MXPA99008486A - Receptor 5 que contiene el dominio de muerte - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de un tumor que comprende detectar la presencia o cantidad de:a) una molécula deácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos 70%de identidad de secuencia con un péptido que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO.2, b) una molécula deácido nucleico que es complementaria a la secuencia deácido nucleico e (a);c) una molécula deácido nucleico que comprende al menos 15 bases secuenciales de la secuencia deácido nucleico de (a) o (b);y d) una molécula deácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas con la molécula de la secuencia deácido nucleico de (a) y que correlaciona dicha cantidad o presencia con la presencia de un tumor.

Description

RECEPTOR 5 QUE CONTIENE EL DOMINIO DE MUERTE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un nuevo miembro de la familia de los receptores del factor de necrosis del tumor. Más específicamente, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican al receptor 5 que contiene el dominio de muerte humano, o simplemente "DR5". También se proporcionan los polipéptidos de DR5, como son los vectores, células huésped, y métodos recombinantes para producir los mismos. La invención además se refiere a métodos de selección para identificar agonistas y antagonistas de actividad DR5.

TÉCNICA RELACIONADA Numerosas acciones biológicas, por ejemplo, la respuesta a ciertos estímulos y procesos biológicos naturales, se controlan mediante Ref.: 031331 factores tales como las citocinas. Muchas citocinas actúan a través de receptores mediante el acoplamiento del receptor y produciendo una respuesta intra-celular . Por ejemplo, los factores de necrosis del tumor (TNF) alfa y beta son citocinas, las cuales actúan a través de receptores TNF para regular numerosos procesos biológicos, que incluyen la protección contra infección y la inducción del choque y padecimiento inflamatorio. Las moléculas de TNF pertenecen a la superfamilia "TNF-ligando", y actúan juntas con sus receptores o contraligandos , de la superfamilia del "TNF-receptor". Hasta ahora, 9 miembros de la superfamilia de ligandos TNF se han identificado y diez miembros de la superfamilia del TNF-receptor se han caracterizado. Entre los ligandos, se incluyen el TNF-a, la liñfotoxina-a (LT-a, también conocida como TNF-ß), " la LT-ß (encontrada en complejo de heterotrimero LT-a2-ß), FasL, DC40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L y el factor del crecimiento nervioso (NGF) . La superfamilia de los receptores TNF incluye el receptor p55TNF, el receptor p75TNF, la proteina relacionada al receptor TNF, el antigeno FAS o APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40, el receptor NGF y p75 de baja afinidad (Meager, A., Bi ol ogi cal s , 22:291-295 (1994)) . Muchos miembros de la superfamilia del ligando TNF se expresan mediante células T activadas, que implica que son necesarias para las interacciones de las células T con otros tipos de células las cuales son la base de las funciones y la ontogenia de las células. (Meager, A., s upra ) . Considerable atención han ganado las funciones esenciales de varios miembros de la familia del receptor TNF a partir de la identificación y creación de mutantes que han abolido la expresión de estas proteínas. Por ejemplo, las mutaciones que ocurren de manera natural en el antigeno FAS y su ligando, provoca el padecimiento limfoprol iferativo ( atanabe-Fu unaga, R., et al . , Nature 356:314 (1992)), quizás reflejando una falla de la muerte programada de la célula. Las mutaciones del ligando CD40 provocan un estado de inmunodeficiencia ligado a X caracterizado por altos niveles de inmunoglobulina M y bajos niveles de inmonuglobulina G en el plasma, indicando una falla de la activación de las células B dependiente de las células T (Alien, R.C. et al . , Sci ence 259:990 (1993) ) . Las mutaciones objetivo del receptor del factor del crecimiento de los nervios de baja afinidad provoca un padecimiento caracterizado por la falla de la innovación sensorial de las estructuras periféricas (Lee, K.F. et al . , Cell 69:737 (1992) ) . Las TNF y LT-a son capaces de enlazarse a dos receptores TNF (los receptores TNF de 55 y 75 kd) . Un gran número de efectos biológicos generados por TNF y LT-a, actúan a través de sus receptores, que incluyen la necrosis por hemorragia de tumores transplantados, citotoxidad, un papel en el choque endotóxico, en la inflamación, en la inmunorregulación, proliferación y respuestas antivirales, asi como en la protección contra los efectos nocivos de la radiación ionizante. Las TNF y LT-a están implicadas en la patogénesis de un amplio rango de padecimientos, que incluyen, el choque endotóxico, la malaria cerebral, los tumores, el padecimiento autoinmune, el SIDA y el rechazo de injerto-huésped (Beutler, B. y Von Huffel, C, Sci ence 2 64 : 661 - 33 8 (1994)) . Las mutaciones en el receptor p55 provocan una susceptibilidad incrementada a la infección microbiana . Además, un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos cerca del C-terminal de TNFR1 (p55) y Fas se reportó como "el dominio de muerte", la cual es responsable de traducir las señales para la muerte programada de las células (Tartaglia et al. , Cell 78 : 845 (1993) ) . La apoptosis, o la muerte programada de las células, es un proceso fisiológico esencial para el desarrollo normal y la homeostasis de los organismos multicelulares (H. Steller, Science 257:1445-1449 (1995)) . Los desarreglos de la apoptosis contribuye a la patogénesis de numerosos padecimientos humanos que incluyen el cáncer, los padecimientos neurodegenerativos, y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (C.B. Thompson, Science 267:1456-1462 (1995) ) .

Recientemente, se ha enfocado mucha atención a la transducción de la señal y la función biológica de los dos receptores de muerte de las superficie de las células, Fas/APO-1 y TNFR-1 (J.L. Cleveland et al. , Cell 81:479-482 (1995); A. Fraser, et al. , Cell 85:781-784 (1996); S. Nagata et al. , Science 267:1449-56 (1995)) . Ambos son miembros de la familia de los receptores TNF que también incluyen el TNFR-2, el NGFR de baja afinidad, CD40 y CD30, entre otros (C.A. Smith et al. , Science 248:1019-23 (1990); M. Tewari et al. , en Modular Text in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Cari. ED. (Chapman and Hall, London, 1995) . Mientras que los miembros de la familia están definidos por la presencia de repeticiones ricas en cisteina en sus dominios extracelulares, los Fas/APO-1 y TNFR-1 también comparten una región de homología intracelular, designada apropiadamente como "el dominio de muerte" el cual está relacionado de manera distante, al gen suicida de Drosophila reaper (P. Golstein, et al. , Cell 81:185-186 (1995); K. White et al. , Science 264:677-83 (1994)) . Este dominio de muerte compartido sugiere que ambos receptores interactúan con un conjunto relacionado de moléculas de transducción de la señal que, hasta recientemente, permanecían no identificadas. La activación del Fas/APO-1 conjunta la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte FADD/MORT1 (A.M. Chinnaiyan et al. , Cell 81: 505-12 (1995); M. P. Boldin et al. , J. Biol Chem 270:1195-8 (1995); F.C. Kischkel et al., EMBO 14:5519-5588 (1995)), la cual a su vez se une y presumiblemente activa el FLICE/MACH1, un miembro de la familia ICE/CED-3 de las proteasas pro-apópticas (M. Muizo et al. , Cell 85:811-821 (1996); M.P. Boldin et al, Cell 85:803-815 (1996)) .

Mientras que el papel central del Fas/APO-1 es activar la muerte celular, el TNFR-1 puede señalar un arreglo de muchas actividades biológicas diversas de las cuales son el resultado de su capacidad para activar el NF-kB (L.A. Tartaglia et al., Immunol Today 13:151-3 (1992)) . De acuerdo a esto, el TNFR-1 recluta a la molécula adaptadora multivalente TRADD, la cual como la FADD, también contiene un dominio de muerte (H. Hsu et al. , Cell 84:299-308 (1996)) . A través de sus asociaciones con un número de moléculas de señalización que incluyen FADD, TRAF2 y RIP, el TRADD puede señalar tanto la apoptosis como la activación de NF-kB (H. Hsu et al. , Cell 84:299-308 (1996); H. Hsu, et al. , Immunity 4:387-396 (1996)) . Recientemente, se ha descubierto un nuevo ligando TNF que induce la apoptosis. S.R. Wiley et al. (Immunity 3: 673-682 (1995)) nombrada la molécula "ligando que induce la apoptosis relacionada con TNF" o simplemente "TRAIL." La molécula también fue nombrada "ligando Apo-2" o "Apo-2L". R.M. Pitt et al. , J. Biol. Chem. 271:12687-12690 (1996) . Esta molécula también fue descrita en la Solicitud provisional Norteamericana copendiente No. 60/013,405. Por conveniencia, la molécula será referida aqui como TRAIL. A diferencia del ligando FAS, cuyos transcriptos parecen ser más grandemente restringidos a las células T estimuladas, los niveles significativos de TRAIL son detectados en muchos tejidos humanos (por ejemplo, el vaso, el pulmón, la próstata, el timo, el ovario, el intestino delgado, el colón, los limfocitos de la sangre periférica, la placenta y el riñon) , y está transcrito constitutivamente por algunas lineas celulares . Se ha mostrado que el TRAIL actúa independientemente del ligando Fas (Wiley et al . , s upra ) . También se ha mostrado que el TRAIL activa la apoptosis rápidamente, dentro de un marco de tiempo que es similar a la señalización de tiempo a la señalización de muerte por Fas/Apo-IL, pero mucho más rápido que la apoptosis inducida por TNF. S.A. Marsters et al . , Curren t Bi ol ogy 6:750-752 (1996) . La incapacidad del TRAIL para unirse al TNFR-1, Fas, o al DR3 identificado recientemente, sugiere que el TRAIL puede interactuar con un receptor o receptores únicos.

Muchos receptores únicos para el TRAIL ya se han identificado. En la solicitud de Patente provisional Norteamericana copendiente No. 60/035,772, el DR4, un nuevo receptor que contiene el dominio de muerte para el TRAIL, se describió. Ver, Pan et al . , Sci ence 276,111-113 (Abril 1997) . El receptor TR5, la materia de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana copendiente No .60/ 035, 496, ha ahora mostrado que se enlaza al TRAIL. En la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana copendiente No. 60/xxxxx, se predijo que el receptor TRIO también se enlazarla al TRAIL, debido a la homología de secuencias con DR4. Los efectos de los ligandos de la familia TNF son variados y tienen una influencia sobre numerosas funciones, tanto normales y anormales, en los procesos biológicos del sistema de los mamíferos. Hay una clara necesidad, por lo tanto, para la identificación y caracterización de tales receptores y ligandos que influyen en la actividad biológica, tanto en los estados normales como en los estados de padecimientos. En particular, hay la necesidad de aislar y caracterizar receptores nuevos adicionales que se enlacen al TRAIL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de amino ácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO:2) o la secuencia de amino ácido codificada por el clon de ADNc depositado como ATCC Depósito No. 97920 del 7 de Marzo de 1997. La presente invención también proporciona vectores recombinantes, los cuales incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención, y a células huésped que contienen los vectores recombinantes, asi como a métodos para fabricar tales vectores y células huésped y para usarlos en la producción de polipéptidos de DR5 o péptidos mediante técnicas recombinantes. La invención, además, proporciona un polipéptido DR5 aislado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido descrito ahi. La presente invención también proporciona ensayos -de diagnóstico tales como ensayos cuantitativos y de diagnóstico para detectar niveles de la proteina DR5. Asi, por ejemplo, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobre expresión de DR5, o la forma soluble del mismo, comparado a las muestras de tejidos de control normales se puede usar para detectar la presencia de tumores. Los ligandos de la familia del Factor de Necrosis del tumor (TNF) son conocidos y se sabe que están entre las citocinas pleiotrópicas , que inducen un gran número de respuestas celulares, que incluyen la citotoxicidad, la actividad anti-viral, las actividades inmunorreguladoras , y la regulación transcripcional de varios genes. La respuesta celular a los ligandos de la familia TNF incluyen no solamente respuestas fisiológicas normales, sino también padecimientos asociados con una apoptosis incrementada o la inhibición de la apoptosis. La apoptosis -la muerte programada de la célula- es un mecanismo fisiológico implicado en la eliminación de los limfocitos T periféricos del sistema inmune, y su desregulación puede llevar a un número de diferentes procesos patogénicos. Los padecimientos asociados con un incremento en la sobrevivencia de las células o a la inhibición de la apoptosis, incluye cánceres, padecimientos autoinmunes, infecciones virales, inflamación, padecimiento de injerto contra huésped, rechazo agudo del injerto, y rechazo crónico del injerto. Los padecimientos asociados con la apoptosis incrementada incluyen SIDA, padecimientos neurodegenerativos, síndromes mielodisplásticos , daño por isquemia, padecimiento del hígado inducido por toxinas, choque séptico, caquexia y anorexia. Asi, la invención además proporciona un método para mejorar la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que implica la administración a una célula la cual expresa el polipéptido DR5 de una cantidad efectiva de un agonista capaz de incrementar la señalización mediada por DR5. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 se incrementa para tratar un padecimiento en donde se muestra la apoptosis disminuida . En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para inhibir la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, la cual implica la administración a una célula que expresa el polipéptido DR5, una cantidad efectiva de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada por DR5. Preferiblemente, la señalización mediada por DR5 se disminuye para tratar un padecimiento en donde se muestre la apoptosis incrementada. Si cualquier candidato "agonista" o "antagonista" de la presente invención puede mejorar o inhibir la apoptosis esto se puede determinar utilizando los ensayos de respuestas celulares ligando/receptor de la familia TNF conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en más detalle abajo. Asi, en un aspecto adicional, se proporciona un método de selección para determinar si un candidato agonista o antagonista es capaz de mejorar o inhibir la respuesta celular a un ligando de la Familia TNF. El método involucra poner en contacto las células que expresan el polipéptido DR5 con un compuesto candidato y un ligando de la familia TNF, ensayar una respuesta celular y comparar la respuesta celular a una respuesta estándar, ensayando el estándar cuando se pone en contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, por lo que una respuesta celular incrementada sobre el estándar indica que el compuesto candidato es un agonista de la via de señalización del ligando/receptor y un decremento en la respuesta celular comparado con el estándar indica que el compuesto candidato es un antagonista de la via de señalización del ligando/receptor. Mediante la invención, una célula que expresa el polipéptido DR5 se puede poner en contacto con ya sea un ligando de la familia TNF administrado endógena o exógenamente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el nucleotido (SEC ID N0:1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:2) de DR5. Se predijo que los aminoácidos 1-51 (subrayados) constituyen el péptido de la señal (los residuos de aminoácidos de aproximadamente 51 a aproximadamente 1 en la SEC ID NO : 2 ) ; los aminoácidos 52-184 constituyen el dominio extracelular (residuos de amino ácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 133 en la SEC ID NO:2); los aminoácidos 185-208 (subrayados) constituyen el domino de la transmembrana (los residuos de amino ácidos desde aproximadamente 134 hasta aproximadamente 157 en la SEC ID NO : 2 ) ; y los aminoácidos 209-411 constituyen el dominio intracelular (los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 158 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ) , de los cuales los aminoácidos 324-391 (mostrados en itálicas) constituyen el dominio de muerte (los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 273 hasta aproximadamente 340 en la SEC ID NO: 2) .

La Figura 2 muestra las regiones de similaridad entre las secuencias de aminoácidos de DR5 (HLYBX88), el receptor 1 del factor de necrosis del tumor (h TNFR1 ) (SEC ID NO : 3 ) , la proteina Fas humana (SEC ID NO : 4 ) , y el receptor 3 que contiene el dominio de muerte (SEC ID NO : 5 ) . La comparación fue creada con el programa Megalign que está contenida en el conjunto Star ADN de programas utilizando el método Clustal.

La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácido DR5. Las regiones alfa, beta, de giro y de espiral; la hidrofilicidad y la hidrofobicidad; las regiones amfipáticas; las regiones flexibles, el Índice antigénico y la probabilidad superficial se muestran también. En la gráfica "Índice antigénico- Jameson-Wolf", los residuos aminoácidos de aproximadamente 62 hasta aproximadamente 110, aproximadamente 119 hasta aproximadamente 164, aproximadamente 224 a aproximadamente 271, y aproximadamente 275 hasta aproximadamente 370 se muestran en la figura 1 y corresponden a las regiones altamente antigénicas mostradas de la proteina DR5. Estos fragmentos altamente antigénicos en la Figura 1 corresponden a los siguientes fragmentos, respectivamente, en la SEC ID NO : 2 : residuos amino ácidos desde aproximadamente 11 hasta aproximadamente 59, desde aproximadamente 68 hasta aproximadamente 113, desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220, y desde aproximadamente 224 hasta aproximadamente 319.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleotidos (HAPBU13R y HSBBU76R) de dos moléculas de ADNc las cuales están relacionadas a la secuencias de nucleótidos mostradas en la Figura 1 (SEC ID NO: 1) .

La Figura 5A es una gráfica de barras que muestra la sobre expresión de la apoptosis inducida por DR5 en células de carcinoma del seno humano MCF7. La figura 5B es una gráfica de barras que muestra la sobre expresión de la apoptosis inducida por DR5 en células de carcinoma epiteloide humano (Hela) . La Figura 5C es una gráfica de barras que muestra la apoptosis inducida por DR5 que fue bloqueada por los inhibidores caspase, CrmA y z-VAD-fmk, pero el FADD negativo dominante estuvo sin efecto. La Figura 5D es un inmunomanchado que muestra, como DR4, DR5 no interactúan con FADD y TRADD in vi vo . La Figura 5E es una gráfica de barras que muestra una versión negativa dominante de una molécula similar al FLICE identificada de manera nueva, el FLICE2 (Vincenz, C. et al. , J. Bi ol . Ch em . 2 72 : 651 8 (1997)), bloquea eficientemente la apoptosis inducida por DR5, mientras que el FLICE negativo dominante tuvo solamente un efecto parcial bajo las condiciones de bloqueo. También muestra la apoptosis bloqueada efectivamente de TNFR-1.

La Figura 6A es un inmunomanchado que muestra que el DR5-Fc (asi como DR4 y TRID) se enlazó específicamente al TRAIL, pero no al ligando TNF-a citotóxico relacionado. El panel inferior de la Figura 6A muestra las fusiones Fc de entrada presentes en los ensayos de enlace. La Figura 6B es una gráfica de barras que muestra que el DR5-Fc bloquea la capacidad del TRAIL de inducir la apoptosis. Los datos (media + estándar) mostrados en la Figura 6B son el porcentaje de núcleos apoptóticos entre los núcleos totales contados (n=4) . La Figura 6C es una gráfica de barras que muestra que el DR5-Fc no tuvo efecto en la apoptosis de la muerte celular inducida por TNF-a bajo las condiciones donde el RNFRl-Fc abolió el TNFa asesino .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS.

