IT202000004846A1 - Pro-drug innovativo micellare su backbone polimerico del Killer TNF-apoptosis induced ligand. - Google Patents

Pro-drug innovativo micellare su backbone polimerico del Killer TNF-apoptosis induced ligand. Download PDF

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Donato Cosco
Massimo Fresta
Donatella Paolino
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Univ Degli Studi Padova
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Description

Pro-drug innovativo micellare su backbone polimerico del Killer TNF-apoptosis induced ligand
Campo Tecnico dell?invenzione
La presente invenzione ha come oggetto lo sviluppo di sistemi di trasporto micellari PEGilati della famiglia di citochine TNF (Tumor Necrosis Factor). In particolare,l?invenzione riguarda l'uso in terapia e diagnosi del coniugato di una proteina della famiglia TRAIL e relativi mutanti per la diagnosi e il trattamento di vari tumori nei mammiferi.
Ad oggi sono noti almeno otto membri di questa stessa famiglia: LT?, KillerTRAIL?, LT?, i ligandi di CD20; CD40, CD30, CD27, OX40, 4-1BB, FasL e CD253 (TRAIL), oltre al KillerTRAIL, TNF-apoptosis induced ligand (KillerTRAIL).
La strategia di coniugazione oggetto della presente invenzione ? quella di legare la proteina, TRAIL e relativi mutanti, pi? preferibilmente KillerTRAIL, al polietilenglicole (PEG) e/o ad un backbone fosfolipide-polietilenglicole (PEG),ad esempio del tipo DSPE-PEG,tramite un gruppo tiolico (-SH) presente sulla catena polimericadella proteina.Il PEG pu? essere un alcossi-polietilenglicole, preferibilmente metossi-polietilenglicole (mPEG) derivatizzato ad una sua estremit? con un fosfolipide ed all?altra estremit? con un gruppo reattivo verso i tioli. Questo approccio permette di ottenere un derivato anfifilico e stabile, che riesce ad ovviare alle problematiche di stabilit?, ai fenomeni d?aggregazione e dalla bassa emivita legate alla proteina nativa,ottenendo cos? un miglioramento dei parametri biofarmaceutici, farmacocinetici e una migliore attivit? antitumorale rispetto alla proteina nativa.
Inoltre, le caratteristiche anfipatiche del composto, oggetto dell?invenzione, hanno permesso di realizzare anche dei sistemi micellari, che presentano la proteina nativa esposta sulla superficie,in grado di migliorare la stabilit?, la biodistribuzione, l?attivit? della proteina nativa, mantenendone l?effetto terapeutico e targhettante.Questo sistema garantisce la possibilit? di co-veicolare all?interno del nanosistema farmaci lipofili o anfipaticiche possono avere un?azione sinergicae ridurre i fenomeni di resistenza alla terapia antitumorale. Infatti, una delle problematiche riscontrate nello sviluppo clinico di questa proteina ? la resistenza alla terapia pro-apoptotica. Questo fenomeno ? presente sui tessuti tumorali che esprimono sulla loro superficie il recettore della famiglia delle citochine TNF-apoptosis induced ligand (KillerTRAIL). Questi meccanismi di difesa ancora poco conosciuti bloccano l?azione farmacologica pro-apoptotica dei composti della famiglia di citochine TRAIL come riportato in letteratura [1,2].
Per realizzare i nanosistemi dell?invenzione ? stato quindi utilizzato il polietilenglicole (PEG) etero-bifunzionale, coniugato ad un?estremit? con un fosfolipide come ad esempio la DSPE (distearoil-fosfatidil-etanolammina) e attivato all?altra estremit? per essere reattivo nei confronti dei gruppi tiolici presenti sulla proteina. Preferibilmente il gruppo ? il gruppo maleimidico.L?utilizzo di questo derivato ha favorito la sintesi di un composto amfipatico, costituito da fosfolipide-PEG-proteina, che forma micelle stabili contenenti sulla superficie la proteina. La presenza della proteina sulla superficie delle micelle ne amplifica la loro capacit? targhettante verso specifici siti tumorali.
Arte Nota
Le proteine pro-apoptotiche hanno riscosso, negli ultimi anni, un grande successo, dovuto in larga parte alla loro potente attivit? antitumorale in vitro ed in vivo. Le proteine pi? promettenti sono risultate quelle della famiglia TRAIL. TRAIL (nota anche come TNFSFlO, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L) ? un membro della famiglia dei ligandi di TNF.
Il suo mutante pi? promettente in terapia si ? dimostrato la proteina nota e commercializzata come KillerTRAIL. Il KillerTRAIL umano monomerico, ? un composto noto ed ? presente sul mercato (http://www.enzolifesciences.com/ALX-201-073/killertrail-protein-solublehuman-recombinant/).
Purtroppo, nessuno studio clinico ? proseguito in questo campo di ricerca a causa dei problemi riscontrati durante la somministrazione di KillerTRAIL. La rapida clearance, l?elevata tossicit?, dovuta molto probabilmente alla trimerizzazione della proteina dopo somministrazione sistemica, la formazione di immunocomplessi e la resistenza terapeutica da parte dei tessuti tumorali, rendono il KillerTRAIL un farmaco poco utilizzato in campo clinico.
Per ottimizzare l?uso clinico di questa proteina sono stati sintetizzati nanoaggregati misti polimero-lipide contenenti il KillerTRAIL in grado di complessare farmaci lipofili ed anfipatici e direzionare la proteina pro-apoptotica KillerTRAIL, che ha propriet? terapeutiche e targhettanti verso cellule che sovraesprimono recettori specifici per la proteina nativa sulla loro superficie. L?utilizzo di questi nanoaggregati si basa sul principio che le macromolecole, con caratteristiche anfifiliche, possano auto-aggregarsi e formare strutture micellari con la porzione lipofila a formare un core verso l?interno dell?aggregato (componente lipidica) e la porzione idrofila verso il compartimento acquoso esterno (proteina direzionante).
La necessit? di risolvere le problematiche sopra esposte, personalizzare la terapia, aumentarne l?efficacia terapeutica e ridurne la tossicit? ?,tuttavia,rimasta irrisolta.
Da diversi anni il KillerTRAIL viene studiato come potenziale composto antitumorale. Una terapia antitumorale efficace ha come obiettivo quello di sviluppare farmaci molto selettivi, con un?elevata efficienza terapeutica e ridotti effetti collaterali [3].
La proteina KillerTRAIL ? in grado di indurre apoptosi in diversi tipi di cellule tumorali resistenti alle convenzionali chemioterapia e radioterapia, senza causare effetti tossici rilevanti sulle cellule sane dei pazienti [4,5]. Tuttavia, le cellule tumorali primarie sviluppano rapidamente resistenza al trattamento chemioterapico con KillerTRAIL, malgrado l'espressione sulla loro superficie dei recettori pro-apoptotici, specifici per questa proteina, rendendo questo farmaco inefficace nella terapia oncologica.
Questa resistenza ? probabilmente causata da meccanismi multipli,e comprende l?iperespressione delle proteine della famiglia Bcl-2, soprattutto XIAP, la sovraespressione della protein-chinasi B (PKB/Akt), la delezione del gene Bax e le mutazioni della caspase, oltre a molti altri fattori di resistenza [6-9]. Malgrado tutte queste ipotesi, i meccanismi alla base della resistenza delle cellule tumorali primarie nei confronti di KillerTRAIL sono ancora oggetto di numerose indagini sperimentali, e numerose ricerche hanno avuto come obiettivo quello di sviluppare protocolli chemioterapici in cui il KillerTRAIL ? stato utilizzato in combinazione con altri farmaci antitumorali per migliorare l?attivit? terapeutica di questo composto[10,11].
Il ligando TNF-inducente l'apoptosi (TRAIL, Apo2L, CD253, TNFSF10) ? un tipo di proteina trans-membrana II dicirca34kDa, scoperto da due diversi gruppi negli anni 1995/1996 [12,13]. TRAIL ? una proteina nota (https://www.uniprot.org/uniprot/P50591) che consiste in una sequenza amminoacidica di 281 aa nella forma umana e 291 aa nella forma murina che condividono un grado di omologia del 65%, ed ha un peso molecolare pari a circa 32.5 kDa. TRAIL ? caratterizzata da un dominio di transmembrana, un dominio C-terminale extracellulare ricco di cisteine conservato tra i membri della stessa famiglia, e un dominio N-terminale citoplasmatico che presenta invece delle caratteristiche uniche.
I membri della famiglia TRAIL, a cui appartiene anche KillerTRAIL, come KillerTRAIL-?, FasL, TRAIL, che vengono chiamati anche ligandi di morte, sono in grado di attivare un programma di morte cellulare in seguito al legame con specifici recettori di membrana. TRAIL, ad esempio, ? un ligando omotrimerico in grado di interagire con membri specifici della famiglia dei recettori di KillerTRAIL grazie alla presenza di domini extracellulari CRD [14].
TRAIL e KillerTRAIL si diversificano per un Tag di poli-istidina (HisTag), presente sulla catena peptidica di KillerTRAIL che ne incrementa la funzione terapeutica.
Come la maggior parte dei membri della superfamiglia dellecitochine TNF, il KillerTRAIL pu? essere tagliato dalla superficie cellulare da metalloproteasi per formare una molecola solubile [15]. TRAIL, gli altri membri della famiglia del TRAIL [16] e KillerTRAIL, nella loro forma attiva, formano macromolecole trimeriche e si legano in modo selettivo a cinque distinti recettori: TRAIL-R1 (DR4; Apo2; CD261; TNFRSF10A) [17], TRAIL-R2 (DR5, KILLER, TRICK2A, TRICK2B, CD262, TNFRSF10B) [18-20], TRAIL-R3 (DcR1, LIT, TRID, CD263, TNFRSF10C) [17,18,21], TRAIL-R4 (DcR2; TRUNDD; CD264; TNFRSF10D) [22], e osteoprotegerina (OPG; OCIF; TNFRSF11B) [23,24].TRAIL e KillerTRAIL sono attivi nei confronti di diverse patologie in cui cellule e tessuti esprimono sulla loro superficie i recettori della superfamiglia delle citochine TNF. ? stato infatti riportato in letteratura che Apo2L/TRAIL, e quindi anche il KillerTRAIL, pu? svolgere un ruolo nella modulazione del sistema immunitario, comprese le malattie autoimmuni come l'artrite [25-29]. Inoltre, ? stato anche riportato che forme solubili di Apo2L/TRAIL, e quindi anche il KillerTRAIL, inducono apoptosi in vitro in diversi tipi di cellule tumorali, inclusi tumori del colon, polmone, mammella, prostata, rene, ovaie e sistema nervoso centrale, nonch? melanoma, leucemia e mieloma multiplo [30-39].
Le potenzialit? targhettanti e terapeutiche di questo ligando sono molteplici. Tuttavia, permane il problema della sua tossicit?, legato all?aggregazione della proteina dopo somministrazione sistemica, fenomeno simile a quello che accade per altre proteine terapeutiche [40], che spesso impedisce il proseguimento della terapia per lo scatenarsi di una risposta immunitaria verso la stessa cura [40-42].
Oltre alle proteine umane ricombinanti con struttura simile al KillerTRAIL, che mostrano un?attivit? antitumorale potente e una selettivit? contro le cellule tumorali che esprimono sulla loro superficie il sistema recettoriale TRAIL-Rs [43], anticorpi contro il recettore KillerTRAIL, che funzionano da agonisti, sono in fase di sperimentazione in diversi studi sperimentali per la loro potenziale azione terapeutica. L?uso di varianti TRAIL-R1 o TRAIL-R2-selettivo potrebbe consentire una migliore terapia tumore-specifica attraverso il blocco dell?effetto mediato dal recettore antagonista, risultando in una maggiore efficacia con effetti collaterali minori rispetto al TRAIL wild type [44-48].
Versioni ricombinanti di TRAIL, come quella denominata KillerTRAIL, che presenta un Tag di poli-istidina (HisTag), o strutture ridotte a base di leucina e isoleucina, cos? come le versioni non-Taggate, sono state prodotte e testate per valutarne l?efficacia e la selettivit? in diversi modelli tumorali. Mentre le versioni non-Tag sembravano possedere alta selettivit? verso le cellule tumorali, ma una minore efficacia, le versioni KillerTRAIL-tagged hanno mostrato una maggiore efficacia per la formazione di strutture complesse a maggiore affinit?. Allo stesso tempo, questi derivati del KillerTRAIL hanno mostrato in vitro una tossicit? leggermente superiore verso cellule normali, come gli epatociti umani [49,50].
LZ-TRAIL e IZ-TRAIL rappresentano uno stato intermedio ed hanno un'efficacia simile a FLAG/His-TRAIL in vitro, ma non hanno la stessa tossicit? dei composti riportati in precedenza [51-53]. Inizialmente, ? stato ipotizzato che gli aggregati del KillerTRAIL potessero essere epatotossici [54]. Tuttavia, alcune ricerche hanno riportato dei risultati contrastanti per l'effetto tossico di KillerTRAIL a livello epatico. Questi risultati sperimentali sono attualmente oggetto di numerosi studi. Non ? tuttavia chiaro se l?epatotossicit? in vitro delle differenti varianti di KillerTRAIL si possa verificare anche in vivo [55].
L'uso di anticorpi monoclonali ad attivit? agonistica, come agenti terapeutici, rappresenta una delle strategie emergenti nella terapia antitumorale. Anticorpi monoclonali selettivi per il recettore TRAIL-R1 (Mapatumumab) o TRAIL-R2 (Lexatumumab; HGS-TR2J; Apomab, AMG655, LBY135; CS-1008 o versione umanizzata di TRA-8) sono attualmente in corso di studi clinici [51,56,57].
Tuttavia, la necessit? di risolvere le problematiche finora descritte, di personalizzare la terapia, di aumentarne l?efficacia terapeutica e ridurne la tossicit?, ? ad oggi rimasta irrisolta.
Sommario dell?invenzione
Abbiamo per questo motivo sviluppato e verificato sperimentalmente delle nuove strategie per la veicolazione di composti, che appartengo ai membri della famiglia TRAIL, a cui appartiene anche KillerTRAIL, come KillerTRAIL, KillerTRAIL-?, FasL, TRAIL, al fine di ottenere una modulazione delle caratteristiche biofarmaceutiche della famiglia di queste proteine (come ad esempio TRAIL, KillerTRAIL) senza per? modificarne la capacit? di legame con il substrato cellulare.
Abbiamo infatti trovato che una coniugazione fosfolipide-PEG-proteina in cui la proteina ? TRAIL o un suo mutante, in particolare KillerTRAIL, inaspettatamente, non influenza le propriet? di legame della proteina nativa con il sito recettoriale.
Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione la realizzazione di una nuova formulazione terapeutica, stabile, biocompatibile e biodegradabile i cui nanoaggregati di tipo micellare risultano non tossici, facili da riprodurre su scala industriale (scale-up) e versatili sotto il profilo terapeutico.
