BRPI0706530A2 - métodos e composições para tratamento de doenças alérgicas - Google Patents

Abstract

METODOS E COMPOSIçõES PARA TRATAMENTO DE DOENçAS ALéRGICAS. Revelados na presente invenção são anticorpos que reconhecem e antagonizam especificamente receptor humano TSLP, e métodos de empregar estes anticorpos para tratar ou melhorar doenças ou distúrbio me- diados por sinalização de TSLP

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS ECOMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ALÉRGICAS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Mecanismos ou trajetórias fisiológicas específicas mediadas porcélulas imunes e citocinas, por exemplo, trajetórias conduzindo a várias dis-túrbios inflamatórias. A Iinfopoietina estromal tímica humana (TSLP) é umacitocina similar a IL-7 que é produzida de células epiteliais humanas. Ela pro-move diferenciação de célula B e também co-estimula ambos timócitos ecélulas T maduras. A TSLP se liga a um receptor heterodimérico específiconas células dendríticas CD11c+ humanas (DC's). O receptor heterodímeroconsiste em uma cadeia de receptor similar à gama comum (receptor de TS-LP; TSLPR) e a cadeia IL-7R-a. Ver, por exemplo, Tonozuka et al., Cytoge-net. Cell Genet. 93:23-25, 2001; Pandey et al., Nat. Immunol. 1:59-64, 2000;L. S. Park et al., J. Exp. Med. 192:659-670, 2000; e Reche et al., J. Immunol.167:336-343, 2001. O Iigante que se liga ao receptor induz as DC's a secre-tarem quimioquinas de atração de TH2, TARC (timus e quimioquina reguladapara ativação) e MDC (quimioquina derivada de macrófago). Em adição, aTSLP também induz ativação de DC potente, expansão de célula T CD4+simples, e polarização subseqüente a um TH2 fenótipo, produzindo citocinaspró-alérgicas interleucina 4 (IL-4), IL-5, IL-13 e fator-α de necrose de tumor.

Foi também verificado que a sinalização da TSLP resulta na ati-vação do fator de transcrição de Stat5. Além disso, pacientes com dermatiteambas aguda e atópica crônica foram reportados para sobreexpressaremTSLP em lesões de pele, sugerindo que a expressão de TSLP é associadacom inflamação alérgica in vivo. Aparte dos queratinócitos da pele, alto nívelde expressão de TSLP foi também verificado em células epiteliais bronqui-ais, músculos lisos e fibroblastos de pulmão, suportando um papel potencialpara TSLP em indicações alérgicas respiratórias também. Além disso, célu-las de maestro ativadas por IgE expressam nível muito alto de TSLP, ummecanismo que pode participar na manutenção do Th2 fenótipo.

Cerca de 20% da população nos países ocidentais sofrem dedistúrbios inflamatórias, por exemplo, as doenças alérgicas, que incluemasma, rinite, dermatite atópica, e alergia a alimento. De 50% a 80% dos pa-cientes com dermatite atópica têm ou desenvolvem asma ou rinite alérgica.Até aqui, não existe cura para asma induzida por alergia, dermatite atópica,e rinite alérgica. Tratamentos atuais, tais como antagonistas beta-2 adreno-ceptor para asma, Elidel para dermatite atópica, e H1-anti-histamina pararinite alérgica, são usados para alcançar os sintomas. Desse modo, existeuma necessidade aumentada na técnica para melhores terapias para tratarestes distúrbios inflamatórios, em particular, inflamação alérgica. A presenteinvenção refere-se a estes e outros problemas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma concretização da invenção aqui proporciona um anticorpohumano isolado ou anticorpo humanizado ou fragmento funcional do mesmocom uma região de ligação de antígeno que é específica para receptor deIinfopoietina estromal tímico humano alvo (hTSLPR), e o anticorpo ou frag-mento funcional do mesmo que se liga a hTSLPR. Em uma concretizaçãorelacionada, a ligação a hTSLPR é determinada pelo menos pela ligação dereceptor de hTSLP de superfície celular, prevenindo a liberação mediadorainflamatória.

Em ainda outra concretização, a invenção proporciona uma regi-ão isolada de ligação de antígeno de um anticorpo ou fragmento funcionaldeste. Em certas concretizações, a região isolada de ligação de antígenoinclui uma região de H-CDR1 tendo uma seqüência de aminoácido TYGMS(SEQ ID NO: 7), e variantes conservativas da mesma. Conforme aqui descri-to, as variantes conservativas incluem resíduos de aminoácido em qualquerdas seqüências de aminoácido identificadas. Em uma concretização relacio-nada, a região isolada de ligação de antígeno é uma região de H-CDR2 ten-do uma seqüência de aminoácido WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ ID NO:8), e variantes conservativas da mesma. Em outra concretização relaciona-da, a região isolada de ligação de antígeno é uma região de H-CDR3 tendouma seqüência de aminoácido EGFITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9), evariantes conservativas da mesma.

Em outra concretização, a região isolada de ligação de antígenoé uma região de L-CDR1 tendo uma seqüência de aminoácido KASQDVG-TAVA (SEQ ID NO: 10), e variantes conservativas da mesma. Em ainda ou-tra concretização relacionada, a região isolada de ligação de antígeno é umaregião de L-CDR2 tendo uma seqüência de aminoácido WASTRHT (SEQ IDNO: 11), e variantes conservativas da mesma. Em ainda outra concretizaçãorelacionada, a região isolada de ligação de antígeno é uma região de L-CDR3 tendo uma seqüência de aminoácido QQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), evariantes conservativas da mesma.

Em outra concretização, a região isolada de ligação de antígenoé uma cadeia pesada tendo a região variável de seqüência de aminoácidoSEQ ID NO: 5, e uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 porcento de identidade de seqüência nas regiões CDR com a região CDR deSEQ ID NO: 5. Em uma concretização relacionada, a região isolada de liga-ção de antígeno é uma cadeia leve tendo a região variável de seqüência deaminoácido SEQ ID NO: 6, e uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80,90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nas regiões CDR com a regi-ão CDR de SEQ ID NO: 6.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona anticorposantagonistas monoclonais contra hTSLPR. Alguns dos anticorpos anti-TSLPR da invenção têm a mesma especificidade de ligação conforme aque-/ Ia de um anticorpo de referência que contém uma seqüência de região vari-ável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, e uma seqüência de região variá-vel de cadeia leve de SEQ ID NO: 6. Alguns destes anticorpos são anticor-pos totalmente humanos que exibem a mesma especificidade de ligaçãoconforme aquela do anticorpo de referência. Alguns dos anticorpos têm umaseqüência de região de determinação de complementaridade (CDR) de ca-deia pesada de TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ IDNO: 8) ou EGFITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9); ou uma seqüência CDRde cadeia leve de KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ IDNO: 11), ou QQYSTYPT (SEQ ID NO: 12).

Alguns dos anticorpos anti-hTSLPR têm seqüências CDR1,CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGV-PRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9),respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve,KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente. Alguns outros anticorposda invenção contêm uma seqüência de aminoácido de região variável decadeia leve que é pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 5, e uma seqüên-cia de aminoácido de região variável de cadeia leve que é pelo menos 85%idêntica a SEQ ID NO: 6. Alguns outros anticorpos anti-hTSLPR da invençãotêm uma seqüência de aminoácido de região variável de cadeia leve que éidêntica a SEQ ID NO: 5, e seqüência de aminoácido de região variável decadeia leve que é idêntica a SEQ ID NO: 6.

Alguns anticorpos anti-hTSLPR da invenção são anticorpos decamundongo. Alguns outros são anticorpos quiméricos. Alguns dos anticor-pos quiméricos têm uma região constante de cadeia pesada humana e umaregião constante de cadeia leve humana. Alguns outros anticorpos anti-hTSLPR da invenção são anticorpos humanizados. Alguns outros anticorposanti-hTSLPR da invenção são anticorpos totalmente humanos que exibem amesma especificidade de ligação como um anticorpo que contém uma se-qüência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, e uma se-qüência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6. Também provi-dos na invenção são anticorpos de cadeia simples, por exemplo, um frag-mento Fab. Alguns dos anticorpos anti-hTSLPR são de isotipo IgGI. Algunsoutros anticorpos são de isotipo lgG4.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos iso-lados ou recombinantes (por exemplo, DNA) que codificam um polipeptídeocontendo a região variável de cadeia pesada ou a região variável de cadeialeve de um anticorpo anti-hTSLPR da invenção. Por exemplo, os polinucleo-tídeos podem codificar um anticorpo de cadeia pesada que contém seqüên-cias CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7),WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTVVGAAGRFVY (SEQID NO: 9), respectivamente. Os polinucleotídeos podem também codificarum anticorpo de cadeia leve que contém seqüências CDR1, CDR2, e CDR3,KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente. Alguns polinucleotídeos dainvenção codificam uma seqüência madura de região variável de cadeia pe-sada que é pelo menos 90% idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5. Al-guns outros polinucleotídeos codificam uma seqüência madura de regiãovariável de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à região madura deSEQ ID NO: 6. Alguns destes polinucleotídeos codificam uma seqüênciamadura de região variável de cadeia pesada que é idêntica à região madurade SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência madura de região variável de cadeialeve que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, ainvenção proporciona células hospedeiras isoladas que abrigam (1) umsegmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada de um an-ticorpo anti-hTSLPR da invenção, e (2) um segundo segmento de DNA re-combinante que codifica uma cadeia leve do anticorpo. Em algumas das cé-lulas hospedeiras, os segmentos de DNA recombinantes são respectivamen-te operavelmente ligados a um primeiro e a um segundo promotor, e sãocapazes de serem expressos nas células hospedeiras. Algumas destas célu-las hospedeiras expressam um anticorpo monoclonal que tem seqüênciasCDRf1 CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7),WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTVVGAAGRFVY (SEQID NO: 9), respectivamente; e seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeialeve, KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente. Algumas outras célulashospedeiras expressam um anticorpo anti-hTSLPR que contém uma se-qüência madura de região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5; e uma seqüência madura de re-gião variável de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à região madurade SEQ ID NO: 6. Algumas destas células hospedeiras expressam um anti-corpo anti-hTSLPR que contém uma seqüência madura de região variávelde cadeia pesada que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5, e umaseqüência madura de região variável de cadeia leve que é idêntica à regiãomadura de SEQ ID NO: 6. Algumas das células hospedeiras são células demamífero não-humanas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de tratamen-to de um distúrbio inflamatório em um indivíduo, por exemplo, um pacientehumano. Estes métodos requerem administrar ao indivíduo uma composiçãofarmacêutica que contém uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-hTSLPR. Tipicamente, o anticorpo anti-hTSLPR tem a mesma especificidadede ligação como aquela de um anticorpo anti-hTSLPR que contém uma se-qüência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, e uma se-qüência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6. Em alguns des-tes métodos terapêuticos, um anticorpo totalmente humano é empregado.Em alguns métodos, o anticorpo anti-TSLPR abriga seqüência de CDR1,CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGV-

PRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTWGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9),respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve,KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente. Em alguns métodos, o anti-corpo anti-hTSLPR empregado contém uma seqüência madura de regiãovariável de cadeia pesada que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5,e uma seqüência madura de região variável de cadeia leve que é idêntica àregião madura de SEQ ID NO: 6. Alguns dos métodos são dirigidos ao tra-tamento de indivíduos que sofrem de unia doença inflamatória alérgica. E-xemplos de doenças inflamatórias alérgicas que são acessíveis ao tratamen-to incluem dermatite atópica, asma, ou rinite alérgica.

Em ainda outra concretização, a invenção proporciona um imu-noconjugado produzido de um primeiro componente que é um anticorpo oufragmento do mesmo, e um segundo componente tendo uma segunda se-qüência de aminoácido. Por exemplo, o imunoconjugado é uma citotoxina,ou o imunoconjugado é uma proteína de ligação ou anticorpo tendo a espe-cificidade de ligação para um alvo que é diferente de hTSLPR.

Em outra concretização, a invenção proporciona um estojo tendoum anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo. Em algumas concretiza-ções, o estojo contém adicionalmente um veículo ou excipiente farmaceuti-camente aceitável, portanto. Em outras concretizações relacionadas, o anti-corpo no estojo está presente em uma dose unitária. Em ainda outra concre-tização relacionada, o estojo inclui instruções para uso na administração aum indivíduo.

Uma compreensão adicional da natureza e vantagens da pre-sente invenção pode ser realizada por referência às porções remanescentesdo relatório descritivo e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra classificação para anticorpos antagonistas anti-TSLPR usando um ensaio de proliferação de célula dependente de hTSLPem células BaF3/hTSLPR/hlL7Rcc.

As figuras 2A-2C mostram purificação de camundongo e anti-corpos monoclonais quiméricos anti-hTSLPR A: anticorpo quimérico deIgG 1; B: anticorpo quimérico de lgG4; e C: anticorpo de camundongo deIgGI.

As figuras 3A-3C mostram atividade antagonista de anticorpoanti-hTSLPR de camundongo purificado (clone 1 D6.C9) por ensaio de proli-feração de célula e ensaio de informação de luciferase. A: proliferação decélulas Ba/F3-hTSLPR-hlL7Ra; B: proliferação de células BaF3/hTSLPR/hlL7Ra/Stat5-Luc; e C: atividade de luciferase de células BaF3/hTSLPR/hlL7Ra/Stat5-Luc.

A figura 4 mostra seqüências de nucleotídeos das regiões variá-veis do clone de anticorpo monoclonal anti-hTSLPR de camundongo1 D6.C9.

A figura 5 revela a seqüência de aminoácidos de região variáveldo clone de anticorpo anti-hTSLPR de camundongo 1 D6.C9. As regiões dedeterminação de complementaridade (CDRs) e as regiões de estrutura (FRs)são indicadas por resíduos sublinhados ou resíduos italicizados.

A figura 6 mostra os resultados dos ensaios de informação deluciferase comparando atividade antagonista de anticorpos anti-hTSLPR decamundongo purificados e quiméricos em células Ba/F3 que sobreexpres-sam hTSLPR, hlL7Ra, e Stat5-Luc.A figura 7 mostra a inibição de seção TARC mediada por ETSLPde monócitos humanos pelos anticorpos anti-hTSLPR de camundongo equiméricos.

A figura 8 mostra a identificação do Domínio de Ligação do anti-corpo - o anticorpo de TSLPR se liga a um epítopo descontínuo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada em parte no desenvolvimentopelos presentes inventores de anticorpos antagonistas contra TSLPR huma-na. Os anticorpos anti-hTSLPR gerados em anticorpos anti-hTSLPR de ca-mundongo ou quiméricos in vitro foram verificados serem capazes de inibiratividades mediadas por sinalização de TSLP, por exemplo, a proliferaçãode célula mediada por TSLP. Desse modo, estes anticorpos são úteis comoagentes terapêuticos ou profiláticos contra um número de doenças ou distúr-bios mediados por ou associados com atividades de sinalização de TSLP,por exemplo, doenças inflamatórias alérgicas, tais como dermatite atópica easma. As seções que se seguem proporcionam Orientação para produção euso das composições da invenção, e para efetuar os métodos da invenção.

I. Definições

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e cientí-ficos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compre-endido por aqueles cersados na técnica a qual esta invenção pertence. Asseguintes referências proporcionam um técnico com a definição geral demuitos dos termos usados nesta invenção: Oxford Dictionary of Biochemistrye Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed.,2000); Dictionary of Microbiology e Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.),John Wiley & Sons (3PrdP ed., 2002); e A Dictionary of Biology (Oxford Pa-perback Reference), Martin e Hine (Eds.), Oxford University Press (4PthPed., 2000). Em adição, as seguintes definições são providas para auxiliar oleitor na prática da invenção.

De modo que a presente invenção possa ser mais prontamentecompreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionaissão colocadas através de toda descrição detalhada.O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, Iin-fócitos, células dé apresentação de antígeno, células fagocíticas, granulóci-tos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fíga-do incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resultam em danoseletivo em, destruição de, ou eliminação a partir do corpo humano de pato-genias de invasão, células ou tecidos infectados com patogenias, célulascancerosas, ou, nos casos de auto-imunidade ou inflamação patológica, cé-lulas ou tecidos humanos normais.

Uma "trajetória de transdução de sinal" refere-se ao relaciona-mento bioquímico entre uma variedade de moléculas de transdução de sinalque desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção deuma célula para outra porção de uma célula.

O termo "anticorpo" conforme referido aqui inclui anticorpos to-tais e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, "porção de ligaçãode antígeno"), ou cadeias simples do mesmo. Um "anticorpo" que ocorrenaturalmente é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeiaspesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfito.

Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pe-sada (abreviada aqui como Vh), e a região constante de cadeia pesada. Aregião constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1,CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável decadeia leve (abreviada aqui como VQ1 e a região constante de cadeia leve. Aregião constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. AS re-giões Vh e Vl podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hiperva-riabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade(CDR), interespersadas com regiões que são mais conservadas, denomina-das regiões de estrutura (FR). Cada Vh e Vl é composta de três CDRs equatro FRs dispostas de terminal amino para terminal carbóxi na seguinteordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis dascadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage comum antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligaçãoda imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias célulasdo sistema imune (por exemplo, células efetuadoras) e o primeiro compo-nente (CIq) do sistema de componente clássico.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente "porção de antígeno"), conforme aqui usado, refere-se a com-primento total ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capa-cidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, TSLPR).

Mostrou-se que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode serrealizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplosde fragmentos de ligação envolvidos dentro do termo "porção de ligação deantígeno" de urri anticorpo inclui um fragmento de Fab, um fragmento mono-valente consistindo nos domínios VL, VH, Cl e CH1; um fragmento de F(ab)2,um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fab ligados poruma ponte de dissulfito na região de articulação; um fragmento de Fd consis-tindo nos domínios Vh e CH1; um fragmento de Fv consistindo dos domíniosVl e Vh de um braço simples de um anticorpo; um fragmento de dAb (Wardet al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio Vh; e umaregião de determinação dé complementaridade isolada (CDR).

Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv1 Vl eVH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um Iigante sintético que os capacita a seremproduzidos como uma cadeia de proteína simples na qual o par de regiõesVl e Vh para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de ca-deia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426;e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85:5879-5883). Tais anticorposde cadeia simples são também pretendidos para serem envolvidos dentro dotermo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos deanticorpo são obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas por a-queles versados na técnica, e os fragmentos são classificados para utilidadena mesma maneira conforme são os anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", conforme aqui usado, refere-se a umanticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especifici-dades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se ligaum animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcro-mossomal para genes de imunoglobulina humanos, ou um hibridoma prepa-rado dos mesmos, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfor-mada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfecto-ma, anticorpos isolados de um recombinante, biblioteca de anticorpo huma-no combinatorial, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isoladospor outros meios que envolvem união de todo ou uma porção de um gene deimunoglobulina humano, seqüências para outras seqüências de DNA. Taisanticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regi-ões de estrutura e de CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulinade linha de germe humanas. Em certas concretização, contudo, tais anticor-pos humanos recombinantes podem ser objetivados para mutagênese invitro (ou, quando um transgênico de animal para seqüências humanas de Igé usado, mutagênese somática in vivo) e, desse modo, as seqüências deaminoácidos das regiões Vh e VLdos anticorpos recombinantes são seqüên-cias que, enquanto derivadas de e relacionadas a seqüências de linha degerme humana Vh e VL, não podem existir naturalmente dentro do repertóriode linha de germe de anticorpo humano in vivo.

Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo em que(a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída outrocada de modo que o local de ligação de antígeno (região variávél) estejaligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, funçãoefetuadora e/ou espécies, ou uma molécula totalmente diferente que conferenovas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxi-na, hormônio, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ouuma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada com uma regiãovariável tendo uma especificidade de antígeno diferente ou alterada. Por e-xemplo, conforme mostrado nos Exemplos abaixo, um anticorpo anti-hTSLPR de camundongo pode ser modificado pela substituição de sua regi-ão constante com a região constante de uma imunoglobulina humana. Devi-do à substituição com uma região constante humana, o anticorpo quiméricopode reter sua especificidade no reconhecimento da TSLPR humana, en-especificamente a TSLPR é substancialmente livre de anticorpos que se li-gam especificamente a antígenos outros do que TSLPR). Um anticorpo iso-lado que se liga especificamente a TSLPR pode, contudo, ter reatividadetransversal a outros antígenos, tais como moléculas de TSLPR de outrasespécies. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmentelivre de outro material e/ou químicos celulares.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal", conforme aqui usados, referem-se a uma preparação de molé-culas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição deanticorpo monoclonal revela uma especificidade simples de ligação e afini-dade para um epítopo particular.

O termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, é pretendidopara incluir anticorpos tendo regiões variáveis em que ambas as regiões deestrutura e de CDR são derivadas de seqüências de origem humana. Alémdisso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante tam-bém é derivada de tais seqüências humanas, por exemplo, seqüências delinha de germe humanas, ou versões que sofreram mutação de seqüênciasde linha de germe humanas. Os anticorpos humanos da invenção podemincluir resíduos de aminoácido não codificados por seqüências humanas (porexemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômica ou específicade local in vitro, ou por mutação somática in vivo).

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorposque revelam uma especificidade simples de ligação que tem regiões variá-veis nas quais ambas as regiões de estrutura e de CDR são derivadas deseqüências humanas. Em uma concretização, os anticorpos monoclonaishumanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida deum animal não-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgê-nico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesadahumano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui usa-do, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, cri-ados ou isolados por meios recombinarites, tais como anticorpos isolados dequanto apresenta antigenocidade reduzida em humano, conforme compara-do ao anticorpo de camundongo original.

Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que retém a reativi-dade de um anticorpo não-humano, enquanto é menos imunogênico em hu-manos. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela retenção de regiões deCDR não-humanas, e substituição das partes remanescentes do anticorpocom suas contrapartes humanas (isto é, a região constante, bem como asporções de estrutura da região variável). Ver, por exemplo, Morrison et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immu-noi, 44:65-92, 1988; Verhoeyen et ai, Science, 239:1534-1536, 1988; Pad-lan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Outros exemplos de tecnologia de engenharia humana incluem,mas não estão limitados a tecnologia Xoma revelada na Patente dos Esta-dos Unidos Ns 5.766.886.

O termo "Humaneering", conforme aqui usado, refere-se a ummétodo para converter anticorpos não-humanos em anticorpos humanosprojetados (Ver, por exemplo, KaIoBios' Humaneering™ technology).

Conforme aqui usado, "isotipo" se refere à classe de anticorpo(por exemplo, IgM, IgE, IgG, tais como IgGI ou lgG4) que é provida pelosgenes de região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo de reconhecimento de um antígeno", e "um anticorpo específico para um antígeno", são usadas permutavelmenteaqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

Conforme aqui usado, um anticorpo que "especificamente se ligaa uma TSLPR humana" refere se a um anticorpo que se liga a TSLPR hu-mana com uma Kd de 200 χ 10"12 M ou menos, 150 χ 10'12 M ou menos, ou100 χ 10"12 M ou menos.

O termo "especificidade de ligação", conforme aqui usado, refe-re-se à capacidade de um local de combinação de anticorpo individual reagircom somente um determinante antigênico. O local de combinação do anti-corpo está localizado na porção de Fab da molécula, e é construído a partirdas hiper-regiões variáveis das cadeias pesadas e leves. A afinidade de Ii-gação de um anticorpo é a resistência da reação entre um determinante an-tigênico simples e um local de combinação simples no anticorpo. Ela é asoma das forças atrativas e repulsivas que operam entre o determinante an-tigênico e o local de combinação do anticorpo. A afinidade é a constante deequilíbrio que descreve a reação antígeno-anticorpo.

A ligação específica entre duas entidades significa uma ligaçãocom uma constante de equilíbrio (Ka) de pelo menos 1 χ IO7M'1, IO8M"1, 109M'1, ou 1010 M'1. A frase "especificamente (ou seletivamente) se liga" a umanticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-hTSLPR) refere-se a uma reaçãode ligação que é determinante da presença de um antígeno cognato (porexemplo, um polipeptídeo de TSLPR humana) em uma população heterogê-nea de proteínas e outros biológicos. Em adição à constante de equilíbrio(Ka) notada acima, um anticorpo anti-hTSLPR da invenção tipicamente tam-bém tem uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 1 χ 10"2s'1, 1 χ 10"3s"1, 1 χ 10"4s"1, ou mais baixa, e se liga a uma TSLPR humana com uma afi-nidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para liga-ção a um antígeno não-específico (por exemplo, BSA). As frases "um anti-corpo que reconhece um antígeno", e "um anticorpo específico para um an-tígeno", são usados permutavelmente aqui com o termo "um anticorpo quese liga especificamente a um antígeno".

O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capazde se ligar especificamente a um anticorpo. Epítopos usualmente consistemem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais co-mo aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e usualmente têm caracterís-ticas estruturais tridimensionais específicas, bem como características decarga específicas. Epítopos conformacionais e não-conformacionais são dis-tinguidos em que a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na pre-sença de solventes de desnaturação.

O termo "ácido nucléico" é usado aqui permutavelmente com otermo "polinucleotídeo", e refere-se a deoxirribonucleotídeos ou ríbonucleotí-deos e polímeros dos mesmos na forma trançada ou simples ou dupla. Otermo envolve ácidos nucléicos contendo análogos de nucleotídeo conheci-dos, ou resíduos de cadeia principal modificados ou ligações, que são sinté-ticos, ocorrem naturalmente, e ocorrem não-naturalmente, que têm proprie-dades de ligação similares como o ácido nucléico de referência, e que sãometabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. E-xemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforami-datos, fosfonatos de metila, metila fosfonatos de quiral-, 2-0-metila ribonu-cleotídeos, ácidos peptídeo-nucléicos (PNAs).

A menos que de outro modo indicado, uma seqüência de ácidonucléico particular envolve também implicitamente variantes conservativa-mente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degene-radas), e seqüências compíementares, bem como a seqüência explicitamen-te indicada. Especificamente, conforme detalhado abaixo, substituições decódon degeneradas podem ser alcançadas pela geração de seqüências emque a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) ésubstituída com resíduos de base misturados e/ou deoxiinosina (Batzer etal., Ácido nucléico Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608, 1985; e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos que ocorrem na-turalmente e sintéticos, bem como análogos de aminoácido, e amínoácidosmiméticos que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos que o-correm naturalmente. Os aminoácidos' que ocorrem naturalmente são aque-les codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos quesão mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato,e O-fosfoserina. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm amesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre natural-mente, isto é, uma carbono alfa que é ligado a um hidrogênio, a um grupocarboxila, a um grupo amino, e a um grupo R, por exemplo, homoserina, denorleucina, de metionina, sulfóxido de metil metionina de sulfônio. Tais aná-logos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina), ou suportes depeptídeo modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica comoum aminoácido que ocorre naturalmente. Aminoácidos miméticos referem-sea compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estruturaquímica geral de um aminoácido, mas que funcionam em uma maneira simi-lar a um aminoácido que ocorre naturalmente.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados permutavel-mente aqui para referirem-se a um polímero de resíduos de aminoácido. Ostermos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduosde aminoácido é um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorrenaturalmente correspondente, bem como a um polímero de aminoácido queocorre naturalmente, e polímero de aminoácido que não ocorre naturalmen-te. A menos que de outro modo indicado, uma seqüência de polipeptídeoparticular também envolve implicitamente variantes conservativamente modi-ficadas da mesma.

O termo "variante conservativamente modificada" se aplica aambas as seqüências de aminoácido e de ácido nucléico. Com relação àsseqüências de ácido nucléico particulares, variantes conservativamente mo-dificadas referem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam idêntica ou es-sencialmente seqüências idênticas de aminoácidos, ou onde o ácido nucléi-co não codifica uma seqüência de aminoácido, para seqüências essencial-mente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande nú-mero de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dadaproteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificamo aminoácido alanina. Desse modo, em toda posição onde uma alanina éespecificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer doscódons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado.

Tais variações de ácido nucléico são "variações mudas", que são uma espé-cie de variações conservativamente modificadas. Toda seqüência de ácidonucléico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve toda variaçãomuda possível do ácido nucléico. Um versado na técnico reconhecerá quecada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é ordinariamente o úni-co códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon paratriptofano), pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmenteidêntica. Conseqüentemente, cada variação muda de um ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo está implícita em cada seqüência descrita.Por seqüências de polipeptídeo, "variantes conservativamentemodificadas" incluem substituições individuais, retiradas ou adições a umaseqüência de polipeptídeo que resultam na substituição de um aminoácidocom um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conser-vativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem-conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas sãoem adição a, e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespé-cies, e alelos da invenção. Os seguintes oito grupos contêm aminoácidosque são substituições conservativas para um outro:

1) Alanina (A), Glicina (G);2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);3) Asparagina (N), Glutamina (Q);4) Arginina (R), Lisina (K);5) Isoleucina (I), Leucina (L)1 Metionina (M), Valina (V);6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W);7) Serina (S), Treonina (T); e8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins(1984)).

Os termos "idêntica", ou percentagem de "identidade," no con-texto de dois ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos, refe-rem-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas.Duas seqüências são "substancialmente idênticas" se duas seqüências têmuma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeosque são os mesmos (isto é, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade sobre uma região especi-ficada, ou, quando não especificada, sobre a seqüência total), quando com-parada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de com-paração, ou região designada conforme medida usando-se um dos seguin-tes algoritmos de comparação de seqüência, ou por alinhamento manual einspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que épelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) em comprimento,ou mais preferivelmente sobre uma região que é 100 a 500 ou 1000 ou maisnucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) em comprimento.

Por comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência agecomo uma seqüência de referência, a qual seqüências de teste são compa-radas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüência, as se-qüências de testes e de referência são admitidas em um computador, coor-denadas de subseqüência são designadas, se necessário, parâmetros deprograma de algoritmo de seqüência são designados. Parâmetros de pro-grama de falta podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem serdesignados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula apercentagem dé identidades de seqüência para as seqüências testes relati-vas à seqüência de referência, baseado nos parâmetros de programa.

Uma "janela de comparação", conforme aqui usado, inclui refe-rência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguasselecionadas a partir do grupo consistindo em 20 a 600, usualmente cercade 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, emque uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência domesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem op-timamente alinhadas. Métodos de alinhamento de seqüências para compa-ração são bem-conhecidos na técnica. Alinhamento ótimo de seqüênciaspara comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homo-Iogia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appi Math. 2:482c, pelo algo-ritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970, pela pesquisa por método de similaridade de Pearson e Lip-man, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988, por implementações com-putadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA noWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Sci-ence Dr., Madison, Wl), ou alinhamento manual e inspeção visual (ver, porexemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)).

Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determi-nação de percentagem de identidade de seqüência e similaridade de se-qüência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Alts-chul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402,1977; e Altschul et al., J. MoL Biol.215:403-410, 1990, respectivamente. O software para realização de análisede BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotech-nology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares deseqüência de alta classificação (HSPs) pela identificação de palavras curtasde comprimento W na seqüência de questão, que ou se equipara ou satisfazalguma classificação limite de valor positivo T quando alinhada com umapalavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T éreferido como o limite de classificação de palavra vizinha (Altschul et al., su-pra). Estes acertos de palavra vizinha inicial agem como sementes para ini-cialização de pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo asmesmas. Os acertos de palavra são entendidos em ambas as direções aolongo de cada seqüência assim que a classificação de alinhamento cumula-tivo possa ser aumentada. As classificações cumulativas são calculadas u-sando-se, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (classificaçãode retribuição para um par de resíduos de equiparação; sempre > 0) e N(classificação de penalidade para resíduos de desequiparação; sempre < 0).

Para seqüência de aminoácidos, uma matriz de classificação é usada paracalcular a classificação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra emcada direção é cessada quando: a classificação de alinhamento cumulativo/ cai pela quantidade X a partir de seu valor alcançado máximo; a classifica-ção cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou maisalinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o final de qualquerseqüência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e Xdeterminam a sensitividade e velocidade do alinhamento. O programaBLASTN (para seqüências de nucleotídeo) usa como faltas um comprimentode palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma compa-ração de ambos os filamentos. Para seqüências de aminoácidos, o progra-ma BLASTP usa como faltas um comprimento de palavra de 3, e expectativa(E) de 10, e a matriz de classificação de BLOSUM62 (ver Henikoff e Heni-koff, Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:10915, 1989) alinhamentos (B) de 50,expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamen-tos.

O algoritmo de BLAST também realiza uma análise estatísticada similaridade entre duas seqüências {ver, por exemplo, Karlin e Altschul,Proc. Nati Acad. Sei. USA 90:5873-5787, 1993). Uma medida de similarida-de provida pelo algoritmo de BLAST é a menor probabilidade de soma(P(N))1 que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma equi-paração entre dois nucleotídeos ou seqüências de aminoácido ocorreria porchance. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma se-qüência de referência se a menor probabilidade de soma em uma compara-ção do ácido nucléico de teste para o ácido nucléico de referência é menordo que cerca de 0,2, mais preferivelmente menos do que cerca de 0,01, e,mais preferivelmente, menos do que cerca de 0,001.

Outra percentagem de identidade de seqüência notada acimadiferente, outra indicação que duas seqüências de ácido nucléico ou polipep-tídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado peloprimeiro ácido nucléico é imunologicamente reativo cruzado com os anticor-pos elevados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico,conforme descrito abaixo. Desse modo, um polipeptídeo é tipicamente subs-tancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os doispeptídeos diferem somente por substituições conservativas. Outra indicaçãoque duas seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênticas éque as duas moléculas ou seus complementos hibridizam uma à outra sobcondições severas, conforme descrito abaixo. Ainda outra indicação que du-as seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênticas é que osmesmos prímeres podem ser usados para amplificar a seqüência.

