CN115181720B - 一种无血清培养基及其应用、一种cho细胞表达重组抗体的构建方法 - Google Patents

一种无血清培养基及其应用、一种cho细胞表达重组抗体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及细胞培养与重组抗体的技术领域，具体公开了一种无血清培养基及其应用、一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法。上述无血清培养基包含有基础培养基；所述无血清培养基还包含以下组分作为补充因子：卵磷脂、硫酸胆碱、胰岛素、转铁蛋白、柠檬酸铁、丙酮酸钠、乙醇胺、七水硫酸锌、偏硅酸钠、五水硫酸铜、亚硒酸钠、硫酸镍、六水氯化铝；所述无血清培养基还包含以下浓度的组分作为功能性添加物：烟酸肌醇脂50‑100mg/L、胆固醇亚麻酸盐12‑24mg/L、月桂醇硫酸钠0.08‑0.2 mg/L。将本申请提供的无血清培养基用于CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，能够有效提高CHO细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。

Description

一种无血清培养基及其应用、一种CHO细胞表达重组抗体的构 建方法
技术领域
本申请涉及细胞培养的技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其应用、一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法。
背景技术
CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycells)，具有不死性，可以传代培养上百代，是生物技术药物研发重要的工程抗体和重组蛋白的表达系统，也是工业大规模化生产中最常见的细胞株，被广泛作为外源基因的宿主生产蛋白药物。CHO细胞具有转录后准确的修饰功能，表达的糖基化蛋白在分子结构和生物学功能方面最接近天然分子蛋白；另外，CHO细胞属于成纤维细胞，细胞内源蛋白表达低，表达产物直接分泌到培养基中，便于收集目标表达产物。
传统的CHO细胞培养方式是在含有血清的培养基中贴壁生长，血清能够为细胞的生长增殖提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质。但是血清的成分复杂，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。另外，利用含血清培养基培养细胞获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍。因此，无血清培养基已成为哺乳动物细胞培养技术的发展方向。在工业化大规模生产中，细胞悬浮培养明显优于单层培养，是哺乳动物细胞大规模培养的首选模式。
目前，已有无血清培养基能培养CHO细胞长期传代，但难以获得较高的CHO细胞密度和细胞活性。另外目前的无血清培养基用于CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，获得的重组抗体的表达量较低。
发明内容
为了能够提高细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量，本申请提供一种无血清培养基及其应用、一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法。
第一方面，本申请提供一种无血清培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清培养基，所述无血清培养基包含DMEM/F12作为基础培养基；
所述无血清培养基包含以下浓度的组分作为补充因子：卵磷脂3-6mg/L、硫酸胆碱10-40mg/L、胰岛素0.1-10mg/L、转铁蛋白5-50mg/L、柠檬酸铁20-80mg/L、丙酮酸钠5-10mg/L、乙醇胺1-10mg/L、七水硫酸锌0.5-5mg/L、偏硅酸钠0.02-0.4mg/L、五水硫酸铜0.012-0.12mg/L、亚硒酸钠0.02-0.08mg/L、硫酸镍0.0004-0.004mg/L、六水氯化铝0.0006-0.006mg/L；
所述无血清培养基包含以下浓度的组分作为功能性添加物：烟酸肌醇脂50-100mg/L、胆固醇亚麻酸盐12-24mg/L、月桂醇硫酸钠0.08-0.2mg/L。
本申请通过在商品化的基础培养基中加入补充因子和功能性添加物，提供了一种无血清培养基，并用于CHO细胞的无血清培养方法和CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，能够有效提高CHO细胞的细胞密度和细胞活力，同时能够有效提高重组抗体的表达量。因此，本申请提供的无血清培养基适合工业化高密度、高活性悬浮培养CHO细胞，且适合用于CHO细胞高密度长期表达重组抗体的构建方法中。
细胞的细胞膜含有大量的细胞脂质，作为细胞中细胞膜的结构组分，脂类在运输和信号系统中起着重要的作用。本申请使用的胆固醇亚麻酸盐属于脂类物质，有利于细胞的悬浮培养，能够提高细胞在无血清培养条件下的存活率和生产力；另外本申请发现将烟酸肌醇脂、月桂醇硫酸钠与胆固醇亚麻酸盐作为无血清培养基中的功能性添加物，能够进一步提高CHO细胞培养过程中的细胞密度和细胞活性。
