CN101820913A - 在表达含死亡结构域的受体的细胞中诱导细胞凋亡的免疫脂质体 - Google Patents

在表达含死亡结构域的受体的细胞中诱导细胞凋亡的免疫脂质体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对癌症、自体免疫性疾病或炎症具有治疗作用的免疫脂质体制品。具体而言，本发明涉及包含能够诱导表达含死亡结构域的受体的细胞的凋亡的抗体作为成分的免疫脂质体。

Description

在表达含死亡结构域的受体的细胞中诱导细胞凋亡的免疫脂质体
技术领域
本发明涉及含有结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体、对表达该细胞表面受体的细胞具有细胞凋亡诱导作用并可用作肿瘤治疗和/或预防剂的免疫脂质体。本发明还涉及使用该脂质体治疗和/或预防癌症、自体免疫性疾病或炎症的方法。
背景技术
脂质体作为药物载体，特别作为静脉注射用的给药系统(DDS)的载体已引起大量关注，因为它们可含有大量水溶性或疏水物质(D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics to Applications″，Elsevier SciencePublishers，(1993))。近年来，用亲水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)表面改性的脂质体甚至已用于具有低体内稳定性的药物，因为它们与传统脂质体相比，在体内较少聚集和较少被网状内皮系统捕获。因此，这些表面改性的脂质体已在制药技术中投入实际使用，其在血液中实现高稳定性(该药物在血液中的半衰期：20-40小时)。此外，为了将功能分子如蛋白质、肽或糖结合到脂质体表面上(或为了使脂质体表面含有这些功能分子)从而赋予其功能性，近年来已作出许多尝试。
已经提出包括将药物包封到脂质体中并使抗体结合到其表面上的方法作为体内给药至特定位点的手段。特别地，在癌症治疗领域中，含有包封在其中的抗肿瘤药的抗体缀合脂质体已被报道为有效。这类含抗体的脂质体被称作免疫脂质体。在许多情况下，免疫脂质体的药理学作用归因于包封在脂质体中的抗肿瘤药。与此相比，免疫脂质体中所含的抗体通过其结合到肿瘤细胞中特异性表达的抗原上而用于将这些免疫脂质体输送至肿瘤细胞。因此，免疫脂质体中所含的抗体通常只需具有结合到肿瘤细胞特异性抗原上的功能，且抗体本身不必充当治疗剂。对由此可靶向给药的脂质体(甚至PEG-脂质体)而言，所施用的脂质体大部分在到达靶细胞之前被肝等中的免疫细胞捕获和降解，或大量药物损失在溶液中。因此，只有有限量的药物实际到达靶位并发挥其活性。因此，为了开发具有在更稳定包含药物的同时到达靶细胞并在靶位有效释放包封药物的功能的脂质体，已作出许多尝试。但是，这类脂质体迄今尚未投入实际使用。此外，理论上，每一药物都应适用于脂质体。但是，在血液中的稳定药物保留极大取决于脂质体的脂质组分与包封的药物之间的物理相互作用(相容性)。在目前的情况下，只实际适用于有限类型的药物。因此，为获得具有有限给药并含有包封在其中的所述有限类型之一的药物的脂质体的更高药理学作用，需要以新型方式为该脂质体提供进一步的药理学作用。
参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体(以死亡受体为典型)已知通过由配体结合引起的它们在细胞膜上的局部多聚而生物引发细胞内凋亡信号的诱导(Cell Death and Differentiation，10：66-75(2003))。能够结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体如今正作为治疗药物处于临床开发中，并预计具有以对表达该受体的细胞(癌细胞/免疫性疾病相关细胞)特异性的方式发挥拮抗作用以杀死这些细胞的治疗作用。这些抗体的作用被认为基于如下机制：通过该机制，抗体在结合到该受体上之前或之后通过交联多聚，由此造成抗原受体的多聚(即细胞凋亡诱导)。它们的活性的呈现在体外实验中可能要求通过将二抗添加到其上来人工交联当前抗体，而在体内则需要通过免疫效应细胞上的Fc受体使抗体交联的作用机制。近年来已试图通过抗体的结构改性来进一步增强抗体的原始功能。例如，已经报道，通过除去抗体上的特定糖链结构来改进对Fc受体的亲合力。但是，免疫效应细胞的量或功能随个体而变。此外，在药物治疗的癌症患者或免疫性疾病患者中，免疫效应细胞的量或功能极大降低。现有抗体可能未对这类癌症或免疫性疾病患者产生充足药理学作用。因此，需要进一步增强抗体本身的功能。
发明公开
本发明的一个目的是提供对癌症具有治疗作用的药剂。本发明的另一目的是提供含有能够诱导细胞凋亡的抗体的脂质体制品。
本发明人为实现这些目的作出勤勉的研究并因此通过发现含有能够诱导细胞凋亡的抗体的脂质体制品可表现出比仅该抗体更显著的细胞凋亡诱导能力而完成本发明。由于该抗体高密度存在于该脂质体上，本发明的脂质体与生物交联抗体类似地发挥作用。因此，不依赖于体外二抗或体内效应细胞的存在，该免疫脂质体更有效地独自发挥细胞凋亡诱导能力。这甚至在通过该抗体本身不能获得充足治疗作用的患者中也产生有效治疗作用。此外，含有包封在其中的药物的本免疫脂质体产生有效的药物靶向靶细胞的功能以及双重药理学作用，即该药物的治疗作用和该提高的抗体活性的治疗作用。这可以带来仅包封药物的脂质体或只有靶向能力的抗体的免疫脂质体不可实现的治疗作用。
具体而言，本发明包括下列发明：
(1)含有下列组分(a)和(b)并特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的免疫脂质体：
(a)特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体、该抗体的功能片段、或包含该抗体的重链和轻链互补决定区并特异性结合到该细胞表面受体上的多肽；和
(b)两亲成囊泡脂质。
(2)根据(1)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出细胞凋亡诱导活性。
(3)根据(1)或(2)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞体外表现出的细胞凋亡诱导活性等于或强于通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该活性。
(4)根据(1)至(3)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出的致50％细胞生存力浓度为通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该浓度的1/2.5或更小。
(5)根据(1)至(4)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出的致50％细胞生存力浓度为通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该浓度的1/10或更小。
(6)根据(1)至(5)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体含有特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体，其中该抗体是全长抗体分子。
(7)根据(6)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.23摩尔％的抗体密度含有该全长抗体分子。
(8)根据(7)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.002摩尔％至0.14摩尔％的抗体密度含有该全长抗体分子。
(9)根据(1)至(5)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体功能片段是F(ab′)2。
(10)根据(9)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.23摩尔％的抗体密度含有F(ab′)2。
(11)根据(10)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.006摩尔％至0.11摩尔％的抗体密度含有F(ab′)2。
(12)根据(1)至(5)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体功能片段是Fab′。
(13)根据(12)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.94摩尔％的抗体密度含有Fab′。
(14)根据(13)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.005摩尔％至0.56摩尔％的抗体密度含有Fab′。
(15)根据(1)至(14)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是嵌合抗体。
(16)根据(1)至(14)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是人源化抗体。
(17)根据(1)至(14)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是人抗体。
(18)根据(1)至(5)任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的多肽是单链可变区片段抗体(single-chain variable fragment antibody)。
(19)根据(18)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至1.8摩尔％的抗体密度含有该单链可变区片段抗体。
(20)根据(19)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.005摩尔％至0.56摩尔％的抗体密度含有该单链可变区片段抗体。
(21)根据(1)至(20)任一项的免疫脂质体，其特征在于参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体是含死亡结构域的受体。
(22)根据(21)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体选自Fas、DR4、DR5和TNF受体。
(23)根据(22)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是DR5。
(24)根据(22)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是DR4。
(25)根据(22)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是Fas。
(26)根据(23)的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含由序列表中所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸残基1至118构成的重链可变区序列和由序列表中所述的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸残基1至107构成的轻链可变区序列。
(27)根据(24)的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含选自由杂交瘤m2E12产生的抗体、结合到与该抗体相同的表位上的抗体和该抗体的人源化抗体的抗体的重链和轻链可变区。
(28)根据(25)的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含由序列表中所述的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基1至139构成的重链可变区序列和由序列表中所述的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基1至131构成的轻链可变区序列。
(29)含有下列组分(a)和(b)并特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的免疫脂质体：
(a)内源配体，其特异性结合到该细胞表面受体上并具有经由该受体或经由该内源配体的功能片段诱导细胞凋亡的活性；和
(b)两亲成囊泡脂质。
(30)根据(29)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体表现出比该内源配体强的对表达该细胞表面受体的细胞的细胞凋亡诱导活性。
(31)根据(29)或(30)的免疫脂质体，其特征在于该细胞表面受体是含死亡结构域的受体。
(32)根据(31)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体选自Fas、DR4、DR5和TNF受体。
(33)根据(32)的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体的内源配体是TRAIL或Fas配体。
(34)根据(1)至(33)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体含有甾醇和磷脂作为脂质成分。
(35)根据(34)的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的甾醇是胆甾醇。
(36)根据(35)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的20摩尔％至50摩尔％的含量含有胆甾醇作为该免疫脂质体的脂质成分之一。
(37)根据(34)至(36)任一项的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的磷脂是磷脂酰胆碱。
(38)根据(37)的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分的磷脂酰胆碱含有具有14至22个碳原子的酰基。
(39)根据(38)的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分的磷脂酰胆碱含有具有14至18个碳原子的酰基。
(40)根据(34)至(39)任一项的免疫脂质体，其中该免疫脂质体进一步含有亲水聚合物或该亲水聚合物的脂质衍生物作为脂质成分。
(41)根据(40)的免疫脂质体，其特征在于该亲水聚合物的脂质衍生物中的亲水聚合物具有500至20000的平均分子量。
(42)根据(41)的免疫脂质体，其特征在于该亲水聚合物的脂质衍生物中的亲水聚合物具有2000至5000的平均分子量。
(43)根据(40)至(42)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.1摩尔％至10摩尔％的含量含有该亲水聚合物的脂质衍生物。
(44)根据(43)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的1摩尔％至6摩尔％的含量含有该亲水聚合物的脂质衍生物。
(45)根据(40)至(44)任一项的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的该亲水聚合物的脂质衍生物是聚乙二醇改性的脂质。
(46)根据(34)至(44)任一项的免疫脂质体，其特征在于使用具有末端马来酰亚胺基团的脂质或亲水聚合物经由硫醚键将该脂质体与抗体缀合。
(47)根据(1)至(46)任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体具有30至1000纳米的平均粒度。
(48)根据(47)的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体具有30至200纳米的平均粒度。
(49)根据(1)至(48)任一项的免疫脂质体，其特征在于将具有抗肿瘤活性的药物包封在该脂质体中。
(50)根据(1)至(48)任一项的免疫脂质体，其特征在于将对自体免疫性疾病或炎症具有治疗作用的药物包封在该脂质体中。
(51)包含根据(1)至(50)任一项的免疫脂质体作为活性成分的药物组合物。
(52)包含根据(1)至(49)任一项的免疫脂质体作为活性成分的抗肿瘤药。
(53)包含根据(1)至(48)和(50)任一项的免疫脂质体作为活性成分的自体免疫性疾病或炎症治疗剂。
附图简述
图1是显示实施例1、2和3中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带虚线的白圈、带虚线的黑圈和带实线的白圈分别代表实施例1、2和3中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图2是显示实施例19、20和21中制备的免疫脂质体对A375细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例19、20和21中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图3是显示实施例8、10、12、14和16中制备的免疫脂质体对A375细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白色三角形、带虚线的黑色三角形、带实线的白圈、带虚线的黑圈和带虚线的白圈分别代表实施例8、10、12、14和16中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图4是显示实施例7、9、11、13和15中制备的免疫脂质体对A2058细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白色三角形、带虚线的黑色三角形、带实线的白圈、带虚线的黑圈和带虚线的白圈分别代表实施例7、9、11、13和15中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图5是显示实施例26、27、28、29、30和31中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带虚线的白色三角形、带实线的白色三角形、带实线的黑色三角形、带虚线的白圈、带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例26、27、28、29、30和31中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hHFE7A的活性；
图6是显示实施例4、17和18中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的黑圈和带虚线的白圈分别代表实施例4、17和18中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图7是显示实施例22和23中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例22和23中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图8是显示实施例24中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈代表实施例24中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图9是显示实施例25中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈代表实施例25中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图10是显示实施例5和6中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例5和6中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图11是显示实施例3和20中制备的免疫脂质体对来自特定风湿病患者的滑膜细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例3和20中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图12是显示实施例5中制备的免疫脂质体对人克隆癌细胞株COLO205-移植的裸鼠的抗肿瘤活性的图。在该图中，无符号的实线代表未施加抗体的小鼠的肿瘤体积。带实线的白圈和带实线的白色三角形代表已分别接受施用3.3毫克/千克和10毫克/千克抗体的小鼠的肿瘤体积；
图13是显示实施例32、33、34和35中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的白圈、带虚线的黑圈和带实线的黑色三角形分别代表实施例32、33、34和35中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图14是显示实施例44、45、46、47、48和49中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的白圈、带实线的黑色正方形、带实线的白色正方形、带实线的黑色三角形和带虚线的黑圈分别代表实施例44、45、46、47、48和49中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图15是显示实施例50、51和52中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的白圈和带虚线的黑色正方形分别代表实施例50、51和52中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图16是显示实施例53、54、55、56和57中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带虚线的白圈、带实线的黑色正方形、带实线的白圈、带虚线的黑圈和带实线的白色三角形分别代表实施例53、54、55、56和57中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hHFE7A的活性；
图17是显示实施例58中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈代表实施例58中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图18是显示实施例36和37中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例36和37中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的MAB631的活性；
图19是显示实施例38和39中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例38和39中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的MAB6311的活性；
图20是显示实施例59和60中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈和带虚线的黑圈分别代表实施例59和60中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的rsTRAIL(P)的活性；
图21是显示实施例61中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈代表实施例61中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的rsTRAIL(B)的活性；
图22是显示实施例41、42、43和69中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈、带虚线的白圈、带虚线的黑圈和带实线的黑色正方形分别代表实施例41、42、43和69中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图23是显示实施例67和68中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带虚线的黑圈和带实线的白圈分别代表实施例67和68中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的hTRA-8的活性；
图24是显示实施例40中制备的免疫脂质体对WR19L12a细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的白圈代表实施例40中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的DX2的活性；
图25是显示实施例62、64、65和66中制备的免疫脂质体对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带虚线的白圈、带虚线的黑圈、带实线的白圈和带虚线的黑色正方形分别代表实施例62、64、65和66中获得的脂质体的活性。带实线的黑圈代表二次交联的m2E12的活性；且
图26是显示实施例70、71和72中制备的免疫脂质体对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性的图。在该图中，带实线的黑圈、带虚线的黑菱形和带实线的黑色正方形分别代表实施例70、71和72中获得的脂质体的活性。带实线的白圈、带虚线的白菱形和带实线的白色正方形分别代表以22∶78的比率混合的m2E12和hTRA-8、以56∶44的比率混合的m2E12和hTRA-8以及以80∶20的比率混合的m2E12和hTRA-8的活性。
本发明的最佳实施方式
在本说明书中，术语“癌症”和“肿瘤”以相同意义使用。
在本说明书中，术语“基因”意在包括DNA及其mRNA、cDNA及其cRNA。
在本说明书中，术语“多聚核苷酸”在与核酸相同的意义上使用并且也包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中，术语“多肽”和“蛋白质”之间不加区分地使用。
在本说明书中，术语“RNA片段”是指含有RNA的片段。
在本说明书中，术语“细胞”也包括个体动物中的细胞和培养细胞。
在本说明书中，术语“细胞恶性转化”是指细胞表现出异常生长，例如，丧失对接触抑制的敏感性，或表现出非贴壁依赖性生长。表现出这类异常生长的细胞被称作“癌细胞”。
在本说明书中，术语“细胞毒性”是指细胞中的任何病理变化，并且不仅指直接损害，还指对细胞的任何结构或功能破坏，如DNA断裂、碱基二聚化、染色体断裂、有丝分裂器破坏和各种酶活性的降低。
在本说明书中，术语“细胞毒活性”是指造成细胞毒性的活性。
在本说明书中，例如，短语“免疫脂质体中所含的抗体(或多肽)”中所用的术语“所含”是指该脂质体的脂质成分的官能团与该多肽的官能团基于物理/生物亲合力形成共价键或非共价键的状态。
在本说明书中，术语“含死亡结构域的受体”是指在细胞内区域中具有与果蝇自杀基因reaper同源的被称作“死亡结构域”的细胞凋亡信号转导区的受体分子(受体分子的实例包括，但不限于，Fas、TNFRI、DR3、DR4、DR5和DR6)。
在本说明书中，术语“抗体功能片段”是指对抗原具有结合亲合力的部分抗体片段，并包括Fab、F(ab′)2、scFv和类似物。此外，抗体功能片段还包括Fab′，其是通过在还原条件下处理F(ab′)2而获得的抗体可变区的一价片段。但是，抗体功能片段不限于这些分子，只要其能够结合到抗原上。此外，这些功能片段不仅包括通过用适当的酶处理抗体蛋白质的全长分子而获得的片段，还包括使用基因改变的抗体基因由适当宿主细胞制备的蛋白质。
在本发明中，术语“Fab′”是指如上所述通过在还原条件下处理F(ab′)2而获得的抗体可变区的一价片段。这种Fab可以利用在还原条件下在该Fab′中产生的硫醇基团与脂质体缀合。但是，使用基因改变的抗体基因制备的Fab′或包含在羧基末端基因工程化的含半胱氨酸残基的多肽的Fab也可以利用它们各自的硫醇基团与脂质体缀合，并且也包含在本发明的Fab′中。
在本说明书中，术语“单链可变区片段抗体”在与单链Fv(scFv)相同的意义上使用。
在本说明书中，术语“二抗”是指特异性结合到抗体分子上以在抗体分子之间形成交联的抗体。
在本说明书中，术语“两亲成囊泡脂质”包括具有疏水和亲水部分且本身可进一步在水中形成双层囊泡的脂质，以及与其它脂质一起并入脂双层中的所有两亲脂质，其中使其疏水区与该双层膜的内部疏水区接触，同时其亲水区排列成面向该膜的极性外表面。
在本说明书中，术语“脂质体”是指由两亲成囊泡脂质形成的脂质结构。该脂质体通常是由具有内部水相的单层或更多层脂双层构成的封闭囊泡。在本发明中，脂质体在更广意义上是指脂质复合粒子。
在本说明书中，术语“免疫脂质体”是指由脂质体和蛋白质形成的复合物。
在本说明书中，免疫脂质体的“抗体密度”是指该免疫脂质体中所含的抗体摩尔数与该免疫脂质体的总脂质成分摩尔数的比率(以摩尔％表示)。
在本说明书中，术语“平均粒度”是指相对于体积或数量测得的粒度分布平均值。通过例如电磁波散射法(例如激光衍射法和动态光散射)和光透射法(例如离心沉降)测量粒子的粒度。
1.关于细胞凋亡相关基因
在本发明中，所述免疫脂质体中所含的抗体被要求结合到特定抗原上并经由该抗原表现出细胞毒活性。此外，该抗原必须选自以对肿瘤细胞特异性的方式存在的那些抗原，以防止杀死正常细胞。这类抗原组的一个实例可以包括肿瘤坏死因子(在本说明书下文中称作“TNF”)相关的细胞凋亡诱导配体(在本说明书下文中称作“TRAIL”)受体组。TRAIL是TNF族蛋白质的成员，并包括Fas配体和TNF-α(Wiley SR等人，Immunity 1995Dec；3(6)：673-82)。这些蛋白质是强的细胞凋亡诱导因子。
这些TNF族蛋白质的受体以细胞外区域中的富含半胱氨酸的重复序列为特征。其中，Fas(Fas配体的受体)和TNF受体I(在本说明书下文中称作“TNFRI”)(TNFα的受体)统称为含死亡结构域的受体，其在细胞内区域中具有细胞凋亡信号转导必需的与果蝇自杀基因reaper同源的区域，被称作“死亡结构域”(Golstein，P.等人，(1995)Cell.81，185-186；和White，K等人，(1994)Science 264，677-683)。
已经确认了TRAIL的五种受体。其中两种(DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2))能够转导细胞凋亡信号，另外三种(DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和骨保护素(osteoprotegerin)(OPG))不转导细胞凋亡信号。如在Fas和TNFRI中那样，DR4和DR5都在细胞内片段中包含死亡结构域并经由含有Fas相关死亡结构域蛋白质(在本说明书下文中称作“FADD”)和胱天蛋白酶(caspase)8的路径转导细胞凋亡信号(Delgi-Esposti MA等人，Immunity 1997 Dec；7(6)：813-20；和Chaudhary PM等人，Immunity 1997 Dec；7(6)：821-30)。
对上述Fas、TNFRI、DR4或DR5而言，结合到这种分子上的充当激动剂的抗体已知对在细胞表面上带有该分子的细胞表现出细胞凋亡诱导能力(Journal of Cellular Physiology，209：1021-1028(2006)；Leukemia，Apr；21(4)：805-812(2007)；Blood，99：1666-1675(2002)；和Cellular Immunology，Jan；153(1)：184-193(1994))。通过与二抗或效应细胞交联，增强激动型抗体的药理学作用(Journal of Immunology，149：3166-3173(1992)；和European Journal of Immunology，Oct；23(10)：2676-2681(1993))。该免疫脂质体包含结合到脂质体膜上的许多抗体，因此可以被视为模拟抗体交联态的结构。因此，与经由二抗或效应细胞的传统交联相比，该免疫脂质体可能更大提高该激动型抗体的药理学作用。此外，该免疫脂质体可人工实现高度交联态。因此预计，单独的该抗体不一定具有激动活性。由于这些原因，可以选择结合到该含死亡结构域的受体上的抗体作为本发明的免疫脂质体中可包含的抗体。
2.结合到DR5上的抗体
(1)DR5基因
人DR5(死亡受体5)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：22547118(Accession No：NM_147187)。在本文中，DR5基因的核苷酸序列还包括由DR5氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR5同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，DR5还包括由DR5氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR5同等的生物活性的蛋白质。
(2)抗DR5的抗体
本发明的抗DR5的抗体可以根据标准方法通过用DR5或用选自DR5氨基酸序列的任意多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体来获得。
此外，使产生抗DR5的抗体的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞根据本领域已知的方法融合(例如Kohler和Milstein，Nature(1975)256，第495-497页；和Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodies，第365-367页，Plenum Press，N.Y.(1980))，由此建立杂交瘤，也可由其获得单克隆抗体。
在本文中，可通过经基因工程使宿主细胞中表达DR5基因来获得用作抗原的DR5。
具体而言，制备能够表达DR5基因的载体并引入宿主细胞中，随后使其表达该基因，并可以纯化表达的DR5。
此外，构建编码与抗体恒定区融合的DR5细胞外区域的人工基因，由其在适当的基因表达系统中制备的蛋白质也可用作免疫原。
下面具体描述获得抗DR5的抗体的方法。
(2)-1.抗原的制备
用于制备抗-DR5抗体的抗原的实施例可以包括DR5、由其至少6个氨基酸的连续部分氨基酸序列构成的多肽和通过在这些序列中加入任意氨基酸序列或载体而获得的衍生物。
DR5可以从人肿瘤组织或肿瘤细胞中直接纯化使用。此外，DR5可以体外合成或通过经基因工程使宿主细胞产生蛋白质来获得。
在基因工程中，具体而言，将DR5基因并入能够表达DR5的载体中，随后可以在含有转录和转译必需的酶、底物和能量物质的溶液中合成DR5。或者，可以用其转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞并使其表达DR5以获得该蛋白质。
DR5cDNA可以例如通过所谓的聚合酶链反应(下文称作“PCR”)法获得，其中使用表达DR5的cDNA库作为模板并使用特异性增强DR5cDNA的引物进行PCR(参见Saiki，R.K.等人Science(1988)239，第487-489页)。
体外多肽合成法的实例包括，但不限于，Roche Diagnostics GmbH制造的Rapid Translation System(RTS)。
宿主原核细胞的实例包括大肠杆菌(Escherichia Coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。为了用所述基因转化这些宿主细胞，用包含复制子(即复制起点)和源自与宿主相容的物种的调节序列的质粒载体转化宿主细胞。此外，该载体优选应具有可赋予转化的细胞表型性状(表型)选择性的序列。
宿主真核细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞。例如，猴COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，第175-182页，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶-缺陷株(Urlaub，G.和Chasin，L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，第4126-4220页)常用作脊椎动物细胞，尽管脊椎动物细胞不限于此。
由此获得的转化体可以根据标准方法培养并通过该培养使其细胞内或细胞外产生相关多肽。
可以根据所用的宿主细胞从常规使用的各种培养基中适当选择该培养用的培养基。对大肠杆菌而言，例如，可以使用任选补充了抗生素(例如氨苄青霉素)或IPTG的LB培养基。
在该培养中由该转化体细胞内或细胞外产生的重组蛋白可以通过本领域已知的各种分离程序，利用该蛋白质的物理性质、化学性质等分离和纯化。
这些程序的具体实例可以是，用普通蛋白质沉淀剂处理、超滤、各种液相色谱技术如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法和高效液相色谱法(HPLC)、渗析及其组合。
此外，要表达的重组蛋白可连接到6个组氨酸残基上，由此在镍亲和柱上有效纯化所得蛋白质。
通过结合这些方法，可以简单地以高收率和高纯度大量制造相关多肽。
(2)-2.抗-DR5单克隆抗体的制造
特异性结合到DR5上的抗体的实例可以包括特异性结合到DR5上的单克隆抗体。下面描述获得该抗体的方法。
为了制造单克隆抗体，通常需要下列过程：
(a)纯化用作抗原的生物聚合物的步骤，
(b)通过注射，用抗原免疫动物，随后收集该动物的血液，检测其抗体滴度以确定脾切除术的时机并随后制备抗体生成细胞的步骤，
(c)制备骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的步骤，
(d)进行抗体生成细胞和骨髓瘤之间的细胞融合的步骤，
(e)选择产生所述抗体的杂交瘤组的步骤，
(f)分成单细胞克隆株(克隆)的步骤，
(g)根据情况，培养杂交瘤以大量制造单克隆抗体或饲养杂交瘤移植动物的步骤，
(h)研究由此制备的单克隆抗体的生物活性和结合特异性或检测标记试剂的性质等的步骤。
下面根据这些步骤详细描述制备单克隆抗体的方法，尽管制备抗体的方法不限于此。例如，也可以使用脾细胞和骨髓瘤以外的抗体生成细胞。
(a)抗原的纯化
可以使用通过上述方法制备的DR5或其一部分作为抗原。
此外，也可以使用由表达DR5的重组细胞制备的膜片段、表达DR5的重组细胞本身、DR5与另一蛋白质的融合蛋白和根据本领域技术人员公知的方法化学合成的本发明的蛋白质的部分肽作为抗原。
(b)抗体生成细胞的制备
将步骤(a)中获得的抗原与完整或不完整的弗氏佐剂或其它辅助剂，如硫酸钾铝混合，并用这些免疫原免疫实验动物。可以毫无问题地使用本领域中已知的杂交瘤制备方法中所用的动物作为实验动物。具体而言，例如，可以使用小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和马。但是，从要与提取的抗体生成细胞融合的骨髓瘤细胞的易得性等角度看，优选使用小鼠或大鼠作为要免疫的动物。