O termo "operavelmente ligado" refere-se a um relacionamentofuncional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo,DNA). Tipicamente, ele refere-se ao relacionamento funcional de uma se-qüência regulatória transcricional para uma seqüência transcrita. Por exem-plo, uma seqüência promotora ou intensificadora é operavelmente ligada auma seqüência de codificação se ela estimula ou modula a transcrição daseqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada, ou outrosistema de expressão. Geralmente, as seqüências regulatórias transcricio-nais que são operavelmente ligadas a uma seqüência transcrita são fisica-mente contíguas à seqüência transcrita, isto é, elas são de ação eis. Contu-do, algumas seqüências regulatórias transcricionais, tais como intensificado-ras, não necessitam ser fisicamente contíguas ou localizadas em proximida-de às seqüências de codificação cuja transcrição elas intensificam.

O termo "vetor" é pretendido para referir-se a uma molécula depolinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual ela foiligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um laço de DNAfilamentado duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem serligados. Outro tipo de vetor é um vetorviral, no qual segmentos de DNA adi-cionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes dereplicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzi-dos (por exemplo, vetores bacteriais tendo uma origem bacterial de replica-ção, e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, veto-res de mamífero não-epissomais) podem ser integrados no genoma de umacélula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e, desse modo, sãoreplicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores sãocapazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operati-vamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expres-são recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral,os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante sãofreqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados permutavelmente como o plasmí-deo que é a forma mais comumente usada de vetor. Contudo, a invenção épretendida para incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais comovetores virais (por exemplo, retrovírus defectivos de replicação, adenovírus evírus adeno-associados), que servem para funções equivalentes.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente"célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual um vetor de expressãorecombinante foi introduzido. Deve ser compreendido que tais termos sãopretendidos para referirem-se não somente à célula objeto particular, mas àprogenia de tal célula. Devido a certas modificações poderem ocorrer emgerações sucessivas devido a sua mutação ou influências ambientais, talprogenia não pode, de fato, ser idêntica à célula de origem, mas estão aindaincluídas dentro do escopo do termo "célula hospedeira", conforme aqui u-sado.

O termo "doença ou condição inflamatória" refere-se a qualquercondição caracterizada por inflamação local em um local de dano ou infec-ção, e inclui doenças auto-imunes, certas formas de estados inflamatóriosinfecciosos, característica de atividade de neutrofil indesejável de transplan-tes de órgão, ou outros implantes, e virtualmente qualquer outra condiçãocaracterizada pelo acúmulo de neutrofil indesejado em local de tecido local.Estas condições incluem, mas não estão limitadas a, meningite, edema ce-rebral, artrite, nefrite, síndrome de angústia respiratória adulta, pancreatite,miosite, neurite, doenças de tecido conectivo, plebite, arterite, vasculite, a-lergia, anafilaxia, erlichiose, gota, transplantes de órgão e/ou colite ulcerati-va.

O termo "indivíduo" inclui animais humanos e não-humanos. A-nimais não-humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferose não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelha, cão, vaca, gali-nhas, anfíbios, e répteis. Exceto quando notado, os termos "paciente" ou"indivíduo" são usados aqui permutavelmente.

O termo "tratamento" inclui a administração de compostos ouagentes para prevenir ou retardar o começo dos sintomas, complicações, ouindícios bioquímicos de uma doença (por exemplo, uma doença inflamatóriaalérgica), aliviar os sintomas ou suspender ou inibir desenvolvimento adicio-nal da doença, condição, ou distúrbio. O tratamento pode ser profilático (pa-ra prevenir ou retardar o começo da doença, ou prevenir a manifestação desintomas clínicos ou subclínicos dos mesmos), ou supressão ou alívio tera-pêutico de sintomas após a manifestação da doença.

A frase "trajetória de transdução de sinal", ou "trajetória de sina-lização" (por exemplo, a trajetória de sinalização TSLP) refere-se a pelo me-nos uma reação bioquímica, mas mais comumente uma série de reaçõesbioquímicas, que resultam de interação de uma célula com um composto ouagente estimulatório. Desse modo, a interação de um composto estimulató-rio (por exemplo, TSLP) com uma célula gera um "sinal" que é transmitidoatravés da trajetória de transdução de sinal, ultimamente resultando em umaresposta celular, por exemplo, uma reposta imune.

II. AnticorposAntagonistascontraTSLPRHumana

1. Visão Geral

A invenção proporciona anticorpos que se ligam especificamentea TSLPR humana. Estes anticorpos anti-hTSLPR são capazes de antagoni-zar atividades de sinalização mediadas por TSLP, por exemplo, proliferaçãode célula mediada por TSLP, conforme descrito nos Exemplos abaixo. Méto-dos gerais para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais sãobem-conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibo-dies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S-pring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein1 Nature 256:495-497, 1975;Kozbor et ai., Immunology Today 4:72, 1983; e Cole et ai, pp. 77-96 in Mo-noclonal Antibodies e Câncer Therapy, 1985.

Preferivelmente, os anticorpos anti-hTSLPR da invenção sãoanticorpos monoclonais de camundongo similares a monoclonais que ocor-rem contra TSLPR humana (clone 1D6.C9), conforme descrito nos Exemplosabaixo. Anticorpos monoclonais referem-se a anticorpos derivados de umclone simples. Qualquer técnica para produção de anticorpo monoclonal po-de ser empregada para produzir anticorpos anti-hTSLPR da invenção, porexemplo, transformação oncogênica ou viral de linfócitos B. Um sistema deanimal para preparação de hibridomas é o sistema de murino. A produçãode hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem-estabelecido.Conforme ilustrado nos Exemplos abaixo, anticorpos monoclonais anti-hTSLPR podem ser gerados pela imunização de um animal não-humano(por exemplo, camundongo) com um polipeptídeo de hTSLPR, ou um frag-mento, proteína de fusão, ou variante dos mesmos. As células B isoladas apartir do animal são, em seguida, fundidas em células de mieloma para gerarhibridomas de produção de anticorpo. Os anticorpos monoclonais anti-hTSLPR de camundongo podem ser obtidos por classificação dos hibrido-mas em um ensaio ELISA usando-se um polipeptídeo de hTSLPR ou proteí-na de fusão. Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esple-nócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Co-participantesde fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos defusão são também bem-conhecidos na técnica, por exemplo, Harlow & Lane,supra.

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeiapesada (SEQ ID NO: 5) e de cadeia leve (SEQ ID NO: 6) do anticorpo anti-TSLPR de camundongo exemplar descritas nos Exemplos abaixo são mos-tradas na figura 5. Também conforme indicado na figura, as seqüências deCDR da região variável de cadeia pesada deste anticorpo são TYGMS (C-DR1; SEQ ID NO: 7), WlNTYSGVPRYADDFKG (CDR2; SEQ ID NO: 8), eEGFITTVVGAAGRFVY (CDR3; SEQ ID NO: 9). As seqüências de CDR daregião variável de cadeia leve são KASQDVGTAVA (CDR1; SEQ ID NO:10), WASTRHT (CDR2; SEQ ID NO: 11), e QQYSTYPT (CDR3; SEQ ID NO:12).

Os anticorpos interagem com antígenos predominantemente a-través de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões dedeterminação de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve (C-DR's). Tipicamente, os anticorpos anti-hTSLPR da invenção têm pelo menosuma de suas seqüências de CDR de cadeia pesada ou de cadeia leve idên-tica às seqüências de CDR correspondentes mostradas na figura 5. Algunsdestes anticorpos anti-hTSLPR da invenção têm a mesma especificidade deligação conforme aquela do anticorpo anti-TSLPR de camundongo exempli-ficado (clone 1 D6.C9) revelada nos Exemplos abaixo. Estes anticorpos po-dem competir com o anticorpo anti-hTSLPR de camundongo (clone 1D6.C9)para ligação à hTSLPR. Alguns anticorpos anti-hTSLPR da invenção têmtodas as seqüências de CDR em suas regiões variáveis de cadeia pesada ede cadeia leve respectivamente idênticas às seqüências de CDR correspon-dentes mostradas na figura 5. Desse modo, estes anticorpos anti-hTSLPRtêm as três seqüências de CDR de cadeia pesada respectivamente idênticasa SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 9, e as três seqüências deCDR de cadeia leve respectivamente idênticas a SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11, e SEQ ID NO: 12.

Em adição a ter-se seqüências de CDR respectivamente idênti-cas às seqüências de CDR correspondentes do anticorpo anti-hTSLPR decamundongo (clone 1D6.C9), alguns dos anticorpos anti-hTSLPR da inven-ção têm seqüências de região variável de cadeia pesada e de cadeia levetotais respectivamente idênticas às seqüências de região variável corres-pondentes do anticorpo de camundongo conforme mostrado na figura 5 (istoé, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6). Em algumas outras concretizações, ou-tras do que as seqüências de CDR idênticas, os anticorpos contêm resíduosde aminoácido nas porções de estrutura das regiões variáveis que são dife-rentes dos resíduos de aminoácido correspondentes mostrados na figura 5(por exemplo, alguns dos anticorpos anti-hTSLPR humanizados descritosabaixo). Não obstante, estes anticorpos têm tipicamente suas seqüências deregião variável totais que são substancialmente idênticas (por exemplo, 75%,85%, 90%, 95%, ou 99%) às seqüências de região variável correspondentesconforme mostrado na figura 5.

Os anticorpos anti-hTSLPR da invenção podem ser um anticorpointacto que contém duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Eles podemtambém ser fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo intacto ouanticorpos de cadeia simples. Os anticorpos anti-hTSLPR da invenção inclu-em anticorpos produzidos em um animal não-humano (por exemplo, o anti-corpo anti-hTSLPR de camundongo mostrado na figura 5). Eles também in-cluem anticorpos modificados que são formas modificadas do anticorpo anti-hTSLPR de camundongo mostrado na figura 5. Freqüentemente, os anticor-pos modificados são anticorpos recombinantes que têm propriedades simila-res ou aperfeiçoadas relativas àquela do anticorpo de camundongo exempli-ficado. Por exemplo, o anticorpo de camundongo anti-hTSLPR exemplificadonos Exemplos abaixo pode ser modificado pela retirada da região constante,e substituindo-o com uma região constante diferente que pode conduzir àmeia-vida aumentada, por exemplo, méia-vida de soro, estabilidade ou afini-dade do anticorpo. Os anticorpos modificados podem ser criados, por exem-plo, pela construção de vetores de expressão que incluem as seqüências deCDR a partir do anticorpo de camundongo enxertado nas seqüências de es-trutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (Jones et al.,1986, Nature 321, 522-525). Tais seqüências de estrutura podem ser obtidasa partir de base de dados de DNA públicas.

Alguns dos anticorpos modificados são anticorpos quiméricosque contêm seqüências de imunoglobulina humana parciais (por exemplo,regiões constantes), e seqüências de imunoglobulina não-humana parciais(por exemplo, as seqüências de região variável de anticorpo de camundongoanti-hTSLPR mostradas na figura 5). Alguns outros anticorpos modificadossão anticorpos humanizados. Geralmente, um anticorpo humanizado tem umou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo de uma fonte que énão-humana. Métodos para humanização de anticorpos não-humanos sãobem-conhecidos na técnica, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos.5.585.089 e 5.693.762; Jones et al., Nature 321: 522-25, 1986; Riechmannet al., Nature 332: 323-27, 1988; e Verhoeyen et ai, Science 239: 1534-36,1988. Estes métodos podem ser prontamente empregados para gerar anti-corpos anti-hTSLPR humanizados da invenção pela substituição de pelomenos uma porção de uma CDR de um anticorpo não-humano anti-hTSLPRpara as regiões correspondentes de um anticorpo humano. Em algumasconcretizações, os anticorpos humanizados anti-hTSLPR da invenção têmtodas as três CDRs em cada cadeia de imunoglobulina a partir do anticorpode camundongo anti-hTSLPR mostrado na figura 5 enxertado nas regiões deestrutura humanas correspondentes.

Os anticorpos anti-hTSLPR descritos acima podem suportarsubstituições de aminoácido não-críticas, adições ou retiradas em ambas asregiões variáveis e constantes sem perda de especificidade de ligação oufunções efetuadoras, ou redução intolerável de afinidade de ligação. Usual-mente, os anticorpos incorporando tais alterações exibem identidade de se-qüência substancial para um anticorpo de referência (por exemplo, o anti-corpo de camundongo anti-hTSLPR mostrado na figura 5) do qual eles foramderivados. Por exemplo, as regiões variáveis de cadeia leve maduras de al-guns dos anticorpos anti-hTSLPR da invenção têm pelo menos 75% ou pelomenos 85% de identidade de seqüência para a seqüência da região variávelde cadeia leve madura do anticorpo anti-hTSLPR mostrado na figura 5. Simi-larmente, as regiões variáveis de cadeia pesada maduras dos anticorpostipicamente mostram pelo menos 75% ou pelo menos 85% de identidade deseqüência para a seqüência da região variável de cadeia pesada madura doanticorpo anti-hTSLPR mostrado na figura 5. Alguns dos anticorpos anti-hTSLPR modificados têm a mesma especificidade e afinidade aumentadacomparada ao anticorpo de camundongo anti-hTSLPR (clone 1D6.C9) mos-trado na figura 5. Usualmente, a afinidade dos anticorpos anti-hTSLPR (porexemplo, anticorpos humanizados) têm uma afinidade de ligação que é amesma ou melhor do que o anticorpo de camundongo original. A afinidadede ligação dos anticorpos modificados é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95% ou 100% do anticorpo de camundongo original.

2. Anticorpos anti-hTSLPR quiméricos e humanizados

Alguns dos anticorpos anti-hTSLPR da invenção são anticorposquiméricos (por exemplo, camundongo/humano) que são compostos de re-giões de um anticorpo não-humano anti-hTSLPR antagonistas junto comregiões de anticorpos humanos. Por exemplo, uma cadeia H quimérica podecompreender a região de ligação de antígeno da região variável de cadeiapesada do anticorpo de camundongo anti-TSLPR (por exemplo, a seqüênciamostrada em SEQ ID NO: 5) ligada a pelo menos uma porção de uma regiãoconstante de cadeia pesada humana. Esta cadeia pesada quimérica podeser combinada com uma cadeia L quimérica que compreende a região deligação de antígeno da região variável de cadeia leve do anticorpo de ca-mundongo anti-hTSLPR (por exemplo, a seqüência mostrada em SEQ IDNO: 6) ligada a pelo menos uma porção da região constante de cadeia levehumana.

Os anticorpos anti-hTSLPR quiméricos da invenção podem serproduzidos de acordo com a descrição nos Exemplos abaixo, bem como mé-todos conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica a cadeiapesada ou cadeia leve de uma molécula monoclonal de anticorpo anti-hTSLPR de murino pode ser digerido com enzimas de restrição para remo-ver a região Fc de murino, e substituído com a porção equivalente de umgene que codifica uma região constante Fc humana. Os vetores de expres-são e células hospedeiras adequadas para expressão de anticorpos recom-binantes e anticorpos humanizados em particular, são bem-conhecidos natécnica. Os vetores que expressam genes quiméricos que codificam cadeiasde imunoglobulina anti-hTSLPR podem ser construídos usando-se técnicasrecombinantes padrões, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001); e Brent et al.,Current Protocols in Molecular Blology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.,2003). As seqüências de região constante humanas podem ser selecionadasde várias fontes de referência, incluindo, mas não limitadas àquelas listadasem Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Editi-on, U.S. Department of Health e Human Services, U.S. Government PrintingOffice, 1991. Ensinamentos mais específicos de produção de anticorposquiméricos por recombináção de DNA foram também ensinados na técnica,por exemplo, Robinson et al., Publicação de Patente InternacionalPCT/US86/02269; Akira, et al., Publicação de Patente Européia 184.187;Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeu 171,496; Morrison et al., Pedidode Patente Europeu 173.494; Neubergeret ál., Publicação Internacional WO86/01533; Gabilly et al., Patente dos Estados Unidos Ns 4.816.567; Cabilly etal., Pedido de Patente Europeu 125.023; Better (1988) Science 240:1041-1043; Liu (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood (1985) Nature 314:446-449; Shaw (1988) J. Natl. Cancer Inst.80:1553-1559).