Per migliorare le propriet? biofarmaceutiche, aumentare l?attivit? terapeutica della famiglia delle proteine pro-apoptotiche TRAIL e relativi mutanti, in particolare KillerTRAIL, e ridurne la resistenza delle cellule tumorali primarie, la proteina pro-apoptotica ? stata modificata mediante coniugazione con un derivato fosfolipide-PEG, preferibilmente distearoil-fosfatidil-etanolamminapolietilen glicole(DSPE-PEG), attraverso un linker maleimmidico. Il processo di sintesi ? stato eseguito in un singolo passaggio di reazione.
La strategia di sintesi? stata quella di coniugare la proteina TRAIL o un suo mutante, in particolare il KillerTRAIL, utilizzando il gruppo tiolico(?SH) dell?amminoacido cisteina in posizione 230, con il fosfolipide-PEG, preferibilmente distearoil-fosfatidil-etanolammina-N-maleimide-polietilen glicole (DSPE-PEG-maleimide). Questo processo di sintesi non modifica l?attivit? terapeutica della proteina nativa n? in vitro n? in vivo. Preferibilmente il PEG ? un PEG di circa 2 kDa.
Il coniugato ottenuto (fosfolipide-PEG-proteina, preferibilmente DSPE-PEG-KillerTRAIL) ha caratteristiche anfifiliche che possono essere sfruttate per veicolare sinergicamente farmaci lipofili nel derivato terapeuticamente attivo, mantenendo inalterate sia l?attivit? targhettante sia quella terapeutica della proteina. Infatti, la porzione lipofila del coniugato si riorganizza in ambiente acquoso, formando una struttura idrofobica interna che incapsula/complessa il farmaco lipofilo in base del suo peso molecolare edai suoi parametri chimicofisici. Al contrario, le catene di PEG e la proteina si organizzano verso l?ambiente acquoso formando un rivestimento polimerico esterno del sistema autoaggregante che presenta sulla superficie esterna la porzione targhettante della proteina pro-apoptotica che mantiene la sua attivit? terapeutica.
Le proteine della famiglia TRAIL e relativi mutanti, come KillerTRAIL, a cui si riferisce l?invenzione sono quelle che presentano nella catena amminoacidica una sola cisteina. Questo permette di ottenere una coniugazione specifica tragruppo SH della proteina nativa ed il gruppo maleimide del fosfolipide-PEG-maleimide. In particolare, per ottenere questa coniugazione si utilizza il gruppo maleimidico sfruttando la reazione di Michael [58] che favorisce la formazione del legame chimico C-S molto stabile. Il derivato preferito, DSPE-PEG-KillerTRAIL, ? stato caratterizzato sia sotto il profilo chimico-fisico che biologico.
? stato anche prodotto e caratterizzato il derivato PEG-KillerTRAIL mancante cio? della porzione fosfolipidica, anch?esso di interesse farmaceutico, con caratteristiche applicative similari.
Altro oggetto dell?invenzione sono le composizioni farmaceutiche contenenti il derivato oggetto dell?invenzione e gli eccipienti farmaceuticamente utilizzati per la loro preparazione.
Ancora altro oggetto sono le preparazioni farmaceutiche per uso diagnostico comprendenti il derivato oggetto dell?invenzione e un agente diagnostico.
Ulteriori oggetti dell?invenzione sono le applicazioni per uso terapeutico e diagnostico di detti derivati.
Ulteriori oggetti, scopi e vantaggi risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata dell?invenzione.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: Analisi cromatografica mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) della reazione e relativa descrizione del processo di caratterizzazione analitica di DSPE-PEG-KillerTRAIL.
Figura 2: SDS-PAGE delle reazioni con PEG (20kDa) (A) e DSPE-PEG-maleimide (MAL) (2kDa) (B), in presenza di un agente riducente e non riducente. Il KillerTRAIL ? stato utilizzato come campione standard di riferimento.
Figura 3: Spettro MALDI-TOF-MS di DSPE-PEG-maleimide (MAL) 2kDa (A) e del derivato DSPE-PEG-KillerTRAIL (B).
Figura 4a: Analisi dimensionale mediante scattering dinamico di luce. Dimensioni medie del prodotto di coniugazione DSPE-PEG-KillerTRAIL per i valori di Intensit? di scattering (A e B), Volume (C e D) e Numero (E e F). I pannelli A e B si riferiscono alle dimensioni medie delle micelle di DSPE-PEG-KillerTRAIL misurate come intensit? (%) in funzione della distribuzione dimensionale in intensit? delle particelle. I pannelli C e D si riferiscono alle dimensioni medie delle micelle di DSPE-PEG-KillerTRAIL misurate come volume (%) in funzione della distribuzione dimensionale in volume delle particelle. I pannelli E ed F si riferiscono alle dimensioni medie delle micelle di DSPE-PEG-KillerTRAIL misurate come numero (%) in funzione della distribuzione dimensionale in numero delle particelle;
Figura 4b: Analisi dimensionale mediante scattering dinamico di luce del solo KillerTRAIL. Il pannello A si riferisce alle dimensioni medie di KillerTRAIL misurate come intensit? (%) in funzione delle dimensioni delle particelle. Il pannello B si riferisce alle dimensioni medie di KillerTRAIL misurate come volume (%) in funzione delle dimensioni delle particelle. Il pannello C si riferisce alle dimensioni medie di KillerTRAIL misurate come numero (%) in funzione delle dimensioni delle particelle.
Figura 5: Analisi cromatografica mediante asymmetric flow-field flow fractionation di DSPE-PEG-KillerTRAIL alla massima lunghezza d?onda di 280 nm.
Figura 6: Analisi cromatografica dell?aggregato ottenuta mediante cromatografia di gel permeazione con sistema di esclusione sterica (GPC/SEC) multidetector di DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale a si riferisce al rilevatore che misura l?indice di rifrazione dei diversi composti di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuto per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale b si riferisce al rilevatore che misura il peso molecolare assoluto, ad un angolo di 90?,dei diversi composti di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuti per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale c si riferisce al rilevatore per la viscosit? intrinseca,in funzione della pressione differenziale, di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuti per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale d si riferisce si riferisce al rilevatore per la viscosit? intrinseca, in funzione della pressione interna, di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuti per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale e si riferisce al rilevatore che misura il peso molecolare assoluto, ad un angolo di 7?,dei diversi composti di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuti per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL. Il canale f si riferisce al rivelatore UV, a multipla lunghezza d?onda ed in fornisce la composizione dei diversi composti, di cui ? dotato lo strumento ed al relativo grafico ottenuti per il composto DSPE-PEG-KillerTRAIL.
Figura 7: Attivit? biologica in vitro di KillerTRAIL e DSPE-PEG-KillerTRAIL su cellule di cheratinociti umani NCTC224 e cellule tumorali di colon HCT116.
Figura 8:Farmacocinetica e biodistribuzione di KillerTRAIL (A) e fosfolipide-KillerTRAIL (B) in diversi organi e fluidi biologici (sangue, fegato, rene, pancreas, polmoni, urine). Concentrazione plasmatica a diversi tempi d?incubazione (15, 30, 60, 240 min.)di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL(C).
Figura 9: Biodistribuzione in diversi organi e fluidi biologici (sangue, fegato, rene, pancreas, polmoni, urine) di KillerTRAIL (A),e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL(B) in topi xenotrapiantati con cellule di carcinoma del colon HCT116. Concentrazione proteica, identificata in sangue, fegato e massa tumorale a diversi tempi d?incubazione (15, 30, 60, 24 min.) per KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL (C).
Figura 10: Attivit? antitumorale in vivo, di KillerTRAIL e del suo derivato fosfolipide-PEG-KllerTRAIL.
Figura 11: Comparazione dell?attivit? antitumorale in vivo, di KillerTRAIL, PEG-KillerTRAIL e del derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
Figura 12: Inibizione della vitalit? cellulare in vitro e relativa attivit? anti-tumorale di KillerTRAIL e del suo derivato mPEG-KillerTRAIL su cellule tumorali umane di colon HCT-116 e cheratinociti umani NCTC2544.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Nell?ambito della presente invenzione:
- I termini polietilenglicole e PEG sono da considerare sinonimi e saranno usati indifferentemente l?uno rispetto all?altro;
- Il termine ?addotto? identifica un composto costituito da un fosfolipide legato ad un polietilenglicole o PEG;
- Il termine TRAIL sar? usato per identificare una proteina pro-apoptotica di tipo esogeno appartenente alla famiglia di citochine tumor necrosis factor, le proteine della famiglia sono: TNFSF10, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L [12, 13];
- La dicitura fosfolipide-PEG-TRAIL, in particolare fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, pu? essere individuata indifferentemente con i termini ?coniugato? o ?coniugato polimerico? e prevede sempre che il PEG sia legato ad una estremit? al fosfolipide ed all?estremit? opposta alla proteina TRAIL con un legame covalente C-S sul residuo cisteinico della sequenza di detta proteina tramite un linker, quale ad esempio il gruppo maleimidico.
Nell?ambito della presente invenzione con il termine polietilenglicole (PEG) eterobifunzionale, si intende un polietilenglicole coniugato ad un?estremit? con un fosfolipide, come ad esempio la DSPE (distearoil-fosfatidil-etanolammina), e all?altra estremit? legato con un gruppo reattivo nei confronti del gruppo tiolico della proteina, ad esempio il gruppo maleimidico. I derivati del PEG, utilizzati nell?invenzione, sono disponibili in commercio e, tipicamente, i derivati del PEG che possono essere utilizzati nella presente invenzione sono preparati non omogenei venduti in base al peso molecolare medio. Ad esempio, i derivati del PEG (2000 e 5000 Da), disponibili in commercio, in genere contengono catene di polietilene glicole che variano leggermente dal peso molecolare indicato sulla confezione del prodotto commerciale e presentano una deviazione standard pari ? 500 Da. Il peso molecolare del PEG ? preferibilmente nell?intervallo 2-200 kDa, preferibilmente 10-50 kDa.
Nell?ambito della presente invenzione con il termine backbone si intende un sistema anfipatico costituito da fosfolipide-PEG-proteina (pi? precisamente fosfolipide-PEG-linker-proteina) che, alla sua concentrazione micellare critica, forma micelle stabili contenenti sulla superficie le catene di PEG con coniugata la proteina. La concentrazione micellare critica, spesso indicata in modo abbreviato come CMC, ? un parametro che rappresenta il valore di concentrazione di una soluzione di tensioattivo alla quale, raggiunta o superata la temperatura di Krafft (temperatura micellare critica), un certo numero di monomeri si aggregano portando alla formazione di micelle. Questo parametro ? un parametro noto e pu? essere facilmente individuato da un esperto del settore in base alle sue conoscenze combinate con le informazioni della presente descrizione.
Nell?ambito della presente invenzione con la dicitura TRAIL e sue varianti o TRAIL, e suoi mutanti, si intende la proteina TRAIL (nota anche come TNFSF10, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L) che ? un membro della famiglia dei ligandi di TNF.
Per variante o mutante si intende che la proteina TRAIL differisce in almeno una posizione di aminoacidi dalla proteina TRAIL wild type (nota anche come TNFSF10, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L) (Entrez GenelD: 8743; numero di accesso NM_003810.2; UniProtKB/Swiss-Prot: P50591; UniProtKB / TrEMBL: Q6IBA9).
Un mutante di TRAIL particolarmente preferito ? la proteina presente in commercio come KillerTRAIL.
La presente invenzione riguarda pertanto la veicolazione di proteine terapeutiche pro-apoptotiche di tipo esogeno, in particolare la citochina CD523 o TRAIL e suoi mutanti, veicolazione realizzata mediante coniugazione con il backbone polimerico definito sopra. Tra le varie citochine appartenenti alla superfamiglia di citochine tumor necrosis factor ? stata selezionata come particolarmente preferita la citochina contenente un linker peptidico (KillerTRAIL o k-TRAIL) che rende la sua struttura terziaria pi? stabile. Questa citochina, come le sue omologhe, induce apoptosi in seguito al legame con recettori transmembana pro-apoptotici.
A causa dei problemi di tossicit? (a livello del tessuto epatico) e bassa emivita di queste citochine, lo scopo raggiunto dalla presente invenzione ? stato quello di ridurre tali problematiche attraverso una coniugazione sul backbone polimerico.
? pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per ottenere coniugati polimerici della citochina CD523 o TRAIL ed i suoi mutanti, in particolare KillerTRAIL, unitamente agli usi terapeutici, diagnostici e teranostici di detti coniugati polimerici.
La presenza di una sola cisteina, naturalmente presente nella catena aminoacidica in questa famiglia di citochine, consente la PEGhilazione selettiva di un solo sito attivo del copolimero. Questo tipo di processo sintetico permette di ridurre l?ingombro sterico della proteina endogena e quindi favorire la sua interazione con il sito recettoriale, non modificando il suo legame con il recettore e di conseguenza la sua attivit? terapeutica. Inoltre, la PEGhilazione della sola cisteina presente in catena laterale della proteina, inizialmente sconsigliata secondo i dati riportati in letteratura, ha inaspettatamente e vantaggiosamente migliorato l?azione terapeutica della proteina nativa senza interferire con il suo effetto targhettante.
Preferibilmente la proteina ? il TRAIL, pi? preferibilmente la proteina ? KillerTRAIL e la cisteina interessata al processo di coniugazione con il PEG ? in posizione 230 della catena peptidica.
Il TRAIL presenta la sequenza riportata nella lista inserita nel sito https://www.uniprot.org/uniprot/P50591 e comprende la sequenza aa 95-281: Seq ID No 1:
TSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKAL GRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTK NDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKEND RIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG.
Sono ricompresi nell?ambito dell?invenzione i mutanti che hanno un?omologia del 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%,78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o maggiore omologia di sequenza rispetto alla proteina TRAIL o alKillerTRAIL o che comprendono un polipeptide con almeno il 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%,78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o maggiore omologia di sequenza rispetto al polipeptide di SEQ ID No 1.
L?invenzione si basa sulla scelta di specifiche condizioni di reazione e sull?impiego di un PEG modificato recante ad un?estremit? un fosfolipide e sull?altra estremit? un gruppo reattivo per il tiolo della cisteina presente nella sequenza aminoacidica della proteina (ad esempio maleimmide, preferibilmente N-alchilmaleimmide, come ad esempio N-metilmaleimmide o N-etilmaleimmide) in modo da reagire selettivamente con il gruppo tiolico della sequenza amminoacidica.
Pi? in particolare la presente invenzione ha come oggetto lo sviluppo di sistemi di veicolazione a struttura micellari PEGhilati del Killer TNF-apoptosis induced ligand (KillerTRAIL). La strategia di coniugazione che ? stata valutata riguarda la possibilit? di legare il KillerTRAIL al fosfolipide-polietilenglicoleattivatograzie alla presenza del gruppo tiolico (-SH) della cisteina in posizione 230 della catena proteica.
Sono stati sviluppati anche altri derivati del PEG aventi reattivit? specifica verso il gruppo tiolo. Oltre a PEG-maleimide (MAL-PEG) si possono citare altri gruppi funzionali che presentano la stessa reattiva (reazione di sostituzione nucleofila) verso i tioli come ad esempio PEG-disolfuro orto-piridinico (OPSS-PEG), PEG iodio-acetammide (IA-PEG) e PEG-vinil-solfone (VS-PEG). Attualmente, MAL-PEG e OPSS-PEG sono i derivati pi? utilizzati.
