JP2004507214A - 腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたゲノム配列と、この配列に向けられた腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法とに関する。さらに、本発明は、シトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適していることを見出したことによるものである。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
【発明の属する技術分野】
【0001】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のRNAへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察(治療)レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、PNAオリゴマーとに関し、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び/又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【0002】
ガン患者の治療及び診断の代替方法の発達が望まれている。現行の方法である、放射性治療、化学療法などは多くの場合に好ましくない副作用を伴い、ガンの多くの形では無効である。
【0003】
ガンの遺伝的特質は、多数の優性である形質転換された状態(腫瘍遺伝子)の正の調節因子と同様に、多数の劣勢である(腫瘍抑制遺伝子)負の調節因子を含んでおり、複雑である。およそ100の腫瘍遺伝子が同定されている。腫瘍遺伝子はいくつかのグループに分類されており、膜内外タンパク質から転写因子の範囲での活性の異なるタイプを表している。およそ10の腫瘍抑制遺伝子が現在では知られている。腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子または細胞成長に通常のある制約を加えている遺伝子の機能の損失、すなわち、それらの制約の解放は、腫瘍化につながる。遺伝子上の異型(ヘテロ)接合性の損害又は自然(突然)変異に加えて、さらなる腫瘍形成を導く機構の可能性がある。遺伝子のはエピジェネティクスパラメータ誤調節は腫瘍形成をもたらすことがが確認されている。最も特徴的なはエピジェネティクスパラメータは、シトシンのC5位置の共有結合修飾である、遺伝子のメチル化である。ガンのメチル化異常は単位突然変異、グローバルハイポメチレーション(global hypomethylation)、個々の遺伝子のハイポメチレーション(hypomethylation)、CpG島のハイパーアメチレーション(hypermethylation)又は刷り込みの失敗(loss)が含まれている。
【0004】
CpG島での突然変異の高い割合はガンを引き起こす可能性がある。メチル化シトシン塩基は自然に脱アミノ反応によりウラシルなることがある。ミスマッチの修復はそのうえDNA−MTaseにより阻害され、シトシンからチアミジン(thiamidine)トランジションが起こる可能性がる。この好適な例として、P53遺伝子がある。この遺伝子の突然変異は、すべての腫瘍の50%以上で存在し、CpGジヌクレオチドのシトシンからのチミジン(thymidine)トランジションの推定値は24%である。
【0005】
広範囲メチル化の低レベル化は、腫瘍の多くの形成において一般的である。個々の遺伝のハイポメチレーション(hypomethylation)もまた認められている。
メチル化と細胞増殖の逆相関はbc1−2遺伝子(リンパ性白血病)と肺と結腸腫瘍のK−ras proto−oncogeneで認められる。
【0006】
p16遺伝子は重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子の調節遺伝子である。p16タンパク質は、G1/S境界で細胞周期の進行を停止させ、p16作用の欠如は、無秩序な細胞増殖を可能にすることで癌の進行につながる場合がある。高メチル化が仲介するp16遺伝子の不活性化は、脳腫瘍と、乳癌と、結腸癌と、頭部及び頚部癌と、非小細胞肺ガンと、高度非ホジキンリンパ腫において実証されている。
【0007】
腫瘍形成におけるメチル化の役割は、SignalとGinderの’DNA Methylation’Blood, Vol.93 No. 12 (June 15), 1999:pp.4059−4070;において概説されている。さらに腫瘍遺伝子に関連するメチル化の例には、以下が含まれている。
【0008】
頭部及び頚部癌。Sanchez−Cespedes M ら、”Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients”Cancer Res.2000 Feb.15;60(4):892−5
ホジキン病(悪性リンパ腫)。Garcia JF ら、”Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin’s disease”Lab invest 1999 Dec;79(12):1453−9
胃ガン。Yanagisawa Y ら、”Methylation of the hMLHl promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability”Int J Cancer 2000 Jan 1;85(1):50−3)
【0009】
ガン遺伝子のメチル化依存調整の特定は、ガン治療及び診断の代替方法を開発する可能性を広げるものである。DNAメチル化阻害因子による治療は、重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子p16の遺伝子発現を修復するものとして示されている。Benderら、″Inhibition of DNA methylation by 5−aza−2’−deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.″Cancer research 58;95−101(1998)。これにより、腫瘍細胞系の成長の抑制につながる遺伝的レベルの遺伝子発現が生じた。
【0010】
メチル化ベースの治療は、化学療法、外科処置、及び放射線治療といった現行の治療方法に比べ、大きな利点を有する可能性がある。こうした治療は、従来の治療方法に対する耐性がある腫瘍を治療する手段を提供する可能性もあり、これは、Soengasらの″Inactivation of the apoptosis effector Apaf−1 in malignant melanoma″Nature 409;207−211(2001)によって実証されている。加えて、メチル化特異的治療の開発に加え、Minマウスでの実験は、DNAメチル化の阻害が腫瘍の発生を抑制できることを示している。Lairdら、″Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation″Cell 81;197−205(1995)。更に、DNAメチル化分析は、癌診断の新しい手段を提供する可能性がある。
【0011】
5−メチルシトシンは、真核細胞のDNAにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として5−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、5−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、5−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、5−メチルシトシンが運ぶはエピジェネティク情報は、PCR増幅中に完全に失われる。
【0012】
5−メチルシトシンに関してDNAを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、5−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。その結果、元のDNAは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるDNAをアガロースマトリックスで囲み、DNAの拡散及び復元を防ぎ(重亜硫酸塩は一本鎖DNAとのみ反応する)、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる(Olek A, Osward J,Walter J. Amodified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acid Res.1996 Dec 15;24(24):5064−6)。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約3000塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【0013】
5−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。T., DePamphilis, M.L., Zorbas,H., Nucleic Acids Res.1998,26,2255。
【0014】
現在まで、僅かな例外を除き(例えば、Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single−tube PCR test for the diagnosis is of Angelman and Prader−Willi Syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar−Apr;5(2):94−8)、重亜硫酸塩(bisulfite)手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか(Olek A, Walter J. The pre−implantation ontogeny of the H19 methylation imprint.Nat Genet.1997 Nov;17(3):275−6)、或いは、プライマ延長反応によって(Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation−sensitive single nucleotide primer extension(Ms−SNuPE).Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2529−31,WO出願95/00669)又は酵素的な消化によって(Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay.Nucleic Acid res.1997 Jun 15;25(12):2532−4)、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている(Olekら、WO99/28498)。