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1. (SEC ID NO : 2 ) , o un fragmento del polipéptido. El polipéptido DR5 de la presente invención comparte de homología de secuencia con otros receptores que contienen el dominio de muerte conocidos de la familia del TNFR que incluye el TNFR-1 el DR3 y Fas humanos (Figura 2) . La secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) fue obtenida mediante la secuenciación de clones de ADNc tales como HLYBX88, que fue depositado el 7 de Marzo de 1997, en la Colección de Cultivos Tipo Americano, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 29852, y a la cual se le dio el número de acceso 97920. El clon depositado está contenido en el plasmido pSport 1 (Life Technologies, Gai thersburg, MD) .

MOLÉCULAS DE ACIDO NUCLEICO A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótidos determinados por la secuenciación de una molécula de ADN aqui, fueron determinadas utilizando un secuenciador de AND automatizado (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.) y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas aqui, fueron predichas por la traducción de una secuencia ADN determinada como se indicó arriba. Por lo tanto, como es conocido en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante su aproximación automatizada, cualquier secuencia de nueclótidos determinada aqui puede contener algún error. Las secuencias de nucleótidos determinadas mediante automatización son típicamente al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% y al menos aproximadamente 99.9% idénticas a las secuencias de nucléotidos reales de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede ser determinada más precisamente mediante otras aproximaciones que incluyen los métodos de secuenciación del ADN manuales bien conocidos en la técnica. También como es conocido en la técnica, una sola inserción o eliminación en una secuencia de nucleótidos determinada comparada a la secuencia real provocará una desviación de la estructura en la traducción de la secuencia de nucleótidos tales que la secuencia de amino ácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, iniciando en el punto de tal inserción o eliminación. Utilizando la información provista aqui, tal como la secuencia" de ácidos nucleicos establecida en la SEC ID NO : 1 , una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido DR5 se puede obtener utilizando los procedimientos de clonación y selección estándares, tal como aquellos para clonar los CADNs utilizando RNAm como el material iniciador. Ilustración de la invención, las moléculas de ácido nucleico de la invención han sido identificadas en las genotecas de ADNc de los siguientes tejidos: células dendriticas primarias, tejido endotelial, vaso, leucemia limfocitica crónica, y células del estroma del timo humano. La secuencias de nucleótidos determinadas del ADNc del DR5 de la SEC ID NO : 1 contiene una estructura de lectura abierta que codifica una proteina de aproximadamente 411 residuos de aminoácidos cuyo codon de iniciación está en la posición 130-132 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l), con una secuencia líder de aproximadamente 51 residuos de amino ácidos. De miembros conocidos de la familia del receptor TNF, el polipéptido DR5 de la invención comparte el grado mayor de homología con los polipéptidos TNFR1, FAS y DR3 humanos, mostrado en la Figura 2, que incluyen una homología de secuencia significante sobre múltiples dominios ricos en cisteina. La homología del DR5 muestra a otros dominios de muerte que contienen receptores que indican fuertemente que el DR5 es también un receptor que contiene el dominio de muerte con la capacidad de inducir la apoptosis. El DR5 también ha mostrado que se enlaza al TRAIL. Como se indicó, la presente invención también proporciona la forma o formas maduras de la proteina DR5 de la presente invención. De acuerdo a la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por las células de mamíferos tienen una señal o secuencia lider secretoria la cual es escindida de la proteina de forma madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de la proteina de crecimiento a través de la mayor parte del retículo endoplásmico . En la mayoría de las células de mamíferos y aún las células de insectos generan proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la escisión de una proteina secretada no enteramente uniforme, lo cual da como resultado dos o más especies maduras de la proteina. Además, se ha conocido anteriormente, que la especificidad de escisión de una proteina secretada está determinada de manera final por la estructura primaria de la proteina completa, esto es, es inherente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido . Por lo tanto, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéotido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificado por el clon de ADNc contenido en el huésped identificado como Depósito ATCC No. 97920, y como se muestra en la Figura 1, (SEC ID NO:2) . Por la proteina DR5 madura, que tiene la secuencia de aminoácido codificada por los clones de ADNc contenido en el huésped identificado como Depósito ATCC No. 97920, se indica la forma o formas maduras de la proteina DR5 producida mediante la expresión en una célula de mamífero (por ejemplo células COS, como se describe abajo) de la estructura de lectura abierta, codificada por la secuencia de ADN humano del clon contenido en el vector en el huésped depositado. Como se indica abajo, el DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADN contenido en el Depósito ATCC No. 97920, puede o no puede diferir de la proteina DR5 "madura" predicha mostrada en la SEC ID NO : 2 (los aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360) dependiendo de la exactitud del sitio de escisión predicho, basado en el análisis por computadora. Los métodos para predecir si una proteina tiene una secuencia lider secretoria asi como el punto de punto de escisión para esa secuencia lider, están disponibles. Por ejemplo, el Método de McGeoch ( Vi rus Res , 3 : 21 1 - 2 8 6 (1985)) y von Heinje ( Nucl ei c Aci ds Res . 14:4683-4690 (1986)) se puede utilizar. La exactitud para predecir los puntos de escisión de las proteínas secretorias de mamíferos conocidas para cada uno de estos métodos está en el rango de 75-80%, von Heinje, s upra . Sin embargo, los dos métodos no producen siempre los mismos puntos de escisión predichos para una proteina dada . En el presente caso, la secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido DR5 completo de la presente invención fue analizada mediante un programa de computadora ("PSORT") . Ver, K. Nakai y M. Kanehisa, Genomic 14:897-911 (1992) . El PSORT es un sistema experto para predecir la localización celular de una proteina basada en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción mediante computadora de la localización, los métodos de McGeoch y von Heinje están incorporados. El análisis mediante el programa PSORT predice los sitios de escisión entre los aminoácidos 51 y 52 en la Figura 1 (-1 y 1 en la SEC ID NO : 2 ) .

Posteriormente, las secuencias de aminoácidos completas fueron adicionalmente analizadas mediante inspección visual, aplicando una forma simple de la regla de von Heinje (-1, -3) . von Heinje, s upra . Asi, la secuencia lider para la proteina DR5 está predicha y consiste de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 51, subrayados en la Figura 1 (que corresponden a aproximadamente -51 a aproximadamente 1 en la SEC ID NO : 2 ) , mientras que la proteina DR5 predicha consiste de residuos de aminoácidos desde aproximadamente 52 hasta aproximadamente 411 en la Figura 1 (que corresponden a aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ) . Como se indicó, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tal como ARNm, o en la forma de ADN, que incluyen por ejemplo, ADNc y el ADN genómico obtenido mediante clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser de una sola hebra o de doble hebra. El ADN de una sola hebra puede ser la hebra codificante, también conocida como la hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, también referida como la hebra ant i-sentido . Mediante moléculas de ácido nucleico "aisladas" se indica una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido quitada o eliminada de su medio ambiente natural. Por ejemplo, las moléculas ADN recombinantes contenidas en un vector son consideradas aisladas para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en las células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcialmente o substancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcriptos de ARN i n vi vo o in vi tro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente invención, además incluyen tales-moléculas producidas sintéticamente. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen moléculas de ADN de DR5 que comprenden una estructura de lectura abierta (ORF) mostrada en la SEC ID NO : 1 ; moléculas de ADN que comprenden la secuencia de codificación para la proteina DR5 madura; y las moléculas de ADN que comprenden una secuencia diferente substancialmente de aquellas descritas anteriormente, pero las cuales, debido a la degeneración del código genético, aún codifican la proteina de DR5. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Asi, seria rutinario para alguien hábil en la técnica generar tales variantes degenerativas. En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido de DR5 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el plasmido depositado como depósito ATCC No. 97920 del 7 de Marzo de 1997. En una modalidad adicional, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de codifica al polipéptido DR5 maduro o al polipéptido DR5 de longitud completa que carece de la metionina N-terminal . La invención además proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO : 1 o la secuencia de nucleótidos del ADNc del DR5 contenido en el clon depositado descrito arriba, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores. Tales moléculas aisladas, particularmente moléculas de ADN, son utilizadas como sondas para la solución de mapas genéticos mediante la hibridazión i n si t u con cromosomas, y para la detección de la expresión del gen DR5 en el tejido humano, por ejemplo, mediante análisis de manchado Northern. La presente invención está dirigida adicionalmente a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aqui. Mediante un fragmento de una molécula de ADN aislada que tiene la secuencia de nucleótidos del ADNc depositado, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO : 1 , o la hebra complementaria a la misma, se indican fragmentos de ADN al menos aproximadamente 15 nt, y más preferiblemente al menos 20 nt, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, y aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o 500 nt de longitud. Estos fragmentos tienen numerosos usos que incluyen, pero no están limitados a sondas y cebadores de diagnóstico como se discute aqui. Por supuesto los fragmentos de ADN más largos, 500-1500 nt en longitud son también útiles de conformidad con la presente invención, como son los fragmentos que corresponden a la mayoría, sino es que a todas, las secuencias de nucleótidos del ADNc depositado o como se muestra en la SEC ID NO : 1. Mediante un fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se indican fragmentos los cuales incluyen 20 o más bases contiguas a partir de la secuencia de nucleótidos del ADN depositado o de la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:l. Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a las moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende el dominio extracelular de DR5 (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 52 hasta aproximadamente 184 en la Figura 1 (desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 133 en la SEC ID NO : 2 ) ) ; un polipétido que comprende el domino de la transmembrana DR5 (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 185 hasta aproximadamente 208 en la Figura 1 (desde aproximadamente 134 hasta aproximadamente 157 en la SEC ID NO : 2 ) ) ; un polipéptido que comprende el dominio intracelular DR5 (residuos aminoácidos desde aproximadamente 209 hasta aproximadamente 411 en la Figura 1 (desde aproximadamente 158 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ) ) ; y un polipéptido que comprende el domino de muerte de DR5 (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 324 hasta aproximadamente 391 en la FIGURA 1 (desde aproximadamente 273 hasta aproximadamente 340 en la SEC ID NO: 2) ) . Puesto que la localización de estos dominios ha sido predicha mediante gráficas por computadora, alguien con habilidades ordinarias apreciará que los residuos de aminoácidos que constituyen estos dominios pueden variar ligeramente (por ejemplo, por aproximadamente 1 hasta aproximadamente 15 residuos) dependiendo del criterio usado para definir cada dominio. Los fragmentos de ácido nucleicos de la invención codifican un polipéptido de DR5 de longitud completa, que carecen de los nucleótidos que codifican la metionina amino-terminal (nucleótidos 130-132 en la SEC ID NO : 1 ) como se conoce que la metionina se escinde naturalmente y tales secuencias pueden ser usadas en vectores de expresión del DR5 generados en ingeniería genética. Los polipéptidos codificados mediante tales polinucleótidos están también contemplados por la invención . Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención, además incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican porciones portadoras de epitopes de la proteina DR5. En particular, tales fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, las moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 62 hasta aproximadamente 110 en la Figura 1 (aproximadamente 11 hasta aproximadamente 59 en la SEC ID NO : 2 ) ; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 119 hasta aproximadamente 164 en la Figura 1 (aproximadamente 68 hasta aproximadamente 113 en la SEC ID NO:2) ; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 224 hasta aproximadamente 271 en la Figura 1 (aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO : 2 ) ; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 275 hasta aproximadamente 370 en la Figura 1 (aproximadamente 224 hasta aproximadamente 319 en la SEC ID NO:2) . Los inventores han determinado que los fragmentos de polipéptidos anteriores son regiones antigénicas de la proteina DR5. Los métodos para determinar otras de tales porciones que llevan el epitope de la proteina de DR5 se describen en detalle abajo.

Además, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas a las porciones extensivas de las SEC ID NO : 1 que han sido determinadas desde los clones de ADNc relacionados siguientes: HAPBU13R (SEC ID NO : 6 ) y HSBBU76R (SEC ID NO : 7 ) . Las secuencias de nucleótidos de HAPBU13R y HSBBU76R se muestran en la Figura 4. Además, la invención incluye un polinucleótido que comprende cualquier porción de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de la SEC ID NO : 1 del residuo 284 a 1,362, preferiblemente desde 284 hasta 681. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones de hibridización severas a una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita arriba, por ejemplo, los clones de ADNc contenidos en el Depósito ATCC No. 97920. Mediante "condiciones de hibrización severas" se indica la incubación durante toda la noche a 42°C en una solución que comprende: formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esper a de salmón centrifugada, desnaturalizada 20 g/ml, seguido por el lavado de los filtros en SSC 0. lx a aproximadamente 65°C. Por un polinucleótido que se hibridiza a una "porción" de un polinucleótido, se indica un polinucleótido (ya sea ADN o RNA) que se hibridiza a al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nt, •aún más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, y aún más preferiblemente aproximadamente 30-70 ó 80-150 nt, o la longitud completa del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como sondas y cebadores de diagnóstico como se discutió arriba y se discutirá en más detalle enseguida. Por una porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se indican 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el ADNc depositado o la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO : 1 ) . Por su puesto, un polinucleótido que se hibridriza solamente a una secuencia poli A (tal como el tracto poli (A) terminal 3' del ADNc de DR5 mostrado en la Figura 1 (SEC ID NO : 1 ) ) , o a una porción complementaria de los residuos T (o U) , no estarla incluida en un polinucleótido de la invención usado para hibridizarse a una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que tal polinucleico se hibridizaria a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una porción poli (A) o complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de doble hebra) . Como se indicó, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido DR5 pueden incluir, pero no están limitados a, la secuencia de codificación para el polipéptido maduro, por si mismo: la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y las secuencias adicionales, tales como aquellas que codifican una secuencia secretoria o lider, tal como una secuencia pre-, o pro- o prepro- proteina; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin las secuencias de codificación adicionales antes mencionadas, junto con secuencias adicionales de no codificación, incluyen por ejemplo, pero no están limitados a secuencias 5' y 3' no codificantes y a intrones, tales como las secuencias no traducidas, transcritas, que juegan un papel en la transcripción, y procesamiento del ARNm -que incluyen las señales de división y poliadenilación, por ejemplo- el enlace del ribosoma y la estabilidad del ARNm; las secuencias de codificación adicionales que codifican para aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proporcionan funcionalidades adicionales. Asi, por ejemplo, el popipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como un péptido, lo que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (Quiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al . , Proc Na ti . Aca d . Sci . USA 86 : 821-824 (1989), por ejemplo, el hexa-histidina, proporciona una purificación conveniente de la proteina de fusión. La marca o etiqueta "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epitope derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza, la cual se ha descrito por Wilson et al . , Cell 37 : 1 61 - 11 8 (1984) . Como se discute más abajo, otra de tales proteínas de fusión incluyen el receptor de DR5 fusionado a Fc en el N o C terminales . La presente invención además se refiere a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican porciones, análogos o derivados del receptor DR5. Las variantes pueden ocurrir naturalmente, tal como una variante alélica natural. Mediante una "variante alélica" se indica una o varias formas alternativas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., Jonh Wiley & Sons, New York (1985) . Las variantes que se presentan no naturalmente se pueden producir utilizando técnicas de mutagénesis bien conocidas. Tales variantes incluyen aquellas producidas por sustituciones de nucleótidos, eliminaciones o adiciones que involucran uno o más nucleótidos. Las variantes se pueden alterar en las regiones codificantes o no codificantes o en ambas. La alteración de las regiones de codificación puede producir substituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas.

