TW200914064A - Immunoliposome which can induce apoptosis to the cells expressing death domain-containing receptors - Google Patents

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Takako Niwa
Kimihisa Ichikawa
Hiroko Yoshida
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Description

200914064 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明爲有關作爲腫瘤之治療及/或預防劑有用之含有與 細胞凋零誘導關連之細胞表面受體結合之抗體、對表現該 細胞表面受體之細胞具有誘導細胞凋零作用之免疫微脂粒 、及用該微脂粒之治療及/或預防癌、自體免疫疾病或炎症 性疾病之方法。 【先前技術】 微脂粒因可包含多量水溶性或疏水性之物質，故作爲藥 物載劑，尤其靜脈注射用之Drug Delivery System: DDS之 載劑頗受高度關心（（D.D.Lasic，” Liposomes: from basic to applications" ， Elsevier Science Publishers, (1993)))° 近 年以親水性高分子，例如聚乙二醇（PEG)表面修飾之微脂 粒比習用之微脂粒減輕微脂粒之凝集化及於體內之由細網 內皮系之捕捉等，而也可適用於體內安定性低之藥物，作 爲實現血中之高安定性（藥物血中半減期20-40小時）之製 劑技術已達實用化。更於近年，以賦予機能性爲目的有諸 多嘗試於微脂粒表面結合（含有）蛋白質、胜肽、糖等機能 性分子。 作爲將藥物輸送至體內特定部位之手段，提案於微脂粒 封入藥劑，於其表面結合抗體之方法，尤其於癌治療之領 域，有封入抗腫瘤劑之抗體結合微脂粒之有效性之報告。 如此含有抗體之微脂粒乃稱免疫微脂粒。多數場合，免疫 微脂粒之藥效爲依內封於微脂粒之抗腫瘤劑，他方面，於 200914064 免疫微脂粒含有之抗體乃藉結合於對腫瘤細胞專一地表現 之抗原，利用以將免疫微脂粒輸送至腫瘤細胞。故一般含 於免疫微脂粒之抗體，只要具有腫瘤細胞專一地結合抗原 之機能即可，抗體本身具有作爲治療劑之機能並非必須。 即使於如此賦予標的指向性之微脂粒（即使於PEG微脂粒） ，被投與中之大部分於到達標的細胞以前補足於肝臟等免 疫細胞而消費，或多量之藥物消失於溶液中，故實際到達 標的部位而能表現活性之藥物只限於一部分。於是，將藥 物就更安定含有而到達標的細胞，於標的部位賦予有效率 放出內封藥物之機能之微脂粒雖有諸多嘗試開發，但未至 實用化。又理論上微脂粒應可適用於所有藥物，但是否能 於血中安定地保持藥物，則大大依存於微脂粒之脂質成分 與內封藥物之物性相互作用（相性），適用可能之藥物之種 類實際上被限定爲現狀。如此，於有限送達量封入有限種 類之藥物之微脂粒，欲得更高藥理效果，於微脂粒要求以 新形更賦予藥理效果。 已知參與死亡受體所代表之細胞凋零誘導之細胞表面受 體爲由配體結合之細胞膜上之局部受體之多量化成爲生物 學上對細胞內之細胞凋零·信號誘導之扳機 （Cell Death and Differentiation, 1 0 : 66-75 (2003))。具有參與細胞凋零 誘導對細胞表面受體之結合能力之抗體，現在處於作爲治 療藥臨床之開發階段，表現該受體之細胞（癌細胞.免疫疾 病關連細胞）專一地呈激動劑作用，期待將此死滅之治療效 果。作爲此抗體之作用機制，於該受體結合之前或結合之 200914064 後’抗體彼此被交聯而多量化，引起抗原受體之多量化（也 即細胞凋零誘導）。於活體外實驗，添加對本抗體之二次抗 體而人工交聯爲活性表現所必要，又於活體內，由免疫效 應細胞上之Fc受體而交聯乃視爲抗體之活性表現必要之 作用機制。近年，改變抗體之構造來嘗試使抗體本來之機 能更增強，例如去除抗體上特定之糖鏈構造來改善與Fc 受體之親和性之報告。但免疫效應細胞之量或功能有個人 差，又於既受藥物治療之癌患者或免疫疾病患者，免疫效 應細胞之量或功能大大降低。於如此癌·免疫疾病患者， 以既存之抗體有不能獲得充分藥效之疑慮，須求抗體本身 之更加機能增強。 【發明內容】 本發明之一課題爲提供對癌具有治療效果之醫藥品。本 發明之另一課題爲提供含有可對細胞誘導細胞凋零之抗體 之微脂粒製劑。 本發明者等爲解決上述課題致力檢討結果，發現含有可 對細胞誘導細胞凋零之抗體之微脂粒製劑比該抗體單獨之 場合，可呈示顯著細胞凋零誘導能力，終於完成本發明。 本發明之微脂粒於微脂粒上將抗體以高密度存在，則與生 物學上交聯之抗體同樣機能，其結果可不依存活體外之二 次抗體或活體內之效應細胞之存在，免疫微脂粒單獨則可 更有效發揮細胞凋零誘導能力。由此，即使在抗體單獨則 無法獲得充分治療效果之患者也可得有效治療效果。又封 入藥物之本免疫微脂粒除以藥物爲標的細胞有效標定之機 200914064 能，也有由藥物之治療效果和增強之抗體之活性之治療效 果之雙重藥理效果。由此，可得藥物封入微脂粒單獨或只 具有標定能力之抗體之免疫微脂粒則無法實現之治療效果 〇 也即，本發明包含以下之發明。 (1) 一種免疫微脂粒，其與參與細胞凋零誘導之細胞表面受 體專一地結合而含有如下（a)及（b): (a) 與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體 、該抗體之機能性片段、或含有該抗體之重鏈及輕鏈之相 補性決定部位而與該細胞表面受體專一地結合之多肽； (b) 兩親媒性小胞形成脂質。 (2) 如（1)記載之免疫微脂粒，其係對表現參與細胞凋零誘 導之細胞表面受體之細胞呈示細胞凋零誘導活性。 (3) 如（1)或（2)記載之免疫微脂粒，其係對表現參與細胞凋 零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該細胞表面受體專一 地結合之抗體之全長分子由二次抗體或蛋白質G、A等抗 體結合蛋白質來交聯時呈示與於活體外呈示細胞凋零誘導 活性同等、或於活體外呈示更強細胞凋零誘導活性。 (4) 如（1)至（3)記載之免疫微脂粒，其係對表現參與細胞凋 零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該細胞表面受體專一 地結合之抗體之全長分子由二次抗體或蛋白質G、A等抗 體結合蛋白質來交聯時與於活體外呈示之50%細胞生存濃 度比較，呈示1/2.5以下之50%細胞生存濃度。 (5) 如（1)至（4)記載之免疫微脂粒，其係對表現參與細胞凋 200914064 零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該細胞表面受體專一 地結合之抗體之全長分子由二次抗體或蛋白質G、A等抗 體結合蛋白質來交聯時與於活體外呈示之50%細胞生存濃 度比較，呈示1/10以下之50%細胞生存濃度。 (6) 如（1)至（5)中任一項記載之免疫微脂粒，其係含有與參 與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體，而該 抗體爲抗體之全長分子。 (7) 如（6)記載之免疫微脂粒，其係含有抗體之全長分子對 總脂質莫耳數爲0.000014莫耳％至0.23莫耳％之抗體密度 0 (8) 如（7)記載之免疫微脂粒，其係含有抗體之全長分子對 總脂質莫耳數爲0.002莫耳％至0.14莫耳％之抗體密度。 (9) 如（1)至（5)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與細 胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體之機能性片 段爲 F(ab’ ）2。 (10) 如（9)記載之免疫微脂粒，其中含有F(ab’ ）2對總脂質 莫耳數爲0.000014莫耳％至0.23莫耳％之抗體密。 (11) 如（10)記載之免疫微脂粒，其中含有F(ab，）2對總脂質 莫耳數爲0.006莫耳％至0.Π莫耳％之抗體密度。 (12) 如（1)至（5)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與細 胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體之機能性片 段爲Fab’ 。 (13) 如U2)記載之免疫微脂粒’其中含有pab，對總脂質莫 耳數爲0.000014莫耳％至0.94莫耳％之抗體密度。 200914064 (1 4)如（1 3 )記載之免疫微脂粒，其中含有ρ a b ’對總脂質莫 耳數爲0.005莫耳％至〇_56莫耳％之抗體密度。 (1 5)如（1)至（1 4)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與 細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體爲嵌合體 抗體。 (16) 如（1)至（14)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與 細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體爲人化抗 體。 (17) 如（1)至（14)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與 細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體爲人抗體 〇 (1 8)如（1)至（5)中任一項記載之免疫微脂粒，其中與參與細 胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之多肽爲單鏈可變 部位抗體。 (19) 如（18)記載之免疫微脂粒，其中含有單鏈可變部位抗 體對總脂質莫耳數爲0.000014莫耳％至1.8莫耳％之抗體密 度。 (20) 如（19)記載之免疫微脂粒，其中含有單鏈可變部位抗 體對總脂質莫耳數爲0.005莫耳％至0.56莫耳％之抗體密 度。 (21) 如（1)至（20)中任一項記載之免疫微脂粒，其中參與細 胞凋零誘導之細胞表面受體爲含有死亡功能域之受體。 (22) 如（21)記載之免疫微脂粒，其中含有死亡功能域之受 體爲由Fas、DR4、DR5及TNF受體而成之群選擇。 -10- 200914064 (23) 如（22)記載之免疫微脂粒，其中含有死亡功能域之受 體爲DR5。 (24) 如（22)記載之免疫微脂粒，其中含有死亡功能域之受 體爲DR4。 (25) 如（22)記載之免疫微脂粒，其中含有死亡功能域之受 體爲Fas。 (26) 如（23)記載之免疫微脂粒，其中抗體分子或該抗體之 機能性片段爲含有由序列表記載之序列編號1之胺基酸序 列之1 ~ 1 1 8號胺基酸殘基而成重鏈可變領域序列及序列表 記載之序列編號2之胺基酸序列1〜107號之胺基酸殘基而 成之輕鏈可變領域序列。 (27) 如（24)記載之免疫微脂粒，其中抗體分子或該抗體之 機能性片段爲含有由融合瘤2E12產生之抗體、與該抗體 同一抗原決定部位結合之抗體或由該抗體之人化抗體選擇 之抗體之重鏈及輕鏈可變領域。 (28) 如（25)記載之免疫微脂粒，其中抗體分子或該抗體之 機能性片段爲含有由序列表記載之序列編號3之胺基酸序 列之1~139號之胺基酸殘基而成重鏈可變領域序列及序列 表記載之序列編號4之胺基酸序列1 ~ 1 3 1號之胺基酸殘基 而成輕鏈可變領域序列。 (29) —種免疫微脂粒，其與參與細胞凋零誘導之細胞表面 受體專一地結合而含有如下（a)及（b): (a)與該細胞表面受體專一地結合，且具有仲介該受體而於 細胞誘導細胞凋零之活性之內因性配體或該內在性配體之 -11 - 200914064 機能性片段； (b)兩親媒性小胞形成脂質。 (3 0)如（29)記載之免疫微脂粒，對表現該細胞表面受體之 細胞，呈示比該內因性配體更強之細胞凋零誘導活性。 (31)如（29)或（30)記載之免疫微脂粒，其中細胞表面受體爲 含有死亡功能域之受體。 (3 2)如（31)記載之免疫微脂粒，其中含有死亡功能域之受 體爲由Fas、DR4、DR5及TNF受體而成之群選擇。 (3 3)如（32)記載之免疫微脂粒，其中對含有死亡功能域之 受體之內在性配體爲TRAIL或Fas配體。 (34) 如（1)至（33)中任一項記載之免疫微脂粒，其中構成免 疫微脂粒之脂質含有固醇類、磷脂質。 (35) 如（34)記載之免疫微脂粒，其中構成免疫微脂粒之脂 質之一之固醇類爲膽固醇。 (3 6)如（3 5)記載之免疫微脂粒，其中構成免疫微脂粒之脂 質之一之膽固醇以對總脂質莫耳數爲20莫耳％至50莫耳％ 之比例含有。 (37) 如（34)至（36)中任一項記載之免疫微脂粒，其中構成免 疫微脂粒之脂質之一之磷脂質爲磷脂醯膽鹼。 (38) 如（3 7)記載之免疫微脂粒，其中構成免疫微脂粒之脂 質之磷脂醯膽鹼中之醯基爲碳數14至22。 (39) 如（38)記載之免疫微脂粒，其中構成免疫微脂粒之脂 質之磷脂醯膽鹼中之醯基爲碳數14至18。 (40) 如（34)至（39)中任一項記載之免疫微脂粒，其中構成免 -12 -. 200914064 疫微脂粒之脂質更含有親水性聚合物或該親水性聚合物之 脂質衍生物。 (41)如（40)記載之免疫微脂粒，其中親水性聚合物之脂質 衍生物中親水性聚合物之平均分子量爲500至20000。 (4 2)如（4 1)記載之免疫微脂粒，其中親水性聚合物之脂質 衍生物中親水性聚合物之平均分子量爲2000至5000。 (43) 如（40)至（42)中任一項記載之免疫微脂粒，其中親水性 聚合物之脂質衍生物以對總脂質莫耳數爲0.1莫耳％至1 0 莫耳％之比例含有。 (44) 如（40)至（44)中任一項記載之免疫微脂粒，其中如（43) 記載之免疫微脂粒、親水性聚合物之脂質衍生物以對總脂 質莫耳數爲1莫耳％至6莫耳％之比例含有。 (45) 如（40)至（44)項任項之一種構成免疫微脂粒之脂質之一 ，其中親水性聚合物之脂質衍生物爲聚乙二醇修飾脂質。 (46) 如（34)至（44)中任一項記載之免疫微脂粒，其中使用末 端具有馬來醯亞胺基之脂質或親水性聚合物、微脂粒和抗 體仲介硫醚結合來結合。 (47) 如（1)至（46)中任一項記載之免疫微脂粒、免疫微脂粒 之平均粒徑爲30- 1000nm。 (48) 如（47)記載之免疫微脂粒，其中免疫微脂粒之平均粒 徑爲 30-200nm。 (49) 如（1)至（48)中任一項記載之免疫微脂粒，其微脂粒中 封入具有抗腫瘤活性之藥劑。 (50) 如（1)至（48)中任一項記載之免疫微脂粒，其微脂粒中 -13- 200914064 封入具有自體免疫疾病或炎症性疾病之治療作用之藥劑。 (51) —種醫藥組成物，含有如（1)至（50)中任一項記載之免 疫微脂粒爲有效成分。 (52) —種抗腫瘤劑，含有如（1)至（49)中任一項記載之免疫 微脂粒爲有效成分。 (5 3)—種自體免疫性疾病或炎症性疾病之治療劑，含有如 (1)至（48)或（50)中任一項記載之免疫微脂粒爲有效成分。 【實施方式】 (實施發明之最佳形態） 本說明書中，「癌」和「腫瘤」以同意義使用。 本說明書中，「基因」一詞，不只 DNA，也含有其 mRNA、cDNA 及其 cRNA。 本說明書中，「聚核苷酸」一詞以與核酸同意義使用， 也包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。 本明細中，「多肽」和「蛋白質」不區別使用。 本說明書中，「RNA劃份」乃指含有RNA之劃份。 本說明書中，「細胞」也包括動物個體內之細胞、培養 細胞。 本說明書中，「細胞之癌化」乃指細胞喪失對接觸阻止 現象之感受性，或呈示立足場非依存性增殖等細胞呈示異 常增殖，如此呈示異常增殖之細胞稱「癌細胞」。 本說明書中，「細胞傷害」乃指以任何形於細胞呈示病 理變化，不只直接外傷，也指DN A之切斷和鹼基之二聚物 之形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損傷、各種酵素 -14- 200914064 活性之降低等所有細胞之構造或機能上之損傷。 本說明書中「細胞傷害活性」乃指引起上述細胞傷害。 本說明書中’使用例如「免疫微脂粒所含有之抗體（或多 肽）」等表現時之「含有」乃指具有構成該微脂粒之脂質之 官能基和具有該多肽之官能基形成共有結合，或基於物理 •生物學親和性之非共有結合之狀態。 本說明書中「含有死亡功能域之受體」乃指將與黑猩猩 蠅之自殺基因reaper呈示相同性之稱「死亡功能域」之細 胞凋零信號傳達領域於細胞內功能域具有之受體分子（包括 Fas ' TNFRI、 DR3、DR4、 DR5 及 DR6，但不限於這些 )° 本說明書中「抗體之機能性片段」乃指具有與抗原結合 活性之抗體之部分片段，包括Fab、F(ab’ ）2、scFv等。又 將F(ab’ ）2於還原條件下處理之抗體之可變領域之一價片 段之Fab’也包括於抗體之機能性片段。但只要具有與抗 原之結合能力，不限於這些分子。又於這些機能性片段不 只將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，也包括使 用基因工程上改變之抗體基因於適當宿主細胞產生之蛋白 質。 本發明中「Fab’」爲如上述將F(ab’ ）2於還原條件下處 理之抗體之可變領域之一價之片段，可利用於還原條件生 成之Fab’中之硫醇基使該Fab’與微脂粒結合。但用基 因工程上改變之抗體基因而產生之Fab’或於羧基末端賦 予含有基因工程上半胱胺酸殘基之多肽之Fab也可利用各 -15- 200914064 硫醇基與微脂粒結合而包括於本發明中Fab’ 。 本說明書中「單鏈可變部位抗體」爲與單鏈Fv(scFv)同 意義使用。 本說明書中「二次抗體」乃指於抗體分子專一地結合’ 而將該抗體分子彼此交聯之抗體。 本說明書中「兩親媒性小胞形成脂質」乃指具有疏水性 及親水性部分，更可單獨於水中形成二層小胞之脂質、或 與其他脂質一起吸入脂質雙重層，此時該雙重膜之內部疏 水領域與其疏水性領域接觸，更包括其親水性領域向該膜 之外部極性表面並列之一切兩親媒性脂質。 本說明書中「微脂粒」乃指由兩親媒性小胞形成脂質形 成之脂質構造體。微脂粒典型爲於內部有水相之由單層或 多層之脂質雙重層而構成之閉鎖小胞，本發明乃更廣指粒 子狀之脂質複合體。 本說明書中「免疫微脂粒」乃指由微脂粒和蛋白質而形 成之複合體。 本說明書中免疫微脂粒之「抗體密度」爲對構成免疫微 脂粒之總脂質莫耳數，將於該免疫微脂粒含有之抗體之莫 耳數之比例以莫耳％標記者。 本說明書中「平均粒徑」爲以體積或數爲基準測定之粒 徑分布之平均値。粒徑可依例如雷射繞射法、動光散射法 等電磁波散射法、離心沈澱法等光透過法測定。 1.關於細胞凋零關連基因 關於本發明中含有目的免疫微脂粒之抗體，要求該抗體 -16 - 200914064 對特定抗原結合，且仲介該抗原呈示細胞傷害活性。又爲 防止正常細胞被殺傷，有將腫瘤細胞專一地存在之抗原選 擇之必要。如此抗原群之一例’有腫瘤細胞壊死因子（本說 明書中以下稱「TNF」）關連細胞凋零誘導配體（本說明書 中以下稱「TRAIL」）受體群。TRAIL爲TNF家族蛋白質之一 貝’此含有 Fas 配體及 TNF-α (Wiley SR 等 Immunity 1995 Dec ; 3 (6) : 67 3-82)。這些蛋白質爲細胞凋零之強力誘導因 子。 這些TNF家族蛋白質之受體由細胞外功能域之半胱胺酸 富反復序列來特徴，尤其屬於Fas配體之受體之Fas，及 屬於TNFa 之受體之TNF受體1(本說明書中以下稱「 TNFRI」）爲於細胞內功能域具有呈示與黑握@虫®之自殺基 因 reaper (Golstein，P.，等（ 1 995) Cell. 81，1 85- 1 86，White，K， 等（ 1 994) Science 264，677-683)相同性領域之稱「死亡功能 域」之細胞凋零之信號傳達所必須之領域，而總稱爲含有 死亡功能域之受體。 關於 TRAIL，有 5種受體被鑑定，這些中 2種 (DR4(TRAIL-R1)及DR5(TRAIL-R2))可傳達細胞凋零信號， 其他 3 種（DcRl(TRAIL-R3)，DcR2(TRAIL-R4)及骨保護素 (osteoprotegerin: OPG)不傳達細胞调零信號。與Fas及 TNFRI同樣，DR4及DR5兩者之細胞內片斷含有死亡功能 域，而仲介含有Fas關連死亡功能域蛋白質（本說明書中以 下稱「FADD」）及Caspase8之經路傳達細胞凋零信號 (Chaudhary PM，等 Immunity 1 997 Dec ; 7(6) : 813-20 ; -17- 200914064
Schneider P，等 Immunity 1997 Dec ; 7(6) ·· 821-30)。 關於上述Fas、TNFRI、DR4、DR5，已知結合於該分子 而作爲激動劑作用之抗體對將該分子於細胞表面保有之細 胞呈示細胞凋零誘導能力（Journal of Cellular Physiology , 209 ： 1 22 1 - 1 028 (2006) ； Leukemis, Apl ； 21 (4) ： 805 - 812 (2007) ； Blood, 99 ： 1666-1675 (2002) ； Cellular
Immunology, Jan ； 153 (1) ： 184-193 (1994))。上述激動劑 抗體之藥效由二次抗體或效應細胞之交聯而增強 Uournal of Immunology, 1 49 : 3 1 66-3 1 73( 1 992) ； Eouropian Journal of Immunology,Oct; 23( 1 0): 2676-268 1 (1 993))。免疫微脂粒 可於微脂粒膜上結合多數抗體，可視爲模仿抗體之交聯狀 態之構造體。故比仲介習用之二次抗體或效應細胞之交聯 ，更可增強上述激動劑抗體之藥效。又因可實現人工高度 之交聯狀態，故也可期待抗體單獨未必具有激動劑活性之 必要。由以上之理由，於含有死亡功能域之受體結合之抗 體，可選擇爲於本發明之免疫微脂粒含有之抗體。 2.結合於DR5之抗體 (1)DR5基因 人DR5(death receptor 5)基因之核音酸序列及胺基酸序列 於基因庫以 GI : 22547 1 1 8(登録編號：NMJ 47 1 87)登録。 DR5之胺基酸序列中，有1或數個胺基酸取代、缺失、附 加之胺基酸序列而成，將具有與DR5同等生物活性之蛋白 質編碼之核苷酸序列也包括於DR5基因之核苷酸序列。又 DR5之胺基酸序列中，有1或數個胺基酸取代、缺失、附 -18 - 200914064 加之胺基酸序列而成，具有與DR5同等生物活性之蛋白質 也包括於DR5。 (2)對DR5之抗體 對本發明之DR5之抗體可依常法將由DR5或DR5之胺基 酸序列選擇之任意多肽免疫於動物，採集活體內產生之抗 體來精製而得。 又可依公知之方法（例如 Kohler and Milstein, Nature ( 1 975) 256，p.495-497 ; Kennet’R.ed·，Monoclonal 抗體， p.365-367，Prenum Press, N.Y.(1980))，將產生對 DR5 之抗 體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合來樹立融合瘤，也可 得單元抗體。 又成爲抗原之DR5可將DR5基因依基因操作而於宿主細 胞產生而得。 具體而言，製作可表現DR5基因之載體，將此導入宿主 細胞而表現該基因，來精製表現之DR5。 又可構築將DR5之細胞外領域與抗體之定常領域融合之 4 人工基因，將適切基因表現系中調製之蛋白質作爲免疫原 使用。 以下具體說明對DR5之抗體之取得方法。 (2)-1.抗原之調製 爲製作抗DR5抗體之抗原可爲由DR5或其至少6個連續 之部分胺基酸序列而成之多肽，或於這些附加任意之胺基 酸序列或載體之衍生物。 DR5可由人之腫瘤組織或腫瘤細胞直接精製而使用，又 -19- 200914064 可將DR5於活體外合成，或依基因操作而於宿主細胞產生 而得。 於基因操作，具體而言，將DR5導入表現可能之載體後 ，於含有將轉錄和翻譯所必要之酵素、基質及能量物質之 溶液中合成，或其他原核生物、或真核生物之宿主細胞予 以轉形來表現DR5，而得該蛋白質。 DR5之cDNA可例如以表現DR5之cDNA庫爲模板，用 將DR5 cDNA專一地增幅之引子施行聚合酶連鎖反應（以乃 稱「PCR」）（Saiki，R.K.等 Science ( 1988) 239，p.487-489)之 所謂PCR法來取得。 多狀之活體外合成法可爲例如Roche-Diagnostics公司製 之迅速翻譯系統（RTS)，但不受此限定。 原核細胞之宿主可爲例如大腸菌（Escherichia coli)或枯草 菌（Bacillus subtilis)等。將目的基因於這些宿主細胞內轉 形，可於含有能與宿主適合之種由來之複製子也即複製起 點和含有調節序列之質體載體將宿主細胞轉形。又載體以 具有能於轉形細胞賦予表現形質（表現型）之選擇性之序列 者較佳。 真核細胞之宿主細胞包括脊椎動物、昆蟲、酵母等細胞 、脊椎動物細胞常用例如猿之細胞之COS細胞（Gluzman,Y. Cell( 1 98 1 ) 23，p.1 75- 1 82、ATCC CRL- 1650)、小鼠纖維芽細 胞NIH3T3 (ATCC No. CRL- 1 658)或倉鼠卵巢細胞（CH0細胞 、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酶缺損株（Urlaub, G. and Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 980) 77 ,p4126- -20- 200914064 4220)等，但不受此等限定。 如上所述所得轉形體可依常法培養’由該培養於細胞內， 或細胞外產生目的之多肽。 該培養所用培養基依採用宿主細胞而可適宜選擇慣用之 各種者，若爲大腸菌，則可例如依LB培養基而添加安比 西林等抗生物質或IPTG來使用。 依上述培養，於轉形體之細胞內或細胞外產生之重組蛋 白質可依利用該蛋白質之物理性質或化學性質等之各種公 知分離操作法來分離♦精製。 該方法具體而言，可例示如依通常之蛋白質沈澱劑之處 理、超濾、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交換 層析、親和層析、高速液體層析（HPLC)等各種液體層析、 透析法、這些之組合等。 又可於表現重組蛋白質連繫由6殘基而成之組胺酸，則 可有效精製鎳親和柱。 組合上述方法則可容易以高產率、高純度大量製造目的 多肽。 (2)-2.抗DR5單元抗體之製造 與DR5專一地結合之抗體之例可爲與DR5專一地結合之 單元抗體，其取得方法如下： 製造單元抗體時，一般須如下述作業工程，即 (a) 作爲抗原使用之活體高分子之精製、 (b) 注射抗原於動物而免疫後，採集血液而檢定其抗體價來 決定脾臟摘出之時期後，調製抗體產生細胞之工程、 -21 - 200914064 (C)骨髓腫細胞（以下稱「骨髓瘤」）之調製、 (d) 抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合、 (e) 選別產生目的抗體之融合瘤群、 (f) 分割爲單一細胞克隆（選植）、 (g) 有時，爲大量製造單元抗體而培養融合瘤，或飼育移植 融合瘤之動物、 (h) 檢討如此製造之單元抗體之生理活性、及其結合特異性 ，或檢定標識試藥之特性等。 以下沿上述工程詳述單元抗體之製作法，但該抗體之製 作法不受此限制，也可使用例如脾細胞以外之抗體產生細 胞及骨髓瘤。 (a) 抗原之精製 抗原可使用如前述方法調製之DR5或其一部分。 又由D R 5表現重組體細胞調製之膜劃份，或d R 5表現重 組體細胞本身、DR5與其他蛋白質之融合蛋白質，更也可 依業者周知之方法，以化學合成之本發明之蛋白質之部分 胜肽爲抗原使用。 (b) 抗體產生細胞之調製 混合工程U)所得抗原與弗氏之完全或不完全佐劑，或紳 明礬等助劑，作爲免疫原於實驗動物免疫。實驗動物可將 公知之融合瘤製作法所用動物無阻礙使用。具體而每，可 用例如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但由與摘出 之抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞之取得容易性等觀點， 以小鼠或大鼠爲被免疫動物較佳。 -22- 200914064 又實際使用之小鼠及大鼠之系統無特限，於小鼠之場合 ，可用例如各系統 A、AKR BALB/c BDP BA CE、C3H、 57BL、C5 7BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、 NZW、RF. R III、SJL、SWR、WB、129 等，又於大鼠之 場合’可用例如 Low, Lewis, Spraque，Daweley, ACI，BN, Fischer 等 ° 這些小鼠及大鼠可由例如日本可麗兒公司、日本查爾斯 河公司等實驗動物飼育販售業者取得。 其中’斟酌與後述骨髓瘤細胞之融合適合性，於小鼠以 BALB/c系統，於大鼠以LOW系統作爲被免疫動物特佳。 又考慮抗原於人與小鼠之相同性，則使用降低去除自己 抗體之活體機構之小鼠，也即自體免疫疾病小鼠也較佳。 這些小鼠或大鼠之免疫時之週齡宜5~12週齡，更宜6〜8 週齡。 欲由 DR5或此重組體來免疫動物，可用例如於 Weir’D.M.， Handbook of Experimental Immunology Vol.I. II. HI., Blackwell Scientific Publications, Oxford ( 1 987)； Kabat, E. A. and Maye r, Μ. M., Experimental Immuno chemistry, Charles C Thomas Publisher S pig field, Illinois ( 1 964)等詳細記載之公知方法。 這些免疫法中’具體例示本發明適宜方法如下： 即先將抗原膜蛋白劃份’或表現抗原之細胞投與動物之 皮內或腹腔內。 但爲提筒免疫效率，以兩者之倂用較佳，前半施行皮內 -23 - 200914064 投與，後半或僅最終回施行腹腔內投與，則可特提高免疫 效率。 抗原之投與程序依被免疫動物之種類、個體差等而異’ 惟一般以抗原投與回數3~6回，投與間隔2~6週較佳’以 投與回數3〜4回，投與間隔2 ~ 4週更較佳。 又抗原之投與量依動物之種類、個體差等而異，惟一般 爲0.05~5mg，宜0.1〜0.5mg之程度。 追加免疫可如上之抗原投與之1〜6週後，宜2~4週後， 更宜2~3週後施行。 施行追加免疫之際之抗原投與量依動物之種類、大小等 而異，一般例如小鼠之場合爲〇.〇5〜5mg，宜0.1〜0.5mg， 更宜0.1~0.2mg之程度。 上述追加免疫1~1〇日後，較佳爲2〜5日後，更較佳爲 2~3日後，由被免疫動物將抗體產生細胞由上述追加免疫 起1~10日後，宜2~5日後，更宜2〜3日後，由被免疫動物 無菌取出含有抗體產生細胞之脾臟細胞或淋巴球。 於此際測定抗體價，將抗體價充分高之動物作爲抗體產 生細胞之供給源，則可提高以後操作之效率。 所用抗體價之測定法可例如RIA法或ELISA法，但不受 這些方法限制。 本發明中抗體價之測定例如依ELIS A法，可依如下程序施 行。 先將精製或部分精製之抗原吸附於ELISA用96穴板等固 相表面’更將未吸附抗原之固相表面被覆與抗原無關之蛋 -24- 200914064 白質’例如牛血清蛋白素（以下稱「BSA」），而將該表面 洗淨後，與作爲第一抗體而階段稀釋之試料（例如小鼠血清 )接觸’於上述抗原結合試料中之抗體。 更加作爲第二抗體而酵素標識之對小鼠抗體之抗體結合 於小鼠抗體，洗淨後加該酵素之基質，基於基質分解之發 色測定吸光度之變化等，算出抗體價。 由這些脾臟細胞或淋巴球之抗體產生細胞之分離可依公 知之方法（例如 Kohler 等，Nature (1975) 256，p,495; Kohler 等，Eur. J. Immnol. ( 1 977) 6，ρ·511 ; Milstein 等， Nature ( 1 977) 266 , p.550 ； Walsh, Nature, ( 1 977) 266, P.495)施行。 例如脾臟細胞之場合，可用將細胞細切而以不鏽鋼篩過 濾後，於Eagle最低必須培養基（MEM)浮游來分離抗體產 生細胞之一般方法。 (c)骨髓腫細胞（以下稱「骨髓瘤」）之調製 細胞融合所用骨髓瘤細胞無特限，可由公知之細胞株適 宜選擇使用。但考慮由融合細胞選擇融合瘤時之方便性， 以使用其選擇手續確立之 HGPRT(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株較佳。 也即小鼠由來之 X63-Ag8 (X63)、NS1-ANS/1 (NS1)、 P3X63-Ag8.Ul (P3 Ul)、X63 - Ag 8 · 65 3 (X63.65 3)、SP2/0-Agl4 (SP2/0)、MPC1 1-45.6TG1.7 (45.6TG)、FO、S149/5XXO、 BU.l等、大鼠由來之 210.RSY3.Ag.l.2.3 (Y3)等、人由來 之 U266AR (SKO-007)、GM1 500 · GTG-A12 (GM 1 500)、 -25- 200914064 UC729-6 ' LICR-L〇W-HMy2 (HMy 2) 、 8226AR/NIP4-1 (NP41)等。 這些 HGPRT缺損株可由例如 American Type Culture Collection (ATCC)等取得。 這些細胞株於適當培養基，例如於8-吖鳥嘌呤培養基[於 RPMI- 1 640培養基加麩醯胺酸、2-氫硫基乙醇、僅大黴素 、及牛胎血清（以下稱「FCS」）之培養基加8-吖鳥嘌呤之 培養基]、Iscove改變Dulbecco培養基以下稱「IMDM」）， 或Dulbecco改變Eagle培養基以下稱「DMEM」）繼代培養 ’惟於細胞融合之3至4日前以正常培養基[例如含有1 〇 % FCS之ASF104培養基（味素公司製）]繼代培養，於融合當 曰確保2xl07以上之細胞數。 (d)細胞融合 抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合可依公知之方法（weir， D. Μ., Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford ( 1 987) ； Kabat, E. A. and Mayer, Μ. M., Experimental Immunochemistry’ C h a r 1 e s C T h o m a s P u b 1 i s h e r S p i g f i e 1 d，111 i η o i s ( 1 9 6 4)等）於 細胞之生存率不極度降低程度之條件下適宜實施。 如此方法可用例如於聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中混 合抗體產生細胞和骨髓瘤細胞之化學方法，利用電刺激之 物理方法等。 其中上述化學方法之具體例如下： 即作爲高濃度聚合物溶液使用聚乙二醇時，於分子量 -26- 200914064 1500-6000，宜 2000~4000 之聚乙二醇溶液中，於 30~40°C ，宜35~38°C之溫度混合抗體產生細胞與骨髓瘤細胞1〜10 分，宜5〜8分。 (e)融合瘤群之選擇 由上述细胞融合所得融合瘤之選擇方法無特限，通常使 用 HAT(次黃嘌呤·胺基喋呤·胸苷）選擇法（Kohler等， Nature ( 1 975) 25 6, p,495 ； Milstein at al., Nature ( 1 977) 2 6 6, p · 5 5 0) ° 此方法使用以胺基喋呤不能生存之HGPRT缺損株之骨髓 瘤細胞得融合瘤時有效。 即將未融合細胞及融合瘤以HAT培養基培養，則可僅將 對胺基喋呤有耐性之融合瘤選擇殘存且增殖。 (0分割爲單一細胞克隆（選植） 融合瘤之選植法可用例如甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、 極限稀釋法等公知之方法（例如Barbara，B. M. and Stanley， M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. ' Freeman and Company, San Francisco (1980))。這些方法中， 特以極限稀釋法較佳。 依此方法，於微板接種大鼠胎兒由來之纖維芽細胞株， 或正常小鼠脾臟細胞、胸腺細胞、腹水細胞等飼養細胞。 他方面，預先將融合瘤於培養基中稀釋成〇.2~〇.5個 /0.2ml，將此稀釋融合瘤之浮游液於各穴各加入0.1 ml，每 一定期間（例如每3日）將約1/3之培養基邊換新邊續培養2 週之程度，則可增殖融合瘤之克隆。 -27- 200914064 就認定抗體價之穴，例如依極限稀釋法反復選植2~4回 ，將安定而認定抗體價者選擇爲抗DR5單元抗體產生融合 瘤株。 (g)由融合瘤培養調製單元抗體 如此選擇之融合瘤雖可將此培養而有效得單元抗體，但 於培養之前，篩選產生目的單元抗體之融合瘤較佳。 此篩選可採用其本身既知之方法。 本發明中抗體價之測定可例如於上述（b)之項目說明之依 ELISA法施行。 依上述方法所得融合瘤可於液體氮中或-80°C以下之冷凍 庫中以凍結狀態保存。 選植完了之融合瘤可將培養基由HT培養基更換於正常培 養基培養。 大量培養可用大型培養瓶之回轉培養，或以自旋培養施 行。 將此大量培養中上清以凝膠過濾等當業者周知之方法精製 ，則可得於本發明之蛋白質專一地結合之單元抗體。 又同系統之小鼠（例如上述BALB/c)，或於Nu/Nu小鼠之 腹腔內注射融合瘤，而增殖該雜交瘤，則可得大量含本發 明單元抗體之腹水。 投與腹腔內時，於事前（3〜7日前）投與2,6,10，14-四甲基 十五烷（pristane)等礦物油，則可得更多量之腹水。 例如於與融合瘤同系統之小鼠之腹腔內預先注射免疫抑 -28- 200914064 制劑，將T細胞惰性化後，於20日後，將1〇6〜1〇7個之融 合瘤.克隆細胞於不含血清之培養基中浮游（〇 . 5 ml)而投與 腹腔內’通常腹部膨滿而蓄積腹水時，由小鼠採集腹水。 依此方法，得比培養液中約丨00倍以上濃度之單元抗體 0 依上述方法所得單元抗體可例如依Weir，D. M.：
Handbook of Experimental Immunology, V〇l· I，π，III， Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)記載之方 法精製。 即硫安鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層 析法等。 作爲精製之簡便方法，也可利用市售之單元抗體精製套 組（例如MAbTrap GII套組；Pharmacia公司製）等。 如此所得單元抗體對DR5具有高抗原特異性。 (h)單元抗體之檢定 如此所得單元抗體之異型及亞型之決定可如下施行。 首先作爲鑑定法可爲Ouchterlony法、ELISA法或RIA法 〇
Ouchterlony法雖簡便，但單元抗體之濃度低時’須濃縮 操作。 他方面，用ELISA法或RIA法時，將培養上清就此與抗 原吸附固相反應，更作爲第二次抗體使用1與各種免疫球 蛋白異型、亞型對應之抗體’則可鑑定單元抗體之異型、 -29- 200914064 亞型。 又作爲更簡便之方法，也可利用市售之鑑定用之套組（例 如小鼠Typer套組；Bio-Rad公司製）等。 蛋白質之定量可依Foreign row Lee法、及由280nm中吸 光度[1.4(OD280) =免疫球蛋白lmg/ml]算出之方法施行。 (3)其他抗體 本發明之抗體除對上述DR5之單元抗體之外，更含有以 降低對人異種抗原性等爲目的之人爲改變之基因重組型抗 體，例如由嵌合體抗體、人化（Humamzed)抗體、人抗體等 。這些抗體可用既知之方法製造。 嵌合體抗體可爲抗體之可變領域和定常領域爲相互異種 之抗體，例如將小鼠由來抗體之可變領域接合於人由來之 定常領域之嵌合體抗體（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855， （1984))。 人化抗體可爲僅將互補性決定領域（CDR ; complementarity determining region)人化抗體可爲僅將互 補性決定領域（Nature( 1 986)32 1,ρ·522-525)，依 CDR 移植法 、除將CDR之序列，也將一部分構架之胺基酸殘基也移植 於人抗體之抗體（國際公開小冊W090/07861)。 更可列舉抗人抗體。人抗體乃指只具有人染色體由來之 抗體之基因序列之人抗體。抗DR5人抗體可用含有人抗體 之Η鏈和L鏈之基因之人染色體斷片之人抗體產生小鼠之 方法（Tomizuka，Κ.等，Nature Genetics (1997) 16，ρ.133-143 -30- 200914064 ;Kuroiwa，Y 等，Nuc. Acids Res_ ( 1 998) 26，p.3447-3448 ; Y〇 s hi d a，H .等，A nim al Ce 11 Tec hn o 1 o g y : Basic and
Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1 999 ； Tomizuka, K.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727)來取得。 如此轉基因動物具體而言，將非人哺乳動物之內在性免 疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座被破壞，代之以仲介酵母人 工染色體（Yeast ar ti f i c i al c hr om 〇 s 〇 me，Y A C)宿主等導入人 免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座之基因重組動物，藉剔除 動物及轉基因動物之製作，及這些動物彼此交配來作出。 也可由基因重組技術，將如此人抗體之重鏈及輕鏈各別 編碼之cDNA，宜由含有該cDNA之宿主使真核細胞轉形， 培養產生基因重組人單元抗體之轉形細胞，將此抗體由培 養上清中取得。 於此，宿主可用例如真核細胞，宜CHO細胞、淋巴球或 骨髓瘤等哺乳動物細胞。 又已知將由人抗體庫選別之噬菌體顯示由來之人抗體取 得之方法（Wormstone，I. M.等，Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7)，ρ·230 1 -2308 ; Carmen, S.等 ，Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2) ,p. 1 89-203 ； Siriwardena, D.等，Opthalmology (2002) 109 (3)，p.427-43 1)。 -31 - 200914064 例如可用將人抗體之可變領域作爲一股鏈抗體（scFv)於 噬菌體表面表現，而選擇結合於抗原之噬菌體之噬菌體顯 示法（Nature 生技（2005) 23，（9), p.1105-1116)。 解析選擇結合於抗原之噬菌體之噬菌體之基因，則可決定 編碼結合於抗原之人抗體之可變領域之DNA序列。 若明白結合於抗原之scFv之DNA序列，則可使用與適當 宿主之表現載體之組合，製作具有該序列之表現宿主，導 入適當宿主來表現，則可取得人抗體。（W092/01 047, WO92/2079 1, WO93/0621 3, W093/ 1 1 23 6, W09 3/ 1 9 1 72, WO95/0 1 43 8，W095/1 5 3 88、 Annu. Rev. Immunol ( 1 994) 1 2, p.43 3 -45 5、 Nature 生技（2005) 23 (9)，p.1105 -1116)。 將抗體基因一旦單離後，導入適當宿主來製作抗體時， 可用適當宿主和表現宿主之組合。 以真核細胞爲宿主使用時，可用動物細胞、植物細胞、 真核微生物。 動物細胞可爲（1)哺乳類細胞，例如猿之細胞之COS細胞 (Gluzman, Y .Cell ( 1 98 1 ) 23, p.175- 1 82, ATCC CRL- 1 650)' 小鼠纖維芽細胞NIH3T3(ATCC No. CRL- 1 65 8)或倉鼠卵巢 細胞（CH◦細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酶缺損株 (Ur 1 aub , G. a n d Chasin,L.A. Pr oc. N atl. Ac ad. S ci. U. S . A . (1 9 8 0) 77，p.4126-4220)。 使用原核細胞時，可用例如大腸菌、枯草菌。 -32- 200914064 於這些細胞將目的抗體基因依轉形而導入’將轉形之細 胞於活體外培養而得抗體。 本發明之抗體之異型無限制’可爲例如IgG (igGl、IgG2 、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgAl、IgA2)、IgD 或 IgE 等、 較佳爲IgG或IgM。 又本發明之抗體只要維持與抗原之結合性，則也可爲具 有與抗體之抗原結合部之抗體之斷片或其修飾物。 例如抗體之機能性片段可爲將Fab、F(ab’ ）2、F(ab’ 還原所得抗體之一價可變領域片段F a b ’、F v、或重鏈及輕 鏈之 Fv 以適當接頭連結之單鏈 Fv(scFv)、 diabody(diabodies)、線狀抗體、及抗體斷片所形成之多特 異性抗體等，但只要保持對抗原之結合性、不限於上述片 段。上述抗體之片段可將完全長之抗體分子以木瓜酵素、 胃蛋白酶等酵素處理來取得。又用將上述抗體片段之重鏈 及輕鏈編碼之核酸序列而以適當基因表現系產生蛋白質， 也可取得上述抗體片段。又於抗體之機能性片段之羧基末 端將含有半胱胺酸殘基之多肽予以基因工程上附加之蛋白 質也可作爲本發明中抗體之機能性片段使用。如此機能性 片段之一例可爲於重鏈或輕鏈之羧基末端附加含有半胱胺 酸殘基之多肽之Fab，但不受此限定。附加之半胱胺酸殘 基之硫醇基可用於抗體之機能性片段與微脂粒之結合。 本發明之抗體也可爲對至少2種類之相異之抗原具有特 異性之多特異性抗體。通常如此分子爲結合2個抗原者（即 雙重特異性抗體（blspeciflc抗體）），惟本發明中「多特異性 抗體」也包含對其以上（例如3種類）之抗原具有特異性之 -33- 200914064 抗體。 本發明之抗體可爲多特異性抗體全長而成之抗體，或也 可爲如此抗體之斷片（例如F(ab’ ）2二特異性抗體）。雙重 特異性抗體也可將2種抗體之重鏈和輕鏈（HL對）結合來製 作，也可將產生相異之單元抗體之融合瘤融合，而製作雙 重特異性抗體產生融合細胞來製作（Millstein等，Nature ( 1 983) 305，p.537-539)。 本發明之抗體也可爲單鏈可變部位抗體（也可記載爲 scFv)。單鏈可變部位抗體可將抗體之重鏈V領域和輕鏈V 領域以多肽之接頭連結而得（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg 及 Moore 編、 Springer Yerlag, New York, p.269-3 1 5 ( 1 994) ； Nature 生技 (2005 ), 23，p.1 1 26- 1 1 36)。 製作單鏈可變部位抗體之方法爲本技術領域中周知（例如 美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國 專利第5,091，513號、美國專利第5,45 5,03 0號）。此單鏈可 變部位抗體中，重鏈V領域和輕鏈V領域爲仲介不作成結 合之接頭，宜多肽接頭來連結（Huston, S .等’ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1 9 8 8), 85, p.5 87 9 -5 8 8 3 )。單鏈可變 部位抗體中重鏈V領域及輕鏈V領域可爲同一抗體由來’ 也可分別抗體由來。連結v領域之胜肽接頭可用由例如 12~19殘基而成之任意之一股鏈胜肽。 編碼爲單鏈可變部位抗體之D N A爲編碼前述抗體之重鏈 或重鏈V領域之DNA、及編碼輕鏈或輕鏈V領域之DNA 中，以編碼這些之序列中之全部或所望之胺基酸序列之 -34- 200914064 D N A部分爲模板，用規定其兩端之引子對依P C R法增幅， 次更將胜肽接頭部分編碼之DNA，及將其兩端規定爲與各 重鏈、輕鏈連結之引子對組合增幅而得。 又一旦製作編碼單鏈可變部位抗體之DNA，將含有這些 之表現宿主，及由該表現宿主轉形之宿主可依常法而得， 又用其宿主可依常法得單鏈可變部位抗體。 這些抗體斷片可仿前述將基因取得來表現，而由宿主產 生。 本發明之抗體爲胺基酸序列相異之複數種類之抗DR5抗 體之混合物，也可爲多克隆抗體。多克隆抗體之一例可爲 CDR相異之複數種類之抗體之混合物。如此多克隆抗體可 培養產生相異抗體之細胞混合物，可用由該培養物精製之 抗體（W02004/06 1 1 04 號）。 抗體之修飾物也可用與聚乙二醇（PEG)等各種分子結合之 抗體。 本發明之抗體可更與這些抗體和其他藥劑結合形成者 (Immunoconjugate)。如此抗體之例可爲該抗體與放射性物 質或具有藥理作用之化合物結合之物（Nature生技（2005) 23，ρ·1 1 37 - 1 1 46)。 所得抗體可精製至均勻。抗體之分離、精製可於通常之 蛋白質使用之分離、精製方法。 例如將層析柱、過濾器、超濾、鹽析、透析、調製用聚 丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等適宜選擇組合，則可分 離、精製抗體（Strategies for Protein Purification and Charcterization · A Laboratoy Course Manual, Daniel R. -35- 200914064
