配列番号２もしくは４に示される完全なアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809中に含まれるcDNAクローンによりコードされるような完全なアミノ酸配列を有する全長TNFRポリペプチドのアミノ酸配列；(b)配列番号２中の31〜300位もしくは配列番号４中の31〜170位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809中に含まれるcDNAクローンによりコードされるようなアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチドのアミノ酸配列；あるいは(c)配列番号２中の31〜283位もしくは配列番号４中の31〜 166位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809中に含まれるcDN Aクローンによりコードされるようなアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、上記の(a)、(b)、または(c)に記載されるアミノ酸配列に、少なくとも80％同一、より好ましくは少なくとも90％同一,そしてさらにより好ましくは95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に少なくとも90％類似性、より好ましくは少なくとも95％類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の(a)、(b)、または(c)に記載されるアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含むペプチドもしくはポリペプチドに関する。本発明のTNFRポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸〜約50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体までの任意の長さ、およびこのアミノ酸配列全体を含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた本発明に含まれる。別の実施態様では、本発明は、上記の(a)、(b)、または(c)に記載されるアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。本発明は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法をさらに提供する。このような抗体は、以下に記載するように、診断的または治療的に有用である。腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーリガンドは、細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む多数の細胞性応答を誘導する、最も多面的なサイトカイン中にあることが公知である。本発明はまた、TN FRポリペプチド、特にヒトTNFRポリペプチド（例えば、HIV感染、エンドトキシンショック、ガン、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、慢性移植片拒絶、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性損傷、毒素誘導性肝疾患、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振を含む感染性疾患を処置するために使用され得る）を含む薬学的組成物を提供する。TNFRポリペプチドを必要とする個体を処置する方法もまた提供される。本発明は、インビトロの細胞に対する投与、エクスビボの細胞に対する投与、インビボの細胞に対する投与、または多細胞生物に対する投与のためのTNFRポリヌクレオチドまたはTNFRポリペプチドを含む組成物をさらに提供する。本発明のこの局面の特定の特に好ましい実施態様において、この組成物は、疾患の処置のために宿主生物中でTNFRポリペプチドを発現するためのTNFRポリヌクレオチドを含む。この点について特に好ましい実施態様は、TNFRポリペプチドの異常な内因性活性と関連する機能不全の処置のためのヒト患者中での発現である。別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイが提供され、このアッセイは、TNFファミリーリガンドに対するTNFR ポリペプチド結合への候補化合物の効果を決定することを含む。特に、この方法は、TNFファミリーリガンドをTNFRポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、およびTNFファミリーリガンドに対するTNFRポリペプチド結合が、候補化合物の存在によって増加されるかまたは減少されるかどうかを決定する工程を含む。このアッセイにおいて、標準的結合を超えるTNFRポリペプチドの結合の増加は、候補化合物がTNFRポリペプチド結合活性のアゴニストであることを示し、そして標準物と比較してのTNFRポリペプチド結合の減少は、化合物がTNFRポリペプチド結合活性のアンタゴニストであることを示す。 TNFR-6αおよびTNFR-6βは内皮細胞、ケラチノサイト、正常前立腺および前立腺腫瘍組織で発現される。これらの組織または細胞（特に免疫系）の多くの障害について、「標準の」TNFR遺伝子発現レベル（すなわち、免疫系の障害を有しない個体由来の健康な組織中のTNFR発現レベル）と比較して、顕著に高いかまたは低いレベルのTNFR遺伝子発現は、このような障害を有する個体から採取される特定の組織（例えば、癌性組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または脊髄液）中で検出され得る。従って、本発明は、そのような障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。この診断方法は以下を含む：(a)個体の細胞または体液中のTNFR遺伝子発現レベルをアッセイする工程；(b)TNFR遺伝子発現レベルを標準のTNFR遺伝子発現レベルと比較し、それにより、標準の発現レベルと比較されるアッセイしたTNFR遺伝子発現レベルの増加または減少が免疫系の障害を示す工程。本発明のさらなる局面は、身体中のTNFRポリペプチド活性のレベルの増加を必要としている個体を処置する方法に関し、この方法は、このような個体に対して、本発明の単離されたTNFRポリペプチドまたはそのアゴニストの治療有効量を含む組成物を投与する工程を含む。本発明のなおさらなる局面は、身体中のTNFRポリペプチド活性のレベルの減少を必要としている個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の TNFRアンタゴニストを含む組成物をこのような個体へ投与する工程を含む。本発明の使用に関して好ましいアンタゴニストは、TNFR特異的抗体である。図面の簡単な説明図１は、TNFR-6αのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。図２は、TNFR-6βのヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。図３は、TNFR-6α(「TNFR-6a」)、およびTNFR-6β（「TNFR-6ｂ」）のアミノ酸配列と以下に示す他のTNFレセプターとの比較に適切なDNAstar中のメガラインプログラム(Megaline Program)を使用してClustal方法により作成したアラインメントを示す：TNFR１（配列番号５）；TNFR２（配列番号６）；NGFR（配列番号７）；LTbR（配列番号８）；FAS（配列番号９）；CD27（配列番号10）；CD30（配列番号11）；CD40（配列番号12）；4-1BB（配列番号13）；OX40（配列番号14）；V C22（配列番号15）；およびCRMB(配列番号16)。図４および図５は、それぞれTNFR-6αおよびTNFR-6βのアミノ酸配列の別々の分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数および表面確率が示される。「抗原性指数−Jameson- Wolf」グラフ中で、タンパク質の高度に抗原性の領域、すなわち本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域位置を示す。図６は、配列番号１および３に関連するHELDI06Rおよび有CEOW38Rのヌクレオチド配列を示す。詳細な説明本発明は、クローン化されたcDNAを配列決定することにより決定された、それぞれ配列番号２および４で示されるアミノ酸配列を有するTNFR-6αまたはTNFR-6 βポリペプチド（包括的に「TNFRポリペプチド」）をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１および２（配列番号１および３）で示されるヌクレオチド配列は、HPHAE52およびHTPCH84クローン（American Type Culture Collection，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852で19 96年11月22日に寄託され、そして、それぞれATCC 97810および97809の整理番号が与えられた）を配列決定することにより得られた。寄託されたクローンは、pB luescript SK(-)プラスミド(Stratagene，La Jolla，CA)に含まれる。本発明のTNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質は、それぞれのタンパク質のＮ末端側の142残基にわたって同一のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を共有する、スプライス改変体である。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ヒトTNFR -2 mRNA（図３）(配列番号６)の翻訳産物と約23％類似し、そして複数の保存されたシステインリッチドメインを共有する。重要なことには、これらのタンパク質は、有意なサブユニット間の相同性を有して、４つの反復システインリッチモチーフを含むこれらの細胞外ドメインにわたり実質的な配列類似性を共有する。 TNFR-2は、TNFによるヒトＴ細胞増殖を排他的に仲介すると考えられる(PCT WO/9 4/09137)。核酸分子他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B iosystems，Inc.，Foster City，CAのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％同一、より代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、配列決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、このような挿入または欠失の点にて始まる。核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、DNA分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そして RNA分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド(A，G，C，およびU )の対応する配列（ここで特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における各チミジンデオキシリボヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)によって置き換えられる）が意図される。図１および図２（配列番号１および３）のヌクレオチド配列のような、本明細書中で提供される情報を使用して、TNFRポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発物質としてmRNAを使用してcDNAをクローニングするための手順のような標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発明の実例となるTNFR-6αおよびTNFR-6βクローン（それぞれ、図１および２）は、以下の組織由来のcDNAライブラリー中で同定された：内皮細胞、ケラチノサイト、正常前立腺組織、および前立腺癌組織。図１および２（配列番号１および３）のTNFR cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、図１および２（配列番号１および３）中のヌクレオチド配列のヌクレオチド25〜27位および73〜75位に、それぞれ開始コドンを有する、300および170アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。 TNFR-6αおよびTNFR-6β遺伝子のオープンリーディングフレームは、TNFR-2（配列番号２の約31〜283残基および配列番号４の約31〜166残基の可溶性細胞外ドメインをそれぞれ含む）についてのヒトmRNAの翻訳産物と配列相同性を共有する。当業者が理解するように、上記で議論された配列決定誤差の可能性によって、約300および170アミノ酸を含む寄託されたcDNAによりコードされた実際に完全な TNFRポリペプチドは、いくらか長いかもしれないし、短いかもしれない。より一般的には、実際のオープンリーディングフレームは、図１および２（配列番号１および３）中に示されるＮ−末端から最初のメチオニンコドンから予測されるオープンリーディングフレームの±20アミノ酸の範囲、より好ましくは±10アミノ酸の範囲のどこかにあり得る(これは個々のそれぞれの図中に示される翻訳された配列とインフレームである)。種々の機能性ドメインを同定するために使用される分析判定基準に依存して、TNFRポリペプチドの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの正確な「アドレス」は、上記の推定の位置とわずかに異なり得ることがさらに理解される。例えば、配列番号２中の細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用した判定基準に依存してわずかに変化し得る(例えば、このアドレスは約１から約20残基、より好ましくは約１から約５残基「シフト」し得る)。いずれにしても、以下でさらに議論されるように、本発明は、本明細書中に記載の細胞外ドメインのＮ−末端から１つ以上のアミノ酸を欠失するポリペプチド（TNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質の細胞外ドメインの溶解型を構成する）を含む、完全なポリペプチドのＮ−末端から種々の残基が欠失されたポリペプチドをさらに提供する。リーダー配列および成熟配列完全なTNFRタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２および４で示されるようなリーダー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、TNFRタンパク質の成熟した形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナルの仮説によれば、粗面小胞体を通して成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が一旦開始されると、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質は、分泌される「成熟」した形態のタンパク質を生成するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルまたは分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ特異性で分泌されるタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌されるタンパク質の切断は、完全には均一ではなく、これによってタンパク質の２つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌されるタンパク質の切断特異性が完全なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断特異性はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。従って、本発明は、ATCC受託番号97810または97809として同定されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ATCC受託番号97810または97809中のcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチド」により、寄託されるベクター中に含まれるクローンのヒトDNA配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレームを哺乳動物細胞（例えば、上記のCOS細胞）中に発現させることにより産生されるタンパク質の成熟形態が意味される。さらに、タンパク質が分泌リーダーおよびそのリーダー配列のための切断点を有するか否かを推定する方法は利用可能である。例えば、McGeoch(Virus Res． 3:271-286(1985))の方法は、完全（切断されていない）タンパク質の短いＮ末端荷電領域および続く非荷電領域からの情報を使用する。von Heinje(Nucleic Aci ds Res．14:4683-4690(1986))の方法は、切断部位、代表的には残基-13〜+2（ここで、+1は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）の周囲の残基からの情報を使用する。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定することの精度は、75〜80％の範囲である(von Heinje、前出)。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質について同じ推定切断点を常に生じるわけではない。本発明の場合において、完全なTNFRポリペプチドの推定アミノ酸配列は、コンピュータープログラム「PSORT」によって分析された。このプログラムは、Insti tute for Chemical Research，Kyoto UniversityのDr．Kenta Nakaiから入手可能であり(K.NakaiおよびM.Kanehisa，Genomics 14:897-911(1992)を参照のこと) 、これはアミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞性局在を予測するための熟練したシステムである。このコンピューターによる局在の予測の一部として、McGe ochおよびvon Heinjeの方法が組み込まれている。このプログラムによるTNFRアミノ酸配列の分析は、以下の結果を提供した：TNFR-6αおよびTNFR-6βは、それぞれ配列番号２および４の残基31〜300および31〜170のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする。示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD NA（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成的に生成されるゲノムDNAを含む）の形態で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、そのような合成的に生成された分子をさらに含む。本発明の単離された核酸分子は、それぞれ配列番号１および３に示されるヌクレオチド配列の25〜27 73〜75の位置に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子を含む。それぞれ、配列番号２および４の31〜300および31〜170の位置に示される推定成熟TNFRポリペプチドに対するコード配列を含むDNA分子もまた、含まれる。さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝子コードの縮重に起因して、なおTNFRタンパク質をコードする、 DNA分子を含む。当然のことながら、遺伝子コードおよび種特異的なコドン選択性は当該分野において周知である。従って、上記の縮重型改変体を作成して、例えば特定の宿主についてコドン発現を最適にすること（例えば、ヒトmRNA中のコドンをE.coliのような細菌宿主に好ましいコドンに変化させること）は当業者が日常的に行うことである。別の局面においては、本発明は、ATCC受託番号第97810号または同第97809号として寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。