RO123115B1

RO123115B1 - Anticorp selectiv pentru un receptor cu afinitate pentru un ligand înrudit cu factorul de necroză tumorală, inductor al apoptozei

Info

Publication number: RO123115B1
Application number: ROA200400389A
Authority: RO
Inventors: Tong Zhou; Robert P. Kimberly; William J. Koopman; Albert F. Lobuglio; Donald J. Buchsbaum
Original assignee: Uab Research Foundation
Priority date: 2001-11-01
Filing date: 2002-11-01
Publication date: 2010-11-30
Also published as: ES2357225T3; JP4371814B2; EP1506011B1; PL373531A1; EP2287285A2; KR101004098B1; PL211755B1; CN100482276C; CO5580833A2; CN1655814A; IL161685A; CA2465040C; EP2287285A3; NZ532591A; NO338458B1; BR0213844A; KR20040070349A; JP2005509414A; RU2004116475A; EP1506011A2

Abstract

Invenţia se referă la un anticorp purificat, care se leagă în mod selectiv la un receptor DR4TRAIL şi care nu se leagă la DR5, DcR1 sau DcR2, în care respectivul anticorp, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei, in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4, în care activitatea de inducere a apoptozei in vitro este caracterizată prin viabilitatea celulelor ţintă mai mică de 50%, la concentraţii ale anticorpului de aproximativ 100 ng/ml, şi o compoziţie acceptabilă farmaceutic, utilizată pentru obţinerea unui medicament administrat în tratamentul cancerului sau al unei boli inflamatorii sau autoimune, prin inducerea selectivă a apoptozei şi inhibarea proliferării celulare.

Description

Prezenta invenție se referă la un anticorp capabil de legare specifică la un singur tip de receptor, al cărui ligand inductor de apoptoză (definit în cele ce urmează „TRAIL”) este înrudit cu factorul de necroză umorală (definit în cele ce urmează „TNF”), în deosebi, la un anticorp monoclonal care induce apoptoza in vivo și in vitro celulelor care exprimă acest singur tip de receptor și la terapia bazată pe acesta.

Este cunoscut faptul că TRAIL este un membru al familiei TNF de proteine, care include, de asemenea ,TNF-a și ligandul Fas (1). Aceste proteine sunt inductori eficienți ai apoptozei. Până acum au fost identificați cinci receptori pentru TRAIL, dintre care doi, DR4 (TRAIL-R1) și DR5 (TRAIL-R2) (2-7), sunt capabili de transducerea semnalului apoptozei, în timp ce ceilalți trei, DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) și osteoprotegerina (OPG) nu transduc semnalul apoptozei (8-12). Toți cei cinci receptori pentru TRAIL prezintă o omologie semnificativă a domeniilor lor de legare a ligandului extracelular. în mod similar, receptorului I pentru Fas și TNF (definit în cele ce urmează drept „TNFRI”), segmentele intracelulare ale ambilor receptori, DR4 și DR5, conțin un domeniu al morții și transduc un semnal al apoptozei de-a lungul unei căi care implică proteina domeniului morții Fas-asociată (definită în cele ce urmează drept„FADD”) și caspaza 8 (6,7). în plus față de transducerea semnalului apoptozei, receptorii DR4 și DR5 pot, de asemenea, activa o cale care implică NFkb (6,7).

S-a demonstrat că funcțiile biologice ale lui TRAIL includ capacitatea lui TRAIL de a induce, în mod selectiv, apoptoza celulelor tumorale transformate, celulele normale fiind relativ rezistente la apoptoza TRAIL-mediată (13-15). Această selectivitate sugerează că, în contrast cu ligandul Fas, administrarea de TRAIL este asociată cu niveluri foarte joase de toxicitate, așa cum s-a demonstrat prin administrarea sistemică de TRAIL într-un model animal, fără inducerea unei toxicități semnificative (13). în consecință, TRAIL a fost propus ca un agent eficient de inducere a apoptozei, ceea ce ar reprezenta un agent terapeutic convenabil pentru tratamentul cancerului și al altor boli asociate cu proliferarea anormală a celulelor. TRAIL a fost, de asemenea, propus pentru a fi un puternic agent inductor de apoptoză, care ar fi convenabil pentru tratamentul bolilor autoimune și inflamatorii. S-a demonstrat că apoptoza mediată de TRAIL este implicată în moartea celulară indusă prin activare a celulelor T, în acest fel funcționând ca un mecanism alternativ la ligandul Fas (16, 17). Apoptoza TRAIL-mediată poate funcționa, de asemenea, în inducerea apoptozei celulelor T și a altor celule inflamate (18) și joacă un rol în activitatea ucigașă a celulelor NK (19-21) și în funcționarea imuno-modulatoare a celulelor dendritice (22,23). Astfel, apoptoza TRAIL-mediată poate funcționa și în asigurarea și controlul imunității.

Sistemul receptorTRAIL este complex și include cel puțin doi receptori ai morții, DR4 și DR5, și cel puțin doi receptori neapoptotici, DcR1 și DcR2. Toți acești receptori nu numai că prezintă o înaltă omologie de secvență aminoacizi, dar manifestă, de asemenea, o afinitate de legare similară TRAIL (2-12). Abilitatea receptorilor DcR1 și DcR2 de a concura pentru legarea de TRAIL, fără inducerea apoptozei, sugerează că aceștia pot acționa ca receptori capcană, care blochează sau modulează activitatea ligandului TRAIL. De altfel, a fost raportat că celulele netransformate exprimă niveluri mai înalte de receptori capcană decât celulele transformate. Prin urmare, s-a presupus că modularea diferențiată a expresiei receptorilor morții și receptorilor capcană poate reprezenta un mecanism cheie de reglare, care să determine susceptibilitatea celulelor la apoptoză TRAIL-mediată, cauzată de lipsa de anticorpi specifici receptorilor (2).

Cu toate că expresia și funcția lui DR4 și DR5 a fost studiată în mod intens, progresul a fost împiedicat din lipsa anticorpilor monoclonali specifici receptorilor. Expresia de suprafață celulară a DR5 nu a fost documentată. S-a raportat că o listă de anticorpi ai receptorilor anti-TRAIL a fost generată și că aceștia sunt capabili de inducere a apoptozei celulelor de

RO 123115 Β1 melanom in vitro, dar numai după imobilizarea anticorpilor, pentru a promova cross-linkarea, 1 și, în anumite cazuri, celulele necesită cultivarea cu actinomicină D (24). Au fost generați câțiva anticorpi anti-DR5 (24). Totuși, acești anticorpi monoclonali anti-DR5, generați mai 3 înainte, au avut o slabă activitate de inducere a apoptozei in vitro, chiar în condiții de crosslinkare. Nicio activitate in vivo nu a fost raportată. Acești anticorpi nu au fost utilizați pentru 5 examinarea expresiei de suprafață celulară a receptorilor TRAI L (24). Deci, există o nevoie de anticorp monoclonal selectiv, pentru fiecare receptor TRAIL specific, care să fie capabil 7 nu numai de a lega receptorul de suprafața celulei, dar și să inducă puternic apoptoză diferitelor tipuri de celule anormale, inclusiv, celulelor tumorale, atât in vivo, cât și in vitro, 9 fără a fi necesară cerința pentru cross-linkare sau imobilizare. Un astfel de anticorp nu ar furniza numai un agent terapeutic potențial, dar și un instrument de diagnostic pentru analiza 11 funcțională a receptorului TRAIL. Există o cerință deosebită pentru un anticorp specific contra fiecăruia dintre receptorii care induc moartea, DR4 și DR5. 13 în dezvoltarea sau progresia multor boli, există adesea cazul în care celulele nu sunt eliminate. în multe boli autoimune și situații inflamatorii, celulele supraviețuitoare activate 15 atacă țesuturile sau celulele normale. Mai mult, progresia genezei tumorale și formarea panusului proliferativ al artritei reumatoide sunt caracterizate printr-o proliferare necontrolată 17 a celulelor. Astfel, apoptoza insuficientă conduce la dezvoltarea bolii și utilizările ligandului inductor de apoptoză sau a anticorpului monoclonal agonist, pentru a intensifica apoptoza, 19 sunt considerate drept o strategie terapeutică potențială, pentru eliminarea acestor celule nedorite. De exemplu, artrita reumatoidă (definită în cele ce urmează drept „RA”) este o 21 boală autoimună umană obișnuită. înțelesul actual al fiziopatologiei RA este acela că celulele autoimune T și celulele B inițiază un răspuns inflamator în articulații, răspuns care conduce 23 la hiperproliferarea sinoviocitelor. Ca o consecință a hiperproliferării celulelor sinoviale, metalo-proteinazele (definite în cele ce urmează drept „MMPs”) sunt produse în exces, ceea 25 ce conduce mai departe la distrugerea erozivă a cartilagiului și a osului, care este caracteristică pentru RA (25). Deci, controlul hiperproliferării celulelor sinoviale inflamatorii 27 este pasul cheie în tratamentul pentru RA. Mecanismele moleculare conducătoare la hiperproliferarea celulelor sinoviale sunt încă necunoscute. Deși celulele sinoviale hiperpro- 29 liferative sunt nemaligne și netransformate, multe studii au sugerat că acestea au câteva trăsături comune cu celule transformate (46). Aceste celule, așa numitele „sinoviocite 31 aparent transformate”, sunt caracterizate printr-un reticulendoplasmicrugos dens, numeroși nudei neregulați și modificări ale scheletului normal al celulei fusiforme. S-a presupus că 33 incorporarea oncogenelor și a genelor virus-derivate ar putea fi mecanismele declanșatoare pentru apariția transformată a celulelor sinoviale în RA (46). 35

Cel puțin două aspecte ale RA sugerează că apoptoza defectuos reglată poate contribui la mersul înainte al bolii și că elicitarea terapeutică a apoptozei poate fi un 37 tratament eficient: absența eliminării celulelor T activate sugerează că există o moarte celulară indusă de activarea defectuoasă a acestor celule T, care este un proces ce implică 39 apoptoza Fas-mediată și apoptoza TRAIL-mediată, și natura hiperproliferativă a celulelor sinoviale RA este un factor care joacă un rol important în stadiile târzii ale fiziopatologiei RA. 41 într-adevăr, s-a demonstrat că administrarea de anticorpi anti-Fas în articulația inflamată inhibă dezvoltarea artritei cronice la șoarecii transgenici tax, care sunt un model animal 43 pentru RA umană (26). în afară de aceasta, transducerea localizată cu gena fas ligand, printr-un vector adenoviral, este eficientă în prevenirea artritei indusă de colagen (27). 45

Inhibarea proliferării celulelor sinoviale inflamate, prin creșterea apoptozei Fas-mediată, a fost observată în ambele cazuri. Deși ligandul Fas este un inductor puternic de apoptoză în 47 celulele sinoviale ale RA, aplicarea apoptozei Fas ligand-mediată, ca terapie pentru om, a

RO 123115 Β1 fost limitată, datorită toxicității letale a ficatului. Astfel, apoptoza indusă de receptorul TRAIL reprezintă o terapie mai sigură și mai eficientă pentru tratamentul RA, decât apoptoza Fasligand indusă. De asemenea, apoptoza indusă de receptorul TRAIL reprezintă o terapie mai sigură și mai eficientă, pentru tratamentul cancerului, decât apoptoza Fas-ligand indusă. Apoptoza TRAIL-mediată este cunoscută pentru modul specific de a induce apoptoza celulelor tumorale transformate, fără afectarea celulelor normale. S-a demonstrat că administrarea sistemică de TRAIL solubil trimerizat nu a produs toxicitate la animalele experimentale, deși a fost capabil să inducă regresia tumorilor implantate (13, 28). Potențialul acesteia ca o terapie ajutătoare în tratamentele tradiționale a fost subliniat prin recenta descoperire că expresia lui DR5 și susceptibilitatea de a induce apoptoza TRAILmediată în celulele cancerului de sân este sporită prin iradiere, sugerând că, combinată cu iradierea, eficiența lui TRAIL ar putea fi crescută în terapia cancerului (29).

în plus, gena care codifică receptorul TRAIL, DR5, a fost cartată pe cromozomul 8 p21-22, poziții cu o înaltă frecvență de mutație în celule canceroase. S-a raportat că, cel puțin două feluri de celule tumorale, cancerul pulmonar cu celule mic (31) și cancerul capului și gâtului (32), prezintă mutații în domeniul morții genei DR5. Prin urmare, există o nevoie de anticorp anti-DR5 în cercetarea cancerului, pentru a determina efectul variației epitopului receptorului asupra dezvoltării și progresiei cancerului. Mai mult, funcționalitatea mutațiilor receptorului TRAIL ar furniza un instrument de diagnostic clinic util, folosit în asociere cu alți biomarkeri, în detectarea timpurie a cancerului și o prognoză asupra stării de agresivitate a tumorii.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este de a realiza anticorp purificat, care se leagă în mod selectiv la un receptor D4 TRAIL, la o compoziție care conține o cantitate terapeutică din respectivul anticorp și utilizarea pentru producerea unui medicament administrat în tratamentul cancerului sau al unei boli inflamatorii sau autoimune, prin inducerea selectivă a apoptozei și inhibarea proliferării celulare.

Anticorpul purificat, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că se leagă în mod selectiv la un receptor D4 TRAIL, care nu se leagă la DR5, DcR1 sau DcR2, în care respectivul anticorp, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo și in vitro în celulele țintă care exprimă DR4, în care activitatea de inducere a apoptozei in vitro este caracterizată prin viabilitate mai mică de 50%, la concentrații ale anticorpului de aproximativ 100 ng/ml.

Compoziția conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta conține o cantitate terapeutică din anticorpul definit în revendicarea 1 și un purtător acceptabil farmaceutic.

Utilizarea unui anticorp purificat, pentru producerea unui medicament administrat în tratamentul cancerului sau a unei boli inflamatorii sau autoimune, prin inducerea selectivă a apoptozei și inhibarea proliferării celulare.

Prin aplicarea invenției, se obține avantajul producerii apoptozei celulare, fără a induce toxicitatea celulară.

într-o variantă, invenția se referă la un anticorp care recunoaște un receptor TRAIL DR5 și care induce apoptoza în celulele ce exprimă DR5 in vivo sau in vitro. în continuare, este prezentat un anticorp care recunoaște DR5, dar nu și DR4, DcR1 sau DcR2. Detaliat, în mod special, este un anticorp monoclonal pentru DR5 produs de o linie hibridoma.

O metodă prezentată este inducerea apoptozei în celule țintă sau inhibarea proliferării celulelor țintă, prin punerea în contact a celulei cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp capabil de legare la DR5 sau DR4. în diferitele variante ale metodei, poate fi inclusă inhibarea apoptozei sau proliferarea celulară, prin punerea în contact a celulelor țintă cu ambii anticorpi.

RO 123115 Β1

De asemenea, este prezentată o compoziție farmacologică care include o cantitate 1 terapeutică de anticorp monoclonal activ contra lui DR5 sau DR4, un purtător farmacologic acceptabil și, opțional, un recipient ce conține anticorpul și purtătorul. Invenția furnizează, 3 în continuare și folosirea unui anticorp care recunoaște pe DR5 sau a unui anticorp care recunoaște pe DR4, pentru prepararea unui agent terapeutic pentru apoptoza selectivă a 5 celulelor anormale sau reglate defectuos.

Un anticorp al prezentei invenții interacționează cu un receptor al cărui ligand ce 7 induce apoptoza este înrudit cu factorul de necroză tumorală precum DR4, DR5, DrR1, DrR2 și OPG, inducând apoptoza într-o celulă care exprimă un astfel de receptor. Este prezentat 9 un anticorp al invenției, capabil de legare selectivă la un epitop agonist sau antagonist de receptor al cărui ligand ce induce apoptoza este înrudit cu factorul de necroză tumorală. 11

Prezenta invenție furnizează și un tratament pentru o boală înrudită apoptozei, cancerului, unei boli inflamatorii sau unei boli autoimune printr-o metodă care include 13 punerea în contact a țesutului țintă având boala, cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp al invenției, singur sau în combinație cu alți anticorpi ce induc apoptoza și/sau alți agenți 15 terapeutici sau tratamente.

Se descrie, în continuare, o proteină de fuziune care include o secvență antigenică 17 de aminoacizi ai receptorului TRAIL, având cel puțin zece baze, cuplate la o proteină a imunoglobulinei sau un fragment al acesteia, capabil de elicitarea unui răspuns imun la 19 subiect.

Prezenta invenție furnizează o metodă de terapie genică, în care o celulă țintă este 21 transfectată cu o secvență de acid nucleic a receptorului TRAIL, într-un vector de expresie, astfel încât receptorul TRAI L este exprimat pe celula țintă. Celula țintă este apoi expusă unui 23 antibiotic, care se leagă selectiv la receptorul TRAIL.

Sunt furnizate secvențele de acizi nucleici și secvențele de aminoacizi care conțin 25 codificarea imunoglobulinelorcu lanț greu sau ușor al anticorpului selectiv pentru DR5. Sunt, de asemenea, furnizate secvențe pentru un anticorp care se leagă selectiv la DR4. De 27 asemenea, sunt detaliați vectorii care includ o secvență de acizi nucleici ai invenției și celulele gazdă transformate cu un vector al invenției. 29

Prezenta invenție prezintă un anticorp DR5 umanizat (adică, TRA-8) și un anticorp umanizat DR4 (adică 2E12), ca și o celulă transfectată care produce anticorpul umanizat 31 DR5 și o celulă transfectată care produce anticorpul umanizat DR4.

Este descris un proces pentru producerea anticorpului umanizat DR5 sau DR4, în 33 care o gazdă este transformată cu secvențe de acizi nucleici care conțin codificarea lanțului ușor al imunoglobulinei umanizate și a lanțului greu al imunoglobulinei umanizate, după care 35 gazda transformată este incubată pentru o perioadă predeterminată de timp.

De asemenea, este descris un proces pentru inducerea apoptozei în celule țintă, cu 37 o cantitate eficientă farmaceutic de anticorp DR5 umanizat, anticorp DR4 umanizat sau o combinație a ambilor, în prezența sau absența altor agenți terapeutici și a altor tratamente. 39

Este prezentată o trusă comercială pentru inducerea apoptozei, care include un anticorp umanizat TRA-8 selectiv pentru DR5 sau un anticorp umanizat pentru DR4 (adică 41 2E12 umanizat), împachetat într-un recipient convenabil și, opțional, cu instrucțiunile de utilizare. 43

Absența celulelor distruse este datorată defectelor din sistemul de inducere a apoptozei, care sunt asociate cu defecte care includ, în mod ilustrativ, expresia sau funcția 45 ligandului, a receptorului sau a moleculelor reglatoare intracelulare și efectoare. Prezenta invenție oferă o metodă de a corecta un sistem deficient de inducere a apoptozei și de a 47 elucida defectele specifice inerente într-un sistem dat ce induc apoptoza deficientă.

RO 123115 Β1

Prezenta invenție se referă la o nouă clasă de anticorpi monoclonali, care au activitate selectivă de inducere a apoptozei in vivo și in vitro, contra receptorilor specifici TRAIL, incluzând DR5, DR4, DcR1 și DcR2. Astfel, anticorpii prezentei invenții se leagă în mod specific la unul dintre receptorii TRAIL. Prin „legare selectivă” sau „recunoaștere specifică” se înțelege că anticorpul se leagă numai la un receptor TRAIL și prezintă, folosind analiza Western Blot tradițională, o legare mică sau nu se leagă deloc la alte tipuri de receptori TRAIL. Un anticorp DR5 al prezentei invenții se leagă selectiv la DR5 și prezintă un fond de nelegare de mai sus de circa 1,5 ori pentru DR4, DcR1 sau DcR2. în mod similar, anticorpul DR4 al prezentei invenții se leagă selectiv la DR4 și prezintă un fond de nelegare de mai sus de circa 1,5 ori pentru DR5, DcR1 sau DcR2. Prezenta invenție are utilitate ca reactiv în cercetarea semnalării apoptozei, precum și utilitate ca agent terapeutic eficient contra celulelor care exprimă receptori TRAIL, incluzând, în mod ilustrativ, larga clasă a celulelor canceroase, celule care prezintă dereglări ale sistemului de apoptoză, limfocitele activate sau alte celule imune activate (adică celule limfoide și celule mieloide), celule infectate viral și celule sinoviale cu proliferare anormală (adică celule sinoviale ale artritei reumatoide, care includ celule sinoviale inflamatorii, celule limfoide și mieloide activate din sinovie, sinoviocite de tip macrofage și sinoviocite de tip fibroblast) ale bolilor autoimunei. Anticorpii în conformitate cu prezenta invenție sunt specifici în legarea anumitor tipuri de receptori TRAIL, în ciuda omologiei care există între acestea. Anticorpii inventați oferă o apoptoză țintită numai acelor celule care exprimă un receptor TRAIL țintă sau, alternativ, blocând apoptoza TRAIL a celulelor care exprimă un receptor țintă.

Un anticorp monoclonal DR5 sau un anticorp monoclonal DR4 al prezentei invenții servește ca inductor puternic de apoptoză în celule ce exprimă DR5 sau, respectiv, DR4 in vitro și ca un puternic inductor de apoptoză in vivo. Secvențe CDR parțial umanizate, grefate pe coloana vertebrală a anticorpului umanizat, și anticorpii proteinei de fuziune DR5 sau DR4 ai prezentei invenții prezintă proprietăți apoptotice similare.

Până în prezent, nu este disponibil niciun anticorp monoclonal care să se lege la DR5 de suprafață celulară și care, chiar în concentrații scăzute, să inducă apoptoza celulelor care exprimă DR5 atât in vitro, cât și in vivo, în absența unui cross-linker. Prezenta invenție include un anticorp DR5 operativ ca agent terapeutic în tratamentul unor boli foarte diverse. Deși pentru TRAIL solubil s-a demonstrat că este eficient în inducerea apoptozei celulelor tumorale in vivo, activitatea de ucidere pare să fie foarte scăzută, adesea fiind necesare doze mari și repetate (13). Prezenta invenție furnizează un anticorp purificat care se leagă la un receptor TRAIL DR5, în care numitul anticorp, în forma sa solubilă și la concentrații scăzute, are activitate inductoare de apoptoză in vivo și in vitro, în celule care exprimă DR5. într-o variantă preferată, anticorpul purificat se leagă la un receptor TRAIL DR5, în absența cross-linkării anticorpului. De preferat, anticorpul nu induce o apoptoză semnificativă a celulelor de fibroblast normale. Preferabil, activitatea inductoare de apoptoză este caracterizată printr-o viabilitate a celulelor țintă mai mică de 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5% sau orice procent între aceste valori, la concentrații de anticorp mai mici de circa 0,1,1, 5, 10 sau 20 pg/ml sau la orice concentrație dintre acestea. Anticorpul purificat se leagă specific la receptorului TRAIL DR5 și nu se leagă la receptorii TRAIL DR4, DcR1 sau DcR2, după analiza de rutină Western Blot. într-o variantă preferată, anticorpul este un anticorp monoclonal, având, preferabil, aceeași specificitate a epitopului ca hibridoma șoareceșoarece TRA-8, care are în ATCC numărul de acces PTA-1428.

TRA-8, unul dintr-o serie de anticorpi DR5 conform cu prezenta invenție, este eficient farmaceutic la animale purtând o transgenă DR5 umană și are și utilitate în stabilirea unui model pentru investigarea rolului DR5 și TRAIL.

RO 123115 Β1

Diferite variante ale invenției furnizează anticorpi care induc apoptoza în prezența sau 1 absența cross-linkării. De exemplu, o variantă preferată a anticorpului DR5 (adică TRA-8) induce apoptoza în absența cross-linkării. Alte variante furnizează anticorpi care induc 3 apoptoza în prezența cross-linkerilor, incluzând, de exemplu, o variantă preferată a anticorpului DR4 (2E12). 5

Astfel, invenția furnizează un anticorp purificat, care se leagă, în mod specific, la receptorul TRAIL DR4, în care numitul anticorp, în forma sa solubilă, are activitate de 7 inducere a apoptozei in vivo și in vitro, în celule țintă care exprimă DR4. într-o variantă, anticorpul este un anticorp monoclonal, având aceeași specificitate a epitopului ca și 9 hibridoma 2E12, având în ATCC numărul de acces PTA-3798, depozitat în 24 octombrie 2001, sub numele desemnat de „2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4, în folosul The 11 UAB Research Foundation. 2E12, ca unul din seria de anticorpi DR4 ai prezentei invenții, este activ farmaceutic în reducerea mărimii tumorii, comparativ cu animalele martor netratate 13 sau comparativ cu mărimea tumorii înainte de tratament in vivo, la animale cu cancere exprimând DR4. 15

Ambii anticorpi pentru DR4 și DR5 sunt eficienți în formă solubilă la doze scăzute, prin doze scăzute înțelegându-se doze sau concentrații mai mici de circa 0,01 la circa 1 17 pg/ml in vitro și mai mici de circa 1 la 10 mg/kg in vivo. O caracteristică preferată a anticorpilor prezentei invenții este aceea că aceștia induc apoptoza selectiv celulelor care 19 exprimă receptorii DR5 sau DR4, fără inducerea apoptozei în celule normale, neactivate, netransformate precum hepatocite, fibrocite, sinoviocite etc. Un anticorp în conformitate cu 21 prezenta invenție, produs contra unui receptor TRAIL, este recoltat, în conformitate cu prezenta invenție, de la un animal experimental, dar poate fi făcut prin orice metodă 23 cunoscută în domeniul de specialitate, de producere sau de sinteză a anticorpilor. Prin umanizare, anticorpul conform cu prezenta invenție își menține activitatea de legare a 25 receptorului în timpul elicitării unui răspuns imun, diminuat și tolerabil terapeutic într-un subiect uman, astfel încât anticorpul receptorului anti-TRAIL umanizat, în conformitate cu 27 prezenta invenție, este folosit ca agonist sau antagonist terapeutic, pentru un receptor TRAIL dat. Prezenta invenție este operativă ca agent terapeutic in vivo, deoarece, opțional, nu este 29 necesară o cross-linkare secundară de anticorp, pentru receptorul anti -TRAIL.

Prezenta invenție se extinde dincolo de un singur anticorp al receptorului anti-TRAI L, 31 având efecte apoptotice agoniste sau antagoniste. Mai degrabă, doi sau mai mulți anticorpi ai receptorului anti-TRAIL sunt aduși în contact cu o cultură de celule in vitro sau un țesut 33 al corpului subiectului in vivo, pentru a crea un tratament sporit. Prin „tratament sporit”, se înțelege orice efect adăugat, sinergie sau de potențare. De exemplu, linia de celule glioma 35 U87 și liniile celulare hematopoetice U937 și Molt-4 sunt sensibile la expunere pentru o expunere sinergică la anticorpii agoniști anti-DR4 și anti-DR5, în timp ce expunerea la un 37 singur anticorp agonist anti-DR5 prezintă doar un succes limitat în inducerea apoptozei.

în plus, anticorpii receptorului anti-TRAIL antagoniști au o utilitate deosebită în 39 prezenta invenție, când un anticorp este specific pentru a se lega la unul dintre receptorii capcană DcR1, DcR2 sau OPG. Blocarea selectivă a unui receptor capcană cu un anticorp, 41 conform cu prezenta invenție, în tipurile de celule care exprimă receptori capcană, are efect de deplasare a echilibrului de legare a lui TRAIL spre acei receptori capabili de transducerea 43 semnalului de apoptoză. Astfel, într-o altă terapie combinată, conformă cu prezenta invenție, un anticorp care se leagă de un receptor capcană sensibilizează celula care îl exprimă spre 45 legarea cu receptorul TRAIL, care transduce semnalul apoptozei agoniste.

RO 123115 Β1 într-o altă variantă, prezenta invenție oferă o metodă de elucidare a epitopurilor agoniste și antagoniste ale unui receptor TRAIL dat. Mai mult, polimorfismele dintre indivizi, asociate cu un receptor TRAIL dat, sunt elucidate conform cu prezenta invenție, prin folosirea unei liste de anticorpi monoclonali, fiecare având o regiune diferită, variabilă sau CDR. O listă caracterizată a anticorpilor monoclonali furnizează abilitatea de a defini epitopurile agoniste și antagoniste, ca și polimorfismele. Astfel, o listă de anticorpi monoclonali, conformi cu prezenta invenție, are utilitate în descoperirea de medicamente și/sau în trierea subiecților predispuși la boală.

O altă variantă a prezentei invenții implică proteinele de fuziune, care includ un fragment antigenic al receptorului TRAI L cuplat la o proteină de imunoglobulină, o polipeptidă sau un fragment al acestora. Un fragment de receptor TRAIL fiind definit ca având un număr suficient de baze, pentru a obține un răspuns imunogen la un receptor TRAIL nativ, exprimat la suprafața celulară a subiectului. Un fragment al receptorului TRAIL de fuziune include cel puțin zece aminoacizi. O proteină de fuziune a imunoglobulinei sau un fragment al acesteia este definit în prezent invenție ca incluzând o proteină nativă sau sintetică, sau un segment de polipeptidă având un număr suficient de baze aminoacide, pentru a activa un răspuns în cascadă, imunogen la subiect. Un imunogen al prezentei invenții, care include o fuziune a fragmentului de receptor TRAIL, cuplat la un fragment de imunoglobină, are utilitatea unui agent terapeutic in vivo, pentru a elicita un anticorp al receptorului anti-TRAIL in situ, la subiect.

încă, într-o altă variantă suplimentară, prezenta invenție este operativă în terapia genică. Invenția furnizează astfel o metodă de inducere selectivă a apoptozei în celule țintă, care cuprinde etapele de: transfectare a celulelor țintă cu un vector ce cuprinde o secvență de acid nucleic a receptorului TRAIL exprimabilă; exprimarea pe respectiva celulă a receptorului TRAIL codificat de către numita secvență de acid nucleic a receptorului TRAIL; și de punere în contact a numitelor celule cu un anticorp ce induce apoptoza selectivă, pentru legarea numitului receptor TRAIL. într-un aspect al terapiei genice al prezentei invenții, celulele țintă sunt transfectate cu un vector ce poartă o secvență exprimabilă, corespunzătoare unui receptor TRAIL, vectorul fiind convențional și ales pe baza susceptibilității celulelor țintă la vector. Vectorii terapiei genice includ, în mod ilustrativ, adenovirusul, pAdCMV5. Pe lângă faptul că celulele sau țesuturile țintă exprimă receptorul TRAIL transfectat, celulele sau țesuturile sunt expuse la un anticorp conform cu prezenta invenție, specific pentru legarea la receptorul TRAIL transfectat. Se apreciază că anticorpul receptorului anti-TRAIL este fie agonist, fie antagonist cu acesta, adecvat cu rezultatul terapeutic dorit.

Anticorpii prezentei invenții sunt, de asemenea, operativi, împreună cu un sensibilizator. Un sensibilizator, așa cum este folosit în prezenta invenție, este definit a include orice stimul care induce apoptoza, inclusiv lumina ultravioletă, molecule organice care includ, în mod specific, clasa bisindolmaleimidelor, metale grele și specii de radicali liberi.

în contextul terapiei cancerului, TRA-8 este capabil de a induce apoptoza majorității celulelor tumorale TRAIL- sensibile, într-o modalitate dependentă de caspază în absența cross-linkării secundare. Ambii anticorpi, TRA-8 și 2E12, singuri sau în combinație, manifestă o puternică activitate tumoricidă in vivo. Abilitatea lui TRA-8 sau 2E12 de a induce apoptoza majorității celulelor TRAIL - sensibile confirmă că oricare dintre aceștia fie DR5, fie DR4, singur este suficient pentru a declanșa apoptoza. Majoritatea celulelor tumorale, detaliate în prezenta invenție, exprimă DR5 de suprafață celulară și susceptibilitatea acestora la moarte celulară indusă de TRA-8, care a fost asemănătoare cu susceptibilitatea acestora la TRAIL, indicând că DR5 este un receptor primar al morții pentru apoptoză TRAIL- mediată

RO 123115 Β1 în majoritatea celulelor tumorale. Rezultate similare au fost obținute cu anticorpi specifici 1 pentru DR4 (adică 2E12). Astfel, expresia diferențiată a DR5 sau DR4 a celulelor normale și canceroase este operativă în selectivitatea apoptozei TRAIL- mediată. TRA-8 ocolește 3 receptorii capcană, pentru a induce apoptoza TRAIL- mediată. Cu toate că numai un număr mic de celule tumorale TRAIL- rezistente sunt sensibile la TRA-8, aceasta arată că receptorii 5 capcană nu par să joace un rol major în rezistența celulelor tumorale la apoptoza TRAILmediată. 7

Deși studii anterioare au indicat că administrarea sistemică a formei solubile de TRAIL la animale induce regresia tumorii, fără să provoace toxicitate³⁴²², forma legată de 9 membrană de TRAIL- uman induce leziuni în ficat la șoareci, așa cum s-a arătat aici. Totuși, toxicitatea hepatică a TRAIL este mult mai puțin puternică față de cea a ligandului Fas, așa 11 cum s-a demonstrat prin susceptibilitatea mai scăzută a hepatocitelor normale la leziunile TRAIL- induse, comparativ cu ligandul Fas și prin lipsa de letalitate la TRAIL in vivo. Prin 13 urmare, titrarea de TRAIL are utilitate în terapia cancerului.

Așa cum s-a detaliat în prezenta invenție, absența nivelurilor semnificative de 15 expresie a proteinei DR5 la hepatocitele normale este demonstrată și asociată cu rezistența hepatocitelor la apoptoza TRA-8 indusă. Cross-linkarea lui DR5 cu un anticorp monoclonal 17 este insuficientă pentru a organiza formele homopolimerice ale receptorului morții, capabile de a declanșa apoptoza. 19

Experimentele pe marmoset (maimuțe mici) au arătat că nu sunt dovezi de toxicitate hepatică la administrare de TRA-8. Astfel, un anticorp DR5 monoclonal agonist este probabil 21 să fie mai selectiv și mai sigur ca agent terapeutic decât forma solubilă de TRAIL. în mod similar, DR4 este exprimat de celule transformate sau activate și nu este exprimat în cantități 23 apreciabile sau numai în cantități mult mai scăzute de către celulele normale, de exemplu, de fibroblaste. DR4 al prezentei invenții induce apoptoza anumitor celule țintă, fără o moarte 25 celulară apreciabilă în celulele care nu sunt celule țintă, precum fibroblastele etc. Așa cum este folosită în prezenta invenție, absența unui efect sau lipsa unui efect apreciabil sau 27 semnificativ se referă și include absența completă a efectului sau a unui efect care este mai scăzut sau egal cu nivelurile de fond sau martor și nu depășesc nivelurile de bază sau a 29 martorului cu mai mult de 1,5 ori față de nivelul de bază sau al martorului.

Ca test de triere sau instrument de vizualizare, prezenta invenție este bine adaptată 31 pentru detectarea de mici clusteri de celule DR4 sau DR5, care pot încă să prezinte morfologie celulară normală. De exemplu, colorarea in situ a unei secțiuni celulare de celule 33 canceroase umane, care includ cancer de plămân, prostată și ficat cu anticorpi marcați, conform cu prezenta invenție, identifică în mod rapid celulele canceroase. Anticorpii 35 prezentei invenții sunt utili și în trierea altor manifestări de boală, ce includ, de exemplu, diferite boli inflamatorii și autoimune precum artrita reumatoidă. O astfel de triere poate fi utilă 37 chiar înainte de atacul altor simptome clinice și ar putea fi folosit pentru trierea subiecților cu risc de boală, astfel încât tratamentul profilactic să poată începe înainte de manifestarea altor 39 semne sau simptome. în mod specific, celulele canceroase sunt observate că exprimă niveluri foarte înalte de DR5, comparativ cu celulele normale de același tip. Prin urmare, 41 prezenta invenție este utilizată ca o metodă de triere sensibilă, pentru stadiile timpurii de malignizare dintr-un țesut, incluzând cel puțin plămânul, prostata, colonul, sângele, colul 43 uterin, sânul și ficatul. în prezenta cerere, este detaliat un proces terapeutic pentru inhibarea proliferării celulelor anormale, asociat cu boala, precum, în mod ilustrativ, cancerele maligne 45 și leucemiile limfatice printre altele.

Prezenta invenție detaliază în continuare toate amănuntele unui anticorp mono- 47 clonal antiuman DR5, desemnat ca TRA-8, având în ATCC numărul de acces PTA-1428.

RO 123115 Β1

Se apreciază că tehnicile și rezultatele detaliate cu privire la TRA-8, anticorp agonisi monoclonal antiuman DR5, sunt în întregime capabile de extindere și aplicare la anticorpii DR5 antagoniști, ca și la anticorpii produși contra DR4, DcR1 sau DcR2, acționând în ambele maniere, agonistă și antagonistă. Astfel, prezenta invenție detaliază, în cele de față, un anticorp care induce apoptoza, în mod specific, pentru DR4 uman. într-o variantă, anticorpul are aceeași specificitate a epitopului ca hibridoma 2E12, care a fost depozitat în 24 octombrie 2001, pentru a obține un număr de acces în beneficiul „The UAB Research Fondation” la American Type Culture Collection, Rockville, Md. Descrierea materialului depozitat a fost “2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4, cu sușa denumită 2E12 și numărul fișei de referință PCT/US 01/14151. Nivelurile de expresie ale unui receptor de apoptoză precum Fas nu sunt corelate în mod necesar cu susceptibilitatea celulelor la apoptoză. Pentru apoptoza TRAIL-mediată, s-a sugerat că expresia receptorilor capcană pentru TRAI L influențează susceptibilitatea celulelor. în plus, s-a sugerat că DR5 trebuie să fie asociat cu DR4, pentru o transducție eficientă a semnalului apoptozei pe calea 8 a FADDului și a caspazei. Disponibilitatea anticorpului agonist monoclonal anti-DR5 a permis evaluarea reglării semnalizării DR5 și evaluarea rolului său relativ în apoptoza TRAILmediată. Compararea susceptibilității celulelor la apoptoza TRA-8 - mediată cu susceptibilitatea acestora la apoptoza TRAIL-mediată oferă sensul rolului lui DR5 în apoptoza TRAIL - mediată și mecanismele care pot afecta susceptibilitatea. Avantaje similare sunt furnizate de anticorpul DR4.

Aceste avantaje se extind, în general, la anticorpii umanizați DR5 și DR4 ai prezentei invenții. O clonă moleculară a unui anticorp la DR-5, de exemplu, este preparată prin tehnici cunoscute, așa cum sunt detaliate în următoarele exemple. Metodologia ADN-ului recombinant (33) este operativă în cele de față, pentru construirea de secvențe de acid nucleic care să conțină codificarea moleculei de anticorp monoclonal sau a regiunii de legare a antigenului de acestea.

Prezenta invenție permite construirea de anticorpi pentru receptorii TRAIL umanizați, care sunt puțin probabili să inducă un răspuns (34) al anticorpului antișoarece uman (definit de aici înainte drept „HAMA”), în același timp, având încă o funcție efectoare de anticorp eficient. Anticorpii în întregime umani potfi obținuți și prin imunizarea șoarecilor capabili de producerea unui anticorp în întregime uman (adică șoareci modificați genetic, pentru a produce anticorpi umani), urmată de trierea de clone care se leagă la DR5 sau DR4, induc apoptoza și concurează la epitopul TRA-8 sau 2E12. Vezi, de exemplu, Lonberg and Huszar (1995), “Human antibodies from transgenic mice” (Anticorpi umani din șoareci transgenici), Int. Rev. Immunol. 13:65-93, care este încorporat în cele de față, prin referire în totalitatea lui, pentru metodele de producere de anticorpi în întregime umani. Așa cum sunt folosiți în cele de față, termenii „uman” și „umanizat” referitor la anticorpi se referă la orice anticorp care este de așteptat să prezinte un răspuns terapeutic tolerabil, slabimunogen laun subiect uman.

Prezenta invenție furnizează pentru un anticorp DR5, un anticorp anti-DR5 umanizat, imunoglobuline cu lanț greu și ușor TRA-8 și imunoglobuline umanizate, cu lanț greu și ușor. Invenția prezintă, de asemenea, un anticorp DR4, un anticorp umanizat DR4, imunoglobuline cu lanț greu și ușor, ale anticorpului DR4 și imunoglobuline cu lanț greu și ușor, umanizate, acizi nucleici care conțin codificarea anticorpului și lanțurile grele și ușoare, vectori care conțin acizii nucleici ai acestora și celule cuprinzând vectorii. Anumite trunchieri ale acestor proteine sau gene îndeplinesc funcții de reglare sau enzimatice ale secvenței totale de proteină sau genă. De exemplu, secvențele de acid nucleic care le codifică pe acestea pot fi alterate prin substituții, adiții, deleții sau prin expresie multimerică, care dotează funcțional

RO 123115 Β1 proteinele sau genele echivalente. Datorită degenerării secvențelor care codifică acizii 1 nucleici, alte secvențe care conțin, în mod substanțial, codificarea acelorași secvențe de aminoacizi, ca cele ale proteinelor produse natural, pot fi utilizate în aplicarea prezentei 3 invenții. Acestea includ, dar nu se limitează la secvențele de acizi nucleici, incluzând în totalitate sau numai porțiuni ale secvențelor de acizi nucleici care conțin codificarea 5 polipeptidelor de mai sus, care au fost alterate prin substituirea diferiților codoni ce conțin codificarea unui reziduu de aminoacid echivalent, funcțional în interiorul secvenței, pro- 7 ducând prin urmare o modificare silențioasă. Se apreciază că secvența de nucleotide a unei imunoglobine, conformă cu prezenta invenție, tolerează variațiile de omologie de secvență 9 de până la 25% așa cum s-a calculat prin metode standard („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromolecule Sequencing and synthesis, Selected Methods 11 and Applications, „Metode curente de comparare și analiză a secvenței’’, Metode selectate de secvențiere și sinteză a macromoleculelorși analiză, pag. 127-149, 1998, Alan R. Liss, 13 Inc.) așa de lungă, încât o variantă formează un anticorp operativ care recunoaște DR5 receptor TRAIL. 15

De exemplu, unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi dintr-o secvență a polipeptidei poate fi substituit de un alt aminoacid cu o polaritate similară, care acționează ca 17 un echivalent funcțional, rezultând o alterare silențioasă. Substituenții pentru un aminoacid dintr-o secvență pot fi selectați dintre alți membri ai clasei la care aminoacidul aparține (adică 19 o substituție conservativă). De exemplu, aminoacizii nepolari (hidrofobi) includ alanina, leucina, izoleucina, valina, pralina, fenilalanina, triptofanul și metionina. Aminoacizii polar 21 neutri includ glicina, serina, treonina, cisteina, tirozina, asparagina și glutamina. Aminoacizii încărcați pozitiv (bazici) includ arginina, lizina și histidina. Aminoacizii încărcați negativ (acizi) 23 includ acidul aspartic și acidul glutamic. De asemenea, incluse în scopul prezentei invenții sunt proteinele sau fragmente ale acestora sau derivați ale acestora, care sunt modificate, 25 în mod diferențiat în timpul sau după translare, de exemplu, prin glicozilare, clivaj proteolitic, linkare la o moleculă de anticorp sau la alți liganzi celulari etc. în plus, vectorul recombinant, 27 care conține codificarea secvențelor de acizi nucleici ai anticorpilor prezentei invenții, poate fi modificat prin inginerie genetică, astfel încât să modifice procesarea sau expresia unui 29 vector. Alte modificări pot fi făcute fie în secvența de acizi nucleici, fie în cea de aminoacizi, fără reducerea sau fără o reducere substanțială a activității apoptozei în anticorp. Astfel de 31 modificări se pot produce în regiunile CDR sau ne-CDR, folosind tehnicile de rutină din domeniul de specialitate. Vezi, de exemplu, Yang și colab., (1995), J. Mol. Biol. 254: 392- 33

403, care este încorporată în prezenta invenție, prin referințe în totalitatea acesteia, pentru metodele de mutageneză pas cu pas (walking mutagenesis) a CDR. 35 în plus, un inhibitor care conține codificarea secvenței de acizi nucleici poate fi supus mutației in vitro sau in vivo, pentru a crea și/sau a distruge translarea, inițierea și/sau 37 terminarea secvențelor, sau pentru a crea variații în regiunile codificatoare și/sau a forma noi situs-uri ale endonucleazei de restricție sau a le distruge pe cele pre-existente, pentru a 39 facilita următoarea modificare in vitro. Orice tehnică de mutageneză cunoscută în domeniul de specialitate poate fi utilizată, inclusiv, dar fără a se limita la mutageneză in vitro 41 direcționată pe situs, J. Biol. Chem. 253: 6551, întrebuințarea linkerilor Tab (Pharmacia) și alții asemenea. 43

Datele cristalografiei cu raze X arată că pliul imunoglobulinic al anticorpului formează, în general, o lungă structură cilindrică, ce cuprinde două straturi de fâșii-β antiparalele, 45 fiecare constând din trei sau patru lanțuri-β. într-o regiune variabilă, trei bucle de la fiecare din domeniile V ale lanțurilor H și L se adună împreună, pentru a forma situs-ul de legare al 47 antigenului. Fiecare dintre aceste bucle este denumită regiune determinantă complementară (CDR). CDR-urile au cea mai înaltă variabilitate în secvența de aminoacizi ai anticorpului. 49

RO 123115 Β1

Porțiunile regiunii variabile, care nu sunt parte a unui CDR, sunt numite „regiuni de structură” (Framework regions, regiuni „FR”) și joacă în general un rol în menținerea structurii CDR. Preferabil, toate CDR-urile de la un anticorp dat sunt grefate într-un anticorp acceptor, în scopul de a păstra regiunea de legare pentru regiunea epitopului receptorului TRAIL. Se apreciază că grefarea unei porțiuni din cantitatea totală de CDR-uri într-un donor este operativă în prezenta invenție. Se înțelege că, în general, grefarea atrage după sine înlocuirea, reziduu cu reziduu, a unui aminoacid sau a unei regiuni, cu un altul. Totuși, ocazional, în special odată cu transferul unei regiuni, unul sau mai multe reziduuri pot fi adăugate sau eliminate sau substituite de acestea, așa cum se dorește, și că asemenea deleții și inserții, ca și înlocuirile și inversiunile proprii sunt la aprecierea specialistului în domeniu.

Un anticorp al prezentei invenții este obținut prin, de exemplu, grefarea fiecărui CDR al subunității lanțului L și al lanțului H ale unui anticorp monoclonal pentru receptorul antiTRAIL, într-o regiune CDR corespunzătoare anticorpului uman, drept urmare, umanizarea unui anticorp monoclonal de șoarece eficient contra unui receptor-TRAIL.