La coniugazione ? ottenuta mediante legame con un fosfolipide-PEG (il cui elenco esaustivo ? di seguito riportato), preferibilmente fosfatidil-etanolamminapolietilenglicole (DSPE-PEG) derivatizzato con un gruppo reattivo verso i tioli, preferibilmente una maleimide. Il peso molecolare del PEG ? preferibilmente nell?intervallo 2-200 kDa, preferibilmente 10-50 kDa.
Tuttavia, potrebbero essere utilizzati altri gruppi noti essere reattivi per la coniugazione polimerica di proteine, reattivi verso i tioli quali: alo-acetili, maleimidi, ftalimmidi, aziridine, acriloili, agenti arilanti, vinil-sulfoni, piridil-disulfidi, TNB-tioli e agenti di riduzione dei ponti S-S. Altre immidi presenti sul mercato come n-idrossi-succinimmide, non sono selettive verso i tioli e reagiscono anche con le ammine.
I polietilenglicoli maggiormente preferiti sono DSPE-PEG-maleimide 10000 Da, DSPE-PEG-maleimide 20000 Da, DSPE-PEG-maleimide 40000 Da, DSPE-PEG-maleimide ramificata10000 Da, DSPE-PEG-maleimide ramificata 20000 Da e DSPE-PEG-maleimide ramificata40000 Da e relative miscele. Possono analogamente essere impiegati anchealtri polimeri ad azione analoga, come l?esporto del ramo ? in grado di comprendere e che possono essere scelti fra: polivinilpirrolidone; poli-acriloil-morfolina; N-idrossi-etil-metacrilammide copolimero; poli(2-etil-ossazolina); acido poli-glutammico; acido ialuronico; acido poli-sialico; e copolimeri di PEG-poli-aminoacidi. Tuttavia, ? preferito il PEG in quanto ? un polimero monofunzionale. Si pu? ottenere la coniugazione di questa proteina anche tramite gli altri polimeri sopra indicati, ma la resa di reazione rispetto al PEG sarebbe inferiore. Inoltre, il PEG, ? un copolimero biocompatibile e biodegradabile approvato dalla European Medicine Agency (EMA) e dalla Food and Drug Administration (FDA).
Per realizzare questa strategia, quindi, si ? partiti da un PEG funzionalizzato con un fosfolipide scelto fra: polietilenglicole1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)750]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)2000]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)5000]}; 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[dibenzociclooctil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-azido(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[succinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[carboxi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[maleimide(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[PDP(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3fosfoetanolammina-N-[amino(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[cianur(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[poli(etilene glicol)2000-N'-carbossifluoresceina] (sale d?ammonio)e di polietilene glicole: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)750]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)2000]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)5000]}; 1,2-distearoil-sn-glyicero-3-fosfoetanolammina-N-[dibenzociclooctil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[azido(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[succinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[carbossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[maleimide(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[PDP(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[amino(politilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[cyianur(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[polietilene glicol)2000-N'-carbossifluoresceina] (sale d?ammonio).
Questo approccio ha permesso di ottenere un derivato stabile, che riesce ad ovviare alle problematiche legate alla stabilit?, aggregazione e bassa emivita della proteina nativa e alla sua naturale predisposizione ad aggregarsi in ambiente acquoso formando cos? trimeri, ed ottenendo cos? un miglioramento dei parametri farmacocinetici e una migliore attivit? antitumorale. Il composto cos? realizzato ha caratteristiche anfipatiche e permette di preparare sistemi micellari, allo scopo di migliorare la stabilit?, la biodistribuzione e l?attivit? della proteina nativa.
Il nuovo sistema anfipatico fosfolipide-PEG-TRAIL, alla sua concentrazione micellare critica, former? micelle stabili contenenti sulla superficie la proteina. La presenza della proteina sulla superficie delle micelle promuove la loro capacit? targhettante verso le cellule tumorali che esprimono sulla loro superficie i recettori della famiglia del TRAIL. Tutti i PEG coniugati con fosfolipide ed i PEG coniugati con fosfolipide e funzionalizzati con la maleimide, riportati in precedenza, sono prodotti commerciali distribuiti da Avanti Polar Lipids (https://avantilipids.com), il suo distributore Europeo Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com), NanoCS (http://www.nanocs.com), Creative PEGWORKS (https://www.creativepegworks.com), BioCHemPEG (https://www.biochempeg.com/content/xtheme/hunanhuateng/default.aspx), Iris Biotech (https://www.iris-biotech.de).
In questa struttura gioca un ruolo fondamentale il PEG che funge da copolimero di rivestimento del core lipofilo dei nanoaggregati, ed espone la proteina terapeutica sulla superficie del derivato micellare senza modificarne l?attivit? intrinseca verso le cellule ed i tessuti bersaglio che esprimono sulla loro superficie i recettori della famiglia del TRAIL. Inoltre, il PEG stabilizza i nanoaggregati micellari ottenuti impedendo la formazione di ponti di solfuro e la conseguente aggregazione tra i monomeri della proteina. La struttura anfipatica del PEG favorisce anche l?adsorbimento sulla superficie dei nanoaggregati micellari di molecole idrosolubili che possono essere co-veicolati con i derivati liposolubili incapsulati/complessati nel core lipofilo dei nanoaggregati.
Per migliorare le propriet? biofarmaceutiche, aumentare l?attivit? terapeutica di KillerTRAIL,e ridurne la resistenza da parte delle cellule tumorali primarie, la proteina pro-apoptotica ? stata quindi modificata, coniugando il derivato fosfolipide-PEG, preferibilmente DSPE-PEG. Questo processo di sintesi pu? essere eseguito in un singolo processo di reazione che prevede gli step fondamentali seguenti:
- Preparare una soluzione acquosa tamponata ad un pH 5-8 contenente la proteina della famiglia TRAIL in forma monomerica;
- Aggiungere il backbone polimerico fosfolipide-PEG-maleimide in rapporto 1:4 (TRAIL: backbone) e mantenere sotto agitazione, fino a completamento della reazione mediante la comparsa del picco cromatografico in HPLC dopo 4 h d?incubazione(Esempio 4, Figura 1).
La proteina del gruppo TRAIL pu? essere preventivamente purificata.
Al termine del processo di coniugazione pu? essere aggiunto uno step di purificazione del coniugato per eliminare i componenti non reagiti (TRAIL e backbone) ed un ulteriore step di liofilizzazione.
Eventualmente, lo step di liofilizzazione pu? essere preceduto, seguito o sostituito da uno step in cui si combina il coniugato con uno o pi? farmaci lipofili, come descritto successivamente. ? stato verificatoche questo processo di sintesi non modifica l?attivit? terapeutica della proteina nativa n? in vitro n? in vivo (Figure 10 e 11).
Il coniugato ottenuto (fosfolipide-PEG-TRAIL) ha caratteristiche anfifiliche che possono essere sfruttate per veicolare sinergicamente farmaci lipofili e anfipatici, mantenendo inalterate sia l?attivit? targhettantesia quella terapeutica del TRAIL, come KillerTRAIL. Infatti, la porzione lipofila del coniugato fosfolipide-PEG-TRAIL (ad esempio DSPE-PEG-KillerTRAIL) in ambiente acquoso si organizza in modo da formare nanoaggregati, costituti da un core idrofobico interno capace di incapsulare/complessare farmaci lipofili come ad esempio, ma non limitatamente a: Paclitaxel, Docetaxel, Campothecina, Etoposide, Doxorubicina base anidra, irinotecan base anidra, vascular endothelial growth factor (VEGFR) inhibitors (es. Cabozantinib, Nintedanib), Wnt/?-catenin modulators (es.XAV-939 (CAS NO. 284028-89-3), ICG-001(CAS NO. 780757-88-2)), Hedgehog inhibitors (es. SANT75 [73], HPI1 Antibody o HIC04F9(https://www.thermofisher.com/antibody/product/HPi1-Antibody-clone-HIC0-4F9-Monoclonal/MA5-16126)), PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)/(Protein kinase B) Akt/(mammalian target of rapamycin) mTOR modulators (es. Rapamycin, Buparlisib), o anfifilici in funzione del loro peso molecolare e dei parametri chimico-fisici, come ad esempio alcuni peptidi naturali con potente attivit? antitumorale [59,60].
Le catene di PEG e la proteina TRAIL ricoprono la superficie esterna dei nanoaggregati micellari e si dispongono verso l?ambiente acquoso esterno formando il suo rivestimento polimerico. Questa organizzazione spaziale fa in modo che la proteina nativa TRAIL, che ha un?azione targhettante oltre che terapeutica, sia presente sulla superficie dei nanoaggregati micellari e si leghi alle cellule e tessuti tumorali che esprimono sulla loro superficie i recettori della famiglia del TRAIL.
Il nuovo derivato ottenuto, fosfolipide-PEG-TRAIL,in particolare il fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, ? stato caratterizzato sia sotto il profilo chimicofisico che biologico.
Considerando in particolare le caratteristiche del KillerTRAIL [61], le strategie di veicolazione adottate sono state tali da garantire una modulazione delle caratteristiche biofarmaceutiche della proteina senza alterare la capacit? di legame con il substrato cellulare. La coniugazione effettuata sul gruppo tiolico della cisteina nella catena polipeptidica della proteina, in particolare di KillerTRAIL, non ha influenzato le propriet? dilegame con la famiglia dei recettori del TRAIL.
Particolarmente preferito ? il composto fosfolipide-PEG, ad esempio quello con peso molecolare di 2000Da, derivatizzato all?estremit? carbossilica con un fosfolipide di uso comune e assolutamente atossico, come ad esempio la distearoil-fosfatidiletanolammina (DSPE) gi? presente in commercio e comunemente utilizzato per la preparazione di sistemi vescicolari ad uso farmaceutico [62]. Questo lipide, come altri lipidi, ? inserito nella lista di fosfolipidi coniugati al PEG riportati precedentemente nell?invenzione.
All?altra estremit? della catena polimerica del PEG sono generalmente presenti gruppi funzionali di vario tipo. Per le finalit? della presente invenzione ? preferibile utilizzare il gruppo maleimidico, che reagisce facilmente con il gruppo tiolico della proteina, preferenzialmente KillerTRAIL, favorendo la formazione di un legame stabile che funge da ponte tra il PEG e la proteina. La presenza di un gruppo maleimidico all?estremit? della catena di PEG, opposta a quella coinvolta nel legame con il fosfolipide, permette cos? il legame con la cisteina in posizione 230 della catena proteica del TRAIL, in particolare il KillerTRAIL, come gi? riportato in precedenza nel corso dell?invenzione, tramite la reazione di addizione simmetrica di Michael [58].
? stato verificato che il composto cos? ottenuto non preclude l?attivit? del KillerTRAIL, anzi, ne riduce la tossicit? a breve e a lungo termine e, rimanendo all?interno della finestra terapeutica, aumenta l?emivita della proteina stessa, prolungando la finestra terapeutica, cio? il tempo che intercorre fra una somministrazione e l?altra, aumentando il targeting molecolare sul substrato cellulare. Inoltre, ? importante sottolineare che la metodica di sintesi proposta ? assolutamente priva di rischi in quanto non vengono utilizzati solventi organici, n? composti tossici di alcun genere in nessuna fase di sviluppo dello schema di sintesi (Schema 1). Questo aumenta significativamente la tollerabilit? del composto, con un costo contenuto del processo sintetico e la rapidit? nelle fasi di purificazione dei coniugati dalle molecole non reagite.
Lo schema di sintesi del prodotto fosfolipide-PEG-KillerTRAIL che porta alla formazione dei nanoaggregati a struttura micellare pu? essere quindi cos? schematizzato nei suoi step fondamentali:
- Far reagire la proteina TRAIL o suo derivato o suo mutante, in particolare KillerTRAIL, con ilfosfolipide-PEG-gruppo attivoin tampone fosfato per circa 7 ha temperatura ambiente;
- Aggiungere il farmaco lipofilo prescelto in funzione del tipo di patologia che si vuole aggredire. Un esempio di farmaci che possono essere scelti e che non escludono per? nessun principio attivo lipofilo di nuova o vecchia sintesi attualmente non presenti, sono: paclitaxel, docetaxel, campothecina, etoposide, doxorubicina base anidra, irinotecan base anidra, piccole molecole con attivit? antitumorale quali: vascular endothelial growth factor (VEGFR) inhibitors (es. Cabozantinib, Nintedanib), Wnt/?-catenin modulators (es. XAV-939 (CAS NO.
284028-89-3), ICG-001(CAS NO. 780757-88-2)), Hedgehog inhibitors (es. SANT75 [73], HPI1Antibody o HIC0-4F9 (https://www.thermofisher.com/antibody/product/HPi1-Antibody-clone-HIC0-4F9-Monoclonal/MA5-16126)), PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)/(Protein kinase B)Akt/(mammalian target of rapamycin) mTOR modulators (es.
Rapamycin, Buparlisib);
- Disperdere i composti lipofili e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL in una soluzione isotonica a pH fisiologico, come ad esempio tampone fosfato, acqua, soluzione fisiologica allo 0.9% (p/v); soluzione di glucosio al 5% (p/v), per favorire a formazione del nanoaggregato a struttura micellare;
- Purificare il composto cos? ottenuto e in caso, si renda necessario, procedere con ulteriori processi di purificazione, da un minimo di 2 ad un massimo di 10.
La successiva valutazione della solubilit? in acqua del derivato ottenuto ha dimostrato che pi? dell?80%, anche pi? dell?85% del coniugato oggetto della seguente invenzione, preferibilmente circa l?87% nel caso di DSPE-PEG-KillerTRAIL, ? solubile in tampone fosfato (PBS), o altro mezzo acquoso, a pH intorno alla neutralit?, a 37?C, dopo 80 h d?incubazione. Al contrario, nelle stese condizioni d?incubazione, il KillerTRAIL non funzionalizzato/derivatizzato forma aggregati che precipitano in PBS diminuendo drasticamente la concentrazione di proteina nativa in soluzione (circa il 40% gi? dopo sole 2 hd?incubazione).
