JP4371814B2 - 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドレセプターに対して選択的な抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本願は、米国仮出願番号60/346,402(2001年11月1日出願)の利益を主張し、そして現在係属中である、PCT/US01/14151(2001年5月出願)に対する優先権を主張する。PCT/US01/14151は、米国仮出願番号60/201,344(2000年5月2日出願)の利益を主張する。本願が利益を主張する出願は、本明細書中で、それらの全体にわたって参考として援用する。
本発明は、1つの型の腫瘍壊死因子(本明細書中で以後「TNF」と呼ばれる)関連アポトーシス誘導リガンド(本明細書中で以後「TRAIL」と呼ばれる)レセプターに特異的に結合することが可能な抗体、より詳細には、1つの型のレセプターを発現する細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体ならびにそれに基づく治療法に関する。
TRAILは、TNFファミリータンパク質のメンバーであり、それはまた、TNF−αおよびFasリガンドも含む(1)。これらのタンパク質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。現在まで、TRAILに対する5つのレセプターが同定されており、それらのうちの2つである、DR4(TRAIL−R1)およびDR5(TRAIL−R2)(2〜7)は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能である。一方、他の3つ、DcR1(TRAIL−R3)、DcR2(TRAIL−R4)およびオステオプレテゲリン(OPG)は、アポトーシスシグナルを伝達しない(8〜12)。TRAILに対する5つすべてのレセプターは、それらの細胞外リガンド結合ドメイン内に有意な相同性を共有する。FasおよびTNFレセプターI(本明細書中で以後「TNFRI」と呼ばれる)と同様に、DR4およびDR5の両方の細胞内部分は、死ドメインを含み、そしてFas関連死ドメインタンパク質(本明細書中で以後「FADD」と呼ばれる)およびカスパーゼ8を含む経路を通ってアポトーシスシグナルを伝達する(6、7)。アポトーシスシグナルの伝達に加えて、DR4およびDR5レセプターはまた、NFκbの関与する経路を活性化し得る(6、7)。
1つの実施形態において、本発明は、TRAILレセプターDR5を認識する抗体およびインビボまたはインビトロでDR5を発現する細胞にアポトーシスを誘導する抗体に関する。さらに、DR5だけでなく、DR4、DcR1またはDcR2を認識する抗体が、開示される。ハイブリドーマによって生成されるDR5に対するモノクローナル抗体は、具体的に詳述される。
細胞除去の失敗は、アポトーシス誘導システムの欠陥に起因し、それは例証的にリガンド、レセプター、または細胞内調節分子およびエフェクター分子の発現または機能を含む欠陥に関連する。本発明は、不十分なアポトーシス誘導システムを正す方法に加えて、所与の欠陥的なアポトーシス誘導システムに備わる特定の欠陥を解明する方法を提供する。
a)抗原として用いる生体高分子の精製;
b)最初に抗原の注射を使用して動物を免疫し、動物から血を抜き、脾臓を取り出す時点を決定するため、抗体力価をアッセイした後の抗体生成細胞の調製;
c)ミエローマ細胞の調製;
d)抗体生成細胞およびミエローマ細胞を融合する工程;
e)望ましい抗体を生成するハイブリドーマを選択する工程;
f)単一細胞クローンを調製する工程(クローニング);
g)必要に応じて、ハイブリドーマ細胞を培養するか、またはモノクローナル抗体の大規模調製のため、ハイブリドーマ細胞を移植した動物を育てる工程;ならびに
h)このようにして調製したモノクローナル抗体の生物学的活性および特異性を試験するか、あるいはマーカー因子特性をのアッセイする工程。
((a)抗原の調製)
抗原として有効な組換えタンパク質(本明細書以下に「組換えヒトDR5」または「組換えヒトDR4」として言及される)は、ADENO−Quest kit(Quantum BiotechmologiesInc.,Canada)を使用し、QBI−293A細胞をヒトDR5またはヒトDR4の細胞外ドメインおよびヒトIgG1抗体(本明細書以下に「IgG」として言及される)のFc領域、(PTA−1428を参照のこと)を含む融合タンパク質の発現ベクターpAdDR5−IgGでトランスフェクトして、このタンパク質を発現させ、そして発現産物を収集し、部分的に精製することによって、得られる。プラスミドpAdDR5−IgGは、ヒトDR5またはヒトDR4およびヒトIgG融合タンパク質をコードするDNAを、動物細胞の発現ベクターであるpAdCMV5に挿入することで構築される。他の材料、例えばDR5またはDR4をコードするDNA、ベクターおよび宿主は、本明細書中で有効である。
((b)抗体生成細胞の調製)
マウスを、以下の工程において生成された免疫原で免疫する;
(a)アジュバント(例えば、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン)と混合する。他の適した実験動物としては、例示的にラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられる。
((c)ミエローマ細胞の調製)
確立されたマウス細胞株(例えば、8−アザグアニン耐性マウスを含む)由来の細胞は、BALB/cミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3−U1)(35)、P3/NSI/1−Ag4−1(NS−1)(36)、Sp2/0−Ag14(SP−2)(37)、P3X63Ag8.653(653)(38)およびP3X63Ag8(X63)(39)由来のミエローマ細胞の供給源として働く。選択された細胞株は、例えば8−アザグアニン培地のような適切な培地に連続的に移される。8−アザグアニン培地は、Iscove改変Dulbecco培地(本明細書以下に、「IMDM」として言及される)またはDulbecco改変Eagle培地(本明細書以下に、「DMEM」として言及される)を含む。RPMI−1640培地は、グルタミン、2−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清(本明細書以下に、「FCS」として言及される)、および8−アザグアニンで補充されている。次に、細胞は、少なくとも2×107細胞が融合の日に有効となることを確実にするため、融合3〜4日前に、例えば10%FCSを含むASF104培地(Ajinomoto,K.K.)のような通常培地に移される。
動物の任意の適した部分から得られるリンパ球および形質細胞は、抗体を産生するための前駆細胞である。リンパ球または形質細胞の供給源としては、例えば脾臓、リンパ節、末梢血またはそれらの任意の適切な組みが挙げられ、脾臓細胞が最も一般的な供給源である。
使用される骨髄腫株が、8−アザグアニンに抵抗性である(すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)酵素が欠損している)場合、あらゆる非融合骨髄腫細胞およびあらゆる骨髄腫―骨髄腫融合体は、HAT培地中では生存不可能である。一方、お互いが抗体産生細胞である融合体、ならびに抗体産生細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、生き残り得、前者のみが限定された寿命を有する。したがって、HAT培地中でインキュベートを継続すると、所望のハイブリドーマのみが選択される。
次に、抗体力価を決定するための工程b)に述べられた方法と同様の方法を用いて、特異的抗体を産生することが示されたハイブリドーマは、クローニングのために別のプレートに移される。適したクローニング方法は、以下を含む:プレートの1ウェルあたり1細胞を含むようにハイブリドーマが希釈され、次いで培養される限界希釈法;軟寒天培地における培養の後にコロニーが回収される軟寒天法;培養のために単一細胞に分けるためにマイクロマニピュレーターを使用する方法;およびセルソータにより単一細胞が、分けられる「クローン選別(sort−a−clone)」。
クローニングによって得られたハイブリドーマは、次にHT培地でない通常培地において培養される。大規模培養は、大きな培養ボトルを使用したローラーボトル培養またはスピナー培養によって行わる。次に、大規模培養からの上清は、本発明の抗体についての基本であるDR5またはDR4モノクローナル抗体を得るために、当業者に周知のゲル濾過のような適切な方法によって収集され、そして精製される。ハイブリドーマはまた、大容量のDR5またはDR4モノクローナル抗体を含む腹水を得るために、BALB/cマウスまたはnu/nuマウスのような同系マウスにおいて、腹腔内で増殖され得る。市販のモノクローナル抗体精製キット(例えば、MAbTrap GII Kit;Pharmacia)は、収集され抗体の精製に便利よく用いられている。
モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの適切な同定方法としては、オークターロニー方法、ELISAおよびRIAが挙げられる。好ましくは、同定には、Mouse Typer Kit(商標;BioRad)のような市販のキットを使用する。
本発明の特有の特性は、細胞表面のDR5に結合する能力である。これは、DR5発現細胞のフローサイトメトリー解析によって示される。第1に、DR5の特異的細胞表面結合は、ヒトDR5をコードする全長cDNAがトランスフェクトされたCOS−7細胞によって確認される。詳細には、TRA−8は、DR5がトランスフェクトされたCOS−7のみを認識し、空のコントロールベクターまたはDR4をコードするベクターででトランスフェクトされたCOS−7は認識しない。第2に、3つの異なる起源(ヒト悪性腫瘍細胞の造血癌、グリオーマおよび前立腺癌)が試験される。発現レベルは大きく変化するが、これらのトランスフォームした腫瘍細胞の大部分は、有意なレベルの細胞表面DR5を発現した。第3に、RA患者およびOA患者から得たヒト初代滑膜線維芽細胞の2つのパネルが、調査される。全てのRA滑膜細胞は、OA細胞と比較して有意に高いレベルのDR5を発現した。
本発明に従って惹起された抗体が、TRAILレセプターを認識する能力、および悪性ヒト腫瘍細胞のアポトーシスを直接的に誘導する能力は、インビトロで種々の濃度の抗体(特に、TRA−8)とともに細胞を培養する間、細胞生存率アッセイ(ATPLite)により決定される。大部分の腫瘍細胞は、TRA−8の誘導するアポトーシスに対して感受性である。いくらかの細胞にとって、TRA−8は、強力なアポトーシス誘導活性を示した(例えば、TR−8は、pg/mlレベル内でヒトJurkat細胞のアポトーシスを誘導し得る)。重要なことには、TRA−8の誘導するアポトーシスは、架橋を必要とせず、そしてほとんどの細胞において、TRA−8は、エンハンサーの存在下で、組み換え可溶性TRAILよりも強力なアポトーシス誘導活性を示した。
TRA−8の腫瘍殺傷活性は、2つのSCID/ヒト腫瘍細胞モデルにおいて評価される。第1に、SCIDマウスは、ヒト白血病Jurkat細胞を静脈内に接種され、TRA−8の1用量(100μg)で処置される。この結果は、大部分の移植Jurkat細胞が、TRA−8で処置することにより末梢血および脾臓から取り除かれることを示す(Jurkat細胞のフローサイトメトリー解析およびインサイチュ免疫組織化学染色によって決定された)。第2に、ヒト星状細胞腫細胞1321N1はSCIDマウスに皮下接種され、そして腫瘍保有マウスは、TRA−8の1用量で処置される。移植された1321N1細胞の増殖は、TRA−8処置マウスにおいて有意に阻害される(腫瘍の大きさ、および組織学的解析によって決定された)。
8人のRA患者および4人のOA患者から単離された初代滑膜細胞は、DR5の細胞表面発現について試験される。TRA−8は、全てのRA細胞をポジティブに染色し得ないが、全てのOA細胞はネガティブに染色し得る。従って、RAは、TRA−8によって検出されるようなDR5の表面発現によってOAから識別される。
TRA−8がRA滑膜細胞のアポトーシスを誘導する能力は、種々の濃度のTRA−8の存在するインビトロ培養の間、細胞生存率アッセイによって決定される。全てのRA細胞は、100ng/mlのTRA−8に対しての高レベル〜中間レベルまでの感受性を示した。対照的に、全てのOA細胞は、TRA−8の誘導するアポトーシスに対して本質的に耐性がある。重要なことに、TRA−8は、エンハンサーを用いた可溶性TRAILよりもRA滑膜細胞に対して、より良好なアポトーシス誘導活性を示した。さらに、抗Fas抗体(CH−11)と比較して、TRA−8は、RA滑膜細胞に対してより良好な選択性を示した。
TRA−8は、TNF−aとしてRA滑膜細胞において、NF−kb活性化を誘導し得るので、滑膜細胞のMMP1およびMMP3の産生に対するTRA−8の影響が、決定される。TNF−aは、MMPの用量依存性増加を誘導した一方、TRA−8は、MMPの任意の産生を誘導することができず、そしてある濃度において、TRA−8は、RA滑膜細胞において、MMPの産生をわずかに減少させた。
カスパーゼは、アポトーシスの誘導に重要な役割を果たすので、TRA−8がカスパーゼの活性化を誘導する能力は、ヒトJurkat細胞において決定される。Jurkat細胞が、低用量(50ng/ml)のTRA−8とともにインキュベートされた場合、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ3の活性化は、ウエスタンブロット分析およびカスパーゼ切断分析によって示されるようにインキュベーション後15分という早さで観察される。カスパーゼの活性化の時期、数および強さの観点から、例示の抗体TRA−8を含め、本発明の抗体は、抗ヒトFas抗体(CH−11)のようなあらゆる他の既知のアポトーシス誘導抗体よりもさらに良い活性を示した。
非経口的注射に適切な組成物は、生理学的に受容可能な減菌した水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、および減菌された注射可能溶液または分散液への再構成のための減菌された粉末を含み得る。適切な水性、および非水性キャリア、希釈液、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど)、これらの適切な混合物、植物油(オリーブオイルのような)およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機物のエステルが挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要とされる粒子の大きさの保持により、および界面活性剤の使用により、保持され得る。