Fragmentele de anticorp, care conțin idiotipul de moleculă, sunt, de asemenea, obținute și operative în cele de față, folosind tehnici cunoscute. De exemplu, astfel de fragmente includ, ilustrativ, fragmentul 2 (AB¹) al receptorului anti-TRAIL, care poate fi produs prin digestia cu pepsină a moleculei de anticorp, fragmentele AB' ale anticorpului receptorului TRAIL obținute prin reducerea punților disulfurice ale fragmentului 2 (AB¹) ale receptorului TRAIL și fragmentul de anticorp care este obținut prin tratarea moleculei de anticorp cu papaină și un agent reducător.

Anticorpii prezentei invenții pot fi produși folosind numeroase tehnici cunoscute în domeniul de specialitate. Ca un exemplu, anticorpul monoclonal anti-DR5, TRA-8, poate fi obținut prin cultivarea de hibridoma care, în schimb, poate fi obținut prin imunizarea unui șoarece cu DR5 uman și fuzionarea ulterioară a celulelor splenice sau celulelor nodulului limfatic de la șoarece cu celule de mielom de șoarece.

Prepararea unui anticorp monoclonal implică, ilustrativ, următorii pași:

a) purificarea unei biomacromolecule pentru utilizare ca antigen;

b) prepararea de celule producătoare de anticorp, după prima imunizare a unui animal, folosind injecții de antigen, sângerarea animalului și analizarea titrului de anticorpi, cu scopul de a determina când să se scoată splina;

c) prepararea de celule de mielom;

d) fuzionarea celulelor producătoare de anticorpi și a celulelor de mielom;

e) selectarea de hibridoma care produce anticorpul dorit;

f) prepararea unei clone dintr-o singură celulă (donare);

g) opțional, cultivarea de celule hibridoma sau creșterea animalelor în care celule hibridoma au fost transplantate pentru prepararea pe scară mare a anticorpului monoclonal; Și

h) testarea activităților biologice și specificitatea sau analizarea proprietăților de agent markerale anticorpului monoclonal astfel preparat.

Procedeul pentru prepararea anticorpului monoclonal este detaliat mai jos, cu referire la pașii descriși mai sus. Această metodă pentru prepararea unui anticorp al prezentei invenții are intenția de a fi doar o ilustrare a metodelor de preparare și nu se limitează la aceasta. Alte proceduri cunoscute pot fi urmate sau se urmează metode modificate, de exemplu, prin utilizarea celulelor producătoare de anticorpi, altele decât celule splenice sau de mielom

RO 123115 Β1

a) Prepararea de antigen 1

O proteină recombinantă (definită în cele ce urmează ca „DR5 uman recombinant” sau „DR4 uman recombinant”), eficientă ca antigen, este obținută prin transfectarea celulelor 3 QBI-293A cu vectorul de expresie pAdDR5-lgG, pentru obținerea unei proteine de fuziune care cuprinde domeniul extracelular al lui DR5 uman sau DR4 uman și regiunea Fc a 5 anticorpului IgG 1 uman (definită în cele ce urmează ca „IgG”, conform PTA-1428), pentru a o exprima se folosește kitul ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), urmat 7 de colectarea și purificarea parțială a produsului de expresie. Plasmida pAdDR5-lgG este construită prin inserția de ADN ce conține codificarea lui DR5 uman sau DR4 uman și 9 proteina de fuziune IgG umană în pAdCMV5, care este un vector de expresie pentru celulele animale. Alte materiale, precum ADN-ul ce conține codificarea lui DR5 sau DR4, vectorul și 11 gazda sunt operaționale în lucrarea de față.

DR5 uman sau DR4 uman și proteina de fuziune IgG, produse în supernatantul 13 culturii de celule QBI-293A transfectate cu vectorul pAdDR5-lgG, pot fi parțial purificate prin cromatografia de afinitate Protein A-Sepharose sau prin cromatografia de afinitate Protein 15 G-Sepharose, sau cromatografia cu schimbători de ioni folosind o coloană Q Resource (nume de marcă: Pharmacia). 17

Alternativ, DR5 sau DR4 purificate, obținute din membranele celulare ale liniilor celulare umane, sunt utilizate ca antigen. Mai mult, deoarece structurile primare ale DR4 și 19 DR5 sunt cunoscute (conform PTA-1428), o peptidă cuprinzând secvența de aminoacizi SECV ID Nr. 1, poate fi sintetizată chimic prin metode cunoscute precum metoda Sânger și 21 folosită ca antigen.

b) Prepararea celulelor producătoare de anticorp 23

Un șoarece este imunizat cu imunogenul produs la pasul (a), amestecat cu un adjuvant, precum adjuvantul lui Freund, complet sau incomplet sau alaun. Alte animale 25 experimentale convenabile includ, ilustrativ, șobolani, cobai, iepuri, câini, pui, cai, porci, vaci și oi. 27

Căile de administrare adecvate pentru a imuniza un animal experimental includ calea injectării subcutanate, intraperitoneale, intravenoase, intradermice și intramusculare, fiind 29 preferate injecțiile subcutanate și intraperitoneale.

Imunizările sunt efectuate opțional cu o singură doză sau cu câteva doze repetate 31 la intervale potrivite (preferabil de la 1 la 5 săptămâni). Animalele imunizate sunt monitorizate pentru titrul de anticorpi din serul lor și un animal cu un titru de anticorpi suficient de înalt 33 este selectat ca sursă de celule producătoare de anticorp. Selectarea unui animal cu un titru înalt face procesul ce urmează mai eficient. Celulele pentru fuziunea ce urmează sunt, în 35 general, recoltate de la animal de la 3 până la 5 zile după imunizarea finală.

Metodele pentru analizarea titrului de anticorpi includ diferite tehnici, binecunoscute 37 precum analiza radioimunologică (definită în cele ce urmează drept „RIA”), analiza imunologică în fază solidă a enzimei (definită în cele ce urmează drept „ELISA”), analiza anti- 39 corpilor fluorescenți și analiza hemaglutinării pasive, cu RIA și ELISA, preferate din rațiuni de sensibilitate a detectării, rapiditate, acuratețe și potențial de automatizare. 41

Determinarea titrului de anticorp poate fi efectuată, de exemplu, prin ELISA, după cum urmează. Mai întâi, DR5 sau DR4 purificat sau parțial purificat este adsorbit pe supra- 43 fața unei faze solide, precum plăci ELISA cu 96degodeuri, urmatde blocarea oricărei suprafețe rămase, de care DR5 sau DR4 să nu fie legate cu o proteină neînrudită cu antigenul 45 precum albumina serică bovină (BSA). După spălare, suprafețele godeurilor sunt puse în contact cu probe diluate seriat de ser de șoarece, pentru a fi capabile de legarea anticorpului 47

RO 123115 Β1

DR5 sau DR4 din probă la antigen. Un anticorp antișoarece marcat, ca anticorp secundar, este adăugat pentru a fi legat la anticorpul de șoarece. Marcarea poate include o marcare enzimatică, o marcare fluorescentă sau alte marcări cunoscute în domeniul de specialitate. După spălare, substratul enzimatic este adăugat și titrul de anticorpi este estimat prin determinarea modificării de absorbanță, datorită dezvoltării de culoare produsă prin alterarea substratului sau ceva asemănător.

c) Prepararea celulelor de mielom

Celule de la linii celulare de șoarece stabilizate servesc ca sursă de celule de mielom, incluzând, de exemplu, un șoarece rezistent la 8-azaguanină, derivat de la sușele de mielom Balb/c P3x63Ag8U.1 (P3-U1) (35), P3/NSI/1-Ag4-1(NS -1) (36), Sp2/0-Ag14 (SP-2) (37), P3x63Ag8.653 (653) (38) și P3x63Ag8 (X63) (39). Linia celulară selectată este transferată succesiv pe un mediu adecvat precum mediu 8-azaguanină. Mediul 8-azaguanină include mediul Dulbecco modificat de Iscove (definit în cele ce urmează drept „IMDM”) sau mediul Eagle modificat de Dulbecco (definitîn cele ce urmează drept„DMEM”). Mediul RPMI-1640 este suplimentat cu glutamină, 2-mercaptoetanol, gentamicină, serfetal de vițel (definitîn cele ce urmează drept „FCS”) și 8-azaguanină. Celulele sunt transferate apoi pe mediu normal precum mediul ASF104 (Ajinomoto, K. K.) care conține 10% FCS, cu 3 până la 4 zile anterior fuziunii, în scopul de a se asigura că cel puțin 2 x 10⁷ celule sunt disponibile în ziua fuziunii.

d) Fuziunea celulară

Limfocitele și celulele plasmei, obținute din orice parte convenabilă a animalului, sunt celule precursoare pentru a produce anticorpi. Sursele de limfocite sau de celule ale plasmei includ, ilustrativ, splina, nodulii limfatici, sânge periferic sau orice combinație adecvată a acestora, celulele splinei fiind însă sursa cea mai obișnuită.

După ultima injecție de activare, țesutul în care celulele producătoare de anticorp sunt prezente este prelevat de la șoarecele care are titrul de anticorpi predeterminat. în mod curent, tehnica favorită pentru fuziunea celulelor splinei cu celulele de mielom preparate în pasul c) utilizează polietilenglicolul.

Tehnica de fuziune include spălarea celulelor splenice și de mielom cu mediu fără ser (precum RPMI 1640) sau cu soluție salină tamponată cu fosfat (definită în cele ce urmează drept „PBS”), astfel încât raportul numărului de celule splenice la celulele de mielom să fie aproximativ între 5:1 și 10:1, urmată de centrifugare. După ce supernatantul a fost îndepărtat și celulele aglomerate (pelleted) suficient afânate, s-a adăugat la picătură cu amestecare 1 ml de mediu fără ser conținând 50% (g/v) de polietilenglicol (greutate moleculară 1.000 la 4.000). După aceea, s-au adăugat încetișor 10 ml de mediu fără ser și, apoi, s-a centrifugat. Supernatantul este din nou înlăturat și celulele aglomerate sunt suspendate într-o cantitate adecvată de mediu HAT, care conține o soluție de hipoxantină, aminopterină și timidină (definitîn cele ce urmează drept „HAT”) și interleukină-2 de șoarece (definită în cele ce urmează drept „IL-2”). Suspensia este apoi distribuită în godeurile plăcilor de cultură (definite în cele ce urmează, în mod simplu, drept „plăci”) și incubate în prezența a 5% v/v CO₂ la 37°C, pentru circa 2 săptămâni, cu adăugarea suplimentară de mediu HAT.

e) Selecția de hibridoma

Când sușa de mielom utilizată este rezistentă la 8-azaguanină, adică este deficientă în enzima hipoxantin guanin fosforibozil transferază (HGPRT), orice celule de mielom nefuzionate și orice fuziuni de mielom-mielom sunt incapabile să supraviețuiască pe mediu HAT. Pe de altă parte, fuziunile de celule producătoare de anticorp, una cu alta, ca și cele de hibridoma ale celulelor producătoare de anticorp cu celule de mielom pot supraviețui, primele având doar o viață limitată. în felul acesta, incubarea continuată pe mediu HAT va avea ca rezultat numai selecția de hibridoma dorite.

RO 123115 Β1

Hibridoma rezultată a crescut sub formă de colonii, care au fost apoi transferate pe 1 mediu HAT lipsit de aminopterină (mediu HT). După aceea, probe mici de supernatant ale culturii sunt prelevate, pentru a determina titrul de anticorpi anti-Fas prin, de exemplu, 3 analiza ELISA. Când proteina de fuziune mai sus menționată este folosită ca antigen ELISA, este de asemenea necesar să elimine clonele care produc un anticorp care se leagă specific 5 la regiunea Fc a IgG 1 umană. Prezența sau absența unei astfel de clone poate fi verificată, de exemplu, prin ELISA, folosind ca antigen Fas-lgG1 sau lgG1. 7

f) donarea

Hibridoma, la care s-a demonstrat că produce anticorpi specifici, folosind o metodă 9 similară cu cea descrisă la pasul b) pentru a determina titrul de anticorpi, este, apoi, transferată pe o alte placă pentru donare. Metodele de donare adecvate includ: metoda 11 diluției limitate, în care hibridoma este diluată până la a conține o celulă per godeul unei plăci și apoi cultivată; metoda cu agar moale, în care colonii recuperate după cultivare din mediu 13 cu agar moale; o metodă de utilizare a unui micromanipulator pentru a separa o singură celulă pentru cultivare; și „sort-a-clone” în care celulele singure sunt separate într-o mașină 15 de sortare.

Procedeul de donare conform cu, de exemplu, metoda diluției limitate, este repetată 17 de 2 până la 4 ori, pentru fiecare godeu la care s-a demonstrat un titru de anticorpi, și clonele având titrul de anticorpi stabil sunt selectate ca hibridoma producătoare de anticorp 19 monoclonal anti-DR5. Hibridoma care produce un anticorp DR5 antișoarece este selectată printr-o metodă similară pentru obținerea unei linii celulare producătoare de anticorp 21 monoclonal anti-DR5. TRA-8 hibridoma șoarece-șoarece, care este bază pentru anticorpii prezentei invenții, a fost depozitat la American Type Culture Collection, la 21 martie 2000 și 23 are numărul de acces PTA-1428. Hibridoma 2E12 a fost depozitată la American Type Culture Collection, la 24 octombrie 2001, așa cum s-a descris mai sus, și are numărul de 25 acces ATCC nr. PTA-3798. în felul acesta, când se prepară un anticorp folosind hibridoma TRA-8 șoarece-șoarece sau orice alt hibridoma stabilizat, prepararea poate fi efectuată prin 27 urmărirea unui procedeu care începe de la pasul (g) de mai jos, cu pașii de la (a) la (f) omiși.

(g) Cultura de hibridoma pentru a prepara anticorp monoclonal 29

Hibridoma obținută prin donare este apoi cultivată pe mediu normal și nu pe mediu

HT. Cultura la scară mare este efectuată prin cultivare în vase „roller”, folosind vase de 31 cultură mari sau prin cultivare în vase „spinner”. Supernatantul din cultura la scară mare este apoi recoltat și purificat printr-o metodă adecvată precum filtrarea pe gel, care este 33 binecunoscută celor specializați în domeniu, pentru a obține un anticorp monoclonal DR5 sau DR4, care reprezintă baza pentru anticorpii prezentei invenții. Hibridoma poate fi, de 35 asemenea, crescută intraperitoneal într-un șoarece singenic precum șoarecele Balb/c sau un șoarece nu/nu, pentru a se obține ascite care conțin anticorpi monoclonali DR5 sau DR4, 37 în cantități mari. Kituri de purificare pentru anticorpii monoclonali, disponibile comercial (de exemplu, MAbTrap Gll Kit; Pharmacia) sunt convenabil utilizate pentru a purifica anticorpii 39 recoltați.

Anticorpii monoclonali preparați ca mai sus au o înaltă specificitate pentru DR5 uman 41 sau, respectiv, pentru DR4 uman.

i) Analiza anticorpilor monoclonali 43

Metode de identificare convenabile ale izotipului și ale subclasei de anticorpi monoclonali includ metoda Ouchterlony, ELISA și RIA. De preferat, se folosește un kit 45 comercial pentru identificare precum Mouse Typer Kit (nume de marcă; BioRad). Determinarea cantitativă a proteinei poate fi efectuată prin metoda Folin-Lowry sau prin 47 calcul bazat pe absorbanța la 280 nm (1,4 (OD280) = 1 mg/ml Imunoglobulină).

RO 123115 Β1

Identificarea epitopului care recunoaște anticorpul monoclonal se efectuează după cum urmează. Mai întâi, sunt preparate diferite structuri parțiale ale moleculei care recunoaște anticorpul monoclonal. Structurile parțiale sunt preparate prin metoda în care diferite peptide parțiale ale moleculei sunt preparate pe cale sintetică prin tehnica cunoscută a sintezei de oligopeptide sau metoda în care ADN-ul care conține codificarea polipeptidei parțiale dorite este încorporat într-o plasmidă de expresie convenabilă și este exprimată întro gazdă adecvată precum E. Coli, pentru a produce peptidele. în general, pentru obiectivul de mai sus, ambele metode sunt frecvent folosite în combinație. De exemplu, o serie de polipeptide având lungimi reduse, în mod corespunzător, lucrând de la capătul C- sau Nterminal al proteinei antigen, poate fi preparată prin tehnici stabilite de inginerie genetică. Prin stabilirea fragmentelor care reacționează cu anticorpul, se obține o idee aproximativă a situs-ului epitopului.

Epitopul este identificat într-un mod mai apropiat, prin sintetizarea unei varietăți de oligonucleotide mai mici, corespunzătoare cu acesta sau mutante ale peptidei, folosind tehnici stabilite pentru sinteza de oligopeptide, pentru a determina o proprietate de legare a peptidelor la anticorpul monoclonal anti-DR5, de exemplu, care reprezintă baza pentru prepararea anticorpului prezentei invenții și o inhibare competitivă a legării peptidei la un antigen cu anticorpul monoclonal. Kituri disponibile comercial precum SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, Inc) și o serie de kituri de sinteză a peptidelor „multipin”, bazate pe metoda de sinteză multipin (Chiron Corp.), pot fi convenabil utilizate, pentru a obține o largă varietate de oligopeptide.

Un anticorp al prezentei invenții are proprietățile funcționale variate de la a) la f), descrise mai jos, fiecare dintre acestea fiind verificată prin, de exemplu, o metodă descrisă mai departe, în lucrarea de față.

a) Legarea specifică a lui TRA-8 la celule exprimând DR5 uman

O trăsătură unică a prezentei invenții este abilitatea de a lega DR5 de suprafață celulară. Aceasta este demonstrată prin analiza citometriei în flux a celulelor care exprimă DR5. Mai întâi, legarea specifică suprafeței celulare a lui DR5 este confirmată prin celulele COS-7 transfectate cu cADN uman de lungime totală, care conține codificarea pentru DR5 uman. în mod specific, numai TRA-8 recunoaște celulele COS-7 transfectate cu DR5, dar nu și vectorul martor gol sau vectorul care conține codificarea pentru DR4. în al doilea rând, sunt testate trei origini diferite: hematopoetică, gliom și cancer de prostată ale celulelor tumorale maligne umane. Majoritatea acestor celule tumorale transformate au exprimat niveluri semnificative ale DR5 de suprafață celulară, deși nivelurile de expresie au variat în mare măsură. în al treilea rând, au fost examinate două liste de celule fibroblast sinovial primare umane de la pacienți RA și OA. Toate celulele sinoviale RA au exprimat niveluri semnificativ mai înalte de DR5, comparativ cu celulele OA.

b) Inducerea apoptozei celulelor tumorale maligne umane in vitro, în absența crosslinkării

Abilitatea unui anticorp produs în conformitate cu prezenta invenție de a recunoaște receptorul TRAIL și de a induce în mod direct apoptoză în celule tumorale umane maligne este determinată prin testul de viabilitate celulară (ATPLite,) în timpul cultivării in vitro a celulelor cu diferite concentrații ale unui anticorp, în mod specific, ale lui TRA-8. Majoritatea celulelor tumorale sunt susceptibile de apoptoza TRA-8 indusă. Pentru câteva celule, TRA-8 manifestă o puternică activitate inductoare de apoptoză, de exemplu, TRA-8 este capabil de a induce apoptoza celulelor umane Jurkat la nivelurile de pg/ml. Important este faptul că apoptoza TRA -8-indusă nu necesită cross-linkare și la majoritatea celulelor TRA-8 manifestă o mai puternică activitate de inducere a apoptozei, decât TRAIL solubil, recombinant în prezența intensificatorului.

RO 123115 Β1

c) Activitatea tumoricidă a TRAS in vivo 1

Activitatea tumoricidă a TRA-8 a fost evaluată în două modele SCID/celule tumorale umane. în primul model, șoareci SCID au fost inoculați intravenos cu celule Jurkat de 3 leucemie umană și tratate cu o singură doză (100 pg) de TRA-8. Rezultatele prezentate demonstrează că majoritatea celulelor Jurkat implantate au fost eliminate din sângele 5 periferic și splină, prin tratament cu TRA-8, așa cum s-a determinat prin analiza de citometrie în flux și colorația imunohistochimică in situ a celulelor Jurkat. în al doilea model, celule 7 astrocitoma umane, 1321N1, au fost inoculate subcutanat în șoareci SCID și șoarecii purtători de tumori au fost tratați cu o singură doză de TRA-8. Creșterea celulelor 1321 N1 9 implantate a fost inhibată semnificativ la șoarecii tratați cu TRA-8, așa cum s-a determinat prin măsurarea mărimii tumorii și analiza histologică. 11

d) Identificarea celulelor sinoviale RA de către TRAS

Celule sinoviale primare izolate de la 8 pacienți cu RA și 4 cu OA au fost testate 13 pentru expresia de suprafață celulară a DR5. TRA-8 este capabil de a colora, în mod pozitiv, toatecelulele RA, darcoloreazăîn mod negativ toate celulele OA, astfel, RA este diferențiată 15 de OA, prin expresia de suprafață a DR5, așa cum a fost detectată de către TRA-8.

e) Inducerea apoptozei în celule fibroblast sinoviale RA de către TRAS 17

Abilitatea lui TRA-8 de a induce apoptoza celulelor sinoviale RA a fost determinată prin analiza viabilității celulare din timpul cultivării in vitro, în prezența diferitelor concentrații 19 de TRA-8. Toate celulele RA au prezentat niveluri de susceptibilitate de la niveluri înalte până la intermediare, la o concentrație de 100 ng/ml de TRA-8. în contrast, toate celulele OA 21 sunt în mod esențial rezistente la apoptoza indusă de TRA-8. Important este că TRA-8 a prezentat o activitate de inducere a apoptozei mai bună asupra celulelor sinoviale RA, decât 23 TRAIL solubil cu intensificator. Mai mult, comparativ cu anticorpul anti-Fas (CH-11), TRA-8 a manifestat o selectivitate mai bună pentru celulele sinoviale RA. 25

f) TRA-8 nu induce producerea de MMP-uri în celulele sinoviale RA

Deoarece TRA-8 este capabil de a induce activarea NF-kb în celulele sinoviale RA 27 ca TNF-a, s-a determinat efectul lui TRA-8 asupra producerii de MMP1 și MMP3 de celulele sinoviale. în timp ce TNF-a indus o creștere dependentă de doză a MMP-urilor, TRA-8 este 29 incapabil de a induce orice producere de MMP-uri și, în câteva concentrații, TRA-8 descrește în mod ușor producerea de MMP-uri în celulele sinoviale RA. 31

g) TRAS induce activarea multiplă a caspazei

Caspaza joacă un rol crucial în inducerea apoptozei. Abilitatea lui TRA-8 de a induce 33 activarea caspazei a fost determinată în celulele umane Jurkat. Când celulele Jurkat au fost incubate cu o doză scăzută (50 ng/ml) de TRA-8, s-a observat activarea caspazei 8, 35 caspazei 9 și caspazei 3, nu mai devreme de 15 min de la incubare, după cum s-a demonstrat prin analiza Western Blot și analiza de clivaj a caspazei. în ceea ce privește 37 timpul de execuție, numărul și puterea de activare a caspazei, anticorpii prezentei invenții, inclusiv anticorpul demonstrativ TRA-8, au manifestat o activitate mult mai bună decât orice 39 alt anticorp inductor de apoptoză cunoscut precum anticorpul Fas antiuman (CH-11).

Anticorpul 2E12 legatîn mod specific la DR4în forma sa solubilă are/n v/voși in vitro 41 activitate inductoare de apoptoză în celule țintă care exprimă DR4 (incluzând, de exemplu, celule canceroase, celule sinoviale de artrită reumatoidă, celule imune activate precum 43 limfocite activate și celule infectate viral), are activitate tumoricidă in vivo (de preferat, în absența toxicității pentru celulele netumorale). De preferat, anticorpul DR4 al invenției are 45 activitate de inducere a apoptozei, caracterizată prin mai puțin de circa 60,50,40,30,20 sau 10% viabilitate a celulelor țintă, la concentrații ale anticorpului de mai puțin de 30,3,0,3 sau 47 0,03 μg/ml, și o activitate tumoricidă, caracterizată prin 10,20, 30,40, 50,60, 70,80, 90 sau

RO 123115 Β1

100% reducere în mărimea tumorii. Astfel, un anticorp al prezentei invenții este o substanță având proprietatea de a induce apoptoză în mod selectiv în celule patogene, așa cum s-a demonstrat în studiul efectelor de la punctele (a) și (g). Prin urmare, acesta este util ca agent profilactic și terapeutic, pentru bolile asociate cu o supraviețuire neconvenabilă de celule sau cu o proliferare neconvenabilă de celule precum cele care pot fi atribuite dereglării sistemelor de apoptoză, inclusiv sistemul ligand Fas/Fas.

Abilitatea unui anticorp al prezentei invenții de a induce apoptoză este confirmată de cultivarea celulelor precum celulele Jurkat ale liniei celulare de leucemie umană (American TypeCulture No. TIB-152) și linia celulară de astrocitoma 1321 N1, pe mediu în care proba test a fost adăugată și s-a făcut determinarea ratei de supraviețuire, de exemplu, prin analiza ATPLite.

Anticorpul prezentei invenții, în special, anticorpii DR5 și DR4 având aproape aceeași imunogenicitate la om ca cea a anticorpilor umani, este folosit ca un agent pentru profilaxia sau tratamentul bolilor asociate cu o supraviețuire neconvenabilă de celule sau cu o proliferare neconvenabilă de celule, incluzând pe cele care pot fi atribuite dereglării sistemelor de apoptoză din bolile inflamatorii și autoimune, care includ lupusul eritematos sistemic, boala lui Hashimoto, artrita reumatoidă, boala de respingere a gazdei față de grefă, sindromul lui Sjogren, anemia pernicioasă, boala Addison, sclerodermia, sindromul lui Goodpasture, boala lui Crohn, anemia hemolitică autoimună, sterilitatea, miastenia gravis, scleroza multiplă, boala Basedow, purpura trombopenică, diabetul zaharat insulinodependent, alergia, astmul, boala atopică, arterioscleroza; miocarditele, cardiomiopatia; nefrita glomerulară; anemia hipoplastică; rejecția după transplantul de organ și numeroasele malignizări ale plămânului, prostatei, ficatului, ovarului, colonului, colului uterin, țesutului limfatic și ale sânului. Anticorpii prezentei invenții pot fi utilizați pentru a induce apoptoză țintit și selectiv în celule imune activate, incluzând limfocitele activate, celulele limfoide, celulele mieloide și celulele sinoviale reumatoide (inclusiv sinoviocitele inflamatorii, sinoviocitele de tip macrofag, sinoviocitele de tip fibroblast) și celule infectate viral (inclusiv, de exemplu, acele celule infectate cu HIV, atâta timp cât acele celule țintite exprimă sau pot fi făcute să exprime receptorii TRAIL specifici (adică DR4 sau DR5).

Un astfel de agent profilactic sau terapeutic poate fi administrat în diferite forme. Modul convenabil de administrare include administrarea orală precum cea prin tablete, capsule, granule, pudre sau siropuri, sau administrarea parenterală precum cea prin injecții sau supozitoare.

Anticorpul sau agentul terapeutic poate fi administrat oral, rectal, intracisternal, intraventricular, intracranial, intratecal, intraarticular, intravaginal, parenteral (intravenos, intramuscularsau subcutanat), local (pudre, alifii sau picături), prin injecții intraperitoneale, transdermice, prin inhalare sau sub formă de spray bucal sau nazal. Cantitatea exactă de anticorp sau agent terapeutic necesară va varia de la un subiect la altul, dependent de vârstă, greutate și starea generală a pacientului, de severitatea bolii care este tratată, de locația și mărimea tumorii, de compușii speciali administrați, de modul de administrare și de alții asemenea. O cantitate adecvată poate fi determinată prin una dintre tehnicile obișnuite din domeniu de specialitate, folosind numai experimentarea de rutină dată de învățămintele din lucrarea de față. Dozele unice tipice de anticorp se situează de la 0,1-10000 pg, de preferat între 1 și 100 pg. Concentrațiile tipice de anticorpi dintr-un purtător se situează de la 0,2 la 2000 nanograme pe mililitru administrat. Pentru o injecție într-o articulație, volumele de anticorp și purtător vor varia în funcție de articulație, dar aproximativ de la 0,5-10 ml, preferabil de la 1-5 ml, sunt injectate în genunchiul uman și aproximativ 0,1-5 ml, de preferat

1-2 ml, în glezna umană.

RO 123115 Β1 în funcție de modul de administrare dorit, anticorpul sau agentul terapeutic poate fi 1 în compozițiile farmaceutice sub formă de dozare solidă, semilichidă sau lichidă precum, de exemplu, tablete, supozitoare, pilule, capsule, pudre, lichide sau suspensii, de preferat în 3 formă de unități de dozare convenabile pentru o singură administrare a unei doze precise. Compozițiile vor include o cantitate eficientă de substrat selectat în combinație cu un purtător 5 acceptabil farmaceutic și, în plus, poate include și alți agenți medicinali, agenți farmaceutici, purtători sau diluanți. Prin „acceptabil farmaceutic” se înțelege un material care nu este de 7 dorit din punct de vedere biologic sau în alte privințe, care poate fi administrat la un individ, împreună cu substratul selecționat, fără a cauza efecte biologice nedorite, semnificative sau 9 fără a interacționa într-o manieră dăunătoare cu oricare dintre ceilalți componenți ai compoziției farmaceutice în care este conținut. 11

Compozițiile convenabile pentru injecția parenterală pot cuprinde soluții apoase sau neapoase, sterile, acceptabile fiziologic, dispersii, suspensii sau emulsii și pudre sterile, 13 pentru reconstituire în soluții injectabile sterile sau dispersii. Exemplele de purtători convenabili apoși sau neapoși, de diluanți, solvenți sau vehicule includ apa, etanolul, poliolii 15 (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol și alții asemenea), amestecuri convenabile ale acestora, uleiuri vegetale (precum uleiul de măsiine) și esteri organici injectabili precum 17 oleatul de etil. Fluiditatea corectă poate fi menținută, de exemplu, prin folosirea unui înveliș precum lecitina, prin menținerea mărimii necesare a particulei, în cazul dispersiilor și prin 19 folosirea de surfactanți.

Aceste compoziții pot conține, de asemenea, adjuvanți precum agenți de conservare, 21 de umezire, de emulsifiere sau de distribuție. Prevenirea acțiunii microorganismelor poate fi asigurată de diferiți agenți antibacterieni sau antifungici, de exemplu, parabeni, clorbutanol, 23 fenol, acid sorbic și alții asemenea. De asemenea, poate fi de dorit să se includă ageriți izotonici, de exemplu, zaharuri, clorură de sodiu și alții asemenea. Absorbția prelungită a 25 formei farmaceutice injectabile poate fi realizată prin folosirea de agenți de absorbție întârziată, de exemplu, monostearatul de aluminiu și gelatina. 27

Formele de dozare solide pentru administrare orală includ capsulele, tabletele, pilulele, pudrele și granulele. în astfel de forme solide de dozare, compusul activ este 29 amestecat cu cel puțin un excipient uzual inert (sau un purtător) precum cifratul de sodiu sau fosfatul dicalcic sau (a) materiale de umplutură sau de extindere (extenders), ca, de 31 exemplu, amidon, lactoză, zaharoză, glucoza, manitol și acid silicic, (b) lianți, ca, de exemplu, carboximetilceluloza, alginați, gelatină, polivinilpirolidonă, zaharoză și gumă 33 arabică, (c) umectanți, ca de exemplu, glicerol, agenți de dezintegrare, ca de exemplu, agaragar, carbonat de calciu, amidon de cartof sau tapioca, acid alginic, anumite complexe de 35 silicați și carbonat de sodiu, soluții de încetinire, ca, de exemplu, parafina, (f) acceleratori de absorbție, ca, de exemplu, compușii de amoniu cuaternar, (g) agenți de umectare, ca, de 37 exemplu, cetilalcoolul și monostearatul de glicerol, (h) adsorbanți, ca, de exemplu, kaolina și bentonita și (i) lubrifianți, ca, de exemplu, talcul, stearatul de calciu, stearatul de magneziu, 39 polietilengIicoli solizi, laurii sulfatul de sodiu sau amestecuri ale acestora, în cazul capsulelor, tabletelor și pilulelor, formele de dozare mai pot cuprinde și agenți de tamponare. 41

Compozițiile solide de un tip similar pot fi, de asemenea, utilizate ca umplutură în capsule gelatinoase moi și tari, umplute, folosind astfel de excipienți ca lactoza sau lapte 43 îndulcit precum și polietilenglicoli cu greutate moleculară mare și alții asemenea.

Formele de dozare solidă precum tabletele, drajeurile, capsulele, pilulele și granulele 45 pot fi preparate cu învelișuri sau anvelope precum învelișuri enterice sau altele binecunoscute în domeniu. Acestea pot conține agenți de opacifiere și pot avea, de asemenea, 47 o astfel de compoziție, încât eliberează compusul activ sau compușii activi într-o anumită

RO 123115 Β1 porțiune a tractului intestinal, într-o manieră întârziată. Exemplele de compoziții de ambalare, care pot fi utilizate, sunt substanțele polimerice și cerurile. Compușii activi pot fi, de asemenea, sub formă microîncapsulată, dacă este adecvat, cu unul sau mai mulți dintre excipienții sus menționați.

Formele de dozare lichidă, pentru administrarea orală, includ emulsii, soluții, suspensii, siropuri și extracte acceptabile farmaceutic. în plus față de compușii activi, formele de dozare lichidă mai pot conține diluanți inerți, folosiți, în mod obișnuit, în domeniul de specialitate, precum apa sau alți solvenți, agenți de solubilizare și emulsificatori, cal de exemplu, alcoolul etilic, alcoolul izopropilic, carbonatul de etil, acetatul de etil, alcoolul benzilic, benzoatul de benzii, propilenglicolul, 1,3-butilenglicolul, dimetilformamida, uleiuri, în special, uleiul de semințe de bumbac, uleiul pe bază de nuci (alune), ulei de germeni de porumb, ulei de măsline, ulei de castor și ulei de susan, glicerol, alcool tetrahidrofurfurilic, polietilenglicoli și esteri ai acizilor grași de sorbitan sau amestecuri ale acestor substanțe și altele asemenea.

Pe lângă astfel de diluanți inerți, compoziția poate include, de asemenea, adjuvanți precum agenți de umectare, agenți de emulsifiere și suspendare, agenți de îndulcire, aromare și de parfumare.

Suspensiile, în plus față de compușii activi, pot conține agenți de suspendare, ca, de exemplu, alcooli izostearil etoxilați, sorbitol polioxietilen și esteri de sorbitan, celuloză microcristalină, metahidroxid de aluminiu, bentonită, agar-agarși tragacantsau amestecuri ale acestor substanțe și altele asemenea.

Compozițiile pentru administrare rectală sunt, de preferat, supozitoare, care pot fi preparate prin amestecarea compușilor prezentei invenții cu excipienți sau purtători neiritanți adecvați precum untul de cacao, polietilenglicolul sau o ceară de supozitoare, care sunt solide la temperatură obișnuită, dar devin lichide la temperatura corpului și, pentru acest motiv, se topesc în rect sau cavitatea vaginală, și eliberează compusul activ.

Formele de dozare pentru administrarea topică a compusului acestei invenții includ alifii, pudre, spray-uri și inhalanți. Compusul activ este amestecat în condiții sterile cu un purtător acceptabil fiziologic și orice substanțe de conservare, de tamponare sau de propulsie ce pot fi necesare. Formulele oftalmice, alifiile, pudrele și soluțiile sunt, de asemenea, considerate ca fiind incluse în scopului acestei invenții. Termenii de „săruri, esteri, amide și promedicamente acceptabile farmaceutic”, așa cum sunt folosiți în lucrarea de față, se referă la acele săruri carboxilate, săruri de adiție ale aminoacizilor, esteri, amide și premedicamente ale compușilor prezentei invenții, care sunt în scopul unei rațiuni medicale sănătoase, sunt adecvați pentru utilizare în contact cu țesuturile pacienților, fără toxicitate excesivă, iritație, răspuns alergic și altele asemenea, proporțional cu un raport rezonabil beneficiu/risc, și eficienți în utilizarea intenționată a cestora, ca și formele „zwitterionic”, acolo unde sunt posibile, ale compușilor acestei invenții. Termenul de „săruri” se referă la săruri de adiție cu acizi organici și anorganici, relativ netoxice, ale compușilor prezentei invenții. Aceste săruri pot fi preparate in sittrin timpul izolării și purificării finale a compușilor sau prin reacția în mod separat a compusului purificat, sub forma sa de bază liberă, cu un acid adecvat, organic sau anorganic, și izolarea sării astfel formate. Sărurile reprezentative includ hidrobromuri, hidrocloruri, sulfați, bisulfați, nitrați, acetați, oxalați, valerați, oleați, palmitați, stearați, laurați, borați, benzoați, lactați, fosfați, tosilați, citrați, maleați, fumarăți, succinați, tartrați, mesilați naftilați, glucoheptonați, lactobionați, metansulfonați, laurosulfonați și altele asemenea. Acestea pot include cationi pe bază de metale alcaline și metale alcalino-pământoase precum sodiu, litiu, potasiu, calciu, magneziu și altele asemenea, precum și cationi netoxici de amoniu, amoniu cuaternar și amine, inclusiv, dar fără a se limita la amoniu, tetrametilamoniu, tetraetilamoniu, metilamină, dimetilamină, trimetilamină, trietilamină, etilamină și alții asemenea, (vezi, de exemplu, S. M. Barge și colab., „Pharmaceutical Salts”

J. Pharm. Sci., 1977,66: 1-19, care este încorporată în lucrarea de față prin referire).

RO 123115 Β1

Termenul de „premedicament” se referă la compușii care sunt rapid transformați in 1 vivo, pentru a produce compușii parentali ai formulei de mai sus, de exemplu, prin hidroliză în sânge. O discuție minuțioasă este furnizată în T. Higuchi și V. Stei la, „Pro-drugs as Novei 3 Delivery Systems”(Promedicametele ca sisteme noi de distribuire) Voi. 14 al A.C.S. Symposium Series și în Bioreversible Carriers in Drug Design, (Purtători bioreversibili în 5 proiectarea medicamentelor) ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. 7

O celulă țintă este o celulă a unui animal, incluzând în mod ilustrativ omul, primate neumane, pisici, câini, șobolan, șoarece, cobai, iepure, capră, oaie, vacă, cal, pui, porc, 9 marmoset (maimuța mică) și dihorul.

în plus, anticorpul sau agentul terapeutic al prezentei invenții poate exista în formă 11 nesolvatată, ca și în formă solvatată în solvenți acceptabili farmaceutic precum apa, etanolul și alții asemenea. în general, formele solvatate sunt considerate echivalentele formelor 13 nesolvatate pentru scopurile prezentei invenții.

Moleculele de anticorpi sunt purificate prin tehnici cunoscute, incluzând, în mod 15 ilustrativ, cromatografia de aminoabsorbție sau de aminoafinitate, tehnici cromatografice precum cromatografia lichidă la presiune înaltă sau o combinație a acestora. 17

Un alt aspect al prezentei invenții include un produs farmaceutic pentru folosire în distribuirea anitcorpului anti-TRAIL activ biologic sau a anticorpului receptor anti-TRAIL 19 umanizat la un vertebrat. Produsul farmaceutic include o cantitate eficientă farmaceutic de anticorp receptor anti -TRAIL sau al unui fragment al acestuia, un purtător acceptabil 21 farmaceutic și un recipient ce înconjoară purtătorul și anticorpul în mod steril.

într-o variantă preferată a invenției, o cantitate eficientă farmaceutic dintr-un anticorp 23 al invenției inhibă proliferarea celulară sau induce apoptoza prin contact cu celula țintă sau cu celulele țintă. O cantitate eficientă farmaceutic sau cantitatea dintr-un anticorp care 25 recunoaște fie pe DR5, fie pe DR4 sau un anticorp umanizat care recunoaște fie pe DR5, fie pe DR4 este o cantitate administrată la un individ, suficientă pentru a produce efectul dorit. 27 Așa cum sunt folosiți în lucrarea de față, termenii de „cantitate eficientă farmaceutic” și „cantitate terapeutică” sunt sinonimi. Efectele dorite ale administrării unei cantități eficiente 29 farmaceutic de anticorpi care recunosc pe DR5 sau pe DR4 includ moartea uneia sau a mai multor celule țintă, inhibarea creșterii uneia sau a mai multor celule țintă, stimularea lui DR5 31 sau, respectiv, a lui DR4, legarea la DR5 sau, respectiv, la DR4, și niveluri de NFkB crescute sau activitatea într-o celulă țintă. O celulă țintă este o celulă care exprimă DR5 sau DR4 și 33 include, ilustrativ, celule cu creștere anormală și celule tumorale precum papiloame și negi; cancer de sân, cancer de colon, cancer hepatic, leucemie, cancer de plămân, melanom, 35 mielom, osteosarcom, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer de prostată, cancer al capului și gâtului, cancer de tiroidă, cancer uterin, tumori ale creierului precum astrocitomas, 37 celule imune activate (adică limfocite activate, celule limfoide și mieloide activate), celule inflamatorii, celule sinoviale din artrita reumatoidă și celule infectate viral. în vivo, celula țintă 39 este o celulă a unui individ cu o stare patologică, inclusiv aceea în care proliferarea celulară este anormală sau dereglată precum cancerul malign sau benign și artrita reumatoidă. 41 într-o altă variantă preferată, celula țintă este, de asemenea, pusă în contact cu un agent terapeutic. 43

Un agent terapeutic este un compus sau o compoziție eficientă în ameliorarea stării patologice. Un exemplu ilustrativ de agent terapeutic include un compus anticancer. 45

Un compus anticancer este un compus sau o compoziție eficientă în inhibarea sau întreruperea creșterii unei celule cu creștere anormală. O cantitate eficientă farmaceutic a 47 unui compus anticancer este o cantitate administrată la un individ, suficientă pentru a produce inhibarea sau întreruperea creșterii celulei cu creștere anormală. 49

RO 123115 Β1

Exemplele ilustrative de compuși anticancer includ: bleomicina, carboplatina, clorambucil, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, daunorubicina, dactinomicina, dietilstilbestrol doxorubicina, etopozida, 5-fluorouracil, floxuridina, melfalan, metotrexat, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipozida, 6-tioguanina, vincristina și vinblastina. Alte exemple de compuși și agenți terapeutici anticancer se găsesc în The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow și colab., eds., 1987, Rahway, N. J. și Sladek și colab., Metabolism andAction of Anti-CancerDrugs, 1987, Powis și colab., eds., Taylorand Francis, New York, N. Y.

Anticorpul prezentei invenții poate fi mai departe combinat cu alte terapii precum chimioterapia și/sau radioterapia, în tratamentul malignității și eficacitatea terapeutică poate fi crescută prin compuși inductori de apoptoză precum bisindolimaleimidă VIII (Bis VIII) sau alți agenți de sensibilizare de tip SN-50 sau LY294002. Astfel, într-o variantă, anticorpul sau anticorpii prezentei invenții pot fi combinați cu Bis VIII și un compus chimioterapeutic (de exemplu, adriamicina). în altă variantă, anticorpul sau anticorpii prezentei invenții pot fi combinați cu un medicament antiinflamator nesteroidic (de exemplu, sulfura de sulindac sau alți inhibitori decât COCS-1 sau COCS-2) și un compus chimioterapeutic (de exemplu, adriamicina). în tratamentul altor boli, adică boli autoimune sau inflamatorii, pot fi utilizate, de asemenea, combinațiile de tratament. De exemplu, un anticorp poate fi administrat în combinație cu alți agenți terapeutici de tipul agențilorchimioterapeutici, agenți antiinflamatori, DMARD-uri, metotrexat, bisindolilmaleimidă VIII sau altagentsensibilizantși alții asemenea. Radioterapia poate fi, de asemenea, combinată cu alți agenți terapeutici în tratamentul bolilor inflamatorii și autoimune. O persoană specializată în domeniu va adapta forma radioterapiei la specificul bolii autoimune sau inflamatorii (de exemplu, sinovectomie iradiată în tratamentul artritei).

Terapia folosind un anticorp al prezentei invenții poate fi, de asemenea, combinată cu terapia care folosește un alt anticorp al invenției. De exemplu, un anticorp pentru DR5 poate fi administrat la un subiect care are nevoie, împreună, anterior sau în urma administrării unui anticorp pentru DR4.0 astfel de terapie combinată cu anticorpi poate fi mai departe combinată cu administrarea unuia sau mai multor agenți terapeutici (de exemplu, agent chimioterapeutic, doxorubicină și/sau metotrexat), radioterapie sau ambele. Comparativ cu anticorpul anti-DR5 anterior publicat (24), activitatea de inducere a apoptozei a anticorpului demonstrativ TRA-8 al prezentei invenții este foarte puternică și este capabilă de a induce apoptoza celulelor Jurkat cu niveluri de pg/ml in vitro și demonstrează o activitate tumoricidă superioară in vivo, comparativ cu TRAIL solubil prezentat anterior. Administrarea intravenoasă a unei singure doze de TRA-8 este suficientă pentru a inhiba creșterea atât a tumorii solide, cât și a celulelor tumorale hematopoetice, în timp ce inducerea regresiei tumorii in vivo cu TRAIL solubil necesită o doză mult mai mare (500 pg în fiecare zi, timp de 10 zile). Anticorpii receptorului anti-TRAIL ai prezentei invenții par a fi la fel de siguri ca și TRAAL solubil, deoarece, în mod exemplar, anticorpul TRA-8 nu induce apoptoza celulelor de fibroblast netransformate. Rezultate similare au fost observate și la anticorpii DR4.

Vectorii prezentei invenții includ o secvență de acid nucleic care conține codificarea lanțului greu și ușor de imunoglobulină a anticorpului DR5 sau DR4 linkatîn mod operabil la un element reglator, precum un promotor sau un intensificator. Termenul de „linkatîn mod operabil” se referă la un aranjament al secvențelor de nucleotide configurate astfel pentru a efectua funcția lor obișnuită. Astfel, un element reglator linkat, operabil la o secvență de nucleotide care conține codificarea unei polipeptide, este capabil să direcționeze transcrierea, replicarea și/sau translarea polipeptidei. Acesta va fi recunoscut de specialiștii în domeniu ca un vector unic ce include opțional secvențele codificatoare pentru ambele lanțuri, greu și ușor, ale imunoglobulinei anticorpului DR5 sau DR4. într-una din variante, vectorii conțin codificarea lanțului ușor sau a lanțului greu de imunoglobuline umanizate.

