BR122015019398B1

BR122015019398B1 - Métodos para produzir planta de alfafa tolerante a glifosato tendo evento transgênico j-163 e para produzir feno de alfafa

Info

Publication number: BR122015019398B1
Application number: BR122015019398-2A
Authority: BR
Inventors: Kim A. Beazley; Kenneth L. Ferreira; Sharie N. Fitzpatrick; Mark H. McCaslin; Carlos C. Reyes
Original assignee: Monsanto Technology Llc; Forage Genetics, Inc.
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2019-10-01
Also published as: BRPI0407173A; US20060272042A1; CA2514450C; US20180312931A1; AR114135A2; US20150267267A1; EP1587931B1; EP2267136B1; AU2004209383B2; EP2267136A3; US20090282497A1; WO2004070020A3; AU2004209383A1; MX336070B; US7566817B2; DK2270189T3; ATE553202T1; CA2743564C; EP2270189A1; DK1587931T3

Abstract

resumo patente de invenção: "moléculas de dna, kit de detecção de dna, bem como métodos para produzir planta de alfafa tolerante a glifosato tendo evento transgênico j-163, para detectar dna em planta de alfafa j-163 e para produzir feno de alfafa". a presente invenção refere-se a moléculas de dna recombinantes compreendendo as sequências seq id no: 5, seq id no: 6, seq id no: 7 e seq id no: 8 e a kit de detecção de dna. a presente invenção refere-se ainda a métodos para produzir planta de alfafa tolerante a glifosato tendo evento transgênico j-163, para detectar dna em planta de alfafa j-163 e para produzir feno de alfafa.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, mais especificamente, a invenção refere-se à tolerância transgênica ao glifosato em uma planta de alfafa. A invenção, mais se refere aos eventos J-101 e J-163 de alfafa tolerantes ao glifosato e aos ensaios para detecção da presença do DNA de alfafa tolerante ao glifosato em um extrato de plantas. Particularmente, a presente invenção está direcionada ao evento J-163.

Antecedentes da Invenção [002] A alfafa se constitui em uma importante cultura de forragem animal em diversas áreas do mundo. Os métodos de biotecnologia têm sido aplicados à alfafa para o aperfeiçoamento das características agronômicas e da qualidade do produto. Uma importante característica agronômica na produção da alfafa é a tolerância ao herbicida, em particular, a tolerância ao herbicida de glifosato.

[003] A alfafa é uma planta leguminosa perene (Mendicago sativa) da família Leguminosae (família pulsante), a mais importante planta de pasto e feno na América do Norte, também cultivada extensivamente na Argentina, sul da Europa e Ásia. A alfafa apresenta um alto rendimento, alto teor de proteína e crescimento prolífico. Entretanto, ao contrário da maioria dos grãos ou cultura de fibras das quais as sementes são separadas na colheita, as sementes são normalmente colhidas junto com a colheita da forragem, reduzindo, de modo potenPetição 870190044759, de 13/05/2019, pág. 10/22

2/37 ciai, a qualidade. As reduções na qualidade se apresentam, normalmente, na forma de um teor mais baixo de proteína e de capacidade de digestão da ração. As ervas daninhas na alfafa nova significam, especialmente, a redução do rendimento e da qualidade da colheita. As principais ervas daninhas em campos de alfafa nova são sazonais, tais como, capim verde tipo rabo de raposa, anserina e quarto de cordeiro. As ervas daninhas anuais, tais como, Flixweed, mostarda azul, carteira do pastor, outros tipos de mostarda e capim-cevadinha fofo, são as ervas daninhas mais prováveis de provocar graves problemas em plantios estabelecidos. As ervas daninhas perenes, tais como cevada de capim de rabo de raposa e dente de leão provocam, também, problemas comuns de ervas daninhas em plantações estabelecidas de alfafa. Trepadeira corriola e cardo do Canadá são ervas daninhas na alfafa, para as quais não existem atualmente satisfatórios métodos de controle. Uma ocorrência de alfafa tolerante a herbicida seria uma característica de utilidade para o controle de ervas daninhas e manutenção da qualidade da forragem.

[004] O composto de N-fosfonometilglicina, também conhecido como glifosato, é um herbicida bem-conhecido que apresenta atividade em um amplo espectro de espécies de plantas. O glifosato é o ingrediente ativo do produto Roundup® (Monsanto e Co.), um herbicida seguro que apresenta um desejável curto tempo de meia-vida no ambiente. Quando aplicado a uma superfície de uma planta, o glifosato de move sistemicamente através da planta. O glifosato é fitotóxico devido a sua inibição no percurso do ácido chiquímico, que proporciona um precursor para a síntese dos aminoácidos aromáticos. O glifosato inibe a síntese da enzima 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato (EPSPS) encontrada nas plantas. A tolerância ao glifosato pode também ser obtida mediante expressão das variantes de EPSPS que apresentam afinidade mais baixa para o glifosato e, portanto, retêm sua atividade catalíti

3/37 ca na presença do glifosato (Patentes U.S. N° 5.633.435; 5.094.945; 4.535.060 e 6.040.497). As enzimas que decompõem o glifosato em tecidos de plantas (patente U.S. N° 5.463.175) são também capazes de conferir tolerância celular ao glifosato. Tais genes são usados para a produção de cultivos transgênicos que são tolerantes ao glifosato, dessa forma, permitindo o uso do glifosato para o eficaz controle de ervas daninhas com a mínima preocupação quanto ao dano da colheita. Por exemplo, a tolerância ao glifosato foi geneticamente construída no milho (Patente U.S. N° 5.554.798), trigo (Zhou e outros, Plant Cell Rep., 15:159-163, 1995), soja (WO 92/00377) e canola (WO 92/04449). Os transgenes para a tolerância ao glifosato e os transgenes para tolerância a outros herbicidas, por exemplo, gene bar (Toki e outros, Plant Physiol., 100:1503-1507, 1992; Thompson e outros, EMBO J., 6:25192523, 1987; fosfinotricina acetiltransferase, DeBlock e outros, EMBO J., 6:2513-2522, 1987, herbicida de glifosinato) são também de utilidade como marcadores selecionáveis ou marcadores de pontuação, podendo proporcionar um fenótipo útil para a seleção de plantas ligadas a outros traços agronômicos úteis.

[005] A expressão de genes estranhos em plantas é conhecida como sendo influenciada por sua posição cromossomal, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou devido à proximidade dos elementos de regulação transcricional (por exemplo, intensificadores) do sítio de integração (Weising e outros, Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Por essa razão, é normalmente necessário se selecionar vários grandes eventos a fim de identificar um evento caracterizado pela expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, foi observado nas plantas e em outros organismos que pode haver uma grande variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também haver diferenças nos padrão espacial e temporal de expressão, por exemplo, diferenças na

4/37 expressão relativa de um transgene em diversos tecidos de plantas, que não podem corresponder aos padrão esperados de elementos reguladores transcricionais presentes no constructo do gene introduzido. Por essa razão, é comum se produzir de centenas a milhares de diferentes eventos e selecionar aqueles para um único evento que seja desejado níveis e padrão de expressão de transgene para fins comerciais. Um evento que tenha desejados níveis ou padrão de expressão de transgenes é de utilidade para a introdução do transgene dentro de outros fundamentos genéticos mediante cruzamento sexual usando métodos de procriação convencionais. A progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica do transformante original. Essa estratégia é usada para garantir a confiável expressão do gene em uma série de variedades que são bem-adaptadas às condições de cultura sítio.