Marshak φ eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 99 6) > Antibodies - A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))’ 但不受這些 限定。 層析可爲親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠 過濾、逆相層析、吸附層析等。 這些層析可用HPLC或FPLC等液相層析施行。 親和層析所用柱可爲蛋白質A柱、蛋白質G柱。 例如用蛋白質A柱之柱，可爲Hyper D，POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等。 也可用將抗原固定化之載體，利用與抗原之結合性來精 製抗體。 (4)抗DR5抗體之具體例 例如於國際公開小冊、W098/5 1 793、W0200 1/83560、 W02002/94880、WO2003/542 1 6、WO2006/8397 1、W02007 /22 1 57記載之DR5表現細胞誘導細胞凋零之抗DR5抗體乃 可作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分使用。乃稱爲 Lexatumumab、HGSTR2J、AP0MAB、APOMAB7.3、AMG-65 5、LB Y135之抗DR5抗體、及這些變異體也可作爲本發 明之免疫微脂粒之構成成分使用可能。但只要保有對DR5 蛋白質之結合能力、不受上述抗體限定。 3.結合Fas之抗體 (1 )Fas基因 人Fas基因之核苷酸序列及胺基酸序列爲於基因庫以GI :1 82409(登録編號：M67454)登録。又Fas之胺基酸序列 -36- 200914064 中，由1或數個胺基酸被取代、缺失、附加之胺基酸序列 而成，將具有與Fas同等生物活性之蛋白質編碼之核苷酸 序列也包括於Fas基因之核苷酸序列。又Fas之胺基酸序 列中，由1或數個胺基酸被取代、缺失、附加之胺基酸序 列而成，而具有與Fas同等生物活性之蛋白質也包括於 Fas 〇 (2) 對Fas之抗體 至於結合於Fas之抗體、可仿「2.(2)對DR5之抗體」記 載之方法取得。 (3) 其他抗體 至於結合於Fas之抗體、可仿「2. (3)其他抗體」記載之 方法取得。 (4) 抗Fas抗體之具體例 例如於美國專利第6,972,323號記載之於Fas表現細胞誘導 細胞凋零之抗Fas抗體及其變異體可作爲本發明之免疫微 脂粒之構成成分使用。但只要保有對Fas蛋白質之結合能 力、不受上述抗體限定。 4.對其他抗原之抗體 至於DR5及Fas以外之受體，也若該受體含有死亡功能 域時，依上述抗體之製作法可取得於該受體結合’於該受 體表現細胞誘導細胞凋零之抗體。如此抗體成爲本發明之 免疫微脂粒之構成成分。含有死亡功能域之受體可爲 TNFRI、DR3、DR4、DR6等，但只要傳達細胞細胞凋零誘 導信號之受體，則不限於上述記載之受體。 人TNFRI基因之核苷酸序列及胺基酸序列爲於基因庫以 -37- 200914064 GI: 339748(登録編號：M75 866)登録。又TNFRI之胺基酸 序列中，由1或數個之胺基酸被取代、缺失、附加之胺基 酸序列而成，將具有與TNFRI同等生物活性之蛋白質編碼 之核苷酸序列也包括於TNFRI基因之核苷酸序列。又 TNFRI之胺基酸序歹IJ中，由1或數個之胺基酸被取代、缺 失、附加之胺基酸序列而成，具有與TNFRI同等生物活性 之蛋白質也包括於TNFRI。 人DR3 (death receptor 3)基因之核音酸序列及胺基酸序列 爲於基因庫以 GI: 23200020(登録編號：NM_ 1 4 89 65 )登録 。又DR3之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取代、 缺失、附加之胺基酸序列而成，將具有與DR3同等生物活 性之蛋白質編碼之核苷酸序列也包括於DR3基因之核苷酸 序列。又DR3之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取 代、缺失、附加之胺基酸序列而成，具有與DR3同等生物 活性之蛋白質也包括於DR3。 人DR4 (death receptor 4)基因之核苷酸序列及胺基酸序列 爲於基因庫以GI: 2 1 36 1 085 (登録編號：NMJ03844)登録 。又DR4之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取代、 缺失、附加之胺基酸序列而成，將具有與DR4同等生物活 性之蛋白質編碼之核苷酸序列也包括於DR4基因之核苷酸 序列。又DR4之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取 代、缺失、附加之胺基酸序列而成，具有與DR4同等生物 活性之蛋白質也包括於 DR4。例如於國際公開小冊 W0 2002/97300記載之抗體、Mapatumumab、及係這些變異 體之抗DR4抗體可作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分使 -38- 200914064 用。但只要保有對DR4蛋白質之結合能力，則不限於上述 抗體。 人DR6(death receptor 6)基因之核苷酸序列及胺基酸序列 爲於基因庫以GI: 23238206(登録編號：NM_0 1 4452)登録 。又DR6之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取代、 缺失、附加之胺基酸序列而成，將具有與DR6同等生物活 性之蛋白質編碼之核苷酸序列也包括於DR6基因之核苷酸 序列。又DR6之胺基酸序列中，由1或數個之胺基酸被取 代、缺失、附加之胺基酸序列而成，具有與DR6同等生物 活性之蛋白質也包括於DR6。 5 .免疫微脂粒之構成成分 本發明提供含有於參與前述1.至4.記載之細胞凋零之細 胞表面上之受體專一地結合之蛋白質，呈示細胞凋零誘導 活性之免疫微脂粒。 「微脂粒」乃指由兩親媒性小胞形成脂質所形成之脂質 構造體（（D.D.Lasic, Liposomes :. from basic to applications” ， Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 ( 1 99 3)))。微脂粒典型上爲於內部有水相之由單層或多層 脂質雙重層所構成之閉鎖小胞，本發明中乃更廣指粒子狀 之脂質複合體。也包括例如是否具有水相不明確之複合體 。脂質複合體至少含有1種脂質，此外也可指含有親水性 聚合物、多糖類、胺基酸等，這些以共有或非共有結合呈 粒子狀形成者。 「免疫微脂粒」乃指由上述微脂粒與蛋白質所形成之複 -39- 200914064 合體。蛋白質不限於抗體，也包括內因性配體或該內因性 配體之機能性胜肽等。 這些免疫微脂粒含有兩親媒性小胞形成脂質，將參與細 胞凋零誘導之受體專一地結合之蛋白質（抗體、內因性配體 等）及胜肽以共有結合或非共有結合載持於微脂粒。「兩親 媒性小胞形成脂質」爲具有疏水性及親水性部分，更可單 獨於水中形成二層小胞之脂質、或與其他脂質一起吸入脂 質雙重層，此時該雙重膜之內部疏水領域與其疏水性領域 接觸，更包括其親水性領域向該膜之外部極性表面並列之 一切兩親媒性脂質。 「脂質雙重層」爲極性脂質分子之疏水性領域彼此匯合 、疏水性部向二分子層之中心，他方面，親水性領域向水 相配列之構造。 本發明之免疫微脂粒含有（1)兩親媒性小胞形成脂質、（2) 親水性聚合物、（3)蛋白質及胜肽等，也可於微脂粒之內部 含有治療用藥物。又只要不阻礙脂質複合體之形成則無特 限。以下就構成免疫微脂粒之各成分詳述。 (1)兩親媒性小胞形成脂質 構成微脂粒之脂質成分包括磷脂質、糖脂質、神經鞘脂 質、固醇類、二醇類、飽和或不飽和之脂肪酸、界面活性 劑、具有親水性聚合物之衍生物脂質等（參照文獻「 Liposomes : from physics to applications」之 Chapter 1.
Chemistry of lipids and liposomes)。可爲如下示（1)-1.至 -40- 200914064 (1)-8.之例示。 (1)-1.磷脂質 憐脂質大別爲甘油隣脂質和神經銷憐脂質。甘油碟脂質· 之代表性者爲磷脂醯膽鹼（PC)、磷脂醯絲胺酸（PS)、磷脂 醯肌醇（PI)、磷脂醯甘油（PG)、磷脂醯乙醇胺（PE)、磷脂酸 (PA)。他方面，神經鞘磷脂質之代表性者爲鞘髓磷酯類。 可爲以下之（a)至（i)記載之脂質。 (a)磷脂醯膽鹼類 例如二軟脂醯磷脂醯膽鹼（DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼 (DSPC)、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC)、二油醯磷脂醯膽 鹼（DOPC)、二月桂醯磷脂醯膽鹼（DLPC)、二癸醯磷脂醯膽 鹼（DDPC)、二辛醯磷脂醯膽鹼（DOPC)、二己醯磷脂醯膽鹼 (DHPC)、二丁醯磷脂醯膽鹼（DBPC)、二反油醯磷脂醯膽鹼 、二亞麻仁油醯磷脂醯膽鹼、二花生四烯醯磷脂醯膽鹼、 二花生醯磷脂醯膽鹼（DEPC)、二庚醯磷脂醯膽鹼、二己醯 磷脂醯膽鹼、雙十七醯磷脂醯膽鹼、雙二十二醯磷脂醯膽 鹼、桐醯磷脂醯膽鹼、氫化卵磷脂醯膽鹼（HEPC)、氫化大 豆磷脂醯膽鹼（HS PC)、1-軟脂醯-2-花生四烯醯磷脂醯膽鹼 、1-軟脂醯-2-油醯磷脂醯膽鹼、1-軟脂醯-2-亞麻仁油醯磷 脂醯膽鹼、1-軟脂醯-2-肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、1-軟脂醯-2-硬脂醯磷脂醯膽鹼、1-硬脂醯-2-軟脂醯磷脂醯膽鹼、1，2-二肉豆蔻醯胺-1,2-去氧磷脂醯膽鹼、1-肉豆蔻醯-2-軟脂醯 磷脂醯膽鹼、1-肉豆蔻醯-2-硬脂醯磷脂醯膽鹼、二-〇-十六 -41 - 200914064 醯磷脂醯膽鹼、反二反油醯磷脂醯膽鹼、二軟脂醯-磷脂醯 膽鹼、正十八醯-2-甲基磷脂醯膽鹼、正十八醯磷脂醯膽鹼 、1-月桂基丙一醇-3 -憐醯基膽鹼、赤-N -二十四酸基神經 鞘磷脂醯膽鹼、軟脂醯-(9 -順-油醯基）-3 - s η -磷脂醯膽鹼等 〇 (b) 磷脂醯絲胺酸類 例如二硬脂醯磷脂醯絲胺酸（DSPS)、二肉豆蔻醯磷脂醯 絲胺酸（DMPS)、二月桂醯磷脂醯絲胺酸（DLPS)、二軟脂醯 磷脂醯絲胺酸（DPPS)、二油醯磷脂醯絲胺酸（DOPS)、溶磷 脂醯絲胺酸、桐醯磷脂醯絲胺酸、1,2-二-(9-順-油醯基）-3-sn-磷脂醯絲胺酸等。 (c) 磷脂醢肌醇類 例如二軟脂醯磷脂醯肌醇（DPPI)、二硬脂醯磷脂醯肌醇 (DSPI)、二月桂醯磷脂醯肌醇（DLPI)等。 (d) 磷脂醯甘油類 例如二軟脂醯磷脂醯甘油（DPPG) '二硬脂醯磷脂醯甘油 (DSPG)、二油醯磷脂醯甘油（DOPG)、二月桂醯磷脂酿甘油 (DLPG)、一肉丑寇酸憐脂酸甘油（DMPG)、溶憐脂酿甘油、 氫化大豆磷脂醯甘油（HSPG)、氫化卵磷脂醯甘油（HEPG)、 心磷脂（二磷脂醯甘油）等。 (e) 磷脂醯乙醇胺（cephalin)類 例如二軟脂醯磷脂醯乙醇胺（DPPE)、二硬脂醯磷脂醯乙 醇胺（DSPE)、二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE)、二月桂醯磷脂 -42- 200914064 醯乙醇胺（DLPE)、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺（DMPE)、二癸 醯磷脂醯乙醇胺（DDPE)、N-戊二醯磷脂醯乙醇胺（NGPE)、 溶磷脂醯乙醇胺、N-(7-硝基-2，1，3-苄醯氧二唑-4-基）-1，2-二油醯-sn-磷脂醯乙醇胺、桐醯磷脂醯乙醇胺、N-丁二醯 油醯磷脂醯乙醇胺、1 -十六醯-2-軟脂醯甘油磷脂醯乙醇胺 等。 ⑴磷脂酸類 例如二軟脂醯磷脂酸（DPPA)、二硬脂醯磷脂酸（DSPA)、 二肉豆蔻醯磷脂酸（DMPA)、二油醯磷脂酸（DOPA)等。 (g) 神經鞘磷脂質 例如鞘髓磷酯類、二軟脂醯鞘髓磷酯類、二硬脂醯鞘髓 磷酯類、神經醯胺（ceramide)、胺乙基磷酸（CiliaUne)、神 經醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基甘油等。 (h) 具有聚合性殘基之聚合性磷脂質 作爲不飽和磷脂質、具有聚合性殘基之聚合性磷脂質可 爲例如1,2 -雙（2,4 -十八碳二烯醯基）-sn -甘油-3-磷醯基膽鹼 、1，2-雙（2,4-十六碳二烯醯基）-^-甘油-3-憐醯基膽鹼、1-( 十八醯基）-2-(2,4-十八碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼 、1-(十六醯基）-2-(2,4-十八碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基 膽鹼、1-(十八醯基）-2-(2,4 -十六碳二烯醯基）-sn -甘油-3-磷 醯基膽鹼、1-(十六醯基）-2-(2,4-十六碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼、l-(2,4-十八碳二嫌醯基）-2-(十八醯基）-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼、1-(2,4-十六碳二烯醯基）-2-(十六醯基 -43- 200914064 )-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼、1,2-雙-(8,10,12-十八碳三烯醯基 )-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼、1，2-雙（12-甲基丙烯醯癸醯基）-sn-甘油-3-磷醯基膽鹼、l，2-雙（9-(對乙烯苄醯基）壬醯基）_ sn -甘油-3-磷醯基膽鹼等。 又別之聚合性磷脂質可爲例如1，2-雙（2,4-十八碳二烯醯 基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1,2-雙（2,4-十六碳二烯醯基 )-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1-(十八醯基）-2-(2,4-十八碳二 烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1-(十六醯基）-2-(2,4-十 八碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1-(十八醯基）-2-(2,4-十六碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1-(十六 醯基）-2-(2，4-十六碳二烯醯基）-s η-甘油-3-磷醯基乙醇胺、 1-(2,4-十八碳二烯醯基）-2-(十八醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙 醇胺、1-(2,4-十六碳二烯醯基）-2-(十六醯基）-sn-甘油-3-磷 醯基乙醇胺、1，2-雙-(8,10,12-十八碳三烯醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1,2-雙（12-甲基丙烯醯癸醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺、1,2-雙（9-(對乙烯苄醯基）壬醯基）-sn-甘油-3-磷醯基乙醇胺等。 更別之聚合性磷脂質可爲例如1,2-雙（2,4-十八碳二烯醯 基）-sn-甘油-3-磷酸、1,2-雙（2,4-十六碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷酸、1-(十八醯基）-2-(2,4-十八碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷酸、1-(十六醯基）-2-(2,4 -十八碳二靖酸基）-sn -甘油-3-磷 酸、1-(十八醯基）-2-(2,4 -十六碳二烯醯基）-sn -甘油-3-磷酸 、1-(十六醯基）-2-(2,4-十六碳二烯醯基）-sn-甘油-3-磷酸、 -44 - 200914064 1-(2，4 -十八碳二烯醯基）-2-(十八醯基）_sn_甘油-3-磷酸、卜 (2,4 -十六碳二烯醯基）-2-(十六醯基）-Sn_甘油_3_磷酸、i，2_ 雙-(8，10，12-十八碳三烯醯基）-311，甘油-3_磷酸、1，2-雙（12_ 甲基丙稀酿癸醯基）-sn-甘油-3-憐酸、；1,2 -雙（9-(對乙燒节 酿基）壬酿基）-sn -甘油-3-隣酸等憐酸衍生物或其鹽等。 又於聚合性磷脂質也可含有非聚合性脂肪酸殘基、非聚 合性脂肪酸殘基可爲碳數2~24之直鏈或分岐鏈之院基、 酿基、非聚合性嫌基、非聚合性嫌醯基等。 ⑴其他磷脂質 以磷脂醯酥胺酸、磷酸二鯨蠟酯、溶磷脂質、係屬以磷 脂醯膽鹼爲主成分含有隣脂醯乙醇胺.鞘髓碟酯類·膽固醇 等之複數種脂質之混合物之蛋卵磷脂、大豆卵磷脂。 (1)-2.糖脂質 糖脂質可大別甘油糖脂質和神經鞘糖脂質。可爲如下（a) 至（c)之脂質。 (a)甘油糖脂質 例如二糖基一甘油醋、糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘 油醋、半乳糖基一甘油酯、擴酸氧基核糖基二甘油酯、 (1，3)-D-甘露糖基（1，3)二甘油酯、二半乳糖基甘油酯、二 半乳糖基二月桂醯甘油酯、二半乳糖基二肉豆蔻醯甘油醋 、二半乳糖基二軟脂醯甘油酯、二半乳糖基二硬脂醯甘油 醋、半乳糖基甘油醋、半乳糖基二月桂醢甘油酯、半乳糖 -45- 200914064 基一硬脂醯甘油酯、二半乳糖基二醯基甘油等。 (b) 神經鞘糖脂質 例如神經醯胺（腦苷脂（Cerebroside))、半乳糖基神經醯胺 '乳糖基神經醯胺、二半乳糖基神經醯胺、神經節苷脂 (gangli〇slde)GMi、神經節苷脂GM2、神經節苷脂GM3、硫 脂質（sulfatide)、神經醯胺寡己苷脂、古羅保苷脂。 (c) 其他糖脂質 神經醯胺寡己苷脂、軟脂醯苷脂、硬脂醯苷脂、十四醯 苷脂、烷基苷脂、胺苯基苷脂、膽固醇甘露糖基苷脂、膽 固醇基苷脂、3-膽固醇基-6’ -(糖硫基）己醚糖脂質、糖 醯胺類等。 (1)-3.固醇類 固醇類之最代表性者爲膽固醇。已知膽固醇有助脂質雙 重層構造之膜剛性及安定性。膽固醇之外，固醇類可爲例 如膽固醇丁二酸、二氫膽固醇、羊毛蘭醇、二氫羊毛蘭醇 、碳鏈固醇、豆固醇、麩固醇、菜子固醇（Brassicasterol) 、酵母固醇（zymosterol)、麥角固醇（Ergosterol)、菜油 (Campesterol)固醇、岩藻固醇（Fucosterol)、22-酮固醇、 20-羥基固醇、7-羥基膽固醇、19-羥基膽固醇、22-羥基膽 固醇、25-羥基膽固醇、7-去氫膽固醇、5α-膽固醇-7-烯-3y5-醇、表膽固醇、去氫麥角固醇、硫酸膽固醇、半丁二 酸膽固醇、酞酸膽固醇、磷酸膽固醇、戊酸膽固醇、膽固 醇半丁二酸酯、3厶Ν-(Ν'，Ν'二甲基胺乙烷）-胺甲醯基膽固 醇、膽固醇乙酸酯、膽固醇油酸酯、膽固醇亞麻仁油酸酯 -46- 200914064 、膽固醇十四酸酯、膽固醇十八酸酯、膽固醇二十酸酯、 糞固醇（coprostanol)、膽固醇酯、膽固醇磷醯基膽鹼、 3,6,9-三咢辛烷-1-醇-膽固醇基-3e-醇等。 (1)-4.中性脂質 中性脂質可爲例如二甘油酯（例如二甘油三油酸酯、二甘 油三軟脂酸酯）及混合甘油三癸酸酯-癸酸二甘油酯 '三醯 基甘油（三甘油三油酸酯、三甘油三軟脂酸酯、三甘油三肉 豆蔻酸酯、三甘油三月桂酸酯、三甘油三癸酸酯、三甘油 三癸酸酯、三甘油三己酸酯等）、角鯊烯、生育酚、膽固醇 等。 (1)-5.飽和或不飽和脂肪酸 飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸可爲例如辛酸、壬酸、癸酸 、十一碳烯酸、十二碳烯酸、十三碳烯酸、十四碳烯酸、 十五碳烯酸、十六碳烯酸、十七碳烯酸、十八碳烯酸、十 九碳烯酸、二十碳烯酸、二十二碳烯酸、二十四碳烯酸、 油酸、亞油酸、亞麻酸、icoseric acid、芥酸（erucic acid) 、二十二碳五烯酸等碳數5〜30之飽和或不飽和之脂肪酸 (1)-6.荷電性脂質 可爲如下（a)至（b)記載之脂質。 (a)陰離子性脂質 陰離子性脂質乃指具有生理學pH中負電荷之脂質。磷脂 醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、心磷脂 (cardiolipin)等酸性磷脂質、油酸、十六碳烯酸、十八碳烯 -47- 200914064 酸、十四碳烯酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸、神經節昔脂 GMi '神經節苷脂GM2、神經節苷脂GM3等神經節苷脂類 、二鯨蠟基磷酸等酸性脂質、N-醯基-L-麩醯胺酸等酸性胺 基酸系界面活性劑等。 (b)陽離子性脂質 陽離子性脂質乃指具有生理學pH正電荷之脂質。ν,Ν-二 硬脂醯基-Ν,Ν·二甲基溴化銨（DDAB)、鯨蠛基三甲基溴化 銨（CTAB)、Ν-(α-三甲基乙醯銨）-雙十二醯基-D-麩胺醯氯 (TMAG)、DL-1，2-二油醯基-3-二甲基胺丙基-yS -羥乙基銨 (DORI)、N-[l-(2,3-二油醯氧基）丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙 基溴化銨（DORIE)、N-(l，2-雙十四醯氧丙基）-3-基）-N，N-二 甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE)、（1，2-二油醯氧丙基）-Ν,Ν,Ν-三甲基氯化銨（DOTMA)、雙十七醯胺甘胺醯亞精胺 、Ν,Ν-雙十八醯胺-甘胺醯精胺' Ν，Ν-雙十八醯胺甘胺酸、 1，2-二油醯基-3-丁二醯基- sn-甘油膽鹼酯（DOSC)、1,2-二油 醯基-sn-甘油-3- 丁二醯基-2-羥乙基二硫化鳥胺酸 (DOGSDSO)、鯨蠟基氯化吡錠（CPyC)、1,2-二油醯基-sn-甘 油-3-乙基磷醯基膽鹼（DOEPC)、N-(l-(2,3-二油醯基氧基） 丙基）-N-(2-(精胺羧醯胺基）乙基）-N，N-二甲基銨三氟乙酸 酯（0〇5?八）、1(1-(2,3-二油醯氧基）丙基）-1^，1^，1^-三甲基氯 化銨（DOTAP)、Ν,Ν-二油醯基-N，N-二甲基氯化銨（DODAC) 、1,2-二油醯-sn-3-磷醯基乙醇胺（DOPE)、1,2-二油醯-3-(4'三甲基銨基）丁醯基-sn-甘油（D0BT)、1,3-二油醯氧-2-(6-羧精胺基）_丙醯胺（D0SPER)、二軟脂醯磷脂醯基乙醇醯 -48- 200914064 胺基精胺（DPPES)等脂多胺、0-烷基磷脂醯膽鹼、0-烷基 磷脂醯乙醇胺、離胺酸·精胺酸或鳥胺酸之醯胺及磷脂醯 乙醇胺、3 A -(Ν-(Ν'Ν'二甲基胺乙烷）胺甲醯基）膽固醇 (DC-Chol)、3-/3 -[Ν-(Ν',Ν'，Ν'_三甲基胺乙烷）胺甲醯基]膽 固醇（TC-Chol)、雙-胍基-亞精胺-膽固醇（BGSC)、雙-胍基-tren-膽固醇（BGTC)、（4'三甲基氨）丁酸膽固醇基（ChOTB) 、3/S-N-(聚乙烯亞胺）-胺甲醯基膽固醇、碘化膽固醇基-3/3-羧醯胺基-伸乙基三甲基銨、卜二甲胺基-3-三甲基銨 基-DL-2-丙基-膽固醇基羧醯碘、膽固醇基-3/S-羧醯胺伸乙 基乙二胺、碘化膽固醇基-3点-氧丁二醯胺-伸乙基三甲基 錶、1-二甲胺基-3-三甲基銨基-DL-2-丙基-膽固醇基-3召-氧丁二醯碘、2-(2-三甲基銨基）-乙基甲胺基乙基-膽固醇 基-3/3-氧丁二醯碘、膽固醇基半丁二酸酯、長鏈乙二胺、 長鏈吡錠化合物、第四銨化合物等。 (1)-7.界面活性劑 界面活性劑可大別爲親水性部分爲離子性之（a)陽離子性 界面活性劑、（b)陰離子性界面活性劑、（c)兩性界面活性 劑、和親水性部分爲非離子性之（d)非離子性界面活性劑。 (a)陽離子性界面活性劑 陽離子性界面活性劑可爲烷基乙二胺鹽、醯基乙二胺鹽 、第四級銨鹽、乙二胺衍生物等。具體而言，.苄烷氯化銨 、醯胺基乙基二乙基乙二胺鹽、N-烷基聚烷基聚乙二胺鹽 、脂肪酸聚伸乙基聚醯胺、鯨蠟基三甲基溴化銨、十二醯 基三甲基溴化銨、烷基聚氧乙烯乙二胺、N-烷基胺丙基乙 -49- 200914064 二胺、脂肪酸三乙醇胺酯等。 (b) 陰離子性界面活性劑 陰離子性界面活性劑可爲醯基肌胺酸、烷基硫酸鈉 基苯磺酸鈉、烷基硫酸酯鈉、烷基醚硫酸酯鈉、α烯 鈉、α 磺酸基脂肪酸酯鈉、碳數7~22之脂肪酸鈉及 酸鉀等。具體而言，十二醯基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉 酸鈉、去氧膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉等。 (c) 兩性界面活性劑 兩性界面活性劑可爲烷胺基脂肪酸鈉、烷基甜菜鹼 基乙二胺氧化物等。具體而言，3-[(3-膽醯胺丙基）二 基]-1-丙磺酸、Ν-十四基-Ν，Ν-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸 (d) 非離子性界面活性劑 非離子性界面活性劑可爲聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙 苯基醚、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪 、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸烷醇醯胺、 聚合物型非離子界面活性劑、烷基乙二胺型非離子界 性劑、烷醯胺型非離子界面活性劑等。具體而言，單 聚氧乙烯山梨聚糖、聚山梨酸酯80、聚氧乙烯聚氧丙 、PluronicF68、山梨聚糖單月桂酸酯、山梨聚糖單油 、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇等。 (1)-8.與前述脂質之任一親水性聚合物結合之「親水 合物之脂質衍生物」（於「6.(1)脂質與親水性聚合物 合樣式」詳載）也可作爲本發明之免疫微脂粒之構成成 用。 、垸 磺酸 脂肪 、膽 、院 甲銨 等。 烯烷 酸酯 嵌段 面活 油酸 二醇 酸酯 性聚 之結 分使 -50- 200914064 將如上示兩親媒性小胞形成脂質依通常適宜混合來調製 微脂粒。至於代表性脂質組成，以磷脂質或糖脂質爲主成 分，更將固醇類對總脂質莫耳數以20至50莫耳％之比例 含有之脂質組成。宜以磷脂醯膽鹼類爲主成分，更將膽固 醇對總脂質莫耳數以20至50莫耳％之比例含有之脂質組 成。 (2)親水性聚合物 微脂粒投與血液循環中，具有易被肝臟、脾臟、肺等細 網內皮系（RES : reticulo-endothelial system)捕捉之性質。 此若標的臟器爲肝臟或肺等則成有利性質，但若以全身作 用爲目的時，標的部位爲RES以外之場合成爲大缺點。親 水性聚合物之存在提供血中滯留性之改善和回避由RES之 吸入微脂粒之性質。又親水性聚合物之存在，也提供微脂 粒保存中分散安定性。 本發明之免疫微脂粒所用親水性聚合物之種類爲聚乙烯 吡咯啶酮（PVP)、聚伸烷基氧化物、聚烷二醇（例如聚乙二 醇（PEG)、聚丙二醇、聚四甲二醇、聚六甲二醇等）、聚甘 油、聚丙烯酸、聚丙烯醯胺、聚乙烯亞胺、聚縮水甘油、 神經節苷脂、葡聚糖、藻醇、聚乙烯醇、聚乙烯甲基醚、 聚甲基咢唑啉、聚乙基咢唑啉、聚羥丙基咢唑啉、聚羥丙 基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、 聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維 素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚天冬醯胺 '聚胺基 磷腈（phosphazene)、聚（羥烷基羧酸）、乙二醇-丙二醇共聚 -51 - 200914064 合體、苯乙烯-馬來酸酐共聚合體、二乙烯醚-馬來酸酐交 互共聚合體、環糊精、玻尿酸'硫酸腦苷脂、軟骨素硫酸 、多糖類（例如直鏈澱粉、支鏈澱粉、果膠、甲殼質、甘露 聚糖、三聚葡糖、角叉聚糖' 甲基纖維素等）、多肽、合成 聚胺基酸（例如聚-L-離胺酸等）等。 上述親水性聚合物爲由1以上之反復單位構造而成，其 單位構造數無限制，可爲直鏈型也可爲分岐型。宜分子量 爲5 00至20000之親水性聚合物，更宜分子量爲2000至 5 000之親水性聚合物。又這些聚合物可作爲同質聚合物及 嵌段或無規共聚物。例如含有由聚乳酸、聚乙醇酸而成之 聚乳酸/聚乙醇酸共聚物等。 上述親水性聚合物可爲烷基、烷氧基、羥基、羰基、烷 氧羯基、氰基、胺基、硫醇基、馬來醯亞胺基、乙嫌擴酿 基、醯肼基等取代基導入之衍生物。 爲回避血中滯留性之改善和由RES之微脂粒之吸入目的 中，宜微脂粒中親水性聚合物或親水性聚合物之脂質衍生 物之含量爲對總脂質莫耳數可爲0· 1至10莫耳％之比例。 更宜對總脂質莫耳數爲1至6莫耳％之比例。 (3)蛋白質 可將上述「2.於DR5結合之抗體」、「3.於Fas結合之抗 體」、及「4.於其他抗原結合之抗體」所述抗體作爲本發 明之免疫微脂粒之構成成分。又至於將具有對本發明記載 之細胞凋零誘導能力之受體之天然配體結合之微脂粒也爲 本發明之範圍。更可將於含有死亡功能域之受體專一地結 -52- 200914064 合之人工胜肽也可作爲本發明之免疫微脂粒之構成成分。 如此人工胜肽之例可爲於Fas結合之機能性胜肽 (Yoshimori 等，Apoptosis 10 (2)，323 -3 29 (2005))。又由上 述分子群選擇於同一抗原結合之2種類以上分子，於同一 免疫微脂粒上共存，則可改善對特定抗原之結合能力。更 由上述分子群選擇於相異抗原結合之2種以上分子，於同 一微脂粒上共存，則也可對複數抗原作用。 (4) 內水相 若微脂粒內部有水相存在時，水相所用水溶液只要不阻 礙微脂粒之形成則無特限。通常可使用氯化鈉水溶液、緩 衝液（磷酸緩衝液 '乙酸緩衝液、HEPES緩衝液等）、單糖 類或二糖類之水溶液（葡萄糖水溶液、繭蜜糖水溶液等）。 (5) 添加劑 於免疫微脂粒之構成成分也可更添加機能性賦予劑。如 此機能性賦予劑可爲如膜安定化劑、膜表面之親水性調整 劑、曲率調整劑、抗氧化劑、電荷賦予劑、凍結保護劑等 。例如糖、糖脂質、甘油、聚乙二醇等安定劑、生育酚或 抗壞血酸等氧化防止劑。膽固醇類可作爲膜安定化劑、膜 表面之親水性調整劑或微脂粒之曲率調整劑等、生育酚類 可作爲抗氧化劑使用。 又於免疫微脂粒加上述添加劑時，其種類和含量無特限 ，可考慮免疫微脂粒之物性而適宜選擇。 (6) 內封藥物 又本發明之免疫微脂粒可於內水相將親水性藥物、及於 200914064水性藥物封入。封入之藥物只要不阻礙微脂粒之 形成則無特限，可爲抗腫瘤劑、抗風濕劑、抗病毒劑、抗 菌劑等具有細胞傷害活性之藥物。抗腫瘤劑可爲例如下列 歐黴素（Bleomycin)、Carboplatin、Chlorambucil、cisplatin 、秋水仙素（colchicine)、cyclophosphamide、陶諾黴素 (Daunorubicin) 達可及諾黴素（Dactinomycin)、 Diethylstilbestrol、Doxorubicin、Etoposide、5-氟尿喷 D定、 氟尿苷（Floxuridine)、Melphalan、gemcitabine、Imatinib、 irinotecan、Methotrexate、埋多黴素（mitomycin)、6-氫硫基 嘌吟、paclitaxel (Taxol)、Nexavar、SUTENT、Teniposide 、6 -硫基鳥嘌哈、Vincristine、Vinblastine。抗癌化合物及 治療劑之例更見於 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第 15 編、Berkow 等編，1987、Rahway, N. J.及 Sladek 等 Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1 987, Powis 等編、Taylor 及 Francis, New York, N. Y.。 自體免疫疾病治療劑或抗炎症劑可爲例如雙氯芬酸 (Diclofenac) 、 Loxoprofen 鈉、celecoxib 、 Etodolac 、 meloxicam 、 Rofecoxib ，比羅昔康（Piroxicam)、 indomethacin、異丁 苯丙酸（Ibuprofen)、naproxen 等非類固 醇性抗炎症劑，或例如胺甲喋呤（Methotrexate)、 Chloroquine 、氫化 Chloroquine 、環孢素（cyclosporin)、 penicillamine、Sulfasalazine、Π丫 硫基嘿 π令、Leflunomide 等 疾病修飾性抗風濕藥。 如上所述，可將各種藥劑封入免疫微脂粒之內水相來作 -54- 200914064 用。他方面’上述藥劑也可以未封入免疫微脂粒之狀態而 與免疫微脂粒倂用來作用於標的細胞。 6.免疫微脂粒成分之結合樣式 本發明之免疫微脂粒由兩親媒性小胞形成脂質、親水性 聚合物、蛋白質、胜肽、糖等構成而前述脂質、蛋白質、 胜肽及親水性聚合物形成共有結合或非共有結合。本發明 之免疫微脂粒之形態也可於微脂粒表面直結蛋白質、胜肽 等機能性分子、或仲介親水性聚合物而於微脂粒結合。前 者之場合，親水性聚合物也可於微脂粒直結而含有。 (1)脂質與親水性聚合物之結合樣式 親水性聚合物之脂質衍生物爲由上述5.(1)記載之兩親媒 性小胞形成脂質與上述5. (2)記載之親水性聚合物而成，其 組合無特限，可依目的而適宜選擇。脂質與親水性聚合物 由具有脂質之官能基（含有於脂質人爲導入之官能基）與具 有親水性聚合物之官能基（含有於親水性聚合物人爲導入之 官能基）仲介直接或接頭形成共有結合。 於親水性聚合物之脂質衍生物可爲以下者，但不限於此 。親水性聚合物之脂質衍生物爲例如聚乙二醇修飾脂質、 聚乙烯亞胺衍生物、聚乙烯醇衍生物、聚丙烯酸衍生物、 聚丙烯醯胺衍生物、葡聚糖衍生物、聚甘油衍生物、甲殼 質衍生物、聚乙烯吡咯啶酮衍生物、聚天冬醯胺酸醯胺衍 生物、聚-L-離胺酸衍生物、甘露聚糖衍生物、三聚葡糖衍 生物等。 「聚乙二醇（PEG)修飾脂質」可爲文獻（（D.D.Lasic， -55- 200914064 ” Liposomes : from basic to applications” ，Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 (1993))之” Chapter 11. Liposomes as a drug delivery system”）記載之聚乙二醇（PEG)修飾憐脂酸 乙醇胺類，更具體而言，N-單甲氧基聚乙二醇丁二醯基磷 脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇羰基磷脂醯乙醇胺類 、N-單甲氧基聚乙二醇伸乙基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧 基聚乙二醇羰乙羰基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二 醇羰丙羰基磷脂醯乙醇胺類、N-單甲氧基聚乙二醇（2-氯-1，3,5-三哄-4,6-二基）丁二醯基磷脂醯乙醇胺類、二-CI2 h 醯基-甘油-磷脂醯乙醇胺-N-PEG、二-Cm*醯基-甘油-單 PEG醚、單C12.^醯基甘油-二PEG醚、聚乙二醇烷基醚、 N-(2,3-雙十四醯氧丙基）醯胺聚乙二醇甲基醚、N-(2,3-雙 十四醯氧丙基）胺甲酸酯聚乙二醇甲基醚、N_(2,3_雙十四 醯氧丙基）丁二醯胺聚乙二醇甲基醚、神經鞘胺醇-丨_( 丁二 醯基甲氧基聚乙二醇類、神經鞘胺醇-i-( 丁二醯基（甲氧基 聚乙二醇））類、聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂 肪酸酯（例如單硬脂酸聚乙二醇、單油酸聚乙二醇、二甘油 三月桂酸酯酸聚乙二醇、二硬脂酸聚乙二醇、二油酸聚乙 二醇、硬脂酸二乙二醇等）、聚乙二醇蓖麻油、吡咯啶酮羧 酸異硬脂酸PEG-40水添蓖麻油、單甲氧基聚乙二醇-3,5-雙十五烷氧苄基胺甲酸酯、4_(Ν'(甲氧基聚乙二醇羰基）2-胺乙基）Ν，Ν-二硬脂醯苄醯胺、DSPE-pEG(N0F公司製品、 SUNBRIGHT DSPE-020C ' DSPE-050C ' DSPE-020G ' DSPE-〇 5 0G 、 DSPE-020CN 、 DSPE-050CN) ' D S PE-Multi - arm -56- 200914064 PEG(NOF 公司製品、SUNBRIGHT DSPE-PTE020)、DSPE-Comb·型 PEG(NOF 公司製品、SUNBRIGHT DSPE-AM0530K) 、二醯基甘油-PEG(NOF公司製品、SUNBRIGHT GS-020，GS-050)、膽固醇-PEG(N〇F 公司製品、SUNBRIGHT CS-010、CS -020、C S -050) ' PEG-Ceramide(Avanti POLAR LIPID公司製品）、mPEG-DTB-DSPE(DTB ;二硫苄基 '國際 公開小冊、W02005/05 135 1)、PEG-DAA(DAA ;二烷氧丙基 、國際公開小冊W02005/026372)等。 其他親水性聚合物之脂質衍生物之具體例可爲聚氧乙烯 蓖麻油·硬化蓖麻油（例如聚氧乙烯POE(3)蓖麻油、POE(5) 硬化蓖麻油等）、Ν-[ω-甲氧基聚（氧伸乙基）-α氧羰基]-磷 脂醯乙醇胺類、〇-(Cm8烷醯基或烯醯基）三聚葡糖、Ν-烷醯基或烯醯基）聚丙烯醯胺、DSPE-聚甘油（NOF公 司製品、SUNBRIGHT DSPE-PG8G)等。 將親水性聚合物結合於脂質之方法有U)於預先形成之微 脂粒分散液結合親水性聚合物之方法、（b)將親水性聚合物 之脂質衍生物於調製之微脂粒加入之方法。 (a) 於預先形成之微脂粒結合親水性聚合物之方法，例如用 甲苯磺醯氯活性化PEG，此續於含有具有胺基之脂質（磷脂 醯乙醇胺等於微脂粒高pH條件下添加，得以親水性聚合 物修飾之微脂粒（Senior 等，Biochim. Biophys. Acta.1-62: 7 7-82 (1991 ))。又其他多數結合也可利用爲當業者周知。 (b) 調製親水性聚合物之脂質衍生物而於微脂粒加入之方法 ，親水性聚合物可作爲結合脂質之衍生物使用，則可將其 -57- 200914064 疏水性部位插入微脂粒之脂質層。將這些親水性聚合物衍 生物於預先形成之微脂粒分散液來加溫，或將親水性聚合 物衍生物於微脂粒構成脂質成分之混合時添加，得以親水 性聚合物修飾之微脂粒。由親水性聚合物來衍生物化之脂 質之製造可例如美國專利第5,395,6 1 9號記載，可依公知 之方法製造。例如欲磷脂質之反應活性官能基與PEG共有 結合’可用氰尿酸氯之方法.（Blume等，Biochim.Biophys. Acta .1 029: 9 1 -97 (1990)及美國專利第 5,21 3,804 號）、用 簾醯亞胺基之方法（Proc.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact. Mater., 17 ： 77-7 8 ( 1 990) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 ： 11460-11464 (1991) ; Biochim· Blophys .Acta.， 1066 : 29-36 (1991)； Biochim. Biophys. Acta., 1105： 193-200 (1992)； Period. Biol.，93: 349-352 (1991))、用酸酐之方法、用戊 二醛之方法等公知之方法。 (2)脂質與蛋白質之結合樣式 於微脂粒將蛋白質或胜肽等固定化之方法可爲如下述（1) 至（X)之方法。構成微脂粒之脂質與蛋白質之結合爲脂質具 有之官能基（包括於脂質人爲導入之官能基）與蛋白質具有 之官能基（包括於蛋白質人爲導入之官能基）之共有結合、 或基於物理·生物學親和性之非共有結合來形成。形成共 有結合之官能基之組合爲例如胺基/羧基、胺基/N-羥丁二 醯亞胺基酯、胺基/醛基 '胺基/甲苯磺醯基、胺基/硝苯羰 基、胺基/縮醛基、胺基/異硫氰酸酯基、胺基/鹵化醯基、 胺基/苯并三唑羧酸酯基、醯肼基/醛基、硫醇基/馬來醯亞 -58- 200914064 胺基、硫醇基/乙烯磺醯基等、硫醇基/硫醇基等。非共有 結合可利用疏水結合或抗生物素蛋白（avidin) /生物素、 聚組胺酸標記/鎳等專一結合。 (i)於蛋白質導入疏水性基，則對疏水環境下之微脂粒之脂 質層予以親和性，將此加入別途調製之微脂粒之方法 (Biochimica et Biophysica Acta, 812， 116(1985)) 〇 (η)將抗體或內因性配體作爲與細胞之膜蛋白質之融合蛋 白質來表現，將此膜蛋白部分於別途調製之微脂粒加入之 方法（莫耳 Med. 7 ( 1 0) 723，（2001 ))。 (iii) 若微脂粒構成脂質成分爲糖脂質時，將其糖以氧化劑 氧化而生成醛基，將此與蛋白質之胺基反應而形成許夫鹼 來使脂質與蛋白質結合之方法（Biochimica et Biophysica Acta. 640，66 ( 1 98 1 ))。 (iv) 微脂粒調製時將具有能與胺基反應之官能基之脂質混 合，於此將蛋白質之Lys殘基之ε -胺基或N末端之α -胺 基反應而加入微脂粒之方法U. Immunol Methods. 1983, 65(3) : 295-306)。 將蛋白質之胺基與脂質共有結合時，脂質所必要之反應 性官能基可爲例如N-羥丁二醯亞胺基酯（NHS酯）、醛基、 甲苯磺醯基 '硝基苯羰基、縮醛基、羧基、異硫氰酸酯基 、鹵化醯基、苯并三唑羧酸酯基等。 (v) 微脂粒調製時將具有能與硫醇基反應之官能基之脂質混 合，於此將與具有硫醇基之蛋白質反應之方法Uounial of Immunological Method, 75,35 1 ( 1 984) ； Biochemical and -59- 200914064
Biophysical Research Communications, 1 1 7, 399 (1 983))° 賦予蛋白質硫醇基已知用N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫 基）丙酸酯（SPDP)(Carlsson，J.等 Biochem. J. 173，723, ( 1 978))或N-丁二醯亞胺基-S-乙醯硫乙酸酯（SATA)、N-丁 二醯亞胺基-S-乙醯硫丙酸酯（SATP)、亞胺基噻茂烷（Traut， R. R.等 Biochemistry 12，3266 ( 1973))、氫硫烷基亞胺酸 酯等化合物來施行之方法爲公知。上述方法之外，將蛋白 質之內在性二硫醇基還原成硫醇基而可作爲結合使用。尤 其蛋白質爲抗體時，可利用抗體（全長或片段）之鉸鏈領域 及重鏈與輕鏈之連結部位之二硫醇基，抗體與脂質之結合 中以用內在性硫醇基之後者之方法由蛋白質之活性維持之 點較佳。例如可將IgG抗體以胃蛋白酶等酵素予以 F(ab’ ）2化、可將以二硫基蘇醇等還原而得之Fab’所生成 之硫醇基供結合（Martin，F. J.等 Biochemistry 20，4229 (1981))。IgM 之場合，可仿 Miller 等之方法（J .Biol. Che m 25 7，286 ( 1 965))，以穏和之條件將J鏈還原所得之IgMs之 Fc部分之硫醇基供結合。 蛋白質之硫醇基與脂質予以共有結合時必要之脂質之官 能基爲馬來醯亞胺基、乙烯磺醯基、硫醇基等。例如含有 馬來醯亞胺基之脂質可爲N-(3-(2-吡啶二硫基）丙醯基）磷 脂醯乙醇胺、N-(間馬來醯亞胺苄醯基）二軟脂醯磷脂醯乙 醇胺、N-(4-對馬來醯亞胺苯基）丁醯磷脂醯乙醇胺（MPB-PE)等。馬來醯亞胺基化試藥可爲Ν-( ε -馬來醯亞胺基己 醯氧基）丁二醯亞胺之外，製作胺基之馬來醯亞胺基衍生物 -60- 200914064 一般使用之N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）丁酸酯 (SMPB)，N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）丙酸酯、 N- (r-馬來醯亞胺基丁醯氧基）丁二醯亞胺等。 又可以上述馬來醯亞胺基化試藥將蛋白質之胺基取代爲 馬來醯亞胺基。這些與具有硫醇基之例如將吡啶二硫基丙 酸酯（PDP)等修飾之脂質反應而形成共有結合。 (vi)微脂粒調製時混合具有能與醛基反應之官能基之脂質 、結合糖鏈由來之醛基之方法。 通常真核生物中，蛋白質爲由翻譯後修飾而接受糖鏈修 飾。尤其抗體之場合，於其Fc領域有糖鏈存在。將這些 糖鏈氧化而生成之醛基與醯肼反應而形成共有結合，故於 脂質修飾醯耕，則可仲介糖鏈將蛋白質及胜肽固定化於脂 質（B i 〇chi mica e t B i ophy s ica Acta 1 420 1 5 3 - 1 67 ( 1 999))。 (vU)微脂粒、蛋白質各所具有之官能基彼此用交聯劑或縮 合劑等來結合之方法。 將脂質所具有之胺基與蛋白質之胺基結合，則可於微脂 粒表面將蛋白質固定化（Biochemical and Biophysical Research Communications, 89， 1 1 14 (197 9) ； Liposome