经过试验分析可知，相比于在基础培养基中加入10％的FBS组成含血清培养基，或者选择使用市售的CD CHO无血清培养基，用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，本申请通过在基础培养基DMEM/F12中加入补充因子和功能性添加物组成无血清培养基，用于CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，能够有效提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够有效提高重组抗体的表达量。
同时，经过试验分析可知，相比于选择使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠中的一种或者两种作为功能性添加物，本申请选择同时使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠作为功能性添加物，将制备得到的无血清培养基用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。
优选地，所述烟酸肌醇脂的浓度是60-90mg/L、所述胆固醇亚麻酸盐的浓度是15-21mg/L、所述月桂醇硫酸钠的浓度是0.12-0.16mg/L。
在一个具体的实施方案中，所述烟酸肌醇脂的浓度可以为50mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/L、100mg/L。
在一些具体的实施方案中，所述烟酸肌醇脂的浓度还可以为50-60mg/L、50-75mg/L、50-90mg/L、60-75mg/L、60-100mg/L、75-90mg/L、75-100mg/L、90-100mg/L。
在一个具体的实施方案中，所述胆固醇亚麻酸盐的浓度可以为12mg/L、15mg/L、18mg/L、21mg/L、24mg/L。
在一些具体的实施方案中，所述胆固醇亚麻酸盐的浓度还可以为12-15mg/L、12-18mg/L、12-21mg/L、15-18mg/L、15-24mg/L、18-21mg/L、18-24mg/L、21-24mg/L。
在一个具体的实施方案中，所述月桂醇硫酸钠的浓度可以为0.08mg/L、0.12mg/L、0.14mg/L、0.16mg/L、0.2mg/L。
在一些具体的实施方案中，所述月桂醇硫酸钠的浓度还可以为0.08-0.12mg/L、0.08-0.14mg/L、0.08-0.16mg/L、0.12-0.14mg/L、0.12-0.2mg/L、0.14-0.16mg/L、0.14-0.2mg/L、0.16-0.2mg/L。
经过试验分析可知，当控制功能性添加物中各组分的浓度在上述范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将功能性添加物中各组分的浓度控制在上述范围。
第二方面，本申请提供了上述无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：按照配方，称取所述补充因子和所述功能性添加物，充分溶解于所述基础培养基中；调节pH至6.6-7.2，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得所述无血清培养基。
第三方面，本申请提供了上述无血清培养基在CHO细胞培养领域以及CHO细胞表达重组抗体领域的应用。
优选地，所述CHO细胞选自CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-中的任意一种。
第四方面，本申请提供了一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法，所述构建方法中使用的培养基为上述无血清培养基。
优选地，所述CHO细胞表达重组抗体的构建方法，具体包括以下步骤：利用所述无血清培养基，对所述CHO细胞进行复苏与传代；利用转染试剂，将转染级质粒转染到所述CHO细胞中进行瞬时表达，之后通过Protein A亲和层析纯化，得到重组抗体蛋白。
优选地，所述转染试剂为浓度为1.5-2.5mg/mL的聚乙烯亚胺溶液。
在一个具体的实施方案中，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度可以为1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL。
在一些具体的实施方案中，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度还可以为1.5-2mg/mL、2-2.5mg/mL。
经过试验分析可知，当控制转染试剂聚乙烯亚胺溶液的浓度在上述范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将聚乙烯亚胺溶液的浓度控制在上述范围。
优选地，所述转染级质粒的浓度为1-1.5mg/mL。
在一个具体的实施方案中，所述转染级质粒的浓度可以为1mg/mL、1.25mg/mL、1.5mg/mL。
在一些具体的实施方案中，所述转染级质粒的浓度还可以为1-1.25mg/mL、1.25-1.5mg/mL。
经过试验分析可知，当控制转染级质粒的浓度在上述范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将转染级质粒的浓度控制在上述范围。
