TW200916477A - Antibodies modified with hydrophobic molecules - Google Patents

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200916477 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於作爲腫瘤之治療及/或預防劑爲有用之免 疫微脂粒（immunoliposome )，其具有與細胞凋零誘導有關 的細胞表面受體結合之抗體，且對於表現該細胞表面受體的 細胞具有誘導細胞凋零的作用；以及關於使用該微脂粒之癌 症、自體免疫疾病或炎症性疾病之治療及/或預防法。又， 本發明係關於作爲腫瘤之治療及/或預防劑爲有用之疏水性 分子修飾抗體，該疏水性分子修飾抗體含有與細胞凋零誘導 有關的細胞表面受體結合的抗體，且對表現該細胞表面受體 的細胞具有誘導細胞凋零的作用；以及關於使用該疏水性分 子修飾抗體之癌症、自體免疫疾病或炎症性疾病之治療及/ 或預防法。 【先前技術】 微脂粒因可包含多量水溶性或疏水性物質，作爲藥物載 劑，特別是作爲靜脈注射用之藥物遞送系統（Drug Delivery v System : DDS )之載劑已被高度關注 ((D.D.Lasic, ’’Liposomes : from basic to applications”， Elsevier Science Publishers，（ 1993)))。近年，已完成以親 水性高分子，例如以聚乙二醇（PEG )表面修飾的微脂粒， 與向來之微脂粒相比下，由於微脂粒之凝集化及於體內經網 狀內皮系統的捕捉等被減輕，亦適用於體內安定性低的藥 物，而實現高血中安定性（藥物血中半衰期20〜40小時） 的製劑技術的實用化。又近年來，已進行許多以陚予機能性 200916477 的目的於微脂粒表面結合（含有）蛋白質、胜肽、糖等之機 能性分子之嘗試。 作爲將藥物輸送至體內之特定部位的手段，已提出將藥 劑封入微脂粒，且於其表面結合抗體的方法，特別是已報告 癌症治療領域中，封入抗腫瘤劑之結合抗體的微脂粒之有效 性。此等含有抗體之微脂粒，稱爲免疫微脂粒。於許多場合， 免疫微脂粒之藥效，來自內封於微脂粒的抗腫瘤劑，另一方 面，含於免疫微脂粒的抗體，係爲了經由與腫瘤細胞專一性 表現的抗原結合，將免疫微脂粒輸送至腫瘤細胞而被利用。 因此，一般而言免疫微脂粒中含有的抗體，以具有與腫瘤細 胞專一性抗原結合的機能者即可，不需考量抗體本身具有作 爲治療劑的機能。關於賦予如此標的指向性的微脂粒（即使 於PEG微脂粒），因被投與物的大部分到達標的細胞以前就 被肝臓等免疫細胞補捉而被消耗，多量藥物於溶液中喪失， 實際到達標的部位而可表現活性的藥物限於一部份。因此， 有許多嘗試更安定地含有藥物而使到達標的細胞，賦予於標 、 的部位有效率地放出內封藥物的機能的微脂粒之開發，但尙 未至實用化。又，理論上應當所有的藥物可適用於微脂粒， 但於血中可安定地保持藥物者，微脂粒之脂質成分與內封藥 物之物性上的相互作用（相性）有很大依存性，實際情形爲 可適用的藥物種類實際上被限定。如此，於封入受限的送達 量、受限的種類之藥物的微脂粒中，爲了獲得更高的藥理效 果’冀求更能賦予藥理效果之新形態的微脂粒。 參與細胞凋零誘導之細胞表面受體所代表之死亡受體 200916477 (d e a t h r e c e p t 〇 r )，經由配位體結合於細胞膜一部分的受體 之多量化已知成爲生物學上細胞內細胞凋零·訊號誘導之觸 發物（Cell Death and Differentiation, 1 0 : 66- 75 ( 2003 ))。 具有與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的結合能力之抗 體，目前於治療藥之臨床開發階段，對表現該受體的細胞（癌 症細胞·免疫疾病關連細胞）專一性地激動性作用，而期待 使其死滅的治療效果。作爲此抗體之作用機制，被認爲是結 合該受體前或結合後，抗體彼此被交聯（crosslinking )而多 量化，而引起抗原受體之多量化（即，細胞凋零誘導）。試 管內（in vitro )實驗中，添加抗本抗體的二次抗體的人工性 交聯爲活性表現所必要，又，活體內（in vivo )的體內，經 由免疫效應物（effector )細胞上之F c受體而被交聯者被 認爲係抗體活性表現上必要的作用機制。近年來，已嘗試經 由對抗體施予構造上的改變，使抗體本身具有的機能更增 強，例如於除去抗體上之特定糖鏈構造上，已報告有提升與 F c受體之親和性者。然而，免疫效應物細胞之量或作用上 有個人的差異，又已接受藥物治療的癌症患者或免疫疾病患 者中，免疫效應物細胞的量或作用會大幅降低。如此的癌 症•免疫疾病患者中，已存在的抗體亦擔心有不能獲得充分 藥效，而要求抗體本身之進一步機能增強。 【發明內容】 本發明之一課題爲提供對癌症具有治療效果的醫藥 品。本發明之另一課題係提供含有可對細胞誘導細胞凋零的 抗體的微脂粒製劑或疏水性分子修飾抗體。 200916477 本發明者們，爲了解決上述課題而專心、檢討的結果， 發現含有可對細胞誘導細胞凋零的抗體之微脂粒製劑，與單 獨該抗體時相比較下，可顯示顯著的細胞凋零誘導能力，遂 而完成本發明。本發明之微脂粒，使抗體高密度存在於微脂 粒上，與生物學上經交聯的抗體有同樣機能，此結果，不依 賴試管內之二次抗體或活體內之效應物細胞之存在，而較單 獨之免疫微脂粒更有效發揮細胞凋零誘導能力。由此，於單 獨使用抗體未能獲得充分治療效果的患者中亦帶來有效的 治療效果。又，本發明者們，於確認上述微脂粒製劑機能之 過程中，發現以經疏水性分子修飾的抗體，與上述微脂粒製 劑同樣地，與單獨該抗體時相比較下，可顯示顯著的細胞凋 零誘導能力。即，本發明之疏水性分子修飾抗體，未依存於 試管內之二次抗體或活體內之效應物細胞之存在，單獨以疏 水性分子修飾抗體更有效地發揮細胞凋零誘導能力。因此， 本發明之疏水性分子修飾抗體於單獨以抗體未充分獲得治 療效果的患者中帶來有效的治療效果。 即，本發明包含以下之發明。 (1)一種疏水性分子修飾抗體，其含有以下（a)至（c)， 且與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體結合： (a )與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性結 合的抗體、該抗體之機能性片段、或與含該抗體之重鏈及輕 鏈之互補性決定部位的該細胞表面受體專一性結合的多胜 狀； (b )水溶性連結物； 200916477 (C )藉由（b )與（a )連結的疏水性分子。 (2 )如（1 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其對於表 現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，顯示出細胞凋 零誘導活性。 (3 )如（1 )或（2 )所記載之疏水性分子修飾抗體， 其對於表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與專 一性結合該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二次抗 體或ProteinG、A等之抗體結合蛋白質而被交聯時於試管內 所示的細胞凋零誘導活性相同，或於試管內顯示更強的細胞 凋零誘導活性。 (4 )如（3 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其對於表 現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與專一性結合 該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二次抗體或 ProteinG、A等之抗體結合蛋白質而被交聯時之試管內所示 的50%細胞生存濃度相比較，顯示1/4以下之50%細胞生存 濃度。 (5 )如（4 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其對於表 現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與專一性結合 該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二次抗體或 ProteinG、A等之抗體結合蛋白質而被交聯時之試管內所示 的50%細胞生存濃度相比較下，顯示1/10以下之50%細胞 生存濃度。 (6 )如（1 )或（2 )所記載之疏水性分子修飾抗體， 專一性與參與誘導細胞凋零之細胞表面受體結合的抗體之 200916477 機能性片段係藉由水溶性連結物與疏水性分子連結’且對於 表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞顯示細胞凋 零誘導活性。 (7 )如（1 )至（5 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其含有與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一 性結合的抗體，且該抗體爲抗體之全長分子。 (8 )如（1 )至（6 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體之機能性片段爲F ( ab ’）2。 (9 )如（1 )至（6 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體之機能性片段爲Fab’。 (1 〇 )如（1 )至（9 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲嵌合抗體。 (U )如（1)至（9 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲人化抗體。 (1 2 )如（1 )至（9 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲人類抗體。 (1 3 )如（1 )至（6 )項中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的多胜肽爲單鏈可變部位抗體。 -10- 200916477 C 1 4 ) w C 1 )运（丨3 )項中任—項所記載之疏水性分 子與細胞凋零誘導的細胞表面受體爲含有 死亡功能域之受體。 (15} $E1 ( 14 >所記載之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受鵝選自Fas、DR4、DR5及TNF受體組成 之群。 (1 6 )如（1 5 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲DR5。 (1 7 )如（1 5 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲DR4。 (1 8 )如（1 5 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲Fas » (1 9 )如（1 6 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段爲包含序列表所記載之序列 編號1之胺基酸序列之1〜1 1 8編號的胺基酸殘基所構成的 重鏈可變區序列及序列表所記載之序列編號2之胺基酸序列 、 之1〜1 〇 7編號的胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區序列。 (20 )如（1 7 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段爲包含選自融合瘤2E 1 2所産 生的抗體、與該抗體結合相同的抗原決定的抗體或該抗體之 人化抗體的抗體之重鏈及輕鏈可變區。 (2 1 )如（1 8 )所記載之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段包含序列表所記載之序列編 號3之胺基酸序列之1〜1 3 9編號的胺基酸殘基所構成的重 -11- 200916477 鏈可變區序列及序列表所記載之序列編號4之胺基酸序列之 1〜1 3 1編號的胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區序列。 (22 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲磷脂質。 (23 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲磷脂醯乙醇胺。 (2 4 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲二硬脂基磷脂醯乙醇胺。 (2 5 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲膽固醇。 (2 6 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子之所示L〇gD爲4以上。 (2 7 )如（2 6 )所記載之疏水性分子修飾抗體’其中疏 水性分子之所不L 〇 g D爲1 0以上。 (2 8 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中水溶性連結物爲聚環氧烷（Polyalkylene v 〇xi de) ° (29 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中水溶性連結物爲聚乙二醇。 (3 0 )如（2 9 )所記載之疏水性分子修飾抗體’其中聚 乙二醇之平均分子量爲100以上20000以下。 (3〗）如（3 0 )所記載之疏水性分子修飾抗體’其中聚 乙二醇之平均分子量爲500以上5000以下。 (3 2 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 -12- 200916477 修飾抗體，其中疏水性分子爲磷脂醯乙醇胺，且水溶性連結 物爲聚乙二醇。 (3 3 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲二硬脂基磷脂醯乙醇胺，且水 溶性連結物爲聚乙二醇。 (3 4 )如（1 )至（2 1 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子爲膽固醇，且水溶性連結物爲聚 乙二醇。 (3 5 )如（3 2 )至（3 4 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中聚乙二醇之平均分子鴦爲2000以上3400以 下。 (3 6 )如（1 )至（3 5 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子之結合的水'溶性連結物係藉由抗 體之離胺酸殘基與抗體結合。 (3 7 )如（1 )至（3 5 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子之結合的水溶性連結物係藉由抗 • 體之半胱胺酸殘基與抗體結合。 (3 8 )如（1 )至（3 5 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中疏水性分子之結合的水溶性連結物係藉由將 抗體之絞鏈區雙硫鍵還原所得的半胱胺酸殘基與抗體結合。 (3 9 )如（1 )至（3 8 )中任一項所記載之疏水性分子 修飾抗體，其中對於抗體一分子，疏水性分子以〗至5 0個 分子結合。 (40 )如（3 9 )所記載之疏水性分子修飾抗體’其中對 -13- 200916477 於抗體一分子，疏水性分子以1至1 0個分子結合。 (41) 一種醫藥組成物，其含有（1)至（40)中任一 項所記載之疏水性分子修飾抗體爲有效成分。 (42 ) —種抗腫瘤劑，其含有（1 )至（40 )中任一項 所記載之疏水性分子修飾抗體爲有效成分。 (43 )—種自體免疫性疾病或炎症性疾病之治療劑’其 含有（1 )至（40 )項中任一項所記載之疏水性分子修飾抗 體爲有效成分。 【實施方式】 實施發明之最佳形態 又，本說明書中「癌症」與「腫瘤」係以相同意義使用。 本說明書中，所謂「基因」不僅指D N A ’亦包含其m RNA、cDNA 及其 cRNA。 本說明書中，所謂「多核苷酸」係以與核酸相同意義使 用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。 本說明書中，「多胜肽」與「蛋ΰ質」係未區別地使周。 本說明書中，所謂「R Ν Α劃分」係指包含R Ν Α的劃 分。 本說明書中，「細胞」爲動物個體內之細胞’亦包含培 養細胞。 本說明書中，所謂「細胞之癌症化I ’係指細胞喪失接 觸抑制現像的感受性、或顯示基底非依賴性增殖等’所謂顯 示細胞異常增殖者’而顯示如此異常增殖的細胞稱爲「癌症 細胞」。 -14- 200916477 本說明書中，所謂「細胞傷害」，係指任何形態之細胞 所具有的病理性變化，不限於直接的外傷，D N A之切斷或 鹼基之二量體之形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損 傷、各種酵素活性的低下等所有的細胞構造或機能上的損 傷。 本說明書中所謂「細胞傷害活性」係指造成上述細胞傷 害者。 本說明書中，例如使用所謂「免疫微脂粒所含有的抗體 (或多胜狀）」等表現時之「所含有」，係指構成該微脂粒的 脂質具有之官能基與該多胜肽具有之官能基係基於共價結 合、或物理的•生物學的親和性而形成非共價結合的狀態。 本說明書中所謂「含有死亡功能域之受體」，係指含有 與果蠅之自殺基因r e a p e r顯示相同性之於細胞內功 能域所具有之稱爲「死亡功能域」的細胞凋零訊號傳遞區域 的受體分子（包含 Fas、TNFRI、DR3、DR4、DR5 及 DR6, 但未限於此）者。 本說明書中之「抗體之機能性片段」，係指具有與抗原 之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F ( ab’）2、scFv 等。又，於還原F(ab’）2之條件下經處理的抗體之可變區 之一價片段的Fab’亦包含於抗體之機能性片段中。惟’只要 具有與抗原之結合能力即可並未限於此等分子。又’此等之 機能性片段，不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素 處理，而且包含使用基因工程改變的抗體基因於適當宿主細 胞所産生的蛋白質。 -15- 200916477 本發明中所謂「Fab’」，將如上述之F(ab，）2於還原條 件下處理的抗體之可變區之一價之片段，利用於還原條件所 產生的Fab’中之硫醇基可使該Fab’與微脂粒結合。惟，使 用基因工程改變的抗體基因所産生的Fab ’或羧基末端上賦 予含基因工程的半胱胺酸殘基的多胜肽之Fab亦可利用各個 硫醇基而與微脂粒結合，被包含於本發明之Fab，。 本說明書中「單鏈可變部位抗體」以與單鏈F v ( s C Fv)相同意義使用。 本說明書中所謂「二次抗體」係指與抗體分子專一性結 合而該抗體分子彼此交聯的抗體。 本說明書中所謂「兩親性小胞形成脂質」，係指具有疏 水性及親水性部分，且又單獨於水中能形成二層小胞之脂 質、或與其他脂質同時被收入脂質雙層，此時該雙層膜之內 部疏水區域與此疏水性區域接觸，又此親水性區域面向該膜 之外部極性表面且包含一切的兩親性脂質。 本說明書中所謂「微脂粒」，係指藉由兩親性小胞形成 脂質所形成的脂質構造體。微脂粒典型地爲內部具有水相之 單層或多層之脂質雙層所構成的閉鎖小胞，但本發明中係更 廣泛指粒子狀脂質複合體。 本說明書中所謂「免疫微脂粒」係指微脂粒與蛋白質所 形成的複合體 本說明書中所謂免疫微脂粒之「抗體密度」，係指相對 於構成免疫微脂粒之總脂質莫耳數，該免疫微脂粒含有的抗 體之莫耳數之比例以莫耳百分比標記者。 -16- 200916477 本說明書中所謂「平均粒子徑」，係指以體積或數目爲 基準所測定的粒子徑分布之平均値。粒子之粒子徑，例如以 雷射繞射法、動態光散亂法等電磁波散亂法、離心沈降法等 之光透過法測定。 本說明書中所謂「疏水性分子修飾抗體」，係指結合疏 水性分子的抗體、或藉由水溶性連結物與疏水性分子結合的 抗體。 1.關於細胞凋零關連基因 關於本發明之目的免疫微脂粒所含有的抗體，要求該抗 體對特定抗原結合，且經由該抗原顯示細胞傷害活性。又， 爲了防止正常細胞被殺傷，必須選擇專一性存在於腫瘤細胞 的抗原。作爲如此的抗原群之一例，可列舉腫瘤細胞壞死因 子（本說明書中以下稱爲「TNF」）關連細胞凋零誘導配位體 (本說明書中以下稱爲「TRAIL」）受體群。TRAIL爲TNF 家族蛋白質之成員，此包含Fas配位體及TNF-a( Wiley SR，et al.Immunity 1995 Dec; 3( 6): 673-82)。此寺蛋白質爲細胞 凋零之強力誘導因子。 此等TNF家族蛋白質之受體，帶有來自細胞外功能域之 富含半胱胺酸的重複序列的特徴’但其中爲Fas配位體之受 體的Fas '及TNFa之受體的TNF受體1(本說明書中以下 稱爲「TNFRI」），於細胞內功能域具有顯示與稱爲果蠅之自 殺基因 reaper (Golstein，P.，et al.( 1995) Cell. 81, 185-186, White,K，et al.( 1994) Science 264，677-683)有相同性的區 域的「死亡功能域」的細胞凋零之訊號傳達上必須的區域’ 200916477 總稱爲含有死亡功能域之受體。 關於TRAIL已鑑定出5種受體，此等中2種（DR4 (TRAIL-R1)及DR5(TRAIL-R2))可傳達細胞凋零訊號， 其他 3 種（DcRl (TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)及護骨 素（osteoprotegerin: OPG)不會傳達細胞调零訊號。與Fas 及TNFRI相同地，DR4及DR5兩者之細胞內片段含死亡功 能域，因而經由含Fas關連死亡功能域蛋白質（本說明書中 以下稱爲「FADD」）及Caspase8的路徑而傳達細胞凋零訊 號（Chaudhary PM,et al.Immunity 1 997 Dec； 7( 6)： 813-20 ； Schneider P,et a 1. Immunity 1997 Dec ; 7 ( 6) : 821-30)。 關於上述之Fas、TNFRI、DR4、DR5，與該分子結合而 作爲激動劑作用抗體，對於細胞表面保有該分子的細胞，顯 示出細胞凋零誘導能力爲已知（Journal of Cellular Physiology, 209 ： 1221-1028( 2006)； Leukemis, Apl； 21( 4)： 805 -8 1 2 ( 2007 ) ； Blood, 99 : 1 666- 1 675 ( 2002 ) ； Cellular Immunology, Jan; 153 ( 1): 184-193 ( 1994))。上述激動劑 、 抗體之藥效經由二次抗體或效應物細胞交聯而被增強 (Journal of I mmun ο 1 o g y, 1 4 9 ： 3 1 66-3 1 73 ( 1 992 ) ； Eouropian Journal of Immunology,Oct ； 23 ( 10): 2676-2681 ( 1993 ))° 免疫微脂粒於微脂粒膜上結合許多抗體，而可捕捉仿似抗體 交聯狀態的構造體。因此，經由藉向來之二次抗體或效應物 細胞交聯，亦可特別地增強上述激動劑抗體之藥效。又，爲 了可具體顯現人工性高度交聯狀態，亦期待單獨之抗體未必 要具有激動劑活性。由以上理由’結合含有死亡功能域之受 -18- 200916477 » 體的抗體，可選擇作爲本發明免疫微脂粒中可能含有的抗 體。 2·結合DR5之抗體 (1 ) DR5基因 人類DR5 ( death receptor 5)基因之核苷酸序列及胺基 酸序列已於Genbank中登錄爲GI: 22547118 (登錄號： NM_147U7)。又，DR5之胺基酸序列中，編碼1或數個胺 基酸被取代、刪除、添加的胺基酸序列而成之與DR5有同等 生物活性的蛋白質的核苷酸序列亦包含於D R5基因之核苷 酸序列。又，DR5之胺基酸序列中，具有1或數個胺基酸被 取代、刪除、添加的胺基酸序列而成之與DR5同等生物活性 的蛋白質亦包含於DR5。 (2 )抗DR5之抗體 本發明之抗DR5之抗體，可使用通常方法，以選自DR5 或DR5之胺基酸序列的任意多胜肽免疫動物，採取活體內産 生的抗體、純化而得。 又，依據公知之方法（例如Kohler and Milstein，Nature (1 9 7 5 ) 25 6, p.49 5 -49 7； K e nn e t, R. e d., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N.Y· ( 1980))，使産生抗 DR5 之 抗體之抗體産生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，可獲 得單株抗體。 又，作成抗原之DR5可經由自DR5基因之基因操作使 於宿主細胞産生而獲得。 具體而言，製作可表現DR5基因的載體，將其導入宿主 200916477 細胞而表現該基因，純化經表現的DR5純化爲宜。 又，構築D R 5之細胞外區域與抗體之恆定區融合的人工 基因，亦可使用於適切基因表現系中調製的蛋白質作爲免疫 原。 以下，具體説明抗DR5之抗體之取得方法。 (2 ) -1.抗原之調製 作爲製作抗DR5抗體之抗原，可列舉DR5或其至少6 個連續部分胺基酸序列而成的多胜肽、或加入此等任意之胺 基酸序列或担體的衍生物。 DR5可由入類腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化使用，又， 可於試管內合成DR5、或經基因操作於宿主細胞産生而獲 得。 基因操作，具體而言，將DR5倂入可表現的載體後，於 含有轉錄及轉譯上必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合 成、或經由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形而 表現DR5，可獲得該蛋白質。 % DR5之cDNA ’例如以表現DR5的cDNA庫作爲模版， 使用專一性增幅DR5 cDNA的引子進行聚合酶鏈反應（以下 稱爲「PCR」）（Saiki,R.K.，et al. Science ( 1988 ) 239 P · 4 8 7 - 4 8 9 )，由所謂的P C R法可取得者。 多胜肽之試管內合成法’例如可列舉Roche Diagnostic 公司製之快速轉譯系統（RTS)，但不限於此。 作爲原核細胞之宿主，例如可列舉大腸菌（Escherichia c〇li)或枯草桿囷（Bacillus subtilis)等。使目的基因於此 -20 - 200916477 等宿主細胞內轉形，含有可與適合宿主的種由來的複製子 (repl icon)即複製起點、及調節序列的質體載體中使宿主 細胞轉形。又，作爲載體，具有可賦予轉形細胞中表現形質 (表現型）之選擇性者爲較佳。 真核細胞之宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、酵母等細 胞，作爲脊椎動物細胞，例如，宜使用猴細胞之C Ο S細胞 (Gluzman，Y. Cell( 1981 )23, P.175-182、ATCC CRL-1650)、 小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCCN〇. CRL-1658)或中國倉鼠 卵巢細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61 )之二氫葉酸還原酵素 欠缺株（Urlaub, G. and Chasin, L,A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 980 ) 77,p4126-4220)等，但不限於此等。 如上述所獲得的轉形體，可依通常方法培養，由該培養 於細胞內、或細胞外產生目的多胜肽。 作爲該培養所用之培養基，可視採用的宿主細胞適當選 擇慣用的各種培養基，若爲大腸菌，例如於LB培養基可視 必要添加安比西林（a m p i c. i 11 i η )等抗生素或I P T G使用。 & 由上述培養，轉形體之細胞內或細胞外所産生的重組蛋 白質，可利用該蛋白質之物理的性質或化學的性質等由各種 公知分離操作法分離•純化。 作爲該方法，具體而言例如經通常之蛋白質沈澱劑處 理、超過濾、分子篩色層分析（凝膠過濾）、吸附色層分析、 離子交換色層分析、親和性色層分析、高速液體色層分析 (HP LC )等各種液體色層分析、透析法、此等之組合等。 又，經表現的重組蛋白質經由連繫6殘基所構成的組胺 -21 - 200916477 酸，可於鎳親和性管柱中有效率地純化。 藉由組合上述方法’以高產率、高純度爲目的，可更容 易地大量製造多胜肽。 (2) -2.抗DR5單株抗體之製造 作爲專一性結合DR5的抗體之例，可列舉專一性結合 DR5的單株抗體，其取得方法如以下記載。 於單株抗體之製造上一般而言如下述作業工程係必須 的。 即， (a )使用作爲抗原的生物體高分子之純化、 (b )經由注射抗原至動物而免疫後，採取血液測量其 抗體力價而決定脾臓摘出的時期後，調製抗體産生細胞的工 程、 (c )骨髓瘤細胞（以下稱爲「骨髓瘤」）之調製、 (d)抗體産生細胞與骨髓瘤之細胞融合、 (e )產生作爲目的抗體的融合瘤群之選別、 (f )單一細胞選殖株的分群（選殖）、 (g )依據場合，大量製造單株抗體用的融合瘤之培 養、或移植融合瘤的動物之飼育、 (h )如此製造的單株抗體之生理活性、及其結合專一 性之檢討、或作爲標識試藥之特性之鑑定等。 以下，依上述工程詳述單株抗體之製作法，但該抗體之 製作法並未限於此等，例如亦可使用脾臟細胞以外之抗體産 生細胞及骨髓瘤。 -22 - 200916477 (a )抗原之純化 作爲抗原，可使用以如前述方法調製的DR5或其一部 分。 又’亦可使用由DR5表現重組體細胞調製的膜劃分、或 DR5表現重組體細胞本身、DR5與其他蛋白質之融合蛋白 質，又使用相關業者眾所皆知之方法，將化學合成的本發明 蛋白質之部分胜肽作爲抗原使用。 (b )抗體産生細胞之調製 將工程（a )中所得的抗原與費氏（Freund)完全或不 完全佐劑、或硫酸鋁鉀等助劑混合，作爲免疫原免疫實驗動 物。於實驗動物使用公知融合瘤製作法可無妨礙地使用動 物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、 馬等。惟’由摘出的抗體産生細胞與骨髓瘤細胞融合之入手 容易性等觀點’小鼠或大鼠作爲被免疫動物爲較佳。 又’實際上使用的小鼠及大鼠之系統並未特別限制，於 使用小鼠時，例如可使用A、A K R B A L B / c B D P B A C E、C 3 Η、 57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、 NZW、RF· R III、SJL、SWR、WB、129 等各系統，又使用 大鼠時’例如可使用 Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、 BN、Fischer等各系統。 此等小鼠及大鼠例如可獲自日本CLEA、日本Charles river等實驗動物飼育販賣業者。 其中’若考量與後述骨髓瘤細胞融合適合性，小鼠中以 BALB/c系統，大鼠以Low系統作爲被免疫動物爲特佳。 -23 - 200916477 又’考慮抗原之人類與小鼠的相同性，使除去自體抗體 的生體機構降低的小鼠，即亦可使用自體免疫疾病小鼠。 又，此等小鼠或大鼠免疫時之週齢，較佳爲5〜12週齢， 又更佳爲6〜8週齢。 經由D R 5或其重組體免疫動物，例如可使用 We i r, D . M ., H an d b ο 〇 k of Experimental Immunology Vol.I, II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford ( 1 9 8 7 )； Kabat, E. A. and Maye r, Μ. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois ( 1 964 )等詳細記載的公知方法。 此等之免疫法中’具體顯示本發明中的較佳方法，例如 以下所示者。 即’首先’投與作爲抗原的膜蛋白劃分、或表現抗原的 細胞至動物的皮內或腹腔內。 惟，爲了提高免疫效率，較佳爲倂用兩者，前半段進行 皮內投與，僅後半段或最終回進行腹腔內投與，可特別地提 1 高免疫效率。 抗原投與之進度表因被免疫動物之種類、個體差異等而 不同，一般而言’抗原投與次數3〜6次，投與間隔2〜6週 間爲較佳’投與次數3〜4次’則投與間隔2〜4週間爲較佳。 又，抗原之投與量因動物之種類、個體差異等而不同， —般而言爲0.05〜5 mg’較佳爲0.1〜〇.5 mg左右。 追加免疫爲如以上之抗原投與之1〜6週後，較佳爲2 〜4週後，更佳爲2〜3週後進，行。 -24- 200916477 又’進行追加免疫時抗原投與量依動物種類、大小等而 不同’一般而言，例如於小鼠的場合爲0.05〜5 mg，較佳爲 0.1〜0.5 mg’更佳爲0.1〜0.2 mg左右。 自上述追加免疫1〜10日後，較佳爲2〜5日後，更佳 爲2〜3日後自被免疫動物以無菌方式取出含抗體産生細胞 的脾臓細胞或淋巴球。 又’此時測定抗體力價，將抗體力價成爲足夠高的動物 作爲抗體産生細胞之供給源使用，可提高以後操作的效率。 於此作爲使用的抗體力價之測定法，例如可列舉R I A 法或ELISA法，但不限於此等方法。 本發明中抗體力價之測定，例如依ELISA法，可如以下 述載的順序進行。 首先，使純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔 平盤等之固相表面，進而於未吸附抗原的固相表面以與抗原 無關係的蛋白質，例如以牛血清白蛋白（以下稱爲「B S A」） 覆蓋，洗淨該表面後，以作爲將第一抗體之梯度稀釋的試料 (例如小鼠血清）接觸，使上述抗原與試料中之抗體結合。 又加入作爲第二抗體之經酵素標識的抗小鼠抗體的抗 體而與小鼠抗體結合，洗淨後加入該酵素的基質，基於基質 分解測定經由發色的吸光度變化等，算出抗體力價。 自此等脾臓細胞或淋巴球之抗體産牛.細胞之分離。可依 據公知方法（例如 Koh 丨er et al.，Nature ( 1 97 5 ) 2 5 6，ρ·495 ; Kohler et al., Eur. J. Immnol.( 1 97 7 ) 6, p.511； Milstein et al., Nature ( 1977 ) 2 6 6, p. 5 5 0 ； Walsh, Nature, ( 1 9 7 7 ) 266, -25 - 200916477 p.495 )進行。 例如，於脾臓細胞之場合’可採用將細胞細切以不鏽鋼 網過濾後，於Eagle最小必須培養基（MEM )游離而分離抗 體産生細胞的一般性方法。 (c )骨髓瘤細胞（以下，稱爲「骨髓瘤」）之調製 細胞融合所用的骨髓瘤細胞並未特別限制’可自公知細 胞株適宜選擇使用。惟，考慮由融合細胞選擇融合瘤時之便 利性，使用確立此選擇手續的HGPRT (次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核糖轉移酶(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase))缺損株爲較佳。 即，小鼠由來之 X63-Ag8(X63)、NS 卜 ANS/1 (NS1)、 P3X63-Ag8.Ul( P3U1)、X63-Ag8.653( X63.653 )、SP2/0-Agl4 (SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7 ( 45.6TG)、FO、S149/5XXO、 BU.l等，大鼠由來之210.RSY3.Ag.l.2.3(Y3)等，人類由 來之 U266AR ( SKO-007)、GM1500.GTG-A12 ( GM1500)、 TJC 72 9- 6 > LTCR-LOW-HMy2( HMy2 )> 8 2 2 6 A R/NI P 4 - 1 ( NP4 1 ) 、 等。 此等之H G P R T缺損株’例如可由American Type Culture Collection ( ATCC)等取得。 此等之細胞株，於適當培養基，例如於8 -氮鳥嘿哈培養 基〔RPMI-164〇培養基中添加麩醯胺酸、2-|荒基乙醇、慶大 黴素（gentamycin )、及牛胎兒血清（以下稱爲「FCS」）的 培養基中加入8-氣鳥嘿D令的培養基〕、iSc〇ve氏改變

Dulbecco 氏培養基（Iscove’s Modified Dulbecco，s Medium; -26 - 200916477 以下稱爲「IMDM」）、或Dulbecco氏改變j£agie氏培養基 (Dulbecco，s Modified Eagle Medium ;以下稱爲 r DMEM」） 中繼代培養，細胞融合之3至4日則於正常培養基〔例如含 10%FCS的ASF104培養基（味之素（股）公司製）〕中繼代 培養，融合當日確保2 X 1 07以上的細胞數。 (d )細胞融合 抗體産生細胞與骨髓瘤細胞之融合，依據公知方法 (Weir, D. Μ., Handbookof Experimental Immunology Vol.I II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford ( 1 9 8 7 )； Kabat, E . A. and Mayer, M . M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield，Illinois ( 1964)等），可於不使細胞生存率極度降 低的程度的條件下適宜實施。 此等方法，例如可使用於聚乙二醇等之高濃度聚合物溶 液中混合抗體産生細胞與骨髓瘤細胞的化學方法、利用電氣 刺激的物理方法等。 其中，上述化學方法之具體例如下所示。即，使用爲高 濃度聚合物溶液的聚乙二醇的場合時，分子量1500〜6000， 較佳爲2000〜4000之聚乙二醇溶液中，於30〜40 °C，較佳 爲3 5〜3 8 °C之溫度下將抗體産生細胞與骨髓瘤細胞混合1〜 10分鐘、較佳爲5〜8分鐘。 (e )融合瘤群之選擇 由上述細胞融合所獲得的融合瘤之選擇方法並未特別 限制，通常使用H A T (次黃嘌呤.胺基喋呤·胸腺嘧啶） -27 - 200916477 選擇法（Kohler et al·，Nature ( 1 975 ) 256，ρ·495 ; Milstein et al., Nature ( 1 977 ) 266，p.550)。 此方法使用於胺基喋呤中無法生存的HGPRT缺損株之 骨髓瘤細胞獲得融合瘤的場合爲有效的。 即，經由於HAT培養基中培養未融合細胞及融合瘤’ 使選擇性殘留僅現存對胺基喋呤耐性的融合瘤，並可使其增 殖。 (f )單一細胞選殖株之分離（選殖） 作爲融合瘤之選殖法，例如可使用甲基纖維素法、軟洋 菜膠法、限界稀釋法等之公知方法（例如Barbara，B. M. and Stanley, Μ. S.： Selected Methods in Cellular Immunology, W H. Freeman and Company, San Francisco( 1980))。此等方法 中，特別是限界稀釋法爲較佳。 以此方法，於微量盤中接種大鼠胎兒由來的纖維母細胞 株、或正常小鼠脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞等供應細胞。 另一方靣，預先將融合瘤以0.2〜0 · 5個/0.2 ml的方式於 培養基中稀釋，此經稀釋的融合瘤之游離液於各別孔中每孔 放入0 _ 1 m 1 ’每隔一定期間（例如每3日）一邊將約1 / 3培 養基以新的培養基交換一邊繼續培養2週左右，可使融合瘤 之選殖株增殖。 關於被認爲有抗體力價之孔，例如經限界稀釋法重複2 〜4次選殖’選擇安定地被認爲有抗體力價者作爲抗dR5單 株抗體産生融合瘤株。 (g )經融合瘤培養之單株抗體之調製 -28- 200916477 如此經選擇的融合瘤，可經由培養，有效_ 抗體，但培養之前，期望先篩選產生作爲目的& 融合瘤。 於此篩選可採用其本身既知之方法。 本發明中抗體力價之測定可依據例如上述 中説明的E L I S A法進行。 依據如以上之方法所獲得的融合瘤，可於 -8 0°C以下之冷凍庫中以凍結狀態保存。 完成選殖之融合瘤，將培養基由HT培養ί 養基培養。 使用大型培養瓶的回轉培養、或旋轉器培i 養。 此大量培養之上清液，經由使用凝膠過濾_ 皆知之方法純化，可獲得專一性結合本發明蛋^ 體。 又，同系統之小鼠（例如上述之B ALB/c ) 小鼠之腹腔內注射融合瘤，經由使該融合瘤增5 大量本發明單株抗體的腹水。 腹腔內投與時，事前（3〜7日前）投與2, 基十五院（2,6,10，14-tetramethyl pentadecane) 等之礦物油，可獲得較多量腹水。 例如，融合瘤與同系統之小鼠之腹腔內預夕 制劑，使T細胞不活性化後，於20日後將1 〇6 瘤·選殖株細胞於不含血清的培養基中使游離 ϊ地獲得單株 J單株抗體的 〔b )之項目 良態氮中或 ;換成正常培 ί進行大量培 ^該業者眾所 3質之單株抗 、或 N u / Ν ία I，可獲得含 6，10，14-四甲 ；PRISTANE ) &注射免疫抑 〜1 〇7個融合 (0.5 ml)而 -29 - 200916477 投與至腹腔內，通常腹部會膨脹，以積存腹水的程度自小鼠 採取腹水。 依據此方法，獲得與培養液中相比約1 00倍以上濃度之 單株抗體。 由上述方法獲得的單株抗體，可例如以記載於Weir，D. Μ· : Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications，Oxford ( 1978 )之方法純 化。 即，硫銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色層分析法、 親和性色層分析法等。 作爲純化之簡便方法，亦可利用市售單株抗體純化套組 (例如，MAbTrap GII套組；Pharmacia公司製）等。 如此所得單株抗體具有對DR5之高抗原專一性。 (h )單株抗體之檢定 如此所得單株抗體之異型及亞群之決定可如以下進行。 首先’可列舉奧克特洛尼平板雙向擴散法（Ouchterlony ) 法、ELISA法、或RIA法作爲鑑定法。 奧克特洛尼平板雙向擴散法雖爲簡便，但單株抗體之濃 度爲低的場合有濃縮操作的必要。 另一方面，使用ELISA法或RIA法的場合，使培養上 清液以原樣與抗原吸附固相反應，進一步經由使用作爲第二 次抗體的對應各種免疫球蛋白異型、亞群的抗體，可鑑定單 株抗體之異型、亞群。 又，作爲更簡便的方法，亦可利用市售鑑定用套組（例 -30 - 200916477 如，小鼠typer套組；Bio-Rad公司製）等。 又，蛋白質之定量，可依據Folin-Lowry法，及由280nm 之吸光度〔1.4(OD280)=免疫球蛋白lmg/ml〕算出的方法 進行。 (3 )其他抗體 本發明之抗體，除了抗上述DR5之單株抗體外，亦包含 以抗人類之異種抗原性降低等爲目的之人爲改變的基因重 組型抗體，例如嵌合（Chimeric)抗體、人化抗體（Humanized) 抗體、人類抗體等。此等抗體可使用既知方法製造。 作爲嵌合抗體，可列舉抗體可變區與恆定區互爲異種的 抗體，例如，可列舉小鼠由來抗體之可變區接合人類由來之 恆定區的嵌合抗體（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，81， 6 8 5 1 -6 8 5 5, ( 1 9 84 )) ° 作爲人化抗體，僅互補性決定區（C D R ; c o m p 1 e m e n t a r i t y determining region)組合人類由來之抗體的抗體（Nature (1 986 ) 32 1 5p:522-525 )，可列舉依據 CDR 移植法，除 CDR 之序列外亦有一部份框架區之胺基酸殘基移植人類抗體的 抗體（國際公開小冊W090/07861)。 又，可舉例抗人類抗體。抗DR5人類抗體意指具有只有 人類染色體由來的抗體的基因序列的人類抗體。抗DR5人類 抗體可經由使用具有含人類抗體Η鏈與L鏈基因的人類染 色體片段的人類抗體産生小鼠的方法（To m i zu k a，K . e t a 1.， Nature Genetics ( 1 997 ) 1 6, p.1 3 3 - 1 43 ； Kuroiwa, Y .et.al., Nuc. Acids Res ( 1998) 26，p.3447-3448; Yoshida, H. et.al.， 200916477