此外，实际使用的小鼠和大鼠的谱系不受特别限制。例如，可以使用如A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB和129之类的小鼠谱系和如Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN和Fischer之类的大鼠谱系。
这些小鼠和大鼠可以获自，例如，实验动物培育者/销售商，如CLEAJapan，Inc.和Charles River Laboratories Japan，Inc。
在这些谱系中，考虑到与下述骨髓瘤细胞的融合相容性，小鼠BALB/c谱系和大鼠Low谱系特别优选作为要免疫的动物。
此外，考虑到人和小鼠之间的抗原同源性，还优选使用具有降低的自身抗体清除生物机制的小鼠，即自体免疫性疾病小鼠。
这些小鼠和大鼠在免疫时优选为5至12周大，更优选6至8周大。
为了用DR5或其重组体免疫动物，可以使用例如Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology第I.II.III.卷，BlackwellScientific Publications，Oxford(1987)和Kabat，E.A.和Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Springfield，Illinois(1964)中详细描述的本领域已知的方法。
在这些免疫方法中，如下所述具体阐述本发明中优选的方法。
具体而言，首先将用作抗原或抗原表达细胞的膜蛋白质片段皮内或腹膜内施用于动物。
但是，优选联用这两种给药途径以提高免疫效率。通过在早期免疫中进行皮内给药和在后期免疫中或仅在末次免疫中进行腹膜内给药，特别可以提高免疫效率。
抗原的给药方案根据要免疫的动物的类型、其个体差异等而不同。抗原通常优选以2至6周为间隔分3至6剂给药，更优选以2至4周为间隔分3至4剂给药。
此外，抗原的剂量根据动物类型、其个体差异等而不同，并通常为大约0.05至5毫克，优选0.1至0.5毫克。
在这种抗原给药后1至6周，优选2至4周，更优选2至3周进行加强免疫。
在本文中，加强免疫中的抗原剂量根据动物类型、其大小等而不同，并通常为大约0.05至5毫克，优选0.1至0.5毫克，更优选0.1至0.2毫克，例如对小鼠而言。
在加强免疫后1至10天，优选2至5天，更优选2至3天，从由此免疫的动物中无菌提取含抗体生成细胞的脾细胞或淋巴细胞。
在这种程序中，测量它们的抗体滴度并可以使用具有充分提高的抗体滴度的动物作为抗体生成细胞源，由此提高后继程序的效率。
此处所用的测量抗体滴度的方法的实例可以包括，但不限于，RIA和ELISA。
本发明的抗体滴度测量可以通过如下所述的程序，例如根据ELISA进行。
首先，使纯化或部分纯化的抗原吸附到固相，如用于ELISA的96孔板的表面上。此外，用与该抗原无关的蛋白质，例如牛血清白蛋白(下文称作“BSA”)覆盖未吸附抗原的固相表面。洗涤该表面，然后与作为一抗的连续稀释样品(例如小鼠血清)接触以使样品中的抗体结合到该抗原上。
此外，向其中加入抗该小鼠抗体的酶标记抗体作为二抗以使该二抗结合到该小鼠抗体上。在洗涤后，向其中加入酶底物，例如，测量由基于底物降解的显色造成的吸光度变化，由此计算抗体滴度。
可以根据本领域已知的方法从这些脾细胞或淋巴细胞中分离抗体生成细胞(例如Kohler等人，Nature(1975)256，第495页；Kohler等人，Eur.J.Immunol.(1977)6，第511页；Milstein等人，Nature(1977)，266，第550页；和Walsh，Nature，(1977)266，第495页)。
例如，对脾细胞而言，可以采用普通方法，包括将细胞切成条，经不锈钢筛过滤它们，然后通过浮在Eagle′s最小必需培养基(MEM)中来从中分离抗体生成细胞。
(C)骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的制备
细胞融合中所用的骨髓瘤细胞不受特别限制，并且可以从本领域已知的细胞株中适当选用。但是，考虑到从融合细胞中方便的选择杂交瘤，优选使用HGPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)-缺陷株，其选择方法已确立。
其具体实例包括：小鼠源X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO和BU.1；大鼠源210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)；和人源U266AR(SKO-007)、GM1500.GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)和8226AR/NIP4-1(NP41)。
这些HGPRT-缺陷株可获自，例如，American Type Culture Collection(ATCC)。
这些细胞株在细胞融合之前在适当培养基，例如8-氮鸟嘌呤培养基[RPMI-1640培养基，补充了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(下文称作“FCS”)并进一步补充了8-氮鸟嘌呤]、Iscove′s改进Dulbecco′s培养基(下文称作“IMDM”)或Dulbecco′s改进Eagle培养基(下文称作“DMEM”)中继代培养和在正常培养基[例如，含10％FCS的ASF104培养基(Ajinomoto Co.，Inc.制造)]中继代培养3至4天。在融合当天，固定2×107或更多细胞。
(d)细胞融合
抗体生成细胞和骨髓瘤细胞之间的融合可以根据本领域已知的方法在不过度降低细胞生存力的条件下适当地进行(例如，Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology第I.II.III.卷，BlackwellScientific Publications，Oxford(1987)；和Kabat，E.A.和Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Springfield，Illinois(1964))。
例如，可以使用包括在高浓度聚合物(例如聚乙二醇)溶液中混合抗体生成细胞和骨髓瘤细胞的化学方法和使用电刺激的物理方法作为这类方法。
在这些方法中，如下所述具体例举化学方法。
具体而言，当使用聚乙二醇作为该高浓度聚合物溶液中的聚合物时，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞在30至40℃，优选35至38℃的温度下在分子量为1500至6000，优选2000至4000的聚乙二醇的溶液中混合1至10分钟，优选5至8分钟。
(e)杂交瘤组的选择
选择通过细胞融合获得的杂交瘤的方法不受特别限制，通常使用HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶)选择法(Kohler等人，Nature(1975)256，第495页；和Milstein等人，Nature(1977)266，第550页)。
这种方法使用在aminobuterin中不能存活的HGPRT-缺陷型骨髓瘤细胞有效获得杂交瘤.
具体而言，可以在HAT培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，由此仅使耐aminobuterin的杂交瘤选择性保留和生长。
(f)分成单细胞克隆株(克隆)
例如，可以使用本领域已知的方法，如甲基纤维素、软琼脂和有限稀释法作为克隆杂交瘤的方法(例如Barbara，B.M.和Stanley，M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman和Company，SanFrancisco(1980))。在这些方法中，有限稀释法特别优选。
在这种方法中，将饲养细胞(feeder)如大鼠胚胎源成纤维细胞株或正常小鼠脾、胸腺或腹水细胞接种到微板上。
另一方面，预先在培养基中将杂交瘤稀释至0.2至0.5个/0.2毫升。含有漂浮在其中的稀释杂交瘤的这种溶液以0.1毫升/孔的浓度添加，且杂交瘤可连续培养大约2周，同时定期(例如以3天为间隔)将大约1/3培养基换成新培养基，由此生长杂交瘤克隆株。
对具有可观察到的抗体滴度的孔而言，例如，通过有限稀释法的克隆重复2至4次，并选择稳定观察到其抗体滴度的克隆株作为产生抗-DR5单克隆抗体的杂交瘤株。
(g)通过杂交瘤培养制备单克隆抗体
可以培养由此选择的杂交瘤以由此有效获得单克隆抗体。在培养之前，应优选筛选产生所述单克隆抗体的杂交瘤。
对于这种筛选，可以采用本身为本领域中已知的方法。
根据本发明的抗体滴度测量可以例如通过段落(b)中所述的ELISA进行。
通过上述方法获得的杂交瘤可以在液氮中或在冷冻器中在-80℃或更低温度下冷藏。
完整克隆的杂交瘤可以在HT培养基中培养，随后将该HT培养基换成正常培养基。
通过使用大培养瓶的旋转培养或旋动培养，进行大规模培养。
可以根据本领域技术人员公知的方法，如凝胶过滤法纯化这种大规模培养中获得的上清液，以获得特异性结合到本发明的蛋白质上的单克隆抗体。
此外，杂交瘤可以腹膜内注射到相同谱系thereas(例如BALB/c)的小鼠或Nu/Nu小鼠中并生长以大量获得含有本发明的单克隆抗体的腹水。
对腹膜内给药而言，预先(在给药前3至7天)给予矿物油，如2，6，10，14-四甲基十五烷(姥鲛烷)以获得更大量的腹水。
例如，预先向与杂交瘤相同谱系的小鼠腹膜内注射免疫抑制剂以使T细胞失活。20天后，使106至107个杂交瘤克隆细胞漂浮(0.5毫升)在无血清培养基中，并将该溶液腹膜内给药于小鼠。通常在由于腹水积聚而发生腹胀时从小鼠中收集腹水。
通过这种方法，以比培养物溶液中高大约100倍的浓度获得单克隆抗体。
通过该方法获得的单克隆抗体可以通过例如Weir，D.M.：Handbookof Experimental Immunology，第I，II，III卷，Blackwell ScientificPublications，Oxford(1978)中所述的方法纯化。
其具体实例包括硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱法和亲和色谱法。
为了纯化，也可以使用市售单克隆抗体纯化试剂盒(例如MAbTrapGII Kit；Pharmacia Inc.制造)等作为方便的方法。
由此获得的单克隆抗体对DR5具有高的抗原特异性。
(h)单克隆抗体的检测
可以如下所述测定由此获得的单克隆抗体的同种型和亚类。
首先，识别方法的实例包括Ouchterlony方法、ELISA和RIA。
Ouchterlony方法是方便的，但对于低浓度的单克隆抗体，需要浓缩程序。
另一方面，当使用ELISA或RIA时，使培养上清液直接与吸附了抗原的固相反应，并进一步使用与各种免疫球蛋白同种型和亚类相容的抗体作为二抗，由此识别该单克隆抗体的同种型和亚类。
此外，也可以使用市售识别用试剂盒(例如Mouse Typer Kit；Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)等作为更方便的方法。
此外，可以根据Folin-Lowry法和使用280纳米下的吸光度的计算法[1.4(OD280)＝1毫克/毫升免疫球蛋白]量化该蛋白质。
(3)其它抗体
本发明的抗体包括抗DR5的单克隆抗体以及为了例如降低对人的异种抗原性而人工修饰的基因重组抗体，例如嵌合、人源化和人抗体。这些抗体可根据已知方法制造。
嵌合抗体的实例包括具有源自彼此不同的物种的可变和恒定区的抗体，具体包括包含连接在一起的小鼠源性可变区和人源性恒定区的嵌合抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855，(1984))。
人源化抗体的实例可以包括，包含互补决定区(CDRs)被另一物种的互补决定区替代的人源性抗体的抗体(Nature(1986)321，第522-525页)和包含CDR序列和一些骨架氨基酸残基通过CDR接枝被另一物种的替代的人抗体的抗体(WO90/07861的小册子)。
本发明的抗体的另一些实例可以包括抗-人抗体。抗-DR5人抗体是指只有人染色体源抗体的基因序列的人抗体。该抗-DR5人抗体可以通过使用具有含人抗体H和L链的基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法获得(例如，Tomizuka，K.等人，Nature Genetics(1997)16，第133-143页；Kuroiwa，Y.等人，Nucl.Acids Res.(1998)26，第3447-3448页；Yoshida，H.等人，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects第10卷，第69-73页(Kitagawa，Y.，Matsuda，T.和Iijima，S.eds.)，KluwerAcademic Publishers，1999；和Tomizuka，K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，第722-727页)。
对这类转基因动物而言，具体地，可以通过准备敲除动物和转基因动物并使这些动物杂交来创造基因重组动物，其中非人哺乳动物中的内源性免疫球蛋白重链和轻链的基因座断裂并取而代之地经由酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链的基因座。
此外，用编码各个这类人源化抗体重链和轻链的cDNA，优选含有该cDNA的载体通过基因重组技术转化真核细胞，也可以培养产生基因重组人单克隆抗体的转化细胞，由此从培养上清液中获得这些抗体。
例如，在本文中，可以使用真核细胞，优选哺乳动物细胞，如CHO细胞、淋巴细胞和骨髓瘤作为宿主。
此外，获得选自人抗体库的噬菌体展示人抗体的方法也是已知的(Wormstone，I.M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，第2301-2308页；Carmen，S.等人，Briefings in FunctionalGenomics and Proteomics(2002)，1(2)，第189-203页；和Siriwardena，D.等人，Ophthalmology(2002)109(3)，第427-431页)。
例如，可以使用噬菌体展示法，其包括使人抗体可变区作为噬菌体表面上的单链抗体(scFv)表达并选择结合到抗原上的噬菌体(NatureBiotechnology(2005)，23，(9)，第1105-1116页)。
可以分析基于抗原结合选择的噬菌体的基因，由此确定编码结合到抗原上的人抗体可变区的DNA序列。
当弄清结合到抗原上的scFv的DNA序列时，可以制备具有该序列的表达载体并引入适当宿主中，随后基因表达以获得人抗体(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，第433-455页和Nature Biotechnology(2005)23(9)，第1105-1116页)。
可以临时分离抗体基因，随后引入适当宿主中以制备抗体。在这种情况下，适当的宿主和表达载体可合并使用。
当使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。
动物细胞的实例可以包括(1)哺乳动物细胞，例如猴COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，第175-182页，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶-缺陷株(Urlaub，G.和Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，第4126-4220页)。
当使用原核细胞时，其实例可以包括大肠杆菌和枯草杆菌。
将所述抗体基因通过转化引入这些细胞，并体外培养该转化细胞以获得抗体。
本发明的抗体的同种型不受限制，其实例包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA(IgA1或IgA2)、IgD和IgE，并优选包括IgG和IgM。
本发明的抗体还可以是具有该抗体的抗原结合位点的抗体片段或其改性形式，只要其保持对抗原的结合亲合力。
该抗体功能片段的实例包括Fab、F(ab′)2、Fab′(其是通过还原F(ab′)2而获得的抗体可变区的一价片段)、Fv、包含经适当连接物连接的重链和轻链Fvs的单链Fv(scFv)、diabody、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。但是，该抗体功能片段不限于这些片段，只要其保持对抗原的亲合力。这些抗体片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理全长抗体分子来获得。此外，抗体片段也可以通过在适当的基因表达系统中使用编码该抗体片段的重链和轻链的核酸序列制造蛋白质来获得。此外，也可以使用包含在抗体功能片段的羧基末端基因工程化的含半胱氨酸残基的多肽的蛋白质作为本发明的抗体功能片段。这类功能片段的实例可以包括，但不限于，包含在重链或轻链的羧基末端添加的含半胱氨酸残基的多肽的Fab。添加的半胱氨酸残基的硫醇基团可用于将该抗体功能片段结合到脂质体上。
本发明的抗体还可以是对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。这种分子通常包含结合在一起的两种抗原(即双特异性抗体)。本发明的“多特异性抗体”包括对多种(例如三种)抗原具有特异性的抗体。
用作本发明的抗体的多特异性抗体可以是全长抗体或这种抗体的片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。该双特异性抗体可以通过结合两种抗体的重链和轻链(HL对)来制备，或也可以通过融合彼此不同的产生杂交瘤的单克隆抗体以制备产生双特异性抗体的融合细胞来制备(Mi1lstein等人，Nature(1983)305，第537-539页)。
本发明的抗体可以是单链可变区片段抗体(也称作scFv)。该单链可变区片段抗体通过经由多肽连接物连接抗体的重链和轻链可变区来获得(Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113(Rosenberg和Moore ed.，Springer Verlag，New York，第269-315页(1994)；和Nature Biotechnology(2005)，23，第1126-1136页)。
制备单链可变区片段抗体的方法是本领域公知的(例如美国专利Nos.4,946,778、5,260,203、5,091，513和5,455,030)。在这种单链可变区片段抗体中，重链和轻链可变区经由不形成缀合物的连接物，优选多肽连接物连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)，85，第5879-5883页)。该单链可变区片段抗体中的重链和轻链可变区可源自相同抗体或可源自不同抗体。例如，使用12至19个残基的任意单链肽作为用于连接可变区的肽连接物。
如下获得编码单链可变区片段抗体的DNA：通过使用为其两个末端设计的引物对的PCR法，扩增编码抗体的重链或重链可变区的DNA和编码其轻链或轻链可变区的DNA的全长序列或部分序列(编码所需氨基酸序列)作为模板；随后与设计成将连接物序列的两端分别连接至重链和轻链序列的引物对一起，进一步扩增编码肽连接物部分的DNA。
此外，一旦制备编码该单链可变区片段抗体的DNA，可以根据标准方法获得含有该DNA的表达载体和用该表达载体转化的宿主。此外，利用该宿主，可以根据标准方法获得单链可变区片段抗体。
对这些抗体片段而言，以如上相同的方式获得和表达它们的基因，并可以使宿主产生该抗体片段。
本发明的抗体可以是多克隆抗体，其是氨基酸序列不同的多个抗-DR5抗体的混合物。多克隆抗体的一个实例可以包括CDRs不同的多个抗体的混合物。培养产生彼此不同的抗体的细胞混合物，并且可以使用从该培养物中纯化的抗体作为这类多克隆抗体(WO2004/061104)。
通过使本发明的抗体与各种分子如聚乙二醇(PEG)结合而获得的抗体也可用作该抗体的改性形式。
本发明的抗体还可以是这些抗体与其它药物形成的缀合物(免疫缀合物)。这类抗体的实例可以包括通过使这些抗体结合到放射性材料或具有药理学作用的化合物上而获得的缀合物(Nature Biotechnology(2005)23，第1137-1146页)。
所得抗体可以纯化至均匀。在抗体分离和纯化中，可以使用用于普通蛋白质的任何分离/纯化法。
可以通过适当选择和合并来分离和纯化抗体，例如使用色谱柱、过滤器、超滤、盐析、渗析、用于制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳、和等电聚焦(Strategies for Protein Purification and Characterization：A LaboratoryCourse Manual，Daniel R.Marshak等人eds.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1996)；和Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，尽管分离/纯化法不限于此。
色谱法的实例包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法。
这些色谱技术可以使用液相色谱法，如HPLC或FPLC进行。
亲和色谱法中所用的柱的实例包括蛋白质A和蛋白质G柱。
基于蛋白质A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia Inc.)。
此外，也可以使用固定抗原的载体利用它们对抗原的亲合力来纯化抗体。
(4)抗-DR5抗体的具体实例
例如，作为本发明的免疫脂质体的成分，可以使用WO98/51793、WO2001/83560、WO2002/94880、WO2003/54216、WO2006/83971和WO2007/22157的小册子中所述的抗-DR5抗体，其诱导表达DR5的细胞的凋亡。此外，也可以使用称作Lexatumumab、HGSTR2J、APOMAB、APOMAB7.3、AMG-655和LBY135的抗-DR5抗体及其变体作为本发明的免疫脂质体的成分。但是，本发明的抗-DR5抗体不限于这些抗体，只要其能够结合到DR5蛋白质上。
3.结合到Fas上的抗体
(1)Fas基因
人Fas基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：182409(Accession No：M67454)。在本文中，Fas基因的核苷酸序列还包括由Fas氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与Fas同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，Fas还包括由Fas氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与Fas同等的生物活性的蛋白质。
(2)抗Fas的抗体
可以根据段落“2.(2)抗DR5的抗体”中所述的方法获得结合到Fas上的抗体。
(3)其它抗体
可以根据段落“2.(3)其它抗体”中所述的方法获得结合到Fas上的抗体。
(4)抗-Fas抗体的具体实例
例如，可以使用美国专利No.6,972,323中所述的抗-Fas抗体(其诱导表达Fas的细胞的凋亡)及其变体作为本发明的免疫脂质体的成分。但是，本发明的抗-Fas抗体不限于这些抗体，只要其能够结合到Fas蛋白质上。
4.抗其它抗原的抗体
对于DR5和Fas以外的受体，当该受体含有死亡结构域时，可以根据上述抗体制备方法获得通过结合到该受体上而诱导表达该受体的细胞的凋亡的抗体。这类抗体可用作本发明的免疫脂质体的成分。含死亡结构域的受体的实例可以包括TNFRI、DR3、DR4和DR6。但是，含死亡结构域的受体不限于这些受体，只要它们是转导细胞凋亡诱导信号的受体。
人TNFRI基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：339748(Accession No：M75866)。在本文中，TNFRI基因的核苷酸序列还包括由TNFRI氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与TNFRI同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，TNFRI还包括由TNFRI氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与TNFRI同等的生物活性的蛋白质。
人DR3(死亡受体3)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：23200020(Accession No：NM_148965)。在本文中，DR3基因的核苷酸序列还包括由DR3氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR3同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，DR3还包括由DR3氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR3同等的生物活性的蛋白质。
人DR4(死亡受体4)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：21361085(Accession No：NM_003844)。在本文中，DR4基因的核苷酸序列还包括由DR4氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR4同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，DR4还包括由DR4氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR4同等的生物活性的蛋白质。例如，可以使用WO2002/097033的小册子中所述的抗体、Mapatumumab及其变体抗-DR4-抗体作为本发明的免疫脂质体的成分。但是，本发明的抗-DR4抗体不限于这些抗体，只要其能够结合到DR4蛋白质上。
人DR6(死亡受体6)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为GI：23238206(Accession No：NM_014452)。在本文中，DR6基因的核苷酸序列还包括由DR6氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR6同等的生物活性的蛋白质的编码核苷酸序列。此外，DR6还包括由DR6氨基酸序列通过置换、缺失或添加一个或更多个氨基酸而产生的氨基酸序列构成并具有与DR6同等的生物活性的蛋白质。
5.免疫脂质体的成分
本发明提供包含段落1至4中所述的特异性结合到参与细胞凋亡的细胞表面上的任何受体上的蛋白质并表现出细胞凋亡诱导活性的免疫脂质体。
术语“脂质体”是指由两亲成囊泡脂质形成的脂质结构((D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics to Applications″，Elsevier Science Publishers，第1-171页(1993)))。该脂质体通常是由具有内部水相的单层或更多层脂双层构成的封闭囊泡。在本发明中，脂质体在更广意义上是指脂质复合粒子。例如，本发明的脂质体甚至包括其水相未确定性证实的复合物。该脂质复合物含有至少一种类型的脂质，并可另外含有亲水聚合物、多糖、氨基酸等。脂质复合物是指由这些成分经共价或非共价键形成的粒子。
术语“免疫脂质体”是指通过脂质体和蛋白质形成的复合物。该蛋白质不限于抗体，还包括内源配体、内源配体的功能肽和类似物。
该免疫脂质体含有两亲成囊泡脂质并包含特异性结合到参与细胞凋亡诱导的受体上的蛋白质(例如抗体或内源配体)或肽，其中该脂质体经由共价或非共价键支承该蛋白质或肽。“两亲成囊泡脂质”包括具有疏水和亲水部分且本身可进一步在水中形成双层囊泡的脂质、以及与其它脂质一起并入脂双层中的所有两亲脂质，其中使其疏水区与该双层膜的内部疏水区接触，同时其亲水区排列成面向该膜的极性外表面。
“脂双层”是指如下结构：其中极性脂质分子的疏水区彼此结合且这些疏水部分面向该双层的中心，而亲水区排列成面向水相。
本发明的免疫脂质体包含(1)两亲成囊泡脂质，(2)亲水聚合物，(3)蛋白质或肽和类似物，并可以在脂质体内含有治疗药物。此外，本发明的免疫脂质体的成分不限于此，除非它们抑制脂质复合物形成。下文详细描述该免疫脂质体的各成分。
(1)两亲成囊泡脂质
该脂质体的脂质组分包括磷脂、糖脂、鞘脂、甾醇、二醇、饱和或不饱和脂肪酸、表面活性剂和具有亲水聚合物的衍生物脂质(见文献“Liposomes：From Physics to Applications″，第1章.Chemistry of lipidsand liposomes)。这些脂质可以例举在下示(1)-1.至(1)-8.中。
(1)-1.磷脂
磷脂大致分类成甘油磷脂和鞘磷脂。甘油磷脂的典型实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)。另一方面，鞘磷脂的典型实例包括神经鞘磷脂。这些磷脂的实例可以包括下列(a)至(i)中所述的磷脂。
(a)磷脂酰胆碱
其实例包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、二辛酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二己酰磷脂酰胆碱(DHPC)、二丁酰磷脂酰胆碱(DBPC)、dielaidoyl磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二花生四烯酰磷脂酰胆碱、双二十碳烯酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二庚酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、双十七烷酰磷脂酰胆碱、二山嵛酰磷脂酰胆碱、eleostearoyl磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1，2-二肉豆蔻酰氨基-1，2-脱氧磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、二-O-十六烷基磷脂酰胆碱、transdielaidoyl磷脂酰胆碱、dipalmitelaidoyl-磷脂酰胆碱、n-十八烷基-2-甲基磷脂酰胆碱、n-十八烷基磷脂酰胆碱、1-月桂基丙二醇-3-磷酸胆碱、赤-N-二十四酰鞘磷脂酰胆碱和棕榈酰-(9-顺式-十八烯酰)-3-sn-磷脂酰胆碱。
(b)磷脂酰丝氨酸
其实例包括二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二月桂酰磷脂酰丝氨酸(DLPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、溶血磷脂酰丝氨酸、桐酰(eleostearoyl)磷脂酰丝氨酸和1，2-二-(9-顺式-十八烯酰)-3-sn-磷脂酰丝氨酸。
(c)磷脂酰肌醇
其实例包括二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)和二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)。
(d)磷脂酰甘油
其实例包括二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、溶血磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)和心磷脂(双磷脂酰甘油)。
(e)磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)
其实例包括二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二癸酰磷脂酰乙醇胺(DDPE)、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺(NGPE)、溶血磷脂酰乙醇胺、N-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-基)-1，2-二油酰-sn-磷脂酰乙醇胺、桐酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺和1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷脂酰乙醇胺。
(f)磷脂酸
其实例包括二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)和二油酰磷脂酸(DOPA)。
(g)鞘磷脂
其实例包括神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、神经酰胺氨乙基膦酸、神经酰胺磷酸乙醇胺和神经酰胺磷酰甘油。
(h)具有可聚合残基的可聚合磷脂
作为不饱和磷脂的具有可聚合残基的可聚合磷脂的实例包括1，2-双(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(十八酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(十六酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(十八酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(十六酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(2，4-十八碳二烯酰基)-2-(十八酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(2，4-十六碳二烯酰基)-2-(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双-(8，10，12-十八碳三烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双(12-甲基丙烯酰氧基十二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-双(9-(对乙烯基苯甲酰)壬酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
此外，其它可聚合磷脂的实例包括1，2-双(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(十八酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(十六酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(十八酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(十六酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(2，4-十八碳二烯酰基)-2-(十八酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(2，4-十六碳二烯酰基)-2-(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双-(8，10，12-十八碳三烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双(12-甲基丙烯酰氧基十二酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1，2-双(9-(对乙烯基苯甲酰)壬酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
其它可聚合磷脂的另一些实例包括磷酸衍生物，如1，2-双(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1，2-双(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(十八酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(十六酰基)-2-(2，4-十八碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(十八酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(十六酰基)-2-(2，4-十六碳二烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(2，4-十八碳二烯酰基)-2-(十八酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1-(2，4-十六碳二烯酰基)-2-(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1，2-双-(8，10，12-十八碳三烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸、1，2-双(12-甲基丙烯酰氧基十二酰基)-sn-甘油-3-磷酸和1，2-双(9-(对乙烯基苯甲酰)壬酰基)-sn-甘油-3-磷酸和它们的盐。
在本文中，该可聚合磷脂可以含有不可聚合的脂肪酸残基。不可聚合的脂肪酸残基的实例包括具有2至24个碳原子的直链或支链烷基、酰基、不可聚合的链烯基和不可聚合的链烯酰基。
(i)其它磷脂
其实例包括磷脂酰苏氨酸、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂和卵磷脂或大豆卵磷脂、主要由磷脂酰胆碱构成并包含磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂、胆甾醇等的多种脂质的混合物。
(1)-2.糖脂
糖脂大致分类成甘油糖脂和鞘糖脂。其实例可以包括下列(a)至(c)中所述的脂质。
(a)甘油糖脂
其实例包括二糖基甘油二酯、糖基甘油二酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、硫氧核糖基甘油二酯、(1，3)-D-甘露糖基-(1，3)甘油二酯、二半乳糖基甘油酯、二半乳糖基二月桂酰甘油酯、二半乳糖基二肉豆蔻酰甘油酯、二半乳糖基二棕榈酰甘油酯、二半乳糖基二硬脂酰甘油酯、半乳糖基甘油酯、半乳糖基二月桂酰甘油酯、半乳糖基二肉豆蔻酰甘油酯、半乳糖基二棕榈酰甘油酯、半乳糖基二硬脂酰甘油酯和二半乳糖基二酰甘油。
(b)鞘糖脂
其实例包括神经酰胺(脑苷脂)、半乳糖苷神经酰胺、乳糖酰基鞘氨醇、二半乳糖苷神经酰胺、神经节苷脂GM1、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3、硫苷脂、神经酰胺寡己糖苷和红细胞糖苷酯。