本発明はさらに、図１もしくは２（配列番号１もしくは３）に示されるヌクレオチド配列、または上記の寄託されたクローン中に含まれるTNFR cDNAのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子（特にDNA分子）は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、および例えば、ノーザンブロット分析によるヒト組織におけるTNFR遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。詳細には、本発明は、それぞれ配列番号１および３の25〜924位および73〜5 82位からなる、配列番号１または３の部分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。また、それぞれ28〜924位および76〜582位からなる、配列番号１および３の部分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドのように、アミノ末端メチオニンを欠失するTNFRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、また意図される。このようなポリヌクレオチドによってコードされる、それぞれ配列番号２および４の２〜300位および2〜170位のアミノ酸配列を含むポリペプチドのようなポリペプチドもまた、提供される。さらに、本発明は、以下のように、配列番号１および３の広範な部分に関するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：HELDI06R（配列番号17）および HCEOW38R（配列番号18）は配列番号１および３の両方に関する。配列番号19または20でも、あるいは配列番号19または20のいずれかのサブフラグメントでもない配列番号１および３のポリペプチドフラグメントが好ましい。HELDI06RおよびHC EOW38Rの配列は図６に示されている。より一般的には、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、あるいは図１または２（配列番号１または３）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、長さが少なくとも約15nt、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてなおさらに好ましくは、少なくとも約40ntのフラグメントが意図され、これらは本明細書中に議論されるように診断用プローブおよび診断用プライマーとして有用である。もちろん、50〜300ntの長さのより長いフラグメントもまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１および２（配列番号１および３）に示されるヌクレオチド配列の全てではないにしても、ほとんどに対応するフラグメントと同様に、本発明に従えば有用である。特に、配列番号１に示される連続的な500ヌクレオチドに少なくとも95％同一である、少なくとも500ヌクレオチドを含むフラグメントが好ましい。少なくとも20ntの長さのフラグメントによって、例えば、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または図１および２（配列番号１および３）に示されるようなヌクレオチド配列由来の20以上の連続的な塩基を含むフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメントは、図４および５に同定されるように、ならびに以下により詳細に記載されるように、TNFRポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第97810号または第978 09号に含まれるcDNAクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、以下：50％ホルムアミド、５×SSC(15 0mMNaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハート液、10％硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNA、を含む溶液中で42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65℃にて0.1×SSC中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらにより好ましくは約30〜70（例えば50）ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNAのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または図１または２（配列番号１または３）に示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図される。当然のことながら、ポリA配列（例えば、TFN R cDNAの3'末端ポリ（A）トラクト）にのみ、またはT（またはU）残基の相補的なストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A）ストレッチまたはその相補体（例えば、ほとんど任意の二本鎖cDNAクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。示されるように、TNFRポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含み得るが、これらに限定されない：それ自体によって、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的配列（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列のような約26〜35アミノ酸リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列）；成熟ポリペプチドのコード配列で、上記の付加的コード配列を含むかまたは含まない。本発明の核酸によって、上記のタンパク質配列とともに付加的非コード配列もまたコードされ、この配列は、例えば、イントロンおよび非コード5'および3'配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む、転写、mRNA プロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性）を担う、転写された非翻訳配列）；さらなる機能性を提供するような付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、を含むがこれらに限定されない。従って、ポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター（QIAGEN,Inc.、9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA， 91311）中に提供されるタグのような、ヘキサーヒスチジンペプチドである。これらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサーヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク質には、Ｎ末端またはＣ末端にてFc に融合されたTNFR-5、TNFR-6α、またはTNFR-6βが含まれる。改変体および変異体ポリヌクレオチド本発明は、さらに、TNFRポリペプチドの一部、アナログ、または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される。Genes II，Lewin，B.編、John Wiley&Sons，New York(1985)。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生される改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変化され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな置換、付加、および欠失であり、これらはTNFRポリペプチド、またはそれらの一部の特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に好ましいのは、保存的置換である。非常に好ましいのは、配列番号２および４に示されるアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質、または寄託されたcDNAクローンによってコードされる成熟型TN FRポリペプチド配列をコードする核酸分子である。配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の細胞外ドメインまたは寄託されたcDNAクローンによりコードされるTNFRアミノ酸配列の細胞外ドメインをコードする核酸分子が、最も高度に好ましい。さらなる実施態様には、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに、少なくとも90％同一、そしてより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（ａ）配列番号２もしくは４中の、またはATCC受託番号97810もしくは97809に含まれるcDNAクローンによってコードされるような、完全アミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）それぞれ配列番号２もしくは４中の、またはATCC受託番号97810もしくは978 09に含まれるcDNAクローンによってコードされる31〜300位もしくは31〜170位のアミノ酸配列を有する成熟型TNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）それぞれ配列番号２および４中の31〜283位および31〜166位のアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）上記の(ａ)、(ｂ)、または（ｃ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。本発明のさらなる実施態様には、上記の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）または（ｄ）中のヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも90％同一、そしてより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）または（ｄ）中のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）または（ｄ）中のアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、ならびにこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法ならびに組換え技術によってTNFRポリペプチドまたはペプチドの産生のためにそれらを用いる方法に関する。 TNFRポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも 95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、TNFRポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは 3'末端位置において、または参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群中のいずれかに散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１または２に示されるヌクレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Com puter Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53 711)のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Bestfitは、SmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematics 2:482- 489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性のセグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、本発明による参照配列に例えば95％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。本出願は、TNFR活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図１または２（配列番号１および３）に示される核酸配列、または寄託されたcDNA の核酸配列と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がTNFR活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用するかをなお知っているからである。TNFR活性を有するポリペプチドをコードしない、本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ(1)TNFR遺伝子またはその対立遺伝子改変体をcDNAライブラリーから単離すること；(2)Vermaら， Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York (1988)に記載の、TNFR遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、「FISH」)；および、特定の組織におけるTNFRm RNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。しかし、実のところ、TNFRタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする図１または２（配列番号１および３）に示される核酸配列、あるいは寄託された cDNAの核酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「TNFR活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明のTNFR-6αタンパク質またはTNFR-6βタンパク質の成熟形態、または細胞外形態の活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される。TNFファミリーリガンドは、本発明のTNFR-6αおよびTNFR-6βを含むTNF-ファミリーレセプターに結合することによって、種々の細胞性応答を誘導する。TNFRタンパク質を発現する細胞は、TNFR-Iレセプターリガンドに対して強力な細胞性応答を有すると考えられ、これにはＢリンパ球(CD19+)、CD4およびCD8+Ｔリンパ球の両方、単球、ならびに内皮細胞が挙げられる。「TNF-ファミリーリガンドに対する細胞性応答」によって、細胞、細胞株、組織、組織培養物、または患者に対する任意の遺伝子型、表現型、および／または形態学的変化が意図され、これはTNF-ファミリーリガンドによって誘導される。示されるように、このような細胞性応答には、TNF-ファミリーリガンドに対する正常な生理学的応答だけではなく、アポトーシスの阻害によるもののような、増加した細胞増殖、または増加した細胞増殖の阻害に関連した疾患もまた、含まれる。上記についてのスクリーニングアッセイは、当該分野において公知である。このようなスクリーニングアッセイの１つは、例えば、Science246:181-296(1989 年10月)に記載されるような、レセプターの活性化によって引き起こされる細胞外pHの変化を測定する系における、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトされたCHO細胞）の使用を含む。例えば、TNF-ファミリーリガンドを、本発明のレセプターポリペプチドの成熟型を発現する細胞と接触させ得、そしてTNFRポリペプチドが活性であるかどうかを決定するために、２次メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が測定され得る。もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配列、または図１または２（配列番号１および３）に示される核酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が「TNFRタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセイを行うことすら必要なく、当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がまたTNFRタンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、当業者が、以下にさらに記載されるように、タンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸での置換）を十分に知っているからである。ベクターおよび宿主細胞本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるTNFRポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、一般に、ウイルス増殖は相補性宿主細胞においてのみ生じる。ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。 DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、phoAプロモーター、およびtacプロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418、またはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella t yphimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophi la S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞）；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、293細胞、およびBowes黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60 、およびpQE-9（QIAGEN,Inc.前述から入手可能）;Phagescriptベクター、Bluesc riptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A，pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、 pXT1，およびpSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pharmaciaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Davisら，Basic Methods I n Molecular Biology(1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、精製の間の、または続く取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化、およびタンパク質の精製のために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カナダ対応出願第2045869号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばhIL-5のようなヒトタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でFc 部分と融合されている。D.Bennettら，J．Molecular Recognition 8:52-58(1995 )、およびK.Johansonら，J．Biol．Chem．270：9459-9471(1995)を参照のこと。 TNFRタンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：直接単離されたか、または培養されたかにかかわらず、体液、組織、および細胞を含む天然の供給源からの精製産物；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得る。