JPWO2009020093A1 - デスドメイン含有受容体発現細胞にアポトーシスを誘導するイムノリポソーム - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌、自己免疫疾患または炎症性疾患に対して治療効果を有するイムノリポソーム製剤に関する。すなわち、本発明は、デスドメイン含有受容体発現細胞にアポトーシスを誘導可能な抗体を構成成分とするイムノリポソームに関する。
Description
本発明は、腫瘍の治療および/または予防剤として有用な、アポトーシス誘導に関連する細胞表面受容体に結合する抗体を含有し、該細胞表面受容体を発現する細胞に対しアポトーシスを誘導する作用を有するイムノリポソーム、並びに該リポソームを用いた癌、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の治療および/または予防法に関する。
リポソームは、水溶性もしくは疎水性の物質を多量に包含できることから、薬物キャリアーとして、特に静脈注射用のドラッグデリバリーシステム(Drug Delivery System:DDS)のキャリアーとして高い関心がもたれてきた(D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications”, Elsevier Science Publishers, (1993))。近年、親水性高分子、例えばポリエチレングリコール(PEG)で表面修飾されたリポソームは、従来のリポソームと比べリポソームの凝集化および体内での細網内皮系による捕捉などが軽減されることから、体内安定性の低い薬物にも適用され、血中での高い安定性(薬物血中半減期20−40時間)を実現する製剤技術として実用化に至っている。さらに近年では、機能性を付与する目的でリポソーム表面へ蛋白質、ペプチド、糖等の機能性分子を結合(含有)させる試みが数多く行われている。
薬物を体内の特定部位に輸送する手段として、リポソームに薬剤を封入し、その表面に抗体を結合する方法が提案されており、特に癌治療の分野において、抗腫瘍剤を封入した抗体結合リポソームの有効性が報告されている。このような抗体を含有するリポソームは、イムノリポソームと呼ばれる。多くの場合、イムノリポソームの薬効は、リポソームに内封された抗腫瘍剤によるものであり、一方でイムノリポソームに含有される抗体は、腫瘍細胞に特異的に発現する抗原に結合することによって、イムノリポソームを腫瘍細胞へ輸送するために利用されている。従って、一般的にはイムノリポソームに含有される抗体は、腫瘍細胞特異的な抗原に結合する機能を持っていれば良く、抗体自体が治療剤としての機能を有することは必須とはみなされていない。このように標的指向性を付与したリポソームにおいても(PEGリポソームにおいてさえも)、投与された内の大部分が標的細胞に到達する以前に肝臓等の免疫細胞に補足され消費されるか、多量の薬物が溶液中に失われるため、実際に標的部位に到達して活性を発現し得る薬物は一部に限られる。そこで、薬物をより安定に含んだまま標的細胞に到達させ、標的部位にて効率よく内封薬物を放出する機能を付与したリポソームの開発が多く試みられているが、未だ実用化には至っていない。また、理論的にリポソームにはあらゆる薬物が適用できるはずであるが、血中で安定に薬物を保持できるかは、リポソームの脂質成分と内封薬物との物性的な相互作用(相性)に大きく依存しており、適用可能な薬物の種類は実際には限定されるのが現状である。このように、限られた送達量、限られた種類の薬物を封入したリポソームにおいて、より高い薬理効果を得るためには、リポソームに新たな形で更に薬理効果が付与されることが求められている。
デスレセプターに代表されるアポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体は、リガンド結合による細胞膜上での局所的な受容体の多量化が、生物学的に細胞内へのアポトーシス・シグナル誘導の引き金となることが分かっている(Cell Death and Differentiation, 10:66-75 (2003))。アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体への結合能を有する抗体が、現在、治療薬として臨床での開発段階にあり,当該受容体を発現している細胞(癌細胞・免疫疾患関連細胞)特異的に、アゴニスト的に作用し、これを死滅させる治療効果が期待されている。この抗体の作用機序として、当該受容体に結合する前もしくは結合した後に、抗体同士が架橋(クロスリンク)され多量化することで、抗原受容体の多量化(すなわちアポトーシス誘導)が引き起こされると考えられる。in vitro実験では、本抗体に対する二次抗体を添加することで人工的にクロスリンクさせることが活性発現に必要であり、またin vivo生体内においては、免疫エフェクター細胞上のFcレセプターにより架橋されることが抗体の活性発現に必要な作用メカニズムと考えられている。近年、抗体に構造的な改変を加えることにより、抗体の本来もつ機能をより増強させる試みがなされており、例えば抗体上の特定の糖鎖構造を除去することで、Fcレセプターとの親和性が向上することが報告されている。しかしながら、免疫エフェクター細胞の量や働きには個人差があること、また薬物治療を既に受けている癌患者や免疫疾患患者においては、免疫エフェクター細胞の量や働きが大きく低下している。そのような癌・免疫疾患患者においては、既存の抗体では十分な薬効が得られないことも懸念され、抗体自身のさらなる機能増強が求められている。
本発明の一つの課題は、癌に対して治療効果を有する医薬品を提供することである。本発明の他の一つの課題は、細胞にアポトーシスを誘導可能な抗体を含有するリポソーム製剤を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、細胞にアポトーシスを誘導可能な抗体を含有するリポソーム製剤が、当該抗体単独の場合に比べて、顕著なアポトーシス誘導能を示す得ることを見出して、本発明を完成させた。本発明のリポソームは、リポソーム上で抗体を高密度に存在させることで、生物学的に架橋された抗体と同様に機能し、その結果、in vitroでの二次抗体またはin vivoでのエフェクター細胞の存在に依存せずに、イムノリポソーム単独でアポトーシス誘導能をより有効に発揮する。これにより、抗体単独では十分な治療効果が得られない患者においても有効な治療効果をもたらす。また、薬物を封入した本イムノリポソームは、薬物をターゲット細胞へ効率的にターゲティングする機能に加え、薬物による治療効果と増強された抗体の活性による治療効果の二重の薬理効果をもたらす。このことから、薬物封入リポソーム単独もしくはターゲティング能のみを有する抗体のイムノリポソームでは実現できなかった治療効果をもたらすことができる。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体、該抗体の機能性断片、または該抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定部位を含み該細胞表面受容体と特異的に結合するポリペプチド;
(b)両親媒性小胞形成脂質。
(2)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、アポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする(1)に記載のイムノリポソーム。
(3)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示すアポトーシス誘導活性と同等、またはより強いアポトーシス誘導活性をin vitroにおいて示すことを特徴とする(1)または(2)に記載のイムノリポソーム。
(4)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/2.5以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする(1)乃至(3)に記載のイムノリポソーム。
(5)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/10以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする(1)乃至(4)に記載のイムノリポソーム。
(6)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体を含有し、該抗体が抗体の全長分子であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(7)抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(6)に記載のイムノリポソーム。
(8)抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.002mol%乃至0.14mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項(7)に記載のイムノリポソーム。
(9)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片が、F(ab’)2であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(10)F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密で含有することを特徴とする(9)に記載のイムノリポソーム。
(11)F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.006mol%乃至0.11mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(10)に記載のイムノリポソーム。
(12)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片がFab’であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(13)Fab’を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.94mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(12)に記載のイムノリポソーム。
(14)Fab’を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(13)に記載のイムノリポソーム。
(15)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がキメラ抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(16)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト化抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(17)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(18)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するポリペプチドが、単鎖可変部位抗体であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(19)単鎖可変部位抗体を総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至1.8mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(18)に記載のイムノリポソーム。
(20)単鎖可変部位抗体を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(19)に記載のイムノリポソーム。
(21)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする(1)乃至(20)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(22)デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される(21)に記載のイムノリポソーム。
(23)デスドメイン含有受容体が、DR5である(22)に記載のイムノリポソーム。
(24)デスドメイン含有受容体が、DR4である(22)に記載のイムノリポソーム。
(25)デスドメイン含有受容体が、Fasである(22)に記載のイムノリポソーム。
(26)抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列の1〜118番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列の1〜107番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(23)に記載のイムノリポソーム。
(27)抗体分子または該抗体の機能性断片が、ハイブリドーマ2E12によって産生される抗体、該抗体と同じエピトープに結合する抗体または該抗体のヒト化抗体から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むことを特徴とする(24)に記載のイムノリポソーム。
(28)抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列の1〜139番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列の1〜131番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(25)に記載のイムノリポソーム。
(29)以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)該細胞表面受容体と特異的に結合し、かつ該受容体を介して細胞にアポトーシスを誘導する活性を持つ内因性リガンドまたは該内在性リガンドの機能性断片;
(b)両親媒性小胞形成脂質。
(30)該細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該内因性リガンドよりも強いアポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする(29)に記載のイムノリポソーム。
(31)細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする(29)または(30)に記載のイムノリポソーム。
(32)デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される(31)に記載のイムノリポソーム。
(33)デスドメイン含有受容体に対する内在性リガンドがTRAILまたはFasリガンドである(32)に記載のイムノリポソーム。
(34)イムノリポソームを構成する脂質として、ステロール類、リン脂質を含有することを特徴とする(1)乃至(33)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(35)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、ステロール類が、コレステロールであることを特徴とする(34)に記載のイムノリポソーム。
(36)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、コレステロールを、総脂質モル数に対して、20mol%乃至50mol%の割合で含有することを特徴とする(35)に記載のイムノリポソーム。
(37)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、リン脂質が、ホスファチジルコリンであることを特徴とする(34)乃至(36)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(38)イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至22であることを特徴とする(37)に記載のイムノリポソーム。
(39)イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至18であることを特徴とする(38)に記載のイムノリポソーム。
(40)イムノリポソームを構成する脂質として、さらに親水性ポリマーまたは該親水性ポリマーの脂質誘導体を含有する、(34)乃至(39)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム
。
(41)親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、500乃至20000であることを特徴とする(40)に記載のイムノリポソーム。
(42)親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、2000乃至5000であることを特徴とする(41)に記載のイムノリポソーム。
(43)親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、0.1mol%乃至10mol%の割合で含有することを特徴とする(40)乃至(42)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(44)親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、1mol%乃至6mol%の割合で含有することを特徴とする(43)に記載のイムノリポソーム。
(45)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、親水性ポリマーの脂質誘導体がポリエチレングリコール修飾脂質であることを特徴とする(40)乃至(44)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(46)末端にマレイミド基を有する脂質または親水性ポリマーを用いて、リポソームと抗体とがチオエーテル結合を介して結合していることを特徴とする(34)乃至(44)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(47)イムノリポソームの平均粒子径が30-1000nmであることを特徴とする(1)乃至(46)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(48)イムノリポソームの平均粒子径が30-200nmであることを特徴とする(47)に記載のイムノリポソーム。
(49)リポソーム中に抗腫瘍活性を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする(1)乃至(48)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(50)リポソーム中に自己免疫疾患または炎症性疾患の治療作用を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする(1)乃至(48)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(51)(1)乃至(50)のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する医薬組成物。
(52)(1)乃至(49)のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
(53)(1)乃至(48)のいずれか一つ、または(50)に記載のイムノリポソームを有効成分として含有する自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療剤。
(1)以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体、該抗体の機能性断片、または該抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定部位を含み該細胞表面受容体と特異的に結合するポリペプチド;
(b)両親媒性小胞形成脂質。
(2)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、アポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする(1)に記載のイムノリポソーム。
(3)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示すアポトーシス誘導活性と同等、またはより強いアポトーシス誘導活性をin vitroにおいて示すことを特徴とする(1)または(2)に記載のイムノリポソーム。
(4)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/2.5以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする(1)乃至(3)に記載のイムノリポソーム。
(5)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/10以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする(1)乃至(4)に記載のイムノリポソーム。
(6)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体を含有し、該抗体が抗体の全長分子であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(7)抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(6)に記載のイムノリポソーム。
(8)抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.002mol%乃至0.14mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項(7)に記載のイムノリポソーム。
(9)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片が、F(ab’)2であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(10)F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密で含有することを特徴とする(9)に記載のイムノリポソーム。
(11)F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.006mol%乃至0.11mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(10)に記載のイムノリポソーム。
(12)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片がFab’であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(13)Fab’を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.94mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(12)に記載のイムノリポソーム。
(14)Fab’を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(13)に記載のイムノリポソーム。
(15)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がキメラ抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(16)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト化抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(17)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト抗体であることを特徴とする(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(18)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するポリペプチドが、単鎖可変部位抗体であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(19)単鎖可変部位抗体を総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至1.8mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(18)に記載のイムノリポソーム。
(20)単鎖可変部位抗体を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする(19)に記載のイムノリポソーム。
(21)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする(1)乃至(20)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(22)デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される(21)に記載のイムノリポソーム。
(23)デスドメイン含有受容体が、DR5である(22)に記載のイムノリポソーム。
(24)デスドメイン含有受容体が、DR4である(22)に記載のイムノリポソーム。
(25)デスドメイン含有受容体が、Fasである(22)に記載のイムノリポソーム。
(26)抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列の1〜118番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列の1〜107番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(23)に記載のイムノリポソーム。
(27)抗体分子または該抗体の機能性断片が、ハイブリドーマ2E12によって産生される抗体、該抗体と同じエピトープに結合する抗体または該抗体のヒト化抗体から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むことを特徴とする(24)に記載のイムノリポソーム。
(28)抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列の1〜139番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列の1〜131番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(25)に記載のイムノリポソーム。
(29)以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)該細胞表面受容体と特異的に結合し、かつ該受容体を介して細胞にアポトーシスを誘導する活性を持つ内因性リガンドまたは該内在性リガンドの機能性断片;
(b)両親媒性小胞形成脂質。
(30)該細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該内因性リガンドよりも強いアポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする(29)に記載のイムノリポソーム。
(31)細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする(29)または(30)に記載のイムノリポソーム。
(32)デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される(31)に記載のイムノリポソーム。
(33)デスドメイン含有受容体に対する内在性リガンドがTRAILまたはFasリガンドである(32)に記載のイムノリポソーム。
(34)イムノリポソームを構成する脂質として、ステロール類、リン脂質を含有することを特徴とする(1)乃至(33)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(35)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、ステロール類が、コレステロールであることを特徴とする(34)に記載のイムノリポソーム。
(36)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、コレステロールを、総脂質モル数に対して、20mol%乃至50mol%の割合で含有することを特徴とする(35)に記載のイムノリポソーム。
(37)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、リン脂質が、ホスファチジルコリンであることを特徴とする(34)乃至(36)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(38)イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至22であることを特徴とする(37)に記載のイムノリポソーム。
(39)イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至18であることを特徴とする(38)に記載のイムノリポソーム。
(40)イムノリポソームを構成する脂質として、さらに親水性ポリマーまたは該親水性ポリマーの脂質誘導体を含有する、(34)乃至(39)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム
。
(41)親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、500乃至20000であることを特徴とする(40)に記載のイムノリポソーム。
(42)親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、2000乃至5000であることを特徴とする(41)に記載のイムノリポソーム。
(43)親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、0.1mol%乃至10mol%の割合で含有することを特徴とする(40)乃至(42)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(44)親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、1mol%乃至6mol%の割合で含有することを特徴とする(43)に記載のイムノリポソーム。
(45)イムノリポソームを構成する脂質の一つである、親水性ポリマーの脂質誘導体がポリエチレングリコール修飾脂質であることを特徴とする(40)乃至(44)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(46)末端にマレイミド基を有する脂質または親水性ポリマーを用いて、リポソームと抗体とがチオエーテル結合を介して結合していることを特徴とする(34)乃至(44)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(47)イムノリポソームの平均粒子径が30-1000nmであることを特徴とする(1)乃至(46)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(48)イムノリポソームの平均粒子径が30-200nmであることを特徴とする(47)に記載のイムノリポソーム。
(49)リポソーム中に抗腫瘍活性を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする(1)乃至(48)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(50)リポソーム中に自己免疫疾患または炎症性疾患の治療作用を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする(1)乃至(48)のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
(51)(1)乃至(50)のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する医薬組成物。
(52)(1)乃至(49)のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
(53)(1)乃至(48)のいずれか一つ、または(50)に記載のイムノリポソームを有効成分として含有する自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療剤。
なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、DNAのみならずそのmRNA、cDNA及びそのcRNAも含まれるものとする。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「RNA画分」とは、RNAを含んでいる画分をいう。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。
本明細書中における、「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、DNAの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷をいう。
本明細書中における「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことをいう。
本明細書中において、例えば「イムノリポソームに含有される抗体(またはポリペプチド)」のような表現が使用された場合の「含有される」とは、該リポソームを構成する脂質の有する官能基と該ポリペプチドの有する官能基が、共有結合、あるいは物理的・生物学的親和性に基づいた非共有結合を形成している状態をいう。
本明細書中における「デスドメイン含有受容体」とは、ショウジョウバエの自殺遺伝子reaperと相同性を示す「デスドメイン」と呼ばれるアポトーシスシグナル伝達領域を細胞内ドメインに持つ受容体分子(Fas, TNFRI, DR3、DR4, DR5およびDR6を含むがこれらに限定されない)をいう。
本明細書中における「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Fab、F(ab’)2、scFv等を含む。また、F(ab’)2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の機能性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
本発明における「Fab’」とは、上記のようにF(ab’)2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であり、還元条件で生じたFab’中のチオール基を利用して該Fab’とリポソームを結合させることができる。但し、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて産生されるFab’またはカルボキシル末端に遺伝子工学的にシステイン残基を含むポリペプチドを付与したFabも各々のチオール基を利用してリポソームと結合させることが可能であり、本発明におけるFab’に含まれる。
本明細書中における「単鎖可変部位抗体」は、シングルチェインFv(scFv)と同じ意味で用いられている。
本明細書中における「二次抗体」とは、抗体分子に特異的に結合して、該抗体分子同士を架橋する抗体をいう。
本明細書中における「両親媒性小胞形成脂質」とは、疎水性および親水性部分を有し、さらに単独で水中で二層小胞を形成することのできる脂質、または他の脂質と共に脂質二重層に取り込まれ、その際、当該二重膜の内部疎水領域とその疎水性領域が接触、さらにその親水性領域が当該膜の外部極性表面に向かって並ぶ一切の両親媒性脂質を含む。
本明細書中における「リポソーム」とは、両親媒性小胞形成脂質によって形成された脂質構造体をいう。リポソームは、典型的には、内部に水相を有する単層または多層の脂質二重層から構成される閉鎖小胞であるが、本発明においては、より広く、粒子状の脂質複合体をいう。
本明細書中における「イムノリポソーム」とは、リポソームと蛋白質によって形成される複合体をいう。
本明細書中におけるイムノリポソームの「抗体密度」とは、イムノリポソームを構成する総脂質モル数に対する、当該イムノリポソームに含有される抗体のモル数の割合をモルパーセントとして標記したものをいう。
本明細書中における「平均粒子径」とは、体積または数を基準にして測定される粒子径の分布の平均値をいう。粒子の粒子径は、例えば、レーザー回折法、動的光散乱法などの電磁波散乱法、遠心沈降法などの光透過法で測定される。
1. アポトーシス関連遺伝子について
本発明において目的のイムノリポソームに含有される抗体については、該抗体が特定の抗原に対して結合し、かつ該抗原を介して細胞傷害活性を示すことが要求される。また、正常細胞が殺傷されることを防ぐために、腫瘍細胞特異的に存在する抗原を選択する必要がある。このような抗原群の一例として、腫瘍細胞壊死因子(本明細書において以下「TNF」という)関連アポトーシス誘導リガンド(本明細書において以下「TRAIL」という)受容体群を挙げることができる。TRAILは、TNFファミリー蛋白質のメンバーであり、これは、FasリガンドおよびTNF-αを含む(Wiley SR,et al.Immunity 1995 Dec;3(6):673-82)。これらの蛋白質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。
本発明において目的のイムノリポソームに含有される抗体については、該抗体が特定の抗原に対して結合し、かつ該抗原を介して細胞傷害活性を示すことが要求される。また、正常細胞が殺傷されることを防ぐために、腫瘍細胞特異的に存在する抗原を選択する必要がある。このような抗原群の一例として、腫瘍細胞壊死因子(本明細書において以下「TNF」という)関連アポトーシス誘導リガンド(本明細書において以下「TRAIL」という)受容体群を挙げることができる。TRAILは、TNFファミリー蛋白質のメンバーであり、これは、FasリガンドおよびTNF-αを含む(Wiley SR,et al.Immunity 1995 Dec;3(6):673-82)。これらの蛋白質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。
これらのTNFファミリー蛋白質の受容体は、細胞外ドメインのシステインリッチ反復配列により特徴付けられるが、その中でもFasリガンドの受容体であるFas、およびTNFαの受容体であるTNF受容体I(本明細書において以下「TNFRI」という)は、ショウジョウバエの自殺遺伝子reaper (Golstein,P.,et al. (1995) Cell. 81, 185-186, White,K,et al. (1994) Science 264, 677-683)と相同性を示す領域である「デスドメイン」と呼ばれるアポトーシスのシグナル伝達に必須の領域を細胞内ドメインに持ち、デスドメイン含有受容体と総称される。
TRAILについては5種の受容体が同定されており、これらのうち2種(DR4(TRAIL-R1)およびDR5(TRAIL-R2))は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能であり、他の3種(DcR1(TRAIL-R3), DcR2(TRAIL-R4)およびオステオプロテゲリン(osteoprotegerin:OPG)は、アポトーシスシグナルを伝達しない。FasおよびTNFRIと同様に、DR4およびDR5の両者の細胞内セグメントはデスドメインを含み、そしてFas関連デスドメイン蛋白質(本明細書において以下「FADD」という)およびカスパーゼ8を含む経路を介してアポトーシスシグナルを伝達する(Chaudhary PM,et al.Immunity 1997 Dec; 7(6): 813-20; Schneider P,et al. Immunity 1997 Dec; 7(6): 821-30)。
上記の、Fas, TNFRI, DR4, DR5については、該分子に結合してアゴニストとして働く抗体が、該分子を細胞表面に保有する細胞に対して、アポトーシス誘導能を示すことが知られている(Journal of Cellular Physiology , 209: 1221-1028 (2006); Leukemis, Apl; 21 (4): 805-812 (2007) ; Blood, 99: 1666-1675 (2002); Cellular Immunology, Jan; 153 (1): 184-193 (1994))。上記のアゴニスト抗体の薬効は、二次抗体またはエフェクター細胞による架橋によって増強される(Journal of Immunology,149:3166-3173(1992); Eouropian Journal of Immunology,Oct;23(10):2676-2681(1993))。イムノリポソームは、リポソーム膜上に多くの抗体が結合し、抗体の架橋状態を模倣した構造体であると捉えることができる。従って、従来の二次抗体またはエフェクター細胞を介した架橋よりも、上記のアゴニスト抗体の薬効が格段に増強される可能性がある。また、人工的に高度の架橋状態を具現できるために、抗体単独が必ずしもアゴニスト活性を持つ必要が無いことも期待される。以上の理由により、デスドメイン含有受容体に結合する抗体は、本発明のイムノリポソームに含有可能な抗体として選択することができる。
上記の、Fas, TNFRI, DR4, DR5については、該分子に結合してアゴニストとして働く抗体が、該分子を細胞表面に保有する細胞に対して、アポトーシス誘導能を示すことが知られている(Journal of Cellular Physiology , 209: 1221-1028 (2006); Leukemis, Apl; 21 (4): 805-812 (2007) ; Blood, 99: 1666-1675 (2002); Cellular Immunology, Jan; 153 (1): 184-193 (1994))。上記のアゴニスト抗体の薬効は、二次抗体またはエフェクター細胞による架橋によって増強される(Journal of Immunology,149:3166-3173(1992); Eouropian Journal of Immunology,Oct;23(10):2676-2681(1993))。イムノリポソームは、リポソーム膜上に多くの抗体が結合し、抗体の架橋状態を模倣した構造体であると捉えることができる。従って、従来の二次抗体またはエフェクター細胞を介した架橋よりも、上記のアゴニスト抗体の薬効が格段に増強される可能性がある。また、人工的に高度の架橋状態を具現できるために、抗体単独が必ずしもアゴニスト活性を持つ必要が無いことも期待される。以上の理由により、デスドメイン含有受容体に結合する抗体は、本発明のイムノリポソームに含有可能な抗体として選択することができる。
2.DR5に結合する抗体
(1)DR5遺伝子
ヒトDR5(death receptor 5)遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:22547118(アクセッション番号:NM_147187)として登録されている。なお、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR5遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質もDR5に含まれる。
(1)DR5遺伝子
ヒトDR5(death receptor 5)遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:22547118(アクセッション番号:NM_147187)として登録されている。なお、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR5遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質もDR5に含まれる。
(2)DR5に対する抗体
本発明のDR5に対する抗体は、常法を用いて、DR5又はDR5のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
本発明のDR5に対する抗体は、常法を用いて、DR5又はDR5のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
また、公知の方法(例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497; Kennet,R.ed., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N.Y.(1980))に従って、DR5に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
なお、抗原となるDR5はDR5遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
具体的には、DR5遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したDR5を精製すればよい。
また、DR5の細胞外領域を抗体の定常領域と融合した人工的な遺伝子を構築し、適切な遺伝子発現系において調製された蛋白質を免疫原として使用することもできる。
以下、具体的にDR5に対する抗体の取得方法を説明する。
(2)−1. 抗原の調製
抗DR5抗体を作製するための抗原としては、DR5又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
(2)−1. 抗原の調製
抗DR5抗体を作製するための抗原としては、DR5又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
DR5は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、DR5をin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
遺伝子操作では、具体的には、DR5を発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってDR5を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
DR5のcDNAは例えば、DR5を発現しているcDNAライブラリーを鋳型として、DR5 cDNAを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR」という)(Saiki,R.K.,et al. Science (1988) 239, p.487-489)を行なう、いわゆるPCR法により取得することができる。
ポリペプチドのin vitro合成法としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム(RTS)が挙げられるが、これに限定されない。
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質(表現型)の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,Y. Cell(1981) 23, p.175-182、ATCC CRL-1650)、マウス繊維芽細胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(Urlaub, G. and Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77 ,p4126-4220)等がよく用いられているが、これらに限定されない。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、LB培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やIPTGを添加して用いることができる。