Animal Cell Technology： Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 ( Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1 999 ； Tomizuka, K. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 2000 ) 97，p.722-727 )而取得。 此等轉基因動物，具體而言，非人類哺乳動物之內在性 免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞，替代性地將藉由酵 母人工染色體（Yeast artificial chromosome, YAC)載體等 導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座的基因重組動 物，經由基因剔除動物及轉基因動物之製作、及此等動物彼 此雜交可製作得到。 又，經由基因重組技術，編碼此等人化抗體之重鏈及輕 鏈之個別的cDNA，較佳爲經由含該cDNA的載體將真核細 胞轉形，經由培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞， 亦可自培養上清液中獲得此抗體。 其中，作爲宿主，可使用例如真核細胞，較佳爲CHO 細胞、淋巴球或骨髓瘤等晡乳動物細胞。 又，亦已知取得由人類抗體庫選別的噬菌體表現（phage display)由來之人類抗體的方法（Wormstone, I.M. et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science. ( 2002 ) 4 3(7) , p.2301-2308 ； Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics ( 2002 ) , 1 (2) , p . 1 8 9 - 2 0 3 ； Siriwardena, D. et.al., Opthalmology (2002 ) 1 09 ( 3 )，jj.427-43 1 ) ° 例如，可使用將人類抗體之可變區作爲一單鏈抗體 -32 - 200916477 (scFv )於噬菌體表面上表現，選擇結合抗原的噬菌體的噬 菌體表現法（Nature Biotechnology ( 2005) , 23，（ 9), p.1105-1116) ° 經由解析以結合抗原所選擇的噬菌體之基因，可決定編 碼結合抗原的人類抗體之可變區的DNA序列。 若結合抗原的scFv之DNA序列爲明白的，製作具有該 序列的表現載體，且經由導入適當宿主使其表現可取得人類 抗體(W092/01047 ' WO92/2079 1、WO93/062 1 3、 W093/1 1 236 ' W093/1 9172、WO95/0 1 43 8、W095/1 53 88 ' Annu. Rev. Immunol ( 1994) 1 2，p . 4 3 3 - 4 5 5、Nature Biotechnology ( 2005) 23 (9) , p.1105-1116)° 一旦單離抗體基因後，導入適當宿主而製作抗體時，可 使用適當宿主與表現載體之組合。 使用真核細胞作爲宿主時，可使用動物細胞、植物細 胞、真核微生物。 作爲動物細胞，可列舉（1 )哺乳類細胞，例如爲猴細 胞的 COS 細胞（Gluzman，Y .Cell( 1 9 8 1 )2 3，p.1 7 5 - 1 8 2，ATCC CRL- 1 6 5 0 )、小鼠纖維母細胞 NIH3T3( ATCC No. CRL- 1 6 5 8 ) 或中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉 酸還原酵素缺損株（Urlaub，G.and Chasin，L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1980) 77,p.4126-4220)。 使用原核細胞時’可列舉例如大腸菌、枯草桿菌。 於此等細胞，經由轉形導入作爲目的的抗體基因，於試 管內培養經轉形細胞而獲得抗體。 -33 - 200916477 本發明之抗體之異型無限制，例如可列舉I g G ( I g G 1、 IgG2 ' IgG3、IgG4)、IgM、IgA ( IgAl、IgA2)、IgD 或 IgE 等，較佳爲IgG或IgM。 又本發明之抗體，於維持與抗原的結合性的範圍內，亦 可爲具有抗體之抗原結合部的抗體之片段或其修飾物。 例如，作爲抗體之機能性片段，可列舉爲還原Fab、F (ab’）2、F ( ab’）2所得抗體之一價之可變區片段的Fab’、 Fv、或重鏈及輕鏈之Fv以適當連結物所連結的單鏈Fv (scFv)'雙功能抗體（diabodies)、線狀抗體、及由抗體片 段所形成的多專一性抗體等，只要保持對抗原的結合性即可 並未限於上述片段。上述抗體片段，可經由以木瓜酵素、胃 蛋白酶等酵素處理完全長的抗體分子取得。又，使用編碼上 述抗體片段之重鏈及輕鏈的核酸序列而經適當基因表現系 產生蛋白質，亦可取得上述抗體片段。又，抗體之機能性片 段之羧基末端上以基因工程添加含半胱胺酸殘基的多胜肽 的蛋白質亦可使用作爲本發明抗體的機能性片段。作爲此等 機能性片段之一例，可列舉於重鏈或輕鏈之羧基末端上添加 含半胱胺酸殘基的多胜肽的Fab，但並未限於此。經添加的 半胱胺酸殘基之硫醇基，可使用於使抗體之機能性片段與微 脂粒結合之用。 再者，本發明抗體亦可爲對至少2種類相異抗原具有專 一性的多專一性抗體。通常此等分子爲結合2個抗原者（即， 雙專一性抗體（bispecific antibody))，本發明之「多專一性 抗體」爲包含對此等以上（例如，3種類）抗原具有專一性 -34 - 200916477 的抗體者。 本發明之抗體亦可爲多專一性抗體由全長構成的抗 體、或此等抗體之片段（例如，F ( ab ’）2雙專一性抗體）。 雙專一性抗體亦可爲結合2種類抗體之重鏈與輕鏈（H L對） 而製作者，亦可經由使産生相異單株抗體的融合瘤融合而製 作出雙專一性抗體産生融合細胞，製作本發明之抗體 (Millstein et al., Nature ( 1 98 3 ) 305, p.537-539) ° 本發明之抗體可爲單鏈可變部位抗體（亦記載爲 scFv )。單鏈可變部位抗體可經由以多胜肽連結物連結抗體 之重鏈V區與輕鏈V區而得（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 ( Rosenburg 及 Moore 編、 Springer Verlag, New York, p.26 9-3 1 5 ( 1 994 ) ； Nature Biotechnology ( 2005) , 23, p.1126-1136) ° 製作單鏈可變部位抗體之方法爲該技術領域中所眾所 皆知（例如，美國專利第4,946,77 8號、美國專利第5,260,203 號、美國專利第5,091，513號、美國專利第5,45 5,03 0號）。 此單鏈可變部位抗體中，重鏈V區與輕鏈V區爲不作成共軛 物的方式的連結物，較佳爲藉由多胜狀連結物連結（Huston， J. S .et al.，Proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1 9 8 8 )，85， p.5879-5883)。單鍵可變部位抗體之重鍵V區及輕鍵V區可 來自同一抗體，亦可來自別的抗體。作爲連結V區的胜狀連 結物，例如使用1 2〜1 9個殘基所構成的任意一條鏈胜肽。 編碼單鏈可變部位抗體的DNA’編碼前述抗體之重鏈或 重鏈V區的D N A、及編碼輕鏈或輕鏈V區的D N A中，以編 200916477 碼此等序列中之全部或所冀望之胺基酸序列的DNA部分爲 模板，經由使用規定此兩端的引子對的PCR法增幅，其次， 又經由組合編碼胜肽連結物部分的DNA、及其兩端各別連結 重鏈、輕鏈的方式規定的引子對增幅而被獲得。 又，一旦編碼單鏈可變部位抗體的DNA被製作，含有 此等的表現載體、及經該表現載體轉形的宿主可依據通常方 法獲得，又，經由使用此宿主，可依通常方法獲得單鏈可變 部位抗體。 此等抗體片段可與前述相同樣地取得基因使其表現，而 由宿主産生。 本發明之抗體可爲胺基酸序列爲相異的複數種類之抗 DR5抗體之混合物，亦可爲多株抗體。作爲多株抗體之— 例，可列舉CDR爲相異的複數種類之抗體之混合物。作爲 此等多株抗體，培養產生相異抗體的細胞之混合物，使用自 該培養物純化的抗體而完成（W02004/061 1 04號）。 作爲抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇（PEG )等各 種分子結合的抗體。 本發明之抗體，進一步此等抗體可與其他藥劑形成共軛 物（Immunoconjugate)。作爲此等抗體之例，可列舉該抗體 爲與具有放射性物質或藥理作用的化合物結合之物（Nature Biotechnology ( 2005 ) 23，p · 1 1 3 7 - 1 1 46 ) ° 所得抗體可純化至均一。抗體之分離、純化可使用通常 蛋白質使用的分離、純化方法。 例如可適宜選擇色層分析管柱、過濾器、超過據、鹽析、 -36 - 200916477 透析、調製用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，並組合 此等，將抗體分離、純化（Strategies for Protein Purification and Charcterization ： A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. e d s ., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 9 9 6 ) ； Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988))，但未 限於此等。 作爲色層分析，可列舉親和性色層分析、離子交換色層 分析、疏水性色層分析、凝膠過濾、逆相色層分析、吸附色 層分析等。 此等之色層分析可使用HPLC或FPLC等液相色層分析 進行。 作爲親和性色層分析所用的管柱’可列舉蛋白質A管 柱、蛋白質G管柱。 例如使用蛋白質A作爲管柱’可列舉Hyper D、P〇ROS、 Sepharose F. F. ( Pharmacia)等 ° 又使用固定化抗原的担體，利用對抗原的結合性亦可純 化抗體。 (4)抗DR5抗體之具體例 例如，國際公開小冊、W098/5 1 793、W0200 1 /83 5 60、 W02002/94880、W Ο 2 0 0 3 / 5 4 2 1 6、W Ο 2 0 0 6 / 8 3 9 7 1、 W02007/22 1 57所記載之於DR5表現細胞中誘導細胞凋零的 抗DR5抗體能夠作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分使 用。又，稱爲 Lexatumumab、HGSTR2J、APOMAB、 200916477 APOMAB7.3、AMG-655、LBY135 的抗 DR5 抗體，及此等之 變異體，可作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分使用。惟， 只要保有抗DR5蛋白質的結合能力，並未限於上述抗體。 3. 結合Fas之抗體 (1 ) F a s基因 人類Fas基因之核苷酸序列及胺基酸序列已登錄於 Genbank 中爲 GI: 182409 (登錄號：M67454)。又，Fas 之 胺基酸序列中，編碼由1或數個胺基酸被取代、刪除、添加 的胺基酸序列構成之具有與Fas同等生物活性的蛋白質的核 苷酸序列亦包含於Fas基因之核苷酸序列。又，Fas之胺基 酸序列中，由1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的胺基酸 序列構成之具有與Fas同等生物活性的蛋白質亦包含於Fas。 (2 )抗Fas之抗體 結合Fas之抗體可依據「2. ( 2 )抗DR5之抗體」所記 載之方法取得。 (3 )其他抗體 結合Fas之抗體可依據「2. (3)其他抗體」所記載之方 法取得。 (4 )抗Fas抗體之具體例 例如，美國專利第6，9 7 2,3 2 3號所記載之F a s表現細胞 中誘導細胞凋零的抗Fas抗體及其變異體，可作爲本發明之 免疫微脂粒之構成成分使用。惟，只要保有對Fas蛋白質的 結合能力，不限於上述抗體。 4. 抗其他抗原之抗體 -38 - 200916477 關於DR5及Fas以外之受體，該受體爲含有死亡功能域 的場合，依據上述所述抗體之製作法，結合該受體，對該受 體表現細胞誘導細胞凋零的抗體之取得爲可能。此等抗體成 爲本發明之免疫微脂粒之構成成分。作爲含有死亡功能域的 受體，可列舉TNFRI、DR3、DR4、DR6等，只要爲傳達細 胞細胞凋零誘導訊號的受體，不限於上述所記載之受體。

人類TNFRI基因之核苷酸序列及胺基酸序列登錄於 Genbank 之 GI ： 339748 (登錄號：M75866)。又，於 TNFRI 之胺基酸序列，編碼1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的 胺基酸序列而成之具有與TNFRI同等生物活性的蛋白質的 核苷酸序列亦包含於TNFRI基因之核苷酸序列。又，TNFRI 之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的胺 基酸序列而成之具有與TNFRI同等生物活性的蛋白質亦含 於 TNFRI。 人類DR3 (死亡受體3)基因之核苷酸序列及胺基酸序 列登錄於 G e n b a n k 之 GI : 2 3 2 0 0 0 2 0 (登錄號：Ν Μ— 1 4 8 9 6 5 )。 又，於DR3之胺基酸序列，編碼1或數個胺基酸被取代、刪 除、添加的胺基酸序列而成之具有與DR3同等生物活性的蛋 白質的核苷酸序列亦包含於DR3基因之核苷酸序列。又，於 DR3之胺基酸序列，1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的 胺基酸序列而成之具有與DR3同等生物活性的蛋白質亦包 含於DR3。 人類DR4 (死亡受體4)基因之核苷酸序列及胺基酸序 列登錄於 Genbank 之 GI : 2 1 3 6 1 085 (登錄號：NM_003 844 )。 -39 - 200916477 又，DR4之胺基酸序列中，編碼1或數個胺基酸被取代、刪 除、添加的胺基酸序列而成之具有與DR4同等生物活性的蛋 白質之核苷酸序列亦包含於DR4基因之核苷酸序列。又，於 DR4之胺基酸序列，1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的 胺基酸序列而成之具有與DR4同等生物活性的蛋白質亦包 含於DR4。例如，爲國際公開小冊W02002/97300所記載之 抗體、Mapatumumab、及此等之變異體之抗DR4抗體可作爲 本發明之免疫微脂粒之構成成分使用。惟，只要能保有對 DR4蛋白質的結合能力，不限於上述抗體。 人類DR6 (死亡受體6)基因之核苷酸序列及胺基酸序 列登錄於 Genbank 之 GI: 23238206(登錄號：NM_014452)。 又，於DR6之胺基酸序列，編碼1或數個胺基酸被取代、刪 除、添加的胺基酸序列而成之具有與DR6同等生物活性的蛋 白質的核苷酸序列亦包含於DR6基因之核苷酸序列。又，於 DR6之胺基酸序列，1或數個胺基酸被取代、刪除、添加的 胺基酸序列而成之具有與DR6同等生物活性的蛋白質亦包 含於DR6。 5 .免疫微脂粒之構成成分 本發明提供含有專一性結合參與前述1 ·至4 .所記載 之細胞凋零之細胞表面上的受體的蛋白質，而顯示細胞凋零 誘導活性的免疫微脂粒。 「微脂粒」係指經由兩親性小胞形成脂質所形成的脂質 構造體（（D.D.Lasic，”Liposomes : from basic to applications’’，Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 -40 - 200916477 (1 993 )))。微脂粒係典型地內部具有水相的單層或多層之 脂質雙層所構成的閉鎖小胞，於本發明更廣泛地係意指的粒 子狀之脂質複合體。例如，亦包含是否具有水相爲不明確的 複合體。脂質複合體至少含有1種類之脂質，亦可含有其他 親水性聚合物、多糖類、胺基酸等，此等意指爲共價或非共 價結合所形成的粒子狀者。 「免疫微脂粒」意指經由上述微脂粒與蛋白質所形成的 複合體。所謂蛋白質，不限於僅指抗體，亦含內因性配位體 或該內因性配位體之機能性胜肽等。 此等之免疫微脂粒爲含有兩親性小胞形成脂質，而專一 性結合參與細胞凋零誘導的受體之蛋白質（抗體、內因性配 位體等）及胜肽以共價結合或非共價結合負載於微脂粒。「兩 親性小胞形成脂質」係指含有具疏水性及親水性部分，進而 單獨於水中形成一層小胞所生成的脂質、或與其他脂質一起 被收入脂質雙層，此時，該雙層膜之內部疏水區域與此疏水 性區域接觸，又此親水性區域靣向該膜之外部極性表靣排列 之全部的兩親性脂質。 「脂質雙層」係指極性脂質分子之疏水性區域彼此會 合，疏水性部面向二分子層之中心，另一方面，親水性區域 面向水相排列的構造。 本發明之免疫微脂粒，含有（1)兩親性小胞形成脂質、 (2 )親水性聚合物、（3 )蛋白質及胜狀等，微脂粒之內部 亦可含有治療用藥物。又，只要不妨礙脂質複合體之形成， 並未特別限於此等。以下詳述構成免疫微脂粒的各成分。 -41 - 200916477 (1 )兩親性小胞形成脂質 構成微脂粒之脂質成分中含有磷脂質、糖脂質、神經鞘 脂質、固醇類、二醇類、飽和或不飽和之脂肪酸、界面活性 劑、含親水性聚合物的衍生物脂質等（參照文獻 「Liposomes : from physics to applications」之 Chapter 1. Chemistry of lipids and liposomes)。可以以下所示（1) -1 . 至（1 ) -8 ·作爲例示列記。 (1 ) -1 ·磷脂質 磷脂質大略分爲甘油磷脂質與神經鞘磷脂質。甘油磷脂 質之代表例可列舉磷脂醯膽鹼（PC )、磷脂醯絲胺酸（PS )、 磷脂醯肌醇（PI)、磷脂醯甘油（PG)、磷脂醯乙醇胺（PE)、 磷脂酸（PA )。另一方面，神經鞘磷脂質之代表例可列舉神 經鞘髓磷脂。可列舉以下之（a )至（i )所記載之脂質。 (a )磷脂醯膽鹼類 例如，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼（D P P C )、二硬酯 醯基磷脂醯膽鹼（D S P C )、二肉苣蔻醯基磷脂醯膽鹼 (DMPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼（DOPC)、二月桂醯基磷脂 醯膽鹼（DLPC)、二癸醯基磷脂醯膽鹼（DDPC)、二辛醯基 磷脂醯膽鹼（DOPC)、二己醯基磷脂醯膽鹼（DHPC)、二丁 醯基磷脂醯膽鹼（DBPC)、二反油醯基磷脂醯膽鹼、二亞油 醯基磷脂醯膽鹼、二花生醯基磷脂醯膽鹼、二（二十碳烯醯 基）磷脂醯膽鹼（DEPC)、二庚醯基磷脂醯膽鹼、一己醯基 磷脂醯膽鹼、二（十七醯基）磷脂醯膽鹼、二（二十二醯基） 磷脂醯膽鹼、桐酸醯基磷脂醯膽鹼、氫化卵磷脂醯膽鹼 -42- 200916477 (HEPC)、氫化大豆憐脂醯膽鹼（HSPC)、1-棕櫚醯基-2-花 生醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼、I-棕櫚醯基-2-亞油醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-肉萱蔻醯 基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2 _硬酯醯基磷脂醯贍鹼、卜硬酯 醯基-2·棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1，2-二肉宣蔻醯基醯胺4,2-去氧憐脂酸膽驗、1-肉宣寇酸基-2-掠欄酿基憐脂醯膽鹼、ι_ 肉萱蔻醯基-2-硬酯醯基磷脂醯膽鹼、二-〇-十六基碟脂醯膽 鹼、反二反油醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚酯基-磷脂醯膽鹼、 η-十八基-2-甲基磷脂醯膽鹼、η-十八基磷脂醯膽鹼、1-月 桂基丙二醇_3_磷酸膽鹼、赤式-Ν-二十四醯基神經鞘磷脂醯 膽鹼、棕櫚醯基-(9 -順-十八醯基）-3 - s η -磷脂醯膽鹼等。 (b )磷脂醯絲胺酸類 例如，可列舉二硬酯醯基磷脂醯絲胺酸（D S P S )、二肉 宣蔻醯基磷脂醯絲胺酸（DMPS )、二月桂醯基磷脂醯絲胺酸 (DLPS)、二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸（DPPS)、二油醯基磷 脂醯絲胺酸（DOPS )、溶磷脂醯絲胺酸、桐酸醯基磷脂醯絲 胺酸、1,2-二-(9-順-十八醯基）-3- s η -磷脂醯絲胺酸等。 (c )磷脂醯肌醇類 例如，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯肌醇（DPPI )、二硬醋 醯基磷脂醯肌醇（DSPI)、二月桂醯基磷脂醯肌醇（DLPI) 等。 (d )磷脂醯甘油類 例如，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯甘油（DPPG )、二硬酯 酿基磷脂醯甘油（DSPG )、二油醯基磷脂醯甘油（DOPG )、 200916477 二月桂醯基磷脂醯甘油（dlpg )、二肉宣蔻醯基磷脂醯甘油 (DMPG )、溶磷脂醯甘油、氫化大豆磷脂醯甘油（HSPG)、 氫化卵磷脂醯甘油（HEPG)、心磷脂（cardi〇l ipin)(二磷脂 醯甘油）等。 (e )磷脂醯乙醇胺（腦磷脂（cephalin))類 例如，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺（D P P E )、二硬 酯醯基磷脂醯乙醇胺（D S P E )、二油醯基磷脂醯乙醇胺 (DOPE)、二月桂酿基磷脂醯乙醇胺（DLPE)、二肉豈蔻醯 基磷脂醯乙醇胺（DMPE )、二癸醯基磷脂醯乙醇胺（DDPE )、 N -戊二醯基磷脂醯乙醇胺（NGPE )、溶磷脂醯乙醇胺、N -(7-硝基-2，1,3-苄醯氧基二唑-4-基）-1，2-二油醯基-3 11-磷脂醯乙醇胺、桐酸醯基磷脂醯乙醇胺、N -琥珀醯基二油 醯基磷脂醯乙醇胺' 1-十六基-2-棕櫚醯基甘油磷脂醯乙醇胺 等。 (f )磷脂酸類 例如，可列舉二棕櫚醯基磷脂酸（D P P A )、二硬酯醯基 磷脂酸（DSPA)、二肉萱蔻醯基磷脂酸（DMPA)、二油醯基 磷脂酸（DOPA )等。 (g )神經鞘磷脂質 例如，可列舉神經鞘髓磷脂、二棕櫚醯基神經鞘髓磷 脂、二硬酯酸基神經鞘髓磷脂、神經醯胺氨乙基磷酸、神經 醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基甘油等。 (h )具有聚合性殘基的聚合性磷脂質 作爲不飽和磷脂質，具有聚合性殘基的聚合性磷脂質 -44 - 200916477 爲，可列舉例如1，2 _雙（2,4 -十八烷二烯醯基）-S η -甘油 -3-磷酸膽鹼、1,2-雙（2,4-十六烷二烯醯基）-s η-甘油- 3-磷酸膽驗、1-(十八酿基）-2-( 2,4-十八院二烯醯基）-s η -甘油-3-磷酸膽鹼、1-(十六醯基）-2-(2,4-十八烷二烯醯 基）-s η-甘油-3-磷酸膽鹼、1-(十八醯基）-2-(2,4-十六 烷二烯醯基）-s η-甘油-3-磷酸膽鹼、1-(十六醯基）-2-(2,4-十六烷二烯醯基）-3 11-甘油-3-磷酸膽鹼、1-(2,4-十八烷二烯醯基）-2-(十八醯基）-S η -甘油-3-磷酸膽鹼、 1-( 2,4 -十六烷二烯醯基）-2-(十六醯基）-s η-甘油-3-磷 酸膽鹼、1，2-雙-(8,10，12-十八烷三烯醯基）-3 11-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-雙（12-甲基丙烯醯基氧基癸醯基）-s η-甘 油-3-磷酸膽鹼、1，2-雙（9-( ρ-乙烯基苄醯基）壬醯基）-s η -甘油-3 -磷酸膽驗等。 又，其他聚合性磷脂質爲，例如，可列舉1 ,2 -雙（2，4-十八烷二烯醯基）-s η -甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙（2，4- +六悖一馐赔其、-s η -廿油-^ -碰醏贿胺、1 - ί + Λ啤其、 -2-( 2,4-十八烷二烯醯基）-s n -甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(十 六醯基）-2-(2,4-十八烷二烯醯基）-S n-甘油-3-磷酸乙醇 胺、1-(十八醯基）-2_(2,4-十六烷二烯醯基）-811-甘油 -3-磷酸乙醇胺' 1-(十六醯基）-2-(2,4-十六烷二烯醯基） -s η -甘油-3-磷酸乙醇胺、1-( 2,4-十八烷二烯醯基）-2-(十 八醯基）-s η -甘油-3-磷酸乙醇胺、1 - ( 2,4-十六烷二烯醯 基）-2-(十六醯基）-s η -甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙-(8, 10,12-十八烷三烯醯基）-s η -甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2- -45 - 200916477 雙（12 -甲基丙嫌醯基氧基癸酿基）-s n_甘油_3_碟酸乙醇 胺、1,2-雙（9- ( P -乙烯基苄醯基）壬醯基）_s n -甘油·3_ 磷酸乙醇胺等° 又，其他聚合性磷脂質爲，例如，可列舉i，2·雙（2,4_ 十八烷二烯醯基）-s η -甘油-3-磷酸、1,2-雙（2，4-十六院 二稀醯基）_s η_甘油-3-磷酸、1-(十八酶基）_2_(2,4 -十 八烷二烯醯基）_s η _甘油-3-磷酸、1-(十六醯基）-2-( 2，4-十八院二稀醯基）-s η-甘油-3-磷酸、1-(十八醯基） (2,4 -十六院二稀醢基）_s η _甘油-3-碟酸、卜（十六醯基） _2_ (2,4-十六烷二烯醯基）-s η-甘油-3-磷酸、卜（2,4-十 八烷二烯醯基）-2-(十八醯基）-s η -甘油_3_磷酸、丨_( 2,4-十六烷二烯醯基）-2-(十六醯基）-s η-甘油-3-隣酸、1，2_ 雙-(8,10,12-十八烷三烯醯基）-s η-甘油-3 -隣酸、丨，2-雙 (12-甲基丙烯醯基氧基癸醯基）-3 11-甘油-3-磷酸、1，2-雙（9-( ρ-乙烯基苄醯基）壬醯基）_s η •甘油磷酸等 磷酸衍生物或其鹽等。 又，聚合性磷脂質可含有非聚合性脂肪酸殘基’作爲非 聚合性脂肪酸殘基可列舉碳數2〜24之直鏈或分支鏈之烷 基、醯基、非聚合性烯基、非聚合性烯醯基等。 (i )其他磷脂質 可列舉含有以磷脂醯蘇胺酸、二鯨蠟醇磷酸酯、溶磷脂 質、磷脂醯膽鹼作爲主成分之磷脂醯乙醇胺·神經鞘髓磷 脂.膽固醇等之複數種脂質之混合物的蛋卵磷脂、大豆卵碟 脂。 -46 - 200916477 (1 ) -2.糖脂質 糖脂質大略分爲甘油糖脂質與神經鞘糖脂質。可列舉以 下（a )至（c )所記載之脂質。 (a )甘油糖脂質 例如，二糖基雙甘油酯、糖基雙甘油酯、二半乳糖基雙 甘油酯、半乳糖基雙甘油酯、磺基氧基核糖基 (sulfooxyribosyl)雙甘油酯、（l，3) -D-甘露糖基（1，3) 雙甘油酯、二半乳糖基甘油酯、二半乳糖基二月桂醯基甘油 酯、二半乳糖基二肉宣蔻醯基甘油酯、二半乳糖基二棕櫚醯 基甘油酯、二半乳糖基二硬酯醯基甘油酯、半乳糖基甘油 酯、半乳糖基二月桂醯基甘油酯、半乳糖基二肉宣蔻醯基甘 油酯、半乳糖基二棕櫚醯基甘油酯、半乳糖基二硬酯醯基甘 油酯、二半乳糖基二醯基甘油等。 (b )神經鞘糖脂質 例如，可列舉神經醯胺（腦苷類（cere bro side))、半乳 糖基神經醯胺、乳糖基神經醯胺、二半乳糖基神經醯胺、神 經節苷酯G Μ 1、神經節苷酯G Μ 2、神經節苷酯g Μ 3、硫脂質 (sulfatide )、神經醯胺寡己糖苷、糖醯胺類。 (c )其他糖脂質 可列舉神經醯胺寡己糖苷、棕櫚醯基葡萄糖苷 (glycoside)、硬脂基糖苷（glu c.oside)、肉宣蔻基糖苷、烷 基葡萄糖苷、胺基苯基葡萄糖苷、膽固醇基麥芽糖苷、膽固 醇基糖苷、3 -膽固醇基-6’-(糖基硫基）己基醚糖脂質、糖 醯胺類等。 -47 - 200916477 (1 ) -3.固醇類 固醇類中最具代表性者可列舉膽固醇。膽固醇已知有gj 於脂質雙層構造之膜剛性及安定性。膽固醇之外，於固醇 類，例如，可列舉膽固醇丁二酸、二氫膽固醇、羊毛甾醇、 二氫羊毛甾醇、脫氫膽甾醇、豆甾醇（stigmasterol)、穀留 醇（sitosterol )、菜油留醇（campesterol )、菜好留醇 (brassicasterol)、酵母留醇（zymosterol)、麥角留醇 (ergosterol)、菜油留醇（campesterol)、岩藻留醇 (fucosterol)、22 -酮基甾醇、20 -羥基固醇、7 -羥基膽固醇、 19-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、7-去氫膽 固醇、5α -膽固醇-7-烯- 3β -醇、表膽固醇、去氫麥角固醇、 硫酸膽固醇、半丁二酸膽固醇 '酞酸膽固醇、磷酸膽固醇、 戊酸膽固醇、膽固醇半丁二酸酯、3βΝ-( Ν'，Ν' -二甲基胺 基乙烷）-胺甲醯基膽固醇、膽固醇乙酸酯' 膽固醇基油酸 酯、膽固醇基亞麻油酸酯、膽固醇基肉豈蔻酸酯 '膽固醇基 棕櫚酸酯、膽固醇基莅生酸酯、糞固醇（coprosian〇l)、膽固 醇酯、膽固醇基磷醯基膽鹼、3,6，9-三氧雜辛烷-1-醇-膽固醇 基-3e -醇等。 (1 ) -4.中性脂質 作爲中性脂質，例如，可列舉雙甘油酯（例如二油精、 二棕櫚油精）及混合辛酸甘油酯-癸酸甘油酯雙甘油酯、三 醯基甘油（三油精、三棕櫚油精、三肉豆蔻油精、三月桂油 精、二癸精、三辛精、三己精等）、鯊烯、生育酚、膽固醇 等。 -48 - 200916477 (1 ) - 5 .飽和或不飽和脂肪酸 作爲飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸，例如，可使用辛酸、 壬酸、癸酸甘油酯酸、十一碳烯酸、月桂酸、十三碳烯酸、 十四碳嫌酸、十五碳嫌酸、十六碳嫌酸、人造奶油酸、硬脂 酸、十九碳烯酸、花生酸、二十二碳烯酸、二十四碳烯酸、 油酸、亞油酸、亞油精酸、二十碳烯酸、芥酸、二十二碳五 烯酸等碳數5〜30之飽和或不飽和脂肪酸。 (1 ) -6.電荷性脂質 可列舉以下（a )至（b )所記載之脂質。 (a )陰離子性脂質 陰離子性脂質係指生理學上p Η中具有負電荷的脂 質。可列舉磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌 醇、心磷脂等之酸性磷脂質，油酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉营 蔻酸、亞油酸、亞麻酸等之脂肪酸，神經節苷酯〇 M i、神經 節苷酯GM2、神經節苷酯GMs等之神經節苷酯類，二（十 /、、基）碟酸寺之酸性脂質，N -醒基-L -魅酿瞭酸酸等之酸性 胺基酸系界面活性劑等。 (b )陽離子性脂質 陽離子性脂質係指生理學上P Η中具有正電荷的脂 質。可列舉Ν，Ν -二硬脂基，Ν -二甲基溴化銨（DDAB)、 十/、基一，甲基溴化錢（CTAB)、Ν-(α -三甲基乙酿截）_二 月桂基-D-麩胺醯氯（TMAG)、DL-1，2-二油醯基_3_二甲 基胺基丙基-β-羥基乙基銨（DORI)、N-〔 1-(2,3 -二油醯基 氧基）丙基〕-N，N-二甲基-N-經基乙基溴化銨（d〇RIE)' 200916477 1^-(1，2-二肉宣蔻基氧基丙烷）-3-基）-^^，^^-二甲基1-羥基乙基溴化銨（〇]^111£)、（1,2-二油醯基氧基丙基）·^， N，N-三甲基銨氯化物（DOTMA )、雙十七醯胺甘胺醯亞精 胺、N , N -二（十八基）醯胺-甘胺醯精胺、N , N -二（十八 基）醯胺甘胺酸、1，2-二油醯基-3-琥珀醯基-s η-甘油膽鹼 酯（DOSC)、1，2 -二油醯基-s η-甘油-3-琥珀醯基-2-羥基乙 基二硫化鳥胺酸（DOGSDSO )、十六基吡啶鑰氯化物 (CPyC)、1，2-二油醯基-s η ·甘油-3-乙基磷酸膽鹼 (DOEPC)、Ν-(1-(2,3·二油醯基氧基）丙基）·Ν-(2-(精胺羧醯胺基）乙基）-Ν，Ν-二甲基銨三氟乙酸酯 (DOSPA)、N-( 1-(2,3 -二油醯基氧基）丙基）-Ν，Ν,Ν-三甲基銨氯化物（DOTAP )、Ν,Ν-二油醯基- Ν，Ν-二甲基 銨氯化物（〇〇0八〇、1，2-二油醯基-5 11-3-磷酸乙醇胺 (DOPE)、1，2-二油醯基-3-(4'-三甲基錢基）丁醯基-s n . 甘油（DOBT)、1，3_二油醯基氧基-2- ( 6-羧精胺基）-丙基醯 胺（DO SPER)、二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇醯胺基精胺 ' (DPPES )等脂多胺、〇 -烷基磷脂醯膽鹼、〇 -烷基磷脂醯 乙醇胺、離胺酸·精胺酸或鳥胺酸之醯胺及磷脂醯乙醇胺、 3β-(Ν-(Ν，，Ν' -二甲基胺基乙烷）胺甲醯基）膽固醇 (DC-Chol)、3-β-〔 Ν-( Ν'Ν'Ν、三甲基胺基乙烷）胺 甲醯基〕膽固醇（T C - C h ο 1 )、雙-胍基-亞精胺-膽固醇 (BGSC)、雙-胍基- tren-膽固醇（BGTC)、（4，-三甲基氨） 丁酸膽固醇基（ChOTB )、3β-Ν -(聚乙烯亞胺）-胺甲醯基 膽固醇、碘化膽固醇基-3β-羧基-醯胺-伸乙基三甲基銨、；!_ -50 - 200916477 二甲基胺基-3-三甲基銨基-D L -2 -丙基-膽固醇基羧酸碘化 物、膽固醇基_3β -羧醯胺乙二胺、碘化膽固醇基_3β -氧丁二 醯胺-伸乙基三甲基銨、1-二甲基胺基-3-三甲基銨基-D L -2-丙基-膽固醇基-3β -氧丁二酸碘化物、2- (2 -三甲基銨基）-乙基甲胺基乙基-膽固醇基-3β -氧丁二酸碘化物、膽固醇基半 丁二酸酯、長鏈胺、長鏈吡啶鑰化合物、第四銨化合物等。 (1 ) -7.界面活性劑 界面活性劑可大略分爲親水性部分爲離子性之（a)陽離 子性界面活性劑、（b)陰離子性界面活性劑、（c)兩性界面活 性劑’及親水性部分爲非離子性之（d)非離子性界面活性劑。 (a )陽離子性界面活性劑 作爲陽離子性界面活性劑，可列舉烷基胺鹽、醯基胺 塩、第四級銨鹽、胺衍生物等。具體而言，氯化苄烷銨、醯 胺基乙基二乙基胺鹽、N -烷基聚烷基聚胺鹽、脂肪酸聚伸 乙基聚醯胺、十六基三甲基溴化銨、十二基三甲基溴化銨、 烷基聚氧伸乙基胺、N -烷基胺基丙基胺、脂肪酸三乙醇胺 酯等。 (b )陰離子性界面活性劑 作爲陰離子性界面活性劑，可爲醯基肌胺酸、烷基硫酸 鈉 '烷基苯磺酸鈉、烷基硫酸酯鈉、烷基醚硫酸酯鈉、α烯 烴磺酸鈉、（X磺酸基脂肪酸酯鈉、碳數7〜2 2之脂肪酸鈉及 脂肪酸鉀等。具體而言，可列舉十二基硫酸鈉、月桂基硫酸 納、膽酸納、去氧膽酸納、牛擴去氧膽酸鈉等。 (C )兩性界面活性劑 -51- 200916477 作爲兩性界面活性劑，可列舉烷基胺基脂肪酸鈉、烷基 甜菜鹼、烷基胺氧化物等。具體而言，可列舉3-〔（3 -膽醯 胺丙基）二甲基銨基〕-1-丙磺酸、N-十四基- N，N-二甲基 -3 -銨基-1-丙磺酸等。 (d )非離子性界面活性劑 作爲非離子性界面活性劑，可列舉聚環氧乙烷烷基醚、 聚環氧乙烷烷基苯基醚、聚環氧乙烷山梨糖醇酐脂肪酸酯、 山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油磷脂肪酸酯、脂 肪酸烷醇醯胺、嵌段聚合物型非離子界面活性劑、烷基胺型 非離子界面活性劑、烷基醯胺型非離子界面活性劑等。具體 而言，單油酸聚環氧乙烷山梨糖醇酐、聚山梨酸酯80、聚氧 乙烯聚氧丙二醇、Pluronic F68、、山梨糖醇酐單月桂酸酯、 山梨糖醇酐單油酸酯、聚環氧乙烷硬化蓖麻油60、聚環氧乙 院月桂基醇等。 (1 ) - 8 .前述脂質任一者與親水性聚合物結合的「親水 性聚合物之脂質衍生物」（「詳細記載於6 .( 1 )脂質與親水 性聚合物之結合樣式」）亦可作爲本發明之免疫微脂粒之構 成成分使用。 通常適宜地混合以上所示兩親性小胞形成脂質而調製 微脂粒。作爲代表性脂質組成，可列舉以磷脂質或糖脂質作 爲主成分，以相對於總脂質莫耳數爲2 0至5 0 m ο 1 %之比率進 一步含有固醇類的脂質組成。較佳地，以磷脂醯膽鹼類作爲 主成分，更將膽固醇以相對總脂質莫耳數爲20至5 Omol%之 比率含有之脂質組成。 -52 - 200916477 (2 )親水性聚合物 微脂粒具有一旦投與至血液循環，易被肝臓、脾臓、肺 等網狀內皮系統（RES: reticulo-endothelialsystem)捕捉 的性質。此若標的臟器爲肝臟或肺等則成爲有利性質，但若 以全身作用爲目的時，標的部位爲RES以外之場合成爲大缺 點。親水性聚合物之存在提供血中滯留性之提升和回避經由 RES之吸入微脂粒之性質。又，親水性聚合物之存在，亦提 供微脂粒保存時之分散安定性。 本發明之免疫微脂粒所用之親水性聚合物之種類可列 舉爲聚乙烯吡咯酮（PVP )、聚環氧烷、聚伸烷二醇（例如， 聚乙二醇（PEG )、聚丙二醇、聚丁二醇、聚己二醇等）、聚 丙烯酸、聚丙烯酸、聚丙烯醯胺、聚乙烯亞胺、聚縮水甘油、 神經節苷脂、葡聚糖、藻醇、聚乙烯醇、聚乙烯甲基醚、聚 甲基噚唑啉、聚乙基噚唑啉、聚羥基丙基噚唑啉、聚羥基丙 基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚 羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥基甲基纖 維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、聚天冬醯胺、聚 胺基磷腈（phosphazene)、聚（羥基烷基羧酸）、乙二醇-丙二醇 共聚物、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、二乙烯醚-馬來酸酐交互 共聚物、環糊精、玻尿酸、硫酸腦苷類、軟骨素硫酸、多糖 類（例如，直鏈澱粉、支鏈澱粉、果膠、甲殼質、甘露聚糖、 三聚葡糖、角叉聚糖、甲基纖維素等）、多胜肽、合成聚胺 基酸（例如，聚-L -離胺酸等）等。 上述之親水性聚合物’由1個以上重複單位構造而成’ -53 - 200916477 其單位構造數並未限制，可爲直鏈型亦可爲分支型。較佳 地，可列舉分子量爲500至20000之親水性聚合物，再更佳 地，可列舉分子量爲2000至5000之親水性聚合物。又，此 等聚合物可使用均聚合物及嵌段或無規聚合物。例如，亦包 含聚乳酸、聚乙醇酸而成之聚乳酸/聚乙醇酸共聚合物等。 上述之親水性聚合物可爲導入烷基、烷氧基、羥基、羰 基、院氧基鑛基、氰基、胺基、硫醇基、順丁嫌二醒亞胺基、 乙烯基磺酸基、醯肼基等取代基的衍生物。 爲血中滯留性之提升和回避經由RE S之微脂粒吸入之 目的，微脂粒中親水性聚合物或親水性聚合物之脂質衍生物 之含量較佳爲相對總脂質莫耳數可爲〇 · 1至1 0莫耳％之比 例。相對於總脂質莫耳數爲1至6莫耳％之比例爲更佳。 (3 )蛋白質 可將上述「2.結合DR5之抗體」、「3.結合Fas之抗體」、 及「4_結合其他抗原之抗體」所述抗體作爲本發明之免疫 微脂粒之構成成分。又，至於將對具有本發明所記載之細胞 凋零誘導能力的受體之天然配位體結合的微脂粒亦爲本發 明之範圍。再者，亦可將專一性結合含有死亡功能域之受體 的人工胜肽作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分。作爲如此 人工胜肽之例，可列舉結合Fas之機能性胜肽（Yoshimori et al，Apoptosis 10 ( 2) , 323-329 ( 2005))。又，自上述分子 群選擇結合同一抗原之2種類以卜.分子’於同一免疫微脂粒 上共存 > 則可提升對特疋抗原之結合能力。更由上述分子群 選擇結合相異抗；原之2種以上分子’於同一微脂粒上共存’ -54 - 200916477 則亦可對複數抗原作用。 (4 )內水相 若微脂粒內部存有水相時，水相所用水溶液只要不阻礙 微脂粒之形成則無特別限制。通常可使用氯化鈉水溶液、緩 衝液（磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、HEPES緩衝液等）、單糖類 或二糖類之水溶液（葡萄糖水溶液、繭蜜糖水溶液等）。 (5 )添加劑 免疫微脂粒之構成成分中亦可更添加機能性賦予劑。此 等機能性賦予劑可列舉例如，膜安定化劑、膜表面之親水性 調整劑、曲率調整劑、抗氧化劑、電荷賦予劑、凍結保護劑 等。例如，糖、糖脂質、丙烯酸、聚乙二醇等之安定劑、生 育酚或抗壞血酸等之抗氧化劑。膽固醇類亦可作爲膜安定化 劑、膜表面之親水性調整劑或微脂粒之曲率調整劑等，生育 酚類可作爲抗氧化劑使用。 又，於免疫微脂粒加上述添加劑時，其種類和含量無特 別限制，可考慮免疫微脂粒之物性而適宜選擇。 i ( 6 )內封藥物 又本發明之免疫微脂粒可於內水相將親水性藥物、及於 膜中將疏水性藥物封入。封入之藥物只要不阻礙微脂粒之形 成則無特別限制，可爲抗腫瘤劑、抗風濕劑、抗病毒劑、抗 菌劑等之具有細胞傷害活性之藥物。作爲抗腫瘤劑可列舉例 如下列歐黴素（Bleomycin)、卡鉑（Carboplatin)、苯丁酸氮 芥（Chlorambucil)、順鉑（cisplatin)、秋水仙素（colchicine)、 寰磷醯胺（cyclophosphamide)、陶諾黴素（Daunorubicin)、 -55 - 200916477 達可及諾黴素（Dactinomycin)、己稀雌酣 (Diethylstilbestrol)、多柔比星（Doxorubicin)、依托撲沙 (Etoposide)、5 -氟尿喃H定、氟尿苷（Floxuridine)、美法斋 (Melphalan)' 吉西他濱（gemcitabine)、伊馬替尼 (Imatinib)、伊立替康（irinotecan)、氨甲喋口令 (Methotrexate)、埋多黴素（mitomycin)、6 -氫硫基嘌 Π令、紫 杉醇（paclitaxel)、索拉非尼（Sorafenib)、舒尼替尼 (SUTENT)、替尼泊苷（Teniposide)、6 -硫基鳥嘌U令、長春 新驗（Vincristine)、長春花驗（Vinblastine)。抗癌症化合 物及治療劑之例更見於The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第 15 編、Berkow 等人編，1987、Rahway，N. J.及 Sladek 等人，Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987，Powis 等人編、Taylor 及 Francis，New York, N. Y.。 自體免疫疾病治療劑或抗炎症劑可列舉例如雙氯芬酸 (Dielofenac)、洛索洛芬納（loxoprofensodium)、塞來昔布 (celecoxib)、依托度酸（Etodolac)、美洛昔康（meloxicam)、 羅非昔布（Rofecoxib)'比羅昔康（Piroxicam)、卩引哄美辛 (indomethacin)、異丁 苯丙酸（Ibuprofen)、奈普生 (n a p r ο X e η )等非類固醇性抗炎症劑，或例如胺甲喋哈 (Methotrexate)、氯喹（Chloroquine)、氮化氯嗤、環孢素 (cyclosporin)、青黴胺（penicillamine)、柳氮磺啦11疋 (Sulfasalazine)、吖硫基嘌呤、來氟米特（Leflunomide) 等疾病修飾性抗風濕藥。 -56 - 200916477 如上所述，可將各種藥劑封入免疫微脂粒之內水相使其 作用。另一方面，上述藥劑亦可以未封入免疫微脂粒的狀態 與免疫微脂粒倂用而作用於標的細胞。 6.免疫微脂粒成分之結合樣式 本發明之免疫微脂粒由兩親性小胞形成脂質、親水性聚 合物、蛋白質、胜肽、糖等構成而前述脂質、蛋白質、胜肽 及親水性聚合物形成共價結合或非共價結合。本發明之免疫 微脂粒之形態亦可於微脂粒表面直接結合蛋白質、胜肽等機 能性分子、或經由親水性聚合物而結合於微脂粒。前者之場 合，親水性聚合物也可於微脂粒直接結合而含有。 (1 )脂質與親水性聚合物之結合樣式 親水性聚合物之脂質衍生物爲由上述5 ·( 1 )記載之兩 親性小胞形成脂質與上述5 .( 2 )記載之親水性聚合物而成， 其組合無特別限制，可依目的而適宜選擇。脂質與親水性聚 合物由具有脂質之官能基（於脂質含有人爲導入之官能基） 與具有親水性聚合物之官能基（於親水性聚合物含有人爲導 入之官能基）直接或藉由連結物形成共價結合。 作爲親水性聚合物之脂質衍生物可列舉以下者，但未限 於此等。作爲親水性聚合物之脂質衍生物，例如，可列舉聚 乙二醇修飾脂質、聚乙烯亞胺衍生物、聚乙烯基醇衍生物、 聚丙烯酸衍生物、聚丙烯醯胺衍生物、葡聚糖衍生物、聚甘 油衍生物、甲殻質衍生物、聚乙烯吡咯酮衍生物、聚天冬醯 胺酸醯胺衍生物、聚-L -離胺酸衍生物、甘露聚糖衍生物、 三聚葡糖衍生物等。 -57 - 200916477

