JP2004507213A - 細胞周期に関連する疾患の診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞周期に関連する遺伝子の化学的に修飾されたゲノム配列と、この配列に向けられた細胞周期に関連する遺伝子のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法とに関する。本発明は、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータと、特にそのシトシンメチル化パターンとが細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適していることを見出したことに基づいている。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
【技術分野】
【0001】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のRNAへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察(治療)レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、PNAオリゴマーとに関し、細胞周期及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び/又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【0002】
細胞周期は、各減数分裂間の一連の事象で、細胞が二つの娘細胞に分裂することで完了する。この周期は、G1、S、G2、及びM期という4種類の個別の段階によって構成される。核及び細胞質の分裂は、M(分裂)期に発生し、DNAの複製は、S期に発生する。M期の終了とS期の開始との間の期間は、G1と呼ばれ、S期の終了とM期の開始との間の段階は、G2と呼ばれる。
【0003】
こうした段階と一つの段階から次の段階への進行とを調整することは、順序化された細胞分裂の調整において重要な要素である。一つの段階から次の段階への一方向性の進行は、様々な生化学的「チェックポイント」において制御される。こうした「チェックポイント」又は生化学経路は、大きな関心に値し、こうした経路内での変化により、染色体の複製及び分離といった細胞周期に関連する事象の忠実性が減少する場合がある。
【0004】
哺乳類の細胞において、G1は、最も重要なチェックポイントを意味する。この時点において、細胞は、DNA複製に集中し、増殖を調整する。他のチェックポイントは、S期において複製した染色体の完全性をチェックする時、及びG2において細胞質分裂に集中する時に存在する。この時点で細胞が分裂しない場合、細胞は、染色体の補体(complement)を通常の二倍有する状態を維持する。
【0005】
調整システムは、経路の次の構成物をリン酸化又は脱リン酸化することで外的信号及びチェックポイントに反応する一連の酵素で構成される。リン酸化は、サイクリン依存性キナーゼによって触媒される。こうしたホロ酵素は、調整サブユニット(サイクリン)及び関連触媒サブユニット(サイクリン依存性キナーゼ又はCDK)という二種類のタンパク質サブユニットによって構成される。これらは、多くのレベルの調整を受け、両方とも、調整回路自体の活動の制御と、調整回路の決定を実行する基質の活動の制御とに使用される。一般に、異なるタイプのサイクリンは、文字によって表され(サイクリンA、サイクリンB等)、CDKは、数字によって区別される(CDK1、CDK2等)。細胞周期調整因子の役割は、Stephen Elledgeの″J.Cell Cycle Checkpoints:Preventing an Identity Crisis″Science,274;1664−1672(1996)において概説されている。
【0006】
細胞周期の誤調整は増殖につながる可能性があり、細胞周期調整因子は、多数の疾患、特に腫瘍の形成に、関与するとされてきた。細胞周期経路の崩壊に伴う疾患の例には、以下が含まれる。
【0007】
1.HIV感染。Zhou及びRatner、″Phosphorylation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Vpr Regulates Cell Cycle Arrest″Journal of Virology,Vol.74;6520−6527(2000)。
2.アルツハイマー病。Brucknerら、″Aberrancies in signal transduction and cell cycle related events in Alzheimer’s disease.″J Neural TransmSuppl;54:147−58(1998)。
3.移植片対宿主疾患。Boussiotisら、″Altered T−cell receptor+CD28−mediated signaling and blocked cell cycle progression in interleukin 10 and transforming growth factor−beta−treated alloreactive Tcells that do not induce graft−versus−host disease.″Blood.;97(2):565−571(2001)。
4.老化。Zhuら、″Neuronal CDK7 in hippocampus is related to aging and alzheimer disease″Neurobiol Aging.;21(6):807−13(2000)。
5.糸球体疾患。Shanklandら、″Differential expression of cyclin−dependent kinase inhibitors in human glomerular disease:role in podocyte proliferation and maturation.″Kidney Int.;58(2):674−83(2000)。
6.レービ小体疾患。Takahashiら、″Cyclin−dependent kinase5(Cdk5)associated with Lewy bodies in diffuse Lewy body disease.″Brain res.17;862(1−2):253−6(2000)。
7.関節炎。Kohsakaら、″Treatment of arthritis with cyclin−dependent kinase inhibitor P16INK4a gene″Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi.;22(6):397−9(1999)。
8.神経変性疾患。Patrickら、″Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration″Nature9;402(6762):615−22(1999)。
9.動脈硬化。Ihlingら、″Co−expression of p53 and MDM2 in human atherosclerosis:implications for the regulation of cellularity of atherosclerotic lesions.″J Pathol;185(3):303−12(1998)。
10.毛細血管拡張性運動失調。Matsuokaら、″Linkage of ATM to Cell Cycle Regulation by the Chk2 Protein Kinase″Science,Vol.282;1893−1897(1998)。
11.膀胱癌。Del Pizzoら、″Loss of Cell Cycle Regulators p27Kipl and Cyclin E in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder Correlates with Tumor Grade and Patient Survival″American Journal of Pathology,Vol.155:1129−1136(1999)。
12.白血病。Vrhovacら、″Prognostic Significance of the Cell Cycle Inhibitor p27Kipl in Chronic B−Cell Lymphocytic Leukemia″Blood Vol.91;4694−4700(1998)。
13.結腸直腸癌。Thomas G.V、″Down−Regulation of p27 Is Associated with Development of Colorectal Adenocarcinoma Metastases″American Journal of Pathology;153;681−687(1998)。
14.胃癌。Takani Y、″Cyclin D2 Overexpression and Lack of p27 Correlate Positively and Cyclin E Inversely with a Poor Prognosis in Gastric Cancer Cases″American Journal of Pathology;156;585−594(2000)。
15.肝臓癌。Albrecht J、″Regulation of GI cyclin−dependent kinases in the liver:role of nuclear localization and p27 sequestration″Vol.277;1207−G1216,(1999)。
16.肺癌。Nabeyrat E、″Retinoic acid−induced proliferation of lungalveolar epithelial cells in linked to p21CIP1 downregulation″Vol.278;42−L50,(2000)。
17.前立腺癌、De Marzo A、″Expression of the Cell Cycle Inhibitor p27Kipl in,normal,Hyperplastic,and Neoplastic Cells″American Journal of Pathology;153;911−919(1998)。
【0008】
DNAのメチル化は、遺伝子発現の正確な調整において必須要素である。例えば、p16タンパク質は、G1/S境界で細胞周期の進行を停止させ、p16作用の欠如は、無秩序な細胞増殖を可能にすることで癌の進行につながる場合がある。高メチル化が仲介するp16遺伝子の不活性化は、脳腫瘍と、乳癌と、結腸癌と、頭部及び頚部癌と、非小細胞肺ガンと、高度非ホジキンリンパ腫において実証されている。他の研究も、メチル化と遺伝子調整との間のつながりを立証しており、これには、Jacksonらの″Loss of genomic methylation causes p53 dependant apoptosis and epigenetic deregulation″Nature Genetics27;31−39(2001)が含まれ、これはいくつかの重要な細胞周期遺伝子の異常な発現パターンを示している。
【0009】
細胞周期遺伝子のメチル化依存調整の同定は、癌治療及び診断の代替方法を開発する可能性を広げるものである。DNAメチル化阻害因子による治療は、重要な細胞周期遺伝子p16の遺伝子発現を修復するものとして示されている。Benderら、″Inhibition of DNA methylation by 5−aza−2’−deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.″Cancer research58;95−101(1998)。これにより、腫瘍細胞系の成長の抑制につながる遺伝的レベルの遺伝子発現が生じた。
【0010】