Il processo dell?invenzione, che comprende tutte le proteine della famiglia dei ligandi di TNF ed in particolare del TRAIL (nota anche come TNFSF10, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L), delle sue varianti mutanti che differiscono in almeno una posizione di aminoacidi dalla proteina TRAIL wild type (nota anche come TNFSF10, TL2; APO2L; CD253; Apo-2L), (Entrez GenelD: 8743; numero di accesso NM_003810.2; UniProtKB/Swiss-Prot: P50591; UniProtKB / TrEMBL: Q6IBA9),del KillerTRAIL,comprende le seguenti fasi:
i. La proteina ? stata purificata in modo preliminare mediante dialisi in tampone fosfato (PBS) a pH 7.4 in presenza di EDTA 0.05mM, utilizzando membrane da dialisi con cut-off di 2000 Da per eliminare il ditiotreitolo (DTT) utilizzato nella soluzione di stoccaggio della proteina stessa. Il campione purificato ? stato successivamente analizzato mediante spettroscopia UV/Vis e Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC).In queste condizioni sperimentali la proteina KillerTRAIL si trova in forma monomerica.
ii. Alla soluzione tampone contenente la citochina della famiglia TRAIL prescelta, preferibilmente KillerTRAIL (1mg/mL) viene aggiunto il fosfolipide-PEG-maleimide in rapporto molare 1:4 (proteina:PEG). La miscela di reazione viene mantenuta sotto costante agitazione a temperatura ambiente fino a completamento della reazione. L?andamento della reazione pu? essere monitorato mediante il prelievo, a diversi tempi d?incubazione, di un?aliquota (25 ?L) di campione per eseguire l?analisi cromatografica.
iii. A reazione completata, monitorata grazie RP-HPLC (Esempio 4, Figura 1) e la tecnica elettroforetica SDS-PAGE (Esempio 5, Figura 2), il prodotto di reazione viene nuovamente purificato utilizzando una membrana da dialisi (cut-off 30000 Da) per eliminare la quantit? residua di proteina che non ha reagito durante la sintesi del composto. ? stata sviluppata e validata inoltre una metodica cromatografica di gel filtrazione per eliminare la quantit? residua di fosfolipide-PEG-maleimide (utilizzato in eccesso) e di KillerTRAIL che non hanno reagito durante il processo di sintesi. Tale metodica ? stata eseguita mediante una tecnica di gel filtrazione successivamente descritta.
iv. La proteina funzionalizzata con il fosfolipide-PEG pu? essere liofilizzata e pu? essere conservata alla temperatura di -20?C per gli usi successivi. v. Il coniugato cos? prodotto e purificato pu? essere somministrato tal quale o, nel caso in cui si scelga di co-somministrare in modo sinergico altri farmaci lipofili o amfifilici, il farmaco verr? dispersocon il prodotto fosfolipide-PEG-KillerTRAIL per ottenere un nanoaggregato micellare e successivamente quantificato, come riportato in letteratura [63,64].
La resa di reazione ottenuta ? stata maggiore del 42.3%, per tutti i coniugati ottenuti, risultando essere in linea con la quantit? di proteina necessaria per esplicare la sua azione terapeutica. Al fine di aumentare la resa, la stessa reazione ? stata condotta in ambiente denaturante reversibile (guanidinio 6 M). La resa di reazione ottenuta ? stata simile a quella ottenuta nelle precedenti condizioni di reazione. La presenza della macromolecola lipidica fosfolipide-PEG diminuisce la stretta interazione fra la proteina (KillerTRAIL) e il gruppo maleimidico del PEG, riducendo la formazione di un numero di legami maggiori tra la proteina nativa e lo stesso gruppo maleimidico del PEG riducendo leggermente la resa di reazione rispetto al coniugato mPEG-KillerTRAIL. Questa leggera diminuzione della resa del prodotto di reazione non modifica l?attivit? terapeutica della proteina KillerTRAIL poich? ? comunque ottenuta una concentrazione della proteina attiva, nel coniugato, superiore alla dose terapeutica richiesta per la sua attivit?. Inoltre, la presenza di KillerTRAIL sulla superficie degli aggregati micellari aumenta l?interazione con i recettori specifici della proteina, espressi sulle cellule tumorali, e produce di conseguenza un maggiore effetto terapeutico e targhettante rispetto al KillerTRAIL.
In relazione ai punti precedenti i e ii, per soluzione tampone si intendono PBS, tampone fosfato, a pH compreso fra 5 e 8, preferibilmente fra 6.8 e 7.5, perch? un pH pi? basso denaturerebbe in modo irreversibile la proteina, invece, un pH pi? alto permetterebbe il legame dei gruppi amminici delle proteine, pi? reattivi dei tioli a pH<8.
La sperimentazione in vivo (Esempio 11, Figura 10 e Figura 11) ? stata eseguita su ratti maschi (6 settimane d?et?, peso circa 200 gr) per la valutazione della farmacocinetica e della biodistribuzione, e su topi Balb/c (4-5 settimane d?et?, peso medio 20-25 gr), in cui ? stato sviluppato il tumore (xenograft) mediante inoculazione di cellule di carcinoma al colon HTC116.
I risultati ottenuti hanno dimostrato: i) un miglioramento dei parametri farmacocinetici di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL rispetto al solo KillerTRAIL (emivita o t1/230.3 volte superiore del derivato lipidico PEGhilato rispetto alla proteina nativa); ii) un aumento della biodistribuzione sistemica del nanoaggregato micellare di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL rispetto alla proteina nativa, ed in particolare una maggiore permanenza nel circolo sistemico di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL con una selettivit? per il tessuto tumorale che esprime i recettori di superficie della famiglia del TRAIL ed in particolare del KillerTRAIL e, contestualmente, una diminuzione del suo accumulo passivo negli organi del sistema reticolo endoteliale (RES); iii) un aumento dell?attivit? antitumorale in vivo.
L?attivit? antitumorale in vivo su topi Balb/c,in cui sono state impiantate all?interno dell?organo (xenograft) cellule di carcinoma del colon HTC116, ? stata valutata misurando l?aumento del volume del tumore nell?arco temporale di 20 giorni dall?inizio della terapia dopo somministrazione di una dose equivalente a0.04 mg/kg di proteina libera o di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL come nanoaggregati micellari ogni 4 giorni) (Esempio 11, Figure 10 e Figura 11). Il nanoaggregato micellare formato da fosfolipide-PEG-KillerTRAIL si ? dimostrato pi? attivo del KillerTRAIL libero, riducendo la crescita della massa tumorale del 60% rispetto al 31.25% del KillerTRAIL libero (Esempio 11, Figure 10 e Figura 11). Le differenze ottenute dipendono dal legame selettivo del fosfolipide-PEG-KillerTRAIL verso il tessuto tumorale, rispetto alla proteina nativa, da un suo maggiore accumulo nella massa tumorale e delle migliori propriet? biofarmaceutica e farmacocinetica del derivato micellare rispetto alla proteina nativa (Esempio 11, Figura 8).
Un ulteriore obiettivo di questa ricerca ? stato quello di valutare in modo dettagliato l?azione targhettante del TRAIL per ottenere un effetto, oltre che terapeutico, anche diagnostico in presenza di un agente radio marcante inserito nei nanoaggregati micellari. Il TRAIL infatti ha propriet? di targeting attivo che promuovono il legame dei nanoaggregati micellari ottenuti verso le cellule esprimenti i recettori della famiglia di TRAIL, in particolare KillerTRAIL, favorendo in questo modo anche l?individuazione di vasi e/o tessuti neoformati o metastasi in fase iniziale ed espletando in tale sede anche la sua potente attivit? terapeutica. La presenza di queste propriet? biofarmaceutiche e l?aggiunta del radio marcato rendono questo nanoaggregato micellare un potenziale agente teranostico, come riportato in seguito.
I coniugati polimerici ottenuti possono essere utilizzati per tutte quelle patologie in cui ? stata valutata la presenza dei recettori di morte cellulare programmata (Apoptosi) della famiglia del KillerTRAIL e dei derivati ad essi correlati, implicati in una serie di patologie tumorali, immunitarie, angiogenetiche e sul turnover osseo. TRAIL pu? legarsi a cinque diversi recettori trovati su una variet? di tipi di cellule: quattro recettori di membrana e un recettore solubile. Due di questi recettori di membrana, TRAIL-R1/recettore di morte 4 (DR4) e TRAIL-R2/recettore di morte 5 (DR5), agiscono come recettori agonisti, contenenti un dominio di morte citoplasmatico attraverso il quale TRAIL pu? trasmettere un segnale apoptotico. Gli altri due recettori di membrana, TRAIL-R3/decoy receptor 1 (DcR1) e TRAIL-R4 / decoy receptor 2 (DcR2), agiscono come recettori antagonisti / regolatori, privi del dominio responsabile della morte cellulare programmata. Oltre a questi quattro recettori transmembrana, ? stato identificato un quinto recettore antagonista solubile l?osteoprotegerina (OPG), responsabile del turnover osseo. Le patologie cui si fa principalmente riferimento sono varie tipologie di tumori solidi e liquidi, malattie infiammatorie e autoimmuni che esprimono sulla superficie delle cellule e dei tessuti i recettori apoptotici della famiglia del TRAIL, in particolare KillerTRAIL (Tabella 1).
Tabella 1: Alcune patologiele cui cellule sovraesprimono i recettori di morte cellulare programmata appartenenti alla citochina TRAIL, in particolare KillerTRAIL.
Leucemia
Carcinoma al seno
Carcinoma della prostata
Carcinoma polmonare
Carcinoma renale
Carcinoma pancreatico
Alzheimer
Melanoma
Sindrome mielodisplastica
Linfomi
Carcinoma epatico
Randomiosarcoma
Glioma
Carcinoma polmonare non a piccole cellule
Virus dell?epatite B
Virus dell?epatite C
Steatosi epatica non correlate all?abuso di
alcool
Fibrosi epatica
Cirrosi
Mesotelioma
Ipertensione arteriosa polmonare
Sclerosi sistemica
Carcinoma della cervice uterina
Fibrosi polmonare
Asma
Virus influenzale
Aterosclerosi
Lupus eritematoso
Sclerosi multipla
HIV
Sclerosi laterale amiotrofica
Citomegalovirus
Artrite reumatoide
Miastenia gravis
Fra le patologie pi? studiate riportiamo il carcinoma pancreatico (adenocarcinoma duttale del pancreas e i tumori neuroendocrini, che originano dalle cellule delle isole di Langerhans), il carcionoma polmonare non a piccole cellule (carcinoma a cellule squamose), il carcinoma a grandi cellule e l?adenocarcinoma, che a sua volta si suddivide in sarcomatosi e linfomi polmonari), il carcinoma della cervice uterina (carcinoma a cellule squamose e adenocarcinoma), il mesotelioma(che colpisce e si differenzia in vari tessuti: polmone (pleura), il cuore (pericardio), l?intestino (peritoneo) e i testicoli (tunica vaginale),il rabdomiosarcoma(embrionale e alveolare), i gliomie relativi sottotipi (glioblastoma, astrocitoma anaplastico, astrocitoma diffuso, astrocitoma pilocitico, altri astrocitomi, oligodendroglioma, ependimoma e altri), la leucemia linfocitica cronica.
Le preparazioni farmaceutiche contenenti il coniugato polimerico PEG-KillerTRAIL secondo l?invenzione possono essere ottenute mescolando questo coniugato polimerico con coadiuvanti, eccipienti o stabilizzanti che rispettano i requisiti richiesti per gli eccipienti ad uso farmaceutico presenti in commercio [65], sotto forma di formulazioni liofilizzate, soluzioni o sospensioni acquose. I vettori, gli eccipienti o gli stabilizzanti utilizzati sono preferibilmente scelti fra: tamponi come tris-(idrossimetil)-amminometano cloridrato (Tris-HCl), 4-(2-idrossietil)-1-piperazine-acido etansulfonico (HEPES), fosfato, citrato e altri acidi organici; antiossidanti tra cui acido ascorbico e metionina; conservanti, come ottadecildimetilbenzil ammonio cloruro, esametonio cloruro, benzalconio cloruro, benzetonio cloruro, fenolo, butil o benzil alcol, alchil parabeni (metil o propil parabene); catecolo; resorcinolo; cicloesanolo; 3-pentanolo; polipeptidi a basso peso molecolare (meno di circa 10 residui); proteine, come albumina sierica, gelatina o immunoglobuline; polimeri idrofili come polivinilpirrolidone; amminoacidi come glicina, glutammina, asparagina, istidina, arginina o lisina; monosaccaridi, disaccaridi e altri carboidrati inclusi glucosio, mannosio o destrine; zuccheri come saccarosio, mannitolo, trealosio o sorbitolo; contro-ioni formanti sale come sodio; e / o tensioattivi non ionici come TWEEN<TM>, PLURONICS<TM >o polietilenglicole (PEG).
Ulteriori esempi di questi eccipientiincludono scambiatori di ioni, come allumina, stearato di alluminio; lecitina; sostanze tampone, come glicina, acido sorbico, sorbato di potassio; miscele di gliceridi parziali di acidi grassi vegetali saturi; acqua;Sali, o elettroliti, come protamina solfato, idrogeno fosfato disodico, idrogeno fosfato di potassio, cloruro di sodio; silice colloidale; trisilicato di magnesio; polivinil-pirrolidone e sostanze a base di cellulosa.
Gli eccipienti per realizzare forme farmaceutiche per applicazioni topiche o gel comprendono:polisaccaridi, come carbossi-metil-cellulosa o metil-cellulosa, polivinilpirrolidone, poliacrilati, polimeri a blocchi di etilene-propilene, polietilenglicole e cere. Per tutte le somministrazioni, vengono opportunamente utilizzati le forme farmaceutiche a rilascio modificato. Tali forme includono, ad esempio, microcapsule, nanocapsule, liposomi, cerotti, forme di inalazione, spray nasali, compresse sublinguali e preparazioni a rilascio prolungato.
I coniugati polimerici di TRAIL (fosfolipide-PEG-TRAIL, ed in particolare fosfolipide-PEG-KillerTRAIL) da utilizzare per la somministrazione in vivo devono essere sterili ed apirogeni. Ci? viene facilmente realizzato mediante filtrazione attraverso membrane di filtrazione sterilizzanti, prima o dopo la liofilizzazione e la loro ricostituzione sotto forma di soluzione, sospensione o emulsione. I coniugati polimerici ed i coniugati fosfolipide-polimero di TRAIL, in particolare i coniugati polimerici di KillerTRAIL o fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, sono normalmente conservati in forma anidra, ad esempio liofilizzata, o in soluzione se utilizzati per somministrazione sistemica. Se in forma liofilizzata, i coniugati polimerici di TRAIL sono tipicamente formulati in combinazione con altri ingredienti, appartenenti a quelli elencati in precedenza, per la ricostituzione con un diluente appropriato al momento dell'uso. Un esempio di una formulazione liquida ? una soluzione sterile, limpida, incolore, non conservata, riempita in un flaconcino monodose per iniezione sottocutanea, intramuscolare, o endovenoso.
Le formulazioni possono essere ad esempio poste in un contenitore provvisto di una porta di accesso sterile, ad esempio un sacchetto o una fiala di soluzione per endovenosa avente un tappo perforabile da un ago da iniezione ipodermico. Le formulazioni sono preferibilmente somministrate come iniezioni o infusioni ripetute per via endovenosa (i.v.), sottocutanea (s.c.), intramuscolare (i.m.), o come aerosol adatte per il rilascio intra-nasale o intra-polmonare.
I coniugati qui descritti e sintetizzatipossono essere utilizzati per via parenterale, insieme a veicoli quali acqua, soluzioni tamponi, soluzione fisiologica, stabilizzanti (ad esempio antiossidanti), agenti chelanti (ad esempio EDTA), e posso essere prodotti in condizioni di sterilit? ed apirogenicit?. Con il termine parenterale si definisce il tipo di somministrazione tramite lesione attraverso i tegumenti esterni ed immissione del medicinale direttamente in circolo (ad esempio la via intradermica, la via sottocutanea, la via intramuscolare e la via endovenosa).