これらの組成物はまた、保護剤、湿潤剤、乳化剤、分配剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の活動を妨げることは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの、種々の抗菌剤および抗真菌剤により、確実にされ得る。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等浸透圧剤を含むこともまた、所望され得る。注射可能な薬学的形態の延長された吸収が、吸収を遅らせる薬、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することで、もたらされ得る。
本発明の抗体は、悪性腫瘍の処置において他の治療(例えば、化学治療および/または放射性治療)とさらに組み合わされ得、そして治療効力は、アポトーシス誘導化合物(例えば、ビスインドリルマルイミドVIII(ビスVIII)またはSN−50もしくはLY294002のような他の感作剤)によって高められ得る。従って、1つの実施形態において、本発明の抗体は、ビスVIIIおよび化学療法剤(例えば、アドリアマイシン)と組み合わされ得る。別の実施形態においては、本発明の抗体は、非ステロイド抗炎症性薬物(例えば、スリンダクスルフィドまたは他のCOX−1インヒビターもしくは他のCOX−2インヒビター)、化学療法剤(例えば、アドリアマイシン)と組み合わされ得る。他の疾患(例えば、自己免疫疾患および炎症性疾患)の処置において、処置の組み合せもまた、使用され得る。例えば、抗体は、化学治療剤、抗炎症剤、DMARD、メトトレキセート、ビスインドリルマルイミドVIIIまたは他の感作剤などのような、他の化学治療剤と組み合わせて投与され得る。放射性治療もまた、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置において他の治療剤と組み合わされ得る。当業者は、特定の炎症性疾患または自己免疫疾患に対して放射性治療の形態を適合する(例えば、関節炎の処置における放射線骨膜切除)。
(1.1 DR5 cDNAのクローニング)
ヒトDR5タンパク質をコードするDNAを、以下を使用する次のRT−PCR法によってクローン化する。
HeLa細胞の全RNAを、TRIzol Reagent(GIBCO BRL)を使用することによって抽出する。First−Strand cDNA合成キット(Amersham Pharmacia Biotech)を、このキットに備え付けられた指示マニュアルに従って使用することによって得られるcDNAを、PCR反応についてのテンプレートとして使用する。
次のオリゴヌクレオチドプライマーをPCRのために合成する:
5’−gacgatgcccgatctactttaaggg−3’(DR5p1:配列番号1);
5’−ccactgggtgatgttggatggg−3’(DR5p2:配列番号2)。
PCR反応溶液の組成:
テンプレートcDNA、全33μl反応物中の5μl
プライマーDR5p1、10pmol;
プライマーDR5p2、10pmol;
10×濃縮PCR緩衝液(キットに備え付けられている)、10μl;
dNTP(各2.5mM)、4μl;および
Taqポリメラ−ゼ(Promega)、5単位。
膜貫通ドメインを欠くヒトDR5の可溶性形態を得るため、発現プラスミドベクターを構築する。このベクターを、ヒトIgG1 Fc DNA(41)に融合されたヒトDR5の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするように設計する。膜貫通ドメインを欠くヒトDR5をコードするDNAを、次のPCR反応によって得る。
PCR反応のためのテンプレートは、pcDNA3−DR5を使用する。
次のオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRのために合成する:
5’−gacgatgcccgatctactttaaggg−3’(DR5p1:配列番号1);
5’−ggatccgtggacacattcgatgtc−3’(DR5p3:配列番号3);
別のように特定されなければ、これらの実施例中の全てのオリゴヌクレオチドを、Lifetechnologiesによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、蒸留水中で溶かした後、−20℃で保存する。
PCR反応を行い、そして増幅されたDNAを実施例1.1(c)によって単離する。
QBI−293A細胞(ADENO−Quest Kitに備えられている)を、指示マニュアルに従ってADENO−Quest Kit(Quantum Biotechnologies Inc.、Canada)を使用してpAdΔDR5−FcおよびQBI−ウイルスDNA(ADENO−Quest Kitに備えられている)を用いて共トランスフェクトする。組換えウイルスプラークを培養し、上清のELISA分析によってDR5−IgG融合タンパク質の発現についてスクリーニングする。ポジティブプラークを、QBI−293A細胞中で増幅し、そしてウイルスストックとして−80℃で保存する。50枚のQBI−293A細胞ディッシュ(150mm)を、10m.o.i.(感染多重度)でpAdΔDR5−Fc組換えウイルスを用いてトランスフェクトする。培養培地を、48時間トランスフェクションした後、収集する。
カラム:ProteinA−Sepharose CL−4Bカラム(カラムサイズ2ml;Pharmacia);
溶出緩衝液:0.1Mグリシン(pH2.4)、0.15MNaCl;
中和緩衝液:1MTris−HCl(pH8.5)。
(2.1 免疫)
6〜8週齢の雌Balb/cマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)を、アフィニティー精製されたヒトDR5/hIgG1融合タンパク質で免疫する。初期肉趾免疫について、融合タンパク質(50μg)を、フロイントの完全アジュバント(Difco,Detroit,MI)中に乳化する。次いで、マウスを、50μgの融合タンパク質の4回の注射でブーストした(アジュバントを有さずに1日置きに投与される)。最後の注射の3日後、局所的リンパ節由来のリンパ球を、NS−1骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを、10%ウシ胎仔血清を補充したF104培地中で培養する。陽性のハイブリドーマを、ELISAによって選択し、このELISAにおいて、プレートは、1μg/ml DR5/hIgG1またはコントロールとして等量のFas/hIgG1でコーティングされる。ハイブリドーマのアイソタイプを、マウスIgアイソタイプ特異的ヤギ抗体のパネル(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)を使用するELISAによって決定する。モノクローナル抗体を、固定された抗マウスIgGまたはプロテインG(Sigma)を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
ブースト注射の3日後において、局所的リンパ節を、マウスから除去し、50単位/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、および300μg/mlのL−グルタミン酸を含有する10mlの無血清RPMI 1640培地(GIBCO BRL)中に置き、器官をスパチュラを使用してメッシュ(Cell Strainer;Falcon)を通過させることによって破壊した。得られた細胞懸濁物を、遠心分離し、局所的リンパ節細胞をペレットにし、次いで、無血清RPMI培地で2回洗浄した。次いで、この洗浄した細胞を、無血清RPMI培地中に再懸濁し、計数する。
4〜10週齢の雌BALB/cマウス(Japan SLC,Inc.製)から胸腺を取り出し、上記のようにメッシュ(Cell Strainer;Falcon)上で破壊し、粉砕された細胞を、10% v/v FCSを含有するHT培地で2回洗浄した。1匹のマウスからの胸腺に対応するある量の胸腺細胞を、10% v/v FCSを含有する30mlのHT培地中に懸濁し、供給用細胞懸濁物を生成する。上記実施例2.2において得られた融合細胞調製物を、この供給用細胞懸濁物で10〜100倍に希釈し、さらに供給用細胞懸濁物で連続的に希釈し、5細胞/ml、1細胞/mlおよび0.5細胞/mlの融合細胞濃度を有する懸濁物を作製する。このように調製したサンプルを、96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルに100μl/ウェルで分配し、5% v/v CO2下で、37℃で5日間インキュベートする。
増殖するハイブリドーマからの培養上清を、1μg/ml DR5/hIgG1またはコントロールとして同量のFas/hIgG1(41)のいずれかでコーティングされたプレートを使用して、ELISAによってスクリーニングする。結合した抗体を、基質としてTMB(Sigma,St Louis,MI)を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化抗マウス免疫グロブリン(Southern Biotechnology.Birmingham,AL)を使用して検出する。1μg/mlの濃度の精製DR5−IgG1または同量のFas−hIgG1を、96ウェルのELISA/RIA STRIP PLATE(Costar,NY)のウェルに導入する。プレートを、4℃で一晩静置しておき、ウェル表面上にタンパク質を吸着させる。この時間の後、ウェル中の溶液を捨て、各ウェルを、PBS−Tweenで3回洗浄する。次いで、1%(w/v)のウシ血清アルブミン(A3803;Sigma Chemicals Co.)を含有する100μlのPBSを、各ウェルに添加し、プレートを、37℃で1時間インキュベートする。次いで、ウェルを、PBS−Tweenでさらに3回洗浄し、次いで、増殖するハイブリドーマからの50μlの各培養上清を、各ウェルに添加する。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートし、ウェルを、PBS−Tweenで再度4回洗浄する。洗浄後、PBSで1000倍に希釈された、1ウェル当たり50μlの西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(Southern Biotechnology.Birmingham,AL)を添加し、プレートを、再度37℃で1時間インキュベートし、その後、ウェルを、PBS−Tweenで4回洗浄する。次いで、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジリデン(TMB)液体基質系(Sigma)を、100μl/ウェルの量で添加し、プレートを、室温で5分間静置し、次いで、反応を、100μl/ウェルの0.2N H2SO4の添加によって停止した。各ウェルの450nmの吸光度(コントロール 650nm)を、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して測定し、融合細胞を、融合細胞上清が添加されなかったサンプル(OD値;0.03)より明らかに高い吸光度(450nm−650nm,OD値;>0.5)を有したサンプルから選択する。さらに、増殖するハイブリドーマからの培養上清をまた、Jurkat細胞を使用してアポトーシス誘導活性を測定することによって、機能的にスクリーニングする。Jurkat細胞(1ウェル当たり1000細胞)および5μMのビスインドリルマレイミドVIII(BisVIII,Alexis,San Diego,CA)を含有する50μlのRPMI培地を、50μlの増殖するハイブリドーマからの培養上清の存在下で、96ウェルプレートに添加する。細胞を、加湿培養器中で37℃で一晩培養する。アポトーシスを、ATPLiteキットを製造業者(Packard Instruments)によって指示されるように使用して細胞生存性によって決定し、サンプルを、TopCounter(Packard Instruments)を使用して計数する。
ELISAプレートを、2μg/mlのDR4−Ig融合タンパク質またはDR5−Ig融合タンパク質で一晩コーティングする。3% BSAでのブロッキングの後、可溶性TRAIL−FLAGまたはTRA−8を、指示された濃度で添加し、37℃で1時間インキュベートする。TRAILまたはTRA−8の結合を、それぞれ、HRP−結合体化抗Flag抗体(Alexis)またはHRP−結合体化抗マウスIgG1(Southern Biotechnology)によって検出する。反応を、TMB基質緩衝液によって開始し、Benchmark Microplate Reader(BioRad)によって測定する。Kd値を、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software,San Diego,CA)を使用する非線形回帰の一部位結合モデルによって推定する。競合的ELISAのために、100ng/mlのTRAIL−FLAGを添加し、種々の濃度のTRA−8の存在下でインキュベートする。TRAILの結合を上記のように決定する。
上記2.3および2.4に記載される工程を、2.4において選択される細胞について5回繰り返し、それによって、いくつかのハイブリドーマクローンの選択を可能にし、これらの各々は、DR5−IgGを結合するが、Fas−IgGを結合しない単一の抗体を産生した。この選択手順の結果として、TRA−8と命名され、DR5−IgGに結合するが、Fas−IgGに結合しない抗体を産生するマウス−マウスハイブリドーマを得る。このハイブリドーマ(TRA−8)は、2000年3月1日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号PTA−1428を割り当てられた。
正常ヒト組織ホモジネートおよび癌組織ホモジネートのウェスタンブロット分析用のフィルターを、Geno Technology(St Louis,MO)から購入する。各レーンを、抗βアクチン抗体によって決定される等量のタンパク質で充填する。ブロットを、1μg/mlのTRA−8で一晩プローブし、続いて、HRP−結合体化ヤギ抗マウスIgG1(Southern Biotechnology)で室温で1時間プローブし、化学発光によって現像する。
ヒト組織を、Tissue Procurement Center of UABから得る。凍結切片を、70%エタノール中で固定し、PBS中の10%ウシ血清でブロックし、次いで、10μg/mlのアフィニティー精製TRA−8と共に室温で60分間インキュベートする。比色基質としてジアミノベンジジン(Vector,Burlingame,CA)を用いる抗マウスIgG ABCキットを、反応性を可視化するために使用する。