[006] Seria vantajoso ser possível a detecção da presença de um particular evento a fim de determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Além disso, um método para detecção de um particular evento seria de utilidade, por exemplo, para o cumprimento das determinações necessárias para a aprovação do pré-marcador e rotulação dos alimentos derivados de plantas de cultura recombinante. É possível se detectar a presença de um transgene através de qualquer método de detecção de ácido polinucléico já conhecido, tal como, a reação em cadeia por polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido polinucléico. Esses métodos de detecção geralmente focam os elementos genéticos frequentemente usados, tais como, promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para a discriminação entre diferentes eventos, particularmente, aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA, a menos que a sequência de DNA cromossomal (DNA de flanqueamento) adjacente ao

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DNA do transgene inserido seja conhecida. Um evento específico de ensaio de PCR é discutido, por exemplo, por Windels e outros (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent., 64/5b:459-462, 1999), o qual identificou um evento de soja 40-3-2 tolerante ao glifosato através de PCR usando um conjunto de iniciadores abrangendo a junção entre o transgene inserido e o DNA de flanqueamento, especificamente um iniciador que incluiu a sequência da inserção e um segundo iniciador que incluiu a sequência do DNA de flanqueamento. Os métodos de detecção de DNA específico de evento de planta transgênica foram também descritos na Patente U.S. N° 2002/0013960 e WO 02/27004.

[007] A presente invenção refere-se à ocorrência de eventos J101 e J-163 de alfafa tolerante ao herbicida de glifosato e às moléculas contidas nessas plantas de alfafa que são de utilidade nos métodos de detecção para a alfafa tolerante ao glifosato e descendência da mesma.

Sumário da Invenção [008] A presente invenção refere-se a um evento de alfafa transgênica, designado por J-101, tendo a semente sido depositada na ATCC (American Type Culture Collection), com N° de Acesso PTA4814. Outro aspecto da invenção compreende as plantas descendentes ou sementes ou partes regeneráveis das plantas e sementes do evento J-101 da alfafa. A invenção também inclui as partes de planta do evento J-101 da alfafa, incluindo, mas sem que haja qualquer limitação, o pólen, óvulo, flores, brotos, raízes e folhas. A invenção proporciona uma planta de alfafa tolerante ao glifosato, que apresenta todas as características fisiológicas e morfológicas do evento J-101 da alfafa, conforme descrito na reivindicação 1, além das plantas descendentes e partes das mesmas.

[009] Um aspecto da invenção proporciona composições e métodos para detecção da presença de uma região de junção transge

6/37 ne/genômica de DNA, da planta ou semente do evento J-101 de alfafa. As moléculas de DNA são fornecidas, compreendendo pelo menos uma molécula de DNA de junção transgene/genômica selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e complementos das mesmas, em que a molécula de junção abrange o sítio de inserção que compreende um DNA heterólogo inserido dentro do genoma e o DNA genômico da célula de alfafa flanqueando o sítio de inserção do evento J-101 de alfafa. Um evento J-101 de alfafa e uma semente compreendendo essas moléculas de DNA constituem um aspecto da presente invenção.

[0010] Uma nova molécula de DNA é fornecida, que é uma SEQ ID NO: 3 da região de transgene/genômica de DNA ou complemento da mesma, do evento J-101 de alfafa. Uma planta e semente de alfafa compreendendo a SEQ ID NO: 3 em seu genoma constitui um aspecto da presente invenção. De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de DNA, que é uma SEQ ID NO: 4 da região de transgene/genômica de DNA ou o complemento da mesma, em que a molécula de DNA é nova no evento J-101 de alfafa. Uma planta e semente de alfafa compreendendo a SEQ ID NO: 4 em seu genoma constitui um aspecto da presente invenção.

[0011] De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas para uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região de transgene da molécula de DNA da SEQ ID NO: 3 e uma molécula de DNA de similar extensão de qualquer porção de uma região de DNA genômico de alfafa na posição de flanqueamento 5'da SEQ ID NO: 3, onde essas moléculas de DNA quando usadas juntas são de utilidade como iniciadores de DNA em um método de ampliação de DNA que produz um amplicon. O amplicon produzido usando esses iniciadores

7/37 de DNA no método de ampliação de DNA compreende a SEQ ID NO:

e serve de diagnóstico para o evento J-101 de alfafa. Qualquer amplicon produzido pelos iniciadores homólogos de DNA ou complementares a qualquer porção da SEQ ID NO: 3 que ainda compreende SEQ

ID NO: 1 constitui um aspecto da presente invenção.

[0012] De acordo com outro aspecto da presente invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas para uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região de transgene da molécula de DNA da SEQ ID NO: 4 e uma molécula de DNA de extensão similar de qualquer porção de um DNA genômico de flanqueamento 3' de alfafa da SEQ ID NO: 4, em que essas moléculas de DNA são de utilidade como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA. O amplicon produzido usando esses iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA compreende a SEQ ID NO: 2 e se constitui em um diagnóstico para o evento J-101 de alfafa. Qualquer amplicon produzido pelos iniciadores de DNA homólogos ou complementares a qualquer porção da SEQ ID NO: 4 que compreende ainda a SEQ ID NO: 2 constitui um aspecto da presente invenção.

[0013] A invenção inclui ainda a planta ou semente de alfafa, cujo DNA de genoma contém a SEQ ID NO: 3 ou a SEQ ID NO: 4 ou um amplicon, que é produzida em métodos de amplificação de DNA que compreendem a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2.

[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de detecção da presença de DNA correspondendo especificamente ao DNA do evento J-101 de alfafa em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo o DNA com um conjunto de iniciadores que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico do evento

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J-101 de alfafa produz um amplicon de DNA compreendendo a SEQ

ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2, constituindo um diagnóstico para o evento J-101 de alfafa; (b) execução de uma reação de amplificação de ácido nucléico, dessa forma, produzindo o amplicon; e (c) detecção do amplicon.

[0015] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de detecção da presença de DNA correspondendo especificamente ao DNA do evento J-101 de alfafa em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo o DNA com uma sonda compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2, que se hibridizam sob condições severas de hibridização com o DNA genômico do evento J-101 de alfafa e não se hibridizam sob condições severas de hibridização com um DNA de planta controle de alfafa; (b) submissão da amostra e sonda às condições severas de hibridização e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA do evento J-101 de alfafa.

[0016] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de produção de uma planta de alfafa que é tolerante à aplicação de glifosato, compreendendo as etapas de: (a) cruzar sexualmente um primeiro evento J-101 de alfafa tolerante ao glifosato de origem com uma segunda planta de alfafa de origem que omite a tolerância ao glifosato, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de plantas descendentes; e (b) selecionar uma planta descendente que tolera a aplicação do glifosato. Os métodos de procriação podem compreender as etapas de cruzamento de uma planta do evento J-101 de alfafa de origem com uma segunda planta de alfafa de origem que também é tolerante ao glifosato e seleção da descendência tolerante ao glifosato através de um DNA molecular marcador, geneticamente ligado a um fenótipo tolerante ao glifosato encontrado em cada DNA de origem.

[0017] A presente invenção refere-se ainda a um evento de alfafa

9/37 designado J-163, tendo semente depositada no ATCC (American Type Culture Collection) sob o N° de Acesso PTA-4815. Outro aspecto da presente invenção refere-se a plantas, sementes ou partes regeneráveis de plantas e sementes descendentes do evento J-163 de alfafa. A invenção também abrange partes de plantas do evento J-163 de alfafa que incluem, sem que haja qualquer limitação, pólen, óvulo, flores, brotos, raízes e folhas.

[0018] A invenção proporciona uma planta de alfafa tolerante ao glifosato que apresenta todas as características fisiológicas e morfológicas do evento J-163 de alfafa, conforme descrito na reivindicação 1, além das plantas descendentes e partes das mesmas.