Especialmente preferidos entre aquellas son las substituciones, adiciones y eliminaciones silentes, las cuales no alteran las propiedades y actividades del receptor DR5 o porciones del mismo. También especialmente preferidos en relación a estos son las substituciones conservativas. Las modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que son al menos 90% idénticas, y más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO : 2 ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO : 2 , pero que carece de la metionina amino terminal ; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon ADNc contenido en el depósito ATCC No. 97920; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 97920; (f) una secuencia> de nucleótidos que codifica el dominio extracelular DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 1 hasta aproximadamente 133 en la SEC ID NO : 2 o el dominio extracelular DR5 codificado por el ADNc contenido en el depósito ATCC No. 97920; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de la transmembrana DR5 que tiene las secuencias de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 134 hasta aproximadamente 157 de la SEC ID NO : 2 o el dominio de la transmembrana de DR5 codificado por el ADNc contenido en el depósito ATCC No. 97920; (h) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 158 a aproximadamente 360 de la SEC ID NO : 2 , o el dominio intracelular DR5 codificado por el ADNc contenido en el depósito ATCC No. 97920; (i) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de muerte DR5 que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 273 a aproximadamente 340 de la SEC ID NO : 2 , o el dominio de muerte DR5 codificado por el ADNc contenido en el depósito ATCC No. 97920; y (j) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g)/ (h) o (i) anteriores. Mediante un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido DR5 se indica que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta 5 puntos de mutaciones por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica al polipéptido DR5. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (pregunta) puede ser ya sea la secuencia de nucleótidos DR5 completa mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO : 1 ) o cualquier fragmento de polinucleótidos como se describió aquí . Como una materia práctica, ya sea que cualquier molécula de ácido nucleico particular sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO : 1 o la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc depositado se puede determinar convencionalmente utilizando los programas de computadoras, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, Universty Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) . El Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Appl i ed Ma th ema ti cs 2:482-489(1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre las dos secuencias. Cuando se utiliza el Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo a la presente invención, los parámetros se ajustan, por su puesto, de manera tal que el porcentaje de identidad sea calculado sobre la longitud completa de la secuencia del nucleótido de referencia y que los espacios en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos sea permitida en la secuencia de referencia. En una modalidad especifica, la identidad entre una secuencia de referencia, (pregunta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también referida como una alineación de secuencia global, se determina utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App . Biosci. 6:237-245 (1990)) . Los parámetros preferidos utilizados en una alineación de FASTDB de las secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitario, k-tuple=4, Pena por diferencia=l , Pena por unión=30, Longitud del Grupo de Aleatorización=0, Valor por corte =1, Pena por separación o diferencia=5, Pena por tamaño de separación =0.05, Tamaño de ventaha=500 o la longitud de la secuencia del nucleótido objeto, cualquiera que sea más corto. De acuerdo a esta modalidad, si la secuencia objetivo es más acorta que la secuencia pregunta o de referencia debido a las eliminaciones 5' o 3', no debido a las eliminaciones internas, se hace una corrección. manual a los resultados para tomar en cuenta el hecho de que el -programa FASTDB no toma en cuenta los cortes o truncaciones 5' y 3' de la secuencia objetivo cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias objetivo truncadas en los extremos 5' o 3', en relación a la secuencia pregunta o de referencia, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia de pregunta que son 5' y 3' de la secuencia objetivo, las cuales no están apareadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia pregunta o referencia. Una determinación de si un nucleótido está apareado/alineado se determina mediante los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje se extrajo del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una valoración de identidad de porcentaje final. Este registro corregido es el que se usa para los propósitos de esta modalidad. Solamente las bases que están fuera de las bases 5' y 3' se la secuencia sujeto, como se presenta por la alineación FASTDB, las cuales no están apareadas/alineadas con la secuencia pregunta, están calculadas para los propósitos del ajuste de manera manual del porcentaje de la valoración de identidad. Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea a una secuencia de pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las supresiones ocurren al extremo 5' de la secuencia objeto y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases al extremo 5' . Las pases no apareadas 10 representan el 10% de la secuencia (número de bases los extremos no apareada/número total de bases en la secuencia de pregunta) asi que un 10% se extrae del porcentaje de la valoración de identidad calculado por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes son apareadas perfectamente, la identidad del porcentaje final será 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se compara con una secuencia pregunta de 100 bases. Este tiempo de las supresiones son supresiones internas, de manera que no hay bases en los extremos 5' o 3' de la secuencia objetivo las cuales no estén apareadas /alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, solamente las bases 5' y 3 ' de la secuencia objeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia pregunta son manualmente corregidas. No se hace ninguna otra correcciones manuales para los propósitos de esta modalidad. La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 971, 981 o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NO : 1 , la secuencia de ácido nucleico de los ADNc depositados, o fragmentos del mismo, irrespectivos de si codifican un polipéptido que tiene actividad DR5. Esto es porque aún una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene actividad DR5, un experto en la técnica conocerá como usar la molécula deácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridización o un cebador de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que no codifican un polipéptido que tiene actividad DR5 incluyen, i n t er al i a (1) aislamiento del gen DR5 o variantes alélicas del mismo en una genoteca DNAc ; (2) hibridación i n si t u (por ejemplo, "FISH") a aspersiones de cromosomas de metafase para proporcionar ubicación cromosomal precisa del gen DR5, como se describe en Verna et al., Human Chromosomes : A Manual of Ba si c Techni qu es, Pergamon, Press, Néw York (1988); y (3) Análisis de manchado North.ern para detectar la expresión ARNm de DR5 en tejidos específicos. Sin embargo, son preferidas las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NO : 1 ; la secuencia de ácido nucleico de los ADNc depositados, o fragmentos del mismo, los cuales, en efecto, codifican un polipéptido que tiene actividad de la proteína DR5. Mediante "un polipéptido que tiene actividad DR5" se indican polipéptidos que presenta actividad similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad de la proteína DR5 de la invención (ya sea la proteina de longitud completa o, preferiblemente, la proteina madura), como se midió en un ensayo biológico par.ticular. Por ejemplo, la actividad de la proteína DR5 puede medirse usando los ensayos de muerte celular realizados esencialmente como se describe previamente (A.M. Chínnaiyam, e t al . , Cel l 81:505-12 (1995); M.P. Boldin, e t al . , J. Bi ol . Ch em 2 70 : 11 95 - 8 (1995); F.C. Kischkel, et al . , EMBO 14:5575-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, et al . , J. Bi ol Ch em 271:4961-4965 (1996)) y como se expone en el Ejemplo 5, abajo. En las células MCF7, los plasmidos que codifican al DR5 de longitud completa o un candidato de dominio celular que contiene el receptor son co-trans fectadas con la proteina verde fluorescente que codifica el constructo reportero pLatern. El núcleo de las células transfectadas con DR5 presentará morfología apoptótica como la ensayada mediante teñido DAPI . Parecido al TNFR-1 y Fas/APO-1 (M. Muzio, et al . , Cel l 85:817-827 (1996); M.P. Boldin, et al . , Cel l 85:803-815 (1996); M. Tewari, et al . , J. Bi ol . Ch em 270:3255-60 (1995)), la apoptosis inducida por DR5 es bloqueada preferiblemente por los inhibidores de las proteasas parecidas a ICE, CrnA y z-VAD-fmk. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico tienen una secuencia de al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado, la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NO : 1 , o los fragmentos de la misma, codificarán un polipéptido "que tenga una actividad de la proteína DR5". En efecto, puesto que las variantes degenerativas de estas secuencias de nucleótidos todas codificarán al mismo polipéptido, en muchos ejemplo, esto será claro a un experto en la técnica aún sin realizar los ensayos de comparación descritos arriba. Se reconocerá, además, en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido que tiene actividad de la proteina DR5. Esto es debido a que el experto en la técnica está completamente consiente de las substituciones de amino ácidos que son ya sea similarmente parecidas o diferentes a la función de la proteina de efecto significante (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) . Por ejemplo, la guía concerniente a como preparar substituciones de aminoácidos silentes fenotípicamente, se proporciona en Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Pretein Sequences: Tolerance to Amino Acid Subs ti tut ions" , Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las substituciones de los aminoácidos.

Ensayos de los polinucleótidos Esta invención está también relacionada al uso de los polinucleótidos DR5 para detectar los polinucleótidos complementarios tales como, por ejemplo, un reactivo de diagnóstico. La detección de una forma mutada del DR5 asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede agregar o definir un diagnóstico de un padecimiento o sucept ibilidad a un padecimiento que resulta de la sub-expresión o sobre-expresión o expresión alterada del DR5 o una forma soluble del mismo, tal como, por ejemplo, tumores o padecimientos autoinmunes. Los individuos que llevan mutaciones en el gen DR5 se pueden detectar en el nivel de ADN mediante una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico se pueden obtener a partir de células de pacientes, tales como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejido, y material de autopsia. El ADN genómico se puede usar directamente para la detección o se puede amplificar enzimáticamente utilizando la técnica PRC antes del análisis (Saiki et al . , Na t ure 324 : 1 63 - 1 6 6 (1986)) . El ARN o ADNc puede también usarse en las mismas formas. Como un ejemplo, los cebadores PRC complementarios al ácido nucleico que codifica el DR5 se pueden utilizar para identificar y analizar las expresiones y mutaciones del DR5. Por ejemplo, las eliminaciones e inserciones se pueden detectar por un cambio en el tamaño de los producto amplificado en comparación con el genotipo normar. Las mutaciones de los puntos se pueden identificar por la hibridización del ADN amplificado al RNA de DR5 radiomarcado o alternativamente, secuencias ADN antisentido de DR5 radiomarcado. Las secuencias perfectamente apareadas se pueden distinguir de los duplexes no apareados mediante la digestión RNAse A o mediante las diferencias en las temperaturas de fusión. Las diferencias de las secuencias entre un gen y genes que tienen mutaciones también se puede revelar mediante la secuenciación de ADN. Además, los segmentos de ADN clonados, pueden ser empleados como sondas para detectar segmentos ADN específicos. La sensibilidad de tales métodos se puede incrementar grandemente por el uso apropiado del PRC u otro método de amplificación. Por ejemplo, un cebador de secuenciación se usa con un producto PCR de doble hebra o una molécula de referencia o plantilla de una sola hebra generada mediante un PCR modificado. La determinación de las secuencias se realiza mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciación automática con etiquetas fluorescentes. Los ensayos genéticos basados en las diferencias de las secuencias de ADN pueden realizarse mediante detección de la alteración en la mobilidad electroforética de fragmentos ADN en los geles, con o sin agentes de desnaturalización. Las eliminaciones e inserciones de pequeñas secuencias se pueden visualizar por electrofóresis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden distinguirse de los geles de gradientes de formamida desnaturalizantes en los cuales la mobilidad de diferentes fragmentos ADN se retardan en el gel a diferentes posiciones de conformidad con su punto de fusión especifico o a su temperatura de fusión parciales (ver, por ejemplo Myers et al . , Sci en ce 230 : 12 42 (1985)) . Los cambios en la secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante las pruebas de protección de la nucleasa, tal como protección Rnase y SI o el método de escisión químico (por ejemplo, Cotton et al . , Pro c . Na ti . Aca d . Sci . USA 85: 4397-4407 (1985) ) .

Así, la detección de una secuencia de ADN específica, se puede lograr por métodos que incluyen, pero no están limitados a, hibridización, protección de Rnase, escisión química, secuenciación de ADN directo o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, los polimorfismo de la longitud del fragmentos de restricción ("RFLP") y manchado Southern del ADN genómico) . .Además de la electroforesis en gel convencional y de la secuenciación de ADN, se pueden detectar también las mutaciones mediante análisis i n si t u .

Vectores y Células Huésped La presente invención también se refiere a vectores que incluyen moléculas de ADN de la presente invención, células huésped las cuales son diseñadas genéticamente con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células huésped pueden ser diseñadas genéticamente para incorporar moléculas de ácido nucleico y expresar los polipéptidos de la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser introducidos solos o con otros polinucleótidos. Tales otros polinucleótidos pueden ser introducidos independientemente, co-introducidos o introducidos en forma unida a los polinucleótidos de la invenció . De acuerdo con este aspecto de la invención el vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmido, un vector de fago de una sola o de doble hebra, un vector viral de ARN o ADN de una sola hebra o de doble hebra. Tales vectores pueden introducirse en las células como polinucleótidos, preferiblemente ADN, mediante técnicas bien conocidas para la introducción del ADN y ARN en las células. Los vectores virales pueden tener una replicación competente o una replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral en general ocurrirá solamente en células huésped complementarias .

Entre los vectores . preferidos, en ciertas especies, están aquellos para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención. De manera general, tales vectores comprenden regiones de control cis-activas efectivas para la expresión en un huésped ligado operativamente al polinucleótido que va a ser expresado. Los factores trans-act ivación apropiados ya sea, están complementados por el huésped, suministrados por un vector de comple entación o suministrados por el mismo vector sobre la introducción en el huésped. Una gran variedad de vectores se expresión se pueden usar para expresar un polipéptido de la invención. Tales vectores incluyen vectores cromosómicos, vectores derivados de virus y vectores episomales, por ejemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levaduras, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tal como baculovirus, virus papova, tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de aves de corral, virus de la pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones del mismo, tal como aquellos derivados de elementos genéticos bacteriófagos y plasmidos, tales como cosmidos y fagemidos, todos pueden ser usados para 4 le expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. De manera general, cualquier vector adecuado par mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un polipéptido en un huésped, puede ser usados para la expresión en relación a esto. La secuencia ADN en el vector de expresión está unida operativamente a la secuencia o secuencias de control de la expresión apropiada, que incluyen por ejemplo, un promotor dirigido a la transcripción ARNm. Los representantes de tales promotores incluyen el promotor PL fago lambda, los promotores E . col i l a c , trp y ta c , los promotores tempranos y últimos SV40 y los promotores de LTRs retroviral, por nombrar solo unos cuantos de los promotores bien conocidos. En general, los constructos de expresión contendrán sitios para la transcripción, iniciación y terminación, y, en la región transcrita, un sitio que enlaza al ribosoma para traducción. La porción que codifica los transcriptos maduros expresada por los constructos incluirán un AUG de iniciación de traducción en el inició y un codon de iniciación (UAA, UGA o UAG) posicionados adecuadamente al extremo del polipéptido a ser traducido.

Además, los constructos pueden contener regiones de control que regulan asi como expresiones que engendran o engendradas. En general, tales regiones serán operadas por la transcripción de control tal como los sitios de enlaze del represor e incrementadores, entre otros. Los vectores para la propagación y expresión en general incluirán marcadores selectivos. Tales marcadores pueden también ser adecuados para la amplificación o los vectores pueden contener marcadores adicionales para este propósito. En este sentido, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores selectivos para proporcionar un rasgo fenotipico para la selección de células huésped transformadas. Tales marcadores incluyen, pero no están limitados a, recutadas dihidrofolata o resistencia a neomicina para cultivos celulares eucarióticos, y genes resistentes a la tetraciclina o ampicilina para el cultivo de E . c ol i y otras bacterias . El vector que contiene la secuencia ADN apropiada como se describe asi mismo aqui, también un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, pueden introducirse en un huésped apropiado usando una variedad de técnicas bien conocidas adecuadas para la expresión aqui de un polipéptido deseado. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacteriales tales como células E . Col i , S trep t omyc es y Salmonel l a typh imuri um ; células fúngales, tales como células de levaduras; células de insecto tales como células Dros ophi l a S2 y Spodop t era Sf9; células animales tal como CHO, COS y células de melanoma Bowes; y células de plantas. Los medios de cultivo apropiados y las condiciones para las células huésped descritas anteriormente son conocidos en la técnica. Entre los vectores preferidos para usar en las bacterias están el pQE70, pQE60 y pQE-9, disponible de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Estos vectores están listados solamente para medios de ilustración de los vectores principalmente comercialmente disponibles y bien conocidos, disponibles para aquellos expertos en la técnica. La selección de vectores apropiados y promotores para la expresión en una célula huésped es un procedimiento bien conocido y una técnicas requisito para la construcción de vectores de expresión, la introducción del vector en el huésped y la expresión en el huésped son rutinas para un experto en la técnica. La presente invención también se refiere a células huésped que contienen los constructos descritos anteriormente discutidos arriba. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o una célula huésped puede ser una célula procariót ica, tal como una célula bacterial. La cepa huésped puede que puede ser seleccionada, modula la expresión de las secuencias del gen insertadas, o modificadas y procedimientos al producto del gen en las modas específicas deseadas. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en la presencia de ciertos inductores; asi, la expresión del polípétido diseñado genéticamente puede ser controlada. Además, las células huésped tienen diferentes características y mecanismos específicos para el procedimiento y modificación traduccional y post-traduccional (por ejemplo, fosforilación, ecsisión) de proteínas. Las líneas celulares apropiadas pueden elegirse para asegurar las modificaciones deseadas y procesamientos de la proteína expresada anteriormente. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse por la transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección catiónica de lípidos mediada, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos están descritos en muchos manuales estándares de laboratorio, tales como Davis et al . , Basi c Methods in Mol ecul ar Bi ol ogy (1986) . El polipéptido puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión (que comprende el polipéptido unido vía un enlace péptido a una secuencia de proteina heteróloga (de una proteina diferente)), y puede incluir no solamente señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Tal proteina de fusión puede elaborarse por polinucleótidos ligantes de la invención y la secuencia de ácido nucleico deseada que codifica la secuencia de aminoácido deseada a la otra, mediante métodos conocidos en la técnica, en la estructura lectora proper, y que expresa el producto de proteína de fusión por métodos conocidos en la técnica alternativamente, tal proteína de fusión puede elaborarse por técnicas sintéticas de proteínas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador péptido. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede agregarse al N-término del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la subsecuente manipulación y almacenaje. De manera adicional, también se puede agregar una región al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden ser removidas previo a la preparación final del polipéptido. La adición de las porciones péptidas a polipéptidos para engendrar secreción o excreción, mejora la estabilidad y facilita la purificación, entre otros, son técnicas familiares y de rutina en el arte. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que se utiliza para solubilizar proteínas. Por ejemplo el documento EP-A-0 464 533 (Contraparte Canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otras proteínas humanas o parte de las mismas. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es ventajosamente minuciosa para el uso en terapia y diagnosis y así resulta, por ejemplo, en propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A-0232 262) . De otro modo, para algunos usos, podrá ser deseable permitir eliminar la parte Fc después que la proteína de fusión ha sido expresada, detectada y purificada en la manera ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fc provista para ser un hidrance para usar en la terapia y diagnosis, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se usa como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento del fármaco, por ejemplo, las proteínas humanas, tal como el receptor hIL-5, han sudo fusionados con las porciones Fc para los propósitos de ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Ver, D, Benne t t e t al . , Jo urnal of Mol ecul ar Recogni ti on, 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al . , The Journal of Bi ol ogi cal Chemi stry, 270:9459-9471 (1995) . Los polipéptidos de DR5 pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos estándar los cuales incluyen, pero no están limitados a, sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía por fos focelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, la cromatografía liquida de alta resolución ("HPLC") es empleada para la purificación. Las técnicas bien conocidas para repartir la proteina pueden ser empleadas para regenerar conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, que incluye por ejemplo, levadura bacterial, plantas superiores, células de insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención puede ser glicosilados o pueden no ser glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención, también pueden incluir un residuo inicial de metionina modificado, en algunos casos como un resultado de procedimientos mediados por huésped. Los polinucleótidos DR5 y los polipéptidos pueden ser usados de conformidad con la presente invención por una variedad de aplicaciones, particularmente aquellas que hacen uso de las propiedades químicas y biológicas de DR5. Entre estas están las aplicaciones en el tratamiento de tumores, resistencia a parásitos, bacterias y virus, para inducir la proliferación de células T, células endoteliales y ciertas células hematopoieticas, para tratar restenosis, padecimiento del injerto contra huésped, para regular las respuestas anti-virales y para prevenir ciertos padecimientos autoinmunes después de la estimulación del DR5 mediante un agonista. Las solicitudes adicionales se refieren al diagnóstico y tratamiento de padecimientos celulares, tejidos y organismos. Estos aspectos de la invención se discuten más abajo.

Polipéptidos y Fragmentos DR5 La invención además proporciona un polipéptido DR5 aislado que tiene la secuencia de aminoácidos que codifica por el ADNc depositado, o la secuencia de aminoácido en la SEC ID NO : 2 ; o un polipéptido o péptido que comprende una porción de los polipéptidos anteriores. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de DR5 pueden variar sin efecto significante en la estructura o función de la proteina. Tales diferencias en la secuencia están contempladas, deberá recordarse que serán áreas críticas en la proteína las cuales determinan la actividad. Tales áreas usualmente comprenderán residuos los cuales hacen el sitio de enlace del ligando o el dominio de muerte, o el cual forma estructuras terciarias que afectan estos dominios. Así, la invención además incluye variaciones de la proteina DR5 la cual muestra actividad substancial de la proteína DR5 o la cual incluye regiones de DR5, tal como las porciones de la proteina se discuten abajo. Tales mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones de tipo. Como se indica arriba, la guia concerniente a la cual el aminoácido cambia es similar al silente fenotipicamente que se puede encontrar en Bowie, J.U. et a l . , Sci ence 247:1306-1310 (1990)) . Asi, el fragmento, derivado, o análogo del polipéptido de la SEC ID NO : 2 , o que codifica o el ADNc depositado, puede ser (i) una en la cual al menos uno o más de los residuos de aminoácidos son substituyentes con un residuo de aminoácido no conservado (preferiblemente un residuo o residuos de aminoácidos conservados, y más preferiblemente, al menos uno pero menos que diez residuos de aminoácidos conservados) y tal residuo de aminoácido substituido puede ser o no pude ser uno que codifica por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo substituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro esta fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la media vida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) una en la cual los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como un péptido de una región de fusión IgG Fc o una secuencia líder o secretoria o una secuencia la cual es empleada para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proteina. Tales fragmentos, derivados y análogos están considerados dentro del ámbito del experto en la técnica por las enseñanzas aqui. De particular interés son las substituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos y con aminoácidos cargados negativamente o neutrales. Los últimos resultan en proteínas con carga positiva reducida para mejorar las características de la proteina DR5. La prevención de la agregación es altamente deseable. La agregación de las proteína no solamente resulta en una pérdida de la actividad, sino también pude ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, debido a que pueden ser inmunogénicas (Pinckard et al., Clin Exp. Inmuno, 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36;838-845 (1987); Cleand et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)) . El reemplazo de los aminoácidos pueden también cambiar la selectividad del enlace a los receptores de la superficie celular. Ostade et al., Nature 361:266-268 . (1993) describe ciertas mutaciones que resultan en la selectividad de enlace de TNF-alfa a solamente uno de los dos tipos conocidos de receptores TNF. Asi, el receptor DR5 de la presente invención puede incluir uno o más substituciones de aminoácidos, eliminaciones o adiciones, ya sea de mutaciones naturales o manipulación humana. Como se indicó, los cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, tal como substituciones de aminoácidos conservativos, que no afectan significantemente las partes o la actividad de la proteina (ver Tabla 1) .