Jurkat細胞(1×106/ml)を、500ng/mlのTRA−8と共にインキュベートする。細胞溶解物のアリコート(30μgのタンパク質)を、15% SDS−PAGE上で分離して、ナイロン膜上にブロットし、そしてこのブロットを、抗カスパーゼ8抗体、抗カスパーゼ9抗体、および抗カスパーゼ3抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)でプローブし、続いて、HRP−結合体化二次抗体でプローブし、切断産物の化学発光可視化を行う。カスパーゼインヒビターセットを、R&D Systems(Minneapolis,MN)から購入する。各カスパーゼインヒビターを、推定した濃度で培養液に添加する。
マウス−マウスハイブリドーマ(TRA−8)を、10% v/v FCSを含有する500mlのASF培地中、5% v/v CO2下で、37℃で5日間インキュベーションすることによって、1×106細胞/mlの細胞密度まで増殖する。次いで、培養物を遠心分離(1,000r.p.m.、5分間)し、上清を回収する。上清からのTRA−8の精製を、以下の条件下で、Protein G−Sepharose CL−4Bアフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia)を使用して達成する:
カラム:Protein G−Sepharose CL−4Bカラム(カラムサイズ 2ml;Pharmacia);
溶出緩衝液:0.1M グリシン(pH2.4)、0.15M NaCl;
中性化緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)。
実施例1〜3の手順を、実施例1に詳述されるものの代わりにDR4テンプレートcDNAおよびプライマーを用いて繰り返し、DR4抗原を得る。このDR4抗原は、DR4に対して特異的なモノクローナル抗体を得るために実施例1.2〜3により使用される。
モノクローナル抗体を、実施例1に従ってそれぞれの抗原を作製するための対応するcDNAおよびプライマーを置換することによっておとり受容体DcR1およびDcR2に対して惹起する。免疫グロブリンGとのDcR1融合体またはDcR2融合体に対する発現ベクターおよび得られた精製モノクローナル抗体を、実施例2および3に従って作製する。
TRAILのレセプターの全て、およびTNFRファミリーの他のタンパク質は、有意な相同性を共有するので、例示的な抗体TRA−8のDR5に対する特異性を、2つの異なるヒトDR5−IgG融合タンパク質および可溶性の組換え形態の他の関連するタンパク質を使用するウェスタンブロット分析によって決定する。第一のDR5−Ig融合タンパク質を、DR5の細胞外部分の残基1〜180由来のcDNAと、ヒトIgG1の定常領域をコードするcDNAとを融合させることによって、構築する。この融合cDNAを、組換えアデノウイルスベクター(Quantum Biotechnogies,Inc.,Montreal,Canada)にクローニングする。発現されるDR5/hIgG1融合タンパク質(これは、50kDaの相対分子量を有した)を、抗ヒトIgGアフィニティーカラム(Sigma,St Louis,MO)を使用して精製する。特異性のウェスタンブロット分析のために、第二の組換えヒトDR5/IgG1融合タンパク質(アミノ酸52〜212)ならびにTRAIL−R1融合タンパク質、TRAIL−R3融合タンパク質およびTRAIL−R4融合タンパク質を、Alexisから購入する。ヒトFasおよびTNFR1の可溶性形態は、Amgen,Inc.,Thousands Oaks,CA,USAのCarl Edwards博士によって親切にも提供された。使用した可溶性組換えヒトDR4、DcR1、DcR2、TNFR1、R4、およびFas分子は、ヒトIgG1融合タンパク質である。0.5μgの各タンパク質を、10% SDS−PAGEで分離し、そしてニトロセルロース膜上にブロットする。これらのブロットを、PBS中5%乾燥ミルクで、室温で1時間ブロックし、そして1μg/mlの精製モノクローナル抗DR5抗体(クローン:TRA−8)または0.1μg/mlのHRP結合体化ヤギ抗ヒトIgGで、4℃で一晩プローブする。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合体化ヤギ抗マウスIgGを、二次抗体として使用して、結合したTRA−8を検出する。これらのブロットを、化学発光によって現像する。
次いで、TRA−8が、細胞表面において発現されるDR5に結合する能力、およびこの反応の特異性を、全長ヒトDR5 cDNAもしくは全長ヒトDR4 cDNAを含む発現ベクター、またはコントロールとして空のベクターでトランスフェクトされた、COS−7(American Type Culture Collection番号CRL−1651)細胞を使用して評価する。フィコエリトリン(PE)結合体化抗マウスIgG1(Pharmingen)を、二次抗体として使用して、結合TRA−8を検出する。1×104細胞の蛍光を、フローサイトメーター(FACSVantage)を使用して、以下の条件下で測定する:
励起波長:488nm;
検出波長:600nm。
励起波長:488nm;
検出波長:600nm。
TRA−8が、インビトロで形質転換された細胞におけるアポトーシスを誘導するか否かを決定するために、全てのDR5ポジティブ腫瘍細胞を、TRA−8またはTRAILのいずれかによって誘導されるアポトーシスに対するそれらの感受性について試験する。
種々の理由により、インビトロ研究で見込みを示す多数の薬剤は、インビボで有効性を示さない。従って、インビボ動物モデルにおけるTRA−8の有効性を紙面することが、重要である。このことを達成するために、TRA−8抗ヒトDR5抗体を、ヒトDR5分子を発現するヒト異種移植片保有マウスに投与する。使用したマウスは、6〜8週齢のNOD/SCIDマウス(Jackson Laboratory)であり、このマウスに、ヒト星状細胞腫1321N1細胞(l×107個)を皮下接種するか、またはヒト白血病Jurkat細胞(1×106個)を静脈内接種する。腫瘍の接種から2日後、マウスにTRA−8(100μg)を静脈内接種する。TRA−8での処置から5日後、1321N1腫瘍増殖を、その腫瘍塊の大きさおよび重量によって決定する。Jurkat細胞の増殖を、脾臓の重量、および接種した動物の脾臓におけるヒトCD3ポジティブJurkat細胞の割合によって決定する。腫瘍組織の生検を採取し、そして組織学的に試験する。
TRAIL媒介アポトーシスの先行技術研究のほとんどは、悪性細胞に焦点を当てていた。本発明に従うTRAIL媒介アポトーシスはまた、自己免疫状態および炎症性状態(例えば、RA)の治療法である。
RAを有する患者由来の8種の初代培養滑膜細胞のパネル上でのDR5の発現を、変形性関節症(本明細書中以後「OA」と呼ぶ)を有する患者由来の8種の初代培養滑膜細胞上でのDR5の発現と比較する。これら8種のヒト初代RA滑膜細胞培養物(RA−1014、RA−1016、RA−1021、RA−512、RA−707、RA−811、RA−716、およびRA−929)は、Dr.M.Ohtsuki(Sankyo Co.Ltd.,Tokyo,Japan)によって快適に提供されており、10% FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンで補充されたDMEM中で培養される。これら7種のOA滑膜細胞の初代細胞培養物を、標準的なコラゲナーゼ方法によってOA患者の滑膜組織から単離し、そして同じ条件下で培養する。全ての初代細胞の継代数は、10より下である。DR5の発現を、実施例5に記載されるようなFACS分析によって決定する。
一般に、図8a、図8bのとおり、RA患者から単離された全ての滑膜細胞は、TRAIL抗体および抗DR5抗体によって誘導されるアポトーシスに対して感受性であり、かつ全てのOA細胞は、TRAIL抗体および抗DR5抗体によって誘導されるアポトーシスに対して耐性である。これらの研究は、TRA−8抗体が、正常細胞に優先して変更された細胞を標的することを示している。さらに、TRAILによって誘導されるアポトーシスに対する感受性または耐性のパターンは、抗DR5抗体によって誘導されるアポトーシスに対する感受性または耐性のパターンと相関する。このことは、滑膜細胞がDR5を主に利用して、TRAILアポトーシスを誘発することを示している。
アポトーシスのシグナル伝達と増殖のシグナル伝達との間に緊密な関連が存在するという概念を支持する、多くの証拠が存在する(45)。DR5が、アポトーシスシグナル伝達に加え、NF−κb経路を活性化し得、として、NF−κb活性化によって、抗アポトーシスシグナル伝達され得ることを確立した。従って、ゲルシフトアッセイが行われる。指定された時間の間で、1mg/mlエンハンサーの存在下で、50ng/mlの組換え可溶型TRAILである、Fasリガンドで、または50ng/mlのTRA−8で、細胞を刺激する。この核抽出物を、調製し、二重染色[32P]標識オリゴDNAプローブとともにインキュベートした。これらの結果を、サイクロンホスファイメージャー(cyclone phospha−imager)(TopCount NXT,Packard Instrument Company,CT)を使用して分析する。RA滑膜細胞を、TNF−αまたはTRAILとインキュベートした後に、NF−κbを、時間依存的様式で活性化させた。このTRA−8抗体は、NF−κbを強力に活性化し得る。対照的に、Fasリンガンドは、図10aが示すように、NF−κb活性化を誘導し得ない。
24時間の細胞生存アッセイの間で、96ウェルプレートにおける新たな正常ヒト肝細胞を、In Vitro Technology(Baltimore,MD)から購入した。これらの肝細胞を、Hepatocyte Culture Medium(可溶性のTRAILまたはTRA−8のいずれの1μg/ml含む)中で培養する。6時間の生存アッセイの間に、正常肝細胞または、肝細胞癌細胞を、UAB Tissue Procurement Centerから収集した新鮮な外科生検材料から単離する。ヒト肝臓の単離のための全ての試薬(肝細胞灌流緩衝液、消化培地、洗浄培地、および吸着培地)を、Gibcoから購入した。これらの組織スライドを、Hepatocyte Digest Medium中で37℃にて、振とう(50rpm)しながら、1時間、消化した。これらの単離した肝細胞を、低速遠心分離(50g,3分間)によって回収し、そして、Hepatocyte Washing Mediumで6回、洗浄した。肝細胞の単一の細胞懸濁物を、96ウェルMatrigelプレート(BD)中のAttachment Medium(10%FCSを含む)の中で、6時間培養した。接着していない肝細胞は、予め温めた接着培地(attachment medium)を用いて2回洗浄することによって、取り除いた。接着した肝細胞をさらに、6時間に亘って、架橋剤、またはTRA−8もしくはCH11の存在下で、種々の濃度のTRAILまたはFasLとともにインキュベートする。
8〜10週齢の雌性B6マウスに、109pfuのAd/hTRAILと、同じ数のAd/Tet−onとを、静脈内注射する。マウスに、アデノウイルスベクターの接種の後すぐに、飲料水中に様々な濃度のテトラサイクリンを供給する。肝臓の損傷は、AST診断キット(Sigma)を使用してASTの血清レベルによって決定する。TRAILの発現を、ノーザンブロット分析によって決定する。
DR5が、活性化したT細胞およびB細胞のTRAIL媒介性アポトーシスにおける役割を担うか否かを決定するために、休止したT細胞およびB細胞ならびに活性化したT細胞およびB細胞におけるDR5の表面での発現を、TRA−8を使用して調べた。PBMCにおけるこの刺激を受けないヒトT細胞は、顕著なレベルのDR5を発現しなかった(図14)。抗CD3またはCon−A刺激のいずれか後の48時間で、細胞表面DR5発現が、有意に増加する。同様に、刺激を受けていないB細胞は、非常に低いレベルのDR5を発現した。LPSでなく抗μの刺激によって、DR5の増大した細胞表面発現を生じた。これらの結果は、活性化したT細胞およびB細胞の両方が、高レベルの細胞表面DR5を発現することを示す。細胞を、20μg/mlのTRA−8およびPE抗マウスIgG1で染色する。
活性化T細胞および活性化B細胞がTRA−8媒介アポトーシスに感受性であるか否かを決定するために、ヒトPBMCのT細胞およびB細胞を、それぞれ、抗CD3または抗μを用いて、インビトロで48時間刺激する。生存細胞および増殖芽細胞を勾配遠心分離によって回収し、そして種々の濃度のTRA−8と共にインキュベートする。未刺激のT細胞よびB細胞は、TRA−8媒介アポトーシスに感受性でない(図15)。総刺激T細胞およびB細胞は、TRA−8媒介アポトーシスに対する中程度増加した感受性を示し、20%の細胞が、一晩の培養後にTRA−8によって殺傷された。高度に増殖性の芽T細胞は、TRA−8媒介アポトーシスに対してより感受性でありさえする。70%より多くの芽T細胞が、一晩の培養後にTRA−8によって殺傷され得る。芽B細胞はまた、他と比較して、TRA−8媒介アポトーシスにより感受性である。これらの結果は、活性化T細胞および活性化B細胞が、DR5媒介アポトーシスに感受性であることを示す。
TRA−8のインビボ抗T細胞効果を決定するために、NOD/SCIDマウスに、1×108ヒトPBMCを静脈内注射する。通常は、SCIDマウスにおいて、ヒトT細胞は、異種刺激に応答してすばやく活性化される。ヒトPBMC/SCIDマウスに、移入の日から100μgのTRA−8またはコントロールIgG1を腹腔内注射し、3日間毎日繰り返す。移入の5日後、単核細胞を脾臓から単離し、そして抗ヒトCD3抗体で染色し、そしてリンパ球集団を、フローサイトメトリーにかけ、そしてCD3ポジティブのヒトT細胞を分析する。コントロール処理マウスにおける抗ヒトCD3染色によって決定されるように、脾臓リンパ球の約30%はヒトT細胞である。しかし、わずかなヒトT細胞のみ(3%未満)が、TRA−8処理マウス中の脾臓リンパ球から得られる(図16)。インサイチュ組織学的研究は、コントロールマウスの脾臓において、ヒトT細胞は、脾臓で再集合され、わずかなアポトーシス細胞が、TUNEL染色によって実証されるように観察されるのみであることを明らかにした。対照的に、生存ヒトT細胞との再集合は、TRA−8処理マウスの脾臓において観察されず、むしろ、多くのアポトーシス細胞が観察される(図17)。これらの結果は、TRA−8が、インビボで抗T細胞活性を有することを実証しており、GVH疾患の処理についての本発明の抗体の有用性を示している。
i)TRA−8でのインサイチュ染色によるヒト癌組織におけるDR5発現。
9個のヒト乳癌細胞株、3個の卵巣癌株、3個の結腸癌株および3個の前立腺癌株を、DR5の細胞表面発現およびインビトロにおけるTRA−8誘導性アポトーシスに対する感受性について試験する。9個のうち7個の乳癌株、3個のうち3個の卵巣癌株、3個のうち3個の結腸癌株および3個のうち3個の前立腺癌株が、可変レベルの細胞表面DR5を発現した。9個の乳癌細胞株のうち3個が、TRA−8媒介性アポトーシスに対して非常に感受性であり、3個が中程度に感受性であり、そして3個が耐性である。3個全ての卵巣癌株は、非常に感受性である。3個の結腸癌株のうち1個が、非常に感受性であり、一方、2個は、中程度の感受性を有する。3個の前立腺癌株のうち2個が、中程度の感受性を有し、そして1個が、耐性である。