Technology，1 5 5 (1 983))。具有胺基之脂質爲例如磷脂醯乙 醇胺、磷脂醯絲胺酸或磷脂醯酥胺酸等。蛋白質之胺基爲 由離胺酸殘基之ε -胺基及N末端之α -胺基來提供。欲於 由具有胺基之脂質構成之微脂粒將蛋白質固定化、可採用 以戊二醛將脂質之胺基與蛋白質之胺基直接交聯之方法、 用反應活性試藥將脂質之胺基與蛋白質之胺基予以化學結 -61 - 200914064 合之方法等公知之方法。二價交聯劑除戊二醛之外，可爲 二丁二醯亞胺基辛二酸酯（DSS)、酞醛、對酞醛等二醛、 甲基庚二醯亞胺酸酯（DMP)、二異硫氰基二苯乙烯二磺酸 鈉（DIDS)等。反應活性試藥可爲N-羥基丁二醯亞胺基3-(2-吡啶硫基）丙酸酯、間馬來醯亞胺苄基-N-羥丁二醯亞胺 基酯、二硫雙（丁二醯亞胺基丙酸酯）、雙（磺酸基丁二醯亞 胺基）辛二酸酯、二丁二醯亞胺基辛二酸酯等。 將脂質具有之胺基與蛋白質具有之硫醇基、或脂質具有 之硫醇基與蛋白質具有之胺基結合，則可於微脂粒表面將 蛋白質固定化。於胺基和硫醇基具有反應性之二價交聯劑 可爲N-丁二醯亞胺基3-(2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDP)、N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）丁酸酯（SMPB)、N-丁 二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）乙酸酯（SMPA)、N-丁二 醯亞胺基溴乙酸酯、N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯 基）丙酸酯（SMPP)、N-(r ·馬來醯亞胺基丁醯氧基）丁二醯 亞胺（GMBS)、Ν·( ε -馬來醯亞胺基己醯氧基）丁二醯亞胺 (EMCS)等。 脂質之羧基與蛋白質之胺基、或脂質具有之胺基與蛋白 質具有之羧基用縮合劑來結合，則可於微脂粒表面將蛋白 質固定化（Biochemistry，Vol.31,2850-2855(1992))。 將脂質之硫醇基與蛋白質之硫醇基結合，則可於微脂粒 表面將蛋白質固定化。例如可用雙馬來醯亞胺基己烷等交 聯劑。 (viii)利用生物素與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素蛋白（ -62- 200914064 avidin)之專一親和性，使蛋白與脂質結合之方法。 將生物素修飾蛋白質與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素蛋白 修飾脂質予以非共有結合（Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12 ： 3 1 1 -325 (2002))。又抗生蛋白鏈黴素及 抗生物素蛋白形成4量體，可利用最大4分子之生物素之 結合’則可將生物素修飾蛋白質以抗生物素蛋白或抗生蛋 白鏈黴素接頭於生物素修飾脂質而予以非共有結合 (Biochimica et Biophysica Acta 1239 133-144 (1995))。 (i x)利用組胺酸標記與鎳離子之親和性，使蛋白與脂質結 合之方法。 利用聚組胺酸標記（His-Tag)與鎳離子（Νι2 + )之親和性，則 可於微脂粒將蛋白質及胜肽固定化（Μ ο 1 e c u 1 a r Pharmaceutics 3, 5, 5 25 -5 30)。依基因工程手法，將 His-Tag融合之嵌合體蛋白質或胜肽依公知之方法表現、精製 。又將具有金屬（Ni2 + )螯合部位之NTA(nitriloacetic acid)' IDA(iminodiacetic acid)等於脂質之末端修飾，則可調製 Ni2+被固定化之微脂粒。於該微脂粒之Ni2+專一地結合
His-Tag，則His-Tag融合蛋白質或胜肽固定化於微脂粒上 〇 (X)於抗體之Fc功能域有親和性之蛋白質或仲介其蛋白質 功能域，將抗體之全長分子結合之方法。 於抗體之Fc功能域有親和性之蛋白質A或蛋白質G蛋白 質、或仲介參與Fc功能域之結合之蛋白質A，蛋白質G 之功能域蛋白質，則可將抗體之全長分子載持。此時蛋白 -63 - 200914064 質A，蛋白質G蛋白質可依上述⑴至（ix)中之任何方法於 微脂粒脂質結合（BMC Immunology 2006,7 : 24)。 上述（1)至（X)中，調節蛋白質和參與固定化之脂質之比例 ’則可任意變化於微脂粒固定化之蛋白質之量。 (3)親水性聚合物與蛋白質之結合樣式 於親水性聚合物將蛋白質或胜肽等固定化之方法有如下 述⑴至（vii)之方法。欲將親水性聚合物與蛋白質、或將依 上述方法所得親水性聚合物之脂質衍生物與蛋白質結合， 將親水性聚合物具有之官能基（包括於親水性聚合物人爲導 入之官能基）與蛋白質具有之官能基（包括於蛋白質人爲導 入之官能基）反應，而形成共有結合或非共有結合之方法。 形成共有結合之官能基之組合可爲例如胺基/羧基、胺基 /N-羥丁二醯亞胺基酯、胺基/醛基、胺基/甲苯磺醯基、胺 基/硝苯羰基、胺基/縮醛基、胺基/異硫氰酸酯基、胺基/鹵 化醯基、胺基/苯并三唑羧酸酯基、醯肼基/醛基、硫醇基/ 馬來醯亞胺基、硫醇基/乙烯磺醯基等、硫醇基/硫醇基等 。非共有結合可利用抗生物素蛋白/生物素、聚組胺酸標記 /鎳等專一結合。蛋白質可於親水性聚合物之主鏈·側鏈之 任意末端及非末端部位結合，也可對親水性聚合物1分子 可有複數個結合。 (i)於具有與胺基之反應性官能基之親水性聚合物，將蛋白 質及胜肽之Lys殘基之ε-胺基或N末端之α-胺基反應之 方法（Int J Oncol. 2003 23(4) : 1159-65.)。 蛋白質之胺基爲由Lys殘基之ε-胺基或N末端之α-胺 -64- 200914064 基來提供。欲將蛋白質之胺基與脂質結合時’親水性聚合 物衍生物所必要之反應性官能基可爲例如N-淫丁二酶亞月安 基酯（NHS酯）、醛基、甲苯磺醯基、硝基苯羰基、縮酵基 、羧基、異硫氰酸酯基、鹵化醯基、苯并三唑羧酸酯基等 〇 (ii)於具有與硫醇基之反應性官能基之親水性聚合物’將 具有硫醇基之蛋白質及胜肽之硫醇基結合之方法（Dmitrl
Kirpotin 等，Biochemistry, 1997，36，66-75)。 對蛋白質之硫醇基之賦予已知使用N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDPHCarlsson，等 Biochem.I_ 1 73， 723 ( 1 978))或N-丁二醯亞胺基-S-乙醯硫乙酸酯（SATA)、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯硫丙酸酯（SATP)、亞胺基噻茂烷 (Traut，R. R_ 等 Biochemistry 12，3266 (1973))、氫硫垸基 亞胺酸酯等化合物來施行之公知之方法。上述方法之外， 將蛋白質之內在性二硫醇基以TCEP、DTT、氫硫基乙醇、 半胱胺酸、半胱胺醯二胺等來還原成硫醇基，而可用以結 合。尤其蛋白質爲抗體時，可利用抗體（全長或片段）之鉸 鏈領域及重鏈與輕鏈之連結部位之二硫醇基、抗體與親水 性聚合物之結合中使用內在性硫醇基之後者之方法由活性 維持之點較佳。例如將IgG抗體以胃蛋白酶等酵素予以 F(ab )2化，更可以一硫基蘇醇等還原所得於Fab’生成之 硫醇基供結合（Martin, F. I.等 Biochemistry 20，4229 (1981))。IgM之場合’可仿Miller等之方法（〗· Biol. Chem 257，286 (1965))，以穏和之條件將j鏈還原所得之igMs之 -65- 200914064
Fc部分之硫醇基供結合。 與蛋白質之硫醇基之結合必要之官能基爲馬來醯亞胺基 、乙烯磺醯基、硫醇基等。如此親水性聚合物衍生物可爲 例如PEG-馬來醯亞胺〔NOF公司製品、SUNBRIGHT MA SERIES (馬來醯亞胺-PEGs)〕、PEG-乙烯楓（Bo B.Lundberg 等，Int. J. Pharm, 205，101 - 108 (2000))、甲氧基（醯肼）聚 乙二醇、雙（醯肼）聚乙二醇等。馬來醯亞胺基化試藥除Ν-ίε -馬來 醯亞胺 基己醯 氧基）丁 二醯亞 胺之外 ，可爲 製作胺 基之馬來醯亞胺基衍生物一般使用之Ν-丁二醯亞胺基4-( 對馬來醯亞胺苯基）丁酸酯（SMPB)，N·丁二醯亞胺基4-(對馬 來醯亞胺苯基）丙酸酯、N- (r-馬來醯亞胺基丁醯氧基）丁 二醯亞胺等。 又可於上述馬來醯亞胺基化試藥將蛋白質之胺基以馬來 醯亞胺基取代。這些與具有硫醇基之例如將吡啶二硫基丙 酸酯（PDP)等修飾之親水性聚合物反應而形成共有結合。 (Ui)於具有與醛基之反應性官能基之親水性聚合物、與蛋 白質之糖鏈由來之醛基結合之方法。 通常真核生物中，蛋白質由翻譯後修飾而接受糖鏈修飾 。尤其抗體時，於其Fc領域有糖鏈存在。將這些糖鏈氧 化而生成之醛基和醯肼可反應而形成共有結合，故於親水 性聚合物修飾醯肼，則可仲介糖鏈而將蛋白質及胜肽於親 水性聚合物固定化（Biochimica et Biophysica Acta 1420 153-167 (1999))。 (iv)將親水性聚合物、蛋白質各具有之官能基彼此用交聯 -66- 200914064 劑或縮合劑等來結合之方法。 將親水性聚合物具有之胺基與蛋白質之胺基結合，則可 於親水性聚合物使蛋白質固定化。具有胺基之親水性聚合 物之衍生物可爲例如 PEG-NH2〔 NOF 公司製品、 SUNBRIGHT PA SERIES(Amino-PEGs)〕等。蛋白質之胺基 爲由離胺酸殘基之ε -胺基及N末端之α -胺基而提供。欲 於具有胺基之親水性聚合物將蛋白質固定化，可採用以戊 二醛使親水性聚合物之胺基與蛋白質之胺基直接交聯之方 法、用反應活性試藥使親水性聚合物之胺基與蛋白質之胺 基予以化學結合之方法等公知之方法。二價交聯劑除戊二 醛之外，可用二丁二醯亞胺基辛二酸酯（DSS)、酞醛、對 酞醛等二醛、甲基庚二醯亞胺酸酯（DMP)、二異硫氰基二 苯乙烯二磺酸鈉（DIDS)等。反應活性試藥爲Ν-羥基丁二醯 亞胺基3“2-吡啶硫基）丙酸酯、間馬來醯亞胺苄基-Ν-羥丁 二醯亞胺基酯、二硫雙（丁二醯亞胺基丙酸酯）、雙（磺酸基 丁二醯亞胺基）辛二酸酯、二丁二醯亞胺基辛二酸酯等。 親水性聚合物具有之胺基與蛋白質具有之硫醇基、或親 水性聚合物具有之硫醇基與蛋白質具有之胺基結合’則可 於親水性聚合物將蛋白質固定化。對胺基和硫醇基具有反 應性之二價交聯劑可爲Ν-丁二醯亞胺基3-(2-吡啶二硫基） 丙酸酯（SPDP)、N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）丁 酸酯（SMPB)、N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）乙酸 酯（SMPA)、N-丁二醯亞胺基溴乙酸酯、N-丁二醯亞胺基4-(對馬來醯亞胺苯基）丙酸酯（SMPP)、N-( r -馬來醯亞胺基 -67- 200914064 丁醯氧基）丁二醯亞胺（GMBS)、Ν-( ε -馬來醯亞胺基己醯氧 基）丁二醯亞胺（EMCS)等。 親水性聚合物之羧基與蛋白質之胺基、或親水性聚合物 具有之胺基與蛋白質具有之羧基以縮合劑結合，則可於親 水性聚合物將蛋白質固定化（Maruyama Κ等，Biochimica et Biophysica， 1234,74-80 (1995))。 將親水性聚合物之硫醇基與蛋白質之硫醇基結合，則可 於親水性聚合物將蛋白質固定化。例如用雙馬來醯亞胺基 己烷等交聯劑。 (v) 利用生物素與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素蛋白之專一親 和性使蛋白質與親水性聚合物結合之方法。 可將生物素修飾蛋白質與抗生蛋白鏈黴素或抗生物素蛋 白修飾親水性聚合物予以非共有結合（Antisense and Nucleic Acid Drug Development 1 2: 3 1 1 -325 (2002))。又抗 生蛋白鏈黴素及抗生物素蛋白形成4量體，利用可結合最 大4分子之生物素，將生物素修飾蛋白質由抗生物素蛋白 或抗生蛋白鏈黴素接頭於生物素修飾親水性聚合物而予以 非共有結合（Biochimica et Biophysica Acta 1239 133-144 (1995))。 (vi) 利用組胺酸標記與鎳離子之親和性、結合蛋白質與親 水性聚合物之方法。 利用聚組胺酸標記（His-Tag)與鎳離子（Ni2 + )之親和性可於 微fl曰粒將蛋白質及胜肽固定化（Molecular Pharmaceutics 3, 5，525-530)。依基因工程手法，可將His-Tag融合之嵌合 -68- 200914064 體蛋白質或胜肽由公知之方法表現、精製。又將具有金屬 (Ni2 + )螯合部位之 NTA(nitriloacetic acid)、IDA(imino d i a c e t i c a c i d)等於親水性聚合物之末端或側鏈修飾，則可 調製Ni2 +被固定化之微脂粒。於該微脂粒之Ni2 +專一地結 合His-Tag ’則His-Tag融合蛋白質或胜肽固定化於親水性 聚合物。 (vii)於抗體之Fc功能域具有親和性之蛋白質或仲介其蛋白 質功能域結合抗體之全長分子之方法。 於抗體之Fc功能域具有親和性之蛋白質A或蛋白質G蛋 白質、或仲介與Fc功能域之結合參與之蛋白質A,蛋白質 G之功能域蛋白質，可將抗體之全長分子載持。此時蛋白 質A，蛋白質G蛋白質可依上述U)至（vi)之任何方法於親 水性聚合物結合（BMC Immunology 2006,7 : 24)。 上述（1)至（vii)中，調節蛋白質與具有反應性之親水性聚 合物之比例，則可仲介親水性聚合物將固定化於微脂粒之 蛋白質之量任意變化。 7 .免疫微脂粒之形態 微脂粒典型上爲由內部有水相之單層或多層之脂質雙重 層而構成之閉鎖小胞（D.D.Lasic, ” Liposomes : from basic to applications” ，Elsevier Science Publishers, pp. 1-171 ( 1 993))，但本發明中乃更廣指粒子狀之脂質複合體。採取 典型閉鎖小胞構造之微脂粒之形態可爲多重膜微脂粒（MLV ;multilamellar vesicle)、小小一枚膜微脂粒（SUV; small unilamellar vesicle)、大大一枚膜微脂粒（LUV ; large -69- 200914064 unilamellar vesicle)、脂質複合體之構造無明確規定。本發 明中免疫微脂粒之粒徑乃依上述大小調節法而異，其製造 可能之微脂粒大小之下限爲約20nm程度（D.D.Lasic， ” Liposomes : from basic toapplications” ， Elsevier
Science Publishers, ρρ· 1 - 1 7 1 (1 993))。他方面，微脂粒大 小之上限爲可血管內投與之7 // m以下之必要。本發明所 用免疫微脂粒之粒徑無特限，通常爲0.03至5 μ m程度。 由注射來全身投與之場合，考慮微脂粒之血中滯留性、腫 瘤或炎症部位等病態組織之集積性，以4 0 0 n m以下較佳。 構成微脂粒之脂質成分及其組成比率可考慮微脂粒分散液 之pH、滲透壓、Zeta電位、相轉移溫度、活體內之血中 滯留性、安定性等物性來選定。 8 .免疫微脂粒之調製法及精製法 (1)免疫微脂粒調製法 本發明之微脂粒製造方法無特限，當業者可能利用之方 法（D.D.Lasic， Liposomes : from basic to applications" Elsevier Science Publishers, pp. 1 - 17 1 ( 1 993))皆可能適用。 用上述脂質可依薄膜法、逆相蒸發法、乙醇注入法、醚注 入法、脫水-再水和法、界面活性劑透析法、水和法、凍結 融解法、小型微脂粒小胞之鈣誘發融合法、機械化學法、 己烷-span80透析法，有機溶劑小球蒸餾法等製造，可依 超音波照射法、凍結融解後之超音波照射法、擠壓法、夫 冉其壓法、勻化法等方法調節微脂粒之粒徑。可依公知之 方法施行由多重膜微脂粒至一枚膜微脂粒，由一枚膜微脂 -70- 200914064 粒至多重膜微脂粒之轉換。 又可依公知之方法將藥物載持於微脂粒之內部。一般可 爲被包化法、遙控載法（pH梯度法）、對離子濃度梯度法、 凍結融解法、界面活性劑去除法、電機穿孔法、超臨界二 氧化碳法、膜載法等（G.Gregoriadis，“Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques” ,2nd edition，Vol.I-III，CRC Press)。藥物之封入形態只要於微月旨 粒載持藥物之構造體則其形態無特限，例如將藥物內包於 脂質小胞之閉鎖空間內之形態、內包於脂質層間之形態、 包含於脂質層內之形態等，也可爲這些組合之形態。 免疫微脂粒之調製法可大別爲（A)調製含有具有反應性官 能基之脂質或親水性聚合物之微脂粒，對此與蛋白質反應 之方法、或（B)具有反應性官能基之親水性聚合物與蛋白質 反應，與別途調製之不具有反應性官能基之微脂粒融合之 方法。 (A) 上述微脂粒調製法中，作爲微脂粒構成脂質成分之一部 分，使用具有反應性官能基之脂質、或具有反應性官能基 之親水性聚合物衍生物脂質，以任意方法調製微脂粒。將 所得微脂粒與蛋白質如上述6-(2)、（3)記載反應’將微脂 粒之脂質分子或親水性聚合物與蛋白質予以共有結合或非 共有結合。 (B) 已知脂質-親水性聚合物-蛋白質之結合體於與微脂粒 (無必要反應性官能基）之混合分散液中，於脂質分子之相 轉移溫度附近及其以上之溫度條件下融合’也即引起兩親 -71 - 200914064 媒性小胞形成脂質之再構成，得於水相配置親水性聚合物-蛋白質部分，於脂質相配置脂質部分之免疫微脂粒（Paul S.Uster 等 FEBS，1996，243-246 ; T.Ishida 等 FEBS，1 999, 1 29- 1 3 3)。於此，微脂粒與脂質-親水性聚合物-蛋白質 之結合體融合之適當條件爲考慮該脂質之物性等來選擇。 (2) 免疫微脂粒之精製法 免疫微脂粒之精製乃指於上述免疫微脂粒調製法8.(1)之 過程生成、未結合於微脂粒之未反應之蛋白質或胜肽等分 離、或於上述免疫微脂粒調製法8.(1)之過程生成、未與微 脂粒融合之親水性聚合物-蛋白質之分離。免疫微脂粒之精 製爲由層析之分離、超瀘、透析、超離心分離等。 (3) 免疫微脂粒之抗體密度測定法 免疫微脂粒之「抗體密度」乃定義爲將對構成免疫微脂 粒之總脂質莫耳數，於該免疫微脂粒含有之抗體之莫耳數 之比例以莫耳％標記者。於此，總脂質乃指含於上述5-(1) 列舉之兩親媒性小胞形成脂質、構成微脂粒之所有脂質。 脂質之定量方法可爲例如依放射性同位素之方法 (Maehama T，等，Anal Biochem.279 (2) : 248,2000)，依高 速液體層析之方法（Serunian L.A.等 ，Methods Enzymol.1991 ; 1 98 : 7 8)，依氣體層析之方法（Hoving EB， 等 ’ J Chromatogr B Biomed Appl .1 995，15 ; 671 (1-2): 341)，依質量分析之方法（Wenk M.R.等，Nat Biotechnol. 200 3，21 (7) : 813)、吸光光度法、化學定量法、酵素的定 量法等。尤其磷脂質爲Bartlett法（Bartlett GR.等，；I Biol -72- 200914064
Chem. 1 959, 234(3): 46)、Stewart 法（John Charles,等，Anal Biochem.1980,1; 104(1): 10)，又憐脂醯膽驗類等含有膽 鹼之脂質時，利用膽鹼氧化酶之酵素定量法（Takayama Μ, 等，Clin Chim Acta. 1977，15; 79 (1): 93)，於膽固醇之場 合，利用膽固醇氧化酶之酵素定量法（Allain CC,等，Clin Chem. 1 974,20 (4) : 470)等。聚乙二醇之定量可依示差折射 率測定（“Comprehensive Polymer Science”，1st Edition, 1 989)、苦味酸法（Int.J.Pharm. 203，255，2000)等施行。總 脂質量可依上述方法測定總脂質量或特定之脂質成分之脂 質量，由對該脂質之總脂質量之構成比率（理論値）算出。 但微脂粒構成脂質之構成比率假定爲於免疫微脂粒之製作 工程不變動。 蛋白質之定量方法可依CBQCA法（You WW等，Anal Biochem. 15 ; 244 (2) : 277)、紫外吸收法、Biuret 法、
Bradford法、Kieldahl法、Lowry法等公知之方法施行。 免疫微脂粒爲含有抗體之全長分子時，可以0.000014莫 耳％至0.23莫耳％，宜0.002莫耳％至0.14莫耳％之範圍選 擇抗體密度。免疫微脂粒含有抗體之FUb’ ）2時’可以 0.0 00 014莫耳％至0.23莫耳％，宜0.00 6莫耳％至0.11莫耳 %之範圍選擇抗體密度。免疫微脂粒含有Fab’時’可以 0.000014莫耳％至0.94莫耳％，宜0.〇〇5莫耳％至0.56莫耳 %之範圍選擇抗體密度。免疫微脂粒含有單鏈可變部位抗 體時，可以0.000014莫耳％至1.8莫耳％，宜0.005莫耳％ 至0.56莫耳％之範圍選擇抗體密度。 -73- 200914064 於此，免疫微脂粒之最小抗體密度（0.0000 14莫耳％)乃指 於粒徑1 OOOnm之免疫微脂粒結合各種抗體2個之狀態。 最大抗體密度（抗體全長：0.23莫耳％、F(ab’ ）2: 0.23莫 耳％、Fab’ ： 0.94莫耳％、scFv : 1.8莫耳％)乃指於免疫微 脂粒上抗體以最密狀態存在之狀態。也即將免疫微脂粒上 之抗體之佔有面積假定爲以各種抗體分子之長徑作爲直徑 之圓面積，將免疫微脂粒之表面積除以抗體分子之圓面積 之値之抗體數存在之狀態、抗體以最密配置之狀態（Allen 等 Biochimica et Biophysica Acta (1 995))。抗體分子之長 徑爲以抗體全長爲14.2nm，以F(ab’ ）2爲14.2nm，以 Fab’爲7nm，以scFv爲5nm。關於抗體全長，F(ab’ ）2、 Fab’ 之長徑，採用 Raghupathy 等，The Journal of Biological Chemistry (1971)記載之値。關於 scFv 之長徑， 參照 Raghupathy 等，The Journal of Biological Chemistry (1971)，更由 Hoedemaeker 等，J. Biol. Chem (1997)記載之 s c F v之結晶構造算出長徑，採用5 n m。 9.含有免疫微脂粒之醫藥 依上述「8.免疫微脂粒調整法及精製法」之項記載之方 法所得之免疫微脂粒爲活體內之DR5、 Fas等細胞凋零關 連受體之生物活性，也即仲介受體對癌細胞誘導細胞凋零 而阻礙癌細胞之增殖，故作爲醫藥，尤其可作爲癌之治療 劑。 依活體外之免疫微脂粒之抗腫瘤活性爲可以將細胞凋零 關連受體過剩表現之細胞中細胞之增殖之抑制活性測定。 -74- 200914064 例如培養將DR5過剩表現之癌細胞株，於培養系以種種 濃度添加免疫微脂粒、測定對焦點形成、噬菌斑形成及類 球狀體增殖之抑制活性。 活體內利用實驗動物之免疫微脂粒對癌之治療效果可例 如於將高表現DR5之腫瘤細胞株移植之裸小鼠投與免疫微 脂粒、來測定癌細胞之變化。 癌之種類可爲肺癌、前列腺癌、肝臟癌、卵巢癌、大腸 癌、乳癌、胰臟癌、血球癌（白血病、淋巴腫等）等，但只 要成治療對象之癌細胞表現含有死亡功能域受體，則不受 這些限定。 又已知對Fas及DR5之抗體爲對炎症性細胞誘導細胞凋 零（J· Clin. Invest. 1 996, 98 (2)，27 1 -278 ; Int. Immunol. 1 996, 8 ( 10)，1 595 - 1 602)。故本發明之免疫微脂粒可作爲自 體免疫疾病或炎症性疾病之治療劑。至於此自體免疫或炎 症性之疾病，其例爲全身性紅斑性狼瘡、橋本病、關節風 濕、宿主移植片病、休格連症候群、惡性貧血、艾迪遜病 、硬皮症、Goodpasture症候群、克隆病、自體免疫溶血性 貧血、生殖不能症、重症肌無力症、多發性硬化症、巴塞 杜病、血栓不足紫斑病、胰島素依存糖尿病、過敏症、氣 喘病、異位性皮膚炎疾病、動脈硬化症、心肌炎、心肌症 、腎小球腎炎、再生不良性貧血、臟器移植後之排斥反應 〇 本發明也提供含有治療有效量免疫微脂粒和藥學容許之 稀釋劑、載體、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑之 -75- 200914064 醫藥組成物。 本發明之醫藥組成物中容許之製劑所用物質較佳爲投與 量或投與濃度中，對投與醫藥組成物者爲非毒性者較佳。 本發明之醫藥組成物可含有用以將pH、滲透壓、粘度、 透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率 、吸產率、滲透率改變、維持、保持之製劑用物質。 製劑用之物質可爲如下者，但不限於這些：甘胺酸、丙 胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸 類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等抗氧化劑 、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、（Tris-鹽酸）溶 液等緩衝劑、甘露糖醇或甘胺酸等充塡劑、乙二胺四乙酸 (EDTA)等螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、石-環糊精或 羥丙基- yS-環糊精等錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等增 量劑、單糖類、二糖類或葡萄糖、甘露糖或糊精等其他烴 '著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等親 水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、苄烷氯化銨、 苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥 苯甲酸丙醋、Chlorexydine、山梨酸或過氧化氫等防腐劑 、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑、甘露糖醇或山梨糖醇 等糖醇、懸浮劑、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨酸酯20或聚 山梨酸酯80等聚山梨酸酯、三硝基甲苯（triton)、胺基 丁三醇（tromethamine )、卵磷脂或膽固醇等界面活性劑 、蔗糖或山梨糖醇等安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘 露糖醇.山梨糖醇等彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形 -76- 200914064 劑、及/或藥學上之補助劑。 這些製劑用之物質之添加量以對免疫微脂粒之重量爲 0.0 1 ~ 1 0 0倍，尤其以〇. 1 ~ 1 〇倍添加較佳。 製劑中適宜醫藥組成物之組成可由業者依適用疾病、適 用投與經路等適宜決定。 醫藥組成物中之賦形劑或載體可爲液體也可爲固體。 適當賦形劑或載體可爲注射用之水或生理食鹽液、人工腦 脊髓液或非經口投與通常用之其他物質。 也可用含有中性之生理食鹽液或血清蛋白素之生理食鹽 液爲載體。 於醫藥組成物也可含有PH7.0-8.5之Tris緩衝液或pH4.0-5.5之乙酸緩衝液或於這些含有山梨糖醇或其他化合物。 本發明之醫藥組成物可以選擇之組成以必要純度作爲適當 藥劑、準備成凍乾品或液體。 含有免疫微脂粒之醫藥組成物可用蔗糖等適當賦形劑之 凍乾品而成型。 ； 本發明之醫藥組成物可調製成非經口投與用，也可調製 成經口之消化管吸收用。 製劑之組成及濃度可依投與方法來決定，對本發明之醫 藥組成物所含抗體之抗原之親和性，即對抗原之解離定數 (Kd値），親和性越高（Kd値低），越可對人之投與量少而發 揮藥效，故可基於此結果而決定本發明之醫藥組成物對人 之投與量。 投與量於將免疫微脂粒投與人時，可將依抗體量換算約 -77- 200914064 0.1〜100mg/kg於1〜30日投與1回。 本發明之醫藥組成物之形態可爲包括點滴之注射劑、坐 劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。 以下舉實施例具體說明本發明，但本發明不受這些實施 例限定。又下述實施例中有關基因操作之各操作若無特示 ，可依「分子選植（Molecular Cloning)」（Sambrook，J.， Fritsch, E.F.及 Maniatis， T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Pressl 989年發刊）記載之方法施行，或用市售 之試藥或套組時，可依市售品之指示書使用。 於免疫微脂粒結合之蛋白質之濃度乃用CBQCA蛋白質 定量套組（Molecular Probes)依添附之指示書而定量。微脂 粒之磷脂質濃度乃用磷脂質C和光試劑（和光純藥工業公 司）依添附之指示書定量。免疫微脂粒之粒徑乃用粒徑測定 機（Nicomp Particle Sizer Model 370，Nicomp Particle Sizing Systems)來測定。 【參考例1】 hTRA-8 F(ab’ ）2 之調製 將抗人DR5抗體hTRA-8以乙酸緩衝液（20mM乙酸鈉 ，pH4.5)調製爲10mg/ml之濃度。又hTRA-8爲將係屬小鼠 抗人 DR5 抗體之 TRA-8 (Nature Med.2001，7(8)，954-60)人 化之抗體，其作爲重鏈胺基酸序列具有於序列表記載之序 列編號1之胺基酸序列，作爲輕鏈胺基酸序列具有於序列 表記載之序列編號2之胺基酸序列。於本抗體溶液1 ml添 加固定化胃蛋白酶（Pierce生技公司）1 25 // 1後，於37°C保 -78- 200914064 溫8.5小時，將本抗體片段化爲F(ab’ ）2片段。將反應溶 液離心，由上清濾除固定化胃蛋白酶。以離子交換層析 (AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，Resource S 6ml) ; A 液（5OmM 檸檬酸緩 衝液，pH4.0)，B 液（5 0mM 檸檬酸緩衝液，1M NaCl, ρΗ4·0) :梯度（Β液15— 40%,50CV，直線梯度）；4°C ; 6ml/分；檢 出波長UV280 nm)，去除胜肽片段及未消化之全長hTRA-8 ，回收 F(ab’ ）2劃份（57-lllml之溶出劃份）。由使用 Labscale TFF系統（MILLIPORE公司）、聚醚磺醯基膜 (MILLIPORE 公司，Pellicon XL，Biomax 50(分劃分子量； 50,000))之超瀘操作，將檸檬酸緩衝液交換爲HEPES緩衝 液（20mM HEPES，1 50mM NaCl，pH7.4)。 【參考例2】 hHFE7A F(ab’ ）2 之調製 將抗人Fas抗體hHFE7A以乙酸緩衝液（20mM乙酸鈉 ，pH4.5)調製成10mg/ml之濃度。又hHFE7A將係屬小鼠抗 人 Fas 抗體之 HFE7A (Int. Immunol · 20 0 0, 1 2 (4)，5 5 5 - 62)予 以人化之抗體，作爲其重鏈胺基酸序列具有序列表記載之 序列編號3之胺基酸序列，作爲輕鏈胺基酸序列具有序列 表記載之序列編號4之胺基酸序列。於本抗體溶液1 ml添 加固定化胃蛋白酶（Pierce生技公司）125 1後，於371：
保溫8.5小時，將本抗體片段化成F(ab’ ）2片段。將反應 溶液離心，由上清濾除固定化胃蛋白酶。依離子交換層析 (AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE -79- 200914064 HEALTHCARE 公司，Resource S 6ml) ; A 液（50mM 檸檬酸 緩衝液，pH4.0)、B液（50mM檸檬酸緩衝液、1 M NaCl， PH4.0)；梯度（B 液 15-40%，50CV，直線梯度）；4°C ; 6ml/ 分；檢出波長UV 280 nm)回收胜肽片段及濾除未消化之全 長 hHFE7A、F(ab’ ）2 劃份（40-65ml 之劃份）。依用 Labscale TFF系統（MILLIPORE公司）、聚醚磺醯基膜（MILLIPORE公 司，Pellicon XL, Biomax 50(分劃分子量；50，000))之超爐操 作，將檸檬酸緩衝液交換爲HEPES緩衝液（20mM HEPES， 150mM NaCl，pH7.4)。 【參考例3】 hTRA-8 scFv 之調製 (l)hTRA8 scFv表現載體之作成 將編碼hTRA8之Η鏈領域之載體TRA8-H pHA15-l作爲 VH之模板，用2寡核苷酸引子將編碼hTRA8 scFv之前半 部分之DNA依PCR法增幅。 同樣將編碼hTRA8之L鏈領域之領域之載體TRA8-L LM-1L作爲VL之模板，用2寡核苷酸引子，將編碼hTRA8 scFv之後半部分之DNA依PCR法增幅。 此時，VH與VL之間將可撓牲胜肽接頭（GGGGS)x3於C 末端設計引子成附加HHHHHHGGAC序列（含有組胺酸6殘 基標記及Cys殘基之序列）。將這些2DNA片段於5’插入 NdeI(TAKARA BIO 公司）’於 3’ 插入 XhoI(TAKARA BI0 公司）部位’依PCR法連結、製作將hTRA8 scFv編碼之 DNA。 -80- 200914064 將製作之 DNA以限制酵素 Ndel、Xhol消化後，於 pET22b( + )(Novagen)之多選植部位存在之限制酵素Ndel、 Xhol部位插入，而構築pET22b( + )hTRA8 scFv表現載體。 (2) hTRA8 scFv 之表現 將於（1)所得pET22b( + )hTRA8 scFv表現載體依公知之方 法於 OrigamiB(DE3)(N〇Vagen)大腸菌株導入，而於含有 100；ag/ml 安比西林（Sigma-Aldrich)、25/zg/ml 康黴素（和 光純藥工業公司）、34 " g/ml綠黴素（和光純藥工業公司）之 LB板塗布，得轉形體。次將此轉形體之噬菌斑於20ml之 LB培養基（Invitrogen)中邊振盪邊於37°C增殖終夜至近飽 和，將此接種於2 L之新LB培養基。將細菌於2公升坂 口燒瓶中37°C通氣培養增殖至0D 600 nm = 0.8。將溫度降 低爲16°C，其後用0.5mM異丙基-召-D-硫吡喃半乳糖苷 (IPTG)(和光純藥工業公司）惹起蛋白質表現。細菌培養 於通氣培養下16°C持續18小時。 (3) 蛋白質精製 _ 將細胞以6000gx20分離心來粒化，於含有20mM Tris-鹽 酸（和光純藥工業公司）（pH8.0)、100mM NaCl (MANAC Incorporated)、4mM CHAPS(Sigma-Aldrich)、10% 甘油（和光 純藥工業公司）（v/v)、蛋白酶阻礙劑混合液Completemini ( 無EDTA) (Roche Diagnostic GmbH)之緩衝劑再懸浮而於-8 0 °C保存。 將再懸浮液以流水解凍，於冰上施行超音波破碎，以 24,000xg、4°C、20分之離心分離去除細胞片。 -81 - 200914064 將離心上清通過0.45 ul之濾器後，以His標記·親和柱 精製。也即於AKTA Prime系統（GE Healthcare公司）於柱 His-Trap HP lml (GE Healthcare 公司）樣品.施行後，以流 量 1 m 1 / 分、2 0 m Μ T r i s -鹽酸（p Η 7.5)、5 0 0 m Μ N a C1、4 0 m Μ 咪唑（CALBIOCHEM)、0.6% CHAPS、ImM DTT(Sigma-Aldnch)、予以5柱體積分洗淨、次以20mM Tris-鹽酸 (ρΗ7_5)、500mM NaCl、0.6% CHAPS、ImM DTT、500mM 咪唑來梯度溶出。 將His-Trap HP溶出之各劃份以SDS-PAGE解析，對含有 scFv之劃份，更施行凝膠過濾層析精製。也即於柱 Superdex75pg HiLoadl6/60 (GE Healthcare 公g)用 50mM Tris-鹽酸（pH7.5)' 500mM NaCl、10%甘油、10mM CHAPS 、ImM DTT 而添加樣品。分取 Superdex75pg HiLoadl6/60 溶出之各劃份，以SDS-PAGE解析，回收scFv劃份。 【實施例1】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 將於參考例1調製之F(ab’ ）2溶液（抗體濃度2.5mg/ml， HEPES緩衝液），於10mM L-半胱胺酸（和光純藥工業公司） 存在下，於室溫保溫90分、還原爲Fab’ 。依凝膠過濾精 製（柱；GE HEALTHCARE 公司 PD-10 脫鹽柱；HEPES 緩 衝液）去除L-半胱胺酸，得hTRA-8 Fab’片段。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂酸礙脂醯膽驗（L-a -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 COATSOMEMC- -82- 200914064 6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯憐脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol)succinyl distearoylphosphatidylethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400- Mai ；和 NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 22mg、7.73mg、1.26mg(莫耳比 100: 66: 1)量取於節型燒 瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml而溶解。次減壓蒸除氯仿 ，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加HEPES緩 衝液（20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4) 3ml 而懸浮，得微 脂粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散 液用濟壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID 公司） ，由具有 100 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合反應 混合上述hTRA-8 Fab’ （3.6mg/ml，1 5 .3 # 1)與微脂粒分散 液（10mM DPPC，500 // 1)使呈 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 50 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與 微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合 之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫 基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM，5 // 1而於室溫反應30 分來惰性化化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠過瀘層析 (AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280 -83- 200914064 nm)來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超 濾濃縮’得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號1，抗體濃度 33,5// g/ml，磷脂質濃度6.3mM，抗體密度0.0058莫耳％ ，平均粒徑73.0±35.9 nm(HEPES緩衝液））。 【實施例2】 仿實施例1之（1)，將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿 實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。
