CN101370831A - 用于治疗过敏性疾病的针对胸腺基质淋巴细胞生成素受体的抗体 - Google Patents

用于治疗过敏性疾病的针对胸腺基质淋巴细胞生成素受体的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性识别和拮抗人TSLP受体的抗体，和使用这些抗体治疗或改善由TSLP信号介导的疾病或紊乱的方法。

Description

用于治疗过敏性疾病的针对胸腺基质淋巴细胞生成素受体的抗体
背景技术
细胞因子和免疫细胞介导特异性的生理机制或通路，例如，导致多种炎性紊乱的通路。人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是由人上皮细胞产生的IL-7类细胞因子。其促进B细胞分化并且还能够共刺激胸腺细胞和成熟T细胞。TSLP结合至人CD11c+树突细胞(DC)上的特异性异二聚体受体。该受体异二聚体由普通的γ类似受体链(TSLP受体；TSLPR)和IL-7R-α链的异二聚体组成。见，例如，Tonozuka等人，Cytogenet.CellGenet.93：23-25，2001；Pandey等人，Nat.Immunol.1：59-64，2000；L.S.Park等人，J.Exp.Med.192：659-670，2000；和Reche等人，J.Immunol.167：336-343，2001。结合于受体的配体诱导DC分泌吸引TH2的化学因子，TARC(胸腺和激活调节的化学因子)和MDC(巨噬细胞衍生的化学因子)。此外，TSLP也诱导有效的DC激活、天然CD4+T细胞扩展、和随后极化为TH2表型，产生前-过敏性(pro-allergic)细胞因子白介素4(IL-4)、IL-5、IL-13和肿瘤坏死因子-α。
还发现TSLP信号导致Stat5转录因子的激活。而且，已有报道，急性和慢性的特应性皮炎患者在皮肤伤口过表达TSLP，表明TSLP表达与体内的过敏性炎症有关。除了皮肤的角质细胞，也已经在支气管上皮细胞、平滑肌和肺成纤维细胞中发现高水平的TSLP表达，支持TSLP在呼吸过敏指征中的可能作用。此外，IgE激活的肥大细胞表达非常高水平的TSLP，该机制可能参与维持TH2表型。
在西方国家中约20％的人口患有炎性紊乱，例如，过敏性疾病，其包括哮喘、鼻炎、特应性皮炎和食物过敏。特应性皮炎患者的50％到80％具有或发展哮喘或变态反应性鼻炎。迄今为止，无法治愈过敏诱导的哮喘、特应性皮炎和变态反应性鼻炎。当前的治疗，例如使用β-2肾上腺素受体拮抗物用于哮喘，爱宁达(Elidel)用于特应性皮炎，和H1-抗组织胺用于变态反应性鼻炎，来靶向这些征状。因此在本领域越来越需要更好的治疗方法来治疗这些炎性紊乱，特别是，过敏性炎症。本发明解决此问题和其它问题。
发明概述
本发明的实施方案提供分离的人或人源化的抗体或其功能片段，具有对靶标蛋白质人胸腺基质淋巴细胞生成素受体(hTSLPR)特异性的抗原结合区，并且该抗体或其功能性片段结合hTSLPR。在相关实施方案中，至少通过细胞表面hTSLP受体结合阻止炎性介质释放来确定结合至hTSLPR。
在另一实施方案中，本发明提供抗体或其功能性片段的分离的抗原结合区。在某些实施方案中，分离的抗原结合区包括具有氨基酸序列TYGMS(SEQ ID NO：7)的H-CDR1区和其保守的变体。如本文所述，保守变体包括在任何鉴定的氨基酸序列中的氨基酸残基。在相关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有氨基酸序列WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)的H-CDR2区和其保守变体。在另一相关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有氨基酸序列EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)的H-CDR3区和其保守的变体。
在另一实施方案中，分离的抗原结合区是具有氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)的L-CDR1区和其保守的变体。在另一有关实施方案中，分离的抗原结合区是具有氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：11)的L-CDR2区和其保守的变体。在另一有关实施方案中，分离的抗原结合区是具有氨基酸序列QQYSTYPT(SEQ IDNO：12)的L-CDR3区和其保守的变体。
在另一实施方案中，分离的抗原结合区是具有可变区氨基酸序列SEQID NO：5的重链，并且该序列在CDR区与SEQ ID NO：5的CDR区具有至少60、70、80、90或95的百分数的序列同一性。在有关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有可变区氨基酸序列SEQ ID NO：6的轻链，并且该序列在CDR区与SEQ ID NO：6的CDR区具有至少60、70、80、90或95的百分数的序列同一性。
在另一方面，本发明提供针对hTSLPR的单克隆拮抗物抗体。本发明的一些抗-TSLPR抗体与含有SEQ ID NO：5的重链可变区序列和含有SEQ ID NO：6的轻链可变区序列的参考抗体具有相同的结合特异性。这些抗体中的一些是完全的人抗体，其展现与参考抗体相同的结合特异性。一些抗体具有TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQID NO：8)或EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)的重链互补决定区(CDR)序列；或KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ IDNO：11)或QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)的轻链CDR序列。
一些抗-hTSLPR抗体具有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别是TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别是KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ IDNO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。本发明的一些其它的抗体含有重链可变区氨基酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少85％的同一性，和轻链可变区氨基酸序列，其与SEQ ID NO：6具有至少85％的同一性。本发明的其它的一些抗-hTSLPR抗体具有与SEQ ID NO：5相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ ID NO：6相同的轻链可变区氨基酸序列。