作爲「聚乙二醇（PEG)修飾脂質」，可爲文獻 ((D.D.Lasic，’’Liposomes : from basic to applications”， Elsevier Science Publishers, pp. 1 - 1 7 1 ( 1993 ))之” Chapter 11. Liposomes as a drug delivery system”）所記載之聚乙二 醇（PEG )修飾磷脂醯乙醇胺類，更具體而言，可列舉N -單甲氧基聚乙二醇琥珀醯基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基 聚乙二醇羰基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇伸乙 基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇羰基乙基羰基磷 脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇羰基丙基羰基磷脂醯 乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇（2-氯-1,3,5-三畊-4,6-二基） 琥珀醯基磷脂醯乙醇胺類、二-C 12-24醯基-甘油-磷脂醯乙醇 胺- N- P E G、二-C12.24醯基-甘油-單P E G醚、單C丨2-24 醯基甘油-二P E G醚、聚乙二醇烷基醚、N-(2,3-二肉宣 蔻基氧基丙基）醯胺聚乙二醇甲基醚、Ν·(2,3 -二肉宣蔻基 氧基丙基）醯胺聚乙二醇甲基醚、Ν-(2,3 -二肉登蔻基氧基 丙基）丁二醯胺聚乙二醇甲基醚、神經鞘胺醇-1 -(琥珀醯 基甲氧基聚乙二醇類、神經鞘胺醇-1 -(琥珀醯基（甲氧基 聚乙二醇））類、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇 脂肪酸酯（例如，單硬脂酸聚乙二醇、單油酸聚乙二醇、二 月桂酸聚乙二醇、二硬脂酸聚乙二醇、二油酸聚乙二醇、硬 脂酸二乙二醇等）、聚乙二醇蓖麻油、吡咯啶酮羧酸異硬脂 酸PEG-40加氫蓖麻油、單甲氧基聚乙二醇-3, 5-雙十五烷氧 苄基胺甲酸酯4_( Ν'-(甲氧基聚乙二醇羰基）2-胺基乙基） Ν，Ν-二硬酯醯基苄醯胺、DSPE-PEG(NOF CORPORATION -58 - 200916477 製品、SUNBRIGHT DSPE-020C、DSPE-050C、DSPE-020G、 DSPE-05 0G、DSPE-020CN、DSPE-05 0CN)、DSPE-Multi-arm PEG ( NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT DSPE-PTE020 )、DSPE-Comb-shaped PEG ( NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT DSPE-AM0530K)、 Diacylglycerol-PEG( NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT GS-020,GS-050 )、Cholesterol-PEG ( NOF CORPORATION 製 品、SUNBRIGHT CS-0 1 0，CS-020，CS-050 )、PEG-Ceramide (Avanti POLAR LIPID，INC.製品）、mPEG-DTB-DSPE (DTB ;二硫苄基，國際公開小冊、W 0 2005/05 1 3 5 1 )、P E G - D A A ( DAA ;二烷基氧基丙基、國際公開小冊 W02005/0263 72 )等 ° 作爲其他親水性聚合物之脂質衍生物之具體例，可列舉 聚環氧乙烷蓖麻油·硬化蓖麻油（例如，聚環氧乙烷P〇E( 3 ) 蓖麻油、POE ( 5 )硬化蓖麻油等）、N -〔 ω-甲氧基聚（氧伸 乙基）-α-氧基羰基〕-磷脂醯乙醇胺類、◦ - ( C 烷醯基 或烯醯基）三聚葡糖、N-( (：1()-18烷醯基或烯醯基）聚丙 烯醯胺、DSPE-聚甘油（NOF CORPORATION製品、 SUNBRIGHT DSPE-PG8G)等。 作爲使親水性聚合物結合於脂質之方法，可列舉（a ) 於預先形成之微脂粒分散液結合親水性聚合物之方法、（b ) 調製親水性聚合物之脂質衍生物而倂入微脂粒之方法。 (a )於預先形成之微脂粒結合親水性聚合物之方法， 例如使用三氟代乙烷磺醯基氯（Tresyl chloride )活性化 -59 - 200916477 PEG，接著於含有具有胺基之脂質（磷脂醯乙醇胺等）的微 脂粒於高pH條件下添加，獲得經親水性聚合物修飾之微脂 粒(Senior et al, Biochim. Biophys. Acta.1-62 ： 77-82 (1 99 1 ))。又，亦可利用其他多種結合爲本項業者眾所皆 知。 (b )調製親水性聚合物之脂質衍生物而加入微脂粒之 方法，經由將親水性聚合物作爲結合脂質之衍生物使用，則 可將其疏水性部位插入微脂粒之脂質層。將這些親水性聚合 物衍生物加入預先形成之微脂粒分散液來加溫，或將親水性 聚合物衍生物於微脂粒構成脂質成分之混合時添加，獲得以 親水性聚合物修飾之微脂粒。由親水性聚合物來製造衍生物 化之脂質可例如美國專利第5,3 9 5，619號記載，依公知之方 法製造。例如於磷脂質之反應活性官能基與PEG共價結合， 可用氰尿醯氯之方法（Blume et a. 1,Biochim, Biophys.

Acta .1029: 9 卜 97( 1990)及美國專利第 5,213,804 號）、使 用幾化二亞胺之方法（P r 〇 c , I n t e r n . S y m p · C ο n t r ο 1. R e 1. Bioact. Mater., 17：77-7 8( 1 990 )；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 11460-11464 ( 1 9 9 1 ) ； Biochim. Biophys .Acta., 1 066 : 2 9-3 6 ( 1 99 1 ) ； Biochim. Biophys. Acta., 1105 : 1 93 -200 (1992); Period. Biol·, 93: 349-352 ( 1991))、使用酸酐之 方法、使用戊二醛之方法等公知之方法。 (2 )脂質與蛋白質之結合樣式 於微脂粒將蛋白質或胜肽等固定化之方法，可列舉下述 (i )至（X )所示方法。構成微脂粒之脂質與蛋白質之結 -60- 200916477 合，經由脂質具有之官能基（包括於脂質人爲導入之官能基） 與蛋白質具有之官能基（包括於蛋白質人爲導入之官能基） 之共價結合、或基於物理性·生物學親和性的非共價結合而 形成。形成共價結合之官能基之組合，例如，可列舉胺基/ 羧基、胺基/N-羥琥珀醯亞胺基酯、胺基/醛基、胺基/甲苯磺 醯基、胺基/硝苯羰基、胺基/縮醛基、胺基/異硫氰酸酯基、 胺基/鹵化醯基、胺基/苯并三唑羧酸酯基、醯肼基/醛基、硫 醇基/順丁烯二醯亞胺基、硫醇基/乙烯磺醯基等、硫醇基/ 硫醇基等。非共價結合可利用疏水結合或抗生物素蛋白 (avidin ) /生物素、聚組胺酸標記/鎳等專一結合。 (i )經由於蛋白質導入疏水性基，對疏水環境下之微 脂粒之脂質層予以親和性，將此倂入以其他方式調製的微脂 粒之方法（Biochimica et Biophysica Acta, 812，116 (1 9 8 5 ) ) 〇 (i i )將抗體或內因性配位體作爲與細胞之膜蛋白質 之融合蛋白質使其表現，將此膜蛋白部分併入以其他方式調 製的微脂粒之方法（Mol Med. 7 ( 10) 723，（ 2001))。 (i i i )若微脂粒構成脂質成分爲糖脂質時，將其糖 以氧化劑氧化而生成醛基，將此與蛋白質之胺基反應而形成 許夫鹼來使脂質與蛋白質結合之方法（Biochimica et Biophysica Acta. 640， 66 ( 1981))。 (i v )微脂粒調製時將具有能與胺基反應之官能基之 脂質混合，於此將蛋白質之Lys殘基之ε-胺基或N末端之α-胺基反應而倂入微脂粒之方法（J . I m m u η ο 1 M e t h 〇 d s · 1 9 8 3 , 200916477 65(3)： 295-306)。 使蛋白質之胺基與脂質共價結合時’脂質所必要之反應 性官能基可列舉例如N_羥琥珀醯亞胺基酯（NHS酯）、醛基、 甲苯磺醯基、硝基苯羰基、縮醛基、羧基、異硫氰酸酯基、 鹵化醯基、苯并三唑羧酸酯基等。 (v )微脂粒調製時將具有能與硫醇基反應之官能基之 脂質混合，使此與具有硫醇基之蛋白質反應之方法（Journal of Immunological Method, 75,3 5 1 ( 1 9 8 4 ) ； Biochemical and Biophysical Research Communications, 117，3 99 ( 1 98 3 ))。 賦予蛋白質之硫醇基已知使用N -琥珀醯亞胺基-3- ( 2-吡啶二硫基）丙酸酯（3?0?)(〇31*183011，>1义1&13丨0(^6111_：[· 173, 723, ( 1978))或N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫乙酸酯 (SATA)、N -琥珀醯亞胺基-S -乙醯基硫丙酸酯（SATP)、 亞胺基噻陳（Traut，R. R, et al Biochemistry 12，3266 (1 973 ))、锍基烷基亞胺酸酯等之化合物進行的方法爲公 知。上述方法之外，可還原蛋白質之內茌性二硫醇基成爲硫 醇基而作爲鍵使用。尤其，蛋白質爲抗體之場合，抗體（全 長或片段）之鉸鏈區域及重鏈與輕鏈之連結部位之二硫醇基 之利用爲可能，由蛋白質之活性維持之觀點，抗體與脂質之 結合中使用內在性硫醇基的後者之方法爲較佳。例如，IgG 抗體以胃蛋白酶等酵素F(ab’）2化，進而以二硫蘇糖醇等 還原所得的Fab’所生成的硫醇基提供於鍵結爲可能（Martin, F. J. et al Biochemistry 20, 4229 ( 1981))。IgM 之場合’依 據 Miller 等人之方法（J .Biol· Chem 257，286 ( 1965))，以 200916477 穩定條件可還原J鏈所得之IgMs之Fc部分之硫醇基供鍵結。 作爲蛋白質之硫醇基與脂質共價結合時必要脂質之官 能基’可列舉順丁烯二醯亞胺基、乙烯基磺酸基、硫醇基等。 例如’作爲含有順丁烯二醯亞胺基之脂質，可列舉N - ( 3 · (2-吡啶二硫基）丙醯基）磷脂醯乙醇胺、N-(m -順丁烯 二醯亞胺苄醯基）二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺、N-( 4-p -順 丁烯二醯亞胺苯基）丁醯基磷脂醯乙醇胺（MPB-PE )等。 作爲順丁烯二醯亞胺基化試藥，可爲Ν-(ε-順丁烯二醯亞胺 基己醯氧基）琥珀醯亞胺之外，爲製作胺基之順丁烯二醢亞 胺基衍生物一般使用之Ν-琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞 胺苯基）丁酸酯（SMPB)、Ν-琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞 胺苯基）丙酸酯、Ν-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基）琥珀醯亞 胺等。 又，亦可以上述順丁烯二醯亞胺基化試藥將蛋白質之胺 基取代爲順丁烯二醯亞胺基。此等與具有硫醇基之例如將吡 啶二硫基丙酸酯（PDP)等修飾之脂質反應而形成共價結合。 (V i )微脂粒調製時混合具有能與醛基反應之官能 基之脂質、結合糖鏈由來之醛基之方法。 通常於真核生物中，蛋白質經轉譯後修飾而接受糖鏈修 飾。尤其於抗體之場合，其Fc區域存有糖鏈。氧化此等糖 鏈所牛成之醛基與醯胼’因反應而形成共價結合，於脂質修 飾醯肼，可藉由糖鏈固定蛋白質及胜狀於脂質（B i 〇 c h i m i c a et Biophysica Acta 1420 153-167 ( 1999)) ° (v i i )微脂粒、蛋白質各別具有之官能基彼此使用 -63 - 200916477 交聯劑或縮合劑等來結合之方法。 將脂質所具有之胺基與蛋白質之胺基結合，則可於微脂 粒表面將蛋白質固定化（Biochemical and Biophysical Research Communications, 89，1 1 14 ( 1 9 7 9 ) ； Liposome Technology, 1 5 5 ( 1 98 3 ))。具有胺基之脂質爲，例如，可列 舉磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸或磷脂醯蘇胺酸等。蛋白質 之胺基由離胺酸殘基之ε-胺基及N末端之a-胺基提供。欲於 由具有胺基之脂質構成之微脂粒將蛋白質固定化，可採用以 戊二醛將脂質之胺基與蛋白質之胺基直接交聯之方法、用反 應活性試藥將脂質之胺基與蛋白質之胺基予以化學鍵結之 方法等公知之方法。作爲二價交聯劑，除戊二醛之外，可列 舉二琥珀醯亞胺基辛二酸酯（DSS)、酞醛、對酞醛等二醛、 甲基庚二醯亞胺酸酯（DMP)、二異硫氰基二苯乙烯二磺酸鈉 (DIDS)等。反應活性試藥可爲Ν-羥基琥珀醯亞胺基 3-(2-吡啶硫基）丙酸酯、間順丁烯二醯亞胺苄基-N-羥琥珀醯亞胺 基酯、二硫雙（琥珀醯亞胺基丙酸酯）、雙（磺酸基琥珀醯亞胺 基）辛二酸酯、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯等。 將脂質具有之胺基與蛋白質具有之硫醇基、或脂質具有 之硫醇基與蛋白質具有之胺基鍵結，可於微脂粒表面固定化 蛋白質。作爲於胺基與硫醇基具有反應性之二價交聯劑，可 列舉N -琥珀醯亞胺基3 - ( 2 -吡啶二硫基）丙酸酯（S P D P )、 N -琥珀醯亞胺基4- ( p -順丁烯二醯亞胺基苯基）丁酸酯 (SMPB )、N -琥珀醯亞胺基4-( p -順丁烯二醯亞胺基苯基） 乙酸酯（SMPA )、N -琥珀醯亞胺基溴乙酸酯、N -琥珀醯亞 -64- 200916477 胺基4-( p-順丁烯二醯亞胺基苯基）丙酸酯（SMPP)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀醯亞胺（gmbs )、 N - ( ε -順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺（EMCS) 等。 脂質之羧基與蛋白質之胺基、或脂質具有之胺基與蛋白 質具有之羧基’使用縮合劑鍵結，則可於微脂粒表面將蛋白 質固定化（Biochemistry，Vol.31，2850-2855 ( 1992))。 使脂質之硫醇基與蛋白質之硫醇基鍵結合，可於微脂粒 表面固定化蛋白質。例如，使用雙順丁烯二醯亞胺基己烷等 之交聯劑。 (ν i i i )利用生物素（biotin)與抗生蛋白鏈黴素 (streptavidin)或抗生物素蛋白（avidin)之專一親和性， 使蛋白與脂質結合之方法。 可將生物素修飾蛋白質與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素 蛋白修飾脂質經非共價鍵結（A n t i s e n s e a n d N u c 1 e i c A c i d Drug Development 12: 3 1 1 -3 2 5 ( 2002))。又，抗生蛋白鏈 黴素及抗生物素蛋白形成4量體，利用可爲最大4分子之生 物素之結合’可將生物素修飾蛋白質經由抗生物素蛋白或抗 生蛋白鏈黴素連結物非共價結合於生物素修飾脂質 (Biochimica et Biophysica Acta 1 23 9 1 3 3 - 1 44 ( 1995 ))。 (i x )利用組胺酸標記與鎳離子之親和性，使蛋白與 脂質結合之方法。 利用聚組胺酸標記（His-Tag )與鎳離子（Ni2+ )之親和 性於微脂粒固定化蛋白質及胜肽爲可能（Molecular -65 - 200916477

Pharmaceutics 3, 5, 525-530 )。經由基因工程技術，融合

His·Tag的嵌合蛋白質或胜肽可經由公知方法表現、純化。 又’將具有金屬（Ni2+ )螯合部位的NTA (氮川三乙酸 (nitrilo acetic acid))、IDA (亞胺二乙酸（imin〇diacetic acid))等於脂質末端上修飾，可調製使Ni2+固定化的微脂 粒。該微脂粒之Ni2 +專一性結合His-Tag，使His-Tag融合 蛋白質或胜肽被固定化於微脂粒上。 (X )於抗體之Fc功能域藉由具有親和性之蛋白質或 其蛋白質功能域使抗體之全長分子結合的方法。 通過ϊΐ抗體之Fc功能域具親和性之Protein A或Protein G蛋白質，或參與與Fc功能域結合的Protein A、Protein G 之功能域蛋白質，可負載抗體之全長分子。此時Protein A、 ProteinG蛋白質可以上述（i )至（i χ)之任—方法結 合於微脂粒脂質（BMC Immunology 2006,7 : 24)。 上述（i )至（X)中，調節參與蛋白質固定化的脂質 之比例，可使於微脂粒固定化的蛋白質之量任意變化。 (3 )親水性聚合物與蛋白質之結合樣式 作爲於親水性聚合物將蛋白質或胜肽等固定化之方 法，可列舉下述⑴至（vii)所示之方法。作爲親水性聚合物與 蛋白質、或依上述方法所得親水性聚合物之脂質衍生物與蛋 白質結合的方法，可列舉將親水性聚合物具有之官能基（包 括於親水性聚合物人爲導入之官能基）與蛋白質具有之官能 基（包括於蛋白質人爲導入之官能基）反應’而形成共價結合 或非共價結合之方法。形成共價結合之官能基之組合可爲例 -66 - 200916477 如胺基/羧基、胺基/N-羥琥珀醯亞胺基酯、胺基/醛基、胺基 /甲苯磺醯基 '胺基/硝苯羰基、胺基/縮醛基、胺基/異硫氰 酸酯基、胺基/鹵化醯基、胺基/苯并三唑羧酸酯基、醯肼基/ 醛基、硫醇基/順丁烯二醯亞胺基、硫醇基/乙烯磺醯基等、 硫醇基/硫醇基等。非共價結合可利用抗生物素蛋白/生物 素、聚組胺酸標記/鎳等專一性結合。蛋白質可於親水性聚 合物之主鏈·側鏈之任意末端及非末端部位結合，亦可對親 水性聚合物1分子有複數個結合。 (i )於具有與胺基之反應性官能基的親水性聚合物， 使蛋白質及胜肽之LyS殘基之ε-胺基或N末端之（I-胺基反應 的方法（Int J Oncol. 2003 23 ( 4): 1159-65.)。 蛋白質之胺基由Lys殘基之ε-胺基或N末端之ct-胺基 提供。使蛋白質之胺基與脂質結合時，親水性聚合物衍生物 所必要之反應性官能基可列舉例如Ν-羥琥珀醯亞胺基酯 (NHS酯）、醛基、甲苯磺醯基、硝基苯羰基、縮醛基、羧基、 異硫氰酸酯基、鹵化醯基、苯并三唑羧酸酯基等。 (i i )於具有與硫醇基之反應性官能基的親水性聚合 物，使具有硫醇基之蛋白質及胜肽之硫醇基結合的方法 (Dmitri Kirpotin et al, Biochemistry, 1 9 9 7，3 6，6 6 - 7 5 )。 對蛋白質賦予硫醇基，使用Ν -琥珀醯亞胺基-3- ( 2-吡 d定二硫基）丙酸酯（SPDP) ( Carlsson，J. et al. Biochem.J. 173,723( 1978))或N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫乙酸酯 (SATA)、N -琥珀醯亞胺基-S -乙醯基硫丙酸酯（SATP )、 亞胺基暖陳（Traut，R. R. et al_ Biochemistry 12，3266 200916477 (1 973 ))、巯基烷基亞胺酸酯等化合物進行的方法爲公知之 方法。上述方法之外，可將蛋白質之內在性二硫醇基以 TCEP、DTT、锍基乙醇、半胱胺酸、半胱胺（Cysteamine ) 等還原作爲硫醇基結合使用。尤其，蛋白質爲抗體之場合， 抗體（全長或片段）之絞鏈區域及重鏈與輕鏈之連結部位之 二硫醇基之利用爲可能，抗體與親水性聚合物之結合中使用 內在性硫醇基的後者之方法由活性維持之觀點爲較佳。例 如，IgG抗體以胃蛋白酶等酵素F(ab’）2化，更可以二硫 蘇糖醇等還原獲得的Fab’上提供結合所生成的硫醇基 (Martiη，F. J· et al · Biochemistry 20，4229 ( 1 9 8 1 ) ) ° IgM 之場合，依據Miller等人之方法（J. Biol. Chem 257，286 (1 965 ))，可提供於穩定條件下還原J鏈獲得的IgMs之Fc 部分提供硫醇基結合。 與蛋白質之硫醇基結合所必要的宫能基可列舉順丁烯 二醯亞胺基、乙烯基磺酸基、硫醇基等。此等親水性聚合物 衍生物可列舉例如，PEG-順丁烯二醯亞胺〔NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT MA SERIES (順 丁烯二 醯亞胺- PEGs)〕、PEG-乙嫌颯（Bo B.Lundberg et al，Int. J. Pharm，205，101-108 (2000))、甲氧基（醯肼）聚乙二醇、 雙（醯肼）聚乙二醇等。作爲順丁烯二醯亞胺基化試藥，除 N - ( ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺之外，可 列舉一般用於製作胺基之順丁烯二醯亞胺基衍生物使用的 Ν -琥珀醯亞胺基4- ( ρ -順丁烯二醯亞胺基苯基）丁酸酯 (SMPB )，Ν ·琥珀醯亞胺基4-( ρ -順丁烯二醯亞胺基苯基） -68 - 200916477 丙酸酯、Ν - (γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀醯亞 胺等。 又’亦可於上述順丁烯二醯亞胺基化試藥將蛋白質之胺 基取代爲順丁烯二醯亞胺基。此等具有硫醇基，與例如將吡 啶二硫基丙酸酯（PDP)等修飾之親水性聚合物反應而形成共 價結合。 (i 1 i )於具有與醛基之反應性官能基的親水性聚合 物結合來自蛋白質糖鏈醛基之方法。 通常真核生物中，蛋白質由轉譯後修飾而接受糖鏈修 飾。尤其抗體時，於其Fc區域存有糖鏈。將此等糖鏈氧化 而生成之醛基和醯肼，因反應形成共價結合，故於親水性聚 合物修飾醯肼，則可通過糖鏈而將蛋白質及胜肽固定化於親 水性聚合物（Biochimica et Biophysica Acta 1420 153-167 (1999))° (i ν )將親水性聚合物、蛋白質各具有之官能基彼此 用交聯劑或縮合劑等來結合之方法。 將親水性聚合物具有之胺基與蛋白質之胺基結合，可於 親水性聚合物使蛋白質固定化。具有胺基之親水性聚合物之 衍生物可列舉例如PEG_NH2〔 NOF CORPORATION製品、 SUNBRIGHT PA SERIES( Amino-PEGs)〕等。蛋白質之胺基 爲由離胺酸殘基之ε -胺基及N末端之α -胺基而提供。欲於 具有胺基之親水性聚合物將蛋白質固定化，可採用以戊一醛 使親水性聚合物之胺基與蛋白質之胺基直接交聯之方法、使 用反應活性試藥使親水性聚合物之胺基與蛋白質之胺基予 -69 - 200916477 以化學結合之方法等公知之方法。作爲二價交聯劑，除戊二 醛之外，可列舉二琥珀醯亞胺基辛二酸酯（DSS)、酞醛、對 酞醒等二酸、庚一亞氨酸一甲酯（Dimethyl pimelimidate (DMP))、二異硫氰基二苯乙烯二磺酸鈉（DIDS)等。作爲 反應活性試藥，可列舉N -羥基琥珀醯亞胺基3- ( 2-吡啶硫 基）丙酸酯、m -順丁烯二醯亞胺基苄基-N -羥基琥珀醯亞胺 酯、二硫雙（琥珀醯亞胺基丙酸酯）、雙（磺酸基琥珀醯亞 胺基）辛二酸酯、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯等。 使親水性聚合物具有之胺基及蛋白質具有之硫醇基、或 親水性聚合物具有之硫醇基及蛋白質具有之胺基結合，於親 水性聚合物固定化蛋白質爲可能。對胺基與硫醇基具反應性 的二價交聯劑，可列舉N -琥珀醯亞胺基3- ( 2-吡啶二硫基） 丙酸酯（SPDP )、N -琥珀醯亞胺基4- ( p -順丁烯二醯亞胺 基苯基）丁酸酯（S Μ P B )、N -琥珀醯亞胺基4 - ( P -順丁烯 二醯亞胺基苯基）乙酸酯（SMPA)、Ν -琥珀醯亞胺基溴乙 酸酯、Ν -琥珀醯亞胺基4 - ( ρ -順丁烯二醯亞胺基苯基）丙 酸酯（S Μ Ρ Ρ )、Ν - ( γ -順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀 醯亞胺（GMBS )、Ν - ( ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基） 琥珀醯亞胺（EMCS )等。 親水性聚合物之羧基與蛋白質之胺基、或親水性聚合物 具有之胺基與蛋白質具有之羧基以縮合劑結合’可於親水性 聚合物固定化蛋白質（Maruyama K et a1，Biochimica et

Biophysica， 1234,74-80 ( 1995))。 使親水性聚合物之硫醇基與蛋白質之硫醉基結合’可於 -70 - 200916477 親水性聚合物固定化蛋白質。例如，使用雙順丁烯二醯亞胺 基己烷等之交聯劑。 (v)利用生物素與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素蛋白之 專一性親和性使蛋白質與親水性聚合物結合的方法。 可將生物素修飾蛋白質與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素 蛋白修飾親水丨生聚合物非共價結合（A n t i s e n s e a n d N u c 1 e i c Acid Drug Development 12 : 3 1 1 -3 2 5 ( 2002))。又，抗生蛋 白鏈黴素及抗生物素蛋白形成4量體，利用可結合最大4分 子之生物素，將生物素修飾蛋白質經由抗生物素蛋白或抗生 蛋白鏈黴素連結物可與生物素修飾親水性聚合物非共價結 合(Biochimica et Biophysica Acta 1 2 3 9 133-144 ( 1995))° (v i )利用組胺酸標記與鎳離子之親和性，結合蛋白 質與親水性聚合物之方法。 利用聚組胺酸標記（His-Tag)與鎳離子（Ni2 + )之親和性可 於微脂粒將蛋白質及胜肽固定化（Molecular Pharmaceutics 3, 5, 525-530)。依基因工程手法，融合His-Tag的嵌合蛋白 質或胜肽可依公知方法表現、純化。又，具有金屬（Ni2+ ) 螯合部位之NTA (氮川三乙酸）、IDA (亞胺二乙酸）等於親 水性聚合物之末端或側鏈修飾’則可調製Ni2 +被固定化之微 脂粒。於該微脂粒之N i2 +專一地結合H i s - T a g ’則H i s - T a g 融合蛋白質或胜肽固定化於親水性聚合物。 (v i i )於抗體之Fc功能域藉由具有親和性之蛋白 質或其蛋白質功能域’結合抗體之全長分子的方法°