Anticorpos quiméricos que têm as variáveis de região totais deum anticorpo não-humano podem ser adicionalmente humanizados para re-duzir antigenicidade do anticorpo em ser humano. Isto é tipicamente acom-panhado pela substituição de certas seqüências ou resíduos de aminoácidonas variáveis de região Fv (regiões de estrutura ou regiões de não-CDR)com seqüências equivalentes ou resíduos de aminoácido de variáveis deregião Fv humanas. Estas seqüências adicionalmente substituídas ou resí-duos de aminoácido não são usualmente diretamente envolvidos na ligaçãode antígeno. Mais freqüentemente, a humanização de um anticorpo não-humano procede pela substituição somente das CDRs de um anticorpo não-humano (por exemplo, o anticorpo de camundongo mostrado na figura 5)para as CDRs em um anticorpo humano. Em alguns casos, isto é seguidopor substituição de alguns resíduos adicionais nas regiões de estrutura hu-manas com os resíduos correspondentes a partir do anticorpo doador não-humano. Tal enxerto adicional é freqüentemente necessário para aperfeiçoara ligação ao antígeno. Isto é porque anticorpos humanizados que somentetêm CDRs enxertadas de um anticorpo não-humano podem ter menos doque atividades de ligação perfeitas conforme comparados àqueles do anti-corpo doador não-humano. Desse modo, em adição às CDRs, os anticorposhumanizados anti-hTSLPR da invenção podem freqüentemente ter algunsresíduos de aminoácido na região de estrutura humana substituída com re-síduos correspondentes a partir do anticorpo doador não-humano (por e-xemplo, o anticorpo de camundongo mostrado na figura 5). Métodos parageração de anticorpos humanizados por substituição de CDR, incluindo crité-rios para seleção de resíduos de estrutura para substituição, são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, em adição à técnica acirriá notada comrelação à produção de anticorpos quiméricos, ensinamentos adicionais naprodução de anticorpos humanizados são providos em, por exemplo, Winteret al., Pedido de Patente Britânico GB 2188638A (1987), Patente dos Esta-dos Unidos 5.225.539; Jones (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al.,1988 Science 239:1534; e Beidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060. Asubstituição de CDR também pode ser efetuada usando-se mutagênese diri-gida de local de oligonucleotídeo conforme descrito em, por exemplo, WO94/10332 intitulado Humanized Antlbodies to Fc Receptórs for Immunoglobu-Iin G on Human Mononuclear Phagocytes.

Os anticorpos quiméricos ou anti-hTSLPR humanizados da in-venção podem ser imunoglobulinas monovalentes, divalentes ou polivalen-tes. Por exemplo, um anticorpo monovalente quimérico é um dímero (HL)formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes de dissul-fito com uma cadeia L quimérica, conforme notado acima. Um anticorpoquimérico divalente é um tetrâmero (H2 L2) formado por dois dímeros HL as-sociados através de pelo menos uma ponte de dissulfito. Um anticorpo qui-mérico polivalente é baseado em uma agregação de cadeias.

3. Anticorpos anti-hTSLPR Humanos

Em adição aos anticorpos quiméricos ou humanizados anti-hTSLPR, também incluídos na invenção estão anticorpos totalmente huma-nos que exibenri a mesma especificidade de ligação e afinidade de ligaçãocomparável ou melhor. Por exemplo, os anticorpos humanos podem ter asmesmas ou melhores características de ligação em relação àquelas de umanticorpo não-humano de referência que contém uma seqüência de regiãovariável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5, e a seqüência de região variá-vel de cadeia leve de SEQ ID NO: 6. Comparados aos anticorpos quiméricosou humanizados, os anticorpos humanos anti-hTSLPR da invenção têm an-tigenicidade adicionalmente reduzida quando administrados em indivíduoshumanos.

Os anticorpos humanos anti-hTSLPR podem ser gerados usan-do-se métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, um método invivo para substituição de uma região variável de anticorpo não-humano comuma região variável humana em um anticorpo, enquanto mantém as mes-mas ou proporciona melhores características de ligação em relação àquelasdo anticorpo não-humano, foi revelado no Pedido de Patente dos EstadosUnidos N2 de Série 10/778.726 (Publicação Ns 20050008625). O métodoocorre em substituição guiada por epítopo de regiões variáveis de um anti-corpo não-humano de referência com um anticorpo totalmente humano. Oanticorpo humano resultante geralmente não está relacionado estruturalmen-te ao anticorpo não-humano de referência, mas se liga ao mesmo epítopo nomesmo antígeno como o anticorpo de referência. Brevemente, a aproxima-ção de substituição de complementaridade guiada por epítopo em série écapacitada pelo ajuste de uma competição em células entre um "competidor"e uma biblioteca de híbridos diversos do anticorpo de referência ("anticorposde teste") para ligação à quantidades Iimitantes de antígeno na presença deum sistema de informação que responde à ligação de anticorpo de teste aantígeno. O competidor pode ser o anticorpo de referência ou derivado domesmo, tal como um fragmento de cadeia simples de Fv. O competidor podetambém ser um Iigante natural ou artificial do antígeno que se liga ao mesmoepítopo conforme o anticorpo de referência. Os únicos requerimentos docompetidor são que ele se liga ao mesmo epítopo conforme o anticorpo dereferência, e que ele compete com o anticorpo de referência para ligação deantígeno. Os anticorpos de teste têm uma região V de ligação de antígenoem comum a partir do anticorpo não-humano de referência, e a outra regiãoV selecionada aleatoriamente de uma fonte diversa, tal como uma bibliotecade repertório de anticorpos humanos. A região V comum a partir do anticor-po de referência serve como um guia, posicionando os anticorpos de testeno mesmo epítopo no antígeno, e na mesma orientação, de modo que sele-ção é inclinada em direção a fidelidade de ligação de antígeno mais alta parao anticorpo de referência. A identificação do domínio de ligação de TSLPRfoi identificada pelo mapeamento do epítopo, e é mostrada na figura 8. Oanticorpo de TSLPR se liga a um epítopo descontínuo.

Muitos tipos de sistema de informação podem ser usados paradetectar interações desejadas entre anticorpos de teste e antígeno. Por e-xemplo, fragmentos de informação de complementação podem estar ligadosa antígeno e anticorpo de teste, respectivamente, de modo que a ativaçãode informação por complementação de fragmento somente ocorre quando oanticorpo de teste se liga ao antígeno. Quando as fusões de anticorpo deteste e fragmento de informação de antígeno são co-expressas com umcompetidor, a ativação de informação torna-se dependente da capacidadedo anticorpo de teste para competir com o competidor, que é proporcional àafinidade do anticorpo de teste para o antígeno. Outros sistemas de informa-ção que podem ser usados incluem o reativador de um sistema de reativa-ção de informação auto-inibido (RAIR), conforme revelado no Pedido de Pa-tente dos Estados Unidos N2 de Série 10/208.730 (Publicação Ne20030198971), ou sistema de ativação competitivo revelado no Pedido dePatente dos Estados Unidos N9 de Série 10/076.845 (Publicação N9.20030157579).

Com o sistema de substituição de complementaridade guiadopor epítopo em série, seleção é feita para identificar células que expressamum anticorpo de teste simples junto com o competidor, antígeno, e compo-nentes de informação. Nestas células, cada anticorpo de teste compete um aum com o competidor para ligação a uma quantidade Iimitativa de antígeno.

A atividade da informação é proporcional à quantidade de antígeno ligado aoanticorpo de teste, que, por sua vez, é proporcional à afinidade do anticorpode teste para o antígeno e a estabilidade do anticorpo de teste. Os anticor-pos de teste são inicialmente selecionados na base de sua atividade relativaàquela do anticorpo de referência quando expresso como o anticorpo de tes-te. O resultado da primeira etapa de seleção é um conjunto de anticorpos"híbridos", cada um do qual sendo compreendido da mesma região V não-humana a partir do anticorpo de referência, e uma região V humana a partirda biblioteca, e cada um do qual se liga ao mesmo epítopo no antígeno co-mo o anticorpo de referência. Um de mais dos anticorpos híbridos selecio-nados na primeira etapa terá uma afinidade para o antígeno comparável aou mais alta do que aquela do anticorpo de referência.

Na segunda etapa dé substituição de região V, as regiões V hu-manas selecionadas na primeira etapa são usadas como guia para a sele-ção de substituições humanas para a região V de anticorpo não-humanoremanescente de referência com uma biblioteca diversa de regiões V huma-nas cognatas. Os anticorpos híbridos selecionados na primeira etapa podemtambém ser usados como competidores para a segunda etapa de seleção. Oresultado da segunda etapa de seleção é um conjunto de anticorpos total-mente humanos que diferem estruturalmente do anticorpo de referência,mas que competem com o anticorpo de referência para ligação ao mesmoantígeno. Alguns dos anticorpos humanos selecionados se ligam ao mesmoepítopo no mesmo antígeno como o anticorpo de referência. Entre estes an-ticorpos humanos selecionados, um ou mais se ligam ao mesmo epítopocom uma afinidade que é comparável a ou mais alta do que aquela do anti-corpo de referência.

Usando-se um dos anticorpos de camundongo ou quimérico an-ti-hTSLPR acima descrito como o anticorpo de referência, este método podeser prontamente empregado para gerar anticorpos humanos que se ligam aTSLPR humana com a mesma especificidade de ligação e a mesma ou me-lhor afinidade de ligação. Em adição, tais anticorpos humanos anti-hTSLPRpodem também ser comercialmente obtidos de companhias que produzemcostumeiramente anticorpos humanos, por exemplo, KaIoBios, Inc. (Mounta-inView, CA).

4. Outros tipos de anticorpos anti-hTSLPR

Os anticorpos anti-hTSLPR da invenção também incluem anti-corpos de cadeia simples, anticorpos bi-específicos e anticorpos multi-específicos. Em algumas concretizações, os anticorpos da invenção são an-ticorpos de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples contêm em umacadeia de polipeptídeo estavelmente dobrada simples as regiões de ligaçãode antígeno de ambas a cadeia pesada e a cadeia leve. Como tal, anticor-pos de cadeia simples tipicamente retêm a especificidade de ligação e afini-dade de anticorpos monoclonais, mas são de tamanho consideravelmentemenor do que imunoglobulinas clássicas. Para certas aplicações, os anticor-pos de cadeia simples anti-hTSLPR dá invenção podem proporcionar muitaspropriedades vantajosas conforme comparado a um anticorpo intacto anti-hTSLPR. Estes incluem, por exemplo, folga mais rápida a partir do corpo,maior penetração de tecido para ambas as imagem de diagnóstico e terapia,e uma diminuição significante na imunogenicidade quando comparada comanticorpos baseados em camundongo. Outros benefícios potenciais de usode anticorpos de cadeia simples incluem capacidades aumentadas de classi-ficação em métodos de classificação de alta produção, e o potencial paraaplicação não-parenteral.

Os anticorpos de cadeia simples anti-hTSLPR da invenção po-dem ser preparados usando-se métodos que foram descritos na técnica. E-xemplos de tais técnicas incluem aquelas descritas nas Patentes dos Esta-dos Unidos Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et ai, Métodos in Enzymo-Iogy 203:46-88, 1991; Shu et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7995-7999,1993; e Skerra et ai, Science 240:1038-1040, 1988.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona anticorposanti-hTSLPR derivados ou ligados a outra molécula funcional para gerar umamolécula biespecífica ou multi-específica que se liga a locais de ligação múl-tiplos, ou epítopos alvos. A molécula funcional inclui outro peptídeo ou prote-ína (por exemplo, uma citocina, um agente citotóxico, um agente estimulató-rio imune ou inibitório, um fragmento de Fab', ou outro fragmento de ligaçãode anticorpo conforme discutido acima). Por exemplo, um anticorpo anti-hTSLPR, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, pode ser funcional-mente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, asso-ciação não-covalente, ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas deligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mi-mético de ligação. Desse modo, os anticorpos anti-hTSLPR biespecíficos emulti-específicos da invenção compreendem pelo menos um anticorpo mo-noclonal anti-hTSLPR, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, comuma primeira especificidade de ligação para TSLPR humana e uma segundaespecificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. O segundo epítopoalvo pode ser um receptor de Fc, por exemplo, FcyRI humano, ou um recep-tor de Fcy humano. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas emulti-específicas capazes de se ligar ambos a FcyRI1 FcyR ou FceR que ex-pressam células efetuadoras (por exemplo, monócitos, macrófagos ou célu-las polimorfonucleares (PMNs)), e às células alvos que expressam TSLPRhumana (por exemplo, células dendríticas CD11c+ humanas. Estas molécu-las alvos multi-específicas (por exemplo, biespecíficas ou multi-específicas)de TSLPR humana que expressam células para células efetuadoras, e dis-paradoras de atividades de célula efetuadora mediadas por receptor Fc, taiscomo fagocitose de células que expressam TSLPR humana, citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina,ou geração de ânion peróxido.

As moléculas biespecíficas e multi-específicas anti-hTSLPR dapresente invenção podem ser produzidas por métodos que foram descritosna técnica. Estes incluem técnicas químicas (ver, por exemplo, Kranz, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 78:5807, 1981), técnicas de polidoma (ver, por exem-plo, Patente dos Estados Unidos 4.474.893), ou técnicas de DNA recombi-nantes. As moléculas biespecíficas e multi-específicas da presente invençãopodem também ser preparadas pela conjugação das especificidades deconstituinte, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e TSLPRanti-humana, usando-se métodos conhecidos na técnica, e conforme aquidescritos. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespe-cífica e multi-específica pode ser gerada separadamente e, em seguida, con-jugada para uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínasou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação po-de ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticula-ção incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SA-TA), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e 4-(N-maleimidome-til)ciclohexano-1-carboxilato sulfosuccinimidil (sulfo-SMCC). Quando as es-pecificidades de ligação são anticorpos (por exemplo, dois anticorpos huma-nizados), elas podem ser conjugadas via ligação de sulfidril das regiões dearticulação de terminal C das duas cadeias pesadas. A região de articulaçãopode ser modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidril,por exemplo, um, antes da conjugação.

A ligação das moléculas biespecíficas e multi-específicas a seusalvos específicos pode ser confirmada por ensaio imunoabsorvente ligado aenzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), ou um Ensaio Western Blot.Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos deproteína-anticorpo de interesse particular pelo emprego de um reagente eti-quetado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interes-se. Por exemplo, os complexos de anticorpo FcR podem ser detectados u-sando-se, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anti-corpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando-sequalquer de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticor-po pode ser radioativamente etiquetado e usado em um radioimunoensaio(RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The EndocrineSociety, março, 1986). O isótopo radioativo pode ser detectado por tais mei-os com o uso de um contador γ, ou um contador de cintilação, ou por auto-radiografia.

III. Polinucleotídeos, Vetores e Células Hospedeiras paraProdução de Anticorpos Anti-hTSLPR

A invenção proporciona polinucleotídeos substancialmente puri-ficados (DNA oü RNA) que codificam polipéptídeos compreendendo seg-mentos ou domínios das cadeias de anticorpo anti-hTSLPR descritas acima.Alguns dos polinucleotídeos da invenção compreendem a seqüência de nu-cleotídeo da região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 13,e/ou a seqüência de nucleotídeo de região variável de cadeia leve mostradaem SEQ ID NO: 14. Alguns outros polinucleotídeos da invenção compreen-dem seqüências de nucleotídeo que são substancialmente idênticas (porexemplo, pelo menos 65, 80%, 95%, ou 99%) às seqüências de nucleotídeode SEQ ID NO: 13, ou SEQ ID NO: 14. Quando expressos a partir de veto-res de expressão apropriados, polipeptídeos codificados por estes polinucle-otídeos são capazes de exibir capacidade de ligação de antígeno.

Também prõvidos na invenção são polinucleotídeos que codifi-cam pelo menos uma região CDR e usualmente todas as regiões CDR apartir da cadeia pesada ou leve do anticorpo anti-hTSLPR mostrado na figu-ra 5. Alguns outros polinucleotídeos codificam toda ou substancialmente to-da seqüência de região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve doanticorpo anti-hTSLPR mostrado na figura 5. Por exemplo, alguns destespolinucleotídeos codificam a seqüência de aminoácido da região variável decadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 5, e/ou a seqüência de aminoácidoda região variável de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 6. Devido à de-generação do código, uma variedade de seqüências de ácido nucléico codi-ficarão cada uma das seqüências de aminoácidos de imunoglobulina.

Os polinucleotídeos da invenção podem codificar somente a se-qüência de região variável de um anticorpo anti-hTSLPR. Eles podem tam-bém codificar ambas uma região variável e uma região constante do anticor-po. Algumas das seqüências de polinucleotídeo dos ácidos nucléicos da in-venção codificam uma seqüência madura de região variável de cadeia pesa-da que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 90%, ou99%) à seqüência madura de região variável de cadeia pesada do camun-dongo 1D6.C9 de anticorpo anti-hTSLPR mostrado em SEQ ID NO: 5. Al-gumas outras seqüências de polinucleotídeo codificam uma seqüência ma-dura de região variável de cadeia leve que é substancialmente idêntica àseqüência madura de região variável de cadeia leve do anticorpo de camun-dongo 1 D6.C9 mostrado em SEQ ID NO: 6. Algumas das seqüências de po-linucleotídeo codificam um polipeptídeo que compreende regiões variáveisde ambas a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo de camundongo.