RO 123115 Β1

Următoarele exemple sunt expuse mai jos, pentru a ilustra metodele și rezultatele 1 conforme cu prezenta invenție. Aceste exemple nu au intenția de a fi inclus toate aspectele prezentei invenții, ci, mai degrabă, de a ilustra metodele și rezultatele reprezentative. Aceste 3 exemple nu au intenția de a exclude echivalențe și variații ale prezentei invenții, care sunt evidente pentru o persoană ce lucrează în domeniul de specialitate. 5 în continuare, se prezintă 30 de exemple de realizare, în legătură cu figurile, care reprezintă: 7

- fig. 1, caracterizarea lui TRA-8. (a) Specificitatea de legare a lui TRA-8: analiza

Western Blot (partea de sus a figurii): proteine de fuziune recombinante ale familiei TNFR 9 sondate cu TRA-8 sau IgG antiumană. Banda 1: DR5/proteina de fuziune hlgG1 (imunogenă); banda 2: DR4/hlgG1 (TRAIL-R1); banda 3: DR5/hlgG1; banda 4: TRAIL-R3 11 (DcR-1)/hlgG1;banda5:TRAIL-R4 (DcR-2) / hlgG1; banda6: CD95/hlgG1; banda7: TNFRI solubil. Analiza ELISA (partea de jos a figurii): numerele surselor sunt egale cu cele de la 13

Western Blot, cu excepția sursei 8, care este o proteină de fuziune murină DR5/hlgG1. (b) Activitatea de legare a TRAIL și TRA-8 la DR5 și DR4; plăcile ELISA au fost acoperite cu 15

DR5/hlgG1 (stânga figurii) sau DR4/hlgG1 (mijlocul figurii) și, apoi, incubate cu TRAIL sau TRA-8. (c) Analiza citometriei în flux a expresiei de suprafață a DR5. Celule Cos-7 17 transfectate cu vectorul de expresie pcADN3 care conține cADN-ul de lungime totală a DR5 (histograma plină), cADN -ul DR4 (histograma goală, linie continuă) sau a vectorului gol 19 (histograma goală, linie întreruptă). La 48 h după transfecție, celulele au fost colorate cu TRA-8, urmatdelgGI antișoarece PE-conjugată, (d) Reactivitatea imunohistochimicăinsitu 21 pentru DR5: lamele citospin cu celule Cos-7 transfectate cu vector de expresie DR5 sau cu vector martor au fost colorate cu TRA-8 la 48 h după transfecție, (e) Activitatea de ucidere 23 a TRA-8: celule Jurkat au fost incubate cu concentrațiile indicate de TRA-8. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin testele ATPLite, MTT și testul de excludere PI după cultivare 25 peste noapte. Rezultatele testelor ATPLite și MTT sunt prezentate ca procent al mediei martorului și rezultatele testului PI sunt prezentate ca procent de celule negative PI. (f) 27

Analiza Western Blot a activării caspazei: celule Jurkat au fost incubate cu 500 ng/ml TRA-8, pentru un timp indicat. Uzatele celulare au fost separate prin SDS-PAGE 15%, etalate și 29 sondate cu anticorpi anticaspază. Săgețile indică subunitățile clivate ale fiecărei caspaze.

(g) Testul inhibării caspazei: celule Jurkat au fost incubate cu 50 ng/ml TRA-8 peste noapte, 31 în prezența a diferite concentrații indicate de inhibitori de caspază. Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul ATPLite; 33

- fig. 2, expresia de suprafață celulară a lui DR5 și susceptibilitatea la apoptoza DR5- mediată. Celule normale T și B, izolate proaspăt din sânge periferic, linii celulare de celule 35 T (a și a'), de gliom (b și b'), de cancer de prostată (c) și de celule B (d) au fost incubate cu TRA-8 sau cu anticorp martor izotip lgG1 murin, urmat de IgG 1 antișoarece de capră PE- 37 conjugată. Histogramele goale reprezintă martorul izotipului de anticorp, în timp ce histogramele pline reprezintă colorația TRA-8. Apoptoza a fost determinată prin analiza 39 ATPLite, după incubare peste noapte cu TRAIL solubil (cercuri goale) sau TRA-8 (cercuri pline), prezentate în a, b' și d; 41

- fig. 3A', linia celulară U937 de celule T a fost incubată cu TRA-8 sau cu anticorp martor izotip IgG 1 murin. Apoptoza a fost determinată prin analiza ATPLite, după incubare 43 peste noapte cu TRAIL solubil (cercuri goale) sau cu TRA-8 (cercuri pline);

- fig. 3, liniile celulare de gliom (b) sau de cancer de prostată (c) au fost incubate cu 45

TRA-8 sau cu anticorp martor izotip lgG1 murin. Apoptoza a fost determinată prin analiza ATPLite, după incubare peste noapte cu TRAIL solubil (cercuri goale) sau TRA-8 (cercuri 47 pline);

RO 123115 Β1

- fig. 4 prezintă o serie de grafice, demonstrând viabilitatea celulară a celulelor umane Jurkat, după expunerea la concentrațiile indicate de (A) sușe de anticorpi, TRA-1, TRA-8 și TRA-10 și de (B) TRAIL, în prezența unei concentrații fixe a sușelor de anticorpi inventați, descriși în fig. 4A;

- fig. 5, expresia lui DR5 în țesut normal și canceros. Omogenate de țesut normal și canceros au fost sondate cu TRAIL-8 și developate prin chemoluminiscență. (a) Analiza Western Blot a proteinei DR5 în țesut normal: banda 1: ficat, banda 2: creier, banda 3: plămân, banda 5: rinichi, banda 6: splină, banda 6: testicul, banda 7: ovar, banda 8: inimă, banda 9: pancreas, (b). Analiza Western Blot a proteinei DR5 în țesut canceros. Au fost sondate probe de țesut canceros care conțineau cancere de ovar (banda 1), plămân (banda

2), ficat (banda 3), rect (banda 4), col uterin (banda 5), piele (banda 6), testicul (banda 7), tiroidă (banda 8), uter (banda 10), stomac (banda 11), laringofaringe (banda 12) și pancreas (banda 13). Imunohistochimia in situ a țesutului uman normal (c) și a țesutului canceros (d). Secțiunile înghețate au fost imunocolorate cu TRA-8;

- fig. 6, activitatea tumoricidă a TRA-8. Șoareci SCID au fost inoculați subcutanat cu celule 1321N1. Șoarecii au fost injectați intravenos cu o singură doză de 100 pg de TRA-8 în a doua zi după inocularea tumorii (a) sau cu trei doze de 100 ug de TRA-8, începând din a 7-a zi după inocularea tumorii (b). Creșterea tumorii a fost determinată prin greutate și examinare histologică prin colorare H&E. Fotografiile au arătat creșterea tumorii viabile la șoarecii martor, dar nu și la șoarecii tratați cu TRA-8 (c, partea de sus a figurii) și colorația H&E a tumorii (c, partea de mai jos a figurii). Șoarecii SCID au fost injectați cu 10⁶ celule Jurkat și tratați cu o singură doză de TRA-8 în a doua zi după injectare. Șapte zile mai târziu, celulele splinei au fost recoltate, colorate cu anticorp CD3 antiuman și analizate prin citometrie în flux (d) sau prin imunohistochimie (e);

- fig. 7 prezintă expresia de suprafață celulară a DR5 în celule sinoviale RA (A) și OA (B). 1 x 10⁶ celule sinoviale de cultură primară au fost colorate cu TRA-8 purificat prin cromatografie de afinitate, urmat de anticorp IgG 1 antișoarece de capră PE-conjugat. Au fost analizate 10.000 de celule viabile prin FACSvantage;

- fig. 8 prezintă o serie de grafice, demonstrând viabilitatea celulară ca o funcție a apoptozei indusă de concentrația de TRAIL și TRA-8 a tipurilor reprezentative de celule sinoviale RA (A) și OA (B) cu concentrații diferite de TRAIL solubil recombinant (cercuri goale) sau de TRA-8 purificat prin afinitate/cercuri pline. Viabilitatea celulară este procentul de cpm al celulelor tratate contra cpm -ui celulelor netratate;

- fig. 9 prezintă o serie de grafice, demonstrând dependența caspazei de apoptoza DR5-mediată a celulelor sinoviale din RA. Celule sinoviale din RA (RA512) au fost incubate cu 50 ng/ml de ligand Fas solubil (pătrate goale), anticorp anti-Fas (CH-11) (pătrate pline),TRAI L solubil (cercuri goale) sau anticorp anti-DR5 (TRA-8) (cercuri pline), în prezența variatelor concentrații de inhibitori de caspază. După cultivare peste noapte, viabilitatea celulară a fost determinată prin analiza ATPLite;

- fig. 10 prezintă o analiză electroforetică de modificare a gelului (electrophoretic gelshift assay), care indică activarea NFkb. Celule RA1016 au fost incubate cu 20 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml TRAIL solubil sau 50 ng/ml TRA-8, pentru o perioadă de timp indicată, înainte de a fi supuse electroforezei. Fig. 10B și C sunt grafice ce prezintă producția de MMP-1 și MMP-3. 1 x 10⁶/ml de celule sinoviale RA indicate au fost incubate cu concentrațiile indicate de TNF-a (cercuri goale), de TRAIL (triunghiuri goale) sau de TRA-8 (cercuri pline). După cultivare peste noapte, supernatantul culturilor a fost colectat. Nivelurile de MMP-uri din supernatantul culturilor a fost determinat prin ELISA;

RO 123115 Β1

- fig. 11, TRA-8 nu induce toxicitate hepatocelulară. (a) Țesutul de ficat normal nu 1 exprimă DR5. Secțiunile în parafină a două țesuturi normale de ficat, un țesut de carcinom hepatocelular și preparatul „citospin” de celule HepG2 au fost pregătite pentru colorația H&E 3 și secțiunile înghețate corespondente au fost colorate cu TRA-8 (b). Analiza citometriei în flux a expresiei de suprafață celulară a DR5. Hepatocite, izolate de la două țesuturi de ficat 5 normal și de la un caz de țesut de carcinom hepatocelular, și celule HepG2 au fost colorate cu TRA-8, anticorp anti-Fas (Dx2) sau un izotip de anticorp martor. Histogramele pline indică 7 colorația TRA-8 sau Dx2 și histogramele goale sunt martorii izotipului corespondent;

- fig. 12, TRAIL induce toxicitatea hepatocelulară, pe când TRA-8 nu o induce. 9

Hepatocite umane normale proaspete au fost menținute pe mediu de cultură pentru hepatocite (Hepatocyte Cultura Medium). (a) Apoptoza hepatocitelor a fost indusă cu 1 pg/ml 11 de TRAIL solubil plus cross-linker sau TRA-8 și a fost analizată la timpii indicați. Viabilitatea celulară a fost determinată prin ATPLite. Rezultatele sunt prezentate ca procent de celule 13 viabile, comparate cu martorul mediului. Barele hașurate indică TRAIL și cele negre indică TRA-8. (b) Nucleii condensați ai hepatocitelor au fost colorați cu Hoechst 33352 și analizați 15 prin citofotometrie în flux, (c) Efectul cicloheximidei asupra apoptozei hepatocitelor. Hepatocitele au fost cultivate pe mediu martor sau pe mediu cu 1 (pg/ml TRAIL sau TRA-8 17 în prezența (bare pline) sau absența (bare goale) a 1 pg/ml cicloheximidă timp de 8 h. Viabilitatea celulară a fost determinată prin ATPLite. Rezultatele sunt prezentate ca o medie 19 ± SEM a culturilor triplicate a două experimente, (d) O comparație a susceptibilității hepatocitelor normale la apoptoza DR5 și Fas-mediată. Hepatocite proaspăt izolate au fost 21 incubate cu concentrațiile indicate de TRAIL solubil, TRA-8, FasL solubil sau anticorpul monoclonal anti-Fas CH11 (anti-Fas mAb CH11) timp de 6 h. Viabilitatea celulară a fost 23 determinată prin analiza ATPLite. Rezultatele sunt prezentate ca procent de celule viabile, comparate cu martorul mediului. Pentru hepatocitele normale, este prezentată media ± SEM 25 a patru indivizi normali. Rezultatele pentru celulele de carcinom hepatocelular de la un pacient și pentru celule HepG2 sunt prezentate ca o medie a culturilor triplicate; 27

- fig. 13, TRAIL induce hepatita. Șoareci B6 au fost inoculați intravenos cu 10⁹ pfu de vector adenoviral care conține codificarea lungimii totale de TRAIL uman sub controlul 29 elementului transcripțional „Tet-on”. Expresia TRAIL a fost indusă prin dozele indicate de tetraciclină, (a) Analiza Northern Blot a expresiei TRAIL uman în ficat. La 24 h după 31 inocularea vectorului și inducerea cu tetraciclină, ARN -ul total a fost izolat din ficat și sondat cu cADN TRAIL uman sau cu β-actină. (b) Nivelurile serice ale AST. La 24 h după 33 transducția de TRAIL, nivelurile serice ale AST au fost determinate, (c) Moartea celulelor TRAIL-mediată a hepatocitelor infectate de vectorul adenoviral: șoareci B6 au fost inoculați 35 intravenos cu vector adenoviral inductibil la tetraciclină. La 48 h după inoculare, hepatocitele de la șoarecii inoculați și de la martorii neinoculați au fost izolate și incubate cu concentrațiile 37 indicate de TRAIL, timp de 8 h (stânga figurii). Viabilitatea celulară a hepatocitelor a fost determinată prin analiza ATPLite. Șoareci, inoculați cu vector adenoviral ca și sus, au fost 39 injectați intravenos cu 10 pg de TRAIL uman solubil 48 h mai târziu. Nivelurile serice de AST au fost măsurate la 24 h după injectarea de TRAIL (dreapta figurii), (d și e). Analiza 41 histologică a lezării ficatului indusă de TRAIL. Ficatul a fost colectat de la toți șoarecii la 24 h (d) sau la 7 zile (e) după transducția cu TRAIL. Secțiunile în parafină au fost colorate H&E 43 și fotografiate la o mărire de 100 x (partea de sus a figurii) și de 400 x (partea de jos a figurii);

- fig. 14 prezintă o serie de grafice, arătând că celulele T activate și celulele B 45 activate, purificate de PBMC uman, exprimă niveluri crescute de DR5, așa cum s-a determinat prin citometria în flux, pentru celulele în odihnă (gol) și celule activate (hașurate); 47

RO 123115 Β1

- fig. 15 reprezintă graficele viabilității ca o funcție a concentrației de TRA-8, pentru celulele T și B purificate, prezentate în fig. 14, care au fost stimulate timp de 48 h, cu antiCD3 sau anti-μ, în care celule activate și celulele blast au fost colectate la diferite densități de Ficoll-Paque. Viabilitatea este determinată prin analiza ATPLite;

- fig. 16 prezintă o histogramă și reprezentarea grafică a citometriei în flux, demonstrând expresia CD3 într-o populație de limfocite consemnate la șoareci NOD/SCID la care celulele NK au fost eliminate, șoareci injectați cu PBMC și TRA-8 sau IgG (martor);

- fig. 17 prezintă fotografiile microscopice ale celulelor colorate pentru CD3 și TUNEL de țesut splenic de șoarece, așa cum a fost detaliat în exemplul 13;

- fig. 18 prezintă diagramele citotoxicității pentru celule B umane normale și leucemice, leucemia limfolitică cronică (CCL) în prezența lui TRA-6, BISVIII și combinații ale acestora;

- fig. 19A prezintă legarea specifică a 2E12 la DR4. Plăci ELISA au fost învelite cu forma solubilă a proteinelor de fuziune receptor TRAI L uman-Fc IgG 1 umană, după cum s-a indicat, și incubate cu concentrațiile indicate de anticorp monoclonal 2E12, urmat de lgG1 antișoarece H RP-conjugat. Reacția a fost developată cu tampon substrat TM B și valorile OD au fost măsurate la 450/650 nM;

- fig. 19B prezintă legarea lui 2E12 la DR4 de suprafață celulară. Celule Cos-7 au fost transfectate cu vectorul care conține cADN-ul de lungime totală pentru DR4 (histograma plină) sau vectorul martor (histograma goală). Celulele transfectate au fost colorate cu 10 pg/ml 2E12 și IgG 1 antișoarece PE-conjugat. Celulele au fost analizate prin citometrieîn flux;

- fig. 19C prezintă activitatea apoptozo-inductoare a 2E12. Celule de limfom B Ramos uman au fost incubate peste noapte cu concentrațiile indicate de 2E12 în prezența a 2 pg/ml lgG1 antișoarece. Viabilitatea celulară a fost determinată prin analiza ATPLite;

-fig. 19D, activarea caspazei indusă de2E12. Celule Ramos au fost tratate cu2E12 și anticorp IgG antișoarece la timpii indicați. Activarea caspazei și clivajul PARP au fost determinate prin analiza Western Blot, folosind anticorpi specifici anti-caspază sau PARP;

- fig. 20 prezintă efectul lui 2E12 și al adriamicinei la șoareci nuzi atimici purtând grefe străine de cancer de sân. Celule 2LMP (3x 10⁷) au fost injectate subcutanat la șoareci nuzi atimici în ziua 0. Două grupe de șoareci au fost injectați intraperitoneal cu 200 pg 2E12, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 și 24. Două grupe de șoareci au primit intravenos adriamicină (6mg/kg),înziua8,12 și 16. Un grup de șoareci nu a primit anticorpi. Datele sunt exprimate ca modificare medie a mărimii tumorii, comparativ cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup);

- fig. 21 prezintă efectul lui TRA-8, 2E12 și al adriamicinei la șoareci nuzi atimici purtând grefe străine de cancer de sân. Celule 2LMP (3 x 10⁷) au fost injectate subcutanat la șoareci nuzi atimici în ziua 0. Două grupe de șoareci au fost injectați intraperitoneal cu 200 pg TRA-8 și 2E12, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 și 24. Două grupe de șoareci au primit intravenos adriaminică (6 mg/kg), în ziua 8,12 și 16. Un grup de șoareci nu a primit anticorpi. Datele sunt exprimate ca o modificare medie a mărimii tumorii, comparativ cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup);

- fig. 22 A prezintă analiza citometriei în flux a expresiei DR5 de suprafață celulară dintr-o listă de linii celulare de cancer de sân uman. Celulele de cancer de sân au fost recoltate folosind EDTA și colorate cu 10 pg/ml anticorp monoclonal (mAb) TRA-8 timp de 1 h la 4°C, urmat lgG1 antișoarece de capră PE-conjugat, apoi analizat folosind softwerele FACScan și CellQuest. Histogramele groase indică colorația TRA-8 și histogramele subțiri indică incubarea cu anticorp martor izotipul IgG 1 de șoarece;

RO 123115 Β1

- fig. 22B prezintă citotoxicitatea lui TRA-8 față de liniile celulare de cancer de sân 1 umane. Celulele au fost tripsinizate și reetalate la o densitate de 1.000 celule/godeu pe o placă de 96 de godeuri. Anticorpul TRA-8 a fost adăugat după etalarea celulelor, și s-a 3 incubat timp de 24 h, la 37°C. Viabilitatea celulară a fost evaluată la 24 h după adăugarea de TRA-8, folosind analiza ATPLite. Nivelurile de ATP sunt raportate la celulele martor 5 netratate, ca medie și SE de la 2-3 experimente independente, fiecare făcută în triplicat;

- fig. 23A prezintă citotoxicitatea în tratamentul combinat de TRA-8 și adriamicină al 7 liniilor celulare de cancer de sân uman. Celulele (1.000/godeu) au fost expuse la diferite concentrații de adriamicină timp de 24 h, la 37°C, începând cu 24 h după etalarea celulelor.9

TRA-8 a fost adăugat 24 h după adăugarea adriamicinei și nivelurile de ATP au fost determinate 24 h mai târziu. Valorile reprezintă media și SE a determinărilor triplicate de la 11

2-4 experimente independente, fiecare fiind efectuată în triplicat, și au fost raportate la celule martor netratate;13

- fig. 23B prezintă citotoxicitatea în tratamentul combinat de TRA-8 și paclitaxel al liniilor celulare de cancer de sân uman. Celulele (1.000/godeu) au fost expuse la diferite15 concentrații de paclitaxel timp de 24 h, la 37°C începând cu 24 h după etalarea celulelor. TRA-8 a fost adăugat la 24 h după adăugarea de paclitaxel și nivelurile de ATP au fost17 determinate 24 h mai târziu. Valorile reprezintă media și SE a determinărilor triplicate de la

2-4 experimente independente, fiecare fiind efectuată în triplicat, și au fost raportate la celule 19 martor netratate;

- fig. 24 prezintă efectul lui TRA-8 asupra creșterii tumorii la șoareci nuzi atimici 21 purtând grefe străine stabilizate de cancer de sân uman 2LMP. Celule 2LMP (3 x 10⁷) au fost injectate subcutanat în ziua 0. Două grupe de șoareci au fost injectate intraperitoneal cu 23 200 pg sau 600 pg TRA-8 în zilele 7, 10, 14, 17, 21 și 24. Un grup de șoareci nu a primit anticorp. Datele reprezintă media modificării în mărime a tumorii (produs a două diametre), 25 comparativ cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup);

- fig. 25 prezintă efectul lui TRA-8 și al adriamicinei asupra creșterii tumorii la șoareci 27 nuzi atimici purtând grefe străine de cancer de sân. Celule 2LMP (3 x 10⁷) au fost injectate subcutanat la șoareci nuzi atimici în ziua 0. Două grupe de șoareci au fost injectate 29 intraperitoneal cu 200 pg TRA-8 în zilele 7, 10, 14,17, 21 și 24. Două grupe de șoareci au primit intravenos adriamicină (6 mg/kg) în ziua 8, 12 și 16. Un grup de șoareci nu a primit 31 anticorp. Datele sunt exprimate ca medie a modificării în mărime a tumorii (produs a două diametre), comparativ cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup); 33

- fig. 26 prezintă efectul lui TRA-8 și al paclitaxel la șoareci nuzi atimici purtând grefe străine de cancer de sân. Celule 2LMP (3 x 10⁷) au fost injectate subcutanat la șoareci nuzi 35 atimici în ziua 0. Două grupe de șoareci au fost injectate intraperitoneal cu 200 pg TRA-8, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 și 24. Două grupe de șoareci au primit intravenos paclitaxel 37 (20 mg/kg), în ziua 8, 12, 16, 20 și 24. Un grup de șoareci nu a primit anticorp. Datele sunt exprimate ca medie a modificării în mărime a tumorii (produs a două diametre), comparativ 39 cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup);

- fig. 27 prezintă efectul lui TRA-8, al adriamicinei și al iradierii cu ⁶⁰Co asupra 41 creșterii tumorii la șoareci nuzi atimici purtând grefe străine de cancer de sân. Celule 2LMP (3 x 10⁷) au fost injectate subcutanat la șoareci nuzi atimici în ziua 0. Trei grupe de șoareci 43 au fost injectate intraperitoneal cu 200 pg TRA-8, în zilele 7,10,14,17,21 și 24. Două grupe de șoareci au primit intravenos adriamicină (6 mg/kg), în ziua 8, 12 și 16. Patru grupe de 45 șoareci au primit iradiere cu ⁶⁰Co 3 Gy, în ziua 9 și 17. Un grup de șoareci nu a primit anticorp. Datele sunt exprimate ca o medie a modificării în mărime a tumorii (produs a două 47 diametre), comparativ cu mărimea din ziua 7 (n = 8 șoareci/grup).

RO 123115 Β1

Exemplul 1. Prepararea de antigen DR5

1.1 Clonarea cADN-ului DR5

ADN-ul care conține codificarea proteinei DR5 umane este obținut prin următoarea metodă RT-PCR, folosind:

a) Matriță

ARN-ul total al celulelor HeLa este extras folosind reactivul TRIzol (GIBCO BRL). Matrița pentru reacția PCR a folosit cADN-ul, care a fost obținut prin utilizarea trusei de sinteză a primei catene ADNc (Amersham Pharmacia Biotech), în conformitate cu instrucțiunile manualului furnizat împreună cu kitul.

b) Primerii PCR

Următoarele oligonucleotide, primeri, sunt sintetizate pentru reacția PCR:

5'- gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SECV. ID. Nr. 1);

5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SECV. ID. Nr. 2).

în lipsa unei alte precizări, toate oligonucleotidele din aceste exemple sunt sintetizate prin Lifetechnologies. Toate oligonucleotidele sunt depozitate la -20°C, după ce au fost dizolvate în apă distilată.

c) Reacția PCR

Compoziția soluției pentru reacția PCR:

matriță de cADN, 5 μΙ dintr-un total de 33 μΙ de reacție;

primer DR5p1, 10 pmoli; primer DR5p2, 10 pmoli;

x tampon PCR concentrat (furnizat odată cu kitul), 10 μΙ;

dNTP-uri (2,5 mM din fiecare), 4 μΙ; și polimeraza Taq (Promega), 5 unități.

Se adaugă soluție de apă distilată sterilă până la un volum total de 100 μΙ. Fără o altă precizare, dNTP-urile sunt un amestec echimolar de dATP, dCTP, dGTP și dTTP (2,5 mM din fiecare).

Reacția PCR este condusă după cum urmează. Soluția este mai întâi încălzită la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu de încălziri la 94°C, timp de 30 s, la 52°C, timp de 1 min și la 72°C, timp de 3 min, care este repetat de 40 de ori. După ce această procedură este terminată, soluția de reacție este încălzită la 72°C, timp de 10 min.

Astfel obținute, fragmentele de ADN amplificate sunt separate pe un gel de agaroză 1 % care conține 0,25 pg/ml bromură de etidium. Benzile determinate care conțin fragmentele de ADN dorite sunt scoase folosind o lamă de ras și ADN-ul este recuperat din acestea, folosind kitul Gene Clean (BIO101). Fragmentul de ADN este donat, folosind kitul TA Cloning (Invitrogen, CA). Aceasta se efectuează după cum urmează.

Fragmentul de ADN recuperat din soluția reacției PCR, împreună cu 50 ng de vector pCR2.1, care este furnizat odată cu trusa Cloning TA, este amestecat cu 1 μΙ de 10 x tampon de reacție al ligazei (6 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM clorură de magneziu, 5 mM clorură de sodiu, 7 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidină și 0,1 mg/ml albumină serică bovină), la care s-au adăugat 4 unități de ligazăADN T4 (1 μΙ). Volumul total al amestecului este ajustat la 10 μΙ, cu apă deionizată sterilă și soluția de ligază rezultată este incubată la 14°C, timp de 15 h. După acest timp, 2 μΙ din soluția de reacție a ligazei sunt adăugați la 50 μ I de sușe TOP 10F' de E. Coli competentă, care este furnizată odată cu trusa TA de donare și adusă la competență în conformitate cu manualul de instrucțiuni, la care sau adăugat 2 μΙ de 0,5 M β-mercaptoetanol și amestecul rezultat este menținut pe gheață, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s și, din nou, pe gheață, timp de 5 min. La pasul următor, 500 μΙ de mediu conținând 2% v/v triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie, 0,05% g/v

RO 123115 Β1 clorură de sodiu, 2,5 mM clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu și 20 mM glucoză 1 (definit în cele ce urmează drept mediu „SOC”) sunt adăugați culturii și amestecul este incubat, timp de o oră, la 37°C, cu agitare. După acest timp, cultura este răspândită pe o 3 placă de mediu bulion-L cu agar (1% v/v triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie, 0,5% g/v clorură de sodiu, 0,1% g/v glucoză și 0,6% g/v bacto-agar (Difco)), conținând 100 pg/ml 5 ampicilină. Coloniile rezistente la ampicilină, apărute pe placă, sunt selectate, preluate cu bucla unei anse de platină și cultivate pe mediu de bulion-L conținând 100 pg/ml ampicilină 7 la 37°C, peste noapte, cu agitare la 200 rpm. După incubare, celulele sunt separate prin centrifugare și din acestea este preparat ADN plasmidian prin metoda alcalină. Fragmentul 9 EcoRI-EcoRI de cADN de DR5 din plasmida astfel obținută este subclonat într-o plasmidă pcADN3 (Invitrogen, CA). Lungimea totală a genei DR5 din pcADN3 a fost secvențiată și 11 găsită la fel cu secvența publicată. Plasmida astfel obținută este desemnată ca plasmida pcADN3-DR5. 13

1.2 Construirea vectorului de expresie DR5-lgG în vederea obținerii unei forme solubile a lui DR5 uman lipsit de domeniu 15 transmembranar, s-a construit un vector de expresie al plasmidei. Acest vector este desemnat a conține codificarea unei proteine de fuziune care cuprinde domeniul extracelular 17 al lui DR5 uman fuzionat la lgG1 Fc ADN (41). ADN-ul care codifică DR5 uman lipsit de domeniul transmembranar este obținut prin următoarea reacție PCR.19

a) Matriță

Ca matriță pentru reacția PCR, s-a folosit pcADN3-DR5.21

b) Primeri PCR

Următorii primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru reacția PCR:23

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SECV. ID. Nr. 1); 5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5p3: SECV. ID. Nr. 3);25

Fără altă specificare, toate oligonucleotidele sunt depozitate la -20°C, după ce au fost dizolvate în apă distilată.27

c) Reacția PCR

Reacția PCR a fost condusă și ADN-ul amplificat a fost izolat ca în exemplul 1.1 (c).29

Plasmida astfel obținută este desemnată ca plasmida pCR-ADR5. Fragmentul BamHI-EcoRI care codifică fragmentul Fc uman este recuperat din pm Fas-hlgGI, Fc este 31 subclonatăîn situsurile de multidonare BamHI și EcoRI ale pcADN3. Plasmida astfel obținută este denumită pcADNFc. în afară de aceasta, fragmentul BamHI-BamHI conținând 33 codificarea regiunii umane solubile DR5, care este recuperat din pCR-ADR5, a fost subclonat în situsul BamHI al plasmidei pcADNFc. Plasmida astfel obținută este denumită plasmida 35 pcADN ADR5-Fc. Fragmentul EcoRI conținând codificarea regiunii umane solubile DR5-lgG Fc umane, care a fost recuperată din plasmida pcADN ADR5-Fc, a fost în mod abrupt 37 terminată (bont) prin folosirea fragmentului Klenow al ADN polimerazei (GIBCO BRL) și apoi subclonată într-un vector navetă (shuttle) pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., 39 Canada) care a fost terminat în mod abrupt după tăiere de către BamHI. Plasmida astfel obținută este desemnată ca plasmida pAd ADR5-Fc. 41

1.3 Expresia și purificarea proteinei de fuziune DR5-lgG1 umană

Celulele QBI-293A (furnizate odată cu trusa ADENO-Quest) au fost co-transfectate 43 cu pAdA DR5-Fc și ADN QBI-viral (furnizat odată cu trusa ADENO -Quest), folosind trusa ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), în conformitate cu manualul de 45 instrucțiuni. Plăcile cu virus recombinant sunt cultivate și triate pentru expresia proteinei de fuziune DR5-lgG, prin analiza ELISA a supernatantului. Plăcile pozitive sunt amplificate în 47 celule QBI-293A și depozitate la -80°C ca stoc de virus. Cincizeci de plăci (150 mm) cu celule QBI-293A sunt transfectate cu virusul recombinant pAd ADR5-Fc la 10 moi. 49 (Multiplicity of Infection, Multiplicitatea infecției). Mediile de cultură sunt recoltate la 48 h după transfecție. 51

RO 123115 Β1

Celulele transfectate având gena DR5-lgG sunt crescute la o densitate celulară de 1 x 10⁶ celule/ml, prin incubare pe 500 ml de mediu DMEM (GIBCO), conținând 10% v/v FCS, la 37°C, în atmosferă de CO₂ 5% v/v, timp de 2 zile. Cultura este apoi centrifugată (1000 rpm, 5 min) și supernatantul colectat. Purificarea a DR5-lgG din supernatant este realizată folosind cromatografia de afinitate ProteinA-Sepharose CL-4B (Pharmacia), în următoarele condiții:

- coloană: coloană ProteinA-Sepharose CL-4B (mărimea coloanei 2 ml; Pharmacia);

- tampon de eluare: glicină 0,1 M (pH 2,4), 0,15 M NaCI;

- tampon de neutralizare: 1 M Tris-HCI (pH 8,5).

După ce tot supernatantul a fost aplicat pe coloană, s-a spălat de trei ori cu 20 ml de PBS și, apoi, câte 1 ml de tampon de eluare s-a adăugat de 10 ori. Densitatea optică a fiecărei fracții eluate (1 ml) a fost măsurată. Fracțiile de la a doua până la a cincea (cu OD₂₈₀> 0,1) au fost colectate și, după adăugarea a 100 pl de tampon de neutralizare, eluatele au fost plasate separat în tuburi de dializă și au fost dializate contra a un litru de PBS (pH 7,5) la 4°C. Tamponul de dializă fiind schimbat de două ori.

Eluatele au fost apoi analizate pentru expresia produsului genei DR5-lgG, prin ELISA. Mai întâi, 100 μΙ din fiecare fracție au fost plasate separat în godeurile unei microplăci cu 96 de godeuri (Costar) și incubate la 37°C, timp de o oră. După acest timp, soluția din godeuri a fost îndepărtată și placa a fost spălată de trei ori cu 100 μΙ/godeu de PBS conținând 0,1% v/v Tween 20 (definit în cele ce urmează, drept „PBS-Tween”). După spălare, PBS conținând 2% g/v albumină serică bovină (definită în cele ce urmează, drept „BSA”) a fost adăugată în cantități de 100 μΙ/godeu și placa a fost apoi incubată la 37°C, timp de o oră. După acest timp, godeurile au fost spălate suplimentar de trei ori cu 100 μΙ/godeu de PBSTween, după care 100 μΙ/godeu dintr-o soluție de anticorp monoclonal IgG antiuman diluat de 1000 ori cu PBS-Tween au fost adăugați în fiecare godeu și placa a fost încă odată incubată la 37°C, timp de o oră. Godeurile au fost apoi spălate de 3 ori cu 100 μΙ/godeu de PBS-Tween. Apoi, s-a adăugat sistemul de substrat lichid 3,3',5,5'-tetrametil-benzidină (definit în cele ce urmează, drept „TMB”) într-o cantitate de 100 μΙ/godeu și placa a fost lăsată să stea la temperatura camerei, timp de 5 min și, apoi, reacția a fost stopată prin adăugarea a 100 μΙ/godeu de 0,2 N H₂SO₄. Absorbanța fiecărui godeu a fost citită la 450 nm, pentru a estima concentrația de anticorp legat, folosind absorbanța la 650 nm ca citire martor. Absorbanța a fost măsurată folosind un cititor de microplăci (Molecular Devices). Producția de DR5-lgG a fost confirmată folosind metoda ELISA. Greutatea moleculară a proteinei de fuziune DR5-lgG1 exprimată a fost determinată folosind analiza Western blot, în care anticorpul monoclonal (mAb) lgG1 antiuman (Sigma) a fost folosit pentru a detecta anticorpul pe gel. Greutatea moleculară a proteinei de fuziune DR5-lgG1 exprimată a fost de aproximativ 50 kDa. Puritatea atinsă a fost mai mare de 90%, după cum a fost evaluată prin analiza pe SDS-PAGE și detecția proteinei s-a făcut prin colorația Coomassie blue.

Exemplul 2. Generarea de anticorpi monoclonali contra DR5 uman

2.1. Imunizarea

Șoareci Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), femele în vârstă de 6-8 săptămâni, au fost imunizați cu proteina de fuziune DR5/lgG1 umană purificată prin afinitate. Pentru imunizarea inițială a labei piciorului, proteina de fuziune (50 pg) a fost emulsifiată în adjuvant Freund complet (Difco, Detroit, Ml). Șoarecii au fost apoi menținuți sub presiune cu patru injecții de 50 pg de proteină de fuziune, administrată fără adjuvant, la fiecare a doua zi. La trei zile după ultima injecție, limfocitele din nodulii limfatici locali au fost fuzionate cu celule NS-1 de mielom și hibridoamele au fost cultivate pe mediu F104 suplimentat cu 10%

RO 123115 Β1 ser fetal de vițel. Hibridoamele pozitive sunt selectate prin analiza ELISA, în care plăcile sunt 1 învelite, fiecare, cu 1 pg/ml de DR5/hlgG 1 sau cu aceeași cantitate de Fas/hlgG1 ca martor. Izotipul hibridoamelor a fost determinat prin ELISA, folosind o înșiruire de anticorpi de capră 3 specifici pentru izotipul Ig de șoarece (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Anticorpii monoclonali sunt purificați prin cromatografie de afinitate, folosind lgG1 antișoarece 5 imobilizată sau proteina G (Sigma) imobilizată.

2.2. Fuziunea celulara 7 în a treia zi după injecția de susținere, nodulii limfatici locali au fost îndepărtați din șoarece și plasați în 10 ml de mediu RPMI 1640 fără ser (GIBCO BRL), care conține 50 9 unități/ml de penicilină, 50 pg/ml streptomicină și 300 pg/ml acid L-glutamic și apoi dezagregați prin trecerea organului printr-o sită (Cell Strainer, Falcon), folosind o spatulă. 11 Suspensia de celule rezultată a fost centrifugată, pentru a aglomera celulele nodulilor limfatici locali, care au fost apoi spălate de două ori cu mediu RPMI fără ser. Celulele spălate 13 au fost apoi resuspendate în mediu RPMI fără ser și numărate.

între timp, celulele de mielom NS1 (TIB-18 din American Type Culture Collection), 15 care au fost crescute la o densitate celulară ce nu a depășit 1x10⁸ celule/ml în mediu ASF104 (Ajinomoto, K.K.) conținând 10% v/v FCS (Gibco BRL) („mediu ASF cu ser”) la37°C, 17 în atmosferă de 5% v/v CO₂, au fost în același mod, dezagregate, spălate, resuspendate și numărate. 19

O cantitate din suspensia de celule NS1, calculată în așa fel încât să conțină 3 x 10⁷celule, a fost amestecată cu o cantitate din suspensia de celule splenice, calculată în așa 21 fel, încât să conțină 3 x 10® celule. Amestecul rezultat a fost centrifugat și supernatantul înlăturat. Pașii următori ai fuziunii celulare au fost efectuați, în timp ce s-a menținut, tot 23 timpul, tubul de plastic ce conține grămăjoara de celule la 37°C, într-un vas de laborator cu apă caldă. 25

Un mililitru dintr-o soluție 50% (g/v) de polietilenglicol 1500 (Boehringer Manheim) a fost apoi adăugată încetișor în tub, în tot acest timp agitându-se grămăjoara de celule (pellet) 27 prin folosirea vârfului unei pipete. După aceea, s-au adăugat încet, în două porții, 1 ml de mediu RPMI fără ser, preîncălzit la 37°C, urmat de adăugarea a încă 7 ml de mediu RPMI 29 fără ser. Amestecul rezultat a fost apoi centrifugat, supernatantul s-a înlăturat și s-au adăugat 10 ml de mediu HAT conținând 10% v/v FCS, în timp ce s-a efectuat o agitare 31 blândă cu vârful unei pipete. S-au adăugat încă 20 ml de mediu HAT care conține 10% v/v FCS și suspensia a fost distribuită în microplăci de cultură cu 96 de godeuri, în cantitate de 33

100 μΙ/godeu și incubate la 37°C, în atmosferă de 5% v/v CO₂. După 7 sau 8 zile, s-au utilizat câte 100 μI/ godeu de mediu HAT proaspăt, pentru a înlocui mediul din fiecare godeu ce 35 prezintă o culoare gălbuie. Celulele fuzionate din aceste godeuri au fost donate prin metoda diluției limitante, așa cum se descrie mai jos. 37

2.3. Clonarea prin diluție limitantă

Timusurile de la șoareci Balc/c, femele în vârstă de 4 până la 10 săptămâni (de la 39 Japonia SLC, Inc.), au fost prelevate, dezagregate printr-o sită (Cell Strainer, Falcon), așa cum s-a descris mai sus, și celulele dezagregate au fost spălate de două ori cu mediu HT 41 conținând 10% v/v FCS. O cantitate de celule de timus, corespunzătoare celei de la un șoarece, este suspendată în 30 ml de mediu HT conținând 10% v/v FCS, pentru a se obține 43 o suspensie celulară de alimentare (feeder). Preparatul de celule fuzionate, obținut mai sus, în exemplul 2.2, a fost diluat cu această suspensie celulară de alimentare, de la 10 până la 45 100 de ori și, apoi, diluată mai departe, în serie, cu suspensia celulară de alimente, pentru a produce suspensii ce au densități ale celulelor fuzionate de 5,1 și 0,5 celule/ml. Probele 47 astfel preparate au fost distribuite în godeurile microplăcilor de cultură a celulelor cu 96 de godeuri, într-o cantitate de 100 μΙ/godeu și incubate timp de 5 zile, la 37°C, în atmosferă de 49 5% v/v CO₂.

RO 123115 Β1

2.4. Trierea

Supernatantul culturilor de la hibridoamele crescute a fost triat prin metoda ELISA, folosind plăci învelite fie cu 1 pg/ml DR5/hlgG1, fie cu aceeași cantitate de Fas/hlgG1 (41) ca martor. Anticorpii legați au fost detectați folosind imunoglobuline antișoarece, conjugate cu peroxidază de hrean (HRP) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) cu TMB (Sigma, St Louis, Ml) ca substrat. DR5-lgG1 purificat la o concentrație de 1 pg/ml sau aceeași cantitate de Fas-hlgG1 au fost introduse într-un godeu al plăcii STRIP RIA cu 96 de godeuri, denumită „ELISA/RIA STRIP PLATE” (Costar, Ny). Placa a fost lăsată să stea la 4°C peste noapte, pentru a permite adsorbția proteinei pe suprafața godeului. După acest timp, soluția din godeuri a fost înlăturată și fiecare godeu a fost spălat de 3 ori cu PBS-Tween. Apoi au fost adăugați 100 μΙ de PBS conținând 1% (g/v) albumină serică bovină (A3803; Sigma Chemicals Co.) în fiecare godeu și placa a fost incubată la 37°C, timp de o oră. Godeurile au fost apoi spălate de încă trei ori cu PBS-Tween și, apoi, 50 μΙ din supernatantele fiecărei culturi de la hibridoamele crescute s-au adăugat în fiecare godeu. Placa a fost apoi incubată la 37°C, timp de o oră și godeurile au fost din nou spălate de 4 ori cu PBS-Tween. După spălare, în fiecare godeu s-au adăugat 50 μΙ de anticorp de imunoglobulină antișoarece de capră, marcat cu peroxidază de hrean (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), diluat de 1000 de ori cu PBS și placa a fost din nou incubată la 37°C, timp de o oră, după care godeurile au fost spălate de 4 ori cu PBS-Tween. Apoi, s-a adăugat sistemul de substrat lichid 3,3',5,5'-tetrametil-benzidină (TMB) (Sigma), într-o cantitate de 100 μΙ/godeu și placa a fost lăsată să stea la temperatura camerei, timp de 5 min, după care reacția a fost stopată prin adăugare de 100 μΙ/godeu de 0,2 N H₂SO₄. Absorbanța fiecărui godeu la 450 nm (martor 650 nm) a fost măsurată folosind un cititor de microplăci (Molecular Devices) și celulele fuzionate au fost selectate din proba care a avut o absorbanță (450 - 650 nm, Valori OD > 0,5) în mod clar mai mare decât cea la care s-a adăugat supernatant de la celule ce nu au fuzionat (valori ale OD 0,03). în afară de aceasta, supernatantele culturilor de la hibridoamele crescute au fost triate funcțional și prin măsurarea activității de inducere a apoptozei, folosind celule Jurkat. 50 μΙ de mediu RPMI conținând celule Jurkat (1.000 celule per godeu) și 5 μΜ de bisindolilmaleimidă VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, Ca) au fost adăugate în plăci de 96 godeuri, în prezența a 50 μΙ de supernatant al culturilor de hibridoame crescute. Celulele au fost cultivate într-un incubator cu umidificare la 37°C peste noapte. Apoptoza a fost determinată prin măsurarea viabilității celulare, folosind trusa ATPLite, după instrucțiunile producătorului (Packard Instrumente) și probele au fost numărate, folosind un numărător TopCounter (Packard Instruments).

2.5. Legarea lui TRAIL și TRA-8 la receptori determinată prin ELISA

Plăcile ELISA au fost învelite cu 2 pg/ml de proteină de fuziune DR4-lg sau DR5-lg și lăsate peste noapte. După blocarea cu 3% BSA, TRAIL-FLAG solubil sau TRA-8 au fost adăugați la concentrațiile indicate și incubați la 37°C, timp de o oră. Legarea lui TRAIL sau a lui TRA-8 a fost detectată cu anticorpul anti-Flag conjugat-HRP (Alexis) sau, respectiv, lgG1 anti-murin conjugat-HRP (Southern Biotechnology). Reacțiile au fost developate cu tampon substrat TMB și măsurate cu cititorul Benchmark Microplate Reader (BioRad). Valorile Kd au fost estimate după modelul legării la un situs (one-site) de regresie nelineară, folosind softul GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Pentru ELISA competitivă, s-au adăugat 100 ng/ml TRAIL-FLAG și a fost incubat în prezența a diferite concentrații de TRA-8. Legarea lui TRAIL a fost determinată la fel ca mai sus.

RO 123115 Β1

2.6. Clonarea 1

Pașii descriși în exemplele 2.3 și 2.4 de mai sus au fost repetați de 5 ori pentru celulele selectate la punctul 2.4, permițând în acest fel selecția câtorva clone hibridoma, 3 fiecare dintre acestea producând un singur anticorp care se leagă la DR5 -IgG, dar care nu se leagă la Fas-lgG. Ca rezultat al acestui proces de selecție, s-a obținut o hibridoma 5 șoarece-șoarece, denumită TRA-8 și care produce un anticorp care se leagă la DR5-lgG, dar nu la Fas-lgG. Această hibridoma, TRA -8, a fost depozitată la American Type Culture 7 Collection, la 1 martie 2000 și i-a fost alocat numărul de acces PTA-1428.