於抗體之Fc功能域具有親和性之Protein八或Protein G -71- 200916477 蛋白質、或藉由參與和Fc功能域結合的Protein A、Protein G之功能域蛋白質’可負載抗體之全長分子。此時，Protein A、ProteinG蛋白質可以上述（i )至（v i )任一方法結 合親水性聚合物（BMC Immunology 2006,7 : 24)。 上述（i )至（v i i )中，調節具有與蛋白質反應性 的親水性聚合物之比率，可藉由親水性聚合物使固定於微脂 粒的蛋白質的量任意變化。 7 .免疫微脂粒之形態 微脂粒典型上爲由內部有水相之單層或多層之脂質雙 層構成之閉鎖小胞（D.D.Lasic，”Liposomes : from basic to applications”，Elsevier Science Publishers，pp. 1-171 (1993))，但本發明中乃更廣指粒子狀之脂質複合體。採取 典型的閉鎖小胞構造作爲微脂粒之形態，可爲多重膜微脂粒 (MLV; multilamellar vesicle)、小單層膜微月旨粒（SUV; small unilamellar vesicle)、大單層膜微脂粒（LUV; large unilamellar vesicle)中任一者，脂質複合體之搆造益未明確 規定。本發明中免疫微脂粒之粒子徑，依上述大小調節法而 異，其製造可能的微脂粒大小之下限爲約20nm左右 (D.D.Lasic，” Liposomes : from basic toapplications”， Elsevier Science Publishers, pp. 1 - 1 7 1 ( 1 993 ))。另一方面， 微脂粒大小之上限，必須爲可血管內投與之7 μ m以下。本 發明中使用的免疫微脂粒之粒子徑並未特別限制，通常爲 〇.〇3至5 μηι左右。經由注射全身投與之場合，考慮微脂粒 之血中滯留性、腫瘤或炎症部位等之病態組織之集積性，希 -72 - 200916477 望爲4〇Onm以下。構成微脂粒之脂質成分及其組成比率，可 考慮微脂粒分散液之pH、浸透壓、Zeta電位、相轉移溫度、 活體內之血中滯留性、安定性等物性而選定。 8 .免疫微脂粒之調製法及純化法 (1 )免疫微脂粒調製法 本發明之微脂粒製造方法未特別限定，本項業者可利用 的方法（D.D.Lasic, ”Liposomes: from basic to applications” Elsevier Science Publishers, pp. 1 - 1 7 1 ( 1 99 3 ))皆可適用。 使用上述之脂質，可依薄膜法、逆相蒸發法、乙醇注入法、 醚注入法、脫水-再水和法、界面活性劑透析法、水和法、 凍結融解法、小型微脂粒小胞之鈣誘發融合法、機械化學 法、己烷-s p an 8 0透析法、有機溶劑小球蒸餾法等製造，可 依超音波照射法、凍結融解後之超音波照射法、擠壓法、法 式壓爐法（F r e n c h P r e s s m e t h 〇 d )、均質法等方法調節微脂粒 之粒子徑。又，依公知之方法，進行自多重膜微脂粒至單層 膜微脂粒、自單層膜微脂粒至多重膜微脂粒之轉換爲可能。 又，可依公知之方法將藥物負載於微脂粒之內部。一般 可列舉被包化法、遙控載法（pH梯度法）、對離子濃度梯度 法、凍結融解法、界面活性劑去除法、電機穿孔法、超臨界 一氧化碳法、膜載法等（G.Gregoriadis,“ Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques ”，2nd edition，Vo l.I-III,CRC Press)。藥物之封入 形態只要於微脂粒載持藥物之構造體則其形態無特別限 制’例如將藥物內包於脂質小胞之閉鎖空間內之形態、內包 -73 - 200916477 於脂質層間之形態、包含於脂質層內之形態等，亦可爲此等 組合之形態。 免疫微脂粒之調製法可大略分爲（A )調製含有具反應 性官能基之脂質或親水性聚合物之微脂粒，對此與蛋白質反 應之方法、或（B )具有反應性官能基之親水性聚合物與蛋 白質反應，與其他方式調製的不具有反應性官能基的微脂粒 融合的方法。 (A )於上述之微脂粒調製法中，作爲微脂粒構成脂質 成分之一部份，使用具有反應性官能基之脂質、或具有反應 性官能基之親水性聚合物衍生物脂質，以任意方法調製微脂 粒。所得微脂粒與蛋白質，如上述6- ( 2 )、（ 3 )所記載反應， 將微脂粒之脂質分子或親水性聚合物與蛋白質共價結合或 非共價結合。 (B )已知脂質-親水性聚合物-蛋白質之結合體於與微 脂粒（無必要反應性官能基）之混合分散液中，於脂質分子之 相轉移溫度附近及其以上之溫度條件下融合，即引起兩親媒 性小胞形成脂質之再構成，獲得於水相配置親水性聚合物-蛋白質部分，於脂質相配置脂質部分之免疫微脂粒（Paul S.Uster et al. FEBS, 1 996, 243 -246 ； T.Ishida et al. FEBS, 1 999, 1 29- 1 3 3 )。於此，微脂粒與脂質-親水性聚合物-蛋白 質之結合體融合之適當條件爲考慮該脂質之物性等來選擇。 (2 )免疫微脂粒之純化法 免疫微脂粒之純化係指於上述免疫微脂粒調製法8.( 1 ) 之過程所生之未結合於微脂粒的未反應蛋白質或胜肽等之 -74 - 200916477 分離、或上述免疫微脂粒調製法8. ( 1)之過程所生之未與 微脂粒融合的親水性聚合物-蛋白質之分離。作爲免疫微脂 粒之純化法，可列舉由色層分析分離、超過濾、透析、超遠 心分離等。 (3 )免疫微脂粒之抗體密度測定法 免疫微脂粒之「抗體密度」係定義爲相對於構成免疫微 脂粒之總脂質莫耳數，該免疫微脂粒含有的抗體之莫耳數之 比率標記爲莫耳％者。於此，總脂質乃指含於上述5 _( 1 ) 列舉之兩親性小胞形成脂質之構成微脂粒的全部脂質。 作爲脂質之定量方法，例如，可列舉依放射性同位素之 方法（Maehama T, et al，Anal Biochem.279( 2): 248,2000)、 依闻速液體色層分析之方法（Serunian L.A.et al, Methods Enzymol.1991 ; 198: 78)、依氣體色層分析之方法（Hoving EB,et al，J Chromatogr B Biomed Appl .1 9 9 5, 15; 671 (1-2): 341)、依質量分析之方法（WenkM.R.etal,Nat Biotechnol. 2003, 2 1 ( 7 ) : 8 1 3 )、吸光光度法、化學定量法、 ' 酵素定量法等。尤其，於磷脂質的場合爲B a r 11 e 11法（B a r 11 e 11 GR.et al，J Biol Chem. 1959, 234( 3): 46)、Stewart 法（John Charles，et al,Anal Biochem.1980,1 ; 104(1): 10)、憐脂醯 膽鹼類等含有膽鹼之脂質時，利用膽鹼氧化酶之酵素定量法 (Takayama M, et al, Clin Chim Acta. 1977，] 5 ； 79 ( 1): 9 3 )、於膽固醇之場合’利用膽固醇氧化酶之酵素定量法 (Allain CC, et al, Clin Chem.1 974,20 ( 4 ) ： 470)等。聚乙 二醇之定量可依示差折射率測定（“Comprehensive Polymer -75 - 200916477

Science ”，1st Edition，1989)、苦味酸法（lnt.j.Pharm_ 203， 25 5, 2000 )等進行。總脂質量可依上述方法測定總脂質量或 特定之脂質成分之脂質量’由對該脂質之總脂質量之構成比 率（理論値）算出。但微脂粒構成脂質之構成比率假定爲於免 疫微脂粒之製作工程不變動。 作爲蛋白質之定量方法，可依CBQCA法（You WW，et al, Anal Biochem. 15; 244 ( 2): 277)、紫外線吸收法、Biuret 法、Bradford法、Kieldahl法、Lowry法等公知方法進行。 免疫微脂粒爲含有抗體之全長分子的場合，可於 0.0000 1 4mol%至 0.23mol%，較佳爲 〇.〇〇2mol%至 0.14mol% 之範圍內選擇抗體密度。免疫微脂粒含有抗體之F(ab’）2 的場合，可於 〇.〇〇〇〇14mol% 至 0.23mol%，較佳爲 0.006mol% 至O.llmol%之範圍內選擇抗體密度。免疫微脂粒爲含有Fab’ 的場合，可於 〇 · 〇 〇 〇 〇 1 4 m ο 1 °/。至 0.9 4 m ο 1 %，較佳爲 0 · 0 0 5 m ο 1 % 至0.5 6mol%之範圍選擇抗體密度。免疫微脂粒含有單鏈可 變部位抗體的場合，可於〇 . 〇 〇 〇 〇 1 4 m ο 1 %至1 . 8 m ο 1 %，較佳爲 0.005mol%至0.56mol%之範圍選擇抗體密度。 於此，免疫微脂粒之最小抗體密度（〇.〇〇〇〇 14mol% )係 指粒子徑1〇〇 〇nm之免疫微脂粒結合各種抗體2個的狀態。 最大抗體密度（抗體全長：〇.23mol%、F( ab’）2 : 〇.23mol%、 F a b ’ ： 0.9 4 m ο 1 %、s c F v : 1 . 8 m ο 1 % )係指免疫微脂粒.卜·抗體 以最密狀態存在之狀態。即，將免疫微脂粒上之抗體之佔有 面積假定爲以各種抗體分子之長徑作爲直徑之圓面積’將免 疫微脂粒之表面積除以抗體分子之圓面積之値之抗體數存 -76 - 200916477 在之狀態，作爲抗體以最密配置之狀態（Allen et al. Biochimica et BiophysicaActa( 1995))。抗體分子之長徑爲 以抗體全長爲14.2nm，以F(ab’）2爲14.2nm，以Fab’爲7nm， 以scFv爲5nm。關於抗體全長、F(ab’）2、Fab’之長徑，採 用 Raghupathy 等，The Journal of Biological Chemistry (1971).記載之値。關於scFv之長徑，參照Raghupathy等， The Journal of Biological Chemistry (1971) > 更由 Hoedemaeker 等人，J. Biol. Chem (1997)記載之 scFv 之結晶 構造算出長徑，採用5nm。 9.疏水性分子修飾抗體之構成成分 「疏水性分子修飾抗體」係指結合疏水性分子的抗體， 及疏水性分子藉由水溶性連結物結合的抗體。因此，本發明 之疏水性分子修飾抗體由（1 )疏水性分子、（2 )水溶性連 結物、（3 )抗體所構成（（2 )水溶性連結物可省略）。以下 詳述關於構成疏水性分子修飾抗體之各成分。 Γ 1 )疏7k性分子 「疏水性分子」之疏水性可以該分子分布於水相-有機 相之2相的濃度比率（分配係數）定義，具體而言，以水相 -有機相間之分配係數（分配比）D之對數，LogD之値定義 (分配係數及分配比之用語定義參照文獻「化學便覽改訂5 版基礎編II」（日本化學會編，九善株式會社，P 1 68- 1 77 ))。本說明書中「LogDj意指依LogD計算程式 Advanced Chemistry Development, I n c .之 A C D / L o g D ( 9.0 版），使用附屬之手冊文獻（ACD/logD Suite Reference -77 - 200916477

Manual ( 2005))所記載之算法算出的理論分配係數。本發 明之「疏水性分子」係定義於生理條件的p Η 7中L 〇 g D爲2 以上，較佳LogD爲8以上的有機分子。即，L〇gD爲2以上 (即水相-有機相中存在濃度比爲1 : 1 00以上）的化合物， 於中性水溶液中分布的場合，可認爲具有由疏水性相互作用 形成集合體的性質。經疏水性分子修飾之抗體，於水溶液中 藉由此疏水性分子間之疏水相互作用，促進抗體彼此之複合 體之形成。疏水性分子’只要分子彼此於水溶液中經疏水的 相互作用具有形成分子彼此之集合體的性能的有機化合物 即可，未限定於特定構造’可大略分類爲脂質、疏水性胜肽、 其他有機分子。以下之5 .( 1 ) -1 .至（1 ) — 3 ·列記作爲例 示。 (1 ) -1 ·脂質 所謂「脂質」係指具長鏈脂肪酸或烴鏈，對水爲難溶性 且易溶於有機溶劑的有機化合物。「脂質」由LogD爲2以上 且於水溶液中由疏水性相互作用可獲得分子集合體，可列舉 作爲本發明之疏水性分子。「脂質」可進一步大略分類爲磷 脂質、糖脂質、神經鞘脂質、固醇類、二醇類、飽和或不飽 和Sh肪酸、電何性脂質等。以下列舉此等之具體例。 (1 ) -1-1 .磷脂質 作爲磷脂質，可使用「5·免疫微脂粒之構成成分」之（1 ) -1所記載之磷脂質。 (1 ) -1-2.糖脂質 作爲糖脂質，可使用Γ 5 .免疫微脂粒之構成成分」之 -78- 200916477 (1 ) -2所記載之糖脂質。 (1 ) -1-3.固醇類 作爲固醇類，可使用「5.免疫微脂粒之構成成分」之（1) -3所記載之固醇類。 (1 ) -1-4.中性脂質 作爲中性脂質，可使用「5 .免疫微脂粒之構成成分」之 (1 ) -4所記載之中性脂質及神經鞘胺醇。 (1 ) -1 - 5 .飽和或不飽和脂肪酸 作爲飽和或不飽和脂肪酸，可使用「5 .免疫微脂粒之構 成成分」之（1 ) -1所記載之飽和或不飽和脂肪酸。 (1 ) -1-6.電荷性脂質 作爲電荷性脂質，可使用「5 .免疫微脂粒之構成成分」 之（1 ) -6所記載之電荷性脂質。 (1 ) -2.疏水性胜肽 胺基酸中，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺 酸、脯胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、酪胺酸、苯基丙胺酸已知 爲疏水性比較高的胺基酸。含有此等之疏水性胺基酸作爲構 成成分，LogD爲2以上之胜肽可作爲疏水性分子使用。更 具體而言，可列舉此等之疏水性胺基酸具有3 0%以上序列的 胜肽（5mer以上）爲疏水性分子，更較佳爲此等之疏水性 胺基酸具有50%以上序列的胜肽（5 mer以上）爲疏水性分子。 (1 ) -3.其他有機分子 關於其他有機分子（天然化合物、化學合成化合物不 拘）’只要L o g D爲2以上，於水溶液中發揮疏水性相互作用， -79- 200916477 可作爲本專利之疏水性分子使用。例如，可列舉脂溶性維生 素之維生素A (視黃醇）、維生素D (鈣化醇（c a 1 c i f e r ο 1 ))、 維生素E(生育酚）、維生素K及此等之衍生物。又’可舉 例由一條至複數條之長鏈烷基鏈（碳數1〇以上）構成的有 機分子（例如二烷基甘油等），或富勒烯C60等碳分子作爲 疏水性分子之例。又，可將由螢光素、蒽等多環芳香環構成 的有機分子作爲疏水性分子使用。 列舉上述5 .( 1 ) -1 ·至（1 ) - 3 .中所列舉之化合物中的 LogD之値作爲示例。例如，二硬脂基磷脂醯乙醇胺（DSPE) 之LogD(pH 7)爲13.2,二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺（DPPE) 爲11.1、二肉萱蔻醯基磷脂醯乙醇胺（DMPE)爲9.0、N-硬脂基神經鞘胺醇（神經醯胺）爲14.4、as ialo神經節苷酯 GM1爲10.4、膽固醇爲9.8、二硬脂基甘油爲16.4'二肉宣 蔻醯基甘油爲1 2.2、硬脂酸爲6.0、油酸爲5 · 4、神經鞘胺醇 爲4.2、維生素E (生育酚）爲1 1 .9、維生素D (鈣化醇） 爲9.7、維生素A (視黃醇）爲6.8、維生素Κι爲12.2，富 勒烯C 6 0爲1 3 . 3、螢光素爲2 · 9、蒽爲4 · 6，此等於中性水 溶液中達到疏水相互作用而具有形成集合體的性質。 (2 )水溶性連結物 本發明中，水溶性連結物爲將顯示藥理效果的抗體分子 與經疏水性相互作用促進複合體形成的效果的疏水性分 子，藉由適切的立體空間而擔當連繫的任務。因此，只要爲 於水溶液中形成無凝集的特定立體空間的性質之分子，未限 -80- 200916477 定於特定構造，但鏈狀（亦可爲分支）之水溶性高分子可於 本發明中作爲水溶性連結物。作爲水溶性連結物，可使用 「5 .免疫微脂粒之構成成分」之（2 )所記載之親水性聚合 物。 (3 )抗體 抗體只要爲於活體內顯示特定藥理效果的抗體未特別 限定，例如，可以上述「2.結合DR5之抗體」、「3.結合Fas 之抗體」、及「4.結合其他抗原之抗體」所述抗體作爲本發 明疏水性分子修飾抗體之構成成分。 1 〇.疏水性分子修飾抗體之結合樣式 本發明之疏水性分子修飾抗體，由疏水性分子、水溶性 連結物、抗體所構成，前述之疏水性分子與抗體、疏水性分 子與水溶性連結物、及水溶性連結物與抗體形成共價結合。 (1 )疏水性分子與水溶性連結物之結合樣式 疏水性分子與水溶性連結物，由上述「9 .疏水性分子修 飾抗體之構成成分」之（1 )記載之疏水性分子、及相同於 (2 )所記載之水溶性連結物而成，此組合未特別限定，可 視目的適宜選擇。疏水性分子與水溶性連結物，疏水性分子 具有的官能基（含人爲導入的官能基）與水溶性連結物具有 的官能基（含人爲導入的官能基）直接或藉由連結物形成共 價結合。

疏水性分子與水溶性連結物之結合體可依本項業者眾 所皆知之各種方法合成。例如，可依COMPREHENSIVE POLYMER SCIENCE, The Synthesis, Characterization, 200916477

Reactions & Applications of Polymers, Volume 6 Polymer Reactions所記載之合成方法製作。 水溶性連結物與疏水性分子之共價結合體可列舉以下 作爲示例。例如，可列舉聚乙二醇與疏水性分子之結合體、 聚乙烯亞胺與疏水性分子之結合體、聚乙烯基醇與疏水性分 子之結合體、聚丙烯酸與疏水性分子之結合體、聚丙烯醯胺 與疏水性分子之結合體、葡聚糖與疏水性分子之結合體、聚 丙烯酸與疏水性分子之結合體、殼聚糖與疏水性分子之結合 體、聚乙烯吡咯酮與疏水性分子之結合體、聚天冬醯胺酸醯 胺與疏水性分子之結合體、聚胺基酸與疏水性分子之結合 體、甘露聚糖與疏水性分子之結合體、三聚葡糖與疏水性分 子之結合體等。 又，具體的「聚乙二醇（PEG )與疏水性分子之結合體」， 可爲文獻（（D.D.Lasic，” Liposomes : from basic to applications”，Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1 9 9 3 ))之”Chapter 11. Liposomes as a drug delivery system”）所記載之聚乙二醇（PEG)修飾磷脂酿乙醇胺類。 更具體的「聚乙二醇（PEG)與疏水性分子之結合體」’可爲 聚乙二醇琥珀醯基磷脂醯乙醇胺類、聚乙二醇簾基碟脂醯乙 醇胺類、聚乙二醇乙嫌磷脂醯乙醇胺類、聚乙一醇擬基乙基 羰基磷脂醯乙醇胺類、聚乙二醇羯基丙基羰基憐脂醯乙醇胺 類、聚乙二醇（2-氯-1，3,5-三哄-4,6-二基）號拍酿基磷脂酸 乙醇胺類、聚乙二醇院基醚、二- c】2_24醯基-甘油-單PEG醚、 單C12.24醯基甘油-二PEG酸、Ν· ( 2,3·二肉宣蔻基氧基丙 -82 - 200916477 基）酿胺聚乙二醇甲基醚、N- (2,3 -二肉苣蔻基氧基丙基） 氨基甲酸酯聚乙二醇甲基醚、N-(2,3-二肉萱蔻基氧基丙基） 琥珀醯胺聚乙二醇甲基醚、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯、 聚乙二醇脂肪酸酯（例如，單硬脂酸聚乙二醇、單油酸聚乙 二醇、二月桂酸聚乙二醇、二硬脂酸聚乙二醇、二油酸聚乙 二醇、硬脂酸二乙二醇等）、聚乙二醇蓖麻油、螢光素異硫 氰酸酯聚乙二醇等，此等之「聚乙二醇（PEG )與疏水性分 子之結合體」，於與疏水性分子未結合端的聚乙二醇末端上 導入與下列（2 )詳述的抗體之反應性官能基。 (2 )抗體與疏水性分子或抗體與水溶性連結物之結合 樣式 作爲於抗體結合疏水性分子或於抗體結合水溶性連結 物的方法，可列舉下述（i )至（iV )所示方法。作爲疏水 性分子或水溶性連結物與抗體結合的方法，可列舉經由使疏 水性分子或水溶性連結物具有的官能基（含人爲導入的官能 基）與抗體具有的官能基（含人爲導入的官能基）反應，形 成共價結合的方法。作爲形成共價結合的官能基之組合，例 如’可列舉胺基/羧基、胺基/N -羥基琥珀醯亞胺酯、胺基/ 醛基 '胺基/三氟代乙烷磺醯基（tresyl )、胺基/硝苯基羰基、 胺基/乙縮醛基、胺基/異硫氰酸酯基、胺基/鹵化醯基、胺基 /苯并三哩碳酸醋基、醯肼基/醒基、硫醇基/順丁燦二醯亞胺 基、硫醇基/乙烯基礎酸基等、硫醇基/硫醇基等。抗體可於 水溶性連結物之主鏈·側鏈任一者之末端及非末端部位結合 又，疏水性分子或水溶性連結物亦可對抗體1分子爲複數個 200916477 結合。 (i )抗體之Lys殘基之ε-胺基或N末端之α-胺基，使 具有與胺基之反應性官能基的疏水性分子或水溶性連結物 反應的方法（Int J Oncol. 2003 23 ( 4): 1159-65_)。 抗體之胺基經由Lys殘基之e-胺基或N末端之α-胺基提 供。抗體之胺基與疏水性分子或水溶性連結物結合時，作爲 疏水性分子及水溶性連結物必要的反應性官能基，例如，可 列舉Ν -羥基琥珀醢亞胺酯（NHS酯）基、醛基、三氟代乙 烷磺醯基、硝基苯基羰基、乙縮醛基、羧基 '異硫氰酸酯基、 鹵化醯基、苯并三唑碳酸酯基等。具有Ν-羥基琥珀醯亞胺 酯（NHS酯）基的疏水性分子之衍生物，具體而言，可列舉 DSPE-NHS ( NOF CORPORATION 製品、COATSOME FE-8080SU5)、POPE-NHS (NOF CORPORATION 製品、 COATSOME FE-608 1 SU5)' DMPE-NHS( NOF CORPORATION 製品、COATSOME FE-4040SU5)、DPPE-NHS (NOF C O R P O R AT I ON 製品、C O AT S Ο Μ E F E - 6 0 6 0 S U 5 )、D Ο P E - Ν H S (NOF CORPORATION 製品、COATSOME FE-8181SU5)等。 又，作爲具有N -羥基琥珀醯亞胺酯（NHS酯）基之疏水性 分子-水溶性連結物之衍生物，具體而言，可列舉 DSPE-PEG-NHS ( NOF CORPORATION 製品' SUNBRIGHT SERIES DSPE-020GS )等。 (i i )於抗體之硫醇基上結合具有與硫醇基之反應性 官能基的疏水性分子或水溶性連結物的方法（Dmitri Kirpotin et al，Biochemistry, 1 997，36，66-75 ) 〇 -84 - 200916477 可利用抗體'(全長或片段）之絞鏈區域及重鏈與輕鏈之 連結部位之二硫醇基，抗體之內在性二硫醇基以TCEP、 DTT、锍基乙醇、半胱胺酸、半胱胺等還原爲硫醇基，可結 合使用。例如，IgG抗體以胃蛋白酶等酵素F ( ab’）2化， 進而可以二硫蘇糖醇等還原獲得的Fab’上所生的硫醇基提 供於結合（Martin，F.J.et al.Biochemistry 20,4229 ( 1981 ))。 IgM之場合，依據Miller等人之方法（J.Biol.Chem 257,286 (1 965 ))，可以於穩定條件下還原J鏈獲得IgMs之Fc部分 之硫醇基提供於結合。 由基因工程技術，於抗體之基因序列導入人工半胱胺 酸，可用於結合半胱胺酸具有的硫醇基。又，化學性方式， 已知可使用N -琥珀醯亞胺基-3- (2 -吡啶二硫基）丙酸酯 (SPDP) ( Carlsson.J. et al. Biochem. J. 1 73, 723 ( 1 978 )) 或N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫乙酸酯（SATA )、N-琥珀醯 亞胺基-S-乙醯基硫丙酸酯（SATP )、亞胺基唾陳（Traut，R. R. e t a 1 · B i o c h e m i s t r y 1 2 , 3 2 6 6 ( 1 9 7 3 ))、蔬基院基亞胺酸酯等 之化合物，於抗體上添加硫醇基的方法爲公知之方法。 作爲與抗體硫醇基結合上必要的官能基，可列舉順丁烯 二醯亞胺基、乙烯基磺酸基、硫醇基等。

作爲具有順丁烯二醯亞胺基的疏水性分子之衍生物，具 體而言，可列舉DPPE-順丁烯二醯亞胺 〔NOF CORPORATION 製品、COAT SOME (FE-6060MA3)〕、DSPE-順 丁稀二醯亞胺〔NOF CORPORATION 製品、COAT SOME (FE- 80 80MA3 )〕、POPE-順 丁烯二醯亞胺〔NOF -85 - 200916477 CORPORATION 製品、CO AT SOME (FE-6081MA3)〕、DMPE-順 丁烯二醯亞胺〔NOF CORPORATION 製品、COATSOME (FE-4040MA3 )〕、DOPE-順 丁烯二醯亞胺〔NOF CORPORATION 製品、COAT SOME( FE-81812MA3)〕等。又， 作爲具有順丁烯二醯亞胺基之疏水性分子-水溶性連結物之 衍生物，具體而言，可列舉DSPE-PEG-Mal (NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT SERIES DSPE-020MA， DSPE-05 0MA )等。 又，作爲順丁烯二醯亞胺基化試藥，除N- ( ε-順丁烯二 醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺之外，可列舉製作胺基之 順丁烯二醯亞胺基衍生物用之一般使用的Ν-琥珀醯亞胺基 4- ( ρ-順丁烯二醯亞胺基苯基）丁酸酯（SMPB )，Ν -琥珀醯 亞胺基4- ( ρ-順丁烯二醯亞胺基苯基）丙酸酯、Ν-( γ-順丁 烯二醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀醯亞胺等。 又，亦可以上述順丁烯二醯亞胺基化試藥將抗體之胺基 取代爲順丁烯二醯亞胺基。此等，具有硫醇基，例如，與以 吡啶二硫基丙酸酯（PDP )等修飾的疏水性分子或水溶性連 結物反應形成共價結合。 (i i i )來自抗體糖鏈的醛基上結合具有與醛基之反 應性官能基的疏水性分子或水溶性連結物的方法。 抗體（全長抗體）於Fc區域存有糖鏈。氧化此糖鏈獲 得的醛基，可與具有胺基之疏水性分子或水溶性連結物形成 席夫鹼（Schiff base )，接著將席夫鹼經氫化硼鈉等還原劑 還原，藉由糖鏈於抗體上可與疏水性分子或水溶性連結物共 -86 - 200916477 價結合。又，使醯肼修飾的疏水性分子或水溶性連結物反 應，藉由糖鏈可使抗體與疏水性分子或水溶性連結物共價結 合（Biochimica et Biophysica Acta 1 420 1 5 3 - 1 67 ( 1 999 ))。 (i v )使用交聯劑或縮合劑等將抗體、疏水性分子、 水溶性連結物各別具有的官能基彼此結合的方法。 使抗體具有之胺基與疏水性分子或水溶性連結物具有 之胺基結合，可使疏水性分子或水溶性連結物結合於抗體。 抗體之胺基由離胺酸殘基之ε-胺基及N末端之α-胺基提 供。固定化疏水性分子或水溶性連結物於抗體’可採用使用 戊二醛基而使抗體之胺基與疏水性分子或水溶性連結物之 胺基直接交聯的方法、使用反應活性試藥使抗體之胺基與疏 水性分子或水溶性連結物之胺基經化學結合的方法等之公 知方法。作爲二價交聯劑’除戊二醛之外，可列舉二琥珀醯 亞胺基辛二酸酯（DSS )、酞醛、對酞醛等之二醛、庚二亞氨 酸甲酯（DMP)、二異硫氰基二苯乙烯二磺酸鈉（DIDS)等。 作爲反應活性試藥，可列舉Ν-羥基琥珀醯亞胺基3- ( 2-吡 啶硫基）丙酸酯、m-順丁烯二醯亞胺基苄基-Ν-羥基琥珀醯 亞胺酯、二硫雙（琥珀醯亞胺基丙酸酯）、雙（磺酸基琥珀 醯亞胺基）辛二酸酯、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯等。 使抗體具有之硫醇基與疏水性分子或水溶性連結物具 有之胺基、或抗體具有之胺基與疏水性分子或水溶性連結物 具有之硫醇基結合，可於抗體上固定化疏水性分子或水溶性 連結物。作爲對胺基與硫醇基具有反應性的二價交聯劑可列 舉N-琥珀醯亞胺基3 - ( 2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDP )、N- -87 - 200916477 琥珀醯亞胺基4 - ( p -順丁烯二醯亞胺基苯基）丁酸酯 (SMPB ) ' N-琥珀醯亞胺基4- ( P-順丁烯二醯亞胺基苯基） 乙酸酯（S Μ P A )、N -琥珀醯亞胺基溴乙酸酯、N -琥珀醯亞胺 基4- ( p-順丁烯二醯亞胺基苯基）丙酸酯（SMPP )、N- ( γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基）琥珀醯亞胺（gmbs)、n-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺（EMCS) 等。 抗體之羧基與疏水性分子或水溶性連結物之胺基、或抗 體之胺基與疏水性分子或水溶性連結物之羧基以縮合劑結 合，可於抗體上固定化疏水性分子或水溶性連結物 (Maruyama K et al, Biochimica et Biophysica，1 2 3 4, 74-80 (1 9 9 5 ))。作爲具有胺基之疏水性分子-水溶性連結物之衍 生物，具體而言可列舉 DSPE-PEG-NH2( NOF CORPORATION 製品、SUNBRIGHT SERIES DSP E-020PA，DSP E-050 PA)等。 使抗體之硫醇基與疏水性分子或水溶性連結物之硫醇 基結合，可結合疏水性分子或水溶性連結物於抗體。例如， 使用雙順丁烯二醯亞胺基己烷等之交聯劑。 上述（i )至（i V )中，調節抗體與疏水性分子或水溶 性連結物之反應比率’可於抗體1分子上任意變換結合的疏 水性分子或水溶性連結物之數目。 1 1 .疏水性分子修飾抗體之調製法及純化法 (1 )疏水性分子修飾抗體之調製法 (1 ) - 1 ·疏水性分子-水溶性連結物之製造 疏水性分子與水溶性連結物之結合體，可依據該業者眾 -88 - 200916477 所皆知之各種方法合成。例如，可依COMPREHENSIVE POLYMER SCIENCE, The Synthesis, Characterization, Reactions & Applications of Polymers, Volume 6 Polymer Reactions所記載之合成方法製作，以具有反應性官能基之 疏水性分子與具有對應其之官能基的水溶性連結物於緩衝 液中或有機溶劑中混合可製造。 (1 ) -2.疏水性分子-抗體、或疏水性分子-水溶性連結 物-抗體之製造 對於具有硫醇基之抗體，經由具有順丁烯二醯亞胺基之 疏水性分子或水溶性連結物部分與具有順丁烯二醯亞胺基 之上述疏水性分子-水溶性連結物於緩衝液中混合，可製造 疏水性分子-抗體、或疏水性分子-水溶性連結物-抗體。抗體 之硫醇基，除經基因工程技術添加半胱胺酸之外，抗體之絞 鏈區域之內在性二硫醇基以TCEP、DTT、锍基乙醇、半胱 胺酸、半胱胺等還原而獲得。例如，IgG抗體以胃蛋白酶等 酵素作F ( ab’）2化，又以二硫蘇糖醇等還原而獲得的Fab’ 可提供所生的硫醇基作結合（^^1^11，？：1.431· Biochemistry 20，4229 ( 1981))。又，使抗體與 N-琥珀醯亞 胺基-3- ( 2-吡啶二硫基）丙酸酯（8?0?)(0&1：133〇11，〗七&1· Biochem. J . 1 73, 72 3 ( 1 97 8 ))或N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基 硫乙酸酯（S AT A )、N -琥珀醯亞胺基-S -乙醯基硫丙酸酯 (SATP)、亞胺基噻陳（Traut，R.R. et al. Biochemistry 12， 3 2 6 6 ( 1 9 7 3 ))、锍基烷基亞胺酸酯等之化合物反應，亦可化 學性添加硫醇基於抗體上。 -89 - 200916477 對具有胺基之抗體，經由具有活性酯之疏水性分子或水 溶性連結物部分以具有活性酯之上述疏水性分子·水溶性連 結物於緩衝液中混合，可製造疏水性分子-抗體、或疏水性 分子-水溶性連結物-抗體。抗體之胺基由Lys殘基之e-胺基 或N末端之α-胺基提供。 對氧化抗體糖鏈獲得的醛基，以具有胺基之疏水性分子 或水溶性連結物部分與具有胺基之上述疏水性分子-水溶性 連結物混合，形成席夫鹼，接著添加氫化硼鈉等之還原劑還 原席夫鹼，可製造疏水性分子-抗體、或疏水性分子-水溶性 連結物-抗體。又，具有醯肼之疏水性分子或水溶性連結物 部分經由與具有醯肼之上述疏水性分子-水溶性連結物於緩 衝液中混合，可製造疏水性分子-抗體、或疏水性分子-水溶 性連結物-抗體。（Biochimica et Biophysica Acta 1420 153-167 ( 1999))° 惟，只要形成疏水性分子-抗體、或疏水性分子-水溶性 連結物-抗體之共價結合，不限定於上述方法。形成共價結 合之官能基之組合，例如，可列舉胺基/羧基、胺基/ N -羥基 琥珀醯亞胺酯、胺基/醛基、胺基/三氟代乙烷磺醯基、胺基/ 硝苯基羰基、胺基/乙縮醛基、胺基/異硫氰酸酯基、胺基/ 鹵化醯基、胺基/苯并三唑碳酸酯基、醯肼基/醛基、硫醇基/ 順丁烯二醯亞胺基、硫醇基/乙烯基磺酸基等、硫醇基/硫醇 基等，任一者皆可用於本發明之疏水性分子修飾抗體之製 造。 (2 )疏水性分子修飾抗體之純化法 -90 - 200916477 疏水性分子修飾抗體之純化係指上述之（η之過程中 所生成之未反應之疏水性分子、水溶性連結物、疏水性分子 -水溶性連結物、抗體之分離。作爲疏水性分子修飾抗體之 純化法，可列舉使用各種色層分析（離子交換色層分析、疏 水色層分析、親和性色層分析、逆相色層分析等）之利用與 管柱担體之相互作用的分離純化、凝膠過濾色層分析、超過 濾、透析、超遠心分離等之利用分子大小不同的分離純化法。 1 2.疏水性分子修飾抗體中疏水性分子之結合數之分析法 疏水性分子修飾抗體之分析，可對疏水性分子修飾抗體 本身，或經由酸及酵素處理等將疏水性分子修飾抗體水解， 分離各構成成分而實施。 作爲抗體之定量方法，可依CBQCA法（You WW, et al, Anal Biochem. 1 5 ; 244 ( 2 ) : 277 )、紫外線吸收法、Biuret 法、Bradford法、Kieldahl法、Lowry法等之公知方法進行。 以下，記載疏水性分子及水溶性連結物之定量法，但只 要爲專一性定量疏水性分子及水溶性連結物的方法即可，未 特別限定於此等。 疏水性分子爲脂質的場合，作爲脂質之定量方法，例如 可列舉依放射性同位素之方法（M a e h a m a T, e t a 1, A n a 1 Bi〇chem.279( 2): 248, 2000)、依高速液體色層分析之方法 (Serunian L.A.et a 1, Methods R n z y m o 1 . 1991 ; 198 : 78)、 依氣體色層分析之方法（Hoving EB,et al, J Chromatogr B Biomed Appl.1 995, 1 5 ； 671 ( 1-2): 341)、依質量分析之方 法（Wenk M.R.et al，Nat Biotechnol.2003,21 ( 7): 813)、吸 200916477 光光度法、化學定量法、酵素定量法等。尤其，磷脂質可列 舉 Bartlett 法（Bartlett GR.et al，J Bi〇l Chem.1959,234( 3): 46)、Stewart 法（John Charles，et al，Anal Biochem.1980，1 ; 104(1): 10)，又’磷脂醯膽鹼類等之含膽鹼之脂質之場合 利用膽驗興化酶的酵素定量法（Takayama M，et al，Clin Chim Acta’1977，15; 79( 1): 93)，於膽固醇之場合，利用膽固醇 氧化酶之酵素定量法（Allain CC，et al,Clin Chem. 1974, 20 (4 ) ： 470 )等。 水溶性連結物爲聚乙二醇的場合，聚乙二醇之定量可依 不差屈折率測定（“Comprehensive Polymer Science’’，1st Edition，1989)、苦味酸法（Int. J. Pharm. 203，255，2000)、 依鋇•硪素定量（B.Skoog et al’Vox Sang. 1979，37 : 345) 等進行。 其他，亦可依使用專一性認識疏水性分子及水溶性連結 物的抗體的 E L I S A ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent A s s a y )法定量。 由以上述方法定量的抗體及疏水性分子、水溶性連結物 之各種莫耳濃度，可算出疏水性分子修飾抗體之抗體1分子 上結合的疏水性分子及疏水性分子-水溶性連結物之結合數 目。 抗體之硫醇基與疏水性分子或水溶性連結物結合的場 合，定量結合反應前後之每一個抗體1分子硫醇基之數目， 可估計此減少數爲疏水性分子或水溶性連結物之結合數。硫 醇基之定量可定量依Elluman法（Elluman，G· L_ et al，Arch. -92 - 200916477

