TWI401261B - 用於治療過敏性疾病之方法及組合物 - Google Patents

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Description

用於治療過敏性疾病之方法及組合物
本發明係關於用於治療過敏性疾病之方法及組合物。
細胞激素及免疫細胞介導特定生理機制或途徑，例如導致多種發炎病症之途徑。人類胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)為由人類上皮細胞所產生之類IL－7細胞激素。其促進B細胞分化以及可共刺激胸腺細胞與成熟T細胞。在人類CD11c＋樹突狀細胞(DC)上TSLP與特定雜二聚受體結合。該受體雜二聚體由普通類γ受體鏈(TSLP受體；TSLPR)及IL－7R－α鏈組成。參見，例如Tonozuka等人，Cytogenet.Cell Genet.93：23－25,2001；Pandey等人，Nat.Immunol.1：59－64,2000；L.S.Park等人，J.Exp.Med.192：659－670,2000；及Reche等人，J.Immunol.167：336－343,2001。與受體結合之配位體誘發DC分泌TH 2吸引趨化因子、TARC(胸腺及活化調節趨化因子)及MDC(巨噬細胞衍生性趨化因子)。此外，TSLP亦誘發有效DC活化、原態CD4＋T細胞擴增及TH 2表型之後續極化，產生前過敏性細胞激素介白素4(IL－4)、IL－5、IL－13及腫瘤壞死因子－α。
亦發現TSLP信號傳輸導致Stat5轉錄因子之活化。此外，已報導急性與慢性異位性皮膚炎患者在皮膚病變中過度表現TSLP，其表明TSLP表現與活體內過敏性炎症相關。除皮膚角質細胞以外，高水準之TSLP表現亦見於支氣管上皮細胞、平滑肌及肺纖維母細胞中，其亦提供TSLP對呼吸性過敏性適應症之潛在作用。此外，IgE活化肥大細胞表現極高水準之TSLP，其為可參與維持TH 2表型之機制。
西方國家中約20%之人患有發炎病症，例如包括哮喘、鼻炎、異位性皮膚炎及食物過敏之過敏性疾病。50%至80%患有異位性皮膚炎之患者患有或發展成哮喘或過敏性鼻炎。迄今為止，仍無法治癒過敏症誘發性哮喘、異位性皮膚炎及過敏性鼻炎。當前治療劑(諸如用於哮喘之β－2腎上腺素能受體拮抗劑、用於異位性皮膚炎之Elidel及用於過敏性鼻炎之H1－抗組織胺劑)用以靶向該等症狀。因此，在此項技術中存在對於治療該等發炎病症(尤其過敏性炎症)之更佳療法之增加的需求。本發明解決該等及其他問題。
本文中之本發明之實施例提供一種具有對靶蛋白人類胸腺基質淋巴細胞生成素受體(hTSLPR)具有特異性之抗原結合區的分離人類或人源化抗體或其功能片段且該抗體或其功能片段與hTSLPR結合。在一相關實施例中，至少藉由細胞表面hTSLP受體結合預防發炎介體釋放來確定與hTSLPR的結合。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體或其功能片段之分離抗原結合區。在某些實施例中，該分離抗原結合區包括具有胺基酸序列TYGMS(SEQ ID NO：7)之H－CDR1區及其保守變異體。如本文中所描述，保守變異體包括在所鑑別之胺基酸序列之任一者中的胺基酸殘基。在一相關實施例中，分離抗原結合區為具有胺基酸序列WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)之H－CDR2區及其保守變異體。在另一相關實施例中，分離抗原結合區為具有胺基酸序列EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之H－CDR3區及其保守變異體。
在另一實施例中，分離抗原結合區為具有胺基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)之L－CDR1區及其保守變異體。在另一相關實施例中，分離抗原結合區為具有胺基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：11)之L－CDR2區及其保守變異體。在另一相關實施例中，分離抗原結合區為具有胺基酸序列QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之L－CDR3區及其保守變異體。
在另一實施例中，分離抗原結合區為具有可變區胺基酸序列SEQ ID NO：5及與SEQ ID NO：5之CDR區相比在CDR區中具有至少60、70、80、90或95%序列一致性的序列之重鏈。在一相關實施例中，分離抗原結合區為具有可變區胺基酸序列SEQ ID NO：6及與SEQ ID NO：6之CDR區相比在CDR區中具有至少60、70、80、90或95%序列一致性的序列之輕鏈。
在另一態樣中，本發明提供抵抗hTSLPR之單株拮抗劑抗體。某些本發明之抗TSLPR抗體與含有SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變區序列之參考抗體具有相同的結合特異性。某些該等抗體為顯示與參考抗體相同之結合特異性的全人抗體。某些抗體具有重鏈互補判定區(CDR)序列TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)或EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；或輕鏈CDR序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)或QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
某些抗hTSLPR抗體具有分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。本發明之某些其他抗體含有具有與SEQ ID NO：5至少85%一致性之重鏈可變區胺基酸序列及具有與SEQ ID NO：6至少85%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。本發明之某些其他抗hTSLPR抗體具有與SEQ ID NO：5一致之重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：6一致之輕鏈可變區胺基酸序列。
本發明之某些抗hTSLPR抗體為小鼠抗體。某些其他抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體具有人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。本發明之某些其他抗hTSLPR抗體為人源化抗體。本發明之某些其他抗TSLPR抗體為顯示與含有重鏈可變區序列SEQ ID NO：5及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：6之抗體相同之結合特異性的全人抗體。本發明亦提供單鏈抗體，例如Fab片段。某些抗hTSLPR抗體為IgG1同型。某些其他抗體為IgG4同型。
在另一態樣中，本發明提供編碼含有本發明之抗hTSLPR抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區之多肽的分離或重組性聚核苷酸(例如DNA)。舉例而言，聚核苷酸可編碼含有分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的抗體重鏈。聚核苷酸亦可編碼含有分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之CDR1、CDR2及CDR3序列的抗體輕鏈。本發明之某些聚核苷酸編碼具有與SEQ ID NO：5之成熟區至少90%一致性之成熟重鏈可變區序列。某些其他聚核苷酸編碼具有與SEQ ID NO：6之成熟區至少90%一致性之成熟輕鏈可變區序列。某些該等聚核苷酸編碼與SEQ ID NO：5之成熟區一致之成熟重鏈可變區序列或與SEQ ID NO：6之成熟區一致之成熟輕鏈可變區序列。
在另一態樣中，本發明提供具有(1)編碼本發明之抗hTSLPR抗體之重鏈之重組DNA區段及(2)編碼抗體之輕鏈之第二重組DNA區段的分離宿主細胞。在某些宿主細胞中，重組DNA區段分別可與第一啟動子及第二啟動子操作性連接且能夠表現於宿主細胞中。某些該等宿主細胞表現具有單株抗體，該單株抗體具有分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。某些其他宿主細胞表現含有具有與SEQ ID NO：5至少90%一致性之成熟重鏈可變區序列；及具有與SEQ ID NO：6至少90%一致性之成熟輕鏈可變區序列的抗hTSLPR抗體。某些該等宿主細胞表現含有與SEQ ID NO：5之成熟區一致之成熟重鏈可變區序列；及與SEQ ID NO：6之成熟區一致之成熟輕鏈可變區序列的抗hTSLPR抗體。某些宿主細胞為非人類哺乳動物細胞。
在另一態樣中，本發明提供治療受檢者(例如人類患者)發炎病症之方法。該等方法需要向受檢者投予含有有效量之抗hTSLPR抗體之醫藥組合物。抗hTSLPR抗體通常具有與含有重鏈可變區序列SEQ ID NO：5及輕鏈可變區序列SEQ ID NO：6之抗hTSLPR抗體相同之結合特異性。在某些該等治療方法中，採用全人抗體。在某些方法中，抗TSLPR抗體具有分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。在某些方法中，所用抗hTSLPR抗體含有與SEQ ID NO：5之成熟區一致之成熟重鏈可變區序列；及與SEQ ID NO：6之成熟區一致之成熟輕鏈可變區序列。某些方法針對治療患有過敏性發炎疾病之受檢者。經受治療之過敏性發炎疾病之實例包括異位性皮膚炎、哮喘或過敏性鼻炎。
在另一實施例中，本發明提供由為抗體或其片段之第一組份及具有第二胺基酸序列之第二組份製造的免疫結合物。舉例而言，免疫結合物為細胞毒素，或免疫結合物為對不同於hTSLPR之靶具有結合特異性之結合蛋白或抗體。
在另一實施例中，本發明提供具有抗體或其抗體片段之套組。在某些實施例中，該套組因此進一步含有醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在其他相關實施例中，套組中之抗體係以單位劑量存在。在另一相關實施例中，該套組包括用於說明向受檢者投藥之用法說明書。
參考說明書之其餘部分及申請專利範圍可進一步瞭解本發明之性質及優點。
本發明部分基於本發明者對於抵抗人類TSLPR之拮抗劑抗體之研發。發現小鼠中所產生之抗hTSLPR抗體或活體外所製造之嵌合抗hTSLPR抗體能夠抑制藉由TSLP信號傳輸所介導之活性，例如TSLP－介導性細胞增殖。因此，該等抗體適用作抵抗大量由TSLP信號傳輸活性所介導或與TSLP信號轉導活性相關之疾病或病症(例如過敏性發炎疾病，諸如異位性皮膚炎及哮喘)的治療劑或預防劑。下列部分提供製造及使用本發明之組合物及實現本發明之方法的指導。
I.定義
除非另作定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與通常由一般熟習本發明所屬之技術者所瞭解之含義相同的含義。下列參考文獻向熟習此項技術者提供許多適用於本發明之術語的一般定義：Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith等人(編)，Oxford University Press(修訂版，2000)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton等人(編)，John Wiley & Sons(第3版，2002)；及A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin及Hine(編)，Oxford University Press(第4版，2000)。此外，提供下列定義幫助讀者實踐本發明。
為使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在整個實施方式中闡明其他定義。
術語"免疫反應"係指(例如)淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由上述細胞或肝臟所產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞激素及補體)導致對侵入病原體之人體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或(在自身免疫或病理性炎症之情況下)正常人類細胞或組織之選擇性損壞、破壞或消除的作用。
"信號轉導途徑"係指在將信號自細胞之一部分傳導至細胞之另一部分中起作用之多種信號轉導分子之間的生化關係。
如本文中所提及之術語"抗體"包括全抗體及任何抗原結合片段(亦即"抗原結合部分")或其單鏈。天然存在"抗體"為包含由二硫鍵相互連接之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的糖蛋白。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH )及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個域(CH1、CH2及CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL )及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個域CL 組成。VH 及VL 區可進一步再分成稱為互補判定區(CDR)之高變區，該高變區與稱為框架區(FR)之更恆定區域交替。各VH 及VL 由自胺基端至羧基端按以下順序排列之3個CDR及4個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該等宿主細胞或因子包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及典型補體系統之第一組份(Clq)。
如本文中所用術語抗體之"抗原結合部分"(或簡言之"抗原部分")係指保留與抗原(例如TSLPR)特異性結合之能力的全長抗體或抗體之一或多個片段。已展示可由全長抗體之片段執行抗體之抗原結合功能。包涵於術語抗體之"抗原結合部分"內之結合片段的實例包括Fab片段，其為由VL 、VH 、CL 及CH1域組成之單價片段；F(ab)2 片段，其為在鉸鏈區上包含兩個由雙硫橋連接之Fab片段的二價片段；由VH 及CH1域組成之Fd片段；由單組抗體之VL 及VH 域組成之Fv片段；由VH 域組成之dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544－546)；及分離互補判定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個域(VL 及VH )由獨立基因編碼，但其可使用重組法由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成其中VL 及VH 區成對以形成單價分子之單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等人，1988 Science 242：423－426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879－5883)。該等單鏈抗體亦意欲包涵於術語抗體之"抗原結合部分"內。該等抗體片段使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得且以與完整抗體相同之方式篩選該等片段以用於應用。