TABLA 1. Substituciones de Aminoácidos Conservativas Aromática Fenilalanina Triptofano Tirosina Hidrofóbica Leucina Isoleucina Valina Polar Glutamina Asparagina Básica Arginina Lisina Histidina Acidica Ácido aspart ico Ácido glutámico Pequeña Alanina Serina Treonina Metionina Glicina Los aminoácidos en la proteína DR5 de la presente invención que son esenciales para la función puede ser identificado por métodos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis de sitio dirigida, o mutagenesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Sci ence 2 :1081-1088 (1989)) . El último procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales a todos los residuos en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes son después ensayadas por su actividad biológica tal como enlace al receptor o in vitro o actividad proliferativa in vitro. Los sitios que son críticos para el enlace del ligando receptor puede también determinarse por análisis estructural tal como cristalización resonancia magnética nuclear o etiquetación de fotoafinidad ( Smi th e t al . , J. Mol . Bi ol . 224:899-904 (1992) y de Vos et al . Sci en ce 255:306-312 (1992)). Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada. Mediante "polipéptido aislado" se indica un polipéptido eliminado de su ambiente nativo. Así, un polipéptido producido y/o contenido dentro de una célula huésped recombinante se considera aislada para propósitos de la presente invención.

También indicado como un "polipéptido aislado" están los polipéptidos que han sido purificados, parcialmente o substancialmente, a partir de una células huésped recombinante. Por ejemplo, una versión recombinantemente producida del polipéptido DR5 puede ser purificada substancialmente por el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67 : 31-40 81988) . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que codifican por el ADNc depositado que incluye al polipéptido lider; el polipéptido maduro que codifica por el polipéptido lider ADNc menor depositado (es decir, la proteína madura) ; un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente -51 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ; un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente -50 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ; un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ; un polipéptido que comprende el domino extracelular; un polipéptido que comprende el dominio de la transmembrana; un polipéptido que comprende el domino intracelular; un polipéptido que comprende los dominios intracelulares y extracelulares con toda o parte del domino de la transmembra eliminado; y un polipéptido que comprende el domino de muerte; así como también polipéptidos los cuales son al menos 80% idénticos, más preferiblemente al menos 90% o 95% idénticos, aún más preferiblemente al menos 96%, 97&, 98% o 99% idénticos a los polipéptidos descritos arriba, y también incluyen porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos . Mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de al menos, por ejemplo 95% "idéntico" a una secuencia de aminoácido de referencia de un polipéptido DR5 se indica que la secuencia de aminoácido del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia del polipéptido DR5. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de al menos 95% idéntica a un secuencia de aminoácido de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o substituir con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta 5% de los residuos de aminoácido total en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir a las posiciones amino o carboxi terminal de la secuencia de aminoácido de referencia o cualquiera entre aquellas posiciones terminales, inesperadas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como un tema práctico, si algún polipéptido particular es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO : 2 ) , la secuencia de aminoácido que codifica por los clones ADNc depositados, o fragmentos del mismo, se pueden determinar convencionalmente, usando programas de computadora conocidos tal como el programa Bestfit (Wisconsing Sequence Analysis Package, Versión 9 por Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison Wl 53711) . Cuando se usa el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento, de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de conformidad con la presente invención, los parámetros son puestos, por supuesto, de manera tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácido de referencia y que permite abrir en homología hasta 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia . En modalidades especificas, la identidad entre una secuencia de referencia (pregunta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también son referidas como un alineamiento de secuencia global, determinada usando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App, Biosci. 6:237-245(1990) ) . Los parámetros preferidos usados en un alineamiento de aminoácido mediante FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, Pena por di ferencia=l , Pena por unión=20, Longitud del Grupo de Aleatorización=0, Valor por corte =1, Pena por separación o di ferencia=5 , Pena por tamaño de separación =0.05, Tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia del nucleótido objeto, cualquiera que sea más corto. De acuerdo a esta modalidad, si la secuencia objetivo es más acorta que la secuencia pregunta o de referencia debido a las eliminaciones N o C- terminal , no debido a las eliminaciones internas, se hace una corrección manual a los resultados para tomar en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no toma en cuenta los cortes o truncaciones N o C-terminal de la secuencia objetivo cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias objetivo truncadas en los términos N y C, en relación la secuencia pregunta o de referencia, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia de pregunta que N y C-terminal de la secuencia objetivo, las cuales no están apareadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia pregunta o referencia. Una determinación de si un nucleótido está apareado/alineado se determina mediante los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje se extrajo del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una valoración de identidad de porcentaje final. Este registro corregido es el que se usa para los propósitos de esta modalidad.

Solamente los residuos al N y C-terminal de la secuencia sujeto, los cuales no están apareados/alineados con la secuencia pregunta, están considerados para los propósitos del ajuste de manera manual del porcentaje de la valoración de identidad. Esto es, solamente las posiciones de los residuos de la secuencia de pregunta fuera de los residuos N y C terminal más lejano de la secuencia objetivo. Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos de aminoácido se alinea a una secuencia de pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. Las supresiones ocurren al N-término de la secuencia objeto y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases al N-término. Los residuos no apareados 10 representan el 10% de la secuencia (número de residuos a los N y C-terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia de pregunta) asi que un 10% se extrae del porcentaje de la valoración de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes son apareados perfectamente, la identidad del porcentaje final será 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos se compara con una secuencia pregunta de 100 residuos.

Este tiempo de las supresiones son supresiones internas, de manera que no hay bases en los N y C-termino de la secuencia objetivo las cuales no estén apareadas/alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, solamente las posiciones de los residuos de los extremos N y C-termino de la secuencia objeto, como se presentan en el alineamiento FASTDB, que no están apareadas/alineadas con la secuencia pregunta son manualmente corregidas. No se hacen ningunas otras correcciones manuales para los propósitos de esta modalidad . El polipéptido de la presente invención podrá ser usado como un marcador de peso molecular en los geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración de gel por tamiz molecular usando métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los presente inventores han descubierto que el polipéptido de DR5 es una proteína de 411 residuos que presenta tres dominios estructurales principales. Primero, el domino de enlace de ligando se identificó dentro de los residuos de aproximadamente 52 hasta aproximadamente 184 en la FIG.l (residuos aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 133 en la SEC ID NO : 2 ) . Segundo, el dominio de la transmembrana se identificó dentro de los residuos desde aproximadamente 185 hasta aproximadamente 208 en la Figura 1 (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 134 hasta aproximadamente 157 en la SEC ID NO : 2 ) . Tercero, el dominio intracelular se identificó dentro de los residuos desde aproximadamente 209 hasta aproximadamente 411 en la Figura 1 (residuos de aminoáciods desde aproximadamente 158 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO : 2 ) . De manera importante, el dominio intracelular incluye un dominio de muerte a los residuos desde aproximadamente 324 hasta aproximadamente 391 (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 273 hasta aproximadamente 340 en la SEC ID NO : 2 ) . Los fragmentos adicionales preferidos del polipéptido mostrado en la Figura 1, incluyen la proteina madura de los residuos desde aproximadamente 52 hasta aproximadamente 411 ( residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO;2), y polipéptidos solubles que comprenden todo o parte de los dominios extracelulares e intracelulares pero carecen del dominio de la transmembrana. La invención además proporciona polipéptidos DR5 que codifican por el clon DNAc depositado que incluye la secuencia lider y fragmentos de polipéptido DR5 seleccionados de la proteína madura, el domino extracelular, el domino de la transmembrana, el dominio intracelular, el dominio de muerte, y todas las combinaciones del mismo . En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción que lleva un epitope de un polipéptido descrito aqui. El epitope de esta porción de polipéptido es un apitope inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epitope inmunogénico" se define como parte de una proteína que incita una respuesta anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunogen. De otro modo, una región de una molécula de proteína a la cual un anticuerpo se puede unir, está definida cono un "epitope antigénico". El número de epitopes inmunogénicos de una proteína en general es menos que el número de epitopes antigénicas. Ver por ejemplo Geysen et al . , Proc . Na ti . Aca d . Sci . USA 81:3998-4002 (1983) . Como la selección de péptidos o polipéptidos que llevan un epitope antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteina a la cual un anticuerpo se puede unir), es bien conocida en que la técnica que relativamente acorta péptidos sintéticos de la parte mímica de una secuencia de proteína es capaz de manera rutinaria de producir un antisuero que reacciona con la proteina mimetizada parcialmente. Ver por ejemplo, Stucliffe, J.G., Shinnick, T.M., Greene N. y Learnes, R.A. "Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins", Sci en ce 21 9 : 6 60 -666 (1993) . Los péptidos capaces de producir suero reactivo de proteína son frecuentemente representadas en la secuencia primaria de una proteína que puede ser caracterizada por un conjunto de reglas químicas simples, y están confinadas no para regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epitopes inmunogénicas) o a los amino o carboxi terminales. Los péptidos y polipéptidos que llevan epitopes antigénicas, son por lo tanto, empleados como anticuerpos superiores, que incluyen anticuerpos monoclonales, que enlazan específicamente a un polipéptido de la invención. Ver por ejemplo, Wilson, et al., Cell 37:767-778(1984) a 777. Los péptidos y polipéptidos que llevan epitopes antigénicas de la invención, preferiblemente contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácido de un polipéptido de la invención . Se pueden usar ejemplos no limitantes de péptidos o polipéptidos antigénicos para generar anticuerpos específicos DR5 que incluyen: un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 62 hasta aproximadamente 110 en la Figura 1 ( aproximadamente 11 hasta aproximadamente 59 en la SEC ID NO : 2 ) ; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 119 hasta aproximadamente 164 en la figura 1 (aproximadamente 68 hasta aproximadamente 113 en la SEC ID NO : 2 ) ; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 224 hasta aproximadamente 271 en la Figura 1 (desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO : 2 ) ; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 275 hasta aproximadamente 370 en la figura 1 (aproximadamente 224 hasta aproximadamente 319 en la SEC ID NO : 2 ) . Como se indica arriba, los inventores han determinado que los fragmentos polipéptidos anteriores son regiones antigénicas de la proteína DR5. Los péptidos y. polipéptidos que llevan epitopes de la invención pueden ser producidos por cualquier medio convencional. Hougthen, R.A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides: Specifícity of Antigen-Antibody Interaction at level of Individual Amino Acids", Pro c . Na ti . Aca d . Sci . USA 82:5131-5135 (1985) . Este proceso "Síntesis múltiple simultánea del Péptido (SMPS)" se describe además en la Patente Norteamericana U.S. No. 4,631,211 por Hougthen et al , (1986) . Como apreciará un experto en la técnica, los polipéptidos DR5 de la presente invención y los fragmentos que llevan epitopes del mismo descritos arriba, pueden ser combinados con pares del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), que resultan el polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión, facilitan la purificación y muestran una vida media i n vi vo incrementada. Esto se ha mostrado por ejemplo, por proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de las in unoglobulinas de mamíferos (EPA 394,827; Traunecker et al . , Na t ure 331 : 84 - 8 6 (1988)). Las proteínas de fusión que tiene una estructura dimérica enlazada al disulfuro debido a la parte IgG puede también ser más eficientes en el enlace y neutralización de otras moléculas que la proteina DR5 monomérica o un solo fragmento de la proteína (Fountoulakis et al . , J. Bi och em 270:3958-3964 (1995) ) .

Ensayos de Polipéptido La presente invención también se refiere a ensayos de diagnóstico tal como ensayos cuantitativos y de diagnóstico para detectar niveles de la proteína DR5, o la forma soluble de la misma, en células y tejidos, incluyendo la determinación de los niveles normales y anormales. Asi, por ejemplo, un ensayo de diagnóstico de conformidad con la invención, por ejemplo para detectar la sobre expresión del DR5, o forma soluble del mismo, comparada con las muestras de tejidos de control normales, pueden usarse para detectar la presencia de tumores. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar los niveles de una proteina, tal como una proteina DR5 de la presente invención, o una forma soluble de la misma, en una muestra derivada de un huésped son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos , ensayos de enlace competitivos, análisis de manchado Western, y ensayos Elisa. Los niveles de la proteina DR5 ensayados en una muestra biológica pueden ocurrir usando cualquier método conocido en la técnica. Mediante "muestra biológica" se indica cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, linea celular, cultivo de tejido, u otra fuente que contiene la proteína del receptor DR5 o ARNm. Preferidas para ensayar los niveles de proteína DR5 en una muestra biológica son las técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de la proteína DR5 en los tejidos se puede estudiar con los métodos inmunohistológicos clásicos. (Jalkanen, M. et al . , J. Cell. Biol. 101:916-985 (1985); Jalkanen, M. et al. , Cell. Biol. 105:3081-3096 (1987)) . Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión del gen de la proteina BR5 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (Elisa) y el radioinmunoensayo (RÍA) . Las marcas o etiquetas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen las etiquetas de enzima, tales como la oxidasa de glucosa, radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), Carbono (1 C) , azufre (35S), tritium(3H), Indium (112In) y tecnetio ( 99mTc ) y las etiquetas fluorescentes tales como fluoresceina y rodamina y biotina.

Inhaladura terap utica Se conoce que los ligandos de la familia del factor de necrosis de tumor (TNF) están entre las citocinas más pleyotrópicas , que inducen un -gran numero de respuestas celulares, que incluyen citotoxicidad, actividad antiviral, actividades inmunorreguladoras y la regulación trancripcional de varios genes (Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrisis Factors : Gene Structure and Biological Activities", Symp . Quan t . Bi ol . 51 : 591 - 609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler B., y Cerami, A . , Ann u . Rev. Bi och em . 57:505-518 (1988); Oíd, L.J., Sci . , Am . 258:59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Let t . 285:199-224 (1991)) . Los ligandos de la familia TNF inducen tales respuestas celulares mediante el enlace a los receptores de la familia TNF, que incluyen el DR5 de la presente invención. Las células que expresan el polipéptido DR5 se cree que tienen una respuesta celular potente hacia los ligandos DR5 que incluyen las células dendriticas primarias, tejido endotelial, baso, leucemia linfocítica crónica y células del estroma del timo humano. Mediante "una respuesta celular a un ligando de la familia TNF" se indica cualquier cambio genotipico, fenotípico/o morfológico, a una célula, linea celular, tejido, cultivo de tejido o paciente que es inducido mediante un ligando de la familia TNF. Como se indico tales respuestas celulares incluyen no solamente respuesta fisiológica normales a los ligandos de la familia TNF sino también padecimientos asociados con la apoptosis incrementada, o ala inhibición de la apoptosis. La apoptosis (muerte celular programada) es un mecanismo fisiológico implicado en la eliminación de los linfocitos T periféricos del sistema inmune y su desrregulación puede llevar a un número de diferentes procesos patogénicos (Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213 (1994); Kra mer, P.H., et al . , Curr . Opi n . Immunol . 6 : 2 1 9 - 289 (1994) ) . Los padecimientos asociados con la sobrevivencia incrementada de las células o la inhibición de la apoptosis, incluye cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas, conmutaciones T53 y tumores dependientes de la hormona, tales como cáncer del seno, cáncer del próstata, sarcoma de caposi y cáncer de ovarios); padecimientos autoinmunes (tales como lupus eritematoso cistémico, artritis reumatoide, glomerulonefritis relacionado al sistema inmune) e infecciones virales (virus herpes, virus de la viruela, y adenovirus), inflamación; padecimiento de injerto contra huésped, rechazo agudo del injerto y rechazo crónico del injerto. Los padecimientos asociados con la apoptosis incrementada incluyen sida; padecimientos neurodegenerativos (tales como el padecimiento de Alzhaimer, padecimiento de Parkinson, esclerosis lateral amiotrópica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar) ; síndromes miolodisplásticos (tales como anemia aplástica) daño esquémico (tales como aquél causado por el infarto al miocardio, golpe y daño de reperfusión) , enfermedad del hígado inducida por toximad (tal como aquella causada por el alcohol), golpe séptico, caquexia y anorexia. Asi, en un aspecto de la presente invención, se dirige a un método para incrementar la apoptosis inducida por un ligando de la familia del TNF, el cual involucra la administración a un célula la cual expresa al polipéptido DR5 una cantidad efectiva de un ligando DR5, análogo o un agonista capaz de incrementar a señalización mediada de DR5. Preferiblemente, la señalización mediada de DR se incrementa para tratar un padecimiento donde la apoptosis disminuye o la citocina disminuye y se presenta la expresión de la molécula de adhesión. Un agonista puede incluir formas solubles de DR5 y anticuerpos monoclonares dirigidos contra el polipéptido DR5. En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a un método para inhibir la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, el cual involucra la administración a una célula la cual expresa el polipéptido DR5, una cantidad efectiva de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada de DR5. Preferiblemente, la señalización mediada de DR5 disminuye para tratar un padecimiento donde se muestra la apoptosis incrementada de la expresión NFkB . Un antagonista puede incluir formas solubles de DR5 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido DR5. Por "agonista" se indican compuestos sintéticos que ocurren naturalmente capaces de incrementar o potenciar la apoptosisi. Por "antagonista" se indican compuestos que ocurren naturalmente o sintéticos capaces de inhibir la apoptosis. Si cualquier candidato "agonista" o "antagonista" de la presente invención, puede incrementar o inhibir la apoptosis, se pude determinar usando ensayos de respuesta celular de la familia TNF del ligando/ receptor conocida en la técnica, que incluye aquellas descritas en más detalle abajo. Un procedimiento de selección tal involucra el uso de melanofores que son transfectados para expresar el receptor de la presente invención. Tal técnica de selección está descrita en el Documento PCT WO 92/01810, publicado el 6 de Febrero de 1992. Tal ensayo puede ser empleado, por ejemplo, para la selección de un compuesto el cual inhibe (o incrementa) la activación del polipéptido receptor de la presente invención haciendo contacto de las células melanóforas las cuales codifican al receptor con ya sea un ligando de la familia del TNF y el antagonista candidato (o agonista) . La inhibición o incremento de la señal generada por el ligando indica que el compuesto es un antagonista o agonista de la via de señalización el ligando/receptor. Otras técnicas de selección incluyen el uso de células las cuales expresan al receptor (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema con cambios de pH extracelular medidos causados por la activación del receptor. Por ejemplo, los compuesto se pueden poner en contacto con una célula la cual expresa el polipéptido del receptor de la presente invención y una segunda respuesta mensajera, por ejemplo, la transducción de la señal o los cambios de pH, pueden medirse para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe al receptor.