上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。
該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。
また、発現させる組換え蛋白質に6残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。
上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
(2)−2. 抗DR5モノクローナル抗体の製造
DR5と特異的に結合する抗体の例として、DR5と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
(2)−2. 抗DR5モノクローナル抗体の製造
DR5と特異的に結合する抗体の例として、DR5と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。
すなわち、
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
すなわち、
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
(a)抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したDR5又はその一部を使用することができる。
(a)抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したDR5又はその一部を使用することができる。
また、DR5発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はDR5発現組換え体細胞自身、DR5と他の蛋白質の融合蛋白質さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
(b)抗体産生細胞の調製
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
(b)抗体産生細胞の調製
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統A, AKR BALB/c BDP BA CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF. R III, SJL, SWR, WB, 129 等が、またラットの場合には、たとえば、Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは BALB/c 系統が、ラットではLow 系統が被免疫動物として特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは5〜12週齢、さらに好ましくは6〜8週齢である。
DR5又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Maye r, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。
すなわち、まず、抗原である膜蛋白画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。
ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数3〜6回、投与間隔2〜6週間が好ましく、投与回数3〜4回、投与間隔2〜4週間がさらに好ましい。
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、0.05-5 mg、好ましくは0.1-0.5 mg程度とする。
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の1〜6週間後、好ましくは2〜4週間後、さらに好ましくは2〜3週間後に行う。
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には、0.05-5 mg、好ましくは0.1-0.5 mgさらに好ましくは0.1-0.2 mg程度とする。
上記追加免疫から1〜10日後、好ましくは2〜5日後、さらに好ましくは2〜3日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。
なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、RIA法又はELISA法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
本発明における抗体価の測定は、例えばELISA法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。
まず、精製又は部分精製した抗原をELISA用96穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン(以下「BSA」という)により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料(例えばマウス血清)に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法(例えば、Kohler et al.,Nature (1975) 256, p.495; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977) 6, p.511; Milstein et al., Nature (1977) 266 , p.550; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495)に従って行うことができる。
例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地(MEM)に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
(c)骨髄腫細胞(以下、「ミエローマ」という)の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。
すなわち、マウス由来のX63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO、S149/5XXO, BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3)等、ヒト由来のU266AR (SKO-007), GM1500・GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41)等である。
これらのHGPRT欠損株は例えば、American Type Culture Collection(ATCC)等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば8−アザグアニン培地[RPMI-1640培地にグルタミン、2−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清(以下「FCS」という)を加えた培地に8−アザグアニンを加えた培地]、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;以下「IMDM」という)、又はダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;以下「DMEM」という)で継代培養するが、細胞融合の3乃至4日前に正常培地[例えば、10%FCSを含むASF104培地(味の素(株)社製)]で継代培養し、融合当日に2×107以上の細胞数を確保しておく。
(d)細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir, D. M., Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois (1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir, D. M., Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois (1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500-6000、好ましくは2000-4000のポリエチレングリコール溶液中で、30〜40℃、好ましくは35〜38℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1〜10分間、好ましくは5〜8分間混合する。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500-6000、好ましくは2000-4000のポリエチレングリコール溶液中で、30〜40℃、好ましくは35〜38℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1〜10分間、好ましくは5〜8分間混合する。
(e)ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノブテリン・チミジン)選択法(Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550)が用いられる。
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノブテリン・チミジン)選択法(Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550)が用いられる。
この方法は、アミノブテリンで生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。
すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる(例えばBarbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980))。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる(例えばBarbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980))。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー(feeder)を接種しておく。
一方、あらかじめハイブリドーマを0.2-0.5個/0.2mlになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに0.1mlずつ入れ、一定期間毎(例えば3日毎)に約1/3の培地を新しいものに交換しながら2週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを2〜4回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗DR5モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
(g)ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、例えば上記(b)の項目で説明したELISA法により行うことができる。
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−80℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をHT培地から正常培地に換えて培養される。
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。
この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
また、同系統のマウス(例えば、上記のBALB/c)、あるいはNu/Nuマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前(3〜7日前)に2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(プリスタン)等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
たとえば,ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、T細胞を不活性化した後、20日後に106 〜107 個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊(0.5ml)させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を採取する。
この方法により、培養液中に比べて約100倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばWeir, D. M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)に記載されている方法で精製することができる。
すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット(例えば、MAbTrap GIIキット;ファルマシア社製)等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、DR5に対して高い抗原特異性を有する。
(h)モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
まず、同定法としてはオクテルロニー(Ouchterlony)法、ELISA法、又はRIA法が挙げられる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
一方、ELISA法又はRIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット(例えば、マウスタイパーキット;バイオラッド社製)等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度[1.4(OD280)=イムノグロブリン1mg/ml]より算出する方法により行うこと
ができる。
ができる。
(3)その他の抗体
本発明の抗体には、上記DR5に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体が挙げられ、例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が挙げられる(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984))。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体(Nature(1986)321,p.522-525)、CDR移植法によって、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(国際公開パンフレットWO90/07861)を挙げることができる。
さらに、抗ヒト抗体を挙げることができる。抗DR5ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗DR5ヒト抗体は、ヒト抗体のH鎖とL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143; Kuroiwa, Y .et.al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727)によって取得することができる。
このようなトランスジェニック動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome, YAC)ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物およびトランスジェニック動物の作製、およびこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするcDNA、好ましくは該cDNAを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはCHO細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone, I. M. et.al ,Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2) ,p.189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431) も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116)を用いることができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。
抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる(WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388、 Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455、 Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116)。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman, Y .Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650)、マウス繊維芽細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。
本発明の抗体のアイソタイプの制限はなく、例えばIgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgDあるいはIgE等が挙げられるが、好ましくはIgGまたはIgMを挙げることができる。
また本発明の抗体は、抗原との結合性を維持している限り、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。
例えば、抗体の機能性断片としては、Fab, F(ab’)2, F(ab’)2を還元して得られる抗体の一価の可変領域断片であるFab’、Fv、または重鎖および軽鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv), diabody (diabodies), 線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などが挙げられるが、抗原に対する結合性を保持している限り上記の断片に限定されない。上記の抗体の断片は、完全長の抗体分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって取得することが可能である。また、上記の抗体断片の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を用いて適当な遺伝子発現系によって蛋白質を産生させることによっても、上記の抗体断片を取得することができる。また、抗体の機能性断片のカルボキシル末端にシステイン残基を含むポリペプチドを遺伝子工学的に付加した蛋白質も本発明における抗体の機能性断片として使用することができる。このような機能性断片の一例として、重鎖または軽鎖のカルボキシル末端にシステイン残基を含むポリペプチドを付加したFabを挙げることができるが、これに限定されない。付加されたシステイン残基のチオール基は、抗体の機能性断片とリポソームを結合させるために使用可能である。
さらに、本発明の抗体は少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は2個の抗原を結合するものであるが(即ち、二重特異性抗体(bispecific antibody))、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上(例えば、3種類)の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の抗体は、多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)でもよい。二重特異性抗体は2種類の抗体の重鎖と軽鎖(HL対)を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる(Millstein et al., Nature (1983) 305 ,p.537-539)。
本発明の抗体は単鎖可変部位抗体(scFvとも記載する)でもよい。単鎖可変部位抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg及びMoore編、Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994); Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136)。
単鎖可変部位抗体を作製する方法は当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号)。この単鎖可変部位抗体において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S .et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883)。単鎖可変部位抗体における重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
単鎖可変部位抗体をコードするDNAは、前記抗体の重鎖または重鎖可変領域をコードするDNA、および軽鎖または軽鎖可変領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
また、一旦単鎖可変部位抗体をコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従って単鎖可変部位抗体を得ることができる。
これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗DR5抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、CDRが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る(WO2004/061104号)。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤とコンジュゲートを形成しているもの(Immunoconjugate)でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる(Nature Biotechnology (2005) 23 ,p.1137-1146)。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。
例えばプロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
(4)抗DR5抗体の具体例
例えば、国際公開パンフレット、WO98/51793, WO2001/83560, WO2002/94880, WO2003/54216, WO2006/83971, WO2007/22157に記載のDR5発現細胞にアポトーシスを誘導する抗DR5抗体は、本発明のイムノリポソームの構成成分として使用可能である。また、Lexatumumab, HGSTR2J, APOMAB, APOMAB7.3, AMG-655, LBY135と呼ばれる抗DR5抗体、およびこれらの変異体についても、本発明のイムノリポソームの構成成分として使用可能である。但し、DR5蛋白質に対する結合能を保有する限り、上記の抗体に限定されない。
3.Fasに結合する抗体
(1)Fas遺伝子
ヒトFas遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:182409(アクセッション番号:M67454)として登録されている。なお、Fasのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、Fasと同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、Fas遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、Fasのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、Fasと同等の生物活性を有する蛋白質もFasに含まれる。
(2)Fasに対する抗体
Fasに結合する抗体については、「2.(2)DR5に対する抗体」に記載の方法に準じて取得することができる。
(3)その他の抗体
Fasに結合する抗体については、「2.(3)その他の抗体」に記載の方法に準じて取得することができる。
(4)抗Fas抗体の具体例
例えば、米国特許第6,972,323号に記載のFas発現細胞にアポトーシスを誘導する抗Fas抗体およびその変異体は、本発明のイムノリポソームの構成成分として使用可能である。但し、Fas蛋白質に対する結合能を保有する限り、上記の抗体に限定されない。
4.その他の抗原に対する抗体
DR5およびFas以外の受容体についても、当該受容体がデスドメインを含有する場合、上記に述べた抗体の作製法に従って、該受容体に結合し、該受容体発現細胞にアポトーシスを誘導する抗体の取得が可能である。このような抗体は、本発明のイムノリポソームの構成成分となる。デスドメインを含有する受容体としては、TNFRI, DR3, DR4, DR6などを挙げることができるが、細胞アポトーシス誘導シグナルを伝達する受容体であれば、上記に記載の受容体に限定されない。
ヒトTNFRI遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:339748(アクセッション番号:M75866)として登録されている。なお、TNFRIのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、TNFRIと同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、TNFRI遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、TNFRIのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、TNFRIと同等の生物活性を有する蛋白質もTNFRIに含まれる。
ヒトDR3 (death receptor 3)遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:23200020(アクセッション番号:NM_148965)として登録されている。なお、DR3のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR3と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR3遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR3のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR3と同等の生物活性を有する蛋白質もDR3に含まれる。
ヒトDR4 (death receptor 4)遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:21361085(アクセッション番号:NM_003844)として登録されている。なお、DR4のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR4と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR4遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR4のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR4と同等の生物活性を有する蛋白質もDR4に含まれる。例えば、国際公開パンフレットWO2002/97300に記載の抗体、Mapatumumab、およびこれらの変異体である抗DR4抗体は、本発明のイムノリポソームの構成成分として使用可能である。但し、DR4蛋白質に対する結合能を保有する限り、上記の抗体に限定されない。
ヒトDR6(death receptor 6)遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankにGI:23238206(アクセッション番号:NM_014452)として登録されている。なお、DR6のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR6と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR6遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR6のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR6と同等の生物活性を有する蛋白質もDR6に含まれる。
5.イムノリポソームの構成成分
本発明は、前記の1.乃至4.に記載のアポトーシスに関与する細胞表面上の受容体に特異的に結合する蛋白質を含み、アポトーシス誘導活性を示すイムノリポソームを提供する。
「リポソーム」とは、両親媒性小胞形成脂質によって形成された脂質構造体を意味する((D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications”, Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993)))。リポソームは、典型的には、内部に水相を有する単層または多層の脂質二重層から構成される閉鎖小胞であるが、本発明においては、より広く、粒子状の脂質複合体を意味する。例えば、水相を有するかどうかが明確でない複合体も含まれる。脂質複合体は少なくとも1種類の脂質を含有し、この他に親水性ポリマー、多糖類、アミノ酸等を含んでも良く、それらが共有あるいは非共有結合にて粒子状に形成されたものを意味する。
「イムノリポソーム」とは、上記リポソームと蛋白質によって形成される複合体を意味する。蛋白質とは、抗体のみに限定されず、内因性リガンドや該内因性リガンドの機能性ペプチド等も含まれる。
これらのイムノリポソームは、両親媒性小胞形成脂質を含有し、アポトーシス誘導に関与する受容体に特異的に結合する蛋白質(抗体、内因性リガンド等)およびペプチドを共有結合あるいは非共有結合にてリポソームに担持している。「両親媒性小胞形成脂質」とは、疎水性および親水性部分を有し、さらに単独で水中で二層小胞を形成することのできる脂質、または他の脂質と共に脂質二重層に取り込まれ、その際、当該二重膜の内部疎水領域とその疎水性領域が接触、さらにその親水性領域が当該膜の外部極性表面に向かって並ぶ一切の両親媒性脂質を含む。
「脂質二重層」とは、極性脂質分子の疎水性領域同士が会合し、疎水性部が二分子層の中心に向かい、一方、親水性領域が水相に向かって配列した構造である。
本発明のイムノリポソームは、(1)両親媒性小胞形成脂質、(2)親水性ポリマー、(3)蛋白質およびペプチド等を含み、リポソームの内部に治療用薬物を含んでもよい。また、脂質複合体の形成を阻害しない限り、特にこれらに限定されない。以下にイムノリポソームを構成する各成分について詳述する。
(1)両親媒性小胞形成脂質
リポソームを構成する脂質成分には、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ステロール類、グリコール類、飽和又は不飽和の脂肪酸、界面活性剤、親水性ポリマーを有する誘導体脂質等が含まれる(文献「Liposomes: from physics to applications」のChapter 1. Chemistry of lipids and liposomes参照)。以下に示す(1)−1.乃至(1)−8.を例示として列記することができる。
(1)−1.リン脂質
リン脂質は、グリセロリン脂質とスフィンゴリン脂質に大別される。グリセロリン脂質の代表的なものには、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジン酸(PA)が挙げられる。一方、スフィンゴリン脂質の代表的なものにはスフィンゴミエリンが挙げられる。以下の(a)乃至(i)に記載の脂質を挙げることができる。
(a)ホスファチジルコリン類
例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジミリストリルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC)、ジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジヘキサノイルホスファチジルコリン(DHPC)、ジブチリルホスファチジルコリン(DBPC)、ジエライドイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジアラキドノイルホスファチジルコリン、ジイコセノイルホスファチジルコリン(DEPC)、ジヘプタノイルホスファチジルコリン、ジカプロイルホスファチジルコリン、ジヘプタデカノイルホスファチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、水素化卵ホスファチジルコリン(HEPC)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、1−パルミトイル−2−アラキドノイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−オレオイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−リノレオイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ミリストイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン、1−ステアロイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、1,2−ジミリストイルアミド−1,2−デオキシホスファチジルコリン、1−ミリストイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、1−ミリストイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン、ジ−0−ヘキサデシルホスファチジルコリン、トランスジエライドイルホスファチジルコリン、ジパルミテライドイル−ホスファチジルコリン、n−オクタデシル−2−メチルホスファチジルコリン、n−オクタデシルホスファチジルコリン、1−ラウリルプロパンジオール−3−ホスホコリン、エリスロ−N−リグノセロイルスフィンゴホスファチジルコリン、パルミトイル−(9−cis−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン等が挙げられる。
(b)ホスファチジルセリン類
例えば、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、ジミリストイルホスファチジルセリン(DMPS)、ジラウロイルホスファチジルセリン(DLPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)、ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)、リゾホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルセリン、1,2−ジ−(9−cis−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルセリン等が挙げられる。
(c)ホスファチジルイノシトール類
例えば、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール(DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール(DSPI)、ジラウロイルホスファチジルイノシトール(DLPI)等が挙げられる。
(d)ホスファチジルグリセロール類
例えば、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジラウロイルホスファチジルグリセロール(DLPG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、リゾホスファチジルグリセロール、水素化大豆ホスファチジルグリセロール(HSPG)、水素化卵ホスファチジルグリセロール(HEPG)、カルジオリピン(ジホスファチジルグリセロール)等が挙げられる。
(e)ホスファチジルエタノールアミン(セファリン)類
例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジデカノイルホスファチジルエタノールアミン(DDPE)、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミン(NGPE)、リゾホスファチジルエタノールアミン、N−(7−ニトロ−2,1,3−ベンゾキシジアゾール−4−イル)−1,2−ジオレオイル−sn−ホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、N−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、1−ヘキサデシル−2−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
(f)ホスファチジン酸類
例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)、ジオレイルホスファチジン酸(DOPA)等が挙げられる。
(g)スフィンゴリン脂質
例えば、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、セラミドシリアチン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール等が挙げられる。
(h)重合性残基を有する重合性リン脂質
不飽和リン脂質として、重合性残基を有する重合性リン脂質には、例えば、1,2−ビス(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ビス(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(2,4−オクタデカジエノイル)−2−(オクタデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−2−(ヘキサデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ビス−(8,10,12−オクタデカトリエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ビス(12−メタクリロイルオキシドデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、1,2−ビス(9−(p−ビニルベンゾイル)ノナノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリンなどが挙げられる。
また、別の重合性リン脂質には、例えば、1,2−ビス(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ビス(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(2,4−オクタデカジエノイル)−2−(オクタデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−2−(ヘキサデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ビス−(8,10,12−オクタデカトリエノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ビス(12−メタクリロイルオキシドデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ビス(9−(p−ビニルベンゾイル)ノナノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンなどが挙げられる。
さらに、別の重合性リン脂質には、例えば、1,2−ビス(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1,2−ビス(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−オクタデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(オクタデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(ヘキサデカノイル)−2−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(2,4−オクタデカジエノイル)−2−(オクタデカノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1−(2,4−ヘキサデカジエノイル)−2−(ヘキサデカノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1,2−ビス−(8,10,12−オクタデカトリエノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1,2−ビス(12−メタクリロイルオキシドデカノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸、1,2−ビス(9−(p−ビニルベンゾイル)ノナノイル)−sn−グリセロ−3−リン酸などのリン酸誘導体あるいはその塩などが挙げられる。
なお、重合性リン脂質には非重合性脂肪酸残基が含有されてもよく、非重合性脂肪酸残基としては炭素数2〜24の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基、アシル基、非重合性アルケニル基、非重合性アルケノイル基などが挙げられる。
(i)その他のリン脂質
ホスファチジルスレオニン、燐酸ジセチル、リゾリン脂質、ホスファチジルコリンを主成分としホスファチジルエタノールアミン・スフィンゴミエリン・コレステロール等を含む複数種の脂質の混合物である卵レシチン、大豆レシチンが挙げられる。
(i)その他のリン脂質
ホスファチジルスレオニン、燐酸ジセチル、リゾリン脂質、ホスファチジルコリンを主成分としホスファチジルエタノールアミン・スフィンゴミエリン・コレステロール等を含む複数種の脂質の混合物である卵レシチン、大豆レシチンが挙げられる。
(1)−2.糖脂質
糖脂質は、グリセロ糖脂質とスフィンゴ糖脂質に大別される。以下の(a)乃至(c)に記載の脂質を挙げることができる。
(a)グリセロ糖脂質
例えば、ジグリコシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、スルホキシリボシルジグリセリド、(1,3)−D−マンノシル(1,3)ジグリセリド、ジガラクトシルグリセリド、ジガラクトシルジラウロイルグリセリド、ジガラクトシルジミリストイルグリセリド、ジガラクトシルジパルミトイルグリセリド、ジガラクトシルジステアロイルグリセリド、ガラクトシルグリセリド、ガラクトシルジラウロイルグリセリド、ガラクトシルジミリストイルグリセリド、ガラクトシルジパルミトイルグリセリド、ガラクトシルジステアロイルグリセリド、ジガラクトシルジアシルグリセロール等が挙げられる。
(b)スフィンゴ糖脂質
例えば、セラミド(セレブロシド)、ガラクトシルセラミド、ラクトシルセラミド、ジガラクトシルセラミド、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGM2、ガングリオシドGM3、スルファチド、セラミドオリゴヘキソシド、グロボシドが挙げられる。
(c)その他の糖脂質
セラミドオリゴヘキソシド、パルミチルグリコシド、ステアリルグルコシド、ミリスチルグルコシド、アルキルグリコシド、アミノフェニルグリコシド、コレステリルマルトシド、コレステリルグルコシド、3−コレステリル‐6’−(グリコシルチオ)ヘキシルエーテル糖脂質、グルカミド類等が挙げられる。
(1)−3.ステロール類
ステロール類の最も代表的なものにコレステロールが挙げられる。コレステロールは、脂質二重層構造の膜剛性および安定性に寄与することが知られている。コレステロールの他、ステロール類には、例えば、コレステロールコハク酸、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、チモステロール、エルゴステロール、キャンペステロール、フコステロール、22−ケトステロール、20−ヒドロキシステロール、7−ヒドロキシコレステロール、19−ヒドロキシコレステロール、22−ヒドロキシコレステロール、25−ヒドロキシコレステロール、7−デヒドロコレステロール、5α−コレスト−7−エン−3β−オール、エピコレステロール、デヒドロエルゴステロール、硫酸コレステロール、ヘミコハク酸コレステロール、フタル酸コレステロール、リン酸コレステロール、吉草酸コレステロール、コレステロールヘミサクシネート、3βN−(N´,N´−ジメチルアミノエタン)−カルバモイルコレステロール、コレステロールアセテート、コレステリルオレート、コレステリルリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミテート、コレステリルアラキデート、コプロスタノール、コレステロールエステル、コレステリルフォスフォリルコリン、3,6,9−トリオキサオクタン−1−オール−コレステリル−3e−オール等が挙げられる。
(1)−4.中性脂質
中性脂質としては、例えば、ジグリセリド(例えばジオレイン、ジパルミトレイン)および混合カプリリン−カプリンジグリセリド、トリアシルグリセロール(トリオレイン、トリパルミトレイン、トリミリストレイン、トリラウリン、トリカプリン、トリカプリリン、トリカプロイン等)、スクアレン、トコフェロール、コレステロール等が挙げられる。
(1)−5.飽和又は不飽和脂肪酸
飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、ペラルガン酸、カプリン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、トリデシレン酸、ミリスチン酸、ペンタデシレン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデシレン酸、アラキジン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、アイコセン酸、エルシン酸、ドコサペンタエン酸等の炭素数5〜30の飽和もしくは不飽和の脂肪酸が用いられる。
(1)−6.荷電性脂質
以下の(a)乃至(b)に記載の脂質を挙げることができる。
(a)アニオン性脂質
アニオン性脂質とは、生理学的pHにおいて負電荷を有する脂質を指す。ホスファチジルグリセロール、ホファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン等の酸性リン脂質、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リノレン酸等の脂肪酸、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGM2、ガングリオシドGM3等のガングリオシド類、ジセチルリン酸等の酸性脂質、N−アシル−L−グルタミン酸等の酸性アミノ酸系界面活性剤等が挙げられる。