如本文中所用"分離抗體"係指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合TSLPR之分離抗體大體上不含特異性結合除TSLPR以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合TSLPR之分離抗體可對其他抗原(諸如來自其他物種之TSLPR分子)具有交叉反應性。此外，分離抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學物。
如本文中所用術語"單株抗體"或"單株抗體組合物"係指單分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組合物顯示對於特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
如本文中所用術語"人類抗體"意欲包括具有其中框架區與CDR區源於人類來源之序列之可變區的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦源於該等人類序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變形式。本發明之人類抗體可包括不由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或特定位點突變或由活體內體細胞突變所引起之突變)。
術語"人類單株抗體"係指顯示單一結合特異性之抗體，其具有其中框架區與CDR區源於人類序列之可變區。在一實施例中，人類單株抗體由包括由轉基因非人類動物(例如轉基因小鼠)所獲之B細胞的融合瘤產生，該動物具有包含融合於永生化細胞之人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因的基因組。
如本文中所用術語"重組性人類抗體"包括所有由重組方法製備、表現、製造或分離之人類抗體，諸如自對於人類免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)中分離之抗體或自其中所製備之融合瘤、自轉移以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)中分離之抗體、自重組性組合人類抗體庫中分離之抗體及由任何其他涉及剪接所有或部分人免疫球蛋白基因、序列於其他DNA序列上之方法製備、表現、製造或分離的抗體。該等重組性人類抗體具有其中框架區及CDR區源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組性人類抗體可經受活體外突變(或當使用人類Ig序列之動物轉基因時，則為活體內體細胞突變)且因此重組性抗體之VH 及VL 區之胺基酸序列為如下序列，當源自人類生殖系VH 及VL 序列且與人類生殖系VH 及VL 序列相關時，其可能不活體內天然存在於人類抗體生殖系所有組成部分內。
"嵌合抗體"為抗體分子，其中(a)恆定區或其部分經改變、替換或交換以便抗原結合位點(可變區)與不同或經改變之種類、效應性官能團及/或物種、或賦予嵌合抗體(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)新特性之完全不同分子的恆定區連接；或(b)可變區或其部分用具有不同或經改變之抗原特異性之可變區改變、替換或交換。舉例而言，如以下實例中所示，小鼠抗hTSLPR抗體可藉由用來自人類免疫球蛋白之恆定區替換其恆定區來修飾。歸因於用人類恆定區替換，嵌合抗體可保留其識別人類TSLPR之特異性同時具有與初始小鼠抗體相比更低之人類抗原性。
"人源化"抗體為保留非人類抗體之反應性同時具有降低之人類免疫原性的抗體。其可例如藉由保留非人類CDR區且用其人類對應部分(亦即恆定區以及可變區之框架部分)替換抗體之剩餘部分來獲得。參見，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,81：6851－6855,1984；Morrison及Oi，Adv.Immunol. ,44：65－92,1988；Verhoeyen等人，Science ,239：1534－1536,1988；Padlan,Molec.Immun. ,28：489－498,1991；及Padlan,Molec.Immun. ,31：169－217,1994。人類工程化技術之其他實例包括(但不限於)於US 5,766,886中所揭示之Xoma技術。
如本文中所用術語"人類化"係指將非人類抗體轉化成工程化人類抗體之方法(參見，例如KaloBios'HumaneeringT M 技術)。
如本文中所用"同型"係指由重鏈恆定區基因所提供之抗體種類(例如IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG4)。
本文中可交換使用短語"識別抗原之抗體"及"對抗原具有特異性之抗體"與術語"特異性結合抗原之抗體"。
如本文中所用，"特異性結合人類TSLPR"之抗體係指以200×10－ 1 2 M或更低、150×10－ 1 2 M或更低、或100×10－ 1 2 或更低之KD 與人類TSLPR結合的抗體。
如本文中所用術語"結合特異性"係指個別抗體結合位點以與僅一抗原決定子反應的能力。抗體之結合位點位於分子之Fab部分中且由重鏈及輕鏈之高變區構建。抗體之結合親和力為抗體上之單一抗原決定子與單一結合位點之間的反應強度。其為作用於抗體之抗原決定子與結合位點之間的吸引力及排斥力之總和。親和力為描述抗原－抗體反應之平衡常數。
兩個實體之間的特異性結合意謂以至少1×107 M－ 1 、1×108 M－ 1 、1×109 M－ 1 或1×101 0 M－ 1 之平衡常數(KA )結合。短語"特異性(或選擇性)結合"抗體(例如抗hTSLPR抗體)係指對於蛋白及其他生物製劑之異源群體中同源抗原(例如人類TSLPR多肽)之存在有決定作用的結合反應。除以上所指示之平衡常數(KA )之外，本發明之抗hTSLPR抗體通常亦具有約1×10－ 2 s－ 1 、1×10－ 3 s－ 1 、1×10－ 4 s－ 1 或更低之解離常數(Kd )且以比其與非特異性抗原(例如BSA)結合之親和力大至少兩倍之親和力與人類TSLPR結合。本文中可交換使用短語"識別抗原之抗體"及"對抗原具有特異性之抗體"與術語"特異性結合抗原之抗體"。
術語"抗原決定基"意謂能夠與抗體特異性結合之蛋白決定子。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成且通常具有特定三維結構特性以及荷質比特徵。構形抗原決定基及非構形抗原決定基之區別在於在變性溶劑存在下與前者(而非後者)之結合消失。
本文中術語"核酸"可與術語"聚核苷酸"交換使用且係指呈單股或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包涵含有已知核苷酸類似物或經修飾之骨架殘基或鍵的核酸，該等核酸為合成、天然存在及非天然存在之核酸，其具有與參考核酸相似之結合特性且其以類似於參考核苷酸的方式代謝。該等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2－O－甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有所述，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體(例如簡並密碼子取代)及互補序列以及經明確指明之序列。具體而言，如以下所詳述，簡並密碼子取代可由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來獲得(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605－2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91－98,1994)。
術語"胺基酸"係指天然存在及合成之胺基酸以及胺基酸類似物及以類似於天然存在胺基酸的方式起作用之胺基酸模擬物。天然存在胺基酸為彼等由遺傳密碼子編碼之胺基酸以及彼等隨後經修飾之胺基酸，例如羥脯胺酸、γ－羧基麩胺酸及O－磷絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在胺基酸相同之基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然存在胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但以類似於天然存在胺基酸之方式作用的化合物。
本文中當提及胺基酸殘基之聚合物時可交換使用術語"多肽"及"蛋白質"。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物以及適用於天然存在胺基酸聚合物及非天然存在胺基酸聚合物。除非另有所述，否則特定多肽序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體。
術語"經保守修飾之變異體"適用於胺基酸與核酸序列。相對於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指彼等編碼相同或基本上相同之胺基酸序列之核酸或其中核酸並不編碼胺基酸序列成基本上相同之序列。由於遺傳密碼子之簡並，大量功能上相同之核酸編碼任何所給定之蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在每個其中丙胺酸由密碼子指定之位置上，密碼子可在不改變經編碼之多肽的情況下變成所描述之相應密碼子的任一者。該等核酸變異為"寂靜變異"，其為一種經保守修飾之變異。本文中每個編碼多肽之核酸序列亦描述每種可能之核酸寂靜變異。熟習此項技術者將認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG之外)可經修飾以獲得功能上相同之分子。據此，編碼多肽之核酸之各寂靜變異隱含於各所述序列中。
對於多肽序列而言，"經保守修飾之變異體"包括對多肽序列之個別取代、缺失或添加而導致以化學上相似胺基酸取代胺基酸。在此項技術中熟知提供功能上相似胺基酸之保守性取代表。該等經保守修飾之變異體為除本發明之多晶變異體、種間同系物及等位基因之外還有其他者的變異體且並不排除本發明之多晶變異體、種間同系物及等位基因。下列8個組含有彼此保守性取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺酸(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如Creighton,Proteins (1984))。
於上下文之兩個或兩個以上核酸或多肽序列中術語"一致"或"一致性"百分數係指相同之兩個或兩個以上序列或子序列。當如使用下列序列比較算法之一者或由手動對準及肉眼檢查所量測在比較時窗或經指明區上比較且對準最大一致性時，若兩個序列具有所規定百分數之胺基酸殘基或核苷酸為相同(亦即在所規定區上或若未規定則在整個序列上具有60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性)，則兩個序列為"大體上一致"。一致性視情況存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區上、或更佳存在於長度為100至500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多胺基酸)之區域上。
對於序列比較而言，通常一序列充當參考序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，指定子序列座標且(必要時)，且指定序列算法程式參數。可使用預設程式參數或者可指定替代性參數。隨後序列比較算法基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分數。
如本文中所用"比較時窗"包括參考鄰近位置數目選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群的任一者之區段，其中在最佳對準兩個序列之後序列可與具有相同鄰近位置數目之參考序列相比較。在此項技術中熟知對準供比較用之序列之方法。可例如由以下方法進行供比較用之序列的最佳對準：Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源算法，由Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol. 48：443,1970之同源對準算法，由Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似法搜索，由該等算法(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)之電腦化實施或由手動對準及肉眼檢查(參見，例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou編，2003))。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分數之算法的兩個實例為BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25 ：3389－3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol. 215：403－410,1990中。執行BLAST分析之軟體可公開經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)獲得。該算法涉及首先藉由鑑別於詢問序列中長度為W之短字來鑑別高分序列對(HSP)，當與資料庫序列中相同長度之字對準時其匹配或滿足某些正值化閾值分數T。T稱為鄰近字閾值分數(Altschul等人，前述)。該等初始鄰近字選中數(word hit)充當種子用於啟始檢索以發現含有其之較長HSP。該等字選中數沿各序列雙向延伸直至累積對準分數可增加。對於核苷酸序列而言，使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(失配殘基之懲罰分數；始終<0)計算累積分數。對於胺基酸序列而言，使用計分矩陣計算累積分數。當以下情況時停止延長在各方向上之字選中數：累積對準分數比其最大所獲值減少數量X；累積分數降至零或零以下，此歸因於一或多個負分數殘基對準之積累；或達至任一序列末端。BLAST算法參數W、T及X測定對準之敏感性及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M＝5、N＝－4及比較兩股作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長為3、及期望值(E)為10，且BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)對準(B)為50、期望值(E)為10、M＝5、N＝－4及比較兩股作為預設值。