Otra técnica de tal selección involucra la introducción del ARN que codifica al receptor en oocitos Xenopus para expresar temporalmente al receptor. Los oocitos del receptor pueden entonces ponerse en contacto con el ligando receptor y un compuesto a ser seleccionado, seguido por la eliminación de la inhibición o activación de una señal de calcio en el caso de la selección de compuestos que quizás, inhiban la activación del receptor. Otra técnica de selección involucra la expresión en células de un constructo, donde el receptor está unido a una fosfolipasa C o D. Tales células incluyen células endoteliales, células del músculo liso, células embrióticas del riñon, etc. La selección se puede abarcar como se describe aqui anteriormente por la detección de la activación del receptor o inhibición de la activación del receptor a partir de la señal de fosfolipasa. Otro método involucra la selección de compuestos (antagonistas) los cuales inhiben la activación el polipéptido receptor de la presente invención mediante la determinación de la inhibición del ligando etiquetado a las células las cuales tienen el receptor en la superficie del mismo. Tal método involucra la transfectación de células eucarióticas con ADN que codifica al receptor de manera tal que la célula expresa al receptor en su superficie y se pone en contacto con la célula con un compuesto en la presencia de una forma etiquetada de un ligando conocido. El ligando puede ser etiquetado, por ejemplo, por radioactividad. La cantidad del ligando etiquetado unido al receptor es medida por ejemplo, por la radioactiviad de la medición de los receptores. Si el compuesto se une al receptor como se determina por una reducción del ligando etiquetado el cual enlaza a los receptores, el enlace del ligando etiquetado al receptor se inhibe. Ensayos de selección adicionales para agonistas y antagonistas de la presente invención, se describen en Tartaglia, L.A., y Goeddel, D.V., J. Bol . Ch em . 257:4304-4307(1992) . Así, en un aspecto adicional, un método de selección se proporciona para determinar si un candidato agonista o antagonista es capaz de incrementar o inhibir una respuesta celular a un ligando de la familia del TNF. El método involucra poner en contacto las células las cuales expresan el polipéptido DR5 con un compuesto candidato y un ligando de la familia TNF, ensayando una respuesta celular, y compartiendo la respuesta celular a una respuesta celular estándar, el estándar es ensayado cuando se hace contacto con el ligando en la ausencia de un compuesto candidato, con ello una respuesta celular se incrementa sobre el estándar, que indica que el compuesto candidato es un agonista de la vía se señalización del ligando/receptor y una respuesta celular disminuía comparada con el estándar indica que el compuesto candidato es un antagonista de la via de señalización del ligando/ receptor. Mediante "ensayo de una respuesta celular" se indica una medición cualitativamente o cuantitativamente de una respuesta celular a un compuesto candidato y/o un ligando de la familia TNF (por ejemplo, determinando o estimando un incremento o disminución en la proliferación de las células T o marcados de timidina triados) . Mediante la invención, una célula que expresa el polipéptido DR5 puede ponerse en contacto con un ligando de la familia TNF administrado endógenamente o exó genamente . El agonista de acuerdo con la presente invención incluye compuestos que ocurren de manera natural y compuestos sintéticos tal como, por ejemplo, fragmentos péptidos del ligando de la familia del TNF, factor de crecimiento de transformación, neuro transmisores (tal como glutamato, dopamina, N-meti 1-D-aspartato ) , supresores del tumor (p53) células T citoliticas y antimetabolitos. Los agonistas preferidos incluyen fármacos quimioterapéuticos tal como por ejemplo, ciplatina, doxorubicina, bleomicina, citosina, arabinosida, mostaza de nitrógeno, metotrexato y vincristita. Otros péptidos incluyen etanol y amiloide (Science 267:1457-1458 (1995)) . Agonistas adicionales preferidos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales superiores contra el polipéptido DR5, o un fragmento del mismo, Tales anticuerpos agonistas elevados contra un receptor de la Familia TNF están descritos en Tartaglia, L.A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:9292-9296 (1991); y Tartaglia L.A., y Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267 ( 7 ): 4304-4307 (1992) Ver también, Solicitud PCT WO94/09137. Loa antagonistas de conformidad con la presente invención incluyen compuestos sintéticos y que ocurren de manera natural tal como, por ejemplo, el ligando CD40, aminoácidos neutrales, zinc, estrógeno, andrógeno, genes virales (tal como Adenovirus ElB, Baculovirus p35 y IAP, virus Vacuna crmA, virus Epstein-Bar NHRF1, LMP-1, virus de la fiebre porcina africana LMW5-HL, y virus del herpes yl 34.5), inhibidores de calpaina, inhibidores de la proteasa cisteína, y promotores del tumor (tal como PMA, Phenobarbital , y alfa Hexaclorciclohexano ) . Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. La tecnología antisentido puede ser usada para el control de la expresión del gen a través de los antisentidos ADN o ARN o através de la formación de triple hélice. Las técnica antisentido son discutidas por ejemplo en Okano, J. Neuroche. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press. Boca Ratón, FL (19889. La formación de triple hélice de discute en por ejemplo Lee et al . , Nucl ei c Aci ds Res ea rch 6:3073 (1979); Cooney et al . , Sci en ce 241 : 4 65 (1988); y Dervan et al . , Sci ence 251 : 13 60 (1991) Los métodos están basados en el enlace de un polinucleótido a un ADN o RNA complementario. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de un polinucleótido que codifica al polipétido maduro de la presente invención puede ser usado para diseñar un oligonucleótido RNA desde aproximadamente 10 hasta 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN está diseñado para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción, con ello previene la transcripción y la producción del receptor. El oligonucleótido ARN antisentido hibridiza al ARNm in vivo, y bloquea la traducción de la molécula de RNAm en el polipéptido receptor. En una modalidad, el ácido nucleico antisentido DR5 de la invención se produce intracelularmente por la transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo, se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de la invención. Tal vector puede permanecer episomal o llegar a integrarse cromosomalmente, tan amplia como se transcriba para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores puede ser construidos mediante métodos de tecnología de ADN recombinante estándares a la técnica. Los vectores pueden ser plasmidos virales, u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica al DR5, o fragmento del mismo, puede ser cualquier promotor conocido en la técnica para activarse en vertebrados, preferiblemente células humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o un constitutivo. Tales promotores incluyen, pero no están limitados a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambón, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal prolongada 3' del virus del sarcoma Rous (Yamamoto et al . , Cel l 22 : 1 81 - 1 91 (1980), el promotor de la timidina del herpes (Wagner et al . , Proc . Na ti . Aca d. Sci . U.S. A. 78:1441-1445 (1981), las secuencias reguladoras del gen de metal.otioneina (Brinster, et al . , Na t ura 296:39-42 (1982) ) , etc. Los ácidos nucleicos antisentidos de la invención comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de un ARN transcripto de un gen DR5. Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque preferida, no se requiere. Una secuencia "complementaria de al menos una porción de un ARN", referida aquí, sugiere una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridizarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de los ácidos nucleicos antisentido DR5 de doble hebra, una sola hebra del ADN dúplex, puede ser ensayada, o puede ser ensayada una formación tripexo. La capacidad para hibridizar dependerá de ya sea el grado de complementariedad y la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, el mayor ácido nucleico de hibridización, la base más desigual con un ARN de DR5 puede contener y aún, formar un duplexo estable (o triplexo como sea el caso) . Un experto en la técnica podrá considerar un grado tolerable de desigualdad por el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado . Los antagonistas potenciales de conformidad con la invención también incluyen ARN catalítico o una ribozima (Ver, por ejemplo, PCT Publicación internacional WO/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et al, Science 247:1222-1225 (1990) . Mientras las ribozomas que escinden el ARNm a unas secuencias de reconocimiento de sitio especifico pueden ser usadas para destruir el sANRm, el uso de ribozomas cabeza de martillo son preferidas. Las ribozomas cabeza de martillo escinden el sARNm a los sitos dictados por regiones flanqueada que forman los pares de bases complementarias con ARNm objetivo. El único requerimiento es que el gen ARNm objetivo tiene la siguiente secuencia de dos bases: 5'UG-3' . La construcción y producción de las ribozomas cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describe en más detalle completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334:585-591 (1988), Hay numerosos sitios de escisión de ribozima cabeza de martillo con la secuencia nucleótida de DR5 (Figura 1) . De manera preferible, la ribozima está diseñada de manera que el sitio de reconocimiento de escisión está localizado cerca del extremo 5' del ARNm del DR5, es decir, incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcriptos mRNA no funcionales. Los constructos ADN que codifican la ribozima pueden ser introducidos en la célula de la misma manera como se describe anteriormente para la introducción de ADN que codifica el antisentido. Puesto que los ribozomas, las moléculas antisentido diferentes, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular inferior para su eficiencia. Los antagonistas adicionales a la presente invención incluyen formas solubles de DR5, es decir, fragmentos DR5 que incluyen el dominio de enlace del lingado de la región extracelular del receptor de longitud completa. Tales formas solubles del receptor, el cual puede ser sintético u ocurrir de manera natural, la señalización mediada de DR5 antagoniza por la competencia con la superficie celular de DR5 para enlazar a los ligandos de la familia del TNF. Asi, las formas solubles del receptor que incluyen el dominio de enlace del ligando son nuevas citocinas capaces de inhibir la apoptosis inducida por los ligandos de la familia TNF. Estas se pueden expresar como monómeros, pero, son preferiblemente expresadas como dímeros o trímeros, puesto que han sido mostrados por ser superiores a las formas onoméricas del receptor soluble como antagonistas, por ejemplo, las fusiones de la familia del receptor IgGFc-TNF. Otras citocinas son conocidas en la técnica e incluyen la forma soluble Fas B (una forma soluble del receptor Fas de ratón) que actúa fisiológicamente para limitar la apoptosis inducida por el ligando Fas (Hughes, D.P. y Crispe, I.N., J. Exp . Med . 182:1395-1401 (1995)) . El término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Abm) como se usó aqui se sugiere para incluir moléculas intactas asi también como fragmentos del mismo (tal como, por ejemplo fragmentos Fab, y F(ab')2), los cuales son capaces de enlazar un antígeno. Los fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, claramente más rápido de la circulación, y pueden tener menos enlace de tejido no especifico de un anticuerpo intacto (Wahl et al . , J. Nucí . Med . 24 : 316-325 (1983) ) . Los anticuerpos de acuerdo a la presente invención pueden ser preparados por alguna variedad de métodos estándares que usan inmunogenes de DR5 de la presente invención. Como se indicó, tales inmunogenes DR5 incluyen la longitud completa del polipéptido DR5 (el cual puede o no puede incluir la secuencia lider) y los fragmentos del polipéptido DR5 tal como el dominio de enlace del ligando, el domino de la transmembrana, el dominio intracelular y el domino de muerte. Los anticuerpos de la invención pueden ser usados en métodos conocidos en la técnica relacionada a la localización y actividad de las secuencias de polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, para la imaginación de estos polipéptidos, la medición de niveles del mismo, en muestras fisiológicas apropiadas, etc. Los anticuerpos pueden también usarse en un inmunoensayos y en terapéuticos como agonistas y antagonistaas de DR5.

Las proteínas y otros compuestos lo cuales enlazan los dominios de DR5 ton también agonistas candidatos de conformidad con la presente invención. Tales compuestos de unión pueden ser "capturados" usando el sistema de dos híbridos de levaduras (Fields, and Song, Natura 340:245-246 (1989)). Una versión modificada del sistema de dos híbridos se ha descrito por Roger Brent y sus colegas (Gyuris, J. et al., Cell 75:791-803 (1993); Zervos, A.S., et al., Cell 72:223-232 (1993)). Preferiblemente, el sistema de dos híbridos de levaduras se usa de conformidad con la presente invención para capturar compuestos los cuales se unen a su domino de unión del ligando DR5 o al dominio intracelular DR5. Tales compuestos son buenos candidatos agonistas y antagonistas de la presente invención. Mediante un "ligando de la familia TNF", se indica que los ligandos ocurren de manera natural, recombinante y sintética que con capaces de enlazar a un miembro de la familia del receptor TNF e inducir la vía de señalización del ligando/receptor. Los miembros de la familia del ligando TNF incluye, pero no están limitados a ligandos DR5, TRAIL, TNF-a, linfotoxina-a (LT-a, también conocida como TNF-ß) , LT-ß (encontrado en el complejo heterotrímero LT-a2-ß) , FasL; CD40, CD27, CD30, 4-IBB, 0X40 y el factor del crecimiento nervioso (NGF) . Un ejemplo de un ensayo que puede realizarse para determinar la capacidad del DR5 y sus derivados (incluyendo fragmentos) y análogos del mismo para unir al TRAIL, se describen abajo en el Ejemplo 6. Las aplicaciones terapéuticas representativas de la presente invención se discuten en más detalle abajo. El estado de inmunodeficiencia que define al SIDA, es secundario a una disminución en el número y función de los linfocitos T CD4+. Reportes recientes estiman la pérdida diaria de células T CD4+ por ser entre 3.5 X 107 y 2 X 109 células (Wei X. Et al . , Nature 373: 111-122 (1995) ) . Una causa de la reducción de las células T CD4+ en la serie de infecciones del VIH se cree por ser VIH inducida por apoptosis. Verdaderamente, la muerte celular del VIH inducida por la apoptosis se ha demostrado solamente in vitro, pero también, más importantemente, en individuos infectados (Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213 (1994); Finkel, T.H., y Banda, N.K., Curr. Opin . Immunol . 6: 605-615 (1995); Muro-Caho, C.A., et al . , J. Immunol , 154 : 5555-5566 (1995)). Además, la disminución de la apoptosis y los linfocitos T CD4+ será fuertemente correlacionada en modelos de animales diferentes del SIDA (Brunner, T . , et al . , Nature 373 : 441-444 (1995); Gougeno, M.L., et al . , AIDS Res . Hum. Retroviruses 5:553-563 (1993)) y, no se observa la apoptosis en aquellos modelos de animales en los cuales la replicación viral no resulta en SIDA (Gougeon, M.L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)). Los datos adicionales indican que los linfocitos no infectados pero T activados o cebados de individuos infectados con VIH se someten a apoptosis después del encuentro del ligando FasL de la familia TNF. Usando las líneas celulares monocíticas que resultan en la muerte después de la infección con VIH, se ha demostrado que la infección de las células U937 con VIH resulta en la expresión de novo del FasL y que el FasL media la apoptosis inducida por el VIH (Badley, A.D. et al . , J. Virol 70:199-206 (1996)). Además, el ligando de la familia TNF es detectable en macrófagos no infectados y su expresión está sobre regulada después de la infección con VIH que resultan en la muerte selectiva de los linfocitos T CD4 no infectados (Badley, A.D. et al . , J. Virol 70:199-206 (1996)). Así, por medio de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de individuos VIH+, el cual involucra la administración de un antagonista de la presente invención para reducir la muerte selectiva de los linfocitos T CD4. Los modos de administración y las dosificaciones serán discutidos en detalle más adelante. En el rechazo de un aloinjerto, el sistema inmune del recipiente animal no ha sido previamente cebado para responder, debido a que el sistema inmune para la mayor parte es solamente cebado por los antígenos ambientales.

Los tejidos de otros miembros de las mismas especies no han sido presentados en la misma forma en la que, por ejemplo, los virus y bacterias se han presentado. En el caso del rechazo al aloinjerto, los regímenes inmunosupresivos están diseñados para prevenir al sistema inmune del rechazo del estado efector. Sin embargo, el perfil inmune del rechazo xenografto o xenoinjertos puede parecerse a enfermedades o padecimientos repetitivos más que al rechazo del injerto. En el caso de los padecimientos repetitivos, el sistema inmune, ya ha sido activado, como evidencia mediante la destrucción de las células aisladas nativas. Por lo tanto, en los padecimientos repetitivos, el sistema inmune está ya en el estado efector. Los agonistas de la presente invención son capaces de suprimir la respuesta inmune a ambos injertos y xenoinjertos debido a que los linfocitos se activan y diferencian en las células efectoras, expresarán al polipéptido DR5, y con ello son susceptibles a los compuestos lo cuales mejoran la apoptosis. Así, la presente invención además proporciona un método para la creación de tejidos inmune privilegiados. Los antagonistas DR5 pueden ser empleados para el tratamiento de padecimientos inflamatorios, tales como artritis rehumatoidea, osteoastritis, soriasis, septicemina y padecimiento inflamatorio de los intestinos. Además, debido a la expresión del linfoblasto del DR5, agonista o antagonista DR5 soluble, se puede usar mABs para tratar esta forma de cáncer. Además, el DR5 soluble o mABs neutralizante se puede usar para tratar varias formas agudas y crónicas de inflamación, tal como artritis rehumatoide, osteoartritis, soriasis, septicemia, y padecimiento inflamatorio del intestino.

Modos de Administración Los agonistas o antagonistas descritos aquí, pueden ser administrados in vi tro, ex vivo, o in vivo a las células las cuales expresan el receptor de la presente invención. Mediante la administración de "una cantidad efectiva" de un agonista o antagonista, se pretende una cantidad del compuesto que es suficiente para incrementar o inhibir la respuesta celular a un ligando de la familia TNF y que incluye polipéptidos. En particular, por la administración de una "cantidad efectiva" de un agonista o antagonista se pretende una cantidad efectiva para incrementar o inhibr la apoptosis mediada por DR5. Por su puesto, cuando se desea incrementar la apoptosis, se puede co-administrar un agonista de conformidad con la presente invención, con un ligando de la familia-TNF. Un experto en la técnica apreciará que las cantidades efectivas de un agonista o antagonista se pueden determinar empíricamente y pueden ser empleadas en la forma pura o en una sal farmacéuticamente aceptable, éster o forma de profármaco. El agonista o antagonista puede ser administrado en composiciones en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (es decir, portadores) . • Se entenderá que, cuando se administra a un paciente humano, la dosificación diaria total de los compuestos y composiciones de la presente invención se decidirán por la atención médica dentro del ámbito del juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente efectiva específico para cualquier paciente particular, dependerá de factores bien conocidos en la técnica médica. Como una proposición general, la cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido DR5 administrada parenteralmente por dosis, será en el rango de aproximadamente 1 µg/kh/día hasta 10 mg/kg/día del peso corporal del paciente, a pesar de que como se notó anteriormente, este será sujeto a discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 0.01 mg/kg/día, y más preferiblemente para humanos entre aproximadamente 0.01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se da continuamente, los agonistas o antagonistas DR5 son administrados típicamente a una proporción de dosis de aproximadamente 1 µg/kg/hora hasta aproximadamente 50 µg/kg/hora, ya sea de 1-4 inyecciones por día o por infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una mini bomba. Una solución en bolsa intravenosa puede también ser empleada. La dosificación puede también ser arreglada en un paciente de manera específica para proporcionar una concentración predeterminada de un agonista o antagonista en la sangre, como la determinada por la técnica RÍA. Así la dosificación del paciente puede ajustarse para alcanzar los niveles de la sangre regulares, como los medidos por RÍA, en el orden desde 50 hasta 1000 ng/ml, preferiblemente 150 hasta 500 ng/ml. Se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista o antagonista (que incluye los polinucleótidos DR5 y los polipéptidos de la invención) y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser administrado oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (como polvos, ungüentos, gotas o parches transdérmicos), bucalmente, o como un atomizador oral o nasal. De manera importante, por la coadministración de un agonista y un ligando de la familia TNF, los efectos colaterales clínicos pueden reducirse mediante el uso de dosis bajas de los ligandos y del agonista. Se entenderá que el agonista puede ser "co-administrado" ya sea antes, después o simultáneamente con el ligando de la familia TNF, dependiendo de las exigencias de una aplicación terapéutica particular, Por "portador farmacéuticamente aceptable" se sugiere un material encapsulante, diluyente rellenador sólido no tóxico, semisólido o líquido o para formulación auxiliar y de cualquier tipo. En una modalidad específica "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno estatal o federal o listado en la Pharmacopeia U,S u otra pharmacopeia reconocida de manera general para uso en animales, y más particularmente humano. Se proporcionan ejemplos no limitativos de los portadores farmacéuticos adecuados de conformidad con esta modalidad en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W Martin, e incluyen líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y los similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica es administrada intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerales acuosas pueden ser empleadas como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. El término "parenteral" como se usó aquí, se refiere a modos de administración los cuales incluyen intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutánea e inyección intraarticular e infusión. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para inyección parenteral, pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, así también como polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de usarse. Además, para los polipéptidos DR5, el polipéptido DR5 que contiene la región de transme brana puede también ser usado cuando se solubiliza apropiadamente incluyendo detergentes, tales como CHAPS o NP-40, con amortiguador.