进一步地，所述转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比为2：(1.5-3.5)。
在一个具体的实施方案中，所述转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比可以为2：1.5、2：2.5、2：3.5。
在一些具体的实施方案中，所述转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比还可以为2：(1.5-2.5)、2：(2.5-3.5)。
经过试验分析可知，当控制转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比在上述范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将重链质粒和轻链质粒的重量比控制在上述范围。
综上所述，本申请的技术方案具体以下效果：
本申请通过使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠作为功能性添加物，与补充因子加入至基础培养基中，制备得到一种无血清培养基，将该无血清培养基用于CHO细胞的无血清培养方法和CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，能够有效提高CHO细胞的细胞密度和细胞活性，且能够有效提高重组抗体的表达量。本申请提供的无血清培养基适合用于工业化高密度培养CHO细胞，且适合用于CHO细胞高密度长期表达重组抗体的构建方法中。
本申请在无血清培养基的制备方法中，通过筛选与控制功能性添加物中烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠的浓度，进一步提高了CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且进一步提高了重组抗体的表达量。
本申请在CHO细胞表达重组抗体的构建方法中，通过筛选与控制转染试剂的浓度，转染级质粒的浓度以及转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比，进一步提高了CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且进一步提高了重组抗体的表达量。
具体实施方式
第一方面，本申请提供一种无血清培养基，包含有DMEM/F12(购买自Gibco公司)作为基础培养基；无血清培养基还包含以下浓度的组分作为补充因子：卵磷脂3-6mg/L、硫酸胆碱10-40mg/L、胰岛素0.1-10mg/L、转铁蛋白5-50mg/L、柠檬酸铁20-80mg/L、丙酮酸钠5-10mg/L、乙醇胺1-10mg/L、七水硫酸锌0.5-5mg/L、偏硅酸钠0.02-0.4mg/L、五水硫酸铜0.012-0.12mg/L、亚硒酸钠0.02-0.08mg/L、硫酸镍0.0004-0.004mg/L、六水氯化铝0.0006-0.006mg/L；无血清培养基还包含以下浓度的组分作为功能性添加物：烟酸肌醇脂50-100mg/L、胆固醇亚麻酸盐12-24mg/L、月桂醇硫酸钠0.08-0.2mg/L。
进一步地，功能性添加物包含以下浓度的组分：烟酸肌醇脂60-90mg/L、胆固醇亚麻酸盐15-21mg/L、月桂醇硫酸钠0.12-0.16mg/L。
第二方面，本申请提供了上述无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：按照配方，称取补充因子和功能性添加物，充分溶解于基础培养基中；调节pH至6.6-7.2，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得无血清培养基。
第三方面，本申请提供了上述无血清培养基在CHO细胞培养领域以及CHO细胞表达重组抗体领域的应用。
具体地，CHO细胞选自CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-中的任意一种。
第四方面，本申请提供了一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法，具体包括以下步骤：利用上述无血清培养基，对CHO-S细胞进行复苏与传代；利用转染试剂，将转染级质粒转染到CHO-S细胞中进行瞬时表达，之后通过Protein A亲和层析纯化，得到重组抗体蛋白。
其中，转染试剂为浓度为1.5-2.5mg/mL的聚乙烯亚胺溶液。
具体地，转染级质粒的浓度为1-1.5mg/mL。
进一步地，转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比为2：(1.5-3.5)。
以下结合制备例1-27、实施例1-25、对比例1-15以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
制备例
制备例1-25
制备例1-25分别提供了一种无血清培养基。
上述各制备例的不同之处在于：功能性添加物中各组分的添加量。具体如表1所示。
本制备例中无血清培养基的制备方法包括以下步骤：
称取卵磷脂4mg、硫酸胆碱25mg、胰岛素5mg、转铁蛋白25mg、柠檬酸铁50mg、丙酮酸钠7mg、乙醇胺6mg、七水硫酸锌3mg、偏硅酸钠0.2mg、五水硫酸铜0.08mg、亚硒酸钠0.06mg、硫酸镍0.002mg、六水氯化铝0.003mg；