【0015】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているその他の出版物は、次の通りである。Grigg G, Clark S. Sequencing 5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioessays.1994 Jun;16(6):431−6,431。Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B,Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997Mar;6(3):387−95。Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res.1994 Feb 25;22(4):695−6。Martin V, Ribieras S, Song−Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4。WO 97 46705、WO 9515373、及びWO 45560。
【0016】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、1999年1月に刊行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement,Volume 21,January 1999)と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【0017】
蛍光標識プローブは、固定化DNAアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの5’−OHに対するCy3及びCy5色素の添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Cy3及びCy5色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【0018】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI−TOF)は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.Anal Chem.1988 Oct 15;60(20):2299−301)。検体は、ライト(light)マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【0019】
MALDI−TOF分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である(Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends.1995,1:147−57)。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約100倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。MALDI−TOF分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、DNAに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、DNAがペプチドに類似するような形でDNAを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立DNAに転換することができる(Gut I G, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res.1995 Apr 25;23(8):1367−73)。この修飾済みDNAに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【0020】
ゲノムDNAは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のDNAから取得される。この標準的な方法は、Fritsch及びManiatis編のMolecular Cloning: Alaboratory Manual,1989といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする課題】
【0021】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、シトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適しているということを見出したことに基づいている。
【0022】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたDNAと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを見出したことに基づいている、特にそのシトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適している点である
【0023】
本発明による目的は、ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれと相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸を使用することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号(アクセッション番号)が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のGenBankを使用しており、インターネツトアドレスはwww.ncbi.nlm.nih.govである。
【0024】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【0025】
本発明の目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAとハイブリッド形成する少なくとも13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のCpGジヌクレオチドであり、PNA−オリゴマーの場合は、CpGジヌクレオチドのシトシンが9−merの5’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【0026】
本発明によるオリゴマーは、配列ID番号1乃至配列ID番号536の配列及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆるセット(set)において通常使用される。好適なものは、配列ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセットである。
【0027】
更に、本発明は、配列ID番号1乃至配列ID番号536の及びこれの相補配列及び/又は表1の遺伝子又はそのセグメントの配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列とを増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)を利用可能にする。
【0028】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット(set)の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【0029】
本発明は、化学的前処理されたゲノムDNA(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA)におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも10nのセット(set)(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー)に更に関する。こうしたプローブにより、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット(set)は、配列ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAにおいて単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出するために使用することもできる。
【0030】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマの配置(いわゆる「アレイ」)は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【0031】
そのため、本発明の主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第5,744,305号により知られている。
【0032】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップは、米国特許第5,837,832号により知られている。