Ensayos de Cromosomas Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son también valuables para la identificación de cromosomas. La secuencia es específicamente objetivo y puede hibidrizar con un sitio particular en un cromosoma humano individual . La formación de mapas de ADNs a los cromosomas de conformidad con la presente invención es una primera etapa importante en la correlación de aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. En ciertas modalidades preferidas en este sentido, los polinucleotidos y/o el ADNc aquí descritos, se usan para clonar el ADN genómico de un gen DR5. Este puede estar abarcado usando una variedad de técnicas y genotecas bien conocidas, las cuales en general, están comercialmente disponibles. El ADN genómico se usa entonces para la formación de mapas de cromosomas in si tu, usando técnicas bien conocidas para este propósito. Además, las secuencias se pueden formar en mapas para los cromosomas mediante la preparación de cebadores PCR (preferiblemente 15-25 bp) a partir del ADNc. El análisis en computadora de la región 3' no traducida del gen, se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no abarcan más de un exon en el ADN genómico, así se complica el proceso de amplificación. Estos cebadores son entonces usados para la selección de PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. La hibridación in si tu con florescencia ("FISH") de un clon de ADNc a una extensión de metafase cromosomal puede ser usada para proporcionar un sitio cromosomal preciso en una etapa. Esta técnica puede ser usada con un ADNc tan corto como de 50 o 60 bp. Para una revisión de esta técnica, ver et al . , Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques . Pergamon Press, New York (1988) . Una vez que se ha formado un mapa de una secuencia para un sitio cromosomal preciso, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran por ejemplo en, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en la línea a través de Johns Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre los genes y las enfermedades que han formado mapas para la misma región cromosomal, son entonces identificados a través del análisis del enlace (herencia en común de los genes físicamente adyacentes) . Después, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o en la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en el mismo o en todos los individuos afectados pero no en algunos individuos normales, entonces, la mutación es parecida por ser el agente que da origen a la enfermedad. Habiendo descrito de manera general la invención, la misma será más fácilmente entendida por los siguientes ejemplos de referencia, los cuales están proporcionados a manera de ilustración y no están pensados como limitantes.

EJEMPLO 1 Expresión y Purificación en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica a la proteína DR5 madura, en el clon ADNc depositado (ATCC No. 97920) es amplificada usando cebadores de oligonucleótidos PCR específicos a las secuencias aminoterminal de la proteína DR5 y a las secuencias 3' del vector al gen. De manera adicional, los sitios de restricción que contienen nucleótidos para facilitar la clonación, se agregan a las secuencias 5' y 3' respectivamente. Los siguientes cebadores son usados para la expresión del dominio extracelular DR5 en E. coli : El cebador 5' tiene la secuencia 5' -CGCCCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3' (SEC ID NO: 8) y contiene el sitio Ncol subrayado; y el cebador 3' tiene la secuencia 5'-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3' (SEC ID NO: 9) y contiene el sitio HindIII subrayado. Los sitios restricción son convenientes a los sitios de la enzima de restricción en la expresión bacterial del vector pQE60, los cuales son usados para la expresión bacterial en este ejemplo. (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth; C.A 91311), la resistencia al antibiótico penicilina que codifica al pQE60 ("Amp") y contiene un origen bacterial de replicación ("ori"), un promotor inducible IPTG, y un sitio de enlace de ribosoma ("RBS") . El ADN de DR5 amplificado y el vector pQE60 ambos son digeridos con Ncol y HindIII y los ADNs diferidos son entonces ligados a los otros. La inserción de la proteína de ADN del DR5 en el lugar vector pQE60 restringido de la proteína de DR5 corriente abajo de la región que codifica de y une operablemente a los vectores promotor inducible IPTG y en estructura con un AUG de iniciación colocados apropiadamente para la traducción de la proteína DR5. La mezcla de ligación se transforma en células E. coli competentes que usan procedimientos estándares. Tales procedimientos están descritos en Sambrook et al . , Molecular Clonign : a Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989). La cepa E. Coli M15/rep4, que contiene múltiples copias del plasmido pREP4, el cual expresa el represor lac y confiere resistencia a la canamicina ("Kan"), se usa al realizar el ejemplo ilustrativo aquí. Esta cepa, la cual es solamente una de las muchas que son adecuadas para la proteína DR5 que expresa. Esta cepa, la cual es solamente una de las muchas que son adecuadas para que se exprese la proteína DR5, está comercialmente disponible de Quiagen, supra . Los transformantes son identificados por su capacidad para crecer en placas LB en la presencia de ampicilina y canamicina. El plasmido ADN se aisla de las colonias resistente y la identidad del ADN clonado se confirma por análisis de restricción, PCR, y secuenciación ADN. Los clones que contienen los contructos deseados crecen durante la noche ("0/N") en un cultivo líquido en un medio LB complementado con ya sea ampicilina (100 µg/ml) y canamicina (25 µg/ml) . El cultivo O/N se usa para inocular un gran cultivo, a una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:250. Las células crecen a una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0.4 y 0.6. Se agrega entonces Isopropil-B-D-tiogalactopiranoside ("IPTG") para una concentración final de 1 mM para inducir la transcripción de los promotores sensibles al represor lac, mediante la activación del represor lacl . Las células son subsecuentemente incubadas adicionalmente por 3 a 4 horas. Las células entonces se cosecharon por centrifugación y fueron sometidas a disrupción, por métodos estándares. Los cuerpos de inclusión se purificaron de las células sometidas a disrupción usando técnicas rutinarias de colección, y la proteína se solubiliza de los cuerpos de inclusión en 8M de urea. La solución de 8M de urea que contiene la proteína solubilizada se pasa sobre una columna PD-10 en salina de fosfato amortiguada 2X ("PBS"), con ello se elimina la urea, intercambiando el amortiguador y repartiendo la proteína. La proteína se purifica por una etapa adiciona de cromatografía para remover la endotoxina. Entonces, se filtra estéril. La preparación de la proteina filtrada estéril se almacena en PBS 2X a una concentración de 96 µl/ml.

EJ?MPLO 2 Expresión en células de mamíferos Un vector de expresión de mamíferos típico que contiene el elemento promotor, el cual media la inciación de la transcripción de RNAm, la secuencia que codifica la proteína, y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación del transcripto. Los elementos adicionales incluyen incrementadores, secuencias Kozak y secuencias que intervienen flanqueadas por sitios de donador y un aceptor para el deslizamiento del ARN. La transcripción altamente eficiente puede realizarse con los promotores tempranos y tardíos de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRs) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV) . Sin embargo, las señales celulares pueden también ser usadas (por ejemplo, el promotor de actina humana) . Los vectores de expresión adecuados para usar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC67109) . Las células huésped de mamíferos que podrán ser usadas incluyen, las células Hela 293 humana, H9 y Jurkat, células NHT3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CVI, células QC1-3 quail, células L de ratón y células de ovario de hámster Chino (CHO) . Alternativamente, el gen de interés puede expresarse en líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador selectivo tal como dhfr, gpt, neomicina, hidromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El gen transfectado puede también amplificarse para expresar grandes cantidades de la proteína que codifica. El marcador reductasa dihidrofolata (DHFR) es empleada para desarrollar líneas celulares que lleven varios cientos o aún varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección empleado es la enzima sintasa glutamina (GS) (Murphy eü al . , Bioche. J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al . , Bio/Technology 10: 169-115 (1992)). Usando estos marcadores, las células de mamíferos crecen en un medio selectivo y se seleccionan las células con alta resistencia. Estas líneas celulares contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) son a menudo usadas para la producción de proteínas.

Los vectores de expresión pCL y pC4 que contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma Rous (Cullen et al . , Molecular and Celluar Biology 5:438-447 (March 1985)), más un fragmento del incrementador CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiples, por ejemplo con los sitios de ecsición de la enzima de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores que contienen además el intrón 3' , la señal de poliadenilación y terminación del gen prepropinsulina de rata.

Clonación y Expresión en Células CHO El vector pC4 se usa para la expresión del polipéptido DR5. El plasmido pC4 es un derivado del plasmido pSV2-dhfr (ATCC acceso No. 37146) . El plasmido que contiene el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano SV40. El ovario de hámster Chino u otras células carecen de actividad dihidrofolato que son transfectados con estos plasmidos, pueden ser seleccionados por el crecimiento de las células en un medio selectivo (alfa menos MEM, Lie Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato (MTX) . La amplificación de los genes DHFR en las células resistentes al metotrexato (MTX) han sido bien documentadas (ver por ejemplo, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J. R., y Schimke, R.T., J. Biol . Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma, C, Biochem. et Biophys Acta 1097:107-143 (1990); Page, M. J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las células crecieron en concentraciones aumentadas de resistencia MTX desarrollada al fármaco por la sobre producción de la enzima objetivo, DHFR, como un resultado de la amplificación del gen DHFR. Si un segundo gen se une al gen DHFR, este usualmente se co-amplifica y sobre expresa. Se conoce en la técnica que esta aproximación puede ser usada para desarrollar líneas celulares que lleven más de 1,000 copias del gen o genes amplificados. Subsecuentemente, cuando el metotrexado se elimina, las líneas celulares obtenidas contendrán el gen amplificado integrado en uno o más cromosomas de la célula huésped. El plasmido pC4 contiene, para la expresión del gen de interés, el promotor fuerte de la repetición terminal prolongada (LTR) del virus del Sarcoma Rous (Cullen et al . , Molecular and Cellular Biology 5:438-447 (Marzo 1985), más un fragmento aislado del incrementador del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Corriente abajo del promotor, están los siguientes sitios de ecsición de una sola enzima de restricción que permite la integración de los genes: BamHI, Xba I, y Asp718. Detrás de estos sitios de clonación el plasmído contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen preproinsulina de rata. Otros promotores altamente eficiente pueden también ser usados para la expresión, por ejemplo, del promotor ß-actina humano, los promotores tempranos o tardío SV40, o las repeticiones terminales prolongadas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH, y HTLVI, sistemas de expresión del gen Clontech Tet-OFF y Tet-On y sistemas similares pueden ser usados para expresar el polipéptido DR5 en una forma regulada mediante células de mamíferos (Grossen, M., & Bujard, H., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:5547-5551 (1992). Para la poliadenilación del ARNm, otras señales, por ejemplo, de la hormona de crecimiento humana o los genes globina, se pueden usar también. Las líneas celulares estables que llevan un gen de interés integrado en los cromosomas pueden también seleccionarse sobre la co-transfección con un marcador selectivo tal como gpt, G418, o hidromicina. Es ventajoso usar más de un marcado selectivo en el comienzo, por ejemplo G418 más metotrexato. El plasmido pC4 es digerido con la enzima de restricción BamHi y después desfosforilado usando fosfatos intestinales de ternera por procedimientos conocidos en la técnica. El vector es entonces aislado de un gel de agarosa al 1%.

La secuencia ADN que codifica el polipéptido completo se amplifica usando los cebadores oligonucleótidos PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' de la porción deseada del gen. El cebador 5' que contiene el sitio BamHI subrayado, una secuencia Kozak, y un codon inicial AUG, tiene la siguiente secuencia: 5' -CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEC ID NO: 10). El cebador 3', que contiene el sitio Asp718 subrayado, tiene la siguiente secuencia: 5'-CGCGGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3' (SEC ID NO: 11) . El fragmento ampliado es digerido con la endonucleasa BamHI y Asp718 y después purificado nuevamente en gel de agarosa al 1%. El fragmento asilado y el vector desfosforilado son entonces ligados con ligada ADN T4. Las células E. coli HB101 o XL-1 Blue son entonces transformadas y las bacterias son identificadas por contener el fragmento insertado en el plasmido pC4 usando, por ejemplo, análisis de enzima de restricción. Las células de ovario de Hámster Chino que carecen de un gen DHFR activo son usadas para la transfección. Se cotransfectan 5 µg del plasmido de expresión pC4 con 0.5 µg del plasmido pSV2-Neo usando el método lipofectina (Felgner et al., supra). El plasmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos que incluyen al G418. Las células son sembradas en MEM menos alfa suplementado con 1 mg/ml G418. Después de 2 días, las células son tripsínizadas y sembradas en placas que contiene hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM menos alfa suplementado con 10, 25 o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Después de aproximadamente 10-14 días, los clones individuales son tripsinizados y después sembrados en cajas de petri de 6 pozos o en matraces de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) . Los clones crecen a elevadas concentraciones de metotraxato y son entonces transferidas a nuevas placas de 6 pozos que contienen concentraciones aún superiores de metotrexato ( 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 mM, 20 nM) . El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen los clones, los cuales crecen a una concentración de 100-200 µM. La expresión del producto del gen deseado se analiza por ejemplo, mediante SDS-PAGE y manchado Western o mediante análisis de HPLC de fase inversa.

Clonación y Expresión en Células COS El plasmido de expresión pDR5-HA se hace mediante clonación de un ADNc que codifica al dominio extracelular de la proteína DR5 en el vector de expresión pcADNI/Amp p pcADNIII (el cual puede ser obtenido de Invitrogen, Inc) . El vector de expresión pcADNI/amp contiene: (1) un origen E. coli de replicación efectiva para la propagación en E. coli y otras células procarióticas; (2) un gen con resistencia a la ampicilina para la selección de células procarióticas que contienen plasmidos; (3) un origen SV40 y una señal de poliadenilación arreglada de manera que el ADNc puede ser convenientemente colocado bajo control de expresión del promotor CMV y enlazado operablemente al intron SV40 y a la señal de poliadenilación por medio de los sitios de restricción en el polienlazador. Un fragmento de ADN que codifica el dominio extracelular del polipéptido DR5 y un extremo HA fusionado en la estructura a su extremo 3' es clonada en la región polienlazadora del vector de manera que la expresión de la proteína recombinante se dirige por medio del promotor CMV. El extremo HA que corresponde a un epitope derivado de la proteína hemeglutinina de la influenza descrita por Wilson et al . , Cell 37: 161 (1984). La fusión del extremo HA a la proteína objetivo permite la fácil detección y la recuperación de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce al epitope HA. La estrategia de la construcción del plasmido es como sigue. El ADNc del DR5 del clon depositado es amplificado usando cebadores que contienen sitios de restricción convenientes, mejor descritos anteriormente para la construcción de vectores para la expresión de DR5 en E. coli . Para facilitar la detección, purificación y caracterización del DR5 expresado, uno de los cebadores que contiene un extremo de hemaglutinina (extremo "HA") como se describe anteriormente. Los cebadores adecuados incluyen los siguientes, los cuales son usados en este ejemplo. El cebador 5' que contiene el sitio BamHI subrayado tiene la siguiente secuencia: 5' -CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEC ID NO: 10). El cebador 3' , que contiene la secuencia de restricción Asp718 subrayada, tiene la siguiente secuencia: 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3' (SEC ID NO: 12) . El fragmento ADN amplificado de PCR y el vector, pcADNI/Amp, son digeridos con BamHI y Asp718 y después ligados. La mezcla de la ligación se transforma en cepas E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado es revestido en placas con medio de ampicilina, el cual es entonces incubado para permitir el crecimiento de las colonias resistentes a la ampicilina. El plasmido ADN es aislado de las colonias resistentes y examinado por análisis de restricción u otros medios para la presencia del fragmento que codifica el dominio extracelular del polipéptido DR5. Para la expresión del DR5 recombinante, las células COS son transfectadas con un vector de expresión, como se describe anteriormente, usando DEAE-DEXTRAN, como se describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual , Cold Spring Laboratoru Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) . Las células son incubadas bajo condiciones para la expresión de expresión de DR5 por el vector. La expresión de la proteína de fusión DR5-HA es detectada por radioetiquetado e inmunoprecipitación, usando los métodos descritos en, por ejemplo, Harlow et al . , Antibodies: A Labora tory Manual , 2nd Ed. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) . A este extremo, dos dias después de la transfección, las células son etiquetadas mediante incubación en un medio que contiene 35-S-cisteína por 8 horas. Las células y el medio son colectados, y las células son lavadas y sometidas a lisis con detergente que contiene amortiguador RIPA: 150 nM de NaCl, NP-40 al 1%, 0.1% SDS, NP-40 al 1%, DOC al 5%, TRIS 50 mM, pH 7.5, como se describe por Wilson et al., citado anteriormente. Las proteínas son precipitadas del lisado celular y del medio de cultivo usando un anticuerpo monoclonal HA específico.

Las proteínas precipitadas son entonces analizadas por SDS- PAGE y autorradiografiadas. Un producto de expresión del tamaño esperado es observado en el lisado celular, el cual no se observa en los controles negativos. El conjunto de cebadores usado para la expresión en este ejemplo son compatibles con pC4 usado para la expresión CHO en este ejemplo, pcADNI/Amp para la expresión COS en este ejemplo, y pA2 usado para la expresión del baculovirus en el siguiente ejemplo. Así, por ejemplo, el DR5 completo que codifica el fragmento amplificado para la expresión CHO podrá también ligarse en pcADNI/Amp para la expresión COS o pA2 por la expresión del baculovirus.