(c)其它糖脂
其实例包括神经酰胺寡己糖苷、棕榈糖苷、硬脂糖苷、肉豆蔻糖苷、烷基糖苷、氨基苯基糖苷、胆甾醇基麦芽糖苷、胆甾醇基糖苷、3-胆甾醇基-6′-(糖基硫代)己基醚糖脂和葡糖酰胺。
(1)-3.甾醇
甾醇的最典型实例包括胆甾醇。胆甾醇已知有助于脂双层结构的膜刚度和稳定性。胆甾醇以外的甾醇的实例包括胆甾醇琥珀酸、二氢胆甾醇、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇、酵母甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、岩藻甾醇、22-ketosterol、20-羟基甾醇、7-羟基胆甾醇、19-羟基胆甾醇、22-羟基胆甾醇、25-羟基胆甾醇、7-脱氢胆甾醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、表胆甾醇、脱氢麦角甾醇、胆甾醇硫酸酯、胆甾醇半琥珀酸酯、胆甾醇邻苯二甲酸酯、胆甾醇磷酸酯、胆甾醇戊酸酯、3βN-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰胆甾醇、胆甾醇乙酸酯、油酸胆甾醇酯、亚油酸胆甾醇酯、肉豆蔻酸胆甾醇酯、棕榈酸胆甾醇酯、棕榈酸胆甾醇酯、粪甾醇、胆甾醇酯、胆甾醇基磷酸胆碱和3，6，9-三氧杂辛-1-醇-胆甾醇基-3e-醇。
(1)-4.中性脂质
中性脂质的实例包括甘油二酯(例如，甘油二油酸酯和甘油二棕榈油酸酯)和混合辛酸甘油二酯-癸酸甘油二酯、三酰甘油(例如三油酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯和三己酸甘油酯)、角鲨烯、生育酚和胆甾醇。
(1)-5.饱和或不饱和脂肪酸
可用的饱和和不饱和脂肪酸的实例包括具有5至30个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸，如辛酸、壬酸、癸酸、十一碳烯酸、月桂酸、十三碳烯酸、肉豆蔻酸、十五碳烯酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九烯酸、花生酸、十二碳烯酸、十四碳烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸和二十二碳五烯酸。
(1)-6.带电脂质
其实例可以包括下列(a)至(b)中所述的脂质。
(a)阴离子型脂质
阴离子型脂质是指在生理pH值下带负电荷的脂质。其实例包括：酸性磷脂，如磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和心磷脂；脂肪酸，如油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、亚油酸和亚麻酸；神经节苷脂，如神经节苷脂GM1、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；酸性磷脂，如磷酸二鲸蜡酯；和酸性氨基酸表面活性剂，如N-酰基-L-谷氨酸。
(b)阳离子型脂质
阳离子型脂质是指在生理pH值下带正电荷的脂质。其实例包括N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、N-(α-三甲基氨乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物(TMAG)、DL-1，2-二油酰-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙铵(DORI)、N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、N-(1，2-双十四烷氧基丙)-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、(1，2-二油氧基丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、双十七酰氨基甘氨酰亚精胺、N，N-双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺、N，N-双十八烷基酰氨基甘氨酸、1，2-二油基-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、1，2-二油基-sn-甘油-3-琥珀酰-2-羟乙基二硫化物鸟氨酸(DOGSDSO)、鲸蜡基氯化吡啶鎓(CPyC)、1，2-二油基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、1，2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰-3-(4′-三甲基铵基)丁酰基-sn-甘油(DOBT)、1，3-二油酰氧基-2-(6-carboxyspermyl)-丙酰胺(DOSPER)、脂多胺(例如，二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺(DPPES))、O-烷基磷脂酰胆碱、O-烷基磷脂酰乙醇胺、赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸的酰胺和磷脂酰乙醇胺、3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆甾醇(DC-Chol)、3-β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨甲酰基]胆甾醇(TC-Chol)、双-胍-亚精胺-胆甾醇(BGSC)、双-胍-三氨乙基胺-胆甾醇(BGTC)、(4′-三甲基铵基)丁酸胆甾醇酯(ChOTB)、3β-N-(聚乙烯亚胺)-氨甲酰基胆甾醇、胆甾醇基-3β-羧基-酰氨基-乙烯三甲基碘化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基羧酸酯碘化物、胆甾醇基-3β-羧酰氨基亚乙基胺、胆甾醇基-3β-氧琥珀酰氨基-乙烯三甲基碘化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基-3β-氧琥珀酸酯碘化物、2-(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基乙基-胆甾醇基-3β-氧琥珀酸酯碘化物、半琥珀酸胆甾醇酯、长链胺、长链吡啶鎓化合物和季铵化合物。
(1)-7.表面活性剂
表面活性剂大致分类成(a)阳离子型表面活性剂、(b)阴离子型表面活性剂和(c)具有离子亲水部分的两性表面活性剂和(d)具有非离子亲水部分的非离子型表面活性剂。
(a)阳离子型表面活性剂
阳离子型表面活性剂的实例包括烷基胺盐、酰基胺盐、季铵盐和胺衍生物。其具体实例包括苯扎氯铵、酰氨基乙基二乙基胺盐、N-烷基聚烷基聚胺盐、脂肪酸聚乙烯聚酰胺、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙基胺和脂肪酸三乙醇胺酯。
(b)阴离子型表面活性剂
阴离子型表面活性剂的实例包括酰基肌氨酸、烷基硫酸钠、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸钠、α-烯烃磺酸钠、α-磺基脂肪酸酯钠，以及具有7至22个碳原子的脂肪酸钠或钾。其具体实例包括十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠。
(c)两性表面活性剂
两性表面活性剂的实例包括烷基氨基脂肪酸钠、烷基甜菜碱和烷基胺氧化物。其具体实例包括3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸和N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸。
(d)非离子型表面活性剂
非离子型表面活性剂的实例包括聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸链烷醇酰胺、嵌段聚合物基非离子型表面活性剂、烷基胺基非离子型表面活性剂和烷基酰胺基非离子型表面活性剂。其具体实例包括聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯聚氧丙二醇、Pluronic F68、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60和聚氧乙烯月桂醇。
(1)-8.
也可以使用包含与亲水聚合物结合的任何脂质的“亲水聚合物的脂质衍生物”(详细描述在段落“6.(1)脂质与亲水聚合物的结合模式”中)作为本发明的免疫脂质体的成分。
通常适当混合上示两亲成囊泡脂质以制备脂质体。典型脂质组合物的实例可以包括主要由磷脂或糖脂构成并进一步以总脂质摩尔数的20至50摩尔％的含量含有甾醇的脂质组合物。其优选实例可以包括主要由磷脂酰胆碱构成并进一步以总脂质摩尔数的20至50摩尔％的含量含有胆甾醇的脂质组合物。
(2)亲水聚合物
脂质体在给药至血液循环时具有容易被肝、脾、肺等中的网状内皮系统(RES)捕获的性质。如果目标器官是肝、肺等，这种性质是有利的。但是，在靶向RES以外的位点以实现全身作用时，该性质非常不利。亲水聚合物的存在提供了改进血液保留和防止脂质体的RES吸收的性质。此外，亲水聚合物的存在也在脂质体储存过程中提供分散稳定性。
本发明的免疫脂质体中所用的亲水聚合物的类型的实例包括聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚环氧烷、聚烷撑二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚丁二醇和聚己二醇)、聚甘油、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚缩水甘油、神经节苷脂、葡聚糖、Ficoll、聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸羟丙酯)、聚(丙烯酸羟乙酯)、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚天冬酰胺、聚磷腈、聚(羟基烷基羧酸)、乙二醇-丙二醇共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、环糊精、透明质酸、脑苷脂硫酸盐、软骨素硫酸盐、多糖(例如直链淀粉、支链淀粉、果胶、壳聚糖、甘露聚糖、普鲁兰多糖(pullulan)、角叉菜胶和甲基纤维素)、多肽和合成聚氨基酸(例如聚-L-赖氨酸)。
该亲水聚合物包含一个或更多个重复单元结构。该单元结构数不受限制，且该亲水聚合物可以是直链或支链的。其优选实例可以包括分子量为500至20000的亲水聚合物。其更优选实例可以包括分子量为2000至5000的亲水聚合物。此外，这些聚合物可以以均聚物或嵌段或无规共聚物形式使用。本发明的亲水聚合物还包括，例如，由聚乳酸和聚乙醇酸构成的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物。
该亲水聚合物可以是通过向该聚合物中引入取代基，如烷基、烷氧基、羟基、羰基、烷氧基羰基、氰基、氨基、硫醇、马来酰亚胺、乙烯基砜或酰肼基团而获得的衍生物。
为了改进血液保留和防止脂质体的RES吸收，该脂质体中亲水聚合物或亲水聚合物的脂质衍生物的含量的优选实例可以包括总脂质摩尔数的0.1至10摩尔％的含量。其更优选为总脂质摩尔数的1至6摩尔％的含量。
(3)蛋白质
段落“2.结合到DR5上的抗体”，“3.结合到Fas上的抗体”和“4.结合到其它抗原上的抗体”中描述的抗体可用作本发明的免疫脂质体的成分。此外，与本发明中所述的具有细胞凋亡诱导能力的受体的天然配体结合的脂质体也包括在本发明的范围内。此外，特异性结合到含死亡结构域的受体上的人工肽也可用作本发明的免疫脂质体的成分。这种人工肽的实例可以包括结合到Fas上的功能肽(Yoshimori等人，Apoptosis 10(2)，323-329(2005))。此外，结合到相同抗原上的两个或更多个分子可以选自上述分子组并允许共存于相同免疫脂质体上，由此改进结合到特定抗原上的能力。此外，结合到不同抗原上的两个或更多个分子也可以选自上述分子组并允许共存于相同免疫脂质体上，由此实现对多种抗原的作用。
(4)内部水相
当脂质体具有内部水相时，该水相中所用的水溶液不受特别限制，除非其限制脂质体形成。通常可以使用氯化钠水溶液、缓冲溶液(例如磷酸盐、乙酸盐或HEPES缓冲溶液)或单糖或二糖溶液(例如葡萄糖或海藻糖水溶液)
(5)添加剂
可以向该免疫脂质体的成分中进一步加入功能给予剂。这类功能给予剂的实例包括膜稳定剂、膜表面的疏水改性剂、曲率调节剂、抗氧化剂、给电荷剂和防冻剂。其具体实例包括稳定剂，如糖、糖脂、甘油和聚乙二醇，和抗氧化剂，如生育酚和抗坏血酸。可以使用胆甾醇作为膜稳定剂、膜表面的疏水改性剂、或脂质体的曲率调节剂。可以使用生育酚作为抗氧化剂。
此外，当将这些添加剂添加到免疫脂质体中时，其类型和含量不受特别限制，并根据该免疫脂质体的物理性质适当选择。
(6)包封的药物
此外，本发明的免疫脂质体可以将亲水药物包封在内部水相中和将疏水药物包封在膜中。包封的药物不受特别限制，除非其限制脂质体形成。其实例包括具有细胞毒活性的药物，如抗肿瘤药、抗风湿药、抗病毒剂和抗微生物剂。抗肿瘤药包括博来霉素、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、柔红霉素、放线菌素、二乙基己烯雌酚、阿霉素、依托泊苷、5-氟脲嘧啶、氟尿苷、苯丙氨酸氮芥、吉西他滨、伊马替尼、伊立替康、氨甲喋呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、紫杉醇、sorafenib、舒尼替尼、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和长春碱。抗癌化合物和治疗剂的其它实例可见于The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等人ed.，1987和Rahway，N.J.和Sladek等人，Metabolismand Action of Anti-Cancer Drugs，1987，Powis等人ed.，Taylor和Francis，New York，N.Y。
自体免疫性疾病治疗剂和抗炎药的实例可以包括非类固醇抗炎药，如双氯芬酸、环氧洛芬钠、塞来昔布、依托度酸、美洛昔康、罗非昔布、吡罗昔康、消炎痛、布洛芬和萘普生，以及缓解疾病的抗风湿药，如氨甲喋呤、氯奎、hydrochloroquine、环孢霉素、青霉胺、柳氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤和来氟米特。
如上所述，可以将各种药物包封在该免疫脂质体的内部水相中以使它们发挥作用。另一方面，这些药物可以通过与免疫脂质体联用而非包封在免疫脂质体中来作用于靶细胞。
6.免疫脂质体组分的结合模式
本发明的免疫脂质体包含两亲成囊泡脂质、亲水聚合物、蛋白质、肽、糖等，其中脂质、蛋白质、肽和亲水聚合物形成共价或非共价键。本发明的免疫脂质体可以具有其中功能分子如蛋白质或肽直接结合到脂质体表面上或经由亲水聚合物结合到脂质体上的形式。在前一种情况下，该亲水聚合物也可以直接结合到脂质体上以使其包含在脂质体中。
(1)脂质与亲水聚合物的结合模式
该亲水聚合物的脂质衍生物包含段落5.(1)中所述的两亲成囊泡脂质和段落5.(2)中所述的亲水聚合物。它们之间的组合不受特别限制，并可以根据用途适当选择。该脂质和亲水聚合物经由在脂质的官能团(包括该脂质中人工引入的官能团)和亲水聚合物的官能团(包括该亲水聚合物中人工引入的官能团)之间直接形成或经连接物形成的共价键连接。
该亲水聚合物的脂质衍生物的实例包括，但不限于，下列：聚乙二醇改性的脂质、聚乙烯亚胺衍生物、聚乙烯醇衍生物、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺衍生物、葡聚糖衍生物、聚甘油衍生物、壳聚糖衍生物、聚乙烯基吡咯烷酮衍生物、聚天冬氨酸酰胺衍生物、聚-L-赖氨酸衍生物、甘露聚糖衍生物和普鲁兰多糖衍生物。
“聚乙二醇(PEG)-改性的脂质”的实例可以包括文献((D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics to Applications″，Elsevier Science Publishers，第1-171页(1993))，″第11章.Liposomes as a drug delivery system′)中描述的聚乙二醇(PEG)-改性的磷脂酰乙醇胺，更具体包括N-单甲氧基聚(乙二醇)琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-单甲氧基聚(乙二醇)羰基磷脂酰乙醇胺、N-单甲氧基聚(乙二醇)乙烯磷脂酰乙醇胺、N-单甲氧基聚(乙二醇)羰基乙基羰基磷脂酰乙醇胺、N-单甲氧基聚(乙二醇)羰基丙基羰基磷脂酰乙醇胺、N-单甲氧基聚乙二醇(2-氯-1，3，5-三嗪-4，6-二基)琥珀酰磷脂酰乙醇胺、二-C12-24酰基-甘油-磷脂酰乙醇胺-N-PEG、二-C12-24酰基-甘油-单-PEG醚、单-C12-24酰基甘油-二-PEG醚、聚乙二醇烷基醚、N-(2，3-双十四烷氧基丙基)酰胺聚乙二醇甲基醚、N-(2，3-双十四烷氧基丙基)氨基甲酸酯聚乙二醇甲基醚、N-(2，3-双十四烷氧基丙基)琥珀酰胺聚乙二醇甲基醚、鞘氨醇-1-(琥珀酰甲氧基聚乙二醇)、鞘氨醇-1-(琥珀酰(甲氧基聚乙二醇))、聚乙二醇失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇二月桂酸酯、聚乙二醇二硬脂酸酯、聚乙二醇二油酸酯和二乙二醇硬脂酸酯)、聚乙二醇蓖麻油、吡咯烷酮羧酸PEG-40氢化蓖麻油异硬脂酸酯、氨基甲酸单甲氧基聚(乙二醇)-3，5-双十五烷氧基苄基酯、4-(N′-(甲氧基聚(乙二醇)羰基)2-氨基乙基)N，N-二硬脂酰苯甲酰胺、DSPE-PEG(NOFCORPORATION的产品；SUNBRIGHT DSPE-020C、DSPE-050C、DSPE-020G、DSPE-050G、DSPE-020CN  和DSPE-050CN)、DSPE-Multi-arm PEG(NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHTDSPE-PTE020)、DSPE-Comb-shaped PEG(NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHTDSPE-AM0530K)、二酰甘油-PEG(NOFCORPORATION的产品；SUNBRIGHT GS-020和GS-050)、胆甾醇-PEG(NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHT CS-010、CS-020和CS-050)、PEG-神经酰胺(Avanti POLAR LIPID，INC.的产品)、mPEG-DTB-DSPE(DTB：二硫代苄基；WO2005/051351的小册子)和PEG-DAA(DAA：二烷氧基丙基；WO2005/026372的小册子)。
该亲水聚合物的脂质衍生物的其它实例可具体包括聚氧乙烯蓖麻油/氢化蓖麻油(例如，聚氧乙烯POE(3)蓖麻油和POE(5)氢化蓖麻油)、N-[ω-甲氧基聚(氧乙烯)-α-氧基羰基]-磷脂酰乙醇胺、O-(C10-18烷酰基或烯酰基)普鲁兰多糖、N-(C10-18烷酰基或烯酰基)聚丙烯酰胺和DSPE-聚甘油(NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHT DSPE-PG8G)。
使亲水聚合物结合到脂质上的方法的实例包括(a)包括使亲水聚合物结合到预先形成的脂质体分散体上的方法，和(b)包括制备亲水聚合物的脂质衍生物并将其并入脂质体的方法。
在包括使亲水聚合物结合到预先形成的脂质体分散体上的方法(a)中，例如，使用三氟乙基磺酰氯-活化的PEG并在高pH条件下添加到含具有氨基的脂质(例如磷脂酰乙醇胺)的脂质体中，由此获得亲水聚合物改性的脂质体(Senior等人，Biochim.Biophys.Acta.1062：77-82(1991))。此外，本领域技术人员公知的是，可以使用许多其它键。
在包括制备亲水聚合物的脂质衍生物并将其并入脂质体的方法(b)中，该亲水聚合物可以以脂质结合衍生物形式使用，由此将其疏水位点插入该脂质体的脂质层。将这种亲水聚合物衍生物添加到预先形成的脂质体分散体中，并加热该混合物；或者，在该脂质体的脂质成分的混合过程中加入该亲水聚合物衍生物。结果获得亲水聚合物改性的脂质体。例如在美国专利No.5,395,619中描述了用该亲水聚合物衍化的脂质的制造，其可以根据本领域已知的方法制造。例如，为了在磷脂的反应性官能团和PEG之间形成共价键，使用本领域已知的方法，如使用氰尿酰氯的方法(Blume等人，Biochim.Biophys.Acta.1029：91-97(1990)和美国专利No.5,213,804)、使用碳二亚胺的方法(Proc.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，17：77-78(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：11460-11464(1991)；Biochim.Biophys.Acta.，1066：29-36(1991)；Biochim.Biophys.Acta.，1105：193-200(1992)；和Period.Biol.，93：349-352(1991))、使用酸酐的方法和使用戊二醛的方法。
(2)脂质与蛋白质的结合模式
将蛋白质或肽或类似物固定到脂质体上的方法的实例包括下列(i)至(x)中所示的方法。该脂质体的脂质成分与蛋白质的结合通常该脂质的官能团(包括人工引入该脂质的官能团)与该蛋白质的官能团(包括人工引入该蛋白质的官能团)之间的共价键形成，或通过基于物理/生物亲合力的非共价键形成。形成共价键的官能团的组合的实例包括氨基/羧基、氨基/N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基/醛基团、氨基/三氟乙基磺酰基、氨基/硝基苯基羰基、氨基乙缩醛基团、氨基/异硫氰酸酯基团、氨基/酰基卤基团、氨基/苯并三唑碳酸酯基团、酰肼/醛基团、硫醇/马来酰亚胺基团、硫醇/乙烯基砜基团和硫醇/硫醇基团。对于非共价键，可以使用疏水键或特定键，如抗生物素蛋白/生物素或聚组氨酸标签/镍键。
(i)一种方法，包括：将疏水基团引入蛋白质以使该蛋白质对置于疏水环境中的脂质体的脂质层具有亲合力；和将所得蛋白质并入单独制备的脂质体中(Biochimica et Biophysica Acta，812，116(1985))。
(ii)一种方法，包括使抗体或内源配体作为与细胞膜蛋白质的融合蛋白表达并将这种膜蛋白质部分并入单独制备的脂质体中(Mol Med.7(10)723，(2001))。
(iii)一种方法，包括在脂质体含有糖脂作为脂质组分时，用氧化剂氧化这种糖以形成醛基团，其又与蛋白质的氨基反应以形成席夫碱，由此使该脂质与该蛋白质结合(Biochimica et Biophysica Acta.640，66(1981))。
(iv)一种方法，包括在脂质体制备过程中混合具有氨基反应性官能团的脂质并使这种官能团与蛋白质的Lys残基ε-氨基或N-末端α-氨基反应以将该蛋白质并入脂质体中(J.Immunol Methods.1983，65(3)：295-306)。
在蛋白质的氨基与脂质之间形成共价键所必需的脂质的反应性官能团的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、醛、三氟乙基磺酰基、硝基苯基羰基、乙缩醛、羧基、异硫氰酸酯、酰基卤和苯并三唑碳酸酯基团。
(v)一种方法，包括在脂质体制备过程中混合具有硫醇基团反应性官能团的脂质并使这种官能团与具有硫醇基团的蛋白质反应(Journalof Immunological Method，75，351(1984)；和Biochemical and BiophysicalResearch Communications，117，399(1983))。
通过本领域已知的方法将硫醇基团添加到该蛋白质中，例如，使用如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson，J.等人，Biochem.J.173，723，(1978))、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、亚氨基硫代仿(thiolane)(Traut，R.R.等人，Biochemistry 12，3266(1973))和巯基烷基imidate之类化合物的方法。除这些方法外，将蛋白质的内源二硫醇基团还原成硫醇基团，其又可用在该结合中。特别地，当该蛋白质是抗体时，可以使用该抗体(全长分子或片段)的铰链区中及其重链和轻链之间的连接中的二硫醇基团。为了将抗体与脂质结合，使用内源硫醇基团的后一方法在保持蛋白质活性方面更优选。例如，用酶，如胃蛋白酶将IgG抗体消化成F(ab′)2，并用二硫苏糖醇或类似物进一步还原这种片段以获得在Fab’中形成的硫醇基团，其又用在该结合中(Martin，F.J.等人，Biochemistry 20，4229(1981))。当使用IgM时，根据Miller等人的方法(J.Biol.Chem 257，286(1965))在温和条件下还原IgM的J链以在Fc部分中获得硫醇基团，其又用在该结合中。
在蛋白质的硫醇基团与脂质之间形成共价键所必需的脂质的官能团的实例包括马来酰亚胺、乙烯基砜和硫醇基团。含有马来酰亚胺基团的脂质的实例包括N-(3-(2-吡啶二硫代)丙酰基)磷脂酰乙醇胺、N-(间马来酰亚氨基苯甲酰)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和N-(4-对马来酰亚氨基苯基)丁酰磷脂酰乙醇胺(MPB-PE)。马来酰亚胺化试剂的实例包括常用于制备氨基的马来酰亚胺衍生物的N-(ε-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺以及N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚氨基苯基)丙酸酯和N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺。
此外，可以借助该马来酰亚胺化试剂用马来酰亚胺基团取代该蛋白质的氨基。这种蛋白质与具有硫醇基团的脂质，例如(吡啶二硫代)丙酸酯(PDP)-改性的脂质通过反应形成共价键。
(vi)一种方法，包括在脂质体制备过程中混合具有醛基团反应性官能团并使糖链衍生的醛基团结合到其上。
真核蛋白质常用糖链通过转译后修饰法修饰。特别地，在抗体中，它们的Fc区具有糖链。通过氧化这些糖链形成的醛基团与酰肼通过反应形成共价键。因此，通过用酰肼修饰脂质，可以经由该脂质上的糖链固定蛋白质或肽(Biochimica et Biophysica Acta 1420153-167(1999))。
(vii)一种方法，包括使用交联剂、缩合剂等结合脂质体和蛋白质的各自官能团。
该脂质的氨基可以与该蛋白质的氨基结合，由此将该蛋白质固定到脂质体表面上(Biochemical和Biophysical Research Communications，89，1114(1979)；和Liposome Technology，155(1983))。具有氨基的脂质的实例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰苏氨酸。该蛋白质的氨基由赖氨酸残基ε-氨基和N-末端α-氨基提供。为了将蛋白质固定到包含具有氨基的脂质的脂质体上，可以采用本领域已知的方法，如包括使用戊二醛将脂质的氨基直接交联到蛋白质的氨基上的方法和包括使用反应性试剂将脂质的氨基化学结合到蛋白质的氨基上的方法。二价交联剂的实例包括戊二醛以及辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)、二醛(例如，苯二醛和对苯二甲醛)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)和二异硫氰基二苯乙烯二磺酸钠(DIDS)。反应性试剂的实例包括3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯、间马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯和辛二酸二琥珀酰亚胺基酯。
该脂质的氨基和该蛋白质的硫醇基团，或该脂质的硫醇基团和该蛋白质的氨基可以彼此结合，由此将该蛋白质固定到该脂质体表面上。对氨基和硫醇基团呈反应性的二价交联剂的实例包括3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、4-(对马来酰亚氨基苯基)乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPA)、溴乙酸N-琥珀酰亚胺基酯、4-(对马来酰亚氨基苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPP)、N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺(GMBS)和N-(ε-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)。
该脂质的羧基和该蛋白质的氨基，或该脂质的氨基和该蛋白质的羧基可以使用缩合剂彼此结合，由此将该蛋白质固定到该脂质体表面上(Biochemistry，第31卷，2850-2855(1992))。
该脂质的硫醇基团可以与该蛋白质的硫醇基团结合，由此将该蛋白质固定到该脂质体表面上。例如，使用交联剂，如双马来酰亚氨基己烷。
(viii)一种方法，包括利用生物素对抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的特异性亲合力使蛋白质与脂质结合。
生物素改性的蛋白质可以通过非共价键结合到抗生蛋白链菌素-或抗生物素蛋白-改性的脂质上(Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment 12：311-325(2002))。此外，抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白形成四聚物，并因此最多允许结合四个生物素分子。使用这种原理，生物素改性的蛋白质可以通过非共价键经由抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素连接物结合到生物素改性的脂质上(Biochimica et BiophysicaActa 1239133-144(1995))。
(ix)一种方法，包括利用组氨酸标签对镍离子的亲合力使蛋白质与脂质结合。
可以利用聚组氨酸标签(His-Tag)对镍离子(Ni2+)的亲合力将蛋白质或肽固定到脂质体上(Molecular Pharmaceutics 3，5，525-530)。可以通过本领域已知的方法表达和纯化通过基因工程法与His-Tag融合的嵌合蛋白质或肽。此外，该脂质可以用具有金属(Ni2+)螯合位点的NTA(次氮基乙酸)、IDA(亚氨基二乙酸)或类似物末端改性以制备Ni2+-固定的脂质体。His-Tag特异性结合到该脂质体的Ni2+上，以使该His-Tag-融合蛋白或肽固定在脂质体上。
(x)一种方法，包括经由对抗体Fc结构域或其蛋白质结构域具有亲合力的蛋白质使全长抗体分子结合到脂质体上。
该脂质体可以经由对抗体Fc结构域或参与Fc结构域结合的其结构域蛋白质具有亲合力的蛋白质A或G支承该全长抗体分子。在这种情况下，蛋白质A或G可以通过任何方法(i)至(ix)结合到脂质体脂质上(BMC Immunology 2006，7：24)。
在方法(i)至(x)中，通过调节参与固定的蛋白质和脂质的比率，可以任意改变固定在脂质体上的蛋白质的量。
(3)亲水聚合物与蛋白质的结合模式
将蛋白质或肽或类似物固定在亲水聚合物上的方法的实例包括下列(i)至(vii)中所示的方法。使通过该方法获得的亲水聚合物或该亲水聚合物的脂质衍生物与蛋白质结合的方法的实例包括包含通过该亲水聚合物的官能团(包括在该亲水聚合物中人工引入的官能团)与该蛋白质的官能团(包括在该蛋白质中人工引入的官能团)之间的反应形成共价或非共价键的方法。形成共价键的官能团的组合的实例包括氨基/羧基、氨基/N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基/醛基团、氨基/三氟乙基磺酰基、氨基/硝基苯基羰基、氨基乙缩醛基团、氨基/异硫氰酸酯基团、氨基/酰基卤基团、氨基/苯并三唑碳酸酯基团、酰肼/醛基团、硫醇/马来酰亚胺基团、硫醇/乙烯基砜基团和硫醇/硫醇基团。对于非共价键，可以使用特定键，如抗生物素蛋白/生物素或聚组氨酸标签/镍键。该蛋白质可以结合到该亲水聚合物的主链或侧链的任何末端或非末端位置上。此外，每分子亲水聚合物可以结合多个蛋白质分子。
(i)一种方法，包括使具有氨基反应性官能团的亲水聚合物与蛋白质或肽的Lys残基ε-氨基或N-末端α-氨基反应(Int J Oncol.200323(4)：1159-65)。
该蛋白质的氨基由Lys残基ε-氨基和N-末端α-氨基提供。
使该蛋白质的氨基与脂质结合所必需的亲水聚合物衍生物的反应性官能团的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、醛、三氟乙基磺酰基、硝基苯基羰基、乙缩醛、羧基、异硫氰酸酯、酰基卤和苯并三唑碳酸酯基团。
(ii)一种方法，包括使具有硫醇基团反应性官能团的亲水聚合物结合到具有硫醇基团的蛋白质或肽的硫醇基团上(Dmitri Kirpotin等人，Biochemistry，1997，36，66-75)。
通过本领域已知的方法将硫醇基团添加到该蛋白质中，例如，使用如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson，J.等人，Biochem.J.173，723，(1978))、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、亚氨基硫代仿(Traut，R.R.等人，Biochemistry 12，3266(1973))和巯基烷基imidate之类化合物的方法。除这些方法外，用TCEP、DTT、巯基乙醇、半胱氨酸、半胱胺或类似物将蛋白质的内源二硫醇基团还原成硫醇基团，其又可用在该结合中。特别地，当该蛋白质是抗体时，可以使用该抗体(全长分子或片段)的铰链区中及其重链和轻链之间的连接中的二硫醇基团。为了将抗体与亲水聚合物结合，使用内源硫醇基团的后一方法在保持活性方面更优选。例如，用酶，如胃蛋白酶将IgG抗体消化成F(ab′)2，并用二硫苏糖醇或类似物进一步还原这种片段以获得在Fab’中形成的硫醇基团，其又用在该结合中(Martin，F.J.等人，Biochemistry 20，4229(1981))。当使用IgM时，根据Miller等人的方法(J.Biol.Chem 257，286(1965))在温和条件下还原IgM的J链以在Fc部分中获得硫醇基团，其又可用在该结合中。
结合到蛋白质的硫醇基团上所必需的官能团的实例包括马来酰亚胺、乙烯基砜和硫醇基团。这种亲水聚合物衍生物的实例包括PEG-马来酰亚胺[NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHT MA SERIES(马来酰亚胺-PEGs)]、PEG-乙烯基砜(Bo B.Lundberg等人，Int.J.Pharm，205，101-108(2000))、甲氧基(酰肼)聚乙二醇和双(酰肼)聚乙二醇。马来酰亚胺化试剂的实例包括常用于制备氨基的马来酰亚胺衍生物的N-(ε-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺以及4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯和N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺。
此外，可以借助该马来酰亚胺化试剂用马来酰亚胺基团取代该蛋白质的氨基。这种蛋白质与具有硫醇基团的亲水聚合物，例如(吡啶二硫代)丙酸酯(PDP)-改性的亲水聚合物通过反应形成共价键。
(iii)一种方法，包括使具有醛基团反应性官能团的亲水聚合物结合到蛋白质的糖链衍生的醛基团上。
真核蛋白质常用糖链通过转译后修饰法修饰。特别地，在抗体中，它们的Fc区具有糖链。通过氧化这些糖链形成的醛基团与酰肼通过反应形成共价键。因此，通过用酰肼修饰亲水聚合物，可以经由该亲水聚合物上的糖链固定蛋白质或肽(Biochimica et Biophysica Acta 1420153-167(1999))。
(iv)一种方法，包括使用交联剂、缩合剂等结合亲水聚合物和蛋白质的各自官能团。
该亲水聚合物的氨基可以与该蛋白质的氨基结合，由此将该蛋白质固定到亲水聚合物上。具有氨基的亲水聚合物衍生物的实例包括PEG-NH2[NOF CORPORATION的产品；SUNBRIGHT PA SERIES(氨基-PEGs)]。该蛋白质的氨基由赖氨酸残基ε-氨基和N-末端α-氨基提供。为了将蛋白质固定到具有氨基的亲水聚合物上，可以采用本领域已知的方法，如包括使用戊二醛将亲水聚合物的氨基直接交联到蛋白质的氨基上的方法和包括使用反应性试剂将亲水聚合物的氨基化学结合到蛋白质的氨基上的方法。二价交联剂的实例包括戊二醛以及辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)、二醛(例如，苯二醛和对苯二甲醛)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)和二异硫氰基二苯乙烯二磺酸钠(DIDS)。反应性试剂的实例包括3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯、间马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯和辛二酸二琥珀酰亚胺基酯。
该亲水聚合物的氨基和该蛋白质的硫醇基团，或该亲水聚合物的硫醇基团和该蛋白质的氨基可以彼此结合，由此将该蛋白质固定到该亲水聚合物上。对氨基和硫醇基团呈反应性的二价交联剂的实例包括3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、4-(对马来酰亚氨基苯基)乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPA)、溴乙酸N-琥珀酰亚胺基酯、4-(对马来酰亚氨基苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPP)、N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺(GMBS)和N-(ε-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)。
该亲水聚合物的羧基和该蛋白质的氨基，或该亲水聚合物的氨基和该蛋白质的羧基可以使用缩合剂彼此结合，由此将该蛋白质固定到该亲水聚合物上(Maruyama K.等人，Biochimica et Biophysica，1234，74-80(1995))。