いくつかの乳癌株において、TRA−8誘導性アポトーシスに対するアドリアマイシンの効果を試験する。高用量のアドリアマイシンは、付加的な効果を示した。しかし、TRA−8耐性株のいくつかにおいて、低用量のアドリアマイシンは、TRA−8誘導性アポトーシスを相乗的に増加した。
放射性同位体で標識したTRA−8を使用する。乳癌株に対するTRA−8の結合活性を、腫瘍を移植されたSCIDマウスにおいて、インビトロおよびインビボで試験する。癌細胞に対するインビトロ結合活性を、3nMのKd値として推定し、この値は、ELISAを使用した以前の推定と一致し、そして可溶性TRAILよりも少なくとも50倍大きかった。インビボにおいて、TRA−8は、移植された腫瘍組織に局在した。
慢性リンパ性白血病(CLL)は、B細胞悪性腫瘍の一般的な形態である。CLLにおけるほとんどの悪性B細胞が、成熟表現型を有し、そして多くのアポトーシス刺激に対して耐性である。CLLを有する5人の患者のB細胞におけるDR5の発現および機能を試験する。全ての患者は、PBMCにおける95%より多いCD19+B細胞により示されるように、多数の末梢B細胞を有していた。正常な一次B細胞と比較して、全ての患者のCLL B細胞は、より高いレベルの細胞表面DR5を有し、インビトロにおけるTRA−8誘導性アポトーシスに対してより感受性である。興味深いことに、このCLL B細胞はまた、ビスインドールマレイミドVIII(Bis VIII)誘導性細胞傷害性に対して感受性である。TRA−8およびBisVIIIでの併用処置の後に、CLL B細胞の50%近くが死滅し、一方、正常なB細胞は、非応答性のままである(図18)。NOD/SCIDマウスへのCLL B細胞の移動により、移動の5日後におけるレシピエントマウスの脾臓においてCD19+B細胞の約25%〜30%の再増殖が生じた。しかし、3用量の100μgのTRA−8処置は、レシピエントSCIDマウスの脾臓における5の患者(patient)のうち4のCLL B細胞を完全に排除した。従って、TRA−8は、単独はでまたは他の基質と一緒になって、慢性リンパ性白血病の治療剤として活性である。
(1)TRA−8の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列の決定
TRA−8の重鎖および軽鎖のcDNAを得るために、TRA−8遺伝子およびクローン化されたTRA−8遺伝子の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列を、公知の技術によって決定する。
Glu−Val−Met−Leu−Val−Glu−Ser−Gly−Gly−Gly−Leu−Val−Lys−Pro−Gly−Gly−Ser−Leu−Lys−Leu(配列表の配列番号4)。
Asp−Ile−Val−Met−Thr−Gln−Ser−His−Lys−Phe−Met−Ser−Thr−Ser−Val−Gly−Asp−Arg−Val−Ser(配列表の配列番号5)。
上記の知見に基づいて、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子の、5’非翻訳領域の部分および3’翻訳領域の最末端にハイブリダイズすることが予測されるオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。次いで、TRA−8の重鎖および軽鎖をコードするcDNAを、逆転写およびPCR(RT−PCR)の以下の組合せによってクローニングする。
TRA−8ハイブリドーマ(ATCC No.PTA−1428)の総RNAを、TRIzol試薬(GIBCO BRL)を使用することによって抽出する。PCR反応のためのテンプレートは、キットに備えられる指示マニュアルに従って、First−Strand cDNA合成キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用することによって得られるcDNAを使用した。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRのために合成する:
5’−cagcactgaa cacggacccc−3’(H5NCS1:配列表の配列番号6);
5’−aaaggtaatt tattgagaag−3’(H5NCS2:配列表の配列番号7);
5’−cctcaccatg aacttcgggc−3’(H5SS1:配列表の配列番号8);
5’−ctgttgtatg cacatgagac−3’(H5SS2:配列表の配列番号9);
5’−gaagtgatgc tggtggagtc−3’(H2CS1:配列表の配列番号10);
5’−agtgtgaagt gatgctggtg−3’(H5CS2:配列表の配列番号11);
5’−tttaccagga gagtgggagag−3’(H3CR:配列表の配列番号12);
5’−tgcagagaca gtgaccagag−3’(H3VR:配列表の配列番号13);
5’−tgttcaggac cagcatgggc−3’(L5NCS1:配列表の配列番号14);
5’−aagacatttt ggattctaac−3’(L5NCS2:配列表の配列番号15);
5’−tatcatgaag tctttgtatg−3’(L5SS1:配列表の配列番号16);
5’−gatggagaca cattctcagg−3’(L5SS2:配列表の配列番号17);
5’−gacattgtga tgacccagtc−3’(L5CS:配列表の配列番号18);
5’−ttaacactca ttcctgttga−3’(L3CR:配列表の配列番号19);および
5’−gactgggtca tcacaatgtc−3’(LCSR:配列表の配列番号20)。
PCR反応溶液の組成:
テンプレートcDNA、合計33μlの反応物のうち5μl;
プライマーDR5pl、10pmol;
プライマーDR5p2、10pmol;
10×濃PCR緩衝液(キットに提供される)、10μl;
dNTP(各々、2.5mM)、4μl;および
Taqポリメラーゼ(Promega)、5単位。
(1)TRA−8の可変領域の分子モデリング
TRA−8の可変領域の分子モデリングを、相同性モデリングとして一般的に知られる方法により行う(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.28,235−242(2000))(X線結晶学に由来する3次元構造が利用可能である)に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の一次配列を、上で決定されたTRA−8フレームワーク領域と比較する。結果として、1NCDおよび1HILを、それぞれTRA−8の軽鎖および重鎖についてのフレームワーク領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択する。フレームワーク領域の3次元構造を、TRA−8の軽鎖および重鎖に対応する1NCDおよび1HILの座標を組み合わせることにより生成して、「フレームワークモデル」を得る。Chothiaらにより定義された分類を使用して、TRA−8のCDRを、以下のように分類する:CDRL1、CDRL2、CDRH1およびCDRH2は、基準クラス2、1、1、3にそれぞれ属し、一方CDRL3は、基準クラスのいずれにも属さない。このCDRL1、CDRL2、CDRH1、CDRH2のCDRループは、それらのそれぞれの基準クラスに固有のコンホメーションに固定され、そしてフレームワークモデルに組み込まれる。CDRL3は、Thorntonら(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、クラスター8Aのコンホメーションに帰属され、そしてCDRH3は、H3則(FEBS letter 455,188−197(1999))を使用してk(8)Cに分類される。次いで、CDRL3およびCDRH3の代表的なコンホメーションを、フレームワークモデルに組み込む。
ヒト化TRA−8抗体の構築は、CDRグラフト化として一般的に知られる方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))により実行する。このアクセプター抗体を、フレームワーク領域におけるアミノ酸相同性に基づいて選択する。TRA−8におけるフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))における全てのヒトフレームワーク配列と比較する。結果として、mAB58’CL抗体を、フレームワーク領域について最も高い80%の配列相同性に起因してアクセプターとして選択する。mAb58’CLについてのフレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、TRA−8のフレームワーク領域におけるアミノ酸残基と整列し、そして異なるアミノ酸が使用される位置を同定する。これらの残基の配置を、上で構築されたTRA−8の3次元モデルを使用して解析し、そしてアクセプターにグラフト化されるべきドナー残基を、Queenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))により与えられる規準により選択する。ヒト化TRA−8配列を、いくつかのドナー残基をアクセプター抗体であるmAb58’CLに移行することにより以下の実施例において記載されるように構築する。
(1)ヒト化TRA−8の重鎖可変領域DNAを保有するプラスミドの構築
ヒト化TRA−8の活性を決定するために、ヒト化TRA−8の重鎖を保有するプラスミドを、以下のように構築する。しかし、TRA−8のヒト化は、これらの実施例に限定されないことが理解される。
以下の12のオリゴヌクレオチドを合成する:
PCR反応溶液の組成:
オリゴヌクレオチドA、10pmol;
オリゴヌクレオチドB、10pmol;
オリゴヌクレオチドC、10pmol;
オリゴヌクレオチドD、10pmol;
オリゴヌクレオチドE、10pmol;
オリゴヌクレオチドF、10pmol;
オリゴヌクレオチドG、10pmol;
オリゴヌクレオチドH、10pmol;
オリゴヌクレオチドI、10pmol;
オリゴヌクレオチドJ、10pmol;
オリゴヌクレオチドK、10pmol;
オリゴヌクレオチドL、10pmol;
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM;
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM;
10×Pyrobest緩衝液II、10μl;
dNTP混合物、8μl;
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容積50μlになるまでの再蒸留水。
PCR反応から回収されたDNAフラグメント、5μl;
10×Taqポリメラーゼ緩衝液、1μl;
dNTP混合物、1μl;
Taqポリメラーゼ(5単位/ml)、1μl;および
最終容積10μlになるまでの再蒸留水。
動物細胞用の組換え発現ベクターを、ヒト化TRA−8の重鎖をコードするDNA(上でクローン化された)を以下のように挿入することにより構築する。
(1)TRA−8抗体のヒト化バージョンの軽鎖についてのベクターの構築
配列表の配列番号46に示すように、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列をヒト化するにあたり、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、60番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、63番目のアミノ酸(スレオニン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、87番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、および99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)および108番目のアミノ酸(アラニン)を、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリン、およびスレオニンと置換する。得られる配列を、LM2と称する。
LM2ポリペプチド鎖(配列番号表の配列番号46)をコードするDNA(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域の融合物である)を、PCRの組み合わせを使用することによって、それぞれ合成する。
配列表の配列番号46に規定されるアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号55に規定されるLM2−DNAフラグメントを、2工程PCRを行うことによって調製し、プラスミドベクターに挿入し、E.coli中にクローニングする。
5’末端に付加されたHindIII制限酵素切断部位を有する分泌シグナル配列およびFRL1領域の一部をコードするLM2−F1−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド、pHSGHM17およびpSRPDHHを、欧州特許出願EP 0909 816 A1における記載に従うことにより得る。
プラスミドpHSGHM17 DNA(欧州特許出願EP 0 909 816 A1)、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKSPR11、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(PerkinElmer)、2.5ユニット。
反応溶液の組成:
プラスpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット。
プラスミドpSRPDHH DNA(欧州特許出願EP 0 909 816 A1)、25μg
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF22、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR22、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積50μlに調節し、PCRにおいて用いる。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCF12、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積50μlに調節し、PCRにおいて用いる。