(b)カチオン性脂質
カチオン性脂質とは、生理学的pHにおいて正電荷を有する脂質を指す。N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジドデシル−D−グルタメートクロライド(TMAG)、DL−1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム(DORI)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ)−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、(1,2−ジオレイルオキシプロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン、N,N−ジオクタデシルアミド−グリシルスペルミン、N,N−ジオクタデシルアミドグリシン、1,2−ジオレイル−3−サクシニル−sn−グリセロコリンエステル(DOSC)、1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−サクシニル−2−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン(DOGSDSO)、セチルピリジニウムクロリド(CPyC)、1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−エチルホスホコリン(DOEPC)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N−(2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、N−(1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2−ジオレオイル−sn−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジオレオイル−3−(4´−トリメチルアンモニオ)ブタノイル−sn−グリセロール(DOBT)、1,3−ジオレオイルオキシ−2−(6−カルボキシスペルミル)−プロピルアミド(DOSPER)、シ゛ハ゜ルミトイルホスファチシ゛ルエタノールアミト゛スヘ゜ルミン(DPPES)のようなリポポリアミン、O−アルキルホスファチジルコリン、O−アルキルホスファチジルエタノールアミン、リジン・アルギニンまたはオルニチンのアミドおよびホスファチジルエタノールアミン、3β−(N−(N´,N´−ジメチルアミノエタン)カルバモイル)コレステロール(DC-Chol)、3−β−[N−(N´,N´,N´−トリメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(TC-Chol)、ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール(BGSC)、ビス−グアニジニウム−トレン(tren)−コレステロール(BGTC)、(4´−トリメチルアンモニア)ブタン酸コレステリル(ChOTB)、3β−N−(ポリエチレンイミン)−カルバモイルコレステロール、ヨウ化コレステリル−3β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウム、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリルカルボン酸ヨウ化物、コレステリル−3β−カルボキシアミドエチレンアミン、ヨウ化コレステリル−3β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウム、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリル−3β−オキシコハク酸ヨウ化物、2−(2−トリメチルアンモニオ)−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−3β−オキシコハク酸ヨウ化物、コレステリルヘミコハク酸エステル、長鎖アミン、長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物等が挙げられる。
(1)−7.界面活性剤
界面活性剤は、親水性部分がイオン性である(a)カチオン性界面活性剤、(b)アニオン性界面活性剤、(c)両性界面活性剤と、親水性部分が非イオン性の(d)非イオン性界面活性剤に大別される。
(a)カチオン性界面活性剤
カチオン性界面活性剤としては、アルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等が挙げられる。具体的には、塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、N−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、N−アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等が挙げられる。
(b)アニオン性界面活性剤
アニオン性界面活性剤としては、アシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、炭素数7〜22の脂肪酸ナトリウムおよび脂肪酸カリウム等があげられる。具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
(c)両性界面活性剤
両性界面活性剤としては、アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド等が挙げられる。具体的には、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸、N−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸等が挙げられる。
(d)非イオン性界面活性剤
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、アルキルアミン型非イオン界面活性剤、アルキルアミド型非イオン界面活性剤等が挙げられる。具体的には、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート80、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、プルロニックF68、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等が挙げられる。
(1)−8.前記の脂質のいずれかと親水性ポリマーとが結合した「親水性ポリマーの脂質誘導体」(「6.(1)脂質と親水性ポリマーの結合様式」で詳しく記載する)も本発明のイムノリポソームの構成成分として使用することができる。
以上示した両親媒性小胞形成脂質を通常適宜混合してリポソームが調製される。代表的な脂質組成として、リン脂質もしくは糖脂質を主成分とし、さらにステロール類を、総脂質モル数に対して20乃至50mol%の割合で含有する脂質組成を挙げることが出来る。好適には、ホスファチジルコリン類を主成分とし、さらにコレステロールを総脂質モル数に対して20乃至50mol%の割合で含有する脂質組成を挙げることが出来る。
(2)親水性ポリマー
リポソームは血液循環中に投与されると、肝臓、脾臓、肺等の細網内皮系(RES:reticulo-endothelial system)に捕捉されやすい性質をもつ。これは標的臓器が肝臓や肺等であれば有利な性質となるが、全身的な作用を目的とする場合、標的部位がRES以外の場合には大きな欠点となる。親水性ポリマーの存在は、血中滞留性の向上とRESによるリポソームの取り込みを回避する性質を提供する。また、親水性ポリマーの存在は、リポソーム保存時における分散安定性も提供する。
本発明のイムノリポソームに用いられる親水性ポリマーの種類は、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコール等)、ポリグリセリン、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリグリシドール、ガングリオシド、デキストラン、フィコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアスパルトアミド、ポリホスファゼン、ポリ(ヒドロキシアルキルカルボン酸)、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、硫酸セレブロシド、コンドロイチン硫酸、多糖類(例えば、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、キトサン、マンナン、プルラン、カラギーナン、メチルセルロース等)、ポリペプチド、合成ポリアミノ酸(例えば、ポリ−L−リジン等)等が挙げられる。
上記の親水性ポリマーは、1以上の繰り返し単位構造から成り、その単位構造数に制限はなく、直鎖型でも分岐型であっても良い。好適には、分子量が500乃至20000の親水性ポリマーを挙げることができ、さらに好適には、分子量が2000乃至5000の親水性ポリマーを挙げることができる。また、これらのポリマーは、ホモポリマーおよびブロックもしくはランダムコポリマーとして用いることができる。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸から成るポリ乳酸/ポリグリコール酸コポリマー等も含まれる。
上記の親水性ポリマーは、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボニル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アミノ基、チオール基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヒドラジド基等の置換基が導入された誘導体であっても良い。
血中滞留性の向上とRESによるリポソームの取り込みを回避する目的において、好適には、リポソームにおける親水性ポリマーもしくは親水性ポリマーの脂質誘導体の含量は、総脂質モル数に対して0.1乃至10mol%の割合であることを挙げることが出来る。さらに好適には、総脂質モル数に対して1乃至6mol%の割合である。
(3)蛋白質
上記「2.DR5に結合する抗体」、「3.Fasに結合する抗体」、および「4.その他の抗原に結合する抗体」で述べた抗体を本発明のイムノリポソームの構成成分とすることができる。また、本発明に記載のアポトーシス誘導能を持つ受容体に対するナチュラルリガンドを結合させたリポソームについても、本発明の範囲である。さらに、デスドメイン含有受容体に特異的に結合する人工ペプチドを本発明のイムノリポソームの構成成分とすることもできる。このような人工ペプチドの例としては、Fasに結合する機能性ペプチドを挙げることができる(Yoshimori et al, Apoptosis 10 (2), 323-329 (2005))。また、上記の分子群から同一の抗原に結合する2種類以上の分子を選択し、同一のイムノリポソーム上に共存させることによって、特定の抗原に対する結合能を向上させることができる。さらに上記の分子群から異なる抗原に結合する2種類以上の分子を選択し、同一のリポソーム上に共存させることによって、複数の抗原に対して作用させることも可能である。
(4)内水相
リポソーム内部に水相が存在する場合、水相に用いる水溶液は、リポソームの形成を阻害するものでない限り特に制限はない。通常、塩化ナトリウム水溶液、緩衝液(リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液等)、単糖類もしくは二糖類の水溶液(グルコース水溶液、トレハロース水溶液等)を使用することができる。
(5)添加剤
イムノリポソームの構成成分にさらに機能性付与剤を添加してもよい。このような機能性付与剤には、例えば、膜安定化剤、膜表面の親水性調整剤、曲率調整剤、抗酸化剤、電荷付与剤、凍結保護剤等が挙げられる。例えば、糖、糖脂質、グリセリン、ポリエチレングリコール等の安定剤、トコフェロールやアスコルビン酸等の酸化防止剤が挙げられる。コレステロール類は、膜安定化剤、膜表面の親水性調整剤あるいはリポソームの曲率調整剤等として、トコフェロール類は抗酸化剤として使用可能である。
また、イムノリポソームに上記の添加剤を加える場合、その種類と含量は特に限定されず、イムノリポソームの物性を考慮して適宜選択される。
(6)内封薬物
また、本発明のイムノリポソームは、内水相に親水性薬物を、及び膜中に疎水性薬物を封入することが可能である。封入する薬物は、リポソームの形成を阻害するものでない限り特に制限はなく、抗腫瘍剤、抗リウマチ剤、抗ウイルス剤、抗菌剤等の細胞傷害活性を有する薬物が挙げられる。抗腫瘍剤としては、例えばブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、メトトレキサート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、パクリタキセル、ソラフェニブ、スニチニブ、テニポサイド、6−チオグアニン、ビンクリスチン、ビンブラスチンが挙げられる。抗癌化合物および治療剤のさらなる例は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 第15編、Berkowら編, 1987、Rahway, N. J.およびSladekらMetabolism and Action of Anti-Cancer Drugs,1987, Powisら編、TaylorおよびFrancis, New York, N. Y.に見出される。
自己免疫疾患治療剤または抗炎症剤としては、例えばジクロフェナク、ロキソプロフェンナトリウム、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカム、ロフェコキシブ、ピロキシカム、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロセンなどの非ステロイド性抗炎症剤またはメトトレキセート、クロロキン、ヒドロクロロキン、シクロスポリン、ペニシラミン、スルファサラジン、アザチオプリン、レフルノマイドなどの疾患修飾性抗リウマチ薬を挙げることができる。
以上に述べてきたように、各種薬剤をイムノリポソームの内水相に封入して作用させることが可能である。一方で、上記の薬剤は、イムノリポソームに封入されるていない状態でイムノリポソームと併用して標的細胞に作用させることも可能である。
6.イムノリポソーム成分の結合様式
本発明のイムノリポソームは、両親媒性小胞形成脂質、親水性ポリマー、蛋白質、ペプチド、糖等から構成され、前記脂質、蛋白質、ペプチドおよび親水性ポリマーは共有結合または非共有結合を形成する。本発明のイムノリポソームの形態は、リポソーム表面に蛋白質、ペプチドのような機能性分子が直結してもよく、あるいは親水性ポリマーを介してリポソームに結合してもよい。前者の場合には、親水性ポリマーもリポソームに直結して含まれても良い。
(1)脂質と親水性ポリマーの結合様式
親水性ポリマーの脂質誘導体は、上記5.(1)記載の両親媒性小胞形成脂質と上記5.(2)記載の親水性ポリマーから成り、その組み合わせは特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。脂質と親水性ポリマーは、脂質が有する官能基(脂質に人為的に導入された官能基を含む)と親水性ポリマーが有する官能基(親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む)が直接あるいはリンカーを介して共有結合を形成する。
親水性ポリマーの脂質誘導体には以下のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。親水性ポリマーの脂質誘導体は、例えば、ポリエチレングリコール修飾脂質、ポリエチレンイミン誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリルアミド誘導体、デキストラン誘導体、ポリグリセリン誘導体、キトサン誘導体、ポリビニルピロリドン誘導体、ポリアスパラギン酸アミド誘導体、ポリ−L−リジン誘導体、マンナン誘導体、プルラン誘導体等が挙げられる。
「ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質」としては、文献((D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications”, Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993))の”Chapter 11. Liposomes as a drug delivery system”)に記載のポリエチレングリコール(PEG)修飾ホスファチジルエタノールアミン類を上げることが出来、より具体的には、N−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニルホスファチジルエタノールアミン類、N−モノメトキシポリエチレングリコールカルボニルホスファチジルエタノールアミン類、N−モノメトキシポリエチレングリコールエチレンホスファチジルエタノールアミン類、N−モノメトキシポリエチレングリコールカルボニルエチルカルボニルホスファチジルエタノールアミン類、N−モノメトキシポリエチレングリコールカルボニルプロピルカルボニルホスファチジルエタノールアミン類、N−モノメトキシポリエチレングリコール(2−クロロ−1,3,5−トリアジン−4,6−ジイル)サクシニルホスファチジルエタノールアミン類、ジ−C12−24アシル−グリセロ−ホスファチジルエタノールアミン−N−PEG、ジ−C12−24アシル−グリセロール−モノPEGエーテル、モノC12−24アシルグリセロール−ジPEGエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、N−(2,3−ジミリスチルオキシプロピル)アミドポリエチレングリコールメチルエーテル、N−(2,3−ジミリスチルオキシプロピル)カルバメートポリエチレングリコールメチルエーテル、N−(2,3−ジミリスチルオキシプロピル)スクシンアミドポリエチレングリコールメチルエーテル、スフィンゴシン−1−(スクシニルメトキシポリエチレングリコール類、スフィンゴシン−1−(スクシニル(メトキシポリエチレングリコール))類、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、ジラウリン酸ポリエチレングリコール、ジステアリン酸ポリエチレングリコール、ジオレイン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ジエチレングリコール等)、ポリエチレングリコールヒマシ油、ピロリドンカルボン酸イソステアリン酸PEG-40水添ヒマシ油、モノメトキシポリエチレングリコール−3,5−ジペンタデシロキシベンジルカルバネート、4−(N´−(メトキシポリエチレングリコールカルボニル)2−アミノエチル)N,N−ジステアロイルベンズアミド、DSPE-PEG(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT DSPE-020C, DSPE-050C, DSPE-020G, DSPE-050G, DSPE-020CN, DSPE-050CN)、DSPE-Multi-arm PEG(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT DSPE-PTE020)、DSPE-Comb-shaped PEG(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT DSPE-AM0530K)、Diacylglycerol-PEG(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT GS-020,GS-050)、Cholesterol-PEG(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT CS-010, CS-020, CS-050)、PEG-Ceramide(Avanti POLAR LIPID, INC.製品)、mPEG-DTB-DSPE(DTB;ジチオベンジル、国際公開パンフレット、WO2005/051351)、PEG−DAA(DAA;ジアルキルオキシプロピル、国際公開パンフレットWO2005/026372)等が挙げられる。
その他の親水性ポリマーの脂質誘導体の具体例としては、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油(例えば、ポリオキシエチレンPOE(3)ヒマシ油、POE(5)硬化ヒマシ油等)、N−[オメガ−メトキシポリ(オキシエチレン)−アルファオキシカルボニル]−ホスファチジルエタノールアミン類、O−(C10−18アルカノイルまたはアルケノイル)プルラン、N−(C10−18アルカノイルまたはアルケノイル)ポリアクリルアミド、DSPE-Polyglycerine(NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT DSPE-PG8G)等を挙げることができる。
親水性ポリマーを脂質に結合させる方法としては、(a)予め形成したリポソーム分散液に親水性ポリマーを結合させる方法、(b)親水性ポリマーの脂質誘導体を調製しリポソームに組み込む方法、が挙げられる。
(a)予め形成したリポソームに親水性ポリマーを結合させることによる方法で、例えば、塩化トレシル活性化PEGを用い、これを続いてアミノ基をもつ脂質(ホスファチジルエタノールアミン等)を含有したリポソームに高pH条件下で添加することにより、親水性ポリマーで修飾されたリポソームが得られる(Senior et al, Biochim. Biophys. Acta.1-62: 77-82 (1991))。また、他の多くの結合も利用できることは当業者には周知である。
(b)親水性ポリマーの脂質誘導体を調製しリポソームに組み込む方法で、親水性ポリマーは脂質を結合させた誘導体として用いることにより、その疎水性部位をリポソームの脂質層へ挿入することが可能となる。これらの親水性ポリマー誘導体を予め形成したリポソーム分散液に加えて加温することにより、あるいは、親水性ポリマー誘導体をリポソーム構成脂質成分の混合時に加えることにより、親水性ポリマーで修飾されたリポソームが得られる。親水性ポリマーにより誘導体化された脂質の製造は、例えば米国特許第5,395,619号に記載されており、公知の方法によって製造することができる。例えば、リン脂質の反応活性な官能基とPEGを共有結合させるには、塩化シアヌルを用いる方法(Blume et al,Biochim. Biophys. Acta .1029: 91-97 (1990)および米国特許第5,213,804号)、カルボジイミドを用いる方法(Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 17: 77-78 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460-11464 (1991); Biochim. Blophys .Acta., 1066: 29-36 (1991); Biochim. Biophys. Acta., 1105: 193-200 (1992); Period. Biol., 93: 349-352 (1991))、酸無水物を用いる方法、グルタルアルデヒドを用いる方法等の公知の方法が用いられる。
(2)脂質と蛋白質の結合様式
リポソームに蛋白質やペプチド等を固定化する方法としては、下記(i)乃至(x)に示す方法が挙げられる。リポソームを構成する脂質と蛋白質の結合は、脂質が有する官能基(脂質に人為的に導入された官能基を含む。)と蛋白質が有する官能基(蛋白質に人為的に導入された官能基を含む。)の共有結合、あるいは物理的・生物学的親和性に基づいた非共有結合によって形成される。共有結合を形成する官能基の組み合わせは、例えば、アミノ基/カルボキシル基、アミノ基/N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基/アルデヒド基、アミノ基/トレシル基、アミノ基/ニトルフェニルカルボニル基、アミノ基/アセタール基、アミノ基/イソチオシアネート基、アミノ基/ハロゲン化アシル基、アミノ基/ベンゾトリアゾールカーボネート基、ヒドラジド基/アルデヒド基、チオール基/マレイミド基、チオール基/ビニルスルホン基等、チオール基/チオール基等が挙げられる。非共有結合としては、疎水結合やアビジン/ビオチン、ポリヒスチジンタグ/ニッケル等の特異的な結合を利用することが可能である。
(i)蛋白質に疎水性基を導入することにより、疎水環境下にあるリポソームの脂質層に対して親和性をもたせ、これを別途調製したリポソームに組み込む方法(Biochimica et Biophysica Acta, 812, 116(1985))。
(ii)抗体あるいは内因性リガンドを細胞の膜蛋白質との融合蛋白質として発現させ、この膜タンパク部分を別途調製したリポソームに組み込む方法(Mol Med. 7 (10) 723, (2001))。
(iii)リポソーム構成脂質成分が糖脂質である場合、その糖を酸化剤で酸化することによりアルデヒド基を生成させ、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させることにより脂質と蛋白質を結合させる方法(Biochimica et Biophysica Acta. 640, 66 (1981))。
(iv)リポソーム調製時にアミノ基と反応し得る官能基を持つ脂質を混合しておき、これに蛋白質のLys残基のε−アミノ基またはN末端のα−アミノ基を反応させてリポソームに組み込む方法(J. Immunol Methods. 1983, 65(3): 295-306)。
蛋白質のアミノ基と脂質を共有結合させる場合に、脂質に必要な反応性官能基は、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)、アルデヒド基、トレシル基、ニトロフェニルカルボニル基、アセタール基、カルボキシル基、イソチオシアネート基、ハロゲン化アシル基、ベンゾトリアゾールカーボネート基等が挙げられる。
(v)リポソーム調製時にチオール基と反応し得る官能基を持つ脂質を混合しておき、これとチオール基を有する蛋白質を反応させる方法(Journal of Immunological Method, 75,351 (1984); Biochemical and Biophysical Research Communications, 117, 399 (1983))。
蛋白質へのチオール基の付与は、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(Carlsson,J.et al Biochem. J. 173, 723, (1978))やN−スクシニミジル−S−アセチルチオアセテート(SATA)、N−スクシニミジル−S−アセチルチオプロピオネート(SATP)、イミノチオラン(Traut, R. R. et al Biochemistry 12, 3266 (1973))、メルカプトアルキルイミデート等の化合物を用いて行う方法が公知の方法として知られている。上記の方法の他、蛋白質の内在性ジチオール基を還元してチオール基とし、結合に用いることが可能である。特に、蛋白質が抗体の場合には、抗体(全長あるいはフラグメント)のヒンジ領域および重鎖と軽鎖の連結部位のジチオール基の利用が可能であり、抗体と脂質との結合においては内在性チオール基を用いる後者の方法が蛋白質の活性維持の点からより好ましい。例えば、IgG抗体をペプシン等の酵素でF(ab’)2化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られる Fab’に生じるチオール基を結合に供することが可能である(Martin, F. J. et al Biochemistry 20, 4229 (1981))。IgMの場合は、Millerらの方法(J .Biol. Chem 257, 286 (1965))に準じ、穏和な条件でJ鎖を還元して得られるIgMsのFc部分のチオール基を結合に供することが可能である。
蛋白質のチオール基と脂質を共有結合させる場合に必要な脂質の官能基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、チオール基等が挙げられる。例えば、マレイミド基を含む脂質として、N−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル)ホスファチジルエタノールアミン、N−(m−マレイミドベンゾイル)ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、N−(4−p−マレイミドフェニル)ブチリルホスファチジルエタノールアミン(MPB-PE)等が挙げられる。マレイミド化試薬としては、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドの他、アミノ基のマレイミド誘導体を作製するために一般に使用されているN−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB),N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)プロピオネート、N‐(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド等が挙げられる。
また、上記マレイミド化試薬にて蛋白質のアミノ基をマレイミド基に置換することも可能である。これらは、チオール基をもつ、例えば、ピリジルジチオプロピオネート(PDP)等を修飾した脂質と反応し、共有結合が形成される。
(vi)リポソーム調製時にアルデヒド基と反応し得る官能基を持つ脂質を混合しておき、糖鎖由来のアルデヒド基を結合させる方法。
通常、真核生物においては、蛋白質は翻訳後修飾によって糖鎖修飾を受ける。特に抗体の場合には、そのFc領域に糖鎖が存在する。これらの糖鎖を酸化して生ずるアルデヒド基とヒドラジドは、反応して共有結合を形成するため、脂質にヒドラジドを修飾することで、糖鎖を介して蛋白質およびペプチドを脂質に固定化することが可能である(Biochimica et Biophysica Acta 1420 153-167 (1999))。
(vii)リポソーム、蛋白質が各々のもつ官能基同士を架橋剤又は縮合剤等を用いて結合させる方法。
脂質の有するアミノ基と蛋白質のアミノ基を結合させることで、リポソーム表面に蛋白質を固定化することが可能である(Biochemical and Biophysical Research Communications, 89, 1114 (1979); Liposome Technology, 155 (1983))。アミノ基を有する脂質とは、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルスレオニン等が挙げられる。蛋白質のアミノ基はリジン残基のε−アミノ基およびN末端のα−アミノ基によって提供される。アミノ基をもつ脂質から構成されるリポソームに蛋白質を固定化するには、グルタルアルデヒドを用いて脂質のアミノ基と蛋白質のアミノ基とを直接架橋させる方法、反応活性試薬を用いて脂質のアミノ基と蛋白質のアミノ基とを化学結合させる方法などの公知の方法が採用できる。二価架橋剤としては、グルタルアルデヒドの他、ジサクシンイミジルスベレート(DSS)、フタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド、メチルピメリミデート(DMP)、ジイソチオシアノスチルベンジスルホン酸ナトリウム(DIDS)等が挙げられる。反応活性試薬としては、N−ヒドロキシスクシンイミジル 3−(2−ピリジチオ)プロピオネート、m−マレイミドベンジイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート、ジスクシンイミジルスベレート等が挙げられる。
脂質のもつアミノ基と蛋白質のもつチオール基、あるいは脂質のもつチオール基と蛋白質のもつアミノ基を結合させることで、リポソーム表面に蛋白質を固定化することが可能である。アミノ基とチオール基に反応性をもつ二価架橋剤としては、N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)アセテート(SMPA)、N−スクシンイミジルブロモアセテート、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)プロピオネート(SMPP)、N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド(GMBS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)等が挙げられる。
脂質のカルボキシル基と蛋白質のアミノ基、あるいは脂質のもつアミノ基と蛋白質のもつカルボキシル基を、縮合剤を用いて結合させることで、リポソーム表面に蛋白質を固定化することが可能である(Biochemistry,Vol.31,2850-2855(1992))。
脂質のチオール基と蛋白質のチオール基を結合させることで、リポソーム表面に蛋白質を固定化することが可能である。例えば、ビスマレイミドヘキサン等の架橋剤が用いられる。
(viii)ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンの特異的親和性を利用して、蛋白と脂質を結合させる方法。
ビオチン修飾蛋白質をストレプトアビジンまたはアビジン修飾脂質と非共有結合させることが可能である(Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12: 311-325 (2002))。また、ストレプトアビジンおよびアビジンは4量体を形成しており、最大4分子のビオチンの結合が可能であることを利用し、ビオチン修飾蛋白質をアビジンまたはストレプトアビジンリンカーによってビオチン修飾脂質に非共有結合させることができる(Biochimica et Biophysica Acta 1239 133-144 (1995))。
(ix)ヒスチジンタグとニッケルイオンとの親和性を利用して、蛋白と脂質を結合させる方法。
ポリヒスチジンタグ(His-Tag)とニッケルイオン(Ni2+)の親和性を利用してリポソームに蛋白質およびペプチドを固定化することが可能である(Molecular Pharmaceutics 3, 5, 525-530)。遺伝子工学的手法により、His−Tagを融合したキメラ蛋白質あるいはペプチドを公知の方法により発現、精製することが可能である。また、金属(Ni2+)キレートサイトをもつNTA(nitriloacetic acid)、IDA(iminodiacetic acid)等を脂質の末端に修飾することで、Ni2+が固定化されたリポソームを調製することが可能である。該リポソームのNi2+にHis-Tagが特異的に結合することで、His-Tag融合蛋白質あるいはペプチドがリポソーム上に固定化される。
(x)抗体のFcドメインに親和性のある蛋白質あるいはその蛋白質ドメインを介して、抗体の全長分子を結合させる方法。
抗体のFcドメインに親和性のあるProtein AあるいはProtein G蛋白質あるいは、Fcドメインとの結合に関与するProtein A, Protein Gのドメイン蛋白質を介して、抗体の全長分子を担持させることが可能である。その際Protein A, Protein G蛋白質は、上記(i)乃至(ix)の方法のいずれかでリポソーム脂質に結合させることができる(BMC Immunology 2006,7:24)。
上記(i)乃至(x)において、蛋白質と固定化に関与する脂質の割合を調節することで、リポソームに固定化させる蛋白質の量を任意に変化させることが可能である。
(3)親水性ポリマーと蛋白質の結合様式
親水性ポリマーに蛋白質やペプチド等を固定化する方法としては、下記(i)乃至(vii)に示す方法が挙げられる。親水性ポリマーと蛋白質、あるいは上記の方法で得られた親水性ポリマーの脂質誘導体と蛋白質を結合させるためには、親水性ポリマーが有する官能基(親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む)と蛋白質が有する官能基(蛋白質に人為的に導入された官能基を含む)を反応させることにより、共有結合または非共有結合を形成させる方法が挙げられる。共有結合を形成する官能基の組み合わせは、例えば、アミノ基/カルボキシル基、アミノ基/N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基/アルデヒド基、アミノ基/トレシル基、アミノ基/ニトルフェニルカルボニル基、アミノ基/アセタール基、アミノ基/イソチオシアネート基、アミノ基/ハロゲン化アシル基、アミノ基/ベンゾトリアゾールカーボネート基、ヒドラジド基/アルデヒド基、チオール基/マレイミド基、チオール基/ビニルスルホン基等、チオール基/チオール基等が挙げられる。非共有結合としては、アビジン/ビオチン、ポリヒスチジンタグ/ニッケル等の特異的な結合を利用することが可能である。蛋白質は親水性ポリマーの主鎖・側鎖のいずれの末端および非末端部位に結合しても良く、また親水性ポリマー1分子に対して複数個結合しても良い。
(i)アミノ基との反応性官能基をもつ親水性ポリマーに、蛋白質およびペプチドのLys残基のε−アミノ基またはN末端のα−アミノ基を反応させる方法(Int J Oncol. 2003 23(4): 1159-65.)。
蛋白質のアミノ基はLys残基のε−アミノ基またはN末端のα−アミノ基によって提供される。蛋白質のアミノ基と脂質を結合させる場合に、親水性ポリマー誘導体に必要な反応性官能基は、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)、アルデヒド基、トレシル基、ニトロフェニルカルボニル基、アセタール基、カルボキシル基、イソチオシアネート基、ハロゲン化アシル基、ベンゾトリアゾールカーボネート基等が挙げられる。
(ii)チオール基との反応性官能基をもつ親水性ポリマーに、チオール基を有する蛋白質およびペプチドのチオール基を結合させる方法(Dmitri Kirpotin et al, Biochemistry, 1997, 36, 66-75)。
蛋白質へのチオール基の付与は、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(Carlsson, J. et al. Biochem.J. 173, 723 (1978))やN−スクシニミジル−S−アセチルチオアセテート(SATA)、N−スクシニミジル−S−アセチルチオプロピオネート(SATP)、イミノチオラン(Traut, R. R. et al. Biochemistry 12, 3266 (1973))、メルカプトアルキルイミデート等の化合物を用いて行う方法が公知の方法として知られている。上記の方法の他、蛋白質の内在性ジチオール基をTCEP、DTT、メルカプトエタノール、システイン、システアミン等で還元してチオール基とし、結合に用いることが可能である。特に、蛋白質が抗体の場合には、抗体(全長あるいはフラグメント)のヒンジ領域および重鎖と軽鎖の連結部位のジチオール基の利用が可能であり、抗体と親水性ポリマーとの結合においては内在性チオール基を用いる後者の方法が活性維持の点からより好ましい。例えば、IgG抗体をペプシン等の酵素でF(ab’)2化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られる Fab’に生じるチオール基を結合に供することが可能である(Martin, F. J.et al. Biochemistry 20, 4229 (1981))。IgMの場合は、Millerらの方法(J. Biol. Chem 257, 286 (1965))に準じ、穏和な条件でJ鎖を還元して得られるIgMsのFc部分のチオール基を結合に供することが可能である。
蛋白質のチオール基との結合に必要な官能基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、チオール基等が挙げられる。このような親水性ポリマー誘導体は、例えば、PEG-Maleimide〔NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT MA SERIES (Maleimide-PEGs)〕、PEG-vinylsulfone (Bo B.Lundberg et al, Int. J. Pharm, 205, 101-108 (2000))、メトキシ(ヒドラジド)ポリエチレングリコール、ビス(ヒドラジド)ポリエチレングリコール等が挙げられる。マレイミド化試薬としては、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドの他、アミノ基のマレイミド誘導体を作製するために一般に使用されているN−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB),N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)プロピオネート、N‐(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド等が挙げられる。
また、上記マレイミド化試薬にて蛋白質のアミノ基をマレイミド基に置換することも可能である。これらは、チオール基をもつ、例えば、ピリジルジチオプロピオネート(PDP)等を修飾した親水性ポリマーと反応し、共有結合が形成される。
(iii)アルデヒド基との反応性官能基をもつ親水性ポリマーに、蛋白質の糖鎖由来のアルデヒド基を結合させる方法。
通常、真核生物においては、蛋白質は翻訳後修飾によって糖鎖修飾を受ける。特に抗体の場合には、そのFc領域に糖鎖が存在する。これらの糖鎖を酸化して生ずるアルデヒド基とヒドラジドは、反応して共有結合を形成するため、親水性ポリマーにヒドラジドを修飾することで、糖鎖を介して蛋白質およびペプチドを親水性ポリマーに固定化することが可能である(Biochimica et Biophysica Acta 1420 153-167 (1999))。
(iv)親水性ポリマー、蛋白質が各々持つ官能基同士を架橋剤又は縮合剤等を用いて結合させる方法。
親水性ポリマーの有するアミノ基をと蛋白質のアミノ基を結合させることで、親水性ポリマーに蛋白質を固定化することが可能である。アミノ基を有する親水性ポリマーの誘導体は、例えば、PEG-NH2〔NOF CORPORATION製品、SUNBRIGHT PA SERIES(Amino-PEGs)〕等が挙げられる。蛋白質のアミノ基はリジン残基のε−アミノ基およびN末端のα−アミノ基によって提供される。アミノ基をもつ親水性ポリマーに蛋白質を固定化するには、グルタルアルデヒドを用いて親水性ポリマーのアミノ基と蛋白質のアミノ基とを直接架橋させる方法、反応活性試薬を用いて親水性ポリマーのアミノ基と蛋白質のアミノ基とを化学結合させる方法などの公知の方法が採用できる。二価架橋剤としては、グルタルアルデヒドの他、ジサクシンイミジルスベレート(DSS)、フタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド、メチルピメリミデート(DMP)、ジイソチオシアノスチルベンジスルホン酸ナトリウム(DIDS)等が挙げられる。反応活性試薬としては、N−ヒドロキシスクシンイミジル 3−(2−ピリジチオ)プロピオネート、m−マレイミドベンジイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート、ジスクシンイミジルスベレート等が挙げられる。
親水性ポリマーのもつアミノ基と蛋白質のもつチオール基、あるいは親水性ポリマーのもつチオール基と蛋白質のもつアミノ基を結合させることで、親水性ポリマーに蛋白質を固定化することが可能である。アミノ基とチオール基に反応性をもつ二価架橋剤としては、N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)アセテート(SMPA)、N−スクシンイミジルブロモアセテート、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)プロピオネート(SMPP)、N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド(GMBS)、N−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)等が挙げられる。
親水性ポリマーのカルボキシル基と蛋白質のアミノ基、あるいは親水性ポリマーのもつアミノ基と蛋白質のもつカルボキシル基を縮合剤にて結合させることで、親水性ポリマーに蛋白質を固定化することが可能である(Maruyama K et al, Biochimica et Biophysica, 1234,74-80 (1995))。
親水性ポリマーのチオール基と蛋白質のチオール基を結合させることで、親水性ポリマーに蛋白質を固定化することが可能である。例えば、ビスマレイミドヘキサン等の架橋剤が用いられる。
(v)ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンの特異的親和性を利用して蛋白質と親水性ポリマーを結合させる方法。
ビオチン修飾蛋白質をストレプトアビジンまたはアビジン修飾親水性ポリマーと非共有結合させることが可能である(Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12: 311-325 (2002))。また、ストレプトアビジンおよびアビジンは4量体を形成しており、最大4分子のビオチンの結合が可能であることを利用し、ビオチン修飾蛋白質を、アビジンまたはストレプトアビジンリンカーによってビオチン修飾親水性ポリマーに非共有結合させることができる(Biochimica et Biophysica Acta 1239 133-144 (1995))。
(vi)ヒスチジンタグとニッケルイオンとの親和性を利用して、蛋白質と親水性ポリマーを結合させる方法。
ポリヒスチジンタグ(His-Tag)とニッケルイオン(Ni2+)の親和性を利用してリポソームに蛋白質およびペプチドを固定化することが可能である(Molecular Pharmaceutics 3, 5, 525-530)。遺伝子工学的手法により、His−Tagを融合したキメラ蛋白質あるいはペプチドを公知の方法により発現、精製することが可能である。また、金属(Ni2+)キレートサイトをもつNTA(nitriloacetic acid)、IDA(iminodiacetic acid)等を親水性ポリマーの末端あるいは側鎖に修飾することで、Ni2+が固定化されたリポソームを調製することが可能である。該リポソームのNi2+にHis-Tagが特異的に結合することで、His-Tag融合蛋白質あるいはペプチドが親水性ポリマーに固定化される。
(vii)抗体のFcドメインに親和性のある蛋白質あるいはその蛋白質ドメインを介して、抗体の全長分子を結合させる方法。
抗体のFcドメインに親和性のあるProtein AあるいはProtein G蛋白質あるいは、Fcドメインとの結合に関与するProtein A, Protein Gのドメイン蛋白質を介して、抗体の全長分子を担持させることが可能である。その際Protein A, Protein G蛋白質は、上記(i)乃至(vi)の方法のいずれかで親水性ポリマーに結合させることができる(BMC Immunology 2006,7: 24)。
上記(i)乃至(vii)において、蛋白質と反応性をもつ親水性ポリマーの割合を調節することで、親水性ポリマーを介してリポソームに固定化させる蛋白質の量を任意に変化させることが可能である。
7.イムノリポソームの形態