该亲水聚合物的硫醇基团可以与该蛋白质的硫醇基团结合，由此将该蛋白质固定到该亲水聚合物上。例如，使用交联剂，如双马来酰亚氨基己烷。
(v)一种方法，包括利用生物素对抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的特异性亲合力使蛋白质与亲水聚合物结合。
生物素改性的蛋白质可以通过非共价键结合到抗生蛋白链菌素-或抗生物素蛋白-改性的亲水聚合物上(Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment 12：311-325(2002))。此外，抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白形成四聚物，并因此最多允许结合四个生物素分子。使用这种原理，生物素改性的蛋白质可以通过非共价键经由抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素连接物结合到生物素改性的亲水聚合物上(Biochimica etBiophysica Acta 1239 133-144(1995))。
(vi)一种方法，包括利用组氨酸标签对镍离子的亲合力使蛋白质与亲水聚合物结合。
可以利用聚组氨酸标签(His-Tag)对镍离子(Ni2+)的亲合力将蛋白质或肽固定到脂质体上(Molecular Pharmaceutics 3，5，525-530)。可以通过本领域已知的方法表达和纯化通过基因工程法与His-Tag融合的嵌合蛋白质或肽。此外，该亲水聚合物可以用具有金属(Ni2+)螯合位点的NTA(次氮基乙酸)、IDA(亚氨基二乙酸)或类似物在末端或在侧链改性以制备Ni2+-固定的脂质体。His-Tag特异性结合到该脂质体的Ni2+上，以使该His-Tag-融合蛋白或肽固定在该亲水聚合物上。
(vii)一种方法，包括经由对抗体Fc结构域或其蛋白质结构域具有亲合力的蛋白质使全长抗体分子结合到亲水聚合物上。
该亲水聚合物可以经由对抗体Fc结构域或参与Fc结构域结合的其结构域蛋白质具有亲合力的蛋白质A或G支承该全长抗体分子。在这种情况下，蛋白质A或G可以通过任何方法(i)至(vi)结合到亲水聚合物上(BMC Immunology 2006，7：24)。
在方法(i)至(vii)中，通过调节可与蛋白质反应的亲水聚合物的含量，可以任意改变经由该亲水聚合物固定在脂质体上的蛋白质的量。
7.免疫脂质体的形式
脂质体通常是由具有内部水相的单层或更多层脂双层构成的封闭囊泡(D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics至Applications″，ElsevierScience Publishers，第1-171页(1993))。在本发明中，脂质体在更广意义上是指脂质复合粒子。具有典型的封闭囊泡结构的脂质体的形式可以是多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LUV)中的任一种。该脂质复合物的结构不受具体限制。本发明的免疫脂质体的粒度随尺寸调节方法而不同。可制备的脂质体尺寸的下限为大约20纳米(D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics to Applications″，Elsevier SciencePublishers，第1-171页(1993))。另一方面，该脂质体尺寸的上限需要为允许血管内给药的7微米或更小。本发明中所用的免疫脂质体的粒度不受特别限制，并通常为大约0.03至5微米。为了通过注射全身给药，考虑到该脂质体的血液停留及其在疾病组织如肿瘤或发炎部位的积聚，该粒度优选为400纳米或更小。可以根据脂质体分散体的物理性质，如pH值、渗透压、ζ电势、相变温度、体内血液停留和稳定性，选择该脂质体的脂质组分及其组成比。
8.制备和纯化免疫脂质体的方法
(1)制备免疫脂质体的方法
制造本发明的脂质体的方法不受特别限制，本领域技术人员可获得的任何方法(D.D.Lasic，″Liposomes：From Physics to Applications″，Elsevier Science Publishers，第1-171页(1993))都可用于此。该脂质体可以使用脂质通过例如薄膜、反相蒸发、乙醇注射、醚注射、脱水-复水、表面活性剂渗析、水合、冷冻-解冻、钙诱导的小脂质体囊泡融合、机械化学、己烷-span 80渗析和有机溶剂球粒蒸发法制造。可以通过如超声照射、冷冻-解冻后的超声照射、挤出、French press和均化之类的方法调节该脂质体的粒度。此外，可以根据本领域已知的方法从多层至单层脂质体或从单层至多层脂质体转化。
此外，可以根据本领域已知的方法将药物负载在脂质体内。该方法的实例通常包括包封、远程加载(pH梯度)、抗衡离子浓度梯度、冷冻-解冻、表面活性剂去除、电穿孔、超临界二氧化碳和薄膜加载法(G.Gregoriadis，″Liposome Technology Liposome Preparation and RelatedTechniques″，第2版，第I-III卷，CRC Press)。该药物的包封形式不受特别限制，只要该形式具有用脂质体负载药物的结构。其实例包括药物包封在脂质囊泡的封闭空间内的形式，药物包封在脂质层之间的形式，和药物并入脂质层内的形式。或者，可以使用它们的组合提供的形式。
制备该免疫脂质体的方法大致分类成(A)包括制备包含具有反应性官能团的脂质或亲水聚合物的脂质体并使蛋白质与其反应的方法，和(B)包括使蛋白质与具有反应性官能团的亲水聚合物反应并使该反应产物融合到单独制备的没有反应性官能团的脂质体上的方法。
(A)
在该制备脂质体的方法中，通过使用具有反应性官能团的脂质或具有反应性官能团的亲水聚合物的脂质衍生物作为该脂质体的一些脂质组分的任意方法制备脂质体。所得脂质体如段落6.(2)或6.(3)中所述与蛋白质反应，以在该脂质体的脂质分子或亲水聚合物与蛋白质之间形成共价或非共价键。
(B)
已知的是，脂质-亲水聚合物-蛋白质复合物在约等于或高于脂质分子的相变温度的温度条件下在混合分散体中与脂质体融合，即发生两亲成囊泡脂质的重构，以获得包含位于水相中的亲水聚合物-蛋白质部分和位于脂质相中的脂质部分的免疫脂质体(Paul S.Uster等人，FEBS letters386，1996，243-246；和T.Ishida等人，FEBS letters 460，1999，129-133)。在本文中，根据脂质的物理性质等选择脂质体与脂质-亲水聚合物-蛋白质复合物融合的适当条件。
(2)纯化免疫脂质体的方法
免疫脂质体的纯化是指在段落8.(1)中的免疫脂质体制备方法中制备的脂质体未结合的未反应蛋白质或肽或类似物的分离，或在段落8.(1)中的免疫脂质体制备方法中分离脂质体未融合的亲水聚合物-蛋白质。免疫脂质体的纯化的实例包括通过色谱法、超滤、渗析和超离心法分离。
(3)测量免疫脂质体的抗体密度的方法
免疫脂质体的“抗体密度”是指该免疫脂质体中所含的抗体的摩尔数与该免疫脂质体的总脂质成分的摩尔数的比率(以摩尔％表示)。在本文中，总脂质是指段落5-(1)中所列的两亲成囊泡脂质中所含的脂质和构成该脂质体的所有脂质。
量化脂质的方法的实例包括使用放射性同位素的方法(Maehama T等人，Anal Biochem.279(2)：248，2000)、使用高效液相色谱法的方法(Serunian L.A.等人，Methods Enzymol.1991；198：78)、使用气相色谱法的方法(Hoving EB等人，J Chromatogr B Biomed Appl.1995，15；671(1-2)：341)、使用质谱法的方法(Wenk M.R.等人，Nat Biotechnol.2003，21(7)：813)、吸收光度法、化学量化法和酶量化法。特别地，对磷脂而言，量化法的实例包括：Bartlett法(Bartlett GR.等人，J Biol Chem.1959，234(3)：469)和Stewart法(John Charles等人，Anal Biochem.1980，1；104(1)：10)；对含胆碱的脂质，如磷脂酰胆碱而言，使用胆碱氧化酶的酶量化法(Takayama M等人，Clin Chim Acta.1977，15；79(1)：93)；和对胆甾醇而言，使用胆甾醇氧化酶的酶量化法(Allain CC等人，ClinChem.1974，20(4)：470)。聚乙二醇可以通过差示折射法量化(″Comprehensive Polymer Science″，第1版，1989)、苦味酸法(Int.J.Pharm.203，255，2000)等量化。通过这些方法测量总脂质含量或特定脂质组分的脂质含量并在假定该脂质体的脂质成分的成分比在免疫脂质体制备过程中不变的情况下确定该脂质与总脂质含量的成分比(理论值)，由此计算总脂质含量。
蛋白质可以通过本领域已知的量化法，例如CBQCA(You WW等人，Anal Biochem.15；244(2)：277)、紫外线吸收、缩二脲、Bradford、Kjeldahl和Lowry法量化。
当免疫脂质体含有全长抗体分子时，可以在0.000014摩尔％至0.23摩尔％，优选0.002摩尔％至0.14摩尔％的范围内选择抗体密度。当免疫脂质体含有抗体F(ab′)2时，可以在0.000014摩尔％至0.23摩尔％，优选0.006摩尔％至0.11摩尔％的范围内选择抗体密度。当免疫脂质体含有Fab′时，可以在0.000014摩尔％至0.94摩尔％，优选0.005摩尔％至0.56摩尔％的范围内选择抗体密度。当免疫脂质体含有单链可变区片段抗体时，可以在0.000014摩尔％至1.8摩尔％，优选0.005摩尔％至0.56摩尔％的范围内选择抗体密度。
在本文中，免疫脂质体的最小抗体密度(0.000014摩尔％)是指每个粒度1000纳米的免疫脂质体结合2分子的各抗体(片段)。最大抗体密度(全长抗体：0.23摩尔％，F(ab′)2：0.23摩尔％，Fab′：0.94摩尔％，scFv：1.8摩尔％)是指该抗体以最密状态存在于免疫脂质体上。具体而言，当假定该抗体在免疫脂质体上占据的面积为以各抗体分子的主轴为直径的圆的面积，则数量为将免疫脂质体的表面积除以该抗体分子的圆面积的值的抗体存在状态被定义为该抗体的最致密排列(Allen等人Biochimica et Biophysica Acta(1995))。抗体分子的主轴设定为，全长抗体：14.2纳米，F(ab′)2：14.2纳米，Fab′：7纳米，且scFv：5纳米。关于全长抗体、F(ab′)2或Fab′的主轴，采用Raghupathy等人，The Journalof Biological Chemistry(1971)中描述的值。由Hoedemaeker等人，J.Biol.Chem(1997)中描述的scFv的晶体结构计算scFv的主轴，参考Raghupathy等人，The Journal of Biological Chemistry(1971)，并采用5纳米。
9.包含免疫脂质体的药剂
通过段落“8.制备和纯化免疫脂质体的方法”中所述的方法获得的免疫脂质体经由细胞凋亡相关受体，如DR5或Fas的生物活性，即体内经由该受体，诱导癌细胞的细胞凋亡并抑制癌细胞的生长。因此，该免疫脂质体可用作药剂，特别是癌症治疗剂。
可以基于对过表达该细胞凋亡相关受体的细胞的细胞生长抑制活性测量该免疫脂质体的体外抗肿瘤活性。
例如，培养过表达DR5的癌细胞系并将各种浓度的免疫脂质体添加到该培养系统中。可以测量对转化灶形成、集落形成和球体生长的抑制活性。
通过将免疫脂质体施用于例如过表达DR5的肿瘤细胞系移植裸鼠并测量癌细胞中的变化，可以使用实验动物测量该免疫脂质体对癌症的体内治疗作用。
癌类型的实例包括肺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、乳癌、胰癌和血细胞癌(白血病、淋巴瘤等)。要治疗的癌细胞不限于此，只要它们表达含死亡结构域的受体。
抗Fas和DR5的抗体也已知诱导炎性细胞的凋亡(J.Clin.Invest.1996，98(2)，271-278；和Int.Immunol.1996，8(10)，1595-1602)。因此，本发明的免疫脂质体也可用作自体免疫性疾病或炎症的治疗剂。自体免疫性疾病或炎症的实例包括系统性红斑狼疮、桥本病、关节风湿病、移植物抗宿主症、干燥综合征、恶性贫血、阿狄森氏病、硬皮病、肺出血肾炎综合征、克罗恩病、自体免疫性溶血性贫血、生育不能(impotentiagenerandi)、重症肌无力、多发性硬化、巴塞杜氏病、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、过敏症、气喘病、特应症、动脉硬化、心肌炎、非炎性心肌病、肾小球性肾炎、再生障碍性贫血和器官移植排异。
本发明还提供包含治疗有效量的免疫脂质体和可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
本发明的药物组合物中可接受的药用物质应该在所用剂量或给药浓度下对接受该药物组合物的个体无毒。
本发明的药物组合物可以含有用于改变、维持或保持pH值、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解速率、持续释放速率、吸收率或渗透率的制药物质。
该制药物质的实例可以包括，但不限于，下列：氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂，如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和硼酸盐缓冲剂、碳酸氢盐和Tris-HCl溶液；填料，如甘露醇和甘氨酸；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂，如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷、β-环糊精和羟基丙基-β-环糊精；增量剂，如葡萄糖、甘露糖和糊精；单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和其它烃，如糊精；着色剂；芳香剂；乳化剂；亲水聚合物，如聚乙烯基吡咯烷；低分子量多肽；成盐抗衡离子；防腐剂，如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、thimerosal、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂，如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇，如甘露醇和山梨糖醇；悬浮剂；表面活性剂，如PEG、失水山梨糖醇酯、吐温，如吐温20和吐温80、Triton、tromethamine、卵磷脂和胆甾醇；稳定性增强剂，如蔗糖和山梨糖醇；弹性增强剂，如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨糖醇；给药载体；稀释剂；赋形剂；和/或制药佐剂。
这些制药物质的添加量优选比免疫脂质体重量高0.01至100倍，特别是0.1至10倍。
本领域技术人员可以根据适用的疾病、适用的给药途径等适当确定该药物组合物在制品中的优选组成。
该药物组合物中的赋形剂或载体可以是液体或固体。
适当的赋形剂或载体可以是可注射的水、盐水、脑脊髓液或肠胃外给药中常用的其它物质。
也可以使用中性盐水或含血清白蛋白的盐水作为载体。
该药物组合物还可以含有Tris缓冲剂(pH 7.0至8.5)或乙酸盐缓冲剂(pH 4.0至5.5)以及山梨糖醇或其它化合物。
本发明的药物组合物以冻干或液体形式作为具有所选组成和必要纯度的适当药物制备。
包含该免疫脂质体的药物组合物也可以使用适当赋形剂，如蔗糖以冻干形式制备。
本发明的药物组合物可制备用于非肠胃给药或也可制备用于经口服途径肠胃吸收。
可以根据给药方法确定该制品的组成和浓度。当本发明的药物组合物中所含的抗体具有更高的抗原亲合力，即以离解常数(Kd值)计更高的抗原亲合力(更低的Kd值)时，该药物组合物可以在人体中以较低剂量发挥其药理学作用。根据这种结果，也可以确定本发明的药物组合物在人体中的剂量。
就每1至30天施用一次的抗体量而言，该免疫脂质体在人体中的剂量可以为大约0.1至100毫克/千克。
本发明的药物组合物的剂型的实例包括注射剂，包括点滴剂、栓剂、鼻剂、舌下剂和可经皮吸收剂。
下面，具体参照实施例描述本发明。但是，本发明不受这些实施例的限制。在下列实施例中，除非另行指明，根据″Molecular Cloning″(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，published by Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的方法或根据所用市售试剂或试剂盒中包含的说明书进行与基因工程相关的程序。
使用CBQCA Protein Quantitation Kit(Molecular Probes)根据其中所含的说明书量化缀合到免疫脂质体上的蛋白质的浓度。使用磷脂CTest Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)根据其中所含的说明书量化脂质体的磷脂浓度。使用粒度测量装置(Nicomp Particle Sizer Model370，Nicomp Particle Sizing Systems)测量免疫脂质体的粒度。
参考例1
hTRA-8F(ab′)2的制备
用乙酸盐缓冲剂(20mM乙酸钠，pH 4.5)将抗-人DR5抗体hTRA-8的浓度调节至10毫克/毫升。在本文中，hTRA-8是通过人源化小鼠抗-人DR5抗体TRA-8而得的抗体(Nature Med.2001，7(8)，954-60)并具有序列表中所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列作为重链氨基酸序列和序列表中所述的SEQ ID NO：2的氨基酸序列作为轻链氨基酸序列。由序列表中所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸残基1至118构成的氨基酸序列相当于hTRA-8的重链可变区，由序列表中所述的SEQ IDNO：2的氨基酸序列的氨基酸残基1至107构成的氨基酸序列相当于hTRA-8的轻链可变区。向1毫升该抗体溶液中，加入125微升固定胃蛋白酶(Pierce Biotechnology，Inc.)，然后将该混合物在37℃下培养8.5小时以使本抗体降解成F(ab′)2片段。将反应溶液快速离心(spinneddown)并过滤上清液以除去该固定胃蛋白酶。通过离子交换色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCAREINC.，Resource S 6ml)；溶液A(50mM柠檬酸盐缓冲剂，pH 4.0)、溶液B(50mM柠檬酸盐缓冲剂，1M NaCl，pH 4.0)；梯度(溶液B：15→40％，50CV，线性梯度)；4℃；6毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去肽片段和未消化的全长hTRA-8，以收集F(ab′)2级分(57-111毫升洗脱级分)。使用Labscale TFF系统(MILLIPORE INC.)和聚醚砜膜(MILLIPORE INC.，Pellicon XL，Biomax 50(分子截留：50,000))通过超滤程序将柠檬酸盐缓冲剂换成HEPES缓冲剂(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)。
参考例2
hHFE7A F(ab′)2的制备
用乙酸盐缓冲剂(20mM乙酸钠，pH 4.5)抗-人Fas抗体hHFE7A的浓度调节至10毫克/毫升。在本文中，hHFE7A是通过人源化小鼠抗-人Fas抗体HFE7A而得的抗体(Int.Immunol.2000，12(4)，555-62)并具有序列表中所述的SEQ ID NO：3的氨基酸序列作为重链氨基酸序列和序列表中所述的SEQ ID NO：4的氨基酸序列作为轻链氨基酸序列。由序列表中所述的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基1至139构成的氨基酸序列相当于hHFE7A的重链可变区，由序列表中所述的SEQ IDNO：4的氨基酸序列的氨基酸残基1至131构成的氨基酸序列相当于hHFE7A的轻链可变区。向1毫升该抗体溶液中，加入125微升固定胃蛋白酶(Pierce Biotechnology，Inc.)，然后将该混合物在37℃下培养8.5小时以使本抗体降解成F(ab′)2片段。将反应溶液快速离心(spinneddown)并过滤上清液以除去该固定胃蛋白酶。通过离子交换色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCAREINC.，Resource S 6ml)；溶液A(50mM柠檬酸盐缓冲剂，pH 4.0)、溶液B(50mM柠檬酸盐缓冲剂，1M NaCl，pH 4.0)；梯度(溶液B：15→40％，50CV，线性梯度)；4℃；6毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去肽片段和未消化的全长hHFE7A，以收集F(ab′)2级分(40-65毫升洗脱级分)。使用Labscale TFF系统(MILLIPORE INC.)和聚醚砜膜(MILLIPORE INC.，Pellicon XL，Biomax 50(分子截留：50,000))通过超滤程序将柠檬酸盐缓冲剂换成HEPES缓冲剂(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)。
参考例3
hTRA-8scFv的制备
(1)hTRA-8scFv表达载体的制备
使用编码hTRA-8H链区的载体TRA-8-H pHA15-1作为VH的模板并使用两种寡核苷酸引物，通过PCR扩增hTRA-8 scFv前半段的编码DNA。
同样，使用编码hTRA-8L链区的载体TRA-8-L LM-1L作为VL的模板并使用两种寡核苷酸引物，通过PCR扩增hTRA-8 scFv后半段的编码DNA。
在这种程序中，将引物设计成在VH和VL之间加入柔性肽连接物(GGGGS)×3和在C末端加入序列HHHHHHGGAC(含有6组氨酸残基标签和Cys残基的序列)。然后，在这些DNA片段中插入5′NdeI(TAKARA BIO INC.)和3′XhoI(TAKARA BIO INC.)位点，并通过PCR连接所得片段以制备hTRA-8 scFv-编码DNA。
制备的DNA用限制酶NdeI和XhoI消化，随后插入pET22b(+)(Novagen)的多克隆位点中存在的限制位点NdeI/XhoI中以构建pET22b(+)hTRA-8 scFv表达载体。
(2)hTRA-8scFv表达
将段落(1)中获得的pET22b(+)hTRA-8 scFv表达载体根据本领域已知的方法引入大肠杆菌株OrigamiB(DE3)(Novagen)，并将该细菌细胞施加到含100微克/毫升氨苄青霉素(Sigma-Aldrich，Inc.)、25微克/毫升卡那霉素(WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.)和34微克/毫升氯霉素(WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.)的LB板中，以获得转化体。接着，这些转化体的菌落在20毫升LB培养基(Invitrogen Corp.)中摇振的同时在37℃下生长过夜直至几乎饱和，将这些菌落接种到2升新鲜LB培养基上。在2升摇振烧瓶中在37℃下通过需氧培养法培养细菌直至OD 600nm＝0.8。将温度降至16℃，随后使用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)((WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.)诱导蛋白质表达。细菌培养在需氧培养下在16℃下持续18小时。
(3)蛋白质纯化
该细胞在6000g下离心20分钟以形成沉淀。然后，将这些沉淀再悬浮在含有20mM Tris-HCl(WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.)(pH8.0)、100mM NaCl(MANAC Incorporated)、4mM CHAPS(Sigma-Aldrich，Inc.)、10％甘油(WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.)(v/v)和蛋白酶抑制剂Cocktail Complete mini(无EDTA)(Roche DiagnosticsGmbH)的缓冲剂中并将该再悬浮液储存在-80℃。
该再悬浮液用流动水解冻，并在冰中超声均化，通过在4℃下在24,000g下离心20分钟，除去细胞碎片。
使该离心上清液通过0.45微升过滤器，然后用His标签亲和柱纯化。具体而言，在将样品施加到在AKTA Prime系统(GE Healthcare Inc.)中的柱His-Trap HP 1ml(GE Healthcare Inc.)上后，用5倍柱体积的20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl，40mM咪唑(CALBIOCHEM)、0.6％CHAPS和1mM DTT(Sigma-Aldrich，Inc.)以1毫升/分钟的流速洗涤该柱。接着，使用20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、0.6％CHAPS、1mM DTT和500mM咪唑进行梯度洗脱。
通过SDS-PAGE分析从His-Trap HP中洗脱的各级分，并通过凝胶过滤色谱法进一步纯化含有scFv的级分。具体而言，将样品添加到使用50mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、10％甘油、10mM CHAPS和1mM DTT的柱Superdex 75pg HiLoad 16/60(GE Healthcare Inc.)中。将从Superdex 75pg HiLoad 16/60中洗脱的各级分分离并通过SDS-PAGE分析，收集scFv级分。
实施例1
(1)hTRA-8Fab′的制备
将参考例1中制备的F(ab′)2溶液(抗体浓度：2.5毫克/毫升，HEPES缓冲剂)在10mM L-半胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)存在下在室温下培养90分钟以还原成Fab′。通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去L-半胱氨酸以获得hTRA-8Fab′片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入22毫克、7.73毫克和1.26毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升悬浮用的HEPES缓冲剂(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)，以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(TheMini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fab′(3.6毫克/毫升，15.3微升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，500微升)以hTRA-8 Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶50的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.1，抗体浓度：33.5微克/毫升，磷脂浓度：6.3mM，抗体密度：0.0058摩尔％，平均粒度：73.0±35.9纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例2
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体如下结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(3.6毫克/毫升，152微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，500微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.2，抗体浓度：278.5微克/毫升，磷脂浓度：6.1mM，抗体密度：0.050摩尔％，平均粒度：86.6±39.9纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例3
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(3.6毫克/毫升，244微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，320微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3.2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.3，抗体浓度：413.7微克/毫升，磷脂浓度：4.38mM，抗体密度：0.102摩尔％，平均粒度：84.4±42.2纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例4
(1)hTRA-8Fab′的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入11毫克、3.9毫克和3.15毫克(摩尔比100∶66∶5)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)向其中加入1.5毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入1.5毫升悬浮用的HEPES缓冲剂(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)，以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(TheMini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8 Fab′(4.64毫克/毫升，237微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，200μl)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8 Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.4，抗体浓度：394.5微克/毫升，磷脂浓度：1.91mM，抗体密度：0.224摩尔％，平均粒度：83.7±40.8纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例5
(1)hTRA-8Fab′的制备
将参考例1中制备的F(ab′)2溶液(抗体浓度：5毫克/毫升，HEPES缓冲剂)在40mM(±)-二硫苏糖醇(下文称作DTT；Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)存在下在室温下培养30分钟以还原成Fab′。通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去DTT以获得hTRA-8 Fab′片段。
(2)脂质体的制备
将90毫升溶解用的乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)添加到分别1762毫克、618.6毫克和2481.4毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOF CORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)中。将这种脂质溶液逐滴添加到900毫升HEPES缓冲剂(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)中以获得粗制脂质体分散体。随后，通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，(MILLIPORE INC.))超滤(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.))，将该脂质体分散体的浓度调节至10mM DPPC。使用连续高压匀浆器(EmulsiFlex-C5，AVESTIN，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Nucleopore Track-Etch Membrane，Whatman INC.)中反复挤出该脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8 Fab′(4.86毫克/毫升，5.7毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，132毫升)以hTRA-8 Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶25的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.32毫升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，(MILLIPORE INC.))超滤(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8 Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.5，抗体浓度：1011.0微克/毫升，磷脂浓度：27.63mM，抗体密度：0.040摩尔％，平均粒度：53.7±22.4纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例6
临使用前以与实施例5的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8 Fab′片段。此外，临使用前以与实施例5的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8 Fab′(4.86毫克/毫升，9.05毫升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，49毫升)以hTRA-8 Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入490微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，(MILLIPORE INC.))超滤(LabScale TFFSystem(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8 Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.6，抗体浓度：1363.3微克/毫升，磷脂浓度：8.85mM，抗体密度：0.167摩尔％，平均粒度：50.3±23.6纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例7
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8 Fab′片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8 Fab′(5毫克/毫升，66微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8 Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.7，抗体浓度：96.8微克/毫升，磷脂浓度：1.64mM，抗体密度：0.064摩尔％，平均粒度：101.1±44.2纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例8
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8 Fab’片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8 Fab′(5毫克/毫升，16.5微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.8，抗体浓度：70.7微克/毫升，磷脂浓度：1.39mM，抗体密度：0.055摩尔％，平均粒度：83.3±40.3纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例9
(1)hTRA-8Fab′的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入24毫克、7.73毫克和1.26毫克(摩尔比100∶66∶1)的蛋黄卵磷脂(下文称作eggPC；Q.P.Corporation，PC-98N)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF  CORPORATION，SUNBRIGHTDSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICALCO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(eggPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(AvantiPOLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，66微升)和该脂质体分散体(10mMeggPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.9，抗体浓度：138.8微克/毫升，磷脂浓度：2.32mM，抗体密度：0.065摩尔％，平均粒度：90.2±13.3纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例10
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。此外，临使用前以与实施例9的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，16.5微升)和该脂质体分散体(10mM eggPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.10，抗体浓度：90.9微克/毫升，磷脂浓度：2.98mM，抗体密度：0.033摩尔％，平均粒度：83.1±13.0纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例11