上記のLM2−F1−DNAフラグメント、LM2−F2−DNAフラグメント、LM2−F3−DNAフラグメントおよびLM2−F4−DNAフラグメントが融合されているLM2−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程PCRにおいて調製されたLM2−F1−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM2−F2−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM2−F3−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM2−F4−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5ユニット
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容積50μlに調節し、PCRにおいて用いる。
ヒト化LM2 TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIgκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有する、得られたプラスミドpHSG/M2−1−4を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
上記のように得たヒト化TRA−8重鎖およびヒト化TRA−8軽鎖の発現プラスミドを用いたCOS−7細胞(すなわち、サル腎臓由来の細胞)のトランスフェクションを、FUGENE6トランスフェクション試薬法(Boehringer Mannheim Biochemica)により、そのキットと共に提供される指示マニュアルに従って実施する。
(A)プラスミドDNAなし:
(B)pHB14−1およびpSR/M2−1の同時トランスフェクション。
HPLC:BioCAD 700E(Applied Biosystems)
カラム:プロテインG−IDセンサーカートリッジ(カラムサイズ:2.1mmID×30mmLD、ベッド容積:0.1ml;Cat# 2−1002−00,Applied Biosystems)
溶出緩衝液:0.1Mグリシン−HCl(pH2.5)
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)
検出:280nm
流速;1ml/分
フラクションサイズ:0.5ml/0.5分
フラクションチューブ:1.5mlポリプロピレンマイクロチューブ
温度:4℃。
Jurkat細胞(ATCC No.TIB−152)を使用して、精製したヒト化TRA−8抗体のアポトーシス誘導活性を試験した。
生存度(%)=100×(a−b)/(c−b)
(ここで、「a」は試験ウェルの測定値であり、「b」は細胞のないウェルの測定値であり、そして「c」は抗体を添加しないウェルの測定値である)。
種々のDR5分子に対するTRA−8の反応性を決定するために、TRA−8の反応性を、以下の通り、活性化リンパ球を用いて試験する。
TRA−8の漸増用量予備的毒性研究を、オス1匹およびメス1匹のマーモセットを用いて実施する。3セットの単回静脈内用量(7日間の中断期間により分離される)を実施する。TRA−8の用量を、50,250および1250μg/匹に設定する。各々の処理の48時間後、血液を大腿静脈から回収し、血漿を調製する。血漿アスパルテートアミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの活性を、アナライザー(Fuji DRI−CHEM:FUJI Film Medical Co.,Ltd.)を用いて測定する。全ての血液を、いかなる麻酔も行わずに採取する。結果として、各々の処理の後に、血漿生化学試験において、肝損傷を示す証拠は見られない。
TRA−8が抗癌治療において治療効果を有するか否かを決定するために、種々の癌細胞株を用いてTRA−8のインビトロ殺傷活性を、以下の通りに試験する。
生存度(%)=100×(a−b)/(c−b)
(ここで、「a」は試験ウェルの測定値であり、「b」は細胞のないウェルの測定値であり、そして「c」は抗体を添加しないウェルの測定値である)。
ヒト前立腺癌細胞株PC−3を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、そして10%ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone);1%L−グルタミン−200mM(25030−149、Gibco BRL)および0.5%ペニシリンストレプトマイシン溶液(P−7539、Sigma)を含有するF−12K栄養混合物(21127−022、Gibco−BRL)中で維持する。10% FBSおよび0.5%ペニシリンストレプトマイシン溶液を補充したRPMI1640培地(MED−008、IWAKI)を、以下の実験に使用する。指数関数的に増殖するPC−3細胞をトリプシン処理(trypsinization)により回収し、そして新鮮な培地で2度洗浄する。次いで、この細胞を計数し、新鮮な培地に5×104細胞/mlの密度で再懸濁し、そして実験開始の1日前に総量100μl/ウェルで、平底96ウェルプレート(3598、Coming−Coster)に三連に分配する。ジメチルスルホキシドに溶解させた代表的な抗癌薬であるパクリタキセル(169−18611、Wako)(10mg/ml)を新鮮な培地中で希釈し、次いで、50μl/ウェルの細胞を含む96ウェルプレートに添加する。ジメチルスルホキシドの終濃度は、0.1%未満である。37℃、5% CO2雰囲気中で24時間インキュベートした後、新鮮な培地に希釈したTRA−8をこれらのウェルに添加する。さらに24時間インキュベートした後、1mg/mlのXTTおよび25mMのPMSを含有する50μlの最小必須培地(11095−098、Gibco−BRL)をこれらのウェルに添加し、そしてこのプレートを6時間インキュベートする。次いで、SPECTRA MAX250(Molecular Devices)によってOD450を測定し、細胞生存度を以下に従い算出する。
(1)ヒト化抗体の設計
CDRグラフトとして一般的に知られている方法によって、TRA−8のヒト化版の構築を実施する。mAB58’CL抗体を、参照実施例2に記載されるようにアクセプターとして使用し、そしてTRA−8抗体のCDR領域を、このアクセプターにグラフトする。フレームワーク領域において、いくつかのアミノ酸を、Queenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033,(1989))によって提供された基準によって、TRA−8またはヒトコンセンサス配列のいずれかからアクセプターにグラフトし、そしてヒト化TRA−8配列を、本明細書中以降に記載されるようにして構築する。
配列表の配列番号56に示されるように、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の重鎖のアミノ酸配列のH1型ヒト化は、3番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(リジン)、19番目のアミノ酸(リジン)、40番目のアミノ酸(スレオニン)、42番目のアミノ酸(グルタミン酸)、44番目のアミノ酸(アルギニン)、84番目のアミノ酸(セリン)、88番目のアミノ酸(セリン)、93番目のアミノ酸(メチオニン)、114番目のアミノ酸(スレオニン)、115番目のアミノ酸(ロイシン)の、それぞれ、グルタミン、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシン、およびバリンとの置換を伴った。
オリゴヌクレオチドA、10pmol;
オリゴヌクレオチドB2、10pmol;
オリゴヌクレオチドC、10pmol;
オリゴヌクレオチドD、10pmol;
オリゴヌクレオチドE、10pmol;
オリゴヌクレオチドF、10pmol;
オリゴヌクレオチドG、10pmol;
オリゴヌクレオチドH2、10pmol;
オリゴヌクレオチドI、10pmol;
オリゴヌクレオチドJ、10pmol;
オリゴヌクレオチドK、10pmol;
オリゴヌクレオチドL、10pmol;
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM;
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM;
10×Pyrobest緩衝液II、10μl;
dNTPミックス、8μl;
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容量50μlまでの再蒸留水。
オリゴヌクレオチドA、10pmol;
オリゴヌクレオチドB、10pmol;
オリゴヌクレオチドC、10pmol;
オリゴヌクレオチドD、10pmol;
オリゴヌクレオチドE2、10pmol;
オリゴヌクレオチドF、10pmol;
オリゴヌクレオチドG、10pmol;
オリゴヌクレオチドH、10pmol;
オリゴヌクレオチドI、10pmol;
オリゴヌクレオチドJ、10pmol;
オリゴヌクレオチドK2、10pmol;
オリゴヌクレオチドL、10pmol;
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM;
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM;
10×Pyrobest緩衝液II、10μl;
dNTPミックス、8μl;
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容量50μlまでの再蒸留水。
オリゴヌクレオチドA、10pmol;
オリゴヌクレオチドB、10pmol;
オリゴヌクレオチドC2、10pmol;
オリゴヌクレオチドD、10pmol;
オリゴヌクレオチドE2、10pmol;
オリゴヌクレオチドF、10pmol;
オリゴヌクレオチドG、10pmol;
オリゴヌクレオチドH、10pmol;
オリゴヌクレオチドI2、10pmol;
オリゴヌクレオチドJ、10pmol;
オリゴヌクレオチドK2、10pmol;
オリゴヌクレオチドL、10pmol;
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM;
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM;
10×Pyrobest緩衝液II、10μl;
dNTPミックス、8μl;
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容量50μlまでの再蒸留水。
オリゴヌクレオチドA、10pmol;
オリゴヌクレオチドB3、10pmol;
オリゴヌクレオチドC2、10pmol;
オリゴヌクレオチドD、10pmol;
オリゴヌクレオチドE3、10pmol;
オリゴヌクレオチドF2、10pmol;
オリゴヌクレオチドG、10pmol;
オリゴヌクレオチドH3、10pmol;
オリゴヌクレオチドI2、10pmol;
オリゴヌクレオチドJ、10pmol;
オリゴヌクレオチドK3、10pmol;
オリゴヌクレオチドL2、10pmol;
オリゴヌクレオチドプライマーP1、2μM;
オリゴヌクレオチドプライマーP2、2μM;
10×Pyrobest緩衝液II、10μl;
dNTPミックス、8μl;
Pyrobest DNAポリメラーゼ、0.5μl;および
最終容量50μlまでの再蒸留水。
PCR反応から回収したDNAフラグメント(H1、H3、H4またはM)、5μl;
10×Taqポリメラーゼ緩衝液、1μl;
dNTP混合物、1μl;
Taqポリメラーゼ(5単位/ml)、1μl;および
10μlの最終容量までの再蒸留水。
動物細胞についての組換え発現ベクターを、H1型、H3型およびH4型のヒト化TRA−8の重鎖またはM型のキメラTRA−8(上記でクローニングした)の重鎖をコードするDNAを挿入することによって、以下のように構築する。
(4.1)ヒト化抗体(LM1タイプ)の軽鎖のための発現ベクターの構築
配列表の配列番号72に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端からの3番目のアミノ酸(バリン)、8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(トレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、60番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、63番目のアミノ酸(トレオニン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、87番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、および99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)および108番目のアミノ酸(アラニン)の置換を伴ったマウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化(LM1タイプ)は、それぞれ、グルタミン、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、トレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、グルタミン、バリン、およびトレオニンと置換される。得られた配列は、LM1と称する。
LM1ポリペプチド鎖(配列表の配列番号72)をコードするDNA(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖(LM1タイプ)の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合である)は、それぞれ、PCRの組み合わせを用いることにより合成する。
配列表の配列番号72に規定されたようなアミノ酸配列をコードするLM1−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することによって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてE.coliにクローニングする。
分泌シグナル配列、および5’末端にHindIII制限酵素切断部位を付加したFRL1領域の一部をコードするLM1−F1−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミドpHSGHM17およびpSRPDHHを欧州特許出願EP 0 909 816 A1の記載に従うことにより得る。
プラスミドpHSGHM17 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKSPR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(PerkinElmer)、2.5単位。
プラスミドpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDF22、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKCDR22、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーHKCF12、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記LM1−F1−DNAフラグメント、LM1−F2−DNAフラグメント、LM1−F3−DNAフラグメント、およびLM1−F4−DNAフラグメントが融合されたLM1−DNAを、以下の条件下で調製する。
第一のPCR工程で調製したLM1−F1−DNAのゲルフラグメント、
第一のPCR工程で調製したLM1−F2−DNAのゲルフラグメント、
第一のPCR工程で調製したLM1−F3−DNAのゲルフラグメント、
第一のPCR工程で調製したLM1−F4−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
ヒト化LM1 TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIgκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有する得られたプラスミドpHSG/M1−2−を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化する。
配列表の配列番号73に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端からの8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン),10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン),13番目のアミノ酸(トレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、87番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)、および108番目のアミノ酸(アラニン)の置換を伴った、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化(LM3タイプ)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、トレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、グルタミン、バリン、およびトレオニンと置換される。得られた配列を、LM−3と称する。
LM3ポリペプチド鎖(配列表の配列番号73)をコードするDNA(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域およびヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域の融合である)を、それぞれ、PCRの組み合わせを用いて合成する。
配列表の配列番号73に規定されたようなアミノ酸配列をコードするLM3−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することにより調製し、プラスミドベクタ^中に挿入し、E.coliにクローニングする。
5’末端にHindIII制限酵素切断部位を付加した分泌シグナル配列領域、FRL1、CDRL1、FRL2、およびCDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4、および定常領域の一部をコードするLM3−F31B−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F5、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F6、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R6、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R7、5pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーLR17、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記LM3−F31B−DNAフラグメントとLM3−F31C−DNAフラグメントとが融合されている、LM3−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程PCRにおいて調製されたLM3−F31B−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM3−F31C−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN(50pmol)、
dNTPカクテル(5.0μl)、
10×PCR緩衝液(5.0μl)、
ampliTaq DNAポリメラーゼ(2.5単位)。
ヒト化LM3 TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られたプラスミドpHSG/M3−3−22を、制限酵素Hind IIIおよびEcoR Iを用いて消化する。
配列表の配列番号74に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、85番目のアミノ酸(アスパラギン酸)、99番目のアミノ酸(グリシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)、および108番目のアミノ酸(アラニン)の置換を伴う、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸の他のヒト化(LM4型)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン、バリン、およびスレオニンで置換する。得られる配列を、LM4と名付ける。
LM4ポリペプチド鎖(配列表の配列番号74)(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合物である)をコードするDNAを、PCRの組み合わせを使用することによって、それぞれ合成する。
5’−ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc−3’(MOD1F62;配列番号92)
5’−cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag−3’(MOD1R62;配列番号93)。
配列表の配列番号74に規定されるようなアミノ酸配列をコードするLM4−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することによって調製し、プラスミドベクター中に挿入し、そしてE.coli中にクローン化する。
5’末端にHindIII制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列領域と、FRL1と、CDRL1と、FRL2と、CDRL2と、FRL3と、CDRL3と、FRL4と、上記定常領域の一部とをコードする、LM4−F41B−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F5(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F62(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R62(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R7(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーLR17(50pmol)、
dNTPカクテル(5μl)、
10×PCR緩衝液(5μl)、
ampliTaq DNAポリメラーゼ(2.5単位)。
プラスミドpSRPDHH DNA(25ng)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN(50pmol)、
dNTPカクテル(5μl)、
10×PCR緩衝液(5μl)、
ampliTaq DNAポリメラーゼ(2.5単位)。
上記LM4−F41B−DNAフラグメントとLM4−F41C−DNAフラグメントとが融合されている、LM4−DNAを、以下の条件下で調製する。
第1工程PCRにおいて調製されたLM4−F41B−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM4−F41C−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN(50pmol)、
dNTPカクテル(5.0μl)、
10×PCR緩衝液(5.0μl)、
ampliTaq DNAポリメラーゼ(2.5単位)。
ヒト化LM4 TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られたプラスミドpHSG/M4−5−3−1を、制限酵素Hind IIIおよびEcoR Iを用いて消化する。
配列表の配列番号75に示されるように、TRA−8軽鎖のアミノ酸配列のN末端から8番目のアミノ酸(ヒスチジン)、9番目のアミノ酸(リジン)、10番目のアミノ酸(フェニルアラニン)、11番目のアミノ酸(メチオニン)、13番目のアミノ酸(スレオニン)、20番目のアミノ酸(セリン)、42番目のアミノ酸(グルタミン)、43番目のアミノ酸(セリン)、77番目のアミノ酸(アスパラギン)、78番目のアミノ酸(バリン)、80番目のアミノ酸(セリン)、83番目のアミノ酸(ロイシン)、103番目のアミノ酸(ロイシン)、および108番目のアミノ酸(アラニン)の置換を伴う、マウス抗ヒトDR5抗体TRA−8の軽鎖のアミノ酸の他のヒト化(LM5型)は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、バリン、およびスレオニンで置換する。得られる配列を、LM5と名付ける。
LM5ポリペプチド鎖(配列表の配列番号75)(その各々は、ヒト化抗DR5抗体TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合物である)をコードするDNAを、PCRの組み合わせを使用することによって、それぞれ合成する。
5’−gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat−3’(MOD1F52;配列番号94)
5’−ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc−3’(MOD1F63;配列番号95)
5’−cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag−3’(MOD1R63;配列番号96)
5’−gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa−3’(MOD1R72;配列番号102)。
配列表の配列番号75に規定されるようなアミノ酸配列をコードするLM5−DNAフラグメントを、2工程PCRを実施することによって調製し、プラスミドベクター中に挿入し、そしてE.coli中にクローン化する。
5’末端にHindIII制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列領域と、FRL1と、CDRL1と、FRL2と、CDRL2と、FRL3と、CDRL3と、FRL4と、上記定常領域の一部とをコードする、LM5−F51B−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F1(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R1(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F22(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R22(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F3(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R3(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F42(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R4(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F52(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R52(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F63(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R63(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1R72(5pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P(50pmol)、
オリゴヌクレオチドプライマーLR17(50pmol)、
dNTPカクテル(5μl)、
10×PCR緩衝液(5μl)、
ampliTaq DNAポリメラーゼ(2.5単位)。
反応溶液の組成:
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMOD1F7、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM5−F51B−DNAフラグメントとLM5−F51C−DNAフラグメントとが融合されているLM5−DNAを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成:
第1工程PCRにおいて調製されたLM5−F51B−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM5−F51C−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