ポリペプチドおよびフラグメント本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２および４のアミノ酸配列を有する、単離されたTNFRポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドの部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。改変体および変異体ポリペプチド TNFRポリペプチドの特徴を改良または改変するために、タンパク質工学が使用され得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む、新規の変異体タンパク質または「ムテイン」、あるいは融合タンパク質を作成するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、少なくとも特定の精製条件および保存条件のもとでは、これらはより高い収率で精製され得、そして対応する天然のポリペプチドより良好な溶解性を示し得る。 N末端欠失変異体およびC末端欠失変異体例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態を含む多くのタンパク質について、１つ以上のアミノ酸が実質的な生物学的機能の損失なしでN末端またはC末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。例えば、Ronら、J.Biol.Chem.,268:2984-2988(1993)では、３個、８個または27 個のアミノ末端のアミノ酸残基を失ってもヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質を報告している。本発明の場合、本発明のタンパク質はTNFRポリペプチドファミリーのメンバーであることから、配列番号２および４（TNFR-6αおよび TNFR-6β）の49位のシステインまでのN末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、リンパ球の増殖およびアポトーシスの調節）を維持し得る。配列番号：２および４でのC49残基を含むさらなるN末端欠失を有するポリペプチドは、TNFR関連ポリペプチドのこれらの残基がジスルフィド架橋を形成し、レセプター結合およびシグナル伝達で必要とされる構造安定性を提供することが公知であるので、このような生物学的活性を維持することは期待されない。しかし、タンパク質のN末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失であっても、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じ得、他の生物学的活性はそれでも維持され得る。従って、TNFRタンパク質の完全ドメインまたは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導し、そして／または抗体に結合する短縮型タンパク質の能力は、一般に、完全タンパク質または細胞外ドメインの決して大部分ではない残基がN末端から除去される場合、維持される。完全タンパク質のN末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫的活性を維持するかどうかは、本明細書に記載されているかそうでなければ当該分野で公知である日常的な方法により容易に決定され得る。従って、本発明は、49番目の位置のシステイン残基までの配列番号２および４で示されるTNFRのアミノ酸配列のアミノ末端から欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオリドをさらに提供する。詳細には、本発明は、それぞれ配列番号２および４のm-30 0およびn-170残基のアミノ酸配列を含むTNFR-5ポリペプチドを提供する。ここで、mおよびnは、それぞれ1-49の範囲での整数であり、49は、完全なTNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチド（それぞれ、配列番号２および４で示される）のN末端から最初のシステイン残基の位置であり、これはTNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質の活性に必要であると考えられる。より詳細には、本発明は以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２の1-300、2-300、3-300、4-3 00、5-300、6-300、7-300、8-300、9-300、10-300、11-300、12-300、13-300、1 4-300、15-300、16-300、17-300、18-300、19-300、20-300、21-300、22-300、2 3-300、24-300、25-300、26-300、27-300、28-300、29-300、30-300、31-300、3 2-300、33-300、34-300、35-300、36-300、37-300、38-300、39-300、40-300、4 1-300、42-300、43-300、44-300、45-300、46-300、47-300、48-300、および49- 300；ならびに配列番号４の1-170、2-170、3-170、4-170、5-170、6-170、7-170 、8-170、9-170、10-170、11-170、12-170、13-170、14-170、15-170、16-170、 17-170、18-170、19-170、20-170、21-170、22-170、23-170、24-170、25-170、 26-170、27-170、28-170、29-170、30-170、31-170、32-170、33-170、34-170、 35-170、36-170、37-170、38-170、39-170、40-170、41-170、42-170、43-170、 44-170、45-170、46-170、47-170、48-170、および49-170。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ムテインの多くの例が知られている。例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端からの8-10アミノ otechnology7:199-216(1988))。本発明の場合では、本発明のタンパク質はTNFR ポリペプチドファミリーのメンバーであることから、配列番号２および４それぞれの193位および132位のシステインまでのC末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、リンパ球の増殖およびアポトーシスの調節）を維持し得る。配列番号２および４の193および132位のシステインを含むC末端欠失をさらに有するポリペプチドはそれぞれ、TNFレセプター関連ポリペプチドのこれらの残基が、レセプター結合に必要とされる構造的安定性を提供するためのジスルフィド架橋の形成に必要であることが公知であるので、このような生物学的活性を維持することが期待されない。しかし、タンパク質のC末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的活性はそれでも維持され得る。従って、短縮型のタンパク質の完全または成熟な形態のタンパク質を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は一般に、完全または成熟な形態のタンパク質の決して大部分ではない残基がC末端から除去された場合、維持される。完全なタンパク質のC末端残基を欠失した特定のポリペプチドがこのような免疫活性を維持するかどうかは、本明細書で記載される日常的な方法およびそうでなければ当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。したがって、本発明はそれぞれ配列番号２および４の193位および132位のシステインまでの、配列番号２および４で示されるTNFR-6αおよびTNFR-6βのアミノ酸配列のカルボキシル末端に由来する１つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は配列番号２および４それぞれでのアミノ酸配列の1-yおよび1 -z残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｙは193-300の範囲での任意の整数であり、そしてZは132-170の範囲での任意の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。本発明はまた、アミノ末端とカルボキシル末端の両方から欠失した１つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これらは一般には、配列番号２のm-y 残基および配列番号４のn-z残基（ｍ、ｎ、ｙ、およびｚは上述した整数）を有するポリペプチドとして記載され得る。 ATCC受託番号97810または97809に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全TNFRアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた含まれ、ここで、この部分はATCC受託番号97810または97809それぞれに含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端由来の１位から約49位までのアミノ酸、またはATCC受託番号97810または97809それぞれに含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列のカルボキシル末端由来の１位から約107位もしくは約58位までのアミノ酸、またはATCC受託番号978 10または97809に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列の上記したアミノ末端およびカルボキシル末端欠失体の任意の組合せを含まない。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。他の変異体上記で議論されたタンパク質の末端欠失形態に加えて、TNFRポリペプチドの幾つかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能に有意な影響なしに変化し得ることもまた、当事者により認識される。配列中でのこのような差違を考察する場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域があることに留意すべきである。従って、本発明は、実質的なTMFRポリペプチド活性を示すTNFRポリペプチド改変体または以下で議論されるタンパク質部分のようなTNFRタンパク質の領域を含むTNFRポリペプチド改変体をさらに含む。このような変異体は、当該分野で公知である一般的な規則に従って、活性に影響しないように選択される欠失、挿入、転移、反復、および、型置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換がいかにして生じるかに関するガイダンスが、Bowie,J.U.ら、「Decipherin g the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions, 」Science 247:1306-1310(1990)で提供され、ここで筆者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主だったアプローチが存在すること示している。最初の方法は進化のプロセスに依存し、ここで変異は天然の選択により受け入れられるか、または拒絶されるかのどちらかである。第２のアプローチは、クローン化された遺伝子ならびに機能的に維持する配列を同定するための選択物もしくはスクリーン物の特定部位でのアミノ酸変化を誘導するために遺伝子工学を使用する。筆者らが述べるには、これらの研究はタンパク質はアミノ酸置換に驚くほど寛容性であることを明らかにしてきた。筆者らはどのアミノ酸変化がタンパク質の特定の部位で許容性であり得るかどうかについてもさらに示している。例えば、ほとんどの包理したアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、一方で表面側鎖の特徴で一般に保存されるものはほとんどない。他のこのような表現型的なサイレント置換は、Bowie,J.U.ら（前出）およびその中で引用される参照に記載される。代表的には、保存的置換は、それぞれ脂肪性アミノ酸のAl a、Val、Leu、およびIleの間の置き換え、水酸性残基SerおよびThrの交換、酸性残基AspおよひGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間の置き換えである。従って、配列番号２、４、もしくは６または寄託されたcDNAによりコードされるそれらのポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされ得るかまたはコードされ得ないもの、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟または可溶性の細胞外ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合したもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が上記の形態のポリペプチド（例えば、IgG Fc融合領域ペプチド配列もしくはリーダー配列もしくは分泌配列または上記の形態のポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製について使用される配列）と融合したものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当事者の範囲内であると見なされる。従って、本発明のTNFRは、天然の変異もしくは人工操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、小さな性質の変化が好ましい(表１を参照のこと)。表１。保存的アミノ酸置換体。本発明のTNFRタンパク質の機能上重要なアミノ酸は、当該分野で公知の方法( 例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査型(alanine-scanning)変異誘発 (CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085(1989))により同定され得る。後者の手順は、分子のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は生物学活性（例えば、レセプター結合またはインビトロもしくはインビボでの増殖活性）について試験される。特別な目的は、高度に望ましい改善された特徴（例えば、凝集しにくい）を有するタンパク質を産生し得る荷電した別のアミノ酸または中性アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。凝集は活性を減少させるだけではなく、凝集体は免疫原性であり得ることから薬学的処方物を調製する場合にも問題であり得る(Pin ckardら、Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbinsら、Diabetes 36:838-845 (1987);Clelandら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1 993))。アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面のレセプターに対するリガンドの結合選択性を変化させ得る。例えば、Ostadeら、Nature 361:266-268(1993)は、TNFレセプターの２つの公知の型の１つのみに対するTNF-αの選択的な結合を生じる特定の変異体を記載する。リガンド−レセプター結合について決定的である部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識）により決定され得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899-904(1992)およびde Vosら、Science 255:306-312(1992))。 TNFR-6αおよびTNFR-6βはTNFRレセプター関連タンパク質ファミリーのメンバーであり、TNFRの生物学的活性を完全に排除するのではなく変調させるために、好ましくは、変異はTNFRの保存された細胞外ドメイン中のアミノ酸をコードする配列で、より好ましくはTNFレセプターファミリーのメンバー間で保存されていないこの領域内の残基中で作製される。本発明の一部を形成するものはまた、上記のTNFR変異体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製される。TNFRポリペプチドの組換え産生バージョンは、Smit hおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載されるone-step法により実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野で周知である方法で、本発明の抗TNFR-6α抗体および抗TNFR-6β抗体を使用して天然または組換えの供給源から精製され得る。本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたTNFR ポリペプチドをさらに提供する：（ａ）配列番号２または４で示されるか、またはATCC受託番号97810または97809に含まれるcDNAクローンによりコードされることにより示される完全アミノ酸配列を有する、完全長のTNFRポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号２での31〜300位のアミノ酸配列もしくは配列番号４での31〜170位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチドのアミノ酸配列；または（ｃ）配列番号２での31〜283位のアミノ酸配列もしくは配列番号４での31〜166位のアミノ酸配列、またはATCC受託番号97810もしくは97809に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するTNFR ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列。本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対して少なくとも約 90％の類似性、より好ましくは少なくとも95％の類似性、そしてなおより好ましくは少なくとも96％、97％、98％または99％の類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチドに対して、または配列番号２もしくは４のポリペプチドに対して少なくとも 80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％または95％の同一性、なおより好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％の同一性を含み、そして少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸のこのようなポリペプチドの部分をも含む。２つのポリペプチドについての「％の類似性」とは、類似性の決定のためのBe stfit program(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Gen etics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison, WI 53711)およびデフォルト設定を使用して２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより算出された類似性スコアを意図する。BestfitはSmithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489,1981)の局所的相同性アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性が最良のセグメントを見つけだす。例えば、TNFRポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、95％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列が、TNFRポリペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、または参照配列における総アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以上の隣接した基内のいずれかに散在した、これらの末端位置の間のどこかで起こり得る。