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入20.3毫克、7.73毫克和1.26毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(下文称作DMPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-4040)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(DMPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，66微升)和该脂质体分散体(10mMDMPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.11，抗体浓度：148.5微克/毫升，磷脂浓度：2.47mM，抗体密度：0.065摩尔％，平均粒度：117.9±47.1纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例12
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。此外，临使用前以与实施例11的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，16.5微升)和该脂质体分散体(10mM DMPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.12，抗体浓度：76.8微克/毫升，磷脂浓度：2.94mM，抗体密度：0.028摩尔％，平均粒度：119.3±45.0纳米(HEPES缓冲剂))。
实施例13
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入23.6毫克、7.73毫克和1.26毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二油酰磷脂酰胆碱(下文称作DOPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-8181)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(DOPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，66微升)和该脂质体分散体(10mMDOPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.13，抗体浓度：136.3微克/毫升，磷脂浓度：2.30mM，抗体密度：0.064摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例14
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。此外，临使用前以与实施例13的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，16.5微升)和该脂质体分散体(10mM DOPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.14，抗体浓度：72.9微克/毫升，磷脂浓度：2.13mM，抗体密度：0.037摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例15
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例1中相同的方式制备hTRA-8Fab′片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入23.7毫克、7.73毫克和1.26毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二硬脂酰磷脂酰胆碱(下文称作DSPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-8080)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(DSPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，165微升)和该脂质体分散体(10mMDSPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.15，抗体浓度：178.9微克/毫升，磷脂浓度：1.97mM，抗体密度：0.099摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例16
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。此外，临使用前以与实施例15的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
该抗体通过下列步骤结合到脂质体上：将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，66微升)和该脂质体分散体(10mM DSPC，300微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.16，抗体浓度：60.4微克/毫升，磷脂浓度：1.53mM，抗体密度：0.043摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例17
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入11毫克、3.9毫克和0.69毫克(摩尔比100∶66∶5)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和具有马来酰亚胺基团的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-Mal；NOF CORPORATION，COATSOME FE-8080MA3)，向其中加入1.5毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入1.5毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(4.64毫克/毫升，237微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，200微升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-Mal＝1∶1的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GEHEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的DSPE结合(脂质体组成：表1的No.17，抗体浓度：124.0微克/毫升，磷脂浓度：1.34mM，抗体密度：0.100摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例18
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例1的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’片段。
(2)DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物的制备
向其中加入DSPE-PEG3400-Mal(16.8毫克/毫升，100微升)(其为hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，220微升)的20当量)，然后在37℃下反应1小时。通过加入40微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fab′以分离DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物级分(39-54毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物。每DSPE的hTRA-8Fab′量为1428.6微克/微摩尔DSPE。
(3)脂质体的制备
为了制备脂质体，在茄形烧瓶中分别称入22.05毫克和7.68毫克(摩尔比3∶2)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)和胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入3毫升HEPES缓冲剂以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(4)脂质体与DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物的融合
将DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物(抗体浓度：489.9微克/毫升，408微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，200微升)混合并在60℃下培养3小时。通过凝胶过滤色谱法(柱(GE HEALTHCARE INC.，10×300mm，Sephacryl S-500HR)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟)除去脂质体未融合的DSPE-PEG3400-(hTRA-8Fab′)复合物以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPOREINC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.18，抗体浓度：73.7微克/毫升，磷脂浓度：2.27mM，抗体密度：0.035摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例19
(1)hTRA-8 Fullbody中的二硫化物键的还原(Fullbody是指全长抗体；这同样适用于下列描述)
将hTRA-8(抗体浓度：2.5毫克/毫升)在30mM L-半胱氨酸(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)存在下在室温下培养90分钟以还原hTRA-8 Fullbody中的二硫化物键。通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去L-半胱氨酸以获得具有还原的二硫化物键的hTRA-8 Fullbody。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8 Fullbody(5毫克/毫升，450微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，300微升)以hTRA-8 Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8 Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.19，抗体浓度：23.9微克/毫升，磷脂浓度：3.25mM，抗体密度：0.0029摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例20
以与实施例19的段落(1)中相同的方式还原hTRA-8 Fullbody中的二硫化物键。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8 Fullbody(5毫克/毫升，180微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，300微升)以hTRA-8 Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTAexplorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8 Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.20，抗体浓度：65.4微克/毫升，磷脂浓度：3.07mM，抗体密度：0.0085摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例21
以与实施例19的段落(1)中相同的方式还原hTRA-8Fullbody中的二硫化物键。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8Fullbody(5毫克/毫升，45微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，300微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCAREINC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：No.21 of Table 1，抗体浓度：41.2微克/毫升，磷脂浓度：3.11mM，抗体密度：0.0053摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例22
(1)hTRA-8Fullbody的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到hTRA-8Fullbody(抗体浓度：6毫克/毫升，20mM HEPES，150mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤色谱法(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去Traut′s试剂以将hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fullbody(2毫克/毫升，75微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，150微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶15的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.5微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.22，抗体浓度：70.3微克/毫升，磷脂浓度：1.17mM，抗体密度：0.024摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例23
以与实施例22的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：
将hTRA-8Fullbody(5毫克/毫升，300微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，150微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.5微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.23，抗体浓度：184.4微克/毫升，磷脂浓度：1.07mM，抗体密度：0.0685摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例24
以与实施例22的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例5的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8Fullbody(5毫克/毫升，1.1毫升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，16.5毫升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶45的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入165微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCAREINC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.24，抗体浓度：166.5微克/毫升，磷脂浓度：5.25mM，抗体密度：0.0126摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例25
以与实施例22的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例5的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8Fullbody(5毫克/毫升，4毫升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，1995微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入19.95微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.25，抗体浓度：314.5微克/毫升，磷脂浓度：0.96mM，抗体密度：0.131摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例26
(1)hHFE7A Fab′的制备
将参考例2中制备的F(ab′)2溶液(抗体浓度：2.5毫克/毫升，HEPES缓冲剂)在10mM L-半胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)存在下在室温下培养90分钟以还原成Fab′。通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去L-半胱氨酸以获得hHFE7A Fab′片段。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hHFE7A Fab′(1.5毫克/毫升，33微升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，180微升)以hHFE7A Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.8微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.26，抗体浓度：47.9微克/毫升，磷脂浓度：2.03mM，抗体密度：0.026摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例27
临使用前以与实施例26的段落(1)中相同的方式制备hHFE7A Fab′片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hHFE7A Fab′(1.5毫克/毫升，132微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，180微升)以hHFE7A Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.8微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.27，抗体浓度：115.0微克/毫升，磷脂浓度：1.54mM，抗体密度：0.081摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例28
临使用前以与实施例26的段落(1)中相同的方式制备hHFE7A Fab′片段。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hHFE7A Fab′(1.5毫克/毫升，330微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，180微升)以hHFE7A Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.8微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GE HEALTHCARE INC.，HiLoadSuperdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fab′以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.28，抗体浓度：151.6微克/毫升，磷脂浓度：1.60mM，抗体密度：0.103摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例29
(1)hHFE7A Fullbody的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hHFE7A∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到hHFE7A Fullbody(抗体浓度：6毫克/毫升，20mM HEPES，150mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤色谱法(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去未反应的Traut′s试剂以将hHFE7A Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hHFE7A Fullbody(2毫克/毫升，75微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，150微升)以hHFE7A Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶15的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.5微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.29，抗体浓度：48.1微克/毫升，磷脂浓度：1.06mM，抗体密度：0.018摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例30
(1)hHFE7A Fullbody的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hHFE7A∶Traut′s试剂＝1∶16的摩尔比添加到hHFE7A Fullbody(抗体浓度：6毫克/毫升，20mM HEPES，150mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤色谱法(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；HEPES缓冲剂)除去未反应的Traut′s试剂以将hHFE7A Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hHFE7A Fullbody(2毫克/毫升，75微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，150微升)以hHFE7A Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶15的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.5微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.30，抗体浓度：157.6微克/毫升，磷脂浓度：1.30mM，抗体密度：0.048摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例31
以与实施例29的段落(1)中相同的方式将hHFE7A Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hHFE7AFullbody(5毫克/毫升，300微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，150微升)以hHFE7A Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hHFE7A Fullbody以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用Amicon Ultra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.31，抗体浓度：227.7微克/毫升，磷脂浓度：0.95mM，抗体密度：0.096摩尔％(HEPES缓冲剂))。
实施例1至31中制备的免疫脂质体的组分组合物显示在表1中。
[表1]
Figure GPA00001087506100831
实施例32
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8F(ab′)2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到F(ab′)2溶液(抗体浓度：3毫克/毫升，50mM柠檬酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH5.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将hTRA-8F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.71毫克、33.3毫克和2.1毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8F(ab′)2(1毫克/毫升，400微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以hTRA-8F(ab′)2∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入10微升20mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8F(ab′)2以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.32，抗体浓度：191微克/毫升，磷脂浓度：3.38mM，抗体密度：0.031摩尔％，平均粒度：91.5±23.4纳米(PBS))。
实施例33
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8F(ab′)2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到F(ab′)2溶液(抗体浓度：3毫克/毫升，20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH 6.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将hTRA-8F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8F(ab′)2(1毫克/毫升，400μl)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，300微升)以hTRA-8F(ab′)2∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入3微升20mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8F(ab′)2以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.33，抗体浓度：16微克/毫升，磷脂浓度：0.79mM，抗体密度：0.011摩尔％，平均粒度：66.4±36.5纳米(PBS))。
实施例34
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8F(ab′)2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到F(ab′)2溶液(抗体浓度：3毫克/毫升，20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH 7.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将hTRA-8F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
以与实施例33的段落(3)中相同的方式获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.34，抗体浓度：156微克/毫升，磷脂浓度：1.16mM，抗体密度：0.073摩尔％，平均粒度：68.0±26.2纳米(PBS))。
实施例35
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
将在二甲亚砜中的4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，PierceBiotechnology，Inc.)以hTRA-8F(ab′)2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到F(ab′)2溶液(抗体浓度：3毫克/毫升，20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mMDTPA，pH 7.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将hTRA-8F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
以与实施例33的段落(3)中相同的方式获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.35，抗体浓度：233微克/毫升，磷脂浓度：1.16mM，抗体密度：0.109摩尔％，平均粒度：107.7±58.9纳米(PBS))。
实施例36
(1)小鼠抗-hDR5抗体(MAB631)的硫醇化
将20mM磷酸盐、150mM NaCl和1mM DTPA，pH 8.0添加到小鼠抗-hDR5抗体(MAB631)(R&D Systems，Inc.，1毫克)中以将抗体浓度调节至2毫克/毫升。以MAB631∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比向其中加入4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将MAB631中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将MAB631(1毫克/毫升，450微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，750微升)以MAB631∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入7.5微升20mM巯基乙醇(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的MAB631以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.36，抗体浓度：232微克/毫升，磷脂浓度：4.06mM，抗体密度：0.023摩尔％，平均粒度：105.0±42.4纳米(PBS))。
实施例37
MAB631中的一些赖氨酸残基的氨基以与实施例36的段落(1)中相同的方式硫醇化。此外，临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将MAB631(1毫克/毫升，450微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，225微升)以MAB631∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2.25微升20mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的MAB631以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.37，抗体浓度：141微克/毫升，磷脂浓度：0.83mM，抗体密度：0.068摩尔％，平均粒度：110.2±44.9纳米(PBS))。
实施例38
(1)小鼠抗-hDR5抗体(MAB6311)的硫醇化
将20mM磷酸盐、150mM NaCl和1mM DTPA，pH 8.0添加到小鼠抗-hDR5抗体(MAB6311)(R&D Systems，Inc.，1mg)中以将抗体浓度调节至2毫克/毫升。以MAB6311∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比向其中加入4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将MAB6311中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将MAB6311(1毫克/毫升，360微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，600微升)以MAB6311∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6微升20mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的MAB6311以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.38，抗体浓度：223微克/毫升，磷脂浓度：3.02mM，抗体密度：0.029摩尔％，平均粒度：124.3±44.6纳米(PBS))。
实施例39
以与实施例38的段落(1)中相同的方式将MAB6311中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将MAB6311(1毫克/毫升，360微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，180微升)以MAB6311∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入1.8微升20mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的MAB6311以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.39，抗体浓度：101微克/毫升，磷脂浓度：0.54mM，抗体密度：0.075摩尔％，平均粒度：126.0±49.9纳米(PBS))。
实施例40
(1)小鼠抗-hFas抗体(DX2)的硫醇化
将小鼠抗-hFas抗体(DX2)(BD Biosciences Pharmingen，1.5毫克)用培养基替换(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH 8.0)以将抗体浓度调节至0.64毫克/毫升。以DX2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比向其中加入4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脱盐柱；PBS)除去Traut’s试剂以将DX2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例32的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将DX2(0.25毫克/毫升，1330微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，555微升)以DX2∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入11.1微升10mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的DX2以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表1的No.40，抗体浓度：16微克/毫升，磷脂浓度：0.87mM，抗体密度：0.0073摩尔％，平均粒度：82.5±33.6纳米(PBS))。
实施例41
(1)hTRA-8Fullbody的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到hTRA-8Fullbody(抗体浓度：3.87毫克/毫升，20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；PBS)除去Traut′s试剂以将hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入587.2毫克、206.4毫克、23.38毫克和0.8毫升(摩尔比100∶66∶1∶0.1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOF CORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)、分子量大约2000的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG2000-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-020MA)和Vybrant DiD细胞标记溶液(1mM在溶剂中，Invitrogen)，向其中加入30毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入80毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用EmulsiFlex C-5(AVESTIN)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fullbody(1毫克/毫升，74.1毫升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，123.5毫升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG2000-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入247微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG2000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，MILLIPORE INC.)超滤(LabScale TFFSystem(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8Fullbody以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.41，抗体浓度：1819微克/毫升，磷脂浓度：10.08mM，抗体密度：0.072摩尔％，平均粒度：91.8纳米(PBS))。