Biochem. Biophys. 1959，92: 70)、螢光色素等之檢出容易 的化合物之順丁烯二醯亞胺衍生物等之與硫醇基反應的化 合物之結合的方法等之方法進行。 1 3 .含有免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體之醫藥 以上述「8 ·免疫微脂粒調整法及純化法」項目中記載的 方法獲得的免疫微脂粒、或以「1 1 .疏水性分子修飾抗體之 調製法及純化法」項目中記載的方法獲得的疏水性分子修飾 抗體，由活體內之DR5、Fas等之細胞凋零關連受體之生物 活性，即，藉由受體對癌症細胞誘導細胞凋零而抑制癌症細 胞增殖，可使用作爲醫藥，尤其是對癌症之治療劑。 由試管內之免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體的腫瘤 活性，於細胞凋零關連受體過度表現的細胞中可測定細胞之 增殖抑制活性。 例如，培養過度表現D R 5之癌症細胞株，於培養系中添 加各種濃度的免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體，可測定對 病灶形成、群落形成及類球狀體增殖之抑制活性。 於活體內利用實驗動物之免疫微脂粒或疏水性分子修 飾抗體對癌症的治療效果，例如，於將高表現DR5之腫瘤細 胞株移植之裸鼠投與免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體’測 定癌症細胞之變化。 作爲癌症之種類可列舉肺癌、前列腺癌、肝臟癌、卵巢 癌、大腸癌、乳癌、胰臟癌、血球癌（白血病、淋巴瘤等）等， 但只要成治療對象之癌症細胞表現含有死亡功能域的受 體，則不限定於此等。 -93 - 200916477 又，已知抗Fas及DR5之抗體爲對炎症性細胞誘導細胞 凋零（】.（：1111.11^631 1 996，98(2)，27 1 -278;111111111111111〇1· 1996，8 (10)，1595-1602)。故，本發明之免疫微脂粒或疏水 性分子修飾抗體亦可作爲自體免疫疾病或炎症性疾病之治 療劑使用。作爲此自體免疫或炎症性之疾病，其例可列舉爲 全身性紅斑性狼瘡、橋本病、關節風濕症、宿主移植片病、 休格連症候群、惡性貧血、艾迪遜病、硬皮症、古德巴斯德 症候群（Goodpasture syndrome)、克隆病、自體免疫溶血性 貧血、生殖不能症、重症肌無力症、多發性硬化症、巴塞杜 病、血栓不足紫斑病、胰島素依存糖尿病、過敏、氣喘、異 位性皮膚炎疾病、動脈硬化症、心肌炎、心肌症、腎小球腎 炎、再生不良性貧血、臟器移植後之排斥反應。 本發明亦提供含有治療上有效量之免疫微脂粒或疏水 性分子修飾抗體與藥學上容許之稀釋劑、載劑、可溶化劑、 乳化劑、保存劑及/或補助劑之醫藥組成物。 本發明之醫藥組成物中容許之製劑所用的物質較佳爲 投與量或投與濃度中對醫藥組成物被投與者爲非毒性者較 佳。 本發明之醫藥組成物可含有用以將PH、滲透壓、黏度、 透明度 '顏色、等張性' 無菌性、安定性、溶解率、徐放率、 吸收率、滲透率改變、維持、保持之製劑用物質。 作爲製劑用物質可列舉以下之物’但未限於此等：甘胺 酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之 胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗 -94 - 200916477 氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鹽、T r is _鹽酸 (Tris-Hcl )溶液等之緩衝劑' 甘露糖醇或甘胺酸等之塡充 劑、乙二胺四乙酸（EDTA )等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯 吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β_環糊精等錯化劑、葡萄糖' 甘露糖或糊精等增量劑、單糖類、二糖類或葡萄糖、甘露糖 或糊精等其他烴、著色劑、香味劑、稀釋劑' 乳化劑或聚乙 烯吡咯啶等親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、 氯化苄烷銨、苯甲酸、柳酸 '硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸 甲酯、對羥苯甲酸丙酯、醋酸氯己啶（Chi or hex i dine )、山 梨酸或過氧化氫等防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶 劑、甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇、懸浮劑、PEG、山梨糖醇 酐酯、聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80等聚山梨酸酯、三硝 基甲苯（triton)、胺基丁三醇（tromethamine)、卵磷脂或膽 固醇等界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等安定化增強劑、氯化 鈉、氯化鉀或甘露糖醇.山梨糖醇等彈性增強劑、輸送劑、 稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上之補助劑。 此等之製劑用物質之添加量以對免疫微脂粒或疏水性 分子修飾抗體之重量爲0.01〜100倍，尤其以0.1〜10倍添 加較佳。 製劑中適宜醫藥組成物之組成可由業者依適用疾病、適 用投與路徑等適宜決定。 醫藥組成物中之賦形劑或載劑可爲液體亦可爲固體。 適當賦形劑或載劑可爲注射用之水或生理食鹽液、人工 腦脊髓液或非經口投與通常用之其他物質。 -95 - 200916477 亦可使用含有中性之生理食鹽液或血清蛋白素之生理 食鹽液爲載劑。 於醫藥組成物亦可含有PH7.0-8.5之Tris緩衝液或 pH4.0-5_5之乙酸緩衝液或於此等中含有山梨糖醇或其他化 合物者。 本發明之醫藥組成物以經選擇的組成以必要純度作爲 適當藥劑，準備成凍乾品或液體。 含有免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體之醫藥組成物 亦可使用蔗糖等適當賦形劑成型爲凍乾品。 本發明之醫藥組成物可調製成非經口投與用，亦可調製 成經口之消化管吸收用。 製劑之組成及濃度可依投與方法來決定，本發明之醫藥 組成物所含抗體對抗原之親和性，即相對於對抗原之解離常 數（Kd値），親和性越高（Kd値低），對人之投與量越少而可 發揮藥效，故可基於此結果而決定本發明之醫藥組成物對人 之投與量。 1 投與量爲將免疫微脂粒投與人之時，可將抗體量換算約 0.1〜l〇〇mg/kg於1〜30日投與1次。 作爲本發明之醫藥組成物之形態，可列舉包括點滴之注 射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。 以下以實施例具體說明本發明，但本發明不受此等實施 例限定。又下述實施例中有關基因操作之各操作若無特別明 示，可依「分子選殖（Molecular Cloning)」（Sambrook, J.， Fritsch，E.F.及 Maniatis，T.著，Cold Spring Harbor -96 - 200916477

Laboratory Press 1989年發刊）記載之方法施行，或用市售之 試藥或套組時，依市售品之指示書使用。 結合免疫微脂粒或疏水性分子修飾抗體之蛋白質之濃 度使用CBQCA蛋白質定量套組（Molecular Probes)依據添附 之指示書而定量。微脂粒之磷脂質濃度使用磷脂質C和光試 劑（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)依據添附之指示 書定量。免疫微脂粒之粒徑使用粒徑測定機（Nicomp Particle Sizer Model 370,Nicomp Particle Sizing Systems)測定。 【參考例1】 hTRA-8 F ( ab’）2 之調製 將抗人類DR5抗體hTRA-8於乙酸緩衝液（20mM乙酸 鈉，pH4.5)調製爲l〇mg/ml之濃度。又，hTRA-8爲將屬 小鼠抗人類 DR5 抗體的 TRA-8 ( Nature Med.2001，7(8), 95 4-60 )作成人化抗體的抗體。作爲此重鏈胺基酸序列具冇 序列表所記載之序列編號1之胺基酸序列’作爲輕鏈胺基酸 序列具有序列表所記載之序列編號2之胺基酸序列。於本抗 體溶液lml中，添加固定化胃蛋白酶（Pierce Bio technology,Inc.) 125 μΐ 後，於 37 °C 培育 8.5 hr，將本抗 體片段化爲F ( ab ’）2片段。將反應溶液離心’由上清液濾 除固定化胃蛋白酶。經由離子交換色層分析（AKTA exPlorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.)；管柱（GE HEALTHCARE IN C ., R e s o u r c e S 6 m 1 ) : A 液（5 0 m M 檸檬酸緩衝液 ’ p H 4.0 )、 B液（50mM檸檬酸緩衝液、1 M NaCl, pH4.0 )；梯度（B 液丨5 —40%，5 0CV，線性梯度）；4°C ; 6 ml/min ;偵測波長 -97- 200916477 UV 280 nm )，除去胜肽片段及未消化之全長hTRA-8，回收 F( ab’）2劃分（57-111 ml之溶出劃分）。經由使用Labscale TFF 系統（MILLIPORE INC.)、聚醚碾膜（MILLIPORE INC·， Pellicon XL ,Biomax 50(劃分分子量；50，〇〇〇))之超過濾操 作，將檸檬酸緩衝液交換爲HEPES緩衝液（20mM HEPES， 1 50mM NaCl，ρΗ7·4)。 【參考例2】 hHFE7A F ( ab’）2 之調製 抗人類Fas抗體hHFE7A以乙酸緩衝液（20mM乙酸鈉， ρΗ4·5)調製爲1〇11^/1111之濃度。又，111^£7六爲將屬小鼠 抗人類 Fas 抗體的 HFE7A ( Int.Immunol.2000, 1 2 ( 4 )， 5 5 5 - 6 2 )作人化的抗體，作爲其重鏈胺基酸序列具有序列表 所記載之序列編號3之胺基酸序列，作爲輕鏈胺基酸序列具 有序列表所記載之序列編號4之胺基酸序列。於本抗體溶液 1 ml中添加固定化胃蛋白酶（Pierce Biotechnology, Inc.) 1 2 5 μΐ後，於3 7 =〇培育8 _ 5 hr，將本抗體片段化爲F ( ab ’） 2片段。將反應溶液離心，由上清液濾除固定化胃蛋白酶。 經由離子交換色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.， ResourceS6ml); A 液（50mM 檸檬酸緩衝液，ρΗ4·0)、B 液（50mM檸檬酸緩衝液、1 Μ NaCl，ΡΗ4.0 );梯度（Β液 15 — 40%，5 0CV，線性梯度）；4。。； 6 ml/min;偵測波長 UV 280 nm )，除去胜肽片段及未消化之全長hHFE7A，回收F ( ab’） 2劃分（ 40-65 ml之劃分）。經由使用Labscale TFF系統 -98 - 200916477 (MILLIPORE INC.)、聚醚颯膜（MILLIPORE INC.，Pellicon XL ,Biomax 50(劃分分子量；50,000))之超過瀘操作，將檸 檬酸緩衝液交換爲HEPES緩衝液（20mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4)。 【實施例1】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 將於參考例1調製之F( ab’）2溶液（抗體濃度2.5mg/ml， HEPES 緩衝液），於 10mM L -半腕胺酸（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下，於室溫培育90分鐘，還原爲Fab’。 由凝膠過濾純化（管柱；GE HEALTHCARE INC.PD-10脫鹽管 柱 ；HEPES緩衝液）去除L-半胱胺酸，獲得hTRA-8 Fab’ 片段。 (2 )微脂粒之調製 將一掠潤酿基憐脂釀基膽驗（L-a-Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下表記爲 DPPC; NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、膽固醇 (Sigma-Aldrich, Inc·)、及分子量約3400之於聚乙二醇之末 端具有順丁烯二醯亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬脂醯基 碟脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol)succinyl distearoylphosphatidylethanolamine > 以下表言己爲 DSPE-PEG3400- Mai ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)各以 22mg' 7.73mg、1.26mg(莫耳比 100:66: 1)量取於茄型燒瓶，添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO.,INC.) 3 m 1而溶解。其次經由減壓餾除氯仿，於燒瓶內壁形成脂質 -99 - 200916477 之薄層。於此脂質薄層加HEPES緩衝液（20mM HEPES， 15 0mM NaCl, pH7.4) 3ml而懸浮，獲得微脂粒（DPPC濃度： lOmM)之粗分散液。接著，此微脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)，由具有 100 nm 孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIPID, INC.)重複擠 壓（extruded)，調整微脂粒之粒徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hTRA-8 Fab’： DSPE-PEG3400-Mal=l : 50(莫耳 比）之比例的方式，混合上述hTRA-8 Fab’（3.6mg/ml，15.3μ1) 與微脂粒分散液（l〇mM DPPC，50(^1)，使抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體 之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM，5μ1於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’以凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade); HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2ml/分鐘；偵測波長UV280nm)分離，分取免疫微脂 粒劃份（36-48ml 之劃份）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，分劃分子量50,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半晄胺酸殘基與微脂粒之P E G末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之編號1 ’抗體濃度SLhg/ml，磷脂質濃度 6.3mM，抗體密度〇.〇〇58莫耳％，平均粒徑73.0±35.9nm (HEPES緩衝液））。 -100- 200916477 【實施例2】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地於使用時調製微脂粒 分散液。 關於抗體對微脂粒之結合，如以下方式進行。以hTRA- 8 Fab’： DSPE-PEG3 400-Mal= 1 ： 5(莫耳比）之比例的方式， 混合上述之hTRA-8 Fab’（ 3.6 mg/ml，1 52 μΐ )與微脂粒分 散液（10mM DPPC，500 μΐ)，使抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體的順丁烯 二醯亞胺基，經由相對於DSPE-PEG3400-Mal添加10等量 之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM， 5 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade) ； HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/mU :偵測波長UV2 8 0nm)分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No .2、抗體濃度278.5 pg/ml、磷脂質濃 度6 . 1 m Μ、抗體密度0.050 mol%、平均粒子徑86.6±39.9 nm ( HEPES 緩衝液））。 【實施例3】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 200916477 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地於使用時調製微脂粒 分散液。 關於抗體對微脂粒之結合，進行以下工程。以作成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 : 2 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述hTRA-8 Fab’（ 3.6 mg/ml，244 μΐ)與微 脂粒分散液（10mM DPPC，3 20μ1)，使抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端的順丁烯二醯亞胺基反應。抗體未結合的 順丁烯二醯亞胺基，經由以相對於DSPE-PEG3400-Mal添加 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd·) lOOmM，3.2 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);管柱(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝 液（pH7_4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV2 8 0nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮， 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.3、抗體濃度413.7 pg/ml、磷脂質濃度4.38mM、抗體密度0.102 mol%、平均粒 子徑 84.4±42.2 nm ( HEPES 緩衝液））。 【實施例4】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 -102- 200916477 (2 )微脂粒之調製 二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼（L-a-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine，以下表言己爲 DPPC;NOF CORPORATION COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich，Inc.)、及 分子量約3400之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞胺基之 聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（P〇ly( ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethano lamine，以下標 記爲 DSPE- PEG3 400- Mai ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)各以 11 mg、3.9 mg、3.15 mg (莫耳比1 00 : 66 : 5 )量取於茄型燒瓶，添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO.，INC. ) 1.5 ml而溶解。其次經由減壓餾除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層添加HEPES 緩衝液（20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)1.5 ml 而懸濁， 獲得微脂粒（DPPC濃度：lOmM )之粗分散液。接著，此微 脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID, INC.)，由具有100 nm孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIPID,INC.)重複擠壓（extruded)，調整微脂粒之粒 徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 關於抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下工程。使成 爲 hTRA-8 Fab’ ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 1 (莫耳比）之比 例的方式’混合上述 hTRA-8 Fab’（4.64 mg/ml，237 μΐ)與 微脂粒分散液（DPPC，200 μΐ )，使抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體 -103- 200916477 之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添加10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 10 OmM, 2 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’以凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade) ; HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2ml/min;偵測波長UV280nm)分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC·,分劃分子量50,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No.4、抗體濃度3 94.5 pg/ml、磷脂質濃 度1.91mM、抗體密度0.224 mol %、平均粒子徑83.7 ±40.8 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例5】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 將於參考例-1調製之F( ab’）2溶液（抗體濃度5 mg/ml， HEPES緩衝液），於40mM ( ±)-二硫蘇糖醇（（±) -Dithiothreitol，以下標記爲 DTT; Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)存在下，於室溫培育30分鐘，還原爲Fab’。 由凝膠過濾純化（管柱；GE HEALTHCARE INC.PD-10脫鹽 管柱；HEPES緩衝液）除去DTT，獲得hTRA-8 Fab’片段。 (2 )微脂粒之調製

二棕櫚醯基磷脂醯基膽驗（L-a-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine，以下表記爲 DPPC;NOF CORPORATION -104- 200916477 COATSOMEMC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich，Inc·)、及 分子量約3400之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞胺基之 聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（p〇ly( ethylene glycol ) succinyldistearoyl phosphatidyl ethanolamine > 以下 表記爲 DSPE-PEG3400-Mal ; NOF CORPORATION, SUN BRIGHT DSPE-034MA )各以 1762 mg、618.6 mg、 2481.4 mg(莫耳比 100:66:1)添加乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) 90 ml使溶解。將此脂質溶液滴下於HEPES 緩衝液（20mM HEPES, 150mM NaCl，pH7.4) 900 ml，獲得 微脂粒之粗分散液。接著，以超過濾（Lab Sc ale TFF System (MILLIPORE INC·))、聚醚颯膜（Pellicon XL 50，Biomax 300，劃分分子量；300，000 ( MILLIPO RE INC.))調製微脂 粒分散液濃度爲10mM DPP C，使用高壓連續式均質機 (EmulsiFlex-C5，AVESTIN，INC.)，於 5 0 nm 之孑L 大小之聚 碳酸醋膜（Nucleopore Track-Etch Membrane, Whatman INC.)反覆擠壓（extruded)，調整微脂粒之粒徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 25(莫耳 比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（4.86mg/ml, 5.7ml)與微脂粒分散液（10mM DPPC，132 ml)，使抗體之硫 醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未 結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al 添力口 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries， Ltd. ) 100mM，1.3 2 ml於室溫反應30分鐘而不活性化。未 -105- 200916477 反應之 hTRA-8 Fab’，以超過濾（LabScale TFF System (MILLIPORE INC.)、聚醚颯膜（Pellicon XL 50，Biomax 300，劃分分子量；300,000,（MILLIPORE INC.))分離，獲 得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免 疫微脂粒（微脂粒組成：表1之N0.5、抗體濃度1011.0 pg/ml、磷脂質濃度27.63mM、抗體密度0.040 mol%、平均 粒子徑 53.7±22.4nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例6】 與實施例5之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例5之（2 )同樣地，於使用時調製微脂 粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab’ ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 5 (莫耳比）之比 flj 的方式，混合上述之 hTRA-8 Fab’（4_86 mg/ml，9.05ml)與 微脂粒分散液（10mM DPP C，49ml )，使抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端的順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體 之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100mM，490 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’，以超過濾（LabScale TFF System ( MILLIP ORE INC.)、聚醚砸膜（PeHicon XL 50，Biomax 300,劃分分子 量；3 00，00 0,（ MIL LIP O RE INC.))分離，獲得抗體上之半 胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂 粒組成：表1之Νο·6、抗體濃度1 3 63.3 pg/ml、磷脂質濃度 -106- 200916477 8.85mM、抗體密度 0.167 mol%、平均粒子徑 50.3±23.6 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例7】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地於使用時調製微脂粒 分散液。抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab，： DSPE-PEG3400-Mal = l : 5 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5mg/ml，66 μΐ)與微脂 粒分散液（DPPC，3 00 μΐ )，使抗體之硫醇基與微脂粒 上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之順 丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10等量 之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) lOOmM, 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’ 經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade) ; HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV2 80nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No.7、抗體濃度96.8 pg/ml、磷脂質濃度 1.64mM、抗體密度 0.064 mol%、平均粒子徑 101·1±44·2 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例8】 107- 200916477 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂 粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab，： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 20 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml,16.5 μΐ)與微 脂粒分散液（10mM DPPC，300 μΐ)，使抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端的順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之 順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10等 量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd. )100mM， 3μ1於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab， 經由凝膠過濾色層分析（AKΤΑ explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV2 80nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（3 6 - 4 8 m 1 之劃分）。使用 A m i c ο n U 11 r a ( Μ I L LIP O R E INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之Νο·8、抗體濃度70.7 pg/ml、磷脂質濃度 1.3 9mM、抗體密度 0.05 5 mol%、平均粒子徑 83.3土40.3 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例9】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 與實施例-1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ -108- 200916477 片段。 (2 )微脂粒之調製 卵黄卵磷脂（Egg Yolk Lecithin，以下表記爲eggPC ; Q.P.Corporation，PC-98N)、膽固醇（Sigma-Aldrich, Inc·)、 及分子量約3400之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞胺基 之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下表記爲 D S P E - P E G 3 4 0 0 · M al ; N O F CORPORATION，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各以 24 mg、7.73 mg、1.26 mg (莫耳比1 00 : 66 : 1 )量取於茄型燒瓶，添加 氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO., INC.) 3 ml 使溶解。其次經 由減壓餾除氯仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄 層添加HEPES緩衝液3 ml而獲得微脂粒（蛋PC濃度：10mM) 之粗分散液。接著，此微脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID, INC.)，由具有 100 nm 孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIP ID, INC.)重複擠 壓（extruded)，調整微脂粒之粒徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合 使成爲 hTRA-8 Fab’ ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 5 (莫耳 比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（5mg/ml，66 μΐ )與微脂粒分散液（l〇mM eggPC，300 μΐ )，使抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結 合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添 加 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, -109- 200916477

Ltd. ) lOOmM, 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應 之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝 液（ρΗ7·4 ) ; 4°C ; 2 ml/miii ;偵測波長 UV280nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（3 6-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.9、抗體濃度138.8 pg/m卜磷脂質濃度2.32mM、抗體密度0.065 mol%、平均粒 子徑 90.2±13.3 nm ( HEPES 緩衝液））。 【實施例1 〇】 與實施例1之（1 )同樣地、於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例9之（2 )同樣，於使用時調製微脂粒 分散液。

抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab’ ·· D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 20 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab，（ 5 mg/ml，16.5 μΐ)與微 脂粒分散液（1 〇mM eggPC, 3 00 μΐ )，使抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之 順丁烯二醯亞胺基，經由對D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al添加1 0等 量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM， 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE 200916477 HEALTHCARE INC·);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV280nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 m 1 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮、獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No_10、抗體濃度90.9 pg/ml、磷脂質濃 度2.98mM、抗體密度0.033 mol%、平均粒子徑83.1±13.0 η m ( HEPES 緩衝液））。 【實施例1 1】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 (2 )微脂粒之調製 二肉竟蔻醯基磷脂醯膽鹼（L-a-Dimyristoyl Phosphatidylcholine > 以下表記爲 DMPC; NOF CORPORATION, CO AT SOME MC-4040 )、膽固醇 (Sigma-Aldrich，Inc.)、及分子量約3400之聚乙二醇之末 端具有順丁烯二醯亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基 憐脂醯乙醇胺（poly ( ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine > 以下表言己爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)各以 20.3 mg、7.73 mg、1.26 mg(莫耳比 100: 66:1)量取於茄型燒瓶，添力口氯仿（反八『0〇抓1^1€八1(：0.: 200916477 INC. ) 3 ml使溶解。其次經由減壓餾除氯仿，於燒瓶內壁形 成脂質之薄層。於此脂質薄層添加HEPES緩衝液3ml而獲 得微脂粒（DMPC濃度：10mM)之粗分散液。接著，此微 脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID，INC.)，由具有100 nm孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIPID,INC.)重複擠壓，調整微脂粒之粒徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合 使成爲 hTRA-8 Fab，： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 5 (莫耳 比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（5 mg/ml，66 μΐ )與微脂粒分散液（l〇mM DMPC, 3 00 μΐ )，使抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結 合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添 加 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 10 OmM, 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析(AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝 液（ρΗ7·4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV2 8 0nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPORE INC·，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No. 1 1、抗體濃度〗48.5 pg/ml、磷脂質濃度2.47mM、抗體密度0.06 5 mol%、平均粒 子徑 117_9±47.1 nm( HEPES 緩衝液））。 200916477 【實施例1 2】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1 1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂 粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l ： 20 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml，16.5 μΐ )與微 脂粒分散液（10mM DMPC，3 00 μΐ)，使抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之 順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10等 量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )100mM, 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC·);管柱（GE HEALTHCARE INC.’HiL.oad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV2 80nm)分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮、獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No.12、抗體濃度76.8 pg/ml、磷脂質濃 度2.94mM、抗體密度0.028 mol%、平均粒子徑1 1 9.3±45.0 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例1 3】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 200916477 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 (2 )微脂粒之調製 二油醯基磷脂醯膽鹼（L-a-Dioleoyl Phosphatidylcholine，以下表記爲 DOPC; NOF CORPORATION COATSOME MC-8181 )、膽固醇 (Sigma-Aldrichjnc.)、及分子量約3400之聚乙二醇之末端 具有順丁烯二醯亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷 脂醯乙醇胺（poly ( ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下表記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF C O R P O R AT IΟ N, S UN B RI G Η T DSPE-034MA)各以 23.6 mg、7.73 mg' 1.26 mg(莫耳比 100: 66: 1)量取於茄型燒瓶，添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO.，INC. ) 3 ml使溶解。其次經由減壓餾除氯仿、於燒瓶內 壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層添加HEPES緩衝液3 ml 而獲得微脂粒（DOPC濃度：1 OmM )之粗分散液。接著，此 微脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID，INC·)，由具有100 nm孔大小之聚碳酸酯膜 (Avanti POLAR LIPID,INC.)重複擠壓（extruded)，調整微 脂粒之粒徑。 (3)抗體之對微脂粒之結合 使成爲 hTRA-8 Fab，： DSPE-PEG3400-Mal = l ： 5 (莫耳 比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fab，（ 5 mg/ml，66 μΐ )與微脂粒分散液（l〇mM DOPC, 3 00 μΐ )，使抗體之硫醇 200916477 基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結 合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添 加 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 10 OmM，3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’，經由凝膠過爐色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC . ,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ; HEPES 緩衝 液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min:偵測波長 UV280nm)分離， 分取免疫微脂粒劃分（3 6-48 ml之劃分）。使用Am icon Ultra (MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.13、抗體濃度136.3 pg/rnl、磷脂質濃度 2.30mM、抗體密度 0.064 mol%( HEPES 緩衝液））。 【實施例1 4】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1 3之（2 )於使用時調製微脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab，： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 20 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml，16.5 μΐ)與微 脂粒分散液（1 OmM DOPC, 300 μΐ )，使抗體之硫醇基與微脂 粒卜.之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之 順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10等 量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)100mM， 200916477 3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液(p H 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV2 80nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮、獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No. 14、抗體濃度72.9 pg/ml、磷脂質濃 度 2.13mM、抗體密度 0.037 111〇1%(1^?£8緩衝液））。 【實施例1 5】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 與實施例-1同樣地，於使用時調製hTR A-8 Fab’片段。 (2 )微脂粒之調製

二硬酯醯基憐脂酸膽驗（L-a-Distearoyl Phosphatidylcholine，以下表記爲 DSPC; NOF CORPORATION COATSOME MC- 80 8 0 )、膽固醇（Sigma-Aldrich，Inc.)、及分 子量約3 400之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞胺基之聚 乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly ( ethylene glycol ) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以 下表言己爲 DSPE-PEG3400-Mal ; NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-034MA)各以 23.7 mg、 7.73 mg、1.26 mg (莫耳比100: 66: 1)量取於茄型燒瓶， 添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO.，INC. ) 3ml 使溶解。其 200916477 次經由減壓餾除氯仿、於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂 質薄層添加HEPES緩衝液3ml而獲得微脂粒（DSPC濃度： 10mM )之粗分散液。接著，此微脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID,INC.)，由具有 100 nm 孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIPIDJNC.)重複擠 壓（extruded)，調整微脂粒之粒徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合 使成爲 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 : 2 (莫耳 比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml，165 μΐ)與微脂粒分散液（l〇mM DSPC，300 μΐ)，使抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結 合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添 加 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，

Ltd. ) 1 00mM，3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應 之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade) ; HEPES 緩衝 液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min;偵測波長 UV280nm)分離’ 分取免疫微脂粒劃分（36-4 8 ml之劃分）。使用Ami con Ultra (\111^1?〇1^1>1(：.，劃分分子量50,000)進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.l 5、抗體濃度I78.9 pg/ml、磷脂質濃度 1.97mM、抗體密度 0.099 mol% (HEPES 緩衝液））。 -117- 200916477 【實施例1 6】 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。又，與實施例1 5之（2 )同樣地於使用時調製微脂粒 分散液。 抗體之對微脂粒之結合，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3 400-Mal= 1 ： 5 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml, 66 μΐ)與微脂 粒分散液（10mM DSPC, 3 00 μΐ )，使抗體之硫醇基與微脂粒 上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體之順 丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400 -Mal添加10等量 之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM，3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’， 經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC·):管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液(pH7.4 )； 4°C ; 2 ml./min ;偵測波長UV2 80nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（3 6-48 m 1 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之No. 16 '抗體濃度60.4 pg/ml、磷脂質濃 度 1 _53mM、抗體密度 0.043 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例1 7】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製h T R A - 8 F a b ’ 200916477 片段。 (2 )微脂粒之調製 二棕櫚醯基磷脂酸基膽鹼（L-a-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine，以下表記爲 DPPC;NOF CORPORATION, C O AT SOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich, Inc.)、及 具有順丁烯二醯亞胺基的二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（以下表 記爲 DSPE-Mal ; NOF CORPORATION，COATSOME FE-8080MA3 )各以 11 mg、3.9 mg、0.69 mg (莫耳比 100: 66 : 5 )量取於茄型燒瓶，添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO.，INC. ) 1 .5ml使溶解。其次經由減壓餾除氯仿、於燒瓶 內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層添加HEPE S緩衝液1 . 5 ml而獲得微脂粒（DPPC濃度：10mM )之粗分散液。接著， 此微脂粒分散液使用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID，INC·)，由具有100 nm孔大小之聚碳酸酯膜 (Avanti POLAR LIPID，INC.)重複擠壓，調整微脂粒之粒 徑。 (3 )抗體之對微脂粒之結合 使成爲 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-Mal=l : 1 (莫耳比）之比 例的方式，混合上述之 hTRA-8 Fab’（ 4.64 mg/ml，23 7 μΐ ) 與微脂粒分散液（10mM DPPC, 200 μΐ )，使抗體之硫醇基與

微脂粒上之順丁烯二醯亞胺基反應。抗體未結合的順丁烯二 醯亞胺基，經由以相對於DSPE-Mal添加10等量之锍基乙醇 10 0mM，2 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fab’，經由凝膠過爐色層分析（AKTA explorer 10S 200916477 (GE HEALTHCARE INC.);管柱(GE HEALTHCARE INC.’HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade) ； HEPES 緩衝 液（pH7.4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV280nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（36-48 m 1之劃分）。使用Am icon Ultra(MILLIPOREINC.，劃分分子量50,000)進行超過濾 濃縮，獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之DSPE匕結 合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No . 1 7、抗體濃度 124.0 pg/ml、磷脂質濃度1.34mM、抗體密度0.100 mol% (HEPES緩衝液））。 【實施例1 8】 (1 ) hTRA-8 Fab，之調製 與實施例1之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 (2) DSPE-PEG3400- ( hTRA-8 Fab，）複合體之調製 相對於 hTRA-8 Fab’（ 5 mg/ml, 220 μΐ)添力口 20 當量之 DSPE-PEG3400-Ma! ( 16.8 mg/ml, 100 μΐ ) > 於 3 7 °C 反應 I hr。未結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對 DSPE-PEG3400-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)100mM，40μ1 於室溫反應 30 分鐘 而不活性化。未反應之hTRA-8 Fab’，經由凝膠過濾色層分 析（AKTA explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ) ; HEPES 緩衝液（PH7.4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV2 80nm )分離，分取 D S P E - P E G 3 4 0 0 - ( hTRA-8 Fab,)複 -120- 200916477 合體劃分（ 39-54 m 1之劃分）。使用AmiconUltra (MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮， 獲得 DSPE-PEG3400- ( hTRA-8 Fab’）複合體。每 DSPE 之 hTRA-8 Fab’之量爲 1 4 2 8.6 μ g/μπι ο 1 D S P E。 (3 )微脂粒之調製 微脂粒爲將二棕櫚醯基磷脂醯基膽鹼（L-a-Dipalmitoyl Phosphatidylcholine，以下表記爲 DPPC; NOF CORPORATION，COATSOME MC-6060 )、膽固醇 (Sig.ma-Aldrich，Inc.)各以 22.05 mg、7.68 mg(莫耳比 3 : 2)量取於茄型燒瓶，添加氯仿（ΚΑΝΤΟ CHEMICAL CO·, INC. ) 3 ml使溶解。其次經由減壓餾除氯仿、於燒瓶內壁形 成脂質之薄層。於此脂質薄層添加HEPES緩衝液3 ml而獲 得微脂粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。接著，此微脂 粒分散液使用擠壓機（The Mini -Extruder, A vanti POLAR LIPID，INC.)，由具有100 nm孔大小之聚碳酸酯膜（Avanti POLAR LIPID, INC.)重複擠壓，調整微月旨粒之粒徑。 (4)微脂粒與 DSPE-PEG3400-( hTRA-8 Fab’）複合體 之融合 混合上述之DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’）複合體（抗 體濃度489.9 pg/ml，40 8 μΐ )與微脂粒分散液（10m M DPPC, 2 0 0 μ 1 )，於6 0 °C培育3 hr。與微脂粒未融合的 DSPE-PEG3400- ( hTRA-8 Fab5)複合體，經由凝膠過濾色 層分析（管柱（GE HEALTHCARE INC.，10><300mM,Sephacryl S-500 HR); HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min)分離， 200916477 分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPORE INC.，劃分分子量5 0,000 )進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之N 〇 . 1 8、抗體濃度7 3 . 7 pg/ml、磷脂質濃度 2.27mM、抗體密度 0.035 mol%(HEPES 緩衝液））。 【實施例1 9】 (1 ) hTRA-8 Fullbody之雙硫鍵之還原 將hTRA-8以抗體濃度2.5mg/ml、30mM L-半胱胺酸 (Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)於室溫培育 90 分 鐘，將hTRA-8 Fullbody之雙硫鍵還原。以凝膠過濾純化（管 柱；GE HEALTHCARE INC.PD-10 脫鹽管柱；HEPES 緩衝液） 去除L-半胱胺酸，獲得雙硫鍵被還原之hTRA-8 Fullbody。 (2 )微脂粒之調製 與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂粒分散 液。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hTRA-8 Fullbody: DSPE-PEG3400-Mal=l: 2(莫 耳比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fullbody( 5mg/ml， 450μ1 )與微脂粒分散液（10mM DPPC, 3 00 μΐ )，使抗體之 硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反 應。未結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對 DSPE-PEG3400-Mal 添力口 10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) lOOmM，3 μΐ 於室溫反應 30 分鐘 -122- 200916477 而不活性化。未反應之hTRA-8 Fullbody，經由凝膠過濾色 層分析（AKTA explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.);管 柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ; HEPES 緩衝液（pH7.4 ) ; 4乞；2 ml/min ;偵測波長 UV2 80nm )分離，分取免疫微脂粒劃分（3 6-4 8 ml之劃分）。 使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量 50,000) 進行超過濾濃縮，獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之 P E G末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之N 〇. 1 9、 抗體濃度23.9 gg/m卜磷脂質濃度3.25mM、抗體密度0.0029 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例2 0】 與實施例1 9之（1 )同樣地，還原hTRA-8 Fullbody之 雙硫鍵。又，與實施例1之（2)同樣地，於使用時調製微 脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fullbody : DSPE-PEG3 400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比 例的方式，混合上述之 hTRA-8 Fullbody ( 5 mg/ml, 180 μΐ) 與微脂粒分散液（10mM DPPC，3 00 μΐ)，使抗體之硫醇基與 微脂粒上之PE G鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗 體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添加1〇 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) l〇〇m M，3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fullbody，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer l〇S( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC., HiLoad -123- 200916477

Superdex 200 16/60 prep grade); HEPES 糸爰衝液(p Η 7.4 )； 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長UV280nm )分離，分取免疫微脂 粒劃分（36-48 ml 之劃分）。使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮’獲得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本免疫微脂粒。 (微脂粒組成：表1之No. 20、抗體濃度65.4 pg/ml、磷脂 質濃度3.07mM、抗體密度0.0085 mol% ( HEPES緩衝液）） 【實施例2 1】 與實施例19之（1 )同樣地，還原hTRA-8 Fullbody之 雙硫鍵。又，與實施例1之（2)同樣地，於使用時調製微 脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fullbody ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 20 (莫耳比）之 比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fullbody ( 5 mg/ml, 45 μΐ ) 與微脂粒分散液（lOmM DPPC，3 00 μΐ )，使抗體之硫醇基與 微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗 體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 0mM，3 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fullbody >經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 1 0 S ( G Ε Η E A LT H C A R E IN C .):管柱（G E Η E A LT H C A R E INC.?HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade) ； HEPES 緩衝 液（pH7.4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV2 8 0nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra -124- 200916477 (MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾濃縮， 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No . 2 1、抗體濃度4 1 . 2 pg/m卜磷脂質濃度3.11mM、抗體密度0.005 3 mol%( HEPES 緩衝液））。 【實施例22】 (1 ) hTRA-8 Fullbody 之硫醇化 於 hTRA-8 Fullbody (抗體濃度 6 mg/ml，20mM HEPES， 150mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)將 4mM Traut 氏試劑（2-亞胺基噻茂院.HC1,Pierce Biotechnology, Inc.)以 hTRA-8 : Traut氏試劑=1 : 4之莫耳比添加，於室溫反應90分鐘。之 後’以凝膠過濾色層分析（管柱；GE HEALTHCARE INC.NAP-5脫鹽管柱；HEPES緩衝液）去除Traut氏試劑， 將hTRA-8 Fullbody之一部份離胺酸殘基之胺基硫醇化。 (2 )微脂粒之調製 與實施例1之（2 )同樣地’於使用時調製微脂粒分散 液。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hTRA-8 Fullbody: DSPE-PEG3400-Mal=l: 15(莫 耳比）之比例的方式，混合上述之hTRA_8 Fullbody( 2 mg/m1， 7 5 μ丨）與微脂粒分散液（1 0 m M D P P C，1 5 0 μ 1 )，使抗體之硫 醇基與微脂粒上之P E G鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未 結合抗體之順丁烯二醯亞胺基’經由對DSPE-PEG3 40〇-Mal 添加10等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical -125- 200916477