ヒト化LM5 TRA−8軽鎖の可変領域とヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られるプラスミドpHSG/M5−3−27を、制限酵素Hind IIIおよびEcoR Iで消化する。
配列表の配列番号76に示される配列(キメラ型TRA−8の軽鎖のアミノ酸配列)を、LM6と称する。
LM6ポリペプチド鎖(配列表の配列番号75)(これらの各々は、マウス抗DR5抗体TRA−8軽鎖(LM6型)の可変領域とヒトIg軽鎖(κ鎖)の定常領域との融合体である)をコードするDNAを、PCRの組み合わせを用いることによってそれぞれ合成する。
配列表の配列番号75に規定されるアミノ酸配列をコードするLM6−DNAフラグメントを、2段階PCRを行うことによって調製し、プラスミドベクターに挿入し、そしてE.coli中にクローニングする。
5’末端に付加されたHind III制限酵素切断部位を有し、分泌シグナル配列およびFRL1領域の一部分をコードするLM6−F1−DNAフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミドpHSGHM17およびpSRPDHHを、欧州特許出願EP 0 909 816 A1における記載に従って入手する。
反応溶液の組成:
プラスミドpHSGHM17 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーHKSPR13、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ(PerkinElmer)、2.5単位。
反応溶液の組成:
プラスミドpL28 DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMVF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマーMVR12、50pmol
dNTPカクテル、5μl
10×PCR緩衝液、5μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
反応溶液の組成:
プラスミドpSRPDHH DNA、25ng
オリゴヌクレオチドプライマーMCF11、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5μ1
10×PCR緩衝液、5μ1
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
上記のLM6−F1−DNAフラグメントと、LM6−F2−DNAフラグメントと、LM6−F3−DNAフラグメントとが融合されているLM6−DNAを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成:
第1工程PCRにおいて調製されたLM6−F1−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM6−F2−DNAのゲルフラグメント、
第1工程PCRにおいて調製されたLM6−F3−DNAのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー7AL1P、50pmol
オリゴヌクレオチドプライマー7ALCN、50pmol
dNTPカクテル、5.0μl
10×PCR緩衝液、5.0μl
ampliTaq DNAポリメラーゼ、2.5単位。
マウスTRA−8軽鎖の可変領域と、ヒトIgκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する得られたプラスミドpHSG/LM6−1−4−1を、制限酵素Hind IIIおよびEcoR Iで消化する。
COS−7細胞のトランスフェクションを、FUGENE6トランスフェクション試薬法(Boehringer Mannheim Biochemica)によって、このキットに提供される指示マニュアルに従って行う。
(A):pHA15−1およびpSR/LM1−2(H1L1)の共トランスフェクション
(B):pHB14−1およびpSR/M2−1(H2L2)の共トランスフェクション
(C):pHB14−1およびpSR/LM3−3−44−10(H2L3)の共トランスフェクション
(D):pHB14−1およびpSR/LM4−5−3−3(H2L4)の共トランスフェクション
(E):pHC10−3およびpSR/M2−1(H3L2)の共トランスフェクション
(F):pHC10−3およびpSR/LM3−3−44−10(H3L3)の共トランスフェクション
(G):pHC10−3およびpSR/LM4−5−3−3(H3L4)の共トランスフェクション
(H):pHD21−1およびpSR/LM5−3−27−1(H4L5)の共トランスフェクション
(I):pM11−1およびpSR/LM6−1−4−6(キメラ)の共トランスフェクション。
HPLC系:BioCAD 700E(Applied Biosystems)
カラム:ProteinG−IDセンサーカートリッジ(カラムサイズ:2.1mmID×30mmLD、ベッド容積:0.1ml;Applied Biosystems)
溶出緩衝液:0.1Mグリシン−HCl(pH2.5)
中和緩衝液:1M Tris−HCl(pH8.5)
検出:280nm
流速:1ml/分
画分サイズ:0.5ml/0.5分
画分チューブ:1.5mlポリプロピレンマイクロチューブ
温度:4℃。
Jurkat細胞(ATCC番号TIB−152)を使用して、精製ヒト化TRA−8抗体のアポトーシス誘導活性を調べた。
生存能力(%)=100×(a−b)/(c−b)
ここで、「a」は、試験ウェルの測定値であり、「b」は、細胞の無いウェルの測定値であり、そして「c」は、抗体を添加しないウェルの測定値である。
結果として、試験されたヒト化抗体は、ヒトDR5抗原を発現するヒト前立腺癌細胞におけるアポトーシスを誘導することが実証される。
ヒトDR4の細胞外ドメイン(a.a.1−236)およびヒトIgG1のFc部分を含む融合タンパク質を、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトしたCos−7細胞において発現させた。融合タンパク質を、プロテインAアフィニティーカラムによって精製する。Balb/cマウスを、上記精製融合タンパク質で免疫した。1つのハイブリドーマクローン(2E12(IgG1,κ))(DR4に対する特異的結合およびRamosヒトBリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する)を3回、サブクローン化した。2E12の結合特異性は、コントロール抗原としてヒトDR5、DcR1およびDcR2およびIgG1融合タンパク質を使用するELISAおよびウェスタンブロット分析によって決定した。細胞表面DR4に対する2E12の結合を、ヒトDR4をコードする全長cDNAでトランスフェクトされたCos−7細胞のフローサイトメトリー分析によって決定した。アポトーシス誘導活性を、ヤギ抗マウスIgG1の存在下で、1μg/ml 2E12とともにRamos細胞をインキュベートすることによって決定した。細胞生存能力を、上記のATPLiteアッセイによって決定した。
DR4モノクローナル抗体(2E12)は、ELISAにおいて他のTRAILレセプター(例えば、DR5、DcR1およびDcR2)に結合しなかった(図19a)ので、ヒトDR4に特異的である。2E12は、DR4トランスフェクトCos−7細胞のフローサイトメトリー分析によって実証されるように、細胞表面DR4を認識した(図19b)。2E12は、用量依存性様式で架橋する二次抗体の存在下で、Ramosリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導し得る(図19c)。2E12でのRamos細胞のインビトロ処理は、カスパーゼ8、9および3の時間依存性活性化、ならびにPARPの切断を生じた(図19d)。これらの結果は、2E12が、アゴニスト性抗DR4抗体であることを示し、これは、カスパーゼ依存性様式でアポトーシスを誘導する。
2E12の殺腫瘍活性を、乳癌腫瘍モデルを使用して試験した。ヌードマウスに、s.c.で、ヒト乳癌細胞株(2LMP)を接種した。200μgの2E12のi.p.用量での処置を、腫瘍細胞注射の7日後、10日後、14日後、17日後、21日後、および24日後に行った。動物に、8日目、12日目、および16日目に、i.v.アドリアマイシン(ドキソルビシン)(6mg/kg)を、受容させた。2E12およびアドリアマイシンでの処置(図20)は、2E12単独またはアドリアマイシン単独のいずれよりも大きな腫瘍増殖阻害を生成した。
((1)細胞株および試薬)
ヒト乳癌細胞株MDA−MB−231の2LMPサブクローン、MDA−MB−435のLCC6サブクローン、およびMDA−MB−361のDY36T2サブクローンを、Dr.Marc Lipmann(Georgetown University,Washington,D.C.)から得、そして10%FBS(Hyclone、Logan,UT)を補充した改善MEMにおいて維持した。MDA−MB−231、MDA−MB−453、MDA−MB−468、BT−474、SK−BR−3、およびZR−75−1のヒト乳癌細胞株を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から得た。MDA−MB−231細胞、MDA−MB−453細胞、およびMDA−MB−468細胞を、MEMビタミン、MEM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSを補充したDMEM中で増殖させた。BT−474細胞を、10μgのインシュリン、4.5g/lのグルコース、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSを補充したRPMI1640中で増殖させた。SK−BR−3細胞を、15%FBSを有するMcCoyの培地で増殖させた。ZR−75−1細胞を、20%FBSを有するHamのF12K培地で増殖させた。全ての細胞株を、抗生物質を含まない培地において、37℃で5%のCO2雰囲気下で維持し、そしてマイコプラズマ混入について慣用的にスクリーニングした。
指数関数増殖期の細胞を、DulbeccoのPBS(Ca2+およびMg2+欠乏)で一回洗浄し、そして37℃で、4mM EDTA/0.5%KClを用いて収集した。細胞を、4℃で5分間、1,000rpmで遠心分離によって収集し、一回洗浄し、そして4℃で1%BSAおよび0.01%アジ化ナトリウム(FACS緩衝液)を含むPBS中で再懸濁させた。細胞を、10μg/mlの精製TRA−8またはアイソタイプ特異的IgG1コントロール抗体とともに、60分間、4℃でインキュベートし、緩衝液で一回洗浄し、次いで、10μg/mlのPE結合ヤギ抗マウスIgG1とともに、20分間、4℃でインキュベートした。抗体染色後、細胞を一回、FACS緩衝液で洗浄し、そして1%パラホルムアルデヒドで15分間、氷上で固定した。サンプルを、Becton Dickinson FACScan(San Jose,CA)において分析し、そしてデータをCellQuestソフトウェアを使用して分析した。
細胞をトリプシン処理し、そして完全培養培地において再懸濁させた。ウェル当たり1000個の細胞を、光学的に透明な96ウェルの黒色プレート(Costar #3904、Corning,NY)にプレートし、そして処置を開始する前に37℃で一晩インキュベートした。薬物および抗体を、使用の直前に培養培地において希釈し、そしてDMSOの最終濃度は、常に、0.001%以下であった。細胞生存能力を、TRA−8単独への暴露の24時間後に評価した。細胞傷害性薬物との組み合わせ処置のため、細胞を、抗体を添加する24時間前にこの薬物で前処理し、そしてATPLiteルミネセンスベースのアッセイ(Packard Instruments,Meriden,CT)を使用する、細胞ATPレベルの測定によって、細胞生存能力を評価する前にさらに24時間インキュベートした。全ての反応容量(培養培地および試薬)を半分に減少させたことを除いて、製造業者の推奨するプロトコルに従った。全てのサンプルを三連でアッセイし、3つの独立した実験の最小値からの平均±SEとして報告する。
無胸腺ヌードマウスに、s.c.で3×107 2LMP細胞を注射した。腫瘍細胞注射の7日後に、200または600μg(10または30mg/kg)のTRA−8を、i.p.で投与し、続いて、10日目、14日目、17日目、21日目、および24日目にさらに5回注射した。腫瘍の増殖を、経時的にモニターした。引き続く実験において、2LMP s.c.腫瘍を保有する動物に、i.p.で200μgのTRA−8を、7日目、10日目、14日目、17日目、21日目、および24日目に、単独で、またはアドリアマイシン(6mg/kg i.v.、8日目、12日目および16日目)もしくはパクリタキセル(20mg/kg i.p.、8日目、12日目、16日目、20日目および24日目)とともに注射した。腫瘍サイズおよび退縮速度を決定した。さらに、9日目および17日目に、2LMP異種移植片の3Gy60Co照射とともに、上記と同じレジメンを使用して、TRA−8およびアドリアマイシンを用いて研究を実施した。
3×107個の2LMP細胞を皮下注射した(0日目)胸腺欠損ヌードマウスに、7日目および10日目にTRA−8(100μg)を腹腔投与した。8日目および11日目にアドリアマイシン(3mg/kg)、8日目および11日目にパクリタキセル(10mg/kg)またはTRA−8とアドリアマイシンの併用もしくはTRA−8とパクリタキセルの併用を、同じ用量およびスケジュールで、各2匹のマウス群に与えた。マウスの1つの群は未処置である。異種移植片を、腫瘍細胞注入の14日後に、アポトーシスの研究のために解剖した。本発明者らの標準的な処置プロトコルと比較して処置強度が実質的に減少した理由は、腫瘍組織を14日目の分析に適合させたことであった。腫瘍異種移植片におけるアポトーシスについてのTunelアッセイを、以下の通り実施した。5ミクロンのパラフィン組織切片を、Superfrost/Plusスライドにマウントし、58℃で1時間加温した。組織切片を、キシレンを3回交換して脱パラフィンし、そして無水エタノール、95%エタノール、および70%エタノールの1回交換(各々5分間)によって再水和した。次いで、これらの切片を、Tris緩衝化生理食塩水(0.5M Tris塩基、0.15M NaCl、0.0002% Triton X−100、pH 7.6)中に入れた。アポトーシスの核を、Apop Tag Peroxidaseキット(Intergen,Purchase,NY)を用いて検出した。Proteinase K(蒸留した脱イオンH2O中、20μg/ml)を組織標本に添加し、15分間室温でインキュベートした。内因性ペルオキシダーゼを、過酸化水素の3%水溶液を用いて5分間クエンチした。切片を、平衡緩衝液を用いて30分間処理し、次いでTdT/酵素(標識反応混合物に希釈した)とともに、パラフィンカバーを用いて37℃で1時間インキュベートした。このインキュベーションの間、TdT酵素は、DNAフラグメントの3’−OH末端に結合し、そしてジゴキシゲニン標識化デオキシヌクレオチド、およびジゴキシゲニン非標識化デオキシヌクレオチドの付加を触媒する。ネガティブコントロールを、TdT酵素の代わりに、蒸留H2O(標識反応混合物中に希釈した)とともにインキュベートした。標識反応を終結させるために、停止緩衝液を室温で10分間添加した。抗ジゴキシゲニン結合体を30分間、各スライドに添加した。クロマジェン(chromagen)3,3’DABを使用して、DNAフラグメントの標識した3’OH末端を視覚化した。次いで、これらのスライドを脱イオン水中でリンスし、ヘマトキシリンで軽く対比染色し、段階的なアルコール(graded alcohol)およびキシレンを用いて脱水し、Permountを用いてカバースリップで覆った。組織全体にわたって、約10のランダム視野を、染色されたTunelの割合、および強く染色されたアポトーシス小体の割合について評価した。