I coniugati sintetizzati possono essere somministrati a diverse dosi terapeutiche, incrementando l?efficacia della terapia in termini di durata dell?effetto terapeutico (effetto dovuto alla riduzione della clearance renale) e riduzione della formazione di immunocomplessi (dovuta all?ingombro sterico dei polimeri che impedisce l?aggregazione di pi? molecole proteiche). I dosaggi ottimali saranno comunque individuati dal medico curante in funzione della tipologia di affezione e delle condizioni del paziente.
Inoltre, i coniugati sintetizzati permettono l?accumulo di KillerTRAIL nel tessuto tumorale, mediante targeting passivo, sfruttando il fenomeno di Enhanced Permeation and Retention (EPR). Questo tipo di fenomeno riduce la dose di KillerTRAIL che si potrebbe accumulare nei tessuti sani provocando degli effetti collaterali.
Per quanto riguarda l?utilizzo dell?invenzione per scopi diagnostici, ? possibile prevedere la medesima sintesi utilizzando la stessa proteina TRAIL, radio marcata con <125>I [66,67] o <188>Re/<188>W [68]. Alla formulazione da somministrare si aggiunge, oltre alle sostanze elencate in precedenza,la proteina PEGhilata radio-marcata in modo da poterla tracciare, dopo somministrazione sistemica,tramite le classiche tecniche di diagnostica per immagini come ad esempio risonanza magnetica nucleareassociata alla tomografia a emissione di positroni e alla tomografia assiale computerizzata associata alla tomografia a emissione di positroni (rispettivamente RMN/PET e TAC/PET). Sempre secondo quanto riportato in letteratura [66], la presenza del radioisotopo pu? aumentare la stabilit? in plasma e l?efficacia terapeutica, facendo ipotizzare che il derivato fosfolipide-PEG-TRAILradio-marcato:
- Riduce gli effetti collaterali della proteina nativa appartenente alla famiglia del TRAIL, in particolare KillerTRAIL ed aumenta la stabilit? della suddetta proteina nativa riducendo la potenziale formazione di aggregati,
- Riduce il metabolismo della proteina nativa e aumenta l?efficacia diagnostica e terapeutica della proteina nativa appartenente alla famiglia del TRAIL, ed in particolare il KillerTRAIL.
Le preparazioni farmaceutiche che contengonoi coniugati della proteina pro-apoptotica TRAIL, ed in particolare KillerTRAIL, possono essere somministrate in combinazione anche con altri agenti terapeutici aggiuntivi alla formulazione stessa per avere un effetto sinergico, come ad esempio: 5-fluorouracile, irinotecan (Campotecina-11 o CPT-11)[69]e/o essere somministrate in combinazione con radiazioni ionizzanti [70] e/o agenti diagnostici anche radio-marcati, come <125>I, <188>Re, <188>W e relative combinazioni.
? importante evidenziare che, secondo la letteratura riportata nei paragrafi precedenti, la proteina Apo-2L TRAIL e di conseguenza anche la variante KillerTRAIL, sono proteine che esistono in forma trimerica e come tali esplicano la loro azione terapeutica. La PEGhilazione di TRAIL o di KillerTRAIL secondo l?invenzione ha invece prodotto una nuova entit? macromolecolare contenete il polimero PEG, a diversi pesi molecolari come indicato in precedenza, e una proteina della famiglia del TRAIL, in particolare KillerTRAIL,che si mantiene monomerica anche dopo somministrazione. Questa nuova entit? macromolecolare si ? dimostrata migliorare le propriet? terapeutiche e biofarmaceutiche del TRAIL trimerico non coniugato. Il miglioramento ? da considerarsi sui vari punti di seguito elencati:
1) Il dosaggio utilizzato ? significativamente minore.
2) L?efficacia terapeutica viene mantenuta o anche aumentata nel tempo dopo la somministrazione di PEG-KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
3) PEG-KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono non tossiche dopo somministrazione sistemica nei modelli animali utilizzati per la sperimentazione.
Per quelle patologie per cui sono stati appurati gli effetti positivi di questa terapia, i vantaggi dell?invenzione riguardano inizialmente l?aumento dell?emivita plasmatica del KillerTRAIL, rispetto alla proteina nativa, dovuto alla presenza del polimero mPEG o fosfolipide-PEG che riesce a proteggere la proteina dalla degradazione dovuta agli enzimi plasmatici. Questo porta un aumento temporale dell?attivit? terapeutica e quindi ad una diminuzione delle dosi somministrate, oppure ad un prolungamento dei tempi che intercorrono fra una dose e quella successiva (intervallo tra le dosi somministrate).
La diminuzione della concentrazione per singola dose o la diminuzione del numero di dosi necessarie per ottenere l?effetto terapeutico, riduce l?effetto tossico del KillerTRAIL (epatotossicit?, tossicit? sul sito di inoculo edeffetti collaterali gravi dovuti all?aumento della stimolazione dei recettori del TNF anche nei tessuti sani, quali la MOD, multiple organ failure) e aumenta inoltre la compliance del paziente. Tutti questi effetti positivi migliorano l?approccio terapeutico delle malattie invalidanti precedentemente elencate (Figura 12).
La PEGhilazione della proteina KillerTRAIL ? stata effettuata direttamente sulla cys230, e inaspettatamente il processo di coniugazione ha determinato un aumento della stabilit?, delle propriet? biofarmaceutiche e dell?attivit? della proteina nativa della famiglia del TRAIL, in particolare del KillerTRAIL. Come si pu? chiaramente evincere dalla Figura 10,la proteina PEGhilata risulta mantenere l?attivit? terapeutica a dosaggi molto bassi sia nella forma non PEGhilata che PEGhilata, dove la riduzione del volume tumorale risulta significativa anche 15 giorni dopo la fine del trattamento. La PEGhilazione tuttavia aumenta l?efficacia terapeutica della proteina KillerTRAIL del 60% rispetto alla proteina nativa non PEGhilata (31.25%). Il protocollo terapeutico prevede la somministrazione giornaliera di 0.04 mg/kg (corrispondente alla proteina KillerTRAIL) per 7 giorni (equivalente quindi a 0.28 mg/kg di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL equivalente alla quantit? di proteina nativa) e la valutazione della variazione del volume tumorale dal tempo 0 (primo inoculo) per i successivi 15 giorni a partire dal settimo giorno di trattamento, per un totale di 21 giorni. I risultati sperimentali ottenuti dimostrano che il derivato PEGhilato del KillerTRAIL ed il derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL aumentano:
1) L?efficacia terapeutica della proteina nativa;
2) L?attivit? terapeutica della proteina nativa dopo singola somministrazione di PEG-KillerTRAIL e/o fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
I trattamenti terapeutici sui modelli animali, utilizzati per la sperimentazione in vivo, sono stati stoppati dopo 21 giorni di trattamento in quanto gli animali, che sviluppano il tumore, ed utilizzati come controllo, e quelli trattati con la proteina nativa KillerTRAIL, non sono sopravvissuti oltre i 21 giorni di trattamento, contrariamente a quelli trattati con la PEG-KillerTRAIL e/o fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
Inoltre, la coniugazione con il PEG,sull?unico residuo di cisteina presente nella proteina nativa in posizione 230 (cys 230), impedisce la trimerizzazione della proteina pro-apoptotica TRAIL, ed in particolare KillerTRAIL. Questa procedura pertanto permette non solo di PEGhilare il singolo monomero della proteina KillerTRAIL, ma anche di impedirne la trimerizzazione. Dati sperimentali, relativamente allo studio di spettroscopia di massa MALDI-TOF, effettuato sul coniugato PEG2000Dacon il Killer-TRAIL, indicano la presenza di picchi di frammentazione riferiti al peso molecolare assoluto del PEG (2119,4 Da) e del monomero KillerTRAIL PEGhilato (24008,6 Da). Infatti, il peso molecolare del singolo filamento di KillerTRAIL corrisponde a circa 22000 Da, come riportato dal produttore, e come presente nel database di riferimento Expasy.org (https://www.expasy.org). Questo effetto si evidenzia nell?attivit? e nell?efficacia del fosfolopide-PEG-TRAIL in modo assolutamente inaspettato, garantendo l?ulteriore vantaggio di una co-somministrazione di TRAIL con farmaci antitumorali lipofili o anfifilici co-veicolati utilizzando gli aggregati micellariottenuti con il coniugato. ? stata studiata la differenza fra il coniugato PEG-KillerTRAIL e il coniugato micellare DSPE-PEG-KillerTRAIL e, nel caso in cui sia necessario co-somministrare farmaci lipofili o anfipatici, i dati ottenuti risultato statisticamente significativi (Figura 11). Si riporta come esempio, all?interno dell?invenzione, il grafico relativo alla comparazione dei due coniugati per la riduzione del volume della massa tumorale in topi impiantati (xenografat)con cellule di carcinoma del colon HTC116 (Figura 11).Questi dati dimostrano che il coniugato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ha un effetto statisticamente significativo relativamente alla riduzione della massa tumorale sia rispetto al KillerTRAIL che rispetto al coniugato PEG-KillerTRAIL. Questa riduzione ottenuta sul volume della massa tumorale potrebbe essere ulteriormente migliorata co-veicolando all?interno della formulazione un farmaco lipofilo o anfipatico, che potrebbe avere un?azione sinergica con la proteina nativa, riducendone la resistenza. L?aumento della efficacia terapeutica in vivo di PEG-KillerTRAIL e di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ? un risultato inatteso, in quanto l?ingombro sterico del PEG avrebbe potuto impedire il legame della proteina nativa KillerTRAIL con i recettori della morte cellulare programmata, espressi sulla superficie delle membrane delle cellule, e ridurne quindi l?effetto terapeutico.
Gli esempi seguenti sono da considerare illustrativi e non limitativi della portata della presente invenzione.
Esempi
Materiali
Il KillerTRAIL ? stato acquistato dalla Enzo Lifescience (Firenze, Italia) ((http://www.enzolifesciences.com/ALX-201-073/killertrail-protein-solublehuman-recombinant/).
Distearoil-fosfatidil-etanolammina-PEG-maleimide e gli altri fosfolipidi PEGhilati (Peso molecolare2-200kDa)sono stati acquistatida Iris Biotech (Germania) eda Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA). L?acido etilendiammino tetracetico (EDTA), soluzione di tampone fosfato (PBS), i reagenti per il saggio dell?Acido bicinconinico, il kit per il saggio ELISA utilizzato per la quantificazione del TRAIL, l?acido picrilsulfonico, il 5,5?-ditio-bis(2-nitrobenzoate), l?acrilammide, labisacrilammide, il persolfato d?ammonio, N,N,N?,N?-tetrametiletilenediamina(TEMED), la glicina, il blue brillante comassie, il blu di bromofenolo,le resine per cromatografia liquidasono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich (Milano, Italia). Le membrane da dialisi sono state acquistate da Spectrum Laboratories Inc. (Eindhoven, The Netherlands).Tutte le soluzioni acquose sono state preparate utilizzando acqua deionizzata (milliQgrade, 18.2 MSZ) ottenuta mediante un sistema Millipore MilliQ (MA, USA).Tutti i solventi ed i reattivi utilizzati sono stati scelti tra quelli specifici per HPLC o con grado di purezza tra quelli disponibili in catalogo da Sigma-Aldrich (Milano, Italia) o Carlo Erba (Milan, Italia).
I coniugati ottenutisono stati caratterizzati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), utilizzando una colonna C18 infase inversa (C18 RP-HPLC) che non interferisce con la proteina nativa durante l?analisi,ed un rivelatore UV/Vis. Questa metodica ? stata usata per monitorare l?andamento della reazione, determinarne il completamento, quantificare la resa e purificare i derivati ottenuti, secondo quanto riportato nella seguente sezione.
I prodotti di reazione sono stati analizzati utilizzando diversi saggi colorimetrici (BCA, Habeeb, USA), per determinare la concentrazione di KillerTRAILin soluzione e la presenza di PEG interferente che non ha reagito nel corso della reazione di sintesi.
Per quantificare l?esatto peso molecolare dei prodotti della reazione, i coniugati ottenuti sono stati sottoposti a spettroscopia di massa MALDI/TOF.
Grazie all?utilizzo del sistema Field Flow Fractionation asimmetrico, ? stato possibile determinare la presenza di nanoaggregati stabili ottenuti dopo riarrangiamento della macromolecola anfifilica costituita da fosfolipide-PEG-KillerTRAIL in ambiente acquoso, confermando l?ipotesi di partenza che questo composto potesse formare dei nanoaggregati micellari. Questo dato ? stato confermato anche dall?analisi mediante spettroscopia di fotocorrelazione (dynamic light scattering, DLS).
Studi di spettroscopia di fotocorrelazione (scattering dinamico di luce) sono stati condotti per confermare la presenza di nanoaggregati e valutare la loro omogeneit? (indice di polidispersione).
Il fosfolipide-PEG-KillerTRAIL? stato sottoposto a studi di elettroforesi, in condizioni denaturanti, confermando i datidi cromatografia, al fine di dimostrare l?assenza di dimeri, trimeri o aggregati proteici alla fine della reazione.
La stabilit? di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL? stata valutata confrontando il derivato ottenuto con la stabilit? della proteina nativa in tampone fosfato (PBS) a diversi tempi d?incubazioneed a temperatura ambiente. Le analisi a pH neutro(7.4, PBS) e acido (5, PBS), sono predittive del comportamento del derivato di sintesi durante la sua conservazione. La stabilit? ? stata anche valutata su fluidi biologici (plasma), per simulare le propriet? biofarmaceutiche di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAILnel torrente circolatorio dopo somministrazione sistemica.
KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono stati poi valutati in vitro su cellule di carcinoma epatico HTC116 per valutare la loro attivit? terapeutica (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromide o MTT test) dei derivati ottenuti rispetto alla proteina nativa KillerTRAIL.
I test in vivo di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono stati eseguiti su modelli murini (xenograft) di carcinoma epatico umano. I saggi in vivo sono stati eseguiti per valutare i parametri farmacocinetici, la biodistribuzione e l?attivit? terapeutica antitumorale in termini di riduzione del volume tumorale ed aumento della sopravvivenza degli animali trattati con PEG_KillerTRAIL, fosfolipide-PEG-KillerTRAIL rispetto alla proteina nativa KillerTRAIL.
Esempio 1: Sintesi del derivatofosfolipide-PEG-KillerTRAIL
Il metodo di sintesi ha previsto il legame selettivo del gruppo maleimidico del PEG con il tiolo della cisteina in posizione 230 (cys 230) presente nella sequenza aminoacidica del KillerTRAIL. Il rapporto molare fra i due composti (reagenti) ? rispettivamente di 4/1 fosfolipide-PEG-maleimide/KillerTRAIL, la reazione ? stata eseguita a pH 7.4 edil pH della reazione ? stato monitorato e valutato utilizzando strisce indicatrici di pH Whatman<? >(Sigma Aldrich, milano, Italia).
Di seguito ? riportato lo schema di reazione relativamente alla sintesi del derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL (Schema 1).