メチル化ベースの治療は、化学療法、外科処置、及び放射線治療といった現行の治療方法に比べ、大きな利点を有する可能性がある。こうした治療は、従来の治療方法に対する耐性がある腫瘍を治療する手段を提供する可能性もあり、これは、Soengasらの″Inactivation of the apoptosis effector Apaf−1 in malignant melanoma″Nature 409;207−211(2001)によって実証されている。加えて、メチル化特異的治療の開発に加え、Minマウスでの実験は、DNAメチル化の阻害が腫瘍の発生を抑制できることを示している。Lairdら、″Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation″Cell81;197−205(1995)。更に、DNAメチル化分析は、癌診断の新しい手段を提供する可能性がある。
【0011】
5−メチルシトシンは、真核細胞のDNAにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として5−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、5−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、5−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、5−メチルシトシンが伴うエピジェネティクス情報は、PCR増幅中に完全に失われる。
【0012】
5−メチルシトシンに関してDNAを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、5−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。その結果、元のDNAは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるDNAをアガロースマトリックスで囲み、DNAの拡散及び復元を防ぎ(重亜硫酸塩は一本鎖DNAとのみ反応する)、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる(Olek A,Oswald J,Walter J.A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acid Res.1996 Dec 15;24(24):5064−6)。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約3000塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲的分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【0013】
5−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。Rein,T.,DePamphilis,M.L., Zorbas,H.,Nucleic Acids Res.1998,26,2255。
【0014】
現在まで、僅かな例外を除き(例えば、Zeschning M,Lich C,Buiting K,Doerfler W,Horsthemke B.A single−tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader−Willi Syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar−Apr;5(2):94−8)、重亜硫酸塩(bisulfite)手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか(Olek A,Walter J.The pre−implantation ontogeny of the H19 methylation imprint.Nat Genet.1997 Nov;17(3):275−6)、或いは、プライマ延長反応によって(Gonzalgo ML,Jones PA.Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation−sensitive single nucleotide primer extension(Ms−SNuPE).Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2529−31,WO出願95/00669)又は酵素的な消化によって(Xiong Z,Laird PW.COBRA:a sensitive and quantitative DNA methylation assay.Nucleic Acid res.1997 Jun 15;25(12):2532−4)、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている(Olekら、WO99/28498)
【0015】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているさらなるその他の出版物は、次の通りである。Grigg G,Clark S.Sequencing5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioessays.1994 Jun;16(6):431−6,431。Zeschningk M,Schmitz B,Dittrich B,Buiting K,Horsthemke B,Doerfler W.Imprinted segments in the human genome:different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997 Mar;6(3):387−95。Feil R,Charlton J,Bird AP,Walter J,Reik W.Methylation analysis on individual chromosomes:improved protocol for bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res.1994 Feb 25;22(4):695−6。Martin V,Ribieras S,Song−Wang X,Rio MC,Dante R.Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4。WO 97 46705、WO 9515373、及びWO 45560。
【0016】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、1999年1月に刊行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement,Volume 21,January 1999)と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【0017】
蛍光標識プローブは、固定化DNAアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの5’−OHに対するCy3及びCy5色素の容易な添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Cy3及びCy5色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【0018】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI−TOF)は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である(Karas M,Hillenkamp F.Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.Anal Chem.1988 Oct15;60(20):2299−301)。検体は、ライト(light)マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【0019】
MALDI−TOF分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である(Gut I G,Beck S.DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.Current Innovations and Future Trends.1995,1:147−57)。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約100倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。MALDI−TOF分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、DNAに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、DNAがペプチドに類似するような形でDNAを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立DNAに転換することができる(Gut IG,Beck S.A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry.Nucleic Acids Res.1995 Apr25;23(8):1367−73)。この修飾済みDNAに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【0020】
ゲノムDNAは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のDNAから取得される。この標準的な方法は、Fritsch及びManiatis編のMolecular Cloning:Alaboratory Manual,1989といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする問題】
【0021】
前記を考慮すると、本発明の目的は、細胞周期に関連する遺伝子の化学的に修飾されたDNAと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータと、特にそのシトシンメチル化パターンとが細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適していることを見出したことに基づいている。
【発明を解決するための手段】
【0022】
本発明による目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸を提供することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号(アクセッション番号)が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のGenBankを使用しており、インターネットアドレスはwww.ncbi.nlm.nih.govである。
【0023】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【0024】
本発明の目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAとハイブリッド形成する少なくとも13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のCpGジヌクレオチドであり、PNA−オリゴマーの場合は、CpGジヌクレオチドのシトシンが9−merの5’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【0025】