实施例42
(1)hTRA-8Fab’的制备
将F(ab′)2溶液(抗体浓度：5毫克/毫升，PBS)在40mM(±)-二硫苏糖醇(下文称作DTT；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)存在下在室温下培养90分钟以还原成Fab′。通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；PBS)除去DTT以获得hTRA-8Fab′。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例41的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fab′(5毫克/毫升，6.6毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，12毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG2000-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入0.12毫升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG2000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，MILLIPORE INC.)超滤(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.42，抗体浓度：1632微克/毫升，磷脂浓度：10.08mM，抗体密度：0.176摩尔％，平均粒度：76.7±22.9纳米(PBS))。
实施例43
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以hTRA-8F(ab′)2∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到F(ab′)2溶液(抗体浓度：3.39毫克/毫升，20mM磷酸盐，150mM NaCl，1mM DTPA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤纯化(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；PBS)除去Traut′s试剂以将hTRA-8F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例41的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8F(ab′)2(1毫克/毫升，24.4毫升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，11毫升)以hTRA-8F(ab′)2∶DSPE-PEG2000-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入110微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG2000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(Pellicon XL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，MILLIPORE INC.)超滤(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8F(ab′)2以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.43，抗体浓度：1147微克/毫升，磷脂浓度：10.08mM，抗体密度：0.062摩尔％，平均粒度：83.7±21.8纳米(PBS))。
实施例44
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入282.9毫克、128.9毫克和21毫克(摩尔比100∶66∶1)的二癸酰磷脂酰胆碱(下文称作DDEPC；NOF CORPORATION，COATSOME MC-1010)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入30毫升溶解用的氯仿(KANTOCHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入50毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DDEPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.55毫升)和该脂质体分散体(10mMDDEPC，0.5毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.44，抗体浓度：426微克/毫升，磷脂浓度：2.31mM，抗体密度：0.200摩尔％，平均粒度：45.7±18.1纳米(PBS))。
实施例45
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入310.9毫克、128.9毫克和21.7毫克(摩尔比100∶66∶1)的二月桂酰磷脂酰胆碱(下文称作DLPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-2020)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入30毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入50毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DLPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(AvantiPOLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.55毫升)和该脂质体分散体(10mMDLPC，0.5毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.45，抗体浓度：600微克/毫升，磷脂浓度：2.31mM，抗体密度：0.135摩尔％，平均粒度：65.6±25.7纳米(PBS))。
实施例46
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入45.12毫克、12.89毫克和2.17毫克(摩尔比100∶66∶1)的二(二十二碳酰基)磷脂酰胆碱(下文称作DDOPC；Sigma-Aldrich，Inc.)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTOCHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DDOPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为400纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体。然后，通过探针超声处理(ULTRASONICPROCESSOR SH-7600，SEIKO INSTRUMENT & ELECTRONICS LTD)制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.55毫升)和该脂质体分散体(10mMDDOPC，0.5毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.46，抗体浓度：183微克/毫升，磷脂浓度：2.11mM，抗体密度：0.094摩尔％，平均粒度：147.7±56.7纳米(PBS))。
实施例47
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。此外，临使用前以与实施例44的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体并从孔径为30纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出以制造具有适当粒度的脂质体。
以与实施例44的段落(3)中相同的方式进行抗体与脂质体的结合反应以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.47，抗体浓度：458微克/毫升，磷脂浓度：7.29mM，抗体密度：0.068摩尔％，平均粒度：39.8±17.9纳米(PBS))。
实施例48
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、12.89毫克和2.17毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为400纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.55毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，0.5毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.48，抗体浓度：124微克/毫升，磷脂浓度：1.14mM，抗体密度：0.118摩尔％，平均粒度：75.2±9.1纳米，232.2±29.3纳米(PBS))。
实施例49
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入44.92毫克、12.89毫克和2.17毫克(摩尔比100∶66∶1)的二芥酰磷脂酰胆碱(下文称作DEPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-2121AL)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DEPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为800纳米的聚碳酸酯膜(AvantiPOLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.55毫升)和该脂质体分散体(10mMDEPC，0.5毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.49，抗体浓度：94微克/毫升，磷脂浓度：1.50mM，抗体密度：0.068摩尔％，平均粒度：130.0±43.2纳米(PBS))。
实施例50
(1)hTRA-8Fullbody的制备
以与实施例41的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody的一些氨基酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、12.89毫克和6.3毫克(摩尔比100∶66∶3)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fullbody(1毫克/毫升，360微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，200微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升60mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fullbody以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.50，抗体浓度：81微克/毫升磷脂浓度：1.17mM，抗体密度：0.027摩尔％，平均粒度：57.3纳米(PBS))。
实施例51
以与实施例41的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody中的一些氨基酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例50的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8Fullbody(1毫克/毫升，1200微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mMDPPC，200微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升60mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fullbody以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.51，抗体浓度：156微克/毫升，磷脂浓度：0.73mM，抗体密度：0.084摩尔％，平均粒度：60.8纳米(PBS))。
实施例52
(1)hTRA-8Fullbody的制备
以与实施例41的段落(1)中相同的方式将hTRA-8Fullbody中的一些氨基酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、12.89毫克和21毫克(摩尔比100∶66∶10)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fullbody(1毫克/毫升，1200微升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，200微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6.67微升60mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fullbody以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.52，抗体浓度：161微克/毫升，磷脂浓度：0.66mM，抗体密度：0.092摩尔％，平均粒度：74.1纳米(PBS))。
实施例53
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab′。此外，临使用前以与实施例50的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.44毫升)和用PBS稀释5倍的该脂质体分散体(2mM DPPC，0.2毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶1.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6.67微升60mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.53，抗体浓度：125微克/毫升，磷脂浓度：0.45mM，抗体密度：0.297摩尔％，平均粒度：53.9纳米(PBS))。
实施例54
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、12.89毫克和1.47毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约2000的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG2000-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-020MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.44毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，0.4毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG2000-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入4微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG2000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.54，抗体浓度：354微克/毫升，磷脂浓度：4.54mM，抗体密度：0.085摩尔％，平均粒度：106.5±33.4纳米(PBS))。
实施例55
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、12.89毫克和2.99毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约5000的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG5000-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-050MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.66毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，0.6毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG5000-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG5000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.55，抗体浓度：128微克/毫升，磷脂浓度：3.02mM，抗体密度：0.046摩尔％，粒度：84.9±36.9纳米(PBS))。
实施例56
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、4.84毫克和2.17毫克(摩尔比100∶25∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.44毫升)和该脂质体分散体(10mMDPPC，0.4毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入4微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.56，抗体浓度：214微克/毫升，磷脂浓度：1.95mM，抗体密度：0.156摩尔％，粒度：78.9±41.4纳米(PBS))。
实施例57
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入36.7毫克、19.35毫克和2.17毫克(摩尔比100∶100∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为50纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
以与实施例56的段落(3)中相同的方式进行结合以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.57，抗体浓度：456微克/毫升，磷脂浓度：4.88mM，抗体密度：0.084摩尔％，粒度：89.1±31.9纳米(PBS))。
实施例58
(1)hTRA-8scFv的制备
hTRA-8scFv 5B(缓冲剂：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，10％甘油，10mM CHAPS，1mM DTT)通过凝胶过滤纯化(柱：GEHEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱)用磷酸盐缓冲剂和500mM NaCl，pH 7.4缓冲替换。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入22毫克、7.73毫克和1.7毫克(摩尔比100∶66∶1.5)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入悬浮用的3毫升磷酸盐缓冲剂和500mM NaCl，pH 7.4以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLARLIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8scFv(125微克/毫升，800微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，200微升)以hTRA-8scFv∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶7.5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako PureChemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过凝胶过滤色谱法(AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；柱(GEHEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 20016/60制备级)；HEPES缓冲剂(pH 7.4)；4℃；2毫升/分钟；检测波长：UV 280nm)除去未反应的hTRA-8scFv以分离免疫脂质体级分(36-48毫升级分)。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，分子截留：50,000)进行超滤浓缩以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.58，抗体浓度：14微克/毫升，磷脂浓度：1.3mM，抗体密度：0.025摩尔％，平均粒度：91±16纳米(磷酸盐缓冲剂，500mM NaCl，pH 7.4))。
实施例59
(1)重组体可溶性TRAIL的硫醇化
将重组体可溶性TRAIL(Peprotech Inc.)(下文称作rsTRAIL(P))(150微克)溶解在10mM磷酸钠，140mM NaCl和1mM DTPA，pH 7.4中以将浓度调节至2毫克/毫升。以rsTRAIL(P)∶Traut′s试剂＝1∶1的摩尔比向其中加入在二甲亚砜中的400μM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)，然后在室温下反应90分钟。然后，通过使用Microcon(MILLIPORE INC.，分子截留：3,000；PBS，pH 7.4)超滤(1000-倍稀释)，除去Traut′s试剂以将rsTRAIL(P)中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)rsTRAIL(P)与脂质体的结合反应
如下使rsTRAIL(P)结合到脂质体上：将rsTRAIL(P)(1毫克/毫升，19.6微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，50微升)以rsTRAIL(P)∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶15的比率(摩尔比)混合以使rsTRAIL(P)的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升10mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使rsTRAIL(P)-未结合的马来酰亚胺失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的rsTRAIL(P)，重复至该储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中rsTRAIL(P)上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.59，蛋白质浓度：6微克/毫升，磷脂浓度：1.8mM，rsTRAIL(P)密度：0.011摩尔％，平均粒度：62纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例60
(1)rsTRAIL(P)的硫醇化
以与实施例59中相同的方式将rsTRAIL(P)中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)rsTRAIL(P)与脂质体的结合反应
如下使rsTRAIL结合到脂质体上：将rsTRAIL(P)(1毫克/毫升，58.8微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，50微升)以rsTRAIL(P)∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使rsTRAIL(P)的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入5微升10mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使rsTRAIL(P)-未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的rsTRAIL(P)，重复至该储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中rsTRAIL(P)上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.60，蛋白质浓度：9微克/毫升，磷脂浓度：1.1mM，rsTRAIL(P)密度：0.024摩尔％，平均粒度：73纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例61
(1)重组体可溶性TRAIL的硫醇化
将重组体可溶性TRAIL(Biodesign)(下文称作rsTRAIL(B))(200微克)溶解在10mM磷酸钠，140mM NaCl和1mM DTPA，pH 7.4中以将浓度调节至2毫克/毫升。以rsTRAIL(B)∶Traut′s试剂＝1∶1的摩尔比向其中加入在二甲亚砜中的400μM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)，然后在室温下反应90分钟。然后，通过使用Microcon(MILLIPORE INC.，分子截留：3,000；PBS，pH 7.4)超滤(1000-倍稀释)，除去Traut′s试剂以将rsTRAIL(B)中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)rsTRAIL(B)与脂质体的结合反应
如下使rsTRAIL(B)结合到脂质体上：将rsTRAIL(B)(1毫克/毫升，47微升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，40微升)以rsTRAIL∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶15的比率(摩尔比)混合以使rsTRAIL(B)的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入4微升10mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使rsTRAIL(B)-未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的rsTRAIL(B)，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中rsTRAIL(B)上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.61，蛋白质浓度：4微克/毫升，磷脂浓度：1.2mM，rsTRAIL密度：0.009摩尔％，平均粒度：63纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例62
(1)小鼠抗-hDR4抗体(m2E12)的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以m2E12∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到WO2003/37913的小册子中所述的由杂交瘤m2E12产生的小鼠抗-人DR4抗体m2E12(抗体浓度：1.8毫克/毫升，20mM磷酸盐缓冲剂，150mM NaCl，1mM DTPA，pH8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后，通过凝胶过滤色谱法(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；PBS，pH 7.4)除去Traut′s试剂以将m2E12中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将m2E12(0.77毫克/毫升，97.4微升)和该脂质体分散体(2mMDPPC，1000微升)以m2E12∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶40的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.62，抗体浓度：25微克/毫升，磷脂浓度：1.7mM，抗体密度：0.0059摩尔％，平均粒度：68±25纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例63
以与实施例62中相同的方式将m2E12中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将m2E12(0.77毫克/毫升，195微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以m2E12Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.63，抗体浓度：43微克/毫升，磷脂浓度：1.4mM，抗体密度：0.0122摩尔％，平均粒度：53±24纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例64
以与实施例62中相同的方式将m2E12中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将m2E12(0.77毫克/毫升，390微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以m2E12∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶10的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.64，抗体浓度：72微克/毫升，磷脂浓度：1.2mM，抗体密度：0.0247摩尔％，平均粒度：63±26纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例65
以与实施例62中相同的方式将m2E12中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将m2E12(0.77毫克/毫升，780微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以m2E12∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.65，抗体浓度：159微克/毫升，磷脂浓度：1.2mM，抗体密度：0.0510摩尔％，平均粒度：65±27纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例66
以与实施例62中相同的方式将m2E12中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例1的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将m2E12(0.77毫克/毫升，1950微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以m2E12∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶2的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(SartoriusMechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍。结果获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.66，抗体浓度：281微克/毫升，磷脂浓度：0.86mM，抗体密度：0.1296摩尔％，平均粒度：76±29纳米(PBS，pH 7.4))。
实施例67
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入45.12毫克、12.89毫克和2.17毫克(摩尔比100∶66∶1)的二(二十二碳酰基)磷脂酰胆碱(下文称作DDOPC；Sigma-Aldrich，Inc.)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTOCHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DDOPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为800纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.66毫升)和该脂质体分散体(10mMDDOPC，0.6毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.67，抗体浓度：77微克/毫升，磷脂浓度：0.15mM，抗体密度：0.556摩尔％，平均粒度：896.8±70.8纳米(PBS))。
实施例68
(1)hTRA-8Fab’的制备
临使用前以与实施例42的段落(1)中相同的方式制备hTRA-8Fab’。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入44.92毫克、12.89毫克和2.17毫克(摩尔比100∶66∶1)的二芥酰基(dierucoyl)磷脂酰胆碱(下文称作DEPC；NOF CORPORATION，COATSOME MC-2121AL)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOF CORPORATION，SUNBRIGHTDSPE-034MA)were，向其中加入3毫升溶解用的氯仿(KANTOCHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入5毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DEPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLAR LIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。
(3)抗体与脂质体的结合
将hTRA-8Fab′(1毫克/毫升，0.66毫升)和该脂质体分散体(10mMDEPC，0.6毫升)以hTRA-8Fab′∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶5的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。通过加入6微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fab′以获得本免疫脂质体，其中抗体上的半胱氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.68，抗体浓度：393微克/毫升，磷脂浓度：5.64mM，抗体密度：0.076摩尔％，平均粒度：91.7±33.7纳米(PBS))。
实施例69
(1)hTRA-8F(ab′)2的硫醇化
以与实施例43的段落(1)中相同的方式将F(ab′)2中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。此外，临使用前以与实施例41的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
通过下列步骤进行该抗体与脂质体的结合反应：将hTRA-8F(ab′)2(1毫克/毫升，2.686毫升)和该脂质体分散体(10mM DPPC，11毫升)以hTRA-8F(ab′)2∶DSPE-PEG2000-Mal＝1∶45的比率(摩尔比)混合以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团反应。