抗體於微脂粒之結合乃如下施行。將上述hTRA-8 Fab’ (3.6mg/ml, 152/zl)與微脂粒分散液（10mM DPPC,500 // 1)混 合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 : 5 (莫耳比） 之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司 )100mM，5 // 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分：檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號2，抗體濃度27 8·5μ g/ml，磷脂質濃度6.1mM -84- 200914064 ，抗體密度0.050莫耳％，平均粒徑86.6±39.9 nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例3】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃如下施行。將上述 hTRA-8 Fab’ (3.6mg/ml, 244 // 1)與微脂粒分散液（1 OmM DPPC， 320 /zl)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 2 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mai加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）lOOmM，3.2/z 1而於室溫反應30分來惰性化。未反 應之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號 3，抗體濃度413.7 # g/ml，磷脂質濃度 4.38mM，抗體密度 0.102 莫耳％，平均粒徑 84.4±42.2 nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例4】 (l)hTRA-8 Fab’ 之調製 -85- 200914064 仿實施例1之⑴將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂酸碟脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline > 以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醢憐脂醯乙醇胺（P〇ly (ethylene glycol) succinyldistearoylphosphatidylethanolamine，以下標記爲 DSPE- PEG3400- Mai ；和 NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 llmg、3.9mg、3.15mg(莫耳比 100: 66: 5)量取 於茄型燒瓶，加氯仿（關東化學公司）1.5ml而溶解。次減 壓蒸除氯仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層 加 HEPES 緩衝液（20mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4) 1.5ml 而懸浮，得微脂粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將 此微脂粒分散液用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID公司）、由具有100 nm孔大小之聚羧酸酯膜 (Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓（extruded)、使微脂粒 之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 抗體於微脂粒之結合乃如下施行。將上述上述hTRA-8 Fab’ （4.64mg/ml, 237 μ 1)與微脂粒分散液（l〇mM DPPC, 200 " 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 1 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 -86- 200914064 DS PE-PEG 3 400-Mai加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）lOOmM，2 /Z 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4它 ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號4，抗體濃度394.5 y g/ml，磷脂質濃度 1.91mM，抗體密度 0.224 莫耳％，平均粒徑 83.7±40.8 nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例5】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 將參考例-1調製之F(ab’ h溶液（抗體濃度5mg/ml，HEPES 緩衝液）於40mM(±)-一硫穌糖醇（（±)-Dithiothreitol，以下標 記爲DTT ;和光純藥工業公司）存在下，於室溫保溫30分 ，還原爲Fab’ 。由凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE 公司PD-10脫鹽柱；HEPES緩衝液）去除DTT，得hTRA-8 Fab’片段。 (2) 微脂粒之調製 於二軟脂酿隣脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC; NOF 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 -87- 200914064 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（P〇ly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 1762mg、618.6mg、2481.4mg(莫耳比 100: 66: 1)加乙醇（ 和光純藥工業公司）90ml來溶解。將此脂質溶液滴下於 HEPES 緩衝液（20mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4) 900ml > 得微脂粒之粗分散液。次以超濾（LabScale TFF系統 (MILLIPORE 公司））、聚醚磺醯基膜（Pellicon XL 50，B1〇max 300,分劃分子量；300,000，（MILLIPORE公司））調製微脂粒 分散液之濃度爲 10mM DPPC，用高壓連續式勻化機 (EmulsiFlex-C5, AVESTIN 公司），於 50 nm 之孔大小之聚 竣酸酯膜（Nucleopore Track-Etch Membrane, Whatman 公司 )反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8 Fab’ （4 · 86mg/ml，5.7 ml)與微脂粒分散液 ' (10mM DPPC, 132ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE- PEG3400-Mal=l : 25 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與 微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合 之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫 基乙醇（和光純藥工業公司）100mM, 1.32ml而於室溫反應 30分來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以超濾（LabScale TFF系統（MILLIPORE公司）、聚醚磺醯基膜（Pellicon XL 50，Biomax 300,分劃分子量；300,000，（MILLIPORE 公司））來 -88- 200914064 分離，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合 之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號5，抗體濃度 1011.0/zg/ml，磷脂質濃度27.63mM，抗體密度0.040莫 耳％，平均粒徑53.7±22.4 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例6】 仿實施例5之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例5之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ （4.86mg/ml ，9.05ml)與微脂粒分散液（10mM DPPC， 49ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 : 5 (莫 耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端 之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mai加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）lOOmM，4 90 μ 1而於室溫反應30分來惰性化。未反 應之 hTRA-8 Fab’ 以超濾（LabScale TFF 系統（MILLIPORE 公司）、聚醚磺醯基膜（Pellicon XL 50, Biomax 300,分劃分 子量；300,000, (MILLIPORE公司））來分離，得抗體上之半 胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表1之編號6，抗體濃度1 363.3 /z g/ml，磷脂 質濃度8.85mM，抗體密度0.167莫耳％ ’平均粒徑 50.3±23.6 nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例7】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。抗體於微脂粒之結 -89- 200914064 合乃以如下工程施行。將上述 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml, 66 # 1)與微脂粒分散液（10mM DPPC ,300// 1)混合成hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。 抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10 等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM, 3/zl而於 室溫反應30分來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠 過濾層析（AKTA explorer 1 OS (GE HEALTHCARE 公司）；柱 (GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級） ;HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份） 。用八111丨(：〇111111^(]\411^1?0尺£公司，分劃分子量50,000)施 行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末 端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號7，抗體 濃度96.8从g/ml，磷脂質濃度1.64mM，抗體密度0.064莫 耳％，平均粒徑101.1±44.2 nm(HEPES緩衝液））。 【實施例8】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ （5mg/ml，16.5// 1)與微脂粒分散液（10mM DPPC, 3〇〇 " 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 20 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 -90- 200914064 DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）100mM, 3 // 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。以 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號8，抗體濃度70.7 V g/ml，磷脂質濃度1.39mM ，抗體密度0.055莫耳％，平均粒徑83.3±40.3 nm(HEPES 緩衝液））。 【實施例9】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例-1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將卵黄卵磷脂（Egg Yolk LecUhin，以下標記爲eggPC ; Q.P.Corporation, PC-98N)、膽固醇（Sigma-Aldrich 公司）、 及分子量約3400之於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基 之聚乙—醇丁 一酿基一硬脂酿憐脂酿乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下 標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 24mg、7.73mg' 1.26mg(莫耳比 loo: 66: 1)量取 於前型燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3 m 1來溶解。次減jg -91 - 200914064 蒸除氯仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加 HEPES緩衝液3m卜得微脂粒（eggPC濃度：10mM)之粗分 散液。次將此微脂粒分散液以擠壓機^以！^!^-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司），由具有 100 nm 孔大 小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓，使 微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml，66// 1)與微脂粒分散液 (10mM eggPC， 300 // 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-MaUl : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）100mM，而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱(GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（PH7.4) ; 4°C ; 2ml/分：檢出波長 UV280 nm)來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號9，抗體濃度 138.8/zg/ml，磷脂質濃度2.32mM，抗體密度0.065莫耳％ ，平均粒徑90.2±13.3 nm(HEPES緩衝液））。 【實施例1 0】 -92- 200914064 仿實施例1之（1)將hTR A-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例9之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab' (5mg/ml,16.5//l)用微脂粒分散液（l〇mM eggPC, 300 /z 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal = 1 ： 20 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）lOOmM，3 μ 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7_4); 4°C :2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號10，抗體濃度90.9 M g/ml，磷脂質濃度2.98 mM，抗體密度 0.033 莫耳％，平均粒徑 83.1±13.0 nm (HEPES緩衝液））。 【實施例11】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二肉豆蔑醯磷脂醯膽驗（L-α -Dimyristoyl Phosphatidyl -93 - 200914064 choline，以下標記爲 DMPC ; NOF 公司，COATSOME MC-4040)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯磷脂酿乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 20.3mg、7.73mg、1.26mg(莫耳比 1 0 0 : 6 6 : 1 )量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加HEPES 緩衝液3ml，得微脂粒（DMPC濃度：10mM)之粗分散液。 次將此微脂粒分散液用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID公司），由具有100 nm孔大小之聚羧酸酯膜 (AvanU POLAR LIPID公司）反復擠壓，使微脂粒之粒徑整 齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml，66 y 1)與微脂粒分散液 (10mM DMPC，300 从 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）100mM，3/21而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠過濾層析（AKTA explorer 1 OS (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； -94- 200914064 HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE公司，分劃分子量 50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號11，抗體濃 度148.5#g/ml，磷脂質濃度2.47mM，抗體密度0.065莫 耳％，平均粒徑1 17.9±47.1 nm(HEPES緩衝液））。 【實施例1 2】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例1 1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ (5mg/ml, 1 6.5 1)與微脂粒分散液（1 OmM DMPC， 3 00 # 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal = 1 ： 20 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3 400-Mal力0 1 0等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）lOOmM，而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過瀘層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成= -95- 200914064 表1之編號12’抗體濃度76.8# g/ml，磷脂質濃度 2.94mM ’抗體密度0.028莫耳％，平均粒徑119.3±45.0 n m (Η E P E S 緩衝液））。 【實施例1 3】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將一油 Μ 隣脂酿膽驗（L-α -Dioleoyl Phosphatidylcholine ，以下標記爲 DOPC; N0F 公司 COATSOME MC-8181)、膽 固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇 之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷 脂酸乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ；NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 23.6mg、7.73mg 、1.26mg(莫耳比100 : 66 : 1)量取於茄型燒瓶，加氯仿（關 東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶內壁 形成脂質之薄層。於此脂質薄層加HEPES緩衝液3ml，得 微脂粒（DOPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分 散液用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司 )，由具有100 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合
將上述 hTRA-8 Fab’ （5 mg/ml，66 # 1)與微脂粒分散液 (10mM DOPC，300 仁 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG -96- 200914064 3 400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒 上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來 醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇 (和光純藥工業公司）lOOmM，3 # 1，於室溫反應30分來惰 性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱(〇Ε HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離’分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 八!11丨(；〇111]11^(^411^1?〇尺£公司，分劃分子量50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號1 3，抗體濃 度13 6.3 // g/m卜磷脂質濃度2.30mM，抗體密度0.064莫 耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例14】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例1 3之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ （5mg/ml, 16.5// 1)與微脂粒分散液 U〇mM DOPC， 3 00 # 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal = l ： 20 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mal力卩10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）100mM, 3 // 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 -97- 200914064 之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表 1之編號 14，抗體濃度 72.9" g/ml，磷脂質濃度 2.13mM，抗體密度〇·〇37莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例1 5】 CUhTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例-1將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2)微脂粒之調製 將二硬脂醯磷脂醯膽鹼（L-α -Distearoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DSPC ; N〇F 公司 COATSOME MC-8080)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯碟脂醯乙醇胺（P〇ly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ; N〇F 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 23.7mg、7.73mg、1.26mg(莫耳比 1 00 : 66 : 1 )量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3 ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加HEPES 緩衝液3ml，得微脂粒（DSPC濃度：lOmM)之粗分散液。次 -98- 200914064 將此微脂粒分散液用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID公司），由具有100 nm孔大小之聚羧酸酯膜 (Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓，使微脂粒之粒徑整 齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml，165//1)與微脂粒分散液 (10mM DSPC，300 # 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal = l : 2 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）100mM,3#l而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱(GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 AmlconUltra(MILLIPORE公司，分劃分子量 50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號1 5，抗體濃 度178.9 // g/ml，磷脂質濃度1.97mM，抗體密度0.099莫 耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例1 6】 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。更仿實 施例15之（2)將微脂粒分散液用時調製。 -99- 200914064 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ （5mg/ml, 66/z 1)與微脂粒分散液（10mM DSPC, 300y 1) 混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 : 5 (莫耳比） 之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） lOOmM，3 /z 1而於室溫反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 1 OS (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 1 6/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（3 6-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號16’抗體濃度60.4/z g/ml，磷脂質濃度 1.53mM，抗體密度0.043莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例1 7】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將—軟月曰酿憐月曰酸膽驗（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline’ 以下標記爲 DPPC; NOF 公司，COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及具有馬來醯亞胺基 之二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（以下標記爲DSPE-Mal ; NOF公 -100- 200914064 司，COATSOME FE-8080MA3)各 1 1 mg、3.9 mg、0.6 9 mg (莫耳 比1 00 : 66 : 5)量取於茄型燒瓶，加氯仿（關東化學公司） 1.5ml來溶解。次減壓蒸除氯仿’於燒瓶內壁形成脂質之 薄層。於此脂質薄層加HEPES緩衝液1.5ml，得微脂粒 (DPPC濃度：1 OmM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液以 擠壓機（The Mini-Extruder,Avanti POLAR LIPID 公司），由 具有100 nm孔大小之聚殘酸醋膜（Avanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8 Fab’ （4.64mg/ml，237 # 1)與微脂粒分散液 (10mM DPPC，200 " 1)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-MaUl ： 1 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之馬來醯 亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-Mal 加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）100mM，2/zl 而於室溫反應30分來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以 凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司） ;柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份） 。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分劃分子量 50,000)施 行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之 DSPE結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號17， 抗體濃度124.0 // g/ml，磷脂質濃度1.34mM，抗體密度 0.100莫耳％(HEPES緩衝液））。 -101 - 200914064 【實施例1 8】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例1之（1)將hTRA-8 Fab’片段用時調製。 (2) DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複合體之調製 對 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml，220 // 1)加 20 當量之 DSPE-PEG3400-Mal (1 6.8 mg/ml，1 00// 1)，於 3 7 °C 反應 1 小時。 抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10 等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM，40//1而於 室溫反應30分來惰性化。未反應之hTRA-8 Fab’以凝膠 過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱 (GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級） ;HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm)來分離，分取 DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複 合體劃份（39-54ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分劃分子量 50,000)施行超濾濃縮，得 DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複合體。對 DSPE 之 hTRA-8 Fab’ 之量爲 1 428.6 "g//z 莫耳 DSPE。 (3) 微脂粒之調製 微脂粒乃將二軟脂醯磷脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidylcholine，以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 ，COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich 公司）各 22.05mg、7.68mg(莫耳比3: 2)量取於茄型燒瓶，加氯仿（ 關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶內 壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加HEPES緩衝液3ml， -102- 200914064 得微脂粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒 分散液用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公 司），以具有100 nm孔大小之聚殘酸醋膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓，使微脂粒之粒徑整齊。 (4)微脂粒與DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複合體之融合 將上述DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複合體（抗體濃度 489.9 #2/1111,408 // 1)與微脂粒分散液（1〇111皿0??(：,200 //1) 混合，於60°C保溫3小時。未與微脂粒融合之DSPE-PEG3400-(hTRA-8 Fab’ ）複合體以凝膠過濾層析（柱（GE HEALTHCARE 公司，10x300mm，Sep hacryl S-500 HR); HEPES 緩衝液（PH7.4) ; 4°C ; 2ml/分）來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量5 0,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號18，抗體濃度73.7// g/ml，磷脂質濃度 2 _27mM，抗體密度0.035莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例1 9】 (1) hTRA-8全體（fullbody)之二硫化結合之還原 將hTRA-8於抗體濃度2.5mg/ml ' 30mM L-半胱胺酸（和光 純藥工業公司）保溫室溫90分’將hTRA-8全體之二硫化 結合還原。以凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司 PD-10脫鹽柱；HEPES緩衝液）去除l-半胱胺酸，得二硫 化結合被還原之hTRA-8全體。 (2) 微脂粒之調製 -103 - 200914064 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體 （5mg/ml，45〇vl)與微脂粒分散液 (10mM DPPC，300 # 1)混合成 hTRA-8 全體：DSPE-PEG3400-Mal=l : 2 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）100mM,3//l而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之hTRA-8全體以凝膠過爐層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司 ，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液 (PH7.4) ； 4°C ; 2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取 免疫微脂粒劃份（3 6 - 4 8 m 1 之劃份）。用 A m i c ο η Ultra(MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超瀘濃縮， 得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免 疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號19，抗體濃度 ' 23.9// g/ml，磷脂質濃度3.25mM，抗體密度0.0029莫耳 %(HEPES 緩衝液））。 【實施例20】 仿實施例19之（1)將hTRA-8全體之二硫化結合還原。更 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 全體（5mg/ml，180μ1)與微脂粒分散液（lOmM DPPC,300 /zl) 混合成 hTRA-8 全體：DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之 -104- 200914064 比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯 亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal力D 10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） 100m M,3/zl而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成 :表1之編號20，抗體濃度65.4/z g/ml，磷脂質濃度 3.07mM，抗體密度0.0085莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例2 1】 仿實施例19之（1)將hTRA-8全體之二硫化結合還原。更 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。
抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 全體（5mg/ml，45//1)與微脂粒分散液（10mM DPPC，300 /il) 混合成 hTRA-8 全體 _· DSPE-PEG3400-Mal=l : 20 (莫耳比） 之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） 100mM,3 μ 1而於室溫反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE -105- 200914064 HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4〇C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號 21，抗體濃度41.2# g/ml，磷脂質濃度 3.11mM，抗體密度0.005 3莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例22】 (1) hTRA-8全體之硫醇化 於 hTRA-8 全體（抗體濃度 6mg/ml, 20mM HEPES，150mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂烷 •鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8 : Traut試劑=1 : 4之莫 耳比添加，於室溫反應90分。其後以凝膠過濾層析（柱； GE HEALTHCARE公司NAP-5脫鹽柱；HEPES緩衝液）去 除Traut試劑，將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之胺 基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體 （2mg/ml，75 " 1)與微脂粒分散液 (10mM DPPC，150" 1)混合成 hTRA-8 全體：03?丑-卩丑03400-Mal= 1 : 1 5 (莫耳比）之比例’令抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 -106- 200914064 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）1 OOmM，1 ·5 A 1而於室溫反應30分來惰 性化。未反應之 hTRA-8全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱(GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 八111丨(：〇111111^(^01^1?01^公司，分劃分子量 50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號22，抗體濃 度70.3 // g/ml，磷脂質濃度1.17mM，抗體密度0.024莫耳 %(HEPES 緩衝液））。 【實施例23】 仿實施例22之（1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基 之胺基予以硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用 時調製。
抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行 將上述hTRA-8全體 （5mg/ml，300μ1)和微脂粒分散液 (10mM DPPC，150/zl)混合成 hTRA-8 全體：03?£-?丑〇3400· MaU 1 : 1. 5 (莫耳比）之比例，將抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）l〇〇mM, 1.5 # 1而於室溫反應30分來 惰性化。未反應之hTRA-8全體爲凝膠過濾層析（AKTA -107- 200914064 explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱(GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。將 Amicon Ultra(MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號23，抗體濃 度184.4/zg/m卜磷脂質濃度1.07mM，抗體密度0.0685莫 耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例24】 仿實施例22之（1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基 之胺基予以硫醇化。更仿實施例5之（2)將微脂粒分散液用 時調製。
抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 全體（5mg/ml, 1.1ml)與微脂粒分散液（10mM DPPC, 16.5ml) 混合成 hTRA-8 全體：DSPE-PEG3400-Mal = l : 45 (莫耳比） 之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） lOOmM，165/z 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 -108- 200914064 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIP〇RE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與 微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號24’抗體濃度166.5/zg/ml，碟脂質濃度 5.25mM’抗體密度0.0126莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例25】 仿實施例22之（1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基 之胺基予以硫醇化。更仿實施例5之（2)將微脂粒分散液用 時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 全體（5mg/ml，4ml)與微脂粒分散液（l〇mM DPPC, 1 995 " 1) 混合成 hTRA-8 全體：DSPE-PEG3400-Mal = l : 1_5 (莫耳比） 之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） lOOmM，19.95 // 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離、分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra(MILLIPORE INC·，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與 微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成： 表1之編號 25，抗體濃度314.5 // g/ml，磷脂質濃度 -109- 200914064 0.9 6mM，抗體密度0.131莫耳％ (HEPES緩衝液））。 【實施例26】 (1) hHFE7A Fab’ 之調製 將參考例-2調製之F(ab’ ）2溶液（抗體濃度2.5mg/ml， HEPES緩衝液）於10mM L-半胱胺酸（和光純藥工業公司）存 在下，保溫室溫90分，還原爲Fab’ 。以凝膠過濾精製（ 柱；GE HEALTHCARE公司PD-10脫鹽柱；HEPES緩衝液 )來去除L-半胱胺酸，得hHFE7A Fab’片段。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hHFE7AFab’（1.5mg/ml，33Aίl)與微脂粒分散液 (10mM DPPC, 180μ1)混合成 hHFE7A Fab’ ： DSPE-PEG 3 400-Mal=l : 20 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬 來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙 醇（和光純藥工業公司）lOOmM，1.8//1而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之hHFE7A Fab’以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液 (pH7.4); 4°C ; 2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取 免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 -110- 200914064 微脂粒（微脂粒組成：表1之編號26 ’抗體濃度47.9 # g/ml ，磷脂質濃度2.03mM’抗體密度0.026莫耳％(HEPES緩 衝液））。 【實施例27】 仿實施例26之（1)將hHFE7A Fab’片段用時調製。更仿 實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hHFE7A Fab’ (1.5mg/ml, 1 32 y 1)與微脂粒分散液（1 OmM DPPC, 180 μ 1)混合成 hHFE7A Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 5 ( 莫耳比）之比例，.令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3 4 00-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）100mM, 1.8 # 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hHFE7A Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成 :表1之編號27，抗體濃度1 1 5 · 0 /z g/ml，磷脂質濃度 1.54mM，抗體密度0.08 1莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例28】 仿實施例26之⑴將hHFE7A Fab’片段用時調製。更仿 -111 - 200914064 實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。
抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hHFE7A Fab’ (1.5mg/ml, 3 30 # 丨）與微脂粒分散液（1 OmM DPPC ，180/z 1)混合成 hHFE7A Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal = 1 : 2 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mal力Π 1 0等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）100mM，1.8 # 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應 之 hHFE7A Fab’ 以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml /分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE 公司，分 劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗體上之半胱胺酸殘基 與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成 :表1之編號28，抗體濃度151.6 // g/ml，磷脂質濃度 1 .60mM，抗體密度0.103莫耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例29】 (l)hHFE7A全體之硫醇化 於 hHFE7A 全體（抗體濃度 6mg/ml，20mm HEPES，150mM NaCl, 2mM EDTA，pH8.0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂 烷.鹽酸Pierce生技公司）以hHFE7A : Traut試劑=1 : 4之 莫耳比率添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾層析（ 柱；GE HEALTHCARE公司，NAP-5脫鹽柱；HEPES緩衝液 -112- 200914064 )去除未反應之Traut試劑，將hHFE7A全體之一部分之離 胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hHFE7A全體 （2mg/ml, 75//1)與微脂粒分散液 (1 OmM DPPC, 150// 1)混合成 hHFE7A 全體：DSPE-PEG 3400-Mal = l : 15 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂 粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬 來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙 醇（和光純藥工業公司）100mM，1.5以1而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之hHFE7A全體以凝膠過濾層析（AKTA explorer 1 OS(GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液 (pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取 免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Ami con Ultra (MILLIPORE公司分劃分子量50,000)施行超濾濃縮，得抗 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒（微脂粒組成：表1之編號29，抗體濃度48.1 μ g/ml、 磷脂質濃度1.06mM，抗體密度0.018莫耳％(HEPES緩衝 液））。 【實施例3 0】 (l)hHFE7A全體之硫醇化
於 hHFE7A 全體（抗體濃度 6mg/ml，20mM HEPES, 150mM -113 - 200914064
NaCl,2mM EDTA，pH8.0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂 垸.鹽酸，Pierce生技公司）以hHFE7A: Traut試劑二1: 16 之莫耳比率添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾層 析（柱；GE HEALTHCARE 公司，NAP-5 脫鹽柱；HEPES 緩 衝液）去除未反應之Traut試劑，將hHFE7A全體之一部分 之離胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述 hHFE7A全體 （2mg/ml，75以1)與微脂粒分散液 (10mM DPPC, 150//1)混合成 hHFE7A 全體：DSPE-PEG3400-MaUl : 15 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與 微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合 之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫 基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM, 1.5/zl而於室溫反應 30分來惰性化。未反應之hHFE7A全體以凝膠過濾層析 (AKTA explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）； HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ; 2ml/分；檢出波長 UV280nm) 來分離，分取免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE公司，分劃分子量50,000)施行超 濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表1之編號30，抗體濃 度157.6/zg/ml，磷脂質濃度1.30mM，抗體密度0.048莫 -114- 200914064 耳％(HEPES緩衝液））。 【實施例3 1】 仿實施例29之（1)將hHFE7A全體之一部分之離胺酸殘基 之胺基予以硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用 時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hHFE7A 全體 （5mg/ml，300 // 1)與微脂粒分散液（10mM DPPC， 150" 1)混合成 hHFE7A 全體：DSPE-PEG3400-Mal=l : 1.5 ( 莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3 400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）1 0 0 m Μ，1. 5 μ 1而於室溫反應3 0分來惰性化。未反 應之hHFE7A全體以凝膠過濾層析（ΑΚΤΑ explorer 10S (GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液（pH7.4); 4°C ;2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取免疫微脂粒劃 份（36-48ml 之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE 公司，分 劃分子量5 0,0 0 0)施行超濾濃縮，得抗體上之離胺酸殘基與 微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成·· 表1之編號31’抗體濃度227.7 μ g/ml，磷脂質濃度 0_95mM，抗體密度0.096莫耳％(HEPES緩衝液））。 於實施例1至3 1製作之免疫微脂粒之成分組成如表1。 【表1】 -115- 200914064 實施例編號 蛋白質 I 脂質組成 抗體密度(mol%) 1 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.0058 2 A DPPC : Choi : DSPE-PEGa^oo = 100 : 66 : 1 0.05 3 A DPPC : Choi : DSFE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.102 4 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 5 0.224 5 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.040 6 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.167 7 A DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.064 8 A DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.055 9 A eggPC : Choi: DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.065 10 A eggPC : Choi: DSPE-PEG34〇0 = 100 : 66 : 1 0.033 11 A DMPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.065 12 A DMPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.028 13 A DOPC : Choi: DSPE-PEG34〇0 = 100 : 66 : 1 0.064 14 A DOPC : Choi: DSPE-PEG^oq = 100 : 66 : 1 0Ό37 15 A DSPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.099 16 A DSPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.043 17 A DPPC : Choi : DSPE = 100 : 66 : 5 0.100 18 A DPPC : Choi : DSPE-PEG^o = 100 : 66 : 1 0.035 19 B DPPC : Choi: DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.0029 20 B DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.0085 21 巳 DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.0053 22 巳 DPPC : Choi: DSPE-PEG34〇0 = 100 : 66 : 1 0.024 23 B DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.069 24 巳 DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 ! 0.013 25 B DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.131 26 C DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.026 27 C DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.081 28 C DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.103 29 D DPPC : Choi: DSP.E-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.018 30 i D DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.048 31 I D DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.096 A ·· hTRA-8 Fab’、B : hTRA-8 Fullbody、C : hHFE7A Fab’、D : hHFE7A Fullbody (全體) 【實施例3 2】 (l)hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 於F(ab’ ）2溶液（抗體濃度3mg/ml，50mM檸檬酸，150mM NaCl，lmM DTPA，ρΗ5·0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂烷 •鹽酸，Pierce 生技公司）以 hTRA-8 F(ab’ ）2 : Traut 試劑 =1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾 精製（柱；GE HEALTHCARE公司 NAP-5脫鹽柱；PBS)來 -116- 200914064 去除Traut試劑，將hTRA-8 F(ab’ ）2之一部分之離胺酸殘 基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯碟脂醯膽驗（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司，COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約 3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯憐脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.71mg、33.3mg、2.1mg(莫耳比 100 : 66 : 1 )量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl, pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Av'anti POLAR LIPID 公司）、 具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Ανanti POLAR LIPID公司 )反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將以上述 hTRA-8 F(ab’ ）2 (lmg/ml，400/z 1)和 PBS 稀釋 5 倍之微脂粒分散液（2mM DPPC，1 000 // 1)混合成hTRA-8 F(ab’ ）2 : DSPE-PEG3400-Mal = l : 5 (莫耳比）之比例，令抗 體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應· 。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加 -117- 200914064 1 0當量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）20mM，10 μ 1而 於室溫反應30分來惰性化。未反應之hTRA-8 F(ab’ ）2用 \^1\^5?11^(5&1：1〇1_丨113]\^(：1^1'〇11化5，分劃分子量 300,000)之 超濾來分離，分取抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG 末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號32 ，抗體濃度191 // g/ml，磷脂質濃度3.38mM，抗體密度 0.031 莫耳 ％，平均粒徑 91.5±23.4 nm (PBS))。 【實施例33】 (1) hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 於F(ab’ ）2溶液（抗體濃度3mg/ml，20mM磷酸鹽，150mM NaCl，ImM DTPA，pH6_0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂 烷·鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8 F(ab’ ）2 : Traut試劑 =1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之反應後’以凝膠過濾 精製（柱；GE HEALTHCARE公司NAP-5脫鹽柱；PBS)而 去除Traut試劑，將hTRA-8 F(ab’ ）2之一部分之離胺酸殘 基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述 h T R A - 8 F (a b ’ ）2 (1 m g / m 1, 4 0 0 y 1)和以 P B S 稀釋 5 倍之微脂粒分散液（2mM DPPC ,300 " 1)混合成hTRA-8 F(ab’ ）2 : DSPE-PEG3400-Mal = l : 1 ·5 (莫耳比）之比例，令 抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反 應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal -118- 200914064 加10當量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）20mM，3//1而 於室溫反應30分來惰性化。未反應之hTRA-8 F(ab’ ）2用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics，分劃分子量 300,000)超 濾來分離，得分取抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG 末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號33 ，抗體濃度16 μ g/ml，磷脂質濃度0.79mM，抗體密度 0.011 莫耳 ％，平均粒徑 66.4土36.5 nm (PBS))。 【實施例34】 (1) hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 於F(ab’ h溶液（抗體濃度3mg/ml，20mM磷酸鹽，150mM NaCl, ImM DTPA，pH7_0)將 4mM Traut 試劑（2-亞胺基噻茂 烷·鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8 F(ab’ ）2 : Traut試劑 =1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾 精製（柱；GE HEALTHCARE公司 NAP-5脫鹽柱；PBS)而 去除Traut試劑，將hTRA-8 F(ab’ ）2之一部分之離胺酸殘 基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 仿實施例33(3)，得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG 末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表1之編號34 ，抗體濃度156/z g/ml，磷脂質濃度1.16mM，抗體密度 0.073 莫耳 ％，平均粒徑 68.0±26.2 nm (PBS))。 【實施例35】 -119- 200914064 (1) hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 於F(ab’ ）2溶液（抗體濃度3mg/ml，20mM磷酸鹽，150mM NaCl，ImM DTPA pH7反.7)將溶於二甲亞楓之4mM Traut試 劑 （2-亞胺基噻茂烷·鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8 F(ab’ ）2 : Traut試劑=1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之 反應後，以凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司 NAP-5 脫鹽柱；PBS)而去除 Traut試劑，將 hTRA-8 F(ab’ ）2之一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 仿實施例33(3)，得抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG 末端結合之本免疫微脂粒。得抗體上之離胺酸殘基與微脂 粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2 之編號35，抗體濃度233 μ g/ml，磷脂質濃度1.16mM，抗 體密度0· 109 莫耳％，平均粒徑107.7±58.9 nm (PBS))。 【實施例3 6】 (1)小鼠抗-hDR5抗體 （MAB631)之硫醇化 於小鼠抗-hDR5抗體 （MAB631) (R&D系統公司 lmg)加 20mM 磷酸鹽，150mM NaCl，lmM DTPA，pH8.0，使抗體濃 度爲2mg/ml。將4mM Traut試劑（2 -亞胺基噻茂院·鹽酸 ，Pierce生技公司）以MAB631 : Traut試劑=1 : 4之莫耳比 添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司NAP-5脫鹽柱；PB S)而去除Traut試劑 -120- 200914064 ，將MAB63 1之一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述MAB631(lmg/ml, 450μ1)與以PBS稀釋5倍之微脂 粒分散液（2mM DPPC，750 // 丨）混合成 ΜΑΒ631 : DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10當量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）20mM，7.5# 1而於室溫反應30 分來惰性化。未反應之MAB631用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics，分劃分子量300,000)超濾來分離，得抗體上 之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒 。（微脂粒組成：表2之編號36，抗體濃度232 β g/ml，磷 脂質濃度 4.06mM，抗體密度 0.023 莫耳％，平均粒徑 1 05.0±42.4 nm (PBS))。 【實施例3 7】 仿實施例36(1)將Μ AB 631之一部分之離胺酸殘基之胺基予 以硫醇化。更仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述M A Β 6 3 1 (111^/1111,45(^1)與以？33稀釋5倍之微脂粒分散液（211^ DPPC, 225# 1)混合成 MAB631 : DSPE-PEG3400-Mal = l : 1.5 (莫耳比）之比例’令抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 -121 - 200914064 DSPE-PEG3400-Mal加10當量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）2 0 m Μ，2.2 5 // 1而於室溫反應3 0分來惰性化。未反 應之 ΜΑΒ63 1 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃分 子量3 00,000)超濾來分離，得抗體上之離胺酸殘基與微脂 粒上之P E G末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2 之編號37，抗體濃度141 μ g/ml ’磷脂質濃度〇.83mM，抗 體密度0.068莫耳％，平均粒徑ll〇.2±44.9nm(PBS))。 【實施例3 8】 (1) 小鼠抗-hDR5抗體 （MAB631 1)之硫醇化 於小鼠抗-hDR5 抗體 （MAB6311MR&D系統公司lmg)加 20mM 磷酸鹽，150mM NaCl，ImM DTPA，ρΗ8·0，使抗體濃 度爲2mg/ml。將4mM Traut試劑 （2-亞胺基噻茂烷·鹽酸 ,Pierce生技公司）以MAB631 1 : Traut試劑=1 : 4之莫耳比 添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司NAP-5脫鹽柱；PBS)而去除Traut試齊IJ ，將MAB 6311之一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述MAB6311 (lmg/ml，360 /z 1)和以PBS稀釋5倍之微 月旨粒分散液(2mM DPPC, 600 μ 1)混合成 ΜΑΒ6311 ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10當量之氫硫基 -122- 200914064 乙醇（和光純藥工業公司）20mM，6 // 1而於室溫反應30分來 惰性化。未反應之 MAB6311 以 VIVASPIN(Sartonus ]^(：1^1'〇1143，分劃分子量300,000)超濾來分離，得抗體上 之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒 。（微脂粒組成：表2之編號38，抗體濃度223 μ g/ml，磷 脂質濃度 3.02mM，抗體密度 0.029 莫耳％，平均粒徑 124.3±44.6 nm (PBS))。 【實施例39】 仿實施例38(1)將MAB6311之一部分之離胺酸殘基之胺基 予以硫醇化。更仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製 〇 抗體於微脂粒之結合以如下工程施行。將上述 MAB6311(lmg/mI，360# 1)與PBS稀釋5倍之微脂粒分散液 (2mM DPPC, 180# 1)混合成 MAB6311 : DSPE-PEG3400-Mal = l : 1.5(莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10當量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）20mm，1.8//l而於室溫反應30分來惰 性化。未反應之 MAB631 用 VIVASPIN (Sartorius Mechat:romcs，分劃分子量 300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒。（微脂粒組成：表2之編號39，抗體濃度101 β g/ml ，磷脂質濃度0.54mM，抗體密度0.075莫耳％，平均粒徑 126.0±49.9 nm (PBS))。 -123 - 200914064 【實施例4 0】 (1) 小鼠抗-hFas抗體（DX2)之硫醇化 將小鼠抗-hFas 抗體（DX2) (BD Biosciences Pharmingen 1.5mg)以（柱；GE HEALTHCARE 公司 NAP-5 脫鹽柱； 20mM 磷酸鹽，150mM NaCl, ImM DTPA，pH8.0)來媒體交 換，使抗體濃度爲〇.64mg/ml。將4mM Traut試劑 （2-亞胺 基噻茂烷.鹽酸，Pierce生技公司）以DX2 : Traut試劑=1 : 4 之莫耳比添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過濾精製（ 柱；GE HEALTHCARE公司 NAP-5脫鹽柱；PBS)而去除 Traut試劑，將DX2之一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫 醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例32(2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述DX2 (0.25mg/ml，1330//1)和以PBS稀釋5倍之微 脂粒分散液（2mM DPPC，5 5 5 # 1)混合成0乂2:03?丑-PEG3 400-Mal= 1 : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10當量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）l〇mm，ll.l/zl而於室溫反應30 分來惰性化。未反應之 MAB144用 VIVASPIN(Sartorius 1\^(：}^]：〇11丨〇5，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒。（微脂粒組成：表1之編號40 ’抗體濃度16 μ g/ml -124- 200914064 ，磷脂質濃度0.87mM，抗體密度0.0073莫耳％，平均粒 徑 82.5±33.6 nm (PBS))。 【實施例4 1】 (1) hTRA-8全體之硫醇化 於hTRA-8全體（抗體濃度 3.87mg/ml，20mm 磷酸鹽， 150mM NaCl，ImM DTPA，pH8.0)將 4mM Traut 試劑（2-亞 胺基噻茂烷.鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8: Traut試 劑二1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之反應後，以凝膠過 濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司PD-10脫鹽柱；PBS)而 去除Traut試劑，將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之 胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯磷脂酿膽鹼（L-a -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司，COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、分子量約2000之於 聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二 硬脂醯磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-020MA)及 V y b r a n t D i D細胞標識溶液 （1 m M於溶液 i n v i t r o g e η)各 5 87.2mg ' 206.4mg ' 23.3 8mg ' 0.8ml(莫耳比 l〇〇: 66: 1: 0.1)量取於茄型燒瓶，加氯仿（關東化學公司）30ml來溶解 。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂 質薄層加 PBS (20mM 磷酸鹽，150mm NaCl, pH7.4) 80ml 來 -125 - 200914064 懸浮，得微脂粒（DPPC濃度：l〇mM)之粗分散液。次以此 微脂粒分散液用EmulsiFlex C-5(AVESTIN)、具有50 nm之 孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 上述 hTRA-8 全體（11112/1111,74.11111)和以？65稀釋5倍之 微脂粒分散液（211^0??€：,123.51111)混合成11丁11八-8全體： DSPE-PEG2000-Mal = l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未 結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG2000-Mal加10等量之 氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）100mM, 247 #1而於室溫 反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體用超濾 (LabScale TFF System(MILLIPORE 公司）、聚醚磺醯基膜 (PelliconXL50，Biomax300,分劃分子量；300,000，MILLIP〇RE 公司）來分離，得分取抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之 PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號 41，抗體濃度1819 g/ml，磷脂質濃度10.08mM，抗體密 度0.072莫耳％，平均粒徑91.8 nm (PBS))。 【實施例42】 (l)hTRA-8 Fab’ 之調製 將 F(ab’ ）2 溶液（抗體濃度 5mg/ml, PBS)於 40mM(±)-二硫 蘇糖醇（（±)-Dithiothreitol，以下標記爲DTT ;和光純藥工 業公司）存在下，於室溫保溫90分，還原爲Fab’ 。凝膠 過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司PD-10脫鹽柱：PBS) -126- 200914064 而去除 DTT、得 hTRA-8 Fab’ 。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例4 1 (2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （5mg/ml ，6.6ml)和微脂粒分散被 (10mM DPPC，12ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG2000-Mal=l : 2 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG2000-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）100mM, 0.12ml而於室溫反應30分來惰 性化。未反應之hTRA-8 Fab’以超濾（LabScale TFF系統 (MILLIPORE 公司）、聚醚磺醯基膜（Pellicon XL 50，Biomax 300,分劃分子量；300,000，MILLIPORE公司）來分離’得分 取抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免 疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號42，抗體濃度 1 632以£/1111，磷脂質濃度10.08mM，抗體密度0.176莫耳 %，平均粒徑 76.7±22.9 nm (PBS))。 【實施例43】 (l)hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 於F(ab’ ）2溶液（抗體濃度3.39mg/ml, 20mM磷酸鹽， 150mM NaCl，ImM DTPA, pH8.0)將 4mM Traut 試劑（2-亞 胺基噻茂烷·鹽酸，Pierce生技公司）以hTRA-8 F(ab’ ）2: Traut試劑=1 : 4之莫耳比添加，於室溫90分之反應後， 以凝膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司PD-10脫鹽柱 -127- 200914064 ;PBS)而去除Traut試劑，將hTRA-8 F(ab’ h之一部分之 離胺酸殘基之胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例41 (2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 ?(&13’）2(111^/1111，24.41111)與微脂粒分散液 (10mM DPPC, 11ml)混合成 hTRA.8 F(ab' )ι DSPE-PEG2 000-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG2000-Mal加10當量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM，1 10 # 1而於室溫反應30 分來惰性化。未反應之hTRA-8 F(ab’ ）2以超濾（LabScale TFF系統（MILLIPORE公司））、聚醚磺醯基膜（PelHcon XL 50,Biomax 300,分劃分子量；300,000，MILUPORE 公司）來分 離，得分取抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結 合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號43，抗體濃 度1 147 # g/ml，磷脂質濃度l〇.〇8mM，抗體密度0.062莫 耳％，平均粒徑 83.7±21.8 nm (PBS))。 【實施例44】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二癸醢磷脂酿膽驗（Didecanoyl Phosphatidylcholine，以 下標記爲 DDEPC ; NOF 公司，COATSOME MC-1010)、膽固 -128- 200914064 醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇之 末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂 醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ;NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 282.9mg 、 128.9mg、21mg(莫耳比1 00: 66: 1 )量取於茄型燒瓶，加氯 仿（關東化學公司）3 0 m 1來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶 內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸 鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5 0ml 來懸浮，得微脂粒（DDEPC 濃 度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機 (The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）、具有 50 nm 之孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠 壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.55ml)和微脂粒分散液 (10mM DDEPC, 0.5ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）100mM，5 1而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN (Sartorius ]^^<:1^11：〇11丨〇5，分劃分子量 300,000)超爐來分離，得分取抗 體上之半眺fee酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號44，抗體濃度426 // g/ml -129- 200914064 ，磷脂質濃度2.31 mM，抗體密度0.200莫耳％，平均粒徑 45.7±18.1 nm (PBS))。 【實施例45】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二月桂酿磷脂酿膽驗（Dilauroyl Phosphatidylcholine， 以下標記爲01^(：;1^〇？公司，00八丁3〇!^£1^(：-2020)、膽固 醇（Sigma-A1 dr 1Ch公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇之 末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂 醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ;NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 310.9mg、 128.9mg、21.7mg(莫耳比100: 66: 1)量取於茄型燒瓶，加 氯仿（關東化學公司）30ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒 瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷 酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 50ml而懸浮，得微脂粒（DLPC濃 度：1 OmM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機 (The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）、具有 50 nm 孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (e X t r u d e d)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.55ml)和微脂粒分散液 (10mM DLPC，0.5ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400- 200914064
Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）lOOmM，5 // 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量 300,000)超濾、來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號45，抗體濃度600 v g/ml ，磷脂質濃度2.31 mM，抗體密度0.135莫耳％，平均粒徑 65.6±25.7 nm (PBS))。 【實施例46】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 雙二十二醯碟脂醯膽驗（Didocosanoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DDOPC; Sigma-Aldrich 公司）、膽固 醇（Sigma -Aldrich公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇之 末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂 醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine ’ 以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ；N〇F 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 45.12mg 、 12.89mg、2.17mg(莫耳比丨〇〇: 66: 1)量取於茄型燒瓶，加 氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒 瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷 -131 - 200914064 酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂粒（DDOPC 濃度：1 OmM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機 (The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司），由具有 400 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠 壓（extruded)。其後用探針予以超音波（ULTRASONIC PROCESSOR SH-7600 SEIKO INSTRUMENT & ELECTRONICS LTD)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.55ml)和微脂粒分散液 (10mM DDOPC, 0.5ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微 脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM, 5 # 1而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius 1^(：1^]：〇11丨〇5，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號46，抗體濃度183 μ g/ml ，磷脂質濃度2.1 ImM，抗體密度0.094莫耳％，平均粒徑 147.7±56.7 nm (PBS))。 【實施例47】 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。更仿實施例 44(2)將微脂粒分散液用時調製，用具有30 nm孔大小之聚 羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓（extruded)， -132- 200914064 使微脂粒之粒徑整齊。 抗體於微脂粒之結合乃仿實施例44(3)施行，得抗體上之 半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒 (微脂粒組成：表2之編號47，抗體濃度45 8 μ g/ml，磷脂 質濃度 7.29mM，抗體密度 0.068莫耳％，平均粒徑 39.8±17.9 nm (PBS))。 【實施例4 8】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯憐脂醯膽驗（L-a -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-' PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.7mg、12.89mg、2.17mg(莫耳比 100: 66: 1)量取於前型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：lOmM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）、 具有400 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公 -133 - 200914064 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.55ml)和微脂粒分散液 (1 OmM DPPC，0.5ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-MaUl : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）lOOmM, 5 μ 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius ?^〇1^1：〇1^3，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號48，抗體濃度1 24 // g/ml ，磷脂質濃度1.14mM，抗體密度0.1 18莫耳％，平均粒徑 75.2±9.1 nm 、 2 3 2 2± 2 9 · 3 nm (PB S ))。 【實施例49】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 二芥酷磷脂醯膽驗（Dierucoyl Phosphatidylcholine，以下 標記爲 DEPC: NOF 公司 COATSOME MC-2121AL)、膽固醇 (Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇之末 端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂醯 乙 醇胺（P〇ly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal -134- 200914064 ;NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 44.92mg、12.89 mg、2.17mg(莫耳比100: 66: 1)量取於茄型燒瓶，加氯仿（ 關東化學公司）3 ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶內 壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽， 150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂粒（DEPC濃度： 10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）、具有 800 nm 孔 大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab' (lmg/ml, 0.55ml)和微脂粒分散液 (10mM DEPC，0.5ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）lOOmM，5 // 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius ^^(：1^1：〇1^5，分劃分子量300,000)超爐來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號49，抗體濃度94 g/ml ，磷脂質濃度1.50mM，抗體密度0.068莫耳％，平均粒徑 1 30.0±43.2 nm (PBS))。 【實施例50】 (l)hTRA-8全體之調製 -135- 200914064 仿實施例41(1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之胺 基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂酿磷脂酿膽驗（L-a -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂酿磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.7mg、12.89mg、6.3mg(莫耳比 1 00 : 6 6 : 3)量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）， 以具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體 （1 mg/ml，360 μ 1)和以PBS稀釋5倍 之微脂粒分散液（2m.M DPPC，200 /ζ 1)混合成hTRA-8全體： DSPE-PEG3400-Mal = l ： 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇 基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未 結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之 -136- 200914064 氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）60mM，2 A 1而於室溫反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體用 VIVASPIN (3&1^〇1^115 1\46(：1131；]：〇11卜5，分劃分子量 300,000)超濾、來分離， 得分取抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之 本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號50，抗體濃度 81//g/ml，憐脂質濃度1.17mM，抗體密度0.027莫耳％， 平均粒徑 57.3 nm (PBS))。 【實施例5 1】 仿實施例41(1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之 胺基予以硫醇化。更仿實施例50(2)將微脂粒分散液用時 調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 全體（lmg/ml，1 200 /z 1)和以PBS稀釋5倍之微脂粒分散液 (2mM DPPC，200 # 1)混合成 hTRA-8 全體：03?£-?丑03400-MaUl : 1.5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）6 0 m Μ，2 // 1而於室溫反應3 0分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 全體用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒。（微脂粒組成：表2之編號51，抗體濃度156// g/ml ’磷脂質濃度0 · 7 3 mM，抗體密度0.0 8 4莫耳％，平均粒徑 60.8 nm (PBS))。 -137- 200914064 【實施例52】 (1) hTRA-8全體之調製 仿實施例41(1)將hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之 胺基予以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂酸磷脂醯膽驗（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醢憐脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.7mg、12.89mg、21mg(莫耳比 100: 66: 10)量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）， 以具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體 （lmg/ml，1200//1)和以PBS稀釋5 倍之微脂粒分散液（2mM DPPC, 200 # 1)混合成hTRA-8全體 :DSPE-PEG3400-Mal = l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫 -138- 200914064 醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體 未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量 之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）60mM，6.67 #1而於室 溫反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics，分劃分子量 300,000)超 濾來分離，得分取抗體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG 末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號52 ，抗體濃度161 μ g/ml，磷脂質濃度0.66mM，抗體密度 0.092 莫耳 ％，平均粒徑 74.1nm (PBS))。 【實施例53】 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。更仿實施例 5 0(2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.44ml)與以PBS稀釋5倍之微脂粒分散液 (2mM DPPC，0.2ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 1.5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）60mM，6.67 // 1而於室溫反應30分來 惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量 300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號5 3，抗體濃度 125#g/ml，磷脂質濃度〇.45mM，抗體密度0.297莫耳％ -139- 200914064 ，平均粒徑 53.9 nm (PBS))。 【實施例54】 (1) hTRA-8 Fab'之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂薩憐脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約2000之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯碟脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG2000-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-020MA)各 36_7mg、12.89mg、1.47mg(莫耳比 100: 66: 1)量取於前型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl, pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）、 具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司 )反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.44ml)與微脂粒分散液 (10mM DPPC，〇.4ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG2000-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 -140- 200914064 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG2000-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）1 OOmM，4 μ 1而於室溫反應30分來情性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VlVASPIN(Sartorius !\^(；1^1'〇1^3，分劃分子量300,000)超據來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號5 4，抗體濃度 354私£/：111，磷脂質濃度4.54mM，抗體密度0.085莫耳％ ，平均粒徑 106.5±33.4nm(PBS))。 【實施例55】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂酿磷脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約5000之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂酶磷脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine ’ 以下標言己爲 DSPE-PEG5000-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-050MA)各 36.7mg ' 12.89mg、2.99mg(莫耳比 100: 66: 1)量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 -141 - 200914064 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID 公司）， 以具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml, 0.66ml)和微脂粒分散液 (10mM DPPC, 0.6ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： D S PE-PEG5 000-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG2000-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）100mM, 6 # 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒。（微脂粒組成：表 2之編號55，抗體濃度 128/zg/ml，磷脂質濃度3.02mM，抗體密度0.046莫耳％ ，粒徑 84.9±36.9 nm(PBS))。 【實施例56】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯磷脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 -142- 200914064 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯憐脂醯乙醇胺（P〇ly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.7mg、4.84mg、2.17mg(莫耳比 100: 25: 1)量取於茄型 燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3ml而溶解。次減壓蒸除氯 仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl, pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用擠壓機（The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司）， 以具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Ανanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml, 0.44ml)和微脂粒分散液 (10mM DPPC，0.4ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）100mM，4 # 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量300,000)超濾來分離，得分取抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫 微脂粒。（微脂粒組成：表2之編號56，抗體濃度 214 // g/ml ’磷脂質濃度i .95mM，抗體密度0.156莫耳％ -143 - 200914064 ，粒徑 78·9±4 1.4 nm (PBS))。 【實施例57】 (1) hTRA-8 Fab'之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯憐脂醯膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醯碟脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine ’ 以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ; NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 36.7mg、19.35mg、2.17mg(莫耳比 1 00 : 100 : 1)量取於茄 型燒瓶，加氯仿（關東化學公司）3 ml來溶解。次減壓蒸除 氯仿，於燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl, pH7.4) 5ml而懸浮，得微脂 粒（DPPC濃度：10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液 用濟壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID 公司）’ 以具有50 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公 司）反復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 仿實施例56(3)結合，得抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒 上之PEG末端結合之本免疫微脂粒。（微脂粒組成：表2 之編號57，抗體濃度456 μ g/ml ’磷脂質濃度4.88mM，抗 -144 - 200914064 體密度 0.084 莫耳 ％，粒徑 89.1±31.9 nm (PBS))。 【實施例5 8】 (1) hTRA-8 scFv 之調製 將 hTRA-8 scFv 5B (緩衝液；50mM Tns-鹽酸（PH7.5) ,500mM NaCl, 10% 甘油，i〇mM CHAPS, ImM DTT)用凝 膠過濾精製（柱；GE HEALTHCARE公司PD-10脫鹽柱）， 緩衝液交換爲磷酸鹽緩衝液，5 00mM NaCl, pH7.4。 (2) 微脂粒之調製 將一軟脂酿磷脂薩膽驗（L-a -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline ’ 以下標記爲 DPPC ; NOF 公司 COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約 3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 一硬脂醯碟脂酿乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ; NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 22mg 、7.73mg、1.7mg(莫耳比100: 66: 1.5)量取於茄型燒瓶， 加氯仿（關東化學公司）3ml而溶解。次減壓蒸除氯仿，於 燒瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加3ml之磷酸鹽 緩衝液，500mM NaCl, pH7.4而懸浮，得微脂粒（DPPC濃度 :10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機（The M i n i - E X t r u d e r, A v a n t i P 〇 L A R LIPID 公司），由具有 1 〇 〇 n m 孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3) 抗體於微脂粒之結合 -145 - 200914064 將上述hTRA-8 scFv (125// g/ml，800// 1)和微脂粒分散液 (10mM DPPC，200 // 1)混合成匕丁1^-8 5。？¥:03?£-?£03400-Mal=l : 7.5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上 之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）lOOmM，2// 1而於室溫反應30分來惰 性化。未反應之 hTRA-8 scFv以凝膠過濾層析（AKTA explorer 10S(GE HEALTHCARE 公司）；柱（GE HEALTHCARE 公司，HiLoad Superdex 200 16/60 prep 級）；HEPES 緩衝液 (pH7.4) ; 4°C ; 2ml/分；檢出波長UV280nm)來分離，分取 免疫微脂粒劃份（36-48ml之劃份）。用 Amicon Ultra (MILLIPORE公司，分劃分子量50，000)施行超濾濃縮，得抗 體上之半胱胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免疫微 脂粒（微脂粒組成：表2之編號58，抗體濃度14// g/ml， 磷脂質濃度1.3mM，抗體密度0.025莫耳％，平均粒徑 91±16 nm(磷酸鹽緩衝液，500mM NaCl，pH7.4))。 【實施例5 9】 •重組體可溶性TRAIL之硫醇化 將 Recombinant soluble TRAIL (Peprotech 公司）（以下標 記爲 rsTRAIL(P))(15〇eg)溶解於 10mM 磷酸鈉，140mM NaCl, ImM DTPA，ρΗ7·4、調製爲 2mg/mL。將溶解於二甲 亞砸之400//M Traut試劑（2 -亞胺基噻茂院·鹽酸，Pierce 生技公司）以rsTRAIL(P): Traut試劑=1: 1之莫耳比添加 ，於室溫90分之反應後’以用Microcon (MILLIPORE公司 -146- 200914064 ，分劃分子量 3,000; PBS，ρΗ7·4)之超濾（1 000倍稀釋）去除 Traut試劑，將rsTRAIL(P)之一部分之離胺酸殘基之胺基 予以硫醇化。 •微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3)rsTRAIL(P)於微脂粒之結合反應 rsTRAIL(P)於微脂粒之結合乃如下施行。將上述 rsTRAIL(P) (lmg/ml，19.6/zl)和微脂粒分散液（10mM DPPC， 50 " 1)混合成 rsTRAIL(P) : DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 15 (莫 耳比）之比例，令rsTRAIL(P)之硫醇基與微脂粒上之PEG 鏈末端之馬來醯亞胺基反應。rsTRAIL(P)未結合之馬來醯 亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（ 和光純藥工業公司）1 OmM，5 // 1而於室溫反應30分來惰性 化。未反應之 rsTRAIL(P)用 VIVASPIN(Sartorius ]^(：1^1：〇111〇5，分劃分子量300,000)之超濾反復施行至原液 稀釋1 000倍來去除。得rsTRAIL(P)上之離胺酸殘基與微 脂粒之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表2 之編號 59，蛋白濃度 6// g/ml，磷脂質濃度 1.8mM， rsTRAIL(P)密度 0.011 莫耳 ％，平均粒徑 62 nm (PBS, pH7.4))。 【實施例60】 • rsTRAIL(P)之硫醇化 仿實施例59將rsTRAIL(P)之一部分之離胺酸殘基之胺基 予以硫醇化。 -147- 200914064 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) rsTRAIL(P)於微脂粒之結合反應 rsTRAIL於微脂粒之結合乃如下施行。將上述rsTRAIL(P) (lmg/ml，58.8/zl)和微 旨粒分散液（10mM DPPC，50//1)混合 成 rsTRAIL(P) : DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例 ，令rsTRAIL(P)之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來 醯亞胺基反應。rsTRAIL(P)未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mal力卩1 0等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）10mM, 5 /z 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 rsTRAIL(P)用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics，分劃分子 量300,000)之超濾反復施行至原液稀釋1000倍來去除。得 rsTRAIL(P)上之離胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本 免疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號 60，蛋白濃度 9 v g/ml，磷脂質濃度 l.lmM，rsTRAIL(P)密度 0.024 莫耳 %，平均粒徑 73 nm (PBS, pH7.4))。 【實施例6 1】 (1)重組體可溶性TRAIL之硫醇化 將 Recombinant soluble TRAIL (Biodesign)(以下標記爲 rsTRAIL(B))(200 // g)溶解於 l〇mM 磷酸鈉，140mM NaCl，lmM DTPA, pH7.4，調製成2mg/mL。將溶解於二甲亞 颯之400//M Traut試劑（2-亞胺基噻茂院·鹽酸，Pierce生 技公司）rsTRAIL(B): Traut試劑=1: 1之莫耳比添加，於 室溫90分之反應後，以Microcon (MILLIPORE公司，分劃 -148- 200914064 分子量 3,000 ; PBS，pH7.4)超濾（1000倍稀釋）而去除Traut 試劑，將rsTRAIL(B)之一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫 醇化。 (2)微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3 )rs TRAIL (B)於微脂粒之結合反應 rsTRAIL(B)於微脂粒之結合乃如下施行。將上述 rsTRAIL(B)(lmg/ml，47#1)與微脂粒分散液（10mM DPPC， 40// 1)混合成 rsTRAIL : DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 5 (莫耳比 )之比例，將rsTRAIL(B)之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。rsTRAIL(B)未結合之馬來醯亞胺 基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光 純藥工業公司）1 Om M，4 /z 1而於室溫反應30分來惰性化。 未反應之 rsTRAIL(B)用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics， 分劃分子量300,000)之超濾反·復施行至原液稀釋1 000倍來 去除。得rsTRAIL(B)上之離胺酸殘基與微脂粒之PEG末端 結合之本免疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號6 1，蛋白 濃度4 // g/ml、磷脂質濃度1.2mM，rsTRAIL密度0,009莫 耳 ％，平均粒徑 63 nm (PBS, pH7.4))。 【實施例62】 (1)小鼠抗- hDR4抗體（m2E12)之硫醇化 於依國際公開小冊WO2003/379 1 3記載之融合瘤2E12產 生之係屬小鼠抗人DR4抗體之m2E12(抗體濃度1.8mg/ml， 20mM 磷酸鹽緩衝液，150mM NaCl, ImM DTPA，pH8.0)， -149- 200914064 將4mM Traut試劑 （2-亞胺基噻茂烷·鹽酸，Pierce生技公 司）以hTRA-8 : Traut試劑=1 : 4之莫耳比添加，於室溫90 分之反應後，以凝膠過濾層析（柱；GE HEALTHCARE公司 PD-10脫鹽柱；PBS, pH7.4)去除Traut試劑，將m2E12之 一部分之離胺酸殘基之胺基予以硫醇。 (2) 微脂粒之調製 仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3) 抗體於微脂粒之結合 將上述m2E12(0.77mg/ml，97.4 μ 1)和微脂粒分散液（2mM DPPC, 1 000 # 1)混合成 m2E12 ： DSPE-PEG3400-Mal= 1 ： 40 ( 莫耳比）之比例，將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG3400-Mal力卩10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）1 OOmM，2 /z 1而於室溫反應3 0分來惰性化。未反應 之 m2E12 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分劃分子量 3 00,000)之超濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去除。得抗 : 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒（微脂粒組成：表2之編號62，抗體濃度25 // g/ml， 磷脂質濃度1.7mM，抗體密度0.0059莫耳％，平均粒徑 68±25 nm (PBS，pH7.4))。 【實施例63】 仿實施例62將m2E 1 2之一部分之離胺酸殘基之胺基予以 硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述m2E 1 2 -150- 200914064 (0.77mg/ml, 195//1)和微脂粒分散液（2mM DPPC，1 000 // 1) 混合成 m2E12 全體：DSPE-PEG3400-Mal = l : 20 (莫耳比）之 比例’將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯 亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3 400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司） 100mM，2// 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之 m2E12 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃分子量 3 00,000)之超濾反復施行至原液稀釋1〇〇〇倍來去除。得抗 體上之離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微 脂粒（微脂粒組成：表2之編號63，抗體濃度43 // g/ml， 磷脂質濃度 1.4mM，抗體密度0.0122莫耳％，平均粒徑 53±24 nm (PBS, pH7.4))。 【實施例64】 仿實施例62將m2E 1 2之一部分之離胺酸殘基之胺基予以 硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。上述m2E 1 2 (0.77mg/ml, 3 90 μ1)與微脂粒分散液（2mM DPPC，1 000 // 1) 混合成 m2E12 : DSPE-PEG3400-Mal = l : 10 (莫耳比）之比例 ，將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺 基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal力□ 10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM， 2从1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之m2El 2用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics,分劃分子量 300,000)之 超濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去除。得抗體上之離 200914064 胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表2之編號64，抗體濃度72/z g/ml，磷脂質濃 度1.2mM，抗體密度0.0247莫耳％，平均粒徑63±26nm (PBS，ρΗ7·4))。 【實施例65】 仿實施例62將m2E 12之一部分之離胺酸殘基之胺基予以 硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。上述m2E 1 2 (0.77mg/ml，7 80 /zl)和微脂粒分散液（2mM DPPC，1000 // 1) 混合成 m2E12 : DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例 ，將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺 基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM， 2 // 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之m2E 12用 VIVASPIN (Sartorius Mechatronics，分劃分子量 300,000)之 超濾反復施行至原液稀釋1 〇〇〇倍來去除。得抗體上之離 胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表2之編號65 %抗體濃度159 // g/ml，磷脂質 濃度1.2mM，抗體密度0.0510莫耳％，平均粒徑65±27 nm (PBS, pH7.4))。 【實施例66】 仿實施例62將m2E 1 2之一部分之離胺酸殘基之胺基予以 硫醇化。更仿實施例1之（2)將微脂粒分散液用時調製。 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。上述 m2El 2 -152- 200914064 (0.77mg/ml，1 950 #1)與微脂粒分散液（2mM DPPC，1 000 /zl) 混合成 m2E12 : DSPE-PEG3400-Mal=l : 2 (莫耳比）之比例 ，將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺 基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）100mM, 2 /z 1而於室溫反應30分來惰性化。未反應之m2E 12用 \^1\^3?11^(5&1：1;〇]"丨115]\46(；]131；]：〇11：^5，分劃分子量 300,000)之 超濾反復施行至原液稀釋1000倍來去除。得抗體上之離 胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒（微 脂粒組成：表2之No. 66，抗體濃度281 # g/ml，磷脂質濃 度0.86mM，抗體密度0.1 296莫耳％，平均粒徑76±29nm (PBS, pH7.4))。 【實施例67】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 將雙一十—薩憐脂酸膽驗（Didocosanoyl Phosphatidyl choline ’ 以下標記爲 DDOPC ; Sigma-Aldrich 公司）、膽固 醇（3丨£1^-人1(11^11公司）、及分子量約3400之於聚乙二醇之 末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂 酿乙醇月女（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ;NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 45.12mg、12.89mg 、2.17mg(莫耳比1 00 : 66 : 1)量取於茄型燒瓶，加氯仿（關 -153 - 200914064 東化學公司）3ml來溶解。次減壓蒸除氯仿’於燒瓶內壁 形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (2〇mM磷酸鹽， 150mM NaCl，pH7.4) 5ml來懸浮，得微脂粒（DDOPC濃度： 10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機（The Mini-Extruder, Avanti POLAR LIPID 公司），以具有 800 nm 孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0_66ml)與微脂粒分散液 (1 OmM DDOPC, 0.6ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE- PEG3 400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例、抗體之硫醇基與微脂 粒上上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之 馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基 乙醇（和光純藥工業公司）l〇〇mM,6 μ 1而於室溫反應30分 來惰性化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius ]^(：1131；1：〇1^5,分劃分子量300,000)之超據來分離，得分取 抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免 疫微脂粒（微脂粒組成：表 2之編號 67，抗體濃度 77#g/m卜磷脂質濃度0.15mM，抗體密度0.55 6莫耳％， 平均粒徑 896.8±70.8 nm (PBS))。 【實施例68】 (1) hTRA-8 Fab’ 之調製 仿實施例42(1)將hTRA-8 Fab’用時調製。 (2) 微脂粒之調製 -154- 200914064 將二芥酸碟脂醯膽鹼（Dierucoyl Phosphatidylcholine ’ 以 下標記爲 DEPC; N0F 公司 COATSOME MC-2121AL)、膽固 醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之於聚乙一醇之 末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基二硬脂醯磷脂 醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ；N〇F 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 44.92mg、12.89mg 、2.17mg(莫耳比1 00: 66: 1)量取於茄型燒瓶，加氯仿（關 東化學公司）3 ml來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒瓶內壁 形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷酸鹽， 150mM NaCl, pH7.4) 5ml來懸浮，得微脂粒（DEPC濃度： 10mM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機（The M i n i - E X t r u d e r，A v a n t i P 0 L A R LIPID 公司），以具有 1 0 0 n m 孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反復擠壓 (extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述 hTRA-8 Fab’ （lmg/ml，0.66ml)與微脂粒分散液 (10mM DEPC，0.6ml)混合成 hTRA-8 Fab’ ： DSPE-PEG3400-Mal=l : 5 (莫耳比）之比例，令抗體之硫醇基與微脂粒上之 PEG鏈末端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞 胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10等量之氫硫基乙醇（和 光純藥工業公司）1 〇 〇 m Μ，6 // 1而於室滥反應3 0分來惰性 化。未反應之 hTRA-8 Fab’ 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃分子量300,000)之超濾來分離，得分取 -155 - 200914064 抗體上之半胱胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免 疫微脂粒（微脂粒組成：表2之編號68，抗體濃度 393从g/ml，磷脂質濃度5.64mM，抗體密度0.076莫耳％ ，平均粒徑 91.7±33.7 nm (PBS))。 