【0033】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩(Bisulfite)含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の18塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメントの相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【0034】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【0035】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムDNA試料は、5’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【0036】
分析されるゲノムDNAは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったDNAの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド(histologic object slides)と、又はその組み合わせとである。
【0037】
上で説明したゲノムDNAの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩(bisulfite)(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【0038】
化学的前処理されたDNAの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット(sets)と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのDNAセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行される。
【0039】
この方法の好適な実施形態において、プライマオリゴヌクレオチドのセット(set)は、付録において指定された塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の少なくとも18塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマオリゴヌクレオチドは、好ましくは、CpGジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【0040】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【0041】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴なうことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実効電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化することができる。
【0042】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又はセット(set)とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット(set)は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。前記PNA−オリゴマーは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、9−merの5’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。
【0043】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【0044】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【0045】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【0046】
生成た断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【0047】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用される。
【0048】
本発明による方法は、例えば、充実性腫瘍と、癌との診断及び/又は治療に使用される。配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの本発明による核酸は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用することができる。
【0049】
本発明は、更に、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療を行うための診断剤及び/又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【0050】
本発明の更なる主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断剤及び/又は治療剤に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【0051】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断に関し、これにおいて、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの他のセット(set)と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断の根拠の役割を果たす。
【0052】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料DNAにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、60℃の2.5×SSC緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、37℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されるとして理解される。
【0053】
「機能変異体」という用語は、DNA配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活動を有する、すべてのDNA配列を意味する。
【0054】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてSNP(単一ヌクレオチド多型)とである。
【0055】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子のDNA塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。その他のエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、DNAメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【0056】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて参照し、これに限定されることなく、詳細に説明する。
以下の例は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の断片に関係し、この例では、MYCにおいて、特定のCG位置がメチル化状態に関して分析される。
【実施例1】
【0057】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するMYC遺伝子におけるメチル化分析
以下の実施例は、MYC遺伝子の断片に関係し、メチル化に関して特定のCG位置が分析される。
【0058】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の5位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは5位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)を使用して処理される。
【0059】
重亜硫酸(bisulfite)溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在しなければいけない。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたDNA(配列ID番号531)は、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたDNA試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このDNAは、その後、アルカリ性pH値で脱スルホン化される(10乃至30分、90乃至100℃)。この方法の第三のステップにおいて、このDNA試料は、好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、MYC遺伝子のシトシンが分析される。このため、831bpの長さを有する定められた断片は、特定のプライマオリゴヌクレオチド TTTTGTGTGGAGGGTAGTTG(配列ID番号537)及びCCCCAAATAAACAAAATAACC(配列ID番号538)により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと(これは例えばTAAGGATGCGGTTTGTTA(配列ID番号539))、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置60に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたCy3及びCy5蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅DNAのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩(bisulfite)処理されたDNAのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【0060】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えばTAAGGATGTGGTTTGTTA(配列ID番号540)である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【0061】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料1は毛様細胞性星状細胞腫(脳腫瘍)組織からであり、試料2は毛様細胞性星細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。結果(図1)から、試料1は増幅物の位置60においてメチル化していないのに対して、試料2は同じ位置にメチル化した細胞又は非メチル化細胞の両方の混合物を有することが確認できる。