Subclasa de anticorpi produsă de hibridoma șoarece-șoarece TRA-8 (definităîn cele 9 ce urmează simplu ca „TRA-8) a fost demonstrată a fi lgG1, K, după testare cu trusa de izotipuri de anticorpi monoclonali (Pierce). 11

Folosind proteina noastră de fuziune DR5-lgG1 umană, ca imunogen, au fost obținute șapte clone de hibridoma prin triere inițială ELISA, dintre care toate sunt puternic pozitive 13 pentru DR5-lgG, dar nu și pentru proteina de fuziune Fas-lgG, ceea ce arată că hibridoamele obținute produc anticorpi care recunosc porțiunea extracelulară a lui DR5, dar nu și porțiunea 15 Fc a IgG 1 (date ne prezentate).

2.7. Analiza Western Blot 17

Filtrele pentru analiza Western Blot pentru omogenatele de țesut uman și țesut canceros au fost achiziționate de la Geno Technology (St Louis, MO). Fiecare bandă a fost 19 încărcată cu o cantitate egală de proteină, determinată de către un anticorp anti-P-actină. Blot-urile au fost sondate cu 1 pg/ml TRA-8 peste noapte, urmată de IgG 1 antișoarece de 21 capră conjugat-HRP (Southern Biotechnology) la temperatura camerei, timp de o oră și developate prin chemoluminiscență. 23

2.8 Imunohistochimia in situ

Țesuturile umane au fost obținute de la Centrul de procurare de țesuturi (Tissue 25 Procurement Center) al UAB. Secțiunile înghețate au fost fixate în etanol 70%, blocate cu 10% ser de cal în PBS și, apoi, incubate cu 10 pg/ml de TRA-8 purificat prin afinitate, la 27 temperatura camerei, timp de 60 min. S-a utilizat trusa ABC IgG antișoarece cu diaminobenzidină (Vector, Burlingame, CA), ca substrat colorimetric, pentru a vizualiza 29 reactivitatea.

2.9. Analiza activării caspazei 31

Celule Jurkat (1 x 10⁶/ml) au fost incubate cu 500 ng/ml de TRA-8. S-au separat alicoturi (30 pg de proteină) de lizat de celule pe 15% SDS-PAGE, au fost îmbibate în 33 membrane de nailon și blot-urile au fost sondate cu anticorpii anti-caspază 8, 9 și 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), urmate de anticorpi secundar conjugați -HRP și s-au vizualizat 35 prin chemoluminiscență produșii de clivaj. Setul inhibitorilor de caspază a fost procurat de la R&D Systems (Minneapolis, MN). Fiecare inhibitor de caspază a fost adăugat în cultură 37 la concentrațiile indicate.

Exemplul 3. Purificarea anticorpului monoclonal TRA-8 39

Hibridoma șoarece-șoarece, TRA-8, a fost crescută la o densitate celulară de 1 x 10⁶celule/ml prin incubare în 500 ml de mediu ASF, conținând 10% v/v FCS, la 37°C, în 41 atmosferă de 5% v/v CO₂, timp de 5 zile. Cultura a fost apoi centrifugată (1000 rpm, 5 min) și supernatantul colectat. Purificarea lui TRA-8 din supernatant a fost realizată folosind 43 cromatografia de afinitate ProteinG-Sepharose CL-4B (Pharmacia), în următoarele condiții:

- coloană: coloană de ProteinG-Sepharose CL-4B (mărimea coloanei 2 ml; 45 Pharmacia);

- tampon de eluare: 0,1 M glicină (pH 2,4), 0,15 M NaCI; 47

- tampon de neutralizare: 1 M Triss-HCI (pH 8,5).

RO 123115 Β1

După ce tot supernatantul a fost aplicat pe coloană, aceasta a fost spălată de trei ori cu câte 20 ml de PBS și, apoi, tamponul de eluare a fost adăugat în volume de 1 ml de 10 ori. A fost măsurată densitatea optică a fiecărei fracții eluate (1 ml). Fracțiile de la numărul 2 la numărul 5 (> OD₂₈₀ = 0,1) au fost colectate separat.

După adăugarea a 100 μΙ de tampon de neutralizare, eluatele au fost plasate în tuburi de dializă, în mod separat, și eluatele au fost dializate contra a un litru de PBS (pH 7,5) la 4°C. Tamponul de dializă fiind schimbat de două ori. Această probă a fost analizată pentru activitatea anticorpului anti-DR5 prin ELISA, folosind proteina de fuziune DR5-lgG umană, preparată după tehnica descrisă mai sus.

Exemplul 4. Prepararea antigenului DR4, a vectorului de expresie DR4-lgG și a anticorpului monoclonal anti-DR4

Procedeele din exemplele 1-3 au fost repetate cucADN matrița lui DR4și primerii din aceste procedee, care au fost detaliați în exemplul 1, pentru a obține antigenul DR4, care au fost utilizate ca și în exemplele 1, 2 și 3, pentru a obține anticorpul monoclonal specific contra DR4.

Exemplul 5. Anticorpi monoclonali contra DcR1 și DcR2

Anticorpii monoclonali au fost construiți contra receptorilor capcană DcR1 și DcR2, prin substituirea cADN-ului corespondent și a primerilor, pentru a crea antigenii respectivi, ca în exemplul 1. Vectorii de expresie pentru fuziunile lui DcR1 sau DcR2 cu imunoglobulină G și anticorpii monoclonali purificați rezultați au fost creați după exemplele 2 și 3.

Exemplul 6. Specificitatea anticorpului monoclonal

Cum toți receptorii pentru TRAIL și alte proteine din familia TNFR prezintă o omologie semnificativă, specificitatea exemplară a anticorpului TRA-8 pentru DR5 a fost determinată prin analiza Western Blot, folosind două proteine de fuziune DR5 -IgG umane, diferite și solubile, forme recombinante ale altor proteine înrudite. O primă proteină de fuziune DR5-lg a fost construită prin fuzionarea cADN-ului din reziduurile 1-180 ale porțiunii extracelulare ale lui DR5 și cADN-ul ce conține codificarea regiunii constante a lgG1 umane. cADN-ul fuzionat a fost donat într-un vector adenoviral recombinant (Quantum Biotechnologis, Inc., Montreal, Canada). Proteina de fuziune DR5/hlgG1 exprimată, care are o greutate moleculară relativă de 50 kDa, a fost purificată folosind o coloană de afinitate IgG antiumană (Sigma, St Louis, MO). Pentru analiza Western Blot de specificitate, o a doua proteină de fuziune recombinantă DR5/lgG1 umană, (aa. 52-212) ca și proteinele de fuziune TRAI L-R1, R3 și R4 au fost procurate de la Alexis. Formele solubile ale lui Fas și TNFR1 uman au fost furnizate prin amabilitate de către dr. Cari Edwards din Amgen, Inc., Thousanda Oaks, CA, USA. Moleculele DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4 și Fas umane, recombinante, solubile, utilizate sunt proteine de fuziune lgG1 umane. Câte 0,5 pg din fiecare proteină au fost separate pe 10% SDS-PAGE și îmbibate într-o membrană de nitroceluloză. Blot-urile au fost blocate cu 5% lapte praf în PBS la temperatura camerei, timp de o oră și sondate cu 1 pg/ml de anticorp anti-DR5 monodonal purificat (dona: TRA-8) sau 0,1 pg/ml de IgG antiuman de capră conjugat-HRP, la 4°C peste noapte. IgG antișoarece de capră conjugat cu peroxidază de hrean (HRP) a fost utilizat ca anticorp secundar, pentru a detecta legarea lui TRA-8. Bloturile au fost developate prin chemoluminiscență.

Celule Cos-7, transfectate cu vectorul pcADN3 (Clontech, Palo Alto, CA) care conține DR5 sau DR4 de lungime totală sau un vector gol, au fost folosite pentru analiza citometriei în flux. cADN-ul de lungime totală, ce conține codificarea ligandului TRAIL uman sau ligandului Fas murin, a fost donat în vectorul pTRE în aval de promotorul capabil de control asupra tetraciclinei (Clontech). FragmenteleXhol-HindlllalepTRE-hTRAILsau pTRE-mFasL au fost donate mai departe în vectorul navetă adenoviral pAdBN (Quantum Biotechnologies,

RO 123115 Β1

Inc.). Celulele gazdă 293 au fost cotransfectate cu pAd-TRE-hTRAIL liniarizat sau cu pAd- 1 TRE-mFasL liniarizat și un fragment mare de ADN al adenovirusului. Expresia ligandului TRAIL uman funcțional sau a ligandului Fas murin funcțional din „plaques” de virus 3 recombinant a fost triată folosind analiza de eliberare a ⁵¹Cr pe celule Jurkat ca ținte.

TRA-8 a reacționat puternic cu proteina de fuziune DR5-lgG (~ 50 kDa), care a fost 5 folosită pentru imunizare, așa cum s-a arătat în fig. 1 A, DR5, #1 și slab cu a doua proteină de fuziune DR5-lgG (~ 60 kDa), așa cum s-a arătat în fig. 1 A, DR5, #2. Nu există o legare 7 semnificativă a lui TRA-8 la DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) sau TNFRI. Aceste rezultate arată că TRA-8 recunoaște epitopurile care sunt specifice pentru DR5, dar care nu sunt 9 prezente la alți membri ai familiei.

TRA-8 nu reacționează cu alți membri ai superfamiliei de receptori TNF precum Fas 11 (CD95) și receptorului I al TNF, nici nu reacționează încrucișat TRA-8 cu omologul murin al lui DR5, așa cum s-a demonstrat prin proporția absorbantei optice pentru 450 nm și 650 nm, 13 la numerele 1-7 din panoul de mai jos (fig. 1 A, coloana 8 a panoului de mai jos). TRAIL solubil și TRA-8 s-au legat comparabil la DR5 imobilizat (fig 1B, panoul din stânga). în 15 contrast, TRAIL s-a legat la DR4, dar TRA -8 nu a manifestat nicio activitate de legare la DR4 (fig. 1B, panoul din mijloc). Valorile Kd pentru legarea lui TRAIL și TRA-8 la DR5aufost 17 estimate la 59 nM și, respectiv, 3 nM. Important este că TRA-8 concurează eficient cu TRAIL, pentru legare la DR5, dar nu pentru legare la DR4, așa cum s-a demonstrat prin 19 EILSA competitivă (fig. 1B, panoul din dreapta). Aceste rezultate stabilesc specificitatea lui TRA-8 pentru DR5 uman. 21

TRA-8 este capabil de a detecta expresia de suprafață celulară a lui DR5, analiza citometriei în flux indicând legarea specifică la suprafața celulară a celulelor COS-7 23 transfectate cu DR5 uman de lungime totală, dar nu și la celulele Cos-7 transfectate cu DR4 sau cu vector gol (fig. 1C). în mod similar, imunohistochimia in situ cu TRA-8 a demonstrat 25 reactivitate cu celule Cos -7 transfectate cu ADN DR5 de lungime totală, dar nu și cu aceleași celule transfectate cu vector martor (fig. 1D). TRA-8 nu induce apoptoza celulelor 27 Cos-7 netransfectate și reacția RT-PCR a ARN-plui din celule Cos-7 folosind primeri perechi ce conțin codificarea lui DR5 uman a demonstrat că nu sunt produși specifici PCR. Mai mult, 29 analiza funcțională, folosind celule Jurkat umane ca ținte, a arătat că, în absența crosslinkării, TRA-8 induceîn mod puternic moartea celulară, demonstrată prin trei analize diferite, 31 pentru viabilitatea celulară, incluzând ATPLite, MTT și excluderea PI (fig. 1E). Mai mult de 50% din celulele Jurkat au fost omorâte de TRA-8 la nivel de nanograme, așa cum s-a arătat 33 prin analiza ATPLite. Activitatea de omorâre a lui TRA-8 este specifică pentru DR5, după cum aceasta ar putea fi blocată prin DR5-lg, dar nu și de proteina de fuziune DR4-lg (date 35 neprezentate). Clivajul caspazelor 8, 9 și 3 a putut fi detectat prin analiza Western blot, nu mai devreme de 30 min după tratamentul cu TRA-8 al celulelor Jurkat (fig. 1F) și moartea 37 celulară a celulelor Jurkat a fost complet inhibată de către inhibitorul general al caspazei (ZVAD)(fig. 1G). Inhibitorii individuali de caspază pentru caspaza 8,3,9 și 10 au inhibat parțial 39 moartea celulară, indicând mai mult că moartea celulară TRA-8-mediată este mai întâi un mecanism apoptotic dependent de caspază de la un cap la altul. 41

Exemplul 7. Analiza citometrică în flux a expresiei lui DR5 de suprafață celulară: un receptor major al morții pe multe celule tumorale, dar nu și pe celule normale 43

Abilitatea lui TRA-8 de a lega DR5 exprimat pe suprafața celulară și specificitatea acestei reacții a fost apoi evaluată folosind celule COS-7 (American Type Culture Collection 45 Nr. CRL-1651) transfectate cu vector de expresie conținând cADN-ul lui DR5 sau DR4 de lungime totală sau un vector gol drept martor. lgG1 antișoarece conjugat cu ficoeritrină (PE) 47 (Pharmingen) a fost folosit ca anticorp secundar, pentru a detecta legarea la TRA-8.

RO 123115 Β1

A fost măsurată fluorescenta a 1 x 10⁴ celule, folosind un citometru cu flux (FACSVantage) în următoarele condiții:

- lungimea de undă a excitației: 488 nm;

- lungimea de undă a detecției: 600 nm.

Analiza citometriei în flux a arătat că TRA-8 a colorat aproximativ 30% din celulele COS-7 transfectate cu vector DR5, așa cum s-a prezentat în histograma plină a fig. 1C. Acest procentaj este egal cu cel al eficienței transfecției, așa cum a fost aceasta determinată prin analiza transfecției, folosind proteina fluorescentă verde (GFP) (date neprezentate). TRA-8 nu colorează semnificativ celule transfectate fie cu DR4 (histograma goală) sau vectorul martor (histograma punctată), indicând că TRA-8 este specific pentru DR5 de suprafață celulară.

Deși expresia lui DR5 în celule tumorale a fost în mod extensiv studiată la nivel mARN (introdusă în Bibliografie), expresia de suprafață celulară a lui DR5 nu a fost documentată. Astfel, disponibilitatea anticorpului monoclonal anti-DR5 ne-a permis să examinăm nivelurile de suprafață ale lui DR5 și să corelăm expresia cu sensibilitatea celulelor la apoptoza TRAIL-mediată. Următoarea înșiruire de celule (1x10⁶) a fost incubată cu 10 pg/ml de TRA-8 purificat prin afinitate, la temperatura camerei, timp de 30 min și, apoi, colorate cu IgG 1 antișoarece conjugat PE (Pharmingen) pentru încă 30 min. 10.000 de celule viabile au fost analizate folosind un citometru în flux FACSVantage, în următoarele condiții:

- lungimea de undă a excitației: 488 nm;

- lungimea de undă a detecției: 600 nm.

Cele cinci linii celulare hematopoetice testate sunt Jurkat, GEM-6, Molt -4, H-9 și U937. Expresia DR5 este detectabilă pe suprafața celulelor Jurkat, CEM -6, H-9 și U937, dar aceasta este aproape nedetectabilă pe celulele Molt-4, așa cum se arată în fig. 2a și 2A'. Deși niveluri înalte ale expresiei ARN ale DR5 au fost descrise anterior (43), analizele FACs au indicat că aceste celule nu exprimă niveluri înalte ale lui DR5 de suprafață. Aceste rezultate arată că expresia de suprafață celulară a lui DR5 nu se corelează cu expresia transcripțională a DR5, ceea ce este de neașteptat pentru un astfel de receptor. Nivelul expresiei de suprafață celulară a DR5 poate fi specific originii celulei, deoarece cea mai mare parte a celulelor de origine hematopoetică a exprimat niveluri scăzute, în timp ce cele mai multe celule de gliom și prostată au exprimat niveluri înalte de DR5.

Anticorpul monoclonal TRA-8 a fost utilizat pentru a determina rolul lui DR5 în inducerea apoptozei TRAIL-mediată, prin examinarea expresiei lui de suprafață celulară dintr-o listă de diferite tipuri de celule tumorale umane ca și a susceptibilității acestor celule la apoptoza mediată de ambii, TRAIL și TRA-8. Celule T primare ale sângelui periferic nu exprimă niveluri semnificative ale lui DR5 de suprafață celulară și sunt rezistente la apoptoza mediată atât de TRAIL, cât și de TRA-8 (fig. 2A, 2A' și 3A). Deși toate cele cinci linii celulare de leucemie T umană testate au exprimat niveluri relativ scăzute, totuși detectabile, de DR5 de suprafață celulară, două dintre acestea (Jurkat și CEM-6) sunt puternic susceptibile la apoptoza mediată atât de TRAIL, cât și de TRA-8, indicând că DR5 singur este suficient pentru a induce apoptoza în aceste celule. Celulele Molt-4 și U937 sunt parțial susceptibile la apoptoza TRAI L-mediată, dar sunt relativ rezistente la apoptoza TRA8-mediată, sugerând că alți receptori TRAIL ar putea fi implicați în transducerea unui semnal apoptotic. Celulele H-9 sunt rezistente la ambele tipuri de apoptoză, TRAIL și TRA-8 mediată, ceea ce implică o blocare mediată de o cale intracelulară anti-apoptoză. Lista de celule a inclus linii celulare de gliom malign uman, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 și astrocite normale umane, care au fost furnizate de Dr. Yancey Gillespie de la Departamentul de neurochirugie al Universității Alabama din Birmingham. Liniile celulare de cancer de prostată uman, Du154, PC3 și LnCap, au fost furnizate de dr. William Grizzle de la Departamentul de patologie al Universității Alabama din Birmingham,

RO 123115 Β1 care a obținut liniile celulare de la American Type Culture Collection. Liniile celulare de 1 leucemie T umană, de limfom al celulelor B, celule Jurkat HepG2 (American Type Culture Collection TI B-152) și celule CEM-6 CCRF-CEM (American Type Culture Collection CCL- 3 119), linii celulare de monocite, U937 (American Type Culture Collection CRL-2367) au fost procurate de la American Type Culture Collection. Toate liniile celulare de mai sus au fost 5 cultivate pe mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% FCS. Linia celulară de atsrocitoma umană, 1321N1, a fost furnizată prin amabilitate de dr. Richard Jope de la Departamentul 7 de psihiatrie al Universității Alabama din Birmingham, și cultivată pe mediu DMEM suplimentat cu 5% FCS. 9

TRAIL solubil recombinant uman, procurat de la Corporația Alexis (San Diego, CA), este o proteină de fuziune ce cuprinde domeniul extracelular al lui TRAI L uman (reziduuri de 11 aminoacizi de la 95 la 281), fuzionat la N-ul terminal de un FLAG-tag (capăt-FLAG) și o peptidă linker de 8 aminoacizi. Diferit de ce s-a raportat anterior pentru TRAIL prevăzut cu 13 un cap His (His-tagget TRAIL), această preparare a lui TRAIL singur nu induce un răspuns apoptotic puternic în celule Jurkat și necesită un anticorp anti-FLAG drept cross-linker, 15 pentru a intensifica apoptoza. Anticorpul anti-FLAG a fost procurat de la Alexis.

Toate cele 10 tipuri de celule de gliom malign uman testate au exprimat niveluri 17 detectabile de DR5 la suprafața celulară. Cele mai multe au exprimat niveluri de DR5 de la valori intermediare la înalte, așa cum au fost prezentate în fig. 2B. Trei linii, D-54MG, 19

U373MG și CH-235MG, au exprimat niveluri înalte de DR5, în timp ce șase linii, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 și 1321N1, au exprimat niveluri intermediare de DR5. Numai 21 o singură linie celulară, H-465, a exprimat niveluri scăzute de DR5. Toate cele trei linii celulare de cancer de prostată au exprimat niveluri înalte de DR5, așa cum au fost 23 prezentate în fig. 2C.

Ca și celulele T primare normale, celulele B primare nu au exprimat niveluri 25 semnificative de DR5 și nu au parcurs apoptoza după tratament fie cu TRAIL, fie cu TRA-8 (fig. 2D). Trei linii (SKW6.4, EB-3 și Raji) din cele patru linii celulare de limfom B testate au 27 exprimat niveluri relativ înalte de DR5 și sunt foarte susceptibile la apoptoza mediată atât cu TRAIL, cât și cu TRA-8. A patra linie celulară, Daudi, a exprimat niveluri scăzute de DR5 și 29 a fost mult mai puțin susceptibilă la apoptoza mediată fie de TRAIL, fie de TRA-8. Cu toate că astrocitele primare nu exprimă niveluri detectabile de DR5 de suprafață celulară (fig. 2B), 31 toate cele patru linii celulare de gliom testate au exprimat niveluri înalte de DR5. Nivelul mai înalt de expresie al lui DR5 pe celulele de gliom față de celulele T și B nu este acompaniat 33 de o susceptibilitate semnificativ mai mare la apoptoza mediată la TRAIL și DR5, sugerând că nivelul de expresie de suprafață celulară a lui DR5 nu este în mod necesar corelată cu 35 nivelul apoptozei celulelor tumorale. Reacția RT-PCR, efectuată pentru a determina niveluri de mesaj ale lui DR4, DR5 și DcR2, a detectat mesaj în toate celulele testate (tabelul 1). 37

Totuși, în general, celulele primare normale au exprimat niveluri relativ scăzute de DR5, în comparație cu celulele tumorale transformate. 39

Tabelul 1

Analiza RT-PCR a expresiei receptorului TRAIL*

Celule	DR5	DR4	DcR2
Celule primare T	<0,001	< 0,001	0,015
Jurkat	0,10	< 0,001	0,21
CEM-6	0,50	0,59	0,25

RO 123115 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Molt-4	0,10	< 0,001	0,05
H-9	0,73	0,61	0,07
Celule primare B	< 0,001	< 0,001	0,024
SKW6.4	0,95	0,66	0,45
EB3	0,40	< 0,001	0,35
Raji	0,55	0,11	0,45
Daudi	0,73	0,36	0,63
Astrocite normale	0,05	< 0,001	0,12
SH683	0,56	0,96	0,14
U87	0,44	0,56	0,21
D54	1,15	0,46	0,12
1321N1	0,25	0,35	0,05

*ARN -ul total a fost izolat din celule și reacția RT-PCR a fost efectuată așa cum s-a descris în capitolul Metode. Produșii PCR au fost separați pe gel deagaroză 3% și analizați prin sistemul Fluor-S MAXMultilmager(BioRad). Valorile au fost prezentate sub forma unui procent față de p-actină.

Exemplul 8. Inducerea apoptozei in vitro la celule maligne

Pentru a determina dacă TRA-8 induce apoptoza în celule transformate in vitro, toate celulele tumorale DR5 pozitive au fost examinate pentru susceptibilitatea acestora de a induce apoptoza fie de către TRA-8, fie de TRAIL.

Celule țintă (1 x 10³ per godeu) au fost cultivate în plăci de 96 godeuri, în prezența unor concentrații indicate de TRAIL solubil plus cross-linker (Alexis) sau TRA-8 la 37°C, peste noapte. Viabilitatea celulară a fost determinată folosind (1) trusa ATPLite, conform cu instrucțiunile producătorului (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) trusa viabilității/ proliferării celulare MTT (MTT Cell prolifaration/viability kit, Sigma); sau (3) colorarea PI a celulelor moarte și analizarea prin citometrie în flux. La finalul unei culturi, celulele au fost colorate cu 10 pg/ml PI și celulele PI negative au fost considerate ca celule viabile. Pentru analiza de nudei condensați ai hepatocitelor, celulele au fost colorate cu 10 ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes) și analizate prin citometrie în flux.

Anticorpul TRA-8 este capabil de inducere a apoptozei, în majoritatea liniilor celulare de gliom uman malign (9/10), în două din cele trei linii de cancer de prostată și în două din cele patru linii celulare hematopoetice DR5-pozitive. Acesta nu induce apoptoza în linia celulară Molt-4, care a exprimat niveluri ale suprafeței celulare aproape nedetectabile de DR5. Nivelurile de susceptibilitate ale celulelor la apoptoza TRA-8 mediată au variat totuși în mod considerabil printre liniile celulare.

Variabilitatea susceptibilității celulelor la apoptoza indusă de anticorpul TRA-8 sugerează că deși un nivel minim al expresiei de suprafață celulară a DR5 este necesar, nivelul expresiei de suprafață celulară a DR5 nu este în mod necesar determinantul inițial al susceptibilității și că și alți factori influențează acest proces. Deși toate celulele de gliom au exprimat, în general, niveluri semnificativ mai mari de DR5 de suprafață, decât au făcut-o celulele hematopoetice, susceptibilitatea celulelor de gliom la apoptoza indusă de TRA-8 nu a crescut proporțional, comparativ cu celulele hematopoetice. Susceptibilitatea a cinci linii celulare de gliom, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MGși 1321N1, la apoptoza TRA-838

RO 123115 Β1 inclusă este mare și este echivalentă cu susceptibilitatea acestora la apoptoza TRAIL- 1 mediată, așa cum s-a arătatîn fig. 3B. Două din liniile celulare de gliom, H-456 și SMK1, sunt mult mai puțin susceptibile la apoptoza indusă de TRA-8. în cazul celulelor H-456, expresia 3 de suprafață a DR5 este scăzută; cu toate acestea, expresia de suprafață a DR5 în celule

SMK1 este similară cu cea a celor mai multe linii celulare susceptibile, sugerând că alte 5 mecanisme potjuca un rol în determinarea susceptibilității la apoptoza TRAIL-mediată. Deși toate cele trei linii celulare de cancer de prostată au exprimat niveluri înalte de DR5, celulele 7 Du145 sunt cele mai sensibile la apoptoza TRA-8-indusă, celulele PC3 sunt parțial sensibile în timp ce celulele LnCAP sunt complet rezistente, așa cum s-a arătat în Figura 3c. Printre 9 celulele hematopoetice, s-a găsit că celulele Jurkat și CEM-6 sunt foarte susceptibile la apoptoza TRA-8-indusă, așa cum s-a arătat în fig. 2A, deși amândouă aceste linii celulare 11 au fost găsite exprimând niveluri scăzute de DR5. Cu toate că DR5 este detectabil în celule

U937, aceste celule sunt rezistente la apoptoza TRA-8-indusă. Similar, deși celulele H-9 au 13 exprimat niveluri detectabile de DR5, celulele H-9 sunt rezistente la apoptoza indusă de TRA-8. Aceste rezultate au implicat existența unor mecanisme reglatoare care influențează 15 apoptoza DR5-mediată.

Anticorpi adiționali anti-DR5 de legare la suprafață au fost produși la fel ca și în 17 procedeele din exemplele 1-3. Doi anticorpi adiționali anti-DR5, desemnați ca TRA-1 și TRA10, au fost studiați, împreună cu TRA-8, pentru a determina comparativ abilitatea de a induce 19 apoptoza și, prin urmare, acționează ca un agonist sau, dimpotrivă, blochează apoptoza TRAIL-mediată, prin urmare, acționează ca un antagonist. Celulele Jurkat umane au fost 21 utilizate ca țintă, pentru a determina activitatea agonistă și/sau antagonistă a celor trei anticorpi anti-DR5, denumiți TRA-1, TRA-8 și TRA-10. Așa cum s-a arătat în fig. 4, 23 viabilitatea celulară este de circa 90, 70 și 20%, pentru TRA-10, TRA-1 și, respectiv, TRA-8, după o incubare peste noapte cu 2,5 pg /ml. TRA-8 a indus un puternic răspuns apoptotic, 25 într-un mod dependent de doză, în timp ce TRA-1 a indus doar un răspuns apoptotic moderat și TRA-10 a indus numai un răspuns slab. TRA-8 a fost prin urmare clasificat ca un 27 anticorp anti-DR5 agonist. în fig. 4, viabilitatea celulelor Jurkat umane a fost demonstrată ca o funcție dependentă de doză a apoptozei TRAI L-indusă. TRA-10 a blocat apoptoza celulelor 29 Jurkat umane, într-o măsură semnificativă, la o doză scăzută, în studiul apoptozei TRAILindusă. Astfel, TRA-10 a fost clasificat ca un anticorp anti-DR5 antagonist. 31

Susceptibilitatea a cinci linii celulare de gliom, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235MGși 1321N1, la apoptoza TRA-8-indusă este echivalentă cu susceptibilitatea acestora, la 33 apoptoza TRAIL-mediată, așa cum s-a arătat în fig. 3B, care arată că apoptoza TRAILindusă în aceste celule a fost mediată inițial prin DR5. Mai mult, două din liniile celulare de 35 gliom, Hs683 și U251-MG, sunt rezistente la apoptoza TRAIL-indusă, dar parțial sensibile la apoptoza TRA-8 -indusă, indicând că receptorii capcană funcționează în aceste celule și 37 că folosirea anticorpului TRA-8 ocolește acest mecanism reglator. în liniile celulare de cancer de prostată, în ciuda sensibilității variate a celulelor la apoptoza indusă de TRA-8, acesta a 39 egalat sensibilitatea celulelor la apoptoza indusă de TRAIL, sugerând din nou că DR5 joacă un rol major în apoptoza TRAIL-mediată în celulele cancerului de prostată. Printre celulele 41 hematopoetice, s-a descoperit că Jurkat și CEM-6 sunt foarte susceptibile la apoptoza mediată atât de TRAI L, cât și de TRA-8. Nivelul apoptozei induse de TRA-8 este comparabil 43 cu cel indus de TRAIL, așa cum s-a arătatîn fig. 2A și 3A'. Numai una din liniile celulare de gliom, U87, și două linii celulare hematopoetice, U937 și Molt-4, au manifestat sensibilitate 45 la apoptoza TRAIL-indusă, dar sunt mai puțin sensibile sau rezistente la apoptoza TRA-8 indusă. O linie celulară, linia celulară H-9, a exprimat niveluri detectabile de DR5, dar care 47 sunt rezistente la apoptoza indusă fie de TRAIL, fie de TRA-8. în timp ce niveluri minime de

RO 123115 Β1 expresie ale lui DR5 sunt necesare pentru apoptoza TRA-8-indusă, nivelul de expresie al DR5 nu prezice în mod necesar susceptibilitatea celulelor la apoptoza TRA-8-mediată; receptorii capcană joacă un rol important în modularea apoptozei TRAIL - mediată în câteva celule, dar nu pare a juca un rol majorîn cele mai multe din celulele testate până acum; așa cum s-a anticipat, anticorpul TRA-8 ocolește efectele receptorilor capcană, mutațiile funcționale ale receptorului DR5 se pot produce în celulele transformate, și, în final, mecanismele de reglare intracelulară pot fi la fel de importante sau mai importante decât receptorii capcană în definirea susceptibilității celulelor la apoptoza TRAI L - mediată și DR5 mediată.

Studiile precedente au demonstrat că mARN-ul pentru DR5 este larg distribuit în țesuturile normale⁷. Pentru a evalua expresia DR5 la nivel de proteină, o listă de omogenate de țesut uman normal (Geno Technology, St. Louis, MO) a fost sondată cu anticorp TRA-8 în analiza western blot. Printre nouă țesuturi umane normale, țesutul creierului este slab pozitiv (fig. 5A, banda 2). Proteina DR5 nu este detectabilă prin reactivitatea TRA-8 în ficat (banda 1), plămân (banda 3), rinichi (banda 4), splină (banda 5), testicule (banda 6), ovar (banda 7), inimă (banda 8) sau pancreas (banda 9). în contrast, toate cele treisprezece țesuturi canceroase umane s-au colorat pozitiv cu TRA-8 (fig. 5B), inclusiv cancere de ovar (banda 1), plămân (banda 2), ficat (banda 3), rect (banda 4), col uterin (banda 5), piele (banda 6), testicule (banda 7), tiroidă (banda 8), uter (banda 10), stomac (banda 11), laringofaringe (banda 12) și pancreas (banda 13). Mai mult, imunohistochimia in situ a țesuturilor normale și canceroase cu TRA-8 a confirmat că, în afară de câteva celule pozitive împrăștiate în splină, expresia DR5 în țesut normal de sân, plămân și splină nu este detectabilă (fig. 5C). Țesutul canceros corespondent incluzând carcinomul canalelor de infiltrare ale sânului (breast infiltrating ductal carcinoma), cancerul celulelor mici ale plămânului (small cell lung cancer) și limfomul au reacționat în mod pozitiv cu TRA-8 (fig. 5D). Dintr-un total de 22 de țesuturi canceroase examinate, 5 din 6 cancere de sân, 2 din 2 cancere de col uterin, 4 din 5 cancere de ficat, 5 din 8 limfoame, 2 din 2 cancere de plămân și 2 din 2 cancere de prostată au reacționat în mod pozitiv cu TRA-8. Aceste rezultate sunt compatibile cu cele ale analizei citometriei în flux și arată că țesutul canceros exprimă niveluri mai mari de proteină DR5 decât o fac țesuturile normale.

Exemplul 9. Activitatea tumoricidă a lui TRA-8 in vivo

Din diferite motive, mulți agenți care au promis în studiile in vitro nu au demonstrat eficiență in vivo. De aceea, este foarte important să se testeze eficiența lui TRA-8 pe un model animal in vivo. Pentru a realiza aceasta, anticorpul DR5 antiuman TRA-8 a fost administrat la șoareci purtând xenogrefe umane care exprimă molecula DR5 umană. Șoarecii folosiți au fost șoareci NOD/SCID în vârstă de 6 până la 8 săptămâni (Jackson Laboratory), care au fost inoculați subcutanat cu celule astrocitoma umane 1321N1 (1 x 10⁷) sau au fost inoculați intravenos cu celule Jurkat leucemice umane (1 x 10®). în ziua a 2-a după inocularea tumorii, șoarecii au fost inoculați intravenos cu TRA-8 (100 pg). Cinci zile după tratamentul cu TRA-8, creșterea tumorii 1321N1 a fost determinată prin mărimea și creșterea greutății masei tumorii. Creșterea celulelor Jurkat a fost determinată prin determinarea greutății splinei și prin procentul de celule Jurkat CD3-pozitive umane în splina animalelor inoculate. Au fost efectuate biopsii ale țesuturilor tumorale, care au fost examinate histologic.

Tratamentul timpuriu cu o singură doză intravenoasă de 100 pg de TRA-8 la o zi după inocularea tumorii a inhibat complet celulele 1321N1 de la formarea unei tumori solide (fig. 6A). Tratamentul întârziat cu trei doze de 100 pg TRA-8 la o săptămână după inocularea tumorii a redus greutatea tumorii de patru ori sau mai mult (fig. 6B). Formarea tumorii nu a fost vizibilă la animalele tratate cu TRA-8 într-un stadiu timpuriu (fig. 6C, panoul superior).

RO 123115 Β1

Analiza histologică a relevat un țesut tumoral dramatic degenerat la animalele tratate cu 1 TRA-8 (fig. 6C, panoul inferior), în mod similar, tratamentul cu TRA-8 a inhibat popularea splinei de către celulele Jurkat, așa cum s-a demonstrat prin raritatea de celule Jurkat CD3- 3 pozitve din splină (fig. 6D și E). Analiza histologică a tumorii implantate a arătat puține celule tumorale dispersate în țesutul moale la animalele tratate cu TRA-8, în timp ce martorii au 5 prezentat formarea unei tumori solide, așa cum s-a arătat în fig. 6C. în modelul celulelor Jurkat, numărul de celule Jurkat în splinele animalelor tratate cu TRA-8 este mai mic de 2%, 7 comparativ cu aproape 10% în splina animalelor martor, după cum s-a demonstrat prin analiza citometriei în flux și s-a arătat în fig. 6A și prin colorarea CD3 in situ din fig. 6C. 9

Aceste rezultate confirmă recenta demonstrație că administrarea sistemică de TRAI L recombinant cross-linkat inhibă creșterea tumorii in vivo (13). Aceste rezultate arată că o 11 singură doză de TRA-8 este extraordinar de eficientă în eliminarea celulelor tumorale in vivo.

La fel un anticorp antiuman a fost folosit într-un model murin, dar toxicitatea 13 tratamentului cu TRA-8 nu a putut fi evaluată. Totuși, studiul administrării de TRAIL in vivo a indicat că nicio toxicitate semnificativă nu este asociată cu acest tratament (13). 15

Exemplul 10. Celulele sinoviale RA sunt susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL și TRAS 17

Majoritatea studiilor de specialitate anterioare asupra apoptozei TRAIL- mediată au fost concentrate pe celule maligne. Apoptoza TRAIL- mediată în conformitate cu prezenta 19 invenție este și aceasta un agent terapeutic în stări autoimune și inflamatorii precum RA.

10.1. Analiza prin citometrie în flux a expresiei lui DR5 de suprafață celulară în celule 21 sinoviale RA

Expresia lui DR5 pe o listă de opt culturi primare de celule sinoviale de la pacienți cu 23 RA a fost comparată cu cea de opt culturi primare de celule sinoviale de la pacienți cu osteoartrită (definită în cele ce urmează drept „OA”). Cele opt culturi primare de celule 25 sinoviale RA umane: RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716și RA929 au fost furnizate prin amabilitate de către dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, 27 Japonia) și cultivate pe mediu DMEM suplimentat cu 10% FCS, penicilină, streptomicină și glutamină. Șapte culturi celulare primare de celule sinoviale OA au fost izolate din țesuturi 29 sinoviale ale unor pacienți OA prin metoda colagenezei standard și cultivate în aceleași condiții. Numărul de pasaje al tuturor celulelor primare a fost sub 10. Expresia lui DR5afost 31 determinată prin analiza FACs, așa cum s-a descris în exemplul 5.

Toate culturile primare de celule RA au exprimat niveluri înalte ale DR5 de suprafață 33 și există o mică variație în nivelurile de expresie printre aceste celule sinoviale izolate de la diferiți pacienți, după cum se arată în fig. 7A. în contrast, expresia lui DR5 de suprafață pe 35 suprafața celulelor sinoviale izolate de la pacienți OA este foarte scăzută sau nedetectabilă, ca în fig. 7B. La celulele sinoviale SV40 - transformate s-a descoperit că exprimă niveluri 37 înalte de DR5, comparabile cu cele prezentate de către celulele RA. în contrast, celulele fibroblast netransformate au exprimat niveluri scăzute de DR5, comparativ cu cele 39 prezentate de celulele OA în fig. 7B.

10.2. Susceptibilitatea celulelor sinoviale RA la apoptoza mediată de TRAS sau 41 TRAIL în general, toate celulele sinoviale izolate de la pacienți RA sunt susceptibile la 43 apoptoza indusă atât de TRAIL, cât și de anticorpul anti-DR5 și toate celulele OA sunt rezistente la apoptoza indusă atât de TRAIL, cât și de anticorpul anti-DR5, ca în fig. 8A și B. 45 Aceste studii arată că anticorpul TRA-8 țintește cu prioritate celulele alterate față de cele normale. în afară de aceasta, tiparul de susceptibilitate sau rezistență la apoptoza indusă de 47 TRAIL este corelată cu cea indusă de anticorpul anti-DR5, ceea ce arată că celulele sinoviale utilizează în primul rând DR5, pentru a declanșa apoptoza TRAIL. 49

RO 123115 Β1

Așa cum s-a descris pentru celulele maligne, susceptibilitatea la apoptoza indusă prin TRAIL sau anticorpul anti-DR5 variază printre celulele sinoviale RA cu toate că exprimă niveluri similare de DR5. RA-512 și RA-707 sunt cele mai susceptibile, astfel că peste 80% celule au fost omorâte la concentrații de TRAIL sau TRA-8 sub 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 și RA-929 sunt printre cele cu susceptibilitate intermediară la TRAIL sau TRA-8, cu o moarte celulară de aproape 100%, care se produce în prezența unor concentrații ridicate (> 50 ng(ml) de TRAIL sau TRA-8. în celulele RA-1016 și RA-1021, deși majoritatea (peste 60%) din celule au fost omorâte de o doză scăzută de TRAIL sau TRA-8, o parte de celule au supraviețuit în prezența concentrațiilor ridicate de TRAIL sau TRA-8, ceea ce arată că o subpopulație de celule este rezistentă la apoptoza TRAIL - mediată . în contrast, toate celulele OA sunt mult mai puțin susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL și de TRA-8. în OA52F și OA69F nu au fost omorâte mai mult de 60% de celule, chiar în prezența unor concentrații ridicate de TRAIL sau TRA-8. Celulele OA72M au fost complet rezistente la apoptoza indusă de TRAIL sau TRA-8. Celulele sinoviale SV40 transformate sunt de asemenea susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL și TRA-8 (date neprezentate). în contrast, celulele fibroblast netransformate par să fie rezistente la TRAIL și TRA-8.

S-a demonstrat, în prealabil, că DR5 utilizează o cale dependentă de FADD/caspaza 8, pentru a declanșa apoptoza (44). Pentru a determina dependența de caspază a apoptozei DR5 - mediată a celulelor sinoviale RA, celule RA au fost cultivate cu TRAIL sau anticorp anti-DR5, în prezența inhibitorilor specifici de caspază. Printre cei opt inhibitori de caspază testați, inhibitorii caspazei 6,8 și 10 sunt capabili dea inhiba apoptoza celulelor sinoviale RA indusă de amândoi, TRAIL și TRA-8, așa cum s-a arătat în fig. 9, indicând că aceste trei caspaze sunt implicate în apoptoza DR5 - mediată.

10.3. TRA-8 sau TRAIL induce activarea NF-Kb în celule sinoviale RA, fără eliberare crescută de MMP-uri

Există o bază considerabilă pentru a susține conceptul că sunt legături strânse între semnalarea apoptozei și semnalarea proliferării (45). S-a stabilit că DR5 este capabil de a activa calea NF-Kb în plus față de transducerea semnalului apoptotic și că activarea NF-Kb poate fi capabilă de a transduce un semnal anti-apoptotic. Prin urmare, s-a efectuat un test gel-shift. Celulele au fost stimulate cu 50 ng/ml de TRAIL recombinant solubil, ligand Fas, în prezența a 1 mg/ml intensificator sau 50 ng/ml de TRA-8, pentru un timp indicat. Extractele nucleare au fost preparate și incubate cu sonda oligo-ADN dublu-colorată, marcată [³²Pj. Rezultatele au fost analizate folosind un aparat „cyclone phospha-imager” (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). După ce celulele sinoviale RA au fost incubate cu TNF-a sau TRAIL, NF-Kb a fost activat într-un mod dependent de timp. Anticorpul TRA-8 este capabil de a activa puternic NF-Kb. în contrast, ligandul Fas este incapabil de a induce activarea NF-Kb, ca în fig. 10A.

Astfel, cu toate că TRAIL și anticorpul TRA-8 induc un puternic răspuns apoptoticîn celulele sinoviale RA, aceștia activează de asemenea și NF-kb și activarea NF-kb a fost considerată a contribui la rolul proinflamator al TFN-α în RA. Prin urmare, este posibil ca TRAIL, ca și TNF-α, să poată servi ca o citokină proinflamatoare. Pentru a determina dacă există o consecință biologică similară a activării NF-kb indusă de TRAIL și TNF-α, producția de MMP-uri a fost determinată prin ELISA. Celulele sinoviale au fost cultivate peste noapte pe mediu singur sau cu 50 ng/ml interleukină 1b, 10 ng/ml TNF-a, 50 ng/ml TRAIL sau 50 ng/ml TRA-8. Nivelurile de MMP-1 și MMP-3 în supernatantul culturilor a fost determinat prin kituri ELISA.

Când celulele sinoviale RA au fost incubate cu o citokină proinflamatoare, TNF-α sau IL-1b, producția de MMP-1, 3 și 13 a crescut comparativ cu mediul martor, așa cum s-a prezentat în fig. 10B și C. în contrast, tratamentul cu TRAIL sau anticorp anti-DR5 nu a fost asociat cu o eliberare crescută a acestor MMP-uri.

RO 123115 Β1

Exemplul 11 A. Eșec în a induce toxicitate hepatocelulară1

Pentru testul viabilității celulare de 24 h, au fost procurate hepatocite umane normale, proaspete, în plăci de 96 de godeuri de la In Vitro Technoloy (Baltimore, MD). Hepatocitele3 au fost cultivate pe mediu de cultură pentru hepatocite (Hepatocyte Culture Medium), conținând 1 ng/ml fie de TRAIL solubil, fie de TRA-8. Pentru testul de viabilitate la 6 h,5 hepatocite normale sau celule de cancer hepatocelular au fost izolate din eșantioane chirurgicale colectate de la UAB Tissue Procurement Center. Toți reactivii pentru izolarea7 hepatocitelor umane, incluzând tamponul de perfuzie pentru hepatocite, mediu de digestie, mediu de spălare și mediu de atașare, au fost procurate de la Gibco. Lamelele de țesut au 9 fost supuse digestiei în Hepatocyte Digest Medium la 37°C, cu agitare (50 rpm) timp de o oră. Hepatocitele izolate au fost recoltate prin centrifugare la viteză scăzută (50 g, 3 min) și 11 spălate, cu mediu de spălare a hepatocitelor, de șase ori. Suspensia de celule unice a hepatocitelor a fost cultivată în mediu de atașare conținând 10% FCS pe plăci Matrigel cu 13 96 godeuri (BD), timp de 6 h. Hepatocitele neatașate au fost îndepărtate prin spălare de două ori cu de mediu de atașare preîncălzit. Hepatocitele atașate au fost incubate în 15 continuare cu variate concentrații de TRAIL solubil sau FasL, în prezența unui cross-linker sau a TRA-8 sau CH 11, timp de 6 h. 17

TRAIL are cel puțin doi receptori (DR4 și DR5) care sunt capabili de inducerea apoptozei. TRA-8 a fost utilizat pentru a determina dacă cross-linkarea lui DR5 singur este 19 suficientă pentru a induce apoptoza în hepatocitele normale. Expresia DR5 la nivel de proteină a fost examinată inițial în cinci țesuturi de ficat uman normale și în cinci țesuturi de 21 ficat canceroase prin imunohistochimie in situ, folosind TRA-8. Secțiunile din țesuturi de ficat normale au prezentat o arhitectură și o morfologie celulară normală la colorația H&E (fig. 23 11 A, panourile superioare din stânga), în absența unei reactivități pozitive cu TRA-8 pentru DR5 (fig. 11 A, panouri inferioare, stânga). în contrast, țesutul de carcinom hepatocelular 25 uman a reacționat pozitiv cu TRA-8, într-un tipar compact, cu prezența de DR5 atât în membrana celulară, cât și în citoplasmă celulelor canceroase. Linia celulară de carcinom 27 hepatocelular uman HepG2 este și aceasta pozitivă pentru DR5. Aceste rezultate sunt consecvente printre cele cinci țesuturi de ficat normal și numai unul (adenom de ficat) din 29 cele cinci țesuturi canceroase de ficat este DR5 - negativ. Aceste rezultate sunt compatibile cu datele analizei Western blot, prezentate în fig. 5A, în care, la fel cu alte țesuturi normale, 31 țesutul de ficat uman normal nu a exprimat niveluri semnificative de proteină DR5. în afară de aceasta, analiza Western blot a hepatocitelor umane normale, izolate, sondate cu TRA-8, 33 nu a relevat niveluri detectabile de DR5.