Industries，Ltd·) 100mM，1.5 μ丨於室溫反應30分鐘而不活性 化。未反應之hTRA-8 Fullbody，經由凝膠過濾色層分析 (AKTA explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ; HEPES 緩衝液（PH7.4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV280nm)分離，分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。 使用 AmiconUltra(MILLIPOREINC.，劃分分子量 50,000) 進行超過濾濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之 PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No. 22、 抗體濃度70.3 gg/ml、磷脂質濃度1.17mM、抗體密度0.024 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例23】 與實施例22之（1 )同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。又，與實施例1之（2 )同樣 地，於使用時調製微脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程 使成爲 hTRA-8 Fullbody : D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 1.5 (莫耳比）之比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fullbody ( 5 mg/ml, 300μ1)與微脂粒分散液（10mM DPPC，150 μΐ)，使 抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺 基反應。未結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對 DSPE-PEG3400-Mal 添力口 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM，1.5 μΐ 於室溫反應 30 分 鐘而不活性化。未反應之hTRA-8 Fullbody ’經由凝膠過濾 -126- 200916477 色層分析（AKTA explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.); 管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade)； HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min;偵測 波長UV2 80nm)分離，分取免疫微脂粒劃分（36_48 ml之劃 分）。使用 Amicon Ultra ( MILLIPORE INC.，劃分分子量 5 0,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂 粒上之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1 之No.23、抗體濃度184.4 pg/ml、磷脂質濃度1.07mM、抗 體密度 〇 . 〇 6 8 5 m ο 1 °/。（ Η E P E S 緩衝液））。 【實施例24】 與實施例22之（1 )同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。又，與實施例5之（2 )同樣 地於使用時調製微脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fullbody ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 : 45 (莫耳比）之 比例的方式，混合 h 述之 h T R A - 8 F u 11 b o d y ( 5 m g / m 1，1 .1 m 1 ) 與微脂粒分散液（lOmM DPP C, 16.5 ml )，使抗體之硫醇基與 微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗 體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM，165 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fullbody，經由凝膠過濾色層分析(AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade) ； HEPES 緩衝 -127- 200916477 液（pH7.4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV280nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（3 6-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPO RE INC.，劃分分子量50,000)進行超過濾濃縮、 獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合的本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No. 24、抗體濃度166.5 pg/ml，磷脂質濃度 5_25mM、抗體密度 0.0126 mol%( HEPES 緩衝液））。 【實施例25】 與實施例22之（1 )同樣地，硫醇化hTR A-8 Full body 之一部份離胺酸殘基之胺基。又，與實施例5之（2 )同樣 地，於使用時調製微脂粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hTRA-8 Fullbody ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 1.5 (莫耳比）之 比例的方式，混合上述之hTRA-8 Fullbody ( 5 mg/ml, 4ml) 與微脂粒分散液（lOmM DPPC, 1995 μΐ)，使抗體之硫醇基 與微脂粒上之P E G鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合 抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添加 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM，19.95 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hTRA-8 Fullbody，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.)；管柱（GE HEALTHCARE INC.,Hi Load Superdex 200 16/60 prep grade) ； HEPES 緩衝 液（pH7_4); 4°C ; 2ml/min;偵測波長 UV280nm)分離， 分取免疫微脂粒劃分（3 6-4 8 m 1之劃分）。使用Amicon -128- 200916477

Ultra ( MILLIPORE INC.，劃分分子量50,000 )進行超過濾 濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合 的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No. 25、抗體濃度314.5 pg/m卜磷脂質濃度〇.96mM、抗體密度0.131 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例26】 (1 ) hHFE7A Fab’之調製 將參考例-2調製的F( ab’）2溶液（抗體濃度2.5 mg/ml， HEPES 緩衝液）於 10mM L -半胱胺酸（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)存在下，於室溫下培育90分鐘，還原爲 Fab’。經凝膠過濾純化（管柱；GE HEALTHCARE INC .PD· 10 脫鹽管柱；HEPES緩衝液）除去L -半胱胺酸，獲得hHFE7A Fab’片段。 (2 )微脂粒之調製 與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂粒分散 液。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hHFE7A Fab’ ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 : 2 0 (莫 耳比）之比例的方式，混合上述之hHFE7A Fab’（ 1.5 mg/ml， 3 3 μΐ)與微脂粒分散液（lOmM DPPC，180 μΐ)，使抗體之硫 醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未 結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal 添加10等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries,Ltd. )1 0 0mM, 1 ·8 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性 -129- 200916477 化。未反應之hHFE7A Fab’，經由凝膠過濾色層分析（ΑΚΤΑ explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep g r a d e ) ; Η E P E S 緩衝液（p H 7.4 ) ; 4 °C ; 2 m 1 / m i n ;偵測波長 UV2 8 Onm )分離，分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。 使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量 50,000) 進行超過瀘濃縮，獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之 PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No. 26、 抗體濃度47.9 pg/m卜磷脂質濃度2.03mM、抗體密度0.026 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例2 7】 與實施例26之（1 )同樣地，於使用時調製hHFE 7 A Fab’ 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂 粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hHFE 7 A Fab5 ： DSPE-PRG3400-Mal = 1 : 5 (莫耳比）之比佐!1 的方式，混合上述之hHFE7AFab’（1.5 mg/ml，132 μΐ )與 微脂粒分散液（10mM DPPC，180 μΐ)，使抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體 之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10 等量之硫基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

1 0 0mM，1 .8 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hHFE7AFab’，經由凝膠過瀘色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC .)：管柱(GE HEALTHCARE -130- 200916477 INC.,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade) ； HEPES 緩衝 液（ρΗ7·4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV280nm )分離， 分取免疫微脂粒劃分（36-48 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (MILLIPO RE INC·，劃分分子量50,000)進行超過濾濃縮， 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合的 本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.27、抗體濃度115.0 pg/ml、磷脂質濃度 1.54mM、抗體密度 0.0 8 1 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例2 8】 與實施例26之（1 )同樣地，於使用時調製hHFE7A Fab’ 片段。又，與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂 粒分散液。 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hHFE7A Fab，： DSPR-PEG3400-Mal = l ： 2 (莫耳比）之比例 的方式，混合上述之hHFE7AFab’（ 1.5 mg/ml，330 μΐ)與 微脂粒分散液（1 OmM DPPC,1 80 μΐ )，使抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結合抗體 之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3400-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10OmM, 1.8 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反應之 hHFE7A Fab’，經由凝膠過濾色層分析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.)；管柱(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝 液（pH7.4 ) : 4°C : 2 ml/min :偵測波長 UV280nm )分離， -13 1- 200916477 分取免疫微脂粒劃分（3 6-4 8 ml之劃分）。使用Amicon Ultra (1^11^1?011£11'1(：.，劃分分子量50,000)進行超過濾濃縮， 獲得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合的 本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No . 2 8、抗體濃度1 5 1 . 6 Kg/ml、磷脂質濃度 1.60mM、抗體密度 0.103 mol%(HEPES 緩衝液））。 【實施例2 9】 (1) hHFE7A Fullbody 之硫醇化 於 hHFE7A Fullbody (抗體濃度 6 mg/m 1，2 0m Μ ΗEP ES， 150mM NaCl，2mM EDTA, ρΗ8.0)添力口 4mM Traut 氏試劑（2-亞胺基唾茂院.HC1 Pierce Biotechnology，Inc.)，以 hHFE7A ： Traut氏試劑=1 : 4之莫耳比率添加，於室溫反應 90分鐘。之後，以凝膠過濾色層分析（管柱；GE HEALTHCARE INC.，NAP-5脫鹽管柱；HF.PES緩衝液）除去未反應之Traut 氏試劑，硫醇化hHFE7A Fullbody之一部份離胺酸殘基之胺 基。 (2 )微脂粒之調製 與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂粒分散 液。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hHFE7A Fullbody: D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 15 (莫耳比）之比例的方式，混合上述之hHFE7A Fullbody ( 2 mg/ml，75 μΐ)與微月旨粒分散液（10mM DPPC, 150 μΐ)，使 抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯一醯亞胺 -132- 200916477 基反應。未結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對 DSPE-PEG3 400 -Mal添加10等量之锍基乙醇（WakoPure Chemical Industries, Ltd.) lOOmM, 1.5 μΐ 於室溫反應 30 分 鐘而不活性化。未反應之hHFE7A Fullbody，經由凝膠過濾 色層分析（AKTA explorer 1 OS ( GE HE ALTHC ARE INC ·); 管柱(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ； HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min;偵測 波長UV2 8 0nm )分離，分取免疫微脂粒劃分（3 6-48ml之劃 分）。使用 Amicon Ultra ( MILLIPORE INC.劃分分子量 5 0,0 00 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂 粒上之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1 之No.29、抗體濃度48.1 pg/ml、磷脂質濃度1.06mM、抗體 密度 0.0 18 mol% ( HEPES 緩衝液））。 【實施例3 0】 (1 ) hHFE7A Fullbody 之硫醇化 於 hHFE7A Fullbody (抗體濃度 6mg/ml，20mM HEPES,150mM NaCl,2mM EDTA,pH8.0)添力口 4mM Traut 氏 試劑（2 -亞胺基噻茂院.HC1，Pierce Biotechnology, Inc·)， 以hHFE7A : Traut氏試劑=1 : 16之莫耳比率添加，於室溫 反應9 0分鐘。之後，以凝膠過濾色層分析（管柱；G E HEALTHCARE INC.，NAP-5脫鹽管柱；HEPES緩衝液）除去 未反應之Traut氏試劑’硫醇化hHFE7 A Fullbody之一部份 離胺酸殘基之胺基。 (2 )微脂粒之調製 -133- 200916477 與實施例1之（2 )同樣地，於使用時調製微脂粒分散 液。 (3 )抗體之對微脂粒之結合反應 使成爲 hHFE7A Fullbody : D S P E - P E G 3 4 0 0 - M al = 1 ： 15 (莫耳比）之比例的方式，混合上述之hHFE7A Fullbody ( 2 mg/ml，75 μΐ)與微月旨粒分散液（10mM DPPC，150 μΐ)，使 抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺 基反應。未結合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對 DSPE-PEG3 400 -Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wakο Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 0 0 mM, 1.5 μΐ 於室溫反應 30 分 鐘而不活性化。未反應之hHFE7 A Fullbody，經由凝膠過濾 色層分析（AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.); 管柱(GE HEALTHCARE INC.,HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade); HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2 ml/min;偵測 波長UV28 0nm )分離，分取免疫微脂粒劃分（3 6-48 ml之劃 分）。使用 Amicon Ultra ( MILLIPORE INC.，劃分分子量 5 0,000 )進行超過濾濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂 粒上之PEG末端結合的本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1 之No.30、抗體濃度157.6 pg/ml、磷脂質濃度1.3 0mM、抗 體密度0.048 mol% ( HEPES緩衝液））。 【實施例3 1】 與實施例29之（1 )同樣地，硫醇化hHFE7 A Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。又，與實施例1之（2 )同樣 地，於使用時調製微脂粒分散液。 -134- 200916477 抗體之對微脂粒之結合反應，進行以下之工程。使成爲 hHFE7A Fullbody ： D S P E - P E G 3 4 0 0 - M a 1 = 1 ： 1.5 (莫耳比）之 比例的方式，混合上述之hHFE7A Fullbody ( 5 mg/ml，300 μΐ)與微脂粒分散液（10mM DPPC，150 μΐ)，使抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。未結 合抗體之順丁烯二醯亞胺基，經由對DSPE-PEG3 400-Mal添 加 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，

Ltd· ) lOOmM, 1 ·5 μΐ於室溫反應30分鐘而不活性化。未反 應之hHFE7A Fullbody，經由凝膠過濾色層分析（ΑΚΤΑ explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱（GE HEALTHCARE INC.，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ) ; HEPES 緩衝液（ρΗ7·4 ) ; 4°C ; 2 ml/min ;偵測波長 UV2 8 0nm)分離，分取免疫微月旨粒畫!1分（3 6-48 ml之劃分）。 使用 Amicon Ultra( MILLIPORE INC.，劃分分子量 50,000) 進行超過濾濃縮，獲得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之 PEG末端結合的木免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之No.3 1、 抗體濃度227.7 gg/m卜磷脂質濃度0.95mM、抗體密度0.096 mol% ( HEPES 緩衝液））。 實施例1至31所製作的免疫微脂粒之成分組成示於表 -13 5- 200916477 【表1】 實施例編號 蛋白質 脂質組成 抗體密度 (mol%) 1 A DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇o = 100 ： 66 : 1 0.0058 2 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.05 3 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.102 4 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 5 0.224 5 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.040 6 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.167 7 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.064 8 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.055 9 A eggPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.065 10 A eggPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.033 11 A DMPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.065 12 A DMPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.028 13 A DOPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.064 14 A DOPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.037 15 A DSPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.099 16 A DSPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.043 17 A DPPC : Choi : DSPE = 100 : 66 : 5 0.100 18 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.035 19 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.0029 20 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.0085 21 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.0053 22 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.024 23 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.069 24 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.013 25 B DPPC : Choi : DSPK-PKtj34〇o = 1U0 : 66 : 1 0.131 26 c DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.026 27 c DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.081 28 c DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.103 29 D DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.018 30 D DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.048 31 D DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 ： 66 : 1 0.096 A : hTRA-8 Fab’、B : hTRA-8 Fullbody、C : hHFE7A Fab'、D : hHFE7A Fullbody 【實施例3 2】 (1 ) hTRA-8 Fab’之調製 將參考例1調製的hTRA-8 F ( ab· ) 2溶液（抗體濃度5 -13 6- 200916477

mg/ml,PBS)於（±)-二硫蘇糖醇（（±) -Dithiothreitol，以 下標記爲 DTT; Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 4〇mM 存在下’於室溫下培育30分鐘，還原爲Fab’。經凝膠過濾 純化（管柱：GE HEALTHCARE INC.PD-10脫鹽管柱； Eluent: PBS)除去DTT，獲得hTRA-8 Fab’片段。測定此溶 液之抗體之莫耳濃度[Ab]及SH基之莫耳濃度[SH](各爲[Ab] =37_27 μΜ( 2.05 mg/ml)及[SH] = 152.29 μΜ。抗體每一分 子之SH基數（SH力價）可以求得SH力價（硫醇化抗體）= [SH]/[Ab] = 4.09)。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，]^(下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT D S P E - 0 2 0 M A ) 2.7 5 mg ( 942 nmol )與上述之 hTR A - 8 Fab， 12.96 mg( 235.6 nmol)於PBS中混合，室溫下培育1小時， 使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與 抗體未反應的順丁烯二醯亞胺基，相對DSPE-PEG2000-Mal 添力口 10 等量之 |荒基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, L t d . ) 9.4 2 μ m ο 1於室溫反應3 0分鐘而不活性化。使用A m i c ο η Ultra ( MILLIPORE INC·，劃分分子量1 〇,〇〇〇 )進行超過濾濃 縮，除去锍基乙醇，獲得抗體上之半胱胺酸殘基與 DSPE-PEG2000結合的本PEG脂質修飾抗體（粗製物）。生 -137- 200916477 成的DSPE-PEG2 000修飾hTRA-8 Fab’，因形成作爲高次構 造之膠粒（micelle)，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統： AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.)、管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.)； PBS ( pH7.4 ) ； 4°C; l_2ml/min;偵測波長：280 nm)中， 與hTRA-8 Fab’之高峰劃分（ 74-98ml)相異，而溶出更高分 子量側之劃分（41-59 ml之劃分）。分取此等，由未反應之 hTRA-8 Fab’獲得分離純化之@的DSPE-PEG2000修飾抗體 (表2之No.32,抗體重量4.87mg、平均PEG結合個數3.90 本）。經由陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液A : 50mM檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl，pH4.5 ; 梯度：B 0—1 00% ( 20CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ;溫度： 4°C ;偵測波長：2 80 nm )分析，因相對hTRA-8 Fab’於2.9 分鐘被溶出，本修飾抗體於4.4分鐘溶出。 (3 )結合抗體之疏水性分子之定量 抗體每一分子上結合的疏水性分子之數目（平均），如 下所述，由疏水性分子反應前之抗體上之SH基之數目，減 去疏水性分子結合於抗體上之SH基之殘存數目而決定。 先前之凝膠過濾色層分析純化中，以4 1 -59 ml之劃分 (脂質修飾抗體劃分）與74-9 8 ml之劃分（未修飾抗體劃分） 之色圖求得面積値（各表記爲面積（經修飾抗體）、面積（未修飾 抗體））。又’於各別41-59 ml之劃分（脂質修飾抗體劃分）與 -138- 200916477 74-9 8 ml之劃分（未修飾抗體劃分）中，測定抗體濃度[Ab] 及SH基濃度[SH]，算出抗體每一分子之SH基數（SH力價） (脂質修飾抗體劃分：[Ab] = 55.64 μΜ( 3.06 mg/ml)、[SH] =19.13 μΜ。SH力價（經修飾抗體）=0.34。未修飾抗體劃分： [Ab] = 16.36 μΜ( 0.90 mg/ml)、[SH] =6.84 μΜ。SH 力價（未 修飾抗體）=0.4 2 )。結合抗體之疏水性分子之量，作爲抗體 每一分子之疏水性分子數（平均），由下式決定。 「抗體每一分子之疏水性分子數（平均）」= {SH力價（硫醇化抗體）x(面積（經修飾抗體）+面積（未 修飾抗體））-(S Η力價（經修飾抗體）X面積（經修飾抗體））-(S Η力價（未修飾抗體）X面積（未修飾抗體））} /面積（經 修飾抗體） = 3.90 【實施例3 3】 (1) hTRA-8 Fullbody 之硫醇化 於 h T R A - 8 F u 11 b 〇 d y (抗體濃度 3，8 1 m g / m 1，2 0 m Μ 磷酸 鹽緩衝液，150mM NaCl，ImM DTPA，ρΗ8·0)添加 4mM Traut 氏試劑（2-亞胺基噻茂烷.HC1，Pierce Biotechnology，Inc.)， 以hTRA-8 Fullbody : Traut氏試劑=1 : 4之莫耳比添加，於 室溫反應90分鐘，硫醇化hTRA-8 Fullbody之一部份離胺 酸殘基之胺基。之後，使用凝膠過濾色層分析（管柱：GE HEALTHCARE IN C.NAP-5 脫鹽管柱）於 PBS 溶出’除去 Traut 氏試劑，分取抗體劃分。測定此溶液中抗體之莫耳濃度[Ab] 及 SH 基之莫耳濃度[SH](各爲[Ab] = 1 2.27 μΜ( 1 .84 mg/ml ) -139- 200916477 及[SH] = 8.79 μ Μ。抗體每一分子之SH基數（SH力價）爲 SH力價（硫醇化抗體）=[SH]/[Ab] = 0.72)。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（P〇iy (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine,以下表記爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF C O RP 0 R AT I ON , S UN B RIG Η T DSPE-020MA ) 3 3 6 · 6 pg ( 1 1 5.2 nmo 1 )與上述之 hTRA-8 Fullbody 17.28 mg ( 115_2 nmol)於 PBS 中混合，於室溫下 培育1小時，使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞 胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，添加相對於 DSPE-PEG2000-Mal 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.152 μιποί 於室溫反應 30 分鐘 而不活性化。游離之PEG-DS PE，由陽離子交換色層分析（管 柱：RESOURCE S5 1 mL ( GE HF'ALTHC ARF, INC.);洗析液 A : 20% CH3CN，50mM檸檬酸鹽緩衝液，ρΗ4·5 ;洗析液B : 2 0% CH3CN,5 0mM 檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl，ρΗ4.5 ;梯 度：Β 0-1 00% ( 20CV ) ; 4°C ; 1 .6ml/min ；偵測波長 2 80 nm ) 分離，分取PEG脂質修飾抗體（粗製物）劃分（8-12 ml之 劃分）。生成之 DSPE-PEG2000 修飾 hTRA-8 Fullbody，因形 成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統： AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·)，管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.)； -140- 200916477 PBS( pH7.4); 4°C; 1.2ml/min;偵測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（ 56-74ml)相異，而於更高分子量側 之劃分（41-56ml之劃分）溶出。將此等分取，獲得自未反 應之hTRA-8 Fullbody分離純化之目的DSPE-PEG2000修飾 抗體（表2之No.33，抗體重量130 pg、平均PEG結合個數 1·〇7個）。以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液A: 5 OmM檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl,pH4.5; 梯度：B 0—100% ( 20CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ;溫度： 4°C ;偵測波長：280 nm)分析，相對於hTRA-8 Fullbody 於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於4.0分鐘溶出。 (3 )結合於抗體之疏水性分子之定量 抗體每一分子結合的疏水性分子之數目（平均），如下 所述，由疏水性分子反應前之抗體上之SH基之數目，減去 疏水性分子結合於抗體上之S Η基之殘存數目而決定。 先前之凝膠過濾色層分析純化中，以41-56 ml之劃分 (脂質修飾抗體劃分）與56-74 ml之劃分（未修飾抗體劃分） 之色圖求得面積値（各表記爲面積（經修飾抗體）、面積（未 修飾抗體））。又，各41-56 ml之劃分（脂質修飾抗體劃分） 與5 6-74ml之劃分（未修飾抗體劃分）中，測定抗體濃度[Ab] 及SH基濃度[SH]，算出抗體每一分子之SH基數（SH力價） (脂質修飾抗體劃分：[Ab] = 3.47 μΜ ( 0·52 mg/ml)、[SH] =2.95 μΜ。SH力價（經修飾抗體）=0.85。未修飾抗體劃分： 200916477 [Ab] = 14·73μ M( 2.21 mg/ml)' [SH] = 4.78 μΜ。SH 力價（未 修飾抗體）=0.32)。抗體上結合的疏水性分子之量，作爲抗 體每一分子之疏水性分子數（平均），由下式決定。 「抗體每一分子之疏水性分子數（平均）」= {SH力價（硫醇化抗體）χ(面積（經修飾抗體）+面積（未 修飾抗體））-(SH力價（經修飾抗體）X 面積（經修飾抗體）） -(SH力價（未修飾抗體）X面積（未修飾抗體））}/面積（經 修飾抗體）=1 . 〇 7 【實施例3 4】 (1 ) hTRA-8 Fullbody 之硫醇化 於 hTRA-8 Fullbody (抗體濃度 3.82 mg/ml, 20mM 磷酸 鹽緩衝液，150mM NaCl，lmM DTPA，pH8.0)添加 4mM Traut 氏試劑（2 -亞胺基噻茂院.HC1, Pierce Biotechnology,

Inc.)，以hTRA-8 : Traut氏試劑=1 : l〇之莫耳比，室溫下 反應90分鐘，硫醇化hTRA-8 Fullbody之一部份離胺酸殘 基之胺基。之後，使用凝膠過濾色層分析（管柱：GE HEALTHCARE INC.NAP-5 脫鹽管柱）於 PBS 溶出，除去 Traut 氏試劑，分取抗體劃分。測定此溶液中抗體之莫耳濃度[Ab] 及SH基之莫耳濃度[SH](各爲[Ab] = 11.80μΜ(1.77 mg/ml )及[SH] =18.37 μΜ。抗體每一分子之SH基數（SH 力價）求得SH力價（硫醇化抗體）=[SH]/[Ab] =1 .56 )。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly -142- 200916477 (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT DSPE-020M A ) 7 1 5.3 μ g ( 2 4 4.8 n m o 1 )與 hTRA-8 Fullbody 9.18 mg( 6 1.2 nmol )於PBS中混合，使抗體之硫醇基與PEG 鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二 醯亞胺基，添加相對於DSPE-PEG2000-Mal爲10等量之锍 基乙酉享(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2.44 8 μmo 1 於室溫反應30分鐘而不活性化。游離之PEG-DSPE，由陽離 子交換色層分析（管柱：RESOURCE S，lmL(GE HEALTHCARE INC.);洗析液 A : 20% CH3CN, 50mM 檸檬酸 鹽緩衝液，PH4.5 ;洗析液B : 20% CH3CN，50mM檸檬酸鹽 緩衝液，1 M NaCl，pH4.5 ;梯度：B 0-100% (20CV); 4 °C ； 1.6 m Ι/min ;偵測波長2 8 0 nm)分離，分取PEG脂質修飾抗 體（粗製物）劃分（8-13 ml之劃分）。生成的DSPE-PEG2000 修飾hTRA-8 Fullbody，因形成作爲高次構造之膠粒，於凝 膠過濾色層分析（FPLC系統：AKTA Explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.)，管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.) ； PBS ( pH7.4) ; 4 〇C ; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fullbody 之高 峰劃分（56-74ml )相異，而於更高分子量側之劃分（41-56 ml之劃分）溶出。分取此等，獲得自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化之目的DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之 No.34，抗體重量1.552mg、平均PEG結合個數2.14個）。 -143- 200916477 於陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.)；管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.)；洗析液A: 50mM檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl，pH4.5; 梯度：B 0 — 1 0 0 % ( 2 0 C V，線性梯度）；1 · 6 m 1 /m i η ;溫度： 4°C ;偵測波長：2 8 0 nm)分析，相對於hTRA-8 Fullbody 於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於4.1分鐘溶出。 (3 )結合抗體之疏水性分子之定量 抗體每一分子上結合的疏水性分子之數目（平均），如 下所述，由疏水性分子反應前之抗體上之S Η基之數目，減 去疏水性分子結合於抗體上之SH基之殘存數目而決定。 先前之凝膠過濾色層分析純化中，求得4 1 -5 6 ml之劃分 (脂質修飾抗體劃分）與5 6-74ml之劃分（未修飾抗體劃分） 之色圖中的面積値（各表記爲面積（經修飾抗體）、面積（未 修飾抗體））。又，各於41-56ml之劃分（脂質修飾抗體劃分） 與56-74 ml之劃分（未修飾抗體劃分），測定抗體濃度[Ab] 及SH基濃度[SH]，算出抗體每一分子之SH基數（SH力價）’ (脂質修飾抗體劃分：[Ab] = 10·67 μΜ( 1.60 mg/ml)、[SH] =5.83 μΜ。SH力價（經修飾抗體）=0.55。未修飾抗體劃分： [Ab] = 17.53 μΜ( 2.63 mg/ml)、[SH] = 7.05 μΜ。SH 力價（未 修飾抗體）=0.4 0 )。抗體上結合的疏水性分子之暈，作爲抗 體每一分子之疏水性分子數（平均），如下式決定。 「抗體每一分子之疏水性分子數（平均）」= {SH力價（硫醇化抗體）χ(面積（經修飾抗體）+面積（未 -144- 200916477 修飾抗體））-(S Η力價（經修飾抗體）X 面積（經修飾抗體）） -(SH力價（未修飾抗體）X面積（未修飾抗體））} /面積（經 修飾抗體） = 2.14 【實施例3 5】 (1 ) hTRA-8 Fullbody 之硫醇化 於 hTRA-8 Fullbody (抗體濃度 4.11 mg/ml，20mM 磷酸 鹽緩衝液，150mM NaCl，ImM DTPA，ρΗ8·0)添加 4mM Traut 氏試劑（2 -亞胺基噻茂院.HC1，Pierce Biotechnology, Inc.)， 以hTRA-8 : Traut氏試劑=1 : 25之莫耳比添力卩，室溫下反 應90分鐘，硫醇化hTRA-8 Fullbody之一部份離胺酸殘基 之胺基。之後，使用凝膠過濾色層分析（管柱：GE HEALTHCARE IN C.NAP-5 脫鹽管柱）於 PBS 溶出，除去 Traut 氏試劑，分取抗體劃分。測定此溶液中抗體之莫耳濃度[Ab] 及 SH 基之莫耳濃度[SH](各爲[Ab] = 10.47 μΜ( l_57mg/ml) 及[SH] = 42:7 5 μ.Μ。抗體每一分子之SH基數（SH力價）求 得SH力價（硫醇化抗體）=[SH]/[Ab] = 4.08)。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表記爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF C 0 R P O R AT I Ο N , S UN B RIG Η T DSPE-020MA)1.525 mg( 522 nmol)與 hTRA-8 Fullbody 6.28 200916477 mg(41.9nm〇l)於PBS中混合，使抗體之硫醇基與PEG鏈 末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯 亞胺基，相對於DSPE-PEG2〇00-Mal添加10等量之锍基乙 酉享(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5.22 μηιοί 於室溫 反應30分鐘而不活性化。使用AmiconUltra(MILLIPORE INC.，劃分分子量1 0,000 )進行超過濾濃縮，去除锍基乙醇， 獲得抗體上之離胺酸殘基與DSPE-PEG2000結合的本PEG 脂質修飾抗體（粗製物）。生成之DSPE-PEG2000修飾hTRA-8 Ful lb 〇 dy，因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分 析（FPLC 系統：AKTA Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.) 1 管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ； PB S ( pH7 · 4 ) ; 4 °C ; 1 · 2 ml/min ;偵 孭!!波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fullbody 之高峰劃分（56-74ml) 相異，而於更高分子量側之劃分（4 1 -56 ml之劃分）溶出。 分取此等，由未反應之hTRA-8 Fullbody獲得經分離純化之 目的08?£-?£02000修飾抗體（表2之1^〇.35，抗體重量230.4 、平均PEG結合個數4.25個）。以陽離子交換色層分析 (FPLC 系統：AKTA explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.); 洗析液A : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，pH4.5 ;洗析液B : 50mM 檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl, pH4.5 ;梯度：B 0 —100%( 20CV， 線性梯度）：1 .6 ml/min ;溫度：4°C ;偵測波長：2 8 0 nm ) 分析，相對於hTRA-8 Fullbody於3.7分鐘溶出，本修飾抗 體於3 . 8分鐘溶出。 -146- 200916477 (3 )抗體上結合的疏水性分子之定量 抗體每一分子結合的疏水性分子之數目（平均），如下 所述，由疏水性分子反應前之抗體上之SH基之數目、減去 疏水性分子結合於抗體上之SH基之殘存數目而決定。 先前之凝膠過濾色層分析純化中，4 1 -5 6 ml之劃分（脂 質修飾抗體劃分）與5 6-74ml之劃分（未修飾抗體劃分）之 色圖求得面積値（各表記爲面積（經修飾抗體）、面積（未修 飾抗體））。又，各於4 1 - 5 6 m 1之劃分（脂質修飾抗體劃分） 與56-74 ml之劃分（未修飾抗體劃分），測定抗體濃度[Ab] 及SH基濃度[SH]，算出抗體每一分子之SH基數（SH力價） (脂質修飾抗體劃分：[Ab] = 4.80 μΜ ( 0.72 mg/ml )、[SH] =3_87 μΜ、SH力價（經修飾抗體）=0·81、未修飾抗體劃分： [Ab] = 2.13 μΜ( 0.32 mg/ml)、[SH] = 1.06 μΜ、SH 力價（未 修飾抗體）=0 · 5 0 )。抗體上結合的疏水性分子之量，作爲抗 體每一分子之疏水性分子數目（平均），以如下式決定。 「抗體每一分子之疏水性分子數（平均）」= { S Η力價（硫醇化抗體）X (面積（經修飾抗體）+面積（未 修飾抗體））-(S Η力價（經修飾抗體）X 面積（經修飾抗體）） -(SH力價（未修飾抗體）X面積（未修飾抗體））} /面積（經 修飾抗體） =4.25 【實施例3 6】 (1 ) hTRA-8 Fullbody之雙硫鍵之還原 將hTRA-8，以抗體濃度2.5 mg/ml、30mM L-半胱胺酸 -147- 200916477 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)於室溫下培育 90 分鐘’還原hTRA-8 Fullbody之雙硫鍵。使用凝膠過濾色層 分析（管柱：GE HEALTHCARE INC.PD-10脫鹽管柱），於 PBS溶出，除去L-半胱胺酸，獲得雙硫鍵被還原的hTRA-8 Fullbody。測定此溶液中抗體之莫耳濃度[Ab]及SH基之莫 耳濃度[SH](各爲[Ab] = 7.27 μΜ ( 1_09 mg/ml)及[SH]= 39.71 μΜ。抗體每一分子之SH基數（SH力價）求得SH力 價（硫醇化抗體）=[SH]/[Ab] =5.46)。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol )

succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表言己爲 D SPE-PEG2000-Mal ； NOF CORPORATION,^ SUN BRIGHT DSPE-02 0MA ) 4 7 1.4 μ g ( 1 6 1. 3 nm o 1 )與 h TR A - 8 Fu 11 b o d y 2.4 2 mg( 16.1 nmol )於PBS中混合，使抗體之硫醇基與PEG 鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二 醯亞胺基，相對於DSPE-PEG2000-Mal添加10等量之锍基 乙酉享(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 1.613 μιηοΐ 於 室溫反應30分鐘而不活性化。使用Ami con Ultra (MILL IPORE INC.，劃分分子量1 〇, 000 )進行超過濾濃縮， 去除锍基乙醇，獲得抗體上之半胱胺酸殘基與 DSPE-PEG2000結合之本PEG月旨質修飾抗體（粗製物）。生 成的DSPE-PEG2000修飾hTRA-8 Fullbody，因形成作爲高 -148- 200916477 次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統：ΑΚΤΑ Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.),管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.)； PBS ( pH7.4) ； 4°C; 1.2ml/min;偵測波長：280 nm)中， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（56-74ml )相異，而於更高 分子量側之劃分（41-53 ml之劃分）溶出。分取此等，自未 反應之hTRA-8 Fullbody分離純化獲得目的之 DSPE-PEG2000 fifftiitP(^ Νο.36-ίτ[|ΙΜ* 72.7 μ§> 平均PEG結合個數10.7個）。於陽離子交換色層分析（FPLC 系統：AKTA explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.);管柱： Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液 A: 50mM 檸檬酸鹽緩衝液，PH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl，pH4_5 ;梯度：B 0—100% ( 20CV，線性梯度）；1.6 m 1 / m i η ;溫度：4 °C ;偵測波長：2 8 0 n m )分析，相對h T R A - 8 Fullbody於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於4.0分鐘溶出。 (3 )結合抗體之疏水性分子之定量 結合抗體每一分子之疏水性分子之數目（平均），如下 所述，由疏水性分子反應前之抗體上之SH基之數目、減去 疏水性分子結合於抗體上之S Η基之殘存數目而決定。 先前之凝膠過濾色層分析純化中，以4 1 -53 ml之劃分 (脂質修飾抗體劃分）與5 6- 74ml之劃分（未修飾抗體劃分） 之色圖求得面積値（各表記爲面積（經修飾抗體）、面積 (未修飾抗體））。又，各於41-5 3 ml之劃分（脂質修飾抗體 劃分）與5 6-74ml之劃分（未修飾抗體劃分），測定抗體濃 -149- 200916477