実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix 用バージョン８、Genetics Computer Group，University Research Park，575 S cience Drive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターが設定される。本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲル、または分子ふるいゲル濾過カラム上で分子量マーカーとして使用され得る。下記に詳細に示すように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。これらは、下記のようにTNFRタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用であるか、またはTNFRタンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるTNFRタンパク質結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母２−ハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母２−ハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245-246(1989)に記載されている。エピトープ保有部分別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全てのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli ffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.(1983)「Antibodies that react with predetermined sites on proteins」,Science 219:660-666を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され、そして簡単な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するために有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)の777頁を参照のこと。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約15〜約30個の間のアミノ酸の配列を含む。TNFR特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの限定しない実施例は以下を含む：配列番号２のおよそAla31からおよそThr-46までの、およそPhe-57からおよそThr-117までの、およそCys-132からおよそThr-175までの、およそGly-185からおよそThr-194までの、およそVal-205 からおよそAsp-217までの、およそPro-239からおよそLeu-264までの、およびおよそAla-283からおよそPro-298までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；ならびに配列番号４のおよそAla-31からおよそThr-46までの、およそPhe-57からおよそ Gln-80までの、およそGlu-86からおよそHis-106までの、およそThr-108からおよそPhe-119までの、およそHis-129からおよそVal-138までの、およびおよそGly-1 42からおよそPro-166までのアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図４および図５で示されるJameson-Wolfの抗原指標の分析により、TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドの抗原性エピトープをそれぞれ保有するように決定され得る。本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段により産生され得る。例えば、Houghten,R.A(1985)「General method for the rap id solid-phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of ant igen-antibody interaction at the level of individual amino acids.」Proc. Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135を参照のこと；この「Simultaneous MultipleP eptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211号(19 86)でさらに記載される。本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、抗体を誘導するために当該分野で周知の方法に従って使用される。例えば、Sutcliffeら（前出）；W ilsonら（前出）；Chow,Mら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914;およびBittl e,F.J.ら、J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照のこと。本発明の免疫原性のエピトープ保有ペプチド（すなわち、全てのタンパク質が免疫源である場合に、抗体応答を誘導するタンパク質の部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Geysenら（前出）を参照のこと。さらになお、Geysen(1990)の米国特許第5,194,392号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に対して相補的なエピトープ（すなわち「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Geysen（1989）の米国特許第4,433,092号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Peralkylated Oligopeptide Mixturesに関するHoughten，R．A.ら（1996）の米国特許第5,480,971号は、直鎖C₁-C₇-アルキル過アルキル化（peralkylated ）オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。融合タンパク質当業者が理解するように、上記の本発明のTNFRポリペプチドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの一部と結合し得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を促進し、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(EP A3 94,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988))。IgG部分によるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体TNFRタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和において効率的であり得る(Fountoulakisら、J．Biochem．270:3958-3964(1995))。抗体本発明で使用されるTNFRタンパク質特異的抗体は、完全なTNFR-6αおよびTNFR -6βタンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得、これはキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）を用いて、あるいは十分に長い場合では（少なくともおよそ25アミノ酸）キャリアを用いずに動物の系（例えば、ウサギまたはマウス）に供される。本明細書で使用される用語「抗体(Ab)」または「モノクローナル抗体(Mab)」は、完全な分子ならびにTNFRタンパク質に対し特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメント）を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2フラグメントは完全な抗体のFcフラグメントを欠落し、そして循環からより迅速に除去され、完全な抗体の非特異的な組織への結合をより少なく有し得る(Wahlら、J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。従って、これらのフラグメントは好ましい。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかにより調製され得る。例えば、TNFRタンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に対して投与され得る。好ましい方法では、TNFRタンパク質の調製は、それを実質的に天然の混入物を皆無にするために調製および精製される。次いで、このような調製物は、より特異的な活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。最も好ましい方法においては、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。こ (1976);Hammerlingら：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevie r,N.Y.,(1981)563-681頁中）を使用して調製され得る。一般には、このような手順はTNFRタンパク質抗原，またはより好ましくはTNFRタンパク質発現細胞での動物（好ましくはマウス）の免疫化を含む。適切な細胞は、抗TNFR-6αタンパク質抗体または抗TNFR-6βタンパク質抗体に結合するそれらの能力により認識され得る。このような細胞は任意の適切な組織培養培地で培養され得るが；10％ウシ胎仔血清（約56℃で不活化）を補充し、ならびに約10g/lの非必須アミノ酸、約1,0 00U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシンを補充したEagle 改変Eagle培地中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合される。任意の適切なミエローマ細胞株が本発明に従って使用され得るが；ミエローマ細胞の親細胞株(SP20) （アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville Maryland)より入手可能）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地中で選択的に維持され、次いで、Wandsら(Gastroenterology 80:225-232(1981)) により記載される限界希釈によりクローン化される。次いで、このような選択を通じて入手されたハイブリドーマ細胞は、所望のTNFR抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。あるいは、TNFR抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディオタイプの抗体の使用を通じて２ステップの手順で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ自身の抗原であるという事実を使用し、しかもそれゆえに、第２の抗体に結合する抗体を入手することが可能である。この方法に従って、TNFRタンパク質特異的抗体は、動物（好ましくはマウス）を免疫化するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、そのTNFRタンパク質特異的抗体に結合する能力が、TN FRタンパク質抗原によりブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、TNFRタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるTNFRタンパク質特異的抗体の形成を誘導するための、動物の免疫化に使用され得る。本発明のFabおよびF(ab')2ならびに他の抗体のフラグメントは、本明細書で開示される方法に従って使用され得る。代表的には、このようなフラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを産生するために）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質切断により産生される。あるいは、TNFRタンパク質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用を通じて、または合成化学を通して産生され得る。ヒトにおける、インビボでの抗TNFRの使用については、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上述されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。総説については、Morrison,Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechniq ues 4:214(1986);Cabillyら、米国特許第4,816,567号；Taniguchiら、EP 171496 ;Morrisonら、EP 173494;Neubergerら、WO8601533;Robinsonら、WO870267l;Boul ianneら、Nature 312:643(1984);Neubergerら、Nature 314:268(1985)を参照のこと。免疫系関連障害診断法本発明者らは、TNFR-6αおよびTNFR-6βが、造血および形質転換組織で発現されることを、発見した。多数の免疫系関連障害について、TNFR遺伝子発現の実質的に変化された（増加または減少された）レベルが、このような障害を有する個体から得た免疫系組織またはその他の細胞または体液（例えば、血清および血漿）で、「標準」TNFR遺伝子発現レベル、すなわち、免疫系障害を有さない個体から得た免疫系組織または体液中のTNF発現レベルに比較して、検出され得る。従って、本発明は、免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体からの免疫系組織またはその他の細胞または体液でのTNFRタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された遺伝子発現レベルを標準TNFR遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系障害の指標となる。特に、ガンを有する哺乳動物のある種の組織は、対応の「標準」レベルに比較したとき、TNFRタンパク質およびTNFRをコードするmRNAの有意に減少されたレベルを発現すると考えられる。さらに、TNFRタンパク質の減少レベルは、ガンを有さない同種の哺乳動物からの血清に比較したとき、このようなガンを有する哺乳動物からの特定体液（例えば、血清および血漿）で、検出され得ると考えられる。従って、本発明は、ガンを含む免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体からの免疫系組織またはその他の細胞または体液でのTNFRタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された遺伝子発現レベルを標準TNFR遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系障害の指標となる。腫瘍の診断を含む免疫系における障害の診断が、すでに従来方法に従って実施されたときに、本発明は、予後指標として有用である。予後指標により、低下された遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床結果を経験する。「TNFRタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」によって、TNFR-6αタンパク質および／またはTNFR-6βタンパク質のレベル、またはTNFR -6αタンパク質および／またはTNFR-6βタンパク質をコードするmRNAレベルを、第一の生物学的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはmRNA レベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルのTNFRタンパク質レベルまたはmRNAレベルに対する比較による）に、定性または定量的に決定または評価することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプル中のTNFRタンパク質レベルまたはmRNAレベルは、測定および評価され、標準TNFRタンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較され、この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得られるか、または免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定される。当該分野で評価されるように、一旦標準TNFRタンパク質レベルまたはmRNAレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。「生物学的サンプル」によって、TNFRタンパク質またはmRNAを含有する、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、TNFRタンパク質の遊離細胞外ドメイン（または可溶性型）を含有する体液(血清、血漿、尿、滑液、および髄液のような)、免疫系組織、およびTNFRの完全または細胞外ドメインを発現することが認められているその他の組織供給源を包含する。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルが、mRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。本発明はまた、TNFR遺伝子中の変異を診断するための、本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、本発明の遺伝子の１つに変異が存在するときは、症状は、本発明のレセプターポリペプチド産生の欠如から生じる。さらに、レセプターポリペプチド活性を増強する変異が、レセプターポリペプチドの過剰発現に関連する疾患、例えば、内毒素ショックを導く。遺伝子中の変異は、欠陥遺伝子の配列を正常遺伝子の配列と比較することによって検出され得る。次に、変異遺伝子が、疾患症状または疾患症状に対する感受性に関連することを確証し得る。すなわち、本発明のレセプターポリペプチドの発現不足を導く変異遺伝子が、TNFが腫瘍増殖を阻害できないことと関連する。前出アッセイによって診断され得るその他の免疫系障害は、過敏症、アレルギー、感染性疾患、対宿主性移植片病(graft-host disease)、免疫不全症、自己免疫疾患などを包含する。本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の方法によってDNAレベルで検出され得る。診断に使用される核酸は、例えば、血液、尿、唾液、およびその他の組織からの組織生検からのような、患者の細胞から得られ得る。ゲノムDNAが、検出のために直接使用され得るか、または、分析の前に、PCR（Saikiら、Nature ，324:163-166(1986)）を用いて酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的に使用され得る。例として、この発明の核酸に相補的なPCRプライマーが、本発明のヒト遺伝子での変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入が、正常遺伝子型との比較での増幅産物の大きさの変化によって検出される。点変異は、増幅DNAを、放射標識RNAと、あるいは本発明の放射標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、RNase A消化または融解温度差によって、ミスマッチ配列二重鎖から区別され得る。このような診断は、特に、出生前テストまたは新生児テストに有用である。参照遺伝子と「変異体」との間の配列の相違は、直接DNA配列決定法によって明らかにされ得る。さらに、クローン化DNAセグメントが、特定DNAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は、PCRと組み合わされたときに大きく増強される。