EJ?MPLO 3 Clonación y expresión del dominio extracelular soluble de OR3 en un sistema de expresión de baculovirus En este ejemplo ilustrativo, el vector pA2 que mueve al plasmido es usado para insertar el ADN clonado que codifica la proteína completa, incluyendo su secuencia de señal asociada de manera natural, en un baculovirus para expresar la proteína DR5, usando métodos estándares, tales como aquellos descritos en Summer et al . , A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insec Cell Cul ture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) . Este vector de expresión contiene el promotor polihedron fuerte del virus polihedrosis nuclear Autograph californica (ACMNPV) seguido por los sitios de restricción convenientes. Para una selección fácil del virus recombinante, el plasmido contiene el gen beta-galactosidasa de E. coli bajo control de un promotor Drosophila débil en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen polihedrina. Los genes insertados son flanqueados en ambos sitios por las secuencias virales por la recombinación homologa mediada por la célula con el ADN viral de tipo silvestre o nativo para generar virus viables que expresan el polinucleotido clonado. Muchos otros vectores de baculovirus podrán ser usados en la colocación de pA2, tal como pAc373, pVL941 y pAcIMl proporcionados, como un experto en la técnica podrá apreciar fácilmente, que la construcción proporciona señales localizadas apropiadamente para transcripción, traducción, secreción, y las similares, tales como en la estructura AUG y una señal peptídica como se requiera. Tales vectores son descritos, por ejemplo en Luckow et al . , Virology 170:31-39 (1989). La secuencia ADNc que codifica al dominio extracelular soluble de la proteína DR5 en el clon depositado (ATCC No. 97920) es amplificada usando cebadores de oligonucleótidos PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen: El cebador 5' para DR5 tiene la secuencia 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEC ID NO: 10) contiene el sitio de enzima de restricción BamHI subrayado. Insertado en un vector de expresión, como se describe abajo, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica a DR5 proporciona un péptido con señal de desdoblamiento o división eficiente. Una señal eficiente para la iniciación de la traducción en células eucarióticas, como se describe en Kozak, M . , J. Mol . Biol . 196:947-950 (1987) está localizada apropiadamente en la porción del vector del constructo. El cebador 3', para DR5 tiene la secuencia: 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3' (SEC ID NO: 12) contiene la restricción Asp718 subrayada seguida por los nucleotidos complementarios a la secuencia de nucleótidos DR5 en la Figura 1, seguido por el codón de detención. El fragmento amplificado se aisla a partir de gel de agarosa al 1% usando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 191 Inc., La Jolla, Ca.) El fragmento es entonces digerido con BamHI y Asp718 y nuevamente es purificado en gel de agarosa al 1%. Este fragmento es designado "Fl". El plasmido es digerido con las enzimas del sitio de restricción BamHI y Asp718 y opcionalmente pueden ser desfosforilados usando fosfatasa intestinal de ternera, usando procedimientos de rutina conocidos en la técnica. El ADN es entonces aislado a partir de gel de agarosa al 1% usando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc. La Jolla Ca.). El vector ADN es designado aquí "VI" . El fragmento Fl y el plasmido VI desfosforilado están ligados juntos con la ligasa T4 ADN. Las células C. coli HB101, u otras células huésped adecuadas E. coli, tales como las células XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) , son transformadas con la mezcla de ligación y expandidas en las placas de cultivos. Las bacterias son identificadas porque contienen el plasmido con el DR5 humano usando el método por PCR, en el cual uno de los cebadores que es usado para amplificar el gen y el segundo cebador está también dentro del vector, de manera que solamente aquellas colonias de bacterias que contienen el fragmento del DR5 mostrarán amplificación del ADN. La secuencia del fragmento clonado está confirmada por la secuenciación de ADN. Este plasmido está designado aquí por DR5 pBac. 5 µg del plasmido DR5 pBac son co-transfectados con 1.0 µg de un ADN de baculovirus linearizado comercialmente disponible "ADN baculovirus BaculoGold™" Pharmigen, San Diego, CA) , usando el método lipofectina descrito por Felgner et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 84:7413-7414 (1987). 1 µg del ADN del virus BaculoGold™ y 5 µg del plasmido DR5 pBac son mezclados en un pozo estéril de una placa de mícrolitro que contiene 50 µl de medio Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Más tarde, se agregan 10 µl de Lipofectina más 90 µl del medio Grace, se mezclan y se incuban por 15 minutos a temperatura ambiente. Después la mezcla de transfección se agrega en forma de gotas a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio Grace sin suero. La placa es elevada nuevamente y expuesta para mezclar nuevamente la solución agregada. La placa es entonces incubada por 5 horas a 27°C. Después de 5 horas, la solución de transfección es removida de la placa y se agrega 1 ml de medio Grace de insecto suplementado con suero de ternero fetal 10%. La placa es colocada nuevamente en un incubador y el cultivo se continúa a 27 °C por cuatro días. Después de cuatro días, el sobrenadante es colectado y se realiza un ensayo de plaquetas, como se describe por Summers y Smith, citados anteriormente. Un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) se usó para permitir la fácil identificación y aislamiento de los clones que expresan gal, los cuales producen plaquetas teñidas de azul. {Una descripción detallada de un "ensayo de plaquetas" de este tipo puede también encontrarse en la guía del usuario para el cultivo celular de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, PÁGINAS 9- 10) . Después de una incubación apropiada, las plaquetas teñidas se azul son perforadas con 1 punta de una micropipeta o micropipetador (por ejemplo, Eppendorf) . El agar que contiene los virus recombinantes es entonces suspendido en un tubo microcentrífugo que contiene 200 µl de medio Grace y la suspensión que contiene el baculovirus recombinante es usada para infectar células Sf9 sembradas en discos de 35 mm. Después de cuatro días, los sobrenadantes de estos discos de cultivo son cosechados y después almacenados a 4°C. El virus recombinante es llamado V-DR5. Para verificar la expresión del gen DR5, las células Sf9 se hacen crecer en un medio Grace suplementado con FBS inactivado por calor al 10%. Las células son infectadas con el baculovirus recombinante V-DR5 a una multiplicidad de infección ("MOI" ) de aproximadamente 2 (aproximadamente 1 hasta 2) . Seis horas después, el medio es removido y reemplazado con medio SF900 II menos metionina y cisteina (disponible de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Si son deseadas las proteínas radioetiquetadas, se agregan 42 horas después, 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi. 35S-cisteina (disponible de Amersham) . Las células son incubadas adicionalmente por 16 horas y después son cosechadas por centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante como en las proteínas intracelulares son analizadas por SDS-PAGE seguidas por autorradiografías (si son radioetiquetadas) . La microsecuenciación de la secuencia de aminoácido del termino amino de la proteína purificada puede ser usada para determinar la secuencia amino terminal de la proteína madura y así el punto de desdoblamiento y la longitud de la, señal secretoria peptídica.

EJEMPLO 4 Distribución del tejido de la expresión del gen DR5 El análisis del manchado Northern se realizó para determinar la expresión del gen DR5 en tejido humano, usando los métodos descritos por, entre otros, Sambrook et al . , citado anteriormente. Una sonda ADNc que contiene la secuencia nucleótida completa de la proteína DR5 (SEC ID NO:l) se etiquetó con 32P usando el sistema de etiquetado de ADN rediprime™ (Amersham Life Science) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después del etiquetado, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.) de conformidad con el protocolo del fabricante número PT1200-1. La sonda etiquetada purificada se usó entonces para examinar varios tejidos humanos para ARNm de DR5. Los manchados Northern de Tejidos Múltiples (MTN) que contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmune humano (IM) se obtuvieron a partir de Clontech (Palo Alto, CA) y se examinaron con una sonda etiquetada usando una solución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech) , de conformidad con el protocolo del fabricante número PT1190-1. Después de la hibridación y lavado, los manchados se montaron y expusieron a una película a -70°C durante la noche. Las películas se desarrollaron de conformidad con los procedimientos estándares. La expresión de DR5 se detectó en el corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esqueleto, riñon, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, útero, intestino delgado, colon, leucocitos periféricos de la sangre (PBLs), nudo linfático, médula ósea, e hígado fetal. La expresión de DR5 se valoró también por el manchado Northern en las siguientes líneas de células con cáncer, HL60 (leucemia promielocítica) , células Helia S3, K562 (leucemia mielogenea crónica), MOLT4 (leucemia del linfoblasto) , Raji (linfoma de Burkitt), SW480 (adenocarcinoma colorectal), A549 (carcinoma de pulmón), y G362 (melanoma) , y se detectó en todas las líneas celulares probadas.

EJEMPLO 5 Apoptosis inducida por PCR en Células de Mamíferos La sobre expresión de Fas/ASP-1 y TNFR-1 en la activación del receptor mímico de células de mamífero (M. Muzie et al . , Cell 85:817-827 (1996); M. P. Bodin et al . , Cell 85:802-815 (1996)). Así, este sistema se utilizó para estudiar el papel funcional del DR5 la inducción de apoptosis. Este ejemplo demuestra que la sobreexpresión de la apoptosis inducida por DR5 en ambas células de carcinoma de pecho humano MCF7 y en las células de carcinoma epiteloide humano (Hela) .

Diseño Experimental Los ensayos de muerte celular se realizaron esencialmente como se describe previamente (A.M.

Chinnaiyan, et al . , Cell 81:505-12 (1995); M.P. Boldin, et al . , J. Biol Chem 270 :1195-8 (1995); F.C. Kishkel, et al . , EMBO 14:5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan et al . , J Biol Chem 271 :4961-4965 (1996)). Brevemente, las líneas celulares clónales del carcinoma de pecho humano MCF-7, y las células Hela se co-transfectaron con vectores, DR5, DR5? (52-411), o TNFR-1, junto con un constructo reportero beta-galactosidasa. Las células MCF7 y Hela se transfectaron usando el procedimiento lipofectamina (GIBCO-BRL) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las 293 células se transfectaron usando precipitación CaP0. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se fijaron y tiñeron con X-Gal como se describe previamente (previamente (A.M. Chinnaiyan, et al . , Cell 81:505-12 (1995); M.P.

Boldin, et al . , J. Biol Chem 270:1195-8 (1995); F.C. Kishkel, et al . , EMBO 14:5579-5588 (1995)), y se examinaron microscópicamente. Los datos (media +SD) presentados en la Figura 5 representan el porcentaje de células apoptóticas, redondo, como una función de las células positivas beta-galactosidasa totales (n=3) . La sobre expresión de DR5 induce apoptosis en ambas células MCF7 (Fig. 5a) y Hela (Fig. 5B) . Las células MCF7 también se transfectaron con un constructo de expresión DR5 en la presencia de z-VAD-fmk (20 µl) (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) o cotransfectaron con un exceso de tres partes de CrmA (M.

Tewari et al . , J. Biol Chem 270:3255-60(1995)), o un constructo de expresión FADD-DN, o un solo vector. Los datos presentados en la Figura 5 muestran que la apoptosis inducida por DR5 fue atenuada por los inhibidores de caspasa, pero no solamente por el FADD negativo dominante. Como se demuestra en la Figura 5D, el DR5 no está asociado con el FADD o TRADD in vivo. 293 células se cotransfectaron con los constructos de expresión indicados, usando precipitación de fosfato de calcio. Después de la transfección (a 40 horas), los lisados celulares se prepararon e inmunoprecipitaron con un gel de afinidad anticuerpo Flag M2 (IBI, Kodak), y se detectó la presencia de FADD o TRADD myc etiquetado (myc-TRADD) mediante inmunoteñido con anticuerpo policlonal a FADD o peroxidasa de rábano picante (HRP) de anticuerpo conjugado a myc (BMB) (Baker, S.J. et al . , Oncogene 12: 1 (1996); Chinnaiyan, A.M. et al . , Science 274:990 (1996)). Como se demostró en la Figura 5E, el FLICE 2-DN bloquea la apoptosis inducida por DR5. 293 células se contransfectaron con el constructo de expresión DR5 o TNFR-1 y un exceso de cuatro partes de CrmA, FLICE-DN, FLICE 2-DN, o vector solo, en la presencia de un constructo reportado beta-galactosidasa como se indica. Las células se tiñeron y examinaron 25-30 horas después.

Resultados La sobre expresión de DR5, induce apoptosis en ambas células de carcinoma de pecho humano MCF7 (Figura 5A) y en células de carcinoma epiteloide (Hela) (Figura 5B) . La mayoría de las células transfectadas presentan cambios morfológicos, característicos de las células sometidas a apoptosis (Earnshaw, W.C., Curr. Biol . 7:337 (1995)), llegando a redondearse, condensarse y separarse del disco. La eliminación del dominio de muerte puede abolir la capacidad de muerte. De manera similar, la apoptosis inducida por DR4, DR5 se bloquea por los inhibidores de caspasa, CrmA, y z-VAD-fmk, pero el FADD negativo dominante está sin efecto (Figura 5C) . Consistente con esto, el DR5 no interactúa con FADD y TRADD in vivo (Fig. 5D) . Una versión negativa dominante de una molécula parecida a FLICE recientemente identificada, FLICE2 (Vicenz, C. et al . , J. Biol . Chem. 272: 6518 (1997)), bloquea eficientemente la apoptosis inducida por DR5, mientras, el FLICE negativo dominante tiene solamente efecto parcial bajo condiciones de bloqueo. El TNFR-1 induce la apoptosis efectivamente (Figura 5E) . Tomando en consideración, la evidencia sugiere que DR5 se acopla a un programa apoptótico que involucra la activación de FLICE2 y las caspasas corriente abajo, pero que es independiente de FADD.

EJEMPLO € El dominio extracelular de DR5 se enlaza al ligando citotox±co RAIL, y bloquea la Apoptosis Inducida por TRA L Como se discutió anteriormente, el TRAIL/Apo2L es un ligando citotoxico que pertenece a la familia del ligando del factor necrosis del tumor (TNF) y que induce una muerte celular rápida de muchas líneas celulares transformadas, pero no en tejidos normales, no obstante su dominio de muerte contiene al receptor DR4, se expresa en ambos tipos celulares. Este ejemplo muestra que el receptor DR5 presente, también se enlaza a TRAIL. Dada la similaridad del ligando extracelular se enlaza a los dominios ricos en cisteína de DR5 Y DR4, los presentes inventores teorizaron que el DR5 podrá también enlazarse a TRAIL. Para confirmar esto, el ligando extracelular soluble que se enlaza a los dominios de DR5 se expresó como fusiones a la porción Fc de la inmunoglobulina humana (IgG) . Como se mostró en la Figura 6A, el DR5-Fc específicamente enlaza a TRAIL, pero no, al ligando TNFa citotoxico relacionado. En este experimento, los dominios extracelulares Fc de DR5, DR4, TRID o TNFR1 y los ligandos correspondiente, se prepararon y realizaron ensayos de enlaces como se describe en Pan et al . , Science 276: 111 (1997) . Las fusiones Fc respectivas se precipitaron con la proteína G-Sefarosa y se detectaron los ligandos solubles co-precipitados por inmunoteñido con anto-Flag (Babeo) o anti-myc-HRP (BMB) . El panel inferior de la Figura 6A muestra las fusiones Fc presentes en los ensayos de enlaces . De manera adicional, el DR5-Fc bloquea la capacidad del TRAIL para inducir la apoptosis (figura 6B) . Las células MCF7 se trataron con TRAIL soluble (200 ng/ml) en la presencia de cantidades iguales de fusiones Fc o Fc solo. Seis horas después, las células se fijaron y examinaron como se describe en Pan et al., Id. Los datos (media + SD) mostrados en la Figura 6B, son el porcentaje de núcleo apoptótico entre el cuenteo de núcleos totales (n=4). Finalmente, el DR5-Fc no tiene efecto en la apoptosis de muerte celular inducida por TNFa bajo condiciones donde el TNFRl-Fc abolió completamente la muerte por TNFa (Figura 6C) . Las células MCF7 se trataron con TNFa (40 ng/ml); Genetech, Inc.) en la presencia de cantidades iguales de fusiones Fc o Fc solo. Se tiñeron los núcleos y se examinaron 11-15 horas después. La nueva identificación del DR5 como un receptor para TRAIL, agrega complejidad adicional a la biología de la transducción de la señal iniciada por TRAIL.