[0019] Um aspecto da invenção proporciona composições e métodos para detecção da presença de uma região de junção transgene/genômica do evento J-163 de alfafa. As moléculas de DNA são fornecidas, compreendendo pelo menos uma molécula de DNA de junção transgene/genômica selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e complementos das mesmas, em que a molécula de junção abrange o sítio de inserção que compreende um DNA heterólogo inserido dentro do genoma e o DNA genômico da célula de alfafa flanqueando o sítio de inserção do evento J-163 de alfafa. Um evento J-163 de alfafa e uma semente compreendendo essas moléculas de DNA constituem um aspecto da presente invenção.

[0020] Uma nova molécula de DNA é fornecida, que é uma SEQ ID NO: 7 da região de transgene/genômica ou complemento da mesma, em que essa molécula de DNA é nova no evento J-163 de alfafa. Uma planta e semente de alfafa compreendendo a SEQ ID NO: 7 em seu genoma constitui um aspecto da presente invenção. De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de DNA, que é uma SEQ ID NO: 8 da região de transgene/genômica ou o complemento da mesma, em que a molécula de DNA é nova no evento J

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163 de alfafa. Uma planta e semente de alfafa compreendendo a SEQ ID NO: 8 em seu genoma constitui um aspecto da presente invenção. [0021] De acordo com outro aspecto da presente invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas ao uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região trangênica da molécula de DNA apresentando a SEQ ID NO: 7, e uma molécula de DNA com comprimento similar a qualquer porção da região de DNA genômico da alfafa que flanqueia 5' e que apresenta a SEQ ID NO: 7, em que estas moléculas de DNA, quando usadas juntas, são úteis como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA, o qual produz um amplicon compreendendo a SEQ ID NO: 5. O amplicon, produzido por meio do uso dos iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA, é um diagnóstico para o evento J163 da alfafa. Qualquer amplicon compreendendo a SEQ ID NO: 5 e produzido pelos iniciadores de DNA, homóloga ou complementarmente a qualquer porção da SEQ ID NO: 7, é um aspecto da presente invenção.

[0022] De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas para uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer porção da região de transgene da molécula de DNA da SEQ ID NO: 8 e uma molécula de DNA de similar extensão de qualquer porção de uma região de DNA genômico de alfafa na posição de flanqueamento 3' da SEQ ID NO: 8, onde essas moléculas de DNA são de utilidade como iniciadores de DNA em um método de ampliação de DNA. O amplicon compreendendo a SEQ ID NO: 6 produzido mediante uso desses iniciadores de DNA no método de ampliação de DNA, serve de diagnóstico para o evento J-163 de alfafa. O amplicon compreendendo a SEQ ID NO: 6,

11/37 produzido pelos iniciadores homólogos de DNA ou complementares a qualquer porção da SEQ ID NO: 8, constitui um aspecto da presente invenção.

[0023] Uma planta ou semente de alfafa, o DNA genômico que quando isolado da planta ou semente de alfafa produz um diagnóstico de amplicon para o evento J-163 de alfafa, testado em um método de amplificação de DNA constitui um aspecto da presente invenção.

[0024] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de detecção da presença de DNA correspondendo especificamente ao DNA do evento J-163 de alfafa em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo o DNA com um conjunto de iniciadores, que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico do evento J-163 de alfafa produz um amplicon compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6, constituindo um diagnóstico para o evento J-163 de alfafa; (b) execução de uma reação de amplificação de ácido nucléico, dessa forma, produzindo o amplicon; e (c) detecção do amplicon.

[0025] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de detecção da presença de DNA correspondendo especificamente ao DNA do evento J-163 de alfafa em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo o DNA com uma sonda compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6, que se hibridizam sob condições severas de hibridização com o DNA genômico do evento J-163 de alfafa e não se hibridizam sob condições severas de hibridização com um DNA de planta controle de alfafa; (b) submissão da amostra e sonda às condições severas de hibridização e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA do evento J-163 de alfafa.

[0026] De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcio

12/37 nados métodos de produção de uma planta de alfafa que é tolerante à aplicação de glifosato, compreendendo as etapas de: (a) cruzar sexualmente um primeiro evento J-163 de alfafa tolerante ao glifosato de origem com uma segunda planta de alfafa de origem que omite a tolerância ao glifosato, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de plantas descendentes; e (b) selecionar uma planta descendente que tolera a aplicação do glifosato. Os métodos de procriação podem compreender as etapas de cruzamento de uma planta do evento J-163 de alfafa de origem com uma segunda planta de alfafa de origem que também é tolerante ao glifosato e seleção da descendência tolerante ao glifosato através de um DNA molecular marcador, geneticamente ligado a um fenótipo tolerante ao glifosato encontrado em cada DNA de origem.

[0027] De acordo com um adicional aspecto da invenção, é proporcionada uma planta ou semente de alfafa, na qual seu genoma irá produzir um amplicon compreendendo as SEQ ID NOs:1 ou 2 e 5 ou 6, para diagnóstico de evento J-101 de alfafa e evento J-163 de alfafa quando testado em um método de amplificação de DNA, para amplificar uma molécula de DNA de uma planta ou semente de alfafa. A planta ou semente de alfafa também compreende em seu genoma uma molécula de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:1-8.

[0028] Outro aspecto da invenção compreende uma mistura de semente de alfafa, a mistura compreendendo a semente do evento J101 de alfafa e uma semente de evento J-163 de alfafa. Um campo de plantas de alfafa compreendendo a mistura de plantas J-101 e J-163 de alfafa constitui um aspecto da presente invenção.

[0029] A invenção proporciona plantas de alfafa tolerantes ao glifosato que quando crescidas em um campo e tratadas com uma formulação herbicida contendo glifosato proporcionam uma colheita de feno de alfafa essencialmente isenta de ervas daninhas.

13/37 [0030] Os aspectos anteriores e outros aspectos da invenção se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e dos desenhos anexos.

Breve Descrição dos Desenhos [0031] Figura 1: organização das inserções de transgenes nos genomas de eventos J-101 e J-163 de alfafa e localização dos iniciadores e amplicons do DNA.

[0032] Figura 2: sequência de de J-101;

[0033] Figura 3: sequência de de J-101;

[0034] Figura 4: sequência de de J-163;

[0035] Figura 5: sequência de de J-163;

[0036] Figura 6: iniciadores de plicon a partir dos eventos J-101 ou

DNA 5'transgene/genoma, isolada

DNA 3'transgene/genoma, isolada

DNA 5'transgene/genoma, isolada

DNA 3'transgene/genoma, isolada

DNA usados para produzir um amJ-163 de alfafa;

[0037] Figura 7: mapa de plasmídeo de pMON20998 usado para produzir plantas de alfafa tolerantes ao glifosato.

Descrição Detalhada de Modalidades Preferidas [0038] A invenção refere-se à alfafa tolerante ao glifosato. Em particular, a dois eventos de alfafa, J-101 e J-163, que podem ser usados individualmente, como uma mistura de sementes ou como uma des cendência de um cruzamento de reprodução dos dois eventos para produzir um campo de alfafa que pode ser tratado com formulações herbicidas contendo glifosato, de modo a proporcionar uma cultura de feno de alfafa essencialmente isenta de ervas daninhas. A invenção refere-se ainda a moléculas de DNA que podem ser usadas para especificamente identificar o DNA J-101 e J-163 em uma amostra contendo DNA de alfafa. As definições e métodos seguintes são forneci

14/37 dos para melhor definir a presente invenção e para orientar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que observado em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem também ser encontradas nas publicações de Rieger e outros, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5^a. Edição, Springer-Verlag: N. York, 1991; e na publicação de Lewin, Genes V, Oxford University Press: N. York, 1994. A nomenclatura para as bases de DNA, conforme estabelecido em CFR 37, parágrafo 1.822, é utilizada.