リポソームは、典型的には、内部に水相を有する単層または多層の脂質二重層から構成される閉鎖小胞であるが(D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications”, Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993))、本発明においては、より広く、粒子状の脂質複合体を意味する。典型的な閉鎖小胞構造をとるリポソームの形態としては、多重膜リポソーム(MLV;multilamellar vesicle)、小さな一枚膜リポソーム(SUV;small unilamellar vesicle)、大きな一枚膜リポソーム(LUV;large unilamellar vesicle)のいずれであっても良く、脂質複合体の構造に明確な規定はない。本発明におけるイムノリポソームの粒子径は、上記のサイズ調節法により異なるが、その製造可能なリポソームサイズの下限は、約20nm程度である(D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic toapplications”, Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993))。一方、リポソームサイズの上限は、血管内投与が可能な、7μm以下であることが必要である。本発明で用いるイムノリポソームの粒子径は特に制限されないが、通常0.03乃至5μm程度である。注射による全身投与の場合、リポソームの血中滞留性、腫瘍や炎症部位等の病態組織への集積性を考慮して、400nm以下であることが望ましい。リポソームを構成する脂質成分およびその組成比率は、リポソーム分散液のpH、浸透圧、ゼーター電位、相転移温度、生体内での血中滞留性、安定性等の物性を考慮して選定することができる。
8.イムノリポソームの調製法および精製法
(1)イムノリポソーム調製法
本発明のリポソーム製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法(D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications”, Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993))はいずれも適用可能である。上述の脂質を用い、薄膜法、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル注入法、脱水−再水和法、界面活性剤透析法、水和法、凍結融解法、小型リポソーム小胞のカルシウム誘発融合法、メカノケミカル法、ヘキサン−span80透析法、有機溶媒小球蒸留法等により製造でき、超音波照射法、凍結融解後の超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等の方法によりリポソームの粒子径を調節することができる。また、公知の方法により、多重膜リポソームから一枚膜リポソーム、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことが可能である。
また、公知の方法により薬物をリポソームの内部に担持させることが可能である。一般的には、被包化法、リモートローディング法(pH勾配法)、対イオン濃度勾配法、凍結融解法、界面活性剤除去法、エレクトロポレーション法、超臨界二酸化炭素法、フィルムローディング法等が挙げられる(G.Gregoriadis,“Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques”,2nd edition,Vol.I-III,CRC Press)。薬物の封入形態は、リポソームに薬物が担持された構造体であればその形態は特に制限されないが、例えば、薬物を脂質小胞の閉鎖空間内に内包した形態、脂質層間に内包した形態、脂質層内に包含した形態などが挙げられ、これらの組合せによる形態であっても良い。
イムノリポソームの調製法は、(A)反応性官能基をもつ脂質あるいは親水性ポリマーを含むリポソームを調製し、それに対して蛋白質を反応させる方法、あるいは(B)反応性官能基をもつ親水性ポリマーに蛋白質を反応させ、別途調製した反応性官能基を持たないリポソームと融合させる方法、に大別される。
(A)上記のリポソーム調製法において、リポソーム構成脂質成分の一部として、反応性官能基を有する脂質、あるいは反応性官能基を有する親水性ポリマー誘導体脂質を使用し、任意の方法でリポソームを調製する。得られたリポソームと蛋白質を、上記6−(2)、(3)に記載のように反応させ、リポソームの脂質分子あるいは親水性ポリマーと蛋白質を共有結合あるいは非共有結合させる。
(B)脂質‐親水性ポリマー‐蛋白質の結合体はリポソーム(反応性官能基は必要としない)との混合分散液中で、脂質分子の相転移温度付近およびそれ以上の温度条件下で融合、すなわち両親媒性小胞形成脂質の再構成が起こり、水相に親水性ポリマー−蛋白質部分が、脂質相に脂質部分が配置されたイムノリポソームが得られることが知られている(Paul S.Uster et al. FEBS, 1996, 243-246; T.Ishida et al. FEBS, 1999, 129-133)。ここで、リポソームと脂質‐親水性ポリマー‐蛋白質の結合体を融合させる適当な条件は、当該脂質の物性等を考慮して選択される。
(2)イムノリポソームの精製法
イムノリポソームの精製とは、上記のイムノリポソーム調製法8.(1)の過程で生じた、リポソームに結合しなかった未反応の蛋白質あるいはペプチド等の分離、あるいは上記のイムノリポソーム調製法8.(1)の過程で生じた、リポソームと融合しなかった親水性ポリマー−蛋白質の分離を意味する。イムノリポソームの精製は、クロマトグラフィーによる分離、限外濾過、透析、超遠心分離等が挙げられる。
イムノリポソームの精製とは、上記のイムノリポソーム調製法8.(1)の過程で生じた、リポソームに結合しなかった未反応の蛋白質あるいはペプチド等の分離、あるいは上記のイムノリポソーム調製法8.(1)の過程で生じた、リポソームと融合しなかった親水性ポリマー−蛋白質の分離を意味する。イムノリポソームの精製は、クロマトグラフィーによる分離、限外濾過、透析、超遠心分離等が挙げられる。
(3)イムノリポソームの抗体密度測定法
イムノリポソームの「抗体密度」とは、イムノリポソームを構成する総脂質モル数に対する、当該イムノリポソームに含有される抗体のモル数の割合をモルパーセントとして標記したものと定義する。ここで、総脂質とは上記5−(1)で列挙した両親媒性小胞形成脂質に含まれ、リポソームを構成するすべての脂質を意味する。
脂質の定量方法としては、例えば、ラジオアイソトープによる方法(Maehama T, et al, Anal Biochem.279 (2): 248,2000)、高速液体クロマトグラフィーによる方法(Serunian L.A.et al, Methods Enzymol.1991; 198: 78)、ガスクロマトグラフィーによる方法(Hoving EB,et al, J Chromatogr B Biomed Appl .1995, 15; 671 (1-2): 341)、質量分析による方法(Wenk M.R.et al, Nat Biotechnol. 2003, 21 (7): 813)、吸光光度法、化学的定量法、酵素的定量法等が挙げられる。特に、リン脂質は、Bartlett法(Bartlett GR.et al, J Biol Chem. 1959, 234 (3): 46)、Stewart法(John Charles,et al,Anal Biochem.1980,1; 104 (1): 10)、また、ホスファチジルコリン類等のコリンを含む脂質の場合にはコリンオキシダーゼを利用した酵素的定量法(Takayama M, et al, Clin Chim Acta. 1977, 15; 79 (1): 93)、コレステロールの場合には、コレステロールオキシダーゼを利用した酵素的定量法(Allain CC, et al, Clin Chem.1974,20 (4): 470)等が挙げられる。ポリエチレングリコールの定量は示差屈折率測定(“Comprehensive Polymer Science”,1st Edition, 1989)、ピクリン酸法(Int.J.Pharm. 203, 255, 2000)等により行うことが可能である。総脂質量は、上記の方法から総脂質量あるいは特定の脂質成分の脂質量を測定し、該脂質の総脂質量に対する構成比率(理論値)から算出する。ただし、リポソーム構成脂質の構成比率は、イムノリポソームの作製工程で変動しないものと仮定する。
蛋白質の定量方法としては、CBQCA法(You WW ,et al, Anal Biochem. 15; 244 (2): 277)、紫外吸収法、Biuret法、Bradford法、Kieldahl法、Lowry法等の公知の方法により行うことが可能である。
イムノリポソームが抗体の全長分子を含有する場合には、0.000014mol%乃至0.23mol%、好適には0.002mol%乃至0.14mol%の範囲で抗体密度を選択することができる。イムノリポソームが抗体のF(ab’)2を含有する場合には、0.000014mol%乃至0.23mol%、好適には0.006mol%乃至0.11mol%の範囲で抗体密度を選択することができる。イムノリポソームがFab’を含有する場合には、0.000014mol%乃至0.94mol%、好適には0.005mol%乃至0.56mol%の範囲で抗体密度を選択することができる。イムノ
リポソームが単鎖可変部位抗体を含有する場合には、0.000014mol%乃至1.8mol%、好適には0.005mol%乃至0.56mol%の範囲で抗体密度を選択することができる。
リポソームが単鎖可変部位抗体を含有する場合には、0.000014mol%乃至1.8mol%、好適には0.005mol%乃至0.56mol%の範囲で抗体密度を選択することができる。
ここで、イムノリポソームの最小抗体密度(0.000014mol%)は、粒子径1000nmのイムノリポソームに各種抗体が2個結合している状態を意味する。最大抗体密度(抗体全長:0.23mol%、F(ab’)2:0.23mol%、Fab’:0.94mol%、scFv:1.8mol%)は、イムノリポソーム上に抗体が最密状態で存在している状態を意味する。すなわち、イムノリポソーム上の抗体の占有面積を、各種抗体分子の長径を直径とする円面積と仮定し、イムノリポソームの表面積を抗体分子の円面積で除した値の抗体数が存在する状態を、抗体が最密に配置された状態とする(Allen et al. Biochimica et Biophysica Acta (1995))。抗体分子の長径は、抗体全長を14.2nm、F(ab’)2を14.2nm、Fab’を7nm、scFvを5nmとした。抗体全長、F(ab’)2、Fab’の長径に関しては、Raghupathy et al., The Journal of Biological Chemistry (1971)に記載の値を採用した。scFvの長径に関しては、Raghupathy et al., The Journal of Biological Chemistry (1971)を参照し、さらに、Hoedemaeker et al., J. Biol. Chem (1997)に記載のscFvの結晶構造から長径を算出し、5nmを採用した。
9.イムノリポソームを含有する医薬
上述の「8.イムノリポソーム調整法および精製法」の項に記載された方法で得られるイムノリポソームは、生体内でのDR5, Fas等のアポトーシス関連受容体の生物活性、即ち、受容体を介して癌細胞に対してアポトーシスを誘導し癌細胞の増殖を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療剤として用いることができる。
上述の「8.イムノリポソーム調整法および精製法」の項に記載された方法で得られるイムノリポソームは、生体内でのDR5, Fas等のアポトーシス関連受容体の生物活性、即ち、受容体を介して癌細胞に対してアポトーシスを誘導し癌細胞の増殖を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療剤として用いることができる。
in vitroでのイムノリポソームによる抗腫瘍活性は、アポトーシス関連受容体を過剰発現している細胞における細胞の増殖の抑制活性で測定することができる。
例えば、DR5を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃度でイムノリポソームを添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。
in vivoでの実験動物を利用したイムノリポソームの癌に対する治療効果は、例えば、DR5を高発現している腫瘍細胞株を移植したヌードマウスにイムノリポソームを投与し、癌細胞の変化を測定することができる。
癌の種類としては、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、血球癌(白血病、リンパ腫等)等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞がデスドメイン含有受容体を発現している限りこれらに限定されない。
また、FasおよびDR5に対する抗体は炎症性細胞に対してアポトーシスを誘導することが知られている(J. Clin. Invest. 1996, 98 (2), 271-278; Int. Immunol. 1996, 8 (10), 1595-1602)。従って、本発明のイムノリポソームは、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療剤として用いることも可能である。この自己免疫または炎症性の疾患としては、例として、全身性エリテマトーデス、橋本病、関節リウマチ、宿主移植片病、シェ−グレン症候群、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫溶血性貧血、生殖不能症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血栓不足紫斑病、インスリン依存糖尿病、アレルギー、喘息、アトピー疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球腎炎、再生不良性貧血、臓器移植後の拒絶反応が挙げられる。
本発明は、治療に有効な量のイムノリポソームと薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び/又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
本発明の医薬組成物は、pH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、維持したり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。
製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない:グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素、トリス−塩酸(Tris-Hcl)溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルビテート20やポリソルビテート80等ポリソルビテート、トリトン(triton)、トロメタミン(tromethamine)、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び/又は薬学上の補助剤。
これらの製剤用の物質の添加量は、イムノリポソームの重量に対して0.01〜100倍、特に0.1〜10倍添加するのが好ましい。
製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。
適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩液、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。
中性の生理食塩液や血清アルブミンを含む生理食塩液を担体に用いることもできる。
適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩液、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。
中性の生理食塩液や血清アルブミンを含む生理食塩液を担体に用いることもできる。
医薬組成物にはpH7.0-8.5のTrisバッファーやpH4.0-5.5の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。
本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。
本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。
イムノリポソームを含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。
製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗体の抗原に対する親和性、即ち、抗原に対する解離定数(Kd値)に対し、親和性が高い(Kd値が低い)ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。
投与量は、イムノリポソームをヒトに対して投与する際には、抗体量換算として約0.1〜100mg/kgを1〜30日間に1回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング(Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊)に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
イムノリポソームに結合した蛋白質の濃度はCBQCA Protein Quantitation Kit(Molecular Probes)を用いて添付instructionに従い定量した。リポソームのリン脂質濃度はリン脂質Cテストワコー(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)を用いて添付instructionに従い定量した。イムノリポソームの粒子径は、粒子径測定機(Nicomp Particle Sizer Model 370,Nicomp Particle Sizing Systems)で測定した。
hTRA-8 F(ab’)2の調製
抗ヒトDR5抗体hTRA-8を酢酸バッファー(20mM 酢酸ナトリウム,pH4.5)で10 mg/mlの濃度に調製した。なお、hTRA-8はマウス抗ヒトDR5抗体であるTRA-8 (Nature Med.2001,7(8), 954-60)をヒト化した抗体であり、その重鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列を持ち、軽鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列を持つ。配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列の1〜118番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhTRA-8の重鎖可変領域に相当し、配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列の1〜107番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhTRA-8の軽鎖可変領域に相当する。本抗体溶液 1mlに、Immobilized pepsin(Pierce Biotechnology,Inc.) 125 μlを添加した後、37℃で8.5 hrインキュベーションし、本抗体をF(ab’)2フラグメントへ断片化させた。反応溶液をスピンダウンし、上清をろ過してImmobilized pepsinを除去した。イオン交換クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,Resource S 6 ml);A液(50 mM クエン酸バッファー,pH4.0)、B液(50 mM クエン酸バッファー、1 M NaCl, pH4.0);Gradient(B液15→40%,50CV ,linear gradient);4℃;6 ml/min;検出波長 UV 280 nm)によって、ペプチド断片及び未消化の全長hTRA-8を除去し、F(ab’)2分画(57-111 mlの溶出分画)を回収した。Labscale TFF system (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(MILLIPORE INC., Pellicon XL ,Biomax 50(分画分子量;50,000))を用いた限外濾過操作により、クエン酸バッファーをHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)に交換した。
抗ヒトDR5抗体hTRA-8を酢酸バッファー(20mM 酢酸ナトリウム,pH4.5)で10 mg/mlの濃度に調製した。なお、hTRA-8はマウス抗ヒトDR5抗体であるTRA-8 (Nature Med.2001,7(8), 954-60)をヒト化した抗体であり、その重鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列を持ち、軽鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列を持つ。配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列の1〜118番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhTRA-8の重鎖可変領域に相当し、配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列の1〜107番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhTRA-8の軽鎖可変領域に相当する。本抗体溶液 1mlに、Immobilized pepsin(Pierce Biotechnology,Inc.) 125 μlを添加した後、37℃で8.5 hrインキュベーションし、本抗体をF(ab’)2フラグメントへ断片化させた。反応溶液をスピンダウンし、上清をろ過してImmobilized pepsinを除去した。イオン交換クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,Resource S 6 ml);A液(50 mM クエン酸バッファー,pH4.0)、B液(50 mM クエン酸バッファー、1 M NaCl, pH4.0);Gradient(B液15→40%,50CV ,linear gradient);4℃;6 ml/min;検出波長 UV 280 nm)によって、ペプチド断片及び未消化の全長hTRA-8を除去し、F(ab’)2分画(57-111 mlの溶出分画)を回収した。Labscale TFF system (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(MILLIPORE INC., Pellicon XL ,Biomax 50(分画分子量;50,000))を用いた限外濾過操作により、クエン酸バッファーをHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)に交換した。
hHFE7A F(ab’)2の調製
抗ヒトFas抗体hHFE7Aを酢酸バッファー(20 mM 酢酸ナトリウム,pH4.5)で10 mg/mlの濃度に調製した。なお、hHFE7Aはマウス抗ヒトFas抗体であるHFE7A (Int.Immunol.2000, 12(4), 555-62)をヒト化した抗体であり、その重鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列を持ち、軽鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列を持つ。配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列の1〜139番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhHFE7Aの重鎖可変領域に相当し、配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列の1〜131番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhHFE7Aの軽鎖可変領域に相当する。本抗体溶液1 mlに、Immobilized pepsin (Pierce Biotechnology, Inc.) 125 μlを添加した後、37℃で8.5 hrインキュベーションし、本抗体をF(ab’)2フラグメントへ断片化させた。反応溶液をスピンダウンし、上清をろ過してImmobilized pepsinを除去した。イオン交換クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC., Resource S 6 ml);A液(50 mM クエン酸バッファー,pH4.0)、B液(50 mM クエン酸バッファー、1 M NaCl, pH4.0);Gradient(B液15→40%, 50CV, linear gradient); 4℃; 6 ml/min; 検出波長UV 280 nm)によって、ペプチド断片及び未消化の全長hHFE7Aを除去し、F(ab’)2分画(40-65 mlの分画)を回収した。Labscale TFF system (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(MILLIPORE INC., Pellicon XL, Biomax 50(分画分子量;50,000))を用いた限外濾過操作により、クエン酸バッファーをHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)に交換した。
抗ヒトFas抗体hHFE7Aを酢酸バッファー(20 mM 酢酸ナトリウム,pH4.5)で10 mg/mlの濃度に調製した。なお、hHFE7Aはマウス抗ヒトFas抗体であるHFE7A (Int.Immunol.2000, 12(4), 555-62)をヒト化した抗体であり、その重鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列を持ち、軽鎖アミノ酸配列として配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列を持つ。配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列の1〜139番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhHFE7Aの重鎖可変領域に相当し、配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列の1〜131番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はhHFE7Aの軽鎖可変領域に相当する。本抗体溶液1 mlに、Immobilized pepsin (Pierce Biotechnology, Inc.) 125 μlを添加した後、37℃で8.5 hrインキュベーションし、本抗体をF(ab’)2フラグメントへ断片化させた。反応溶液をスピンダウンし、上清をろ過してImmobilized pepsinを除去した。イオン交換クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC., Resource S 6 ml);A液(50 mM クエン酸バッファー,pH4.0)、B液(50 mM クエン酸バッファー、1 M NaCl, pH4.0);Gradient(B液15→40%, 50CV, linear gradient); 4℃; 6 ml/min; 検出波長UV 280 nm)によって、ペプチド断片及び未消化の全長hHFE7Aを除去し、F(ab’)2分画(40-65 mlの分画)を回収した。Labscale TFF system (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(MILLIPORE INC., Pellicon XL, Biomax 50(分画分子量;50,000))を用いた限外濾過操作により、クエン酸バッファーをHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)に交換した。
hTRA-8 scFvの調製
(1)hTRA8 scFv発現ベクターの作成
hTRA8のH鎖領域をコードしたベクターTRA8-H pHA15-1をVHの鋳型にし、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、hTRA8 scFvの前半部分をコードするDNAをPCR法により増幅した。
(1)hTRA8 scFv発現ベクターの作成
hTRA8のH鎖領域をコードしたベクターTRA8-H pHA15-1をVHの鋳型にし、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、hTRA8 scFvの前半部分をコードするDNAをPCR法により増幅した。
同様に、hTRA8のL鎖領域を領域をコードしたベクターTRA8-L LM-1LをVLの鋳型にし、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、hTRA8 scFvの後半部分をコードするDNAをPCR法により増幅した。
この時、VHとVLの間にフレキシブルなペプチドリンカー(GGGGS)×3を、C末端にHHHHHHGGAC配列(ヒスチジン6残基タグ及びCys残基を含む配列)が付加されるようプライマーを設計した。そして、これら2つのDNA断片を5’にNdeI(TAKARA BIO INC.)、3’にXhoI(TAKARA BIO INC.)部位を挿入し、PCR法により連結し、hTRA8 scFvをコードするDNAを作製した。
作製したDNAを制限酵素NdeI、XhoIで消化した後、pET22b(+)(Novagen)のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素NdeI、XhoI部位に挿入し、pET22b(+)hTRA8 scFv発現ベクターを構築した。
(2)hTRA8 scFvの発現
(1)にて得られたpET22b(+)hTRA8 scFv発現ベクターを、公知の方法に従い、OrigamiB (DE3)(Novagen)大腸菌株へ導入し100 μg/mlのアンピシリン(Sigma-Aldrich)、25 μg/mlのカナマイシン(WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)、34 μg/mlのクロラムフェニコール(WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)を含有するLBプレートに塗布し、形質転換体を得た。次に、この形質転換体のコロニーを20 mlのLB培地(Invitrogen)中で振とうしながら終夜37℃で飽和近くまで増殖させ、それを2 Lの新しいLB培地に接種した。細菌をOD 600 nm=0.8まで2リットル坂口フラスコ中で37℃、通気培養で増殖させた。温度を16℃に低下させ、その後0.5 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG) (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)を用いてタンパク質発現を惹起した。細菌培養を通気培養下16℃で18時間続けた。
(3)タンパク質精製
細胞を、6000gで20分間遠心してペレット化し、20 mM Tris-HCl (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.) (pH8.0)、100 mM NaCl (MANAC Incorporated)、4 mM CHAPS(Sigma-Aldrich)、10% glycerol (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.) (v/v)、プロテアーゼ阻害剤カクテルComplete mini (EDTA free) (Roche Diagnostic GmbH)を有する緩衝剤に再懸濁し-80℃に保存した。
再懸濁液を流水で解凍させ、氷上で超音波破砕を行い、24,000xg、4℃、20分間の遠心分離によって細胞片を除去した。
(2)hTRA8 scFvの発現
(1)にて得られたpET22b(+)hTRA8 scFv発現ベクターを、公知の方法に従い、OrigamiB (DE3)(Novagen)大腸菌株へ導入し100 μg/mlのアンピシリン(Sigma-Aldrich)、25 μg/mlのカナマイシン(WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)、34 μg/mlのクロラムフェニコール(WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)を含有するLBプレートに塗布し、形質転換体を得た。次に、この形質転換体のコロニーを20 mlのLB培地(Invitrogen)中で振とうしながら終夜37℃で飽和近くまで増殖させ、それを2 Lの新しいLB培地に接種した。細菌をOD 600 nm=0.8まで2リットル坂口フラスコ中で37℃、通気培養で増殖させた。温度を16℃に低下させ、その後0.5 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG) (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.)を用いてタンパク質発現を惹起した。細菌培養を通気培養下16℃で18時間続けた。
(3)タンパク質精製
細胞を、6000gで20分間遠心してペレット化し、20 mM Tris-HCl (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.) (pH8.0)、100 mM NaCl (MANAC Incorporated)、4 mM CHAPS(Sigma-Aldrich)、10% glycerol (WAKO Purechemicals Industries, Ltd.) (v/v)、プロテアーゼ阻害剤カクテルComplete mini (EDTA free) (Roche Diagnostic GmbH)を有する緩衝剤に再懸濁し-80℃に保存した。
再懸濁液を流水で解凍させ、氷上で超音波破砕を行い、24,000xg、4℃、20分間の遠心分離によって細胞片を除去した。
遠心上清を0.45 ulのフィルターを通したのち、Hisタグ・アフィニティカラムにて精製を行った。すなわち、AKTA Primeシステム(GE Healthcare Inc.)にてカラムHis-Trap HP 1 ml (GE Healthcare Inc.) にサンプル・アプライ後、流量1 ml/minで20 mM Tris-HCl (pH7.5)、500 mM NaCl、40 mM imidazole(CALBIOCHEM)、0.6% CHAPS、1 mM DTT(Sigma-Aldrich)にて、5カラム体積分洗浄し、次に20 mM Tris-HCl (pH7.5)、500 mM NaCl、0.6% CHAPS、1 mM DTT、500 mM imidazoleでグラジエント溶出させた。
His-Trap HP溶出各フラクションをSDS-PAGEで解析し、scFvを含む画分に対して、さらにゲルろ過クロマトグラフィー精製を行った。すなわち、カラムSuperdex75pg HiLoad16/60 (GE Healthcare Inc.) に50 mM Tris-HCl (pH7.5)、500 mM NaCl、10% glycerol、10 mM CHAPS、1 mM DTTを用いてサンプルを添加した。Superdex75pg HiLoad16/60溶出各フラクションを分取し、SDS-PAGEで解析し、scFv画分を回収した。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
参考例1で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度2.5 mg/ml, HEPESバッファー)を、10mM L−システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column; HEPESバッファー)によってL−システインを除去し、hTRA-8 Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol)succinyldistearoylphosphatidylethanolamine,以下DSPE- PEG3400- Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、22 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 3 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:50 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(3.6 mg/ml, 15.3 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,500 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.1、抗体濃度33.5 μg/ml、リン脂質濃度6.3 mM、抗体密度0.0058 mol%、平均粒子径73.0±35.9 nm(HEPESバッファー))。
参考例1で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度2.5 mg/ml, HEPESバッファー)を、10mM L−システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column; HEPESバッファー)によってL−システインを除去し、hTRA-8 Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol)succinyldistearoylphosphatidylethanolamine,以下DSPE- PEG3400- Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、22 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 3 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:50 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(3.6 mg/ml, 15.3 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,500 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.1、抗体濃度33.5 μg/ml、リン脂質濃度6.3 mM、抗体密度0.0058 mol%、平均粒子径73.0±35.9 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合については、以下のように行った。hTRA-8 Fab’: DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (3.6 mg/ml, 152 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,500 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.2、抗体濃度278.5 μg/ml、リン脂質濃度6.1mM、抗体密度0.050 mol%、平均粒子径86.6±39.9 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合については、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’: DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(3.6 mg/ml, 244 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 320μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 3.2μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.3、抗体濃度413.7 μg/ml、リン脂質濃度4.38 mM、抗体密度0.102 mol%、平均粒子径84.4±42.2 nm(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol)succinyldistearoylphosphatidylethanolamine,以下DSPE- PEG3400- Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、11 mg、3.9 mg、3.15 mg(mol比100:66:5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 1.5 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 1.5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
抗体のリポソームへの結合については、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’: DSPE-PEG3400-Mal=1:1 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.64 mg/ml, 237 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.4、抗体濃度394.5 μg/ml、リン脂質濃度1.91 mM、抗体密度0.224 mol%、平均粒子径83.7±40.8 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol)succinyldistearoylphosphatidylethanolamine,以下DSPE- PEG3400- Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、11 mg、3.9 mg、3.15 mg(mol比100:66:5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 1.5 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にHEPESバッファー(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 1.5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
抗体のリポソームへの結合については、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’: DSPE-PEG3400-Mal=1:1 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.64 mg/ml, 237 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.4、抗体濃度394.5 μg/ml、リン脂質濃度1.91 mM、抗体密度0.224 mol%、平均粒子径83.7±40.8 nm(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
参考例−1で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度5 mg/ml,HEPESバッファー)を、40 mM(±)−ジチオトレイトール((±)−Dithiothreitol,以下DTTと標記;Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で30 分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column; HEPESバッファー)によってDTTを除去し、hTRA-8 Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyldistearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、1762 mg、618.6 mg、2481.4 mg(mol比100:66:1)にエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 90 mlを加えて溶解させた。この脂質溶液をHEPESバッファー(20mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 900 mlに滴下し、リポソームの粗分散液を得た。続いて、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.))、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,(MILLIPORE INC.))にて、リポソーム分散液の濃度を10 mM DPPCに調製し、高圧連続式ホモジナイザー(EmulsiFlex-C5, AVESTIN, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Nucleopore Track-Etch Membrane, Whatman INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:25 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.86 mg/ml, 5.7 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 132ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.32 mlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,(MILLIPORE INC.))によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.5、抗体濃度1011.0 μg/ml、リン脂質濃度27.63 mM、抗体密度0.040 mol%、平均粒子径53.7±22.4 nm (HEPESバッファー))。
参考例−1で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度5 mg/ml,HEPESバッファー)を、40 mM(±)−ジチオトレイトール((±)−Dithiothreitol,以下DTTと標記;Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で30 分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column; HEPESバッファー)によってDTTを除去し、hTRA-8 Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyldistearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、1762 mg、618.6 mg、2481.4 mg(mol比100:66:1)にエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 90 mlを加えて溶解させた。この脂質溶液をHEPESバッファー(20mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 900 mlに滴下し、リポソームの粗分散液を得た。続いて、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.))、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,(MILLIPORE INC.))にて、リポソーム分散液の濃度を10 mM DPPCに調製し、高圧連続式ホモジナイザー(EmulsiFlex-C5, AVESTIN, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Nucleopore Track-Etch Membrane, Whatman INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:25 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.86 mg/ml, 5.7 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 132ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.32 mlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,(MILLIPORE INC.))によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.5、抗体濃度1011.0 μg/ml、リン脂質濃度27.63 mM、抗体密度0.040 mol%、平均粒子径53.7±22.4 nm (HEPESバッファー))。