按照表1，称取相应重量的烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐、月桂醇硫酸钠；
将以上组分充分溶解于950mL基础培养基DMEM/F12中，并调节pH至6.6-7.2，利用无菌去离子水定容至1000mL，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得无血清培养基，4℃保存待用。
表1制备例1-25中功能性添加物中各组分的添加量
Figure BDA0003768713290000061
Figure BDA0003768713290000071
制备例26
本制备例提供了一种无血清培养基。
本制备例与制备例4的不同之处在于：无血清培养基由基础培养基DMEM/F12与补充因子组成。
制备例27
本制备例提供了一种含血清培养基。
本制备例与制备例4的不同之处在于：无血清培养基由基础培养基DMEM/F12与10％的FBS组成。
本制备例中含血清培养基的制备方法包括以下步骤：
10mL FBS充分溶解于基础培养基950mL DMEM/F12中，并调节pH至6.6-7.2，利用无菌去离子水定容至1000mL，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得含血清培养基，4℃保存待用。
实施例
实施例1-13
实施例1-13分别提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
上述各实施例的不同之处在于：无血清培养基的类型。具体如表2所示。
上述CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法具体包括以下步骤：
S1：细胞复苏：从液氮中取出装有1mL CHO-S细胞悬液的冻存离心管，迅速放入37℃水浴中快速解冻；在生物安全柜中，用75％乙醇清洁冻存离心管的外壁，将细胞悬液缓慢加入含10mL无血清培养基的15mL离心管中，轻轻吹打混匀；在1000rpm的条件下，离心5min，弃去上清液；加入2mL无血清培养基，重悬细胞，再转移到培养瓶中；加入5mL无血清培养基，轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，使密度控制在3-4×105cells/mL，活力>95％；然后置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中，培养过夜，第二天换液，在显微镜下观察细胞生长状态，当细胞融合率达到80％-90％，即可进行细胞培养。
S2：细胞传代：从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞培养物稀释，并置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中继续培养，每天需对细胞密度及活力检测，细胞密度达到2.0×106cells/mL左右时需对细胞进行传代；
S3：转染级质粒抽提：利用质粒抽提试剂盒对含有t-PA的菌液(购买自Gibco公司)进行提取转染级质粒，然后向5mL含有转染级质粒的细菌裂解液中加入除内毒素溶液5mL，冰浴60min，直到上清液澄清；随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的转染级质粒进行内毒素检测，确认内毒素低于0.1EU；对提取的重链质粒和轻链质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％，即得转染级质粒；
S4：转染级质粒-转染试剂混合物的制备：称取125mg转染级质粒，加入至100mL的TE缓冲液中，然后加入200mg的聚乙烯亚胺，37℃温育10min，得到转染级质粒-转染试剂混合物，备用；其中转染级质粒中重链质粒与轻链质粒的重量比为2：2.5。
S5：细胞转染：转染当天使细胞密度控制在1.5-2×106cells/mL，将转染级质粒-转染试剂混合物加入待转染的CHO-S细胞中，然后置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中，进行CHO-S细胞的转染。
S6：重组抗体蛋白的纯化：取转染后的CHO-S培养液离心，上清用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析至含有150mmol/mL NaCl，pH＝7.0、且浓度20mmol/mL的Na2HPO4缓冲液中，透析结束后再用Protein A柱纯化，得到重组抗体蛋白。
表2实施例1-13中无血清培养基的类型
Figure BDA0003768713290000081
实施例14-17
实施例14-17分别提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
上述各实施例与实施例3的不同之处在于：聚乙烯亚胺溶液的浓度。具体如表3所示。
表3实施例3、14-17中聚乙烯亚胺溶液的浓度
Figure BDA0003768713290000091
实施例18-25
实施例18-25分别提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