Será claro que la invención puede ser practicada de otro modo como se describe de manera particular en la descripción y ejemplos antes mencionados. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de las muestras anteriores, y, por lo tanto, están dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas. La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patentes, y publicaciones referidas aquí, están con ello incorporadas para referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Ni, Jian Gentz, Reiner Yu, Guo-Liang Su, Jeffrey Rosen, Craig A (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR 5 QUE CONTIENE EL DOMINIO DE MUERTE. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 12 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Human Genome Sciences, Inc. (B) CALLE: 9410 Key West Avenue (C) CIUDAD: Rockville (D) ESTADO: MD (E) PAÍS: US (F) CÓDIGO POSTAL: 20850 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco duro (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US herewith (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/054,021 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-JUL-1997 (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/040,846 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-MAR-1997 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Hoover, Kenley (B) NUMERO DE REGISTRO: 40,302 (C) NUMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: PF366 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 3013098504 (B) TELEFAX: 3013098439 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1600 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genomico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_peptido (B) UBICACIÓN: 130..1362 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 130..1362 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptido (B) UBICACIÓN: 284..1362 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:l CACGCGTCCG CGGGCGCGGC CGGAGA?CCC CGCAAC T GCGCCCACAA AATACACCGA 60 CGATGCCCGA TCTACTTTAA GGCCTGAAAC CCACGGGCCT GAGAGACTAT AAGAGCGTTC 120 CCTACCGCC ATG GAA CAÁ CGG GGA CAG AAC GCC CCG GCC GCT TCG GGG 166 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly -51 -50 -45 -40 GCC CGG AAA AGG CAC GGC CCA GGA CCC AGG GAG GCG CGG GGA GCC AGG 216 Ala Arg Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg -35 -30 -25 CCT GGG CCC CGG sT CCC AAG ACC CTT GTG CTC GTT GTC GCC GCG GTC 264 Pro Gly Pro Arg Val Pro iys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val -20 -15 -10 CTG CTG TTG GTC TCA GCT GAG TCT GCT CTG ATC ACC CAÁ CAÁ GAC CTA 312 Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu lie Thr Gln Gln Asp Leu -5 1 5 10 GCT CCC CAG CAG AGA GCG GCC CCA CAÁ CAÁ AAG AGG TCC AGC CCC TCA 360 Ala Pro Gln Glp Arg Ala Ala Pro Glp Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser 15 20 25 GAG GGA TTG TGT CCA CCT GGA CAC CAT ATC TCA GAA GAC J3GT AGA GAT 408 Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His lie Ser Glu Asp Gly Arg Asp 30 35 40 TGC ATC TCC TGC AAA TAT GGA CAG GAC TAT AGC ACT CAC TGG AAT GAC 455 Cys lie Ser Cys Lye Tyr Gly Glp Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp 45 50 55 CTC CTT TTC TGC TTG CGC TGC ACC AGG TGT GAT TCA GGT GAA GTG GAG 504 Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu 60 65 70 CTA AGT CCC TGC ACC ACG ACC AGA AAC ACÁ GTG TGT CAG TGC GAA GAA 552 Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu 75 80 85 90 GGC ACC TTC CGG GAA GAA GAT TCT CCT GAG ATG TGC CGG AAG TGC CGC $00 Gly Thr Phß Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg 95 100 105 ACÁ GGG TGT CCC AGA GGG ATG GTC AAG GTC GGT GAT TGT ACÁ CCC TGG $48 Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp 110 115 120 AGT GAC ATC GAA TGT GTC CAC AAA GAA TCA GGC ATC ATC ATA GGA GTC 696 Ser Asp lie Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly lie lie He Gly Val 125 130 135 ACÁ GTT GCA GCC GTA GTC TTG ATT GTG GCT GTG TTT GTT TGC AAG TCT 744 Thr Val Ala "Ala Val Val Leu lie Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser 140 145 150 TTA CTG TGG AAG AAA GTC CTT CCT TAC CTG AAA GGC ATC TGC TCA GGT 792 Leu Leu Trp Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly He Cys Ser Gly 155 160 16s 170 GGT GßT GGG GAC CCT GAG CGT GTG GAC AGA AGC TCA CAÁ CGA CCT GGG 840 Gly Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly 175 180 185 GCT GAG GAC AAT GTC CTC AAT GAG ATC GTG AGT ATC TTG CAG CCC ACC ß88 Ala Glu Asp Asn Val Leu Asn Glu lie Val Ser He Leu Gln Pro Thr 190 195 200 CAG GTC CCT GAG CAG GAA ATG GAA GTC CAG GAG CCA GCA GAG CCA ACÁ 936 Gin Val Pro Glu Gln Glu Mer Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr 205 210 215 GGT GTC AAC ATG TTG TCC CCC GGG GAG TCA GAG CAT CTG CTG GAA CCG 984 Gly Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro 220 225 230 GCA GAA GCT GAA AGG TCT CAG AGG AGG AGG CTG CTG GTT CCA GCA AAT 1032 Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 235 240 245 250 GAA GGT GAT CCC ACT GAG ACT CTG AGA CAG TGC TTC GAT GAC TTT GCA 1080 Glu GJ-y AsD Pro Tnr Glu tí?r Leu Ar9 Gln Gys Phe AsP Asp Phe Ala 255 260 265 GAC TTG GTG CCC TTT GAC TCC TGG GAG CCG CTC ATG AGG AAG TTG GGC 1128 Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly 270 275 280 CTC ATG GAC AAT GAG ATA AAG GTG GCT AAA GCT GAG GCA GCG GGC CAC 1176 Leu Met Asp Asn Glu He Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His 285 290 295 AGG GAC ACC TTG TAC ACG ATG CTG ATA AAG TGG GTC AAC AAA ACC GGG 1224 Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu He Lys Trp val Asn Lys Thr Gly 300 305 310 CGA GAT GCC TCT GTC CAC ACC CTG CTG GAT GCC TTG GAG ACG CTG GGA 1272 Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly 315 320 325 330 GAG AGA CTT GCC AAG CAG AAG ATT GAG GAC CAC TTG TTG AGC TCT GGA 1320 Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys He Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly 335 340 345 AAG TTC ATG TAT CTA GAA GGT AAT GCA GAC TCT GCC ATO TCC 1362 Lys Phe Het Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 TAAGTGTGAT TCTCTTCAGG AAGTGAGACC TTCCCTGGTT TACCTTTTTT CTGGAAAAAG 1422 CCCAACTGGA CTCCAGTCAG TAGGAAAGTG CCACAATTGT CACATGACCG GTACTGGAAG 14B2 AAACTCTCCC ATCCAACATC ACCCAGTGGA TGGAACATCC TGTAACTTTT CACTGCACTT 1542 GGCATTATTT TTATAAGCTG AATGTGAT?A TAAGGACACT ATGGAAAAAA AAAAAAAA 16D0 {2} INFORMACIÓNPARALASEC. IDNO: 2- [i) CARACTERÍSTICASDELASECUENCIA (A) LONGITUD: 4! 1 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA, linear (i¿) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA' SEC ID NO: 2: Het Glu Gln Axg ßly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys -51 -50 -45 -40 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro -35 -30 -25 -20 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu -15 -10 -5 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu He Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 1 5 10 Gln Arg Ala Ala "Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 15 20 25 Cys Pro Pro Gly His His He Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys lie Ser 35 4° 45 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu 50 Leu Phe S5 60 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Sßi Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro c 65e — 70 75 Cys Thr Thr Thr Arg Ásn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr 80 Phe 85 90 Arg Glu Glu Asp s.r Pro Glu Met Cys Arg Lys cyS Arg Thr Gly Cy, 95 100 105 ro Arg Gly Met Val ys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Aap n< 110 115 120 125 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly n. Ile Ile Gly Val ^ ^ ^ 130 135 Ala Val Val Leu He Val Ala Val Phe Val Cys Lye Ser Leu Leu Trp 145 150 155 Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly He Cys Ser Gly Gly Gly Gly 160 165 170 Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp 175 180 185 Asn Val Leu Asn Glu He Val Sex He Leu Gln Pro Thx Gln Val Pro 190 195 ' 200 205 Glu Gln Glu Met Glu. Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asp 210 215 220 Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala 225 230 235 Glu Axg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp '240 '-"= 250 Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val 255 260 265 Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Mßt Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp 270 275 280 285 Asn Glu He Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr "¡3° 295 300 Ti~ "y Arg Asp Ala 315 Ser Val Hi. Thr Leu L.u Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu 325 330 Ala Lys Gln Lys He Glu Asp His Leu Leu Sßr Ser Gly Lys Phe Met 340 3 5 Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 455 a ino ácidos (S) TIPO ammo ácidos <C) TIPO DE HEBRA una sola (D) TOPOLOGÍA linear (Ü ) TIPO DE MOLÉCULA proteína (xij DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NO 3 Mß Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Cly He Tyr Pro Sax Gly Val He Gly Leu Val Pro 20 « 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser 35 Val Cys Pro Gln Gly Lys 40 45 Tyr He Kis Pro Glp Asn Asn Ser He 50 55 Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 60 gy -r Tyr L*u Tyr A n Asp Cys Pro Gly cys Arg Glu cys Clu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 95 Arg His cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys 100 Glu Met Gly Gln Val 105 110 Glu He Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Txp Ser Glu Asn .Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Aen Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gn Glu 145 150 155 160 Lys Gln Asp Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cye Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 1BO 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln He Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val He Phe Phe Gly Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Phe He Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys 225 230 235 240 Ser Lys Leu Tyr Ser He Val Cye Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255 Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro val 275 280 235 Pro Ser Ser Thr Phß Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300 10 Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Ala Asp Pro He Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro He Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp 340 345 350 Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu A=n Val Pro Pro 355 360 365 15 Leu Arg Trp Lye Glu Phß Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 370 375 380 He Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Ser Het Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415 Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430 20 Cys Leu Glu Asp He Glu Glu Ala Lau Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 450 455 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. NO: 4. (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD- 335 amino ácidos ( B > TIPO, amino ácidos fC) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA, linear (ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID. NO.4 Met Leu Gly He Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp He Asn Ser 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 35 40 45 10 Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys Kis Lys Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr al Asn Gly Asp Glu Pro 65 70 75 80 Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 85 90 95 Phe St>x Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly 100 105 110 Lßu Glu Val Giu Ile A» Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg 115 120 125 Cys Lys Pro Asn Phß Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp '130 135 140 Pro Cys Thr Lys Cye Glu His Gly He He Lys Glu Cys Thr Leu Thr 145 150 155 150 Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp 165 170 175 Ij€U CVS Lßu Leu Leu Leu Pro Ile Pro- eu He Val Trp Val Lys Arg 180 185 190 Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys -Glu Asn Gn Gly 195 200 205 Ser .His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala He Asn Leu 210 215 220 Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr He Thr Thr He Ala Gly Val Met 225 230 235 240 i Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phß Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu 24S 250 255 Ala Lys He Asp Glu He Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu 260 265 270 Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys 275 280 285 Glu Ala Tyr Asp Thr Leu He Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys 290 295 300 Thr Leu Ala Glu Lys Ile-Gln Thr He He Leu Lys Asp He Thr Ser 305 310 315 320 Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu lie Gln Ser Leu Val 325 330 335 (2) INFORMACIÓNPARALA SEC. ID. NO: 5: [i) CARACTERÍSTICADELA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 417 amino ácidos (B) TIFO: amino ácidos (C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ( Xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 5: Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cye Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln 'Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys He Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 .Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cye Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala 100 Asp 105 110 Thr Arg Cys 51y Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cvs Gln Pro Cys Leu Aso 130 135 Cys 140 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 5 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 O Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 10 210 215 220 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val' hr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys He Cys 260 265 270 35 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 15 275 280 285 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Set Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 20 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu He Glu Ala Val Glu Val Glu He 355 360 365 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 3V7?s5 3- —80 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Axg Mee 385 390 395 400 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 Pro (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6: f i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 507 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: linear ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genomico) (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: AATTCGGCAC AGCTCTTCAG GAAGTCAGAC CTTCCCTGGT TTACCTTTTT TCTGGAAAAA 60 GCCCAACTGG GACTCCAGTC AGTAGGAAAG TGCCACAATT GTCACATGAC CGGTACTGGA 120 AGAAACTCTC CCATCCAACA TCACCCAGTG GNATGGGAAC ACTGATGAAC TTTTCACTGC 180 ACTTGGCATT ATTTTTGTHA AGCTGAATGT GATAATAAGG GCACTGATGG AAATGTCTGG 2 0 ATCATTCCGG TTGTGCGTAC TTTGAGATTT GNGTTTCGGG ATGTNCATTG TGTTTGACAG 300 CACT 'T?T'-M ATCCCTAATG TNAAATGCNT NATTTGATTG TGANTTGGGG GTNAACATTG 360 GTNAAGG TN CCCNTMTGAC ACAGTAGNTG GTNCCCGACT TANAATNGNN GAANANGATG 420 NATNANGAAC CTTTTTTTGG GTGGGGGGGT NHCGGGGCAG TMKAANGNNG NCTCCCCAGG 480 TTTGGKGTNG CAAT GNGGA A NKGTGG 50 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 226 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico <C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomico) (xi ) DESCRIPa?N DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: TTTTTTTTGT AGATGGATCT TACAATGTAG CCCAAATAAA TAAATAAAGC ATTTACATTA 60 GGATAAAAAA GTGCTGTGAA AACAATGACA TCCCAAACCA AATCTCAAAG TACGCACAAA 120 CGGAATGATC GAGACATTTC CATAGGTCCT TATTATCACA TTCAGCTTAT AAAATAATGC 180 CAAGTGCAGT GAAAAGTTAC AGGATGTTCC ATCCACTGGG TGGATT 226 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8: ( ¡ CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A ) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: una sola fD) TOPOLOGÍA: linear (ii ) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomico) (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: CGCCCATGGA GTCTGCTCTG ATCAC 25 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9: (i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: una sola (D> TOPOLOGÍA: linear fií ) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomico) <X ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: CGCAAGCTTT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10: (i ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10: (A) LONGITUD: 36 pares de bases <B) Tipo: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: linear íii ) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomic) (Xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: 5 CGCGGATCCG CCATCATGGA ACAACGGGGA CAGAAC 36 { 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11 : 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: una sola (D) TOPOLOGÍA: linear 15 {ii ) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomico) (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: CGCGGTACCT TAGGACATGG CAGAGTC 27 25 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12: { i ] CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases <B) TIPO: ácido nucleico 30 (C) TIPO DE HEBRA: una sola <D) TOPOLOGÍA: linear ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génomico) 35 ( Xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12: 0 CGCGGTACCT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30 Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia nucleótida al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente -51 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2; (b) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente -50 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2; (c) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que comprende aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2; (d) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (e) una secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (f) una secuencia de nucleótido que codifica al dominio extracelular DR5; (g) una secuencia de nucleótido que codifica al dominio de la transmembrana DR5; (h) una secuencia de nucleótido que codifica al dominio intracelular DR5; (i) una secuencia de nucleótido que codifica al dominio de muerte DR5; y (j) una secuencia de nucleótido complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) , (c), (d) , (e), (f), (g), (h) o (i) anteriores.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido tiene la secuencia nucleótida en la SEC ID NO:l.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido que codifica al polipéptido DR5 tiene la secuencia de aminoácido en la SEC ID NO: 2.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido tiene la secuencia del nucleótido en la SEC ID NO:l que codifica al polipéptido maduro DR5 tiene la secuencia de aminoácido en la SEC ID NO: 2.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido tiene la secuencia de nucleótido completa del clon de ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido tiene la secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido DR5 que tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en ATCC Depósito No. 97920.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleotido tiene la secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido DR5 maduro que tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótido la cual hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas a una secuencia de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido idéntica a la secuencia de nucleótido en (a), (b) , (c) , (d) , (e), (f), (g) , (h), (i), o (j) de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido el cual hibridiza, no solo hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido que consiste de solamente nucleótidos de adenosina o de solamente nucleótidos de ti idina.

9. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende un polinucleotido el cual codifica la secuencia de aminoácido de una porción que lleva epitope de un polipéptido DR5 que tiene una secuencia de aminoácido en (a), (b) , (c), (d), (e), (f), (g), (h) , o (i) de la reivindicación 1.

10. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 9, caracterizada porque codifica una porción que lleva epitope de un polipéptido DR5 seleccionado del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende residuos de aminoácido de aproximadamente 11 hasta aproximadamente 59 en la SEC ID NO:2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 68 hasta aproximadamente 113 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO:2; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 224 hasta aproximadamente 319 en la SEC ID NO: 2.

11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada porque codifica al dominio extracelular DR5.

12. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada porque codifica al dominio de la transmembrana DR5.

13. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada porque codifica al dominio intracelular DR5.

14. Un método para elaborar un vector recombinante, caracterizado porque comprende insertar una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en un vector.

15. Un vector recombinante, caracterizado porque se produce por el método de la reivindicación 14.

16. Un método de elaborar una célula huésped recombinante, caracterizado porque comprende introducir una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en una célula huésped.

17. Una célula huésped recombinante caracterizada porque se produce por el método de la reivindicación 16.

18. Un método recombinante para producir un polipéptido DR5, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 17 bajo condiciones tales que dicho polipéptido es expresado y se recupera dicho polipéptido.

19. Un polipéptido DR5 aislado caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a una secuencia del grupo que consiste de: (a) aminoácidos desde aproximadamente -51 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (b) aminoácidos desde aproximadamente -50 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (c) aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (d) la secuencia de aminoácido del polipéptido DR5 tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (e) la secuencia de aminoácido del polipéptido DR5 maduro que tiene al aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (f) la secuencia de aminoácido del domino extracelular DR5; (g) la secuencia de aminoácido del domino de la transmembrana DR5; (h) la secuencia de aminoácido del domino intracelular DR5; (i) la secuencia de aminoácido del domino de muerte DR5; (j) la secuencia de aminoácido de una porción que lleva epitope de una cualquiera de los polipéptidos de (a) , (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), o (j)

20. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una porción que lleva epitope de una proteina DR5, donde dicha porción se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende residuos de aminoácido de aproximadamente 11 hasta aproximadamente 59 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 68 hasta aproximadamente 113 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 173 hasta aproximadamente 220 en la SEC ID NO: 2; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente 224 hasta aproximadamente 319 en la SEC ID NO": 2.

21. Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un polipéptido DR5 de la reivindicación 19.

22. Un molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótido del clon HAPBU13R (SEC ID NO: 6) (b) la secuencia de nucleótido del clon HSBBU76R (SEC ID NO: 7) ; (c) la secuencia de nucleótido de una porción de la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) donde dicha porción comprende al menos 50 nucleótido contiguos a partir del nucleótido 284 hasta 1,362; y (d) una secuencia de nucleótido complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) o (c) anteriores.

23. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido DR5 donde, excepto por al menos una substitución de aminoácido conservadora, dicho polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido comprende aminoácidos desde aproximadamente -51 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (b) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido comprende aminoácidos desde aproximadamente -50 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (c) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido comprende aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (d) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (e) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido DR5 maduro que tiene al aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (f) una secuencia de nucleótido que codifica al domino extracelular DR5; (g) una secuencia de nucleótido que codifica al domino de la transmembrana DR5; (h) una secuencia de nucleótido que codifica al domino intracelular DR5; (i) una secuencia de nucleótido que codifica a los dominios extracelulares e intracelulares con toda o parte del dominio de la transmembrana suprimido; (j) una secuencia de nucleótido que codifica al domino de muerte DR5; y (k) una secuencia de nucleódio complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), o (j).

24. Un polipéptido DR5 aislado, caracterizado porque, excepto para al menos una substitución del aminoácido conservativo, dicho polipéptido tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) aminoácidos desde aproximadamente -51 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (b) aminoácidos desde aproximadamente -50 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (c) aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 360 en la SEC ID NO: 2 (d) la secuencia de aminoácido del polipéptido DR5 tiene la secuencia de aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (e) la secuencia de aminoácido del polipéptido DR5 maduro que tiene al aminoácido que codifica por el clon ADNc contenido en el ATCC Depósito No. 97920; (f) la secuencia de aminoácido del domino extracelular del receptor DR5; (g) la secuencia de aminoácido del domino de la transmembrana del receptor DR5; (h) la secuencia de aminoácido del domino intracelular del receptor DR5; (i) la secuencia de aminoácido de los dominios intracelulares y extracelulares del receptor DR5; (i) la secuencia de aminoácido del domino de muerte del receptor DR5; y (j) la secuencia de aminoácido de una porción que lleva epitope de una cualquiera de los polipéptidos de (a) , (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), o (j).

25. Una composición farmacéutica, caracterizada. porque comprende al polipéptido de la reivindicación 19 y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al anticuerpo de la reivindicación 21 y un portador farmacéuticamente aceptable.

27. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido de la reivindicación 24 y un portador farmacéuticamente aceptable.

28. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende al polipéptido de la reivindicación 19 fusionado a un polipéptido heterólogo.

29. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 8, caracterizado porque dicho ácido nucleico codifica a una proteína la cual es capaz de ser enlazada por medio de un anticuerpo a un polipéptido DR5, en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácido en la SEC ID NO: 2.

30. Un método para elaborar un vector recombinante caracterizado porque comprende insertar una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 8 en un vector.

31. Un vector recombinante caracterizado porque se produce por la el método de la reivindicación 30.

32. Un método para elaborar una célula huésped recombinante caracterizado porque comprende introducir una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 8 en una célula huésped.

33. Una célula huésped producida por el método de la reivindicación 32.

34. Un método recombinante para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 33 bajo condiciones tales que dicho polipéptido se expresa y se recupera dicho polipéptido.