Schema 1:Schema di sintesi del derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
Entrando pi? nello specifico del processo di sintesi, la prima fase della reazione ha avuto come obbiettivo l?analisi dei reagenti di sintesi, ovvero il PEG-maleimide e la proteina di interesse, in particolare KillerTRAIL. Una volta dimostrato che la proteina nativa, in particolare KillerTRAIL,risultava essere stabile e poteva essere identificato utilizzando la metodica della cromatografia ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa su colonna C18, la sintesi del derivato DSPE-PEG-KillerTRAIL ? stata realizzata utilizzando il gruppo maleimidico del derivato DSPE-PEG-maleimide per il legame selettivo con il gruppo tiolico della cisteina in posizione230 (cys 230) del KillerTRAIL. La metodica HPLC in fase inversa su colonna C18 ? stata anche utilizzata per valutare preventivamente il grado di purezza e le caratteristiche del PEG-maleimide utilizzato come materiale di partenza durante la reazione summenzionata.
La reazione di coniugazione ? stata ottenuta mediante legame ad un composto formato da lipide-polimero del tipo distearoil-fosfatidil-etanolamminapolietilenglicole (DSPE-PEG), di grandezza compresa tra 2-200 kDa, preferibilmente 2-50 kDa.
Oltre alle fasi fondamentali del processo di sintesi sopra indicate, unitamente questo processo di sintesi, si possono ulteriormente aggiungere le seguenti fasi:
- La proteina ? stata purificata in modo preliminare mediante dialisi in tampone fosfato (PBS) a pH 7.4 in presenza di EDTA 0.05mM, utilizzando membrane da dialisi con cut-off di 2000 Da per eliminare il ditiotreitolo (DTT) utilizzato nella soluzione di stoccaggio della proteina. Il campione purificato ? stato successivamente analizzato mediante spettroscopia UV/Vis e RP-HPLC.
- Alla soluzione tampone contenente KillerTRAIL (1 mg/mL) ? stato aggiunto il DSPE-PEG-maleimide in rapporto molare 1/4 (proteina/PEG-maleimide). La miscela di reazione ? stata mantenuta sotto costante agitazione a temperatura ambiente fino al completamento della reazione. L?andamento della reazione ? stato monitorato mediante il prelievo, a tempi prestabiliti, di un?aliquota (25 ?L) di campione per eseguire l?analisi cromatografica.
- A reazione completata, il prodotto di reazione ? stato nuovamente purificato utilizzando una membrana da dialisi (cut-off 30000 Da) per eliminare la quantit? residua di KillerTRAIL che non ha reagito durante la sintesi. Allo stesso tempo, ? stata sviluppata e validata una metodica cromatografica di gel filtrazione per eliminare la quantit? di DSPE-PEG-maleimide in eccesso che non ha reagito durante il processo di sintesi.
La resa di reazione ottenuta ? stata maggiore del 42.3%, per tutti i coniugati ottenuti, risultando essere in linea con la quantit? di proteina nativa necessaria per esplicare la sua azione terapeutica. Al fine di aumentare la resa, la stessa reazione ? stata condotta in ambiente denaturante in condizioni reversibili (guanidinio 6M). La resa di reazione ottenuta ? stata simile (43%) a quella ottenuta nelle precedenti condizioni di reazione.
In relazione ai punti i. e ii. per soluzione tampone si intendono PBS, tampone fosfato, a pH compreso fra 5 e 8, preferibilmente fra 6.8 e 7.5, perch? un pH pi? basso denaturerebbe in modo irreversibile la proteina, invece, un pH pi? alto permetterebbe il legame dei gruppi amminici delle proteine, pi? reattivi dei tioli a pH<8.
La reazione ? stata condotta in soluzione tampone nell?intervallo di pH 6-8, ad esempio tampone fosfato (PBS)a pH 7.4, per 7 h ed a temperatura ambiente, dove per temperatura ambiente s?intende una temperatura compresa tra 22-24?C. Il coniugato ottenuto ? stato purificato e caratterizzato utilizzando le seguenti metodiche: Reverse Phase (C18) High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Spettroscopia di massa Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight (MALDI/TOF), Dynamic light scattering (DLS) e Asymmetric Flow-field Flow Fractionation. Inoltre, il quantitativo di KillerTRAIL e l?andamento della reazione sono stati valutati con i saggi colorimetrici per la determinazione del contenuto proteico, BCA (Bicinchoninic Acid Assay), e HABEEB [71,72]; mentre per determinare il contenuto di PEG nel composto finale ? stato utilizzato il saggio colorimetrico con sali di iodio.
Tutti i dati ottenuti hanno dimostrato la formazione del DSPE-PEG-KillerTRAIL con una resa del 42.3% gi? dopo 4 ore di reazione. La stessa resa ? stata ottenuta alla fine del processo di sintesi dopo 7 h. La resa percentuale di reazione non aumenta significativamente aumentando la quantit? di DSPE-PEG utilizzata nella miscela di reazione, o utilizzando un?agente parzialmente denaturante (43%, resa di reazione) come ad esempio il guanidinio (6 M). Successivamente ? stata valutata la solubilit? in soluzioni acquose del derivato ottenuto, dimostrando che l?87% di DSPE-PEG-KillerTRAIL ? solubile in PBS, o altra soluzione acquosa,a pH 7.4, 37?C dopo 80 h d?incubazione. Al contrario, nelle stese condizioni sperimentali, la proteina nativaKillerTRAIL forma aggregati che precipitano in PBS diminuendo drasticamente la concentrazione di proteina nativa in soluzione (solubilit? pari a circail 40% gi? dopo sole 2 hd?incubazione). L?attivit? residua del DSPE-PEG-KillerTRAIL ? stata valutata su linee cellulari tumorali, ad esempio HTC116, che sono responsive alla proteina nativa dopo incubazione in plasma a 37?C per 45 h, ottenendo circa il 91% di attivit? antitumorale residua per il derivato DSPE-PEG-KillerTRAIL.
Esempio 2: Analisi colorimetriche mediante saggi biochimici
Determinazione dei gruppi amminici primari liberi (Saggio Habeeb)
La determinazione quantitativa dei gruppi amminici del derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, oggetto di questa invenzione, ? stata calcolata mediante il saggio colorimetrico di Habeeb con acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonico (TNBS) [71]. Il TNBS ? stato fatto reagire in ambiente alcalino (condizioni di reazione basiche) con i gruppi amminici dei diversi campioni da analizzare ed il cromoforo che si forma ? stato identificato e valutato mediante spettroscopia UV-Vis alla lunghezza d?onda di335nm.
I campioni da analizzare sono stati preparati solubilizzando i derivati summenzionati (fosfolipide-PEG-maleimide come controllo negativo, derivati TRAIL nativo come controllo positivo a concentrazioni scalari, fosfolipide-PEG-TRAIL, di cui principalmente il KillerTRAIL) in 250?L di tampone borato 20mM, pH 7.2. A ciascun campione sono stati aggiunti, successivamente, 250 ?L di tampone bicarbonato al 4% a pH 8.5 e 250?L di TNBS (1% p/v in dimetil formammide o DMF). Una volta mantenuti tutti i campioni alla temperatura di 40?C per 2 h in bagnetto termostatato, sono stati aggiunti per ogni campione 250 ?L di sodio dodecil solfato al 10% e 125 ?L di HCl 1N. Infine, come anticipato, i campioni vengono valutati mediante spettroscopia UV/Vis alla lunghezza d?onda di 335 nm.
L?assorbimento spettrofotometrico alla lunghezza d?onda di 335nm di ciascun campione ? direttamente proporzionale alla concentrazione dei gruppi amminici la cui concentrazione ? stata calcolata utilizzando una retta di taratura ottenuta con soluzioni a concentrazioni note della proteina nativa (0.1-1 mg/mL), R<2>= 0.9951, y=883.09x 12411.
Determinazione colorimetrica della concentrazione proteica:
Saggio BCA
Quando il campione da analizzare ? una miscela di proteine di diversa natura, non ? possibile applicare direttamente la spettrofotometria UV-Vis per determinarne la concentrazione di ogni singola proteina nel campione. Infatti, le diverse proteine presenti nella miscela di reazione avranno coefficienti di estinzione molare diversi. In questo caso, la valutazione della concentrazione delle proteine, contenute in ciascun campione, avviene per via indiretta utilizzando il metodo colorimetrico di seguito descritto. In particolare, il dosaggio delle proteine presenti in ciascun campione (derivato) ? eseguito misurando la quantit? di albumina sierica bovina (BSA) che ? usata come proteina di riferimento poich? ? possibile determinarne la concentrazione utilizzando la spettrofotometrica UV-Vis.
La concentrazione delle proteine in ciascun campione ? stata confermata sperimentalmente mediante analisi colorimetrica utilizzando il saggio BCA Protein Assay (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e una soluzione di albumina sierica bovina a titolo noto come proteina di riferimento.
Il saggio summenzionato sfrutta, nella prima fase di reazione il metodo del biureto, che si basa sull?uso di sali di rame per misurare il contenuto proteico; quindi, aggiungendo Cu<++ >(CuSO4) alla soluzione da quantificare, in ambiente alcalino in presenza di sodio potassio tartrato, si formano dei chelati del rame Cu<+ >con residui amminoacidici, che danno colorazione viola. Due molecole di acido bicinconinico complessanoil catione rameoso facendo virare la colorazione della soluzione da verde-azzurro a violacea. L?intensit? della colorazione ? proporzionale rispetto alla concentrazione proteica in un intervallo che va da 20 a 2.000 ?g/mL. Questo saggio si basa su una reazione tempo-dipendente. Poich? il saggio del biureto misura nell?intervallo da 5 mg/mL a160 mg/mL, il saggio presenta una seconda fase dell?analisi, con la reazione colorimetrica del rame, che nello stato di ossidazione 1, chela due molecole di acido bicinconinico (BCA) dando una colorazione che produce un?analisi quantitativa in spettrofotometria UV-Vis alla lunghezza d?onda di 562 nm, utilizzando un lettore ELISA ELX808 (BioTek Instruments, Life Science Instrumentation, Germany).
Esempio 3: Spettrofotometria UV-Vis
Un?analisi preliminare della proteina KillerTRAIL? stata eseguita mediante analisi spettrofotometrica utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis Lamba25 (Perkin-Elmer, Northwolk, CT, USA). L?analisi ha permesso di misurare la concentrazione della proteina nativa KillerTRAIL nel campione analizzato. Utilizzando la BSA come standard di riferimento, ed in funzione delle indicazioni ottenute per le diverse concentrazioni (0.2-2 mg/mL) durante l?analisi dei campioni, ? stata costruita una retta di calibrazione (y=4 ? 10<-8 >x 0.0213; R<2 >= 0.9973), utilizzata per le successive analisi sulKillerTRAIL. In base ai dati riportati in letteratura (Expasy Data-protein; https://www.expasy.org/tools/), ? stato visto che il coefficiente di estinzione molare (?) della frazione proteica di 95-281 ? di 27.390 (Abs 0.1% (1 g/L)=1.274, ipotizzando che tutti i residui di cisteina (cys), presenti nella proteina nativa, siano in forma ridotta alla lunghezza d?onda (?) di 280nm).
Esempio 4: Analisi cromatografiche
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Le analisi cromatografiche sono state eseguite con un sistema High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Jasco, Tokyo, Japan), costituito da un sistema di pompe binarie PU-1580, un rivelatore a serie di diodi (DAD) MD 1510 (Tokyo, Japan). Per l?analisi in RP-HPLC ? stata usata una colonna analitica Jupiter C18 Phenomenex (250 x 4.6 mm, 5?m). Gli eluenti e le soluzioni tamponi sono stati filtrati con un sistema Millipore (Benford, MA, USA) munito di filtri da 0.22 ?m e le fasi mobili ottenute sono state sonicate con bagnoad ultrasuoni (UltrasonicCleaner mod. 5210 Branson,Dambury, USA) almeno 30 minuti prima del loro impiego nelle analisi cromatografiche.
KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono stati analizzate mediante RP-C18 HPLC e i picchi cromatografici dei due derivati sono stati identificati mediante spettrofotometro UV-Vis alla lunghezza d?onda di 280 nm.
La fase mobile utilizzata per l?identificazione e la quantificazione di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ? costituita da acqua (H2O) ed acetonitrile (CH3CN); entrambi i solventi sono stati acidificati con acido trifluoroacetico (TFA) 0.05% v/v.La separazione cromatografica ? stata effettuata mediante un gradiente costituito da H2O/CH3CN secondo le miscele di seguito riportato: al t = 0 min.90% (v/v) H20 e 10% (v/v) CH3CN; al t = 25 min.10% (v/v) H2O e 90% (v/v) di CH3CN; al t = 30 min.90% (v/v) H20 e 10% (v/v) di CH3CN. La reazione di coniugazione del KillerTRAIL ? stata monitorata fino a completamento della reazione.
Esempio 5: Analisi elettroforetica SDS PAGE (Elettroforesi su gel di poli-acrilammide)
L?elettroforesi ? una tecnica analitica che permette di separare molecole cariche, in base alla loro diversa mobilit? in un campo elettrico specifico. Le proteine sono state denaturate con sodio-dodecil-solfato (SDS), un detergente anionico che lega con elevata affinit? le proteine stesse (una molecola di SDS ogni due aminoacidi (aa) circa) e conferisce loro una carica netta proporzionale alla massa della proteina stessa. In questo modo la carica effettiva delle catene polipeptidi pu? essere trascurata durante l?analisi e l?unica carica effettiva ? quella ottenuta sul campione dopo ionizzazione con l?SDS.
Poich? tutte le proteine sono state precedentemente denaturate e presentano lo stesso rapporto massa/carica, la loro mobilit? elettroforetica dipende esclusivamente dal peso molecolare e dalla porosit? del gel, che funge da setaccio (Figura 2).
Per la corsa elettroforetica dei campioni proteici ? stato utilizzato un gel d?acrilamide di corsa (running gel) al 12% (p/v), e un gel d?acrilamide di precorsa (stacking gel) al 4% (p/v). Lo strumento utilizzato ? un Mini-PROTEAN<? >Electrophoresis System (Bio-Rad, Laboratories, Inc., USA) munito di una cella verticale, collegato ad un generatore di corrente. La percentuale di poliacrilammide del 10% (p/v) nel gel ? stata utilizzata perch? presenta le migliori caratteristiche tecniche per separare i campioni in esame. Per la corsa elettroforetica sono stati caricati 10?g di proteina, in un volume di 15?L. Ogni campione ? stato denaturato con 15?L di ?sample buffer? costituita da: TRIS 250mM, pH6.8; 2% (v/v) SDS, 25% (v/v) beta-mercapto-etanolo, come agente riducente per rompere eventuali ponti di solfuro presenti nella proteina nativa; blu di bromofenolo 0.1% (v/v); 10% (v/v) glicerolo. I campioni prima di essere caricati sul gel d?acrilimide, sono stati denaturati a 100?C per almeno 5 minuti dopo caricamento nel ?sample buffer?. La corsa elettroforetica ? stata condotta a 100 mV per almeno 1h in buffer di corsa costituito da: TRIS 1mM, pH8.3; glicina 960mM; SDS 0.1% (v/v); acqua deionizzata.