Alguns outros polinucleotídeos codificam dois segmentos de polipeptídeoque respectivamente são substancialmente idênticos às regiões variáveis dacadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo de camundongo.

As seqüências de polinucleotídeo podem ser produzidas por sín-tese de DNA de fase sólida de novo, ou por mutagênese de PCR de umaseqüência existente (por exemplo, seqüências conforme descritas nos E-xemplos abaixo) que codifica um anticorpo anti-hTSLPR, ou seu fragmentode ligação. A síntese química direta de ácidos nucléicos pode ser acompa-nhada por métodos conhecidos na técnica, tais como o método de fosfotriés-ter de Narang et al., 1979, Meth. EnzymoL 68:90; o método de fosfodiésterde Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidi-to de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte desólido da Patente dos Estados Unidos No. 4.458.066. Introdução de muta-ções a uma seqüência de polinucleotídeo por PCR pode ser realizada con-forme descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principies e Applicationsfor DNA Amplification, H A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCRProtocoIsrA Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), AcademicPress, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Acid Nucleics Res. 19:967, 1991;e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.Também providos na invenção são vetores de expressão e célu-las hospedeiras para produção de anticorpos anti-hTSLPR descritos acima.Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os poli-nucleotídeos que codificam as cadeias de anticorpo anti-TSLPR, ou frag-mentos de ligação. Vetores de expressão ambos baseados em virais e não-virais podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospe-deira de mamífero. Os vetores não-virais e sistemas incluem plasmídeos,vetores epissomais, tipicamente com um cassete de expressão para expres-sar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais (ver, por exemplo, Har-rington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não-virais ú-teis para expressão dos polinucleotídeos anti-hTSLPR e polipeptídeos emcélulas de mamífero (por exemplo, humano) incluem pThioHis A, B & C,pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, CA), vetores deMPSV, e numerosos outros vetores conhecidos na técnica para expressãode outras proteínas. Vetores virais úteis incluem vetores baseados em retro-vírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus da herpes, vetores basea-dos em SV40, vírus de pâpilloma, vírus HBP Epstein Barr, vetores de vírusde vacina e vírus Semliki Forest (SFV). Ver, Brent et al., supra; Smith, Annu.Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al·, Cell68:143, 1992.

A escolha do vetor de expressão depende das células hospedei-ras pretendidas nas quais o vetor é para ser expresso. Tipicamente, os veto-res de expressão contêm um promotor e outras seqüências regulatórias (porexemplo, intensificadores) que são operavelmente ligadas aos polinucleotí-deos que codificam uma cadeia de anticorpo anti-hTSLPR ou fragmento. Emalgumas concretizações, um promotor induzível é empregado para prevenirexpressão de seqüências inseridas, exceto sob condições de indução. Ospromotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, IacZ, promotor demetalotioneína, ou um promotor de choque térmico. Culturas de organismostransformados podem ser expandidas sob condições de não-indução seminclinação da população para seqüências de codificação cujos produtos deexpressão são melhores tolerados pelas células hospedeiras. Em adição aospromotores, outros elementos regulatórios podem também ser requeridos oudesejados para expressão eficiente de uma cadeia de anticorpo anti-hTSLPR ou fragmento. Estes elementos tipicamente incluem um códon deiniciação de ATG e local de ligação de ribossoma adjacente ou outras se-qüências. Em adição, a eficiência de expressão pode ser aumentada pelainclusão de intensificadores apropriados ao sistema de célula em uso (ver,por exemplo, Scharf et al., Results ProbL Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittneret al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o intensificador SV40ou intensificador CMV podem ser usados para aumentar a expressão emcélulas hospedeiras de mamífero.

Os vetores de expressão podem também proporcionar uma po-sição de seqüência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusãocom polipeptídeos codificados por seqüências de anticorpo anti-hTSLPRinseridas. Mais freqüentemente, as seqüências de anticorpo anti-hTSLPRinseridas são ligadas a seqüências de sinal antes da inclusão no vetor. Osvetores a serem usados para receber seqüências que codificam anticorpoanti-hTSLPR de domínios variáveis de cadeia leve e pesada as vezes tam-bém codificam regiões constantes, ou partes destas. Tais vetores permitemexpressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiõesconstantes, conduzindo, desse modo, a produção de anticorpos intactos, oufragmentos destes. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias deanticorpo anti-hTSLPR podem ser ou procarióticas ou eucarióticas. E. coli éum hospedeiro procariótico útil para clonagem e expressão dos polinucleotí-deos da presente invenção. Outros hospedeiros microbiais adequados parauso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis, e outros enterobacteriaceae,tais como Salmonella, Serratia, e várias espécies Pseudomonas. Nesteshospedeiros procarióticos, podem-se também produzir vetores de expres-são, que tipicamente contêm seqüências de controle de expressão compatí-veis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Emadição, um número de uma variedade de promotores bem-conhecidos estarápresente, tais como o sistema promotor de lactose, um sistema promotor detriptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase, ou um sistema pro-motor de fago lâmbida. Os promotores tipicamente controlam a expressão,opcionalmente com uma seqüência de operador, e têm seqüências de localde ligação de ribossoma, e similares, para iniciar e completar transcrição etranslação. Outros micróbios, tais como levedura, podem também ser em-pregados para expressarem polipeptídeos anti-hTSLPR da invenção. Célu-las de insetos, em combinação com vetores de baculovírus, podem tambémser usadas.

Em algumas concretizações preferidas, células hospedeiras demamífero são usadas para expressarem e produzirem polipeptídeos anti-hTSLPR da presente invenção. Por exemplo, elas podem ser, ou linha decélula de hibridoma que expressam genes de imunoglobulina endógenos(por exemplo, o clone de hibridoma de mieloma 1 D6.C9, conforme descritonos Exemplos), ou uma linha de célula de mamífero abrigando um vetor deexpressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplifica-das abaixo). Estas incluem qualquer célula de animal ou humana normalmortal ou normal ou anormal imortal. Por exemplo, um número de linhas decélulas hospedeiras adequadas capazes de secretar imunoglobulinas intac-tas foi desenvolvido incluindo linhas de células CHO, várias linhas de célulaCos, células HeLa, linhas de célula de mieloma, células B transformadas ehibridomas. O uso de cultura de célula de tecido de mamífero para expressarpolipeptídeos' é discutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, FromGenes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Vetores de expressãopara células hospedeiras de mamíferos podem incluir seqüências de contro-le de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, e umintensificador (ver, por exemplo, Queen, et ai, Immunol. Rev. 89:49-68,1986), e locais de informação de processamento necessários, tais como lo-cais de ligação de ribossoma, locais de união de RIMA, locais de poliadenila-ção, e seqüências terminadoras transcricionais. Estes vetores de expressãousualmente contêm promotores derivados de genes de mamífero, ou de ví-rus de mamífero. Promotores adequados podem ser constitutivos, específi-cos de tipo de célula, específico de estágio, e/ou moduláveis ou reguláveis.Promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, o promotor de metalo-tioneína, o promotor tardio maior de adenovirus constitutivo, o promotor deMMTV induzível por dexametasona, o promotor SV40, o promotor MRP polll-I, o promotor MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível de tetraciclina(tal como o promotor de CMV prematuro imediato humano), o promotor deCMV constitutivo, e combinações de promotor-intensificador conhecidas natécnica.

Métodos para introdução de vetores de expressão contendo asseqüências de polinucleotídeo de interesse variam dependendo do tipo dehospedeiro celular. Por exemplo, transfecção de cloreto de cálcio é comu-mente utilizada para células procarióticas, pelo que tratamento com fosfatode cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celula-res. (Ver geralmente Sambrook, et ai, supra). Outros métodos incluem, porexemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformaçãomediada por lipossoma, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virosso-mas, imunolipossomas, conjugados de policátion:ácido nucléico, DNA ex-posto, virions artificiais, fusão á proteína estrutural VP22 do vírus da herpes(Elliot e O1Hare, Cell 88:223, 1997), agente de entendimento aumentado deDNA, e transdução ex vivo. Para produção de alto rendimento de longo pra-zo de proteínas recombinantes, expressão estável freqüentemente será de-sejada. Por exemplo, linhas de célula que expressam estavelmente cadeiasde anticorpo anti-hTSLPR ou fragmentos de ligação podem ser preparadasusando-se vetores de expressão da invenção que contêm origens virais dereplicação, ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador se-lecionável. Em seguida à introdução do vetor, as células podem ser permiti-das se desenvolverem por 1-2 dias em um meio enriquecido antes delas se-rem mudadas para meio seletivo. A proposta do marcador selecionável éconferir resistência à seleção, e sua presença permite crescimento de célu-las que expressam com sucesso as seqüências introduzidas no meio seleti-vo. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadasusando-se técnicas de cultura de tecido apropriadas ao tipo de célula.

IV. Propriedades dos Anticorpos Anti-hTSLPR

Uma vez que um anticorpo anti-hTSLPR acima descrito é ex-presso de um vetor de expressão em uma célula hospedeira, ou endogena-mente em um hibridoma, eles podem ser prontamente purificados do meiode cultura e células hospedeiras. Usualmente, cadeias de anticorpo são ex-pressas com seqüências de sinal e são, desse modo, liberadas para o meiode cultura. Contudo, se cadeias de anticorpo não são naturalmente secreta-das pelas células hospedeiras, as cadeias de anticorpo podem ser liberadaspelo tratamento com detergente moderado. As cadeias de anticorpo podem,em seguida, ser purificadas por métodos convencionais, incluindo precipita-ção com sulfato de amônia, cromatografia de afinidade para alvo imobiliza-do, cromatografia de coluna, eletroforese de gel, e similares. Estes métodossão bem-conhecidos e rotineiramente praticados na técnica, por exemplo,Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982; e Harlow & Lane,supra.

Por meio de exemplo, hibridomas selecionados que expressamanticorpos anti-hTSLPR da invenção podem ser desenvolvidos em frascosrotativos de dois litros para purificação monoclonal de anticorpo. Os sobre-nadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia de afi-nidade com proteína A-sefarose ou proteína G-sefarose (Pharmacia, Pisca-taway, NJ). IgG eluído pode ser verificado por eletroforese de gel e cromato-grafia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução tampãopode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por leitu-ra de OD28C). Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotase armazenados a -80°C.

Indiferente de seu método de preparação, os anticorpos mono-clonais anti-hTSLPR da presente invenção se ligam especificamente a hTS-LPR, ou um fragmento antigênico desta. Ligações específicas existem quan-do a constante de dissociação para ligação de anticorpo a hTSLPR, ou umfragmento antigênico deste, é < 1 μΜ, preferivelmente < 100 nM, e mais pre-ferivelmente < 1 nM. A capacidade de um anticorpo se ligar a hTSLPR podeser detectada por etiquetamento do anticorpo de interesse diretamente, ou oanticorpo pode ser desetiquetado, e a ligação detectada indiretamente usan-do-se vários formatos de ensaio intervalados. Ver, por exemplo, Harlow &Lane, supra. Os anticorpos tendo tal especificidade de ligação são mais simi-larmente para compartilhar as propriedades vantajosas exibidas pelo anti-corpo de camundongo 1D6.C9 anti-hTSLPR discutido nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos monoclonais anti-TSLPR da invenção são capa-zes de antagonizar as atividades de sinalização mediadas por TSLP. Estasatividades incluem, por exemplo, secreção de quimioquinas de atração deTh2 por células dendríticas, tais como TARC e MDC; ativação de célulasdendríticas, expansão de célula T CD4+ simples e polarização a um fenótipode Th2, produção de citocinas pró-alérgicas, tais como IL-4, IL-5, IL-13 TN-Fa. Um número de ensaios pode ser empregado para determinar se um an-ticorpo anti-hTSLPR pode inibir atividades celulares mediadas por TSLP.

Estes incluem, por exemplo, qualquer dos ensaios descritos nos Exemplos,tais como o ensaio de proliferação de célula usando células Ba/F3/hTSLPR/hlL7Ra, o ensaio de informação de Iuciferase usando células Ba/F3/ hTSL-PR/IL7Ra/Stat5-Luc, e o ensaio de secreção de TARC. Ensaios adicionaispara medição de atividades de sinalização de TSLP foram também descritosna técnica. Ver, por exemplo, Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001; eIsaksen et al., J lmmunol. 168:3288-94, 2002.

Em algumas concretizações, os anticorpos anti-hTSLPR da in-venção bloqueiam ou competem com a ligação de um anticorpo anti-hTSLPR de referência tendo seqüências de região variável mostradas nafigura 5 (por exemplo, o anticorpo de camundongo 1D6.C9, ou um anticorpoquimérico deste descrito nos Exemplos abaixo) para um polipeptídeo dehTSLPR. Estes podem ser anticorpos anti-hTSLPR totalmente humanosdescritos acima. Eles podem também ser outros anticorpos anti-hTSLPR decamundongo, quimérico ou humanizado que se ligam ao mesmo epítopocomo o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir coma ligação de anticorpo de referência indica que um anticorpo anti-hTSLPRsob teste se liga ao mesmo ou epítopo similar conforme aquele definido peloanticorpo de referência, ou a um epítopo que é suficientemente proximal aoepítopo ligado pelo anticorpo anti-hTSLPR de referência. Tais anticorpos sãoespecialmente similarmente para compartilhar as propriedades vantajosaspara o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com oanticorpo de referência pode ser determinada por, por exemplo, um ensaiode ligação de competição. Com um ensaio de ligação de competição, o anti-corpo sob teste é examinado pela capacidade de inibir ligação específica doanticorpo de referência a um antígeno comum, tal como polipeptídeo de TS-LPR. Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência para li-gação específica ao antígeno se um excesso do anticorpo teste substanci-almente inibe a ligação do anticorpo de referência. Inibição substancial signi-fica que o anticorpo de teste reduz a ligação específica do anticorpo de refe-rência usualmente por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, ou 90%.

Existem um número de ensaios de ligação de competição co-nhecidos que podem ser usados para avaliar a competição de um anticorpoanti-hTSLPR com o anticorpo de referência anti-hTSLPR para ligação a TS-LPR humana. Estes incluem, por exemplo, rádio-imunoensaio de fase sólidadireta ou indireta (RIA), imunoensaio de enzima de fase sólida direta ou indi-reta (EIA), ensaio de competição intercalado (ver Stahli et al., Methods inEnzymology 9:242-253, 1983); biotina-avidina EIA de fase sólida direta (verKirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986); ensaio etiquetado de fasesólida direta, ensaio intercalado etiquetado de fase sólida direta (ver Harlow& Lane, supra), RIA de etiqueta de fase sólida direta usando etiqueta 1-125(ver Morei et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988); biotin-avidin EIA de fasesólida direta (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); e RIA etiquetadadireta (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990). Tipicamente,tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sóli-da, ou células suportando qualquer deste, um anticorpo de teste não-etiquetado anti-hTSLPR e um anticorpo de referência etiquetado. A inibiçãocompetitiva é medida pela determinação da quantidade de etiqueta ligada àsuperfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Usualmente oanticorpo de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificadospelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorposque se ligam ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência, e anticor-pos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epíto-po ligado pelo anticorpo de referência para que um impedimento estéricoocorra.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-TSLPR sele-cionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado u-sando-se reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, reagentes dePierce, Rockford, IL). Estudos de competição usando anticorpos monoclo-nais não-etiquetados e biotinilados podem ser realizados usando-se placasELISA revestidas de polipeptídeo de TSLPR. Ligação de MAb biotiniladapode ser detectada com uma sonda de estrep-avidin-fosfatase alcalina. Paradeterminar o isotipo de um anticorpo anti-TSLPR purificado, isotipos ELISAspodem ser realizados. Por exemplo, cavidades de placas de microtitulaçãopodem ser revestidas com 1 μg/ml de IgG anti-humano durante a noite a4°C. Após bloqueio com 1% de BSA, as placas são reagidas com 1 μg/ml oumenos do anticorpo monoclonal anti-hTSLPR, ou controles de isotipo purifi-cados, à temperatura ambiente por uma a duas horas. As cavidades podem,em seguida, ser reagidas com ou IgGI humano ou sondas conjugadas defosfatase alcalina específica de IgM Humano. As placas são, em seguida,desenvolvidas e analisadas de modo que o isotipo do anticorpo purificadopossa ser determinado.