本发明的一些抗-hTSLPR抗体是小鼠抗体。其它的一些是嵌合抗体。一些嵌合抗体具有人重链恒定区和人轻链恒定区。本发明的其它的一些抗-hTSLPR抗体是人源化抗体。本发明的其它的一些抗-hTSLPR抗体是完全的人抗体，其与含有SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ ID NO：6的轻链可变区序列的抗体显示相同的结合特异性。本发明还提供单链抗体，例如，Fab片段。一些抗-hTSLPR抗体是IgG1同种型的抗体。其它一些抗-hTSLPR抗体是IgG4同种型的抗体。
另一方面，本发明提供分离的或重组的多核苷酸(例如，DNA)，其编码含有本发明的抗-hTSLPR抗体的重链可变区或轻链可变区的多肽。例如，该多核苷酸能够编码抗体重链，其含有CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)。该多核苷酸也可以编码抗体轻链，其含有CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ IDNO：12)。本发明的一些核苷酸编码成熟的重链可变区序列，其与SEQ IDNO：5的成熟区有至少90％的同一性。一些其它的多核苷酸编码成熟的轻链可变区序列，其与SEQ ID NO：6的成熟区有至少90％的同一性。这些多核苷酸中的一些编码成熟的重链可变区序列，其与SEQ ID NO：5的成熟区相同，或成熟的轻链可变区序列，其与SEQ ID NO：6的成熟区相同。
另一方面，本发明提供分离的宿主细胞，其包含(1)编码本发明的抗-hTSLPR抗体重链的重组DNA段，和(2)编码抗体轻链的第二重组DNA段。在一些宿主细胞中，该重组DNA段分别有效连接于第一和第二启动子，并且能够在宿主细胞中表达。一些这样的宿主细胞表达单克隆抗体，该抗体具有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ IDNO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。一些其它的宿主细胞表达抗-hTSLPR抗体，其含有成熟的重链可变区序列，与SEQ ID NO：5的成熟区具有至少90％的同一性；和成熟的轻链可变区序列，与SEQ ID NO：6的成熟区具有至少90％的同一性。一些这样的宿主细胞表达抗-hTSLPR抗体，其含有成熟的重链可变区序列，与SEQ ID NO：5的成熟区相同；和成熟的轻链可变区序列，与SEQ ID NO：6的成熟区相同。一些宿主细胞是非人的哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明提供治疗受试者，例如人患者中炎性紊乱的方法。这些方法需要向受试者施用含有效量的抗-hTSLPR抗体的药物组合物。通常，该抗-hTSLPR抗体与含有SEQ ID NO：5的重链可变区序列和SEQ IDNO：6的轻链可变区序列的抗-hTSLPR抗体具有相同的结合特异性。在一些这样的治疗方法中，使用完全的人抗体。在一些方法中，抗-hTSLPR抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。在一些方法中，使用的抗-hTSLPR抗体含有与SEQ ID NO：5的成熟区相同的成熟的重链可变区序列；和与SEQ IDNO：6的成熟区相同的成熟的轻链可变区序列。一些方法是用于治疗患有过敏炎性疾病的受试者。能够适于治疗的过敏炎性疾病的实例包括特应性皮炎、哮喘或变态反应性鼻炎。
在另一实施方案中，本发明提供提供的免疫交联物由抗体或其片段的第一成份和具有第二氨基酸序列的第二成份制成。例如，免疫交联物是细胞毒素，或免疫交联物是对不同于hTSLPR的靶标具有结合特异性的结合蛋白质或抗体。
在另一实施方案中，本发明提供具有抗体或其抗体片段的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒还含有药物可接受的载体或赋形剂。在其它有关的实施方案中，试剂盒中的抗体是以单位剂量存在的。在另一相关实施方案中，试剂盒包括向受试者施用的操作说明。
对本发明性质和益处的更多的理解可以参考说明书和权利要求的其余部分而实现。
附图说明
图1表示使用hTSLP-依赖的细胞增殖测定在BaF3/hTSLPR/hIL7Rα细胞中对抗-TSLPR拮抗物抗体的筛选。
图2A-2C显示小鼠和嵌合的抗-hTSLPR单克隆抗体的纯化。A：嵌合的IgG1抗体；B：嵌合的IgG4抗体；和C：小鼠IgG1抗体。
图3A-3C显示通过细胞增殖测定和萤光素酶报道基因测定的纯化小鼠抗hTSLPR抗体(克隆1D6.C9)的拮抗物活性。A：Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα细胞的增殖；B：BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc细胞的增殖；和C：BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc细胞的萤光素酶活性。
图4显示小鼠抗-hTSLPR单克隆抗体1D6.C9克隆的可变区的核苷酸序列。
图5显示小鼠抗-hTSLPR单克隆抗体1D6.C9克隆的可变区的氨基酸序列。有下划线的残基或斜体的残基表示互补决定区(CDR)和构架区(FR)。
图6显示在过表达hTSLPR、hIL7Rα和Stat5-Luc的Ba/F3细胞中，比较纯化的小鼠抗-hTSLPR抗体和嵌合的抗-hTSLPR抗体的拮抗物活性的萤光素酶报告基因测定的结果。
图7显示由小鼠抗-hTSLPR抗体和嵌合的抗-hTSLPR抗体对来自人单核细胞的TSLP-介导的TARC部分的抑制。
图8显示抗体结合结构域的鉴定-TSLPR抗体结合至不连续的表位。
发明详述
本发明是由发明人部分的针对人TSLPR的拮抗物抗体的发展而提出的。发现在体外产生的小鼠或嵌合的抗-hTSLPR抗体中产生的抗-hTSLPR抗体能够抑制由TSLP信号介导的活性(例如TSLP介导的细胞增殖)。因此，这些抗体用作针对大量由TSLP信号活性介导或与其有关的疾病或紊乱数(例如过敏炎性疾病，例如，特应性皮炎和哮喘)的治疗或预防物质。以下部分提供制备和使用本发明的组合物和执行本发明的方法的指导。
I.定义