A fine corsa, per osservare l?avvenuta separazione delle proteine, il gel d?acrilamide ? stato fatto reagire con una soluzione di colorante: 0.1%(p/v) Coomassie Brillant Blue, 40% (v/v) etanolo, 10% (v/v) di acido acetico. La miscela acido-etanolo ha la funzione di far precipitare le proteine sul gel e fissare il colorante. Infine,il gel d?acrilamide ? stato decolorato per rimuovere il colorante in eccesso e marcare solo quello rimasto legato al KillerTRAIL. Le reazioni di coniugazione che portano alla formazione di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, in particolare, DSPE-PEG-KillerTRAIL, sono state monitorate tramite SDS-PAGE (Figura 2).
Il gel di poliacrilammide ? stato poi analizzato utilizzando il sistema ottico Molecular Imager<? >(ChemiDocTM, Biorad Laboratories Inc., USA). Per la valutazione elettroforetica ? stata utilizzata la camera elettroforetica Horizon 58 (Life Techonologies Horizontal Gel Electrophoresis System, Usa).
Esempio 6: Spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization- Timeof Flight)
La spettrometria di massa MALDI-TOF, una tecnica analitica che permette di determinare con esattezza e precisione il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinarne la loro struttura in funzione del rapporto massa/carica, ? stata utilizzata per caratterizzare la struttura chimica ed il peso molecolare di DSPE-PEG-KillerTRAIL. DSPE-PEG-maleimide ? un prodotto commerciale e lo spettro di massa ? in linea con le specifiche tecniche del prodotto come riportato successivamente. Gli spettri di massa sono stati ottenuti con lo strumento REFLEX Time of Flight (AB Sciex 4800 plus MALDI-TOF Analyzer) dotato di una sorgente di ioni SCOUT in grado di operare in modalit? lineare positiva. Gli ioni generati da un fascio pulsato di radiazioni UV, prodotte da un laser (laser di azoto, lunghezza d?onda di 337 nm), sono stati accelerati a 25 kV. Una soluzione satura di acido sinapinico in H2O/CH3CN(1:1 v/v) ? stata utilizzata come soluzione di riferimento durante l?analisi ed aggiunta ai campioni precedentemente solubilizzati in soluzione acquosa contenete TFA (0.1% v/v) con un rapporto di 1:1 v/v. A scopo esclusivamente analitico, ? stato quindi analizzato il DSPE-PEG-maleimide 2k Da ed il DSPE-PEG-KillerTRAIL. I dati ottenuti dall?analisi MALDI-TOF hanno dimostrato la formazione del coniugato tra il PEG ed il KillerTRAIL alla fine del processo di reazione. L?analisi ? stata eseguita sul DSPE-PEG-maleimide 2k Da (Figura 3A) il cui peso molecolare ? risultato essere di 2964,2 Da e DSPE-PEG-KillerTRAIL (Figura 3B) il cui peso molecolare assoluto ? risultato essere di 24018,2 Da.
Esempio 7: Analisi dei nanoaggregati micellari mediantedynamic light scattering(DLS)
Il coniugato DSPE-PEG-KillerTRAIL ? stato analizzato mediante spettroscopia di fotocorrelazione, o scattering dinamico di luce (DLS) a 25?C utilizzando lo strumento Malvern Zetasizer Nano ZS, equipaggiato con un laser a 532 nm ed un back scattering di 173?. Il coniugato ? stato sospeso in PBS (pH 7.4) alla concentrazione finale di 1mg/ml. La sospensione ottenuta ? stata filtrata utilizzando membrane di cellulosa da 5 ?m e sottoposta ad analisi DLS. Il raggio idrodinamico e l?indice di polidispersione (PDI) di DSPE-PEG-KillerTRAIL sono stati valutanti utilizzando l?analisi dei cumulanti in funzione della funzione di foto correlazione (Figura 4a e Tabella 2). In Figura 4b si riporta l?analisi solamente del KillerTRAIL.
Tabella 2: Parametri di fotocorrelazione di DSPE-PEG-KillerTRAIL a differenti tempi d?incubazione (1-7 h).
PDI = indice di polidispersione; t = tempo in h.
Esempio 8: Analisi di DSPE-PEG-KillerTRAIL e dei suoi composti di partenza mediante asymmetricflow-fieldflowfractionation
DSPE-PEG-KillerTRAIL ed i suoi composti di partenza sono stati separati e misurati utilizzando il sistema AF2000 AF4-Instrument (AF2000, Postnova Analytics, Landsberg, Germany) (Figura 5). Il sistema meccanico utilizzato per il processo di preparazione ? stato mantenuto ad una temperatura costante di 26?C durante la procedura di separazione; mentre una colonna di frazionamento di 295 mm ? 30 mm ? 60 mm (lunghezza ? larghezza ? altezza) ? stata collegata a 3 pompe peristaltiche. Fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ? stato iniettato manualmente nel sistema di frazionamento utilizzando un iniettore meccanico con un loop da 25 ?L (Rheodyne, Rohnert Park, CA, USA). Una membrana di cellulosa con un cut-off medio di 5000 gx mol<?1 >? stato collocato nel canale AF4 del sistema di separazione per frazionamento ed usato durante le analisi. Lo spessore che determina l?altezza del canale ? di 350 ?m. Il sistema di separazione AF4 ? collegato ad un rivelatore a serie di diodi(DAD)PN3241 impostato ad una lunghezza d?onda di 280 nm.
Esempio 9: Determinazione dell?aggregazione di DSPE-PEG-KillerTRAIL e del peso molecolare dell?aggregato di mediante cromatografia multidetector GPC/SEC
La tecnica GPC/SEC ? stata usata per determinare il peso molecolare (MW) e la distribuzione di MW per le diverse macromolecole, proteine, polimeri naturali e sintetici. Lo strumento utilizzato per questo tipo di studio ? stato il Viscotek GPC/SEC TD Amax (Malvern Company, Viscotek Corp, Houston, USA), sistema munito di un Tetra Detector (TDA) che comprende un Indice di Rifrazione (RI), che fornisce una determinazione accurata del peso molecolare e dell?incremento specifico dell'indice di rifrazione (dn/dc), di un rivelatore UV/Vis (programmato durante le analisi alla lunghezza d?onda massima (?max) di 280 nm) che permette di studiare la composizione chimica dei differenti composti analizzati, un rivelatore di viscosit? differenziale, che fornisce una misura della viscosit? intrinseca dei derivati analizzati e consente di determinare le dimensioni, la conformazione e la loro struttura molecolare, un rilevatore Light Scattering a doppio angolo, uno a7? (Low Angle Light Scattering o LALS) per misurare il MW assoluto, anche delle macromolecole pi? grandi, ed uno a 90? (Right Angle Light Scattering o RALS) per misurare il MW assoluto di piccole molecole. Il GPCmax ? dotato di un sistema integrato per degassare i solventi, per eliminare i gas disciolti, consentire le prestazioni ottimali della pompa e migliorare le linee di base su tutti i rivelatori.
Lo strumento ? dotato di una pompa a doppio pistone, di un campionatore automatico termostatato, che ? stato equipaggiato con due colonne in serie A2500 e A6000M (30 cm, 8 mm I.D.) e di un sensore eluente automatico che interrompe il flusso se rileva che l'alimentazione del solvente ? bassa evitando danni alle colonne.
Gli eluenti utilizzati sono stati H2Oultra-pura (90% v/v) ed CH3CN (10% v/v) ad una velocit? di flusso di 0.7 mL/min. Due standard di riferimento (PEG e destrano) sono stati utilizzati per calibrare lo strumento. I dati ottenuti sono stati processati utilizzando il software Omni SEC 4.7 (Malvern Instruments, Ltd, Worcestershire, UK) ed hanno mostrato la presenza del derivato DSPE-PEG-KillerTRAIL (Figura 6) e la differenza dei valori di riferimento rispetto al backbone polimerico utilizzato in questo caso DSPE-PEG2k-maleimide. I dati correlati al peso molecolare medio, l?indice di polidispersione e il volume di ritenzione di entrambi sono riportati in Tabella 3.
Tabella 3: Analisi delle propriet? chimico-fisiche del derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, in particolare DSPE-PEG-KillerTRAIL e del DSPE-PEG-MAL mediante viscosimetro GPCmax SEC tetradetector Viscotek.
Peak RV: volume di ritenzione; MW: peso molecolare; MW/MN: indice di polidispersione; MN: peso molecolare medio della catena polimerica; MP: peso molecolare del picco a maggiore intensit?.
Esempio 10: Attivit? biologica in vitro di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL
KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono stati testati in vitro per valutare la loro attivit? citotossicit? su cellule di carcinoma umano del colon HCT116; mentre l?attivit? biologica ? stata valutata solo sul derivato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL (Figura 7).
La vitalit? cellulare ? stata valutata mediante il saggio di MTT (bromuro di 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio). La deidrogenasi mitocondriali cellulari riduce il sale di difeniltetrazolio summenzionato in presenza di NADH, con formazione di cristalli di formazano insolubili (di colore blue). La citotossicit? di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ? stata valutata in vitro usando cellule tumorali del colon umano (HCT116) sensibili al KillerTRAIL e cheratinociti umani (cellule NCTC224) non responsivi al KillerTRAIL (Figura 7). Le cellule sono state incubate in incubatore (Guaire<? >TS Autoflow Codu e acqua Jacketed-Incubator) a 37?C (5% CO2), in capsule di petri (100 mm x 20 mm), utilizzando come terreno di coltura D-MEM integrato con glutammato, penicillina (100 UI/ml), streptomicina (100 ?g/mL) e FBS (10%, v/v).
Raggiunta una confluenza dell?80%, le cellule sono state staccate con tripsina (2 mL) e raccolte in una provetta da centrifuga contenente 4 mL di terreno di coltura necessario per neutralizzare la trispsina utilizzata per staccare le cellule. Le piastre sono state successivamente lavate con 2 mL di PBS per rimuovere le cellule residue e la soluzione di lavaggio ? stata trasferita in una provetta da centrifuga. Le provette sono state centrifugate a 1.200 rpm a temperatura ambiente per 5 min. utilizzando una centrifuga Heraeus Sepatech Megafuge 1.0 (Thermo Fisher Scientific, Germania).
Il pellet ottenuto ? stato risospeso in un appropriato volume di terreno per colture cellulari (1-10 mL), seminato in piastre da 96 pozzetti (5 ? 10<3 >cellule/0.1 mL) e incubate per 24 ha 37?C per promuovere l'adesione alle superfici dei singoli pozzetti.
Il terreno di coltura ? stato poi rimosso e le cellule HCT116 e NCTC224 sono state trattate con una soluzione di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL 100 ng/mL per valutarne l?attivit? biologica. Cellule incubate con solo terreno di coltura sono state utilizzate come controllo durante la sperimentazione.
Dopo 24 h di incubazione, il 10% di sali di tetrazolio solubilizzati in soluzione PBS (5 mg/mL) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e le piastre sono state nuovamente incubate per altre 3 h. Il mezzo d?incubazione ? stato rimosso e i sali di formazano (precipitati sul fondo del pozzetto dopo ossidazione) sono stati sciolti con 100 ?L di una miscela di dimetilsulfossido (DMSO)/etanolo (1:1 v/v) che ? stata posta sotto costante agitazione per 20 min. a 230 rpm su un agitatore per piastra (IKA<? >KS 130 controllo, IKA<? >WerkeGmbH& Co., Staufen, Germania).
I sali di formazano dopo essere stati solubilizzati con la miscela solubilizzante summenzionata sono stati quantificati con uno spettrofotometro per micropiastre (BIORAD xMark<TM>, USA) alle lunghezze d?onda rispettivamente di 570 nm e 690 nm. La quantit? di sali di formazano disciolti, ottenuta durante l?analisi, ? direttamente proporzionale alla vitalit? cellulare.
La vitalit? cellulare ? stata calcolata con la seguente equazione:
vitalit? cellulare (%) = (AbsT/AbsC)?100
dove AbsT ? l?assorbanza delle cellule trattate e AbsC ? l?assorbanza del controllo (cellule non trattate). La concentrazione di sali di formazano ? direttamente proporzionale alla vitalit? cellulare, che ? il risultato della media di tre differenti esperimenti ? la deviazione standard.
Esempio 11: Valutazione dell?attivit? biologicain vivo di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL
Gli animali utilizzati per l?esperimento sono ratti maschi Sprague Dawley (SD) del peso medio di 220-250 gr di 4-5 settimane e topi nudi BALB/c (20-25gr, 4-5 settimane) acquistati da Charles River Laboratories (Germania). Gli animali sono stati mantenuti in stabulario in condizioni controllate, suddivisi in gruppi da6-8, con cicli di 12 h di luce/buio, con cibo e acqua ad libitum per 2 settimane. I protocolli per la sperimentazione animale ed il loro benessere sono stati condotti in conformit? alle linee guida istituzionali che ottemperano alle leggi e alle politiche nazionali e internazionali (Direttiva Comunit? Europea del Consiglio, del 24 novembre 1986, 86/609/CEE).
Valutazione dei parametri farmacocinetici di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL
I parametri farmacocinetici di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL sono stati studiati in ratti Winstar preventivamente stabulati prima e trattati con le differenti formulazioni somministrate per via intraperitoneale (i.p.). I ratti sono stati incannulati attraverso la vena giugulare un giorno prima degli esperimenti, divisi casualmente in 6 gruppi (n= 6): 3 gruppi per il KillerTRAIL e 3 gruppi per il fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
Successivamente ? stata somministrata una dose di KillerTRAIL equivalente a 10?g (0.04 mg/kg) o l?equivalente molare di fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, dove entrambe le formulazioni sono state solubilizzate in PBS (pH = 6.0). I campioni di plasma sono stati prelevati a diversi tempi d?incubazione(15, 30, 60, 240 min.), centrifugati e conservati a -80?C fino al momento dell'analisi. Le concentrazioni plasmatiche di KillerTRAIL, ottenute da entrambe le formulazioni farmaceutiche, sono state quantificate utilizzando il kit ELISA KillerTRAIL commerciale (BioSource International, Inc., Fisher Scientific, USA). I parametri farmacocinetici sono stati calcolati dai profili di concentrazione plasmatica mediante analisi del modello non-compartimentale (Figura 8 e Tabella 4).
Tabella 4: Parametri farmacocinetici del KillerTRAIL e del coniugato fosfolipide-PEG-KillerTRAIL.