【実施例2】
【0062】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断
メチル化パターンを腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのDNAメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、例1と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるCpGジヌクレオチドが特定される。これは、個別のCpGメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマ延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【0063】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【0064】
例2は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
充実性腫瘍、及び癌。
【0065】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Iは、毛様細胞性星状細胞腫(脳腫瘍)組織からのものであり、試料IIは、毛様細胞性星細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。CGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、TGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。
【配列の説明】
配列ID番号1乃至536
配列ID番号1乃至536は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するな遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列を示している。特に、奇数の配列番号(配列ID番号1、3、5、...)を有する配列は、いずれの場合にも、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す。偶数の配列番号(配列ID番号2、4、6、...)を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列の相補する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す(例えば、配列ID番号1に対する相補配列は配列ID番号2であり、配列ID番号3に対する補完配列は配列ID番号4である)。
配列ID番号537乃至配列ID番号540は、実施例1において使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【0001】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のRNAへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察(治療)レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、PNAオリゴマーとに関し、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び/又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【0002】
ガン患者の治療及び診断の代替方法の発達が望まれている。現行の方法である、放射性治療、化学療法などは多くの場合に好ましくない副作用を伴い、ガンの多くの形では無効である。
【0003】
ガンの遺伝的特質は、多数の優性である形質転換された状態(腫瘍遺伝子)の正の調節因子と同様に、多数の劣勢である(腫瘍抑制遺伝子)負の調節因子を含んでおり、複雑である。およそ100の腫瘍遺伝子が同定されている。腫瘍遺伝子はいくつかのグループに分類されており、膜内外タンパク質から転写因子の範囲での活性の異なるタイプを表している。およそ10の腫瘍抑制遺伝子が現在では知られている。腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子または細胞成長に通常のある制約を加えている遺伝子の機能の損失、すなわち、それらの制約の解放は、腫瘍化につながる。遺伝子上の異型(ヘテロ)接合性の損害又は自然(突然)変異に加えて、さらなる腫瘍形成を導く機構の可能性がある。遺伝子のはエピジェネティクスパラメータ誤調節は腫瘍形成をもたらすことがが確認されている。最も特徴的なはエピジェネティクスパラメータは、シトシンのC5位置の共有結合修飾である、遺伝子のメチル化である。ガンのメチル化異常は単位突然変異、グローバルハイポメチレーション(global hypomethylation)、個々の遺伝子のハイポメチレーション(hypomethylation)、CpG島のハイパーアメチレーション(hypermethylation)又は刷り込みの失敗(loss)が含まれている。
【0004】
CpG島での突然変異の高い割合はガンを引き起こす可能性がある。メチル化シトシン塩基は自然に脱アミノ反応によりウラシルなることがある。ミスマッチの修復はそのうえDNA−MTaseにより阻害され、シトシンからチアミジン(thiamidine)トランジションが起こる可能性がる。この好適な例として、P53遺伝子がある。この遺伝子の突然変異は、すべての腫瘍の50%以上で存在し、CpGジヌクレオチドのシトシンからのチミジン(thymidine)トランジションの推定値は24%である。
【0005】
広範囲メチル化の低レベル化は、腫瘍の多くの形成において一般的である。個々の遺伝のハイポメチレーション(hypomethylation)もまた認められている。
メチル化と細胞増殖の逆相関はbc1−2遺伝子(リンパ性白血病)と肺と結腸腫瘍のK−ras proto−oncogeneで認められる。
【0006】
p16遺伝子は重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子の調節遺伝子である。p16タンパク質は、G1/S境界で細胞周期の進行を停止させ、p16作用の欠如は、無秩序な細胞増殖を可能にすることで癌の進行につながる場合がある。高メチル化が仲介するp16遺伝子の不活性化は、脳腫瘍と、乳癌と、結腸癌と、頭部及び頚部癌と、非小細胞肺ガンと、高度非ホジキンリンパ腫において実証されている。
【0007】
腫瘍形成におけるメチル化の役割は、SignalとGinderの’DNA Methylation’Blood, Vol.93 No. 12 (June 15), 1999:pp.4059−4070;において概説されている。さらに腫瘍遺伝子に関連するメチル化の例には、以下が含まれている。
【0008】
頭部及び頚部癌。Sanchez−Cespedes M ら、”Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients”Cancer Res.2000 Feb.15;60(4):892−5
ホジキン病(悪性リンパ腫)。Garcia JF ら、”Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin’s disease”Lab invest 1999 Dec;79(12):1453−9
胃ガン。Yanagisawa Y ら、”Methylation of the hMLHl promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability”Int J Cancer 2000 Jan 1;85(1):50−3)
【0009】
ガン遺伝子のメチル化依存調整の特定は、ガン治療及び診断の代替方法を開発する可能性を広げるものである。DNAメチル化阻害因子による治療は、重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子p16の遺伝子発現を修復するものとして示されている。Benderら、″Inhibition of DNA methylation by 5−aza−2’−deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.″Cancer research 58;95−101(1998)。これにより、腫瘍細胞系の成長の抑制につながる遺伝的レベルの遺伝子発現が生じた。
【0010】
メチル化ベースの治療は、化学療法、外科処置、及び放射線治療といった現行の治療方法に比べ、大きな利点を有する可能性がある。こうした治療は、従来の治療方法に対する耐性がある腫瘍を治療する手段を提供する可能性もあり、これは、Soengasらの″Inactivation of the apoptosis effector Apaf−1 in malignant melanoma″Nature 409;207−211(2001)によって実証されている。加えて、メチル化特異的治療の開発に加え、Minマウスでの実験は、DNAメチル化の阻害が腫瘍の発生を抑制できることを示している。Lairdら、″Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation″Cell 81;197−205(1995)。更に、DNAメチル化分析は、癌診断の新しい手段を提供する可能性がある。