例えば、配列決定プライマー(primary)は、二本鎖PCR産物または改変PCR産物によって生成された一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを使用した従来の方法、または蛍光タグを使用した自動配列決定手順によって実施される。特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNaseおよびS1保護または化学切断法(例えば、cottonら、PNAS，85:4397-4401(1985))）によって明らかにされ得る。生物学的サンプル中のTNFRタンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく方法を用いて実施され得る。例えば、組織でのTNFRタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法によって研究され得る(Jalkanen，M．ら、J．Cell．Biol．101:976 -985(1985);Jalkanen，M．ら、J．Cell．Biol．105:3087-3096(1987))。TNFR遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）およびラジオイムノアッセイ(RIA) ）を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、グルコースオキシダーゼのような酵素標識、およびヨウ素(¹²⁵I、¹²¹I)、炭素(¹⁴C)、イオウ(³⁵S)、トリチウム(³H)、インジウム(¹¹²In)、およびテクニチウム（^99mT c）のようなラジオアイソトープ、およびフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、およびビオチンを包含する。個体から得た生物学的サンプル中のTNFRタンパク質レベルのアッセイに加えて、TNFRタンパク質はまた、画像診断によってインビボで検出され得る。TNFRタンパク質のインビボ画像診断のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、NMR 、またはESRによって検出可能なものを包含する。Ｘ線撮影については、適切な標識は、バリウムまたはセシウムのようなラジオアイソトープを包含し、これは検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかに有害ではない。NMRおよびESRのための適切なマーカーは、ジュウテリウムのような検出可能な特徴的なスピンを有するものを包含し、関連ハイブリドーマに対する栄養物の標識によって、抗体へ組み込まれ得る。ラジオアイソトープ(例えば、¹³¹I、¹¹²In、^99mTc)、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような、適切な検出可能イメージング部分で標識された、TNFR特異抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験されるべき哺乳動物へ導入される(例えば、非経口的、皮下的または腹腔内に)。被検体の大きさおよび使用される画像診断システムが、診断画像を作成するために必要な画像部分の量を決定することは、当該分野で理解される。ラジオアイソープ部分の場合には、ヒト被検体について、注入される放射活性の量は、通常、約5〜20ミリキュリーの^99mTcの範囲である。次に、標識抗体または抗体フラグメントは、TNFRタンパク質を含有する細胞の位置に、優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像診断は、S.W.Burchielら、”Immunopharmacokinetics of Radi olabeled Antibodies and Their Fragments”（Tumor Imagingの第13章:The Rad iochemical Detection of Cancer，S.W．BurchielおよびB.A．Rhodes編、Masson Publishing Inc．(1982)）に記載されている。処置腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーリガンドが、細胞障害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写制御を含む、多数の細胞応答を誘導する、最も多面的なサイトカインに属することは、公知である(Goeddel，D.V.ら、 ”Tumor Necrosis Factors:Gene Structure and Biological Activites,”Symp ．Quant．Biol．51:597-609(1986)，Cold Spring Harbor;Beutler，B.,およびCe rami，A.，Annu．Rev．Biochem．57:505-518(1988);Old，L.J.，Sci．Am．258:5 9-75(1988);Fiers，W.，FEBS Lett．285:199-224(1991))。TNF-ファミリーリガンドは、TNF-ファミリーレセプターと結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。TNFRポリペプチドを発現し、TNFR-6αリガンドおよびTNFR -6βリガンドに対する有力な細胞応答を有する細胞は、リンパ球、内皮細胞、ケラチノサイト、および前立腺組織を包含する。「TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答」によって、TNF-ファミリーリガンドによって誘導される、細胞、細胞株、組織、組織培養物、または患者に対する、あらゆる遺伝子型、表現型、および／または形態学的変化が意図される。示されているように、このような細胞応答は、TNF-ファミリーリガンドに対する正常な生理学的応答のみならず、増大されたアポトーシスまたはアポトーシス阻害に関連する疾患に対する応答も包含する。増大された細胞生存性、またはアポトーシス阻害に関連する疾患は、ガン（例えば、濾胞性リンパ腫、p53変異による癌腫、および、乳ガン、前立腺ガン、カポジ肉腫、および卵巣ガンのようなホルモン依存性腫瘍）；自己免疫疾患（例えば、全身紅斑性狼瘡、および免疫関連糸球体腎炎、慢性関節リウマチ）および、ウイルス感染症(例えば、ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、およびアデノウイルス)、形成細胞対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶を包含する。増大アポトーシス関連疾患は、AIDS；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症、網膜色素変性、小脳変性）；脊髄異形成症候群(例えば、再生不良性貧血)、虚血損傷(例えば、心筋梗塞、発作、および再潅流損傷に原因するもの)、毒素誘発肝疾患(例えば、アルコールに原因するもの)、敗血症性ショック、悪液質、および食欲不振を包含する。従って、１つの局面で、本発明は、TNF-ファミリーリガンドにより誘導されるアポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、TNFRポリペプチドを発現する細胞への、TNFR媒介シグナリングを増大し得るTNFRポリプチド、アナログ、またはアゴニストの有効量の投与を包含する。好ましくは、TNFR媒介シグナリングは、減少されたアポトーシスが示される疾患を処置するために増大される。アンタゴニストは、TNFRの可溶性型およびTNFRポリペプチドに対し指向されるモノクローナル抗体を包含し得る。「アゴニスト」によって、アポトーシスを増強または可能にし得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。「アンタゴニスト」によって、アポトーシスを阻害し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。本発明の任意候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」が、アポトーシスを増強または阻害し得るかどうかは、下記により詳細に記載されているものを含む、当該分野で公知のTNF-ファミリーリガンド／レセプター細胞応答アッセイを用いて決定され得る。このようなスクリーニング手順の１つは、本発明のレセプターを発現するためにトランスフェクトされた、メラニン含有細胞の使用を包含する。このようなスクリーニング方法は、1992年2月6日に公開されたPCT WO 92/01810に記載されている。このようなアッセイは、例えば、レセプターをコードするメラニン含有細胞の、TNF-ファミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト（またはアゴニスト）の両方との接触による、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する（または増強する）化合物についてスクリーニングするために使用され得る。リガンドによって生成されたシグナルの阻害または増強は、その化合物が、リガンド／レセプターシグナリング経路のアンタゴニストまたはアゴニストであることを示す。その他のスクリーニング方法は、レセプター活性化による、例えば、Science 246:181-296(1989年10月)に記載されているような、細胞外pH変化を測定するシステムでの、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そして、第二メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が測定されて、潜在的な化合物が、レセプターを活性化するかまたは阻害するかが決定され得る。別のこのようなスクリーニング方法は、レセプターを一時的に発現するために、レセプターをコードするRNAのXenopus卵母細胞への導入を包含する。次に、レセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物と接触させられ、その後、レセプターの活性化を阻害すると考えられる化合物についてのスクリーニングの場合には、カルシウムシグナルの阻害または活性化が検出され得る。別のスクリーニング方法は、レセプターがホスフォリパーゼCまたはDに連結されている構築物の、細胞での発現を包含する。このような細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎細胞などを包含する。スクリーニングは、レセプターの活性化またはホスフォリパーゼシグナルからのレセプターの活性化阻害を検出することによって、上記のように完了され得る。別の方法は、表面上にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合阻害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物についてのスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面上でレセプターを発現するように、レセプターをコードするDNA で真核細胞をトランスフェクトする工程、および既知リガンドの標識形態の存在下で細胞を化合物と接触させる工程を包含する。そのリガンドは、例えば、放射活性によって標識され得る。レセプターに結合された標識リガンド量が、例えば、レセプターの放射活性を測定することによって、測定される。その化合物が、レセプターに結合する標識リガンドの減少によって決定されるように、レセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニングアッセイは、Tartaglia，L.A.およびGoeddel，D.V.，J．Biol．Chem．267(7):43 04-4307(1992)に記載されている。従って、さらなる局面では、スクリーニング方法は、候補アゴニストまたはアンタゴニストが、TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得るかを決定するために提供される。その方法は、TNFRポリペプチドを発現する細胞と、候補化合物およびTNF-ファミリーリガンドとを接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、および、その細胞応答を標準細胞応答と比較する工程を包含し、標準は、接触を候補化合物の非存在下でリガンドを用いて実施したときにアッセイされ、そのことによって、標準に対して増大された細胞応答が、候補化合物がリガンド／レセプターシグナリング経路のアゴニストであることを示し、そして、標準に対して減少された細胞応答が、候補化合物がリガンド／レセプターシグナリング経路のアンタゴニストであることを示す。「細胞応答をアッセイする」によって、候補化合物および／またはTNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、T細胞増殖またはトリチウム化チミジン標識の増加または減少の決定または評価）が意図される。本発明によって、TNFRポリペプチドを発現する細胞は、内因性または外因的に投与されたTNF-ファミリーリガンドのいずれかと接触され得る。本発明に従うアゴニストは、例えば、TNFファミリーリガンドペプチドフラグメント、形質転換増殖因子、神経伝達物質(グルタメート、ドーパミン、N-メチル-D-アスパルテートのような)、腫瘍抑制物質(p53)、細胞溶解T細胞、および抗代謝拮抗物質のような、天然に存在する化合物および合成化合物を包含する。好ましいアゴニストは、例えば、シスプラチン(cisplatin)、ドキソルビシン(doxo rubicin)、ブレオマイシン(bleomycin)、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセート、およびビンクリスチンのような化学療法薬を包含する。その他は、エタノールおよび-アミロイドペプチドを包含する(Scienc e 267:1457-1458(1995))。さらに好ましいアゴニストは、TNFRポリペプチドに対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを包含する。TNF-ファミリーレセプターに対して惹起されたこのようなアゴニスト抗体は、Tartaglia，L.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9292-9296 (1991)；および、Tartaglia，L.A.およびGoeddel，D.V.，J．Biol．Chem．267(7 )4304-4307(1992)に開示されている。PCT出願WO 94/09137もまた参照のこと。本発明に従うアンタゴニストは、例えば、CD40リガンド、中性アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン、ウイルス遺伝子(アデノウイルスE1B、バキュロウイルスp35、およびIAP、ウシ天然痘ウイルスcrmA、エプスタイバーウイルスBH RF1、LMP-1、アフリカブタ熱ウイルスLMW5-HL、およびヘルペスウイルスyl 34.5 のような)、カルパインインヒビター、システインプロテアーセインヒビター、および腫瘍プロモーター（PMA、フェノバルビタール、および-ヘキサクロロシクロヘキサンのような）のような、天然に存在する化合物および合成化合物を包含する。その他のアンタゴニストは、TNFRポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されたポリクローナルおよびモノクローナルアンタゴニスト抗体を包含する。TNF-ファミリーレセプターに対して惹起されたこのようなアンタゴニスト抗体は、Tartaglla，L.A.およびGoeddel，D.V.，J．Biol．Chem．267(7)4304- 4307(1992)およびTartaglia，L.A.ら、Cell 73:213-216(1993)に記載されている。PCT出願WO 94/09137もまた参照のこと。その他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を包含する。アンチセンス技術は、アンチヤンスDNAまたはRNAを介して、または三重ヘリックス形成を介して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス方法は、例えば、Okano，J．Neurochem．56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)に考察されている。三重ヘリックス形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research 6: 3073(1979);Cooneyら、Science 241:456(1988);および、Dervanら、Science 251 :1360(1991)に考察されている。その方法は、ポリヌクレオチドの相補的DNAまたはRNAへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード部分は、長さ約10塩基対から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、そのことによって、転写およびレセプター産生を阻む。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRN Aにハイブリダイズし、mRNA分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAが、レセプター産生を阻害するために、インビボで発現され得るように、細胞へ送達され得る。本発明に従うさらなるアンタゴニストは、TNFRの可溶性形態（すなわち、全長レセプターの細胞外領域からのリガンド結合ドメインを含むTNFRフラグメント）を包含する。レセプターのこのような可溶性形態（天然に存在するか、または合成であり得る）は、TNF-ファミリーリガンドへの結合について細胞表面TNFRと競合することによって、TNFR媒介シグナリングに拮抗作用をなす。従って、リガンド結合ドメインを含むレセプターの可溶性形態は、TNF-ファミリーリガンドによって誘導される腫瘍壊死を阻害し得る、新規サイトカインである。その他のこのようなサイトカインは当該分野で公知であり、Fasリガンドによって誘導されるアポトーシスを制限するように生理学的に作用する、Fas B（マウスFasレセプターの可溶性形態）を包含する(Hughes，D.P.およびCrispe，I.N.，J．Exp．Med． 182:1395-1401(1995))。示されているように、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体アゴニストまたはアンタゴニストは、Tartaglia，L.A.およびGoeddel，D.V.，J．Bio l．Chem．267(7):4304-4307(1992):Tartaglia，L.A.ら、Cell 73:213-216(1993) 、およびPCT出願WO 94/09137に開示されている方法に従って惹起され得る。本明細書で使用されているように、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」 (mAb)は、完全分子、ならびに、抗原に結合し得るそのフラグメント（例えば、F abおよびF(ab')₂フラグメントのような）を包含することが意図される。FabおよびF(ab')₂フラグメントは、完全抗体のFcフラグメントを欠損し、より迅速に循環から排除され、完全抗体のより特異的でない組織結合を有し得る(Wahlら、J． Nucl．Med．24:316-325(1983))。本発明に従う抗体は、上記および当該分野で公知の種々任意の方法によって、調製され得る。細胞外ドメインに結合するタンパク質およびその他の化合物もまた、本発明に従う候補アゴニストおよびアンタゴニストである。このような結合化合物は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて「捕捉され」得る(FieldsおよびSong，Nat ure 340:245-246(1989))。酵母ツーハイブリッドシステムの改変型は、Roger Br entおよび彼の共同研究者らによって記載された(Gyuris，J.ら、Cell 75:791-80 3(1993);Zervos，A.S.ら、Cell 72:223-232(1993))。「TNF-ファミリーリガンド」によって、TNFレセプターファミリーのメンバーに結合し、リガンド／レセプターシグナリング経路を誘導し得る、天然に存在する、組換え、および合成のリガンドが意図される。TNFリガンドファミリーのメンバーは、TNFR-6αリガンドおよびTNFR-6βリガンド、TNF-α、リンホトキシン (lymphdtoxin)-α(LT-α、TNF-βとしても公知である)、LT-β、FasL、CD40、CD 27、CD30、4-1BB、OX40、TRAIL、および神経成長因子（NGF）を包含するが、これらに限定されない。本発明の代表的な治療適用は、下記により詳細に考察される。AIDSを定義する免疫不全の状態は、CD4⁺Tリンパ球の数および機能の減少に副次的である。