BLAST算法亦執行兩個序列之間相似性的統計分析(參見，例如Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873－5787,1993)。由BLAST算法所提供之相似性之一種度量為最小總計概率(P(N))，其提供概率之示值，由該概率兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配將偶然存在。舉例而言，若在將測試核酸與參考核酸比較中最小總計概率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則將核酸視為與參考序列相似。
除以上所指示之序列一致性百分數以外，兩個核酸序列或多肽為大體上一致之另一指征為如下所述由第一核酸所編碼之多肽與相對於由第二核酸所編碼之多肽產生之抗體具有免疫交叉反應性。因此多肽通常大體上與第二多肽一致，例如其中兩種肽僅保守性取代不同。兩個核酸序列為大體上一致的另一指征為如下所述兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列為大體上一致的另一指征為可使用相同引子來擴增序列。
術語"操作性連接"係指兩個或兩個以上聚核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。其通常係指轉錄調控序列與經轉錄序列的功能關係。舉例而言，若啟動子或增強子序列於合適宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則啟動子或增強子序列與編碼序列操作性連接。一般而言，與轉錄序列操作性連接之啟動子轉錄調控序列實體鄰接經轉錄序列，亦即其為順式作用。然而，某些轉錄調控序列(諸如增強子)不必實體鄰接或緊密接近編碼序列，其增強該編碼序列之轉錄。
術語"載體"意欲指能夠輸送與其連接之另一聚核苷酸的聚核苷酸分子。一類載體為"質體"，其係指其他DNA區段可接合於其中的環狀雙股DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠於引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有複製之細菌來源的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)一旦引入宿主細胞中後可併入宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠直接表現其操作性連接之基因。該等載體本文中稱為"重組性表現載體"(或簡稱"表現載體")。一般而言，應用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，當質體為載體之最通常使用形式時，可交換使用"質體"及"載體"。然而，本發明意欲包括該等其他形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，該等表現載體提供等效功能。
術語"重組性宿主細胞"(或簡稱"宿主細胞")係指已引入重組性表現載體之細胞。應瞭解該等術語意欲不僅係指特定受檢者細胞，而且係指該細胞之子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而發生於繼代中，所以該子代實際上可不與母細胞一致但仍包括於如本文中所用術語"宿主細胞"之範疇內。
術語"發炎性疾病或病狀"係指任何以在損傷或感染之部位上局部發炎為特徵的病狀且包括自體免疫疾病、某些形式之感染性發炎狀況、器官移植或其他植入之不當嗜中性細胞活性特徵及實際上以在局部組織部位上之不當嗜中性細胞積累為特徵的任何其他病狀。該等病狀包括(但不限於)腦膜炎、腦水腫、關節炎、腎炎、成人呼吸窘迫綜合症(adult respiratory distress syndrome)、胰腺炎、肌炎、神經炎、結締組織疾病、靜脈炎、動脈炎、脈管炎、過敏症、強過敏、埃立克體病(ehrlichiosis)、痛風、器官移植及/或潰瘍性結腸炎。
術語"受檢者"包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除有所指示之時，本文中可交換使用術語"患者"或"受檢者"。
術語"治療"包括投與化合物或藥劑以預防或延遲疾病(例如過敏性發炎疾病)之症狀、併發症或生化標誌的發作，減輕症狀或停止或抑制疾病、病狀或病症之進一步進展。治療可為預防性(預防或延遲疾病之發作或預防其臨床或亞臨床症狀之表現)或在疾病表現之後治療性抑制或減輕症狀。
短語"信號轉導途徑"或"信號傳輸途徑"(例如TSLP信號傳輸途徑)係指至少一種生化反應，但更通常為一系列生化反應，其由細胞與刺激化合物或藥劑之交互作用產生。因此，刺激化合物(例如TSLP)與細胞之交互作用產生經由信號轉導途徑傳輸之"信號"，最終引起細胞響應(例如免疫反應)。
II.抵抗人類TSLPR之拮抗劑抗體
1.概述 本發明提供與人類TSLPR特異性結合之抗體。該等抗hTSLPR抗體能夠拮抗經TSLP介導之信號傳輸活性，例如如以下實例中所述之經TSLP介導之細胞增殖。在此項技術中熟知製備單株或多株抗體之通用方法。參見，例如Harlow & Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1998；Kohler & Milstein,Nature 256：495－497,1975；Kozbor等人，Immunology Today 4：72,1983；及Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ，第77－96頁，1985。
本發明之抗hTSLPR抗體較佳為單株抗體，如，如以下實例中所述之相對於人類TSLPR(純系1D6.C9)所產生之小鼠單株抗體。單株抗體係指源自單一純系之抗體。可採用任何產生單株抗體之技術來生產本發明之抗hTSLPR抗體，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉形。一種用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。於小鼠中之融合瘤製備為完全確立之程序。如以下實例中所說明，單株抗hTSLPR抗體可藉由使非人類動物(例如小鼠)免疫hTSLPR多肽或其框架、融合蛋白或亞型生成。隨後將自動物分離之B細胞融合於骨髓瘤細胞中以生成產生抗體之融合瘤。單株小鼠抗hTSLPR抗體可藉由使用hTSLPR多肽或融合蛋白於ELISA檢定中篩選融合瘤來獲得。在此項技術中已知用於分離用於融合之經免疫之脾細胞的免疫協定及技術。在此項技術中亦熟知融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序，例如前述之Harlow & Lane。
圖5中展示描述於以下實例中之例示性小鼠抗TSLPR抗體之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：5)及輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO：6)。亦如圖中所指明，該抗體之重鏈可變區之CDR序列為TYGMS(CDR1；SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(CDR2；SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(CDR3；SEQ ID NO：9)。輕鏈可變區之CDR序列為KASQDVGTAVA(CDR1；SEQ ID NO：10)、WASTRHT(CDR2；SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(CDR3；SEQ ID NO：12)。
抗體主要經由位於6個重鏈及輕鏈互補判定區(CDR)中之胺基酸殘基與靶抗原相互作用。本發明之抗hTSLPR抗體通常具有至少一個與展示於圖5中之相應CDR序列一致的其重鏈CDR序列或輕鏈CDR序列。本發明之某些抗hTSLPR抗體具有與某些揭示於以下實例中之例示性小鼠抗TSLPR抗體(純系1D6.C9)相同的結合特異性。該等抗體可與小鼠抗hTSLPR抗體(純系1D6.C9)競爭結合hTSLPR。本發明之某些抗hTSLPR抗體具有分別與展示於圖5中之相應CDR序列一致的重鏈可變區及輕鏈可變區中之所有CDR序列。因此，該等抗hTSLPR抗體具有3個分別與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9一致之重鏈CDR序列及3個分別與SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12一致之輕鏈CDR序列。
除具有分別與小鼠抗hTSLPR抗體(純系1D6.C9)之相應CDR序列一致的CDR序列之外，本發明之某些抗hTSLPR抗體具有分別與如圖5中所示之小鼠抗體之相應可變區序列(亦即SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)一致的其整個重鏈及輕鏈可變區序列。在某些其他實施例中，除一致CDR序列以外，該等抗體於可變區之框架部分中含有不同於圖5中所展示之相應胺基酸殘基的胺基酸殘基(例如某些如下所述之人源化抗hTSLPR抗體)。然而，該等抗體通常具有與圖5中所展示之相應可變區序列大體上一致(例如75%、85%、90%、95%或99%)的其整體可變區序列。
本發明之抗hTSLPR抗體可為含有兩個重鏈及兩個輕鏈之完整抗體。其亦可為完整抗體或單鏈抗體之抗原結合片段。本發明之抗hTSLPR抗體包括於非人類動物中所產生之抗體(例如圖5中所展示之小鼠抗hTSLPR抗體)。其亦包括經修飾之抗體，其為圖5中所展示之小鼠抗hTSLPR抗體的修飾型。該等經修飾之抗體通常為具有相對於例示性小鼠抗體之特性而言相似或經改良之特性的重組性抗體。舉例而言，於以下實例中例示之小鼠抗hTSLPR抗體可藉由缺失恆定區且用可導致抗體之半衰期(例如血清半衰期)、穩定性或親和力增加之不同恆定區替換來修飾。經修飾之抗體可(例如)藉由構建包括接枝於來自具有不同性質之不同抗體的框架序列上之來自小鼠抗體的CDR序列的表現載體來製造(Jones等人，1986,Nature 321,522－525)。該等框架序列可由公開DNA資料庫獲得。
某些經修飾之抗體為含有部分人類免疫球蛋白序列(例如恆定區)及部分非人類免疫球蛋白序列(例如圖5中所展示之小鼠抗hTSLPR抗體可變區序列)之嵌合抗體。某些其他經修飾之抗體為人源化抗體。一般而言，人源化抗體具有一或多個引入其中之來自非人類來源的胺基酸殘基。在此項技術中熟知使非人類抗體人源化之方法，例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，Nature 321：522－25,1986；Riechmann等人，Nature 332：323－27,1988；及Verhoeyen等人，Science 239：1534－36,1988。可易於採用該等方法以藉由用來自非人類抗hTSLPR抗體之CDR的至少一部分取代人類抗體之相應區來生成本發明之人源化抗hTSLPR抗體。在某些實施例中，本發明之人源化抗hTSLPR抗體，具有在由接枝至相應人類框架區之圖5所示之小鼠抗hTSLPR抗體而來之各免疫球蛋白鏈中的所有3個CDR。
如上所述之抗hTSLPR抗體可在不損失結合特異性或效應器(effector)功能或無不可容忍的結合親和力降低之情況下於可變區與恆定區中經受非關鍵性胺基酸取代、添加或缺失。納入該等變化之抗體通常顯示與衍生該等抗體之參考抗體(例如圖5中所展示之小鼠抗hTSLPR抗體)具大體上之序列一致性。舉例而言，本發明之某些抗hTSLPR抗體之成熟輕鏈可變區具有與圖5中所展示之抗hTSLPR抗體之成熟輕鏈可變區之序列至少75%或至少85%的序列一致性。同樣，該等抗體之成熟重鏈可變區通常展示與圖5中所展示之抗hTSLPR抗體之成熟重鏈可變區之序列至少75%或至少85%的序列一致性。某些經修飾之抗hTSLPR抗體具有與圖5中所展示之小鼠抗hTSLPR抗體(純系1D6.C9)相比相同之特異性及增加之親和力。經修飾之抗hTSLPR抗體(例如人源化抗體)之親和力通常具有與原始小鼠抗體之親和力相比相同或更好之結合親和力。經修飾之抗體之結合親和力為原始小鼠抗體之結合親和力的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
2.嵌合及人源化抗hTSLPR抗體 本發明之某些抗hTSLPR抗體為由來自非人類抗hTSLPR抗體拮抗劑之區以及人類抗體之區組成的嵌合(例如小鼠/人類)抗體。舉例而言，嵌合H鏈可包含與人類重鏈恆定區之至少一部分連接之小鼠抗TSLPR抗體的重鏈可變區之抗原結合區(例如SEQ ID NO：5中所展示之序列)。該嵌合重鏈可與嵌合L鏈組合，該嵌合L鏈包含與人類輕鏈恆定區之至少一部分連接之小鼠抗hTSLPR抗體的輕鏈可變區之抗原結合區(例如SEQ ID NO：6中所展示之序列)。
本發明之嵌合抗hTSLPR抗體可根據以下實例中之揭示內容以及此項技術中已知之方法產生。舉例而言，編碼鼠類抗hTSLPR單株抗體分子之重鏈或輕鏈的基因可用限制酶水解以移除鼠類Fc區，且經編碼人類Fc恆定區之基因的等效部分取代。在此項技術中尤其熟知適用於表現重組性抗體及人源化抗體之表現載體及宿主細胞。可使用標準重組性技術構建表現編碼抗hTSLPR免疫球蛋白鏈之嵌合基因的載體，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press(第三版，2001)；及Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou編，2003)。人類恆定區序列可係選自多種參考來源，其包括(但不限於)彼等列於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office,1991中之參考來源。藉由DNA重組產生嵌合抗體之更特定教示亦已在此項技術中所教示，例如Robinson等人，國際專利公開案PCT/US86/02269；Akira等人，歐洲專利申請案184,187；Taniguchi,M.，歐洲專利申請案171,496；Morrison等人，歐洲專利申請案173,494；Neuberger等人，國際申請案WO 86/01533；Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利申請案125,023；Better(1988)Science 240：1041－1043；Liu(1987)PNAS 84：3439－3443；Liu(1987)J.Immunol.139：3521－3526；Sun(1987)PNAS 84：214－218；Nishimura(1987)Canc.Res.47：999－1005；Wood(1985)Nature 314：446－449；Shaw(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553－1559。