Para demonstrar ligação de anticorpos monoclonais anti-hTSLPR em células Vivas que expressam um polipeptídeo de hTSLPR, ci-tometria de fluxo pode ser usada. Brevemente, linhas de célula expressandohTSLPR (crescimento sob condições de crescimento padrões) podem sermisturadas com várias concentrações de um anticorpo anti-hTSLPR em PBScontendo 0,1% de BSA e 10% de soro fetal de bezerro, e incubadas a 37°Cpor 1 hora. Após lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti-humano etiquetado com Fluoresceina sob as mesmas condições como omanchamento de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas porinstrumento FACScan usando-se propriedades de luz e difusão lateral paraobterem-se células simples. Um ensaio alternativo usando-se microscopiade fluorescência pode ser usado (em adição a, ou ao invés de), o ensaio decitometria de fluxo. As células podem ser manchadas exatamente conformedescrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Este métodopermite visualização de células individuais, mas pode ter diminuído a sensiti-vidade dependendo da densidade do antígeno.

Os anticorpos anti-hTSLPR da invenção podem ser adicional-mente testados para reatividade com um polipeptídeo de hTSLPR ou frag-mento antigênico por Western blotting. Brevemente, polipeptídeos de hTSL-PR purificados ou proteínas de fusão, ou extratos de célula que expressamTSLPR podem ser preparados e objetivados para eletroforese de gel dodecilsulfito poliacrilamida de sódio. Após eletroforese, os antígenos separadossão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 10% desoro fetal de bezerro, e sondado com anticorpos monoclonais a serem testa-dos. Ligação de IgG humano pode ser detectada usando-se IgG anti-humano fosfatase alcalina e desenvolvido tabletes de substrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

V. Suportes de Não-lmunoglobulina

Uma ampla variedade de anticorpo/estruturas ou suportes deimunoglobulina pode ser empregada considerando-se que o polipeptídeoresultante inclui pelo menos uma região de ligação que é específica para aproteína alvo. Tais estruturas ou suportes incluem os 5 idiotipos principais deimunoglobulinas humanas, ou fragmentos destas (tais como aqueles revela-dos em outra parte aqui), e incluem imunoglobulinas de outra espécie deanimal, preferivelmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeiapesada simples, tais como aqueles identificados em "camelids", são de inte-resse particular. Novas estruturas, suportes e fragmentos continuam a seremdescobertos e desenvolvidos por aqueles técnicos no assunto.

Em um aspecto, a invenção pertence à geração de anticorposbaseados em não-imunoglobulina usando-se suportes de não- imunoglobuli-na em que CDRs da invenção podem ser enxertadas. Estruturas e suportesde não-imunoglobulina conhecidos e füturos podem ser empregados, consi-derando-se que eles compreendem uma região de ligação específica para aproteína alvo de SEQ ID NO: X. Tais compostos são conhecidos aqui como"polipeptídeos compreendendo uma região de ligação de alvo específico".Estruturas e suportes de não-imunoglobulina conhecidos incluem, mas nãoestão limitados â, Adnectinas (fibronectin) (Compound Therapéutics, Inc.,Waltham, MA), ancyrina (Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), anti-corpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e Ablynx nv (Zwijnaarde,Belgium)), Iipocalin (AnticaIin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), Ϊ-munofarmacêuticos modulares pequenos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Se-attle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Proteína A (Affi-body AG, Sweden) e affilin (gama-cristallin ou ubiquitin) (Scil Proteins GmbH,Halle, Germany).

(i) Adnectinas - Compostos Terapêuticos

Os suportes adnectina são baseados em fibronectina de domíniotipo Ill (por exemplo, o décimo módulo do fibronectina tipo Ill (domínio 10Fn3). O fibronectina de domínio tipo Ill tem 7 ou 8 beta filamentos que sãodistribuídos entre duas folhas beta, que se âcondicionam entre si para for-mar o núcleo da proteína, e contendo adicionalmente laços (análogos a C-DRs) que conectam os beta filamentos entre si e são expostos a solvente.

Existem pelo menos três tais laços em cada borda da intercalação de folhabeta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção dos betafilamentos. (US 6,818,418). Estes suportes baseados em fibronectina nãosão uma imunoglobulina, embora a dobra total esteja proxímamente relacio-nada àquela do fragmento de anticorpo funcional menor, á região variável dacadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento de antígenototal em IgG de camelo e ilhama. Devido a esta estrutura, as propriedadesde ligação de antígeno imitadora de anticorpo de não-imunoglobulina quesão similares em natureza e afinidade àqueles anticorpos.

Estes suportes podem ser usados em randomização de laço, emisturando estratégia in vitro, que é similar ao processo de maturação deafinidade de anticorpos in vivo. Estas moléculas baseadas em fibronectinapodem ser usadas como suportes onde as regiões de laço da molécula po-dem ser substituídas CDRs da invenção usando-se técnicas de clonagempadrão.

(ii) Ancyrina - Co-participantes MolecularesA tecnologia é baseada no uso de proteínas com ancyrina deri-vada de módulos de repetição como suportes para regiões variáveis quepodem ser usadas para ligação a alvos diferentes. O módulo de repetição deancyrina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos consistindo em duas a-helicoidais antiparalelas e um giro β. A ligação das regiões variáveis é muitomais otimizada pelo uso de mostrador de ribossoma.

(iii) Maxicorpos/Avímeros - Avidia

Avímeros são derivados de domínio-A natural contendo proteínatal como LRP-1. Estes domínios são usados por natureza para interação deproteína-proteíría, e em ser humano acima de 250 proteínas são estrutural-mente baseados em domínios A. Os avímeros consistem em um numero demonômeros de "domínio-A" diferentes (2-10) ligados via Iigantes de aminoá-cido. Os avímeros podem ser criados, que podem se ligar ao antígeno alvousando-se a metodologia descrita em, por exemplo, 20040175756;20050053973; 20050048512; e 20060008844.

(vi) Proteína A - Affibody

Ligantes de afinidade Affibody® são proteínas pequenas, sim-ples, compostas de um conjunto de três hélices baseado no suporte de umdos domínios de ligação de IgG de Proteína A. A Proteína A é uma proteínade superfície a partir da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio desuporte consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são randomizados paragerar bibliotecas de Affibody® com um grande número de variantes de Iigan-te (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.831.012). Anticorpos deimitação de moléculas de Affibody® têm um peso molecular de 6 kDa, com-parado ao peso molecular dos anticorpos, que é 150 kDa. Apesar de seutamanho pequeno, o local de ligação de moléculas de Affibody® é similaràquele de um anticorpo.

(v) Anticalinas-Pieris

Anticalinas® são produtos desenvolvidos pela companhia PierisProteoLab AG. Eles são derivados de Iipocalinas1 um grupo difundido de pro-teínas pequenas e robustas que são usualmente envolvidas no transportefisiológico ou armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou in-solúveis. Várias Iipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líqui-dos corpóreos.

A arquitetura da proteína é reminiscente de imunoglobulinas,com laços hipervariáveis no topo de uma estrutura rígida. Contudo, em con-traste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, Iipocalinas sãocompostos de uma cadeia de polipeptídeo simples com 160 a 180 resíduosde aminoácido, sendo apenas marginalmente maior do que um domínio deimunoglobulina simples.

O conjunto de quarto laços, que compõe um pacote de ligação,mostra plasticidade estrutural pronunciada, e tolera uma variedade de cadei-as laterais. O local de ligação desse modo pode ser remoldado em um pro-cesso de proprietário de modo a reconhecer as moléculas alvos prescritasde forma diferente com alta afinidade e especificidade.

Uma proteína da família lipocalin, uma proteína de ligação bilin(BBP) de Pieris Brassicae foi usada para desenvolver anticalinas por muta-genização do conjunto de quatro laços. Um exemplo de um pedido de paten-te descrevendo "anticalinas" é PCT WO 199916873.

(vi) Affilin - Protepinas Scil

Moléculas de Affilin® são proteínas pequenas de não-imunoglobulina que são designadas para afinidades específicas em direçãoa proteínas'e moléculas pequenas. Novas moléculas de Affilin® podem sermuito rapidamente selecionadas de duas bibliotecas, cada uma da qual sen-do baseada em uma proteína de suporte derivada de ser humano diferente.

As moléculas Affilin® não mostram qualquer homologia estrutural para prote-ínas de imunoglobulina. As proteínas Scil empregam dois suportes de Affi-lin®, um dos quais é gama cristal lino, uma proteína de lente de olho estrutu-ral humana, e o outro são proteínas da superfamília da "ubiquitin". Ambos ossuportes humanos são muito pequenos, mostram alta estabilidade de tempe-ratura, e são quase resistentes a mudanças de pH e agentes de desnatura-ção. Esta alta estabilidade é principalmente devido à estrutura de folha betaexpandida das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas de gama cristali-no são descritos no W0200104144, e Exemplos de proteínas "similares aubiquitina" são descritos no W02004106368.

VI. Aplicações Terapêuticas dos Anticorpos Anti-hTSLPR

Os anticorpos anti-hTSLPR podem ser empregados em muitasaplicações terapêuticas ou profiláticas pela inibição das atividades de sinali-zação de TSLP. Estes incluem tratamento de doenças ou condições media-das por sinalização de TSLP, tais como aqueles que afetam o desenvolvi-mento de célula B, desenvolvimento de célula T1 rearranjo de gene receptorde célula T, ou regulação do fator de transcrição de Stat5. Por exemplo, osanticorpos antagonistas anti-hTSLPR podem ser empregados para suprimirou reduzir resposta imune mediada por célula TH2. Em particular, eles sãoadequados para tratamento de pacientes humanos que sofrem de distúrbiosinflamatórios alérgicos associados com ou mediadas por sinalização de TS-LP. As doenças inflamatórias alérgicas que são sensíveis ao tratamento comos anticorpos anti-hTSLPR da invenção incluem, por exemplo, (1) asma,uma doença inflamatória crônica das vias aéreas associadas com obstruçãode fluxo de ar e hipersensibilidade bronquial; (2) dermatite atópica, uma do-ença de pele inflamatória de exacerbação crônica que requer tratamentointermitente de longo prazo; e (3) rinite alérgica, um distúrbioinflamatória damucosa nasal, mediada por linfócitos TH2 que são ligados à atopia. Nos Es-tados Unidos e vários países da Europa, o predomínio diagnosticado paraasma, dermatite atópica e rinite alérgica é esperado aumentar de 46 milhõesno presente para 53 milhões, de 31,7 milhões no presente para 37,2 mi-lhões, e de 55,9 milhões no presente para 64,5 milhões em 2013, respecti-vamente. Cerca de 50 a 80 por cento dos pacientes com dermatite atópicaterão ou desenvolverão asma ou rinite alérgica.

Muitos fármacos atualmente disponíveis para o tratamento dealergias são objetivados na provisão de alívio sintomático, enquanto existerelativamente pouco esforço no campo da imunomodulação similarmentepara proporcionar modificação de doença de longo prazo. Os anticorpos an-ti-hTSLPR da invenção podem proporcionar tratamento de indivíduos novo eeficaz (esp., pacientes humanos) que sofrem de quaisquer destas doençasalérgicas. Impedindo-se TSLP de ativar a trajetória de transdução de sinal dereceptor de TSLP, elas podem bloquear a resposta de TH2 e a produção decitocinas responsáveis por ambas iniciação e manutenção de inflamaçãoalérgica. Conseqüentemente, esta aproximação tem o potencial de induzirum efeito terapêutico de longo prazo e o benefício de modificar a doença empacientes com dermatite atópica, asma e rinite alérgica.

Em outra concretização, a invenção proporciona uma composi-ção farmacêutica tendo pelo menos um de qualquer dos anticorpos acima oufragmentos funcionais ou variantes conservativas, e um veículo farmaceuti-camente aceitável, ou excipiente para este.

Em certas concretizações, a invenção proporciona um métodopara tratamento de um distúrbioou condição associada com a presença deuma célula tendo um hTSLP alvo receptor. O método envolve administrar aum indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de qualquer dascomposições farmacêuticas acima. Em uma concretização relacionada, odistúrbio ou condição a ser tratada é um distúrbiorespiratória.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éasma bronquial, que é uma doença inflamatóría persistente comum do pul-mão caracterizada por hiper-sensibilidade das vias aéreas (AHR), superpro-dução de muco, fibrose e níveis de IgE de soro elevados. Em outra concreti-zação, o distúrbio ou condição a ser tratada é dermatite atópica (alérgica),que é a doença de pele mais comum em criançâs, e é caracterizada por pru-rido intenso e placas eczematosas crônicas.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éselecionada de outras doenças e condições inflamatórias ou obstrutivas davia aérea, tais como COPD, dano agudo do pulmão (ALI), síndrome de an-gústia respiratória aguda/adulto (ARDS), dispnéia, inflamação alérgica da viaaérea, doença da via aérea pequena, carcinoma de pulmão, síndrome deseio aguda em pacientes com doença de célula e hipertensão pulmonar,bem como exacerbação de hiperatividade das vias aéreas conseqüente deoutra terapia de fármaco, em particular outra terapia de fármaco inalada.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada ébronquite de qualquer tipo ou gênese incluindo, por exemplo, bronquite agu-da, araquídica, catarral, "croupus", ou ftinóide.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratadainclui pneumoconiose (uma doença inflamatória, comumente ocupacional,dos pulmões, freqüentemente acompanhadas por obstrução das vias aé-reas, se crônica ou aguda, e ocasionada por inalação repetida de poeiras)de qualquer tipo de gênese, incluindo, por exemplo, aluminose, anthracosis,asbestose, chalicose, ptilose, siderose, silicose, tabacose e bissinose.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éselecionada a partir de rinite atópica (febre) e sinusite crônica.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éselecionada a partir de outras condições inflamatórias da pele, por exemplo,psoriase ou Iupus eritematose.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada édoença inflamatória do intestino, tais como colite ulcerativa e doença deCrohn.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éselecionada a partir de outras condições fibróticas, tais como esclerose sis-têmica, fibrose do fígado, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática oupulmão fibróide.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada érecorrência de tomou ou metástase. A inibição de citocinas Th2 foi mostradapara aumentar vacinas anti-virais em modelos de animal, e pode ser benéfi-ca no tratamento de HIV e outras doenças infecciosas [Ahlers, J. D. , et al.Proc Natl Acad Sci U S A, 2002].

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éuma infecção viral respiratória, que exacerba condições crônicas básicas taiscomo asma, bronquite crônica, COPD, otite média, e sinusite. A infecçãoviral respiratória tratada pode estar associada com infecção bactêrial secun-dária, tais como otite média, sinusite ou pneumonia.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada éselecionada a partir de outras doenças ou condições, em particular doençasou condições tendo um componente inflamatório, por exemplo, doenças doosso e juntas, incluindo artrite reumatóide, artrite psoriática, e outras doen-ças, tais como âterosclerose, esclerose múltipla, e rejeição de aloenxertoaguda ou crônica, por exemplo, seguindo transplante de coração, rim, fíga-do, pulmão ou medula óssea.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada échoque endotóxico, glomerulonefrite, isquemia cerebral e cardíaca, doençade Alzheimer, fibrose cística, infecções de vírus, e as exacerbações associ-adas com as mesmas, síndrome de deficiência imune adquirida (AIDS), es-clerose múltipla (MS), gastrite associada com Helicobacter pylori, e cânce-res, particularmente o crescimento de câncer ovariano.

Em outra concretização, o distúrbio ou condição a ser tratada é osintoma causado por infecção viral em um humano que é causada pelo rino-vírus humano, outros enterovírus, coronavírus, vírus da herpes, vírus da gri-pe, vírus de para-gripe, vírus sincitial respiratório, ou um adenovírus.

O tratamento de acordo com a presente invenção pode ser sin-tomático ou profilático.

A eficiência de um agente da invenção na inibição de condições in-flamatórias, por exemplo, nas doenças inflamatórias de vias aéreas, podeser demonstrada em um modelo de animal, por exemplo, modelo de camun-dongo, rato ou coelho de inflamação de via aérea, ou outras condições in-flamatórias, por exemplo, conforme descrito por Wada et al, J. Exp: Med(1994) 180:1135-40; Sekido et al, Nature (1993) 365:654-57; Modelska etal.,Am. J. fíespir. Crit. Care. Med (1999) 160:1450-56; e Laffon et al (1999) Am.J. Respir. Crít. Care Med. 160:1443-49.

Em ainda outra concretização, a invenção proporciona um método pa-ra identificação de uma célula tendo um receptor de hTSLP. Este métodoenvolve contactar a célula com qualquer dos anticorpos acima ou fragmen-tos de anticorpo tendo adicionalmente uma etiqueta detectável. A etiqueta éradioativa, fluorescente, magnética, paramagnética, ou quimioluminescente.O método adicionalmente pode envolver qualquer da imagem ou separaçãoacima da célula etiquetada.

Em outra concretização, quaisquer dos anticorpos humano ou huma-nizados acima ou fragmentos de anticorpo são sintéticos.

Em outra concretização, a invenção proporciona uma composiçãofarmacêutica e um agente terapêutico adicional.