【實施例69】 (l)hTRA-8 F(ab’ ）2 之硫醇化 仿實施例43(1)將F(ab’ ）2之一部分之離胺酸殘基之胺基 予以硫醇化。更仿實施例4 1 (2)將微脂粒分散液用時調製 〇 抗體於微脂粒之結合乃以如下工程施行。將上述hTRA-8 ?(&1?’）2(11112/1111，2.6861111)與微脂粒分散液（1〇^1]\/10??〇， 11ml)混合成 hTRA-8 F(ab’ ）2 : DSPE-PEG2000-Mal=l : 45 ( 莫耳比）之比例，將抗體之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末 端之馬來醯亞胺基反應。抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對 DSPE-PEG2000-Mai加10當量之氫硫基乙醇（和光純藥工業 公司）100mM, 1 10 # 1而於室溫反應30分來惰性化。未反 應之 hTRA-8 F(ab’ ）2 用超濾（LabScale TFF 系統 (MILLIPORE 公司））、聚醚磺醯基膜（Pellicon XL 50，Biomax 300,分劃分子量；300,000，MILLIPORE公司）來分離’得分 取抗體上之離胺酸殘基與微脂粒之PEG末端結合之本免疫 微脂粒（微脂粒組成：表2之編號69 ’抗體濃度128 μ g/ml ，磷脂質濃度10.〇8mM，抗體密度0.0069莫耳％，平均粒 徑 87.6±18.1 nm (PBS))。 【實施例70】 -156- 200914064 (1) 2E12全體及hTRA-8全體之硫醇化 於2E12全體及hTRA-8全體（抗體濃度1.8mg/ml，20mM 磷酸鹽緩衝液，150mM NaCl，2mM DTPA，pH8.0)將 4mM Traut試劑 （2-亞胺基噻茂烷·鹽酸，Pierce生技公司）以各 抗體（2E12，hTRA-8) : Traut試劑=1 : 4之莫耳比添加，於室 溫90分之反應後，以凝膠過濾層析（柱；GE HEALTHCARE 公司PD-10脫鹽柱；PBS，pH7.4)而去除Traut試劑，將 2E12全體及hTRA-8全體之一部分之離胺酸殘基之胺基予 以硫醇化。 (2) 微脂粒之調製 將二軟脂醯磷脂醢膽鹼（L-α -Dipalmitoyl Phosphatidyl choline，以下標記爲 DPPC ; N0F 公司，COATSOME MC-6060)、膽固醇（Sigma-Aldrich公司）、及分子量約3400之 於聚乙二醇之末端具有馬來醯亞胺基之聚乙二醇丁二醯基 二硬脂醋碟脂醯乙醇胺（poly (ethylene glycol) succinyl distearoyl phosphatidyl ethanolamine，以下標記爲 DSPE-PEG3400-Mal ； NOF 公司，SUNBRIGHT DSPE-034MA)各 44mg 、15.4mg、2.6mg(莫耳比100: 66: 1)量取於前型燒瓶，加 氯仿（關東化學公司）6 m 1來溶解。次減壓蒸除氯仿，於燒 瓶內壁形成脂質之薄層。於此脂質薄層加PBS (20mM磷 酸鹽，150mM NaCl，pH7.4) 6ml來懸浮，得微脂粒（DPPC濃 度：1 OmM)之粗分散液。次將此微脂粒分散液用擠壓機 (The Mini-Extruder，Avanti POLAR LIPID 公司），由具有 100 nm孔大小之聚羧酸酯膜（Avanti POLAR LIPID公司）反 -157- 200914064 復擠壓（extruded)，使微脂粒之粒徑整齊。將此 l〇mM DPPC分散液以PBS, pH7.4調製爲2mM。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述2E12全體（0.77mg/ml，195 # 1)和微脂粒分散液 (2mM DPPC, 1 000 # 1)混合成 2E1 2 全體：〇3?£-?£03400-Mal=l : 20 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，使抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 將未反應之 m2E12 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分 劃分子量300,000)之超濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去 除，將分散液之體積調製爲1 ml。於此階段採集分散液之 一部分，定量結合於微脂粒之2E 1 2之蛋白質量及微脂粒 之脂質量。次將上述hTRA-8全體 （0.77mg/ml，5 84 y 1)與 上述微脂粒分散液混合成hTRA-8全體：DSPE-PEG3400-Mal = 3 : 20 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，使抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10 等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）l〇〇mM，2/zl而於 室溫反應 30分來惰性化。未反應之 hTRA-8全體用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃分子量 300,000)之超 濾反復施行至原液稀釋1000倍來去除，得2種抗體上之 離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒。 將本免疫微脂粒分散液之全抗體濃度及脂質濃度定量’由 全抗體量及2E12之抗體量算出各別之抗體量。（微脂粒組 成：表2之編號70，抗體濃度 2E12: 40//g/ml’ hTRA-8 200914064 :139// g/ml，抗體比率 2E12 : hTRA-8 = 22 : 78，磷脂質 濃度1.15mM，全抗體密度0.062莫耳％ (PBS)) 【實施例7 1】 仿實施例70之（1)施行2E12全體及hTRA-8全體之硫醇 化。更仿實施例70之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體（0.77mg/ml, 195μ 1)和微脂粒分散液 (2mM DPPC, 1000 # 1)混合成 hTRA-8 全體：DSPE-PEG3400-Mal=l : 20 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，將抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 未反應之 hTRA-8 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃 分子量300,000)之超濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去除 ，將分散液之體積調製爲1 ml。於此階段採集分散液之一 部分，將結合於微脂粒之hTRA-8之蛋白質量及微脂粒之 脂質量定量。次將上述2E12全體（〇.77mg/ml，5 84 # 1)和 上述微脂粒分散液混合成 2E12 全體：DSPE-PEG3400-MaU3 : 20 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，使抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10 等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）l〇0mM，2/zl而於 室溫反應30分來惰性化。未反應之 2E12全體用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics,分劃分子量 300,000)之超 濾、反復施行至原液稀釋1〇〇〇倍來去除，得2種抗體上之 離fee酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒。 -159- 200914064 將本免疫微脂粒分散液之全抗體濃度及脂質濃度定量，由 全抗體量及hTRA-8之抗體量算出各別之抗體量。（微脂粒 組成：表2之編號7卜抗體濃度 2E12:93//g/ml，hTRA-8 : 74 v g/nU，抗體比率 2E12 : hTRA- 8 = 56 : 44，磷脂質 濃度1.14mM，全抗體密度0.058莫耳％ (PBS)) 【實施例72】 仿實施例70之（1)施行2E12全體及hTRA-8全體之硫醇 化。更仿實施例70之（2)將微脂粒分散液用時調製。 (3)抗體於微脂粒之結合 將上述hTRA-8全體（0.77mg/ml，78 μ 1)與微脂粒分散液 (2mM DPPC，1000 # 1)混合成 hTRA-8 全體：03?五彳£03400-M a 1 = 1 : 5 0 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，使抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 將未反應之 hTRA-8 用 VIVASPIN(Sartorius Mechatronics，分 劃分子量300,000)之超濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去 除，將分散液之體積調製爲1 ml。於此階段採集分散液之 一部分，將於微脂粒結合之hTRA-8之蛋白質量及微脂粒 之脂質量定量。次將上述2E12全體（0.77mg/ml, 701//1) 和上述微脂粒分散液混合成 2E12 全體：DSPE-PEG3400-MaU9 : 50 (莫耳比）之比例，於室溫反應2小時，使抗體 之硫醇基與微脂粒上之PEG鏈末端之馬來醯亞胺基結合。 抗體未結合之馬來醯亞胺基乃對DSPE-PEG3400-Mal加10 等量之氫硫基乙醇（和光純藥工業公司）lOOmM，2#1而於 室溫反應 30分來惰性化。未反應之 2E12全體用 -160- 200914064 ''/1\/八3?11^(3&1^〇1"丨115]\46(：11&1：1：〇11卜5，分劃分子量 300,000)之超 濾反復施行至原液稀釋1 000倍來去除，得2種抗體上之 離胺酸殘基與微脂粒上之PEG末端結合之本免疫微脂粒。 將本免疫微脂粒分散液之全抗體濃度及脂質濃度定量，由 全抗體量及hT.RA-8之抗體量算出各別之抗體量。（微脂粒 組成：表 2之編號72，抗體濃度 2E12 : 155 y g/mi、 hTRA-8 : 39 " g/m卜抗體比率 2E1 2 : hTRA-8 = 80 : 20，磷 脂質濃度1.57mM，全抗體密度0.049莫耳％ (PBS))。 於實施例32至72製作之免疫微脂粒之成分組成如表2。 【表2】 161 實施例編號 蛋白質 脂質組成 :抗體密度（mol%) 32 E DPPC : Choi; dspe-peg3400 = 100:66: 1 0.031 33 E DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100:66:1 0.011 34 E DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100:66:1 ! 0.073 35 E DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100:66: 1 0.109 36 G DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100:66: 1 0.023 37 G DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100 :66:1 0.068 38 H DPPC : Choi : dspe-peg3400 = 100:66:1 0.029 39 H DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100 : 66 : 1 0.075 40 DPPC : Choi: dspe-peg3400 = 100: 66: 1 0.0073 41 B DPPC : Choi : DSPE~PEG2〇〇〇 = 100:66:1 0.072 42 A DPPC : Choi : DSPE-PEG2000 = 100 : 66 : 1 0.176 43 E DPPC : Choi: dspe-peg2000 = 100 : 66 : 1 0.062 44 A DDEPC : Choi :DSPE-PEG3400 = :100: 66 : 1 0.2 45 A DLPC : Choi : DSPE-PEG3400= 100:66; 1 0.135 46 A DDOPC : Choi :DSPE-PEG34〇〇= 100:66:1 0.094 47 A DDEPC : Choi ：dspe-peg34O0 = :100 : 66 : 1 0.068 48 A DPPC : Choi: dspe-peg34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.118 49 A DEPC Choi: dspe-peg3400 = 100:66:1 0.068 50 巳 DPPC : Choi dspe-peg3400 = 100 : 66 : 3 0.027 51 B DPPC : Choi dspe-peg34〇〇 = 100: 66 : 3 0.084 52 B DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 :66:10 0.092 53 A DPPC : Choi DSPE-PEG期= 100 : 66 : 3 0.297 54 A DPPC : Choi DSPE-PEG2000 — 100: 66 : 1 0.085 55 A DPPC : Choi dspe-peg5000 = 100: 66: 1 0.046 56 A DPPC : Choi dspe-peg3400 = 100: 25 : 1 0.158 57 A DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 100 : 1 0.084 58 F DPPC : Choi : DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.025 59 K DPPC : Choi dspe-peg34〇〇 = 100 : 66 : 1 0.011 60 K DPPC : Choi DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.024 61 L DPPC : Choi : DSPE-PEG謂= 100 : 66 : 1 0.009 62 J DPPC : Choi: DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.006 63 J DPPC : Choi dspe-peg3400 = 100 : 66 : 1 0.012 64 J DPPC : Choi : DSPE-PEG34〇〇 : 100: 66 : 1 0.025 65 J DPPC : Choi dspe-peg340〇 = 100: 66 : 1 0.051 66 J DPPC : Choi :DSPE-PEG3400 = 100 : 66 : 1 0.13 67 A DDOPC : Cho ：dspe-peg340〇 =100 : 66 : 1 0.556 68 A DEPC : Choi dspe-peg3400 = 100: 66: 1 0.076 69 E DPPC : Choi ：dspe-peg3400 = -100: 66: 1 0.0069 70 B&J DPPC : Choi :DSPE-PEG3400 = 100: 66 : 1 0.062 (J : B = 22 : 78) 71 B & J DPPC : Choi ;DSPE-PEG3400 - :100: 66 : 1 0.058 (J : B = 56 : 44) 72 巳& J DPPC : Choi ：dspe-peg3400 : = 100:66:1 0.049 (J : B = 80 : 20) 200914064 A : hTRA-8 Fab’、B : hTRA-8 Fullbody、C : hHFE7A Fab’、D : hHFE7A Fullbody (全體) E : hTRA-8 F(ab，)2、F: hTRA-8 scFv、G : MAB631 Fullbody、H : MAB6311 Fullbody I: DX2 Fullbody、J: 2E12 Fullbody、K : rsTRAIL (peprotech)、L : rsTRAIL (biodesign) -162- 200914064 【試驗例1】 測定實施例1、2、3調製之免疫微脂粒對lurkat細胞之細 胞凋零誘導活性 將】urkat細胞依錐藍染色法計數後，以含有10%牛胎血 清（海克隆公司製）之DMEM培養基（Invitrogen公司製’以 下稱DMEM培養基）調製成lxlO5 cells/ml。預先以DMEM 培養基調製抗體濃度爲2000、200、20、2 ng/ml(最終濃度 1 000、100、10、1 ng/ml)之免疫微脂粒溶液或以l#g/ml 之二次抗體溶液（山羊抗人IgG Fc抗體，MPBiomedicals公 司製）調製爲 2000、200、20、2 ng/ml(最終濃度 1 000、100 、10、1 ng/ml)之hTRA-8溶液以一群3連各50# 1添加於 96穴微板（康寧公司製），將細胞懸浮液各播種50 // 1 (5xl03 cells)。於37°C、5%二氧化碳存在下將各板培養72 小時，測定各穴之ATP量。ATP量測定用蟲螢光素酶發光 試藥（CellTiter Glo，Promega公司製），依添附之規格書測定 。也即將由細胞溶解成分和發光基質成分而成之試液於板 之各穴各添加100 // 1、攪拌後，將上清於96穴白色微板（ 康寧公司製）各移100#丨，將各穴之發光以螢光計（分子裝 置公司製）測定。將添加DMEM培養基和細胞懸浮液之穴 作爲陰性對照穴，以只添加DMEM培養基之穴爲背景穴， 將各穴之細胞生存率依下式算出。 細胞生存率（％ )=(被驗穴之發光強度一背景穴之平均發光強 度）/(陰性對照穴之平均發光強度一背景穴之平均發光強度 )χ100 -163 - 200914064 其結果如第1圖。實施例1、2、3調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞 凋零誘導活性。實施例2或3製作之免疫微脂粒於1、10 、100、1000 ng/ml呈示20%以下細胞生存率。 【試驗例2】 測定實施例1 9、20、2 1調製之免疫微脂粒之對A375細胞 之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對人惡性黒色腫細胞株A3 7 5 細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8乃調 製爲抗體濃度2000 ' 200、20 ng/ml(最終濃度1000、100、 10ng/ml)、以一群2連施行貫驗。 其結果如第2圖。實施例19、2 0、21調製之免疫微脂粒 對A37 5細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細 胞凋零誘導活性。對A 3 7 5細胞雖比h T R A - 8呈示之細胞凋 零誘導活性爲弱，但可將hTRA- 8予以免疫微脂粒化來增 強細胞凋零誘導活性。實施例1 9、20、21製作之免疫微 脂粒於100 ng/ml呈示80%以下之細胞生存率’於1000 ng/ml呈示40%以下之細胞生存率。實施例19製作之免疫 微脂粒於1000 ng/ml呈不20 %以下之細胞生存率。 【試驗例3】 測定實施例8、1 0、1 2、1 4、1 6調製之免疫微脂粒對A375 細胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對人惡性黒色腫細胞株A375 細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8乃調 -164- 200914064 製爲抗體濃度2000、200、20 ng/ml(最終濃度1〇〇〇、1〇〇、 10 ng/ml)，以一群2連施行實驗。 其結果如第3圖。實施例8、10、12、14、16調製之免 疫微脂粒對A37 5細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性。對A3 7 5細胞雖比hTRA-8呈示 之細胞凋零誘導活性爲弱，但可將hTRA-8予以免疫微脂 粒化來增強細胞凋零誘導活性。實施例8、1 0 ' 1 2、14、 16製作之免疫微脂粒於1000 ng/ml呈示60%以下之細胞生 存率。實施例8、16製作之免疫微脂粒於1000 ng/ml呈示 4 0 %以下之細胞生存率。實施例8製作之免疫微脂粒於 1 000 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。 【試驗例4】 測定實施例7、9、1 1、1 3、1 5調製之免疫微脂粒對A205 8 細胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對人惡性黒色腫細胞株 A2058細胞之細胞凋零誘導活性。但免疫微脂粒及hTRA-8 乃調製爲抗體濃度2000、200、20 ng/ml(最終濃度1〇〇〇、 100、10 ng/ml)，以一群2連施行實驗。 其結果如第4圖。實施例7、9 ' 1 1、13、15調製之免疫 微脂粒對A2058細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性。對A205 8細胞雖比hTRA-8呈 示之細胞凋零誘導活性爲弱，但可將hTRA-8予以免疫微 脂粒化來增強細胞凋零誘導活性。實施例9、1 1、1 5製作 之免疫微脂粒於100 ng/ml呈示60%以下之細胞生存率。 -165 - 200914064 實施例1 1、15製作之免疫微脂粒於100 ng/ml呈示40%以 下之細胞生存率。實施例15製作之免疫微脂粒於100 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。實施例7、9、1 1、13 、15製作之免疫微脂粒於1 000 ng/ml呈示20%以下之細胞 生存率。 【試驗例5】 測定實施例26、27、28、29、30、31調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基用含有10%牛 胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製） 、免疫微脂粒及hHFE7A乃調製爲抗體濃度26、2.6、0.26 、0.026 nM(最終濃度 13、1_3、0.13、0.013 nM)。將 hHFE7A交聯之二次抗體（山羊抗人IgG Fc抗體）使用生技 源公司製者。 其結果如第5圖。實施例26、27、28、29、30、31調製 之免疫微脂粒對〗urkat細胞’呈示與以二次抗體交聯之 hHFE7A同等或更強之細胞凋零誘導活性。 【試驗例6】 測定實施例4、1 7、1 8調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞之 細胞凋零誘導活性 將〗urkat細胞依錐藍染色法計數後’以含有1 〇%牛胎血 清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製）調製 成2xl05 cells/ml。預先以RPMI培養基調製抗體濃度爲 -166 - 200914064 2000、200、20、2 ng/ml(最終濃度 1 000、100、10、1 ng/ml)之免疫微脂粒溶液或以1 // g/ml之二次抗體溶液（山 羊抗人IgG Fc抗體、MPBiomedicals公司製）調製爲2000、 200、20、2 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1 ng/ml)之 hTRA-8溶液以一群3連各50// 1添加於96穴微板（康寧公 司製），將細胞懸浮液各播種50// 1 (lxlO4 cells)。於37t 、5 %二氧化碳存在下將各板培養72小時，測定各穴細胞 之細胞內脫氫酵素之活性、算出生細胞數。細胞內脫氫酵 素活性之測定使用 WST-8試藥（生細胞數測定試藥 SF，nacalai tesque)，依添附之規格書施行測定。也即將 WST-8於各穴添加10//1，將WST-8由細胞內脫氫酵素還 原而生成之甲僭之量，將甲僭於450 nm之吸光度以吸光 光度計（分子裝置公司製）測定來定量。以添加RPMI1 640培 養基和細胞懸浮液之穴爲陰性對照穴，以只添加RPMI1 640 培養基之穴爲背景穴，將各穴之細胞生存率依如下式算出 〇 細胞生存率（％) =(被驗穴之吸光度一背景穴之平均吸光度 )/(陰性對照穴之平均吸光度一背景穴之平均吸光度）χ 1〇〇 其結果如第6圖。實施例4、17、18調製之免疫微脂粒 對〗urkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之 細胞凋零誘導活性。實施例4,1 7,1 8製作之免疫微脂粒於 10 ng/ml呈示 60%以下之細胞生存率，於100 ng/ml或 1000 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。 【試驗例7】 -167- 200914064 實施例22、23調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細胞凋 零誘導活性之測定 依試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基用含有1〇%牛 胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製） 、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、20 、2、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1000、1〇〇、10、1、0.1、 0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第7圖。實施例22、23調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞 凋零誘導活性。實施例22,23製作之免疫微脂粒於0.1 ng/ml呈示60%以下之細胞生存率，於1、10、100、1000 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。 【試驗例8】 測定實施例24調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細胞凋 零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度200、20、2、 0.2 ng/ml(最終濃度 100、1〇、1、0.1ng/ml)，以一群 3 連施 行實驗。 其結果如第8圖。實施例24調製之免疫微脂粒對；iurkat 細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTR A - 8更強之細胞凋零 -168 - 200914064 誘導活性。實施例24製作之免疫微脂粒於1 ng/ml呈示 60%以下之細胞生存率，於1〇 ng/ml或100 ng/ml呈示20% 以下之細胞生存率。 【試驗例9】 測定實施例25調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞之細胞凋 零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10%牛 胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製） 、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度200、20、2、 0.2 ng/ml(最終濃度 100、10 ' 1、0_1 ng/ml)，以一群 3 連 施行實驗。 其結果如第9圖。實施例25調製之免疫微脂粒對〗urkat 細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞凋零 誘導活性。實施例25製作之免疫微脂粒於0.1 ng/ml呈示 7 0%以下之細胞生存率，於1、10、1001^/1111呈示20%以下 之細胞生存率。 【試驗例1 0】 測定實施例5、6調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細胞 凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定對白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（In vitro gen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度200、20、2、 -169- 200914064 0.2 ng/ml(最終濃度 1〇〇、10、1、0.1 ng/ml)，以一群 3 連 施行實驗。 其結果如第10圖。實施例5、6調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞 凋零誘導活性。實施例5製作之免疫微脂粒於0.1 ng/ml 呈示70%以下之細胞生存率。實施例6製作之免疫微脂粒 於0.1 ng/ml呈示40%以下之細胞生存率。又實施例5、6 製作之免疫微脂粒於1、10、100 ng/ml呈示20 %以下之細 胞生存率。 【試驗例11】 測定實施例3、20調製之免疫微脂粒對關節風濕患者由來 滑膜細胞之細胞凋零誘導活性 將凍結關節風濕患者由來滑膜細胞（細胞應用公司）懸浮 於滑膜細胞增殖培養基（細胞應用公司製，以下稱培養基） ，以錐藍染色法計數後，以培養基調製成2xl04 cells/ml。 於 96穴微板（康寧公司製）將細胞懸浮液各播種50 # 1 (lxl03cells)。同時將以培養基稀釋抗體濃度爲 2000、200 、20、2 ng/ml之免疫微脂粒溶液及hTRA-8各50 μ 1於板 添加。於37°(：、5%二氧化碳存在下培養一晚後，測定八丁？ 量。ΑΤΡ量測定使用蟲螢光素酶發光試藥（Cell Titer Glo，Promega公司製），依添附之規格書測定。也即將由細 胞溶解成分和發光基質成分而成之試液於板之各穴各添加 100 // 1、攪拌後，將上清於96穴白色微板（康寧公司製）各 移100// 1，將各穴之發光以螢光計（分子裝置公司製）測定 -170- 200914064 °免疫微脂粒溶液代之以培養基添加之穴作爲陰性對照穴 ’以不播種細胞而只添加培養基之穴爲背景穴，將各穴之 細胞生存率依下式算出。 細胞生存率（％)=(被驗穴之發光強度一背景穴之平均發光強 度）/(陰性對照穴之平均發光強度一背景穴之平均發光強度 )χ100 其結果如第1 1圖。實施例3、20之免疫微脂粒對關節風 濕患者由來滑膜細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性。實施例3製作之免疫微脂粒於 1 0 00 ng/ml呈示50%以下之細胞生存率。 【試驗例1 2】 測定實施例5調製之免疫微脂粒於人大腸癌株COLO 205 移植裸小鼠之抗腫瘤活性 檢討實施例5調製之免疫微脂粒之活體內抗腫瘤活性。 將依檢疫確認未檢出小鼠病原微生物之人大腸癌株C0L0 205(購自 American Type Culture Collection)2xl06 cells 移植 裸小鼠BALB/cA 〗cl-nu(日本可麗兒公司）之腋窩部皮下。 將實施例5之免疫微脂粒於投與即前以生理食鹽水（大塚製 藥）稀釋爲抗體濃度1及〇.33mg/ml。對移植7日後之腫瘤 生著之C0L0 205載癌小鼠開始投與實施例5之免疫微脂 粒。具體而言，於第 7及9、1 1、14、16、18、21、23、 25日於載癌小鼠之尾靜脈內毎小鼠體重10g投與0.1ml之 微脂粒溶液。 將移植腫瘤之長徑及短徑用電子數位尺（CD-1 5C :三豊公 -171 - 200914064 司）毎週計測2 - 3回。以如下計算式求出腫瘤體積。 腫瘤體積（mm3)= l/2x短徑2(mm)x長徑（mm) 又算出各個體之腫瘤增殖速度（mm3/day)、用其値施行 Dunnett檢定來檢定統計學上顯著差異。又p値爲〇.〇5未 滿時’視爲群間有顯著差異。 試驗之結果如第1 2圖。實施例5之免疫微脂粒呈示用量 依存之抗腫瘤活性，l〇mg/kg之免疫微脂粒由統計學顯著 差異呈示抗腫瘤活性。 【試驗例1 3】 測定實施例32、33、34、35調製之免疫微脂粒對】urkat細 胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株〗urkat 細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0 %牛胎血 清（海克隆公司製）之RPMI培養基（InvUrogen公司製）、免 疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、20、2 、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、〇_1、0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第13圖。實施例32、33、34、35調製之免疫 微脂粒對Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性，於0.1 ng/ml呈示70%以下之細 胞生存率，於1、10、100、1000 ng/ml呈示30%以下之細 胞生存率。 【試驗例1 4】 測定實施例44、45 ' 46、47、48、49調製之免疫微脂粒對 -172- 200914064
Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（In vitro gen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、 20、2、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、0.1 、0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第14圖。實施例44、45、46、47、48、49調製 之免疫微脂粒對Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之 hTRA-8更強之細胞凋零誘導活性，於1 ng/ml呈示60%以 下之細胞生存率，於10、1〇〇、1000 ng/ml呈示20 %以下之 細胞生存率。 【試驗例1 5】 測定實施例50、51、52調製之免疫微脂粒對lurkat細胞 之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、 20、2、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1 〇〇〇、100、10 ' 1、0.1 、0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第15圖。實施例50、51、5 2調製之免疫微脂 粒對Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強 之細胞凋零誘導活性，於0.1 ng/ml呈示60%以下之細胞生 -173 - 200914064 存率，於1、10、100、1000 ng/ml呈示20%以下之細胞生 存率。 【試驗例1 6】 測定實施例 53、54、55、56、57調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、 20、2、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、0.1 、0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第16圖。實施例53、54、55、56、57調製之免 疫微脂粒對lurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8 更強之細胞凋零誘導活性’於Ing/ml呈示40%以下之細胞 生存率，於1〇、1〇〇、1000 ng/ml呈示5 %以下之細胞生存 率。 【試驗例1 7】 測定實施例5 8調製之免疫微脂粒對iurkat細胞之細胞凋 零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10% 牛胎血清（海克隆公司製）之培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒及hTRA-8乃調製爲抗體濃度2000、200、 20、2、0.2 ng/ml (最終濃度 1〇〇〇、1〇〇 ' 10、1、〇.1 ng/ml) -174- 200914064 ，以一群3連施行實驗。 其結果如第17圖。實施例5 8調製之免疫微脂粒對lurkat 細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞凋零 誘導活性，於lng/ml呈不30%以下之細胞生存率，於10 、100、1000 ng/ml呈不5%以下之細胞生存率。 【試驗例1 8】 測定實施例36、37調製之免疫微脂粒對Jurkat細胞之細 胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病 T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒乃調製爲抗體濃度2000、20、0.2 ng/mL(最 終濃度 1 000、10、0.1 ng/mL)、MAB631 於 1 M g/mL 之二次 抗體溶液（抗小鼠IgG Fc)調製爲2000、20、0.2 ng/mL(最終 濃度1000、10、0.1 ng/mL)，以一群2連施行實驗。 其結果如第1 8圖。實施例36、37調製之免疫微脂粒對 ' Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之MAB631更強之細 胞凋零誘導活性，於0.1 ng/ml呈示5 0 %以下之細胞生存率 ，於10 ng/ml或1000 ng/ml呈示5%以下之細胞生存率。 【試驗例1 9】 測定實施例38、39調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細 胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇% -175- 200914064 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )，抗體濃度於免疫微脂粒調製爲2000、20、0.2 ng/mL(最 終濃度 1000、10、〇_1 ng/mL)，MAB6311 於 l//g/mL 之二 次抗體溶液（抗小鼠IgG Fc)調製爲抗體濃度2000、20、0.2 ng/mL(最終濃度1 000、10、0. 1 ng/mL) ’以一群2連施行 實驗。 其結果如第19圖。實施例38、39調製之免疫微脂粒對 J u r k a t細胞，呈示比以二次抗體交聯之M A B 6 3 1 1更強之細 胞凋零誘導活性，於0. 1 ng/ml呈示40%以下之細胞生存率 ，於1〇112/1111或100〇1^/1111呈不5%以下之細胞生存率。 【試驗例20】 測定實施例59、60調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細 胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病 T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有10% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製 )、免疫微脂粒及rsTRAIL調製爲蛋白濃度2000、200、20 、2 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1 ng/ml) ’ 以一群 2 連施行實驗。 其結果如第20圖。實施例59、60調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，呈示比以rsTRAIL更強之細胞凋零誘導活性 ，於1 ng/ml呈示70%以下之細胞生存率’於1〇、1〇〇、 1000 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。 【試驗例2 1】 -176- 200914064 測定實施例6 1調製之免疫微脂粒對〗urkat細胞之細胞凋 零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0% 牛胎血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（In vitro gen公司製 )、免疫微脂粒及rsTRAIL乃調製爲蛋白濃度2000、200、 20、2 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1 ng/ml)，以一群 2 連施行實驗。 其結果如第21圖。實施例61調製之免疫微脂粒對JTurkat 細胞，呈示比以rsTRAIL更強之細胞凋零誘導活性，於1 0 、100、1000 ng/ml呈示20 %以下之細胞生存率。 【試驗例22】 測定實施例41、42、43、69調製之免疫微脂粒對〗urkat細 胞之細胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 0% 牛胎血清（海克隆公司製）之 RPMI培養基（Invitrogen公司 製），免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度2000、200、 20、2、0.2、0.02 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、0.1 、0.01 ng/ml)，以一群3連施行實驗。 其結果如第22圖。實施例41、42、43、69調製之免疫微 脂粒對Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更 強之細胞凋零誘導活性，於0 ·1 n 2 /m 1呈示8 0 %以下之細胞 生存率，於lng/ml呈示40%以下之細胞生存率，於1〇、 177 200914064 100、1 000 ng/ml呈示10%以下之細胞生存率。 【試驗例23】 測定實施例67、68調製之免疫微脂粒對】urkat細胞之細 胞凋零誘導活性 依試驗例1記載之方法測定白血病T淋巴腫細胞株 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。但培養基使用含有1 〇% 牛胎血清（海克隆公司製）之 RPMI培養基（Invitrogen公司 製）、免疫微脂粒及hTRA-8調製爲抗體濃度2000、200、 20' 2、0.2 ng/ml(最終濃度 1000、100、10、1、0.1 ng/ml) ，以一群3連施行實驗。 其結果如第23圖。實施例68調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞，呈示比以二次抗體交聯之hTRA-8更強之細胞 凋零誘導活性，於lng/ml呈示30%以下之細胞生存率，於 10、100、1 000 ng/ml呈示5%以下之細胞生存率。 【試驗例24】 測定實施例40調製之免疫微脂粒之WR 1 9L 1 2a細胞之細胞 凋零誘導活性 將WR19L12a細胞依錐藍染色法計數後，以含有10%牛胎 血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製）調 製爲lxlO5 cells/mL。預先以RPMI培養基調製爲10、1、 0.1、0.01 // g/mL(最終濃度 5、0.5、0.05、0.005 μ g/mL)之 免疫微脂粒溶液或以0.6/zg/mL之rProteinG (SIGMA公司 製）調製爲 10、1、〇_1、0.01//g/mL(最終濃度 5、0.5、0.05 、0.005 # g/mL)之DX2溶液於一群3連各添加50//L之96 -178- 200914064 穴微板（康寧公司製）’將細胞懸浮液各播種50 // L (5χ 1 〇3 cells)。於37°C、5%二氧化碳存在下將板培養72小時，各 穴之ATP量依試驗例1記載之方法測定。但以添加含有 PBS之RPMI培養基和細胞懸浮液之穴爲陰性對照穴，只 添加RPMI培養基之穴爲背景穴。 其結果如第24圖。實施例40調製之免疫微脂粒對 W R 1 9 L 1 2 a細胞呈示比D X 2更強之細胞凋零誘導活性，於 500、5 000 ng/ml呈示20%以下之細胞生存率。 【試驗例25】 測定實施例62、64、65、66調製之免疫微脂粒之亞歷山大 細胞之細胞凋零誘導活性 將亞歷山大細胞依錐藍染色法計數後，以含有10%牛胎 血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製）調 製爲2xl04 cells/mL。預先以RPMI培養基調製爲2000、 200、20、2 ng/mL(最終濃度 1000、1〇〇、1〇、1 ng/mL)之免 疫微脂粒溶液或以3.6 # g/mL之二次抗體溶液（山羊抗小鼠 IgG Fc、Jackson 公司製）調製爲 2000、200、20、2 ng/mL( 最終濃度1 000、100、10、1 ng/mL)之2E12溶液於一群3 連各添加5 0从L之96穴微板（康寧公司製），將細胞懸浮液 各播種50 /z L (lxlO3 cells)。