可進一步使具有來自非人類抗體之整個可變區的嵌合抗體人源化以減少抗體於人類中之抗原性。其通常藉由於Fv可變區(框架區或非CDR區)中用來自人類Fv可變區之等效序列或胺基酸殘基替換某些序列或胺基酸殘基來實現。該等經另外取代之序列或胺基酸殘基通常不直接與抗原結合有關。非人類抗體之人源化更通常藉由僅用非人類抗體(例如圖5中所展示之小鼠抗體)之CDR取代人類抗體之CDR來進行。在某些情況下，其接著用來自非人類供體抗體之相應殘基替換人類框架區中之某些其他殘基。通常需要該等其他接枝以改良與抗原之結合。其係由於與非人類供體抗體之活性相比較，僅具有由非人類抗體接枝之CDR之人源化抗體可具有較不完善之結合活性。因此，除CDR之外，本發明之人源化抗hTSLPR抗體通常可於人類框架區中具有經來自非人類供體抗體(例如圖5中所展示之小鼠抗體)之相應殘基替換的某些胺基酸殘基。在此項技術中熟知由CDR取代生成人源化抗體之方法(包括選擇用於替換之框架殘基的標準)。舉例而言，除上述所示與產生嵌合抗體有關之技術之外，製造人源化抗體之其他教示提供於(例如)Winter等人，英國專利申請案GB 2188638A(1987)、美國專利5,225,539；Jones(1986)Nature 321：552－525；Verhoeyan等人，1988 Science 239：1534；及Beidler(1988)J.Immunol.141：4053－4060中。CDR取代亦可使用如(例如)標題為Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes 之WO 94/10332中所述的寡聚核苷酸定點突變進行。
本發明之嵌合或人源化抗hTSLPR抗體可為單價、二價或多價免疫球蛋白。舉例而言，單價嵌合抗體為如上所述藉由嵌合H鏈經由雙硫橋與嵌合L鏈關聯所形成之二聚體(HL)。二價嵌合抗體為藉由兩個HL二聚體經由至少一個雙硫橋關聯所形成之四聚體(H2 L2 )。多價嵌合抗體係基於鏈之聚集。
3.人類抗hTSLPR抗體 除嵌合或人源化抗hTSLPR抗體之外，顯示相同結合特異性及相當或更好結合親和性之全人抗體亦包括於本發明中。舉例而言，人類抗體可具有相對於參考非人類抗體之結合特徵而言相同或更好之結合特徵，該參考非人類抗體含有SEQ ID NO：5之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變區序列。與嵌合或人源化抗體相比，當投與至人類受檢者時，本發明之人類抗hTSLPR抗體具有進一步減少之抗原性。
人類抗hTSLPR抗體可使用在此項技術中已知之方法生成。舉例而言，在抗體中用人類可變區替換非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體之結合特徵而言保持相同結合特徵或提供更好結合特徵的活體內方法已揭示於美國專利申請案第10/778,726號(公開案第20050008625號)中。該方法依靠引導用全人抗體替換非人類參考抗體之可變區的抗原決定基。所得人類抗體通常在結構上與參考非人類抗體無關，但與在與參考抗體相同之抗原上之相同抗原決定基結合。簡言之，連續經抗原決定基引導之互補性替換方法能夠藉由於細胞中設定"競爭體(competitor)"與參考抗體("測試抗體")之各種雜合物之庫之間的競爭作用以在對測試抗體與抗原之結合作出響應之報導體系統存在下與有限量之抗原結合來實現。競爭體可為參考抗體或其衍生物，諸如單鏈Fv片段。競爭體亦可為抗原之天然或人造配位體，其結合於與參考抗體相同之抗原決定基上。競爭體之唯一要求為其結合於與參考抗體相同之抗原決定基上且其與參考抗體競爭結合抗原。測試抗體具有一來自非人類參考抗體之共同抗原結合V區及另一隨機選自各種來源(諸如人類抗體之全套庫)之V區。來自參考抗體之共同V－區充當導引，其使測試抗體定位於抗原上之相同抗原決定基上且處於相同方位上，以便選擇偏向對參考抗體之最高抗原結合保真度。TSLPR結合域之鑑別藉由抗原決定部位定位來實現且展示於圖8中。TSLPR抗體與不連續抗原決定基結合。
許多類型之報導體系統可用以偵測測試抗體與抗原之間的所需交互作用。舉例而言，互補報導體片段可分別與抗原及測試抗體連接，以便由片段互補作用實現之報導體激活僅在測試抗體與抗原結合時存在。當測試抗體－及抗原－報導體片段融合與競爭體共表現時，報導體激活變得依賴於測試抗體與競爭體競爭之能力，其與測試抗體對抗原之親和力成比例。其他可使用之報導體系統包括如美國專利申請案第10/208,730號(公開案第20030198971號)中所揭示之自體抑制性報導體再激活系統(RAIR)的再激活劑或於美國專利申請案第10/076,845號(公開案第20030157579號)中所揭示之競爭激活系統。
在連續經抗原決定基引導之互補性替換系統下，進行選擇以鑑別細胞表現單一測試抗體以及競爭體、抗原及報導體組份。在該等細胞中，各測試抗體與競爭體一對一競爭結合於有限量之抗原。報導體之活性與結合於測試抗體之抗原的量成比例，其又與測試抗體對抗原之親和力及測試抗體之穩定性成比例。當表現為測試抗體時最初基於測試抗體相對於參考抗體之活性的活性來選擇測試抗體。第一輪選擇之結果為一組"雜合"抗體，其每一者由來自參考抗體之相同非人類V區及來自庫之人類V區組成且其每一者在抗原上與參考抗體相同之抗原決定基結合。第一輪中所選之雜合抗體之多者中之一者將對抗原具有可與參考抗體對抗原相當之親和力或具有比參考抗體對抗原之親和力更高的親和力。
在第二V區替換步驟中，將在第一步驟中所選之人類V區用作選擇用同源人類V區之各種庫進行人類替換剩餘非人類參考抗體V區的導引。亦可將第一輪中所選之雜合抗體用作第二輪選擇之競爭體。第二輪選擇之結果為一組全人抗體，其在結構上不同於參考抗體，但其與參考抗體競爭結合於相同抗原。某些所選人類抗體結合於與參考抗體相同之抗原之相同抗原決定基上。在該等所選人類抗體中，一或多者以與參考抗體之親和力相當或比參考抗體之親和力更高之親和力與相同抗原決定基結合。
使用如上所述之小鼠或嵌合抗hTSLPR抗體之一者作為參考抗體，可易於採用該方法來產生以相同結合特異性及相同或更高結合親和力與人類TSLPR結合的人類抗體。此外，該等人類抗hTSLPR抗體亦可自通常生產人類抗體之公司(例如KaloBios,Inc.(Mountain View,CA))購得。
4.其他類型之抗hTSLPR抗體 本發明之抗hTSLPR抗體亦包括單鏈抗體、雙特異性抗體及多特異性抗體。在某些實施例中，本發明之抗體為單鏈抗體。單鏈抗體在單折疊穩定多肽鏈中含有來自重鏈與輕鏈之抗原結合區。照此，單鏈抗體通常保留結合特異性及單株抗體親和力，但具有比經典免疫球蛋白明顯小之尺寸。對於某些應用而言，與完整抗hTSLPR抗體相比，本發明之抗hTSLPR單鏈抗體可提供許多有利特性。該等特性包括(例如)當與小鼠基抗體相比時更快地自體內清除、對於診斷顯象與治療而言組織滲透性更大、及免疫原性顯著降低。使用單鏈抗體之其他潛在益處包括在高產量篩選法中篩選能力增強及非經腸應用的潛力。
本發明之單鏈抗hTSLPR抗體可使用在此項技術中所描述之方法來製備。該等技術之實例包括美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46－88,1991；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995－7999.1993；及Skerra等人，Science 240：1038－1040,1988中所描述之彼等技術。
在某些實施例中，本發明提供衍生化之或與另一官能分子連接之抗hTSLPR抗體以便產生與若干結合位點或靶抗原決定基結合之雙特異性或多特異性分子。官能分子包括另一肽或蛋白質(例如細胞激素、細胞毒素劑、免疫刺激劑或抑制劑、Fab'片段或如以上所討論之其他抗體結合片段)。舉例而言，抗hTSLPR抗體或其抗原結合部分可在功能上與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)連接(例如由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他)。因此，本發明之雙特異性及多特異性抗hTSLPR抗體包含至少一種具有對人類TSLPR之第一結合特異性及對第二靶抗原決定基之第二結合特異性的單株抗hTSLPR抗體或其抗原結合片段。第二靶抗原決定基可為Fc受體，例如人類FcγRI或人類Fcγ受體。因此，本發明包括能夠與FcγR1、FcγR或FcεR表現效應細胞(例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))與表現人類TSLPR之靶細胞(例如人類CD11c＋樹突狀細胞)結合之雙特異性及多特異性分子。該等多特異性(例如雙特異性或多特異性)分子使人類TSLPR表現細胞靶向效應細胞且觸發Fc受體介導型效應細胞活性，諸如人類TSLPR－表現細胞之吞噬作用、抗體依賴型細胞介導型細胞毒性(ADCC)、細胞激素釋放或超氧陰離子產生。
本發明之雙特異性及多特異性抗hTSLPR分子可由在此項技術中所描述之方法製備。該等方法包括化學技術(參見，例如Kranz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807,1981)、多雜交瘤(polydoma)技術(參見，例如美國專利第4,474,893號)或重組DNA技術。本發明之雙特異性及多特異性分子亦可藉由使用在此項技術中已知及如本文中所描述之方法使組份結合特異物(例如抗FcR及抗人類TSLPR結合特異物)結合來製備。舉例而言，雙特異性及多特異性分子之各結合特異物可分別產生且隨後相互結合。當結合特異物為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二醯亞胺、N－琥珀醯亞胺基－S－乙醯基－硫代乙酸酯(SATA)、N－琥珀醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基琥珀醯亞胺基4－(N－馬來醯亞胺甲基)環己烷－1－羧酸酯(磺基－SMCC)。當結合特異物為抗體(例如兩個人源化抗體)時，其可經由兩個重鏈之C－末端鉸鏈區的硫氫鍵結合。鉸鏈區可在結合之前經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如一個硫氫基殘基。
雙特異性及多特異性分子與其特異性靶的結合可由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或西方墨點檢定(Western Blot Assay)確認。該等檢定之每一者通常藉由採用對所關注之複合物具有特異性之標記試劑(例如抗體)來偵測特別關注之蛋白質－抗體複合物的存在。舉例而言，可使用(例如)識別抗體－FcR複合物且與抗體－FcR複合物特異性結合之酶聯抗體或抗體片段來偵測FcR－抗體複合物。或者，可使用多種其他免疫測定之任一者來偵測該等複合物。舉例而言，可將抗體進行放射性標記且用於放射免疫測定(RIA)(參見，例如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays ,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,1986年3月)。可由如使用γ計數器或閃爍計數器之該方法或由自動放射照像術偵測放射性同位素。
III.用於生產抗hTSLPR抗體之聚核苷酸、載體及宿主細胞
本發明提供經大體上純化之聚核苷酸(DNA或RNA)，其編碼包含如上所述之抗hTSLPR抗體鏈之片段或域的多肽。本發明之某些聚核苷酸包含SEQ ID NO：13中所展示之重鏈可變區之核苷酸序列及/或SEQ ID NO：14中所展示之輕鏈可變區之核苷酸序列。本發明之某些其他聚核苷酸包含與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14之核苷酸序列大體上一致(例如至少65%、80%、95%或99%)的核苷酸序列。當由合適表現載體表現時，由該等聚核苷酸所編碼之多肽能夠顯示抗原結合能力。
本發明亦提供編碼來自圖5中所展示之抗hTSLPR抗體之重鏈或輕鏈的至少一個CDR區且通常編碼所有3個CDR區之聚核苷酸。某些其他聚核苷酸編碼圖5中所展示之抗hTSLPR抗體之重鏈及/或輕鏈的所有或大體上所有可變區序列。舉例而言，某些該等聚核苷酸編碼SEQ ID NO：5中所展示之重鏈可變區之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：6中所展示之輕鏈可變區之胺基酸序列。由於密碼簡並，故多種核酸序列將編碼免疫球蛋白胺基酸序列之每一者。
本發明之聚核苷酸可僅編碼抗hTSLPR抗體之可變區序列。其亦可編碼抗體之可變區與恆定區。本發明核酸之某些聚核苷酸序列編碼與SEQ ID NO：5中所展示之1D6.C9小鼠抗hTSLPR抗體之成熟重鏈可變區序列大體上一致(例如至少80%、90%或99%)的成熟重鏈可變區序列。某些其他聚核苷酸序列編碼與SEQ ID NO：6中所展示之1D6.C9小鼠抗體之成熟輕鏈可變區序列大體上一致的成熟輕鏈可變區序列。某些聚核苷酸序列編碼包含小鼠抗體之重鏈與輕鏈之可變區的多肽。某些其他聚核苷酸編碼兩種分別與小鼠抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區大體上一致的多肽區段。
聚核苷酸序列可由重新(de novo )固相DNA合成或由編碼抗hTSLPR抗體或其結合片段之現存序列(例如如以下實例中所述之序列)之PCR突變產生。可由此項技術中已知之方法實現核酸的直接化學合成，諸如Narang等人，1979,Meth.Enzymol. 68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol. 68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett. ,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯法；及美國專利第4,458,066號之固相支撐物法。可如(例如)以下文獻中所述執行由PCR向聚核苷酸序列引入突變：PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification ,H.A.Erlich(編)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications ,Innis等人(編)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res. 19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明亦提供用於產生如上所述之抗hTSLPR抗體的表現載體及宿主細胞。可採用多種表現載體來表現編碼抗TSLPR抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。病毒基表現載體與非病毒表現載體可用以在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現卡匣的游離型載體及人類人造染色體(參見，例如Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於表現哺乳動物(例如人類)細胞中之抗hTSLPR聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、pThioHis B及pThioHis C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、pEBVHis B及pEBVHis C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知之用於表現其他蛋白質的眾多其他載體。