上述各实施例的不同之处在于：转染级质粒的浓度以及转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比。具体如表4所示。
表4实施例3、18-25中转染级质粒的浓度以及重链质粒和轻链质粒的重量比
Figure BDA0003768713290000092
对比例
对比例1-13
对比例1-13分别提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
上述各对比例与实施例3的不同之处在于：无血清培养基的类型。具体如表5所示。
表5对比例1-13中无血清培养基的类型
Figure BDA0003768713290000093
Figure BDA0003768713290000101
对比例14
本对比例提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
本对比例与实施例3的不同之处在于：培养方法所用培养基为含血清培养基，含血清培养基为制备例26制备的含血清培养基。其余步骤均与实施例3相同。
对比例15
本对比例提供了一种CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法。
本对比例与实施例3的不同之处在于：无血清培养基为Gibco公司的市售CD CHO培养基，货号为10743029。
性能检测试验
以实施例1-25以及对比例1-15提供的CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法为检测对象，测定CHO-S细胞的细胞密度及细胞活性，并测定重组抗体的表达量。
检测方法：在CHO-S细胞转染后的第1d，第3d，第5d，第7d，每天取上清液，利用血球计数板计数细胞，测定CHO-S细胞的细胞密度；利用台盼蓝染色法，确定CHO-S细胞的细胞活性；利用t-PA人ELISA试剂盒(购买自Gibco公司)检测重组抗体的表达量。
检测结果：如表6所示。
表6实施例1-25以及对比例1-15中CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性、以及重组抗体的表达量
Figure BDA0003768713290000102
Figure BDA0003768713290000111
/>
Figure BDA0003768713290000121
结合表6，通过对比实施例1-25与对比例1-15的检测结果，本申请通过在商品化的基础培养基中加入补充因子和功能性添加物，提供了一种无血清培养基，并用于CHO-S细胞的无血清培养方法和CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，在细胞悬浮培养7d后，CHO-S细胞的细胞密度均高于66×106cells/mL，细胞活性均高于90.2％，重组抗体表达量均高于501mg/L，表明本申请提供的无血清培养基能够有效提高CHO-S细胞的细胞密度，且维持较高的细胞活力，长时间内连续培养表现稳定；同时能够有效提高重组抗体的表达量。因此，本申请提供的无血清培养基适合用于CHO-S细胞的工业化高密度培养，且适合用于CHO-S细胞高密度长期表达重组抗体的构建方法中。
通过对比例实施例1-25与对比例14-15的检测结果，当在基础培养基DMEM/F12中加入10％的FBS组成含血清培养基，并用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，在细胞悬浮培养7d后，CHO-S细胞的细胞密度为39.8×106cells/mL，细胞活性为75.8％，重组抗体表达量为389mg/L。当选择使用Gibco公司的市售CD CHO培养基，用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，在细胞悬浮培养7d后，CHO-S细胞的细胞密度为52.4×106cells/mL，细胞活性为78.9％，重组抗体表达量为467mg/mL。而本申请通过在基础培养基DMEM/F12中加入补充因子和功能性添加物组成无血清培养基，能够有效提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够有效提高重组抗体的表达量。
通过对比例实施例1-24与对比例13的检测结果，相比于在基础培养基DMEM/F12中加入补充因子，本申请选择使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠作为功能性添加物，与补充因子加入至基础培养基DMEM/F12中，制备得到无血清培养基，将该无血清培养基用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，能够有效提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够有效提高重组抗体的表达量。
通过对比例实施例3与对比例7-12的检测结果，相比于选择使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠中的一种或者两种作为功能性添加物，本申请选择同时使用烟酸肌醇脂、胆固醇亚麻酸盐和月桂醇硫酸钠作为功能性添加物，制备得到无血清培养基，将该无血清培养基用于CHO-S细胞表达重组抗体的构建方法中，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。