[0039] Conforme aqui usado, o termo alfafa significa Medicago sativa e inclui todas as variedades de plantas que podem ser procriadas com alfafa. A alfafa é também chamada medie, nome dado a qualquer planta do gênero Medicago, ervas do Velho Mundo com flores azuis ou amarelas, similares àquelas das plantas de cravo-da-índia relacionadas. A medie preta (M. lupulina) e os carrapichos de cravoda-índia (M. arabica e M. hispida) se encontram dentro das espécies sazonais naturalizadas na América do Norte e algumas vezes também cultivadas para produção de feno e para pastagem. A alfafa é classificada na divisão Magnoliophyta, classe Magnoliopsida, ordem Rosales, família Leguminosae. Diferentemente do milho ou da soja, as plantas de alfafa são autotetraplóides, isto é, cada traço ou característica é determinado por genes que residem em quatro cromossomos, ao invés de dois. Isso torna a pesquisa genética bastante complexa e aumenta a dificuldade de melhorar a alfafa. A semente comercial de alfafa é normalmente compreendida de uma mistura de clones que podem constituir um cultivo sintético gerado por meio de interpolinização aleatória entre os clones selecionados, seguido por uma a três gerações de polinização abertas em isolamento. Um cultivo composto de alfafa pode também ser desenvolvido mediante mistura de semente de dois

15/37 ou mais clones ou mediante interpolinização de clones em isolamento. Ao se formar o cultivo composto, quantidades iguais de semente de cada clone componente serão misturadas para formar o estoque inicial de sementes procriadoras. Métodos para procriação de plantas de alfafa transgênicas foram descritos no Pedido de Patente U.S. N° 2002/0042928 (aqui incorporado por meio dessa referência em sua integridade).

[0040] Conforme aqui usado, o termo compreendendo significa incluindo, sem ser limitado.

[0041] O composto glifosato refere-se à N-fosfonometilglicina e seus sais. O glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto e Co.). Tratamentos com herbicida de glifosato referem-se a tratamentos com o herbicida Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup Pro® ou qualquer outra formulação herbicida contendo glifosato. Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem qualquer restrição, aquelas vendidas pela Monsanto Company, como herbicidas Roundup®, Roundup® Ultra, Roundup® Ultramax, Roundup® Weathermax, Roundup® CT, Roundup® Extra, Roundup® Biactiva, Roundup® Bioforce, Rodeo®, Polaris®, Spark® e Acord®, todos os quais contendo glifosato na forma de seu sal de isopropilamônio; aqueles vendidos pela Monsanto Company como herbicidas Roundup® Dry e Rival®, que contêm glifosato na forma de seu sal de amônio; aqueles vendidos pela Monsanto Company como herbicidas Roundup® Geofoce, que contêm glifosato na forma de seu sal de sódio; e aqueles vendidos pela Syngenta Crop Protection como herbicida Touchdown®, que contêm glifosato na forma de seu sal de trimetilsulfônio.

[0042] Um evento transgênico é produzido mediante transformação de células de planta com DNA heterólogo, isto é, construção de ácido nucléico que inclui um transgene de interesse, regeneração de

16/37 uma população de plantas resultantes da inserção do transgene dentro do genoma da planta e seleção de uma planta em particular, caracterizado pela inserção em uma localização particular de genoma. O termo evento refere-se ao transformante original e à descendência do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo evento também refere-se à descendência produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA de transgene heterólogo. Mesmo após se repetir o retrocruzamento com uma origem recorrente, o DNA de transgene inserido e o DNA de flanqueamento da origem transformada se encontram presentes na descendência do cruzamento, na mesma localização cromossomal. O termo evento também refere-se ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido, que seria esperada de ser transferida a uma descendência que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse, como resultado do cruzamento sexual de uma linha de parentesco que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a descendência resultante do mesmo) e uma linha de parentesco que não contém o DNA inserido. Os eventos tolerantes ao glifosato da presente invenção são referidos aqui como J-101 e J-163. A presente invenção proporciona sementes e partes de planta dos eventos J-101 e J-163 e sementes e partes de plantas de cultivos sintéticos produzidos pela combinação de genomas de ambos.

[0043] Uma planta de alfafa tolerante ao glifosato pode ser reproduzida inicialmente mediante cruzamento sexual de uma primeira planta de alfafa de parentesco, consistindo em uma planta de alfafa cultivada a partir de plantas J-101 e J-163 de alfafa transgênica ou de uma planta de alfafa que seja uma descendência do cruzamento de J-101 e J-163, que expresse o fenótipo tolerante ao glifosato e uma segunda planta de alfafa de origem que omite a tolerância ao herbicida de glifo

17/37 sato, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de primeiras plantas descendentes; e, em seguida, uma seleção de uma planta descendente que seja tolerante à aplicação do herbicida de glifosato. Essas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da planta descendente tolerante ao glifosato à segunda planta de alfafa de parentesco ou a uma terceira planta de alfafa de parentesco, depois, selecionando a descendência mediante aplicação do glifosato ou mediante identificação com marcadores moleculares associados às características, produzindo, dessa forma, uma planta de alfafa que tolera a aplicação do herbicida de glifosato. Os marcadores moleculares compreendem as sequências de junção identificadas nos locais 3' e 5' da inserção do transgene na alfafa J-101 e J-163.

[0044] As aplicações de formulações herbicidas que contêm glifosato podem ser aplicadas em um campo de plantas de alfafa que compreende J-101 ou J-163 ou uma mistura de semente de cada ou um cultivo sintético que contém as porções genômicas de J-101 e J163 que contêm o transgene da presente invenção. As taxas de tratamento de glifosato ao campo podem ser de cerca de até 2.721,5 g (6 libras) de equivalente de ácido/ano, dividido em múltiplas aplicações em que nenhum tratamento excede cerca de 680,4 g (1,5 libra) de equivalente de ácido de glifosato. Essas taxas proporcionam um alto nível de controle de ervas daninhas no campo de alfafa. O corte da colheita de feno nos campos de alfafa é de alta qualidade e essencialmente isento de ervas daninhas.

[0045] Deve também ser entendido que duas diferentes plantas transgênicas podem também ser acasaladas para produzir proles que contêm dois transgenes independentemente exógenos de segregação. O retrocruzamento com uma planta de parentesco e um cruzamento excedente com uma planta não-transgênica, como anteriormente descrito, é também contemplado, como sua propagação vegetativa. As

18/37 descrições de outros métodos de procriação, que são comumente usados para diferentes características e culturas, podem ser encontradas em uma de diversas referências, por exemplo, Fehr, na publicação Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. Ed., American Society of Agronomy, Madison Wl (1987). Especificamente para a procriação de alfafa, os métodos descritos no Pedido de Patente U.S. N° 2002/0042928 são particularmente úteis para eventos de reprodução de alfafa transgênica. A resultante planta e semente de alfafa compreende uma mistura de genótipos de eventos de alfafa transgênica. Os genótipos resultam de cruzamentos de diomogênicos (AxxxByyy, onde A e B representam os transgenes) que são obtidos do cruzamento (Axxxyyyy) X (xxxxByyy) e a descendência diomogênica é identificada por PCR. O intercruzamento dos diomogênicos resulta no cultivo de alfafa sintética que é o produto comercial. Na presente invenção, um produto comercial de alfafa pode conter uma mistura genômica que compreende DNA de transgene/genoma de J-101 e J-163.