最近の報告は、CD4⁺T細胞の日々の減少が、3.5×107および2×109細胞の間であると評価している(Wei X.ら、Nature 373:117-122(1995))。HIV感染の環境下でのCD4⁺ T細胞枯渇の１つの原因は、HIV誘導アポトーシスであると考えられている。事実、HIV誘導アポトーシス細胞死は、インビトロだけでなく、より重要なことに、感染個体でも実証された(Ameisen，J.C.，AIDS 8:1197-1213(1994);Finkel，T .H.，およびBanda，N.K.，Curr．Opin．Immunol．6:605-615(1995);Muro-Cacho ，C.A.ら、J．Immunol．154:5555-5566(1995))。さらに、アポトーシスおよびCD 4⁺T-リンパ球枯渇は、AIDSの異なる動物モデルで密接に相関し(Brunner，T.ら、 Nature 373:441-444(1995);Gougeon，M.L.ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 9: 553-563(1993))、アポトーシスは、ウイルス複製がAIDSをもたらさないこれらの動物モデルでは認められない(Gougeon，M.L.ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 9:553-563(1993))。さらなるデータは、HIV感染個体からの非感染だが感作または活性化されたTリンパ球は、TNF-ファミリーリガンドFasLと遭遇後に、アポトーシスを経ることを示す。HIV感染後に死をもたらす単球細胞株を使用して、U93 7細胞のHIVによる感染が、FasLのデノボ発現をもたらすこと、およびFasLが、HI V誘導アポトーシスを媒介することが実証されている(Badley，A.D.ら、J．Virol ．70:199-206(1996))。さらに、TNF-ファミリーリガンドは、非感染マクロファージで検出可能であり、その発現は、HIV感染後にアップレギュレートされ、非感染CD4 Tリンパ球の選択的殺傷をもたらした(Badley，A.D.ら、J．Virol．70:1 99-206(1996))。従って、本発明によって、HIV⁺個体を処置するための方法が提供され、この方法は、本発明のアンタゴニストを、CD4 Tリンパ球の選択的殺傷を減少させるために投与することを包含する。投与様式および投与量は、下記に詳細に考察されている。同種移植片拒絶では、レシピエント動物の免疫系は、ほとんどの場合免疫系は周囲抗原によってのみ感作されるので、応答するように前もって感作されていない。同種のその他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示されるのと同じようには、提示されていない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制養生法は、免疫系がエフェクター期に到達することを阻むように設計される。しかし、異種移植片拒絶の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶よりも疾患再発により類似し得る。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島細胞の破壊によって示されるように、すでに活性化されている。従って、疾患再発では、免疫系はすでにエフェクター期にある。活性化され、エフェクター細胞へ分化されたリンパ球は、TNFRポリペプチドを発現するので、本発明のアゴニストは、同種移植片および異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得、そのことによって、TNFR活性を増強する化合物に感受性である。従って、本発明はさらに、免疫学的寛容組織を作製するための方法を提供する。本発明のアゴニストはさらに、炎症性腸疾患の処置に使用され得る。処方物 TNFRポリペプチド組成物は処方され、個々の患者の臨床状態(特に、TNFR-6α ポリペプチドまたはTNFR-6βポリペプチド単独での処置の副作用)、TNFRポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与計画、および当業者に公知のその他の要因を考慮して、良好な医療処置と一致した様式で投与される。従って、本明細書での目的のためのTNFRポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。一般的な提案として、用量あたり非経口的に投与されるTNFRポリペプチドの薬学的に有効な全体量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であるが、上記に示されているように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましくは、ヒトに対して、ホルモンにつき約0.01および1mg/kg/日の間の範囲である。継続的に投与される場合、TNFRポリペプチドは、代表的には、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、1日あたり1〜4回注入によって、または、例えば、ミニポンプを使用した継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。観察に必要な処置の長さは変化し、応答が生じる処置後間隔は、所望の効果に依存して変化するようである。本発明のTNFRを含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口、槽内(intra cistemally)、腟内、腹腔内、局所(粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチによるように)、口腔に(bucally)、または経口または経鼻スプレーとして、投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」によって、非毒性固体、半固体、または液状充填剤、希釈物、カプセル化材料、または任意型の処方補助剤が意味される。本明細書で使用されているように、用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下(intrasternal)、皮下、および関節内注射および注入を包含する、投与様式のことである。 TNFRポリペプチドはまた、持続放出システムにより適切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル(m irocapsule)）の形態での半透過性ポリマーマトリックスを包含する。持続放出マトリックスは、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー(Sidman，U.ら、Biopolyme rs 22:547-556(1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(R．Langerら、J．Biomed．Mater．Res．15:167-277(1981)、およびR．Langer，Chem．Tech． 12:98-105(1982))、エチレンビニルアセテート（R．Langerら、同書）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を包含する。持続放出TNFRポリペプチド組成物はまた、リポソーム包括TNFRポリペプチドを包含する。TNFRポリペプチド含有リポソームは、それ自体既知の方法によって調製される：DE 3,218,121 ;Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）82:3688-3692(1985);Hwangら、Pro c．Natl．Acad Sci.（USA）77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;EP 88,04 6:EP 143,949;EP 142,641;日本特許出願83-118008;米国特許第4,485,045号および第4,544,545号;および、EP 102,324。一般的に、リポソームは、脂質含有量が約30モル％コレステロールより多い、小さな（約200〜800オングストローム）単ラメラ型であり、選択される割合は、最適なTNFRポリペプチド治療について調整される。非経口投与については、１つの実施態様で、TNFRポリペプチドは、一般的に、単位投与量注入形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）の所望の純度のそれを、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ処方物のその他の成分と適合性であるもの）と混合することにより、処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害なことが知られているその他の化合物を含有しない。一般的に、処方物は、TNFRポリペプチドを均質および密接に、液体キャリアまたは細分割固体キャリアまたは両方と接触させることによって、調製される。次いで、必要に応じて、製品は、所望の処方物に成形される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液を包含する。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような、非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に、本明細書において有用である。キャリアは、等張性および化学安定性を増強する物質のような、微量の添加物を適切に含有する。このような材料は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、およびその他の有機酸またはその塩類のような、緩衝剤；アスコルビン酸のような、抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような、タンパク質；ポリビニルピロリドンのような、親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのような、アミノ酸；単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含むその他の炭水化物；EDTAのような、キレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような、糖アルコール；ナトリウムのような、対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマー(poloxamers)、またはPEGのような、非イオン界面活性剤を包含する。 TNFRポリペプチドは、代表的には、約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは1〜1 0mg/mlの濃度で、pH約3〜8でこのようなビヒクル中に処方される。特定の前記賦形剤、キャリア、または安定剤の使用が、TNFRポリペプチド塩の形成をもたらすことは、理解される。治療投与に使用されるTNFRポリペプチドは、滅菌されなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜）を通す濾過によにって、容易に完了される。治療TNFRポリペプチド組成物は、一般的に、滅菌出入口を有する容器（例えば、皮下注射針によって刺し得る栓を有する静脈内点滴用溶液バッグまたはバイアル）へ入れられる。一般的に、TNFRポリペプチドは、単位または多数回投与容器（例えば、密封アンプルまたはバイアル）中に、水溶液または再構成用の凍結乾燥処方物として、貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、10mlバイアルは、滅菌濾過された1%(w /v)TNFRポリペプチド水溶液（５ml）で満たされ、得られた混合物は、凍結乾燥される。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥TNFRポリペプチドを再構成することによって、調製される。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた、１つ以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と、薬学的または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が伴われ得、この通知は、ヒト投与に対する製造、使用または販売の機関による認可を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、その他の治療化合物と併用して使用され得る。染色体アッセイ本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト染色体における特定の位置に特異的に標的化され、そしてハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現時点では、実際の配列データ（反復多型）に基づく染色体マーカー試薬のほとんどが、染色体位置をマーカーづけするために利用可能ではない。本発明による染色体へのDN Aのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一歩である。この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるcD NAは、TNFRタンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために用いられる。これは、一般的に入手可能である、種々の周知の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のために周知の技術を用いて、インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムDNAが用られる。さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは、15〜25bp）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを複雑化する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために用いられる。中期染色体長へのcDN Aクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「FISH」）は、一工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ得る。この技術は、50または60bp 程度の短さのcDNA由来のプローブと共に用いられ得る。この技術の概説については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual Of Basic Techniques，Pergamon Pr ess，New York(1988)を参照のこと。一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理学的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance In Man（Johns Hopkins Univers ity，Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連が、連鎖分析（物理学的に隣接した遺伝子の共同遺伝）によって同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常個体でも認められない場合、変異は、疾患の原因因子のようである。本発明に一般的に記載されるように、以下の実施例を参照することにより、本発明は、より迅速に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定として意図されない。実施例実施例１：E.coliにおけるTNFR-6αおよびTNFR-6βの発現および精製細菌性発現ベクターpQE60を、本実施例の細菌性発現のために使用する(QIAGEN ，Inc.,9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60はアンピシリン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導性プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN Inc.（前出）から販売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂を用いてアフィニティー精製を可能にする、ヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードするDNAフラグメントが、このペプチドのカルボキシル末端に共有結合した６つのHis残基（すなわち、「６×Hisタグ」）を有するポリペプチドを産生するような様式で挿入され得るように、配置される。しかし、この実施例において、ポリペプチドをコードする配列は、６Hisコドンの翻訳が妨げられ、それゆえ、ポリペプチドは６×Hisタグを伴わずに産生されるように挿入される。 TNFR-6αおよびTNFR-6βアミノ酸配列の成熟形態を含むTNFR-6αおよびTNFR-6 βタンパク質の所望の部分をコードするDNA配列は、TNFR-6αまたはTNFR-6βタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニーリングし、そしてcDNAコード配列の3'側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託されたcDNAクローンから増幅される。pQE60ベクターにおけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、それぞれ、5'および3'配列に加えられる。 TNFR-6αタンパク質の成熟形態をクローニングするために、5'プライマーは、下線を付したNcoI制限部位を含む、配列5'CGC CCA TGG CAG AAA CAC CCA CCT AC 3'（配列番号19）を有する。当然のように、5'プライマーが開始するタンパク質コード配列の位置は、成熟形態より短いかまたは長い完全なタンパク質の所望の部分を増幅するために変動され得ることを、当業者は理解する。3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位を含む、配列5'CGC AAG CTT CTC TTT CAG TGC A AG TG3’（配列番号20）を有する。TNFRTNFR-6βタンパク質の成熟形態をクローニングするために、5'プライマーは、上記の配列番号19の配列を有し、そして3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位を含む、配列5'CGC AAG CTT CTC CTC AGC TCC TGC AGT G3'（配列番号21）を有する。次いで、増幅されたTNFR-6αおよびTNFR-6βのDNAフラグメントならびにpQE60 ベクターは、NcoIおよびHindIIIで消化され、次いで消化されたDNAは、ともに連結される。制限されたpQE60ベクターへTNFR-6αおよびTNFR-6βのDNAを挿入することによって、IPTG誘導性プロモーターおよび開始AUGを有するインフレームから下流の、その関連終止コドンを含むTNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質コード領域を配置する。この関連終止コドンは、挿入位置の下流の６Hisコドンの翻訳を妨げる。連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989) に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換する。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coli株M15/rep4を本明細書中に記載の例示的実施例を行うにあたって使用する。この株（これは、 TNFR-6αまたはTNFR-6βのタンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一の株である）は、QIAGEN Inc.,（前出）から入手可能である。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされたDNAの同定を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認する。所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培地中で一晩（「O/N」）増殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培地に接種する。