適用之病毒載體包括基於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒之載體；痘瘡病毒載體及Semliki Forest病毒(SFV)載體。參見Brent等人，前述；Smith,Annu.Rev.Microbiol. 49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視載體欲表現於其中之所需宿主細胞而定。表現載體通常含有與編碼抗hTSLPR抗體鏈或片段之聚核苷酸操作性連接的啟動子及其他調控序列(例如增強子)。在某些實施例中，採用誘導性啟動子來在除誘發條件外的條件下防止表現插入序列。誘導性啟動子包括(例如)阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子或熱休克啟動子。在不偏向用於編碼序列之群體的情況下在非誘導條件下擴增經轉型之有機體的培養物，該序列之表現產物由宿主細胞更好地耐受。除啟動子之外，亦可要求或需要其他調控要素以有效表現抗hTSLPR抗體鏈或片段。該等要素通常包括ATG起始密碼子及鄰近核糖體結合位點或其他序列。此外，表現效率可藉由包含適合使用中之細胞系統的增強子來增強(參見，例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ. 20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol. ,153：516,1987)。舉例而言，SV40增強子或CMV增強子可用以增加於哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以形成具有由插入抗hTSLPR抗體序列所編碼之多肽的融合蛋白。更通常而言，在包含於載體中之前插入抗hTSLPR抗體序列與信號序列連接。欲用於接受編碼抗hTSLPR抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體使可變區表現為具有恆定區之融合蛋白，藉此導致產生完整抗體或其片段。該等恆定區通常為人類恆定區。
具有且表現抗hTSLPR抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核宿主細胞。E.coli 為一種適用於選殖且表現本發明之聚核苷酸的原核宿主。其他適用之微生物宿主包括桿菌，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis )；及其他腸內菌科，諸如沙門氏菌(Salmonella )、沙雷氏菌(Serratia )；及多種假單胞菌種。在該等原核宿主中，吾人亦可製造表現載體，其通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。此外，將存在許多各種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β－內醯胺酶啟動子系統或噬菌體λ之啟動子系統。該等啟動子通常視情況與操縱基因(operator sequence)一起控制表現，且具有用於啟始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。亦可使用其他微生物(諸如酵母)來表現本發明之抗hTSLPR多肽。亦可使用與桿狀病毒載體組合之昆蟲細胞。
在某些較佳實施例中，將哺乳動物宿主細胞用以表現且產生本發明之抗hTSLPR多肽。舉例而言，其可為表現內源免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如如以下實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或具有外源表現載體之哺乳動物細胞株(例如以下例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。該等細胞包括任何正常致死或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已開發出大量能夠分泌完整免疫球蛋白之合適宿主細胞株，其包括CHO細胞株、多種Cos細胞株、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞株、經轉型之B細胞及融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於(例如)Winnacker,FROM GENES TO CLONES ,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見，例如Queen等人，Immunol.Rev. 89：49－68,1986)；及必需加工信息位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺嘌呤位點、及轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有源自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。合適啟動子可為組成性啟動子、細胞型特異性啟動子、階段特異性啟動子及/或可調節或可調控啟動子。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類立即早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子－增強子組合。
引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，通常將氯化鈣轉染用於原核細胞，而可將磷酸鈣處理或電穿孔用於其他細胞宿主。(通常參見Sambrook等人，前述)。其他方法包括(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉形、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒、免疫脂質體、多價陽離子：核酸結合物、裸DNA、人造病毒粒子、融合疱疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、藥劑增強之DNA吸收及離體轉導。對於長期高產率生產重組性蛋白而言，通常需要穩定表現。舉例而言，穩定表現抗hTSLPR抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明含有病毒複製起點或內源表現要素及可選擇標記基因之表現載體來製備。繼引入載體之後，可使細胞於增殖培養基中生長1－2天，隨後將其轉入選擇性培養基中。可選擇標記之用途為對選擇賦予抵抗性且其的存在使於選擇性培養基中成功表現經引入之序列的細胞生長。抵抗性、經穩定轉染之細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。
IV. 抗hTSLPR抗體之特性
一旦如上所述之抗hTSLPR抗體由表現載體於宿主細胞中或以內生方式於融合瘤中表現，則其可易於自培養基及宿主細胞純化。抗體鏈通常以信號序列表現且因此釋放於培養基中。然而，若抗體鏈並非由宿主細胞天然分泌，則抗體鏈可藉由以溫和清潔劑處理來釋放。隨後抗體鏈可藉由包括硫酸銨沉澱、對固定化靶之親和性層析、管柱層析、凝膠電泳及其類似方法之習知方法來純化。該等方法皆為熟知的且通常用於此項技術中，例如Scopes,Protein Purification ,Springer－Verlag,NY,1982；及Harlow & Lane，前述。
舉例而言，可使表現本發明之抗hTSLPR抗體之所選融合瘤生長於2公升用於單株抗體純化之旋轉燒瓶中。可將上清液過濾且濃縮，隨後以蛋白質A－瓊脂糖或蛋白質G－瓊脂糖進行親和性層析(Pharmacia,Piscataway,NJ)。經溶離之IgG可由凝膠電泳及高效液相層析查核以確保純度。緩衝溶液可換成PBS且濃度可由OD280讀數測定。可將單株抗體等分且儲存於－80℃下。
與其製備方法無關，本發明之抗hTSLPR單株抗體與hTSLPR或其抗原片段特異性結合。若抗體與hTSLPR或其抗原片段結合之解離常數為1 μM、較佳100 nM且最佳1 nM，則存在特異性結合。抗體與hTSLPR結合之能力可藉由直接標記所關注之抗體來偵測，或抗體可未經標記且使用多種夾心檢定格式間接偵測結合。參見，例如Harlow & Lane，前述。具有該結合特異性之抗體很可能具有由以下實例中所論述之1D6.C9小鼠抗hTSLPR抗體所顯示之有利特性。
本發明之抗TSLPR單株抗體能夠拮抗由TSLP所介導之信號傳輸活性。該等活性包括(例如)由諸如TARC及MDC之樹突狀細胞分泌TH 2吸引趨化因子；激活樹突狀細胞、原態CD4＋T細胞擴增及對TH 2表型之極化作用、產生諸如IL－4、IL－5、IL－13 TNFα之原過敏性細胞激素。可採用大量檢定來確定抗hTSLPR抗體是否可抑制TSLP介導之細胞活性。該等檢定包括(例如)於以下實例中所描述之檢定之任一者，諸如使用Ba/F3/hTSLPR/hIL7Rα細胞之細胞增殖檢定、使用Ba/F3/hTSLPR/IL7Rα/Stat5－Luc細胞之螢光素酶報導體檢定及TARC分泌檢定。量測TSLP信號傳輸活性之其他檢定亦描述於此項技術中。參見，例如Reche等人，J.Immunol.,167：336－43,2001；及Isaksen等人，J.Immunol.168：3288－94,2002。
在某些實施例中，本發明之抗hTSLPR抗體阻斷具有圖5中所展示之可變區序列之參考抗hTSLPR抗體(例如以下實例中所描述之小鼠1D6.C9抗體或其嵌合抗體)與hTSLPR多肽的結合或與該結合競爭。該等抗體可為如上所述之全人抗hTSLPR抗體。其亦可為結合於與參考抗體相同之抗原決定基的其他小鼠、嵌合或人源化抗hTSLPR抗體。阻斷參考抗體結合或與該結合競爭之能力表明試驗中之抗hTSLPR抗體結合於與由參考抗體所定義之相同或相似抗原決定基或結合於足夠接近由參考抗hTSLPR抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。該等抗體尤其可能具有由參考抗體所鑑別之有利特性。阻斷參考抗體或與其競爭之能力可由(例如)競爭結合檢定來測定。在競爭結合檢定下，檢查試驗中之抗體抑制參考抗體與共同抗原(諸如TSLPR多肽)特異性結合的能力。若過量測試抗體大體上抑制參考抗體之結合，則測試抗體與參考抗體競爭與抗原的特異性結合。大體上抑制意謂測試抗體通常降低參考抗體之特異性結合達至少10%、25%、50%、75%或90%。
存在大量可用於評估抗hTSLPR抗體與參考抗hTSLPR抗體對與人類TSLPR結合之競爭作用的已知競爭結合檢定。該等檢定包括(例如)固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭檢定(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242－253,1983)；固相直接生物素－抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614－3619,1986)；固相直接標記檢定、固相直接標記夾心檢定(參見Harlow & Lane，前述)；使用I－125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Molec.Immunol.25：7－15,1988)；固相直接生物素－抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546－552,1990)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77－82,1990)。該檢定通常涉及使用經純化之抗原與攜帶該等未標記測試抗hTSLPR抗體及標記參考抗體之任一者結合的固體表面或細胞。競爭性抑制藉由測定在測試抗體存在下與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。測試抗體通常過量存在。由競爭檢定鑑別之抗體(競爭抗體)包括結合於與參考抗體相同之抗原決定基的抗體及結合於足夠接近於由參考抗體所結合之抗原決定基的鄰近抗原決定基而導致發生位阻之抗體。
為測定所選抗TSLPR單株抗體是否結合於獨特抗原決定基，可使用可市售試劑(例如來自Pierce,Rockford,IL之試劑)將各抗體進行生物素標記。可使用經TSLPR多肽塗覆之ELISA板進行使用未標記單株抗體及生物素標記單株抗體之競爭作用研究。生物素標記MAb結合可用鏈球菌－抗生物素蛋白－鹼性磷酸酶探針偵測。為測定經純化之抗TSLPR抗體之同型，可進行同型ELISA。舉例而言，可在4℃下將微量滴定盤之孔以1 μg/ml抗人類IgG塗覆隔夜。在以1% BSA阻斷之後，在環境溫度下使該等板與1 μg/ml或更低之單株抗hTSLPR抗體或經純化之同型對照物反應1至2小時。隨後可使該等孔與人類IgG1或人類IgM－特異性鹼性磷酸酶－結合探針反應。隨後將板顯影且分析以便可測定經純化之抗體之同型。
為證明單株抗hTSLPR抗體結合於表現hTSLPR多肽之活性細胞，可使用流式細胞儀。簡言之，可將表現hTSLPR之細胞株(在標準生長條件下生長)與多種濃度之抗hTSLPR抗體混合於含有0.1% BSA及10%胎牛血清之PBS中且在37℃下培育1小時。在洗滌後，使該等細胞在與一次抗體染色相同之條件下與經螢光素標記之抗人類IgG抗體反應。該等試樣可由FACScan儀器使用光及側向散射特性以於單一細胞上設門來進行分析。除流式細胞儀檢定之外或代替流式細胞儀檢定，可使用使用螢光顯微鏡術之替代性檢定。細胞可完全如上所述染色且由螢光顯微鏡術進行檢驗。該方法允許目測個別細胞，但可視抗原密度而使敏感性減小。
本發明之抗hTSLPR抗體可進一步由西方墨點法測試與hTSLPR多肽或抗原片段之反應性。簡言之，可製備經純化之hTSLPR多肽或融合蛋白或來自表現TSLPR之細胞之細胞提取物且使其經受十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在進行電泳之後，將經分離之抗原轉移至硝化纖維素膜上，以10%胎牛血清阻斷且以欲測試之單株抗體進行探查。人類IgG結合可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶偵測且以BCIP/NBT受質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)顯影。
V.非免疫球蛋白骨架
只要所得多肽包括至少一個對靶蛋白質具有特異性之結合區，則可採用多種抗體/免疫球蛋白框架或支架。該等框架或支架包括人類免疫球蛋白之5個主要個體基因型或其片段(諸如彼等揭示於本文中其它地方之人類免疫球蛋白)且包括較佳具有人源化體之其他動物物種之免疫球蛋白。在此方面，諸如彼等於駱駝科中所鑑別之單一重鏈抗體具有特定重要性。熟習此項技術者連續發現且開發新穎框架、支架及片段。