Expresia de suprafață celulară a lui DR5 pe hepatocitele umane, prin analiza 35 citometriei în flux, a demonstrat că hepatocitele normale, proaspăt preparate, nu au exprimat niveluri detectabile de DR5 de suprafață celulară (fig. 11B, panourile de sus stânga). Nicio 37 expresie nu a fost detectată pe hepatocitele umane normale care au fost crioprezervate sau plasate în cultură pe termen scurt. în contrast, celulele carcinomului hepatocelular proaspăt 39 izolate, la fel ca și celulele HepG2 exprimă DR5 de suprafață celulară. Folosind Fas ca o comparație, hepatocitele normale, celulele de carcinom hepatocelular și celulele HepG2 au 41 exprimat toate niveluri echivalente de Fas (fig. 11B, panouri inferioare). Aceste rezultate sunt compatibile cu cele obținute folosind imunohistochimia in situ și Western blot, și arată că 43 DR5 de suprafață celulară a fost exprimat în mod crescut în celulele de ficat canceros, dar nu și în hepatocitele normale. Prezența nivelurilor de mARN, pentru DR4, DR5, DcR1 și 45 DcR2, în hepatocitele umane, demonstrată prin RT-PCR²³, sugerează că hepatocitele umane ar putea exprima niveluri foarte scăzute de proteină DR5, care sunt sub pragul de detecție 47 de către TRA-8.

RO 123115 Β1

Pentru a determina dacă TRA-8 induce toxicitate hepatocelulară, s-a examinat susceptibilitatea hepatocitelor umane normale la apoptoza indusă de TRA-8 și de TRAIL solubil plus un cross-linker. Când hepatocitele normale au fost cultivate în prezența unei concentrații mari de TRAIL, s-a observat o descreștere în funcție de timp în viabilitatea celulelor prin analizele ATPLite (fig. 12A) și MMT. Moartea celulară TRAIL - mediată a hepatocitelor normale a putut fi văzută cel mai devreme la 4 h după adăugarea de TRAIL. La sfârșitul a 24 h de cultură, mai mult de 80% din hepatocite au fost omorâte de TRAIL. în contrast, în timpul aceleiași perioade de cultură, TRA-8 nu induce o moarte celulară semnificativă în hepatocitele normale. Nucleii condensați colorați cu Hoechst, o caracteristică a apoptozei, sunt sporiți în hepatocitele tratate cu TRAIL, dar nu și în hepatocitele tratate cu TRA- 8 (fig. 12B). Numărul de hepatocite apoptotice a fost bine corelat cu descreșterea viabilității celulare, așa cum a fost determinată prin analiza ATPLite, sugerând că moartea celulară TRAIL - indusă a hepatocitelor a fost mediată prin apoptoză. Aceasta a fost confirmată prin abilitatea lui Z-VAD de a inhiba toxicitatea TRAIL - mediată a hepatocitelor. Pentru că cicloheximida este un intensificator eficient de apoptoză, a fost investigat efectul acestui compus asupra hepatocitelor tratate cu TRAIL și TRA-8. Pe durata unei culturi de 4 h, cicloheximida a intensificat semnificativ moartea celulară a hepatocitelor indusă de către TRAIL, fiind omorâte mai mult de 70% din hepatocite de către TRAIL în prezența ciclohexamidei (fig. 12C). Totuși, tratamentul cu ciclohexamidă este incapabil să intensifice moartea celulară TRA-8 - mediată în hepatocite. Pentru a compara caracteristicile apoptozei indusă de către TRA-8 cu cea indusă de TRAI Lîn hepatocite, hepatocite normale ca și celule canceroase au fost incubate cu concentrații variabile de TRAIL solubil plus cross-linker sau TRA-8. în timpul unei perioade de cultură de 6 h, TRAIL a indus un răspuns apoptotic moderat în hepatocitele normale. Peste 20% din hepatocite au fost omorâte în prezența a 500 ng/ml TRAIL (fig. 12D, stânga sus). Tratamentul cu TRA-8 al hepatocitelor normale nu a elicitat nici o moarte celulară semnificativă peste aceeași perioadă de timp. în contrast cu hepatocitele normale, celulele de carcinom hepatocelular primar (fig. 12D, mijloc sus) și celulele HepG2 (fig. 12D, dreapta sus) sunt puternic susceptibile la apoptoză mediată fie de TRAIL, fie de TRA-8. Peste 80% din celulele de carcinom hepatocelular și aproape 100% din celulele HepG2 au fost omorâte în timpul unei perioade de cultură de 8 h. Aceste rezultate arată că hepatocitele normale sunt complet rezistente la apoptoză TRA-8 - mediată și sunt mult mai puțin susceptibile la apoptoză TRAIL - mediată decât celulele canceroase ale ficatului. Folosind ligandul Fas și anticorpul anti-Fas (CH-11), s-a constatat că nu există o diferență semnificativă de susceptibilitate la apoptoza Fas - mediată între hepatocitele normale, celulele de carcinom hepatocelular și celulele HepG2 (fig. 12D, panourile de mai jos).

Exemplul 11B comparativ. Inducerea de TRAIL uman legația membrană în hepatita in vivo

Șoareci B6, femele în vârstă de 8-10 săptămâni, au fost injectați intravenos cu 10⁹pfu de Ad/hTRAI L cu număr egal de Ad/Tet-on. Șoarecii au fost hrăniți cu diferite concentrații de tetraciclină în apa lor de băut, imediat după inocularea de vectori adenovirali. Lezarea ficatului a fost determinată prin nivelurile serice de AST, folosind un kit de diagnostic AST (Sigma). Expresia lui TRAIL a fost determinată prin analiza Northern blot.

Pentru a determina dacă forma legată de membrană a lui TRAIL induce lezarea ficatului in vivo, un vector adenoviral recombinant, care conține codificarea lui TRAIL uman de lungime totală (Ad/hTRAIL), a fost construit, expresia acestuia fiind sub controlul promotorului tetraciclină-inductibilă. La 24 h după inocularea intravenoasă a șoarecilor B6 cu Ad/hTRAIL, expresia indusă de tetraciclină a lui TRAIL uman a fost observată în ficat într-o manieră dependentă de doză, așa cum s-a demonstrat prin analiza Northern blot (fig. 13A).

RO 123115 Β1

Nivelurile de expresie ale lui TRAIL au fost bine corelate cu lezarea ficatului, așa cum s-a 1 arătat prin creșterea dependentă de tetraciclină în ser a nivelurilor de transaminază, din nou în mod dependent de doză (fig. 13B). Așa cum inocularea cu vector adenoviral în sine ar 3 putea crește susceptibilitatea hepatocitelor la apoptoza TRAIL - mediată , hepatocitele de la șoarecii inoculați cu Ad/TRAIL au fost izolate și testate pentru moartea celulară TRAIL- 5 mediată. Nu a existat nicio creștere semnificativă a morții celulare a hepatocitelor infectate cu Ad/TRAIL, comparativ cu cea de la șoarecii martor (fig. 13C, stânga). în plus, șoarecii 7 inoculați cu Ad/TRAIL nu au prezentat o lezare crescută a ficatului după injectarea intravenoasă de TRAIL solubil uman. Astfel, se înțelege că hepatita indusă de către 9 Ad/TRAIL a fost mediată de niveluri înalte ale expresiei TRAIL în forma sa de membrană. Analiza histologică a secțiunilor de ficat a relevat că lezarea hepatocitelor este vizibilă numai 11 devreme de 24 h după inocularea vectorului (fig. 13D) și persistă pentru cel puțin 7 zile (fig.

13E). Aceste alterări patologice din ficat sunt de asemenea tetraciclină-dependente și se 13 produc într-un mod dependent de doză. Faza timpurie, din primele 24 h de tratament, a lezării ficatului indusă de TRAIL este caracterizată prin focare de necroză. Infiltrarea de 15 celule inflamatorii nu a fost observată în acest stadiu, dar s-a produs hemoragia, în preajma zilei a 7-a după inoculare, lezarea difuză a ficatului este vizibilă cu o dezorganizare lobulară 17 marcată, degenerare severă a hepatocitelor cu citoplasmă grupată neregulat și mari spații clare, ca și apoptoză pronunțată și necroză. Infiltrarea extinsă a celulelor mononucleare este 19 o trăsătură caracteristică acestui stadiu. Aceste rezultate arată că TRAIL uman, în forma sa legată la membrană, este capabil de a induce lezarea ficatului in vivo. în ciuda înclinației lui 21 TRAIL uman de a cauza hepatite severe la șoareci, acesta nu induce un răspuns letal. în contrast, șoarecii inoculați cu vectori similari de control ai tetraciclinei, care conțin codificarea 23 ligandului Fas, au dezvoltat hepatite fulminante cu apoptoză masivă și necroză a hepatocitelor, acompaniate de o hemoragie severă, și printr-o mortalitate care s-a produs depen- 25 dent de doza de tetraciclină, în intervalul a 72 h de la inoculare. Rata de mortalitate a atins 100% în 48 de h în acele subgrupe ce au primit 3 mg/ml de tetraciclină sau mai mult. în 27 contrast, toți șoarecii care au primit Ad/hTRAIL, indiferent de doza de tetraciclină, erau încă în viață patru săptămâni după inoculare. Astfel, se înțelege că, in vivo, forma legată de mem- 29 brană a lui TRAIL este un inductor mai puțin eficace al lezării hepatocelulare decât ligandul Fas. Rezultatele sugerează mai departe că TRAIL ar putea induce lezarea ficatului printr-un 31 mecanism care diferă de mecanismul ce stă la baza toxicității ligandului Fas.

Exemplul 12. Celulele umane T și B activate exprimă niveluri sporite de DR5 33

Pentru a determina dacă DR5 joacă un rol în apoptoza TRAIL - mediată a celulelor

T și B activate, expresia de suprafață a DR5 a fost examinată folosind celule T și B activate 35 și în repaus. Celulele T umane nestimulate în PBMC nu exprimă niveluri semnificative de DR5 (fig. 14). La 48 h după stimulare, fie cu anti-CD3, fie cu Con-A, expresia DR5 de 37 suprafață celulară a fost în mod semnificativ sporită. în mod similar, celulele B nestimulate au exprimat niveluri foarte scăzute de DR5. Stimularea cu anti-μ, dar nu și cu LPS a avut ca 39 rezultat o expresie de suprafață celulară sporită a lui DR5. Aceste rezultate arată că ambele tipuri de celule activate, T și B, exprimă niveluri mai mari de DR5 de suprafață celulară. 41 Celulele au fost colorate cu 20 pg/ml TRA-8 și lgG1 antișoarece PE.

Exemplul 13. Celulele Tși B activate devin susceptibile la apoptoza TRA-8 mediată 43 Pentru a determina dacă celulele T și B activate sunt susceptibile la apoptoza TRA-8 mediată, celule T și celule B de PBMC uman au fost stimulate cu anti-CD3 sau respectiv 45 anti-u, in vitro, timp de 48 h. Celulele viabile și celulele blast proliferative au fost colectate prin centrifugare în gradient și incubate cu diferite concentrații de TRA-8. Celulele T și celu- 47 lele B nestimulate nu au fost susceptibile la apoptoza TRA-8 - mediată (fig. 15). Celulele T

RO 123115 Β1 și celulele B total stimulate au prezentat o susceptibilitate moderat crescută la apoptoza TRA-8 - mediată , 20% din celule fiind omorâte de către TRA-8 după o cultivare peste noapte. Celulele T blast înalt proliferative au fost încă și mai susceptibile la apoptoza TRA-8 mediată. Mai mult de 70% din celulele T blast au putut fi ucise de către TRA-8. Celulele B blast au fost de asemenea mai susceptibile la apoptoza TRA-8 - mediată, comparativ cu altele. Aceste rezultate arată că celulele T și B activate sunt susceptibile la apoptoza DR5 mediată.

Exemplul 14. TRAS epuizează celulele T activate la șoareci uman/SCID

Pentru a determina eficacitatea anti-celule T in vivo a lui TRA-8, șoareci NOD/SCID au fost injectați cu 1 x 10⁸ PBMC uman. în mod normal, celulele T umane la șoareci SCID sunt rapid activate ca răspuns la stimularea xenogenă. Șoarecii PBMC/SCID uman au fost injectați intraperitoneal cu 100 pg TRA-8 sau cu lgG1 martor după ziua de transfer, injectare care a fost repetată zilnic timp de trei zile. Cinci zile după transfer, celulele mononucleare au fost izolate din splină și colorate cu anticorp CD3 antiuman și populația de limfocite a fost supusă citometriei în flux, iar celulele T umane CD3 pozitive au fost analizate. Aproximativ 30% din limfocitele splenice sunt celule T umane, așa cum s-a determinat prin colorația CD3 antiuman în șoarecii martor tratați. Totuși, numai puține celule T umane (mai puțin de 3%) au fost observate printre limfocitele splenice la șoarecii tratați cu TRA-8 (fig. 16). Studiul histologic in situ a arătat că în splina șoarecilor martor, celulele T umane au fost repopulate în splină cu numai câteva celule apoptotice observate, așa cum s-a demonstrat prin colorația TUNEL. în contrast, repopularea cu celule T umane viabile nu s-a observat în splina șoarecilor tratați cu TRA-8, mai degrabă s-au observat multe celule apoptotice (fig. 17). Aceste rezultate demonstrează că TRA-8 are o activitate anti-celule T in vivo și indică utilitatea anticorpilor inventați pentru tratamentul bolii GVH.

Exemplul 15. Activitatea terapeutică anticancera lui TRAS

15.1. Expresia și funcția lui DR5 în țesuturile și liniile celulare canceroase umane

i) Expresia lui DR5 în țesuturile canceroase umane prin colorarea in situ cu TRA-8 Pentru a determina dacă celulele și țesuturile canceroase exprimă diferențiat niveluri mai mari ale DR5, o listă de țesuturi canceroase umane, incluzând peste 20 de cancere de sân, 6 cancere ovariene, 5 cancere de colon și 5 cancere de prostată, au fost colorate cu TRA-8 pentru analiza imunohistochimică. Majoritatea acestor țesuturi canceroase au exprimat DR5 detectabil. Nivelurile de expresie al lui DR5 în aceste țesuturi canceroase a variat. în general, țesuturile canceroase au exprimat niveluri mai mari de DR5 decât țesuturile neimplicate. în plus, expresia DR5 nu este vizibil corelată cu mutația lui p53.

ii) Expresia și funcția lui DR5 în liniile celulare de cancer uman (tabelul 2)

Nouă linii celulare umane de cancer de sân, trei linii de cancer ovarian, trei linii de cancer de colon și trei linii de cancer de prostată au fost examinate pentru expresia de suprafață celulară a lui DR5 și a susceptibilității la apoptoză TRAIL-8 - indusă in vitro. 7 din 9 linii de cancer de sân, 3 din 3 linii de cancer ovarian, 3 din 3 linii de cancer de colon și 3 din 3 linii de cancer de prostată au exprimat niveluri variabile de DR5 de suprafață celulară. Din 9 linii de cancer de sân, 3 au fost foarte susceptibile, 3 intermediare și 3 au fost rezistente la apoptoză TRA-8 - mediată. Toate cele 3 linii de cancer ovarian au fost foarte susceptibile. Una dintre cele 3 linii de cancer de colon a fost foarte susceptibilă, în timp ce 2 au avut o sensibilitate intermediară. Două din cele trei linii de cancer de prostată au avut o sensibilitate intermediară și una a fost rezistentă.

RO 123115 Β1

Tabelul 2 1

Expresia și funcția lui DR5 în celule canceroase umane

Linia celulară	Originea	Expresia¹	Susceptibilitatea²
2LMP	sân	0	++++
LCC6	sân	+++	++++
MB468	sân	+++	+++
MB231	sân	0	+++
ZR-75-1	sân	+++	0
SKBR3	sân	0	0
MB453	sân	0	0
BT474	sân	0	-
DY36T2	sân	-	-
Caov-3	ovar	0	++++
OVCAR-3	ovar	0	++++
Skov-3	ovar	0	+++
WiDR	colon	+++	++++
HST29	colon	0	+++
T84	colon	0	0
PC3	prostată	+++	0
LnCap	prostată	+++	0
Du-145	prostată	+++	0

Notă:¹ determinate prin citometrie în flux, celulele au fost colorate cu 20 pg/ml TRA-8 și comparate cu anticorpul martor, determinate prin analiza ATPLite. ++++: omorâte peste 80%, +++: omorâte între 60 și 80%, ++: omorâte 23 între 40 și 60%, +: omorâte între 20 și 40%, -: neomorâte.

iii) Citotoxicitatea combinată a lui TRA-8 cu adriamicină în câteva linii de cancer de sân, a fost examinat efectul adriamicinei asupra apoptozei 27 TRA-8 induse. Dozele mari de adriamicină au prezentat un efect aditiv. Totuși, în unele linii rezistente la TRA-8, doze scăzute de adriamicină au intensificat în mod sinergie apoptoza 29 TRA-8 - indusă.

iv) Activitatea de legare in vitro și in vivo a lui TRAS la celulele de cancer uman 31

S-a folosit TRA-8 marcat cu radioizotop. Activitatea de legare a lui TRA-8 la o linie celulară de cancer de sân a fost examinată in vitro și in vivo, pe șoareci SCID, implantați cu 33 tumoare. Activitatea de legare in vitro la celulele canceroase a fost estimată ca o valoare Kd de 3 nM, care a fost constantă în estimările noastre anterioare, folosind ELISA și de cel puțin 35 50 de ori mai mare decât TRA1L solubil. In vivo, TRA-8 s-a localizat în țesuturile tumorale implantate. 37

15.2. Terapia leucemiei limfolitice cronice la șoareci NOD/SCID cu TRAS

Leucemia limfolitică cronică (CLL) este o formă obișnuită de malignizare a celulelor 39 B. Majoritatea celulelor B maligne în CLL sunt de un fenotip matur și sunt rezistente la mulți stimuli ai apoptozei. A fost examinată expresia și funcția lui DR5 în celulele B a cinci pacienți 41 cu CLL. Toți pacienții au avut valori mari de celule B periferice, prezente mai mult de 95%

RO 123115 Β1 celule CD19+B în PBMC. Comparativ cu celulele primare normale B, celulele B din CLL ale tuturor pacienților au avut niveluri mai mari ale DR5 de suprafață celulară și au fost mai susceptibile la apoptoza TRA-8 - indusă in vitro. în mod interesant, celulele B din CLL au fost de asemenea sensibile la citotoxicitatea indusă de bisindolmaleimidă VIII (Bis VIII). în urma tratamentului combinat cu TRA-8 și Bis VIII, aproape 50% de celule B din CLL au fost omorâte, în timp ce celulele B normale au rămas fără răspuns (fig. 18). Transferul de celule B de CLL în șoareci NOD/SCID a avut ca rezultat repopularea cu circa 25-30% celule CD19 + Bîn splina șoarecelui recipient, la cinci zile după transfer. Totuși, tratamentul cu trei doze de 100 pg de TRA-8 a eliminat complet celulele B de CLL la patru din cei cinci pacienți din splina șoarecilor SCID recipienți. Astfel, TRA-8 singur sau asociat cu alte substanțe este activ ca agent terapeutic în leucemia limfolitică cronică.

Exemplul 16. Clonarea cADN-ulul (1) Determinarea secvențelor de aminoacizi N-terminal ale lanțurilor grele șl ușoare ale TRA-8

Pentru a obține cADN-urile lanțurilor grele și ușoare de TRA-8, secvențele de aminoacizi N-terminale ale lanțurilor grele și ușoare ale lui TRA-8, precum și de genele TRA8 donate au fost determinate prin tehnici cunoscute.

pg de soluție care conține anticorpul DR5 antiuman TRA-8 a fost supusă electroforezei pe gel de poliacrilamindă SDS („SDS-PAGE”), folosind o concentrație a gelului de 12% g/v, un voltaj constant de 100 V, timp de 120 min. După electroforeză, gelul a fost imersatîn tamponul de transfer de 25 mM Tris HCI (pH 9,5), 20% metanol, 0,02% v/v SDS, timp de 5 min. După acest timp, conținutul de proteină al gelului a fost transferat pe o membrană de difluorură de polivinilidenă („membrană PVDF”; mărimea porilor 0,45 pm; Millipore, Japonia), îmbibată înainte în tampon de transfer, folosind un aparat pentru blotting (depunerea probei) (KS -8451; Marysol) în condițiile unui voltaj constant de 10 V, 4°C, timp de 14 h.

După aceste timp, membrana PVDF a fost spălată cu tampon de spălare 25 mM NaCI, 10 mM tampon de borat de sodiu (pH 8,0), apoi colorată cu soluție de colorare (50% v/v metanol, 20% v/v acid acetic și 0,05% g/v Coomassie Brilliant Blue), timp de 5 min, pentru a localiza benzile de proteină. Membrana PVDF este apoi decolorată cu o soluție de 90% v/v metanol apos și benzile corespunzătoare lanțului greu, banda cu mobilitatea mai scăzută și lanțul ușor, banda cu mobilitatea mai mare, localizată anterior pe membrana PDVF, au fost excizate și spălate cu apă deionizată.

Secvența de aminoacizi N-terminal a lanțurilor grele și ușoare a fost determinată prin metoda automatizată a lui Edman (Edman P. și colab., 1967), Eur.J. Biochem., 1, 80), folosind un secvențiator în fază gazoasă de proteine (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo,

K.K.).

Secvența de aminoacizi N-terminal a benzii corespondente pentru lanțul greu a fost determinată a fi:

Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SECV. ID. Nr. 4 din lista de secvențe);

și cea a benzii corespondente pentru lanțul ușor a fost determinată a fi:

Asp-lle-Val-Met-Thr-GIn-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val.Ser (SECV. ID. Nr. 5 din lista de secvențe);

Compararea acestor secvențe de aminoacizi cu baza de date a secvențelor de aminoacizi de anticorpi, produsă de către Kabat și colab. (Kabat E.A. și colab., (1991), în „Sequences of Proteins of Immunological Interest Voi. II „U.S. Department of Health and Human Services) a relevat că lanțul greu (lanțul γ 1) Și lanțul ușor (lanțul k ) de TRA-8 a aparținut subtipurilor 3 d și, respectiv, 1.

RO 123115 Β1 (2) donarea cADN 1

Bazat pe cele de mai sus, au fost sintetizați primerii de oligonucleotide care ar fi fost de așteptat a hibridiza cu porțiuni ale regiunilor 5'-netranslate și capetele reale ale regiunilor 3 3'-translate ale genelor care aparțin la aceste subtipuri de șoarece. Apoi, cADN-urile care conțin codificarea lanțurilor grele și ușoare de TRA -8 au fost donate prin următoarea 5 combinare a rever transcripției și a PCR (RT-PCR):

a) Matrița 7

ARN-ul total de hibridoma TRA-8 (Nr. PTA-1428 din ATCC) a fost extras prin folosirea reactivului TRIzol (GIBCO BRL). Ca matriță pentru reacția PCR, s-a folosit un cADN care a 9 fost obținut prin folosirea trusei de sinteză First-Strand cDNA (Amersham Pharmacia Biotech) în conformitate cu manualul de instrucțiuni furnizat odată cu trusa. 11

b) Primeri PCR

Următorii primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:13

5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SECV ID Nr. 6 din lista de secvențe) 5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SECV ID Nr. 7 din lista de secvențe)15

5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SECV ID Nr. 8 din lista de secvențe);

5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SECV ID Nr. 9 din lista de secvențe);17

5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SECV ID Nr. 10 din lista de secvențe);

5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SECV ID Nr. 11 din lista de secvențe);19

5'-tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SECV ID Nr. 12 din lista de secvențe);

5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SECV ID Nr. 13 din lista de secvențe);21

5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SECV ID Nr. 14 din lista de secvențe);

5'-aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SECV ID Nr. 15 din lista de secvențe);23

5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SECV ID Nr. 16 din lista de secvențe);

5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SECV ID Nr. 17 din lista de secvențe);25

5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SECV ID Nr. 18 din lista de secvențe);

5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SECV ID Nr. 19 din lista de secvențe); și27

5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SECV ID Nr. 20 din lista de secvențe).

în lipsa unei alte specificații, toate oligonucleotidele din aceste exemple au fost 29 sintetizate de către Pharmacia Biotech. Toate oligonucleotidele au fost păstrate la -20°C, după ce au fost dizolvate în apă distilată. 31

c) Reacția PCR

Compoziția soluției de reacție PCR:33

- matriță cADN, 5 pl din totalul de reacție de 33 μΙ

- primer DR5p1,10 pmol;35

- primer DR5p2,10 pmol;

-10 x tampon concentrat PCR (furnizat împreună cu kitul), 10 μΙ;37

- dNTPs (2,5 mM fiecare), 4 μΙ; și

- Taq polimerază (Promega), 5 unități.39

S-a adăugat apă distilată sterilă la soluție, până la un volum total de 100 μΙ. Fără alte specificații, dNTP-urile sunt un amestec echimolar de dATP, dCTP, dGTP și dTTP (fiecare 41 2,5 mM).

Reacția PCR a fost condusă așa cum urmează. Soluția a fost întâi încălzită la 94°C,43 timp de 2 min, după care urmează un ciclu de încălziri la 94°C, timp de 30 s, 52°C, timp de min și 72°C, timp de 3 min, care a fost repetat de 40 de ori. După terminarea acestei45 proceduri, soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 10 min.

RO 123115 Β1

Fragmentele de ADN amplificate, astfel obținute, au fost separate pe 1% gel de agaroză conținând 0,25 pg/ml bromură de etidium. Benzile determinate a conține fragmentele ADN dorite au fost scoase cu o lamă de ras și ADN-ul a fost recuperat din acestea, folosind un kit Gene Clean (BIO101). Fragmentul ADN a fost donat folosind un vector pGEMT Easy (Promega). Aceasta s-a realizat așa cum urmează.

Fragmentul de ADN recuperat din soluția reacției PCR, împreună cu 50 ng de vector pGEM-T Easy (furnizat odată cu trusa), a fost amestecat cu 1 pl de 10 x tampon de reacție al ligazei (6 mM Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM clorură de magneziu, 5 mM clorură de sodiu, 7 mM B-mercaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidină și 0,1 mg/ml albumină serică bovină) la care s-au adăugat 4 unități de T4 ADN ligază. Volumul total al amestecului a fost ajustat la 10 μΙ cu apă sterilă deionozată și soluția de ligază rezultată a fost incubată la 14°C, timp de 15 h. După acest timp, 2 μΙ din soluția de reacție a ligazei a fost adăugată la 50 μΙ din sușa JM109 de E. coli competentă (furnizată cu trusa și adusă în stare de competență în conformitate cu manualul de instrucțiuni) la care au fost adăugați 2 μΙ de 0,5 Μ βmercaptoetanol și amestecul rezultat a fost ținut pe gheață, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s și din nou pe gheață, timp de 5 min. La pasul următor, 500 μΙ de mediu conținând 2% v/v triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie, 0,05% g/v clorură de sodiu, 2,5 mM clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu și 20 mM glucoză (definit în cele ce urmează ca mediul „SOC”) au fost adăugate la cultură și amestecul a fost incubat timp de o oră la 37°C, cu agitare. După acest timp, cultura a fost răspândită pe o placă de agar cu mediu bulion-L (1% v/v triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie de bere, 0,5% g/v clorură de sodiu, 0,1 % g/v glucoză și 0,6% g/v bactoagar (Difco), conținând 100 ng/ml. Coloniile rezistente la ampicilina care au apărut pe placă au fost selectate și răzuite cu bucla ansei de platină pentru transfer și, apoi, cultivate pe mediu de bulion L conținând 100 pg/ml ampicilina la 37°C, peste noapte, cu o agitare la 200 rpm. După incubare, celulele au fost recoltate prin centrifugare și din acestea a fost preparată plasmida ADN prin metoda alcalină. Plasmida obținută a fost denumită plasmida pH62 pentru lanțul greu al lui TRA-8 sau pL28 pentru lanțul ușor al TRA-8. Sușele de E. coli transformante care găzduiesc aceste plasmide, denumite dreptE coli JM109/pH62 și E, coli JM109/pL28, au fost depozitate la Internațional Patent Organism Depository (Depozitul internațional de organisme brevetate), al Național Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology, 1-1, Higashi 1 chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Deposit of Microorganisms și li s-au acordat numerele de acces FERM BP-7560 și, respectiv, FERM BP-7561. Secvențele de nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului greu și al lanțului ușor de la TRA-8 au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74:5463-5467) folosind un analizator 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Secvențele de nucleotide ale lanțurilor grele și ușoare ale TRA-8 sunt prezentate ca SECV. ID. Nr. 21 și, respectiv, Nr. 22 în Lista de secvențe. Secvențele de aminoacizi ale lanțurilor grele și ușoare TRA-8 sunt prezentate ca SECV. ID. Nr. 23 și, respectiv, Nr. 24 în Lista de secvențe. Secvențele N-terminale de aminoacizi ale lanțurilor grele și ușoare de TRA-8 au fost stabilite în mod perfect prin împerecherea de mai sus. în afară de aceasta, când secvențele de aminoacizi ale lanțurilor grele și ușoare au fost comparate cu baza de date ale secvențelor de aminoacizi ale anticorpilor, s-a stabilit că, pentru lanțul greu, nucleotidele cu Nr. de la 58 la 414 din SECV. ID. Nr. 21 au constituit regiunea variabilă, în timp ce nucleotidele de la Nr. 415 la 1392 din SECV. ID. Nr. 21 au constituit regiunea constantă. Pentru lanțul ușor, nucleotidele cu numerele de la 64 la 387 din SECV. ID. Nr. 22 au constituit regiunea variabilă, în timp ce nucleotidele de la Nr. 388 la 702 din SECV. ID.

RO 123115 Β1

Nr. 22 au constituit regiunea constantă. Localizarea și secvențele CDR -urilor au fost de 1 asemenea elucidate prin compararea omologiei din baza de date. Secvențele de aminoacizi ale CDR 1, CDR 2 și CDR3 ale lanțului greu de TRA-8 sunt prezentate în SECV. ID. Nr. 25, 3

Nr. 26 și, respectiv, Nr. 27. Secvențele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 și CDR3 ale lanțului ușor de TRA-8 sunt prezentate în SECV. ID. Nr. 28, Nr. 29 și, respectiv, Nr. 30.5

Exemplul 17. Proiectarea unei versiuni umanizate a anticorpului TRA-8 (1) Modelarea moleculară a regiunii variabile a TRAS7

Modelarea moleculară a regiunii variabile a TRA-8 a fost efectuată prin metoda cunoscută în general ca modelarea omoloagă (Methods in Enzymology, 203, 121-153,9 (1991)). Secvențele inițiale ale regiunii variabile a imunoglobulinei umane, înregistrată în Protein Data Bank (Banca datelor despre proteine) (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)),11 pentru care sunt disponibile structuri tridimensionale obținute prin cristalografie în raze X, au fost comparate cu regiunile structurii cadru (framework) ale TRA-8 determinate mai sus. Ca 13 rezultat au fost selecționate 1 NCD și 1 HIL ca având cea mai înaltă omologie de secvență cu regiunile structurii cadru pentru lanțurile ușoare și, respectiv, grele de TRA-8. Structurile 15 tridimensionale ale regiunilor de structură cadru au fost generate prin combinarea coordonatelor de la 1 NCD și 1 HIL, care corespund lanțurilor ușoare și grele ale TRA-8, 17 pentru a obține „modelul structurii cadru” („framework model”). Folosind clasificarea dată de Chothia și colab., CDR-urile lui TRA-8 au fost clasificate după cum urmează: CDRLt , CDRL₂, 19 CDRH-i și CDRH₂ aparținând la clasele canonice 2,1,1 și, respectiv, 3 în timp ce CDRL₃ nu aparține niciunei clase canonice specifice. Buclele CDR de la CDRL_d CDRL₂, CDRH_d și 21 CDRH₂ sunt fixate la conformații inerente clasei lor canonice respective și sunt integrate întrun model de structură cadru. Lui CDRL₃ i s-a repartizat conformația de ciorchine 8A, în 23 conformitate cu clasificarea lui Thornton și colab. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) și CDRH₃ a fost clasificat în k(8)C, folosind regula H3 (FEBS letter 455, 188-197 (1999)). Apoi 25 conformațiile reprezentative pentru CDRL₃ și CDRH₃ au fost integrate în modelul structurii cadru. 27 în final, calculele energetice au fost efectuate pentru a elimina contactele interatomice nefavorabile, în vederea obținerii unui model molecular plauzibil al regiunii variabile 29 a TRA-8 în termeni ai energiei. Procedura de mai sus a fost realizată folosind sistemul ABM de modelare moleculară, în mod obișnuit disponibilă comercial (Oxford Molecular Limited, 31 Inc.).

Pentru modelul molecular obținut, acuratețea structurii a fost evaluată mai departe, 33 folosind un software PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).

(2) Proiectarea secvențelor de aminoacizi pentru TRA-8 umanizat 35

Construcția anticorpilor TRA-8 umanizați a fost realizată prin metoda cunoscută în general ca grefare de CDR (Proc. Natl.Acad. Sci. SUA, 86:10029-10033(1989)). Anticorpul 37 acceptor a fost ales pe baza omologiei aminoacizilor din regiunea structurii cadru. Secvențele regiunii structurii cadru din TRA-8 au fost comparate cu toate secvențele de 39 structură cadru umane din baza de date Kabat a secvențelor de aminoacizi ale anticorpilor (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). Ca rezultat, anticorpul mAB58'CL a fost selectat ca 41 acceptor, datorită celei mai mari omologii de secvență, de 80%, pentru regiunea structurii cadru. Reziduurile de aminoacizi din regiunea structurii cadru ale lui mAb 58'CL au fost 43 aliniate alături de cele ale lui TRA-8 și s-au identificat pozițiile în care se găseau aminoacizi diferiți. Locația acestor reziduuri a fost analizată folosind modelul tridimensional al lui TRA-8 45 construit mai sus și reziduurile donor care ar trebui grefate pe acceptor au fost alese pe criteriile date de Queen și colab. (Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 86: 10029 -10033 (1989)). 47

Secvențele TRA 8 umanizate au fost construite după cum se descrie în exemplul următor, prin transferarea reziduurilor donor respective în anticorpul acceptor, mAb58'CL. 49

RO 123115 Β1

Exemplul 18. Construirea unui vector de expresie pentru lanțul greu al anticorpului umanizat (1) Construirea unei plasmide care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanțului greu al lui TRA-8 umanizat

Pentru a determina activitatea lui TRA-8 umanizat, plasmida purtătoare a lanțului greu al lui TRA-8 umanizat a fost construită după cum urmează. Totuși, se apreciază că umanizarea lui TRA-8 nu se limitează la aceste exemple.

Așa cum se prezintă în SECV. ID. Nr. 31 din Lista de secvențe, umanizarea secvențelor de aminoacizi ale lanțului greu al anticorpului DR5 antiuman de șoarece TRA-8 necesită înlocuirea aminoacidului 13 (lizina), aminoacidului 19 (lizina), aminoacidului 40 (treonină), aminoacidului 42 (acid glutamic), aminoacidului 44 (arginina), aminoacidului 84 (serină), aminoacidului 88 (serină) aminoacidului 93 (metionina) aminoacidului 114 (treonină), aminoacidului 115 (leucină) cu glutamină, arginină, alanină, glicină, glicină, asparagină, alanină, valină, leucină și, respectiv, valină.

Plasmida purtătoare a ADN-ului care codifică pentru regiunea variabilă a lanțului greu al lui TRA-8 umanizat (SECV. ID. Nr. 31 din Lista de secvențe) a fost construită după cum urmează.

Reacția PCR a fost folosită pentru a construi următoarele secvențe ADN, fiecare dintre acestea cuprinzând cele descrise mai sus.

Au fost sintetizate următoarele 12 oligonucleotide:

5' - ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SECV. ID. Nr. 32);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg (B; SECV. ID. Nr. 33);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SECV. ID. Nr. 34);

5'-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SECV. ID. Nr. 35);

5'-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SECV. ID. Nr. 36);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc-3' (F; SECV. ID. Nr. 37);

5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SECV. ID. Nr. 38);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SECV. ID. Nr. 39);

5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (I; SECV. ID. Nr. 40);

5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SECV. ID. Nr. 41);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SECV. ID. Nr. 42; și

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SECV. ID. Nr. 43).

Au fost sintetizați următorii 2 primeri PCR, așa cum a fost descris mai sus:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (P1; SECV. ID. Nr. 44); și

5'-gaccgatggg cccttggtgga-3' (P2; SECV. ID. Nr. 45).

RO 123115 Β1

Sinteza ADN-ului care codifică un lanț de polipeptide conținând secvența semnal de 1 secreție, o regiune variabilă a lanțului greu al lui TRA-8 umanizat și 8 reziduuri de aminoacizi de la N-terminal ai regiunii lgG-CH1 a fost realizată folosind o combinație a reacției PCR în 3 modul respectiv.

Fragmentul ADN a fost preparat după cum urmează:5

Compoziția soluției pentru reacția PCR:

- oligonucleotida A, 10 pmol;7

- oligonucleotida B, 10 pmol;

- oligonucleotida C, 10 pmol;9

- oligonucleotida D, 10 pmol;

- oligonucleotida E, 10 pmol;11

- oligonucleotida F, 10 pmol;

- oligonucleotida G, 10 pmol;13

- oligonucleotida H, 10 pmol;

- oligonucleotida 1,10 pmol;15

- oligonucleotida J, 10 pmol;

- oligonucleotida K, 10 pmol;17

- oligonucleotida L, 10 pmol;

- primer de oligonucleotide P1, 2 μΜ;19

- primer de oligonucleotide P2, 2 μΜ;

-10 x tampon Pyrobest II, 10 μΙ;21

- amestec dNTP, 8 μΙ;

- ADN polimeraza Pyrobest, 0,5 μΙ; și23

- apă bidistilată până la un volum total de 50 μΙ.

Reacția PCR a fost condusă așa cum urmează. Soluția a fost întâi încălzită la 94°C,25 timp de 2 min, după care urmează un ciclu de încălziri la 98°C, timp de 10 s, 55°C timp de 30 s și 72°C, timp de 3 min, ciclul a fost repetat de 7 ori. După terminarea acestei proceduri, 27 soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 15 min.

Un volum egal de fenol-cloroform (50% v/v fenol saturat cu apă, 48% v/v cloroform, 29 2% v/v alcool izoamilic) a fost adăugat la 200 μΙ din fiecare produs PCR și amestecat viguros timp de 1 min. După acest timp, amestecul a fost centrifugat la 10.000 x g și stratul apos a 31 fost recuperat și amestecat cu un volum egal de cloroform-alcool izoamilic (96% v/v cloroform și 4% v/v alcool izoamilic), care a fost din nou centrifugat viguros la 10.000 x g și 33 stratul apos a fost recuperat. Seria de pași citați în acest paragraf va fi definită în cele ce urmează drept „extracția fenolică”). 35

Apoi s-a realizat precipitarea în etanol a stratului apos recuperat. Așa cum este utilizată și definită în cele ce urmează ca „precipitarea etanolică”, aceasta constă din 37 adăugarea, cu amestecare, a unei zecimi din volumul unei soluții de acetat de sodiu 3M (pH

5,2) și a 2,5 volume de etanol 100% la soluția ce trebuie tratată și înghețarea amestecului 39 folosind gheață uscată. Amestecul rezultat este apoi centrifugat la 10.000 x g, pentru a recupera ADN-ul sub formă de precipitat. 41

După extracția cu fenol și precipitarea în etanol, precipitatul de ADN rezultat este uscat sub vid, dizolvat în minimum de apă bidistilată și separat prin electroforeză pe gel de 43 agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu o soluție apoasă de 1 pg/ml de bromură de etidium, pentru a permite detectarea ADN-ului la UV. Banda de ADN 45 corespunzătoare ADN-ului TRA-8 umanizat este scoasă cu o lamă de ras și eluată din gel, folosind trusa Geneclean Spin (BIO 101, CA, SUA). După extracție cu fenol, ADN-ul eluat 47 este apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 x g, urmat de precipitarea în etanol și, în final,

RO 123115 Β1 dizolvat în 5 μΙ de apă distilată. Ceea ce a rezultat, adică fiecare ADN extras este donat folosind un vector pGEM-T Easy (Promega), după cum urmează:

- fragmentul ADN recuperat din reacția PCR, 5 μΙ;

-10 x tampon Taq polimerază, 1 μΙ;

- amestec dNTP, 1 μΙ;

- Taq polimerază (5 unități/ml), 1 μΙ: și

- apă bidistilată până la un volum final de 10 μΙ.

După ce fiecare soluție de mai sus reacționează la 70°C, timp de 30 min, fiecare soluție de ADN și vectorul pGEM-T Easy sunt ligate folosind trusa DNA Ligation, Versiunea 2,0 (Takara Shuzo Co., Ltd), folosind protocolul producătorului.

După o incubare de 4 h la 15°C, 2 μΙ din soluția de reacție incubată este amestecată cu 100 μΙ de sușă JM 109 de E. coli competentă, la o densitate celulară de 1-2 x 10⁹celule/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) și amestecul este ținut la gheață timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s și din nou la gheață, timp de 1 min. Apoi, 500 μΙ de mediu SOC (2% v/v triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie, 0,05% g/v clorură de sodiu, 2,5 mM g/v clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu și 20 mM glucoză) este adăugat amestecului, care este incubat pentru încă o oră, cu agitare. Sușele transformante sunt apoi izolate și plasmida ADN este preparată din sușe, așa cum se descrie în „Molecular Cloning A Laboratory Manual”. Secvențele de nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului greu al lui TRA8 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizator 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Plasmidele rezultate au fost desemnate pHB14 (plasmida purtătoare de cADN care codifică lanțul greu al lui TRA-8 umanizat). Sușa E coli transformantă, ce găzduiește această plasmidă, denumită ca E. coli JM109/pHB14, a fost depozitată la Internațional Patent Organism Depository (Depozitul internațional de organisme brevetate), de la Național Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology, 1-1, Higashi 1 chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru „Deposit of Microorganisms” și i s-a acordat numărul de acces FERM BP7556.

(2) Construcția plasmidelor de expresie care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanțului greu de TRAS umanizat

Vectorii de expresie recombinanți pentru celulele animale au fost construiți prin inserarea ADN-ului care conține codificarea lanțului greu de TRA-8 umanizat (donat mai sus), după cum urmează.

pg de plasmidă pSRHHH3 (Solicitarea de brevet european EP 0-909-816-A1), purtând regiunea variabilă a lanțului greu a anticorpului monoclonal anti-Fas umanizat HFE7A și ADN-ul genomic al regiunii constante lgG1 uman, un vector de expresie pentru celulele mamiferelor, a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și Apal, și apoi separat prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu o soluție apoasă 1 pg/ml de bromură de etidium, pentru a permite detectarea de ADN în UV. Benzile vectorului de ADN, conținând ADN-ul genomic al regiunii constante lgG1 uman, fără regiunea variabilă a lanțului greu a HFE7A umanizat, au fost scoase cu o lamă de ras și eluate din gel, folosind trusa Geneclean Spin (BIO 101, CA, SUA). După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, a fost dizolvat în 5 μΙ de apă distilată și, apoi, defosforilat, folosind CIP.

RO 123115 Β1

Plasmida rezultată digerată, defosforilată (100 ng) a fost ligată cu 1 pg de fragment AND 1 pHB14, care cuprinde ADN-ul ce conține codificarea regiunii variabile a lanțului greu de TRA8 umanizat, care a fost de asemenea supus digestiei cu Hindlll și Apal, folosind trusa de 3 ligare ADN, versiunea 2,0 (Takara Shuzo, Co., Ltd ). Amestecul de ligare este apoi folosit pentru a transforma E. coli JM109, care este apoi etalat pe plăci de agar LB, conținând 5 50 pg/ml ampicilină.

Transformanții obținuți prin această metodă au fost cultivați în 2 ml de mediu LB 7 lichid, conținând 50 pg/ml ampicilină, la 37°C peste noapte și ADN-ul plasmidial este extras ulterior din cultura rezultată, prin metoda SDS-alcalină. 9

ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hindlll și Apal, și supus electroforezei pe gel de agaroză 3% g/v, pentru a confirma prezența sau absența insertului 11 de ADN care conține codificarea regiunii variabile a lanțului greu de TRA-8 umanizat. Inserția și orientarea fragmentului de ADN dorit în vector a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului 13 folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Plasmida de expresie rezultată, purtând cADN ce conține codificarea lanțului 15 greu de TRA-8 umanizat, este definită capHB14-1.

Exemplul 19. Construirea unui vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului 17 umanizat (1) Construirea de vectori pentru lanțurile ușoare ale versiunii umanizate a 19 anticorpului TRA-8

După cum s-a prezentat în SECV. ID. Nr. 46 din Lista de secvențe, în secvența de 21 aminoacizi umanizată a lanțului ușor al lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece, aminoacidul 8 (histidină), aminoacidul 9 (lizină), aminoacidul 10 (fenilalanină), aminoacidul 23 11 (metionină), aminoacidul 13 (treonină), aminoacidul 20 (serină), aminoacidul 42 (glutamină), aminoacidul 43 (serină), aminoacidul 60 (acidul aspartic), aminoacidul 63 25 (treonină), aminoacidul 77 (asparagină), aminoacidul 78 (valină), aminoacidul 80 (serină), aminoacidul 83 (leucină), aminoacidul 85 (acidul aspartic), aminoacidul 87 (fenilalanină) și 27 aminoacidul 99 (glicină), aminoacidul 103 (leucină) și aminoacidul 108 (alanină) de la Nterminal al secvenței de aminoacizi ai lanțului ușor de TRA-8 au fost înlocuite cu pralină, 29 serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, serină, serină, leucină, pralină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină și, respectiv, treonină. Secvența 31 rezultată a fost denumită LM2.

Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ai lanțului 33 ușor umanizat de TRA-8 anticorp DR5 antiuman au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului 35 ușor de TRA- 8 umanizat

Codificarea ADN pentru lanțul de polipeptide LM2 (SECV. ID. Nr. 46 din Lista de 37 secvențe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp anti-DR5 umanizat și regiunea constantă a lanțului ușor Ig uman (lanțul k), au fost 39 în mod respectiv sintetizate prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de 7AL1P (SECV. ID. Nr. 47) și 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48), următorii 41 primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga -3' 43 (HKSPR11; SECV. ID. Nr. 49);

5'-ccaagttctttgtctgcatcagtaggagacagggtcaccatcacctgc-3' (HKCDF11; SECV. ID. Nr. 45 50);

5'-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg-3' (HKCDR12; 47 SECV. ID. Nr. 51);

RO 123115 Β1

5'-tgggcatccacccggcacactggggtcccaagcaggtttagtggcagt-3' (HKCDF22; SECV. ID. Nr. 52);

5'-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3' (HKCDR22; SECV. ID. Nr.53; și

5'-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3' (HKCF12; SECV. ID. Nr. 54).

2) Construirea plasmidei pCR3.1/M2-1 (donarea lanțului ușor de TRA-8 umanizat)

Fragmentul LM2-ADN, așa cum este definit în SECV. ID. Nr. 55 din Lista de secvențe, care codifică secvența de aminoacizi, așa cum este definită în SECV. ID. Nr. 46, a aceleiași liste, a fost preparat prin efectuarea reacției PCR în 2 pași, apoi inserat într-un vector plasmidial și donat în E. coli.

a) Primul pas al reacției PCR

Codificarea fragmentului LM2-F1-ADN pentru o secvență semnal a secreției și o porțiune din regiunea FRL_d cu situsul de clivaj al enzimei de restricție Hind III adăugat la capătul 5' a fost preparat în următoarele condiții. Plasmidele matriță, pHSGHM17 și pSRPDHH, au fost obținute prin urmărirea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pHSGHM17 (solicitarea de brevet european, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide HKSPR11, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Codificarea fragmentului de LM2-F2-ADN pentru o porțiune din FRL^ CDRL^ FRL₂și CDRL₂ a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pL28, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide HKCDF11, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide HKCDR12, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq, 2,5 unități.

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 50 μΙ prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Codificarea fragmentului de LM2-F3-ADN pentru o porțiune din CDRL₂, FRL₃ și o porțiune a CDRL₃ a fost preparată în următoarele condiții. Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, (solicitarea de brevet european, 25 ng;

RO 123115 Β1

- primerul de oligonucleotide HKCDF22, 50 pmol;1

- primerul de oligonucleotide HKCDR22, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;3

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq, 2,5 unități.5

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.7

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de 9 ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Codificarea fragmentului de LM2-F4-ADN pentru CDRL₃, FRL₄ și regiunea constantă 11 cu un situs de clivaj al enzimei de restricție EcoRI, adăugat la capătul 3', este preparat în următoarele condiții.13

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;15

- primerul de oligonucleotide HKCF12, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7ALCN, 50 pmol;17

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;19

- ADN polimeraza ampliTaq, 2,5 unități.

Soluția de reacție, având compoziția de mai sus, a fost ajustată la un volum final de 21 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care un ciclu termic 23 de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 25

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml de bromură de 27 etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras. 29

b) Al doilea pas al reacției PCR

LM2-ADN, în care fragmentele LM2-F1-ADN, LM2-F2-ADN, LM2-F3-ADNși LM2-F4-31

ADN descrise mai sus sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:33

- fragmentul de gel al LM2-F1-ADN preparat în primul pas al reacției PCR;

- ragmentul de gel al LM2-F2-ADN preparat în primul pas al reacției PCR; 35

- fragmentul de gel al LM2-F3-ADN preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al LM2-F4-ADN preparat în primul pas al reacției PCR;37

- primerul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7 ALCN, 50 pmol;39

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;41

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Soluția de reacție, având compoziția de mai sus, a fost ajustată la un volum final de 43 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care un ciclu termic 45 de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 47

RO 123115 Β1

Fragmentul LM2-ADN astfel preparat a fost inseratîn plasmida pCR3.1 ADN, folosind kitul de donare EukaryoticTA (Invitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în E. coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de nucleotide ale acestor ADNuri care codifică lanțul ușor de TRA-8 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizor 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin ElmerAppIied Biosystems, Japonia).

Plasmidele rezultate sunt denumite pCR3.1/M2-1 (plasmida care poartă cADN-ul ce conține codificarea regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 umanizat și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig umane).

Plasmida pCR3.1/M2-1 obținută conținând fragmentul LM2-ADN a fost supusă digestiei cu enzima de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pHSG399 de donare a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilatcu CIP. ADN-ul pHSG399 defosforilat rezultat și fragmentul LM2-ADN, care au fost supuse digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 pg/ml cloramfenicol (concentrații finale).Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 pg/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidial a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul LM2-ADN a fost selectată prin electroforeză în gel de agaroză 1%.

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M2-1-4, purtând un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM2 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgKuman. SușadeE. co//transformantăcegăzduieșteaceastă plasmidă, denumită E coli DH5a/pHSG/M2-1-4, a fost depozitată la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la20aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme și i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7563.

3) Construirea plasmidei pSR/M2-1 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor al TRAS LM2 umanizat)

Plasmida pHSG/M2-1-4 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM2 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pSRPDHH de donare (solicitare de brevet european EP 0909816 A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost defosforilatăcu CIP. ADN-ul pSRPDHH defosforilat rezultat și fragmentul ADN Hind HI-EcoR I, obținut din pHSG/M2-1-4, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 100 pg/ml ampicilină și plasmida ADN a fost extrasă din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN dorit în vectorul pSRPDHH a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Plasmida de expresie rezultată, purtând cADN-ul care conține codificarea lanțului ușor de TRA-8 umanizat, a fost denumită pSR/M2 -1.

RO 123115 Β1

Exemplul 20. Producerea de anticorp umanizat 1

Transfecția celulelor COS-7, adică o linie celulară derivată de la un rinichi de maimuță, cu plasmidele de expresie pentru lanțul greu de TRA-8 umanizat și lanțul ușor de 3 TRA-8 umanizat, obținute mai sus, a fost condusă prin metodele reactivului de transfecție FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica), în conformitate cu manualul de instrucțiuni 5 furnizat odată cu trusa.

Celulele COS-7 (American Type Culture Collection Nr. CRL-165) au fost crescute la 7 semiconfluență (3 x 10® celule/placă) într-o placă de cultură (suprafața culturii: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) conținând mediu Eagle modificat Dulbecco (denumit în cele ce urmează 9 drept „D-MED”; Gibco BRL) suplimentat cu ser fetal de vițel 10% (abreviat ca „FCS”; Moregate). 11 între timp, s-au amestecat 10 pg/placă (total 5 plăci) de ADN al plasmidei de expresie a lanțului greu de DR5 umanizat (pHA 15-1) și 10pg/placăde ADN al plasmidei de expresie 13 a lanțului ușor de DR5 umanizat, preparate prin metoda SDS-alcalină și centrifugare în gradient de densitate cu clorură de cesiu și, apoi, s-au precipitat cu etanol, urmat de 15 suspendare în 5 μΙ/placă de H₂O distilată.

După ce 15 μΙ/placă de reactiv de transfecție FUGENE6 sunt amestecați cu 17 180 μΙ/placă cu mediu DMEM fără FCS, această soluție FUGENE (185 μΙ/placă) este amestecată cu 5 μΙ/placă soluție de ADN care conține 10 μΙ/placă de ADN al plasmidei de 19 expresie a lanțului greu de DR5 umanizat și 10 μl/placă de ADN al plasmidei de expresie a lanțului ușor de DR5 umanizat. După 15 min de incubare la temperatura camerei, suspensia 21 de plasmidă obținută (200 μΙ) este adăugată plăcilor COS-7 anterior preparate. După incubare în 5% CO₂la37°C, timp de 24 h, mediul de cultură este schimbat cu mediul D-MEM 23 fără FCS. După incubare în 5% CO₂ la 37°CI timp de 72 h, supernatantul culturii este recuperat, pentru a se purifica produșii de expresie din fluidele supernatantului. Prin metoda 25 descrisă mai sus, celulele COS-7 au fost transfectate cu fiecare dintre următoarele combinații de plasmide: 27 (A) : fără ADN plasmidial;

(B) : cotransfecție de pHB14-1 și pSR/M2-1. 29

Cultura a fost apoi centrifugată (1.000 rpm, 5 min) și supernatantul colectat.

Supernatantul a fost din nou centrifugat (9.800 rpm, 15 min) și filtrat pe un filtru de 0,45 um 31 (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Cat# 25CS045 AS). Purificarea lui IgG din filtrate a fost realizată folosind cromatografia de afinitate Protein G-POROS (Applied Biosystems) în 33 următoarele condiții:

- HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems);35

- coloană: cartuș de sensor ProteinG-ID (mărimea coloanei: 2,1 mmID x 30 mmLD, volumul patului: 0,1 ml; Cat #2-1002-00, Applied Biosystems);37

- tampon de eluare: 0,1 M Glicină-HCI (pH 2,5);

- tampon de neutralizare: 1 M Tris-HCI (pH 8,5);39

- detecție: 280 nm;

- debit: 1 ml/min;41

- mărimea fracției: 0,5 ml/0,5 min;

- eprubeta fracției: microeprubetă de polipropilenă de 1,5 ml;43

- temperatura: 4°C.

După ce toate filtratele au fost aplicate pe coloană, 30 ml de PBS (Sigma, Cat #45

1000-3) au fost folosite pentru a spăla coloana. Când tamponul de eluare a fost aplicat, colectorul de fracții a fost pornit. Fiecare microeprubetă a fracției a conținut anticipat 55 μΙ 47 de 1 M NaCI, 110 μΙ de tampon de neutralizare și 74 μΙ de albumină serică bovină 2 mg/ml

RO 123115 Β1 (Sigma, Cat # A-7030) în PBS. Fracțiile de la numărul 8 la numărul 10 au fost colectate și dializate contra a un litru PBS (pH 7,5) la 4°C, timp de 1 zi, folosind un aparat Slide-Alyzer (Pierce, Cat# 66450). Tamponul de dializă a fost schimbat de două ori.

Verificarea expresiei anticorpilor umanizați și analiza cantitativă a produșilor de expresie din fluidele preparate ale supernatantului culturii a fost realizată prin ELISA, cu un anticorp contra IgG antiuman.

în fiecare godeu al unei plăci de 96 de godeuri (MaxiSorp, Nune), s-au adăugat 100 pl de anticorp policlonal IgG Fc specific antiuman de capră (Kappel), dizolvat la o concentrație finală de 0,5 pg/ml, în tampon de adsorbție (0,05 M bicarbonat de sodiu, 0,02% azidă de sodiu, pH 9,6) și placa a fost incubată la 37°C, timp de 2 h, pentru a determina adsorbția anticorpului. Apoi, placa a fost spălată cu 350 pl de PBS(-), conținând 0,05% Tween-20 (BioRad) (denumit în cele ce urmează ca „PBS-T”) de cinci ori. Godeurilor, după spălare, li s-a adăugat supernatantul culturii, diluat cu mediu D-MEM conținând 10% FCS și au fost incubate la 37°C, timp de 2 h. După o nouă spălare cu PBS-T, s-au adăugat 100 pl de anticorp policlonal specific IgG Fc antiuman de capră, marcat cu fosfatază alcalină (Jackson Immuno Research Lab.), diluat de 10.000 de ori cu PBS-T în fiecare godeu și au fost incubate la 37°C, timp de 2 h. După o nouă spălare cu PBS-T, o soluție substrat de fosfat p-nitrofenil, obținută din trusa de substrat al fosfatazei alcaline (BioRad), a fost adăugată în conformitate cu manualul de instrucțiuni furnizat odată cu trusa. După incubare la 37°C, timp de 0,5 până la o oră, absorbanța a fost măsurată la 405 nm. în experimentele prezente, imunoglobulina G din plasma umană subclasa 1 (lgG1) (Biopure AG), diluată cu mediu D-MEM conținând 10% FCS la anumite concentrații, a fost folosită ca probă de referință a concentrației de anticorpi DR5 umanizat, conținut în fluidele supernatantului culturii.

Ca rezultat, produșii de expresie și cei purificați din supernatantul culturii au fost detectați în mod specific cu anticorp IgG antiuman. Cantitatea de anticorp IgG uman este de 8,96 pg (800 pl).

Exemplul 21. Activitatea de inducere a apoptozei anticorpului umanizat

Celulele Jurkat (ATCC Nr. TIB-152) au fost folosite pentru a examina activitatea de inducere a apoptozei a anticorpului TRA-8 umanizat purificat.

Celulele Jurkat cultivate pe mediu RPMI1640 cu 10% FCS (Gibco BRL) la 37°C, timp de 3 zile, în prezența a 5% CO₂, au fost dispersate în fiecare godeu al microplăcii de 96 de godeuri (Sumitomo Bakelite), la 50 pl per godeu. TRA-8 umanizat, preparat în exemplul 20, a fost ajustat, pentru a avea concentrația produsului final de interes de 100 ng/ml, cu mediul RPMI1640 conținând 10% FCS prin estimarea concentrațiilor acestora în fluide, conform cu metoda descrisă în exemplul 20. Fiecare din soluțiile produșilor de expresie, astfel ajustată la 100 ng/ml, a fost folosită pentru a produce diluții seriate, prin repetarea diluției seriate de 2 ori cu RPMI1640 conținând 10% FCS. Fiecare dintre soluțiile de TRA-8 umanizat diluată a fost adăugată în fiecare godeu la 50 μI per godeu. După ce au reacționat la 37°C, timp de 12 h, s-au adăugat 50 pl de PMS 25 pM (metosulfat de fenazină; Sigma Chemical Co.) conținând 1 mg/ml XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5carboxyaniride inner salt; Sigma Chemical Co.)(concentrații finale de 250 ng/ml pentru XTT și 5 pM pentru PMS). După incubare timp de 3 h, s-a măsurat absorbanța la 450 nm, a fiecărui godeu, pentru a calcula viabilitatea celulară, prin folosirea abilității de reducere a mitocondriei ca index.

Viabilitatea celulelor din fiecare godeu a fost calculată în conformitate cu formula următoare:

Viabilitate (100%) = 100 x (a-b) / (c-b)

RO 123115 Β1 în care „a” reprezintă valoarea măsurată a godeului test, „b” reprezintă valoarea măsurată 1 a godeului fără nicio celulă și „c” reprezintă valoarea măsurată a godeului fără adaos de anticorp,3 ca rezultat, produsul de expresie preparat în exemplul 20 (TRA-8 umanizat) a demonstrat că induce apoptoza în celulele liniei celulare de limfom T, care exprimă antigen 5 DR5 uman.

Exemplul 22. Reactivitatea lui TRAS la diferite molecule DR57

Pentru a determina reactivitatea lui TRA-8 la diferite molecule DR5, reactivitatea lui

TRA-8 a fost examinată folosind limfocitele activate după cum urmează.9

Mai întâi, probe de sânge periferic au fost prelevate de la un om (30 ml), marmoset (maimuța mică) (3 ml) și maimuța cynomolgus (20 ml). Probelor de sânge li s-a adăugat 111 ml de heparină (Novaheparin; Novo) și probele au fost apoi etalate lent peste un volum egal de soluție Ficoll-Paque PLUS ((Amersham Pharmacia Biotech.), greutate specifică: 1,077,13 pentru toți cu excepția maimuței cynomolgus, care a avut o greutate specifică de 1,072) și centrifugate la 1700 rpm, timp de 30 min, pentru a obține o fracție de celule mononucleare 15 din sângele periferic. Această fracție de celule mononucleare a fost spălată de două ori cu soluție de sare Hanks echilibrată și, apoi, suspendatăîn mediu RPM11640 cu 10% v/v FCS 17 la o densitate celulară de 1 x 10⁶ celule/ml. S-a adăugat fitohemaglutinin-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) la suspensia rezultată, până la o concentrație finală de 5 pg/ml și proba a 19 fost incubată la 37°C, sub 5% v/v CO₂, timp de 24 h. După acest timp, celulele au fost recuperate prin centrifugare, spălate și resuspendateîn mediu RPM11640 conținând 10% v/v 21 FCS. Apoi, pentru a activa celulele recuperate, s-a adăugat interleukina-2 (Amersham Pharmacia Biotech) la suspensie, până la o concentrație finală de 10 unități/ml și aceasta 23 a fost incubată la 37°C sub 5% v/v CO₂, timp de 72 h.

O cantitate de preparat activat, calculat a conține 1 x 10⁶ celule limfocite activate, a 25 fost plasată într-o eprubetă test și fiecare suspendată în 50 μI de 0,5,1,5,10 pg/ml de TRA8 în PBS sau 50 pl de PBS singur. Suspensia rezultată a fost lăsată să stea pe gheață timp 27 de o oră, după care celulele au fost spălate de 3 ori cu cantități de 500 pl de PBS și, apoi, suspendate în 50 pl de 20 de pg/ml anticorp IgG antișoarece marcat FITC (Bioresource) în 29 PBS. Folosind celulele suspendate în 500 pl de PBS ca martor, intensitatea fluorescentei a fost măsurată, utilizând un citometru în flux (FACSCalibur; Becton Dickinson). 31

Au fost obținute distribuții ale numărului de celule prin intensitatea fluorescenței și au fost calculate proporții ale numerelor de celule colorate față de cele ale celulelor totale. Mai 33 mult, fiecare valoare Kd a fost calculată folosind concentrația de TRA-8 și proporțiile numerelor de celule colorate față de cele ale celulelor totale. Fiecare frecvență de reactivitate 35 pentru limfocitele activate de om, marmoset (maimuța mică) sau maimuța cynomologus a fost aproape aceeași. Prin urmare, TRA-8 este capabil de legarea unei game largi de DR5 37 de primate, inclusiv omul contra căruia TRA-8 a fost inițial preparat.

Exemplul 23. Studiul escaladării dozei de TRA-8 la marmosete (maimuțe mici) 39

Un studiu de toxicitate preliminară la escaladarea dozei de TRA-8 a fost efectuat folosind un mascul și o femelă de marmoset. Au fost efectuate trei seturi de doze unice 41 intravenoase, care au fost separate printr-o perioadă de urmărire de 7 zile. Doza de TRA-8 a fost stabilită la 50,250 și 1250pg/corp. La 48 h după fiecare tratament, s-a colectat sânge 43 din vena femurală și plasma a fost preparată. Activitățile aspartataminotransferazei și alanin aminotransferazei din plasmă au fost măsurate folosind un analizor (FUJI DRI-CHEM: Fuji 45 Film Medical Co., Ltd ). Toate probele de sânge au fost prelevate fără nici o anestezie. Ca rezultat, nici o dovadă care să indice lezarea hepatică nu a fost înregistrată la examinarea 47 biochimică a plasmei după fiecare tratament.

RO 123115 Β1

Exemplul 24. Studii farmacologice in vitro și in vivo ale lui TRA-8 contra celulelor canceroase

Pentru a determina dacă TRA-8 are eficacitate terapeutică în terapia anticancer, activitatea de omorâre in vitro a TRA-8, folosind diferite linii celulare canceroase, a fost examinată după cum urmează. Diferite celule canceroase (2-8 x 10³ celule/50 μI), cultivate pe mediu RPMI 1640 (pentru celule Jurkat), pe mediu DMEM (pentru celule HCT-116), pe mediu MEM-R (pentru celule WiDr) sau pe mediu DMEM-F12 (pentru celule COL2 -Jck), obținute de la Gibco BRL cu 10% FCS (Gibco BRL) la 37°C, în prezența a 5% CO₂, au fost dispersate în fiecare godeu al unei microplăci de 96 godeuri (Sumitomo Bakelite). TRA-8 a fost ajustat pentru a avea concentrația produsului final de interes de 100 ng/ml, cu mediu conținând 10% FCS. Soluția de TRA-8 (100 ng/ml) a fost folosită pentru a produce diluții seriate, prin repetarea diluării seriate de două ori, cu mediu conținând 10% FCS. Fiecare din soluțiile de TRA-8 diluate a fost adăugată în fiecare godeu, 50 pl per godeu, și incubată la 37°C. După ce a fost lăsat să reacționeze la 37°C, timp de 72 h, s-au adăugat 50 pl de PMS 25 pM (metosulfat de fenazină; Sigma Chemical Co.), conținând 1 mg/ml XTT (concentrații finale de 250 pg/ml pentru XTT și 5 pM pentru PMS). După incubare timp de 3 h, s-a măsurat absorbanța la 450 nm a fiecărui godeu, pentru a calcula viabilitatea celulară, folosind abilitatea de reducere a mitocondriei ca index.

Viabilitate (100%) = 100 x (a-b) / (c-b) în care „a” reprezintă valoarea măsurată a godeului test, „b” reprezintă valoarea măsurată a godeului fără nici o celulă și „c” reprezintă valoarea măsurată a godeului fără adaos de anticorp.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3 de mai jos.

Tabelul 3

Celule	ED50 (pg/ml)
Jurkat	0,001-0,01
HCT-116	0,004-0,02
WiDr	0,007-0,03
COL2-Jck	2,28

Diferitelor linii celulare canceroase li s-a indus în mod puternic apoptoza de către TRA-8 în condițiile in vitro.

în afară de aceasta, s-a determinat efectul antitumoral in vivo al lui TRA-8 la șoareci nuzi transplantați cu celule WiDr, pentru că TRA-8 nu prezintă reacție încrucișată cu DR5 murin.

Anticorpul DR5 antiuman TRA-8 a fost administrat la șoareci nuzi purtând xenogrefe umane care exprimă molecula DR5 umană. Șoarecii folosiți au fost șoareci Balb/c nud/nud în vârstă de 6 săptămâni (femele, de la Clea Japonia Inc.), care au fost transplantați cu linia celulară de cancer de colon WiDr (5 mm³). La o zi după transplantarea tumorii, acești șoareci transplantați au fost zilnic tratați cu injecții intra-articulare de TRA-8 (5 pg/corp) de 14 ori. Creșterea tumorii WiDr a fost zilnic determinată prin mărimea masei tumorale. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4 de mai jos.

RO 123115 Β1

Tabelul 4 1

	8 zile	11 zile	15 zile	18 zile	22 zile	25 zile
Martor (PBS)	196	249	469	584	833	1193
SD	±55	±77	±149	±230	±274	±419
TRA-8	158	97	155	195	365	530
SD	±78	±30	±60	±58	±91	±135

în acest model, în timp ce toate animalele netratate au prezentat o creștere vizibilă a tumorii, creșterea tumorii la animalele tratate cu TRA-8 a fost inhibată, așa cum s-a 9 demonstrat prin mărimea tumorii.

Aceste rezultate au arătat că TRA-8 este eficient în eliminarea celulelor tumorale 11 in vivo.

Exemplul 25. Studiul combinării lui TRA-8 13

Linia celulară de cancer de prostată uman PC-3 a fost obținută de la American Tissue

Culture Collection (ATCC) și menținută într-un amestec de nutrienți F-12K (F-12K Nutrient 15 Mixture, 21127-022, Gibco BRL) conținând 10% ser fetal de bovine (FBS, Hyclone), 1% LGlutamină-200 mM (25030-149, Gibco BRL) și 0,5% soluție de penicilină streptomicină (P- 17

7539, Sigma). Mediul RPMI 1640 (MED-008, IWAKI), suplimentat cu 10% FBS și 0,5% soluție de penicilină streptomicină, a fost utilizat în experimentul următor. Celulele PC-3 în 19 faza de creștere exponențială au fost colectate prin tripsinizare și spălate de două ori cu mediu proaspăt. Apoi, celulele au fost numărate, resuspendate în mediu proaspăt, la o 21 densitate de 5 x 10⁴ celule/ml și distribuite în triplicat, în plăci cu 96 godeuri și fund plat (3598, Corning-Coster), într-un volum total de 100 pl /godeu, cu o zi înainte de începerea 23 experimentului. Un medicament anticancer reprezentativ, Paclitaxel (169-18611, Wako), dizolvat în dimetilsulfoxid (10 mg/ml), a fost diluat în mediu proaspăt și apoi adăugat în 25 plăcile de 96 de godeuri conținând celule în 50 μΙ/godeu. Concentrațiile finale de dimetilsulfoxid au fost mai mici de 0,1%. După incubare timp de 24 h, la 37°C în atmosferă 27 de 5% CO₂, s-a adăugat în godeuri TRA-8 diluat în mediu proaspăt. După incubare timp de încă 24 h, 50 μΙ de mediu minim esențial (Minimum Essential Medium, 11095-098, Gibco 29 BRL), conținând 1 mg/ml de XTT și 25 mM de PMS, au fost adăugați în godeuri și plăcile au fost incubate timp de 6 h. Apoi, s-a măsurat OD450 cu SPECTRA MAX 250 (Molecular 31 Devices) și viabilitatea celulară a fost calculată după cum urmează.

Viabilitate celulară (%) = (OD450 pentru godeul conținând celule tratate cu Taxol 33 și/sau TRA-8 (agent(ți)) - (OD450 pentru godeul care nu conține nici celule, nici agent) x 100 / (OD450 pentru godeul care conține celule, dar nu conține agent - OD450 pentru godeul 35 care nu conține nici celule, nici agent).

Rezultatul testului de mai sus pentru TRA-8 combinat cu un medicament anticancer 37 reprezentativ, Paclitaxel, a fost următorul. Paclitaxelul a redus viabilitatea celulară a celulelor PC-3, dar mai mult de 40% din semnalele indicând celule canceroase viabile au rămas încă 39 la concentrații de până la 200 nM. în mod remarcabil, adăugarea de 0,1 ng/ml de TRA-8 a descrescut în mare măsură viabilitatea celulelor de cancer, până la 10%, chiar dacă nicio 41 reducere în viabilitatea celulară nu a fost văzută după o unică aplicare de TRA-8 la această concentrație. Acest rezultat arată în mod clar că TRA-8 manifestă o activitate anticancer 43 sinergică atunci când este combinat cu alte medicamente anticancer.

RO 123115 Β1

Exemplul 26. Analiza altor tipuri de anticorpi umanizați ai lui TRA-8 (1) Proiectarea anticorpilor umanizați

Construirea unei versiuni umanizate de TRA-8 a fost efectuată prin metoda în general cunoscută ca grefare CDR. Anticorpul mAB58'CL a fost utilizat ca un acceptor așa cum s-a descris în referința de la exemplul 2 și regiunile CDR ale anticorpului TRA-8 au fost grefate pe acceptor. în regiunea structurii cadru, câțiva aminoacizi au fost grefați pe acceptor fie de la TRA-8, fie de la secvențele consens umane, pe criterii date de către Queen și colab., (Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 86: 10029-10033, (1989)) și secvențele de TRA-8 umanizate au fost construite, după cum sunt descrise mai departe în prezenta invenție.

(2) Construirea unei plasmide care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanțului greu al altor tipuri de TRA-8 umanizat sau TRAS de șoarece

Așa cum s-a prezentat în SECV. ID. Nr. 56 din Lista de secvențe, umanizarea de tip H1 a secvențelor de aminoacizi ai lanțului greu al TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 3 (metionină), aminoacidului 13 (lizină), aminoacidului 19 (lizină), aminoacidului 40 (treonină), aminoacidului 42 (acidul glutamic), aminoacidului 44 (arginină), aminoacidului 84 (serină), aminoacidului 88 (serină), aminoacidului 93 (metionină), aminoacidului 114 (treonină), aminoacidului 115 (leucină), cu glutamină, glutamină, arginină, alanină, glicină, glicină, asparagină, alanină, valină, leucină și, respectiv, valină.

Așa cum s-a prezentat în SECV. ID. Nr. 59 din Lista de secvențe, umanizarea de tip H3 a secvențelor de aminoacizi ai lanțului greu al TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 13 (lizină), aminoacidului 19 (lizină), aminoacidului 40 (treonină), aminoacidului 42 (acidul glutamic), aminoacidului 44 (arginină), aminoacidului 88 (serină), aminoacidului 93 (metionină), aminoacidului 114 (treonină), aminoacidului 115 (leucină), cu glutamină, arginină, alanină, glicină, glicină, alanină, valină, leucină și, respectiv, valină.

Așa cum s-a prezentat în SECV. ID. Nr. 60 din Lista de secvențe, umanizarea de tip H4 a secvențelor de aminoacizi ale lanțului greu al TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 13 (lizină), aminoacidului 19 (lizină), aminoacidului 88 (serină), aminoacidului 93 (metionină), aminoacidului 114 (treonină), aminoacidului 115 (leucină), cu glutamină, arginină, alanină, valină, leucină și, respectiv, valină.

Așa cum s-a prezentat în SECV. ID. Nr. 61 din Lista de secvențe, plasmida care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanțului greu al unui TRA-8 himeric a fost denumită „tipul M”. în plus, TRA-8 umanizat descris în exemplele 17 și 18 a fost definit ca „tipul H2.

Plasmidele purtătoare de ADN, ce conțin codificarea regiunii variabile a lanțului greu a lui TRA-8 umanizat sau himeric, au fost construite după cum urmează.

Reacția PCR a fost utilizată pentru a construi următoarele secvențe ADN, fiecare dintre acestea cuprinzând cele descrise mai sus.

Au fost sintetizate următoarele 24 de oligonucleotide:

5'-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac -3' (A; SECV. ID. Nr. 32);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B; SECV. ID. Nr. 33);

5'-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B2; SECV. ID. Nr. 57);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B3; SECV. ID. Nr. 66);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta -3' (C; SECV. ID. Nr. 34);

RO 123115 Β1

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca 1 accattagta -3' (C2; SECV. ID. Nr. 64);

5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa 3 gaacaccctg -3' (D; SECV. ID, Nr.. 35);

5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta 5 tgattacgac-3' (E; SECV. ID. Nr.. 36);

5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta 7 tgattacgac-3' (E2; SECV. ID. Nr. 62);

5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta 9 tgattacgac-3' (E3; SECV. ID. Nr. 67);

5'- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3'(F; 11 SECV. ID. Nr. 37);

5'- ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggto -3' (F2;13

SECV. ID. Nr. 68);

5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G;15

SECV. ID. Nr. 38);

5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct17 gtagctgttg -3' (H; SECV. ID. Nr. 39);

5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct19 gtagctgttg -3' (H2; SECV. ID. Nr. 58);

5'- tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct 21 gtagctgttg -3' (H3; SECV. ID. Nr. 69);

5'- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg 23 cacaggagag -3' (I; SECV. ID. Nr. 40);

5'- tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg 25 cacaggagag -3' (I2; SECV. ID. Nr. 65);

5'- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt 27 tgcaacccac-3' (J; SECV. ID. Nr. 41);

5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc 29 ttggcattgt-3' (K; SECV. ID. Nr. 42);

5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc 31 ttggcattgt-3' (K2; SECV. ID. Nr. 63);

5'- ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc 33 ttggcattgt-3' (K3; SECV. ID. Nr. 70);

5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta 35 atcatagagt cacc -3' (L; SECV. ID. Nr. 43) și

5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta 37 atcatagagt cacc -3' (L2; SECV. ID. Nr. 71).

Următorii 2 primeri PCR au fost sintetizați după descrierea de mai sus: 39

5'- ttggataagc ttggcttgac-3' (P1; SECV. ID. Nr. 44); și

5'- gaccgatggg cccttggtgg a -3' (P2; SECV. ID. Nr. 45). 41

Sinteza de ADN de tip H1, care codifică un lanț de polipeptide cuprinzând o secvență semnal a secreției, o regiune variabilă a lanțului greu de TRA-8 umanizat și 8 reziduuri de 43 aminoacizi la N-ul terminal al regiunii IgG-CH 1, a fost efectuată folosind în mod respectiv o combinație de PCR. 45

Fragmentul de ADN de tip H1 a fost preparat după cum urmează.

Compoziția soluției reacției PCR: 47

- oligonucleotida A, 10 pmol;

- oligonucleotida B2,10 pmol; 49

RO 123115 Β1

- oligonucleotida C, 10 pmol;

- oligonucleotida D, 10 pmol;

- oligonucleotida E, 10 pmol;

- oligonucleotida F, 10 pmol;

- oligonucleotida G, 10 pmol;

- oligonucleotida H2,10 pmol;

- oligonucleotida I, 10 pmol;

- oligonucleotida J, 10 pmol;

- oligonucleotida K, 10 pmol;

- oligonucleotida L, 10 pmol;

- primer de oligonucleotide P1,2 μΜ;

- primer de oligonucleotide P2, 2 μΜ;

-10 x tampon Pyrobest II, 10 μΙ;

- amestec de dNTP, 8 μΙ;

- ADN polimeraza Pyrobest, 0,5 μΙ și

- apă bidistilată pentru un volum final de 50 μΙ.

Reacția POR a fost condusă după cum urmează. Soluția a fost mai întâi încălzită la 94°C, timp de 5 min, după care urmează un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C timp de 30 s, și la 72°C, timp de 1 min, ciclu care a fost repetat de 7 ori. După terminarea completă a acestei proceduri, soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 15 min.

După extracția cu fenol și precipitarea în etanol, precipitatul de ADN rezultat a fost uscat la vid, dizolvat într-un minim de apă bidistilată și separat prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 pg/ml soluție apoasă de bromură de etidium, pentru a permite detecția de ADN în UV.

Benzile de ADN corespunzătoare ADN-ului de tip H1 au fost excizate cu o lamă de ras și eluate din gel, folosind trusa Geneclean Spin (BIO 101, CA, SUA). După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, dizolvat în 5 μΙ de apă distilată.

Sinteza de ADN de tip H3, care codifică un lanț de polipeptide cuprinzând o secvență semnal a secreției, o regiune variabilă a lanțului greu de TRA-8 umanizat și 8 reziduuri de aminoacizi la N-ul terminal al regiunii lgG-CH1, a fost efectuată folosind în mod respectiv o combinație de PCR.

Fragmentul de ADN de tip H3 a fost preparat după cum urmează.

Compoziția soluției reacției PCR:

- oligonucleotida A, 10 pmol;

- oligonucleotida B, 10 pmol;

- oligonucleotida C, 10 pmol;

- oligonucleotida D, 10 pmol;

- oligonucleotida E2, 10 pmol;

- oligonucleotida F, 10 pmol;

- oligonucleotida G, 10 pmol;

- oligonucleotida H, 10 pmol;

- oligonucleotida 1,10 pmol;

- oligonucleotida J, 10 pmol;

- oligonucleotida K2,10 pmol;

- oligonucleotida L, 10 pmol;

- primer de oligonucleotide P1, 2 μΜ;

- primer de oligonucleotide P2, 2 μΜ;

RO 123115 Β1

-10 x tampon Pyrobest II, 10 μΙ; 1

- amestec de dNTP, 8 μΙ;

- ADN polimeraza Pyrobest, 0,5 μΙ și 3

- apă bidistilată pentru un volum final de 50 μΙ.

Reacția PCR a fost condusă după cum urmează. Soluția a fost mai întâi încălzită la 5 94°C, timp de 5 min, după care urmează un ciclu de încălzire la98°C, timp de 10 s, la55°C, timp de 30 s, și la 72°C, timp de 1 min, ciclu care a fost repetat de 7 ori. După terminarea 7 completă a acestei proceduri, soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 15 min.

După extracția cu fenol și precipitarea în etanol, precipitatul de ADN rezultat a fost 9 uscat la vid, dizolvat într-un minim de apă bidistilată și separat prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 pg/ml soluție apoasă de bromură 11 deetidium, pentru a permite detecția de ADN în UV. Benzile de ADN corespunzătoare ADNului de tip H3 au fost excizate cu o lamă de ras și eluate din gel, folosind trusa Geneclean 13

Spin. După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost apoi concentrat prin centrifugare la 7500 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, dizolvat în 5 μΙ de apă distilată. 15

Sinteza de ADN de tip H4, care codifică un lanț de polipeptide cuprinzând o secvență semnal a secreției, o regiune variabilă a lanțului greu de TRA-8 umanizat și 8 reziduuri de 17 aminoacizi la N-ul terminal al regiunii IgG-CH 1, a fost efectuată folosind în mod respectiv o combinație de PCR. 19

Fragmentul de ADN de tip H4 a fost preparat după cum urmează.

Compoziția soluției reacției PCR:21

- oligonucleotida A, 10 pmol;

- oligonucleotida B, 10 pmol;23

- oligonucleotida C2,10 pmol;

- oligonucleotida D, 10 pmol;25

- oligonucleotida E2,10 pmol;

- oligonucleotida F, 10 pmol;27

- oligonucleotida G, 10 pmol;

- oligonucleotida H, 10 pmol;29

- oligonucleotida 12,10 pmol;

- oligonucleotida J, 10 pmol;31

- oligonucleotida K2,10 pmol;

- oligonucleotida L, 10 pmol;33

- primer de oligonucleotide P1, 2 uM;

- primer de oligonucleotide P2, 2 u.M;35

-10 x tampon Pyrobest II, 10 μΙ;

- amestec de dNTP, 8 μΙ;37

- ADN polimeraza Pyrobest, 0,5 μΙ și

- apă bidistilată pentru un volum final de 50 μΙ.39

Reacția PCR a fost condusă după cum urmează. Soluția a fost mai întâi încălzită la 94°C, timp de 5 min, după care urmează un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C,41 timp de 30 s, și la 72°C, timp de 1 min, ciclu care a fost repetat de 7 ori. După terminarea completă a acestei proceduri, soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 15 min. 43

După extracția cu fenol și precipitarea în etanol, precipitatul de ADN rezultat a fost uscat la vid, dizolvat într-un minim de apă bidistilată și separat prin electroforeză în gel de 45 agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 pg/ml soluție apoasă de bromură de etidium, pentru a permite detecția de ADN în UV. Benzile de ADN corespunzătoare ADN- 47 ului de tip H4 au fost excizate cu o lamă de ras și eluate din gel, folosind trusa Geneclean Spin. După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 49 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, dizolvat în 5 μΙ de apă distilată.

RO 123115 Β1

Sinteza de ADN de tip M, care codifică un lanț de polipeptide cuprinzând o secvență semnal a secreției, o regiune variabilă a lanțului greu de TRA-8 himeric și 8 reziduuri de aminoacizi la N-ul terminal al regiunii lgG-CH1, a fost efectuată folosind în mod respectiv o combinație de PCR.

Fragmentul de ADN de tip M a fost preparat după cum urmează.

Compoziția soluției reacției PCR:

- oligonucleotida A, 10 pmol;

- oligonucleotida B3, 10 pmol;

- oligonucleotida C2, 10 pmol;

- oligonucleotida D, 10 pmol;

- oligonucleotida E3, 10 pmol;

- oligonucleotida F2, 10 pmol;

- oligonucleotida G, 10 pmol;

- oligonucleotida H3, 10 pmol;

- oligonucleotida 12,10 pmol;

- oligonucleotida J, 10 pmol;

- oligonucleotida K3,10 pmol;

- oligonucleotida L2, 10 pmol;

- primer de oligonucleotide P1, 2 μΜ;

- primer de oligonucleotide P2, 2 μΜ;

-10 x tampon Pyrobest II, 10 μΙ;

- amestec de dNTP, 8 μΙ;

- ADN polimeraza Pyrobest, 0,5 μΙ și

- apă bidistilată pentru un volum final de 50 μΙ.

Reacția PCR a fost condusă după cum urmează. Soluția a fost mai întâi încălzită la 94°C, timp de 5 min, după care urmează un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s, și la 72°C, timp de 1 min, ciclu care a fost repetat de 7 ori. După terminarea completă a acestei proceduri, soluția de reacție a fost încălzită la 72°C, timp de 15 min.

După extracția cu fenol și precipitarea în etanol, precipitatul de ADN rezultat a fost uscat la vid, dizolvat într-un minim de apă bidistilată și separat prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 Hg/ml soluție apoasă de bromură deetidium, pentru a permite detecția de ADN în UV. Benzile de ADN corespunzătoare ADNului de tip M au fost excizate cu o lamă de ras și eluate din gel, folosind trusa Geneclean Spin. După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, dizolvat în 5 μΙ de apă distilată.

Ceea ce a rezultat, adică fiecare ADN extras (tipul H1, tipul H3, tipul H4 și tipul M), a fost donat, folosind vectorul pGEM-T Easy (Promega), după cum urmează:

- fragmentul de ADN recuperat din reacția PCR (H1, H3, H4 sau M), 5 μΙ;

-10 x tampon Taq polimerază, 1 μΙ;

- amestec de dNTP, 1 μΙ;

- polimeraza Taq (5 unități/ml), 1 μΙ și

- apă bidistilată pentru un volum final de 10 μΙ.

După ce fiecare soluție de mai sus a fost lăsată să reacționeze la 70°C, timp de 30 min, fiecare soluție de ADN și vectorul pGEM-T Easy au fost ligate, folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2,0 (Takara Shuzo Co., Ltd), utilizând protocolul producătorului.

După 4 h de incubare la 15°C, 2 μΙ din soluția de reacție incubată au fost amestecați cu 100 μΙ de E. coli, sușa JM 109 competentă la o densitate celulară de 1-2 x 10⁹ celule/ml (Takara Shuzo Co., Ltd) și amestecul a fost păstrat pe gheață timp de 30 min, apoi, la42°C,

RO 123115 Β1 timp de 30 s și din nou pe gheață, timp de 1 min. Apoi, 500 pi de mediu SOC (2% v/v 1 triptonă, 0,5% g/v extract de drojdie, 0,05% g/v clorură de sodiu, 2,5 mM g/v clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu și 20 mM glucoza) au fost adăugați amestecului, care 3 a fost incubat pentru încă o oră, cu agitare. Sușele transformante au fost apoi izolate și ADNul plasmidial din sușe a fost preparat după descrierea din „Molecular Cloning: A Laboratory 5 Manual”. Secvența de nucleotide ale acestui ADN care conține codificarea lanțului greu de TRA-8 umanizat sau de TRA-8 de șoarece a fost confirmată, în mod respectiv, prin metoda 7 dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74:5463-5467), folosind un aparat 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia). 9 Plasmida rezultată a fost denumită pHA15 (plasmidă ce poartă cADN-ul care codifică lanțul greu de tip H1 al lui TRA-8 umanizat), pHC10 (plasmidă ce poartă cADN-ul care 11 codifică lanțul greu de tip H3 al lui TRA-8 umanizat), pHD21 (plasmidă ce poartă cADN-ul care codifică lanțul greu de tip H4 al lui TRA-8 umanizat) și pM 11 (plasmidă ce poartă cADN- 13 ui care conține codificarea lanțului greu al lui TRA-8 himeric). Sușele de E. co//transformante care găzduiesc aceste plasmide, denumite E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, E. 15 coli JM109/pHD21 și E. coli JM 109/pM 11, au fost depozitate la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 17

1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme și li s-a acordat 19 numărul de acces FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 și, respectiv, FERM BP -7559. 21 (3) Construirea de plasmide de expresie care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanțului greu, a câtorva tipuri de TRA-8 umanizat sau a TRA-8 de șoarece 23

Vectorul de expresie recombinant pentru celulele animale a fost construit prin inserarea ADN-ului care conține codificarea lanțului greu de tip H1, de tip H3 și de tip H4 25 umanizat sau de tip M himeric al lui TRA-8 (donat mai sus) după cum urmează.

pg de plasmidă pSRHHH3 (solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1) care 27 poartă regiunea variabilă a lanțului greu al anticorpului monoclonal anti-Fas umanizat HFE7A și ADN-ul genomic al regiunii constante a IgG 1 umane, un vector de expresie pentru celulele 29 mamiferelor a fost supus digestiei cu enzimelede restricție Hind III și Apa I, și a fost separat prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 pg/ml 31 soluție apoasă de bromură de etidium, pentru a permite detectarea de ADN în UV. Benzile de ADN ale vectorului conținând ADN-ul genomic al regiunii constante IgG 1 umană, fără 33 regiunea variabilă a lanțului greu a lui HFE7A, au fost excizate folosind o lamă de ras și eluate din gel, utilizând trusa Geneclean Spin. După extracția cu fenol, ADN-ul eluat a fost 35 apoi concentrat prin centrifugare la 7.500 x g, urmat de precipitare în etanol și, în final, a fost dizolvat în 5 μΙ de apă distilată și, apoi, defosforilat, folosind CIP. Plasmida rezultată supusă 37 digestiei și defosforilată (100 ng) a fost ligată cu 1 pg din fragmentul de ADN al pHA15, pHC10, pHD21 sau pM11 care conține ADN-ul ce codifică regiunea variabilă a lanțului greu 39 al lui TRA-8 umanizat sau TRA-8 himeric, care a fost de asemenea supus digestiei cu Hind III și Apa I, folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2,0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Amestecul 41 de ligare a fost apoi utilizat pentru a transforma E. coli JM109, care a fost apoi etalată pe plăci cu mediu LB agar conținând 50 pg/ml ampicilină. 43

Transformanții obținuți prin această metodă au fost cultivați în 2 ml de mediu LB lichid, conținând 50 pg/ml ampicilină la 37°C peste noapte și ADN-ul plasmidei a fost ulterior 45 extras din cultura rezultată prin metoda SDS-alcalină.

ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și Apa I și electroforezei 47 în gel de agaroză 3% g/v, pentru a confirma prezența sau absența insertului de ADN care codifică regiunea variabilă a lanțului greu al lui TRA-8 umanizat sau TRA-8 himeric. 49

RO 123115 Β1

Inserarea și orientarea fragmentului de ADN dorit în vector a fost confirmată prin secvențierea ADN, folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Plasmidele de expresie, rezultate, purtând cADN-ul care conține codificarea lanțului greu al lui TRA-8 umanizat sau al lui TRA-8 himeric, au fost denumite pHA15-1, pHC10-3, pHD21-1 și, respectiv, pM11-1.