O agente tarapêutico adicional pode ser selecionado a partir do grupoconsistindo em substâncias de fármaco antiinflamatório, broncodilatador,anti-histamina ou anti-tosse, particularmente no tratamento de doenças obs-trutivas ou inflamatórias das vias aéreas, tais como aquelas mencionadasaqui antes, por exemplo, como potenciadoras de atividade terapêutica detais fármacos, ou como um meio de reduzir dosagem requerida, ou efeitoscolaterais potenciais de tais fármacos. Um agente terapêutico da invençãopode ser misturado com as outras substâncias de fármaco em uma compo-sição farmacêutica fixa, ou pode ser administrado separadamente, antes,simultaneamente com, ou após a outra substância de fármaco. Conseqüen-temente, a invenção inclui uma combinação de um agente da invenção con-forme aqui antes descrito com uma substância de fármaco anti-inflamatória,broncodilatadora, anti-histamina ou antitosse, referido agente da invenção ereferida substância de fármaco estando na mesma ou em composição far-macêutica diferente.

Fármacos anti-inflamatórios adequados incluem esteróides, emparticular glucocorticosteróides, tais como budesonida, beclametasona di-propionato, fluticasona propionato, ciclesonida ou mometasona furoato, ouesteróides descritos nos WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO02/00679 (especialmente aquelas dos Exemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34,37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 e 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 e WO 04/66920; a-gonísticos receptors de glucocorticóide não-esteroidal, tais como aquelesdescritos em DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280,WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 e WO 04/26248; antagònistas deLTB4, tais como BIIL 284, CP-195543, DPC11870, LTB4 etanolamida, LY293111, LY 255283, CGS025Ò19C, CP-195543, ONO-4057, SB 209247,SC-53228, e aqueles descritos na US 5451700; tais antagònistas de LTD4incluem montelukast, pranlukast, zafirlukast, acolato, SR2640, Wy-48,252,ICI 198615, MK-571, LY-171883, Ro 24-5913 e L-648051; inibidores dePDE4, tais como cilomilast (Ariflo® GIaxoSmithKIine), Roflumilast (Byk Gul-den),V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofylline (Almirall Prodesfarma), PD189659 / PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (CeIgene),.SeICID(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vernalis), T-440 (Tanabe), KW-4490(Kyowa Hakko Kogyo), e aqueles revelados nos WO 92/19594, WO93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814,WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450,WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO04/019945, WO 04/045607 e WO 04/037805; Agonísticos de A2a, tais comoaqueles descritos em EP 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO94/17090, WO 96/02543, WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO99/24450, WO 99/24451, WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO99/67264, WO 99/67265, WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO00/78774, WO 01/23399, WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO01/94368, WO 02/00676, WO 02/22630, WO 02/96462, e WO 03/086408; eantagonistas de A2b, tais como aqueles descritos nos WO 02/42298.

Fármacos broncodilatadores adequados incluem agentes antico-linérgicos ou antimuscarínico, em particular brometo de ipratrópio, brometode oxitrópio, sais de tiotrópio e CHF 4226 (Chiesi), e glicopirrolato, mas tam-bém aqueles descritos nos EP 424021, US 3714357, US 5171744, WO01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 e WO 04/05285; eagonísticos beta-2 adrenoceptor, tais como albuterol (salbutamol), metapro-terenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol, e especialmente, formo-terol, carmoterol e sais farmaceuticamente aceitáveis destes, e compostos(na forma livre ou sal ou solvato) de fórmula I do WO 00/75114, cujo docu-mento é incorporado aqui por referência, preferivelmente compostos dosExemplos destes, especialmente o composto (5-[(R)-2-(5,6-Dietila-indan-2-ilamino)-1-hidróxi-etil]-8-hidróxi-1H-quinolin-2-ona) e sais farmaceuticamenteaceitáveis destes, bem como compostos (na forma livre ou sal ou solvato) defórmula I do WO 04/16601, e também compostos dos EP 1440966, JP05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, US 2002/0055651, WO 01/42193,WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/ 70490, WO 02/76933, WO 03/24439,WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764,WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768,WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618WO 04/46083, WO 04/80964, EP1460064, WO 04/087142, WO 04/089892,EP 01477167, US 2004/0242622, US 2004/0229904, WO 04/108675, WO04/108676, WO 05/033121, WO 05/040103 e WO 05/044787.

Fárrhacos duplos antiinflamatórios e broncodilatadores incluemagonístico duplo beta-2 adrenoceptor/antagomistas muscarínicos tais comoaqueles revelados nos US 2004/0167167, WO 04/74246 e WO 04/74812.

Substâncias de fármaco de anti-histamina incluem cloridrato decetirizina, acetaminofeno, clemastina fumarato, prometazina, loratidina, des-loratidina, difenhidramina e cloridrato de fexofenadina, activastina, astemizo-le, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina e tefenadina, bem como a-quelas reveladas nos JP 2004107299, WO 03/099807 e WO 04/026841.

Combinações de agentes terapêuticos da' invenção e agentesanticolinérgicos ou antimuscarínico, esteróides, beta-2 agonísticos, inibido-res de PDE4, agonísticos de receptor de dopamina, antagonitas de LTD4 ouantagonistas de LTB4 podem também ser usados. Outras combinações úteisde agentes da invenção com fármacos antiinflamatórias são aquelas comoutros antagonistas de receptores de quimioquina, por exemplo, CCR-1,CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXCR1,CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagomitas de CCR-5,tais como Schering-Plough antagonistas SC-351125, SCH-55700 e SCH-D,Takeda antagonistas tais como cloreto de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-metilfenil)-5H-benzociclohepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]-tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-amínio (TAK-770), antagonistas de CCR-5 descritos nos US6166037 (particularmente reivindicações 18 e 19), WO 0066558 (particular-mente reivindicação 8), WO 0066559 (particularmente reivindicação 9), WO04/018425 e WO 04/026873.

O agente terapêutico adicional pode também ser selecionado apartir do grupo consistindo em outras moléculas de ligação de çitocina, parti-cularmente anticorpos de outras citocinas, em particular uma combinaçãocom um anticorpo anti-lL4, tal como descrito no PCT/EP2005/00836, um an-ticorpo anti-IgE, tal como Xolair®, um anticorpo anti-IL31, um anticorpo anti-IL31R, um anticorpo anti-IL13, tais como descritos nos W005/007699, umanticorpo antiendoglina, um anticorpo anti-IL1b, um anticorpo anti-TSLP ououtro anticorpo anti-hTSLPR.

Os anticorpos antagonistâs anti-hTSLPR da invenção podem serempregados para tratar um indivíduo ambos terapeuticamente e profilatica-mente. Nas aplicações terapêuticas, uma composição compreendendo umanticorpo antagonista anti-hTSLPR (por exemplo, um anticorpo humanizadoanti-hTSLPR) é administrado a um indivíduo já afetado por uma doença a-lérgica causada por ou associada com sinalização de TSLP. A composiçãocontém o anticorpo em uma quantidade suficiente para curar, reprimir parci-almente, ou abaixar detectavelmente a progressão da condição, e suas com-plicações. Em aplicações profiláticas, composições contendo os anticorposmonoclonais anti-hTSLPR são administradas a um paciente que já não sofrede um distúrbioinflamatória alérgica. Preferivelmente, elas são dirigidas a umindivíduo que está em risco de, ou tem uma predisposição a desenvolvimen-to de um distúrbioinflamatória alérgica. Tais aplicações permitem que o indi-víduo aumente a resistência do paciente ou retarde a progressão de um dis-túrbioinflamatória alérgica mediada por sinalização de TSLP.

VII. Composições farmacêuticas

A invenção proporciona composições farmacêuticas compreen-dendo os anticorpos monoclonais anti-hTSLPR (fragmentos intactos ou deligação) formulados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável. Ascomposições podem adicionalmente conter outros agentes terapêuticos quesão adequados para o tratamento ou prevenção de um dado distúrbio alérgi-ca, por exemplo, os agentes anti-alérgicos conhecidos acima notados. Osveículos farmaceuticamente aumentam ou estabilizam a composição, ou pa-ra facilitar a preparação da composição. Veículos farmaceuticamente aceitá-veis incluem solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibac-teriais e antifungais, agentes de retardamento isotônico e de absorção, esimilares, que são fisiologicamente compatíveis.

A composição farmacêutica da presente invenção pode ser ad-ministrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/oumodo de administração varia dependendo dos resultados desejados. É pre-ferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,ou subcutânea, ou administrada proximal ao local do alvo. O veículo farma-ceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravenosa,intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo,por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o compostoativo, isto é, molécula de anticorpo bi-específica e multiespecífica, pode serrevestido em um material para proteger o composto a partir da ação de áci-dos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

A composição deve ser estéril e fluida. A fluidez correta pode sermantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, tal como lecitin, pela manu-tenção de tamanho de partícula requerido no caso de dispersão, ou pelo usode tensoãtivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto desódio na composição. Absorção de longo prazo das composições injetáveispode ser provida pela inclusão na composição de um agente que retarda aabsorção, por exemplo, monostearato de alumínio ou gelatina.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser prepara-das de acordo com métodos bem-conhecidos e rotineiramente praticados natécnica. Ver, por exemplo, Remington: The Science e Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; e Sustainede Controlled Release DrugDelivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.As composições farmacêuticas são preferivelmente fabricadas sob condi-ções de GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou eficaz doanticorpo anti-hTSLPR é empregada nas composições farmacêuticas da in-venção. Os anticorpos anti-hTSLPR são formulados em formas de dosagemfarmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos àque-les versados na técnica. Regimes de dosagem são ajustados para propor-cionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica).Por exemplo, uma massa simples pode ser administrada, várias doses divi-didas podem ser administradas com o tempo, ou a dose pode ser proporcio-nalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências dasituação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições pa-renterais na forma de dosagem unitária para facilidade de administração euniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária conforme aqui usa-da se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagensunitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém umaquantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o e-feito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico reque-rido.

Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas com-posições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modoa obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar aresposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, emodo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagemselecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluin-do a atividade das composições particulares da presente invenção empre-gada, ou o éster, sal ou amida deste, da via de administração, do tempo deadministração, da taxa de excreção do composto particular sendo emprega-do, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiaisusados em combinação com as composições particulares empregadas, daidade, sexo, peso, condição, história geral de saúde e médica anterior dopaciente sendo tratado, e de fatores similares.

Um médico ou veterinário pode iniciar doses dos anticorpos dainvenção empregada na composição farmacêutica em níveis mais baixos doque aqueles requeridos para alcançar o efeito terapêutico desejado, e gra-dualmente aumentar a dosagem até que um efeito desejado seja alcançado.

Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção, para otratamento de um distúrbioinflamatória alérgica aqui descrita, varia depen-dendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, localalvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou umanimal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático outerapêutico. As dosagens de tratamento necessitam ser tituladas para otimi-zar a segurança e eficácia. Para administração com um anticorpo, a dosa-gem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais usualmente 0,01 a 5mg/kg do pso còrpóreo do hospedeiro. Por exemplo, dosagens podem ser 1mg/kg de peso do corpo ou 10 mg/kg de peso do corpo, ou dentro da faixade 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar determina a administra-ção uma vez por dia de duas em duas semanas, ou uma vez por mês, ouuma vez de 3 a 6 meses.

O anticorpo é usualmente administrado em múltiplas ocasiões.Os intervalos entre dosagens simples podem ser semanalmente, mensal-mente, ou anualmente. Os intervalos podem ser também irregulares confor-me indicado pela medição dos níveis sangüíneos de anticorpo anti-hTSLPRno paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar umaconcentração de anticorpo de plasma de 1-1000 μg/ml e, em alguns méto-dos, 25-300 μg/ml. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado co-mo uma formulação de liberação sustentada, em cujo caso administraçãomenos freqüente é requerida. A dosagem e freqüência varia, dependendo dameia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanizados mos-tram meia-vida mais longa do que aqueles de anticorpos quiméricos e anti-corpos não-humanizados. A dosagem e freqüência de administração podevariar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplica-ções profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em inter-valos relativamente infreqüentes sobre um período de tempo longo. Algunspacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Nas a-plicações tarapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relati-vamente curtos é às vezes requerida até que a progressão da doença sejareduzida ou terminada, e preferivelmente até que o paciente mostre melhoraparcial ou completa de sintomas de doença. Em seguida, o paciente podeser administrado com um regime profilático.

EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos são providos para ilustrar adicionalmen-te a invenção, mas não para limitar seu escopo. Outras variantes da inven-ção serão prontamente aparentes a um técnico no assunto, e são envolvidaspelas reivindicações em anexo.

Exemplo 1. Desenvolvimento de um anticorpo antaqonista de camundonqoanti-hTSLPR

Este Exemplo descreve o desenvolvimento de um anticorpo an-tagonista de camundongo anti-hTSLPR. Camundongo Bcl2 Wehi22 (#1770)foi imunizado com proteína de fusão TSLPR humano (Met 1 - Lys 231 )/lgG1Fc humano (Pro 100 - Lys 330) comprada de R&D System (Minneapolis,MN) (Cat. Ns 981-TR, Lot N9 EDY1312A). A imunização foi efetuada em totalde 8 vezes de injeções por 18 dias. Células B foram isoladas de nodos linfá-ticos periféricos e fundidas em células de mieloma FO (ATCC, Manassas,VA). A produção de anticorpo foi classificada por ELISA contra proteína dehTSLPR/Fc. Um total de 24 clones foi obtido que produz anticorpos que re-conhecem especificamente hTSLPR. A ligação de anticorpos de hTSLPR aTSLPR de superfície de célula foi analisada em ensaio FACS (BD Bioscien-ces, San Jose, CA). Brevemente, células BaF3/hTSLPR/hlL7Ra foram incu-badas com sobrenadantes de cultura de hibridoma, seguido por IgG de anti-camundongo conjugado-FFITC, e analisadas em uma máquina de FACS. Osresultados mostram que 14 clones de hibridoma fora dos 24 clones foramcapazes de se ligar ao receptor de superfície de célula.

Um ensaio de proliferação de célula dependente de hTSLP nascélulas BaF3/hTSLPR/hlL7Rc foi, em seguida, empregado para classificaranticorpos antagonitas de hTSLPR. As células expressam ambos TSLPRhumano e IL7Ra, e são capazes de responder a estimulação TSLP humano(Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001). O ensaio de proliferação decélula foi realizado essencialmente conforme descrito em Reche et al. Bre-vemente, células BaF3/hTSLPR/hlL7Ra foram pré-incubadas com anticor-pos de sobrenadantes de cultura por 1 hora, e induzidas com hTSLP emconcentrações indicadas na figura 1. A proliferação de célula foi medida u-sando-se Alamar Blue (TREK Diagnositc Systems, Cleveland, OH). Para ca-da clone original, um a três subclones foram usados no ensaio. Os resulta-dos, conforme mostrado na figura 1, indicam que três subclones de clone1D6 mostraram forte atividade antagonista.

O anticorpo monoclonal (mAb) de um dos subclones, 1D6.C9, foipurificado (Fig. 2C). Brevemente, meio condicionado livre de soro de culturaMiniperm (Vivascience, Carlsbad, CA) foi tratado com Cleanascite (Ligo-Chem, Fairfield, NJ). O anticorpo foi, em seguida, purificado sobre resina deProteína G (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). O anticorpo purificadofoi testado no ensaio de proliferação de célula conforme descrito acima. Cé-lulas Ba/F3-hTSLPR-hlL7Ra ou células Baf3/hTSLPR/hlL7RÕStat5-Luc fo-ram tratadas com concentrações diferentes do anticorpo por 1 hora antes daadição de 1 ng/ml de hTSLP. Os resultados indicam que a proliferação de-pendente de TSLP de ambas a s células BaF3/hTSLPR/hlL7Ra (Figura 3A)e células Baf3/hTSLPR/hlL7RãStat5-Luc (Figura 3B) foi inibida pela adiçãode um anticorpo dé camundongo anti-hTSLPR em uma maneira dependenteda dose.

Em adição, um ensaio de informação de Iuciferase foi tambémempregado para examinar o efeito do anticorpo nas atividades de sinaliza-ção mediadas por TSLP. TSLP induz fosforilação de Stat3 e Stat5 em célu-las Baf3/hTSLPR/hlL7Ra (Reche et al., supra). Este ensaio foi designadopara medir a expressão de gene de informação sob o controle de Stat5 nascélulas Baf3/hTSLPR/hIL7Ra/Stat5-Luc em resposta a sinalização de TSLP.Brevemente, o constructo de informação de Stat-Luc foi gerado pela inser-ção de um local de ligação de consenso Stat em um vetor de informaçãopGL2 basic Luc (Promega, Madison, Wl) que não contém promotor e intensi-ficador. O local de ligação Stat inserido contém 8 cópias de um elemento deseqüência GATTTCCCCGAAATG (SEQ ID NO: 15) que abriga a seqüênciade ligação Stat de núcleo de TTCCCGGAA (SEQ ID NO: 16) (Yan et al.,Cell- 84:421-30, 1996; e Saylors et al., Gene Ther. 6:944-6, 1999). 0 cons-tructo de informação Stat-Luc foi introduzido nas células BaF3/hTSLPR/hlL7Roc. As células BaF3/hTSLPR/hIL7Ra/Stat5-Luc resultantes foram trata-das com concentrações diferentes do anticorpo de camundongo por 1 horaantes da adição de 1ng/ml de hTSLP. A atividade da Iuciferase foi medidausando-se Bright Glo(Promega, Madison1 Wl). Os resultados obtidos a partirdo ensaio foram mostrados na figura 3C. Similares aos resultados a partir doensaio de proliferação de célula, os dados a partir do ensaio de informaçãode Stat5-Luc também demonstraram a atividade antagonista dependente dadose do anticorpo de camundongo anti-hTSLPR.