【0011】
5−メチルシトシンは、真核細胞のDNAにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として5−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、5−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、5−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、5−メチルシトシンが運ぶはエピジェネティク情報は、PCR増幅中に完全に失われる。
【0012】
5−メチルシトシンに関してDNAを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、5−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。その結果、元のDNAは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるDNAをアガロースマトリックスで囲み、DNAの拡散及び復元を防ぎ(重亜硫酸塩は一本鎖DNAとのみ反応する)、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる(Olek A, Osward J,Walter J. Amodified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acid Res.1996 Dec 15;24(24):5064−6)。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約3000塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【0013】
5−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。T., DePamphilis, M.L., Zorbas,H., Nucleic Acids Res.1998,26,2255。
【0014】
現在まで、僅かな例外を除き(例えば、Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single−tube PCR test for the diagnosis is of Angelman and Prader−Willi Syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar−Apr;5(2):94−8)、重亜硫酸塩(bisulfite)手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか(Olek A, Walter J. The pre−implantation ontogeny of the H19 methylation imprint.Nat Genet.1997 Nov;17(3):275−6)、或いは、プライマ延長反応によって(Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation−sensitive single nucleotide primer extension(Ms−SNuPE).Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2529−31,WO出願95/00669)又は酵素的な消化によって(Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay.Nucleic Acid res.1997 Jun 15;25(12):2532−4)、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている(Olekら、WO99/28498)。
【0015】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているその他の出版物は、次の通りである。Grigg G, Clark S. Sequencing 5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioessays.1994 Jun;16(6):431−6,431。Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B,Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997Mar;6(3):387−95。Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res.1994 Feb 25;22(4):695−6。Martin V, Ribieras S, Song−Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4。WO 97 46705、WO 9515373、及びWO 45560。
【0016】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、1999年1月に刊行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement,Volume 21,January 1999)と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【0017】
蛍光標識プローブは、固定化DNAアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの5’−OHに対するCy3及びCy5色素の添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Cy3及びCy5色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【0018】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI−TOF)は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.Anal Chem.1988 Oct 15;60(20):2299−301)。検体は、ライト(light)マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【0019】
MALDI−TOF分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である(Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends.1995,1:147−57)。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約100倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。MALDI−TOF分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、DNAに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、DNAがペプチドに類似するような形でDNAを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立DNAに転換することができる(Gut I G, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res.1995 Apr 25;23(8):1367−73)。この修飾済みDNAに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【0020】
ゲノムDNAは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のDNAから取得される。この標準的な方法は、Fritsch及びManiatis編のMolecular Cloning: Alaboratory Manual,1989といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする課題】
【0021】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、シトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適しているということを見出したことに基づいている。
【0022】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたDNAと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを見出したことに基づいている、特にそのシトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適している点である
【0023】
本発明による目的は、ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれと相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸を使用することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号(アクセッション番号)が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のGenBankを使用しており、インターネツトアドレスはwww.ncbi.nlm.nih.govである。
【0024】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【0025】