在一態樣中，本發明係關於使用本發明之CDR可接枝於其上之非免疫球蛋白支架產生非免疫球蛋白基抗體。只要已知或未來非免疫球蛋白框架及支架包含對SEQ ID NO：X之靶蛋白質具有特異性之結合區，則可採用該等已知或未來非免疫球蛋白框架及支架。本文中將該等化合物稱為"包含靶特異性結合區之多肽"。已知非免疫球蛋白框架或支架包括(但不限於)Adnectins(纖維結合蛋白)(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、ankyrin(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd(Cambridge,MA)及Ablynx nv(Zwijnaarde,Belgium))、脂質運載蛋白(lipocalin)(Anticalins)(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小分子免疫藥物(small modular immuno－pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、maxybodies(Avidia,Inc.(Mountain View,CA))、蛋白質A(Affibody AG,Sweden)及affilin(γ－晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
(i)Adnectin化合物療法 adnectin支架係基於纖維結合蛋白III型域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(module)(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型域具有7或8個分佈於兩個β折疊之間的β股，該等β股本身相對於彼此封包以形成蛋白質核心，且纖維結合蛋白III型域進一步含有環(類似於CDR)，該等環彼此連接β股且暴露於溶劑中。在β折疊夾層之各邊緣處存在至少3個該等環，其中該邊緣為與β股方向垂直之蛋白質的邊界。(US 6,818,418)。
儘管整個折疊與最小功能抗體片段(包含駱駝及美洲駝IgG中之整個抗原識別單位之重鏈可變區)之折疊緊密相關，但該等纖維結合蛋白基支架並非免疫球蛋白。由於該結構，故非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力上與抗體之彼等性質及親和力相似的抗原結合特性。該等支架可用於與活體內抗體親和力成熟之過程相似的活體外環隨機化及改組策略。該等纖維結合蛋白基分子可用作其中分子之環區域可使用標準選殖技術以本發明之CDR替換的支架。
(ii)ankyrin－分子搭配物 該技術係基於使用具有源自錨蛋白之重複模塊的蛋白質作為支架以攜帶可用於與不同靶結合之可變區。錨蛋白重複模組為由兩個反平行α－螺旋及β轉角組成之33個胺基酸多肽。主要藉由使用核糖體展示優化可變區之結合。
(iii)Maxybodies/Avimer－Avidia Avimer係源自含有天然A域之蛋白質，諸如LRP－1。該等域藉由蛋白質－蛋白質交互作用之性質來使用且人類中超過250種蛋白質在結構上係基於A域。Avimer由大量經由胺基酸連接子連接之不同"A域"單體(2－10個)組成。可使用於(例如)20040175756、20050053973、20050048512及20060008844中所描述之方法製造可與靶抗原結合的Avimer。
(vi)蛋白質A－Affibody Affibody親和力配位體為由基於蛋白質A之IgG結合域之一者的支架之三螺旋束組成的小型單純蛋白質。蛋白質A為來自細菌金黃色葡萄球菌之表面蛋白。該支架域由58個胺基酸組成，其中13個胺基酸經隨機化以產生具有大量配位體變異體之Affibody庫(參見，例如US 5,831,012)。Affibody分子模擬抗體，與分子量為150 kDa之抗體相比，其具有6 kDa之分子量。儘管其尺寸較小，但Affibody分子之結合位點與抗體之結合位點類似。
(v)Anticalins－Pieris Anticalins為由Pieris ProteoLab AG公司開發之產品。其源自脂質運載蛋白，一種分佈廣泛之小型且穩固的蛋白質群，該蛋白質群通常與化學上敏感或不可溶化合物之生理輸送或儲存有關。若干天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。
蛋白質架構重演在硬質框架之上具有高變環之免疫球蛋白。然而，與抗體或其重組性片段形成對比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基的單一多肽鏈構成，僅稍微大於單一免疫球蛋白域。
構成結合袋之4個環之組展示顯著結構塑性且允許多種側鏈。因此結合位點可以專有方法再成形以便識別具有較高親和力及特異性之不同形狀的經指定靶分子。
脂質運載蛋白家族之一種蛋白質，Pieris Brassicae之後膽色素－結合蛋白(BBP)，已用以藉由誘變處理4個環之組來開發anticalins。描述"anticalins"之專利申請案之一實例為PCT WO 199916873。
(vi)Affilin－Scil Proteins A ffilinT M 分子為小型非免疫球蛋白，其經設計對蛋白質及小分子具有特異性親和力。新AffilinT M 分子可非常快地選自兩個庫，其之個者係基於源自不同人類支架蛋白。AffilinT M 分子並不展示與免疫球蛋白之任何結構同源性。Scil Proteins採用兩種AffilinT M 支架，其之一者為γ結晶(人類結構化眼晶狀體蛋白)且另一者為"泛素"超家族蛋白。兩種人類支架皆為極小型的，其展示高溫穩定性且幾乎抵抗pH值變化及變性劑。該高穩定性主要歸因於蛋白質之經擴增之β折疊結構。源自γ結晶之蛋白之實例描述於WO 200104144中且"類泛素"蛋白之實例描述於WO 2004106368中。
VI.抗hTSLPR抗體之治療應用
抗hTSLPR抗體可藉由抑制TSLP信號傳輸活性而用於許多治療性或預防性應用中。該等應用包括治療由TSLP信號傳輸所介導之疾病或病狀，諸如彼等影響B細胞進展、T細胞進展、T細胞受體基因重排或調節Stat5轉錄因子之疾病或病狀。舉例而言，可採用抗hTSLPR拮抗劑抗體來抑制或降低由TH 2細胞所介導之不當免疫反應。抗hTSLPR拮抗劑抗體尤其適於治療患有與TSLP信號傳輸相關或由TSLP信號傳輸所介導之過敏性發炎病症的人類患者。受本發明之抗hTSLPR抗體治療的過敏性發炎疾病包括(例如)(1)哮喘，與氣流阻塞及支氣管過度反應相關之氣管慢性發炎疾病；(2)異位性皮膚炎，需要長期間歇治療之慢性惡化性發炎皮膚病；及(3)過敏性鼻炎，由與異位性皮膚炎相關之TH 2淋巴細胞所介導之鼻黏膜發炎病症。在美國及若干主要歐洲國家中，預期哮喘、異位性皮膚炎及過敏性鼻炎之診斷流行率在2013年分別由目前四千六百萬人增加至五千三百萬人、由目前三千一百七十萬人增加至三千七百二十萬人及由目前五千五百九十萬人增加至六千四百五十萬人。約50%至80%患有異位性皮膚炎之患者患有哮喘或過敏性鼻炎或將發展為哮喘或過敏性鼻炎。
現可用於治療過敏症之大多數藥物旨於使症狀減輕，而在可能提供長期疾病改善之免疫調節領域方面作用相對較少。本發明之抗hTSLPR抗體可對患有任何該等過敏性疾病之受檢者(例如，人類患者)提供新穎且有效的治療。藉由預防TSLP活化TSLP受體信號轉導途徑，本發明之抗hTSLPR抗體可阻斷TH 2反應及負責啟始且維持過敏性炎症之細胞激素的產生。因此，該方法對患有異位性皮膚炎、哮喘及過敏性鼻炎之患者具有誘發長期治療作用及疾病改善益處的潛在作用。
在另一實施例中，本發明提供一種具有上述抗體或功能片段或保守變異體之任一者的至少一種及其醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。
在某些實施例中，本發明提供一種治療與具有受體靶hTSLP之細胞之存在相關之病症或病狀的方法。該方法涉及向需要其之受檢者投與有效量之上述醫藥組合物之任一者。在一相關實施例中，欲治療之病症或病狀為呼吸病症。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為支氣管哮喘，其為以氣管過度反應(AHR)、黏液過度產生、纖維化及血清IgE含量升高為特徵之肺的常見持續性發炎疾病。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為異位性(過敏性)皮膚炎，其為兒童最常見皮膚病且以強烈瘙癢及慢性濕疹斑為特徵。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀係選自其他發炎性或阻塞性氣管疾病及病狀，諸如COPD、急性肺損傷(ALI)、急性/成人呼吸窘迫綜合症(ARDS)、呼吸困難、過敏性氣管發炎、小氣管疾病、肺癌、患有鐮狀細胞病及肺動脈高血壓之患者的急性胸部症候群以及由其他藥物療法(尤其其他經吸入藥物療法)引發之氣管過度反應惡化。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為任何類型或成因之支氣管炎，包括(例如)急性支氣管炎、arachidic支氣管炎、卡他性(catarrhal)支氣管炎、格魯布性(croupus)支氣管炎、慢性支氣管炎或結核性支氣管炎。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀包括任何類型或成因之肺塵埃沈著病(pneumoconiosis)(發炎性常見職業性肺病，常常伴隨氣管阻塞，無論慢性或急性皆藉由反覆吸入粉塵引起)，其包括(例如)礬土沈著病、炭末沈著病、石綿沈著病、石硝沈著病、睫毛脫落、鐵質沈著病、矽粉沉著病、煙草未沉著病及棉屑沉著病。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀係選自異位性鼻炎(花粉熱)及慢性竇炎。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀係選自其他皮膚發炎病狀，例如牛皮癬或紅斑性狼瘡。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為發炎性腸道疾病，諸如潰瘍性結腸炎及克隆氏病(Crohn's disease)。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀係選自其他纖維變性病狀，諸如全身性硬化症、肝纖維化、肺纖維化、特發性肺纖維化或纖維性肺。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為腫瘤復發或轉移。Th2細胞激素之抑制已展示在動物模型中增強抗病毒疫苗且可有利於治療HIV及其他傳染病[Ahlers,J.D.等人，Proc Natl Acad Sci U S A,2002]。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為呼吸道病毒感染，該呼吸道病毒感染會使既存之慢性病症諸如哮喘、慢性支氣管炎、COPD、中耳炎及竇炎惡化。所治療之呼吸道病毒感染可能併發二次細菌感染諸如中耳炎、竇炎或肺炎。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀係選自其他疾病或病狀，尤其是併發發炎之疾病或病狀，例如包括類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎之骨骼及關節疾病；及其他疾病，諸如動脈粥樣硬化、多發性硬化症及例如繼發於心臟、腎臟、肝臟、肺或骨髓移植之後之急性及慢性同種異體移植排斥。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為內毒素性休克、絲球體腎炎、大腦及心臟局部缺血、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、囊腫性纖維化、病毒感染及與其相關之惡化、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多發性硬化症(MS)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )相關之胃炎、及癌症(尤其卵巢癌生長)。
在另一實施例中，欲治療之病症或病狀為由人類鼻病毒、其他腸病毒、冠狀病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合性病毒或腺病毒造成之人類病毒感染所引起的症狀。
根據本發明之治療可為症狀性或預防性治療。
例如如由Wada等人，J.Exp.Med (1994)180：1135－40；Sekido等人，Nature (1993)365：654－57；Modelska等人，Am.J.Respir.Crit.Care.Med (1999)160：1450－56；及Laffon等人(1999)Am.J.Respir.Crit.Care Med. 160：1443－49所描述，本發明之藥劑對抑制發炎病狀(例如對發炎性氣管疾病)的有效性可在具有氣管發炎或其他發炎病狀之動物模型(例如小鼠、大鼠或兔模型)中證明。
在另一實施例中，本發明提供一種鑑別具有hTSLP受體之細胞的方法。該方法涉及使細胞與進一步具有可偵測標記之上述抗體或抗體片段之任一者接觸。該標記為放射性、螢光性、磁性、順磁性或化學發光的。該方法進一步可涉及上述成像或分離經標記細胞之任一者。
在另一實施例中，上述人類或人源化抗體或抗體片段之任一者為合成的。
在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物及其他治療劑。
尤其在治療阻塞性或發炎性氣管疾病(諸如彼等上文中所提及之疾病)時，其他治療劑可係選自由消炎劑、支氣管擴張劑、抗組織胺劑或止咳藥物組成之群，例如作為該等藥物之治療活性增效劑或作為降低該等藥物之所需劑量或潛在副作用的方法。本發明之治療劑可與另一藥物混合成固定醫藥組合物或其可與另一藥物分別投與、在投與另一藥物之前投與、同時投與或在投與另一藥物之後投與。因此，本發明包括上文中所述之本發明之藥劑與消炎劑、支氣管擴張劑、抗組織胺劑或止咳藥物的組合，本發明之藥劑及該藥物處於同一或不同醫藥組合物中。