於37°C、5%二氧化碳存在下 將板培養7 2小時，各穴之ATP量依試驗例1記載之方法 測定。 其結果如第25圖。實施例62、64、65、66調製之免疫 微脂粒對亞歷山大細胞，呈示比2E 1 2更強之細胞凋零誘 -179- 200914064 導活性，於 100 ng/ml呈示70%以下之細胞生存率，於 1000 ng/ml呈示50 %以下之細胞生存率。 【試驗例26】 實施例70、7 1、72調製之免疫微脂粒之亞歷山大細胞之 細胞凋零誘導活性之測定 將亞歷山大細胞依錐藍染色法計數後，以含有10%牛胎 血清（海克隆公司製）之RPMI培養基（Invitrogen公司製）調 製爲2xl04 cells/mL。將預先以RPMI培養基調製爲2000、 200、20、2 ng/mL(最終濃度 1〇〇〇、1〇〇、1〇、1 ng/mL)之免 疫微脂粒溶液、或以3.6 // g/mL之二次抗體溶液（山羊抗小 鼠IgG Fc、Jackson公司製）調製爲2000 ng/mL之2E12溶 液、及以1 // g/mL之二次抗體溶液（山羊抗人IgG Fc ' MPBiomedicals 公司製）調製爲 2000 ng/mL 之 hTRA-8 溶液 ，依22 : 7 8、56 : 44或80 : 20之比率混合，調製爲2000 、200、20、2ng/mL(最終濃度 1〇〇〇、1〇〇、1〇、1 ng/mL)之 2E12與hTRA-8之混合溶液於一群3連各添加50 // L之96 穴微板（康寧公司製），將細胞懸浮液各播種50 // L (lxl 03 cells)。於37°C、5%二氧化碳存在下將板培養24小時，各 穴之ATP量依試驗例1記載之方法測定。其結果如第26 圖。實施例7 0、7 1、7 2調製之免疫微脂粒對亞歷山大細 胞’比調整爲對應比率之抗體呈示更強之細胞凋零誘導活 1生’於10 ng/ml呈不60 %以下’於1〇〇、1〇〇〇 ng/ml呈示 10%以下之細胞生存率。 【試驗例27】 -180- 200914064 由試驗例1至26 ’計算依免疫微脂粒及對照抗體使細胞 生存率降低爲50%之濃度。結果如表3(只記載可求出對照 抗體之5 0 %細胞生存率之試驗例1、6至1 0、1 2至2 2、2 5) 。表中之EC5〇乃示呈示50 %細胞生存率之濃度，更將對照 抗體之50%細胞生存濃度除以各免疫微脂粒之50%細胞生 存濃度之價以EC5。Ab/IL記載。殆全免疫微脂粒中，該免 疫微脂粒呈示之50%細胞生存濃度，比對照抗體之5〇%細 胞生存濃度降低爲1 /1 〇以下。即使由免疫微脂粒之細胞凋 零誘導活性低之試驗例19等場合，也降低爲1/2_5以下。 試驗例7、9、12至15、17、21中，降低爲1 /1 〇〇以下。 【表3】 -181 - 200914064 表3專利實施例化合物ECsn 實驗例No. 實施例化合物編號 EC5〇 (ng/mL) EC5〇 Ab/IL 交聯抗體 EC5〇 (ng/mL) 3 0.57 30.9 1 2 0.93 18.9 17.6 1 9.2 1.9 4 8.61 31.4 6 17 6.33 42.7 270.4 18 10.7 25.3 7 22 0.075 228.0 17.1 23 0.1 171.0 8 24 1.32 55.8 73.7 9 25 0.168 186.9 31.4 1 π 5 0.189 77.2 14.6 6 0.079 184.8 32 0.048 614.6 12 33 0.158 186.7 29.5 34 0.0514 573.9 35 0.274 107.7 44 0.0627 575.8 45 0.211 171.1 13 46 0.477 75.7 36.1 47 0.0276 1308 48 0.158 228.5 49 1.02 35.4 50 0.128 230.5 14 51 0.0757 389.7 29.5 52 0.125 236.0 53 0.235 153.7 54 0.13 277.8 15 55 0.332 108.8 36.12 56 0.489 73.9 57 0.127 284.4 16 58 0.343 99.7 34.19 17 36 0.069 193.6 13 36 37 0.089 150.1 38 0.075 31.9 O QQ 〇 39 0.083 28.8 59 1.9 2.8 C； OA 60 1.24 4.2 20 61 4.24 3.7 15.5 41 0.057 378.8 21 42 0.144 149.9 21 59 43 0.094 229.7 69 0.371 58.2 22 67 7.04 2.7 1 Q 7 68 0.233 80.3 70 1.69 21.5 36.3 25 71 2.93 26.6 77.8 72 10.7 8.2 87.4 -182- 200914064 【產業上之利用可能性】 本發明提供由於其中含有與參與細胞凋零誘導之 面受體專一地結合之抗體之免疫微脂粒之癌治療用 成物、自體免疫疾病或炎症性疾病治療用醫藥組成: 【圖式簡單說明】 【第1圖】第1圖乃示實施例1、2、3調製之免疫 對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附點 實施例1、附點線•爲實施例2、附實線〇爲實施供 示所得微脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之 之活性。 【第2圖】第2圖乃示實施例19、20、21調製之免 粒之A 3 7 5細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 乃示實施例1 9、附點線◦乃示實施例20、附點線 實施例2 1、各示所得微脂粒之活性、附實線♦乃示 聯之hTRA-8之活性。 【第3圖】第3圖乃示實施例8、10、12、14、16 ' 免疫微脂粒之A37 5細胞之細胞凋零誘導活性之圖 附實線△乃示實施例8、附點線▲乃示實施例1 〇、 〇乃示實施例1 2、附點線•乃示實施例1 4、附點 示實施例1 6、各示所得微脂粒之活性、附實線參乃 交聯之hTRA-8之活性。 【第4圖】第4圖乃示實施例7、9、1 1、13、15調 疫微脂粒之A205 8細胞之細胞凋零誘導活性之圖。 實線△乃示實施例7、附點線▲乃示實施例9、附 細胞表 醫藥組 勿。 微脂粒 線〇爲 丨3、各 hTRA-8 疫微脂 實線〇 •乃示 二次交 調製之 。圖中 附實線 線〇乃 示二次 製之免 圖中附 實線〇 -183 - 200914064 乃示實施例1 1、附點線•乃示實施例1 3、附點線〇乃示 實施例1 5、各示所得微脂粒之活性、附實線•乃示二次交 聯之hTRA-8之活性。 【第5圖】第5圖乃示實施例26、27、28、29、30、31調 製之免疫微脂粒對lurkat細胞之細胞凋零誘導活性。圖中 附點線△乃示實施例26、附實線△乃示實施例27、附實 線▲乃示實施例28、附點線〇乃示實施例29、附實線〇 乃示實施例30、附點線•乃示實施例3 1、各示所得微脂 粒之活性、附實線參乃示二次交聯之hHFE7A之活性。 【第6圖】第6圖乃示實施例4、17、18調製之免疫微脂 粒對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附實線〇 乃示實施例4、附點線參乃示實施例1 7、附點線〇乃示實 施例1 8、各示所得微脂粒之活性、附實線·乃示二次交聯 之hTRA-8之活性。 【第7圖】第7圖乃示實施例22、23調製之免疫微脂粒 對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附實線◦乃 示實施例22、附點線•乃示實施例23、各示所得微脂粒 之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA-8之活性。 【第8圖】第8圖乃示實施例24調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附實線〇乃示 實施例24中所得微脂粒之活性、附實線#乃示二次交聯 之hTRA-8之活性。 【第9圖】第9圖乃示實施例25調製之免疫微脂粒對 J u r k a t細胞之細胞调零誘導活性之圖。圖中附實線〇乃示 -184- 200914064 實施例25中所得微脂粒之活性、附實線參乃示二次交聯 之hTRA-8之活性。 【第10圖】第10圖乃示實施例5、6調製之免疫微脂粒 對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附實線〇乃 示實施例5、附點線參乃示實施例6、各示所得微脂粒之 活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA-8之活性。 【第1 1圖】第1 1圖乃示實施例3、20調製之免疫微脂粒 之關節風濕患者由來滑膜細胞之細胞凋零誘導活性之圖。 圖中附實線◦乃示實施例3、附點線鲁乃示實施例20、各 示所得微脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA-8 之活性。 【第12圖】第12圖乃示實施例5調製之免疫微脂粒之人 大腸癌株COLO 205移植裸小鼠中抗腫瘤活性之圖。圖中 無符號之實線乃示無投與抗體時之腫瘤體積、附實線〇爲 將3.3mg/kg、附實線△乃示將l〇mg/kg之抗體投與時之腫 瘤體積。 【第13圖】第13圖乃不實施例32、33、34、35調製之免 疫微脂粒對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中附 實線〇乃示實施例3 2、附點線〇乃示實施例3 3、附點線 •乃示實施例34 '附實線▲乃示實施例3 5、各示所得微 脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA- 8之活性。 【第14圖】第14圖乃示實施例44、45、46、47、48、49 調製之免疫微脂粒對Iurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖 。圖中附實線◦乃示實施例44 '附點線◦乃示實施例45 -185- 200914064 、附實線乃示實施例46、附實線□乃示實施例47、附 實線▲乃示實施例48、附點線•乃示實施例49、各示所 得微脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA-8之活 性。 【第15圖】第15圖乃示實施例50、51、52調製之免疫微 脂粒對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實 線〇乃示實施例5 0、附點線〇乃示實施例5 1、附點線· 乃示實施例52、各示所得微脂粒之活性、附實線·乃示二 次交聯之hTRA-8之活性。 【第16圖】第16圖乃示實施例53、54、55、56、57調製 之免疫微脂粒對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性。圖中之 附點線〇乃示實施例53、附實線乃示實施例54、附實 線〇乃示實施例5 5、附點線參乃示實施例5 6、附實線△ 乃示實施例57、各示所得微脂粒之活性 '附實線·乃示二 次交聯之hHFE7A之活性。 【第17圖】第17圖乃示實施例5 8調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇乃 示實施例5 8中所得微脂粒之活性、附實線參乃示二次交 聯之hTRA-8之活性。 【第18圖】第18圖乃示實施例36、37調製之免疫微脂粒 對]urkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇 乃示實施例36、附點線#乃示實施例37、各示所得微脂 粒之活性、附實線•乃示二次交聯之M A B 6 3 1之活性。 【第19圖】第19圖乃示實施例38、39調製之免疫微脂粒 -186- 200914064 對]urkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇 乃示實施例38、附點線•乃示實施例39 '各示所得微脂 粒之活性、附實線•乃示二次交聯之MAB63 1 1之活性。 【第20圖】第20圖乃示實施例59、60調製之免疫微脂粒 對Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇 乃示實施例59、附點線•乃示實施例60、各示所得微脂 粒之活性、附實線•乃示二次交聯之rsTRAIL(p)之活性。 【第21圖】第21圖乃示實施例61調製之免疫微脂粒對 Jurkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇乃 示實施例6 1中所得微脂粒之活性、附實線♦乃示二次交 聯之rsTRAIL(B)之活性。 【第22圖】第22圖乃示實施例41、42、43、69調製之免 疫微脂粒對〗urkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之 附實線〇乃示實施例4 1、附點線〇乃示實施例42、附點 線參乃示實施例43、附實線乃示實施例69、各示所得 微脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA-8之活性 〇 【第23圖】第23圖乃示實施例67、68調製之免疫微脂粒 對〗urkat細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附點線參 乃示實施例67、附實線◦乃示實施例68、各示所得微脂 粒之活性、附實線•乃示二次交聯之hTRA- 8之活性。 【第24圖】第24圖乃示實施例40調製之免疫微脂粒之 W 1 9L 1 2a細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖中之附實線〇 乃示實施例40中所得微脂粒之活性、附實線•乃示二次 -187- 200914064 交聯之DX2之活性。 【第25圖】第25圖乃示實施例62、64、65、66調 疫微脂粒之亞歷山大細胞之細胞凋零誘導活性之圖 之附點線Ο乃不實施例6 2、附點線#乃不實施例 實線〇乃示實施例65、附點線乃示實施例66、 得微脂粒之活性、附實線•乃示二次交聯之2E 1 2 〇 【第26圖】第26圖乃示實施例70' 71、72調製之 脂粒之亞歷山大細胞之細胞凋零誘導活性之圖。圖 實線•乃示實施例70、附點線♦乃示實施例7 1、 乃示實施例7 2、各示所得微脂粒之活性、附實線 以22 : 7 8之比率混合之2E12及hTRA-8、附點線◊ 5 6 : 44之比率混合之2E12及hTRA-8之活性、附實 示以80 : 20之比率混合之2E12及hTRA-8之活性。 【序列表項目】 序列編號1-人工序列之說明：人化之TRA-8之重 、 酸序列 序列編號2-人工序列之說明：人化之TRA-8之輊 酸序列 序列編號3-人工序列之說明：人化之HFE7A之遲 酸序列 序列編號4-人工序列之說明：人化之HFE7A之_ 酸序列 製之免 。圖中 64、附 各示所 之活性 免疫微 中之附 附實線 〇乃示 乃示以 線□乃 鏈胺基 鏈胺基 鏈胺基 鏈胺基 -188 - 200914064 【序列表】 <110〉第一三共股份有限公司 <120〉對表現含死亡功能域受體之細胞誘導細胞凋零之免疫微脂粒 <130> FP0830 <160> 4 <170〉專利第3 _4版 <210> 1 <21D 449 <212> PRT <213>人工 <220〉 <223〉人化TRA-8之重鏈胺基酸序列 <220〉 <223〉發明人：森田浩司；丹羽貴子；市川公久 <223>發明人：好田宏子 <220〉 <400〉 1
Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Giy Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Aia Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr t le Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 200914064
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Giu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lie Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin G!y 100 105 110
Thr Leu Val Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Me Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240
Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 -2- 200914064
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Giu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430
Aia Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
Lys 200914064 <210> 2 <211> 213 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人化TRA-8之輕鏈胺基酸序列 <400> 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 6!u Ala Lys 130 135 140 200914064
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gty Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211〉 470 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人化HFE7A之重鏈胺基酸序列 <400〉 3
Met Gly Trp Ser Cys Me lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Met Gly Giu lie Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 200914064
Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr: Gys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 115 120 125
Val Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Aia Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 6iy 145 150 155 160
Gly Thr Aia Aia Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175
Val Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr 180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lvs Arg Val Glu Pro 225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Giu 245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 200914064
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Vai Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 295 300
Vaf Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 31S 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350
Ala Pro Me Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Me 385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Val Met His Giu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460 200914064
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213>人工 <220〉 <223〉人化HFE7A之輕鏈胺基酸序列 <400> 4
Giu Thr Asp Thr lie Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Va! Pro Gly 15 10 15
Ser Thr Gly Glu ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 20 25 30
Ser Pro Giy Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val 35 40 45
Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 50 55 60
Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly 65 70 75 80 lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95
Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Giu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 100 105 110
Gin Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 200914064 i le Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140
Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175
Leu Gin Ser 6iy Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys 180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 -9-

Claims (1)

  1. 200914064 十、申請專利範圍： 1 · 一種免疫微脂粒，其與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體 專一地結合而含有如下（a)及（b): (a) 與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 體、該抗體之機能性片段、或含有該抗體之重鏈及輕鏈之 相補性決定部位而與該細胞表面受體專一地結合之多肽； (b) 雨親媒性小胞形成脂質。 2. 如申請專利範圍第1項之免疫微脂粒，其係對表現參與細 胞凋零誘導之細胞表面受體之細胞呈示細胞凋零誘導活性 〇 3. 如申請專利範圍第1或2項之免疫微脂粒，其係對表現參 與細胞凋零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該細胞表面 受體專一地結合之抗體之全長分子由二次抗體或蛋白質G 、A等抗體結合蛋白質來交聯時呈示與於活體外呈示細胞 凋零誘導活性同等、或於活體外呈示更強細胞凋零誘導活 性。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之免疫微脂粒，其係 對表現參與細胞凋零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該 細胞表面受體專一地結合之抗體之全長分子由二次抗體或 蛋白質G、A等抗體結合蛋白質來交聯時，與於活體外呈 示之50%細胞生存濃度比較，呈示1/2_5以下之50%細胞 生存濃度。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之免疫微脂粒，其係 對表現參與細胞凋零誘導之細胞表面受體之細胞，若於該 200914064 細胞表面受體專了地結合之抗體之全長分子由二次抗體或 蛋白質G、A等抗體結合蛋白質來交聯時，與於活體外呈 示之50%細胞生存濃度比較，呈示1/10以下之50%細胞生 存濃度。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之免疫微脂粒，其係 含有與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 體，而該抗體爲抗體之全長分子。 7. 如申請專利範圍第6項之免疫微脂粒，其係含有抗體之全 長分子對總脂質莫耳數爲0.000014莫耳％至0.23莫耳％之 抗體密度。 8 .如申請專利範圍第7項之免疫微脂粒，其係含有抗體之全 長分子對總脂質莫耳數爲0.002莫耳％至0.14莫耳％之抗 體密度。 9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之免疫微脂粒，其中 與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗體之 機能性片段爲F(ab’ ）2。 10. 如申請專利範圍第9項之免疫微脂粒，其中含有 F(ab’ ）2對總脂質莫耳數爲0.0000 1 4莫耳％至0.23莫耳％ 之抗體密。 1 1 ·如申請專利範圍第10項之免疫微脂粒，其中含有 F(ab )2對總脂質莫耳數爲〇·〇〇6莫耳％至0.Π莫耳％之 抗體密度。 1 2.如申請專利範圍第1至5項中任一項之免疫微脂粒，其 中與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 -2- 200914064 體之機能性片段爲Fab’ 。 π·如申請專利範圍第12項之免疫微脂粒，其中含有Fab， 對總脂質莫耳數爲0.000014莫耳％至0.94莫耳％之抗體密 度。 14. 如申請專利範圍第13項之免疫微脂粒，其中含有Fab， 對總脂質莫耳數爲0.005莫耳％至0.56莫耳％之抗體密度 〇 15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫微脂粒，其 中與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 體爲嵌合體抗體。 1 6.如申請專利範圍第1至1 4項中任一項之免疫微脂粒，其 中與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 體爲人化抗體。 Π ·如申請專利範圍第1至14項中任一項之免疫微脂粒，其 中與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之抗 體爲人抗體。 1 8.如申請專利範圍第1至5項中任一項之免疫微脂粒，其 中與參與細胞凋零誘導之細胞表面受體專一地結合之多 肽爲單鏈可變部位抗體。 19. 如申請專利範圍第18項之免疫微脂粒，其中含有單鏈可 變部位抗體對總脂質莫耳數爲0.0000 1 4莫耳％至1.8莫耳 %之抗體密度。 20. 如申請專利範圍第19項之免疫微脂粒，其中含有單鏈可 變部位抗體對總脂質莫耳數爲0.005莫耳％至0.56莫耳％ 200914064 之抗體密度。 21. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之免疫微脂粒，其 中參與細胞凋零誘導之細胞表面受體爲含有死亡功能域 之受體。 22. 如申請專利範圍第21項之免疫微脂粒，其中含有死亡功 能域之受體爲由Fas、DR4、DR5及TNF受體而成之群選 擇。 23. 如申請專利範圍第22項之免疫微脂粒’其中含有死亡功 能域之受體爲DR5。 24. 如申請專利範圍第22項之免疫微脂粒’其中含有死亡功 能域之受體爲DR4。 25. 如申請專利範圍第22項之免疫微脂粒’其中含有死亡功 能域之受體爲Fas。 2 6.如申請專利範圍第23項之免疫微脂粒，其中抗體分子或 該抗體之機能性片段爲含有由序列表記載之序列編號1 之胺基酸序列之1 ~ 1 1 8號胺基酸殘基而成重鏈可變領域 序列及序列表記載之序列編號2之胺基酸序列1 ~ 1 〇7號 之胺基酸殘基而成之輕鏈可變領域序列。 27. 如申請專利範圍第24項之免疫微脂粒，其中抗體分子或 該抗體之機能性片段爲含有由融合瘤2E!2產生之抗體、 與該抗體同一抗原決定部位結合之抗體或由該抗體之人 化抗體選擇之抗體之重鏈及輕鏈可變領域。 28. 如申請專利範圍第25項之免疫微脂粒’其中抗體分子或 該抗體之機能性片段爲含有由序列表記載之序列編號3 -4- 200914064 之胺基酸序列之號之·胺基酸殘基而成重鏈可變領 域序列及序列表記載之序列'褊號4之胺基酸序列1〜1 3 1 號之胺基酸殘基而成輕鏈可變領域序列。 29.—種免疫微脂粒’其與參與細胞凋零誘導之細胞表面受 體專一地結合而含有如下U)及（b): (a) 與該細胞表面受體專一地結合’且具有仲介該受體 而於細胞誘導細胞凋零之活性之內因性配體或該內在性 配體之機能性片段； (b) 兩親媒性小胞形成脂質。 3 0.如申請專利範圍第29項之免疫微脂粒，其係對表現該細 胞表面受體之細胞，呈示比該內因性配體更強之細胞凋 零誘導活性。 3 1.如申請專利範圍2 9或3 0項之免疫微脂粒，其中細胞表 面受體爲含有死亡功能域之受體。 32.如申請專利範圍第3 1項之免疫微脂粒，其中含有死亡功 能域之受體爲由Fas、DR4、DR5及TNF受體而成之群選 擇。 3 3 .如申請專利範圍第32項之免疫微脂粒，其中對含有死亡 功能域之受體之內在性配體爲TRAIL或Fas配體。 34. 如申請專利範圍第1至33項中任一項之免疫微脂粒，其 中構成免疫微脂粒之脂質含有固醇類、磷脂質。 35. 如申請專利範圍第34項之免疫微脂粒，其中構成免疫微 脂粒之脂質之一之固醇類爲膽固醇。 3 6.如申請專利範圍第35項之免疫微脂粒，其中構成免疫微 200914064 脂粒之脂質之一之膽固醇以對總脂質莫耳數爲20莫耳％ 至5 0莫耳％之比例含有。 37.如申請專利範圍第34至36項中任一項之免疫微脂粒， 其中構成免疫微脂粒之脂質之一之磷脂質爲磷脂醯膽鹼 〇 3 8 _如申請專利範圍第37項之免疫微脂粒，其中構成免疫微 脂粒之脂質之磷脂醯膽鹼中之醯基爲碳數14至22。 3 9 .如申請專利範圍第3 8項之免疫微脂粒，其中構成免疫微 脂粒之脂質之磷脂醯膽鹼中之醯基爲碳數14至18。 40.如申請專利範圍第34至39項中任一項之免疫微脂粒， 其中構成免疫微脂粒之脂質更含有親水性聚合物或該親 水性聚合物之脂質衍生物。 4 1 ·如申請專利範圍第40項之免疫微脂粒，其中親水性聚合 物之脂質衍生物中親水性聚合物之平均分子量爲5 0 0至 20000 ° 42.如申請專利範圍第41項之免疫微脂粒，其中親水性聚合 物之脂質衍生物中親水性聚合物之平均分子量爲2000至 5000 ° 43 .如申請專利範圍第40至42項中任一項之免疫微脂粒， 其中親水性聚合物之脂質衍生物以對總脂質莫耳數爲0.1 莫耳％至10莫耳％之比例含有。 4 4 .如申請專利範圍第4 3項之免疫微脂粒，其中親水性聚合 物之脂質衍生物以對總脂質莫耳數爲1莫耳％至6莫耳％ 之比例含有。 200914064 45. 如申請專利範圍第40至44項中任一項之免疫微脂粒， 其中構成免疫微脂粒之脂質之一之親水性聚合物之脂質 衍生物爲聚乙二醇修飾脂質。 46. 如申請專利範圍第34至44項中任一項之免疫微脂粒， 其中使用末端具有馬來醯亞胺基之脂質或親水性聚合物 ，使微脂粒和抗體仲介硫醚結合來結合。 47. 如申請專利範圍第1至46項中任一項之免疫微脂粒，其 中免疫微脂粒之平均粒徑爲30- 1 000nm。 48. 如申請專利範圍第47項之免疫微脂粒，其中免疫微脂粒 之平均粒徑爲30-200nm。 4 9.如申請專利範圍第1至48項中任一項之免疫微脂粒，其 微脂粒中封入具有抗腫瘤活性之藥劑。 50.如申請專利範圍第1至48項中任一項之免疫微脂粒，其 微脂粒中封入具有自體免疫疾病或炎症性疾病之治療作 用之藥劑。 5 1.—種醫藥組成物、含有如申請專利範圍第1至50項中任 一項之免疫微脂粒爲有效成分。 52. —種抗腫瘤劑、含有如申請專利範圍第1至49項中任一 項之免疫微脂粒爲有效成分。 53. —種自體免疫性疾病或炎症性疾病之治療劑、含有如申 請專利範圍第1至48項或第50項之免疫微脂粒爲有效 成分。
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2177230A4 (en) * 2007-08-09 2011-04-27 Daiichi Sankyo Co Ltd IMMUNOLIPOSOM AS INDUCTOR OF APOPTOSIS INTO DEATH DOMAIN-CONTAINING RECEPTOR EXPRESSING CELL
US8993715B2 (en) * 2009-07-06 2015-03-31 Canon Kabushiki Kaisha Labeled protein and method for obtaining the same
CA2775350A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
US9238796B2 (en) 2010-06-04 2016-01-19 Toagosei Co. Ltd. Cell growth-promoting peptide and use thereof
WO2012093732A1 (ja) * 2011-01-07 2012-07-12 セイコーエプソン株式会社 アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対する抗体
US8747891B2 (en) * 2011-05-10 2014-06-10 The Penn State Research Foundation Ceramide anionic liposome compositions
AU2012254842A1 (en) 2011-05-12 2013-05-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Liposomes comprising polymer-conjugated lipids and related uses
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
WO2013155487A1 (en) 2012-04-12 2013-10-17 Yale University Vehicles for controlled delivery of different pharmaceutical agents
US9370182B2 (en) 2012-05-28 2016-06-21 Toagosei Co., Ltd. Antimicrobial peptide and use thereof
WO2014050779A1 (ja) * 2012-09-25 2014-04-03 第一三共株式会社 Ｇｓｋ３阻害剤と抗ｄｒ５抗体の組み合わせ
WO2014061749A1 (ja) 2012-10-18 2014-04-24 東亞合成株式会社 ２型ｔｎｆ受容体の発現を抑制する合成ペプチド及びその利用
TWI585101B (zh) * 2012-11-16 2017-06-01 財團法人農業科技研究院 製備抗體Ｆ（ａｂ’）２片段之方法
CN105848649B (zh) 2013-11-01 2019-08-02 耶鲁大学 用于免疫疗法的模块化粒子
US11299528B2 (en) 2014-03-11 2022-04-12 D&D Pharmatech Inc. Long acting TRAIL receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
US20170071967A1 (en) * 2014-03-12 2017-03-16 Glaxosmithkline Biologicals, Sa Immunogenic liposomal formulation
AU2015242657B2 (en) * 2014-03-31 2020-05-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin Fc fragment linkage
EP3302436A4 (en) * 2015-05-26 2019-01-02 The General Hospital Corporation Liposomal nanoconstructs and methods of making and using the same
EA038551B1 (ru) 2015-12-17 2021-09-14 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Способ лечения или профилактики системного склероза
WO2017177148A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating pancreatitis and pain with death receptor agonists
CN110612119A (zh) 2017-02-07 2019-12-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂
EP3589295A4 (en) 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
WO2018170398A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Children's Medical Center Corporation Engineered liposomes as cancer-targeted therapeutics
WO2019032585A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 The Regents Of The University Of Michigan STRUCTURES IMITATING APOPTOSIS
CN107753434B (zh) * 2017-12-06 2019-11-05 西南交通大学 一种包载亲疏水性不同药物的载药脂质体及其制备方法与应用
AU2019209428A1 (en) 2018-01-22 2020-07-30 Endocyte, Inc. Methods of use for CAR T cells
BR112020015884A2 (pt) * 2018-02-06 2020-12-08 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Receptores de antígeno quimérico (cars) específicos de fluoresceína exibindo a função de célula t ótima contra os tumores marcados por fl-ple
US20200392239A1 (en) * 2018-02-26 2020-12-17 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-dr5 binding molecule in combination with a chemotherapeutic agent for treating cancer
KR20210141554A (ko) * 2019-03-21 2021-11-23 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 세포외 소포 접합체 및 이의 용도
IT202000004846A1 (it) * 2020-03-06 2021-09-06 Univ Degli Studi G Dannunzio Chieti Pescara Pro-drug innovativo micellare su backbone polimerico del Killer TNF-apoptosis induced ligand.
IT202000013042A1 (it) * 2020-06-01 2021-12-01 Univ Degli Studi G Dannunzio Chieti Pescara Sistema liposomiale con killer tnf-apoptosis induced ligand (killertrail), pro-apoptotico-direzionante.
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity
US20230302154A1 (en) * 2020-08-19 2023-09-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nanodrugs for targeted drug delivery and use thereof
WO2022136939A1 (en) * 2020-12-21 2022-06-30 Samarth Zarad A method for preparation of a drug encapsulated liposome in an organic solvent emulsion
CN114150007B (zh) * 2021-12-14 2023-07-21 扬州大学 一种适用于家兔乳腺特异性表达去氨普酶的编码基因及其应用
WO2023204290A1 (ja) * 2022-04-21 2023-10-26 愛知県 多重特異性ナノ粒子
CN115181720B (zh) * 2022-07-27 2023-06-30 天津鸿宇泰生物科技有限公司 一种无血清培养基及其应用、一种cho细胞表达重组抗体的构建方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
JPH09110722A (ja) * 1995-10-20 1997-04-28 Toray Ind Inc 抗腫瘍活性物質の腫瘍細胞内導入用イムノリポソーム及びその調製法
US6210707B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US6972323B1 (en) * 1997-04-01 2005-12-06 Sankyo Company, Limited Anti-Fas antibodies
AU3703100A (en) * 1999-02-22 2000-09-14 Georgetown University Antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic gene delivery
DE10003653A1 (de) * 2000-01-28 2001-08-09 Thorsten Petrich Vektorkonstrukte zur gentherapeutisch vermittelten Radioiodtherapie entdifferenzierter und medullärer Schilddrüsen-Karzinome sowie nicht-thyreoidaler Tumore und ihrer Metastasen
TWI318983B (en) * 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
ES2357225T3 (es) * 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
EP1537858A1 (en) * 2003-12-04 2005-06-08 Vectron Therapeutics AG Drug delivery vehicles and uses thereof
JPWO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
NZ553174A (en) * 2004-09-08 2010-03-26 Genentech Inc Methods of using death receptor ligands Apo2L/Trail and CD20 antibodies
US8029783B2 (en) * 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
MX2007013200A (es) * 2005-04-22 2008-03-24 Johnson & Johnson Composicion de inmunoliposoma para el direccionamiento hacia un receptor de la celula her2.
EP1937814A4 (en) * 2005-09-01 2010-05-05 Ca Nat Research Council ANTIAPOPTOTIC PROTEIN ANTIBODY
EP2177230A4 (en) * 2007-08-09 2011-04-27 Daiichi Sankyo Co Ltd IMMUNOLIPOSOM AS INDUCTOR OF APOPTOSIS INTO DEATH DOMAIN-CONTAINING RECEPTOR EXPRESSING CELL

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