本発明の目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAとハイブリッド形成する少なくとも13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のCpGジヌクレオチドであり、PNA−オリゴマーの場合は、CpGジヌクレオチドのシトシンが9−merの5’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【0026】
本発明によるオリゴマーは、配列ID番号1乃至配列ID番号536の配列及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆるセット(set)において通常使用される。好適なものは、配列ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセットである。
【0027】
更に、本発明は、配列ID番号1乃至配列ID番号536の及びこれの相補配列及び/又は表1の遺伝子又はそのセグメントの配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列とを増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)を利用可能にする。
【0028】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット(set)の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【0029】
本発明は、化学的前処理されたゲノムDNA(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA)におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも10nのセット(set)(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー)に更に関する。こうしたプローブにより、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット(set)は、配列ID番号1乃至配列ID番号536のうち一つ及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAにおいて単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出するために使用することもできる。
【0030】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマの配置(いわゆる「アレイ」)は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【0031】
そのため、本発明の主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第5,744,305号により知られている。
【0032】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップは、米国特許第5,837,832号により知られている。
【0033】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩(Bisulfite)含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の18塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメントの相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【0034】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【0035】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムDNA試料は、5’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【0036】
分析されるゲノムDNAは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったDNAの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド(histologic object slides)と、又はその組み合わせとである。
【0037】
上で説明したゲノムDNAの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩(bisulfite)(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【0038】
化学的前処理されたDNAの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット(sets)と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのDNAセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行される。
【0039】
この方法の好適な実施形態において、プライマオリゴヌクレオチドのセット(set)は、付録において指定された塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の少なくとも18塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマオリゴヌクレオチドは、好ましくは、CpGジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【0040】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【0041】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴なうことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実効電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化することができる。
【0042】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又はセット(set)とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット(set)は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。前記PNA−オリゴマーは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、9−merの5’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。
【0043】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【0044】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【0045】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【0046】
生成た断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【0047】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用される。
【0048】
本発明による方法は、例えば、充実性腫瘍と、癌との診断及び/又は治療に使用される。配列ID番号1乃至配列ID番号536及びこれの相補配列及び/又は表1の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの本発明による核酸は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用することができる。
【0049】
本発明は、更に、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び/又は治療を行うための診断剤及び/又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【0050】
本発明の更なる主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断剤及び/又は治療剤に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【0051】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断に関し、これにおいて、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの他のセット(set)と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断の根拠の役割を果たす。
【0052】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料DNAにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、60℃の2.5×SSC緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、37℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されるとして理解される。
【0053】
「機能変異体」という用語は、DNA配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活動を有する、すべてのDNA配列を意味する。
【0054】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてSNP(単一ヌクレオチド多型)とである。