(4) Construirea de vectori pentru lanțurile ușoare umanizate (4.1) Construirea unui vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului umanizat (tip LM1)

Așa cum s-a arătat în SECV. ID. Nr. 72 din Lista de secvențe, altă umanizare (tip LM1) a secvențelor de aminoacizi ale lanțului ușor al lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 3 (valină), aminoacidului 8 (histidină), aminoacidului 9 (lizină), aminoacidului 10 (fenilalanină) aminoacidului 11 (metionină), aminoacidului 13 (treonină), aminoacidului 20 (serină), aminoacidului 42 (glutamină), aminoacidului 43 (serină), aminoacidului 60 (acid aspartic), aminoacidului 63 (treonină), aminoacidului 77 (asparagină), aminoacidului 78 (valină), aminoacidului 80 (serină), aminoacidului 83 (leucină), aminoacidului 85 (acid aspartic), aminoacidului 87 (fenilalanină) și aminoacidului 99 (glicină), aminoacidului 103 (leucină) și aminoacidului 108 (alanină) de la N-terminal al secvenței de aminoacizi ai lanțului ușor de TRA-8 cu glutamină, pralină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, serină, serină, leucină, pralină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină și, respectiv, treonină. Secvența rezultată a fost denumită LM1.

Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ale lanțului ușor umanizat ale lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman (tip LM1, SECV. ID. Nr. 72 din Lista de secvențe) au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului ușor de TRA-8 umanizat (tip LM1)

ADN codificând lanțul de polipeptide LM1 (SECV. ID. Nr. 72 din Lista de secvențe), acesta fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp anti-DR5 umanizat (tip LM1) și regiunea constantă a lanțului ușor a Ig uman (lanțul k), a fost respectiv sintetizat prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de 7 AL1P (SECV. ID. Nr. 47), 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48), HKCDF11 (SECV. ID. Nr. 50), HKCDR12 (SECV. ID. Nr. 51), HKCDF22 (SECV. ID. Nr. 52), HKCDR22 (SECV. ID. Nr. 53) și HKCF12 (SECV. ID. Nr. 54) a fost sintetizat pentru PCR următorul primer de oligonucleotide.

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattggtcatctgaatgtcaccagtgga-3' (HKSPR12; SECV. ID. Nr. 77).

2) Construirea unei plasmide pCR3.1/LM1-2 (donarea lanțului ușor al lui TRA-8 umanizat de tip LM1)

Fragmentul ADN-LM1 codificând secvența de aminoacizi definită în SECV. ID. Nr. 72 a aceleiași liste a fost preparat prin efectuarea reacției PCR în 2 pași, inserție într-un vector plasmidial și donare în E. coli.

a) Primul pas al reacției PCR

Fragmentul de LM 1-F1-ADN care codifică o secvență semnal a secreției și o porțiune a regiunii FRLi cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție Hind III, adăugată la capătul 5', a fost preparată în următoarele condiții. Plasmidele matriță, pHSGHM17și pSRPDHH, au fost obținute prin urmărirea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pHSGHM17, 25 ng;

RO 123115 Β1

- primerul de oligonucleotide 7AL1P, 50 pmol;1

- primerul de oligonucleotide HKSPR12, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;3

-10 x tampon PCR, 5 pl;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.5

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.7

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu care9 se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentul LM1-F2-ADN codificând o porțiune a FRL_1: CDRL^ FRL₂ și CDRL^afost 11 preparată în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:13

- ADN-ul plasmidei pL28, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide HKCDF11, 50 pmol;15

- primerul de oligonucleotide HKCDR12, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;17

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.19

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.21

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat23 de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentul LM1-F3-ADN care codifică CDRL₂, FRL₃ și o porțiune de CDRL₃ a fost 25 preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:27

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide HKCDF22, 50 pmol;29

- primerul de oligonucleotide HKCDR22, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;31

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq, 2,5 unități.33

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.35

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat37 de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentul LM1-F4-ADN care codifică CDRL₃, FRL₄și regiunea constantă cu situs-ul 39 de clivaj al enzimei de restricție EcoR 1, adăugat la capătul 3', a fost preparat în următoarele condiții.41

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;43

- primerul de oligonucleotide HKCF12, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7 ALCN, 50 pmol;45

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;47

- ADN polimeraza ampliTaq, 2,5 unități.

RO 123115 Β1

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforezăîn gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml de bromură de etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate au fost excizate cu o lamă de ras.

b) Al doilea pas al reacției PCR

ADN-LM1, în care fragmentele ADN-LM1-F1, ADN-LM1-F2, ADN -LM1-F3 și ADNLM1-F4 descrise mai sus sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- fragmentul de gel al ADN-LM1-F1 preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM1-F2 preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM1-F3 preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM1-F4 preparat în primul pas al reacției PCR;

- primerul de oligpnucleotide 7 AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligpnucleotide 7 ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Fragmentul ADN-LM1 astfel preparat a fost inseratîn plasmida pCR3.1 ADN, folosind trusa de donare „EukaryoticTA cloning” (Invitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în sușa de E. Coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului ușor de TRA-8 umanizat (tip LM1) au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizor 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Plasmidele rezultate sunt denumite pCR3.1/LM1-2 (plasmida care poartă cADN-ul ce conține codificarea regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 umanizat (tip LM1) și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig uman).

Plasmida pCR3.1/LM1-2 obținută, conținând fragmentul ADN-LM1, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pHSG399 donat a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilat cu CIP. ADN-ul pHSG399 rezultat și defosforilat și fragmentul ADN-LM1, care au fost supuse digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd ). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar, conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 pg/ml cloramfenicol (concentrații finale). Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 ng/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul ADN-LM1 a fost selectată prin electroforeză în gel de agaroză 1%.

RO 123115 Β1

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M 1 -2-2, purtând 1 un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM1 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman. Sușa de E. coli transformantă, ce găzduiește 3 această plasmida, denumită E.coli DH5a/pHSG/M 1-2-2, a fost depozitată la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science 5 and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme 7 și i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7562.

3) Construirea plasmidei pSR/LM1-2 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor al lui 9 TRAS LM1 umanizat)

Plasmida pHSG/M 1 -2 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii variabile 11 a lanțului ușor de TRA-8 LM1 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de 13 donare pSRPDHH (solicitare de brevet european EP 0-909-816-A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost defosforilat cu CIP. ADN-ul 15 pSRPDHH rezultat, defosforilat și fragmentul ADN Hind HI-EcoR I, obținut din pHSG/M 1-2-2 au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, 17

E.coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 100 pg/ml ampicilină și 19 ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN dorit în vectorul pSRPDHH a fost confirmată prin 21 secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene.

Plasmida de expresie, rezultată, purtând cADN-ul care conține codificarea lanțului 23 ușor de TRA-8 LM1 umanizat, a fost denumită pSR/LM1-2 (4.2) Construirea unui vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului umanizat 25 (tip LM3)

Așa cum s-a arătat în SECV. ID. Nr. 73 din Lista de secvențe, altă umanizare (tip 27 LM3) a secvențelor de aminoacizi ale lanțului ușor al lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 8 (histidină), aminoacidului 9 (lizină), aminoacidului 29 10 (fenilalanină), aminoacidului 11 (metionină), aminoacidului 13 (treonină), aminoacidului 20 (serină), aminoacidului 42 (glutamină), aminoacidului 43 (serină), aminoacidului 77 31 (asparagină), aminoacidului 78 (valină), aminoacidului 80 (serină), aminoacidului 83 (leucină), aminoacidului 85 (acid aspartic), aminoacidului 87 (fenilalanină), aminoacidului 99 33 (glicină), aminoacidului 103 (leucină) și aminoacidului 108 (alanină) de la N-ul terminal al secvenței de aminoacizi ai lanțului ușor de TRA-8 cu pralină, serină, serină, leucină, alanină, 35 treonină, lizină, alanină, serină, leucină, pralină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină și, respectiv, treonină. Secvența rezultată a fost denumită LM3. 37

Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ale lanțului ușor umanizat ale lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman (tip LM3, SECV. ID. Nr. 73 din Lista de 39 secvențe) au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului 41 ușor de TRAS LM3 umanizat

Codificarea ADN pentru lanțul de polipeptide LM3 (SECV. ID. Nr. 73 din Lista de 43 secvențe), acesta fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp antiDR5 umanizat și regiunea constantă a lanțului ușor a Ig uman (lanțul k), a fost respectiv 45 sintetizat prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de 7 AL1P (SECV. ID. Nr. 47) și 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48), următorii 47 primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:

5'-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3' 49 (MOD1F1; SECV. ID. Nr. 78);

RO 123115 Β1

5'-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctcgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt-3' (M0D1R1; SECV. ID. Nr. 79);

5'-ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SECV. ID. Nr. 80);

5'-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3' (MOD1R22; SECV. ID. Nr. 81);

5'-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3' (MOD1F3; SECV. ID. Nr. 82);

5'-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga-3' (MOD1R3; SECV. ID. Nr. 83);

5'-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggtttacaggcag t-3' (MOD1F42; SECV. ID. Nr. 84);

5'-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3' (MOD1R4; SECV. ID. Nr. 85);

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat3'(MOD1F5; SECV. ID. Nr. 86);

5'-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3' (MOD1R52; SECV. ID. Nr. 87);

5'-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F6;SECV. ID. Nr. 88),

5'-ctgccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3' (MOD1R6; SECV. ID. Nr. 89);

5'-aaacggactg tggctgcaccatctgtcttc atcttcccgccatctgatga g-3' (MOD1F7; SECV. ID. Nr. 90);

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3' (MOD1R7; SECV. ID. Nr. 91) și

5'-agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SECV. ID. Nr. 101).

2) Construirea plasmidei pCR3.1/LM3-3-44 (donarea tipului LM3 al lanțului ușor de TRAS umanizat)

Fragmentul ADN-LM3 codificând secvența de aminoacizi definită în SECV. ID. Nr. 73 a aceleiași liste a fost preparat prin efectuarea reacției PCR în 2 pași, inserție într-un vector plasmidial și donare în E. coli.

a) Primul pas al reacției PCR

Codificarea fragmentului de ADN-LM3-F31B pentru o regiune a secvenței semnal a secreției cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție Hind III adăugat la capătul 5', FRLCDRL^ FRL₂ și CDRL_2IFRL₃, CDRL₃, FRL₄ și o porțiune a regiunii constante a fost preparată în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- primerul de oligonucleotide MOD1F1, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R1, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F22, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R22, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F3, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R3, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F42, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R4, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F5, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R52, 5 pmol;

RO 123115 Β1

- primerul de oligonucleotide MOD1F6, 5 pmol;1

- primerul de oligonucleotide MOD1R6, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MGD1F7, 50 pmol;3

- primerul de oligonucleotide MOD1R7, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7AL1P, 50 pmol;5

- primerul de oligonucleotide LR17, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;7

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.9

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de μΙ prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.11

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat13 de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Codificarea fragmentului ADN-LM3-F31C pentru o porțiune a regiunii constante cu 15 un situs de clivaj al enzimei de restricție EcoRI, adăugat la căpătui 3' a fost preparată în următoarele condiții.17

Plasmidele matriță, pSRPDHH, au fost obținute prin respectarea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1.19

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;21

- primerul de oligonucleotide MOD1F7, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide7ALCN, 50 pmol;23

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;25

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 27 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un29 ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.31

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml de bromură de 33 etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate au fost excizate cu o lamă de ras.35

b) Al doilea pas al reacției PCR

ADN-LM3, în care fragmentele ADN-LM3-F31B și ADN-LM3-F31C descrise mai sus 37 sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:39

- fragmentul de gel al ADN-LM3-F31B preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM3-F31C preparatîn primul pas al reacției PCR;41

- primerul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7 ALCN, 50 pmol;43

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;45

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 47 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

RO 123115 Β1

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°,C timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentul ADN-LM3 astfel preparat a fost inseratîn plasmida pCR3.1 ADN, folosind trusa de donare „Eukaryotic TA cloning” (in Vitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în sușa de E.coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului ușor de TRA-8 LM3 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. șicolab., (1977), Proc. Natl.Acad. Sci. SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizor 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Plasmidele rezultate sunt denumite pCR3.1/LM3-3-44 (plasmida care poartă cADN-ul ce conține codificarea regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM3 umanizat și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig uman).

Plasmida pCR3.1/LM3-3-44 obținută, conținând fragmentul LM3-ADN, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pHSG399 de donare a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilat cu CIP. ADN-ul pHSG399 rezultat și defosforilat și fragmentul ADN-LM3, care au fost supuse digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi, E.coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar, conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 pg/ml cloramfenicol (concentrații finale).Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 pg/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda SDS-alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul ADN-LM3 a fost selectată prin electroforeză în gel de agaroză 1%.

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M3-3 22, purtând un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM3 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman. Sușa de E. coli, transformantă, ce găzduiește această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M3-3 22, a fost depozitată la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme și i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7564.

3) Construirea plasmideipSR/LM3-3-44.10 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor al lui TRAS LM3 umanizat)

Plasmida pHSG/M3-3-22 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM3 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pSRPDHH de donare (solicitare de brevet european EP 0909816 A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost defosforilat cu CIP. ADN-ul pSRPDHH rezultat, defosforilat și fragmentul ADN Hind HI-EcoR I obținut de la pHSG/M 1-2-2 au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 100 ng/ml ampicilină și plasmida ADN a fost extrasă din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN dorit în vectorul pSRPDHH a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

RO 123115 Β1

Plasmida de expresie, rezultată, purtând cADN-ul care codifică lanțul ușor de TRA-8 1 LM3 umanizat, a fost denumită pSR/LM3-3-44-10 (4.3) Construirea unul vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului umanizat 3 (tip LM4)

Așa cum s-a arătat în SECV. ID. Nr. 74 din Lista de secvențe, altă umanizare (tip 5 LM4) a secvențelor de aminoacizi ale lanțului ușor al lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impune înlocuirea aminoacidului 8 (histidină), aminoacidului 9 (lizină), aminoacidului 7 10 (fenilalanină), aminoacidului 11 (metionină), aminoacidului 13 (treonină), aminoacidului 20 (serină), aminoacidului 42 (glutamină), aminoacidului 43 (serină), aminoacidului 77 9 (asparagină), aminoacidului 78 (valină), aminoacidului 80 (serină), aminoacidului 83 (leucină), aminoacidului 85 (acid aspartic), aminoacidului 99 (glicină), aminoacidului 103 11 (leucină) și aminoacidului 108 (alanină) de la N-ul terminal al secvenței de aminoacizi ai lanțului ușor de TRA-8 cu pralină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, 13 serină, leucină, projină, fenilalanină, treonină, glutamină, valină și, respectiv, treonină. Secvența rezultată a fost denumită LM4. 15

Plasmidele de expresie, care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ale lanțului ușor umanizat ale lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman (tip LM4) (SECV. ID. Nr. 74 din Lista de 17 secvențe), au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului 19 ușor de TRA-8 LM4 umanizat

Codificarea ADN pentru lanțul de polipeptide LM4 (SECV. ID. Nr. 74 din Lista de 21 secvențe), acesta fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp antiDR5 umanizat și regiunea constantă a lanțului ușor a Ig uman (lanțul k), a fost respectiv 23 sintetizat prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de primerii 7 AL1P (SECV. ID. Nr. 47) și 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48),25

MOD1F1 (SECV. ID. Nr. 78), MOD1R1 (SECV. ID. Nr. 79), MOD1F22 (SECV. ID. Nr. 80), MOD1R22 (SECV. ID. Nr. 81), MOD1F3 (SECV. ID. Nr. 82), MOD1R3 (SECV. ID. Nr. 83),27

MOD1F42 (SECV. ID. Nr. 84), MOD1R4 (SECV. ID. Nr. 85), MOD1F5 (SECV. ID. Nr. 86),

MOD1R52 (SECV. ID. Nr. 87), MOD1F7 (SECV. ID. Nr. 90) și MOD1R7 (SECV. ID. Nr. 91),29

LR17 (SECV. ID. Nr. 101), următorii primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62;31

SECV. ID. Nr. 92);

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R62;33

SECV. ID. Nr. 93).

2) Construirea plasmidei pCR3.1/LM4-5-3 (donarea tipului LM4 de lanț ușor al lui 35 TRAS umanizat)

Codificarea fragmentului ADN-LM4 pentru secvența de aminoacizi definită în SECV. 37 ID. Nr. 74 a aceleași liste a fost preparat prin efectuarea reacției PCR în 2 pași, inserție întrun vector plasmidial și donare în E. coli. 39

a) Primul pas al reacției PCR

Codificarea fragmentului ADN-LM4-F41B, pentru o regiune a secvenței semnal a 41 secreției cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție Hind III, adăugat la capătul 5', FRU CDRLl FRL₂ și CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ și o porțiune a regiunii constante a fost 43 preparată în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție: 45

- primerul de oligonucleotide MOD1F1, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R1, 5 pmol; 47

- primerul de oligonucleotide MOD1F22, 5 pmol;

RO 123115 Β1

- primerul de oligonucleotide MOD1R22, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F3, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R3, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F42, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R4, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F5, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R52, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F62, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R62, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F7, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1R7, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide LR17, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Codificarea fragmentului ADN-LM4-F41C pentru o porțiune a regiunii constante cu un situs de clivaj al enzimei de restricție EcoR I adăugat la capătul 3' a fost preparată în următoarele condiții.

Plasmidele matriță, pSRPDHH, au fost obținute prin respectarea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide MOD1F7, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide7ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul a fost colorat cu 1 pg/ml de bromură de etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate au fost excizate cu o lamă de ras.

b) Al doilea pas al reacției PCR

ADN-LM4, în care fragmentele ADN-LM4-F41B și ADN-LM4-F41C descrise mai sus sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- fragmentul de gel al ADN-LM4-F41B, preparatîn primul pas al reacției PCR; -fragmentul de gel al ADN-LM4-F41C, preparatîn primul pasai reacției PCR;

RO 123115 Β1

- fragmentul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;1

- primerul de oligpnucleotide 7 ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;3

-10 x tampon PCR, 5 pl;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.5

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat9 de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Fragmentul ADN-LM4 astfel preparat a fost inserat în plasmida pCR3.1 ADN, folosind11 trusa de donare „Eukaryotic TA cloning” (in Vitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în sușa de E.coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de 13 nucleotide ale acestor ADN-uri care codifică lanțul ușor de TRA-8 LM4 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Soi. SUA, 15 74:5463-5467), folosind un analizor 3700 DNA Analyzer(ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia). Plasmidele rezultate sunt denumite pCR3.1/LM4-5-3 (plasmida care 17 poartă cADN-ul ce codifică regiunea variabilă a lanțului ușor de TRA-8 LM4 umanizat și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig uman). 19

Plasmida pCR3.1/LM4-5-3 obținută, conținând fragmentul ADN-LM4, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 21 pg de ADN al plasmidei pHSG399 de donare a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilatcu CIP. ADN-ul pHSG399rezultat, defosforilat 23 și fragmentul ADN-LM4, care au fost supuse digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). 25 Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar, conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 ng/ml cloramfenicol (concentrații 27 finale).Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 pg/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu 29 metoda SDS -alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul ADN-LM4 a fost selectată prin electroforeză în gel de 31 agaroză 1%.

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M4-5-3-1, 33 purtând un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM4 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman. Sușa de E. coli transformantă ce găzduiește 35 această plasmida, denumită E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-1 a fost depozitată la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science 37 and Technology, 1-1, Higashi 1 chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, în 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme 39 și i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7565.

3) Construirea plasmidei pSR/LM4-5-3-3 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor al 41 lui TRA-8 LM4 umanizat)

Plasmida pHSG/M4-5-3-1 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii 43 variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM4 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 45 pg de ADN al plasmidei pSRPDHH (solicitare de brevet european EP 0 909 816 A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost 47 defosforilatcu CIP. ADN-ul pSRPDHH rezultat, defosforilat și fragmentul ADN Hind lll-EcoR

RO 123115 Β1

I obținut din pHSG/M4-5-3-1 au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 100 pg/ml ampicilină și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN dorit în vectorul pSRPDHH a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Plasmida de expresie, rezultată purtând cADN-ul care codifică lanțul ușor de TRA-8 LM4 umanizat a fost denumită pSR/LM4-5-3-3.

(4.4) Construirea unui vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului umanizat (tip LM5)

Așa cum s-a arătat în SECV. ID. Nr. 75 din Lista de secvențe, altă umanizare (tip LM5) a secvențelor de aminoacizi ale lanțului ușor al lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman de șoarece impuneînlocuirea aminoacidului 8 (histidină), aminoacidului 9 (lizină), aminoacidului 10 (fenilalanină), aminoacidului 11 (metionină), aminoacidului 13 (treonină), aminoacidului 20 (serină), aminoacidului 42 (glutamină), aminoacidului 43 (serină), aminoacidului 77 (asparagină), aminoacidului 78 (valină), aminoacidului 80 (serină), aminoacidului 83 (leucină), aminoacidului 103 (leucină) și aminoacidului 108 (alanină) de la N-ul terminal al secvenței de aminoacizi ai lanțului ușor de TRA-8 cu pralină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, leucină, pralină, fenilalanină, valină și, respectiv, treonină. Secvența rezultată a fost denumită LM5.

Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ale lanțului ușor umanizat ale lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman (tip LM5) (SECV. ID. Nr. 75 din Lista de secvențe) au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat

Codificarea ADN pentru lanțul de polipeptide LM5 (SECV. ID. Nr. 75 din Lista de secvențe), acesta fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp antiDR5 umanizat și regiunea constantă a lanțului ușor a Ig uman (lanțul k), a fost respectiv sintetizat prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de primerii 7 AL1P (SECV. ID. Nr. 47) și 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48), MOD1F1 (SECV. ID. Nr. 78), MOD1R1 (SECV. ID. Nr. 79), MOD1F22 (SECV. ID. Nr. 80), MOD1R22 (SECV. ID. Nr. 81), MOD1F3 (SECV. ID. Nr. 82), MOD1R3 (SECV. ID. Nr. 83), MOD1F42 (SECV. ID. Nr. 84), MOD1R4 (SECV. ID. Nr. 85), MOD1R52 (SECV. ID. Nr. 87), MOD1F7 (SECV. ID. Nr. 90) și LR17 (SECV. ID. Nr. 101), următorii primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3' (MOD1F52; SECV. ID. Nr. 94);

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F63; SECV. ID. Nr. 95);

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R63; SECV. ID. Nr. 96);

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa-3' (MOD1R72; SECV. ID. Nr. 102).

2) Construirea plasmidei pCR3.1/LM5-3-42 (donarea tipului LM5 de lanț ușor al lui TRA-8 umanizat)

Codificarea fragmentului ADN-LM5 pentru secvența de aminoacizi definită în SECV. ID. Nr. 75 a aceleiași liste a fost preparat prin efectuarea unei reacții PCR în 2 pași, inserție într-un vector plasmidial și donare în E. coli.

RO 123115 Β1

a) Primul pas al reacției PCR 1

Codificarea fragmentului ADN-LM5-F51B pentru o regiune a secvenței semnal a secreției cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție Hind III adăugat la capătul 5', FRL,, 3 CDRL, FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ și o porțiune a regiunii constante a fost preparată în următoarele condiții. 5

Compoziția soluției de reacție:

- primerul de oligonucleotide MOD1F1, 5 pmol;7

- primerul de oligonucleotide MOD1R1,5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F22, 5 pmol;9

- primerul de oligonucleotide MOD1R22, 5 pmol;

- primenii de oligonucleotide MOD1F3, 5 pmol;11

- primerul de oligonucleotide MOD1R3, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F42, 5 pmol;13

- primerul de oligonucleotide MOD1R4, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F52, 5 pmol;15

- primerul de oligonucleotide MOD1R52, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F63, 5 pmol;17

- primerul de oligonucleotide MOD1R63, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide MOD1F7, 50 pmol;19

- primerul de oligonucleotide MOD1R72, 5 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7AL1P, 50 pmol;21

- primerul de oligonucleotide LR17, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;23

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.25

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.27

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat29 de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.

Codificarea fragmentului ADN-LM5-F51C pentru o porțiune a regiunii constante cu 31 un situs de clivaj al enzimei de restricție EcoR I adăugat la capătul 3' a fost preparat în următoarele condiții.33

Plasmidele matriță, pSRPDHH, au fost obținute prin respectarea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1.35

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;37

- primerul de oligonucleotide MOD1F7, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7ALCN, 50 pmol;39

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;41

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 43 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.

Condițiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care urmează un45 ciclu termic de 94°C, timp de 1 min, 55°C, timp de 1 min, și 72°C, timp de 2 min, ciclu repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.47

RO 123115 Β1

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 Hg/ml de bromură de etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras.

b) Al doilea pas al reacției PCR

ADN-LM5, în care fragmentele ADN-LM5-F51B și ADN-LM5-F51C descrise mai sus sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

-fragmentul de gel al ADN-LM5-F51B preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM5-F51C preparat în primul pas al reacției PCR;

- primerul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7 ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Fragmentul ADN-LM5 astfel preparat a fost inseratîn plasmida pCR3.1 ADN, folosind trusa de donare „Eukaryotic TA cloning” (in Vitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în sușa de E. Coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizor 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Plasmidele rezultate sunt denumite pCR3.1/LM5-3-42 (plasmida care poartă cADN-ul ce conține codificarea regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig uman).

Plasmida pCR3.1/LM5-3-42 obținută, conținând fragmentul ADN-LM5, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I.

pg de ADN al plasmidei pHSG399 de donare a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilat cu CIP. ADN-ul pHSG399 rezultat și defosforilat și fragmentul ADN-LM5, care fusese supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar, conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 pg/ml cloramfenicol (concentrații finale).Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 pg/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda SDS -alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul ADN-LM5 a fost selectată prin electroforeză în gel de agaroză 1 %.

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M5-3-27, purtând un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman.

RO 123115 Β1

3) Construirea plasmidei pSR/LM5-3-27-1 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor 1 al lui TRA-8 tip LM5 umanizat)

Plasmida pHSG/M5-3-27 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii 3 variabile a lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 5 pg de ADN al plasmidei pSRPDHH de donare (solicitare de brevet european EP

909 816 A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost 7 defosforilatcu CIP. ADN-ul pSRPDHH rezultat, defosforilat și fragmentul ADN Hind lll-EcoR

I obținut de la pHSG/M5-3-27 au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 9 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, 11 conținând 100 pg/ml ampicilină și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN dorit în 13 vectorul pSRPDHH a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). 15

Plasmida de expresie, rezultată, purtând cADN-ul care conține codificarea lanțului ușor de TRA-8 LM5 umanizat, a fost denumită pSR/LM5-3-27-1.17 (4.5) Construirea unui vector de expresie pentru lanțul ușor al anticorpului umanizat (de tip himera)19

Secvența prezentată în SECV. ID. Nr. 76 din Lista de secvențe și secvența de aminoacizi a lanțului ușor al lui TRA-8 de tip himera a fost denumită LM6.21

Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvențe de aminoacizi ale lanțului ușor umanizat ale lui TRA-8 anticorp DR5 antiuman (tip LM6) (SECV. ID. Nr. 75 din Lista de 23 secvențe) au fost construite după cum urmează.

1) Sinteza de primeri pentru prepararea regiunilor variabile și constante ale lanțului 25 ușor de TRAS LM6 umanizat

Codificarea ADN-ului pentru lanțul de polipeptide LM6 (SECV. ID. Nr. 75 din Lista de 27 secvențe), acesta fiind o fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 anticorp antiDR5 de șoarece (Tip LM6) și regiunea constantă a lanțului ușor a Ig uman (lanțul k), a fost 29 respectiv sintetizat prin folosirea combinațiilor de PCR.

în plus față de primerii 7 AL1P (SECV. ID. Nr. 47) și 7ALCN (SECV. ID. Nr. 48), 31 următorii primeri de oligonucleotide au fost sintetizați pentru PCR:

5'-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3' (HKSPR13; SECV. 33 ID. Nr. 97);

5'-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVF11; SECV. ID. 35 Nr. 98),

5'-aagacagatg gtgcagccacagcccgtttg atttccagcttggtgcctc-3' (MVR11; SECV. ID. Nr. 37 99) și

5'-aagctggaaatcaaacgggctgtggctgcaccatctgtcttcatc-3'(MCF11; SECV. ID. Nr. 100).39

2) Construirea plasmidei pCR3.1/LM6-1-16 (donarea tipului LM6 de lanț ușor al lui

TRAS umanizat)41

Codificarea fragmentului ADN-LM6 pentru secvența de aminoacizi definită în SECV.

ID. Nr. 75 a aceleiași liste a fost preparat prin efectuarea unei reacții PCR în 2 pași, inserție 43 într-un vector plasmidial și donare în E. coli.

a) Primul pas al reacției PCR45

Codificarea fragmentului ADN-LM6-F1 pentru o secvență semnal a secreției și o porțiune a regiunii FRLj cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție Hind III adăugat la capătul 47 5'a fost preparată în următoarele condiții. Plasmidele matriță, pHSGHM17 și pSRPDHH, au fost obținute prin respectarea descrierii din solicitarea de brevet european EP 0 909 816 A1. 49

RO 123115 Β1

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pHSGHM 17, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide 7AL1P, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide HKSPR13, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Codificarea fragmentului ADN-LM6-F2 pentru o porțiune de FR^, CDRL,, FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ și o porțiunea regiunii constante a fost preparată în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pL28, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide MVF11,50 pmol;

- primerul de oligonucleotide MVR12, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Fragmentul ADN-LM6-F3 codificând o porțiune de FRL₄ și regiunea constantă cu situs-ul de clivaj al enzimei de restricție EcoR I adăugată la capătul 3' a fost preparată în următoarele condiții.

Compoziția soluției de reacție:

- ADN-ul plasmidei pSRPDHH, 25 ng;

- primerul de oligonucleotide MCF11, 50 pmol;

- primerul de oligonucleotide 7ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 μΙ;

-10 x tampon PCR, 5 μΙ;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.

Fragmentele de ADN amplificate după PCR au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml de bromură de etidium, pentru a detecta ADN-ul produs în UV. Benzile respective de ADN astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras.

b) Al doilea pas al reacției PCR

ADN-LM6, în care fragmentele ADN-LM6-F1, ADN-LM6-F2 și ADN-LM6-F3 descrise mai sus sunt fuzionate, a fost preparat în următoarele condiții.

RO 123115 Β1

Compoziția soluției de reacție:1

- fragmentul de gel al ADN-LM6-F1 preparat în primul pas al reacției PCR;

- fragmentul de gel al ADN-LM6- F2 preparat în primul pas al reacției PCR; 3

- fragmentul de gel al ADN-LM6-F3 preparat în primul pas al reacției PCR;

- primerul de oligonucleotide 7 AL1P, 50 pmol;5

- primerul de oligonucleotide 7 ALCN, 50 pmol;

- cocteil de dNTP, 5 pl;7

-10 x tampon PCR, 5 pl;

- ADN polimeraza ampliTaq (Perkin Elmer), 2,5 unități.9

Soluția de reacție având compoziția de mai sus a fost ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugarea de apă bidistilată și folosită în reacția PCR.11

Fragmentul ADN-LM6 astfel preparatafostinseratînplasmidapCR3.1 ADN, folosind 15 trusa de donare „Eukaryotic TA cloning” (in Vitrogen), urmând protocolul producătorului și a fost introdus în sușa de E. coli TOP10F' competentă, conținută în kit. Secvențele de 17 nucleotide ale acestor ADN-uri care conțin codificarea lanțului ușor de TRA-8 umanizat au fost confirmate prin metoda dideoxy (Sânger, F. S. și colab., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. 19 SUA, 74: 5463-5467), folosind un analizator ADN.

Plasmidele rezultate au fost denumite pCR3.1/LM6-1-16 (plasmida care poartă 21 cADN-ul ce codifică regiunea variabilă a lanțului ușor de TRA-8 de șoarece și o regiune constantă a lanțului ușor a Ig uman). 23

Plasmida pCR3.1/LM6-1-16 obținută, conținând fragmentul ADN-LM6, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 25 pg de ADN al plasmidei pHSG399 de donare a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, defosforilat cu CIP. ADN-ul pHSG399 rezultat și 27 defosforilat și fragmentul ADN-LM6, care fusese supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I, au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, 29 Co. Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar, conținând 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal și 50 pg/ml cloramfenicol (concentrații 31 finale).Transformanții albi obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 50 ng/ml cloramfenicol și ADN-ul plasmidei a fost extras din cultura rezultată, în conformitate cu 33 metoda SDS-alcalină. ADN-ul plasmidial extras a fost supus digestiei cu Hind III și EcoR I și, apoi, o clonă purtând fragmentul ADN-LM6 a fost selectată prin electroforeză în gel de 35 agaroză 1 %.

Ca rezultat al procedeului de mai sus, a fost obținută plasmida pHSG/M6-1-4-1, 37 purtând un fragment de fuziune a regiunii variabile a lanțului ușor de TRA-8 de șoarece și regiunea constantă a lanțului IgK uman. Sușa de E. coli transformantă, ce găzduiește 39 această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1, a fost depozitată la Depozitul internațional de organisme brevetate de la Național Institute of Advanced Industrial Science 41 and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la 20 aprilie 2001, în conformitate cu tratatul de la Budapesta pentru Depozitul de microorganisme 43 și i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7566.

3) Construirea plasmidei pSR/LM6-1-4-6 (plasmida de expresie pentru lanțul ușor al 45 lui TRA-8 LM6, tip himera)

Plasmida pHSG/M6-1-4-1 obținută, care poartă un fragment de fuziune a regiunii 47 variabile a lanțului ușor de TRA-8 de șoarece și regiunea constantă a lanțului IgK uman, a fost supusă digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I. 49

RO 123115 Β1 pg de ADN al plasmidei pSRPDHH de donare (solidtare de brevet european EP 0 909 816 A1) a fost supus digestiei cu enzimele de restricție Hind III și EcoR I și, apoi, a fost defosforilat cu CIP. ADN-ul pSRPDHH rezultat, defosforilat și fragmentul ADN Hind HI-EcoR I, obținut de la pHSG/LM6-1-4-1 au fost ligate folosind trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co., Ltd.). Apoi, E. coli DH5a a fost transformată cu ADN-ul ligat și dispersată pe mediu LB cu agar. Transformanții obținuți au fost cultivați în mediu LB lichid, conținând 100 pg/ml ampicilină și ADN-ul plasmidial a fost extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda SDS-alcalină. Inserția și orientarea fragmentului ADN doritîn vector au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului, folosind un analizor de secvențe de gene. Plasmida de expresie rezultată, purtând cADN-ul care codifică lanțul ușor de TRA-8 (de tip himera), a fost denumită pSR/LM6-1-4-6.

(5) Producerea mai multor tipuri de anticorp TRA-8 umanizat sau anticorp TRA-8 himeric

Transfecția celulelor COS-7 a fost condusă prin metodele reactivului de transfecție FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica), în conformitate cu manualul de instrucțiuni furnizat cu trusa.

Celulele COS-7 (American Type Culture Collection Nr. CRL-1651) au fost crescute până la semiconfluență (3 x 10⁶ celule/placă) într-o placă de cultură (suprafața culturii: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) conținând mediu Eagle modificat Dulbecco (definit în cele ce urmează drept „D-MED”, Gibco BRL), suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (definit în cele ce urmează, drept „FCS”; Moregate).

între timp, 10 μg/placă (un total de 5 plăci) de ADN al plasmidei de expresie a lanțului greu de DR5 umanizat (pHA15-1) și 10 μg/placă de ADN al plasmidei de expresie a lanțului ușor de DR5 umanizat preparat prin metoda SDS-alcalină au fost amestecate prin centrifugare în gradient de densitate de clorură de cesiu, apoi au fost precipitate cu etanol, urmat de suspendare în 5 μΙ/placă de H₂O distilată.

După ce 15 μΙ/placă de reactiv de transfecție FUGENE6 au fost amestecați cu 180 μΙ/placă de mediu D-MEM fără FCS, această soluție de FUGENE (185 μΙ/placă) a fost amestecată cu 5 μΙ/placă de soluție ADN, conținând 10 pg/placă de ADN al plasmidei de expresie a lanțului greu de DR5 umanizat și 10 pg/placă de ADN al plasmidei de expresie a lanțului ușor de DR5 umanizat. După 15 min de incubare la temperatura camerei, suspensia de plasmide obținută (200 μΙ) a fost adăugată plăcilor cu COS-7 preparate anterior. După incubare în atmosferă de 5% CO₂, la 37°C, timp de 24 h, mediul de cultură a fost schimbat cu mediu D-M EM fără FCS. După incubare în atmosferă de 5% CO₂, la 37°C, timp de 72 h, supernatantul culturii a fost recuperat, pentru a purifica produșii de expresie din fluidele supernatantului. Prin metoda descrisă mai sus, celulele COS-7 au fost transfectate cu fiecare din următoarele combinații de plasmide:

(A) : cotransfecție de pHA15-1 și pSR/LM1-2 (H1L1);

(B) : cotransfecție de pHB14-1 și pSR/M2-1 (H2L2);

(C) : cotransfecție de pHB14-1 și pSR/LM3-3-44 (H2L3);

(D) : cotransfecție de pHB14-1 și pSR/LM4-5-3-3 (H2L4);

(E) : cotransfecție de pHC10-3 și pSR/M2-1 (H3L2);

(F) : cotransfecție de pHC10-3 și pSFt/LM3-3-44-10 (H3L3);

(G) : cotransfecție de pHC10-3 și pSR/LM4-5-3-3 (H3L4);

(H) : cotransfecție de pHD21-1 și pSR/LM5-3-27-1 (H4L5);

(I) : cotransfecție de pM11-1 și pSFVLM6-1-4-6 (himera).

Cultura a fost apoi centrifugată (3.500 rpm, 15 min) și supernatantul colectat.

RO 123115 Β1

Supernatantul a fost filtrat cu un filtru 0,45 pm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Cat #1

25CS045 AS). Purificarea IgG din filtrate a fost realizată folosind cromatografie de afinitate Protein G-POROS (Applied Biosystems), în următoarele condiții:3

- sistem HPLC: BioCAD 700E (Applied Boisystems);

- coloană: cartuș senzor ProteinG-ID;5 (mărimea coloanei: 2,1 mmID x 30 mm LD, volumul patului: 0,1 ml; Applied

Biosystems);7

- tampon de eluare: 0,1 M glicină-HCI (pH 2,5);

- tampon de neutralizare: 1 M Tris-HCI (pH 8,5);9

- detecție: 280 nm;

- debit: 1 ml/min;11

- mărimea fracției: 0,5 ml/0,5 min;

- eprubeta fracției: microeprubetă de polipropilenă de 1,5 ml;13

- temperatura: 4°C.

După ce toate filtratele au fost aplicate pe coloană, 50 ml de PBS (Sigma, Cat 15 #1.000-3) au fost utilizați pentru a spăla coloana. Când a fost aplicat tamponul de eluare, s-a pornit și colectorul de fracții. Fiecare microeprubetă a fracției a conținut anticipat 55 μΙ de 1 17

M NaCI, 110 μΙ de tampon de neutralizare și 74 μΙ de albumină serică bovină 2 mg/ml (Sigma, Cat # A-7030) în PBS. Fracțiile de la nr. 7 la 8 au fost colectate. 19

Verificarea expresiei anticorpilor umanizați și analiza cantitativă a produșilor de expresie în fluidele supernatantului culturilor preparate a fost efectuată prin ELISA, cu un 21 anticorp contra IgG antiuman.

în fiecare godeu al unei plăci de 96 godeuri (MaxiSorp, Nune), s-au adăugat 100 μΙ 23 de anticorp policlonal IgG Fc specific antiuman de capră (Kappel), dizolvat la o concentrație finală de 0,5 pg/ml, în tampon de adsorbție (0,05 M bicarbonat de sodiu, 0,02% azidă de 25 sodiu, pH 9,6) și placa a fost incubată la 37°C, timp de 2 h, pentru a se produce adsorbția anticorpului. Apoi, placa a fost spălată cu 350 μΙ de PBS-T de cinci ori. în godeuri, după 27 spălare, s-a adăugat supernatantul culturii, diluat cu mediu D-MEM conținând 10% FCS și acestea au fost incubate la 37°C, timp de 2 h. După o nouă spălare cu PBS-T, s-au adăugat 29 câte 100 μΙ de anticorp policlonal IgG Fc specific antiuman de capră, marcat cu fosfatază alcalină (Jackson Immuno Research Lab ), diluat de 10.000 de ori cu PBS-T în fiecare godeu 31 și s-au incubat la 37°C, timp de 2 h. După o nouă spălare cu PBS-T, o soluție substrat de pnitrofenil fosfat obținut din trusa Alkaline Phosphatase Substrate (Bio Rad) a fost adăugată 33 în conformitate cu manualul de instrucțiuni, furnizat odată cu trusa. După incubare la 37°C, timp de 0,5 până la o oră, absobanța la 405 nm a fost măsurată. în prezentele experimente, 35 imunoglobulina de plasmă umană G subclasa 1 (lgG1) (Biopure AG), diluată cu mediu DMEM conținând 10% FCS în anumite concentrații, a fost utilizată ca probă de referință a 37 concentrației de anticorpi DR5 umanizați, conținuți în fluidele supernatantului culturilor.

Ca rezultat, produșii de expresie și produșii purificați din supernatantul culturii au fost 39 detectați, în mod specific, cu anticorp IgG antiuman. Concentrația finală a anticorpului IgG uman a fost de 44,03 pg/ml (H1L1), 39,8 pg/ml (H2L2), 26,7 pg/ml (H2L3), 41,0 pg/ml 41 (H2L4), 39,3 pg/ml (H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 pg/ml (H3L4), 16,7 pg/ml (H4L5) și, respectiv, 18,3 pg/ml (himera). 43 (6) Activitatea de inducere a apoptozei a câtorva tipuri de anticorp umanizat sau anticorp himeric 45

Celulele Jurkat (ATCC Nr. TIB-152) au fost utilizate pentru a examina activitatea de inducere a apoptozei a anticorpului purificat TRA-8 umanizat. 47

RO 123115 Β1

Celulele Jurkat cultivate în mediu RPM11640 cu 10% FCS(GibcoBRL) la37°C, timp de 3 zile, în prezență de CO₂ 5%, au fost dispersate în fiecare godeu al unei microplăci de 96 godeuri (Sumitomo Bakelite), în cantitate de 50 μΙ per godeu. TRA-8 umanizat, preparat în acest exemplu, exemplul 26, a fost ajustat pentru a avea concentrația produsului final de interes de 100 ng/ml, cu mediu RPM11640 conținând FCS 10%, prin estimarea concentrațiilor lor din fluide în conformitate cu metoda descrisă la exemplul 26. Fiecare din soluțiile produșilor de expresie astfel ajustate la 100 ng/ml a fost folosită pentru a produce diluții în serie, prin repetarea diluției în serie de două ori, cu mediu RPM11640 conținând 10% FCS. Fiecare din aceste soluții diluate de TRA-8 umanizat (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 sau H4L5) a fost adăugată în fiecare godeu, la 50 μΙ per godeu. După ce au reacționat la 37°C, timp de 12 h, s-au adăugat 50 μΙ de 25 μΜ PMS conținând 1 mg/ml XTT (concentrații finale de 250 pg/ml pentru XTT și 5 μΜ pentru PMS). După incubare timp de 3 h, absorbanța la 450 nm a fiecărui godeu a fost măsurată, pentru a calcula viabilitatea celulară, prin utilizarea abilității de reducere a mitocondriei ca index.

Viabilitate (%) = 100 x (a-b) / (c-b) în care „a” reprezintă valoarea măsurată a godeului test, „b” reprezintă valoarea măsurată a godeului fără celule și „c” reprezintă valoarea măsurată a godeului fără adaos de anticorp.

Ca rezultat, s-a demonstrat că anticorpii umanizați testați induc apoptoza în celulele liniei celulare de limfom T, care exprimă antigenul DR5 uman.

în plus, activitatea de inducere a apoptozei a lui TRA-8 umanizat în PC-3 a fost examinată prin adăugarea de taxol, conform cu metoda descrisă în exemplul 25.

Linia celulară umană de cancer de prostată PC-3 (ATCC Nr. CRL-1435) a fost obținută de la American Tissue Culture Collection (ATCC) și a fost menținută pe mediu F12K Nutrient Mixture (Amestec de nutrienți F-12K, 21127-022, Gibco BRL) conținând 10% serfetal bovin (FBS, Hyclone), 200 mM L-glutamină 1 %(25030-149, Gibco BRL) și 0,5% soluție penicilină streptomicină (P-7539, Sigma). Mediu RPMI 1640 (MED.008, IWAKI) suplimentat cu FBS 10% și soluție penicilină streptomicină 0,5% a fost utilizat în următorul experiment. Celule PC-3 în faza de creștere exponențială au fost colectate prin tripsinizare și spălate de două ori cu mediu proaspăt. Celulele au fost apoi numărate, resuspendate în mediu proaspăt, la o densitate de 5 x 10⁴ celule/ml și distribuite în triplicat, în plăci de 96 godeuri cu fund plat (3598, Corning-Coster), într-un volum total de 100 μΙ/godeu, cu o zi înainte de începerea experimentului. Un medicament anticancer reprezentativ, Paclitaxel (169-18611, Wako), dizolvatîn dimetilsulfoxid (10 mg/ml), a fost diluat în mediu proaspăt și apoi s-a adăugat în plăcile cu 96 godeuri, conținând celulele în 50 μΙ/godeu. Concentrațiile finale de dimetilsulfoxid au fost mai mici de 0,1%. După incubare timp de 24 h, la 37°C, în atmosferă de CO₂ 5%, anticorpul TRA-8 umanizat (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 sau H4L5), diluat în mediu proaspăt, a fost adăugat în godeuri. După incubare pentru încă 24 h, s-au adăugat 50 μΙ de Minimum Essential Medium (11095-098, Gibco BRL), conținând 1 mg/ml XTT și 25 mM de PMS în godeuri și plăcile au fost incubate timp de 6 h. Apoi, a fost măsurat OD450, cu ajutorul unui aparat de contorizare de markeri multipli (ARVO HTS 1420 Multilabel Counter, Wallac Berthold) și viabilitatea celulară a fost calculată după cum urmează.

Viabilitate celulară (%) = (OD450 pentru godeul conținând celule tratate cu agent(ți) Taxol și TRA-8 umanizat) - (OD450 pentru godeul care nu conține nici celule, nici agent) x 100 / (OD450 pentru godeul care conține celule, dar nu conține agent - OD450 pentru godeul care nu conține nici celule, nici agent).

RO 123115 Β1

Ca rezultat, s-a demonstrat că anticorpii umanizați testați induc apoptoza în celulele 1 umane de cancer de prostată care exprimă antigenul DR5 uman.