Accumulointra-tumorale e biodistribuzione in vivo di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL
La biodistribuzione ? stata eseguita su topi nudi xenografati con cellule di carcinoma al colon HCT116 (3 ? 10<6 >cellule/mL). Le cellule sono state inoculate sottocute nel femore di topi nudi BALB/c. La massa tumorale ? cresciuta in una settimana. I topi sono stati trattati per quattro giorni con una singola dose (iniettata per via i.p.) di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL e 96 h dopo l?iniezione sono stati sacrificati. Le masse tumorali ed i diversi organi (fegato, polmone, rene, cuore, cervello, muscolo, osso, pancreas, vescica, stomaco, intestino tenue, colon, milza) sono stati chirurgicamente asportati, raccolti, trattati e conservati come riportato in precedenza (vedi paragrafo relativo allo studio della farmacocinetica). I surnatanti sono stati analizzati utilizzando il kit commerciale ELISA per il KillerTRAIL (BioSource International, Inc., Fisher Scientific, USA). Gli animali sono statisuddivisi in 2 gruppi (n = 8) e la valutazione dell?accumulo intra-tumorale e della biodistribuzione in vivo ? stata eseguita utilizzando KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL, in particolare DSPE-PEG-KillerTRAIL, a diversi tempi di incubazione (15, 30, 60, 240 minuti). Le analisi sono state eseguite in duplicato sia per la formulazione KillerTRAIL sia per la formulazione fosfolipide-PEG-KillerTRAIL (Figura 9). I dati sperimentali ottenuti sono la media di 2 diverse analisi ? la deviazione standard.
Attivit? antitumorale in vivo di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL
L?effetto antitumorale in vivo di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL? stato studiato su topi nudi xenografati con cellule di carcinoma al colon HCT116(3 ? 10<6 >cellule/mL). Dopo sette giorni dall?inoculazione, raggiunta una dimensione ottimale della massa tumorale, i topi nudi BALB/c sono stati trattati per sette giorni con KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL (50 o 100 mg/animale/giorno, equivalente ad una dose di KillerTRAIL). Nei successivi 21 giorni, ogni 5 giorni, ? stato misurato il volume della massa tumore. La somministrazione di KillerTRAIL e fosfolipide-PEG-KillerTRAIL ? avvenuta per via endovenosa (e.v.) attraverso la vena della coda dell?animale. Il volume del tumore ? stato misurato complessivamente per 24 giorni. Questo parametro ? stato calcolato utilizzando la longitudine (L) e il diametro trasversale (W) del tumore secondo la seguente formula:
V=(L?W<2>)/2
I valori di inibizione della crescita tumorale (TGI) sono stati calcolati usando la seguente formula:
TGI=(1-TV campione/TV controllo)?100
in cui TV ? il volume del tumore.
Esempio 12: Analisi statistica
L?analisi statistica dei dati sperimentali di farmacocinetica,biodistribuzione, accumulo intra-tumorale ed attivit? antitumoralein vivo sono stati ottenuti utilizzando l?analisit-student. Un valore p<0.05 ? stato considerato statisticamente significativo. Tutti i valori ottenuti rappresentano la media di diverse misurazioni ? la deviazione standard.

Claims (21)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Coniugato polimerico costituito da un addotto fosfplipide-polietilenglicole legato ad una proteina pro-apoptotica appartenente alla famiglia di citochine tumor necrosis factor scelta fra TRAIL e KillerTRAIL, detto addotto essendo legato alla proteina attraverso un legame covalente su un residuo cisteinico della sequenza di detta proteina fornito da un gruppo reattivo verso i tioli presente sul polietilenglicole.
  2. 2) Coniugato polimerico secondo la rivendicazione 1 in cui il residuo cisteinico ? in posizione 230 della catena peptidica della sequenza della proteina.
  3. 3) Coniugato polimerico secondo le rivendicazioni 1-2 in cui il polietilenglicole ha un peso molecolare medio scelto fra gli intervalli seguenti: tra 200 Da e 300000 Da, tra 3000 e 100000 Da, tra 5000 Da e 80000 Da, tra 10000 Da e 40000 Da, tra 2 e 200 kDa, tra 10 e 50 kDa.
  4. 4) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui il polietilenglicole ? un alcossi-polietilenglicole, preferibilmente un metossipolietilenglicole.
  5. 5) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in cui la proteina comprende la sequenza Seq ID No 1 TSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEK ALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIK ENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIF ELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG.
  6. 6) Coniugato polimerico secondo la rivendicazione 5 in cui la proteina ? un mutante che comprende un polipeptide avente una sequenza amminoacidica con almeno il 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%,78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o maggiore omologia di sequenza rispetto alla SEQ ID No 1.
  7. 7) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 in cui il gruppo reattivo verso i tioli ? scelto fra: N-alchilmaleimmide, come N-metilmaleimmide o N-etilmaleimmide, disolfuro orto-piridinico (OPSS-PEG), iodio-acetammide (IA-PEG), vinil-solfone (VS-PEG).
  8. 8) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7 in cui il fosfolipide dell?addotto ? un fosfolipide scelto fra: polietilenglicole 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)750]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)2000]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)5000]}; 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[dibenzociclooctil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-azido(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[succinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[carboxi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[maleimide(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolammina-N-[PDP(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[amino(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[cianur(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[poli(etilene glicol)2000-N'-carbossifluoresceina] (sale d?ammonio) e di polietilene glicole: 1,2-dimiristoilsn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-750] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-1000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-3000] (sale d?ammonio); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)750]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)2000]}; N-palmitoil-sfingosina-1-{succinil[metossi(polietilene glicol)5000]}; 1,2-distearoil-sn-glyicero-3-fosfoetanolammina-N-[dibenzociclooctil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[azido(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[succinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[carbossi(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[maleimide(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolammina-N-[PDP(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[amino(politilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[cyianur(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-2000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[folato(polietilene glicol)-5000] (sale d?ammonio); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[polietilene glicol)2000-N'-carbossifluoresceina] (sale d?ammonio).
  9. 9) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 in cui il fosfolipide dell?addotto ? la fosfatidil-etanolammina (DSPE).
  10. 10) Coniugato polimerico secondo una delle rivendicazione 1-9 in cui il coniugato polimerico ? radiomarcato con <125>I,<188>Re, o <188>W.
  11. 11) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 in forma di nanoaggregati.
  12. 12) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 in cui in ambiente acquoso il coniugato forma nanoaggregati, aventi un core idrofobico interno capace di incapsulare farmaci lipofili e anfifilici e sulla superficie esterna si dispone la proteina.
  13. 13) Coniugato polimerico secondo la rivendicazione 11 in cui il farmaco ? scelto fra: Paclitaxel, Docetaxel, Campothecina, Etoposide, Doxorubicina base anidra, irinotecan base anidra, vascular endothelial growthfactor (VEGFR) inhibitors, come ad esempio Cabozantinib, Nintedanib; Wnt/?-catenin modulators, come ad esempio XAV-939 (CAS NO. 284028-89-3), ICG-001(CAS NO. 780757-88-2); Hedgehog inhibitors, come ad esempio SANT75, HPI1 Antibody o HIC0-4F9 (https://www.thermofisher.com/antibody/product/HPi1-Antibody-clone-HIC0-4F9-Monoclonal/MA5-16126); PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)/(Protein kinase B) Akt/(mammalian target of rapamycin); mTOR modulators, come ad esempio Rapamycin, Buparlisib; peptidi naturali ad attivit? antitumorale; e relative miscele.
  14. 14) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13 per l?uso in campo terapeutico, diagnostico o teranostico.
  15. 15) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 per l?uso nel trattamento di tumori solidi e liquidi, malattie infiammatorie e autoimmuni caratterizzate dalla presenza sulle superfici delle cellule e/o dei tessuti di recettori apoptotici della famiglia TRAIL, preferibilmente KillerTRAIL.
  16. 16) Coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 per l?uso nel trattamento di Leucemia, Carcinoma al seno, Carcinoma della prostata, Carcinoma polmonare, Carcinoma renale, Carcinoma pancreatico, Alzheimer, Melanoma, Sindrome mielodisplastica, Linfomi, Carcinoma epatico, Randomiosarcoma, Glioma, Carcinoma polmonare non a piccole cellule, Virus dell?epatite B, Virus dell?epatite C, Steatosi epatica non correlate all?abuso di alcool, Fibrosi epatica, Cirrosi, Mesotelioma, Ipertensione arteriosa polmonare, Sclerosi sistemica, Carcinoma della cervice uterina, Fibrosi polmonare, Asma, Virus influenzale, Aterosclerosi, Lupus eritematoso, Sclerosi multipla, HIV, Sclerosi laterale amiotrofica, Citomegalovirus, Artrite reumatoide, Miastenia gravis, Carcinoma pancreatico come Adenocarcinoma duttale del pancreas e Tumori neuroendocrini, che originano dalle cellule delle isole di Langerhans, Carcionoma polmonare non a piccole cellule come il Carcinoma a cellule squamose, il Carcinoma a grandi cellule e l?Adenocarcinoma, che a sua volta si suddivide in sarcomatosi e linfomi polmonari, Carcinoma della cervice uterina come il Carcinoma a cellule squamose e l?Adenocarcinoma, il Mesotelioma che colpisce e si differenzia in vari tessuti: polmone (pleura), cuore (pericardio), intestino (peritoneo) e testicoli (tunica vaginale), il rabdomiosarcoma (embrionale e alveolare), i Gliomi e relativi sottotipi come Glioblastoma, Astrocitoma anaplastico, Astrocitoma diffuso, Astrocitomapilocitico, altri Astrocitomi, Oligodendroglioma, Ependimoma e altri, la Leucemia linfocitica cronica.
  17. 17) Composizione comprendente un coniugato polimerico secondo una delle rivendicazioni 1-13 e almeno un ulteriore elemento scelto tra agenti terapeuticamente attivi, diagnostici, vettori, coadiuvanti, eccipienti e stabilizzanti farmaceuticamente accettabili e relative miscele.
  18. 18) Composizione secondo la rivendicazione 17 in cui l?agente terapeuticamente attivo ? scelto fra Paclitaxel, Docetaxel, Campothecina, Etoposide, Doxorubicina base anidra, irinotecan base anidra, vascular endothelial growthfactor (VEGFR) inhibitors, come ad esempio Cabozantinib, Nintedanib; Wnt/?-catenin modulators, come ad esempio XAV-939 (CAS NO. 284028-89-3), ICG-001(CAS NO.780757-88-2); Hedgehog inhibitors, come ad esempio SANT75, HPI1 Antibody o HIC0-4F9 (https://www.thermofisher.com/antibody/product/HPi1-Antibody-clone-HIC0-4F9-Monoclonal/MA5-16126); PI3K (Phosphoinositide 3-kinases)/(Protein kinase B) Akt/(mammalian target of rapamycin); mTOR modulators, come ad esempio rapamycin, Buparlisib; peptidi naturali ad attivit? antitumorale; e relative miscele.
  19. 19) Composizione secondo le rivendicazioni 16-18 in cui l?agente diagnostico ? un agente diagnostico radio-marcato, preferibilmente <125>I, <188>Re, <188>W e relative combinazioni.
  20. 20) Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-19 ulteriormente comprendente uno tra tamponi, antiossidanti, conservanti, polipeptidi a basso peso molecolare, polimeri idrofili, amminoacidi, carboidrati, zuccheri, contro-ioni formanti sali, tensioattivi non ionici, scambiatori di ioni e relative miscele.
  21. 21) Composizione secondo la rivendicazione 20 in cui i tamponi sono scelti fra tris-(idrossimetil)-amminometano cloridrato (Tris-HCl), 4-(2-idrossietil)-1piperazine-acido etansulfonico (HEPES), fosfato, citrato, altri acidi organici e relative miscele; 22) Composizione secondo una delle rivendicazioni 18-20 in cui l?antiossidante ? acido ascorbico, metionina o relative miscele. 23) Composizione secondo una delle rivendicazioni 19-21 in cui i conservanti sono scelti tra ottadecil-dimetil-benzil ammonio cloruro, esametonio cloruro, benzalconio cloruro, benzetonio cloruro, fenolo, butil o benzil alcol, alchilparabeni (metil o propilparabene); catecolo; resorcinolo; cicloesanolo; 3-pentanolo e relative miscele. 24) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-22 ulteriormente comprendente almeno uno tra polisaccaridi, preferibilmente metil-cellulosa o carbossi-metil-cellulosa, polivinilpirrolidone, poliacrilati, polimeri a blocchi di etilene-propilene, polietilen glicole e cere. 25) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-24 in forma di microcapsule, nanocapsule, liposomi, cerotti, forme di inalazione, spray nasali, compresse sublinguali e preparazioni a rilascio prolungato. 26) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-25 per l?uso in campo terapeutico, diagnostico o teranostico. 27) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-26 per l?uso nel trattamento di tumori solidi e liquidi, malattie infiammatorie e autoimmuni caratterizzate dalla presenza sulle superfici delle cellule e/o dei tessuti di recettori apoptotici della famiglia TRAIL, preferibilmente KillerTRAIL. 28) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-27 per l?uso nel trattamento di Leucemia, Carcinoma al seno, Carcinoma della prostata, Carcinoma polmonare, Carcinoma renale, Carcinoma pancreatico, Alzheimer, Melanoma, Sindrome mielodisplastica, Linfomi, Carcinoma epatico, Randomiosarcoma, Glioma, Carcinoma polmonare non a piccole cellule, Virus dell?epatite B, Virus dell?epatite C, Steatosi epatica non correlate all?abuso di alcool, Fibrosi epatica, Cirrosi, Mesotelioma, Ipertensione arteriosa polmonare, Sclerosi sistemica, Carcinoma della cervice uterina, Fibrosi polmonare, Asma, Virus influenzale, Aterosclerosi, Lupus eritematoso, Sclerosi multipla, HIV, Sclerosi laterale amiotrofica, Citomegalovirus, Artrite reumatoide, Miastenia gravis, Carcinoma pancreatico come Adenocarcinoma duttale del pancreas e Tumori neuroendocrini, che originano dalle cellule delle isole di Langerhans, Carcionoma polmonare non a piccole cellule come il Carcinoma a cellule squamose, il Carcinoma a grandi cellule e l?Adenocarcinoma, che a sua volta si suddivide in Sarcomatosi e Linfomi polmonari, Carcinoma della cervice uterina come il Carcinoma a cellule squamose e l?Adenocarcinoma, il Mesotelioma che colpisce e si differenzia in vari tessuti: polmone (pleura), cuore (pericardio), intestino (peritoneo) e testicoli (tunica vaginale), il rabdomiosarcoma (embrionale e alveolare), i Gliomi e relativi sottotipi come Glioblastoma, Astrocitoma anaplastico, Astrocitoma diffuso, Astrocitomapilocitico, altri Astrocitomi, Oligodendroglioma, Ependimoma e altri, la Leucemia linfocitica cronica. 29) Composizione secondo una delle rivendicazioni 16-27 per uso orale, parenterale, rettale, topico, vaginale, oftalmico o inalatorio. 30) Processo per preparare il coniugato polimerico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 comprendente gli step fondamentali seguenti: - Preparare una soluzione acquosa tamponata ad un pH compreso fra 5 e 8 contenente la proteina in forma monomerica; - Aggiungere l?addotto polimerico in rapporto 1:4 (proteina:addotto) e mantenere sotto agitazione, fino a completamento della reazione. 31) Processo secondo la rivendicazione 29 comprendente uno step ulteriore di liofilizzazione. 32) Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 29-30 in cui lo step di liofilizzazione ? preceduto, seguito o sostituito da uno step in cui si combina il coniugato con uno o pi? farmaci lipofili o anfifilici.
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Guo et al. Reactive oxygen species activated by mitochondria-specific camptothecin prodrug for enhanced chemotherapy
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