[0046] Uma sonda é um ácido nucléico isolado ao qual é fixado um rótulo detectável convencional ou uma molécula repórter, por exemplo, um isótopo radiativo, ligante, agente quimioluminescente ou uma enzima. Tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico alvo, no evento da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de um evento de alfafa, se de uma planta de alfafa ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas, de acordo com a presente invenção, incluem não apenas os ácidos desoxirribonucléicos ou ribonucléicos, mas, também, as poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e que podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.

[0047] Os iniciadores são ácidos polinucléicos isolados que são anelados a um filamento complementar de DNA alvo através de hibri

19/37 dização de ácido nucléico para formar um elemento híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, depois, prolongado ao longo do filamento de DNA alvo por meio de uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Os pares de iniciadores da presente invenção referem-se ao seu uso para amplificação de uma sequência de ácido nucléico alvo, por exemplo, mediante reação em cadeia por polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácido nucléico.

[0048] As sondas e iniciadores são geralmente de extensão de 11 ou mais polinucleotídeos, preferencialmente, 18 ou mais polinucleotídeos, mais preferencialmente, 24 ou 30 ou mais polinucleotídeos. Tais sondas e iniciadores se hibridizam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização altamente severas. Preferencialmente, as sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção apresentam uma completa identidade de sequência com a sequência alvo, embora as sondas que são diferentes da sequência alvo e que mantêm a capacidade de hibridizar as sequências alvo sob condições de hibridização altamente severas possam ser projetadas por métodos convencionais.

[0049] Os métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, na publicação Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a. Edição, Volumes 1-3, Editado por Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (daqui em diante, Sambrook e outros, 1989); Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel e outros, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, N. York, 1992 (com atualizações periódicas) (daqui em diante, referido como Ausubel e outros, 1992); e Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Pres: San Diego, 1990. Pares de iniciadores-PCR (um conjunto de iniciadores) podem ser derivados de uma sequência conhecida, por

20/37 exemplo, mediante uso de programas de computador idealizado para esse fim, tal como um Iniciador (Versão 0,5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

[0050] Os iniciadores e sondas baseados no flanqueamento do DNA genômico e sequências de inserção aqui descritos podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências descritas pelos métodos convencionais, por exemplo, mediante nova clonagem e seqüenciamento de tais sequências.

[0051] As sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção se hibridizam sob condições severas a uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucléico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas ou fragmentos de ácido nucléico dos mesmos são capazes de especificamente se hibridizarem a outras moléculas de ácido nucléico sob determinadas circunstâncias. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucléico são ditas como sendo capazes de especificamente se hibridizarem entre si se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalela e forem de suficiente extensão para manter essa estrutura sob condições altamente severas. Uma molécula de ácido nucléico é dita como complemento de outra molécula de ácido nucléico se as mesmas exibirem uma completa complementaridade. Conforme aqui usado, as moléculas são ditas como exibindo uma completa complementaridade quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas como sendo minimamente complementares se as mesmas se hibridizarem entre si com suficiente estabilidade para permitir que permaneçam aneladas entre si sob condições convencionais de pelo menos baixa severidade. De modo similar, as moléculas são ditas como sendo comple

21/37 mentares se as mesmas puderem se hibridizar entre si com suficiente estabilidade para permitir que as mesmas possam permanecer aneladas entre si sob condições convencionais de alta severidade. As condições condicionais de severidade são descritas por Sambrook e outros, 1989 e por Haymes e outros, na publicação Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington DC (1985). Portanto, as saídas da completa complementaridade são permissíveis, à medida que tais saídas não impeçam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. A fim de que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda, é preciso apenas que seja suficientemente complementar em sequência, de modo a ser capaz de formar uma estrutura estável de filamento duplo na presença de um particular solvente e sob concentrações de sal empregadas.

[0052] Conforme aqui usado, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucléico que irá especificamente se hibridizar ao complemento da sequência de ácido nucléico que está sendo comparada sob altas condições de severidade. Condições apropriadas de severidade que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, aplicação por seis vezes de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a uma temperatura de cerca de 45°C, seguido de lavagem por duas vezes de SSC a 50°C, são conhecidas para aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas na publicação Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma condição de baixa severidade, de cerca de 2 vezes de SSC a 50°C para uma condição de alta severidade de cerca de 0,2 vezes de SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada da condição de baixa severidade à temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de alta severidade a uma

22/37 temperatura de cerca de 65°C. Ambos aspectos de temperatura e sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração do sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é modificada. Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridizar em uma ou mais moléculas de ácido nucléico estabelecidas na SEQ ID NOs:1-8, em complementos ou fragmentos das mesmas, sob condições moderadas de severidade, por exemplo, cerca de 2,0 vezes de SSC e cerca de 65°C. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridizar em uma ou mais moléculas de ácido nucléico estabelecidas na SEQ ID NOs:1-8, em complementos ou fragmentos das mesmas, sob condições de alta severidade. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula preferida marcadora de ácido nucléico da presente invenção compreende a sequência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, complementos ou fragmentos das mesmas. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula preferida marcadora de ácido nucléico da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% da identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, complementos ou fragmentos das mesmas. As moléculas de DNA molecular marcadoras que compreendem as SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, complementos ou fragmentos das mesmas, podem ser usadas como marcadoras em métodos de procriação de plantas para identificar a descendência de cruzamentos genéticos similares aos métodos descritos para análise de marcador de DNA de repetição de sequência simples na publicação DNA markers: protocols, applications and overviews', (1997), 173-185, Cregan e outros, Eds. Wiley-Liss MY; todos os quais aqui integralmente incorporados por meio dessa

23/37 referência. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por meio de qualquer número de métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, podendo ser incluídos, mas sem qualquer limitação, rótulos radiativos, rótulos baseados em anticorpos e rótulos quimioluminescentes.

[0053] Com relação à amplificação de uma sequência de ácido nucléico alvo (por exemplo, através de PCR) usando um particular par de iniciadores de amplificação, condições severas são condições que permitem ao par de iniciador apenas se hibridizar à sequência de ácido nucléico alvo, na qual um iniciador tendo a correspondente sequência do tipo selvagem (ou seu complemento) se ligaria e, preferencialmente, produziría um único produto de amplificação, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.

[0054] O termo específico para (uma sequência alvo) indica que uma sonda ou um iniciador se hibridiza sob condições de hibridização severas somente em uma sequência alvo em uma amostra que compreende a sequência alvo.

[0055] Conforme aqui usado, DNA amplificado ou amplicon refere-se ao produto da amplificação de ácido nucléico de uma sequência de ácido nucléico alvo que faz parte de um molde de ácido nucléico. Por exemplo, para determinar se a planta de alfafa resultante de um cruzamento sexual contém um evento transgênico J-101 ou J-163 ou ambos DNA genômicos, o DNA extraído de uma amostra de tecido de uma planta de alfafa pode ser submetido a um método de amplificação de ácido nucléico usando um par de iniciador que inclui um iniciador derivado da região genômica adjacente ao sítio de inserção do DNA de transgene heterólogo inserido e um segundo iniciador derivado do DNA de transgene heterólogo inserido para produzir um amplicon que serve de diagnóstico para a presença do DNA do evento. O amplicon é de uma extensão e apresenta uma sequência que também

24/37 serve de diagnóstico para o evento. O amplicon pode variar na extensão, desde a extensão combinada do par de iniciador mais o par de base do nucleotídeo ou de mais cerca de cinqüenta pares de base de nucleotídeos, ou de mais cerca de duzentos e cinqüenta pares de base de nucleotídeos ou de mais cerca de trezentos e cinqüenta ou mais pares de base de nucleotídeos. Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado do flanqueamento da sequência genômica em ambos os lados do DNA inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui a inteira inserção de sequência de nucleotídeo. Um elemento de par de iniciador derivado da sequência genômica da planta pode ser localizado a uma distância da sequência de DNA inserida, essa distância podendo variar de um par de base de nucleotídeo até cerca de vinte mil pares de base de nucleotídeos. O uso do termo amplicon exclui especificamente os dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA.