本発明によるオリゴマーは、配列ID番号1乃至配列ID番号424の配列及びこれの相補配列のCpGジヌクレオチド及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆる「セット(set)」において通常使用される。好適なものは、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列からのCpGジヌクレオチド及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセット(set)である。
【0026】
更に、本発明は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つのDNA配列及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子又はそのセグメントの配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列とを増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)を利用可能にする。
【0027】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット(set)の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【0028】
本発明は、化学的前処理されたゲノムDNA(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子の配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも10nのセット(set)(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー)に更に関する。こうしたプローブにより、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット(set)は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列において単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出するために使用することもできる。
【0029】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーの配置(いわゆる「アレイ」)は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【0030】
そのため、本発明の主題は、細胞周期に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第5,744,305号により知られている。
【0031】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む細胞周期に関連する疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップは、米国特許第5,837,832号により知られている。
【0032】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩(bisulfite)含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の18塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメント相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【0033】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【0034】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムDNA試料は、5’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【0035】
分析されるゲノムDNAは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったDNAの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジカルオブジェクトスライド(histological object slides)と、又はその組み合わせとである。
【0036】
上で説明したゲノムDNAの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩(bisulfite)(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【0037】
化学的前処理されたDNAの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのDNAセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行される。
【0038】
この方法の好適な実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)は、付録において指定された塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の少なくとも18塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補する配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、CpGジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【0039】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【0040】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴うことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実行電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレー質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化することができる。
【0041】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又はセット(set)とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット(set)は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。前記PNA−オリゴマは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、9−merの5’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。
【0042】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【0043】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【0044】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレー質量分析法(ESI)を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【0045】
生成された断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【0046】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、細胞周期に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用される。
【0047】
本発明による方法は、例えば、HIV感染と、神経変性疾患と、移植片対宿主疾患と、老化と、糸球体疾患と、レービ小体疾患と、関節炎と、動脈硬化と、充実性腫瘍と、癌との診断及び/又は治療に使用される。配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの本発明による核酸は、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用することができる。
【0048】
本発明は、更に、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療を行うための診断剤及び/又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【0049】
本発明の更なる主題は、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する細胞周期に関連する疾患の診断剤及び/又は治療剤に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【0050】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断に関し、これにおいて、細胞周期に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの他のセット(set)と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断の基準の役割を果たす。
【0051】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料DNAにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、60℃の2.5×SSC緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、37℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されとして理解される。
【0052】
「機能変異体」という用語は、DNA配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活性を有する、すべてのDNA配列を意味する。
【0053】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、細胞周期及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてSNP(単一ヌクレオチド多型)とである。
【0054】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、細胞周期及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子のDNA塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。さらにエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、DNAメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【0055】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて、これに限定されることなく、詳細に説明する。
以下の例は、細胞周期に関連する遺伝子の断片に関係し、この例では、CDK4において、特定のCG位置がメチル化状態に関して分析される。
【実施例1】
【0056】
細胞周期に関連するCDK4遺伝子におけるメチル化分析
以下の実施例は、シトシン依存性キナーゼ4(CDK4)遺伝子の断片に関係し、メチル化に関して特定のCG位置が分析される。