実施例5の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例5の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (4.86 mg/ml ,9.05 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 49 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 490 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50, Biomax 300,分画分子量;300,000, (MILLIPORE INC.))によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.6、抗体濃度1363.3 μg/ml、リン脂質濃度8.85 mM、抗体密度0.167 mol%、平均粒子径50.3±23.6 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。 抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10mM DPPC ,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.7、抗体濃度96.8 μg/ml、リン脂質濃度1.64 mM、抗体密度0.064 mol%、平均粒子径101.1±44.2 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml,16.5 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100mM, 3μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.8、抗体濃度70.7 μg/ml、リン脂質濃度1.39 mM、抗体密度0.055 mol%、平均粒子径83.3±40.3 nm(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例−1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
卵黄レシチン(Egg Yolk Lecithin,以下eggPCと表記; Q.P.Corporation, PC-98N)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、24 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(eggPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM eggPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.9、抗体濃度138.8 μg/ml、リン脂質濃度2.32 mM、抗体密度0.065 mol%、平均粒子径90.2±13.3 nm(HEPESバッファー))。
実施例−1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
卵黄レシチン(Egg Yolk Lecithin,以下eggPCと表記; Q.P.Corporation, PC-98N)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、24 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(eggPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM eggPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.9、抗体濃度138.8 μg/ml、リン脂質濃度2.32 mM、抗体密度0.065 mol%、平均粒子径90.2±13.3 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例9の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 16.5 μl)とリポソーム分散液(10 mM eggPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.10、抗体濃度90.9 μg/ml、リン脂質濃度2.98 mM、抗体密度0.033 mol%、平均粒子径83.1±13.0 nm(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジミリストイルホスファチジルコリン(L-α-Dimyristoyl Phosphatidylcholine,以下DMPCと表記;NOF CORPORATION, COATSOME MC-4040)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、20.3 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3ml加えてリポソーム(DMPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM DMPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.11、抗体濃度148.5 μg/ml、リン脂質濃度2.47 mM、抗体密度0.065 mol%、平均粒子径117.9±47.1 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジミリストイルホスファチジルコリン(L-α-Dimyristoyl Phosphatidylcholine,以下DMPCと表記;NOF CORPORATION, COATSOME MC-4040)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、20.3 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3ml加えてリポソーム(DMPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM DMPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.11、抗体濃度148.5 μg/ml、リン脂質濃度2.47 mM、抗体密度0.065 mol%、平均粒子径117.9±47.1 nm(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例11の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 16.5 μl)とリポソーム分散液(10 mM DMPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.12、抗体濃度76.8 μg/ml、リン脂質濃度2.94 mM、抗体密度0.028 mol%、平均粒子径119.3±45.0 nm(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジオレオイルホスファチジルコリン(L-α-Dioleoyl Phosphatidylcholine,以下DOPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-8181)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、23.6 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(DOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM DOPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.13、抗体濃度136.3 μg/ml、リン脂質濃度2.30 mM、抗体密度0.064 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジオレオイルホスファチジルコリン(L-α-Dioleoyl Phosphatidylcholine,以下DOPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-8181)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、23.6 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(DOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM DOPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.13、抗体濃度136.3 μg/ml、リン脂質濃度2.30 mM、抗体密度0.064 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例13の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (5 mg/ml, 16.5 μl)とリポソーム分散液(10mM DOPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.14、抗体濃度72.9 μg/ml、リン脂質濃度2.13 mM、抗体密度0.037 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例−1と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン(L-α-Distearoyl Phosphatidylcholine,以下DSPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-8080)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、23.7 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.)3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3ml加えてリポソーム(DSPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 165 μl)とリポソーム分散液(10 mM DSPC,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.15、抗体濃度178.9 μg/ml、リン脂質濃度1.97 mM、抗体密度0.099 mol%(HEPESバッファー))。
実施例−1と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン(L-α-Distearoyl Phosphatidylcholine,以下DSPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-8080)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、23.7 mg、7.73 mg、1.26 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.)3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3ml加えてリポソーム(DSPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 165 μl)とリポソーム分散液(10 mM DSPC,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.15、抗体濃度178.9 μg/ml、リン脂質濃度1.97 mM、抗体密度0.099 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例15の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 66 μl)とリポソーム分散液(10 mM DSPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.16、抗体濃度60.4 μg/ml、リン脂質濃度1.53 mM、抗体密度0.043 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION, COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、およびマレイミド基を有するジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(以下DSPE-Malと表記;NOF CORPORATION,COATSOME FE-8080MA3)それぞれ、11 mg、3.9 mg、0.69 mg(mol比100:66:5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 1.5 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを1.5 ml加えてリポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-Mal=1:1 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.64 mg/ml, 237 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM,2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のDSPEとが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.17、抗体濃度124.0 μg/ml、リン脂質濃度1.34 mM、抗体密度0.100 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION, COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、およびマレイミド基を有するジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(以下DSPE-Malと表記;NOF CORPORATION,COATSOME FE-8080MA3)それぞれ、11 mg、3.9 mg、0.69 mg(mol比100:66:5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 1.5 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを1.5 ml加えてリポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-Mal=1:1 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(4.64 mg/ml, 237 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM,2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のDSPEとが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.17、抗体濃度124.0 μg/ml、リン脂質濃度1.34 mM、抗体密度0.100 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体の調製
hTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 220 μl)に対して20当量のDSPE-PEG3400-Mal (16.8 mg/ml, 100 μl)を加え、37℃で1 hr反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 40μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体分画(39-54 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体を得た。DSPEあたりのhTRA-8 Fab’の量は、1428.6 μg/μmol DSPEであった。
(3)リポソームの調製
リポソームはジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)を、それぞれ22.05 mg、7.68 mg(mol比3:2)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(4)リポソームとDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体との融合
上述のDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体(抗体濃度489.9 μg/ml,408 μl)とリポソーム分散液(10m M DPPC, 200 μl)を混合し、60℃で3 hrインキュベートした。リポソームと融合しなかったDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム(GE HEALTHCARE INC., 10×300 mm,Sephacryl S-500 HR);HEPESバッファー(pH7.4);4℃;2 ml/min)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.18、抗体濃度73.7 μg/ml、リン脂質濃度2.27 mM、抗体密度0.035 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1の(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’フラグメントを用時調製した。
(2)DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体の調製
hTRA-8 Fab’(5 mg/ml, 220 μl)に対して20当量のDSPE-PEG3400-Mal (16.8 mg/ml, 100 μl)を加え、37℃で1 hr反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 40μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体分画(39-54 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体を得た。DSPEあたりのhTRA-8 Fab’の量は、1428.6 μg/μmol DSPEであった。
(3)リポソームの調製
リポソームはジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)を、それぞれ22.05 mg、7.68 mg(mol比3:2)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に、HEPESバッファーを3 ml加えてリポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出すことで、リポソームの粒子径を整えた。
(4)リポソームとDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体との融合
上述のDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体(抗体濃度489.9 μg/ml,408 μl)とリポソーム分散液(10m M DPPC, 200 μl)を混合し、60℃で3 hrインキュベートした。リポソームと融合しなかったDSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’)複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム(GE HEALTHCARE INC., 10×300 mm,Sephacryl S-500 HR);HEPESバッファー(pH7.4);4℃;2 ml/min)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.18、抗体濃度73.7 μg/ml、リン脂質濃度2.27 mM、抗体密度0.035 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fullbodyのジスルフィド結合の還元
hTRA-8を、抗体濃度2.5 mg/ml、30 mM L-システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)にて室温で90 minインキュヘ゛ートし、hTRA-8 Fullbodyのジスルフィド結合を還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;HEPESバッファー)によって、L−システインを除去し、ジスルフィド結合が還元されたhTRA-8 Fullbodyを得た。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5mg/ml, 450μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.19、抗体濃度23.9 μg/ml、リン脂質濃度3.25 mM、抗体密度0.0029 mol%(HEPESバッファー))。
hTRA-8を、抗体濃度2.5 mg/ml、30 mM L-システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)にて室温で90 minインキュヘ゛ートし、hTRA-8 Fullbodyのジスルフィド結合を還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;HEPESバッファー)によって、L−システインを除去し、ジスルフィド結合が還元されたhTRA-8 Fullbodyを得た。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5mg/ml, 450μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.19、抗体濃度23.9 μg/ml、リン脂質濃度3.25 mM、抗体密度0.0029 mol%(HEPESバッファー))。
実施例19の(1)と同様にして、hTRA-8 Fullbodyのジスルフィド結合を還元した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 180 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries ,Ltd.) 100m M,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表1のNo.20、抗体濃度65.4 μg/ml、リン脂質濃度3.07 mM、抗体密度0.0085 mol%(HEPESバッファー))
実施例19の(1)と同様にして、hTRA-8 Fullbodyのジスルフィド結合を還元した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 45 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.21、抗体濃度41.2 μg/ml、リン脂質濃度3.11 mM、抗体密度0.0053 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hTRA-8 Fullbodyのチオール化
hTRA-8 Fullbody(抗体濃度6 mg/ml, 20mM HEPES, 150 mM NaCl,2 mM EDTA,pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent(2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology,Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;HEPESバッファー)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries ,Ltd.) 100 mM,1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.22、抗体濃度70.3 μg/ml、リン脂質濃度1.17 mM、抗体密度0.024 mol%(HEPESバッファー))。
hTRA-8 Fullbody(抗体濃度6 mg/ml, 20mM HEPES, 150 mM NaCl,2 mM EDTA,pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent(2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology,Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;HEPESバッファー)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries ,Ltd.) 100 mM,1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.22、抗体濃度70.3 μg/ml、リン脂質濃度1.17 mM、抗体密度0.024 mol%(HEPESバッファー))。
実施例22の(1)と同様にして、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 300μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.23、抗体濃度184.4 μg/ml、リン脂質濃度1.07 mM、抗体密度0.0685 mol%(HEPESバッファー))。
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 300μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.23、抗体濃度184.4 μg/ml、リン脂質濃度1.07 mM、抗体密度0.0685 mol%(HEPESバッファー))。
実施例22の(1)と同様にして、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例5の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:45 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 1.1 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 16.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 165 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.24、抗体濃度166.5 μg/ml、リン脂質濃度5.25 mM、抗体密度0.0126 mol%(HEPESバッファー))。
実施例22の(1)と同様にして、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例5の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (5 mg/ml, 4 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 1995 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 19.95 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリホ゜ソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.25、抗体濃度314.5 μg/ml、リン脂質濃度0.96 mM、抗体密度0.131 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hHFE7A Fab’の調製
参考例−2で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度2.5 mg/ml,HEPESバッファー)を、10mM L−システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;HEPESバッファー)によってL−システインを除去し、hHFE7A Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fab’(1.5 mg/ml, 33 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 180 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 1.8 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.26、抗体濃度47.9 μg/ml、リン脂質濃度2.03 mM、抗体密度0.026 mol%(HEPESバッファー))。
参考例−2で調製したF(ab’)2溶液(抗体濃度2.5 mg/ml,HEPESバッファー)を、10mM L−システイン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;HEPESバッファー)によってL−システインを除去し、hHFE7A Fab’フラグメントを得た。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fab’(1.5 mg/ml, 33 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 180 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 1.8 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra(MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.26、抗体濃度47.9 μg/ml、リン脂質濃度2.03 mM、抗体密度0.026 mol%(HEPESバッファー))。
実施例26の(1)と同様にして、hHFE7A Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hHFE7A Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fab’(1.5 mg/ml, 132 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 180 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )100 mM, 1.8 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.27、抗体濃度115.0 μg/ml、リン脂質濃度1.54 mM、抗体密度0.081 mol%(HEPESバッファー))。
実施例26の(1)と同様にして、hHFE7A Fab’フラグメントを用時調製した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hHFE7A Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fab’(1.5 mg/ml, 330 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC ,180 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.8 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fab’は、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.28、抗体濃度151.6 μg/ml、リン脂質濃度1.60 mM、抗体密度0.103 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hHFE7A Fullbodyのチオール化
hHFE7A Fullbody(抗体濃度6 mg/ml, 20m M HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl Pierce Biotechnology,Inc.)をhHFE7A:Traut’s Reagent=1:4のモル比率で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.,NAP-5 Desalting column;HEPESバッファー)にて未反応のTraut’s Reagentを除去し、hHFE7A Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.29、抗体濃度48.1 μg/ml、リン脂質濃度1.06 mM、抗体密度0.018 mol%(HEPESバッファー))。
hHFE7A Fullbody(抗体濃度6 mg/ml, 20m M HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl Pierce Biotechnology,Inc.)をhHFE7A:Traut’s Reagent=1:4のモル比率で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.,NAP-5 Desalting column;HEPESバッファー)にて未反応のTraut’s Reagentを除去し、hHFE7A Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.29、抗体濃度48.1 μg/ml、リン脂質濃度1.06 mM、抗体密度0.018 mol%(HEPESバッファー))。
(1)hHFE7A Fullbodyのチオール化
hHFE7A Fullbody(抗体濃度6mg/ml,20mM HEPES,150mM NaCl,2mM EDTA,pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhHFE7A:Traut’s Reagent=1:16のモル比率で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC., NAP-5 Desalting column; HEPESバッファー)にて未反応のTraut’s Reagentを除去し、hHFE7A Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.30、抗体濃度157.6 μg/ml、リン脂質濃度1.30 mM、抗体密度0.048 mol%(HEPESバッファー))。
hHFE7A Fullbody(抗体濃度6mg/ml,20mM HEPES,150mM NaCl,2mM EDTA,pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhHFE7A:Traut’s Reagent=1:16のモル比率で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC., NAP-5 Desalting column; HEPESバッファー)にて未反応のTraut’s Reagentを除去し、hHFE7A Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hHFE7A Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fullbody (2 mg/ml, 75 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.30、抗体濃度157.6 μg/ml、リン脂質濃度1.30 mM、抗体密度0.048 mol%(HEPESバッファー))。
実施例29の(1)と同様にして、hHFE7A Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hHFE7A Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhHFE7A Fullbody (5 mg/ml, 300 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 150 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 1.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhHFE7A Fullbodyは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表1のNo.31、抗体濃度227.7 μg/ml、リン脂質濃度0.95 mM、抗体密度0.096 mol%(HEPESバッファー))。
実施例1乃至31で作製されたイムノリポソームの成分組成を表1に示した。
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 50 mM くえん酸,150 mM NaCl,1 mM DTPA, pH5.0)に4 mM Traut’s Reagent(2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.71 mg、33.3 mg、2.1 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 400 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, 10 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.32、抗体濃度191 μg/ml、リン脂質濃度3.38 mM、抗体密度0.031 mol%、平均粒子径91.5±23.4 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 50 mM くえん酸,150 mM NaCl,1 mM DTPA, pH5.0)に4 mM Traut’s Reagent(2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.71 mg、33.3 mg、2.1 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 400 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, 10 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.32、抗体濃度191 μg/ml、リン脂質濃度3.38 mM、抗体密度0.031 mol%、平均粒子径91.5±23.4 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH6.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 400 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC ,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.33、抗体濃度16 μg/ml、リン脂質濃度0.79 mM、抗体密度0.011 mol%、平均粒子径66.4±36.5 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH6.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 400 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC ,300 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM,3 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.33、抗体濃度16 μg/ml、リン脂質濃度0.79 mM、抗体密度0.011 mol%、平均粒子径66.4±36.5 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml,20 mM Phosphate,150 mM NaCl,1 mM DTPA, pH7.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
実施例33(3)と同様にして、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表1のNo.34、抗体濃度156 μg/ml、リン脂質濃度1.16 mM、抗体密度0.073 mol%、平均粒子径68.0±26.2 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml,20 mM Phosphate,150 mM NaCl,1 mM DTPA, pH7.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
実施例33(3)と同様にして、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表1のNo.34、抗体濃度156 μg/ml、リン脂質濃度1.16 mM、抗体密度0.073 mol%、平均粒子径68.0±26.2 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA pH7.7)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.) in dimethylsulfoxideをhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
実施例33(3)と同様にして、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.35、抗体濃度233 μg/ml、リン脂質濃度1.16 mM、抗体密度0.109 mol%、平均粒子径107.7±58.9 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度3 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA pH7.7)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.) in dimethylsulfoxideをhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
実施例33(3)と同様にして、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.35、抗体濃度233 μg/ml、リン脂質濃度1.16 mM、抗体密度0.109 mol%、平均粒子径107.7±58.9 nm (PBS))。
(1)Mouse Anti-hDR5 Antibody (MAB631)のチオール化
Mouse Anti-hDR5Antibody (MAB631) (R&D Systems, Inc. 1 mg)に20 mM Phosphate, 150 mM NaCl ,1 mM DTPA, pH8.0を加え、抗体濃度を2 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をMAB631:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、MAB631の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
MAB631:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB631(1 mg/ml, 450 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC,750 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, 7.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB631は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.36、抗体濃度232 μg/ml、リン脂質濃度4.06 mM、抗体密度0.023 mol%、平均粒子径105.0±42.4 nm (PBS))。
Mouse Anti-hDR5Antibody (MAB631) (R&D Systems, Inc. 1 mg)に20 mM Phosphate, 150 mM NaCl ,1 mM DTPA, pH8.0を加え、抗体濃度を2 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をMAB631:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、MAB631の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
MAB631:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB631(1 mg/ml, 450 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC,750 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, 7.5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB631は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.36、抗体濃度232 μg/ml、リン脂質濃度4.06 mM、抗体密度0.023 mol%、平均粒子径105.0±42.4 nm (PBS))。