Exemplul 27. Producerea de anticorp DR4 3

O proteină de fuziune care conține domeniul extracelular al lui DR4 uman (aminoacizii de la 1-236) și porțiunea Fc a lgG1 uman a fost exprimată în celule Cos-7 5 transfectate cu un vector recombinant adenoviral. Proteina de fuziune a fost purificată pe coloana de afinitate a proteinei A. Șoareci Balb/c au fost imunizați cu proteina de fuziune 7 purificată, așa cum s-a descris mai sus. O clonă hibridoma, 2E12 (lgG1, k), cu legare specifică la DR4 și cu capacitatea de a induce apoptoza celulelor de limfom B uman Ramos 9 a fost subclonată de trei ori. Specificitatea de legare a 2E12 a fost determinată prin analizele ELISA și Western blot, utilizând DR5 uman, DcR1 uman și DcR2 uman, și proteina de 11 fuziune lgG1 ca antigeni martori. Legarea lui 2E12 la DR4 de suprafața celulară a fost determinată prin analiza citometriei în flux a celulelor COS-7 transfectate cu cADN-ul de 13 lungime totală care conține codificarea lui DR4 uman. Activitatea de inducere a apoptozei a fost determinată prin incubarea celulelor Ramos cu 1 pg/ml 2E12, în prezența a lgG1 15 antișoarece de capră. Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul ATPLite, așa cum a fost descris mai sus. 17

Exemplul 28. Caracterizarea anticorpului DR4

Anticorpul monoclonal DR4 (2E12) este specific pentru DR4 uman, după analiza 19 ELISA, acesta nu se leagă la alți receptori TRAIL precum DR5, DcR1 și DcR2 (fig. 19A). 2E12 a recunoscut pe DR4 de suprafață celulară, așa cum s-a demonstrat prin analiza 21 citometriei în flux a celulelor Cos-7 transfectate cu DR4 (fig. 19B). 2E12 a fost capabil de a induce apoptoza celulelor de limfom Ramos, în prezența cross-linkării cu un al doilea 23 anticorp, într-o manieră dependentă de doză (fig. 19C). Tratamentul in vitro al celulelor Ramos cu 2E12 a avut ca rezultat activarea dependentă de timp a caspazei 8, 9 și 3 și 25 clivajul lui PARP (fig. 19D). Aceste rezultate arată că 2E12 este un anticorp anti-DR4 agonist, care induce apoptoza într-un mod dependent de caspază. 27

Folosirea lui anti-DR4 (2E12), urmată de anticorpul lgG1 antișoarece de capră conjugat PE și citometria în flux, anticorpul DR4 a demonstrat că se leagă la celulele unei 29 linii celulare de fibrosarcom (Hs 913T) și la câteva linii celulare de cancer de sân (2LMP. MDA-MB231 și MDA-MB 453), dar a prezentat o legare slabă până la lipsa unei legări la 31 celulele liniei celulare normală de fibroblast de piele umană (Malme-3).

Exemplul 29. Activitatea tumoricidă a anticorpilor DR4 33

Activitatea tumoricidă a lui 2E12 a fost testată folosind modele de tumori de cancer de sân. Șoareci nuzi au fost inoculați subcutanat cu linia celulară de cancer de sân uman, 35 2LMP. Tratamentul cu doze intraperitoneale de 200 pg de 2E12 s-a efectuat în ziua 7, 10, 14, 17, 21 și 24 după injectarea celulelor tumorale. Animalele au primit adriamicină 37 (doxorubicină) (6 mg/kg) intravenos în zilele 8,12 și 16. Tratamentul cu2E12și adriamicină (fig. 20) a produs o inhibare a creșterii tumorii mai mare decât cea produsă fie de 2E12 39 singur, fie de adriamicină singură.

Activitatea tumoricidă a TRA-8 în combinație cu 2E12 a fost testată folosind aceleași 41 modele de tumori de cancer de sân. Tratamentul cu doze intraperitoneale de 200 pg de TRA8 și 2E12 s-a efectuat în zilele 7, 10, 14, 17, 21 și 24 după injectarea celulelor tumorale. 43 Animalele au primit adriamicină (6 mg/kg) intravenos în zilele 8, 12 și 16. Tratamentul cu TRA-8 plus 2E12 sau TRA-8 plus 2E12 și adriamicină a produs o regresie completă a tumorii 45 de 88 și, respectiv, de 100% (fig. 21).

RO 123115 Β1

Exemplul 30. Activitatea tumoricidă a anticorpilor DR4/DR5 în combinație cu alte terapii (1) Linii celulare și reactivi

Subclona 2LMP a liniei celulare umane de cancer de sân MDA-MB-231, subclona LCC6 a MDA-MB-435 și subclona DY36T2 a MDA-MB 361 au fost obținute de la dr. Marc Lipmann (Georgetown University, Washington, D.C.) și menținute în mediu MEM ameliorat, suplimentat cu 10% FBS (Hyclone, Logan, UT). Liniile celulare umane de cancer de sân MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA -MB-468, BT-474, SK-BR-3 și ZR-75-1 au fost obținute de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celulele MDA-MB-231, MDA-MB -453 și MDA-MB-468 au fost crescute în mediu DMEM suplimentat cu vitamine MEM, aminoacizi neesențiali MEM, 1 mM piruvat de sodiu și 10% FBS. Celulele BT-474 au fost crescute în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10 pg/ml insulina, 4,5 g/l glucoza, 10 mM HEPES, 1 mM piruvat de sodiu și 10% FBS. Celulele Sk-BR-3 au fost crescute în mediu McCoycu 15% FBS. Celulele ZR-75-1 au fost crescute în mediu Ham's F12Kcu 20% FBS. Toate liniile celulare au fost menținute în mediu fără antibiotic la 37°C, în atmosferă de CO₂5% și testate de rutină pentru contaminare cu microplasma.

Anticorpul monoclonal TRA-8 (IgG 1) purificat a fost produs la UAB și, de asemenea, furnizat de către Sankyo Co. Ltd. (Tokyo, Japonia). lgG1 antișoarece de capră conjugat cu ficoeritrină și anticorpul martor IgGIizotip-specific au fost obținut de la Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Adriamicina și paclitaxel au fost procurate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) și au fost preparate ca soluții stoc de 10 mM în apă distilată sau, respectiv, DMSO. Pentru studiile pe animale, formula clinică pentru paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ) a fost obținută de la University of Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham, AL). Acest preparat a fost diluat 1: 5 în PBS imediat Înainte de utilizare.

(2) Analiza expresiei DR5 prin imunofluorescență indirectă și citometrie în flux

Celule în faza de creștere exponențială au fost spălate odată cu PBS lui Dulbecco (deficient în Ca²⁺ și Mg²⁺) și recoltate cu 4 mM EDTA/ 0,5% KCI la 37°C. Celulele au fost colectate prin centrifugare la 4°C, timp de 5 min la 1.000 rpm, spălate odată și resuspendate în PBS conținând 1% BSA și 0,01% azidă de sodiu (tamon FACS) la 4°C. Celulele au fost incubate cu 10 ng/ml de TRA-8 purificat sau cu un anticorp mator IgG 1 izotip specific, timp de 60 min, la 4°C, spălate o dată cu tampon, apoi incubate cu 10 pg/ml de lgG1 antișoarece de capră conjugat-PE, timp de 20 min, la 4°C. După colorarea anticorpului, celulele au fost spălate o dată cu tampon FACS și fixate în 1% paraformaldehidătimp de 15 min, pe gheață. Probele au fost analizate cu un aparat Becton Dickinson FACScan (San Jose, CA) și datele au fost analizate utilizând un program sofware CellQuest.

(3) Analiza viabilității celulare utilizând metoda ATPLite

Celulele au fost tripsinizate și resuspendate în mediu de cultură complet. O mie de celule per godeu au fost repartizate în plăci negre cu 96 de godeuri optic clare (Costar #3904, Corning, NY) și au fost incubate peste noapte la 37°C, înainte de începerea tratamentelor. Medicamentele și anticorpii au fost diluate în mediu de cultură imediatînaintea utilizării și concentrația finală de DMSO a fost întotdeauna < 0,001%. Viabilitatea celulară a fost evaluată după 24 h de expunere la TRA-8 singur. Pentru tratamentele combinate cu medicamente citotoxice, celulele au fost pretratate cu medicamentul respectiv timp de 24 de h, înainte de a se adăuga anticorpul și au fost incubate timp de încă 24 h, înainte de evaluarea viabilității celulare, prin măsurarea nivelurilor de ATP celular, folosind analiza pe baza luminiscenței ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT). Protocolul recomandat de producător a fost respectat cu excepția că toate volumele de reacție (mediu de cultură și reactivi) au fost reduse la jumătate. Toate probele au fost analizate în triplicat și au fost raportate ca o medie ± SE de la un minim de 3 experimente independente.

RO 123115 Β1 (4) Studii asupra terapiei cu TRA-8 singur sau în combinație cu chimioterapia sau 1 iradierea în xenogrefele de cancer de sân, purtat de șoareci atimici nuzi

Șoareci atimici nuzi au fost injectați subcutanat cu 3 x 10⁷ celule 2LM P. La 7 zile după 3 injectarea celulelor tumorale, 200 sau 600 pg (10 sau 30 mg/kg) TRA-8 a fost administrat intraperitoneal, urmat de cinci injecții adiționale în zilele 10, 14, 17, 21 și 24. Creșterea 5 tumorii a fost monitorizată în timp. în studii ulterioare, animale purtând tumori subcutanate 2LMP au fost injectate intraperitoneal cu 200 pg de TRA-8, în zilele 7,10, 14, 17, 21 și 24, 7 singur sau în combinație cu adriamicină (6 mg/kg, intravenos, zilele 8,12 și 16) sau paclitaxel (20 mg/kg intraperitoneal, în zilele 8,12, 16, 20 și 24). S-a determinat mărimea tumorii și 9 viteza de regresie. în plus, un studiu a fost efectuat cu TRA-8 și adriamicină, folosind același regim descris mai sus, în combinație cu iradierea cu ⁶⁰Co doză 3 Gy a xenogrefelor 2LMP 11 în zilele 9 și 17.

(5) Analiza apoptozei în xenogrefe 13

Șoareci atimici nuzi, injectați subcutanat cu 3 x 10^z celule 2LMP în ziua 0, au primit

100 pg TRA-8 intraperitoneal în zilele 7 și 10. Fiecare grupă de câte doi șoareci a primit 15 adriamicină (3 mg/kg), în zilele 8 și 11, paclitaxel (10 mg/kg), în zilele 8 și 11, sau o combinație de TRA-8 și adriamicină sau paclitaxel cu aceeași doză și aceeași schemă de 17 administrare. O grupă de șoareci a fost netratată. Pentru studiul apoptozei, xenogrefele au fost disecate în ziua 14 după injectarea celulelor tumorale. Motivul pentru reducerea 19 substanțială a intensității tratamentului, comparativ cu protocolul nostru de tratament standard, a fost de a lăsa țesut tumoral adecvat pentru analiza din ziua 14. Testul Tunel 21 pentru apoptoza în xenogrefe tumorale a fost efectuat după cum urmează. Secțiuni de țesut de cinci microni în parafină au fost montate pe lame Superfrost/Plus și încălzite la 58°C timp 23 de o oră. Secțiunile de țesut au fost deparafinate prin trei băi de xilen și rehidratate printr-o baie de etanol absolut, apoi în baie de etanol 95% și de etanol 70%, fiecare în creștere de 25 min. Apoi, secțiunile au fost plasate în soluție salină Tris-tamponată (0,5 M Tris bază, 0,15 M NaCI, 0,0002% Triton X-100, pH 7,6). Nucleii apoptotici au fost detectați folosind un kit 27 Apop Tag Peroxidase (Intergen, Purchase, NY). S-a adăugat proteinaza K (20 pg/ml în H₂O distilată deionozată) la specimenele de țesut și au fost incubate la temperatura camerei, timp 29 de 15 min. Peroxidazele endogene au fost stopate cu o soluție apoasă de 3% peroxid de hidrogen, timp de 5 min. Secțiunile au fost tratate cu un tampon de echilibrare, timp de 31 30 min și apoi incubate cu TdT/enzimă (diluat în amestecul de reacție de marcare), timp de o oră, la 37°C, folosind învelitori de parafină. în timpul acestei incubări, enzima TdT leagă 33 capetele 3'-OH ale fragmentelor de ADN și catalizează adiția de digoxigenin - marcat și de deoxinucleotide nemarcate. Martorii negativi au fost incubați cu H₂O distilată (diluată în 35 amestecul de reacție de marcare) în locul enzimei TdT. Un tampon stop a fost adăugat timp de 10 min la temperatura camerei, pentru terminarea reacției de marcare. Un conjugat anti- 37 digoxigenin a fost adăugat la fiecare lamă, timp de 30 min. Pentru a vizualiza capătul 3'-OH al fragmentelor de ADN marcate, s-a folosit cromagenul 3,3'DAB. Lamele au fost apoi 39 limpezite cu apă deionizată și contra-colorate ușor cu hematoxilină, deshidratate folosind alcooli de diferite grade și xilen și acoperite cu Permount. Aproximativ 10 câmpuri 41 randomizate au fost evaluate pentru procentul de colorate Tunel și procentul de corpi apoptotici intens colorați din țesut. 43 (6) Analiza statistică (A) Analiza interacțiunii TRA-8 cu citotoxicitatea medicamentului in vitro 45

Datele de citotoxicitate au fost evaluate pentru a aprecia dacă efectele citotoxice ale combinației au fost aditive, mai puțin decât aditive (antagoniste) sau mai mari decât aditive 47 (sinergice). Relațiile doză răspuns pentru agenți singuri sau în combinație au fost modelate

RO 123115 Β1 folosind modelul de ordin secund al suprafeței de răspuns în termeni liniari, de puterea a doua și de interacțiune pentru fiecare din cele 9 linii celulare (Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments, New York, Wiley, 2001), așa cum a fost recomandată de către Gennings (On Testing for Drug/Chemical Interactions: Definitions and Inference (Asupra testării pentru interacțiile medicament/substanță chimică: definiții și concluzie), pag. 457-468, 2000). Un termen de interacțiune semnificativă a fost clasat fie ca sinergie, fie ca antagonist depinzând dacă termenul de interacțiune a fost negativ cu mai mult decât citotoxicitate aditivă sau pozitiv, cu mai puțin decât citotoxicitate aditivă. Dacă termenul de interacțiune a fost nesemnificativ, atunci relația dintre TRA-8 și adriamicină sau TRA-8 și paclitaxel ar fi considerată aditivă, dovedind că termenii aditivi au fost semnificativi.

(B) Analiza terapiei cu TRA-8, chimioterapie, terapia prin iradiere și terapia combinată ale experimentelor individuale pe animale

Datele de la 6 experimente independente au fost analizate prin experiment individual. Combinațiile de tratament au fost comparate cu privire la eficiența antitumorală in vivo, adică inhibarea creșterii tumorii, care a fost măsurată ca trei puncte finale: extinderea timpilor de dublare a tumorii, procentul de regresii tumorale și ratele de creștere în timp. Numărul actual de zile la care tumora își dublează aria de suprafață (produs a două diametre), comparat cu linia de bază a zilei 7, după injectarea celulelor tumorale a fost utilizată în analiza timpului de dublare. Testul neparametric Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru comparații ale timpului mediu de dublare a tumorii între tratamente. Testul exact al lui Fisher a fost folosit pentru a compara proporțiile de regresiuni ale tumorii și regresiunile fără revenire printre grupele de tratament. Pentru a determina dacă orice terapie combinată a produs o inhibare sinergică semnificativă a creșterii tumorii, adică, mai mult decât aditivă, curbele de creștere de la măsurătorile de suprafețe în serie au fost comparate folosind o abordare liniară de model amestecat pe primele trei săptămâni de la începutul terapiei (Lindsey, J. K., Models for RepeatedMeasurements (Modele pentru măsurători repetate) pag. 100-142, Oxford, 1993) Pentru a testa efectele sinergice ale terapiilor combinate, un termen al interacțiunii a fost inclus în model. Dacă termenul interacțiunii era semnificativ și efectul era inhibarea creșterii cu o rată mai mare decât aditivă atunci interacțiunea era considerată sinergică.

(C) Analiza generală a efectelor terapiei

Un total de 166 animale, 10 grupe de tratament și 6 experimente independente au fost incluse în analiza generală. Combinațiile de tratament au fost comparate cu privire la eficacitatea antitumorală in vivo. Timpii medii de dublare a tumorii au fost analizați folosind testul Kruskal-Wallis și testul exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a compara proporțiile de regresiuni tumorale și de regresiuni fără revenire printre grupele de tratament.

Toate analizele statistice au fost conduse folosind SAS® (Sas/Stat User's Guide, SAS onlineDoc. Versiunea 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999).

(6) Expresia DR5 și citotoxicitatea indusă de TRA- 8 în liniile celulare de cancer de sân

Așa cum s-a ilustrat în fig. 22A, toate cele nouă linii celulare de cancer de sân au fost DR5 pozitive cu grade variate de expresie de la puternic pozitive (LCC6 și MDA-MB-453) la slab pozitive (MDA-MB-468 și SK-BR-3). Fig. 22B ilustrează citotoxicitatea indusă de TRA-8 în toate cele nouă linii celulare. Patru linii celulare au fost sensibile la citotoxicitatea indusă deTRA-8 cu concentrații IC50 de la 17 la 299 ng/ml (LCC6,2LMP, MDA-MB-231, MDA-MB468), în timp ce altele au fost în întregime rezistente (DY36T2, BT-474, MDA-MB-453). Nu a existat o corelație bună a expresiei DR5 și a gradului de toxicitate indus de TRA-8, după cum a fost ilustrat de către liniile celulare MDA-MB-453 și MDA-MB-468.

RO 123115 Β1

Efectele lui TRA-8 asupra citotoxicității induse de chimioterapie au fost apoi 1 examinate cu adriamicină (fig. 23A) și paclitaxel (fig. 23B). O analiză pentru a testa interacțiunea dintre efectele anticorpului și ale medicamentului sunt rezumate în tabelul 5. Nu au 3 fost interacțiuni semnificativ sinergice între TRA-8 și paclitaxel, cele mai multe interacțiuni fiind aditive. Patru din cele nouă linii celulare au îndeplinit în întregime criteriile pentru o 5 interacțiune sinergică între TRA-8 și adriamicină. Linia celulară 2LMP a demonstrat o sensibilitate bună la TRA-8, ca și sensibilitate fie la adriamicină, fie la paclitaxel. Această linie 7 celulară a fost aleasă, pentru a explora eficacitatea in vivo a anticorpului și/sau a medicamentelor. 9

Tabelul 5

Efectele interacțiunii in vitro pentru tratamentele combinate 11

Linia celulară	TRA-8 + Adriamicină	TRA-8 + Paclitaxel
Interacțiune	p-valoare^a	Interacțiune	p-valoare^a
LCC6	sinergică	< 0,001	aditivă	0,624
MDA-MB -453	sinergică	<0,001	fără răspuns⁰	0,615
2LMP	aditivă	0,153	aditiv	0,937
MDA-MB-231	aditivă	0,663	aditiv	0,064
BT-474	sinergică	<0,001	ND^b	0,992
ZR-75-1	sinergică	0,013	aditivă	0,172
DY36T2	ND^b	0,808	ND^b	0,798
MDA-MB-468	aditivă	0,184	aditivă	0,724
SK-BR-3	aditivă	0,361	fără răspuns⁰	0,871

^ap -valoarea se referă la semnificația termenului de interacțiune sinergică. Dacă efectele ambilor atât ale lui TRA- 23 8, cât și ale medicamentelor au fost semnificative și termenul de interacțiune a fost semnificativ, atunci efectele combinației au fost considerate sinergice. Dacă p-valoarea interacțiunii nu este < 0,05, atunci efectele combinației 25 au fost considerate aditive.

^bND este nedeterminat pentru că efectul TRA-8 nu a fost semnificativ, dar efectul adriamicinei/paclitaxel a fost 27 semnificativ.

^c Fără răspuns se referă la cazul în care nu a existat un răspuns semnificativ la doză pentru unul sau altul dintre 29 agenți.

(7) Efectele antitumorale in vivo ale lui TRAS singur sau în combinație cu chimioterapia și/sau iradierea 33

TRA-8 în doze de 200 și de 600 pg, de două ori pe săptămână, timp de 6 săptămâni, a produs o inhibare similară a creșterii tumorii cu a tumorilor subcutanate bine-stabilizate de 35 2LPM (fig. 24). în trei experimente independente suplimentare, doza de 200 pg/schema de administrare a produs inhibarea statistic semnificativă a creșterii tumorii (< 0,004, testul 37 Kruskal-Wallis asupra timpilor de dublare a tumorii), comparativ cu martorii netratați și această doză și schema de administrare au fost selectate pentru studiile ulterioare. Fig. 25 39 ilustrează efectele lui TRA-8, adriamicinei sau a combinației de TRA-8 și adriamicină asupra eficacității antitumorale. Comparativ cu martorii netratați, terapia cu TRA-8 singur sau TRA-8 41 plus adriamicină au produs o inhibare semnificativă a creșterii tumorii (p = 0,002, în testul Kruskal-Wallis), în timp ce adriamicina nu a fost diferită față de martori. Combinația de TRA-8 43

RO 123115 Β1 plus adriamicină a produs o inhibare a creșterii mai mare decât a fiecărui agent singur (p = 0,002), și semnificativ mai multe regresii complete de tumori (patru) decât fiecare agent singur, unde nicio regresie completă nu a fost observată (p < 0,001. în testul exact a lui Fisher). Sinergismul lui TRA-8 și al adriamicinei in vivo a fost evaluat folosind o analiză a curbei de creștere timpurie. Termenul de interacțiune a fost semnificativ (p < 0,001) și sinergie. Interacțiunea sinergică a fost coroborată într-un al doilea experiment independent.

Efectele lui TRA-8 și ale paclitaxel au fost studiate pe acest același model cu observații similare (fig. 26). Comparativ cu martorii netratați, TRA-8 și TRA-8 plus paclitaxel au produs o inhibare semnificativă a creșterii tumorii (p < 0,001, în testul Kruskal-Wallis). Creșterea tumorii la animalele tratate cu TRA-8 plus paclitaxel a fost semnificativ diferită față de cea a păciitaxelului singur (p = 0,008) și a produs 3/8 regresii complete, comparativ cu niciuna, pentru fiecare dintre agenți singuri. Analiza curbelor de creștere timpurie a tumorii a demonstrat că efectul sinergie a fost aproape semnificativ (p = 0,063), în timp ce efectele aditive au fost semnificative (p < 0,001).

în final, s-au analizat efectele lui TRA-8, ale adriamicinei și ale iradierii cu ⁶⁰Co, ca agenți singuri sau în diferite combinații, așa cum sunt ilustrate în fig. 27. Au existat diferențe semnificative de la un cap la altul, cu privire la timpii de dublare a tumorii (p < 0,001) și comparațiile multiple au arătat că terapia triplă cu TRA-8, adriamicină și ⁶⁰Co a produs o inhibare a creșterii tumorii, care a fost semnificativ diferită față de toate celelalte grupe tratate, în timp ce grupele de terapie duală (adriamicină plus TRA-8 sau ⁶⁰Co plus TRA-8) au fost diferite față de fiecare grupă cu un singur agent (p < 0,001). Animalele ⁶⁰Co tratate doar prin iradiere (singură) nu au fost diferite față martorii netratați (p = 0,926). Toate combinațiile de tratament pe două căi au avut efecte sinergice semnificative (p < 0,001). Regresii complete au fost observate la 6/8 din animalele care au primit terapie triplă și 4 animale nu au prezentat o revenire a tumorii după 180 zile de urmărire.

(8) Analiza generală a efectelor terapiei

Studiile antitumorale in vivo au cuprins 166 de animale și au fost analizați timpii de dublare a tumorii și frecvența regresiei complete a tumorii pentru toate animalele din fiecare grup de tratament (tabelul 6). Analiza ANOVA pentru timpii medii de dublare a tumorii a indicat diferențe semnificative printre grupele de tratament (p < 0,001), cu multiple comparații care arată că TRA-8 + paclitaxel, TRA-8 + adriamicină și TRA-8 + adriamicină + ⁶⁰Co au timpi medii de dublare a tumorii semnificativ mai lungi decât oricare grupă de tratament lipsită de TRA-8. Adăugarea de TRA-8 la oricare modalitate de tratament a produs un timp de dublare a tumorii mai lung decât a oricărei modalități singură. în mod similar, testul Kruskal-Wallis asupra timpului median de dublare a tumorii a arătat că medianele au fost semnificativ diferite de la un cap la altul (p < 0,001). Comparațiile în chip de perechi, folosind testul Wilcoxin signed-rank, au produs tipare similare, pentru timpul median de dublare a tumorii, ca și comparațiile multiple ANOVA. Această analiză subestimează inhibarea creșterii produsă de cele mai eficiente tratamente, în care grupelor care nu au atins o dublare a tumorii până la sfârșitul experimentului li s-a fixat ziua terminării experimentului. Tabelul 6 furnizează de asemenea frecvența de regresie completă a tumorii și frecvența persistenței a acestei regresii la sfârșitul experimentului. Nu a existat o regresie completă a tumorii observată la animalele tratate fie în regim de chimioterapie sau de iradiere, atestând creșterea tumorii bine-stabilizată și a agresivității tumorii. După testul exact al lui Fisher, au existat diferențe semnificative în frecvența regresiilor complete ale tumorii între grupele de tratament (p < 0,001). 30 din cele 166 de animale au atins regresia completă și 28 dintre acestea au primit TRA-8 singur sau în combinație cu alte modalități. Regresia completă s-a petrecut la 1/42 animale martor; 1/54 animale care au primit chimioterapie, iradiere sau o combinație; și 28/68 au primit TRA-8 singur sau TRA-8 în regimuri combinate. Grupele tratate cu TRA-8 au avut o frecvență semnificativ mai mare (p < 0,001) de regresie completă.

RO 123115 Β1 în mod similar, 14/68 de animale care au primit TRA-8 sau combinații de TRA-8 nu au avut 1 o recreștere a tumorii, comparativ cu 1/42 din martori și 0/52 animale tratate cu chimioterapie și/sau iradiere. Regresiile fără revenire au avut perioade de observații de la 99 la 171 zile 3 (146 ±24 zile).

Tabelul 6 5

Rezultate generale ale timpului de dublare șl ale regresiei complete a tumorilor 2LMP

Regresie completă
T ratament	# din timpul de dublare al tumorii (zile)	Total (%)	Fără revenire (%)	Observații medii Perioada (zile)
Animale	(medie/ mediană)
Martori netratați	44(42)a	12/8	1(2%)	1(2%)	177
^S0Co	8(7)	14/10	0	0	186
Adriamicină	31(28)	17/18	0	0	197
Paclitaxel	7(5)	25/20	0	0	-
Adriamicin + ⁶⁰Co	8(8)	39/36	1(13%)	0	197
TRA-8	30(26)	47/23	6(20%)	5(17%)	159
TRA-8+⁶⁰Co	8(8)	65/50	3(38%)	1(13%)	186
TRA-8 + Paclitaxel	8(8)	71/62	3(38%)	1(13%)	148
TRA-8 +Adriamicină	14(12)	81/64	10(71%)	3(21%)	185
TRA-8+Adriamicină + ⁶⁰Co	8(6)	>140/179	6(75%)	4(50%)	192

Numerele dintre paranteze reprezintă numărul animalelor neverificate (9) Apoptoza în tumorile tratate

Inducerea apoptozei în xenogrefele 2LMP în urma tratamentului cu TRA-8, 27 adriamicină, paclitaxel, TRA-8 + adriamicină și TRA-8 + paclitaxel a fost evaluată folosind tehnica Tunel. La animalele netratate, tumorile au avut 4% celule colorate (intens 1%), în 29 timp ce în tratamentul cu adriamicină sau paclitaxel au avut 8% (intens 6%) și 7% (intens 2%) celule colorate. Animalele tratate cu TRA-8 singur au avut o apoptoza remarcabilă cu 31 25% (intense 15%) celule colorate. Cele tratate cu TRA-8 plus adriamicină au avut 28% (intense 22%) și tratate cu TRA-8 plus paclitaxel au avut 26% (intense 12%) celule colorate. 33

Oricare dintre brevetele sau publicațiile menționate în specificație sunt indicative la nivelul celor specializați în domeniu, cărora invenția le aparține. Aceste brevete și publicații 35 sunt încorporate în prezenta lucrare prin referire, în aceeași măsură, ca și cum fiecare publicație individuală a fost în mod specific și individual indicată a fi încorporată prin 37 bibliografie.

Prezenta invenție nu este limitată ca anvergură de către depozitul mai sus menționat 39 sau de variantele dezvăluite în exemple, care sunt intenționate ca ilustrații ale câtorva aspecte ale invenției, și oricare variante, care sunt funcțional echivalente, sunt în sfera 41 acestei invenții. Diferitele modificări ale invenției, în plus față de cele prezentate și descrise în prezenta lucrare, vor deveni vizibile celor specializați în domeniu și sunt intenționate a 43 cădea în sfera revendicărilor anexate.

RO 123115 Β1

LISTA DE SECVENȚE rflCfc. FUNDAȚIA DE CER CETARE UAE

Zhow, Totig jL, jriJL .jf 'fț.aBjfc -tjjji- Qi t\w îbiA&nyțt IHrv'EI'vIț. r 4

Koopman, iMllam J.

Lț?6u0l<i>.AIbertS.

Buctebeim, Donald J.

<1 w UN ANTICORP SELECTIV PENTRU UN RECEPTOR AL CĂRUI LIGANT CE -INDUCE APOPTOZA ESTE ÎNRUDIT cu FACTORUL DE NECROZĂ TUMORALĂ §1 UTILIZĂRILE ACESTUIA <1 BCfe· 21 QB5-0029P2 <15Ote US BM4fi,4O2 <161^001 11-01 *150 PCTAJ8W14m <15V2t®W3-0Z <15D> US6W20t,3« ^țgt^aw-w-® <tGO> 102 <iW Vaisiunea bravetUlui 3.0 <2ΐϋ> i <2H> es <212> ADN .jjfc’E PțSi- Α^ιπηΒΗιτιΜίΙπ. jiirfcafl r^LraJ’j

SlmflKS!

<21Ct> 2 <211> 22 <aia> adn

RO 123115 Β1

<213>construcție sintetică	1 3
<400> 2		5
ccactgggtgatgttggatg gg	22	7
<210> 3
<211> 24		9
<212> ADN		11
<213> construcție sintetică
		13
<400> 3
ggatccgtgg acacattcga tgtc	24	15

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 4

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gîy Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 δ 10 15

Ser Leu Lys Leu <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> construcție sintetica <400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser <210> 6 <211> 20

RO 123115 Β1 <212> ADN <213> construcție sintetică <400>6 cagcactgaa cacggacccc 20

210>7 <211> 20 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 7 aaaggtaatt tattgagaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetica <400> 8 cctcaccatg aacttcgggc 20

<210>	9
<211>	20
<21	ADN
<213>	construcție sintetică

<400> 9 ctgttgtatg cacatgagac 20 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetică

RO 123115 Β1 <400> 10 gaagtgatgc tggtggagtc <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 11 agtgtgaagt gatgctggtg <210> 12 ³

13 <211> 21 <212> ADN <213> construcție sintetică 19 <400> 12 tttaccagga gagtgggaga g <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 13 tgcagagaca gtgaccagag <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 14 tgtteaggac cagcatgggc <210> 15

RO 123115 Β1 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetică <400>15 aagacatttt ggattctaac 20 <210> 16 <211>20 <212>AND <213> construcție sintetică <400>16 tatcatgaag tctttgtatg 20 <210> 17 <211 >20 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 17 gatggagaca cattctcagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> ADN <2i3> construcție sintetică <400> 18 gacattgtga tgacccagtc 20 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> construcție sintetica

100

RO 123115 Β1

1 <400> 19
ttaacactca ttcctgttga	20	3
<210> 20		5
<211> 20		7
<212> ADN <213> construcție sintetică		9

<400> 20 gactgggtca tcacaatgtc <210> 21 <211> 1386 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 21 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgatgctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgtaatgt cttgggttcg ccagactccg gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acggggggac Ictatgatta cgacggacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa

	15
	17
	19
	21
60
120	23
180	25
240
	27
300
360	29
420
	31
480
540	33
600	35
660
	37
720
780	39
840	41
800
	43
960

101

RO 123115 Β1 cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020 gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080 ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140 acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200 cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg clcttacttc 1260 gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380 ggtaaa 1386 <21 O> 22 <211> 705 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 22 atgaagtctt tgtatgtgtt agtgtataca cattatctgt ttctgtttgc aggtgttgaa60 ggagacattg tgatgaccca gtctcacaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc120 agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta tcaacagaaa 180 ccagggcaat ctcctaaact actgatttac tgggcatcca cccggcacac tggagtccct240 gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag caatgtgcag300 tctgaagact tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa 705 <210> 23 <211> 462 <212> PRT <213> construcție sintetică

102

RO 123115 Β1 <400> 23

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly

1015

Val Gin Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

2530

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

4045

Ser Ser Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu

5560

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro

70 7580

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

9095

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp

115 120125

Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

130 135140

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Glo Thr Asn Ser Met

145 150 155160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170175

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185190

Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

195 200205

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

210 215220

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

225 230 235240

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

245 250255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

260 265270

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

275 280285

Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr

103

RO 123115 Β1

290 295300

Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

305 310 315320

Leu Pro lle Met His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Glu Phe Lys Cys

325 330335

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lle Glu Lys Thr lle Ser

340 345350

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lle Pro Pro

355 360365

Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lle

370 375380

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lle Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly

385 390 395400

Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lle Met Asp Thr Asp

405 410415

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp

420 425430

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

435 440445

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455460 <210> 24 <211> 234 <212> PRT <213> construcție sintetică <400>24

Met Lys Ser Leu Tyr Val Leu Val Tyr Thr His Tyr Leu Phe Leu Phe

1015

Ala Gly Val Glu Gly Asp lle Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met

2530

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin

4045

Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser

5560

Pro Lys Leu Leu lle Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro

70 7580

104

RO 123115 Β1

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr I le

9095

Ser Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr

100 105110

Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys Arg

115 120125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lle Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin

130 135140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155160

Pro Lys Asp lle Asn Val Lys Tip Lys lle Asp Gly Ser Glu Arg Gin

165 170175

Asn Giy Va! Leu Asn Ser T rp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215220 lle Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> construcție sintetică

<400>	25
Ser Tyr Val Met Ser
1	5
<210>	26
<211>	17
<212>	PRT
<213>	construcție sintetică

<400> 26

Thr lle Ser Ser Giy Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

Gly

105

RO 123115 Β1 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 27

Arg Gly Asp Ser Met lle Thr Thr Asp Tyr

10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 28

Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala

5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 29

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 30

Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

5

106

RO 123115 Β1 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> construcție sintetica <400> 31

Glu Va! Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

2530

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

4045

Ala Thr lle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lle Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 32 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 32 ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag 60 ³⁵ caacagctac aggtgtccac 80 <210> 33 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică

107

RO 123115 Β1 <400> 33 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60 ctctcctgtg cagcctctgg 80 <210> 34 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 34 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga 60 gtgggttgca accattagta <210> 35 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 35 gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 60 acaatgccaa gaacaccctg <210> 36 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 36 tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac <210> 37 <211> 64 <212> ADN <213> construcție sintetică

108

RO 123115 Β1

LISTA DE SKYEKTE tnnt. HJfeDAȚLA DE CEH CE ΓARE LI AS

ZfcMi T®Jf5 ggaclactco oomwsoaa ccctogtcac agtctcctca gcstccacca aoggcccatc 60 ggtc 64θ <2«b38

ADN <213> construcție sinteticii creceaagaa gaggajgaia cagctccatc ccaiggtgag gtcaagccaa gcttatccaa so ₁₇ c«>3® •2' '3·. rrreinrrfM sin'eiWi <®β> S» iclcaggf ac cctccaggct gtMtMew icccccagac tccaccssca ttsrttwga 60 ftggagawst gtagctgltg 80 ₂7 <2i0& 40 <213> ionstrucțlBirtfllcii ^ΚΜ>β tccagacccl tcootggtgo ctgecgaaoo caaga-qatta caUact&ct gaaagtgaat «O ccaflftggetg eaoaggagag 80 <11> β <212 > ADM

109

RO 123115 Β1 <400> 41 ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac 60 tactaatggt tgcaacccac <210x42 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetici <400>42 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 <210>43 <211>84 <212>ADN <213> construcție sintetică <400>43 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta 60 gtccgtcgta atcatagagt cacc 84 <210>44 <211> 20 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 44 ttggataagc ttggcttgac <210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> construcție sintetică

110

RO 123115 Β1 <400> 45 gaccgatggg cccttggtgg a <21 O> 46 <211>· 213 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 46

Asp lle Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1015

Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala

2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro

70 7580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

9005

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <21O> 47

111

RO 123115 Β1 <211> 34 <212> ADN <213> construcție sintetica <400> 47 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct 34 <21O> 48 <211> 45 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 48 cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac 45 <210> 49 <211> 60 <212> ADN <213> construcție sintetica <400> 49 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga 60 <210> 50 <211> 48 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 50 ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc 48 <210> 51 <211> 57 <212> ADN <213> construcție sintetică

112

RO 123115 Β1

<400> 51
agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg	57	3
<210> 52		5
<211> 48		7
<212> ADN
<213> construcție sintetică		9

<400> 52

tgggcatcca ccoggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt	48	13
<210> 53		15
<211> 63		17
<212> ADN
<213> construcție sintetică		19
<400> 53		21
ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat	60	23
ggt	63	25
<210> 54 <211> 63		27
<212> ADN		29
<213> construcție sintetică		31
<400> 54		33

cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact 60

gtg	63	35
<210>	55	37
<211>	711	39
<212>	ADN	41
<213>	construcție sintetică

113

RO 123115 Β1 <400>55· atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt60 gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtcacc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca180 gggaaagctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccaagc240 aggtttagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccatctctag tctgcagccg 300 gaggattttg caacctatta ctgtcagcaa tatagtagtt atcggacgtt cggtcaaggc360 accaaggtgg aaatcaaacg gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttotatccc480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc lacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtaagaatt c 711 <210>56 <211>119 <212> PRT <213>ADN <400> 56

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

2530

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

4045

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

9095

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp TyrTrp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

114

RO 123115 Β1 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 57 tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtcccțgaga 60 ctctcctgtg cagcctctgg80 <210> 58 <211 > 80-| 3 <212> ADN <213> construcție sintetică15 <400> 58 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagao tccaccagct gtacttcaga 60 gtggacacct gtagctgttg 80 <210> 59 <211> 119 <212> PRT <213> construcție sintetică <400>59

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

2530

Val Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gty Lys Gly Leu Glu Trp Val

4045

Aia Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

115

RO 123115 Β1

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lle Thr Thr Asp TyrTrp Qly Gin Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 60 <211x119 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 60

Glu Val Met Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

2530

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

40 .45

Aia Thr lle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lle Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 61

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Qly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

25 30

116

RO 123115 Β1

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Giu Lys Arg Leu Glu Trp Val

40 45

Ala Thr lle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

55 605

Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

9095

Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met lle Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

11515

<210> 62	17
<211> 80		19
<212> ADN
<213;» construcție sintetică		21
<400> 62		23
tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg	60
ggtgactcta tgattacgac	80	25
<210> 63		27
<211> 80		29
<212> ADN
<213> construcție sintetică		31
<400> 63		33
ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata	60	35
cagggtgttc ttggcattgt	80
		37
<210> 64
<211> 80		39

<212> ADN <213> construcție sintetică <400> 64

117

RO 123115 Β1 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga 60 gtgggttgca accattagta <210> 65 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 65 tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag <210>66 <211>80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 66 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa 60 ctctcctgtg cagcctctgg 80 <210> 67 <211>80 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 67 tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 80 <210> 68 <211> 64 <212> ADN <213> construcție sintetică

118

RO 123115 Β1 <400> 68 ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc 60 ggtc 64 <210> 69 <211> 80 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 69 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga 60 gtggacacct gtagctgttg

15 <210> 70 <211> 80 -I9 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 70 ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt <210> 71 <211> 70 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 71

25 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta 60 gtccgtcgta 70 <210> 72 <211> 212 <212> PRT

119

RO 123115 Β1 <213> construcție sintetică <400> 72

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 1015

Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala

2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 7580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 9095

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Giu Ala Lys 130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Aia Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu

210 <210> 73 <211> 213 <212> PRT <zi3 > construcție sintetică <400> 73

120

RO 123115 Β1

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1015

Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala

2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

5560

Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin pro

70 7580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

9095

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 .110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155160

Ser Va! Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 1 70175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 74 .

<211> 213 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 74

Asp lle Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 39

1	5	10	15	41
Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
	20	25	30	43

121

RO 123115 Β1

Val Ala TrpTyrGIn Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

55. 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 7580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

9095

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Aia Lys

130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 1 55160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala AspTyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <21O> 75 <211> 213 <212> PRT <213> construcție sintetică <400> 75

Asp lle Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 1015

Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala

2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

5560

122

RO 123115 Β1

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro

70 7580

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

9095

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Giu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 76 <211> 213 <212> PRT <213> construcție sintetică <400>76

Asp lle Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1015

Asp Arg Val Ser lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala

2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lle

4045

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Asn Val Gin Ser

70 7580

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

9095

123

RO 123115 Β1

Phe Gly Gfy Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro

100 105110

Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr

115 120125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145 150 155160

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 .175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 1Θ5190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 77 <211> 60 <212> ADN <213> construcție sintetica <400>77 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60 <210>78 <211 >65 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60 ccagg 65 <210> 79 <211> 69 <212> ADN <213> construcție sintetică

124

RO 123115 Β1 <400> 79 cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt60 cttaagctt <210> 80 <211> 67 <212> ADN9 <213> construcție sintetică <400> 80 ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga60 cagggtc <210> 81 <211> 54 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag 54 <210> 82 <211> 67 ²⁷ <212> ADN <213> construcfie sintetică <400>82 accatcacct goaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60 ccaggaa @7 <210> 83 <211> 72 <212> ADN <213> construcție sintetică

125

RO 123115 Β1 <400> 83 tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga 60 tgcagacaaa ga 72 <210x84 <211> 71 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 84 aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt 60 ttacaggcag t <2102* 85 <211> 72 <212> ADN <213> construcție sintetica <400> 85 cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg 60 ttggtaccag gc 72 <210> 86 <2L1> 63 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 86 gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc 60 tat 63 <210> 87 <211> 60 <212> ADN

126

RO 123115 Β1 <213> construcție sintetica <400> 87 actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac <210> 88 <211> 57 <212> ADN <213> construcție sintetica <400> 88 tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc <210>. 89 <211> 57 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 89 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac <210> 90 <211> 51 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 90 aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g <210>

<212>

ADN <213> construcție sintetică <400> 91

127

RO 123115 Β1 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc 60 gaa 63 <210>92 <211>57 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 92 ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57 <210> 93 <211> 57 <212> ADN <213> construcție sintetică <400>93 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag 57 <210>94 <211>63 <212>ADN <213> construcție sintetică <400> 94

99gtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggăgga ttttgcagat 60 tat 63 <210> 95 <211> 57 <212> ADN <213> construcție sintetică <400> 95 ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc

128

RO 123115 Β1

<210>96		1
<211> 57		3
<212>ADN
<213> construcție sintetică		5
<400> 96		7
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctocg gctgcag	57	9
<210> 97		11
<211> 51
<212> ADN		13
<213> construcție sintetică		15
<400> 97
tgatgtggac atgaattlgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a	51	17
<210> 98		19
<211> 51		21
<212> ADN
<213> construcție sinxenca		23
<400> 98		25
tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c	51	27
<210> 99		29
<211> 49
<212>ADN		31
<213> construcție sintetică		33
<400> 99
aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc	49	35
<210> 100		37
<211> 45		39

129

RO 123115 Β1 <212> ADN <213> construcție sintetică <400>100 aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc 45

<210=- <211>	101 30
<212>	ADN
<213=-	construcție sintetică

<400> 101 agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa <210> 102 <211> 63 <212> ADN <213> construcție sintetici <400> 102 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc 60 gaa 63

130

RO 123115 Β1

Claims

Revendicări 1

1. Anticorp purificat, care se leagă în mod selectiv la un receptor D4 TRAIL și care 3 nu se leagă la DR5, DcR1 sau DcR2, în care respectivul anticorp, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo și in vitro, în celulele țintă care exprimă DR4, în 5 care activitatea de inducere a apoptozei in vitro este caracterizată printr-o viabilitate a celulelor țintă mai mică de 50%, la concentrații ale anticorpului de aproximativ 100 ng/ml. 7
2. Anticorp conform revendicării 1, în care activitatea de inducere a apoptozei este caracterizată printr-o viabilitate a celulelor țintă mai mică de 60%, la concentrații ale 9 anticorpului mai mici de 30 pg/ml.
3. Anticorp conform revendicării 1, în care numitul anticorp este un anticorp 11 monoclonal.
4. Anticorp conform revendicării 1, în care DR4 este un DR4 uman.13
5. Anticorp conform revendicării 1, în care celula țintă este o celulă canceroasă.
6. Anticorp conform revendicării 1, în care celula țintă este o celulă sinovială de artrită15 reumatoidă.
7. Anticorp conform revendicării 1, în care celula țintă este un limfocit activat.17
8. Anticorp conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că respectivul anticorp este un anticorp monoclonal, având aceeași specificitate a epitopului ca și hibridoma 2E12,19 care are numărul de acces la ATCC, PTA-3798.
9. Anticorp conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că respectivul anticorp 21 este un anticorp monoclonal produs de hibridoma 2E12, care are numărul de acces la ATCC,

PTA - 3798.23
10. Anticorp conform revendicării 1, în care numitul anticorp este umanizat.
11. Compoziție care conține o cantitate terapeutică din anticorpul definit în 25 revendicarea 1 și un purtător acceptabil farmaceutic.
12. Compoziție care conține o cantitate terapeutică din anticorpul definit în 27 revendicarea 10 și un purtător acceptabil farmaceutic.
13. Utilizare a unui anticorp definit în revendicarea 1, pentru producerea unui 29 medicament administrat în tratamentul cancerului sau al unei boli inflamatorii sau autoimune prin inducerea selectivă a apoptozei și inhibarea proliferării celulare. 31
14. Utilizare conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că respectivul anticorp este un anticorp umanizat. 33