【0057】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の5位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは5位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)を使用して処理される。
【0058】
重亜硫酸(bisulfite)溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在する。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたDNAは、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたDNA試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このDNAは、その後、アルカリ性pH値で脱スルホン化される(10乃至30分、90乃至100℃)。この方法の第三のステップにおいて、このDNA試料は、好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、CDK4遺伝子のシトシンが分析される。このため、474bpの長さを有する定められた断片は、特定のプライマーオリゴヌクレオチドAAAAATAACACAATAACTCA(配列ID番号425)及びTTTTGGTAGTTGGTTATATG(配列ID番号426)により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと(これは例えばGGGTTGGCGTGAGGTA(配列ID番号427))、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置179に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたCy3及びCy5蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅DNAのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩処理されたDNAのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【0059】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えば、GGGTTGGTGTGAGGTA(配列ID番号428)である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【0060】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料1は健康な脳組織からのものであり、試料2は毛様細胞性星状細胞種(脳腫瘍)組織からのものである。結果(図1)から、試料1は増幅物の位置156においてメチル化していないのに対して、対照的に、試料2は同じ位置に高頻度のメチル化を有することが確認できる。
【実施例2】
【0061】
細胞周期に関連する疾患の診断
メチル化パターンを細胞周期に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのDNAメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、例1と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるCpGジヌクレオチドが特定される。これは、個別のCpGメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマー延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【0062】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【0063】
例2は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
HIV感染、神経変性疾患、移植片対宿主疾患、老化、糸球体疾患、レービ小体疾患、関節炎、動脈硬化、充実性腫瘍、及び癌。
【0064】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Iは、健康な脳組織からのものであり、試料IIは、毛様細胞性星状細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。CGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、TGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。試料Iは、増幅物の位置156においてメチル化していないが、一方、試料IIは、同じ位置において高頻度のメチル化を有することを確認できる。
【配列の説明】
配列ID番号1乃至424
配列ID番号1乃至424は、細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示している。特に、奇数の配列番号(配列ID番号1、3、5、...)を有する配列は、いずれの場合にも、細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す。偶数の配列番号(配列ID番号2、4、6、...)を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列を相補する細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す(例えば、配列ID番号1に対する相補配列は配列ID番号2であり、配列ID番号3に対する補完配列は配列ID番号4である)。
配列ID番号425乃至配列ID番号428は、例1において使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を示す。
【0001】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のRNAへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察(治療)レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、PNAオリゴマーとに関し、細胞周期及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び/又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【0002】
細胞周期は、各減数分裂間の一連の事象で、細胞が二つの娘細胞に分裂することで完了する。この周期は、G1、S、G2、及びM期という4種類の個別の段階によって構成される。核及び細胞質の分裂は、M(分裂)期に発生し、DNAの複製は、S期に発生する。M期の終了とS期の開始との間の期間は、G1と呼ばれ、S期の終了とM期の開始との間の段階は、G2と呼ばれる。
【0003】
こうした段階と一つの段階から次の段階への進行とを調整することは、順序化された細胞分裂の調整において重要な要素である。一つの段階から次の段階への一方向性の進行は、様々な生化学的「チェックポイント」において制御される。こうした「チェックポイント」又は生化学経路は、大きな関心に値し、こうした経路内での変化により、染色体の複製及び分離といった細胞周期に関連する事象の忠実性が減少する場合がある。
【0004】
哺乳類の細胞において、G1は、最も重要なチェックポイントを意味する。この時点において、細胞は、DNA複製に集中し、増殖を調整する。他のチェックポイントは、S期において複製した染色体の完全性をチェックする時、及びG2において細胞質分裂に集中する時に存在する。この時点で細胞が分裂しない場合、細胞は、染色体の補体(complement)を通常の二倍有する状態を維持する。
【0005】
調整システムは、経路の次の構成物をリン酸化又は脱リン酸化することで外的信号及びチェックポイントに反応する一連の酵素で構成される。リン酸化は、サイクリン依存性キナーゼによって触媒される。こうしたホロ酵素は、調整サブユニット(サイクリン)及び関連触媒サブユニット(サイクリン依存性キナーゼ又はCDK)という二種類のタンパク質サブユニットによって構成される。これらは、多くのレベルの調整を受け、両方とも、調整回路自体の活動の制御と、調整回路の決定を実行する基質の活動の制御とに使用される。一般に、異なるタイプのサイクリンは、文字によって表され(サイクリンA、サイクリンB等)、CDKは、数字によって区別される(CDK1、CDK2等)。細胞周期調整因子の役割は、Stephen Elledgeの″J.Cell Cycle Checkpoints:Preventing an Identity Crisis″Science,274;1664−1672(1996)において概説されている。
【0006】
細胞周期の誤調整は増殖につながる可能性があり、細胞周期調整因子は、多数の疾患、特に腫瘍の形成に、関与するとされてきた。細胞周期経路の崩壊に伴う疾患の例には、以下が含まれる。
【0007】
1.HIV感染。Zhou及びRatner、″Phosphorylation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Vpr Regulates Cell Cycle Arrest″Journal of Virology,Vol.74;6520−6527(2000)。
2.アルツハイマー病。Brucknerら、″Aberrancies in signal transduction and cell cycle related events in Alzheimer’s disease.″J Neural TransmSuppl;54:147−58(1998)。
3.移植片対宿主疾患。Boussiotisら、″Altered T−cell receptor+CD28−mediated signaling and blocked cell cycle progression in interleukin 10 and transforming growth factor−beta−treated alloreactive Tcells that do not induce graft−versus−host disease.″Blood.;97(2):565−571(2001)。
4.老化。Zhuら、″Neuronal CDK7 in hippocampus is related to aging and alzheimer disease″Neurobiol Aging.;21(6):807−13(2000)。
5.糸球体疾患。Shanklandら、″Differential expression of cyclin−dependent kinase inhibitors in human glomerular disease:role in podocyte proliferation and maturation.″Kidney Int.;58(2):674−83(2000)。
6.レービ小体疾患。Takahashiら、″Cyclin−dependent kinase5(Cdk5)associated with Lewy bodies in diffuse Lewy body disease.″Brain res.17;862(1−2):253−6(2000)。
7.関節炎。Kohsakaら、″Treatment of arthritis with cyclin−dependent kinase inhibitor P16INK4a gene″Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi.;22(6):397−9(1999)。