度[Ab]及SH基濃度[SH]，算出抗體每一分子之SH基數（SH 力價）（脂質修飾抗體劃分：[Ab] = 2. 1 3 μΜ ( 0.32 mg/ml )、 [SH] = 1.〇8μΜ、SH力價（經修飾抗體）=〇·51、未修飾抗體 劃分：[Ab] = 3.73 μΜ ( 0.56 mg/ml)、[SH] = 1.90 μΜ; SH 力價（未修飾抗體）=0 ·5 1 )。抗體上結合的疏水性分子之量， 作爲抗體每一分子之疏水性分子數（平均），由下式決定。 「抗體每一分子之疏水性分子數（平均）」= {SH力價（硫醇化抗體）χ(面積（經修飾抗體）+面積（未 修飾抗體））-(S Η力價（經修飾抗體）X 面積（經修飾抗體）） •(SH力價（未修飾抗體）X面積（未修飾抗體））} /面積（經 修飾抗體） =10.79 【實施例3 7】 與實施例32之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（P〇iy (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表記爲 DSPE-PHG2000-Mal ： NOF CORPORATION, SUNB RIGHT DSPE-020MA ) 1.17 mg ( 402 nmol )與上述之 hTRA-8 Fab’ 2 2.1 mg ( 402 nmol)於 PBS ( 20mM Phospate，1 5 0 m Μ N aC 1, PH7.4 )中混合，於室溫下培育1小時，使抗體之硫醇基與 200916477 PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁 烯二醯亞胺基，相對於DSPE-PEG2000-Mal添加10等量之 Μ 基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4 μιηοΐ， 經由於室溫反應3 0分鐘而不活性化。生成的d S P E - P E G 2 0 0 0 修飾hTRA-8 Fab’ ’因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過 濾色層分析（FPLC 系統：AKTA Explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.)，管柱：HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ; PBS (pH7.4)； 4°C ； 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fab’之高峰劃 分（ 75-99ml)相異，而於更高分子量側之劃分（42-51 ml 之劃分）溶出。分取此等，自未反應之hTRA-8 Fab’分離純 化獲得目的之DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.37，抗 體重量2917pg)。以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液 A : 50mM 檸檬酸鹽緩 衝液，pH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl, pH4.5 ;梯度：B 0—100% ( 20CV，線性梯度）；1.6 ml/min ; 溫度：4°C ;偵測波長：280 nm)分析’相對於TRA-8 Fab’ 爲2.9分鐘溶出’本修飾抗體於4.4分鐘溶出。 【實施例3 8】 與實施例3 2之（1 )同樣地’於使用時調製h TR A - 8 F ab ’ 片段。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約1 0000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 200916477 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（p0ly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表記爲 DSPE-PEG 1 0000-Mal ； Laysan Bio I n c , D S P E - P E G - M A L -1 0 K ) 5.63mg( 402nmol)與上述之 hTRA-8 Fab，22.1mg( 402nmol) 於PBS中混合，於室溫培育1小時，使抗體之硫醇基與PEG 鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二 醯亞胺基，相對於DSPE-PEG10000_Mal添加10等量之锍基 乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 4μιηο1，經由於 室溫反應3 0分鐘，而不活性化。生成的D S P E - P E G 1 0 0 0 0修 飾hTRA-8 Fab’，因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾 色層分析（FPLC 系統：AKTA Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.) > 管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.) ； PBS ( pH7.4 ) ； 4 °C ； 1 .2 ml/min ;偵測波長：28 0nm )，與 hTRA-8 Fab’ 之高峰劃 分（75 -99ml )相異，而於更高分子量側之劃分（42-51 ml 之劃分）溶出。分取此等，自未反應之hTRA-8 Fab’分離純 化獲得目的之DSPE-PEG10000修飾抗體（表2之Νο·38,抗 體重量2167pg)。以陽離子交換色層分析（FPLC系統：ΑΚΤΑ explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·):管柱：Resource S 1 m 1 ( G E Η E A LT H C A R E IN C ·);洗析液 A : 5 0 m M 檸檬酸鹽緩 衝液，ρΗ4·5;洗析液B: 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl， pH4_5 ;梯度：B 0—1 00% ( 20CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ; 溫度：4 °C ;偵測波長：2 8 0 n m )分析’相對於h T R Λ - 8 F a b ’ -152- 200916477 爲2.9分鐘溶出，本修飾抗體於2.7分鐘溶出。 【實施例3 9】 與實施例32之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺（P〇ly (ethylene glycol ) succinyldipalmitoylphosphatidylethanolamine，以下表記爲 DPPE-PEG200 0-Mal ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT PP-020MA) 54.7 μξ ( 19 nmol )與上述之 hTR A-8 Fab，1.05 mg (1 9 nm o 1 )於P B S中混合，室溫下培育1小時，使抗體之 硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反 應之順丁烯二醯亞胺基，相對於DPPE-PEG2000-Mal添加10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 190 nmol，經甶於室溫反應3 0分鐘，而不活性化。生成的 DPPE-PEG2000修飾hTRA-8 Fab’，因形成作爲高次構造之 膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統：AKTA Explorer 10S (GE HEALTHCARE INC.) > 管柱：H i L o ad S u p e r d e x 2 0 0 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC·); PBS ( pH7.4); 4°C ; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fab’之高 峰劃分（75-99ml )相異，而於更高分子量側之劃分（42-51 ml之劃分）溶出。分取此等，自未反應之hTRA-8 Fab’分離 純化獲得目的之DPPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.39, 200916477 抗體重量102pg)。以陽離子交換色層分析（FPLC系統：ΑΚΤΑ explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·);管柱：Resource S 1 ml(GE HEALTHCARE INC.);洗析液 A: 50mM 檸檬酸鹽緩 衝液，p Η 4.5 ;洗析液B : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液，1 Μ N a C 1, pH4.5;梯度：B 0 —100%(20CV，線性梯度）；1.6 ml/min; 溫度：4°C ;偵測波長：280 nm)分析’相對於hTRA-8 Fab’ 爲2.9分鐘，本修飾抗體於4.1分鐘溶出。 【實施例4 0】 與實施例32之（1)同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約5000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇膽固醇（poly ( ethylene glycol) cholesterol，以下表記爲 Chol-PEG5 000-Mal: NOF CORPORATION,SUNBRIGHT C S - 0 5 0 M A ) 1 0 3.6 19 nmol) 與上述之 hTRA-- 8 Fab’ 1.05 mg ( 19 nmol)於 PBS 中混合’ 於室溫下培育1小時’使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁 烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相 對於Chol-PEG5000-Mal添加10等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 190 nmol 於室溫反應 30 分鐘而 不活件化。生成的Choi-PEG 5 000修飾hTRA-8 Fab’ ’因形 成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統： AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.)，管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.)； -154- 200916477 PBS ( ρΗ7·4) ; 4〇C ; 1.2 ml/min ;偵測波長：280 nm )，與 hTRA-8 Fab’之高峰劃分（ 75-99ml)相異，而於更高分子量 側之劃分（4 2 - 5 1 ml之劃分）溶出。分取此等’自未反應之 hTRA-8 Fab，分離純化獲得目的之Chol-PEG5000修飾抗體 (表2之No.40，抗體重量57pg)。 【實施例4 1】 (1 ) hTRA-8 Fullbody 之硫醇化 於 hTRA-8 Fullbody (抗體濃度 3 mg/ml，20mM 磷酸鹽 緩衝液，150mM NaCl，lmM DTPA，pH8.0)’ 將 4mM Traut 氏 試劑（2-亞胺基唾茂烷.HC1, Pierce Biotechnology, inc_)以 hTRA-8 Fullbody ： Traut氏試劑=1 : 4之莫耳比添加，室溫 下反應90分鐘，硫醇化hTRA-8 Fullbody之一部份離胺酸 殘基之胺基。之後，使用凝膠過濾色層分析（管柱：GE HEALTHCARE INC .NAP-5脫鹽管柱）於PBS中使溶出，除 去Traut氏試劑，分取抗體劃分。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約1 0000之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表 ΐ己爲 DSPE-PEG 1 0000-Mal ； Laysan Bio Inc, DSPE-PEG-MAL-10K)104.9 pg( 7.4 nmol)與上述之 hTRA_8 Fullbody 1.092 mg ( 7.3 nmol)於 PBS 中混合，於室溫下培 育1小時，使抗體之硫醇基與PEG鏈未端之順丁烯二醯亞胺 -155- 200916477 基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，對 DSPE-PEG 1 0000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 74 nmol 於室溫反應 30 分鐘而不 活性化。生成的 DSPE-PEG10000 修飾 hTRA-8 Fullbody，因 形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（F P L C系 統· AKTA Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.); PBS( pH7.4); 4°C; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（57-75ml)相異，而於更高 分子量側之劃分（42-5 1 ml之劃分）溶出。分取此等，自未 反應之hTRA-8 Fullbody分離純化獲得目的之 DSPE-PEG10000修飾抗體（表2之No.41，抗體重量85μ§)。 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.)；管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.)；洗析液A : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液， ρΗ4·5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 Μ N a C 1，Ρ Η 4 _ 5 ; 梯度：B 0 — 1 0 0 % ( 2 0 C V，線性梯度）；1 · 6 m 1 / m i n ;溫度： 4°C ;偵測波長：280 nm)分析，相對於hTRA-8 Fullbody 於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於3 . 3分鐘溶出。 【實施例42】 與實施例41之（1)同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約2000之聚乙二醇之末端具有順丁嫌二醯亞 -156- 200916477 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldipalmitoylphosphatidylethanolamine，以下表言己爲 DPPE-PEG2000-Mal ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT PP-020MA ) 2 1 .6 ( 7.5 nmol )與上述之 h T R A - 8 F u 11 b o d y 1.092 mg( 7.3 nmol)於PBS中混合，於室溫下培育1小時， 使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與 抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DPPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 75 nmol 於室溫反應 30 分鐘而不 活性化。生成的 DPPE-PEG2000 修飾 hTRA-8 Fullbody，因 形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系 統：AKTA Explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE IN C _ ) ; P B S ( p H 7 · 4 ) ; 4 °C ; 1 · 2 m 1 / m i n ;偵測波長：2 8 0 n m )， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（5 7-7 5ml )相異，而於更高 分子量側之劃分（42-5 1 ml之劃分）溶出。分取此等，自未 反應之hTRA-8 Fullbody經分離純化獲得目的之 DPPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.42,抗體重量1 14μβ ) ° 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S(GE HEALTHCARE INC.)；管柱：Resource S 1 ml (GE HEALTHCARE INC.)；洗析液A : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl，pH4.5; 梯度：B 0 —1 00% ( 20CV，線性梯度）；1.6 ml/min ;溫度： -157- 200916477 4 °C ;偵測波長：2 8 0 n m )分析’相對於h T R A - 8 F u 11 b 〇 d y 於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於4.1分鐘溶出。 【實施例43】 與實施例41之（1)同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約5 000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇膽固醇（P〇ly ( ethylene glycol) cholesterol，以下表記爲 Chol-PEG5000-Mal; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT CS-050MA) 40.8 8 pg ( 7.5 nmol)與上述之 hTRA-8 Fullbody 1.092 mg ( 7_3 nmol)於 PBS中混合，於室溫下培育1小時，使抗體之硫醇基與PEG 鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二 醯亞胺基，相對於Chol-PEG5 000-Mal添加10等量之锍基乙 醇(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 75 nmol 於室溫 反應30分鐘而不活性化。生成的Choi-PEG 5 000修飾hTRA-8 Fullbody，因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分 析（FPLC 系統：AKTA Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC·)，管柱：HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ； PBS (pH7.4); 4°C ; 1.2 ml/min;偵 測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fullbody 之高峰劃分（57-75ml) 相異，而於更高分子量側之劃分（42-5 1 ml之劃分）溶出。 分取此等，自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化獲得目的 之<：11〇1-?£〇5000修飾抗體（表2之>1〇.43，抗體重量1(^§)。 -158- 200916477 【實施例44】 與實施例41之（1 )同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表記爲 DSPE-PEG2000 -Mal ； N 0 F C 0 R P 0 R AT I Ο N，S UN B RIG Η T DSPE-02 0MA ) 1 2.4 pg( 4.2 nmol )與上述之 hTRA-8 Fullbody 663 pg (4.4 nmol)於PBS中混合，於室溫下培育1小時， 使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與 抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako P ure Chemical Industries, Ltd.) 42 nmol 於室溫反應 30 分鐘而不 活性化"生成的D S P E - P E G 2 0 0 0修飾h T R A - 8 F u U b o d y，因 形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系 統：AKTA Explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC_); PBS( pH7_4); 4°C; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（57-75ml)相異’而於更高 分子量側之劃分（4 2 - 5 1 m 1之劃分）溶出。分取此等’獲得 自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化的目的 DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.44，抗體重量49pg)。 -159- 200916477 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：ΑΚ ΤΑ explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液A : 50mM檸檬酸鹽緩衝液， ρΗ4·5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl，pH4.5; 梯度：B 0— 1 00% ( 20CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ;溫度： 4°C ;偵測波長：280 nm)分析’相對於hTRA-8 Fullbody 於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於4.1分鐘溶出。 【實施例4 5】 與實施例41之（1)同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約3 400之聚乙二醇之末端具有順丁烯二醯亞 胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表言己爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF C O R P O R AT I ON, S UN B RI G Η T DSPE-034MA) 3 44.5 μ% ( 79.2 nmol )與上述之 hTRA-8 Fullbody 11·88 mg ( 79.2 nmol)於 PBS 中混合，於室溫下

培育1小時、使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞 胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，添加相對 DSPE-PEG3400-Mal 爲 1〇 等量之锍基乙醇（WakoPure Chemical Industries, Ltd. ) 792 nmol 於室溫反應 30 分鐘而 不活性化。生成的 DSPE-PEG3 400 修飾 hTRA-8 Fullbody， 因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPL C -160- 200916477 系統：ΑΚΤΑ Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ; PBS ( pH7.4 ) ; 4°C ; 1 .2 ml/min ;偵測波長：2 8 0 nm )， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（57-75ml)相異，而於更高 分子量側之劃分（42-5 1 ml之劃分）溶出。分取此等，獲得 自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化之目的 DSPE-PEG3400修飾抗體（表2之No.45,抗體重量2587μ§)。 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.);管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.)；洗析液A : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液， ρΗ4·5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl，pH4.5; 梯度：B 0 -> 1 0 0 % ( 2 0 C V，線性梯度）；1 _ 6 m 1 / m i η ;溫度：4 °C ; 偵測波長：2 80nm)分析，相對於hTRA-8 Fullbody於3.7 分鐘溶出，本修飾抗體於4.1分鐘溶出。 【實施例46】 與實施例41之（1 )同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約5000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（P〇iy (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表記爲 DSPE-PEG5 000-Mal ； NOF C O R P O R AT I Ο N , S UN B RI G Η T DSPE-050 Μ A)47.8 μ g( 7.9 nmol)與上述之 hTRA-8 Fullbody 200916477 0.6 mg ( 4 nmol )於PBS中混合，於室溫下培育1小時，使 抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗 體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於DSPE-PEG5 000-Mal 添力[]10 等量之疏基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) 80 nmol於室溫反應30分鐘而不活性化。生成的 DSPE-PEG5000修飾hTRA-8 Fullbody，因形成作爲高次構造 之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系統：AKTA Explorer 10S ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱：HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade( GE HEALTHCARE INC.); PBS ( ρΗ7·4); 4°C ； 1 .2 ml/min ；偵測波長：280 nm)，與 hTRA-8 Fullbody 之高峰劃分（56-7 lml )相異，而於更高分子量側之劃分 (41-5 0 ml之劃分）溶出。分取此等，獲得自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化之目的DSPE-PEG5 000修飾抗體（表2之 No_46，抗體重量71pg)。以陽離子交換色層分析（FPLC系 統：AKTA explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.);管柱： Resource S 1 m 1 ( G E Η E A LT H C A R E IN C .);洗析液 A : 5 0 m Μ 檸檬酸鹽緩衝液，PH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液， 1 Μ N a C 1，p Η 4.5 ;梯度：B 0 — 1 0 0 % ( 2 0 C V，線性梯度）； 1_6 ml/min ;溫度：4°C ;偵測波長：280 nm)分析，相對於 hTRA-8 Fullbody於3.7分鐘溶出，本修飾抗體於3.7分鐘溶 出。 【實施例47】 與實施例41之（1)同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 -162- 200916477 抗體與PEG脂質之結合反應，進行以下之工程。 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ； N 0 F C 0 R P O R AT I Ο N , S UN B RI G Η T DSPE-020MA ) 6 _ 5 4 m g ( 2 · 2 4 μιη ο 1 )與上述之 hT R A - 8 Fullbody 335.4 mg ( 2.24 μιηοΐ)於 PBS 中混合，於室溫下 培育1小時，使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞 胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 22.4 μπιοί 於室溫反應 30 分鐘而 不活性化。生成的 DSPE-PEG2000 修飾 hTRA-8 Fullbody， 因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPL C 系統：AKΤΑ Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC·); PBS( pH7_4); 4°C ; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)， 與hTRA-8 Fullbody之高峰劃分（56-74ml)相異，而於更高 分子量側之劃分（41-50 ml之劃分）溶出。分取此等，獲得 自未反應之hTRA-8 Fullbody分離純化的目的 DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.47，抗體重量25.5 mg )。以陽離子交換色層分析（FPI.C系統：AKTA explorer 1 0S (GE HEALTHCARE INC.)；管柱 ^Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液A : 50mM檸檬酸鹽緩衝液， -163- 200916477 pH4.5;洗析液B:50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 MNaCl，pH4_5; 梯度：B 0 — 1 〇 〇 % ( 2 0 C V，線性梯度）；1 _ 6 m 1 / m i η ;溫度： 4°C ；偵測波長：280 nm )分析，相對於h T R A - 8 F u 11 b o d y 於3 . 7分鐘溶出，本修飾抗體於4.2分鐘溶出。 【實施例4 8】 (1 ) hTRA-8 F ( ab’）2 之硫醇化 於 hTRA-8 F ( ab’）2 溶液（抗體濃度 3. 1 mg/ml, 20mM 磷酸鹽緩衝液，150mM NaCl，ImM DTPA，pH8.0)將 4mM Traut 氏試劑（2-亞胺基噻茂院.HC1，Pierce Biotechnology, Inc_ )以 hTRA-8 F ( ab’）2 : Traut 氏試劑=1 : 4 之莫耳比添 加，室溫下反應90分鐘，將hTRA-8 F ( ab’）2之一部份離 胺酸殘基之胺基硫醇化。之後，使用凝膠過濾色層分析（管 柱：GE HEALTHCARE INC .NAP-5脫鹽管柱）於PBS中溶出， 除去Traut氏試劑，分取抗體劃分。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2 0 0 0之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT DSPE-020MA)168.3 μg( 57.6 nmol)與上述之 hTRA-8 F(ab’） 2 8 _ 6 5 m g ( 7 8.6 n m o 1 )於P B S中混合，於室溫下培育1小 時、使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反 應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 -16 4- 200916477 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 576 nmol 於室溫反應 30 分鐘而 不活性化。生成的DSPE-PEG2000修飾hTRA-8 F ( ab’）2， 因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPL C 系統：AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ; PBS ( pH7.4 ) ; 4°C ; 1 .2 ml/min ;偵測波長：2 8 0 nm )， 與hTRA-8 F (ab’）2之高峰劃分（ 63-78ml)相異，而於更 高分子量側之劃分（42-5 1 ml之劃分）溶出。分取此等，自 未反應之hTRA-8 F ( ab’）2獲得經分離純化的目的 DSPE-PEG2000 Μ 2 ^ Νο.48> ίΐΡΜΜ 8 3 5 μ§ ) 〇 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.)；管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.);洗析液A : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5;洗析液B: 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl，pH4.5 ; 梯度：B 0 一 1 0 0 % ( 2 0 C V，線性梯度）；1 · 6 m i/m i n ;溫度： 4°C ;偵測波長：2 8 0 nm )分析，相對於hTRA-8 F ( ab’）2 爲3.3分鐘溶出，本修飾抗體於4_0分鐘溶出。 【實施例49】 (1 )小鼠抗-hDR5抗體（MAB631 ) Fullbody之硫醇化 於小鼠抗 hDR5 抗體（MAB631) ( R&D Systems, Inc.·) (抗體濃度1.96 mg/ml, 20mM磷酸鹽緩衝液，150mM NaCl， lmMDTPA,pH8.0)將4mMTraut氏試劑（2-亞胺基唾茂烷 •HC1，Pierce Biotechnology, Inc.)以 MAB631 : Traut 氏試劑 -165- 200916477 =1 : 4之莫耳比添加，室溫下反應90分鐘，將MAB63 1

Fullbody之一部份離胺酸殘基之胺基硫醇化。之後，使用凝 膠過濾色層分析（管柱；GE HEALTHCARE INC.NAP-5脫鹽 管柱）於PBS中溶出，除去Traut氏試劑，分取抗體劃分。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol ) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF C 0 RP 0 R AT IΟ N, S UN B RIG Η T DSPE-020MA) 23.4 pg ( 8.4 nmol )與上述之 MAB63 1 Fullbody 632.5 pg( 4.2 nmol)於PBS中混合，於室溫下培育18小時， 使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與 抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 8 4 n m o 1，經由於室溫反應 3 〇 分 鐘而不活性化。生成的DSPE-PEG2000修飾MAB63 1 Fullbody，因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分 析（FPLC 系統：AKTA Explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱：HiLoad Superdex 200 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ； PBS (pH7.4): 4°C : 1.2 ml/min:偵 測波長：280 nm)’與MAB631 Fullbody之高峰劃分 (5 6-74ml )相異，而於更高分子量側之劃分（41-50ml )溶 出。分取此等，獲得自未反應之MAB 63 1 Fullbody經分離純 -16 6- 200916477 化之目的DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.49，抗體重 量62.0μ§)。以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·);管柱：Resource S 1 ml( GE HEALTHCARE INC·);洗析液 A: 50mM 檸檬酸鹽緩 衝液，pH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl, ρΗ4·5 ;梯度：B 0—1 00% ( 20CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ; 溫度：4°C ;偵測波長：280 nm )分析，相對於MAB63 1 Fullbody 爲3 . 5分鐘溶出，本修飾抗體於3.6分鐘溶出。 【實施例5 0】 (1 ) hHFE7A Fullbody 之硫醇化 於抗人類Fas抗體hHFE7A Fullbody (抗體濃度5.55 mg/ml, 20mM 碟酸鹽緩衝液，150mM NaCl，ImM DTPA， ρΗ8·0 )，將4mM Traut氏試劑（2-亞胺基噻茂烷· HC1，Pierce Biotechnology, Inc.)以 hHFE7 A Fullbody: Traut 氏試劑=1 : 4之莫耳比添加，室溫下反應90分鐘，硫醇化hHFE7A Fullbody之一部汾離胺酸殘基之胺基。之後，使用凝膠過濾 色層分析（管柱：GE HEALTHCARE INC.NAP-5脫鹽管柱） 於PBS中溶出，除去Traut氏試劑，分取抗體劃分。 (2 )抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol )

succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ’ 以下表言己爲 DSPE-PEG2000-Mal ; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT -167- 200916477 DSPE-020MA ) 2 2 _ 1 9 μ g ( 7.5 9 nm ο 1 )與上述之 h H F E 7 A Fullbody 566.2 pg( 3.77 nmol)於 PBS 中混合，於室溫下培 育1 8小時，使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞 胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.) 75.9 nmol 於室溫反應 30 分鐘而 不活性化。生成的 DSPE-PEG2000 修飾 hHFE7AFullbody， 因形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC 系統：AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC·)，管柱： HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.); PBS(pH7.4); 4°C; 1.2 ml/min;偵測波長：280 nm)， 與hHFE7AFullbody之高峰劃分（ 55-70ml)相異，而於更 高分子量側之劃分（42-48 ml之劃分）溶出。分取此等，自 未反應之hHFE7A Fullbody獲得經分離純化之目的 DSPE-PEG2000修飾抗體（表2之No.50，抗體重量35μ§)。 以陽離子交換色層分析（FPLC系統：AKTA explorer 10 S( GE HEALTHCARE INC.)；管柱：R e s o u r c e S 1 m 1 ( G E HEALTHCARE INC.);洗析液A: 50mM檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1M NaCl，pH4_5 ; 梯度：B 0—1 0 0% ( 2 0CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ;溫度： 4°C ;偵測波長：2 80 nm )分析，相對於h H F E 7 A F u 11 b o d y 爲3 . 3分鐘溶出，本修飾抗體於3.2分鐘溶出。 【實施例5 1】 (1) m2E12 Fullbody 之硫醇化 -168- 200916477 依據國際公開小冊WO2003/3 79 1 3所記載之融合瘤2E12 生産的小鼠抗人類DR4抗體m2E12 Fullbody (抗體濃度4.6 mg/ml，20mM 磷酸鹽緩衝液，150mMNaCl，ImM DTPA， pH8.0)中將4mM Traut氏試劑（2 -亞胺基噻茂院_HCl，Pierce Biotechnology，Inc.)以 m2E12 : Traut 氏試劑=1 : 4 之莫耳 比添加，室溫下反應90分鐘。之後，使用凝膠過濾色層分 析（管柱；GE HEALTHCARE INC.NAP-5 脫鹽管柱；HEPES 緩衝液）於PBS中溶出而除去Traut氏試劑，將m2E 12 Fullbody之一部份離胺酸殘基之胺基硫醇化。 (2)抗體與PEG脂質之結合反應 將分子量約2000之聚乙二醇之末端上具有順丁烯二醯 亞胺基之聚乙二醇琥珀醯基二硬酯醯基磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol )

succinyldistearoylphosphatidylethanolamine ，以下表記爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF C 0 R P 0 R AT IΟ N , S UN B RIG Η T

dS n nf 1 ή nmol 'l Eft? l· 琉·> rr. 9 P 1 ^ TT n 11 V. η H !〆 Λ. L -l \J A «. J I t · I -KJ kA. w ^ a Λ.Λ AXX \y X y -/、 I . jJ I — pc’ XXX ΛΛ *-> A Λ. Wl· A A 1.^ vl > 2312 pg( 1 5.4 nmol )於PBS中混合，於室溫下培育18小時， 使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反應。與 抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 DSPE-PEG2000-Mal 添力口 1 0 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 160 nmol 於室溫反應 30 分鐘而 不活性化。生成的D S P E - P E G 2 0 0 0修飾m 2 E 1 2 F u丨1 b o d y，因 形成作爲高次構造之膠粒，於凝膠過濾色層分析（FPLC系 統：AKTA Explorer 1 OS ( GE HEALTHCARE INC.)，管柱： -169- 200916477

HiLoad Superdex 2 00 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC. ) ; PBS( pH7.4 ) ; 4。(： ； 1.2 ml/min ;偵測波長：2 80 nm )， 與m2E12Fullbody之高峰劃分（ 55-70ml)相異，而於更高 分子量側之劃分（42-4 8 ml之劃分）溶出。分取此等，自未 反應之m2E12 Fullbody獲得分離純化之目的DSPE-PEG2000 修飾抗體（表2之No.51，抗體重量94.2 pg)。以陽離子交 換色層分析（FPLC 系統：AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE INC.)；管柱：Resource S 1 ml ( GE HEALTHCARE INC.)；洗析液A : 5 0 m M檸檬酸鹽緩衝液， pH4.5 ;洗析液B : 50mM檸檬酸鹽緩衝液，1 M NaCl, ρΗ4·5 ; 梯度·· B 0-> 1 00% ( 2 0CV，線性梯度）；1 .6 ml/min ;溫度·· 41 ;偵測波長：280 nm)分析’相對於m2E 12 Fullbody爲 3 . 3分鐘溶出，本修飾抗體於3.6分鐘溶出。 實施例3 2至5 1所製作的疏水分子修飾抗體之成分組成 不於表2。 -170- 200916477 【表2】 實施例編號 蛋白質 水溶性連結物 疏水性分子 反應時裝入比（莫耳比） (蛋白質：疏水性分子結 合水溶性連結物） 32 A PEG2000 DSPE 1 4 33 B PEG2〇〇〇 DSPE 1 1 34 B PEG2000 DSPE 1 4 35 B PEG2000 DSPE 1 : 12 36 B PEG2000 DSPE 1 : 10 37 A PEG2000 DSPE 1 1 38 A PEGi〇〇〇〇 DSPE 1 1 39 A PEG2000 DPPE 1 1 40 A peg5〇〇〇 Choi 1 1 41 B PEG10000 DSPE 1 1 42 B PEG2000 DPPE 1 1 43 B PEG5000 Choi 1 1 44 B PEG2000 DSPE 1 1 45 B PEG3400 DSPE 1 1 46 B PEG5000 DSPE 1 2 47 B PEG2000 DSPE 1 1 48 C PEG2000 DSPE 1.3 :1 49 D PEG2000 DSPE 1 2 50 E PEG2000 DSPE 1 2 51 F PEG2000 DSPE 1 1 A : hTRA-8 Fab'、B : hTRA-8 Fullbody、C : hTRA-8 F(ab')2 D : MAB631 Fullbody、 E : hHFE7A Fullbody、 F : m2E 12 Fullbody 【實施例5 2】 與實施例41之（1 )同樣地，硫醇化hTRA-8 Fullbody 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG之結合反應，進行以下之工程。 -17 1- 200916477 將末端上具有順丁烯二醯亞胺基之分子量約2000之聚 乙二醇（p〇ly( ethylene glycol)，以下表記爲 PEG2000-Mal; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT ME-020M A ) 9.3 3 2 pg ( 4 nmol)與 hT R A-8 F ul 1 bo dy 0.6 3 6 m g ( 4.2 4 nm o 1 )於 P B S 中 混合，使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反 應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，相對於 PEG2000-Mal 添加 10 等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 40 nmol於室溫反應30分鐘而不活性化。 施用凝膠過濾色層分析管柱（FPLC系統：AKTA Explorer 1 0S (GE HEALTHCARE INC.)，管柱：H i L o a d S u p e r d e x 2 0 0 16/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.); PBS ( pH7.4); ; 1.2 ml/min ;偵測波長：2 8 0 nm )後使溶出，溶出液以 溶出順序分取每3 m 1之爐份（f r a c t i ο η )。其次，此等之各濾 份中所含蛋白質之分子量大小，使用微晶片型電泳 (Experion，Bio-rad Inc.)分析。此結果，相對於爲原料之 hTRA-8 Fullbody 於 5 8 - 7 3 m 1 之濾份溶出，於 5 5 - 5 8 m 1 之溶 出濾份中，較爲原料之hTRA-8 Fullbody更高分子量側獲得 位移的電泳帶，濃縮此溶出濾份，獲得目的之PEG2000修飾 抗體（抗體重量6.28pg)。 【實施例5 3】 與實施例4 1之（1 )同樣地，硫醇化h T R A - 8 F u 11 b 〇 d y 之一部份離胺酸殘基之胺基。 抗體與PEG之結合反應，進行以下之工程。 將末端上具有順丁烯二醯亞胺基之分子量約5000之聚 -172- 200916477 乙二醇（poly( ethylene glycol)，以下表記爲 PEG5000-Mal; NOF CORPORATION,SUNBRIGHT ME-050MA) 21.42 pg ( 4 nmol)與 hTR A - 8 F u 11 bo dy 0 · 6 3 6 m g ( 4 · 2 4 nm o 1 )於 P B S 中 混合，使抗體之硫醇基與PEG鏈末端之順丁烯二醯亞胺基反 應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞胺基，對PEG5000-Mal 添力卩10等量之疏基乙酉学（Wako Pure Chemical Industries， Ltd. ) 40 nmol於室溫反應30分鐘而不活性化。施用凝膠過 爐色層分析管柱（FPLC系統：AKTA Explorer 10S ( GE Η E A LT H C A R E IN C .)，管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.) ； PBS (pH7.4)； 4°C ； 1 .2 ml/min ;偵測波長：280 nm )後而溶出，溶出液以溶出 順序分取每3 ml之濾份。其次，此等之各濾份中所含蛋白 質之分子量大小，使用微晶片型電泳（Experion，Bio-rad Inc.)分析。此結果，相對於爲原料之hTRA-8 Fullbody於 5 8 - 7 3 ml之濾份溶出’ 5 5 -5 8 ml之溶出濾份中較原料之 hTRA_8 Fullbody更高分子量側獲得位移電泳帶，濃縮此溶 出濾份，獲得目的之PEG5000修飾抗體（抗體重量20.15pg)。 【實施例5 4】 與實施例32之（1 )同樣地，於使用時調製hTRA-8 Fab’ 片段。 抗體與PEG之結合反應，進行以下之工程。

將於末端上具有順丁烯一醯亞胺基之分子量約2 〇〇〇之 聚乙二醇（poly ( ethylene glycol)，以下表記爲 PEG2000-MaI ； NOF CORPORATION, SUNBRIGHT 200916477 ME-020MA ) 39.21 pg( 16.8 nmol)與 hTRA-8 Fab’ 0.924 mg (16.8 nmol)於PBS中混合，使抗體之硫醇基與PEG鏈末 端之順丁烯二醯亞胺基反應。與抗體未反應之順丁烯二醯亞 胺基，相對於PEG2000-Mal添加10等量之锍基乙醇（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 168 nmol 於室溫反應 30 分 鐘而不活性化。施用凝膠過濾色層分析管柱（fplc系統： AKTA Explorer 10S( GE HEALTHCARE INC.),管柱：HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep grade ( GE HEALTHCARE INC.)； PBS ( pH7.4 ) ； 4°C; 1.2ml/min;偵測波長：280 nm)後而 溶出，溶出液以溶出順序分取每3 ml之濾份。其次，此等 之各濾份中所含蛋白質之分子量大小使用微晶片型電泳 (Experion, Bio-rad Inc.)分析。此結果，相對於爲原料之 hTRA-8 Fab’於7 6 - 9 7 m 1之濾份溶出，於6 1 - 7 6 m 1之溶出濾 份中，較爲原料之hTRA-8 Fab’更高分子量側獲得位移電泳 帶，濃縮此溶出濾份，獲得目的之PEG2000修飾抗體（抗體 重量 360.4pg)。 【試驗例1】 以實施例1、2、3調製的免疫微脂粒對Jurkat細胞的細 胞凋零誘導活性之測定 將Jurkat細胞依錐藍（typan blue)染色法計數後，以含 有 10%胎牛血清（Hyclone Laboratories.Inc 公司製）之 DMEM 培養基（Invitrogen公司製，以下稱爲DMEM培養基）調製成 1 xlO5個細胞/毫升。預先以DMEM培養基調製抗體濃度爲 2000、200、20、2ng/ml(最終濃度 1 000、100、10、lng/ml) -174- 200916477 之免疫微脂粒溶液或以lpg/ml之二次抗體溶液（山羊抗人類 IgGFc 抗體，MP Biomedicals 公司製）調製爲 2000、200、20、 2ng/ml(最終濃度 1 000、100、10、lng/ml)的 hTRA-8 溶液 以一群3連各50μ1添加於96孔微平盤（Corning公司製），將 細胞懸浮液各播種5(^1(5乂103細胞）。於37°(：、5%二氧化碳 存在下將各平盤培養72小時，測定各孔之ATP量。ATP量 測定使用蟲螢光素酶發光試藥（CellTiter Gl〇，Pr〇mega公司 製），依添附之規格書測定。即，將由細胞溶解成分和發光基 質成分而成之試液於平盤之各孔各添加100 μΐ，攪拌後，將 上清液於96孔白色微平盤（Corning公司製）各移100 μ卜將各 孔之發光以螢光計（分子裝置公司製）測定。將添加DMEM培 養基和細胞懸浮液之孔作爲陰性對照孔，以只添加DMEM培 養基之孔爲背景孔，各孔之細胞生存率由下式算出。 細胞生存率（％) =(被驗孔之發光強度一背景孔之平均發 光強度）/(陰性對照孔之平均發光強度一背景孔之平均發光強 度）乂 100 其結果如第1圖所示。實施例1、2、3調製之免疫微脂 粒對Jurkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之 細胞凋零誘導活性。實施例2或3製作之免疫微脂粒於1、 10、100、1 000ng/ml顯示20%以下細胞生存率。 【試驗例2】 實施例19、20、21調製之免疫微脂粒對A3 7 5細胞之細 胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1所記載之方法測定對人類惡性黑色素瘤細胞 -175- 200916477 株A3 75細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8 調製爲抗體濃度2000、200、20ng/ml(最終濃度1〇〇〇、1〇〇、 10ng/ml)，以一群2連進行實驗。 其結果如第2圖所示。實施例1 9、20、2 1調製之免疫微 脂粒對A3 75細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之 細胞凋零誘導活性。對A3 75細胞雖比hTRA-8所示之細胞凋 零誘導活性爲弱，但可將hTRA-8予以免疫微脂粒化而增強 細胞凋零誘導活性。實施例1 9、20、2 1製作之免疫微脂粒於 100ng/ml顯示80%以下之細胞生存率，於1 000ng/ml顯示40% 以下之細胞生存率。實施例1 9製作之免疫微脂粒於 1 0 0 0 n g / m 1顯示2 0 %以下之細胞生存率。 【試驗例3】 實施例8、10、12、14、16調製之免疫微脂粒對A375 細胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1所記載之方法測定對人類惡性黑色素瘤細胞 株A3 75細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8 調製爲抗體濃度2000、200、2〇ng/ml(最終濃度1〇〇〇、1〇〇、 10ng/ml)，以一群2連進行實驗。 其結果如第3圖所示。實施例8、10、12、14、16調製 之免疫微脂粒對A 3 7 5細胞，顯示比以二次抗體交聯之 h T R A _ 8更強之細胞调零誘導活性。對A 3 7 5細胞雖比h 丁 R A _ 8 顯示之細胞凋零誘導活性爲弱，但可將h T R A - 8予以免疫微 脂粒化而增強細胞凋零誘導活性。實施例8、1 〇、1 2、1 4、 1 6製作之免疫微脂粒於1 〇 0 0 n g / m 1顯示6 0 %以下之細胞生存 -176- 200916477 率。實施例8、1 6製作之免疫微脂粒於1 000ng/ml顯示40% 以下之細胞生存率。實施例8製作之免疫微脂粒於l〇〇〇ng/ml 顯示20%以下之細胞生存率。 【試驗例4】 實施例7、9、11、13、15調製之免疫微脂粒對A205 8 細胞的細胞凋零誘導活性之測定 依試驗例1記載之方法測定對人類惡性黑色素瘤細胞株 A205 8細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8 調製爲抗體濃度2000、200、2〇ng/ml(最終濃度1 000、1〇〇、 1 Ong/ml)，以一群2連施行實驗。 其結果如第4圖所示。實施例7、9、1 1、1 3、1 5調製之 免疫微脂粒對A20 5 8細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性。對A205 8細胞雖比hTRA-8顯示 之細胞凋零誘導活性爲弱，但可將hTRA-8予以免疫微脂粒 化而增強細胞凋零誘導活性。實施例9、1 1、1 5製作之免疫 微脂粒於1 OOng/inl顯示60%以下之細胞生存率。實施例11、 1 5製作之免疫微脂粒於100ng/ml顯示40%以下之細胞生存 率。實施例15製作之免疫微脂粒於100ng/ml顯示20%以下 之細胞生存率。實施例7、9、1 1、1 3、1 5製作之免疫微脂 粒於1 000 ng/m 1顯示20 %以下之細胞生存率。 【試驗例5】 實施例2 6、2 7、2 8、2 9、3 0、3 1調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞株 -177- 200916477

Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0 %胎 牛血清（Hyclone Lab oratories，Inc公司製）之RPMI培養基 (In vitro gen公司製），免疫微脂粒及hHFE7A調製爲抗體濃 度 26、2.6、0.26、0.026 nM(最終濃度 13、1.3、0_13、0.013 nM)。交聯hHFE7A之二次抗體（山羊抗人類IgG Fc抗體）使 用Biosource公司製者。 其結果如第5圖所示。實施例26、27、28、29、30、31 調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞，顯示與以二次抗體交聯之 h H F E 7 A同等或更強之細胞凋零誘導活性。 【試驗例6】 實施例4、1 7、1 8調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞之細 胞凋零誘導活性之測定 將；iurkat細胞依錐藍染色法計數後，以含有1 〇%胎牛血 清（Hyclone Laboratories,Inc 公司製）之 RPMI 培養基 (Invitrogen公司製）調製成2χ105個細胞/毫升。預先以RPMI 培養基調製抗體濃度爲2000、200、20、2ng,/m丨（最終濃度 1 000、100、10、lng/ml)之免疫微脂粒溶液或以hg/m丨之二 次抗體ί谷液（山羊抗人類IgG Fc抗體，MP Biomedicals公司 製）調製爲 2000、200、20、2ng/ml(最終濃度 1 000、1〇〇、10、 lng/ml)之hTRA-8溶液，以一群3連各50μ1添加於96孔微 平盤（Corning公司製），將細胞懸浮液各播種5〇μ1 (1χ1〇4細 胞）。於3 7 °C、5 %二氧化碳存在下將各平盤培養7 2小時，經 由測定各孔細胞之細胞內脫氫酵素之活性，算出活細胞數。 細胞內脫氫酵素活性之測定使用WST-8試藥（活細胞數測定 -178- 200916477 試藥S F, n a c a 1 a i t e s q u e)，依添附之規格書進行測定。即，將 评31'-8於各孔添加1(^卜將\\^1'-8由細胞內脫氫酵素還原而 生成的甲膳之量，經由將甲臢於450 nm之吸光度以吸光光度 計（分子裝置公司製）測定定量。以添加RPMI1 640培養基和 細胞懸浮液之孔爲陰性對照孔，以只添加RPMI1 640培養基 之孔爲背景孔，各孔之細胞生存率由下式算出。 細胞生存率（％) =(被驗孔之吸光度一背景孔之平均吸光 度）/(陰性對照孔之平均吸光度一背景孔之平均吸光度）x 1 〇〇 其結果如第6圖所示。實施例4、1 7、1 8調製之免疫微 脂粒對Jurkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強 之細胞凋零誘導活性。實施例4、1 7、1 8製作之免疫微脂粒 於lOng/ml顯示60%以下之細胞生存率，於100ng/ml或 1 000ng/ml顯示20%以下之細胞生存率。 【試驗例7】 實施例22、23調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞的細胞 凋零誘導活性之測定 以試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。培養基使用含有10%胎牛 血清（Hyclone Laboratories,Inc 公司製）之 RPMI 培養基 (Invitrogen公司製），免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度 2000、200、20、2、0.2、0.02ng/ml(最終濃度 1000、100、 10、1、0.1、0.0 1ng/ml)，以一群 3 連進行實驗。 其結果如第7圖所示。實施例22、23調製之免疫微脂 粒對Jurkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之 -179- 200916477 細胞凋零誘導活性。實施例22、23製作之免疫微脂粒於 0.1ng/ml顯示60%以下之細胞生存率，於1、10、1〇〇、 1 OOOng/ml顯示20%以下之細胞生存率。 【試驗例8】 實施例24調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞的細胞凋零 誘導活性之測定 以試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10%胎 牛血清（Hyclone Laboratories，Inc公司製）之RPMI培養基 (Invitrogen公司製），免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度 200、20、2、0.2ng/ml(最終濃度 1〇〇、10、1、0.1ng/ml)， 以一群3連進行實驗。 其結果如第8圖。實施例24調製之免疫微脂粒對Jurkat 細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞凋零誘 導活性。實施例24製作之免疫微脂粒於Ing/ml顯示60%以 下之細胞生存率，於1 〇 n g,/ m 1或1 0 0 n g / m 1顯示2 0 %以下之細 胞生存率。 【試驗例9】 實施例25調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞的細胞凋零 誘導活性之測定 以試驗例〗記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇%胎 牛血清（Hyclone Laboratories，Inc公司製）之RPMI培養基 (Invitrogen公司製）’免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度 -180- 200916477 200、20、2、0.2ng/ml(最終濃度 1〇〇、1〇、1、〇」ng/ml)’ 以一群3連施行實驗。 其結果如第9圖所示。實施例2 5調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞 凋零誘導活性。實施例25製作之免疫微脂粒於〇.lng/ml顯 示70%以下之細胞生存率，於1、1〇、1〇〇1^/1111顯示2〇%以 下之細胞生存率。 【試驗例1 0】 實施例5、6調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞的細胞凋 零誘導活性之測定 以試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0%胎 牛血清（Hyclone Laboratories，Inc公司製）之RPMI培養基 (Invitrogen公司製），免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度 200、20、2、0.2ng/ml(最終濃度 100、10、1、0.1ng/ml)，以 一群3連施行實驗。 其結果如第1 0圖。實施例5、6調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA_8更強之細胞 凋零誘導活性。實施例5製作之免疫微脂粒於0.1 ng/ml顯示 7 0 %以下之細胞生存率。實施例6製作之免疫微脂粒於 0.1 ng/ml顯示4〇 %以下之細胞生存率。又，實施例5、6製作 之免疫微脂粒於1、1 〇、1 〇〇ng/ml顯示20%以下之細胞生存 率。 【試驗例11】 -18 1- 200916477 實施例3、2 0調製之免疫微脂粒對來自關節風濕患者之 滑膜細胞之細胞凋零誘導活性之測定 將冷凍來自關節風濕患者之滑膜細胞（細胞應用公司） 懸浮於滑膜細胞增殖培養基（細胞應用公司製，以下稱培養 基），以錐藍染色法計數後，以培養基調製成2 X 1 04個細胞/ 毫升。於96孔微平盤（Corning公司製）將細胞懸浮液各播種 5 0μ1(1χ103α1ΐ3)。同時將以培養基稀釋抗體濃度爲2000、200 、20、2ng/ml之免疫微脂粒溶液及hTRA-8各50μ1添加於平 盤。於37 °C、5%二氧化碳存在下培養一晚後，測定ΑΤΡ量 。ATP量測定使用蟲螢光素酶發光試藥（Cell Titer Glo，Promega公司製），依添附之規格書測定。即，將由細胞 溶解成分和發光基質成分而成之試液於平盤之各孔各添加 100μ卜攪拌後’將上清液於96孔白色微平盤（Corning公司 製）各移1 0 0μ1 ’將各孔之發光以螢光計（分子裝置公司製）測 定。添加培養基替代免疫微脂粒溶液的孔作爲陰性對照孔， 以不播種細胞而只添加培養基之孔爲背景孔，各孔之細胞生 存率由下式算出。 細胞生存率（％) =(被驗孔之發光強度—背景孔之平均發 光強度）/(陰性對照孔之平均發光強度一背景孔之平均發光強 度）X100 其結果如第1 1圖所示。實施例3、2 0之免疫微脂粒對來 自關節風濕患者之滑膜細胞，顯示比以二次抗體交聯之 hTRA-8更強之細胞凋零誘導活性。實施例3製作之免疫微脂 粒於1000ng/ml顯示50%以下之細胞生存率。 -182- 200916477 【試驗例1 2】 實施例5調製之免疫微脂粒對人類大腸癌症株COLO 2 05移植裸鼠之抗腫瘤活性之測定 檢討實施例5調製之免疫微脂粒之活體內抗腫瘤活性。 將由檢疫確認未檢出小鼠病原微生物之人類大腸癌株COLO 205(購自 American Type Culture Collection)2><106 細胞移植 至裸鼠BALB/cAJcl-nu(日本CLEA公司）之腋窩部皮下。投 與實施例5之免疫微脂粒之前立即以生理食鹽水（大塚製藥） 稀釋爲抗體濃度1及0.33 mg/ml。對移植7日後之腫瘤生著 之C 0 L 0 2 0 5載癌小鼠開始實施例5之免疫微脂粒之投與。 具體而言，於第7及9、11、14、16、18、21' 23、25曰於 載癌小鼠之尾靜脈內每小鼠體重1 〇g投與〇. 1 ml之微脂粒溶 液。 將移植腫瘤之長徑及短徑使用電子數位尺（C D -1 5 C : Mitutoyo公司）每週計測2-3次。以如下計算式求出腫瘤體積。 腫瘤體積（mm3 ) = W2x短徑2 ( mm ) X長徑（mm ) 又，算出各個體之腫瘤增殖速度（mm3/日），使用其値 進行Dunnett檢定來檢定統計學上顯著差異。又，P値低於 0.0 5時，視爲各群間有顯著差異。 試驗之結果如第1 2圖所示。實施例5之免疫微脂粒顯示 用量依存之抗腫瘤活性，1 〇mg/kg之免疫微脂粒具有統計學 上顯著差異而顯示抗腫瘤活性。 【試驗例1 3】 實施例32調製之疏水性分子修飾抗體對Jurkat細胞的 -183- 200916477 細胞凋零誘導活性之測定 將Jurkat細胞以錐藍染色法計數後，以含有10%胎牛血 清（Hyclone Laboratories，Inc 公司製）之 RPMI1640 培養基 (Invitrogen公司製，以下稱RPMI培養基）調製成lxlO5個細 胞/毫升。預先以RPMI培養基調製抗體濃度爲2000、200、 20、2、0.2、0.02ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、0.1、 0.01ng/ml)之疏水性分子修飾抗體溶液或以lpg/ml之二次抗 體溶液（山羊抗人類IgG Fc抗體，MP Biomedicals公司製）調 製爲 2000、200、20、2、0.2、0.02ng/ml(最終濃度 1000、100、 10、1、0.1、0.01ng/ml)之 hTRA-8 溶液以一群 3 連各 50μ1 添加於96孔微平盤（Corning公司製），將細胞懸浮液各播種 50μ1(5χ103個細胞）。於37t、5%二氧化碳存在下將各平盤培 養72小時，測定各孔之ATP量。ATP量測定用蟲螢光素酶 發光試藥（CellTiter Glo,Pr〇mega公司製），依添附之規格書 測定。亦即將由細胞溶解成分和發光基質成分而成之試液於 平盤之各孔各添加1〇〇μ1、攪拌後，將上清於96孔白色微板 (Corning公司製）各移100 μΐ，將各孔之發光以螢光計（分子裝 置公司製）測定。將添加RPMI培養基和細胞懸浮液之孔作爲 陰性對照孔，以只添加RPMI培養基之孔爲背景孔，各孔之 細胞生存率由下式算出。 細胞生存率（％) =(被驗孔之發光強度一背景孔之平均發 光強度）/(陰性對照孔之平均發光強度一背景孔之平均發光強 度）x100 其結果如第1 3圖所示。實施例3 2調製之疏水性分子修 -184- 200916477 飾抗體對】urkat細胞，顯示比以二次抗體交聯之hTRA-8更 強之細胞凋零誘導活性，於〇.1 ng/ml顯示20 %以下之細胞生 存率，於1、10，100、l〇〇〇ng/ml顯示5%以下之細胞生存 率。 【試驗例1 4】 實施例33、34調製之疏水性分子修飾抗體對）urkat細 胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞 株】urkat細胞的細胞凋零誘導活性。疏水性分子修飾抗體及 二次抗體交聯的h TRA-8調製抗體濃度爲200、20、2' 0.2、 0.02ng/ml (最終濃度 1〇〇、1〇、1、0_1、0.01ng/ml)，以一 群3連進行實驗。 其結果示於第1 4圖。實施例3 3、3 4調製之疏水性分子 修飾抗體對Jurkat細胞顯示較以二次抗體交聯的hTRA-8更 強的細胞凋零誘導活性’於〇· 1 ng/ml顯示60 %以下，於1、 1 0、1 OOngZml顯示20%以下之細胞生存率。 【試驗例1 5】 實施例3 5、3 6調製之疏水性分子修飾抗體對：furkat細 胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞 株J u r k a t細胞的細胞调零誘導活性。疏水性分子修飾抗體及 二次抗體交聯的h TRA_8調製抗體濃度爲200、20、2、0.2、 0.02ng/ml (最終濃度 1〇〇、1〇、1、0.1、0.01ng/ml)，以一 群3連進行實驗。 -185- 200916477 .其結果示於第1 5圖。實施例3 5、3 6調製之疏水性分子 修飾抗體對Jurkat細胞顯示較以二次抗體交聯的hTRA-8更 強的細胞调零誘導活性，於〇 · 1 n g / m 1顯示4 0 %以下，於1、 10、100ng/ml顯示10%以下之細胞生存率。 【試驗例1 6】 實施例3 7、3 8、3 9、40調製之疏水性分子修飾抗體對 Jurkat細胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞 株：Turk at細胞的細胞凋零誘導活性。疏水性分子修飾抗體及 二次抗體交聯的hTRA-8調製抗體濃度爲2000、200、20、2、 0.2、0.02ng/ml(最終濃度 1〇〇〇、1〇〇、1〇、1、〇.1、〇.〇lng/ml)， 以一群3連進行實驗。 其結果示於第16圖。實施例37、38、39、40調製之疏 水性分子修飾抗體對Jurkat細胞顯示與.以二次抗體交聯的 hTRA- 8同等以上的細胞凋零誘導活性。實施例3 7、3 9調製 之疏水性分子修飾抗體於〇.lns,/ml顯示60%以下，於卜10、 100、1 000ng/ml顯示10%以下之細胞生存率。 【試驗例1 7】 以實施例4 1、4 2、4 3、4 4、4 5、4 6調製之疏水性分子 修飾抗體對】urkat細胞之細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例〗3所記載之方法測定對白血病τ淋巴瘤細胞 株Jurkat細胞的細胞凋零誘導活性。疏水性分子修飾抗體及 二次抗體交聯的hTRA-8調製抗體濃度爲200、20、2、0·2、 0.02ng/ml (最終濃度 1〇〇、1〇、1、0·1、0_01ng/ml )，以一 -18 6- 200916477 群3連進行實驗。 其結果示於第17圖。實施例41、42、43、44、45、46 調製之疏水性分子修飾抗體對Jurkat細胞顯示較以二次抗 體交聯的hTRA-8更強的細胞凋零誘導活性，於lng/ml顯示 60%以下，於10、l〇〇ng/ml顯示10%以下之細胞生存率。 【試驗例1 8】 實施例37、48調製之疏水性分子修飾抗體對BxPC-3 細胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對BxPC-3細胞的細胞凋 零誘導活性。疏水性分子修飾抗體及參考例1之hTRA- 8 F (ab ’）2片段，依實施例3 2 ( 1 )所記載之方法將經調製 hTRA-8 Fab’片段、二次抗體交聯的hTRA-8調製抗體濃度爲 2000、200、20、2ng/ml(最終濃度 1000、100、10、lng/ml)， 以一群3連進行實驗。 其結果示於第1 8圖。實施例3 7、4 8調製的疏水性分子 修飾抗體，對BxPC-3細胞顯示較二次抗體交聯的hTRA-8 更強的細胞凋零誘導活性，於l〇ng/ml顯示40%以下，於 100、1 000ng/ml顯示10%以下之細胞生存率。又，hTRA-8 F (ab’）2片段及hTRA-8 Fab’片段幾乎未顯示細胞凋零誘導 活性。本結果顯示不具有本來活性的片段沆體經由疏水性分 子之修飾獲得細胞凋零誘導活性。 【試驗例1 9】 實施例44調製之疏水性分子修飾抗體對BxPC-3細胞的 細胞凋零誘導活性之測定 -187- 200916477 以試驗例1 3所記載之方法測定對B x P C - 3細胞的細胞凋 零誘導活性。將疏水性分子修飾抗體、hTR A- 8及二次抗體 交聯的hTRA-8調製抗體濃度爲2000、200、20、2ng/ml (最 終濃度1 〇〇〇、1 00、1 〇、1 ng/ml )，以一群3連進行實驗。 其結果示於第1 9圖。實施例4 4調製之疏水性分子修飾 抗體對BxPC-3細胞顯示較以二次抗體交聯的hTRA-8更強 的細胞凋零誘導活性，於1 Ong/rnl顯示50%以下、於100、 100〇1^/1111顯示20°/()以下之細胞生存率。又，二次抗體未交 聯的hTRA-8對BxPC-3細胞僅顯示弱的細胞凋零誘導活 性。本結果顯示無二次交聯僅具有弱活性的抗體，經由疏水 性分子之修飾獲得細胞凋零誘導活性。 【試驗例20】 實施例4 9調製之疏水性分子修飾抗體對jurkat細胞的 細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞 株】urkat細胞的細胞凋零誘導活性。惟，疏水性分子修飾抗 體調製抗體濃度爲 2000、200、20、2、0.2、0.02ng/ml (最 終濃度爲 1000、100、1〇、1、〇_1、0.01ng/ml)，MAB631 以 1 .0 pg/ml之二次抗體溶液（山羊抗小鼠igG Fc抗體）調製 爲 2000、200、20、2、0.2、0,02ng/ml(最終濃度 1000、100、 10、1、0.1、0_01ng/ml)，以一群 3 連進行實驗。 其結果示於第2 0圖。實施例4 9調製之疏水性分子修飾 抗體對Jurkat細胞顯示較二次抗體交聯的Μ AB 6 3 1更強的細 胞凋零誘導活性，於〇· lng/ml顯示20%以下，於1、1 0、 -188- 200916477 100ng/ml顯示10%以下之細胞生存率。 【試驗例2 1】 實施例5 0調製的疏水性分子修飾抗體對Jurkat細胞的 細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對白血病T淋巴瘤細胞 株Jurkat細胞的細胞凋零誘導活性。惟，疏水性分子修飾抗 體調製抗體濃度爲2000、200、20、2ng/ml (最終濃度1 00 0、 100' 10、lng/ml)調製，hHFE7A 以 1.0 Hg/ml 之二次抗體 溶液（山羊抗人類IgG Fc抗體，MP BIOMEDICALS公司製） 調製爲 2000、200、20、2ng/ml (最終濃度 1000、100、10、 lng/ml)，以一群3連進行實驗。 其結果示於第2 1圖。實施例5 0調製之疏水性分子修飾 抗體對Jurkat細胞顯示較二次抗體交聯的hHFE7A更強的細 胞凋零誘導活性，於l〇ng./ml顯示5〇%以下，於100、 100〇11目/1111顯示10%以下之細胞生存率。 Γ I才蛤仿丨1 9 2】 實施例5 1調製之疏水性分子修飾抗體對MDA-MB-23 1R 細胞的細胞凋零誘導活性之測定 將MDA-MB-23 1R細胞以錐藍染色法計數後，以含有 10%胎牛血清（HycloneLaboratories，Inc公司製）之DMEM 培養基（Invitrogen公司製’以下稱DMEM培養基）調製成 2x1 04個細胞/毫升。預先以DMEM培養基調製抗體濃度爲 2000、200、20、2ng/ml (最終濃度 1000、100、10、lng/ml) 之疏水性分子修飾抗體溶液或以3.6 Pg/ml之二次抗體溶液 -189- 200916477 (山羊抗小鼠IgG Fc抗體，Jackson公司製）調製爲2000、 200、20、2ng/ml (最終濃度 1 000、100、10、lng/ml )之 m2El2溶液以一群3連各50 μΐ添加於96孔微平盤（ Corning 公司製），將細胞懸浮液各播種5 0 μΐ ( 1 X 1 〇3個細胞）》以試 驗例1 3所記載之方法培養24小時，測定各孔之ΑΤΡ量。 其結果如第22圖所示。實施例5 1調製之疏水性分子修 飾抗體對MDA-MB-231R細胞顯示較二次抗體交聯的m2E12 更強的細胞凋零誘導活性，於1 ng/ml顯示60%以下之細胞 生存率’於10、100、lOOOng/ml顯示10%以下之細胞生存 率。 【試驗例23】 實施例47調製之疏水性分子修飾抗體對人類大腸癌症 株COLO 205移植裸鼠之抗腫瘤活性之測定 檢討實施例47調製的疏水性分子修飾抗體之活體內抗 腫瘤活性。將由檢疫確認未檢出小鼠病原微生物之人類大腸 癌株 C Ο L Ο 2 0 5 (購自 A m e r i c a η T y p e C u 11 u r e Collection)2><106 個細胞移植至裸鼠 BALB/cA Jcl-nu(日本 CLEA公司）之腋窩部皮下。投與實施例47之疏水性分子修 飾抗體之前立即以生理食鹽水（大塚製藥）稀釋爲〇_33 mg/ml。對移植8日後之腫瘤生著之COLO 205載癌小鼠開 始實施例47之疏水性分子修飾抗體之投與。具體而言，於 第 8 、 11 、 13 、 15 、 18 、 20 、 22 、 25 及 27 日，於載癌小鼠 之尾靜脈內每小鼠體重1 〇 g投與0.1 m 1之疏水性分子修飾抗 體溶液。 -190- 200916477 將移植腫瘤之長徑及短徑使用電子數位尺（CD-15C : Mitutoyo公司）每週計測2-3次。以如下計算式求出腫瘤體積。 腫瘤體積（mm3 ) = 1/2χ短徑2 ( mm ) X長徑（mm ) 又，算出各個體之腫瘤增殖速度（mm3/日），使用其値 進行Dunnett檢定來檢定統計學上顯著差異。又，p値低於 0.05時，視爲各群間有顯著差異。 S式驗之結果如桌2 3圖所不。實施例4 7之疏水性分子修 飾抗體顯示具有統計學上顯著差異而顯示抗腫瘤活性。 【試驗例24】 實施例44、4 6調製之疏水性分子修飾抗體、實施例5 2、 5 3調製之疏水性分子之無水溶性連結物修飾抗體對b X P C - 3 細胞的細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對b X P C - 3細胞的細胞凋 零誘導活性。實施例44、46之疏水性分子修飾抗體溶液、 實施例5 2、5 3調製的水溶性連結物修飾抗體溶液及二次抗 體交聯的hTRAI抗體溶液調製抗體濃度爲2000、200、20、 2ng/ml (最終濃度 1 〇〇〇、1 〇〇、1 0、1 ng/mi )，—群 3 連進行 實驗。 其結果如第2 4圖所不。實施例4 4、4 6調製之疏水性分 子修飾抗體對B X P C - 3細胞顯示較二次抗體交聯的h T R A - 8 更強的細胞凋零誘導活性。另一方面，實施例5 2、5 3調製 之疏水性分子之無水溶性連結物修飾抗體僅顯示弱細胞凋 零誘導活性。本結果暗示’由疏水性分子修飾的抗體，疏水 性分子賦予大的活性增強作用，水溶性連結物之賦予爲小。 -19 1- 200916477 【試驗例2 5】 實施例37調製之疏水性分子修飾抗體、實施例54調製 之疏水性分子之無水溶性連結物修飾抗體對BxPC-3細胞的 細胞凋零誘導活性之測定 以試驗例1 3所記載之方法測定對BxPC-3細胞之細胞凋 零誘導活性。實施例3 7之疏水性分子修飾抗體溶液、實施 例54調製之水溶性連結物修飾抗體溶液及二次抗體交聯之 h T R A-8抗體溶液調製爲抗體濃度2000、200、20、2ng/ml (最終濃度1 000、100、10、lng/ml )，一群3連進行實驗。 其結果如第2 5圖所示。實施例3 7調製之疏水性分子修 飾抗體對BxPC-3細胞顯示較二次抗體交聯的hTRA-8更強 的細胞凋零誘導活性。另一方面，實施例54調製之疏水性 分子之無水溶性連結物修飾抗體，僅顯示弱細胞凋零誘導活 性。本結果暗示，由疏水性分子修飾的抗體，疏水性分子賦 予大的活性增強作用，水溶性連結物之賦予爲小。 【試驗例2 6】 由試驗例1至24，計算由疏水性分子修飾抗體及實施二 次交聯的對照抗體細胞生存率降低50%的濃度。結果示於表 3。表中之EC5c顯示50%細胞生存率的濃度，又將對照抗體 之5 0%細胞生存濃度除以各疏水性分子修飾抗體之50%細胞 生存濃度的値記載爲「相對於Ab之EC 5 〇」。於大部份疏水 性分子修飾抗體，該疏水性分子修飾抗體所示5 〇%細胞生存 濃度，與對照抗體之50%細胞生存濃度相比降低至1/1〇以 下。即使由疏水性分子修飾抗體之細胞凋零誘導活性低的試 -192- 200916477 驗例1 7等場合，降低爲1 /4以下。於試驗例1 3至1 6、1 8、 19及24，亦觀察到降低爲1/100以下。 【表3】 試驗例No. 實施例No. EC5〇 (ng/mL) 相對於Ab之EC50 交聯抗體 EC5〇 (ng/mL) 13 32 0.021 833 17.5 14 33 0.15 117 17.5 34 0.056 313 15 35 0.065 48 3.13 36 0.022 142 16 37 0.019 152 2.88 38 2.83 1.0 39 0.11 26.2 40 2.46 1.2 17 41 1.391 1.9 2.71 42 0.555 4.9 43 0.557 4.9 44 0.101 26.8 45 0.037 73.2 46 0.213 12.7 18 37 1.46 685 1000 48 3.72 269 19 44 8.41 119 1000 20 49 0.025 58.4 1.46 21 50 6.94 > 144.1 > 1000 22 51 1.57 > 636.9 > 1000 24 44 8.41 119 1000 46 32.4 31 25 37 1.62 437.6 708.9 -19 3- 200916477 【産業上之利用可能性】 本發明提供由於其中含有專一地結合參與細胞凋零誘導 之細胞表面受體的抗體之免疫微脂粒之癌症治療用醫藥組成 物、自體免疫疾病或炎症性疾病治療用醫藥組成物。 【圖式簡單說明】 【第1圖】第1圖顯示實施例1、2、3調製之免疫微脂 粒對J u rka t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於虛 線之◦顯示實施例1、附於虛線之•顯示實施例2、附於實線 之〇顯示實施例3所得微脂粒之活性、附於實線之•顯示二 次交聯之hTRA-8之活性。 【第2圖】第2圖顯示實施例19、20、21調製之免疫 微脂粒對A3 7 5細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於 實線之〇顯示實施例1 9、附於虛線之〇顯示實施例20、附於 虛線之•顯示實施例2 1所得微脂粒之活性、附於實線之參顯 示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第3圖】第3圖顯示實施例S、10、12、14、16調製 之免疫微脂粒對A37 5細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖 中附於實線之△顯示實施例8、附於虛線之▲顯示實施例 1 0、附於實線之〇顯示實施例1 2、附於虛線之參顯示實施例 1 4、附於虛線之◦顯示實施例1 6所得微脂粒之活性，附於實 線之♦顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第4圖】第4圖顯不實施例7、9、11、13、15調製 之免疫微脂粒對A205 8細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於 圖中附於實線之△顯示實施例7、附於虛線之▲顯示實施例 -194- 200916477 9、附於實線之〇顯示實施例1 1、附於虛線之•顯示實施例 1 3、附於虛線之〇顯示實施例1 5所得微脂粒之活性，附於實 線之•顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第5圖】第5圖顯示實施例26、27、28、29、30、31 調製之免疫微脂粒對】urkat細胞之細胞凋零誘導活性。各於 圖中附於虛線之△顯示實施例2 6、附於實線之△顯示實施例 2 7、附於實線之▲顯示實施例2 8、附於虛線之〇顯示實施例 2 9、附於實線之〇顯示實施例3 0、附於虛線之•顯示實施例 3 1所得微脂粒之活性，附於實線之•顯示二次交聯之hHFE7A 之活性。 【第6圖】第6圖顯示實施例4、17、18調製之免疫微 脂粒對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於 實線之◦顯示實施例4、附於虛線之•顯示實施例1 7、附於 虛線之〇顯示實施例1 8所得微脂粒之活性，附於實線之•顯 示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第7圖】第7圖顯示實施例22、2 3調製之免疫微脂 粒對】u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於實 線之〇顯示實施例22、附於虛線之•顯示實施例23所得微 脂粒之活性，附於實線之•顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第8圖】第8圖顯示實施例24調製之免疫微脂粒對 J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於實線之 〇顯示實施例24中所得微脂粒之活性、附於實線之•顯示二 次交聯之hTRA-8之活性。 【第9圖】第9圖顯示實施例25調製之免疫微脂粒對 -195- 200916477 J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於實線之 〇顯示實施例2 5中所得微脂粒之活性、附於實線之#顯示二 次交聯之hTRA-8之活性。 【第10圖】第10圖顯示實施例5、6調製之免疫微脂 粒對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。各於圖中附於實 線之◦顯示實施例5、附於虛線之•顯示實施例6所得微脂 粒之活性，附於實線之•顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第11圖】第11圖顯示實施例3、20調製之免疫微脂 粒對來自關節風濕患者之滑膜細胞之細胞凋零誘導活性之 圖。各於圖中附於實線之〇顯示實施例3、附於虛線之•顯 示實施例2 0所得微脂粒之活性，附於實線之•顯示二次交聯 之hTRA-8之活性。 【第1 2圖】第1 2圖顯示實施例5調製之免疫微脂粒對 人類大腸癌株COLO 20 5移植裸鼠中抗腫瘤活性之圖。各於圖 中無符號之實線顯示無投與抗體時之腫瘤體積、附於實線之 〇顯示將3 . 3 m g / k g、附於實線之△顯示將1 0 m g / k g之抗體投 與時之腫瘤體積。 【第1 3圖】第1 3圖顯示實施例3 2調製之疏水性分子 修飾抗體對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附於 實線之〇顯示實施例3 2、附於實線之•顯示二次交聯之 hTRA-8之活性。 【第1 4圖】第1 4圖顯示實施例3 3、3 4調製之疏水性 分子修飾抗體對；I u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖 中附於實線之〇顯示實施例3 3、附於虛線之•顯示實施例 -196- 200916477 3 4、附於實線之#顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第1 5圖】第1 5圖顯示實施例3 5、3 6調製之疏水性分 子修飾抗體對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 於實線之〇顯示實施例3 5、附於虛線之•顯示實施例3 6、附 於實線之•顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第16圖】第16圖顯示實施例37、38、39、40調製之 疏水性分子修飾抗體對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之 圖。圖中附於實線之◦顯示實施例3 7、附於實線之·顯示實 施例3 8、附於虛線之鲁顯示實施例3 9、附於虛線之□顯示 實施例40、附於實線之參顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【桌17圖】弟17圖顯不貫施例41、42、43、44、45、 4 6調製之疏水性分子修飾抗體對〗u r k a t細胞之細胞凋零誘 導活性之圖。圖中附於實線之◦顯示實施例4 1、附於實線之 顯示實施例4 2、附於虛線之〇顯示實施例4 3、附於虛線 之參顯示實施例44、附於實線之□顯示實施例45、附於虛 線之矚顯示實施例4 6、附於實線之#顯示二次交聯之h_TR A - 8 之活性。 【第1 8圖】第1 8圖顯示實施例3 7、48調製之疏水性 分子修飾抗體對BxPC - 3細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖 中附於實線之□顯示實施例3 7、附於實線之◦顯示實施例 48、附於虛線之□顯示hTRA-8 Fab’片段、附於虛線之◦顯 示hTRA - 8 F ( a b ’）2片段、附於實線之•顯示二次交聯之 hTRA-8之活性。 【第1 9圖】第1 9圖顯示實施例4 4調製之疏水性分子 -197- 200916477 修飾抗體對BxPC - 3細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 於實線之〇顯示實施例44、附於虛線之〇顯示未二次交聯之 hTRA-8、附於實線之•顯示二次交聯之hTRA-8之活性。 【第20圖】第20圖顯示實施例49調製之疏水性分子 修飾抗體對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 於實線之〇顯示實施例49、附於實線之•顯示二次交聯之 MAB631之活性。 【第2 1圖】第2 1圖顯示實施例5 0調製之疏水性分子 修飾抗體對J u r k a t細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 於實線之〇顯示實施例50、附於實線之參顯示二次交聯之 hHFE7A之活性。 【第22圖】第22圖顯示實施例5 1調製之疏水性分子 修飾抗體對MD A - MB - 2 3 1 R細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖 中附於實線之◦顯示實施例5 1、附於實線之♦顯示二次交聯 之m2E12之活性。 【第23圖】第2.3圖顯示實施例47調製之疏水性分子 修飾抗體對人類大腸癌症株COLO 205移植裸鼠之抗腫瘤活 性之圖。各於圖中之無符號的實線顯示未投與抗體時之腫瘤 體積、附於實線之參顯示投與實施例1 6之疏水性分子修飾 抗體時之腫瘤體積。圖中之箭號顯示實施例47之疏水性分 子修飾抗體之投與曰。 【第2 4圖】第2 4圖顯示實施例4 4、4 6調製之疏水性 分子修飾抗體及實施例5 2、5 3調製之疏水性分子之無水溶 性連結物修飾抗體對BxPC - 3細胞之細胞凋零誘導活性之 -198- 200916477 圖。圖中附於實線之◦顯示實施例4 4、附於實線之□顯示實 施例46、附於虛線之〇顯示實施例52、附於虛線之□顯示 實施例5 3、附於實線之•顯示二次交聯之hTRA - 8之活性。 【第25圖】第25圖顯示實施例37調製之疏水性分子 修飾抗體及實施例5 4調製之疏水性分子之無水溶性連結物 修飾抗體對BxPC - 3細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 於實線之□顯示實施例37、附於虛線之□顯示實施例54 ' 附於實線之參顯示二次交聯之hTRA — 8之活性。 【元件符號說明】 無。 【序列表項目】 序列編號1 -人工序列之説明：經人化抗體之TRA_8之 重鏈胺基酸序列 序列編號2 -人工序列之説明：經人化抗體之T R A - 8之 輕鏈胺基酸序列 岗别纟自諕I人丁序列之説明：經人化抗體之HFE7A之 1 j / j -ju υ - ✓ ·ν 重鏈胺基酸序列 序列編號4-人工序列之説明：經人化抗體之HFE7A之 輕鏈胺基酸序列 -199- 200916477 序列表 <110>第一三共 <120>經疏水性分子修飾之抗體 <130> FP0839 <160> 4 <170〉Pa ten tin版本 3.4 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213>人工 <220> <223>人化TRA-8之重鏈胺基酸序列 <220> <223> 發明人：Mori ta, Koji; Niwa,Takako; Kasuya, Yuji <223> 發明人：Iciiikawa, Kimihisa; Yoshitia, Hirolio <220> <400> 1

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gin Asn Thr Ala Val Tvr Tvr Cvs 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lie Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 200916477

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Lys <210> 2 <2I1> 213 <212> PRT <213>人工 <220> 200916477 <223>人化ΊΈΑ-S之輕鏈胺基酸序列 <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110

Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu 丁hr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Ghi Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 3 <211> 470 <212> PRT <213>人工 <220> <223>人化HFE7A之重鏈胺基酸序列 <400> 3

Met Gly Trp Ser Cys lie He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Scr Gly Ala Glu Val Lys Lys 200916477 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly Glu lie Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 115 120 125

Va] 丁rp G】y G】u G]y Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270

Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320 200916477

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 237 <212〉 PR丁 <213〉人工 <220> <223>人化HFE7A之輕鏈胺基酸序列 <4〇〇> 4

Glu Thr Asp Thr lie Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 15 10 15

Ser Thr Gly Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val 35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 50 55 60 .

Gin Aia Pro Arg Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly 65 70 75 80 lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95

Thr He Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 200916477 100 105 110

Gin Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser 130 135 140

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175

Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys 180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (1)

1. 200916477 十、申請專利範圍： 1 . 一種疏水性分子修飾抗體，其含有以下（a)至（c)，且 與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體結合： (a)與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性結合 的抗體 '該抗體之機能性片段、或與含該抗體之重鏈及 輕鏈之互補性決定部位的該細胞表面受體專一性結合的 多胜肽； (b )水溶性連結物； (c )藉由（b )與（a )連結的疏水性分子。 2.如申請專利範圍第1項之疏水性分子修飾抗體’其對於 表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞’顯示出 細胞凋零誘導活性。 3 .如申請專利範圍第1或2項之疏水性分子修飾抗體，其 對於表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與 專一性結合該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二 次抗體或ProteinG' A寺之抗體結合蛋白質面被父聯時 於試管內所示的細胞凋零誘導活性相同，或於試管內顯 示更強的細胞凋零誘導活性。 4.如申請專利範圍第3項之疏水性分子修飾抗體，其對於 表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與專一 性結合該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二次抗 體或ProteinG、A等之抗體結合蛋白質而被交聯時於試 管內所示的5 0%細胞生存濃度相比較，顯示1 Μ以下之 50%細胞生存濃度。 200916477 5 .如申請專利範圍第4項之疏水性分子修飾抗體，其對於 表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞，與專％ 性結合該細胞表面受體的抗體的全長分子爲經由二次坑 體或ProteinG、A等之抗體結合蛋白質而被交聯時於試 管內所示的5 0%細胞生存濃度相比較下，顯示1 /1 〇以下 之50%細胞生存濃度。 6.如申請專利範圍第1或2項之疏水性分子修飾抗體，專 一性與參與誘導細胞凋零之細胞表面受體結合的抗體之 機能性片段係藉由水溶性連結物與疏水性分子連結，且 對於表現參與細胞凋零誘導的細胞表面受體的細胞顯示 細胞凋零誘導活性。 7 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其含有與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一 性結合的抗體，且該抗體爲抗體之全長分子。 8 .如申請專利範圍第1至6項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表茴受體專一性 結合的抗體之機能性片段爲F ( ab ’）2。 9.如申請專利範圍第1至6項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體之機能性片段爲Fab ’。 1 0.如申請專利範圍第1至9項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲嵌合抗體。 1 1 ·如申請專利範圍第1至9項中任一項之疏水性分子修飾 200916477 抗體’其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲人化抗體。 1 2 ·如申請專利範圍第1至9項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的抗體爲人類抗體。 1 3 ·如申請專利範圍第1至6項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中與參與細胞凋零誘導的細胞表面受體專一性 結合的多胜肽爲單鏈可變部位抗體。 1 4.如申請專利範圍第丨至〗3項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中參與細胞凋零誘導的細胞表面受體爲含有死 亡功能域之受體。 1 5 _如申請專利範圍第丨4項之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體選自Fas、DR4、DR5及TNF受體組 成之群。 1 6.如申請專利範圍第1 5項之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲DR5。 1 7 .如申請專利範圍第1 5項之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲DR4。 1 8 .如申請專利範圍第1 5項之疏水性分子修飾抗體，其中含 有死亡功能域之受體爲Fas。 】9.如申請專利範圍第1 6項之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段爲包含序列表所記載之序 列編號1之胺基酸序列之1〜1 1 8編號的胺基酸殘基所構 成的重鏈可變區序列及序列表所記載之序列編號2之胺 200916477 基酸序列之1〜1 07編號的胺基酸殘基所構成的輕鏈可變 區序列。 2 0 ·如申請專利範圍第1 7項之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段爲包含選自融合瘤2 E 1 2所 産生的抗體、與該抗體結合相同的抗原決定的抗體或該 抗體之人化抗體的抗體之重鏈及輕鏈可變區。 2 1 .如申請專利範圍第1 8項之疏水性分子修飾抗體，其中抗 體分子或該抗體之機能性片段包含序列表所記載之序列 編號3之胺基酸序列之1〜1 3 9編號的胺基酸殘基所構成 的重鏈可變區序列及序列表所記載之序列編號4之胺基 酸序列之1〜1 3 1編號的胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區 序列。 22 .如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲磷脂質。 23 .如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲磷脂醯乙醇胺。 24 .如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲二硬脂基磷脂醯乙醇胺。 2 5 ·如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲膽固醇。 2 6 .如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子之所示L o g D爲4以上。 2 7 ·如申請專利範圍第2 6項之疏水性分子修飾抗體，其中疏 水性分子之所示L 〇 g D爲1 〇以上。 -4 - 200916477 28.如申請專利範圍第丨至21項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中水溶性連結物爲聚環氧烷（polyalkylene oxide ) 〇 2 9 ·如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中水溶性連結物爲聚乙二醇。 30.如申請專利範圍第29項之疏水性分子修飾抗體，其中聚 乙二醇之平均分子量爲100以上20000以下。 3 1 .如申請專利範圍第3 0項之疏水性分子修飾抗體，其中聚 乙二醇之平均分子量爲500以上5000以下。 32.如申請專利範圍第1至21項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲磷脂醯乙醇胺，且水溶性連結 物爲聚乙二醇。 3 3 .如申請專利範圍第1至2 1項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲二硬脂基磷脂醯乙醇胺’且水 溶性連結物爲聚乙二醇。 3 4.如申請專利範圍第1至21項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子爲膽固醇’且水溶性連結物爲聚 乙二醇。 3 5 .如申請專利範圍第3 2至3 4項中任一項之疏水性分子修 飾抗體，其中聚乙二醇之平均分子量爲2000以上3400 以下。 3 6.如申請專利範圍第1至3 5項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子之結合的水溶性連結物係藉由抗 體之離胺酸殘基與抗體結合。 200916477 3 7 .如申請專利範圍第1至3 5項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子之結合的水溶性連結物係藉由抗 體之半胱胺酸殘基與抗體結合。 3 8 ·如申請專利範圍第1至3 5項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中疏水性分子之結合的水溶性連結物係藉由將 抗體之絞鏈區雙硫鍵還原所得的半胱胺酸殘基與抗體結 合。 3 9 ·如申請專利範圍第1至3 8項中任一項之疏水性分子修飾 抗體，其中對於抗體一分子，疏水性分子以1至5 0個分 子結合。 4 0 .如申請專利範圍第3 9項之疏水性分子修飾抗體，其中對 於抗體一分子，疏水性分子以1至1 0個分子結合。 41. 一種醫藥組成物，其含有申請專利範圍第丨至40項中任 一項之疏水性分子修飾抗體爲有效成分。 42. —種抗腫瘤劑，其含有申請專利範圍第i至40項中任一 項之疏水性分子修飾抗體爲有效成分。 4 3 · —種自體免疫性疾病或炎症性疾病之治療劑，其含有申 請專利範圍第1至40項中任一項之疏水性分子修飾抗體 爲有效成分。