Regiões variáveis de mAb 1D6.C9 de cadeia pesada (VH) e decadeia leve (VL) foram clonadas por RT-PCR. As seqüências dos iniciadoresusadas para identificação das regiões variáveis da cadeia pesada e leve sãoconforme se segue. Prímeres para VH são: (1) VH9: GATGGCAGCWGCY-CAAAG (SEQ ID NO: 1); e (2) Η-Constante: GCGTCTAGAAYCTCCACA-CACAGGRRCCAGTGGATAGAC (SEQ ID NO: 2). Prímeres para VL são:(1) LCV3: G G GTCTAG AC ACC ATG G AG WCAC AKWCTC AG GTCTTTRTA(SEQ ID NO: 3); e L-Constante: GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAA-GATGG (SEQ ID NO: 4).

Em resumo, o RNA total foi isolado de clone 1D6.C9. RT-PCRfoi efetuado com prímeres de avanço contra seqüência de sinal de regiõesvariáveis de cadeia pesada ou leve, e prímeres reversos contra região CH1de cadeia pesada ou região de constante cappa de cadeia leve. Os produtosde PCR foram clonados em vetor pCR Il ou pcDNA3.1/V5-His-TPOP-TA pa-ra seqüenciamento. As seqüências de polinucleotídeo das seqüências deregião variável de cadeia pesada e leve deste clone de anticorpo foram en-tão determinadas (figura 4). A seqüência de aminoácidos correspondentedas regiões variáveis (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) são mostradas na fi-gura 5. Também indicadas na figura 5 estão às regiões de CDRs e as regi-ões de estrutura deduzidas de acordo com o sistema de numeração de Ka-bat et al., supra.

Exemplo 2. Geração de anticorpos anti-hTSLPA quiméricosEste Exemplo descreve a geração e caracterização de anticor-pos anti-hTSLPR quiméricos. Os anticorpos quiméricos contêm regiões vari-áveis a partir do clone 1D6.C9 de anticorpo de camundongo anti-hTSLPRacima notado e regiões constantes de imunoglobulinas humanas.

Para gerar os anticorpos quiméricos, as regiões variáveis do anti-corpo de camundongo contra clone 1D6.C9 de TSLPR humano foram prepa-rados usando-se técnicas de PCR e seqüências de prímer descritas no E-xemplo 1 designadas para clonagem de vetores de cassete. Os produtos dePCR foram, em seguida, respectivamente clonados em vetores de casseteque contêm fusões de estrutura interna com seqüências condutoras de imu-noglobulina humana, segmentos J e sinais de união-doador usando-se asseqüências mostradas na Tabela 1. As seqüências foram então transferidasem vetores de mamífero de expressão contendo região constante de imuno-globulina humana, por exemplo, vetores SP2/0.

Tabela 1 Seqüências de prímeres para clonagem em vetores de expressãocappa IgGI

<formula>formula see original document page 65</formula>

Seleção de clones que expressam a cadeia pesada foi baseadana seleção de neomicina, enquanto clones que expressam a cadeia leveforam selecionados usando-se seleção dhfr. A amplificação de gene foi inici-ada usando-se metotrexato. O cassete de região variável para cadeia pesa-da foi transferido para vetores de expressão de IgGI humano e lgG4 demamífero, respectivamente.

Em seguida a subclonagem, para produzir anticorpos quiméricosIgGI, plasmídeos de DNA de IgGI quimérico de cadeia pesada e de cadeialeve cappa foram co-eletroporados em células de mielòma SP2/0. Do mes-mo modo, para produzir anticorpos quiméricos de lgG4, e lgG4 quimérico decadeia pesada e cadeia leve cappa foram co-eletroporados em células demieloma SP2/0. As células foram selecionadas com genetieina, e então cul-tivadas e expandidas em meio de crescimento contendo geneticina e meto-trexato. As células foram adaptadas em meio livre de soro para purificaçãodo anticorpo. Os anticorpos quiméricos de IgGI e lgG4 secretados a partirdas células transfectadas SP2/0 foram purificados (Figura 2A e figura 2B). Aatividade antagonista dos anticorpos quiméricos purificados IgGI e lgG4 foicomparada àquela do anticorpo de camundongo em ensaio de informaçãoLuc. Um anticorpo quimérico IgGI contra receptor de morte 5 (DR5) foi usa-do como controle negativo. Conforme medido pela expressão de gene emcélulas Ba/F3 que sobrexpressam hTSLPR, hlL7Ra, e Stat5-Luc, os resulta-dos indicam que os anticorpos quiméricos anti-hTSLPR exibiram atividadeantagonista similar conforme aquela do anticorpo de camundongo IgGI (Fi-gura 6).

Exemplo 3. Anticorpo anti-hTSLPR inibe secrecão TARC mediada por TSLPEste Exemplo descreve inibição de seção TARC mediada porTSLP de monócitos humanos pelos anticorpos antagonistas anti-hTSLPR.Ambos os anticorpos de camundongo e quimérico anti-hTSLPR acima nota-dos foram examinados para efeito na secreção mediada por TSLP no timode atração TH2 e quimioquina regulada por ativação (TARC) por monócitoshumanos. Exceto pela adição dos anticorpos anti-hTSLPR, os ensaios desecreção de TARC foram realizados essencialmente conforme descrito emSoumelis et al., Nat Immunol. 3:673-80, 2002. Os resultados são mostradosna figura 7. Os dois painéis superior da figura mostram respectivamente se-ção TARC de monócitos humanos e células dendríticas CD11 + estimuladascom TSLP. Os três painéis de fundo mostram respectivamente o efeito detrês anticorpos anti-hTSLPR diferentes na seção TRAC mediada por TSLPde monócitos humanos. Conforme demonstrado na figura, o anticorpo decamundongo anti-hTSLPR e os anticorpos quiméricos anti-hTSLPR (ambosisotipos IgGI e lgG4) foram todos capazes de inibir secreção TARC de mo-nócitos humanos em uma maneira dependente da dose. Isto adicionalmentevalida a atividade de antagonização dos anticorpos anti-hTSLPR na sinaliza-ção de TSLP.

Os estudos de ligação para determinar afinidades de ligação deanticorpos anti-hTSLPR foram conduzidos usando-se análise de ressonânciaBiacore plasmon padrão para medir taxas de "liga" (ka) e "desliga" (kd). Es-tas medições conduzem ao cálculo de constante de ligação (KD) para o anti-corpo. Análise adicional foi também conduzida usando-se ForteBiop paraexaminar as cinéticas de ligação da solução. Em adição, ensaios celularesforam usados para determinar o IC50 para o anticorpo. Os resultados destesestudos são resumidos na Tabela 3.<table>table see original document page 68</column></row><table>Seqüências de Anticorpos

Seqüência NV115-3BVH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22)VK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWA

STRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTK

LEIK (SEQ ID NO: 23)

Seqüência NV115-3E

VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTWGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24)VK

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLLIHWA

VTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGT

KLEIK (SEQ ID NO: 25)

Seqüência NV115-3E

VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTG N P R YAQG FTG R FV FS LDTS VSTA YLQISS LKA EDTAVYYCA REGFITTWGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26)VK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27)

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em maioresdetalhes por meio de ilustração e exemplo para proposta de clareza de com-preensão, será prontamente aparente a um técnico no assunto à luz dos en-sinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem serfeitas a esta sem fugir do espírito ou escopo das reivindicações em anexo.

Todas as publicações, base de dados, seqüências de Banco deGene, patentes, e pedidos de patente citados neste relatório são aqui incor-porados por referência, visto que cada um foi especificamente e individual-mente indicados para serem incorporados por referência.Listagem de Seqüência

SEQ ID NO: 1 - GATGGCAGCWGCYCAAAG

SEQ ID NO: 2 - GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC

SEQ ID NO: 3 -

GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA

SEQ ID NO: 4 - GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG

SEQ ID NO: 5

maaaqsaqaqiqlgqsgpelkkpgetvkisckasgytfttygmswvkqapgkglqwmgwintysgvpryaddfkgr

fafsletsastaylqiynlknedtatyfctregfittwgaagrfvywgqgtlvtvsa

SEQ ID NO: 6

meshtqvfvymllwlsgvegdivmtqshkfmstsvgdrvsitckasqdvgtavawyqqkpgqspklliywastrht

Gvpdrftgsgsgtdftltlnnvqsedladyfcqqystyptfgsgtklelkra

SEQ ID NO: T- TYGMS

seq id no: 8 - wintysgvpryaddfkg

SEQ ID NO: 9 - EGFITTWGAAGRFVY

SEQ ID NO: 10 - KASQDVGTAVA

SEQ ID NO: 11 - WASTRHT

SEQ ID NO: 12 - QQYSTYPT

SEQ ID NO: 13 1D6 hybridoma cadeia pesada DNA seqüência

atggcagctgctcaaagtgcccaagcacagatccagttgggacagtctggacctgagcgaagaagcctggagagac

agtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaacctatggaatgagctgggtgaaacaggctccagga

aagggtttacagtggatgggctggataaatacctactctggagtgccaagatatgctgatgacttcaagggacgat

ttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatctgcagatctacaacctcaaaaatgaggacacggctac

atatttc tgtacaagagaaggatttattactacggtagtaggtgcggctgggaggtttgtttattggggccaaggg

actctggtcactgtctctgca

SEQ ID NO: 14 1D6 seqüênciade DNA hibridoma cadeia leve

atggagtcacatactcaggtctttgtatacatgttgctgtggttgtctggtgttgaagagacattgtgatgaccca

gtctcacaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgggtacc

gctgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaactactgatttactgggcatccacccggcacactg

gagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcacccttaacaatgtgcagtctgaaga

cttggcagattatttc tgtcagc aatatagcacctatcccacgttcggtagtgggaccaagctggagctgaaacgg

gctSEQ ID NO: 15 - GATTTCCCCGAAATGSEQ ID NO: 16 - TTCCCGGAA

SEQ ID NO: 17 NV115-3B VH seqüência de DNA de Genart

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCG

GCTACACCTTCACCACCTACGGCATCAGCTGGCTGCGGCAGGCCCCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGGT

GAACACCAACACCGGCAACCCCAGATACGCCCAGGGCTTCACCGGCCGGTTCGTGTTCAGCCTGGACACCAGCGTG

TCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTTCA

TCACCACCGTGGTGGGAGCCGCCGGAAGATTCGTGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 17 DNA de seqüência de NV115-3B VK Genart

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCCACACCCGGÇTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCCGGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTTAGCGGCACCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCTACCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTTGAAATCAAA

SEQ ID NO: 18 - CAGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAG

SEQ ID NO: 19 - GGAGCTCACGGTCACCAGGG

SEQ ID NO: 20 - GAGTACGCGTTGTGACATCCAGATGACCCAG

SEQ ID NO: 21 - GCTCAAGCTTCGTACCTTGGCCAAACG

SEQ ID NO: 22

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTA YLQIS SLKAEDTAVYYCAREGFITTWGAAGRFVYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO: 23

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTIS

SLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 24

QVQLVQSGAEWKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISS LKAEDTAVYYC AREGFITTWGAAGRFVYWGQGTLVTVS SSEQ ID NO: 25

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLLIHWAVTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS

SLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 26

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVstaylqis slkaedtavyycaregfittwgaagrfvywgqgtlvtvssseq id no: 27

DiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdihtrlawyqqkpgqppklliywastrgsgvpdrfsgsgsgtdftIjtisslraedvavyycqqystyptfgqgtkleik

Claims (32)

1. Anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno destecompreendendo a seqüência de região variável de cadeia pesada de SEQID Ng: 5.

2. Anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno destecompreendendo a seqüência de região variável de cadeia pesada de SEQID Ns:5, e uma seqüência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NQ:6.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que compreendeuma seqüência de região de determinação de complementaridade (CDR) decadeia pesada de TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGVPRYADDFKG (SEQID NO: 8) ou EGFITTWGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9); ou uma seqüência deCDR de cadeia leve de KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQID NO: 11), ou QQYSTYPT (SEQ ID NO: 12).

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que compreendeseqüências CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO:-7), WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTWGAAGRFVY(SEQ ID NO: 9), respectivamente; e seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 decadeia leve, KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO:-11), e QQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que compreendeuma seqüência de aminoácido de região variável de cadeia pesada que épelo menos 80% idêntica a SEQ ID NO: 5, e uma seqüência de aminoácidode região variável de cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica a SEQ IDNO: 6.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um anti-corpo de camundongo.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um anti-corpo quimérico.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, que compreendeuma região constante de cadeia pesada humana e uma região constante decadeia leve humana.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um anticorpo humanizado.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um anti-corpo humano.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um anti-corpo de cadeia simples.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é um frag-mento Fab.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que é dos isoti-po IgGI ou lgG4.

14. Polinucleotídeo isolado ou recombinante que codifica um po-lipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia pesada ou a regiãovariável da cadeia leve do anticorpo como definido na reivindicação 2.

15. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, no qual oanticorpo é um anticorpo humano.

16. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, no qual opolinucleotídeo que codifica o anticorpo compreende seqüências de CDR1,CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGV-PRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9),respectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve,KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente. '

17. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, no qual oanticorpo compreende uma seqüência madura de região variável de cadeiapesada que é pelo menos 80% idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5; euma seqüência madura de região variável de cadeia leve que é pelo menos80% idêntica à região madura de SEQ ID NO: 6.

18. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, no qual oanticorpo compreende uma seqüência madura de região variável de cadeiapesada que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5, e a seqüênciamadura de região variável de cadeia leve que é idêntica à região madura deSEQ ID NO: 6.

19. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, que é umDNA.

20. Célula hospedeira isolada compreendendo (1) um segmentode DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo comodefinido na reivindicação 2, e (2) um segundo segmento de DNA recombi-nante que codifica uma cadeia leve do anticorpo; no qual referidos segmen-tos de DNA são respectivamente operavelmente ligados a um primeiro e aum segundo promotor, e são capazes de serem expressos na referida célulahospedeira.

21. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, noqual o anticorpo monoclonal é um anticorpo humano.

22. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, noqual o anticorpo monoclonal compreende seqüências de CDR1, CDR2, eCDR3 de cadeia pesada, TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGVPR-YADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EGFITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9), res-pectivamente; e seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve,KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10), WASTRHT (SEQ ID NO: 11), eQQYSTYPT (SEQ ID NO: 12), respectivamente.

23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, noqual o anticorpo compreende um seqüência madura de região variável decadeia pesada que é pelo menos 80% idêntica à região madura de SEQ IDNO: 5; e a seqüência madura de região variável de cadeia leve que é pelomenos 80% idêntica à região madura de SEQ ID NO: 6.

24. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, noqual o anticorpo monoclonal compreende uma seqüência madura de regiãovariável de cadeia pesada que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5,e a seqüência madura de região variável de cadeia leve que é idêntica à re-gião madura de SEQ ID NO: 6.

25. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, que éuma linha de célula mamífera não-humana.

26. Método de tratamento de um distúrbioinflamatória em um in-divíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo deacordo com a reivindicação 2.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, no qual o anti-corpo é um anticorpo humano.

28. Método, de acordo com a reivindicação 28, no qual o anti-corpo compreende seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada,TYGMS (SEQ ID NO: 7), WINTYSGVPRYADDFKG (SEQ ID NO: 8) e EG-FITTVVGAAGRFVY (SEQ ID NO: 9), respectivamente; e seqüências deCDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve, KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10),WASTRHT (SEQ ID NO: 11), e QQYSTYPT (SEQ ID NO: 12).

29. Método, de acordo com a reivindicação 26, no qual o anti-corpo compreende (i) uma seqüência madura de região variável de cadeiapesada que é idêntica à região madura de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma seqüên-cia madura de região variável de cadeia leve que é idêntica à região madurade SEQ ID NO: 6.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26, no qual o indiví-duo é um ser humano.

31. Método, de acordo com a reivindicação 26, no qual o indiví-duo sofre de uma doença inflamatória alérgica.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual a doençainflamatória alérgica é dermatite atópica, asma, ou rinite alérgica.