((A)インビトロでの薬物細胞傷害性とTRA−8との相互作用の分析)
細胞傷害性データを、併用細胞傷害性効果が追加的であるか、追加的より少ない(拮抗的)か、または追加的より多い(相乗作用的)かを評価した。薬剤単独および併用についての用量応答関係を、Gennings(On Testing for Drug/Chemical Interactions:Definitions and Inference,第457−468頁,2000)によって推奨されるように、9つの細胞株(Montgomery,D.C.Design and Analysis of Experiments,New York:Wiley,2001)の各々について線形、二次、および交互作用項(interaction term)で、二次反応表面モデル(second−order response surface model)を用いてモデル化した。有意な交互作用項を、交互作用項が、追加的な細胞傷害性より大きくて陰性か、または追加的より小さい細胞傷害性で陽性か否かに依存して、相乗作用的または拮抗的のいずれかとして分類した。交互作用項が有意でない場合、追加的な項が有意であることを条件としてTRA−8とアドリアマイシンまたはTRA−8とパクリタキセルとの間の関係は追加的であるとみなした。
6個の独立した実験からのデータを、個々の実験によって分析した。処置の組み合わせを、3つのエンドポイント;腫瘍倍化時間の延長、腫瘍後退の割合、および経時的な増殖率、として測定したインビボの抗腫瘍効力(すわなち、腫瘍増殖の阻害)に関して比較した。腫瘍細胞の注入7日後のベースラインと比べて、表面積(2つの直径の積)において腫瘍が倍化した実際の日数を、倍化時間分析において使用した。ノンパラメトリックのクラスカルワリス検定を、処置間の腫瘍倍化時間中央値の比較に使用した。フィッシャーの直接確率検定を用いて、処置群の腫瘍後退および再発のない後退の割合を比較した。どのような併用治療が腫瘍増殖の有意な相乗作用的阻害(すなわち、追加的より大きい)を生成したかを決定するために、連続する面積測定からの増殖曲線を、治療開始から最初の3週間にわたって線形混合モデルアプローチ(linear mixed model approach)を用いて比較した(Lindsey,J.K.Models for Repeated Measurements,第100−142頁,Oxford,1993)。併用治療の相乗作用的効果を試験するために、交互作用項をモデルに含めた。この交互作用項が重要であり、かつ効果が追加的より大きな速度での増殖阻害であった場合、相互作用は相乗作用的であるとみなされた。
合計166匹の動物(10匹の処置群、および6匹の独立した実験)を、集計的分析に含めた。処置の組み合わせを、インビボでの抗腫瘍効力に関して比較した。処置群にわたって、腫瘍倍化時間の中央値を、クラスカルワリス検定を用いて分析し、そしてフィッシャーの直接確率検定を用いて、腫瘍の後退および再発のない腫瘍の割合を比較した。
図22Aにおいて示されるように、全9つの胸部癌細胞株は、強陽性(LCC6およびMDA−MB−453)から弱陽性(MDA−MB−468およびSK−BR−3)の発現の多様な程度を有するDR5陽性であった。図22Bは、9つの細胞株のTRA−8誘導性細胞傷害性を示す。4つの細胞株(LCC6、2LMP、MDA−MB−231、MDA−MB−468)が、17〜299ng/mlのIC50濃度でTRA−8誘導性細胞傷害性に感受性であったが、一方他の細胞株(DY36T2、BT−474、MDA−MB−453)は非常に耐性であった。細胞株MDA−MB−453およびMDA−MB−468によって示されるように、DR5発現とTRA−8誘導性細胞傷害性の程度には良好な相関は存在しなかった。
b TRA−8の効果が有意でなかったが、アドリアマイシン/パクリタキセルの効果が有意であったので決定しなかった。
c どちらの薬剤についても有意な用量応答は存在しなかった。
200μgおよび600μgの用量で、週2回、6回投与のTRA−8は、十分に確立した2LMP皮下腫瘍に対する腫瘍増殖の類似した阻害を生じた(図24)。さらなる3つの独立した実験において、200μg用量/スケジュールは、未処置コントロールと比べて統計学的に有意な腫瘍増殖の阻害(p<0.004、腫瘍倍化時間に関するクラスカルワリス検定)を生じ、この用量およびスケジュールをさらなる研究のために選択した。図25は、抗腫瘍効力に対するTRA−8、アドリアマイシンまたはTRA−8とアドリアマイシンの併用の効果を示す。未処置のコントロールと比較した場合、TRA−8単独またはTRA−8+アドリアマイシンを用いた治療は、腫瘍増殖の有意な阻害を生じた(p=0.002 クラスカルワリス検定)が、一方、アドリアマイシンは、コントロールと差異はなかった。TRA−8+アドリアマイシンの併用は、どちらかの薬剤単独よりもより大きな増殖阻害を生じ(p=0.002)、そしてどちらかの薬剤単独(完全な後退は見とめられなかった)よりも腫瘍(4つ)のより完全な、有意な後退を生じた(p<0.001、フィッシャーの直接確率検定)。インビボでのTRA−8およびアドリアマイシンの相乗作用を、初期増殖曲線分析を用いて評価した。交互作用項は有意であり、(p<0.001)、かつ相乗作用的であった。この相乗作用的な相互作用を、第二の独立した実験において確認した。
インビボ抗腫瘍研究には166匹の動物を含め、そして各処置群における全ての動物について腫瘍倍化時間および完全腫瘍後退の頻度を分析した(表6)。平均腫瘍倍化時間についてのANOVA分析により、多数の比較で処置群間の有意な差異(p<0.001)を示し、これは、TRA−8+パクリタキセル、TRA−8+アドリアマイシンおよびTRA−8+アドリアマイシン+60Coが、TRA−8を欠く全ての処置群よりも有意に長い平均腫瘍倍化時間を有することが明らかとなった。すべての処置形式に対するTRA−8の添加は、単独形式よりもより長い腫瘍倍化時間を生じた。同様に、腫瘍倍化についての時間の中央値に関するクラスカルワリス検定により、中央値が、全体で有意に異なった(p<0.001)ことが明らかになった。ウィルコクスンサインランク検定(Wilcoxin signed−rank test)を用いたペアワイズ比較は、ANOVA多数比較としての腫瘍倍化時間についての時間中央値に対して類似のパターンを生じた。この分析は、実験最終日に割り当てられた実験の終わりまでに腫瘍の倍化を達成しなかった群において、最も有効な処置によって生じる増殖阻害を過小評価する。表6はまた、腫瘍の完全な後退の頻度および実験終了までの腫瘍持続性頻度を提供する。化学療法レジメンあるいは放射線のいずれかで処置した動物において、認められる腫瘍の完全な後退は存在せず、十分に確立した腫瘍増殖および腫瘍攻撃性を証明した。フィッシャーの直接確率検定から、処置群間の腫瘍の完全な後退の頻度における有意な差は存在しなかった(p<0.001)。166匹の動物のうち30匹は完全な後退を達成し、そしてこれらのうちの28匹にTRA−8単独または他の形式との併用を与えた。1/42のコントロール動物:化学療法、放射線もしくは併用を受けた1/54の動物;そしてTRA−8単独もしくはTRA−8併用レジメンの28/68において完全な後退が生じた。TRA−8処置群は、完全な後退の有意に大きな頻度(p<0.001)を有した。同様に、TRA−8もしくはTRA−8の併用を受けた14/68の動物は、1/42のコントロールならびに化学療法および/または放射線を用いて処置した0/52の動物と比べて腫瘍の再増殖を有さなかった。再発のない後退は、99〜171日(146±24日)の観察期間を有した。
TRA−8、アドリアマイシン、パクリタキセル、TRA−8+アドリアマイシン、およびTRA−8+パクリタキセルを用いて処置した後、TUNEL技術を用いて、2LMP異種移植片におけるアポトーシスの誘導を評価した。未処置の動物では、腫瘍は4%の染色細胞(1%、強)を有し、一方アドリアマイシンもしくはパクリタキセルで処置した動物では、8%の染色細胞(6%、強)および7%の染色細胞(2%、強)を有した。TRA−8単独で処置した動物は、25%の染色細胞(15%、強)の著しいアポトーシスを有した。TRA−8+アドリアマイシンは、28%の染色細胞(22%、強)を有し、そしてTRA−8+パクリタキセルは、26%の染色細胞(12%、強)を有した。
(参考文献)
Claims (39)
- TRAILレセプターDR4に特異的に結合し、その可溶形態で、DR4を発現する癌細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する精製された抗体であって、ATCC受託番号PTA−3798を有するハイブリドーマ2E12によって生成された、抗体。
- 前記アポトーシス誘導活性が、抗体濃度30μg/ml未満で60%未満の標的細胞生存度により特徴付けられる、請求項1に記載の精製された抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の精製された抗体。
- 前記DR4がヒトDR4である、請求項1に記載の精製された抗体。
- ATCC受託番号PTA−3798を有するハイブリドーマ2E12によって生成されたモノクローナル抗体のヒト化された抗体。
- DR4を発現する癌細胞において選択的にアポトーシスを誘導するための組成物であって、請求項1に記載の抗体を包含する、組成物。
- DR4を発現する癌細胞において選択的にアポトーシスを誘導するための組成物であって、請求項5に記載の抗体を包含する、組成物。
- DR4を発現する癌細胞の増殖を阻害するための組成物であって、請求項1に記載の抗体を包含する、組成物。
- TRAILレセプターDR5に特異的に結合する第2の抗体をさらに包含し、該第2の抗体は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、請求項6、7または8に記載の組成物。
- 治療因子をさらに包含する、請求項6、7または8に記載の組成物。
- 前記治療因子が化学療法因子である、請求項10に記載の組成物。
- 前記治療因子が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド、6−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、請求項10に記載の組成物。
- 前記治療因子がドキソルビシンである、請求項10に記載の組成物。
- 前記治療因子がパクリタキセルである、請求項10に記載の組成物。
- 前記治療因子がメトトレキセートである、請求項10に記載の組成物。
- 治療因子をさらに包含する、請求項9に記載の組成物。
- 前記治療因子が化学療法因子である、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療因子が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド、6−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療因子がドキソルビシンである、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療因子がパクリタキセルである、請求項16に記載の組成物。
- 前記治療因子がメトトレキセートである、請求項16に記載の組成物。
- DR4を発現する癌細胞の増殖を阻害するための組成物であって、請求項5に記載の抗体を包含する、組成物。
- 治療量の請求項1に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
- 治療量の請求項5に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
- 癌を有する被験体を処置するための組成物であって、請求項1に記載の抗体を包含し、該抗体は、該被験体において癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する、組成物。
- TRAILレセプターDR5に特異的に結合する第2の抗体をさらに包含し、該第2の抗体は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、請求項25に記載の組成物。
- 治療因子をさらに包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記治療因子が化学療法因子である、請求項27に記載の組成物。
- 前記治療因子が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド、6−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、請求項27に記載の組成物。
- 前記治療因子がドキソルビシンである、請求項27に記載の組成物。
- 前記治療因子がメトトレキセートである、請求項27に記載の組成物。
- 治療因子をさらに包含する、請求項26に記載の組成物。
- 前記治療因子が化学療法因子である、請求項32に記載の組成物。
- 前記治療因子が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド、6−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、請求項32に記載の組成物。
- 前記治療因子がドキソルビシンである、請求項32に記載の組成物。
- 前記治療因子がパクリタキセルである、請求項32に記載の組成物。
- 前記治療因子がメトトレキセートである、請求項32に記載の組成物。
- 癌を有する被験体を処置するための組成物であって、請求項5に記載の抗体を包含し、該抗体は、該被験体において癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する、組成物。
- 請求項1または5に記載の抗体および使用のための指示を含むキット。
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