合適之消炎藥包括類固醇，尤其糖皮類固醇，諸如布地奈德(budesonide)、倍氯米松二丙酸酯(beclamethasone dipropionate)、氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate)、環索奈德(ciclesonide)或糠酸莫美他松(mometasone furoate)之或於以下專利中所描述之類固醇：WO 02/88167、WO 02/12266、WO 02/100879、WO 02/00679(尤其實例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99及101之彼等類固醇)、WO 03/35668、WO 03/48181、WO 03/62259、WO 03/64445、WO 03/72592、WO 04/39827及WO 04/66920；非類固醇糖皮質激素受體促效劑，諸如於DE 10261874、WO 00/00531、WO 02/10143、WO 03/82280、WO 03/82787、WO 03/86294、WO 03/104195、WO 03/101932、WO 04/05229、WO 04/18429、WO 04/19935及WO 04/26248中所描述之彼等促效劑；LTB4拮抗劑，諸如BIIL 284、CP－195543、DPC11870、LTB4乙醇醯胺、LY 293111、LY 255283、CGS025019C、CP－195543、ONO－4057、SB 209247、SC－53228及於US 5451700中所描述之彼等拮抗劑；LTD4拮抗劑，諸如孟魯司特(montelukast)、普魯司特(pranlukast)、紮魯司特(zafirlukast)、安可來(accolate)、SR2640、Wy－48,252、ICI 198615、MK－571、LY－171883、Ro 24－5913及L－648051；PDE4抑制劑，諸如西洛司特(cilomilast)(ArifloGlaxoSmithKline)、羅氟司特(Roflumilast)(Byk Gulden)、V－11294A(Napp)、BAY19－8004(Bayer)、SCH－351591(Schering－Plough)、阿羅茶鹼(Arofylline)(Almirall Prodesfarma)、PD189659/PD168787(Parke－Davis)、AWD－12－281(Asta Medica)、CDC－801(Celgene)、SelCID(TM)CC－10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T－440(Tanabe)、KW－4490(Kyowa Hakko Kogyo)及於以下專利中所揭示之彼等抑制劑：WO 92/19594、WO 93/19749、WO 93/19750、WO 93/19751、WO 98/18796、WO 99/16766、WO 01/13953、WO 03/104204、WO 03/104205、WO 03/39544、WO 04/000814、WO 04/000839、WO 04/005258、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/018431、WO 04/018449、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/019944、WO 04/019945、WO 04/045607及WO 04/037805；A2 A 促效劑，諸如於以下專利中所描述之彼等促效劑：EP 1052264、EP 1241176、EP 409595A2、WO 94/17090、WO 96/02543、WO 96/02553、WO 98/28319、WO 99/24449、WO 99/24450、WO 99/24451、WO 99/38877、WO 99/41267、WO 99/67263、WO 99/67264、WO 99/67265、WO 99/67266、WO 00/23457、WO 00/77018、WO 00/78774、WO 01/23399、WO 01/27130、WO 01/27131、WO 01/60835、WO 01/94368、WO 02/00676、WO 02/22630、WO 02/96462及WO 03/086408；及A2 B 拮抗劑，諸如於WO 02/42298中所描述之彼等拮抗劑。
合適之支氣管擴張藥物包括抗膽鹼劑或抗毒蕈鹼劑，尤其溴化異丙托銨、溴化氧托銨、噻托銨鹽及CHF 4226(Chiesi)及胃長寧(glycopyrrolate)，且包括於以下專利中所描述之彼等藥劑：EP 424021、US 3714357、US 5171744、WO 01/04118、WO 02/00652、WO 02/51841、WO 02/53564、WO 03/00840、WO 03/33495、WO 03/53966、WO 03/87094、WO 04/018422及WO 04/05285；及β－2腎上腺素能受體促效劑，諸如舒喘寧(albuterol)(沙丁胺醇(salbutamol))、奧西那林(metaproterenol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeterol)、非諾特羅(fenoterol)、異丙喹喘寧(procaterol)且尤其福莫特羅(formoterol)、卡莫特羅(carmoterol)及其醫藥學上可接受之鹽；及WO 00/75114(該文件以引入的方式併入本文中)之式I化合物(呈游離或鹽或溶劑合物形式)，較佳為其實例之化合物，尤其為化合物(5－[(R)－2－(5,6－二乙基－二氫茚－2－基胺基)－1－羥基－乙基]－8－羥基－1H－喹啉－2－酮)及其醫藥學上可接受之鹽；以及WO 04/16601之式I化合物(呈游離或鹽或溶劑合物形式)；以及以下專利之化合物：EP 1440966、JP 05025045、WO 93/18007、WO 99/64035、US 2002/0055651、WO 01/42193、WO 01/83462、WO 02/66422、WO 02/70490、WO 02/76933、WO 03/24439、WO 03/42160、WO 03/42164、WO 03/72539、WO 03/91204、WO 03/99764、WO 04/16578、WO 04/22547、WO 04/32921、WO 04/33412、WO 04/37768、WO 04/37773、WO 04/37807、WO 04/39762、WO 04/39766、WO 04/45618、WO 04/46083、WO 04/80964、EP 1460064、WO 04/087142、WO 04/089892、EP 01477167、US 2004/0242622、US 2004/0229904、WO 04/108675、WO 04/108676、WO 05/033121、WO 05/040103及WO 05/044787。
合適之雙重消炎與支氣管擴張藥物包括雙重β－2腎上腺素能受體促效劑/蕈毒鹼拮抗劑，諸如於US 2004/0167167、WO 04/74246及WO 04/74812中所揭示之彼等雙重β－2腎上腺素能受體促效劑/蕈毒鹼拮抗劑。
合適之抗組織胺劑藥物包括西替利嗪鹽酸鹽(cetirizine hydrochloride)、乙醯胺苯酚、反丁烯二酸氯馬斯汀(clemastine fumarate)、異丙嗪(promethazine)、氯雷他定(loratidine)、地氯雷他定(desloratidine)、苯海拉明(diphenhydramine)及弗克芬德鹽酸鹽(fexofenadine hydrochloride)、艾提斯汀(activastine)、阿司咪唑(astemizole)、氮拉斯汀(azelastine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、咪唑斯汀(mizolastine)及特非拉丁(tefenadine)以及於JP 2004107299、WO 03/099807及WO 04/026841中所揭示之彼等藥物。
亦可使用本發明之治療劑與抗膽鹼劑或抗毒蕈鹼劑、類固醇、β－2促效劑、PDE4抑制劑、多巴胺受體促效劑、LTD4拮抗劑或LTB4拮抗劑之組合。本發明之藥劑與消炎藥之其他適用組合為彼等與趨化因子受體之其他拮抗劑的組合，該等趨化因子受體拮抗劑例如為CCR－1、CCR－3、CCR－4、CCR－5、CCR－6、CCR－7、CCR－8、CCR－9及CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5；尤其CCR－5拮抗劑，諸如Schering－Plough拮抗劑SC－351125、SCH－55700及SCH－D；Takeda拮抗劑，諸如N－[[4－[[[6,7－二氫－2－(4－甲基苯基)－5H－苯幷環庚烯－8－基]羰基]胺基]苯基]－甲基]－四氫－N,N－二甲基－2H－哌喃－4－銨氯化物(TAK－770)、於US 6166037(尤其請求項18及19)、WO 0066558(尤其請求項8)、WO 0066559(尤其請求項9)、WO 04/018425及WO 04/026873中所描述之CCR－5拮抗劑。
其他治療劑亦可係選自由其他細胞激素結合分子、尤其其他細胞激素之抗體、尤其與諸如於PCT/EP2005/00836中所描述之抗IL4抗體、諸如Xolair之抗IgE抗體、抗IL31抗體、抗IL31R抗體、諸如於WO 05/007699中所描述之抗IL13抗體、抗內皮因子抗體、抗IL1b抗體、抗TSLP抗體或另一抗hTSLPR抗體的組合組成之群。
可採用本發明之抗hTSLPR拮抗劑抗體來治療性地與預防性地治療受檢者。在治療應用中，向已受由TSLP信號傳輸與TSLP信號傳輸相關之過敏性疾病影響的受檢者投與包含抗hTSLPR拮抗劑抗體(例如人源化抗hTSLPR抗體)之組合物。該組合物含有足以治癒、部分停止或在可偵測程度上減緩病狀進展及其併發症之量的抗體。在預防性應用中，向並未患有過敏性發炎病症之患者投與含有單株抗hTSLPR抗體之組合物。確切而言，其針對處於發展出過敏性發炎病症之誘因危險下或具有發展出過敏性發炎病症之誘因的受檢者。該等應用使受檢者得以增強患者抵抗力或延遲由TSLP信號傳輸所介導之過敏性發炎病症的進展。
VII.醫藥組合物
本發明提供與醫藥學上可接受之載劑一起調配之包含抗hTSLPR單株抗體(完整或結合片段)的醫藥組合物。該等組合物可另外含有適於治療或預防特定過敏性病症之其他治療劑，例如以上所示之已知抗過敏劑。醫藥學上之載劑增強組合物或使組合物穩定或有助於組合物之製備。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、衣料、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。
可由此項技術中已知之多種方法投與本發明之醫藥組合物。投藥途徑及/或方式視所需結果而變化。較佳靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投藥或投與至靶部位附近。醫藥學上可接受之載劑將適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或注入)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)可以材料塗覆以保護化合物不受酸作用及其他可鈍化化合物之天然條件影響。
該組合物將為無菌及液體組合物。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之衣料、藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。在多數情況下，較佳於組合物中包括等滲劑，例如糖、諸如甘露糖醇或山梨糖醇之多元醇及氯化鈉。可藉由使延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)包括於組合物中而促使長期吸收可注射組合物。
本發明之醫藥組合物可根據所熟知且通常在此項技術中所用之方法製備。參見，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy ,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。治療有效劑量或有效劑量之抗hTSLPR抗體通常用於本發明之醫藥組合物。藉由熟習此項技術者已知之習知方法將抗hTSLPR抗體調配成醫藥學上可接受之劑型。調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量或劑量可隨治療情況之迫切要求按比例降低或增加。尤其有利的為調配非經腸組合物成單位劑型以便於投藥及劑量之均一性。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單次劑量用於欲治療之受檢者的實體離散單位；各單位含有計劃與所需醫藥載劑相關聯用以產生所需治療作用的預定量之活性化合物。
可改變本發明之醫藥組合物中之活性成份的實際劑量水準以便獲得在對患者無毒性之情況下有效達成特定患者、組合物及投藥方式所需之治療反應的一定量活性成份。所選劑量水準視多種藥物動力學因子而定，該等藥物動力學因子包括本發明所用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、欲治療患者之年齡、性別、體重、病狀、全身健康情況及前病史及其類似因子。
醫師或獸醫可以比獲得所需治療作用所需水準更低之水準的以醫藥組合物形式使用之本發明抗體的劑量開始且逐步增加劑量直至達成所需作用。一般而言，用於治療本文中所描述之過敏性發炎病症之本發明組合物的有效劑量視許多不同因子而改變，改等因子包括投藥方式、靶位點、患者生理狀態、患者為人類或動物、所投與之其他藥物及治療為預防性或治療性的。需要滴定治療劑量以優化安全及功效。對於以抗體投藥而言，劑量範圍為以宿主體重計之約0.0001至100 mg/kg且更通常0.01至5 mg/kg。舉例而言，劑量可為1毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或在1－10毫克/公斤體重範圍內。例示性治療方案需要每兩週投藥一次或一月投藥一次或每3至6個月投藥一次。
通常多次投與抗體。單次劑量之間的間隔可為數週、數月或數年。間隔亦可為據量測患者中抗hTSLPR抗體之血液含量所指明之不定期的。在某些方法中，調節劑量以達成1－1000 μg/ml之血漿抗體濃度且在某些方法中達成25－300 μg/ml之血漿抗體濃度。或者，抗體可以持續釋放型調配物形式投與，在該情況下不需頻繁投藥。劑量及頻率視抗體在患者中之半衰期而改變。一般而言，人源化抗體展示其半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性的或治療性的而改變。在預防性應用中，經長時間以相對較長間隔下投與相對較低之劑量。某些患者在其生命之剩餘時間內持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短間隔投與相對較高劑量直至疾病進展降低或終止且較佳直至患者展示病症之部分或完全改善。此後，該患者可按預防性方案投藥。
實例
提供以下實例以進一步說明本發明，但該等實例不限制本發明之範疇。本發明之其他變體將對一般熟習此項技術者易於瞭解且包涵於隨附申請專利範圍中。
實例1.開發小鼠抗hTSLPR拮抗劑抗體
該實例描述小鼠抗hTSLPR拮抗劑抗體之開發。以由R&D System(Minneapolis,MN)(目錄編號981－TR，批號EDY1312A)購得之人類TSLPR(Met 1－Lys 231)/人類IgG1 Fc(Pro 100－Lys 330)融合蛋白使Bcl2 Wehi22小鼠(#1770)免疫。以經18天總計8次注射執行該免疫。使B細胞自周邊淋巴結中分離且融合於F0骨髓瘤細胞(ATCC,Manassas,VA)中。藉由針對hTSLPR/Fc蛋白之ELISA對抗體產生進行篩選。獲得總共24個產生特異性識別hTSLPR之抗體的純系。在FACS檢定(BD Biosciences,San Jose,CA)中分析hTSLPR抗體與細胞表面TSLPR之結合。簡言之，將BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞以融合瘤培養物上清液培育、接著以FITC結合之抗小鼠IgG培育且於FACS機器上分析。結果展示24個純系中之14個融合瘤純系能夠與細胞表面受體結合。