8.神経変性疾患。Patrickら、″Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration″Nature9;402(6762):615−22(1999)。
9.動脈硬化。Ihlingら、″Co−expression of p53 and MDM2 in human atherosclerosis:implications for the regulation of cellularity of atherosclerotic lesions.″J Pathol;185(3):303−12(1998)。
10.毛細血管拡張性運動失調。Matsuokaら、″Linkage of ATM to Cell Cycle Regulation by the Chk2 Protein Kinase″Science,Vol.282;1893−1897(1998)。
11.膀胱癌。Del Pizzoら、″Loss of Cell Cycle Regulators p27Kipl and Cyclin E in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder Correlates with Tumor Grade and Patient Survival″American Journal of Pathology,Vol.155:1129−1136(1999)。
12.白血病。Vrhovacら、″Prognostic Significance of the Cell Cycle Inhibitor p27Kipl in Chronic B−Cell Lymphocytic Leukemia″Blood Vol.91;4694−4700(1998)。
13.結腸直腸癌。Thomas G.V、″Down−Regulation of p27 Is Associated with Development of Colorectal Adenocarcinoma Metastases″American Journal of Pathology;153;681−687(1998)。
14.胃癌。Takani Y、″Cyclin D2 Overexpression and Lack of p27 Correlate Positively and Cyclin E Inversely with a Poor Prognosis in Gastric Cancer Cases″American Journal of Pathology;156;585−594(2000)。
15.肝臓癌。Albrecht J、″Regulation of GI cyclin−dependent kinases in the liver:role of nuclear localization and p27 sequestration″Vol.277;1207−G1216,(1999)。
16.肺癌。Nabeyrat E、″Retinoic acid−induced proliferation of lungalveolar epithelial cells in linked to p21CIP1 downregulation″Vol.278;42−L50,(2000)。
17.前立腺癌、De Marzo A、″Expression of the Cell Cycle Inhibitor p27Kipl in,normal,Hyperplastic,and Neoplastic Cells″American Journal of Pathology;153;911−919(1998)。
【0008】
DNAのメチル化は、遺伝子発現の正確な調整において必須要素である。例えば、p16タンパク質は、G1/S境界で細胞周期の進行を停止させ、p16作用の欠如は、無秩序な細胞増殖を可能にすることで癌の進行につながる場合がある。高メチル化が仲介するp16遺伝子の不活性化は、脳腫瘍と、乳癌と、結腸癌と、頭部及び頚部癌と、非小細胞肺ガンと、高度非ホジキンリンパ腫において実証されている。他の研究も、メチル化と遺伝子調整との間のつながりを立証しており、これには、Jacksonらの″Loss of genomic methylation causes p53 dependant apoptosis and epigenetic deregulation″Nature Genetics27;31−39(2001)が含まれ、これはいくつかの重要な細胞周期遺伝子の異常な発現パターンを示している。
【0009】
細胞周期遺伝子のメチル化依存調整の同定は、癌治療及び診断の代替方法を開発する可能性を広げるものである。DNAメチル化阻害因子による治療は、重要な細胞周期遺伝子p16の遺伝子発現を修復するものとして示されている。Benderら、″Inhibition of DNA methylation by 5−aza−2’−deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.″Cancer research58;95−101(1998)。これにより、腫瘍細胞系の成長の抑制につながる遺伝的レベルの遺伝子発現が生じた。
【0010】
メチル化ベースの治療は、化学療法、外科処置、及び放射線治療といった現行の治療方法に比べ、大きな利点を有する可能性がある。こうした治療は、従来の治療方法に対する耐性がある腫瘍を治療する手段を提供する可能性もあり、これは、Soengasらの″Inactivation of the apoptosis effector Apaf−1 in malignant melanoma″Nature 409;207−211(2001)によって実証されている。加えて、メチル化特異的治療の開発に加え、Minマウスでの実験は、DNAメチル化の阻害が腫瘍の発生を抑制できることを示している。Lairdら、″Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation″Cell81;197−205(1995)。更に、DNAメチル化分析は、癌診断の新しい手段を提供する可能性がある。
【0011】
5−メチルシトシンは、真核細胞のDNAにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として5−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、5−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、5−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、5−メチルシトシンが伴うエピジェネティクス情報は、PCR増幅中に完全に失われる。
【0012】
5−メチルシトシンに関してDNAを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、5−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。その結果、元のDNAは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるDNAをアガロースマトリックスで囲み、DNAの拡散及び復元を防ぎ(重亜硫酸塩は一本鎖DNAとのみ反応する)、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる(Olek A,Oswald J,Walter J.A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acid Res.1996 Dec 15;24(24):5064−6)。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約3000塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲的分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【0013】
5−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。Rein,T.,DePamphilis,M.L., Zorbas,H.,Nucleic Acids Res.1998,26,2255。
【0014】
現在まで、僅かな例外を除き(例えば、Zeschning M,Lich C,Buiting K,Doerfler W,Horsthemke B.A single−tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader−Willi Syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar−Apr;5(2):94−8)、重亜硫酸塩(bisulfite)手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか(Olek A,Walter J.The pre−implantation ontogeny of the H19 methylation imprint.Nat Genet.1997 Nov;17(3):275−6)、或いは、プライマ延長反応によって(Gonzalgo ML,Jones PA.Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation−sensitive single nucleotide primer extension(Ms−SNuPE).Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2529−31,WO出願95/00669)又は酵素的な消化によって(Xiong Z,Laird PW.COBRA:a sensitive and quantitative DNA methylation assay.Nucleic Acid res.1997 Jun 15;25(12):2532−4)、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている(Olekら、WO99/28498)
【0015】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているさらなるその他の出版物は、次の通りである。Grigg G,Clark S.Sequencing5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioessays.1994 Jun;16(6):431−6,431。Zeschningk M,Schmitz B,Dittrich B,Buiting K,Horsthemke B,Doerfler W.Imprinted segments in the human genome:different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997 Mar;6(3):387−95。Feil R,Charlton J,Bird AP,Walter J,Reik W.Methylation analysis on individual chromosomes:improved protocol for bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res.1994 Feb 25;22(4):695−6。Martin V,Ribieras S,Song−Wang X,Rio MC,Dante R.Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4。WO 97 46705、WO 9515373、及びWO 45560。
【0016】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、1999年1月に刊行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement,Volume 21,January 1999)と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【0017】