[0056] A amplificação do ácido nucléico pode ser obtida por meio de quaisquer dos diversos métodos de reação de amplificação de ácido nucléico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia por polimerase (PCR).

[0057] Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e são descritos, entre outras coisas, nas Patentes U.S. N°s 4.683.195 e 4.683.202 e na publicação PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Ed. Innis e outros, Academic Pres: San Diego, 1990. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA bacteriófago (Cheng e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:5695-5699, 1994). Esses métodos, assim como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência da inserção de DNA heterólogo ou sequência de flanqueamento dos eventos de alfafa J-101 e J-163 pode ser examina

25/37 da (e corrigida, se necessário), mediante amplificação de tais sequências do genoma do evento usando iniciadores derivados de sequências aqui fornecidas e extraídas do DNA genômico de amostras representativas depositadas na ATCC, conforme os protocolos PTA-4814 e PTA-4815, seguido de métodos de seqüenciamento de DNA padrão aplicados ao amplicon de PCR ou ao DNA de transgene/genômico clonado isolado.

[0058] O amplicon produzido por esses métodos pode ser detectado através de uma pluralidade de técnicas. Um desses métodos é a Análise de Bit Genética (Nikiforov e outros, Nucleic Acid Res., 22:4167-4175, onde um oligonucleotídeo de DNA é projetado, o qual se sobrepõe à sequência de DNA genômica de flanqueamento e à sequência de transgene de DNA inserido. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microcavidades. Após o PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um iniciador na sequência genômica adjacente de flanqueamento) um produto de PCR de filamento único pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado, servindo como um molde para uma reação de extensão de base única usando uma polimerase de DNA e ddNTPs rotulados específicos para a base seguinte esperada. A leitura pode ser fluorescente ou baseada no procedimento ELISA. Um sinal indica a presença da sequência genômica de inserção/flanqueamento devido ao sucesso da amplificação, hibridização e extensão de base única.

[0059] Outro método é a técnica de Pirosseqüenciamento conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech., 00:18-24, 2000). Nesse método, um oligonucleotídeo é designado de modo a sobrepor o DNA genômico adjacente e a junção da inserção de DNA. O oligonucleotídeo é hibridizado ao produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um iniciador na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma

26/37 polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5'fosfossulfato e luciferina. As DNTPs são adicionadas individualmente e a incorporação resulta em um sinal breve, o qual é medido. Um sinal breve indica a presença da sequência de inserção/flanqueamento do transgene devido ao sucesso da amplificação, hibridização e extensão de base única e múltipla.

[0060] A polarização por fluorescência, conforme descrito por Chen e outros (Genome Res., 9:492-498, 1999) é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando esse método, é projetado um oligonucleotídeo que se sobrepõe à junção de flanqueamento genômico e de DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado a um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um iniciador na sequência de DNA genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma polimerase de DNA e de ddNTP rotulado de fluorescente. A extensão de base única resulta na incorporação da ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência genômica de inserção/flanqueamento de transgene devido ao sucesso da amplificação, hibridização e extensão de base única.

[0061] O método de Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), é descrito como um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA, sendo totalmente entendido mediante as instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada de modo a se sobrepor à junção de flanqueamento genômico e ao DNA de inserção. A sonda de FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e o outro na sequência genômica de flanqueamento) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e de dNTPs. A hibridização da sonda de FRET resulta na divagem e liberação da

27/37 porção fluorescente distante da porção de resfriamento na sonda de

FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento grnômico/inserção de transgene devido ao sucesso da amplificação e hibridização.

[0062] Sinais de alarme moleculares têm sido descritos para o uso em detecção de sequência, conforme descrito em Tyangi e outros (Nature Biotech., 14:303-308, 1996). Sumariamente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é designada de modo a se sobrepor ao flanqueamento genômico e junção de DNA de inserção. A estrutura única da sonda de FRET resulta em que a mesma contenha uma estrutura secundária que mantém as porções de fluorescência e de resfriamento em estreita proximidade. A sonda de FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um iniciador na sequência genômica de flanqueamento) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e de dNTPs. Após o sucesso obtido na amplificação de PCR e da hibridização da sonda de FRET à sequência alvo, resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das poções fluorescentes e de resfriamento, tendo ainda como resultado um sinal fluorescente. Este sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento grnômico/inserção de transgene devido ao sucesso da amplificação e hibridização.

[0063] Os kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições aqui descritas e os métodos bem-conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são de utilidade para a identificação do DNA do evento de alfafa em uma amostra e podem ser aplicados aos métodos de procriação de plantas de alfafa contendo DNA. Os kits podem conter os iniciadores ou sondas de DNA que são homólogos ou complementares à SEQ ID NOs:1-8 ou iniciadores ou sondas homólogas ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgênicos do DNA, essas sequências de DNA podendo

28/37 ser usadas nas reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. As sequências dos elementos genéticos transgênicos contidas no genoma da alfafa (Figura 1) consiste em um fragmento da região da borda direita do Agrobacterium tumefaciens, o promotor mosaico Figwort (Patente U.S. N° 6.018.100, aqui integralmente incorporada por meio dessa referência), onde o promotor foi duplicado (aqui referido como P-eFMV ou p-FMV35Sen), sendo operacional mente conectado a um líder Hsp70 de Petunia hybrida (aqui referido como HSP70 ou L-Ph.Hsp70, Patente U.S. N° 5.659.122, aqui integralmente incorporada por meio dessa referência) e a uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplast EPSPS de Arabidopsis (aqui referido como CTP2 ou TS-AtEPSPS CTP2, Patente U.S. N° 5.633.435, aqui integralmente incorporada por meio dessa referência), operacional mente conectado a um EPSPS resistente a glifosato (aqui referido como CP4 EPSPS ou aroA:CP4, isolado da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens, Patente U.S. N° 5.633.435), operacional mente conectado à região de terminação 3' de ervilha ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (aqui referido como E9 3' ou TPs.RbcS:E9, Coruzzi e outros, EMBO J., 3:1671-1679, 1984) e à região da borda esquerda (LB) do Agrobacterium tumefaciens. As moléculas de DNA úteis como iniciadores nos métodos de amplificação de DNA podem ser derivadas das sequências dos elementos genéticos da inserção de transgene contida no evento de alfafa. Essas moléculas de iniciador podem ser usadas como uma parte de um conjunto de iniciador que também inclui uma molécula de iniciador de DNA derivada do genoma do flanqueamento do evento da inserção do transgene. [0064] Os eventos J-101 e J-163 de alfafa foram produzidos mediante transformação da linha R2336 de Alfafa através da modificação de um método mediado pelo Agrobacterium (Walker e outros, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1:109-121, 1981). Sumariamente, pe

29/37 daços de folhas de alfafa esterilizadas (2-3 mm) são misturados com uma suspensão de Agrobacterium (contendo pMON20998, Figura 7), com 0,05% de Silwet L-77 (Setre Chemical Co., Memphis, TN). Os pedaços são manchados sobre um papel de filtro estéril e depois colocados sobre o papel de filtro esterilizado, descansando sobre uma difusão de células de alfafa em suspensão, com posterior cultivo por 3 dias. Depois desse cultivo, os explantes são transferidos para o meio de SHDN contendo 500 mg/l de ticarcilin (Gujisawa Chemicals, MN); depois de mais 3 dias, os explantes são novamente transferidos para o meio de SHDN contendo glifosato 5 mM, tiarcilin 500 mg/l, sendo então os explantes transferidos para um meio recém-preparado a cada 23 semanas, durante 8-9 semanas. Os brotos são enraizados e transferidos para o solo.