隨後採用於BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞中之hTSLP依賴型細胞增殖檢定來篩選hTSLPR拮抗劑抗體。該等細胞表現人類TSLPR與IL7Rα且能夠對人類TSLP之刺激作出反應(Reche等人，J.Immunol.,167：336－43,2001)。基本上如Reche等人中所述進行細胞增殖檢定。簡言之，將BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞以來自經培養之上清液中之抗體預培育1小時，且以圖1中所指明之濃度的hTSLP誘導。使用Alamar Blue(TREK Diagnositc Systems,Cleveland,OH)量測細胞增殖。對於各親代純系而言，將1至3個次純系用於檢定中。如圖1中所展示之結果表明3個來自純系1D6之次純系展示強拮抗劑活性。
將來自次純系之一者(1D6.C9)的單株抗體(mAb)純化(圖2C)。簡言之，將來自Miniperm培養物(Vivascience,Carlsbad,CA)之無血清條件培養基以Cleanascite(LigoChem,Fairfield,NJ)處理。隨後將抗體經蛋白質G樹脂(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)純化。將經純化之抗體在如上所述之細胞增殖檢定中測試。將Ba/F3－hTSLPR－hIL7Rα細胞或Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞以不同濃度之抗體處理1小時，隨後添加1 ng/ml hTSLP。該等結果表明BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞(圖3A)與Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞(圖3B)之TSLP－依賴型增殖藉由以劑量依賴型方式添加小鼠抗hTSLPR抗體來抑制。
此外，亦採用螢光素酶報導體檢定來檢驗抗體對經TSLP介導之信號傳輸活性之作用。TSLP誘導Stat3及Stat5於Baf3/hTSLPR/hIL7Rα細胞中之磷酸化(Reche等人，前述)。該檢定經設計以在回應TSLP信號傳輸之Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞中控制Stat5下量測報導體基因表現。簡言之，Stat－Luc報導體構築體藉由使Stat一致結合位點插入並不含有啟動子及增強子之pGL2基本Luc報導體載體(Promega,Madison,WI)中來產生。經插入之Stat結合位點含有具有核心Stat結合序列TTCCCGGAA(SEQ ID NO：16)之GATTTCCCCGAAATG序列要素(SEQ ID NO：15)的8個複本(Yan等人，Cell.84：421－30,1996；及Saylors等人，Gene Ther.6：944－6,1999)。將Stat－Luc報導體構築體引入BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞中。將所得BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞以不同濃度之小鼠抗體處理1小時，隨後添加1 ng/ml hTSLP。使用Bright Glo(Promega,Madison,WI)量測螢光素酶活性。圖3C中展示由檢定所得之結果。與由細胞增殖檢定所得之結果相似，來自Stat5－Luc報導體檢定之數據亦證明小鼠抗hTSLPR抗體之劑量依賴型拮抗劑活性。
由RT－PCR選殖出mAb 1D6.C9重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區。用於鑑別重鏈及輕鏈之可變區的引子序列如下。用於VH之引子為：(1)VH9：GATGGCAGCWGCYCAAAG(SEQ ID NO：1)；及(2)H－恆定：GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC(SEQ ID No：2)。用於VL之引子為：(1)LCV3：GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA(SEQ ID NO：3)；及L－恆定：GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG(SEQ ID NO：4)。
簡言之，總RNA自1D6.C9純系中分離。使用針對重鏈或輕鏈可變區之信號序列的前向引子及針對重鏈CH1區或輕鏈K恆定區之反向引子進行RT－PCR。將PCR產物選殖於pCR II或pcDNA3.1/V5－His－TPOP－TA載體中用於生成序列。隨後測定該抗體純系之重鏈及輕鏈可變區序列之聚核苷酸序列(圖4)。圖5中展示可變區之相應胺基酸序列(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)。圖5中亦指明根據Kabat等人(前述)之編號系統所推導之CDR區及框架區。
實例2.產生嵌合抗hTSLPA抗體
該實例描述嵌合抗hTSLPR抗體之產生及表徵。嵌合抗體含有來自以上所示之小鼠抗hTSLPR抗體1D6.C9純系之可變區及來自人類免疫球蛋白之恆定區。
為產生嵌合抗體，使用PCR技術及於設計用於選殖於卡匣載體中之實例1中所描述之引子序列製備針對人類TSLPR純系1D6.C9之小鼠抗體的可變區。隨後將PCR產物分別選殖於含有使用表1中所展示之序列與人類免疫球蛋白前導序列、J－區段及剪接供體信號之順框融合的卡匣載體中。隨後將該等序列轉移至含有人類免疫球蛋白恆定區之哺乳動物表現載體(例如SP2/0載體)中。
對表現重鏈之純系的選擇係基於新黴素選擇，而使用二氫葉酸還原酶(dhfr)選擇來選擇表現輕鏈之純系。使用甲胺喋呤(methotrexate)啟始基因擴增。將重鏈之可變區卡匣分別轉移至人類IgG1及IgG4哺乳動物表現載體中。
繼產生IgG1嵌合抗體之次選殖後，將嵌合IgG1重鏈及K輕鏈之DNA質體共電穿孔於SP2/0骨髓瘤細胞中。同樣，為產生IgG4嵌合抗體，且將嵌合IgG4重鏈及K輕鏈共電穿孔於SP2/0骨髓瘤細胞中。將該等細胞以遺傳黴素(geneticin)選擇且隨後培養且於含有遺傳黴素及甲胺喋呤之生長培養基中擴增。使細胞適應於用於抗體純化之無血清培養基。將由經轉染之SP2/0細胞分泌之嵌合IgG1及IgG4抗體純化(圖2A及圖2B)。使經純化之嵌合IgG1及IgG4抗體之拮抗劑活性與Luc報導體檢定中之小鼠抗體之拮抗劑活性相比。將針對死亡受體5(DR5)之IgG1嵌合抗體用作負對照。如由過度表現hTSLPR、hIL7Rα及Stat5－Luc之Ba/F3細胞中之報導體基因表現所量測，結果表明嵌合抗hTSLPR抗體顯示與小鼠IgG1抗體相似之拮抗劑活性(圖6)。
實例3.抗hTSLPR抗體抑制經TSLP介導之TARC分泌
該實例描述由抗hTSLPR拮抗劑抗體抑制自人類單核細胞之經TSLP介導的TARC部分。由人類單核細胞檢驗以上所示之小鼠抗hTSLPR抗體與嵌合抗hTSLPR抗體對TH 2吸引胸腺及活化調節趨化因子(TARC)之經TSLP介導之分泌的作用。除添加抗hTSLPR抗體外，基本上如Soumelis等人，Nat Immunol.3：673－80,2002中所述進行TARC分泌檢定。圖7展示該等結果。上面兩幅圖分別展示以TSLP刺激之人類單核細胞及CD11＋樹突狀細胞的TARC部分。下面三幅圖分別展示3種不同抗hTSLPR抗體對人類單核細胞之經TSLP介導之TARC部分的作用。如圖中所證明，小鼠抗hTSLPR抗體及嵌合抗hTSLPR抗體(IgG1與IgG4同型)皆能以劑量依賴性方式抑制人類單核細胞之TARC分泌。其進一步使抗hTSLPR抗體對TSLP信號傳輸之拮抗活性有效。
使用標準Biacore電漿共振分析進行測定抗hTSLPR抗體之結合親和力的結合性研究以量測"平衡"(ka)及"解離"(kd)速率。該等量測導致計算抗體之結合常數(KD)。亦使用ForteBiop進行進一步分析以檢驗溶液結合動力學。此外，使用細胞檢定測定抗體之IC50值。表3中概括該等研究之結果。
抗體序列
NV115－3B序列 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：22)
VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：23)
NV115－3E序列 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：24)
VK EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLLIHWAVTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：25)
NV115－3E序列 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：26)
VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：27)
儘管出於清楚瞭解之目的以上已經由說明及實例相當詳細地描述本發明，但按照本發明之教示一般熟習此項技術者易於瞭解在不悖離隨附申請專利範圍之精神或範疇之情況下可對本發明進行某些變化及修改。
本說明書中所列舉之所有公開案、數據庫、Genbank序列、專利及專利申請案均以引入的方式併入本文中，如同已特定地及個別地將各者以引入的方式併入一般。
圖1展示在BaF3/hTSLPR/hIL7Rα細胞中使用hTSLP依賴型細胞增殖檢定篩選抗TSLPR拮抗劑抗體。
圖2A－2C展示小鼠及嵌合抗hTSLPR單株抗體之純化。A：嵌合IgG1抗體；B：嵌合IgG4抗體；及C：小鼠IgG1抗體。
圖3A－3C展示由細胞增殖檢定及螢光素酶指示器檢定所得之純化小鼠抗hTSLPR抗體(純系1D6.C9)之拮抗劑活性。A：Ba/F3－hTSLPR－hIL7Rα細胞之增殖；B：BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞之增殖；及C：BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5－Luc細胞之螢光素酶活性。
圖4展示小鼠抗hTSLPR單株抗體1D6.C9純系之可變區之核苷酸序列。
圖5顯示小鼠抗hTSLPR抗體純系1D6.C9之可變區胺基酸序列。互補判定區(CDR)及框架區(FR)係由加下劃線之殘基或用斜體印刷之殘基指明。
圖6展示來自螢光素酶指示器檢定比較純化小鼠及嵌合抗hTSLPR抗體在過度表現hTSLPR、hIL7Rα及Stat5－Luc之Ba/F3細胞中之拮抗劑活性的結果。
圖7展示由小鼠及嵌合抗hTSLPR抗體抑制人類單核細胞之TSLP介導之TARC部分。
圖8展示抗體結合域－TSLPR抗體與不連續抗原決定基結合的鑑別。
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Claims (23)

  1. 一種經分離抗人類胸腺基質淋巴細胞生成素受體之抗體或其抗原結合部分，其包含分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  2. 一種經分離抗人類胸腺基質淋巴細胞生成素受體之抗體或其抗原結合部分，其包含與SEQ ID NO：5之第10至134之胺基酸具有至少80%一致性之重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：6之第21至128之胺基酸具有至少80%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
  3. 如請求項2之經分離抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：5之第10至134之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：6之第21至128之輕鏈可變區胺基酸序列。
  4. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其為鼠抗體。
  5. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其為嵌合抗體。
  6. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。
  7. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其為人源化抗體。
  8. 如請求項2之經分離抗體或其抗原結合部分，其為人類抗體。
  9. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其為單鏈抗體。
  10. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其為Fab片段。
  11. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分，其屬於IgG1或IgG4同型。
  12. 一種經分離或重組性聚核苷酸，其編碼包含請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區或輕鏈可變區的多肽。
  13. 如請求項12之聚核苷酸，其中該抗體為人源化或人類抗體。
  14. 如請求項12之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列的抗體。
  15. 一種經分離或重組之聚核苷酸，其編碼如請求項2之抗體或其抗原結合部分。
  16. 如請求項12或15之聚核苷酸，其為DNA。
  17. 一種經分離之宿主細胞，其包含(1)編碼請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合部分之重鏈的重組DNA區段及(2) 編碼該抗體之輕鏈之第二重組性DNA區段；其中該等DNA區段分別與第一啟動子及第二啟動子操作性連接且能夠表現於該宿主細胞中。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其中該單株抗體為人源化或人類抗體。
  19. 如請求項17之宿主細胞，其中該單株抗體包含分別為TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)及EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及分別為KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)及QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  20. 如請求項17之宿主細胞，其為非人類哺乳動物細胞株。
  21. 一種請求項1之經分離抗體或其抗原結合部分用於製造供治療受檢者之過敏性發炎病症用之藥劑的用途。
  22. 如請求項21之用途，其中該受檢者為人類。
  23. 如請求項21之用途，其中該過敏性發炎疾病為異位性皮膚炎、哮喘或過敏性鼻炎。
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