細胞を、0.4と0.6との間の、600nmでの光学密度（「0D600」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）１mMの最終濃度で加えて、lacIリプレッサーを不活化することにより、lacリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベートする。次いで、細胞を遠心分離により採集する。次いで、TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドを精製するために、細胞を、6M グアニジン-HCl、pH8中で４℃で３〜４時間撹拌する。細胞片を、遠心分離により除去し、そしてTNFR-6αおよびTNFR-6βを含む上清を、200mM NaClを補充した 50mM Na-酢酸緩衝液(pH6)に対して透析する。あるいは、このタンパク質を、プロテアーゼインヒビターを含む500mM NaCl、20％グリセロール、25mM Tris/HCl pH7.4に対して透析することにより、タンパク質を首尾良く再び折り畳みさせ得る。再生の後、タンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し得る。あるいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程を用いて、純粋なTNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質を得ることができる。精製されたタンパク質を、４℃で保存するかまたは−80℃で凍結する。以下の代替方法を用いて、封入体の形態で存在する場合、E.coli中で発現されたTNFR-6αまたはTNFR-6βを精製し得る。他に特定されない限り、以下の工程全てを４〜10℃にて実施する。 E.coli発酵の産生相の終了の際に、細胞培養物を４〜10℃まで冷却し、そして細胞を、15,000rpm(Heraeus Sepatech)での連続的な遠心分離によって採取する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質予測収量および必要とされる精製タンパク質の重量に基づいて、細胞ペーストの適切な量を、100mM Tris、50mM E DTA、pH7.4を含む緩衝液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサー（high shear m ixer）を用いて、均質な懸濁液に分散させる。次いで、細胞を、溶液をマイクロフルイダイザー(microfluidizer)(Microfuid ics，Corp.またはAPV Gaulin Inc.)に4000〜6000psiで２回通過させることによって溶解させる。次いで、このホモジネートを、0.5M NaClの最終濃度までNaCl 溶液と混合し、続いて、7000×gで15分間遠心分離する。得られるペレットを、0 .5M NaCl、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.4を用いて再度洗浄する。得られた洗浄封入体を、1.5Mグアニジン塩酸塩(GuHCl)で２〜４時間可溶化する。7000×gで15分間遠心分離した後、ペレットを廃棄し、そしてTNFR-6αまたはTNFR-6βポリペプチドを含む上清を、さらにGuHCl抽出を可能にするように４ ℃で一晩インキュベートする。不溶性粒子を除去するための高速遠心分離(30,000×g)の後に、GuHCl可溶化したタンパク質を、50mMナトリウム、pH4.5、150mM NaCl、2mM EDTAを含む、20容量の緩衝液とGuHCl抽出物とを、強力な撹拌により素早く混合することによって再折り畳みさせる。再折り畳みされ、希釈されたタンパク質溶液を、撹拌することなく、さらなる精製工程の前に12時間にわたって４℃で保持した。再折り畳みされたTNFレセプターポリペプチド溶液を明澄化するために、予め調製された、40mM酢酸ナトリウム、pH6.0で平衡化された適切な表面積を有する0 .16μmのメンブレンフィルター（例えば、Filtron）を装備した接線濾過装置（t angential filtration unit）を用いる。濾過されたサンプルを、陽イオン交換樹脂（例えば、Poros HS-50、Perseptive Biosystems）上に装填する。カラムを 40mM酢酸ナトリウム、pH6.0で洗浄し、そして同じ緩衝液中に250mM、500mM、100 0mM、および1500mMのNaClを用いて、段階様式で溶出する。溶出物を280nmでの吸光度で連続的にモニターする。画分を回収し、SDS-PAGEでさらに分析する。次いで、TNFレセプターポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次いで、希釈されたサンプルを、予め調製した、強陰イオン交換樹脂（Poros HQ-50、Perseptive Biosystems）および弱イオン交換樹脂(Poros C M-20、Perseptive Biosystems)の直列カラムのセットに装填する。カラムを40mM 酢酸ナトリウム、pH6.0で平衡化する。両カラムを、40mM酢酸ナトリウム、pH6.0 、200mM NaClで洗浄する。次いで、CM-20カラムを、0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.0から、1.0M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.5までの範囲の10カラム容量の直線勾配を用いて溶出する。画分を、溶出物のA₂₈₀連続モニタリング下で回収する。次いで、TNFR-6αまたはTNFR-6βポリペプチドを含む画分（例えば、16％ SDS-PAGEにより決定される）をプールする。得られたTNFレセプターポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工程の後、95％を超える純度を示す。主要でない夾雑バンドは、５μgの精製タンパク質を装填した場合に、クーマシーブルー染色した16％ SDS-PAGEゲルから観察される。精製タンパク質をまた、エンドトキシン/LPS汚染について試験し、そして代表的にはLPS含量は、LALアッセイに従って0.1ng/ml未満である。実施例２：バキュロウイルス発現系におけるTNFR-6αおよびTNFR-6βタンパク質のクローニングおよび発現この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を用いて、その天然に関与する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全なタンパク質をコードするクローニングされたDNAを、成熟TNFR-6αまたはTNFR-6βタンパク質を発現するバキュロウイルスに、Summerら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures、Texas Agricultural Experimen tal Station Bulletin第1555号(1987)に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNP V)の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、BamHI、XbaI、およびAsp718のような簡便な制限部位を含む。サルウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方向で、弱Drosophilaプロモーターの制御下で、E.coli 由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入遺伝子は、野生型ウイルスのDNAとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列の両側に隣接し、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存ウイルスを産生する。当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチドおよびインフレームAUGを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記のベクター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）の代わりに用い得る。例えば、このようなベクターは、Luckowら、Virology 170:31〜39(1989)に記載される。寄託されたクローン中に、全長のTNFR-6αまたはTNFR-6βタンパク質をコードするcDNA配列（AUG開始コドン、および配列番号２または配列番号４に示される天然に関与するリーダー配列を含む）を、遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。TNFR-6αおよびTNFR-6 βの5'プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位を含む、配列5'CGC GGA T CC GCC ATC ATG AGG GCG TGG AGG GGC CAG3'(配列番号24)を有する。上記の全てのプライマーは、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947〜950(1987)に記載のように、真核生物細胞の翻訳を開始するための効率的なシグナルをコードする。TNFR -6αの3'プライマーは、下線を付したAsp718制限部位を含む、配列5'CGC GGT AC C CTC TTT CAG TGC AAG TG3'（配列番号25）を有する。TNFR-6βの3'プライマーは、下線を付したAsp718制限部位を含む、配列5'CGC GGT ACC CTC CTC AGC TCC TGC AGT G3'（配列番号27）を有する。増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jo lla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントを、上記に特定化されるように、用いられるプライマーの各々に適切な制限酵素で消化する。そして、再度１％アガロースゲル上で精製する。プラスミドを、同じ制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公知の日常的な技術を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。次いで、このDNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このフラグメントおよび脱リン酸化プラスミドを、T4 DNAリガーゼで連結する。E.coli HB101またはXL-1 Blue（Statagene Cloning Systems，La Jolla，CA）のような他の適切なE.coli宿主細胞を、連結混合物で形質転換し、そして培養プレートに播種する。細菌を、すぐ上記で用いられた酵素を使用して個々のコロニー由来のDNAを消化することによって、ヒトTNFレセプター遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。次いで、ゲル電気泳動により消化産物を分析する。クローニングされたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で、pA2-TNFR-6αまたはpA2TNFRTNFR-6β（まとめてpA2-TNFR）と称する。５μgのプラスミドpA2-TNFRを、Felgnerら Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μgの市販の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharminge n，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGold^TM ウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpA2-TNFRを、50μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１mlを有する35mm 組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。次いで、27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technologie s Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersburg 、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10 頁）においても見い出され得る)。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをマイクロピペッターの（例えば、エッペンドルフ）チップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を用いて、35 mmディッシュに播種された昆虫Sf9細胞に感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。 TNFレセプター遺伝子の発現を確認するために、Sf9細胞を、10％熱不活化FBS を補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）で組換えバキュロウイルスを感染させる。放射性標識タンパク質が所望される場合、６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いた SF900 II培地（Life Technologies Inc.，Rockville，MDから入手可能）に置き換える。42時間後、５μCiの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓ-システイン（ Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク質および細胞性のタンパク質をSDS-PAGE、続いて（放射性標識されていれば）オートラジオグラフィーにより分析する。精製タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端の微小配列決定を用いて、TNFレセプタータンパク質の成熟形態のアミノ末端配列を決定し得る。実施例３：哺乳動物細胞におけるTNFR-6αおよびTNFR-6βのクローニングおよび発現代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント(mRNAの転写の開始を媒介する)、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）(例えば、RSV、HTLVI、HIVI)ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性エレメントもまた使用され得る(例えば、ヒトアクチンプロモーター)。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、pSVLおよびpMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat( ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、ならびにpBC12MI（ATCC 67109）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela細胞、293細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、Cos1 細胞、Cos7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)−細胞が挙げられる。あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株において発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である(Murphyら、Bio chem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(1992) )。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞およびNSO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT R）(Cullenら、Molecular and Cellular Biology，438-447(1985年３月))および CMV-エンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530(1985)）を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、およびAsp 718を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。実施例３(a)：COS細胞におけるクローニングおよび発現発現プラスミドpTNFR-α-HAおよびpTNFR-6β-HAを、成熟形態のTNFレセプタータンパク質をコードするcDNAの一部を発現ベクターpcDNAI/AmpまたはpcDNAIII（これは、Invitrogen，Inc.から入手し得る）へクローニングすることによって作製する。発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む：（１）E.coliおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なE.coli複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のための SV40複製起点；（４）CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５）cDNAが都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置された、赤血球凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）をコードするいくつかのコドン、続いて終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:76 7(1984)によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。 pcDNAIIIはさらに、ネオマイシン選択マーカーを含む。完全なTNFレセプターポリペプチドをコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクローンのTNFレセプターcDNAを、E.coliにおけるTNFレセプターの発現のためのベクターの構築について先に記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、当業者によって容易に設計され得る。 PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、XbaIおよびEcoRIで消化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Syst ems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能)へ形質転換し、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてTNFR-αおよびTNFR-6βポリペプチドをコードするフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。組換えTNFR-αおよびTNFR-6βの発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrook ら，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press ，Cold Spring Harbor，New York(1989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるTN FRの発現のための条件下でインキュベートする。 pTNFR-α-HAおよびpTNFR-6β-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Antibodies:A Laboratory Manual,第２版;Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，Cold Spring Harbor，New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、³⁵S-システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてWils onら（上記に引用される）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150m M NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては見られない。