通过对比例实施例1-5与对比例1-2的检测结果，当控制无血清培养基中烟酸肌醇脂的浓度在50-100mg/L的范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将烟酸肌醇脂的浓度控制在上述范围。进一步地，本申请将烟酸肌醇脂的浓度控制在60-90mg/L。
通过对比例实施例3、6-9与对比例3-4的检测结果，当控制无血清培养基中胆固醇亚麻酸盐的浓度在12-24mg/L的范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将胆固醇亚麻酸盐的浓度控制在上述范围。进一步地，本申请将胆固醇亚麻酸盐的浓度控制在15-21mg/L。
通过对比例实施例3、10-13与对比例5-6的检测结果，当控制无血清培养基中月桂醇硫酸钠的浓度在0.08-0.2mg/L的范围内时，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，且能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将月桂醇硫酸钠的浓度控制在上述范围。进一步地，本申请将月桂醇硫酸钠的浓度控制在0.12-0.16mg/L。
通过对比例实施例3、14-17的检测结果，当控制转染试剂聚乙烯亚胺溶液的浓度在1.5-2.5mg/mL的范围内，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将聚乙烯亚胺溶液的浓度控制在上述范围。
通过对比例实施例3、18-21的检测结果，当控制转染级质粒的浓度在1-1.5mg/mL的范围内，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将转染级质粒的浓度控制在上述范围。
通过对比例实施例3、22-25的检测结果，当控制转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比在2：(1.5-3.5)的范围内，能够进一步提高CHO-S细胞的细胞密度和细胞活性，同时能够进一步提高重组抗体的表达量。因此，本申请将重链质粒和轻链质粒的重量比控制在上述范围。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包含DMEM/F12作为基础培养基；
所述无血清培养基包含以下浓度的组分作为补充因子：卵磷脂3-6mg/L、硫酸胆碱10-40mg/L、胰岛素0.1-10mg/L、转铁蛋白5-50mg/L、柠檬酸铁20-80mg/L、丙酮酸钠5-10mg/L、乙醇胺1-10mg/L、七水硫酸锌0.5-5mg/L、偏硅酸钠0.02-0.4mg/L、五水硫酸铜0.012-0.12mg/L、亚硒酸钠0.02-0.08mg/L、硫酸镍0.0004-0.004mg/L、六水氯化铝0.0006-0.006mg/L；
所述无血清培养基包含以下浓度的组分作为功能性添加物：烟酸肌醇脂50-100mg/L、胆固醇亚麻酸盐12-24mg/L、月桂醇硫酸钠0.08-0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述烟酸肌醇脂的浓度是60-90mg/L、所述胆固醇亚麻酸盐的浓度是15-21mg/L、所述月桂醇硫酸钠的浓度是0.12-0.16mg/L。
3.如权利要求1-2中任一项所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：按照配方，称取所述补充因子和所述功能性添加物，充分溶解于所述基础培养基中；调节pH至6.6-7.2，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得所述无血清培养基。
4.如权利要求1-2中任一项所述的无血清培养基在CHO细胞培养领域以及CHO细胞表达重组抗体领域的应用。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基在CHO细胞培养领域以及CHO细胞表达重组抗体领域的应用，其特征在于，所述CHO细胞选自CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1-GS-/-中的任意一种。
6.一种CHO细胞表达重组抗体的构建方法，其特征在于，所述构建方法中使用的培养基为权利要求1-2中任一项所述的无血清培养基。
7.根据权利要求6所述的CHO细胞表达重组抗体的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：利用所述无血清培养基，对所述CHO细胞进行复苏与传代；利用转染试剂，将转染级质粒转染到所述CHO细胞中进行瞬时表达，之后通过Protein A亲和层析纯化，得到重组抗体蛋白。
8.根据权利要求7所述的CHO细胞表达重组抗体的构建方法，其特征在于，所述转染试剂为浓度为1.5-2.5mg/mL的聚乙烯亚胺溶液。
9.根据权利要求7所述的CHO细胞表达重组抗体的构建方法，其特征在于，所述转染级质粒的浓度为1-1.5mg/mL。
10.根据权利要求7所述的CHO细胞表达重组抗体的构建方法，其特征在于，所述转染级质粒中重链质粒和轻链质粒的重量比为2：（1.5-3.5）。
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