蛍光標識プローブは、固定化DNAアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの5’−OHに対するCy3及びCy5色素の容易な添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Cy3及びCy5色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【0018】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI−TOF)は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である(Karas M,Hillenkamp F.Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.Anal Chem.1988 Oct15;60(20):2299−301)。検体は、ライト(light)マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【0019】
MALDI−TOF分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である(Gut I G,Beck S.DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.Current Innovations and Future Trends.1995,1:147−57)。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約100倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。MALDI−TOF分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、DNAに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、DNAがペプチドに類似するような形でDNAを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立DNAに転換することができる(Gut IG,Beck S.A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry.Nucleic Acids Res.1995 Apr25;23(8):1367−73)。この修飾済みDNAに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【0020】
ゲノムDNAは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のDNAから取得される。この標準的な方法は、Fritsch及びManiatis編のMolecular Cloning:Alaboratory Manual,1989といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする問題】
【0021】
前記を考慮すると、本発明の目的は、細胞周期に関連する遺伝子の化学的に修飾されたDNAと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び/又はPNAオリゴマーと、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータと、特にそのシトシンメチル化パターンとが細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療に特に適していることを見出したことに基づいている。
【発明を解決するための手段】
【0022】
本発明による目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸を提供することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号(アクセッション番号)が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のGenBankを使用しており、インターネットアドレスはwww.ncbi.nlm.nih.govである。
【0023】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【0024】
本発明の目的は、配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAとハイブリッド形成する少なくとも13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のCpGジヌクレオチドであり、PNA−オリゴマーの場合は、CpGジヌクレオチドのシトシンが9−merの5’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【0025】
本発明によるオリゴマーは、配列ID番号1乃至配列ID番号424の配列及びこれの相補配列のCpGジヌクレオチド及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆる「セット(set)」において通常使用される。好適なものは、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列からのCpGジヌクレオチド及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセット(set)である。
【0026】
更に、本発明は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つのDNA配列及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子又はそのセグメントの配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列とを増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)を利用可能にする。
【0027】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット(set)の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【0028】
本発明は、化学的前処理されたゲノムDNA(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子の配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも10nのセット(set)(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー)に更に関する。こうしたプローブにより、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット(set)は、配列ID番号1乃至配列ID番号424のうち一つ及びこれの相補配列に従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列において単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出するために使用することもできる。
【0029】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーの配置(いわゆる「アレイ」)は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【0030】
そのため、本発明の主題は、細胞周期に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第5,744,305号により知られている。
【0031】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む細胞周期に関連する疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップは、米国特許第5,837,832号により知られている。
【0032】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩(bisulfite)含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の18塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメント相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、オリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【0033】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【0034】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムDNA試料は、5’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【0035】
分析されるゲノムDNAは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったDNAの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジカルオブジェクトスライド(histological object slides)と、又はその組み合わせとである。
【0036】
上で説明したゲノムDNAの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩(bisulfite)(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【0037】
化学的前処理されたDNAの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのDNAセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行される。
【0038】
この方法の好適な実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)は、付録において指定された塩基配列(配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列)の少なくとも18塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補する配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、CpGジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【0039】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【0040】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴うことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実行電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレー質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化することができる。