実施例36(1)と同様にして、MAB631の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。MAB631:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB631 (1 mg/ml, 450 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 225 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM, 2.25 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB631は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.37、抗体濃度141 μg/ml、リン脂質濃度0.83 mM、抗体密度0.068 mol%、平均粒子径110.2±44.9 nm (PBS))。
(1)Mouse Anti-hDR5 Antibody (MAB6311)のチオール化
Mouse Anti-hDR5 Antibody (MAB6311)(R&D Systems, Inc.1 mg)に20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0を加え、抗体濃度を2 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をMAB6311:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、MAB6311の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
MAB6311:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB6311 (1 mg/ml, 360 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 600 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM,6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB6311は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.38、抗体濃度223 μg/ml、リン脂質濃度3.02 mM、抗体密度0.029 mol%、平均粒子径124.3±44.6 nm (PBS))。
Mouse Anti-hDR5 Antibody (MAB6311)(R&D Systems, Inc.1 mg)に20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0を加え、抗体濃度を2 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をMAB6311:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、MAB6311の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
MAB6311:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB6311 (1 mg/ml, 360 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 600 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM,6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB6311は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.38、抗体濃度223 μg/ml、リン脂質濃度3.02 mM、抗体密度0.029 mol%、平均粒子径124.3±44.6 nm (PBS))。
実施例38(1)と同様にして、MAB6311の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。MAB6311:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のMAB6311 (1 mg/ml, 360 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液を(2 mM DPPC, 180 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 20m M,1.8 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB631は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics, 分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.39、抗体濃度101 μg/ml、リン脂質濃度0.54 mM、抗体密度0.075 mol%、平均粒子径126.0±49.9 nm (PBS))。
(1)Mouse Anti-hFas Antibody (DX2)のチオール化
Mouse Anti-hFas Antibody (DX2) (BD Biosciences Pharmingen 1.5 mg)を(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)で媒体交換し、抗体濃度を0.64 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をDX2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、DX2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
DX2:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のDX2 (0.25 mg/ml, 1330 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 555 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10m M, 11.1 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB144は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表1のNo.40、抗体濃度16 μg/ml、リン脂質濃度0.87 mM、抗体密度0.0073 mol%、平均粒子径82.5±33.6 nm (PBS))。
Mouse Anti-hFas Antibody (DX2) (BD Biosciences Pharmingen 1.5 mg)を(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)で媒体交換し、抗体濃度を0.64 mg/mlにした。4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をDX2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.NAP-5 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、DX2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例32(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
DX2:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のDX2 (0.25 mg/ml, 1330 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 555 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10m M, 11.1 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のMAB144は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表1のNo.40、抗体濃度16 μg/ml、リン脂質濃度0.87 mM、抗体密度0.0073 mol%、平均粒子径82.5±33.6 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fullbodyのチオール化
hTRA-8 Fullbody(抗体濃度3.87 mg/ml, 20m M Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、分子量約2000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG2000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-020MA)およびVybrant DiD cell-labeling solution (1 mM in solvent invitrogen)それぞれ、587.2 mg、206.4 mg、23.38 mg、0.8 ml(mol比100:66:1:0.1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150m M NaCl, pH7.4) 80 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をEmulsiFlex C-5(AVESTIN)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 74.1 ml)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 123.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 247 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、限外濾過(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50, Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.41、抗体濃度1819 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.072 mol%、平均粒子径91.8 nm (PBS))。
hTRA-8 Fullbody(抗体濃度3.87 mg/ml, 20m M Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、分子量約2000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG2000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-020MA)およびVybrant DiD cell-labeling solution (1 mM in solvent invitrogen)それぞれ、587.2 mg、206.4 mg、23.38 mg、0.8 ml(mol比100:66:1:0.1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150m M NaCl, pH7.4) 80 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をEmulsiFlex C-5(AVESTIN)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 74.1 ml)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 123.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 247 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、限外濾過(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50, Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.41、抗体濃度1819 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.072 mol%、平均粒子径91.8 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
F(ab’)2溶液(抗体濃度5 mg/ml, PBS)を、40 mM(±)-ジチオトレイトール((±)-Dithiothreitol,以下DTTと標記;Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)によってDTTを除去し、hTRA-8 Fab’を得た。
(2)リポソームの調製
実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG2000-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml ,6.6 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 12 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 0.12 mlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50, Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.42、抗体濃度1632 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.176 mol%、平均粒子径76.7±22.9 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度5 mg/ml, PBS)を、40 mM(±)-ジチオトレイトール((±)-Dithiothreitol,以下DTTと標記;Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下、室温で90分間インキュベートし、Fab’へと還元した。ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)によってDTTを除去し、hTRA-8 Fab’を得た。
(2)リポソームの調製
実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG2000-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(5 mg/ml ,6.6 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 12 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 0.12 mlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50, Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.42、抗体濃度1632 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.176 mol%、平均粒子径76.7±22.9 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
F(ab’)2溶液(抗体濃度3.39 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 24.4 ml)とリポソーム分散液を(10 mM DPPC, 11 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100mM, 110 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.))、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.43、抗体濃度1147 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.062 mol%、平均粒子径83.7±21.8 nm (PBS))。
F(ab’)2溶液(抗体濃度3.39 mg/ml, 20 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl, Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8 F(ab’)2:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS)にてTraut’s Reagentを除去し、hTRA-8 F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 24.4 ml)とリポソーム分散液を(10 mM DPPC, 11 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100mM, 110 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.))、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000,MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.43、抗体濃度1147 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.062 mol%、平均粒子径83.7±21.8 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジデカノイルフォスファチジルコリン(Didecanoyl Phosphatidylcholine,以下DDEPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-1010)、コレステロール(Sigma-Aldrich ,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、282.9 mg、128.9 mg、21 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 50 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDEPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.44、抗体濃度426 μg/ml、リン脂質濃度2.31 mM、抗体密度0.200 mol%、平均粒子径45.7±18.1 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジデカノイルフォスファチジルコリン(Didecanoyl Phosphatidylcholine,以下DDEPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-1010)、コレステロール(Sigma-Aldrich ,Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、282.9 mg、128.9 mg、21 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 50 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDEPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.44、抗体濃度426 μg/ml、リン脂質濃度2.31 mM、抗体密度0.200 mol%、平均粒子径45.7±18.1 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジラウロイルフォスファチジルコリン(Dilauroyl Phosphatidylcholine,以下DLPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-2020)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、310.9 mg、128.9 mg、21.7 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl,pH7.4) 50 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DLPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DLPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.45、抗体濃度600 μg/ml、リン脂質濃度2.31 mM、抗体密度0.135 mol%、平均粒子径65.6±25.7 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジラウロイルフォスファチジルコリン(Dilauroyl Phosphatidylcholine,以下DLPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-2020)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、310.9 mg、128.9 mg、21.7 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 30 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl,pH7.4) 50 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DLPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DLPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.45、抗体濃度600 μg/ml、リン脂質濃度2.31 mM、抗体密度0.135 mol%、平均粒子径65.6±25.7 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジドコサノイルフォスファチジルコリン(Didocosanoyl Phosphatidylcholine,以下DDOPCと表記;Sigma-Aldrich, Inc.)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、45.12 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、400 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出した(extruded)。その後プローブソニケート(ULTRASONIC PROCESSOR SH-7600 SEIKO INSTRUMENT & ELECTRONICS LTD)し、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDOPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.46、抗体濃度183 μg/ml、リン脂質濃度2.11 mM、抗体密度0.094 mol%、平均粒子径147.7±56.7 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジドコサノイルフォスファチジルコリン(Didocosanoyl Phosphatidylcholine,以下DDOPCと表記;Sigma-Aldrich, Inc.)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、45.12 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、400 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出した(extruded)。その後プローブソニケート(ULTRASONIC PROCESSOR SH-7600 SEIKO INSTRUMENT & ELECTRONICS LTD)し、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDOPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.46、抗体濃度183 μg/ml、リン脂質濃度2.11 mM、抗体密度0.094 mol%、平均粒子径147.7±56.7 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。さらに、実施例44(2)と同様にして、リポソーム分散液を用時調製し、30 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
抗体のリポソームへの結合反応は、実施例44(3)と同様にしておこない、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.47、抗体濃度458 μg/ml、リン脂質濃度7.29 mM、抗体密度0.068 mol%、平均粒子径39.8±17.9 nm (PBS))。
抗体のリポソームへの結合反応は、実施例44(3)と同様にしておこない、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.47、抗体濃度458 μg/ml、リン脂質濃度7.29 mM、抗体密度0.068 mol%、平均粒子径39.8±17.9 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、400 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.48、抗体濃度124 μg/ml、リン脂質濃度1.14 mM、抗体密度0.118 mol%、平均粒子径75.2±9.1 nm、232.2±29.3 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)を用いて、400 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.48、抗体濃度124 μg/ml、リン脂質濃度1.14 mM、抗体密度0.118 mol%、平均粒子径75.2±9.1 nm、232.2±29.3 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジエルコイルフォスファチジルコリン(Dierucoyl Phosphatidylcholine,以下DEPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-2121AL)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44.92 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl ,pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、800 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DEPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.49、抗体濃度94 μg/ml、リン脂質濃度1.50 mM、抗体密度0.068 mol%、平均粒子径130.0±43.2 nm (PBS))
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジエルコイルフォスファチジルコリン(Dierucoyl Phosphatidylcholine,以下DEPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-2121AL)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44.92 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl ,pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、800 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.55 ml)とリポソーム分散液(10 mM DEPC, 0.5 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.49、抗体濃度94 μg/ml、リン脂質濃度1.50 mM、抗体密度0.068 mol%、平均粒子径130.0±43.2 nm (PBS))
(1)hTRA-8 Fullbodyの調製
実施例41(1)と同様にしてhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、6.3 mg(mol比100:66:3)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 360 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 60 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.50、抗体濃度81 μg/ml、リン脂質濃度1.17 mM、抗体密度0.027 mol%、平均粒子径57.3 nm (PBS))。
実施例41(1)と同様にしてhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、6.3 mg(mol比100:66:3)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 360 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 60 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.50、抗体濃度81 μg/ml、リン脂質濃度1.17 mM、抗体密度0.027 mol%、平均粒子径57.3 nm (PBS))。
実施例41(1)と同様にしてhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例50(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml ,1200 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 60 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.51、抗体濃度156 μg/ml、リン脂質濃度0.73 mM、抗体密度0.084 mol%、平均粒子径60.8 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fullbodyの調製
実施例41(1)と同様にしてhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、21 mg(mol比100:66:10)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 1200 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 60 mM, 6.67 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.52、抗体濃度161 μg/ml、リン脂質濃度0.66 mM、抗体密度0.092 mol%、平均粒子径74.1nm (PBS))。
実施例41(1)と同様にしてhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、21 mg(mol比100:66:10)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID,INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (1 mg/ml, 1200 μl)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 60 mM, 6.67 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.52、抗体濃度161 μg/ml、リン脂質濃度0.66 mM、抗体密度0.092 mol%、平均粒子径74.1nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。さらに実施例50(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は、以下の工程で行った。hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:1.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.44 ml)とPBSで5倍希釈したリポソーム分散液(2mM DPPC,0.2ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries ,Ltd.) 60mM, 6.67 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.53、抗体濃度125 μg/ml、リン脂質濃度0.45 mM、抗体密度0.297 mol%、平均粒子径53.9 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約2000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG2000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-020MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、1.47 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.44 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.4 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.54、抗体濃度354 μg/ml、リン脂質濃度4.54 mM、抗体密度0.085 mol%、平均粒子径106.5±33.4 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約2000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG2000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-020MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、1.47 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG2000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.44 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.4 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.54、抗体濃度354 μg/ml、リン脂質濃度4.54 mM、抗体密度0.085 mol%、平均粒子径106.5±33.4 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約5000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG5000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-050MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、2.99 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG5000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.66 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.55、抗体濃度128 μg/ml、リン脂質濃度3.02 mM、抗体密度0.046 mol%、粒子径84.9±36.9 nm(PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約5000のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG5000-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-050MA)それぞれ、36.7 mg、12.89 mg、2.99 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG5000-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.66 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.55、抗体濃度128 μg/ml、リン脂質濃度3.02 mM、抗体密度0.046 mol%、粒子径84.9±36.9 nm(PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、4.84 mg、2.17 mg(mol比100:25:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.44 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.4ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.56、抗体濃度214 μg/ml、リン脂質濃度1.95 mM、抗体密度0.156 mol%、粒子径78.9±41.4 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、4.84 mg、2.17 mg(mol比100:25:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1 mg/ml, 0.44 ml)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 0.4ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.56、抗体濃度214 μg/ml、リン脂質濃度1.95 mM、抗体密度0.156 mol%、粒子径78.9±41.4 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、19.35 mg、2.17 mg(mol比100:100:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
実施例56(3)と同様にして結合し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.57、抗体濃度456 μg/ml、リン脂質濃度4.88 mM、抗体密度0.084 mol%、粒子径89.1±31.9 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、36.7 mg、19.35 mg、2.17 mg(mol比100:100:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、50 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
実施例56(3)と同様にして結合し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。(リポソーム組成:表2のNo.57、抗体濃度456 μg/ml、リン脂質濃度4.88 mM、抗体密度0.084 mol%、粒子径89.1±31.9 nm (PBS))。
(1)hTRA-8 scFvの調製
hTRA-8 scFv 5B (Buffer; 50 mM Tris-HCl (pH7.5) ,500 mM NaCl, 10% Glycerol, 10 mM CHAPS, 1 mM DTT)を、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column)によって、Phosphate Buffer, 500 mM NaCl, pH7.4にBuffer交換した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、22 mg、7.73 mg、1.7 mg(mol比100:66:1.5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に3 mlのPhosphate Buffer, 500 mM NaCl, pH7.4を加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 scFv:DSPE-PEG3400-Mal=1:7.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 scFv (125 μg/ml, 800 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 scFvは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.58、抗体濃度14 μg/ml、リン脂質濃度1.3 mM、抗体密度0.025 mol%、平均粒子径91±16 nm(Phosphate Buffer,500 mM NaCl, pH7.4))。
hTRA-8 scFv 5B (Buffer; 50 mM Tris-HCl (pH7.5) ,500 mM NaCl, 10% Glycerol, 10 mM CHAPS, 1 mM DTT)を、ゲルろ過精製(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column)によって、Phosphate Buffer, 500 mM NaCl, pH7.4にBuffer交換した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、22 mg、7.73 mg、1.7 mg(mol比100:66:1.5)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層に3 mlのPhosphate Buffer, 500 mM NaCl, pH7.4を加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 scFv:DSPE-PEG3400-Mal=1:7.5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 scFv (125 μg/ml, 800 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 200 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 scFvは、ゲルろ過クロマトグラフィー(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);カラム(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPESバッファー(pH7.4); 4℃; 2 ml/min;検出波長UV280nm)によって分離し、イムノリポソーム分画(36-48 mlの分画)を分取した。Amicon Ultra (MILLIPORE INC.,分画分子量50,000)を用いた限外ろ過濃縮を行い、抗体上のシステイン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.58、抗体濃度14 μg/ml、リン脂質濃度1.3 mM、抗体密度0.025 mol%、平均粒子径91±16 nm(Phosphate Buffer,500 mM NaCl, pH7.4))。
・ Recombinant soluble TRAILのチオール化
Recombinant soluble TRAIL (Peprotech Inc.)(以下、rsTRAIL(P)と表記)(150 μg)を10 mM Sodium Phosphate, 140 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH7.4に溶解し、2 mg/mLに調製した。400 μM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology,Inc.) in dimethylsulfoxideをrsTRAIL(P):Traut’s Reagent=1:1のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、Microcon (MILLIPORE INC.,分画分子量 3,000;PBS,pH7.4)を用いた限外濾過(1000倍希釈)にてTraut’s Reagentを除去し、rsTRAIL(P)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
・ リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(P)のリポソームへの結合反応
rsTRAIL(P)のリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL(P): DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(P) (1 mg/ml, 19.6 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 50 μl)を混合し、rsTRAIL(P)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(P)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(P)は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(P)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.59、蛋白濃度6 μg/ml、リン脂質濃度1.8 mM、rsTRAIL(P)密度0.011 mol%、平均粒子径62 nm (PBS, pH7.4))。