実施例３(b)：CHO細胞におけるクローニングおよび発現ベクターpC4を、TNFR-6αおよびTNFR-6βポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドpC4は、プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、よく考証されている(例えば、Alt，F.W.，Kell ems，R.M.，Bertino，J.R.およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:13 57-1370、Hamlin，J.L.およびMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:1 07-143、Page，M.J.およびSydenham，M.A.，Biotechnology 9:64-68(1991)を参照のこと)。漸増濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFRを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の1,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Culle nら、Molecular and Cellular Biology，1985年３月：438-447）の長末端反復（ LTR）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）(Boshart ら、Cell 41:521-530(1985))の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位が存在する：BamHI、XbaIおよびAsp718。プラスミドは、これらのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の3'イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る(例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびH TLVI）由来の長末端反復)。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および同様の系は、哺乳動物細胞において調節された方法でTNFレセプターポリペプチドを発現するために使用され得る(Gossen，M.，およびBujard，H.1992，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 89:5547-5551)。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）は、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を含む安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、G418およびメトトレキサート）を使用することは、有利である。プラスミドpC4を、以下に概説するように選択されたTNFレセプターを増幅するために使用される特定のプライマーに適切な制限酵素で消化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(phosphate)を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。 TNFレセプターポリペプチドをコードするDNA配列を、遺伝子の所望の部分の5' および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。下線を付したBamHI部位を含むTNFR-6αおよびTNFR-6βについての5'プライマーは、以下の配列を有する： 5’CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3’(配列番号25)。TNFR-6αについての3'プライマーは、下線を付したAsp718制限部位を含む以下の配列を有する： 5’CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3’(配列番号26)。TNFR-6βについての3'プライマーは、下線を付したAsp7l8制限部位を含む以下の配列を含む： 5’CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3’(配列番号27)。増幅させたフラグメントを、操作された制限部位で切断するエンドヌクレアーゼで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.co li HB101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（Fe lgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。細胞を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/ml G 418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Greine r，Germany）に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を用いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１ μM、２μM、５μM、10μM、20μM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって、または逆相HPLC分析によって分析する。実施例４：TNFレセプターmRNA発現の組織分布ノーザンブロット分析を行って、とりわけSambrookら（上記に引用される）によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるTNFR-6αまたはTNFR-6β遺伝子の発現を調べる。TNFレセプタータンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１または３）を含むcDNAプローブを、rediprime^TM DNA標識系(Amersham Life Sc ience)を製造者の説明書に従って用いて³²Pで標識する。標識後、プローブを、C HROMA SPIN-100^TMカラム（Clontech Laboratories，Inc.）を製造者のプロトコル番号PT1200^-1に従って用いて精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をTNFレセプターmRNAについて調べる。種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（IM）を含むMultiple Tissue No rthern（MTN）ブロットを、Clontechから入手し、そしてExpressHyb^TMハイブリダイゼーション溶液（Clontech）を製造者のプロトコル番号PT1190-1に従って用いて標識プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−70℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外の方法で実施され得ることは明白である。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示を考慮して可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。本明細書中に参考として援用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、実験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の開示の全体が、これによって本明細書によって参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ニ，ジアンアメリカ合衆国メリーランド 20853, ロックビル，マノーフィールドロード 5502 (72)発明者エブナー，ラインハルトアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザーズバーグ，シェルバーンテラスナンバー316 9906 (72)発明者ユ，グオ−リアンアメリカ合衆国カリフォルニア 94403, サンマテオ，マリナコート 1714―シー (72)発明者ルーベン，スティーブンエム. アメリカ合衆国メリーランド 20832, オルニー，ヘリテジヒルズドライブ 18528 (72)発明者フェン，ピンアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザーズバーグ，レルダコート４

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： (a)配列番号２もしくは４の完全なアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号97810もしくは同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる、TNFR ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列； (b)配列番号２もしくは４の、それぞれ31〜300位もしくは31〜170位のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号97810もしくは同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる、成熟TNFRポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列； (c)配列番号２および４の、それぞれ31〜283位または31〜166位のアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；および (d)上記の(a)、(b)、または(c)のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。２．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１および配列番号３からなる群から選択される完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２および配列番号４からなる群から選択される完全なアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。４．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の約31〜約300、または配列番号４の約31〜約170のアミノ酸配列を有する、前記成熟形態のTNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の約31〜約283、または配列番号４の約31〜約166のアミノ酸配列を有する、TNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。６．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： (a)配列番号２の残基ｍ〜300のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｍは、１〜49の範囲内の整数である； (b)配列番号４の残基ｎ〜170のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｎは、１〜49の範囲内の整数である； (c)配列番号２の残基１〜ｙのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｙは、193〜300の範囲内の整数である； (d)配列番号４の残基１〜ｚのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでZは、132〜170の範囲内の整数である；ならびに (e)配列番号２の残基ｍ〜ｙまたは配列番号４のｎ〜ｚからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｍ、ｎ、ｙ、および、Zは、上記の(a)、(b)、(c)、および(d)において規定される。７．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： (a)ATCC受託番号97810または同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なTNFRアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分が、ATCC受託番号97810および同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる該完全なアミノ酸配列のアミノ末端から、１〜約48アミノ酸を除外する、ヌクレオチド配列； (b)ATCC受託番号97810または同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なTNFRアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分が、ATCC受託番号97810および同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる該完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から、それぞれ１〜約107、および１〜約38アミノ酸を除外する、ヌクレオチド配列；ならびに (c)ATCC受託番号97810または同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なTNFRアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分が、上記の(a)および(b)のそれぞれの該クローンについてのいずれかのアミノ酸末端欠失とカルボキシ末端欠失との組み合わせを含む、ヌクレオチド配列。８．前記ポリヌクレオチド配列が、ATCC受託番号97810または同97809に含まれる cDNAクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。９．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号97810または同97809に含まれるcDNA クローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するTNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。１０．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号97810または同97809に含まれるcD NAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟TNFRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。１１．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、または(d)のヌクレオチド配列に同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａのみの残基またはＴのみの残基からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、核酸分子。１２．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、または(d)のアミノ酸配列を有するTNFR ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。１３．以下からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むTNFRポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする、請求項１２に記載の単離された核酸分子：配列番号２の約Ala-31〜約Thr-46、配列番号２の約Phe-57〜約Thr-117、配列番号２の約Cys-132〜約Thr-175、配列番号２の約Gly-185〜約Thr-194、配列番号２の約 Val-205〜約Asp-217、配列番号２の約Pro-239〜約Leu-264、および配列番号２の約Ala-283〜約Pro-298、配列番号４の約Ala-31〜約Thr-46、配列番号４の約Phe- 57〜約Gln-80、配列番号４の約Glu-86〜約His-106、配列番号４の約Thr-108〜約 Phe-119、配列番号４の約His-129〜約Val-138、および配列番号４の約Gly-142〜約Pro-166。１４．請求項１に記載の単離された核酸分子を、ベクター中に挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。１５．請求項１４に記載の方法によって生成される組換えベクター。１６．請求項１５に記載の組換えベクターを、宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。１７．請求項１６に記載の方法によって生成される、組換え宿主細胞。１８．TNFRポリペプチドを生成するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１７に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。１９．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたTNFRポリペプチド： (a)配列番号２もしくは４に示される完全なアミノ酸配列を有するか、またはA TCC受託番号97810もしくは同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる、完全長TNFRポリペプチドのアミノ酸配列； (b)配列番号２の31〜300位もしくは配列番号４の31〜170位のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号97810もしくは同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる、成熟TNFRポリペプチドのアミノ酸配列；あるいは (c)配列番号２の31〜283位または配列番号４の31〜166位のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号97810もしくは同97809に含まれるcDNAクローンによってコードされる、TNFRポリペプチドの可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列。２０．TNFRタンパク質のエピトープ保有部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで該部分が、以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群から選択される、ポリペプチド：配列番号２の約Ala-31〜約Thr-46、配列番号２の約 Phe-57〜約Thr-117、配列番号２の約Cys-132〜約Thr-175、配列番号２の約Gly-1 85〜約Thr-194、配列番号２の約Val-205〜約Asp-217、配列番号２の約Pro-239〜約Leu-264、および配列番号２の約Ala-283〜約Pro-298、配列番号４の約Ala-31 〜約Thr-46、配列番号４の約Phe-57〜約Gln-80、配列番号４の約Glu-86〜約His- 106、配列番号４の約Thr-108〜約Phe-119、配列番号４の約His-129〜約Val-138 、および配列番号４の約Gly-142〜約Pro-166。２１．請求項１９に記載のTNFRポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。２２．請求項１９に記載のTNFRポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、 TNFRポリペプチド活性の必要性のある患者を処置する方法。２３．請求項１に記載の核酸を患者に投与する工程を包含する、TNFRポリペプチド活性の必要性のある患者を処置する方法。