【0055】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子のDNA塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。その他のエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、DNAメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【0056】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて参照し、これに限定されることなく、詳細に説明する。
以下の例は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の断片に関係し、この例では、MYCにおいて、特定のCG位置がメチル化状態に関して分析される。
【実施例1】
【0057】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するMYC遺伝子におけるメチル化分析
以下の実施例は、MYC遺伝子の断片に関係し、メチル化に関して特定のCG位置が分析される。
【0058】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の5位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは5位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)を使用して処理される。
【0059】
重亜硫酸(bisulfite)溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在しなければいけない。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたDNA(配列ID番号531)は、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたDNA試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このDNAは、その後、アルカリ性pH値で脱スルホン化される(10乃至30分、90乃至100℃)。この方法の第三のステップにおいて、このDNA試料は、好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、MYC遺伝子のシトシンが分析される。このため、831bpの長さを有する定められた断片は、特定のプライマオリゴヌクレオチド TTTTGTGTGGAGGGTAGTTG(配列ID番号537)及びCCCCAAATAAACAAAATAACC(配列ID番号538)により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと(これは例えばTAAGGATGCGGTTTGTTA(配列ID番号539))、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置60に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたCy3及びCy5蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅DNAのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩(bisulfite)処理されたDNAのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【0060】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えばTAAGGATGTGGTTTGTTA(配列ID番号540)である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【0061】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料1は毛様細胞性星状細胞腫(脳腫瘍)組織からであり、試料2は毛様細胞性星細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。結果(図1)から、試料1は増幅物の位置60においてメチル化していないのに対して、試料2は同じ位置にメチル化した細胞又は非メチル化細胞の両方の混合物を有することが確認できる。
【実施例2】
【0062】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断
メチル化パターンを腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのDNAメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、例1と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるCpGジヌクレオチドが特定される。これは、個別のCpGメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマ延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【0063】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【0064】
例2は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
充実性腫瘍、及び癌。
【0065】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Iは、毛様細胞性星状細胞腫(脳腫瘍)組織からのものであり、試料IIは、毛様細胞性星細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。CGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、TGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。
【配列の説明】
配列ID番号1乃至536
配列ID番号1乃至536は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するな遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列を示している。特に、奇数の配列番号(配列ID番号1、3、5、...)を有する配列は、いずれの場合にも、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す。偶数の配列番号(配列ID番号2、4、6、...)を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列の相補する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す(例えば、配列ID番号1に対する相補配列は配列ID番号2であり、配列ID番号3に対する補完配列は配列ID番号4である)。
配列ID番号537乃至配列ID番号540は、実施例1において使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
Claims (32)
- 配列ID番号1乃至配列ID番号536のグループから取り出した配列の一つ及びこれの相補配列に従った、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのセグメントの少なくとも18塩基の長さである配列を含む核酸。
- 遺伝子BRCA2(U43746)、E2F1(M96577)、ELE1(X71413)、MN/CA9(Z54349)、PVT1(M26714)、SAC2(AK001725)、TEM8(AK025429)、TM4SF1(X01394)、TNFSF11(AF053712)、AXL(NM_021913&NM_001699)、CCND3(NM_001760)、CSFIR(NM_005211)、MGMT(NM_002412)、NOV(NM_002514)、SFRS8(NM_004592)、TNFRSF6(NM_000043)、TPD52(NM_005079)、AKT1(NM_005163)、BCL2(NM_000633&NM_000657)、CBL(NM_005188)、CBLC(NM_012116)、CRK(NM_005206&NM_016823)、DCC(NM_005215)、EPHA1(NM_005232)、EPHA3(NM_005233)、ETS1(NM_005238)、ETV5(NM_004454)、ETV6(NM_001987)、FGF3(NM_005247)、FGF4(NM_002007)、FHIT(NM_002012)、GLTSCR1(NM 015711)、GPS1(NM_004127)、GROS1(NM_022356)、HIC1(NM_006497)、IGFBP7(NM_001553)、KISS1(NM_002256)、KRAS2(NM_004985)、LATS1(NM_004690)、LOC51213(NM_016383)、MUC1(NM_002456)、MUC2(NM_002457)、N33(NM_006765)、PTTG1IP(NM_004339)、SE20_4(NM_022117)、SE70_2(NM_022118)、SFN(NM_006142)、ST7(NM_013437)、SUPT3H(NM_003599)、SUPT6H(NM_003170)、TEM1(NM_020404)、TERT(NM_003219)、THRB(NM_000461)、TIMP2(NM_003255)、TMEFF1(NM_003692)、TNFAIP6(NM_007115)、TNFRSF10A(NM_003844)、TNFRSF10B(NM_003842)、TNFRSF10C(NM_003841)、TNFRSF11A(NM_003840)、TNFRSF1A(NM_001065)、TNFSF12(NM_003809)、TNFSF13(NM_003808)、TNFSF15(NM_005118)、TNFSF18(NM_005092)、TP63(NM_003722)、TSSC1(NM_003310)、VDR(NM_000376)、YES1(NM_005433)、FOXG1A(NM_004471)、GRF2(NM_005312)、HSPC070(NM_014160)、RAB3A(NM_002866)、RAB5A(NM_004162)、APC(NM_000038)、BMI1(NM_005180)、CHES1(NM_005197)、SMT3H1(NM_006936)、TIAM1(NM_003253)、VAV1(NM_005428)、MCF2(NM_005369)、MSH2(NM_000251)、ERBB4(NM_005235)、FOXG1B(NM_005249)、TACSTD1(NM_002354)、TRA1(NM_003299)、FOXG1B(NM_005249)、TACSTD1(NM_002354)、FLI1(NM_002017)のいずれか一つの遺伝子に従った配列の一つ及びこれの相補配列に従った、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのセグメントの少なくとも18塩基の長さである配列を含む核酸。
- オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸(PNA)−オリゴマーであって、配列ID番号1乃至536の一つに従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA又はこれの相補配列とハイブリッド形成する又は同一である、少なくとも九個のヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列をいずれの場合でも含むオリゴマー。
- 塩基配列が少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む、請求項3記載のオリゴマー。
- CpGジヌクレオチドのシトシンが、オリゴマーの三分の一のほぼ中央に位置することを特徴とする、請求項4記載のオリゴマー。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の少なくとも二つのオリゴマを含む、オリゴマーのセット(set)。
- 配列ID番号1乃至536に従った又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAに従った配列の一つとこれの相補配列からのすべてのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出するオリゴマーを含む、請求項6記載のオリゴマーのセット(set)。
- 配列ID1乃至配列ID536の一つのDNA配列及びこれの相補配列、及び/又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列、及びこれの相補配列、又はそのセグメントの増殖のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用することが可能な、請求項3記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)。
- 少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されていることを特徴とする、請求項8記載のオリゴヌクレオチドのセット(set)。
- 請求項1記載の化学的前処理されたゲノムDNA及び/又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態及び/又は単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出するための、オリゴマープローブのセット(set)。
- 配列ID1乃至配列ID536の一つ及びこれの相補配列及び/又は請求項2記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析する、キャリヤー材料に固定された様々なオリゴマーの配置(アレイ)を製造する方法であって、請求項3乃至5のいずれか一項に記載の少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
- 請求項11により得ることが可能な、様々なオリゴマーの配置(アレイ)。
- 長方格子又は六方格子の形態で平坦な固相上に配置されることを特徴とする、請求項12記載の様々なオリゴヌクレオチド−及び/又はPNA−オリゴマーのアレイ。
- 固相表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成されることを特徴とする、請求項12又は13記載のアレイ。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の少なくとも一つの核酸を含む、遺伝子のメチル化状態に関連する疾患を分析するDNA−及び/又はPNA−アレイ。
- シトシンメチル化を分析することで、既存の疾患或いは特定の疾患の素因に関する診断及び/又は治療のための遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法であって、
a)ゲノムDNA試料において、5位置においてメチル化されていないシトシン塩基を、化学処理によって、ウラシル又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換するステップと、
b)化学的前処理されたゲノムDNAの断片が、請求項8又は9記載のプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)及びポリメラーゼを使用して増幅され、増幅物が検出可能な標識を運ぶステップと、
c)増幅物が、請求項6又は7記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのセット(set)、或いは請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイとハイブリッド形成するステップと、
d)ハイブリッド形成された増幅物が、その後、検出されるステップと、
が実行されることを特徴とする方法。 - 化学的処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又は二亜流酸塩の水溶液を用いて実行されることを特徴とする、請求項16記載の方法。
- 100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くのの異なる断片が増幅されることを特徴とする、請求項16又は17の一方に記載の方法。
- いくつかのDNAセグメントの増幅が、一つの反応槽において実行されることを特徴とする、請求項16乃至18のいずれか一項に記載の方法。
- ポリメラーゼが、耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項16乃至19のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行されることを特徴とする、請求項20記載の方法。
- 増幅の標識が、蛍光標識であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅の標識が、放射性核種であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅の標識が、質量分析計において検出される通常の質量を有する分離可能な分子断片であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅物又は増幅物の断片が、質量分析計において検出されることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 生成された断片が、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することを特徴とする、請求項24又は25の一方に記載の方法。
- 検出が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化されることを特徴とする、請求項24乃至26のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAが、DNAを含む細胞又は細胞構成要素から得られ、DNAのソースが例えば、細胞系と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド(histologic object slides)と、又はこれらにおいて可能なあらゆる組み合わせとを含むことを特徴とする、請求項16乃至27のいずれか一項に記載の方法。
- 重亜硫酸塩(bisulfite) (=二亜流酸塩、亜硫酸水素塩)試薬と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーを含むキット。
- 充実性腫瘍と、癌との診断のための、請求項1に記載の核酸と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーと、請求項29に記載のキットと、請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイと、請求項6乃至9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット(set)との使用。
- 充実性腫瘍と、癌との治療のための、請求項1に記載の核酸と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーと、請求項29記載のキットと、請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイと、請求項6乃至9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットとの使用。
- 重亜硫酸塩(bisulfite) (=二亜流酸塩、亜硫酸水素塩)試薬と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーを含むキット。
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