Recombinant soluble TRAIL (Peprotech Inc.)(以下、rsTRAIL(P)と表記)(150 μg)を10 mM Sodium Phosphate, 140 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH7.4に溶解し、2 mg/mLに調製した。400 μM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology,Inc.) in dimethylsulfoxideをrsTRAIL(P):Traut’s Reagent=1:1のモル比で加え、室温で90分反応させた。その後、Microcon (MILLIPORE INC.,分画分子量 3,000;PBS,pH7.4)を用いた限外濾過(1000倍希釈)にてTraut’s Reagentを除去し、rsTRAIL(P)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
・ リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(P)のリポソームへの結合反応
rsTRAIL(P)のリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL(P): DSPE-PEG3400-Mal=1:15 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(P) (1 mg/ml, 19.6 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 50 μl)を混合し、rsTRAIL(P)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(P)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(P)は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(P)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.59、蛋白濃度6 μg/ml、リン脂質濃度1.8 mM、rsTRAIL(P)密度0.011 mol%、平均粒子径62 nm (PBS, pH7.4))。
・ rsTRAIL(P)のチオール化
実施例59と同様にしてrsTRAIL(P)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(P)のリポソームへの結合反応
rsTRAILのリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL(P):DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(P) (1 mg/ml, 58.8 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 50 μl)を混合し、rsTRAIL(P)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(P)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(P)は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(P)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.60、蛋白濃度9 μg/ml、リン脂質濃度1.1 mM、rsTRAIL(P)密度0.024 mol%、平均粒子径73 nm (PBS, pH7.4))。
実施例59と同様にしてrsTRAIL(P)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(P)のリポソームへの結合反応
rsTRAILのリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL(P):DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(P) (1 mg/ml, 58.8 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 50 μl)を混合し、rsTRAIL(P)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(P)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mM, 5 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(P)は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(P)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.60、蛋白濃度9 μg/ml、リン脂質濃度1.1 mM、rsTRAIL(P)密度0.024 mol%、平均粒子径73 nm (PBS, pH7.4))。
(1)Recombinant soluble TRAILのチオール化
Recombinant soluble TRAIL (Biodesign)(以下、rsTRAIL(B)と表記)(200 μg)を10 mM Sodium Phosphate, 140 mM NaCl,1 mM DTPA, pH7.4に溶解し、2 mg/mLに調製した。400 μM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.) in dimethylsulfoxideをrsTRAIL(B):Traut’s Reagent=1:1のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、Microcon (MILLIPORE INC.,分画分子量 3,000;PBS,pH7.4)を用いた限外濾過(1000倍希釈)にてTraut’s Reagentを除去し、rsTRAIL(B)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(B)のリポソームへの結合反応
rsTRAIL(B)のリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL: DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(B)(1 mg/ml, 47 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 40 μl)を混合し、rsTRAIL(B)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(B)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10m M,4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(B)は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(B)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.61、蛋白濃度4 μg/ml、リン脂質濃度1.2 mM、rsTRAIL密度0.009 mol%、平均粒子径63 nm (PBS, pH7.4))。
Recombinant soluble TRAIL (Biodesign)(以下、rsTRAIL(B)と表記)(200 μg)を10 mM Sodium Phosphate, 140 mM NaCl,1 mM DTPA, pH7.4に溶解し、2 mg/mLに調製した。400 μM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.) in dimethylsulfoxideをrsTRAIL(B):Traut’s Reagent=1:1のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、Microcon (MILLIPORE INC.,分画分子量 3,000;PBS,pH7.4)を用いた限外濾過(1000倍希釈)にてTraut’s Reagentを除去し、rsTRAIL(B)の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)rsTRAIL(B)のリポソームへの結合反応
rsTRAIL(B)のリポソームへの結合については、以下のように行った。rsTRAIL: DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のrsTRAIL(B)(1 mg/ml, 47 μl)とリポソーム分散液(10 mM DPPC, 40 μl)を混合し、rsTRAIL(B)のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。rsTRAIL(B)が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10m M,4 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のrsTRAIL(B)は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。rsTRAIL(B)上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.61、蛋白濃度4 μg/ml、リン脂質濃度1.2 mM、rsTRAIL密度0.009 mol%、平均粒子径63 nm (PBS, pH7.4))。
(1)Mouse Anti-hDR4 Antibody(m2E12)のチオール化
国際公開パンフレットWO2003/37913に記載のハイブリドーマ2E12によって産生されるマウス抗ヒトDR4抗体であるm2E12(抗体濃度1.8 mg/ml, 20 mM Phosphate Buffer, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に、4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS, pH7.4)にてTraut’s Reagentを除去し、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:40 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12(0.77 mg/ml, 97.4 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.62、抗体濃度25 μg/ml、リン脂質濃度1.7 mM、抗体密度0.0059 mol%、平均粒子径68±25 nm (PBS, pH7.4))。
国際公開パンフレットWO2003/37913に記載のハイブリドーマ2E12によって産生されるマウス抗ヒトDR4抗体であるm2E12(抗体濃度1.8 mg/ml, 20 mM Phosphate Buffer, 150 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH8.0)に、4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)をhTRA-8:Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS, pH7.4)にてTraut’s Reagentを除去し、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:40 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12(0.77 mg/ml, 97.4 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.62、抗体濃度25 μg/ml、リン脂質濃度1.7 mM、抗体密度0.0059 mol%、平均粒子径68±25 nm (PBS, pH7.4))。
実施例62と同様にして、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。m2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12 (0.77 mg/ml, 195 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM, 2μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.63、抗体濃度43 μg/ml、リン脂質濃度1.4 mM、抗体密度0.0122 mol%、平均粒子径53±24 nm (PBS, pH7.4))。
実施例62と同様にして、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:10 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12 (0.77 mg/ml, 390 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.64、抗体濃度72 μg/ml、リン脂質濃度1.2 mM、抗体密度0.0247 mol%、平均粒子径63±26 nm (PBS, pH7.4))。
実施例62と同様にして、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12 (0.77 mg/ml, 780 μl)とリポソーム分散液(2mM DPPC, 1000 μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.65、抗体濃度159 μg/ml、リン脂質濃度1.2 mM、抗体密度0.0510 mol%、平均粒子径65±27 nm (PBS, pH7.4))。
実施例62と同様にして、m2E12の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに、実施例1の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12 (0.77 mg/ml, 1950μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.66、抗体濃度281 μg/ml、リン脂質濃度0.86 mM、抗体密度0.1296 mol%、平均粒子径76±29nm (PBS, pH7.4))。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。m2E12:DSPE-PEG3400-Mal=1:2 (mol ratio)の割合になるように、上述のm2E12 (0.77 mg/ml, 1950μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000μl)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のm2E12は、VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去した。抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.66、抗体濃度281 μg/ml、リン脂質濃度0.86 mM、抗体密度0.1296 mol%、平均粒子径76±29nm (PBS, pH7.4))。
(1)hTRA-8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジドコサノイルフォスファチジルコリン(Didocosanoyl Phosphatidylcholine,以下DDOPCと表記;Sigma-Aldrich, Inc.)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoy lphosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、45.12 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、800 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (1 mg/ml, 0.66 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDOPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリホ゜ソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM,6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.67、抗体濃度77 μg/ml、リン脂質濃度0.15 mM、抗体密度0.556 mol%、平均粒子径896.8±70.8 nm (PBS))。
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジドコサノイルフォスファチジルコリン(Didocosanoyl Phosphatidylcholine,以下DDOPCと表記;Sigma-Aldrich, Inc.)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoy lphosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、45.12 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO.,INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DDOPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、800 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’ (1 mg/ml, 0.66 ml)とリポソーム分散液(10 mM DDOPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリホ゜ソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM,6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.67、抗体濃度77 μg/ml、リン脂質濃度0.15 mM、抗体密度0.556 mol%、平均粒子径896.8±70.8 nm (PBS))。
(1)hTRA−8 Fab’の調製
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジエルコイルフォスファチジルコリン(Dierucoyl Phosphatidylcholine,以下DEPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-2121AL)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44.92 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1mg/ml,0.66ml)とリポソーム分散液(10 mM DEPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.68、抗体濃度393 μg/ml、リン脂質濃度5.64 mM、抗体密度0.076 mol%、平均粒子径91.7±33.7 nm (PBS))
実施例42(1)と同様にして、hTRA-8 Fab’を用時調製した。
(2)リポソームの調製
ジエルコイルフォスファチジルコリン(Dierucoyl Phosphatidylcholine,以下DEPCと表記;NOF CORPORATION COATSOME MC-2121AL)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44.92 mg、12.89 mg、2.17 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 3 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 5 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DEPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。
(3)抗体のリポソームへの結合
hTRA-8 Fab’:DSPE-PEG3400-Mal=1:5 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fab’(1mg/ml,0.66ml)とリポソーム分散液(10 mM DEPC, 0.6 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 6 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fab’は、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過によって分離し、抗体上のシステイン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.68、抗体濃度393 μg/ml、リン脂質濃度5.64 mM、抗体密度0.076 mol%、平均粒子径91.7±33.7 nm (PBS))
(1)hTRA-8 F(ab’)2のチオール化
実施例43(1)と同様にして、F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
実施例43(1)と同様にして、F(ab’)2の一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。さらに実施例41(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
抗体のリポソームへの結合反応は以下の工程で行った。hTRA-8 F(ab’)2:DSPE-PEG2000-Mal=1:45 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 F(ab’)2 (1 mg/ml, 2.686 ml)とリポソーム分散液を(10 mM DPPC, 11 ml)を混合し、抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを反応させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG2000-Malに対して10当量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 110 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 F(ab’)2は、限外濾過(LabScale TFF System (MILLIPORE INC.))、ポリエーテルスルホンメンブレン(Pellicon XL 50,Biomax 300,分画分子量;300,000, MILLIPORE INC.)によって分離し、抗体上のリジン残基とリポソームのPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た(リポソーム組成:表2のNo.69、抗体濃度128 μg/ml、リン脂質濃度10.08 mM、抗体密度0.0069 mol%、平均粒子径87.6±18.1 nm (PBS))。
(1)2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbodyのチオール化
2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbody(抗体濃度1.8 mg/ml, 20 mM Phosphate Buffer, 150 mM NaCl, 2 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)を各抗体(2E12,hTRA-8):Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS, pH7.4)にてTraut’s Reagentを除去し、2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44 mg、15.4 mg、2.6 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 6 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 6 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。この10 mM DPPC分散液をPBS, pH7.4にて2 mMに調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 195 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のm2E12を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1 mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合した2E12の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=3:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 584 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量および2E12の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.70、抗体濃度 2E12:40 μg/ml、hTRA-8:139 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=22:78、リン脂質濃度1.15 mM、全抗体密度0.062 mol% (PBS))
2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbody(抗体濃度1.8 mg/ml, 20 mM Phosphate Buffer, 150 mM NaCl, 2 mM DTPA, pH8.0)に4 mM Traut’s Reagent (2-Iminothiolane・HCl,Pierce Biotechnology, Inc.)を各抗体(2E12,hTRA-8):Traut’s Reagent=1:4のモル比で加え、室温で90 min反応させた。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム;GE HEALTHCARE INC.PD-10 Desalting column;PBS, pH7.4)にてTraut’s Reagentを除去し、2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbodyの一部のリジン残基のアミノ基をチオール化した。
(2)リポソームの調製
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(L-α-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine,以下DPPCと表記;NOF CORPORATION,COATSOME MC-6060)、コレステロール(Sigma-Aldrich, Inc.)、および分子量約3400のポリエチレングリコールの末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールサクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine,以下DSPE-PEG3400-Malと表記;NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-034MA)それぞれ、44 mg、15.4 mg、2.6 mg(mol比100:66:1)をナス型フラスコに量りとり、クロロホルム(KANTO CHEMICAL CO., INC.) 6 mlを加えて溶解させた。次にクロロホルムを減圧留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄層を形成させた。この脂質薄層にPBS (20 mM Phospate, 150 mM NaCl, pH7.4) 6 mlを加えて懸濁させ、リポソーム(DPPC濃度:10 mM)の粗分散液を得た。続いて、このリポソーム分散液をエクストルーダー(The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)を用いて、100 nmの孔サイズをもつポリカーボネートメンブレン(Avanti POLAR LIPID, INC.)から繰り返し押し出す(extruded)ことで、リポソームの粒子径を整えた。この10 mM DPPC分散液をPBS, pH7.4にて2 mMに調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 195 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のm2E12を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1 mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合した2E12の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=3:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 584 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応のhTRA-8 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量および2E12の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.70、抗体濃度 2E12:40 μg/ml、hTRA-8:139 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=22:78、リン脂質濃度1.15 mM、全抗体密度0.062 mol% (PBS))
実施例70の(1)と同様にして、2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbodyのチオール化を行った。さらに、実施例70の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 195 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のhTRA-8を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合したhTRA-8の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=3:20 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 584 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応の2E12 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量およびhTRA-8の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.71、抗体濃度 2E12:93 μg/ml、hTRA-8:74 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=56:44、リン脂質濃度1.14 mM、全抗体密度0.058 mol% (PBS))
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:20 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 195 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のhTRA-8を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合したhTRA-8の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=3:20 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 584 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応の2E12 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量およびhTRA-8の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.71、抗体濃度 2E12:93 μg/ml、hTRA-8:74 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=56:44、リン脂質濃度1.14 mM、全抗体密度0.058 mol% (PBS))
実施例70の(1)と同様にして、2E12 FullbodyおよびhTRA-8 Fullbodyのチオール化を行った。さらに、実施例70の(2)と同様にしてリポソーム分散液を用時調製した。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:50 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 78 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のhTRA-8を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1 mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合したhTRA-8の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=9:50 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 701 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応の2E12 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量およびhTRA-8の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.72、抗体濃度 2E12:155 μg/ml、hTRA-8:39 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=80:20、リン脂質濃度1.57 mM、全抗体密度0.049 mol% (PBS))。
(3)抗体のリポソームへの結合反応
hTRA-8 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=1:50 (mol ratio)の割合になるように、上述のhTRA-8 Fullbody (0.77 mg/ml, 78 μl)とリポソーム分散液(2 mM DPPC, 1000 μl)を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。未反応のhTRA-8を、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、分散液の体積を1 mlに調製した。この段階で分散液の一部を採取し、リポソームに結合したhTRA-8の蛋白質量およびリポソームの脂質量を定量した。続いて、2E12 Fullbody:DSPE-PEG3400-Mal=9:50 (mol ratio)の割合になるように、上述の2E12 Fullbody (0.77 mg/ml, 701 μl)と上記リポソーム分散液を混合し、室温で2時間反応させることで抗体のチオール基とリポソーム上のPEG鎖末端のマレイミド基とを結合させた。抗体が結合しなかったマレイミド基は、DSPE-PEG3400-Malに対して10等量のメルカプトエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM, 2 μlを加え室温で30分反応させることにより、不活性化させた。未反応の2E12 Fullbodyは、VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分画分子量300,000)を用いた限外ろ過を、原液が1000倍希釈されるまで繰り返し行うことで除去し、2種類の抗体上のリジン残基とリポソーム上のPEG末端とが結合している本イムノリポソームを得た。本イムノリポソーム分散液の全抗体濃度および脂質濃度を定量し、全抗体量およびhTRA-8の抗体量から、各々の抗体量を算出した。(リポソーム組成:表2のNo.72、抗体濃度 2E12:155 μg/ml、hTRA-8:39 μg/ml、抗体比率 2E12:hTRA-8=80:20、リン脂質濃度1.57 mM、全抗体密度0.049 mol% (PBS))。
実施例32乃至72で作製されたイムノリポソームの成分組成を表2に示した。
実施例1、2、3で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
Jurkat細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むDMEM培地(インビトロジェン社製、以下DMEM培地)で1×105 cells/mlに調製した。あらかじめDMEM培地で抗体濃度として2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは1 μg/mlの二次抗体溶液(ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体、MPバイオメディカルズ社製)で2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したhTRA-8溶液を一群3連で50μlずつ添加した96穴マイクロフ゜レート(コーニンク゛社製)に、細胞懸濁液を50μl (5x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を測定した。ATP量測定にはルシフェラーゼ発光試薬(CellTiter Glo,プロメガ社製)を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、細胞溶解成分と発光基質成分からなる試液をプレートの各ウェルに100 μlずつ添加し、攪拌後、上清を96穴白色マイクロプレート(コーニング社製)に100 μlずつ移して各ウェルの発光をルミノメーター(モレキュラーデバイス社製)にて測定した。DMEM培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、DMEM培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、各ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。
細胞生存率(%)=(被験ウェルの発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
/(陰性コントロールウェルの平均発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
×100
その結果を図1に示した。実施例1、2、3で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例2または3で作製されたイムノリポソームは、1, 10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例19、20、21で調製したイムノリポソームのA375細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A375細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A375細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図2に示した。実施例19、20、21で調製したイムノリポソームは、A375細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。A375細胞に対してhTRA-8が示すアポトーシス誘導活性は弱いが、hTRA-8をイムノリポソーム化することによってアポトーシス誘導活性を増強することが可能であった。実施例19、20、21で作製されたイムノリポソームは、100 ng/mlにおいて80%以下の細胞生存率を、1000 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を示した。実施例19で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例8、10、12、14、16で調製したイムノリポソームのA375細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A375細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A375細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図3に示した。実施例8、10、12、14、16で調製したイムノリポソームは、A375細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。A375細胞に対してhTRA-8が示すアポトーシス誘導活性は弱いが、hTRA-8をイムノリポソーム化することによってアポトーシス誘導活性を増強することが可能であった。実施例8、10、12、14、16で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を示した。実施例8、16で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を示した。実施例8で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例7、9、11、13、15で調製したイムノリポソームのA2058細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A2058細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法でヒト悪性黒色腫細胞株A2058細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として2000, 200, 20 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図4に示した。実施例7、9、11、13、15で調製したイムノリポソームは、A2058細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。A2058細胞に対してhTRA-8が示すアポトーシス誘導活性は弱いが、hTRA-8をイムノリポソーム化することによってアポトーシス誘導活性を増強することが可能であった。実施例9、11、15で作製されたイムノリポソームは、100 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を示した。実施例11、15で作製されたイムノリポソームは、100 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を示した。実施例15で作製されたイムノリポソームは、100 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。実施例7、9、11、13、15で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例26、27、28、29、30、31で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhHFE7Aは抗体濃度として26, 2.6, 0.26, 0.026 nM(最終濃度13, 1.3, 0.13, 0.013 nM)に調製した。hHFE7Aを架橋する二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体)はバイオソース社製のものを用いた。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhHFE7Aは抗体濃度として26, 2.6, 0.26, 0.026 nM(最終濃度13, 1.3, 0.13, 0.013 nM)に調製した。hHFE7Aを架橋する二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体)はバイオソース社製のものを用いた。
その結果を図5に示した。実施例26、27、28、29、30、31で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhHFE7Aと同等もしくは、より強いアポトーシス誘導活性を示した。
実施例4、17、18で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
Jurkat細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×105 cells/mlに調製した。あらかじめRPMI培地で、抗体濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは1 μg/mlの二次抗体溶液(ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体、MPバイオメディカルズ社製)で2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したhTRA-8溶液を一群3連で50 μlずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50 μl (1x104 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルの細胞の細胞内脱水素酵素の活性を測定することにより、生細胞数を算出した。細胞内脱水素酵素活性の測定にはWST-8試薬(生細胞数測定試薬SF,nacalai tesque)を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、WST-8を各ウェルに10 μl添加し、WST-8が細胞内脱水素酵素により還元されて生成するホルマザンの量を、ホルマザンの450 nmにおける吸光度を吸光光度計(モレキュラーデバイス社製)にて測定することにより定量した。RPMI1640培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、RPMI1640培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、各ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。