【0041】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又はセット(set)とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット(set)は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である13ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、13−merの5’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。前記PNA−オリゴマは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む。CpGジヌクレオチドのシトシンは、9−merの5’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれCpGジヌクレオチドが存在する。
【0042】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【0043】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【0044】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレー質量分析法(ESI)を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【0045】
生成された断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【0046】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、細胞周期に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用される。
【0047】
本発明による方法は、例えば、HIV感染と、神経変性疾患と、移植片対宿主疾患と、老化と、糸球体疾患と、レービ小体疾患と、関節炎と、動脈硬化と、充実性腫瘍と、癌との診断及び/又は治療に使用される。配列ID番号1乃至配列ID番号424及びこれの相補配列及び/又は表1記載の遺伝子配列のうち一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAの本発明による核酸は、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの診断及び/又は治療に使用することができる。
【0048】
本発明は、更に、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで細胞周期に関連する疾患の診断及び/又は治療を行うための診断剤及び/又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【0049】
本発明の更なる主題は、細胞周期に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する細胞周期に関連する疾患の診断剤及び/又は治療剤に関し、この診断剤及び/又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【0050】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断に関し、これにおいて、細胞周期に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータの他のセット(set)と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び/又は予後診断の基準の役割を果たす。
【0051】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料DNAにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、60℃の2.5×SSC緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、37℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されとして理解される。
【0052】
「機能変異体」という用語は、DNA配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活性を有する、すべてのDNA配列を意味する。
【0053】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、細胞周期及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてSNP(単一ヌクレオチド多型)とである。
【0054】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、細胞周期及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子のDNA塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。さらにエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、DNAメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【0055】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて、これに限定されることなく、詳細に説明する。
以下の例は、細胞周期に関連する遺伝子の断片に関係し、この例では、CDK4において、特定のCG位置がメチル化状態に関して分析される。
【実施例1】
【0056】
細胞周期に関連するCDK4遺伝子におけるメチル化分析
以下の実施例は、シトシン依存性キナーゼ4(CDK4)遺伝子の断片に関係し、メチル化に関して特定のCG位置が分析される。
【0057】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の5位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは5位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩(亜硫酸水素塩、二亜流酸塩)を使用して処理される。
【0058】
重亜硫酸(bisulfite)溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在する。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたDNAは、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたDNA試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このDNAは、その後、アルカリ性pH値で脱スルホン化される(10乃至30分、90乃至100℃)。この方法の第三のステップにおいて、このDNA試料は、好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、CDK4遺伝子のシトシンが分析される。このため、474bpの長さを有する定められた断片は、特定のプライマーオリゴヌクレオチドAAAAATAACACAATAACTCA(配列ID番号425)及びTTTTGGTAGTTGGTTATATG(配列ID番号426)により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと(これは例えばGGGTTGGCGTGAGGTA(配列ID番号427))、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置179に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたCy3及びCy5蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅DNAのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩処理されたDNAのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【0059】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えば、GGGTTGGTGTGAGGTA(配列ID番号428)である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【0060】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料1は健康な脳組織からのものであり、試料2は毛様細胞性星状細胞種(脳腫瘍)組織からのものである。結果(図1)から、試料1は増幅物の位置156においてメチル化していないのに対して、対照的に、試料2は同じ位置に高頻度のメチル化を有することが確認できる。
【実施例2】
【0061】
細胞周期に関連する疾患の診断
メチル化パターンを細胞周期に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのDNAメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、例1と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるCpGジヌクレオチドが特定される。これは、個別のCpGメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマー延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【0062】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【0063】
例2は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
HIV感染、神経変性疾患、移植片対宿主疾患、老化、糸球体疾患、レービ小体疾患、関節炎、動脈硬化、充実性腫瘍、及び癌。
【0064】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Iは、健康な脳組織からのものであり、試料IIは、毛様細胞性星状細胞種悪性度II(脳腫瘍)組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。CGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、TGオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。試料Iは、増幅物の位置156においてメチル化していないが、一方、試料IIは、同じ位置において高頻度のメチル化を有することを確認できる。
【配列の説明】
配列ID番号1乃至424
配列ID番号1乃至424は、細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示している。特に、奇数の配列番号(配列ID番号1、3、5、...)を有する配列は、いずれの場合にも、細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す。偶数の配列番号(配列ID番号2、4、6、...)を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列を相補する細胞周期に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムDNAの配列を示す(例えば、配列ID番号1に対する相補配列は配列ID番号2であり、配列ID番号3に対する補完配列は配列ID番号4である)。