通过加入110微升100mM巯基乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(其为DSPE-PEG2000-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经聚醚砜膜(PelliconXL 50，Biomax 300，分子截留：300,000，MILLIPORE INC.)超滤(LabScale TFF System(MILLIPORE INC.))，除去未反应的hTRA-8F(ab′)2以获得本免疫脂质体，其中抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合(脂质体组成：表2的No.69，抗体浓度：128微克/毫升，磷脂浓度：10.08mM，抗体密度：0.0069摩尔％，平均粒度：87.6±18.1纳米(PBS))。
实施例70
(1)m2E12Fullbody和hTRA-8Fullbody的硫醇化
将4mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫代仿·HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以各抗体(m2E12或hTRA-8)∶Traut′s试剂＝1∶4的摩尔比添加到m2E12Fullbody和hTRA-8Fullbody(抗体浓度：1.8毫克/毫升，20mM磷酸盐缓冲剂，150mM NaCl，2mM DTPA，pH 8.0)中，然后在室温下反应90分钟。然后通过凝胶过滤色谱法(柱：GE HEALTHCARE INC.，PD-10脱盐柱；PBS，pH 7.4)除去Traut′s试剂以将m2E12Fullbody和hTRA-8Fullbody中的一些赖氨酸残基的氨基硫醇化。
(2)脂质体的制备
在茄形烧瓶中分别称入44毫克、15.4毫克和2.6毫克(摩尔比100∶66∶1)的L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(下文称作DPPC；NOFCORPORATION，COATSOME MC-6060)、胆甾醇(Sigma-Aldrich，Inc.)和分子量大约3400的在聚乙二醇末端具有马来酰亚胺基团的聚(乙二醇)琥珀酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(下文称作DSPE-PEG3400-Mal；NOFCORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)，向其中加入6毫升溶解用的氯仿(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)。接着，在减压下馏出氯仿，由此在烧瓶内壁上形成脂质薄层。向这种脂质薄层中加入6毫升悬浮用的PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)以获得粗制脂质体(DPPC浓度：10mM)分散体。随后，使用挤出机(The Mini-Extruder，AvantiPOLAR LIPID，INC.)从孔径为100纳米的聚碳酸酯膜(Avanti POLARLIPID，INC.)中反复挤出这种脂质体分散体以制造具有适当粒度的脂质体。用PBS，pH 7.4将这种10mM DPPC分散体的浓度调节至2mM。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将m2E12Fullbody(0.77毫克/毫升，195微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以m2E12Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12，重复至储液稀释1000倍，以将该分散体的体积调节至1毫升。在这种阶段中，收集该分散体的等分试样，并量化该脂质体结合的m2E12的蛋白质含量和该脂质体的脂质含量。随后，将hTRA-8Fullbody(0.77毫克/毫升，584微升)和所得脂质体分散体以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝3∶20的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8Fullbody，重复至储液稀释1000倍，以获得本免疫脂质体，其中这两种抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合。量化本免疫脂质体分散体的总抗体浓度和脂质浓度，并由总抗体含量和m2E12抗体含量计算各抗体含量(脂质体组成：表2的No.70，抗体浓度：40微克/毫升(m2E12)和139微克/毫升(hTRA-8)，m2E12∶hTRA-8的抗体比＝22∶78，磷脂浓度：1.15mM，总抗体密度：0.062摩尔％(PBS))。
实施例71
以与实施例70的段落(1)中相同的方式对m2E12Fullbody和hTRA-8Fullbody施以硫醇化。此外，临使用前以与实施例70的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fullbody(0.77毫克/毫升，195微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶20的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8，重复至储液稀释1000倍，以将该分散体的体积调节至1毫升。在这种阶段中，收集该分散体的等分试样并量化该脂质体结合的hTRA-8的蛋白质含量和该脂质体的脂质含量。随后，将m2E12Fullbody(0.77毫克/毫升，584微升)和所得脂质体分散体以m2E12Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝3∶20的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12 Fullbody was removed，重复至储液稀释1000倍，以获得本免疫脂质体，其中这两种抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合。量化本免疫脂质体分散体的总抗体浓度和脂质浓度，并由总抗体含量和hTRA-8抗体含量计算各抗体含量(脂质体组成：表2的No.71，抗体浓度：93微克/毫升(m2E12)和74微克/毫升(hTRA-8)，m2E12∶hTRA-8的抗体比＝56∶44，磷脂浓度：1.14mM，总抗体密度：0.058摩尔％(PBS))。
实施例72
以与实施例70的段落(1)中相同的方式对m2E12 Fullbody和hTRA-8Fullbody施以硫醇化。此外，临使用前以与实施例70的段落(2)中相同的方式制备脂质体分散体。
(3)抗体与脂质体的结合反应
将hTRA-8Fullbody(0.77毫克/毫升，78微升)和该脂质体分散体(2mM DPPC，1000微升)以hTRA-8Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝1∶50的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的hTRA-8，重复至储液稀释1000倍，以将该分散体的体积调节至1毫升。在这种阶段中，收集该分散体的等分试样并量化该脂质体结合的hTRA-8的蛋白质含量和该脂质体的脂质含量。随后，将m2E12Fullbody(0.77毫克/毫升，701微升)和所得脂质体分散体以m2E12Fullbody∶DSPE-PEG3400-Mal＝9∶50的比率(摩尔比)混合并在室温下反应2小时以使该抗体的硫醇基团与该脂质体上的PEG链的末端马来酰亚胺基团结合。通过加入2微升100mM巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(其为DSPE-PEG3400-Mal的10当量)和随后在室温下反应30分钟，使抗体未结合的马来酰亚胺基团失活。通过经VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分子截留：300,000)超滤，除去未反应的m2E12 Fullbody，重复至储液稀释1000倍，以获得本免疫脂质体，其中这两种抗体上的赖氨酸残基与脂质体上的PEG的末端结合。量化本免疫脂质体分散体的总抗体浓度和脂质浓度，并由总抗体含量和hTRA-8抗体含量计算各抗体含量(脂质体组成：表2的No.72，抗体浓度：155微克/毫升(m2E12)和39微克/毫升(hTRA-8)，m2E12∶hTRA-8的抗体比＝80∶20，磷脂浓度：1.57mM，总抗体密度：0.049摩尔％(PBS))。
实施例32至72中制备的免疫脂质体的组分组成显示在表2中。
[表2]
Figure GPA00001087506101171
试验例1
实施例1、2和3中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
通过锥虫蓝染色法计数Jurkat细胞，然后用含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的DMEM培养基(Invitrogen Corp.制造；下文称作DMEM培养基)将该浓度调节至1×105个细胞/毫升。
将抗体浓度预先用DMEM培养基调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的免疫脂质体溶液或抗体浓度预先用1微克/毫升二抗溶液(山羊抗-人IgG Fc抗体，MPBiomedicals Inc.制造)调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的hTRA-8溶液以50微升/孔的量每组三行地添加至96孔微板(Corning Inc.制造)中。向这种微孔板中，以50微升(5×103个细胞)/孔的量接种细胞悬浮液。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养72小时，并测量各孔的ATP含量。在ATP含量测量中，使用荧光素酶发光试剂(CellTiter Glo，Promega Corp.制造)并根据本文所含的程序进行测量。具体而言，将由细胞溶解产物组分和发光底物组分构成的试验溶液以100微升/孔的量添加到该板中并搅拌。然后，将该上清液以100微升/孔的量转移到96孔白色微板(Corning Inc.制造)中，并使用光度计(Molecular Devices Corp.制造)测量各孔的发光。使用补充了DMEM培养基和细胞悬浮液的孔作为阴性对照孔，并使用仅补充了DMEM培养基的孔作为背景孔。根据下列公式计算各孔的细胞生存力：细胞生存力(％)＝(试验孔的发光强度-背景孔的平均发光强度)/(阴性对照孔的平均发光强度-背景孔的平均发光强度)×100。
结果显示在图1中。实施例1、2和3中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例2和3中制备的免疫脂质体在1、10、100或1000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例2
实施例19、20和21中制备的免疫脂质体对A375细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200或20纳克/毫升(最终浓度：1000、100或10纳克/毫升)并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图2中。实施例19、20和21中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对A375细胞的细胞凋亡诱导活性。hTRA-8对A375细胞表现出的细胞凋亡诱导活性弱，但可以通过使hTRA-8结合到免疫脂质体上来增强。实施例19、20和21中制备的免疫脂质体表现出在100纳克/毫升的浓度下80％或更小的细胞生存力和在1000纳克/毫升的浓度下40％或更小的细胞生存力。实施例19中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例3
实施例8、10、12、14和16中制备的免疫脂质体对A375细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200或20纳克/毫升(最终浓度：1000、100或10纳克/毫升)并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图3中。实施例8、10、12、14和16中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对A375细胞的细胞凋亡诱导活性。hTRA-8对A375细胞表现出的细胞凋亡诱导活性弱，但可以通过使hTRA-8结合到免疫脂质体上来增强。实施例8、10、12、14和16中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出60％或更小的细胞生存力。实施例8和16中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出40％或更小的细胞生存力。实施例8中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例4
实施例7、9、11、13和15中制备的免疫脂质体对A2058细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对人恶性黑色素瘤细胞株A2058细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200或20纳克/毫升(最终浓度：1000、100或10纳克/毫升)并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图4中。实施例7、9、11、13和15中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对A2058细胞的细胞凋亡诱导活性。HTRA-8对A2058细胞表现出的细胞凋亡诱导活性弱，但可以通过使hTRA-8结合到免疫脂质体上来增强。实施例9、11和15中制备的免疫脂质体在100纳克/毫升的浓度下表现出60％或更小的细胞生存力。实施例11和15中制备的免疫脂质体在100纳克/毫升的浓度下表现出40％或更小的细胞生存力。实施例15中制备的免疫脂质体在100纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。实施例7、9、11、13和15中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例5
实施例26、27、28、29、30和31中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)并将免疫脂质体和hHFE7A的抗体浓度调节至26、2.6、0.26或0.026nM(最终浓度：13、1.3、013或0.013nM)。用于交联hHFE7A的二抗(山羊抗-人IgG Fc抗体)由BioSource International Inc制造。
结果显示在图5中。实施例26、27、28、29、30和31中制备的免疫脂质体表现出与二抗-交联的hHFE7A相等或更强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。
试验例6
实施例4、17和18中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
通过锥虫蓝染色法计数Jurkat细胞，然后用含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)将该浓度调节至2×105个细胞/毫升。将抗体浓度预先用RPMI培养基调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的免疫脂质体溶液或抗体浓度预先用1微克/毫升二抗溶液(山羊抗-人IgG Fc抗体，MP Biomedicals Inc.制造)调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的hTRA-8溶液以50微升/孔的量每组三行地添加至96孔微板(Corning Inc.制造)中。向这种微孔板中，以50微升(1×104个细胞)/孔的量接种细胞悬浮液。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养72小时并测量各孔中细胞的细胞内脱氢酶活性，由此计算活细胞数。在细胞内脱氢酶活性测量中，使用WST-8试剂(活细胞计数试剂SF，Nacalai Tesque)并根据本文所含的程序进行测量。具体而言，以10微升/孔的浓度加入WST-8，通过使用吸收计(Molecular Devices Corp.制造)在450纳米下测量formazan的吸光度，量化通过用细胞内脱氢酶还原WST-8而生成的formazan的量。使用补充了RPMI1640培养基和细胞悬浮液的孔作为阴性对照孔，并使用仅补充了RPMI1640培养基的孔作为背景孔。根据下列公式计算各孔的细胞生存力：细胞生存力(％)＝(试验孔的吸光度-背景孔的平均吸光度)/(阴性对照孔的平均吸光度-背景孔的平均吸光度)×100。
结果显示在图6中。实施例4、17和18中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例4、17和18中制备的免疫脂质体表现出在10纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在100或1000纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例7
实施例22和23中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图7中。实施例22和23中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例22和23中制备的免疫脂质体表现出在0.1纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在1、10、100或1000纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例8
实施例24中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至200、20、2或0.2纳克/毫升(最终浓度：100、10、1或0.1纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图8中。实施例24中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例24中制备的免疫脂质体表现出在1纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在10或100纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例9
实施例25中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至200、20、2或0.2纳克/毫升(最终浓度：100、10、1或0.1纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图9中。实施例25中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例25中制备的免疫脂质体表现出在0.1纳克/毫升的浓度下70％或更小的细胞生存力和在1、10或100纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例10
实施例5和6中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至200、20、2或0.2纳克/毫升(最终浓度：100、10、1或0.1纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图10中。实施例5和6中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例5中制备的免疫脂质体在0.1纳克/毫升的浓度下表现出70％或更小的细胞生存力。实施例6中制备的免疫脂质体在0.1纳克/毫升的浓度下表现出40％或更小的细胞生存力。此外，实施例5和6中制备的免疫脂质体在1、10或100纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例11
实施例3和20中制备的免疫脂质体对来自关节风湿病患者的滑膜细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
将来自关节风湿病患者的冷冻滑膜细胞(Cell Applications，Inc.)悬浮在滑膜细胞培养基(Cell Applications，Inc.制造，下文称作培养基)中，并通过锥虫蓝染色法技术，然后用培养基将该浓度调节至2×104个细胞/毫升。将该细胞悬浮液以50微升(1×103个细胞)/孔的量接种到96-孔微板(Corning Inc.制造)中。同时，将用培养基稀释至2000、200、20或2纳克/毫升抗体浓度的免疫脂质体溶液或hTRA-8以50微升/孔的量添加到该板中。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养过夜，然后测量各孔的ATP含量。在ATP含量测量中，使用荧光素酶发光试剂(CellTiter Glo，Promega Corp.制造)并根据本文所含的程序进行测量。具体而言，将由细胞溶解产物组分和发光底物组分构成的试验溶液以100微升/孔的量添加到该板中并搅拌。然后，将该上清液以100微升/孔的量转移到96孔白色微板(Corning Inc.制造)中，并使用光度计(Molecular Devices Corp.制造)测量各孔的发光。使用补充了培养基代替免疫脂质体溶液的的孔作为阴性对照孔并使用仅补充了培养基而没有接种细胞的孔作为背景孔。根据下列公式计算各孔的细胞生存力：细胞生存力(％)＝(试验孔的发光强度一背景孔的平均发光强度)/(阴性对照孔的平均发光强度-背景孔的平均发光强度)×100。
结果显示在图11中。实施例3和20中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对来自关节风湿病患者的滑膜细胞的细胞凋亡诱导活性。实施例3中制备的免疫脂质体在1000纳克/毫升的浓度下表现出50％或更小的细胞生存力。
试验例12
实施例5中制备的免疫脂质体对人克隆癌细胞株COLO 205-移植的裸鼠的抗肿瘤活性的测量
研究实施例5中制备的免疫脂质体的体内抗肿瘤活性。将通过检疫证实没有可检出的小鼠致病微生物的人克隆癌细胞株COLO 205(购自American Type Culture Collection)的2×106个细胞皮下移植至裸鼠BALB/cA Jcl-nu(CLEA Japan，Inc.)的腋区。实施例5的免疫脂质体在临给药之前用盐水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)稀释至1和0.33毫克/毫升抗体浓度。在移植后七天，开始将实施例5的免疫脂质体施用于带COLO 205癌的小鼠，在此肿瘤成功地移植。具体而言，在第7、9、11、14、16、18、21、23和25天，将脂质体溶液以0.1毫升/10克鼠体重的剂量静脉注射至带癌小鼠的尾部。
使用电子游标卡尺(CD-15C；Mitutoyo Corp.)每周2至3次测量移植肿瘤的长轴和短轴。根据下列计算式测定肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝1/2×短轴2(mm)×长轴(mm).
此外，计算各个体的肿瘤生长速率(立方厘米/天)，并使用该值通过Dunnett试验测试统计显著差异。在本文中，小于0.05的P值被认为是组之间的显著差异。
试验结果显示在图12中。实施例5的免疫脂质体表现出剂量依赖性抗肿瘤活性和表现出在10mg/kg剂量下具有统计显著差异的抗肿瘤活性。
试验例13
实施例32、33、34和35中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图13中。实施例32、33、34和35中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在0.1纳克/毫升的浓度下70％或更小的细胞生存力和在1、10、100或1000纳克/毫升的浓度下30％或更小的细胞生存力。
试验例14
实施例44、45、46、47、48和49中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图14中。实施例44、45、46、47、48和49中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在1纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例15
实施例50、51和52中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图15中。实施例50、51和52中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在0.1纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在1、10、100或1000纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例16
实施例53、54、55、56和57中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的图
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图16中。实施例53、54、55、56和57中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在1纳克/毫升的浓度下40％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下5％或更小的细胞生存力。
试验例17
实施例58中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1或0.1纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图17中。实施例58中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在1纳克/毫升的浓度下30％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下5％或更小的细胞生存力。
试验例18
实施例36和37中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；抗体浓度在免疫脂质体的情况下调节至2000、20或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、10或0.1纳克/毫升)和在MAB631的情况下用1微克/毫升二抗溶液(抗-小鼠IgG Fc)调节至2000、20或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、10或0.1纳克/毫升)；并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图18中。实施例36和37中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的MAB631强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在0.1纳克/毫升的浓度下50％或更小的细胞生存力和在10或1000纳克/毫升的浓度下5％或更小的细胞生存力。
试验例19
实施例38和39中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；抗体浓度在免疫脂质体的情况下调节至2000、20或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、10或0.1纳克/毫升)和在MAB6311的情况下用1微克/毫升二抗溶液(抗-小鼠IgG Fc)调节至2000、20或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、10或0.1纳克/毫升)；并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图19中。实施例38和39中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的MAB6311强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在0.1纳克/毫升的浓度下40％或更小的细胞生存力和在10或1000纳克/毫升的浓度下5％或更小的细胞生存力。
试验例20
实施例59和60中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量。
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和rsTRAIL的蛋白质浓度调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)；并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图20中。实施例59和60中制备的免疫脂质体表现出比rsTRAIL强的对Jurkat细胞强的细胞凋亡诱导活性并表现出在1纳克/毫升的浓度下70％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下20％或更小的细胞生存力。
试验例21
实施例61中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和rsTRAIL的蛋白质浓度调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)；并使用每组两行进行该实验。
结果显示在图21中。实施例61中制备的免疫脂质体表现出比rsTRAIL强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并在10、100或1000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例22
实施例41、42、43和69中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2、0.2或0.02纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图22中。实施例41、42、43和69中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在0.1纳克/毫升的浓度下80％或更小的细胞生存力，在1纳克/毫升的浓度下40％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下10％或更小的细胞生存力。
试验例23
实施例67和68中制备的免疫脂质体对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
根据试验例1中所述的方法测量对T-细胞白血病-淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性。但是，所用培养基是含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)；将免疫脂质体和hTRA-8的抗体浓度调节至2000、200、20、2或0.2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10、1或0.1纳克/毫升)；并使用每组三行进行该实验。
结果显示在图23中。实施例68中制备的免疫脂质体表现出比二抗-交联的hTRA-8强的对Jurkat细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在1纳克/毫升的浓度下30％或更小的细胞生存力和在10、100或1000纳克/毫升的浓度下5％或更小的细胞生存力。
试验例24
实施例40中制备的免疫脂质体对WR19L12a细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
通过锥虫蓝染色法计数WR19L12a细胞，然后用含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)将该浓度调节至1×105个细胞/毫升。将抗体浓度预先用RPMI培养基调节至10、1、0.1或0.01微克/毫升(最终浓度：5、0.5、0.05或0.005微克/毫升)的免疫脂质体溶液或抗体浓度预先用0.6微克/毫升rProteinG(Sigma-Aldrich，Inc.制造)调节至10，1、0.1或0.01微克/毫升(最终浓度：5、0.5、0.05或0.005微克/毫升)的DX2溶液以50微升/孔的量每组三行地添加至96孔微板(Corning Inc.制造)中。向这种微孔板中，以50微升(5×103个细胞)/孔的量接种细胞悬浮液。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养72小时，并根据试验例1中所述的方法测量各孔的ATP含量。但是，使用补充了含PBS的RPMI培养基和细胞悬浮液的孔作为阴性对照孔，并使用仅补充了RPMI培养基的孔作为背景孔。
结果显示在图24中。实施例40中制备的免疫脂质体表现出比DX2强的对WR19L12a细胞的细胞凋亡诱导活性并在500或5000纳克/毫升的浓度下表现出20％或更小的细胞生存力。
试验例25
实施例62、64、65和66中制备的免疫脂质体对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
通过锥虫蓝染色法计数Alexander细胞，然后用含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)将该浓度调节至2×104个细胞/毫升。将抗体浓度预先用RPMI培养基调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的免疫脂质体溶液或抗体浓度预先用3.6微克/毫升二抗溶液(山羊抗-小鼠IgG Fc，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造)调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的m2E12溶液以50微升/孔的量每组三行地添加至96孔微板(Corning Inc.制造)中。向这种微孔板中，以50微升(1×103个细胞)/孔的量接种细胞悬浮液。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养72小时，并根据试验例1中所述的方法测量各孔的ATP含量。
结果显示在图25中。实施例62、64、65和66中制备的免疫脂质体表现出比m2E12强的对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在100纳克/毫升的浓度下70％或更小的细胞生存力和在1000纳克/毫升的浓度下50％或更小的细胞生存力。
试验例26
实施例70、71和72中制备的免疫脂质体对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性的测量
通过锥虫蓝染色法计数Alexander细胞，然后用含有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.制造)的RPMI培养基(Invitrogen Corp.制造)将该浓度调节至2×104个细胞/毫升。将抗体浓度预先用RPMI培养基调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)的免疫脂质体溶液或抗体浓度预先用3.6微克/毫升二抗溶液(山羊抗-鼠IgG Fc，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造)调节至2000纳克/毫升的m2E12溶液和抗体浓度预先用1微克/毫升二抗溶液(山羊抗-人IgG Fc，MP Biomedicals Inc.制造)调节至2000纳克/毫升的hTRA-8溶液的m2E12/hTRA-8混合溶液——该m2E12溶液和该hTRA-8溶液以22∶78、56∶44或80∶20的比率混合，并将该浓度调节至2000、200、20或2纳克/毫升(最终浓度：1000、100、10或1纳克/毫升)——以50微升/孔的量每组三行地添加至96孔微板(Corning Inc.制造)中。向这种微孔板中，以50微升(1×103个细胞)/孔的量接种细胞悬浮液。该板在5％二氧化碳存在下在37℃下培养24小时，并根据试验例1中所述的方法测量各孔的ATP含量。
结果显示在图26中。实施例70、71和72中制备的免疫脂质体表现出比调节至相应比率的抗体强的对Alexander细胞的细胞凋亡诱导活性并表现出在10纳克/毫升的浓度下60％或更小的细胞生存力和在100或1000纳克/毫升的浓度下10％或更小的细胞生存力。
试验例27
由试验例1至26计算免疫脂质体或对照抗体使细胞生存力降至50％的浓度。结果显示在表3中(只描述试验例1、6至10、13至23和26，因为可以测定这些实施例的对照抗体的50％细胞生存力)。在该表中，EC50代表表现出50％细胞生存力的浓度。此外，EC50 Ab/IL代表将对照抗体的致50％细胞生存力的浓度除以各免疫脂质体的致50％细胞生存力的浓度而得的值。大多数免疫脂质体表现出为对照抗体的1/10或更小的致50％细胞生存力浓度。甚至在免疫脂质体表现出低的细胞凋亡诱导活性的试验例19中，该免疫脂质体的致50％细胞生存力浓度也为对照抗体的1/2.5或更小。在试验例7、9、13至16、18和22中，其为对照抗体的1/100或更小。
[表3]
Figure GPA00001087506101321
Figure GPA00001087506101331
工业适用性
本发明提供用于癌症治疗的药物组合物和用于自体免疫性疾病或炎症治疗的药物组合物，其包含含有特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体的免疫脂质体。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO：1-人工序列的描述：人源化TRA-8的重链氨基酸序列
SEQ ID NO：2-人工序列的描述：人源化TRA-8的轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：3-人工序列的描述：人源化HFE7A的重链氨基酸序列
SEQ ID NO：4-人工序列的描述：人源化HFE7A的轻链氨基酸序列
[序列表]
序列表
 