細胞生存率(%)=(被験ウェルの吸光度―バックグラウンドウェルの平均吸光度)/(陰性コントロールウェルの平均吸光度―バックグラウンドウェルの平均吸光度)×100 その結果を図6に示した。実施例4、17、18で調製したイムノリポソームはJurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例4,17,18で作製されたイムノリポソームは、10 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、100 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
Jurkat細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×105 cells/mlに調製した。あらかじめRPMI培地で、抗体濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは1 μg/mlの二次抗体溶液(ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体、MPバイオメディカルズ社製)で2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製したhTRA-8溶液を一群3連で50 μlずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50 μl (1x104 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルの細胞の細胞内脱水素酵素の活性を測定することにより、生細胞数を算出した。細胞内脱水素酵素活性の測定にはWST-8試薬(生細胞数測定試薬SF,nacalai tesque)を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、WST-8を各ウェルに10 μl添加し、WST-8が細胞内脱水素酵素により還元されて生成するホルマザンの量を、ホルマザンの450 nmにおける吸光度を吸光光度計(モレキュラーデバイス社製)にて測定することにより定量した。RPMI1640培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、RPMI1640培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、各ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。
細胞生存率(%)=(被験ウェルの吸光度―バックグラウンドウェルの平均吸光度)/(陰性コントロールウェルの平均吸光度―バックグラウンドウェルの平均吸光度)×100 その結果を図6に示した。実施例4、17、18で調製したイムノリポソームはJurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例4,17,18で作製されたイムノリポソームは、10 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、100 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例22、23で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図7に示した。実施例22、23で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例22,23で作製されたイムノリポソームは、0.1 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、1, 10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例24で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA−8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10, 1, 0.1ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA−8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10, 1, 0.1ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図8に示した。実施例24で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例24で作製されたイムノリポソームは、1 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、10 ng/mlまたは100 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例25で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図9に示した。実施例25で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例25で作製されたイムノリポソームは、0.1 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、1, 10, 100ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例5、6で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10、, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度100, 10、, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図10に示した。実施例5、6で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例5で作製されたイムノリポソームは、0.1 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を示した。実施例6で作製されたイムノリポソームは、0.1 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を示した。また、実施例5、6で作製されたイムノリポソームは、1, 10, 100 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例3、20で調製したイムノリポソームの関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
凍結関節リウマチ患者由来滑膜細胞(セルアプリケーションズ社)を滑膜細胞増殖培地(セルアプリケーションズ社製、以下培地)に懸濁し、トリパンブルー染色法で計数後、培地で2×104 cells/mlに調製した。96穴マイクロプレート(コーニング社製)に細胞懸濁液を50 μl (1x103cells)ずつ播種した。同時に、抗体濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/mlに培地で希釈したイムノリポソーム溶液およびhTRA-8を50 μlずつ、プレートに添加した。37℃、5%二酸化炭素存在下で一晩培養後、ATP量を測定した。ATP量測定にはルシフェラーゼ発光試薬(Cell Titer Glo,プロメガ社製)を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、細胞溶解成分と発光基質成分からなる試液をプレートの各ウェルに100 μlずつ添加し、攪拌後、上清を96穴白色マイクロプレート(コーニング社製)に100 μlずつ移して各ウェルの発光をルミノメーター(モレキュラーデバイス社製)にて測定した。イムノリポソーム溶液の代わりに培地を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、細胞を播種せずに培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、各ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。
細胞生存率(%)=(被験ウェルの発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
/(陰性コントロールウェルの平均発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
×100
その結果を図11に示した。実施例3、20のイムノリポソームは、関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対して、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例3で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を示した。
凍結関節リウマチ患者由来滑膜細胞(セルアプリケーションズ社)を滑膜細胞増殖培地(セルアプリケーションズ社製、以下培地)に懸濁し、トリパンブルー染色法で計数後、培地で2×104 cells/mlに調製した。96穴マイクロプレート(コーニング社製)に細胞懸濁液を50 μl (1x103cells)ずつ播種した。同時に、抗体濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/mlに培地で希釈したイムノリポソーム溶液およびhTRA-8を50 μlずつ、プレートに添加した。37℃、5%二酸化炭素存在下で一晩培養後、ATP量を測定した。ATP量測定にはルシフェラーゼ発光試薬(Cell Titer Glo,プロメガ社製)を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、細胞溶解成分と発光基質成分からなる試液をプレートの各ウェルに100 μlずつ添加し、攪拌後、上清を96穴白色マイクロプレート(コーニング社製)に100 μlずつ移して各ウェルの発光をルミノメーター(モレキュラーデバイス社製)にて測定した。イムノリポソーム溶液の代わりに培地を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、細胞を播種せずに培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、各ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。
細胞生存率(%)=(被験ウェルの発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
/(陰性コントロールウェルの平均発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度)
×100
その結果を図11に示した。実施例3、20のイムノリポソームは、関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対して、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示した。実施例3で作製されたイムノリポソームは、1000 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を示した。
実施例5で調製したイムノリポソームのヒト大腸癌株COLO 205移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性の測定
実施例5で調製したイムノリポソームのin vivo抗腫瘍活性を検討した。検疫によってマウス病原微生物が検出されないことを確認したヒト大腸癌株COLO 205(American Type Culture Collectionより購入)2×106 cellsをヌードマウスBALB/cA Jcl-nu(日本クレア)の腋窩部皮下に移植した。実施例5のイムノリポソームを投与直前に、抗体濃度として1および0.33 mg/mlに生理食塩水(大塚製薬)で希釈した。移植7日後の腫瘍が生着したCOLO 205担癌マウスに対して実施例5のイムノリポソームの投与を開始した。具体的には、Day 7および9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 25にマウス体重10gあたり0.1mlのリポソーム溶液を担癌マウスの尾静脈内に投与した。
実施例5で調製したイムノリポソームのin vivo抗腫瘍活性を検討した。検疫によってマウス病原微生物が検出されないことを確認したヒト大腸癌株COLO 205(American Type Culture Collectionより購入)2×106 cellsをヌードマウスBALB/cA Jcl-nu(日本クレア)の腋窩部皮下に移植した。実施例5のイムノリポソームを投与直前に、抗体濃度として1および0.33 mg/mlに生理食塩水(大塚製薬)で希釈した。移植7日後の腫瘍が生着したCOLO 205担癌マウスに対して実施例5のイムノリポソームの投与を開始した。具体的には、Day 7および9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 25にマウス体重10gあたり0.1mlのリポソーム溶液を担癌マウスの尾静脈内に投与した。
移植腫瘍の長径および短径を週2-3回、電子デジタルノギス(CD-15C:株式会社ミツトヨ)を用いて計測した。以下に示す計算式により腫瘍体積を求めた。
腫瘍体積(mm3)= 1/2×短径2(mm)×長径(mm)
また、各個体の腫瘍増殖速度(mm3/day)を算出し、その値を用いてDunnett検定を行なうことで統計学的有意差を検定した。なお、P値が0.05未満の時に群間で有意差があるとみなした。
また、各個体の腫瘍増殖速度(mm3/day)を算出し、その値を用いてDunnett検定を行なうことで統計学的有意差を検定した。なお、P値が0.05未満の時に群間で有意差があるとみなした。
試験の結果を図12に示した。実施例5のイムノリポソームは用量依存的な抗腫瘍活性を示し、10 mg/kgのイムノリポソームは統計学的有意差をもって抗腫瘍活性を示した。
実施例32,33,34,35で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図13に示した。実施例32,33,34,35で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、1, 10, 100, 1000 ng/mlにおいて30%以下の細胞生存率を示した。
実施例44,45,46,47,48,49で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図14に示した。実施例44,45,46,47,48,49で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例50,51,52で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1、0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1、0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図15に示した。実施例50,51,52で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて60%以下の細胞生存率を、1, 10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例53,54,55,56,57で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2、0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10、, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図16に示した。実施例53,54,55,56,57で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2、0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10、, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図16に示した。実施例53,54,55,56,57で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
実施例58で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図17に示した。実施例58で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて30%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図17に示した。実施例58で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて30%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
実施例36,37で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、抗体濃度として、イムノリポソームは2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に、MAB631は1μg/mLの二次抗体溶液(抗マウスIgG Fc)で2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図18に示した。実施例36,37で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したMAB631より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を、10 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、抗体濃度として、イムノリポソームは2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に、MAB631は1μg/mLの二次抗体溶液(抗マウスIgG Fc)で2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図18に示した。実施例36,37で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したMAB631より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を、10 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
実施例38,39で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、抗体濃度として、イムノリポソームは2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に、MAB6311は1μg/mLの二次抗体溶液(抗マウスIgG Fc)で2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に調製し、、一群2連にて実験を行った。
その結果を図19に示した。実施例38,39で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したMAB6311より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、抗体濃度として、イムノリポソームは2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に、MAB6311は1μg/mLの二次抗体溶液(抗マウスIgG Fc)で2000, 20, 0.2 ng/mL(最終濃度1000, 10, 0.1 ng/mL)に調製し、、一群2連にて実験を行った。
その結果を図19に示した。実施例38,39で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したMAB6311より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10 ng/mlまたは1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
実施例59,60で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびrsTRAILは蛋白濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図20に示した。実施例59,60で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、rsTRAILより強いアポトーシス誘導活性を示し、1 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびrsTRAILは蛋白濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図20に示した。実施例59,60で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、rsTRAILより強いアポトーシス誘導活性を示し、1 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例61で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびrsTRAILは蛋白濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図21に示した。実施例61で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、rsTRAILより強いアポトーシス誘導活性を示し、10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびrsTRAILは蛋白濃度として、2000, 200, 20, 2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/ml)に調製し、一群2連にて実験を行った。
その結果を図21に示した。実施例61で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、rsTRAILより強いアポトーシス誘導活性を示し、10, 100, 1000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例41,42,43,69で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含む RPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図22に示した。実施例41,42,43,69で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて80%以下の細胞生存率を、1ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて10%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含む RPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図22に示した。実施例41,42,43,69で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、0.1 ng/mlにおいて80%以下の細胞生存率を、1ng/mlにおいて40%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて10%以下の細胞生存率を示した。
実施例67,68で調製したイムノリポソームのJurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含む RPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図23に示した。実施例68で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて30%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
試験例1に記載の方法で白血病Tリンパ腫細胞株Jurkat細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定した。ただし、培地には10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含む RPMI培地(インビトロジェン社製)を用い、イムノリポソームおよびhTRA-8は抗体濃度として、2000, 200, 20, 2, 0.2 ng/ml(最終濃度1000, 100, 10, 1, 0.1 ng/ml)に調製し、一群3連にて実験を行った。
その結果を図23に示した。実施例68で調製したイムノリポソームは、Jurkat細胞に対し、二次抗体で架橋したhTRA-8より強いアポトーシス誘導活性を示し、1ng/mlにおいて30%以下の細胞生存率を、10, 100, 1000 ng/mlにおいて5%以下の細胞生存率を示した。
実施例40で調製したイムノリポソームのWR19L12a細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
WR19L12a細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で1×105 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で10, 1, 0.1, 0.01μg/mL(最終濃度5, 0.5, 0.05, 0.005 μg/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは0.6μg/mLのrProteinG (SIGMA社製)で10, 1, 0.1, 0.01μg/mL(最終濃度5, 0.5, 0.05, 0.005μg/mL)に調製したDX2溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (5x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。ただし、PBSを含むRPMI培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、RPMI培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとした。
WR19L12a細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で1×105 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で10, 1, 0.1, 0.01μg/mL(最終濃度5, 0.5, 0.05, 0.005 μg/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは0.6μg/mLのrProteinG (SIGMA社製)で10, 1, 0.1, 0.01μg/mL(最終濃度5, 0.5, 0.05, 0.005μg/mL)に調製したDX2溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (5x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。ただし、PBSを含むRPMI培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、RPMI培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとした。
その結果を図24に示した。実施例40で調製したイムノリポソームはWR19L12a細胞に対しDX2より強いアポトーシス誘導活性を示し、500, 5000 ng/mlにおいて20%以下の細胞生存率を示した。
実施例62,64,65,66で調製したイムノリポソームのAlexander細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
Alexander細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×104 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは3.6μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgG Fc、Jackson社製)で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製した2E12溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (1x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。
その結果を図25に示した。実施例62,64,65,66で調製したイムノリポソームは、Alexander細胞に対し、2E12より強いアポトーシス誘導活性を示し、100 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、1000 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を示した。
Alexander細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×104 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは3.6μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgG Fc、Jackson社製)で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製した2E12溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (1x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。
その結果を図25に示した。実施例62,64,65,66で調製したイムノリポソームは、Alexander細胞に対し、2E12より強いアポトーシス誘導活性を示し、100 ng/mlにおいて70%以下の細胞生存率を、1000 ng/mlにおいて50%以下の細胞生存率を示した。
実施例70,71,72で調製したイムノリポソームのAlexander細胞に対するアポトーシス誘導活性の測定
Alexander細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×104 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは、3.6μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgG Fc、Jackson社製)で2000 ng/mLに調製した2E12溶液、および1μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗ヒトIgG Fc、MPバイオメディカルズ社製)で2000 ng/mLに調製したhTRA-8溶液を、22:78、56:44または80:20の比率で混合し、2000, 200, 20, 2ng/ mL(最終濃度1000, 、100, 10, 1 ng/mL)に調製した2E12とhTRA-8の混合溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (1x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを24時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。その結果を図26に示した。実施例70,71,72で調製したイムノリポソームは、Alexander細胞に対し、対応する比率に調整された抗体より強いアポトーシス誘導活性を示し、10 ng/mlにおいて60%以下、100, 1000 ng/mlにおいて10%以下の細胞生存率を示した。
Alexander細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(ハイクローン社製)を含むRPMI培地(インビトロジェン社製)で2×104 cells/mLに調製した。あらかじめRPMI培地で2000, 200, 20, 2 ng/mL(最終濃度1000, 100, 10, 1 ng/mL)に調製したイムノリポソーム溶液もしくは、3.6μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgG Fc、Jackson社製)で2000 ng/mLに調製した2E12溶液、および1μg/mLの二次抗体溶液(ヤギ抗ヒトIgG Fc、MPバイオメディカルズ社製)で2000 ng/mLに調製したhTRA-8溶液を、22:78、56:44または80:20の比率で混合し、2000, 200, 20, 2ng/ mL(最終濃度1000, 、100, 10, 1 ng/mL)に調製した2E12とhTRA-8の混合溶液を一群3連で50μLずつ添加した96穴マイクロプレート(コーニング社製)に、細胞懸濁液を50μL (1x103 cells)ずつ播種した。37℃、5%二酸化炭素存在下でプレートを24時間培養し、各ウェルのATP量を試験例1に記載の方法で測定した。その結果を図26に示した。実施例70,71,72で調製したイムノリポソームは、Alexander細胞に対し、対応する比率に調整された抗体より強いアポトーシス誘導活性を示し、10 ng/mlにおいて60%以下、100, 1000 ng/mlにおいて10%以下の細胞生存率を示した。
試験例1乃至26から、イムノリポソームおよびコントロール抗体によって細胞生存率が50%に低下する濃度を計算した。結果を表3に示した(コントロール抗体の50%細胞生存率を求めることが可能であった試験例1,6乃至10,12乃至22,25のみ記載している)。表中のEC50は50%細胞生存率を示す濃度を示しており、さらにコントロール抗体の50%細胞生存濃度を各イムノリポソームの50%細胞生存濃度で除した価をEC50 Ab/ILとして記載した。ほとんどのイムノリポソームにおいて、該イムノリポソームの示す50%細胞生存濃度は、コントロール抗体の50%細胞生存濃度に比べて1/10以下に低下した。イムノリポソームによるアポトーシス誘導活性が低い試験例19のような場合でも、1/2.5以下に低下した。試験例7,9,12乃至15,17,21においては、1/100以下に低下した。
本発明により、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合する抗体を含有するイムノリポソームによる癌治療用医薬組成物、自己免疫疾患または炎症性疾患治療用医薬組成物が提供された。
配列番号1−人工配列の説明:ヒト化されたTRA-8の重鎖アミノ酸配列
配列番号2−人工配列の説明:ヒト化されたTRA-8の軽鎖アミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明:ヒト化されたHFE7Aの重鎖アミノ酸配列
配列番号4−人工配列の説明:ヒト化されたHFE7Aの軽鎖アミノ酸配列
配列番号2−人工配列の説明:ヒト化されたTRA-8の軽鎖アミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明:ヒト化されたHFE7Aの重鎖アミノ酸配列
配列番号4−人工配列の説明:ヒト化されたHFE7Aの軽鎖アミノ酸配列
Claims (53)
- 以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体、該抗体の機能性断片、または該抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定部位を含み該細胞表面受容体と特異的に結合するポリペプチド;
(b)両親媒性小胞形成脂質。 - アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、アポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする請求項1に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示すアポトーシス誘導活性と同等、またはより強いアポトーシス誘導活性をin vitroにおいて示すことを特徴とする請求項1または2に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/2.5以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする請求項1乃至3に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該細胞表面受容体に特異的に結合する抗体の全長分子が二次抗体またはProteinG、A等の抗体結合蛋白質によって架橋された場合にin vitroにおいて示す50%細胞生存濃度と比較して、1/10以下の50%細胞生存濃度を示すことを特徴とする請求項1乃至4に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体を含有し、該抗体が抗体の全長分子であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- 抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項6に記載のイムノリポソーム。
- 抗体の全長分子を、総脂質モル数に対して、0.002mol%乃至0.14mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項7に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片が、F(ab’)2であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.23mol%の抗体密で含有することを特徴とする請求項9に記載のイムノリポソーム。
- F(ab’)2を、総脂質モル数に対して、0.006mol%乃至0.11mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項10に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体と特異的に結合する抗体の機能性断片がFab’であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- Fab’を、総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至0.94mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項12に記載のイムノリポソーム。
- Fab’を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項13に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がキメラ抗体であることを特徴とする請求項1乃至14のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト化抗体であることを特徴とする請求項1乃至14のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に対して特異的に結合する抗体がヒト抗体であることを特徴とする請求項1乃至14のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するポリペプチドが、単鎖可変部位抗体であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- 単鎖可変部位抗体を総脂質モル数に対して、0.000014mol%乃至1.8mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項18に記載のイムノリポソーム。
- 単鎖可変部位抗体を、総脂質モル数に対して、0.005mol%乃至0.56mol%の抗体密度で含有することを特徴とする請求項19に記載のイムノリポソーム。
- アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする請求項1乃至20のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される請求項21に記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体が、DR5である請求項22に記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体が、DR4である請求項22に記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体が、Fasである請求項22に記載のイムノリポソーム。
- 抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号1のアミノ酸配列の1〜118番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号2のアミノ酸配列の1〜107番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項23に記載のイムノリポソーム。
- 抗体分子または該抗体の機能性断片が、ハイブリドーマ2E12によって産生される抗体、該抗体と同じエピトープに結合する抗体または該抗体のヒト化抗体から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項24に記載のイムノリポソーム。
- 抗体分子または該抗体の機能性断片が、配列表に記載の配列番号3のアミノ酸配列の1〜139番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列表に記載の配列番号4のアミノ酸配列の1〜131番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項25に記載のイムノリポソーム。
- 以下の(a)及び(b)を含有し、アポトーシス誘導に関与する細胞表面受容体に特異的に結合するイムノリポソーム:
(a)該細胞表面受容体と特異的に結合し、かつ該受容体を介して細胞にアポトーシスを誘導する活性を持つ内因性リガンドまたは該内在性リガンドの機能性断片;
(b)両親媒性小胞形成脂質。 - 該細胞表面受容体を発現する細胞に対して、該内因性リガンドよりも強いアポトーシス誘導活性を示すことを特徴とする請求項29に記載のイムノリポソーム。
- 細胞表面受容体が、デスドメイン含有受容体であることを特徴とする請求項29または30に記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体が、Fas、DR4、DR5およびTNF受容体からなる群から選択される請求項31に記載のイムノリポソーム。
- デスドメイン含有受容体に対する内在性リガンドがTRAILまたはFasリガンドである請求項32に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質として、ステロール類、リン脂質を含有することを特徴とする請求項1乃至33のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質の一つである、ステロール類が、コレステロールであることを特徴とする請求項34に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質の一つである、コレステロールを、総脂質モル数に対して、20mol%乃至50mol%の割合で含有することを特徴とする請求項35に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質の一つである、リン脂質が、ホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項34乃至36のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至22であることを特徴とする請求項37に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質である、ホスファチジルコリン中のアシル基が、炭素数14乃至18であることを特徴とする請求項38に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質として、さらに親水性ポリマーまたは該親水性ポリマーの脂質誘導体を含有する、請求項34乃至39のいずれか一つに記載のイムノリポソーム
。 - 親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、500乃至20000であることを特徴とする請求項40に記載のイムノリポソーム。
- 親水性ポリマーの脂質誘導体における親水性ポリマーの平均分子量が、2000乃至5000であることを特徴とする請求項41に記載のイムノリポソーム。
- 親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、0.1mol%乃至10mol%の割合で含有することを特徴とする請求項40乃至42のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- 親水性ポリマーの脂質誘導体を、総脂質モル数に対して、1mol%乃至6mol%の割合で含有することを特徴とする請求項43に記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームを構成する脂質の一つである、親水性ポリマーの脂質誘導体がポリエチレングリコール修飾脂質であることを特徴とする請求項40乃至44のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- 末端にマレイミド基を有する脂質または親水性ポリマーを用いて、リポソームと抗体とがチオエーテル結合を介して結合していることを特徴とする請求項34乃至44のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームの平均粒子径が30-1000nmであることを特徴とする請求項1乃至46のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- イムノリポソームの平均粒子径が30-200nmであることを特徴とする請求項47に記載のイムノリポソーム。
- リポソーム中に抗腫瘍活性を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする請求項1乃至48のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- リポソーム中に自己免疫疾患または炎症性疾患の治療作用を持つ薬剤が封入されていることを特徴とする請求項1乃至48のいずれか一つに記載のイムノリポソーム。
- 請求項1乃至50のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項1乃至49のいずれか一つに記載のイムノリポソームを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
- 請求項1乃至48のいずれか一つ、または請求項50に記載のイムノリポソームを有効
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