配列ID番号425乃至配列ID番号428は、例1において使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を示す。
Claims (32)
- 配列ID番号1乃至配列ID番号424のグループから取り出した配列の一つ及びこれの相補配列に従った、細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのセグメントの少なくとも18塩基の長さである配列を含む核酸。
- 遺伝子CCNB1(M25753)、CCNE1(M73812)(M74093)、DENR(O43583)、EPHA5(L36644)、MCM4(X74794)、NEK3(Z29067)、PCTK3(X66362)、PRKAR1B(M65066)、PRKCG(M13977)(Z15114)、PRKM3(M84490)(Z11696)、PRKMK2(L11285)、ZAP70(L05148)、ACP1(NM_004300)、AKT1(NM_005163)、BMPR2(NM_001204)、DDR1(NM_013993)、CCND3(NM_001760)、CCNF(NM_001761)、CHES1(NM_005197)、CLK3(NM_003992)、DYRK1(NM_001396)、EFNA1(NM_004428)、IFIT1(NM_001548)、SCYB10(NM_001565)、INPP5D(NM_005541)、ISG20(NM_002201)、LY6E(NM_002346)、PCNA(NM_002592)、PIK3CA(NM_006218)、PPP1R3(NM_002711)、PTPN7(NM_002832)、PTPN9(NM_002833)、RHOK(NM_002929)、RYK(NM_002958)、EPHB3(NM_004443)、PPP3CA(NM_000944)、PRKCA(NM_002737)、PRKG1(NM_006258)、MAPK10(NM_002753)、MAPK6(NM_002748)、PTPRC(NM_002838)、PTPRD(NM_002839)、PTPRG(NM_002841)、RBL1(NM_002895)、STK3(NM_006281)、TGFB1(NM_000358)に従った配列の一つ及びこれの相補配列に従った、細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNAのセグメントの少なくとも18塩基の長さである配列を含む核酸。
- オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸(PNA)−オリゴマーであって、請求項1記載の配列ID番号1乃至424の一つに従った細胞周期に関連する遺伝子の化学的前処理されたDNA又は請求項2記載の遺伝子の化学的前処理されたDNA及びこれの相補配列とハイブリッド形成する又は同一である、少なくとも九個のヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列をいずれの場合でも含むオリゴマー。
- 塩基配列が少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む、請求項3記載のオリゴマー。
- CpGジヌクレオチドのシトシンが、オリゴマーの三分の一のほぼ中央に位置することを特徴とする、請求項4記載のオリゴマー。
- 請求項3乃至5のいずれか一項に記載の少なくとも二つのオリゴマーを含む、オリゴマーのセット(set)。
- 請求項1に記載の配列ID番号1乃至424に従った又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAに従った配列の一つとこれの相補配列とからすべてのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を検出するオリゴマーを含む、請求項6記載のオリゴマーのセット(set)。
- 配列ID1乃至配列ID424の一つのDNA配列及びこれの相補配列、及び/又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAの配列、及びこれの相補配列、又はそのセグメントの増殖のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用することが可能な、請求項3記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット(set)。
- 少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されていることを特徴とする、請求項8記載のオリゴヌクレオチドのセット(set)。
- 請求項1記載の化学的前処理されたゲノムDNA又は請求項2に記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAにおけるシトシンメチル化状態及び/又は単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する請求項6乃至9のいずれか一項に記載の少なくとも十個のオリゴマーを含む、オリゴマープローブのセット(set)の使用。
- 配列ID1乃至配列ID424の一つ及びこれの相補配列及び/又は請求項2記載の遺伝子の化学的前処理されたDNAのCpGジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析する、キャリヤー材料に固定された様々なオリゴマーの配置(アレイ)を製造する方法であって、請求項3乃至5のいずれか一項に記載の少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
- 請求項11により得ることが可能な、様々なオリゴマの配置(アレイ)。
- 長方格子又は六方格子の形態で平坦な固相上に配置されることを特徴とする、請求項12記載の様々なオリゴヌクレオチド−及び/又はPNA−オリゴマーのアレイ。
- 固相表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成されることを特徴とする、請求項12又は13記載のアレイ。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の少なくとも一つの核酸を含む、遺伝子のメチル化状態に関連する疾患を分析するDNA−及び/又はPNA−アレイ。
- シトシンメチル化を分析することで、既存の疾患或いは特定の疾患の素因に関する診断及び/又は治療のための遺伝的及び/又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法であって、
a)ゲノムDNA試料において、5位置においてメチル化されていないシトシン塩基を、化学処理によって、ウラシル又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換するステップと、
b)化学的前処理されたゲノムDNAの断片が、請求項8又は9記載のプライマーオリゴヌクレオチドのセット(set)及びポリメラーゼを使用して増幅され、増幅物が検出可能な標識を伴なうステップと、
c)増幅物が、請求項6又は7記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのセット(set)、或いは請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイとハイブリッド形成するステップと、
d)ハイブリッド形成された増幅物が、その後、検出されるステップと、
が実行されることを特徴とする方法。 - 化学的処理が、重亜硫酸塩(bisulfite)、亜硫酸水素塩、又は二亜流酸塩の水溶液を用いて実行されることを特徴とする、請求項16記載の方法。
- 100乃至2000塩基対の長さを有する10より多くの異なる断片が増幅されることを特徴とする、請求項16又は17の一方に記載の方法。
- いくつかのDNAセグメントの増幅が、一つの反応槽において実行されることを特徴とする、請求項16乃至18のいずれか一項に記載の方法。
- ポリメラーゼが、耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項16乃至19のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法を用いて実行されることを特徴とする、請求項20記載の方法。
- 増幅の標識が、蛍光標識であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅の標識が、放射性核種であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅の標識が、質量分析計において検出される通常の質量を有する分離可能な分子断片であることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅物又は増幅物の断片が、質量分析計において検出されることを特徴とする、請求項16乃至21のいずれか一項に記載の方法。
- 生成された断片が、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することを特徴とする、請求項24及び/又は25の一方に記載の方法。
- 検出が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI)を用いて、或いは電子スプレ質量分析法(ESI)を使用して、実行及び視覚化されることを特徴とする、請求項24乃至26のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAが、DNAを含む細胞又は細胞構成要素から得られ、DNAのソースが例えば、細胞系と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド(histologic object slides)と、又はこれらにおいて可能なあらゆる組み合わせとを含むことを特徴とする、請求項16乃至27のいずれか一項に記載の方法。
- 重亜硫酸塩(bisulfite)(=二亜流酸塩、亜硫酸水素塩)試薬と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマを備えるキット。
- HIV感染と、神経変性疾患と、移植片対宿主疾患と、老化と、糸球体疾患と、レービ小体疾患と、関節炎と、動脈硬化と、充実性腫瘍と、癌との診断のための、請求項1又は2に記載の核酸と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーと、請求項29に記載のキットと、請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイと、請求項6乃至9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット(set)との使用。
- HIV感染と、神経変性疾患と、移植片対宿主疾患と、老化と、糸球体疾患と、レービ小体疾患と、関節炎と、動脈硬化と、充実性腫瘍と、癌との治療のための、請求項1又は2に記載の核酸と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNA−オリゴマーと、請求項29記載のキットと、請求項12乃至15のいずれか一項に記載のアレイと、請求項6乃至9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット(set)との使用。
- 重亜硫酸塩(bisulfite)(=二亜流酸塩、亜硫酸水素塩)試薬と、請求項3乃至5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又はPNA−オリゴマーを備えるキット。
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