<110>Daiichi Sankyo Co.，Ltd.
 
<120>在表达含死亡结构域的受体的细胞中诱导细胞凋亡的免疫脂质体
 
<130>FP0830
 
<160>4
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化TRA-8的重链氨基酸序列
 
<220>
<223>发明人：Morita，Koji；Niwa，Takako；Ichikawa，Kimihisa
<223>发明人：Yoshida，Hiroko
 
<220>
 
<400>1
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1         5            10            15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
       20           25             30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
     35          40             45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
  50          55               60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65           70            75           80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
         85            90            95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
      100            105           110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    115            120           125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
  130            135           140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145          150            155          160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
          165           170            175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
       180           185            190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
     195           200           205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
  210           215           220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225          230            235           240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
          245           250          255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
       260           265           270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
     275           280          285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
  290           295           300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305           310           315           320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
         325            330           335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
       340             345         350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    355           360           365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
  370           375           380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385          390            395          400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
          405          410           415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
       420           425           430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    435           440            445
Lys
 
<210>2
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化TRA-8的轻链氨基酸序列
 
<400>2
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1          5           10            15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
      20             25           30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    35            40           45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
  50            55           60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65           70            75           80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
         85            90            95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
      100            105           110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
    115             120           125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
  130            135           140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145           150           155          160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
          165           170          175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
        180          185          190
Cys Glu ValThr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
    195          200            205
Asn Arg Gly Glu Cys
  210
 
<210>3
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化HFE7A的重链氨基酸序列
 
<400>3
 
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1         5             10           15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
       20            25          30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
     35           40           45
Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
  50            55           60
Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65           70           75            80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser
         85            90           95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
       100           105           110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp
    115            120           125
Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
  130           135           140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145           150          155            160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
          165           170          175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
        180          185           190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
     195           200           205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
  210           215           220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225          230           235            240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
         245          250             255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
      260            265          270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    275            280          285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
   290           295          300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305          310            315          320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
         325            330           335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
      340            345            350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
   355              360            365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
  370           375           380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385           390           395          400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
          405           410           415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
       420           425           430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    435           440           445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465           470
 
<210>4
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人源化HFE7A的轻链氨基酸序列
 
<400>4
Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly
1         5             10           15
Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
       20            25            30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
     35           40           45
Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
  50           55           60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly
65           70           75             80
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
          85           90             95
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
       100            105           110
Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
     115          120           125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
   130           135           140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145          150           155           160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
         165           170            175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
      180           185            190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
 195           200                 205Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu  2l0           215                 220Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225           230                 235

Claims (53)

1.含有下列组分(a)和(b)并特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的免疫脂质体：
(a)特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体、该抗体的功能片段、或包含该抗体的重链和轻链互补决定区并特异性结合到该细胞表面受体上的多肽；和
(b)两亲成囊泡脂质。
2.根据权利要求1的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出细胞凋亡诱导活性。
3.根据权利要求1或2的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞体外表现出的细胞凋亡诱导活性等于或强于通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该活性。
4.根据权利要求1至3任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出的致50％细胞生存力浓度为通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该浓度的1/2.5或更小。
5.根据权利要求1至4任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体对表达参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体的细胞表现出的致50％细胞生存力浓度为通过特异性结合到该细胞表面受体上的抗体的全长分子经二抗或抗体结合蛋白如蛋白质G或A交联而体外表现出的该浓度的1/10或更小。
6.根据权利要求1至5任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体含有特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体，其中该抗体是全长抗体分子。
7.根据权利要求6的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.23摩尔％的抗体密度含有该全长抗体分子。
8.根据权利要求7的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.002摩尔％至0.14摩尔％的抗体密度含有该全长抗体分子。
9.根据权利要求1至5任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体功能片段是F(ab′)2。
10.根据权利要求9的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.23摩尔％的抗体密度含有F(ab′)2。
11.根据权利要求10的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.006摩尔％至0.11摩尔％的抗体密度含有F(ab′)2。
12.根据权利要求1至5任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体功能片段是Fab′。
13.根据权利要求12的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至0.94摩尔％的抗体密度含有Fab′。
14.根据权利要求13的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.005摩尔％至0.56摩尔％的抗体密度含有Fab′。
15.根据权利要求1至14任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是嵌合抗体。
16.根据权利要求1至14任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是人源化抗体。
17.根据权利要求1至14任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的抗体是人抗体。
18.根据权利要求1至5任一项的免疫脂质体，其特征在于特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的多肽是单链可变区片段抗体。
19.根据权利要求18的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.000014摩尔％至1.8摩尔％的抗体密度含有该单链可变区片段抗体。
20.根据权利要求19的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.005摩尔％至0.56摩尔％的抗体密度含有该单链可变区片段抗体。
21.根据权利要求1至20任一项的免疫脂质体，其特征在于参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体是含死亡结构域的受体。
22.根据权利要求21的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体选自Fas、DR4、DR5和TNF受体。
23.根据权利要求22的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是DR5。
24.根据权利要求22的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是DR4。
25.根据权利要求22的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体是Fas。
26.根据权利要求23的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含由序列表中所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸残基1至118构成的重链可变区序列和由序列表中所述的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸残基1至107构成的轻链可变区序列。
27.根据权利要求24的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含选自由杂交瘤m2E12产生的抗体、结合到与该抗体相同的表位上的抗体和该抗体的人源化抗体的抗体的重链和轻链可变区。
28.根据权利要求25的免疫脂质体，其特征在于该抗体分子或抗体功能片段包含由序列表中所述的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基1至139构成的重链可变区序列和由序列表中所述的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基1至131构成的轻链可变区序列。
29.含有下列组分(a)和(b)并特异性结合到参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体上的免疫脂质体：
(a)内源配体，其特异性结合到该细胞表面受体上并具有经由该受体或经由该内源配体的功能片段诱导细胞凋亡的活性；和
(b)两亲成囊泡脂质。
30.根据权利要求29的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体表现出比该内源配体强的对表达该细胞表面受体的细胞的细胞凋亡诱导活性。
31.根据权利要求29或30的免疫脂质体，其特征在于该细胞表面受体是含死亡结构域的受体。
32.根据权利要求31的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体选自Fas、DR4、DR5和TNF受体。
33.根据权利要求32的免疫脂质体，其中该含死亡结构域的受体的内源配体是TRAIL或Fas配体。
34.根据权利要求1至33任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体含有甾醇和磷脂作为脂质成分。
35.根据权利要求34的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的甾醇是胆甾醇。
36.根据权利要求35的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的20摩尔％至50摩尔％的含量含有胆甾醇作为该免疫脂质体的脂质成分之一。
37.根据权利要求34至36任一项的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的磷脂是磷脂酰胆碱。
38.根据权利要求37的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分的磷脂酰胆碱含有具有14至22个碳原子的酰基。
39.根据权利要求38的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分的磷脂酰胆碱含有具有14至18个碳原子的酰基。
40.根据权利要求34至39任一项的免疫脂质体，其中该免疫脂质体进一步含有亲水聚合物或该亲水聚合物的脂质衍生物作为脂质成分。
41.根据权利要求40的免疫脂质体，其特征在于该亲水聚合物的脂质衍生物中的亲水聚合物具有500至20000的平均分子量。
42.根据权利要求41的免疫脂质体，其特征在于该亲水聚合物的脂质衍生物中的亲水聚合物具有2000至5000的平均分子量。
43.根据权利要求40至42任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的0.1摩尔％至10摩尔％的含量含有该亲水聚合物的脂质衍生物。
44.根据权利要求43的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体以总脂质摩尔数的1摩尔％至6摩尔％的含量含有该亲水聚合物的脂质衍生物。
45.根据权利要求40至44任一项的免疫脂质体，其特征在于作为该免疫脂质体的脂质成分之一的该亲水聚合物的脂质衍生物是聚乙二醇改性的脂质。
46.根据权利要求34至44任一项的免疫脂质体，其特征在于使用具有末端马来酰亚胺基团的脂质或亲水聚合物经由硫醚键将该脂质体与抗体缀合。
47.根据权利要求1至46任一项的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体具有30至1000纳米的平均粒度。
48.根据权利要求47的免疫脂质体，其特征在于该免疫脂质体具有30至200纳米的平均粒度。
49.根据权利要求1至48任一项的免疫脂质体，其特征在于将具有抗肿瘤活性的药物包封在该脂质体中。
50.根据权利要求1至48任一项的免疫脂质体，其特征在于将对自体免疫性疾病或炎症具有治疗作用的药物包封在该脂质体中。
51.包含根据权利要求1至50任一项的免疫脂质体作为活性成分的药物组合物。
52.包含根据权利要求1至49任一项的免疫脂质体作为活性成分的抗肿瘤药。
53.包含根据权利要求1至48和50任一项的免疫脂质体作为活性的自体免疫性疾病或炎症治疗剂。
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