[0065] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar exemplos de certas modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado por aqueles versados na técnica que os procedimentos descritos nos exemplos seguintes, representam abordagens que os inventores descobriram e que apresentaram um bom funcionamento na prática da invenção, sendo, dessa forma, considerados como exemplos constituintes de modalidades preferidas para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica, à luz da presente descrição, devem observar que diversas mudanças poderão ser feitas em modalidades específicas que são descritas, obtendo-se ainda um resultado próximo ou similar, sem que haja afastamento do espírito e escopo da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1 [0066] O DNA dos eventos J-101 e J-163 de alfafa transgênica foi extraído de sementes de alfafa. O DNA foi isolado do tecido da semente usando o Kit Miniprep Plant Dneasy da Quiagen, de acordo com as

30/37 instruções do fabricante (Quiagen Corp. Valencia, CA). O PCR das sequências de DNA genômico flanqueando o terminal 5' da inserção de T-DNA nos eventos J-101 e J-163 foi executado usando um iniciador designado para as sequências do DNA genômico, flanqueando o terminal 5' da inserção do transgene de cada evento (iniciadores de DNA A (SEQ ID NO: 9) e E (SEQ ID NO: 10), Figura 1), emparelhados com um segundo iniciador (iniciador do DNA Z (SEQ ID NO: 11), Figura 1), localizado na extremidade 5' da inserção no promotor FMV35S duplicado (P-FMV35Sen, duplicação de tandem do promotor a partir do vírus mosaico de Figwort, Patente U.S. N° 6.018.100). A análise de PCR das sequências de DNA genômico flanqueando a extremidade 3' da inserção T-DNA nos eventos J-101 e J-163 foi executada usando um iniciador designado para as sequências de DNA genômico flanqueando a extremidade 3' da inserção de cada evento (iniciadores de DNA B (SEQ ID NO: 12) e F (SEQ ID NO: 13), Figura 1), emparelhados com um iniciador de DNA Y (SEQ ID NO: 14, Figura 1), localizado na sequência de terminação de transcrição E9 3', no terminal 3' da inserção. As sequências de DNA dessas moléculas de iniciador são mostradas na Figura 6. As análises de PCR foram executadas usando aproximadamente 50 nanogramas (ng) do DNA genômico dos eventos J-101 e J-163 e aproximadamente 50 ng do molde de DNA genômico do cultivo R2336 de alfafa não-transgênica como um controle negativo. Cada reação de PCR continha individualmente 10 vezes 5 μΙ do tampão de REDAccuTaq® LA DNA Polimerase Mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 200 μΜ de cada dNTP (Sigma-Aldrich), 0,4 μΜ de cada iniciador e 2,5 unidades de Jump-Start® REDTaq® DNA Polimerase (Sigma-Aldrich) em um volume de reação total de 50 μΙ. As reações de PCR foram executadas sob as seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo à temperatura de 94°C durante 3 minutos; 32 ou 35 ciclos à temperatura de 94°C durante 30 s, 58°C durante 30 s, 72°C durante 30 s ou

31/37 minuto; 1 ciclo à temperatura de 72°C durante 10 minutos.

[0067] Os pares de iniciadores do evento de DNA são usados para produzir um diagnóstico de amplicon para o DNA genômico de J-101 ou J-163. Esses pares de iniciadores de eventos incluem, mas sem que haja qualquer limitação, os iniciadores A e Z e T e B para o evento J-101 e os iniciadores E e Z e Y e F para o evento J-163, que são usados no método de amplificação de DNA descrito. Além desses pares de iniciadores, qualquer par de iniciador derivado da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou os complementos das mesmas, que, quando usado em uma reação de amplificação de DNA produz um diagnóstico de amplicon para, respectivamente, os eventos J-101 e J-163 de alfafa, constitui um aspecto da presente invenção. As condições de amplificação de DNA ilustradas nas Tabelas 1 e 2 podem ser usadas para produzir um amplicon de diagnóstico de J-101 ou J-163, usando os apropriados pares de iniciador de evento. Um amplicon de diagnóstico compreende a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2, para o evento J-101 e a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 para o evento J-163. Qualquer modificação desses métodos usados para produzir um diagnóstico de amplicon para os eventos J-101 ou J-163 está dentro do escopo da técnica comum. Uma planta ou semente de alfafa, cujo genoma produz um diagnóstico de amplicon para os eventos J-101 ou J-163 de alfafa, quando testado em um método de amplificação de DNA constitui um aspecto da presente invenção.

[0068] O amplicon produzido pelo uso de pelo menos uma sequência de iniciador derivada da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 para o evento J-101 ou pelo menos uma sequência de iniciador derivada da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 para o evento J-163, que, quando usada em um método de PCR, produz um amplicon de diagnóstico compreendendo a SEQ ID NOs:1 ou 2, ou 5 ou 6, constitui um aspecto

32/37 da presente invenção. A produção dos amplicons de J-101 ou J-163 pode ser executada usando um Robociclador da Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 ou um termociclador da Eppendorf Mastercycler Gradient, conforme mostrado na Tabela 2 ou através dos métodos e dispositivos conhecidos para aqueles versados na técnica.

33/37 ο Ιφ ο Ιφ ο Ιφ ο Ιφ φ φ φ φ φ ιφ φ φ Ό ο Η—»

C φ φ Ό

LO

Φ C Φ σ φ c φ φ Ό

Ε <ο

C φ ο Ιφ φΊ

Comentários \|		1x a concentração final do tampão, concentração final 1,5 mM de MgCI₂	Concentração final de 200 μΜ de cada dNTP	Concentração final de 0,1 μΜ	Concentração final de 0,1 μΜ	50 ng/reação \|	1 unidade/reação
Quantidade	\| Adicionar ao volume final de 20 μΙ \|	2,0 μΙ	o	0,2 μΙ	0,2 μΙ	0,1 μΙ	1,0 μΙ (recomendado para mudar as pipetas antes da etapa seguinte	• 10-200 ng do DNA genômico • 200 ng do DNA genômico • 50 ng DNA genômico de alfafa não-transgênica • nenhum DNA padrão (solução na qual o DNA foi ressuspenso) • 50 ng de DNA genômico de alfafa J-101
Reagente	\| Agua isenta de nuclease \|	10x tampão de reação (com MgCI₂)	Solução de dATP, dCTP, dGTP e dTTP 10 mM	Iniciador do evento A (SEQ ID NO: 9, novamente suspenso em 1x o tampão de TE ou em água isenta de nuclease, em uma con- centração de 10 μΜ)	Iniciador do evento Z (SEQ ID NO: 11, novamente suspenso em 1x o tampão de TE ou em água isenta de nuclease, em uma concentração de 10 μΜ)	RNase, isenta de Dnase (500 μρ/ηηΙ)	Polimerase de DNA REDTaq (1 unid/μΙ)	DNA extraído (molde): • amostras a serem analisadas: * folhas individuais; * folhas agrupadas (máximo de 10 folhas/ grupo) • controle negativo • controle negativo • controle positivo
\| Etapa		CN	CO			<o		CO

34/37

Suavemente misturado, se necessário (não aquecer a parte superior do termociclador) adicionar 1-2 gotas de óleo mineral na parte superior de cada reação. Prosseguir com o procedimento de PCR em um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 ou um termociclador da Eppendorf Mastercycler Gradient, usando os parâmetros seguintes de ciclização (Tabela 2). O equipamento MJ Engine ou o termociclador da Eppendorf Mastercycler Gradient devem ser processados no modo calculado. Colocar o termociclador Perkin Elmer 9700 com a velocidade ascendente ajustada no máximo.

Tabela 2 - Condições do Termociclador

Ciclo N°	Ajustes: Stratagene Robocycler
1	94°C - 3 minutos
34	94°C -1 minuto 64°C -1 minuto 72°C -1 minuto e 30 segundos
1	72°C -10 minutos

Ciclo N°	Ajustes: MJ Engine ou Perkin Elmer 9700
1	94°C - 3 minutos
34	94°C - 30 segundos 64°C - 30 segundos 72°C -1 minuto
1	72°C -10 minutos

Ciclo N°	Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient
1	94°C - 3 minutos
34	94°C -15 segundos 64°C -15 segundos 72°C -1 minuto
1	72°C -10 minutos

Exemplo 2

O seqüenciamento do DNA para os produtos de PCR é proporcionado ao DNA que pode ser usado para projetar moléculas adicionais de DNA como iniciadores e sondas para a identificação dos eventos J-101 e J-163 de alfafa. Os produtos de PCR dos tamanhos

35/37 esperados representando as sequências de transgene/genômica 5' e 3' foram isolados através de separação dos produtos de PCR em um gel de agarose a 2% por meio de eletroforese. Os produtos de PCR foram isolados incluindo as regiões 5' e 3' do DNA que abrangem a junção de inserção entre a inserção do transgene no genoma da alfafa. Os produtos de PCR 5' e 3' para os eventos J-101 e J-163 foram purificados por eletroforese de gel de agarose, seguido de isolamento da matriz de agarose usando o QIAquick Gel Extraction Kit (Catálogo # 28704, Quiagen Inc., Valencia, CA). Os produtos de PCR purificados foram depois seqüenciados mediante análise de sequência de DNA (ABI Prism® 377, PE Biosystems, Foster City, CA e pelo software de análise de sequência DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, Wl).

A sequência de DNA foi determinada para um segmento de pares de base de 678 nucleotídeos (Figura 2), representando a sequência 5' transgene/genômica do evento J-101 de alfafa (Figura 1) e identificado na SEQ ID NO: 3. Os iniciadores de DNA são indicados na Figura 1, assim como, as SEQ ID NOs. A sequência de DNA foi determinada para um segmento de pares de base de 581 nucleotídeos (Figura 3), representando a sequência 3' transgene/genômica de evento J-101 de alfafa (Figura 1) e identificado na SEQ ID NO: 4. Os dados da sequência mostrados na Figura 2 consistem no amplicon 5' abrangendo 393 bases de DNA genômico de alfafa (sublinhado) e 285 bases de inserção de transgene contendo 2 pares de base da região da borda direita, 83 bases de poliligante e 200 bases do promotor PFMV35Sen. Os dados da sequência mostrados na Figura 3, consistem no amplicon 3' abrangendo 140 bases da sequência de sinal de poliadenilação E9 3' e 177 bases de poliligante da inserção de transgene, assim como 264 bases representando a sequência de DNA genômico de alfafa (sublinhado) que flanqueia o terminal 3' da inserção de transgene no evento J-101.

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A sequência de DNA foi determinada para um segmento de pares de base de 481 nucleotídeos (Figura 4), representando a sequência 5' transgene/genômica do evento J-163 de alfafa e identificado na SEQ ID NO: 7. A sequência de DNA foi determinada para um segmento de pares de base de 550 nucleotídeos (Figura 5), representando a sequência 3' transgene/genômica de evento J-101 de alfafa e identificado na SEQ ID NO: 8. Os dados da sequência mostrados na Figura 4 consistem no amplicon 5' abrangendo 224 bases da sequência de flanqueamento de DNA genômico de alfafa (sublinhado) e 257 bases de inserção de transgene contendo 57 bases de poliligante e 200 bases do promotor P-FMV35Sen. Os dados da sequência mostrados na Figura 5, consistem no amplicon 3' abrangendo 140 bases da sequência de terminação de transcrição E9 3', 218 bases da sequência de constructo de transgene de DNA e 192 bases da sequência de DNA genômico de alfafa (sublinhado) que flanqueia a extremidade 3' da inserção de transgene no evento J-163.

As sequências de junção são constituídas de moléculas de polinucleotídeo relativamente curtas, que são novas sequências de DNA e servem de diagnóstico para os eventos J-101 e J-163 de alfafa e descendência dos mesmos. As sequências de junção nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 representam 9 polinucleotídeos em cada lado de um sítio de inserção do fragmento de sequência de transgene e DNA genômico J-101 de alfafa, e sequências de unção maiores ou mais curtas podem ser selecionadas das SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. As moléculas de junção (SEQ ID NOs.:1, 2, 5 e 6) são de utilidade como sondas de DNA ou como moléculas de iniciador de DNA em métodos de detecção de DNA. Os amplicons de DNA compreendendo as SEQ ID NOs.:1, 2, 5 ou 6 de moléculas de junção constituem aspectos da presente invenção, assim como as plantas de alfafa e partes das mesmas, a partir das quais os amplicons de DNA são produzi

37/37 dos por meio de métodos de amplificação de DNA que contêm DNA genômico de alfafa.

Um depósito da Monsanto Technology LLC, referente a semente de eventos J-101 e J-163 de alfafa descrita acima e nas reivindicações anexas foi feito, sob as condições do Tratado de Budapest, na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va, 20110. O número de acesso na ATCC para o evento J-101 é PTA-4814 e para o evento J-163 é PTA-4815. O depósito será mantido no organismo depositário por um período de 30 anos ou de 5 anos após a última solicitação, ou durante a efetiva vida da patente, aquele que for de maior período, sendo substituído, evento necessário, durante tal período.

Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve se tornar evidente para aqueles versados na técnica, que a invenção poderá ser modificada na disposição e em outros detalhes sem que seja afastado do escopo da tais princípios. Os presentes inventores reivindicam todas as modificações que estejam dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas.

Todas as publicações e documentos de patentes publicados citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por meio dessas referências, da mesma maneira que cada publicação ou pedido de patente individual foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por tais referências.

Claims

1. Método de produção de uma planta de alfafa compreendendo um evento compreendendo SEQ ID NO: 7 e 8 que fornece tolerância a aplicação de herbicida glifosato, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) cruzar sexualmente uma primeira planta de alfafa tolerante a glifosato compreendendo uma molécula de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 8, e seus complementos, com uma segunda planta de origem destituída de tolerância ao herbicida de glifosato, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de plantas descendentes;

(b) selecionar uma primeira planta descendente que é tolerante à aplicação do glifosato;

(c) autofecundar a dita primeira planta descendente, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de segundas plantas descendentes; e (d) selecionar das ditas segundas plantas descendentes uma planta tolerante ao glifosato compreendendo a SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em que uma amostra representativa de semente compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 8, e seus complementos completos, foi depositada no ATCC com o número de acesso PTA-4815.

2. Método de produção de feno de alfafa essencialmente isento de ervas daninhas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

a) plantio de um campo usando semente de uma planta de alfafa tolerante ao glifosato compreendendo uma molécula de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5 a 8, e seus complementos completos, em que uma amostra representativa de semente compreendendo SEQ ID NOs: 5 a 8, e seus complemen-

Petição 870190044759, de 13/05/2019, pág. 11/22

2/2 tos completos, foi depositada no ATCC com o número de acesso PTA4815;

b) aplicação ao campo resultante de plantas de alfafa de uma ou mais doses de suficiente quantidade de glifosato para matar as ervas daninhas, que seja tolerado pelas plantas de alfafa; e

c) colheita de uma ou mais safras de feno de alfafa do dito campo.