除非有另外的定义，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员普通理解相同的含义。下列参考为技术人员提供在本发明中使用的许多术语的通常定义：生物化学和分子生物学牛津词典，Smith等人(编辑)，Oxford University Press(修订版，2000)；微生物学和分子生物学词典，Singleton等人(编辑)，John Wiley和Sons(3PrdP编辑，2002)；和生物学词典(Oxford Paperback Reference)，Martin和Hine(编辑)，Oxford University Press(4PthP编辑，2000)。此外，提供下列定义以帮助读者实践本发明。
为了更容易的理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在详细的说明中提出。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对侵入病原体的人体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞、或对自体免疫或病理炎症、正常人细胞或组织情况的选择性损伤、破坏或消除。
“信号转导通路”指在多种信号转导分子之间的生化关系，所述分子起到从细胞的一个部分到细胞的另一部分传递信号的作用。
本文所指的术语“抗体”包括整个抗体和任意的抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。天然产生的“抗体”是糖蛋白，包含由二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。各个重链由重链可变区(本文简称为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。各个轻链由轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以被细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，与更保守的称为构架区(FR)的区域散布。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一补体(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗原部分”)指抗体的全长或一个或多个片段，其保留了能够特异性结合抗原(例如，TSLPR)的能力。已经显示，可以通过全长抗体的片段来行使抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”之中涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，可以使用重组方法，通过合成的接头将其连接，从而使它们能够被制成单个的蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链的Fv(scFv)；见，例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；和Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段是使用本领域技术人员公知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选该片段使用。
本文使用的“分离的抗体”指基本不含有具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合TSLPR的分离的抗体基本不含特异性结合TSLPR之外抗原的抗体)。然而，特异性结合TSLPR的分离的抗体可以与其它抗原，例如来自其它物种的TSLPR分子具有交叉反应活性。而且，分离的抗体可能基本不含其它的细胞材料和/或化学物质。
本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物表现对特定表型的单一的结合特异性和亲和力。
本文使用的术语“人抗体”意在包括具有不同区的抗体，其中构架和CDR区衍生自人来源的序列。而且，如果该抗体含有恒定区，该恒定区也衍生自这样的人序列，例如，人种系序列，或人种系序列的突变版本。本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异的诱变或体内体细胞突变引起的突变)。
术语“人单克隆抗体”指表现单一的结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架和CDR区都衍生自人序列。在一个实施方案中，由包含从转基因非人动物获得的B细胞的杂交瘤产生人单克隆抗体，所述转基因非人动物，例如，转基因小鼠，具有包含融合于永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部人抗体，例如从动物(例如，小鼠)分离的抗体，其对于人免疫球蛋白基因或从其制备的杂交瘤是转基因或转染色体的；从转化的表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体；从重组的组合人抗体库分离的抗体；和涉及全部或部分的人免疫球蛋白基因、其它DNA序列的剪切而通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，其中构架和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这类重组人抗体可以用于体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内的体细胞诱变)且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可能不在体内人抗体种系库中天然存在，尽管其衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列有关。
“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而该抗原结合位点(可变区)被连接于不同的或改变的类型、效应子功能和/或物种的恒定区，或被连接于赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。例如，在以下实施例中所示，可以通过用人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区来修饰小鼠抗-hTSLPR抗体。由于用人恒定区替代，嵌合抗体可以保留其识别人TSLPR的特异性而与原始的小鼠抗体相比在人中具有减少的抗原性。
“人源的”抗体是保留了非人抗体的反应活性的抗体，而在人中具有较少的免疫原性。这可以，例如通过保留非人CDR区和用其人的复本(即，恒定区以及可变区的构架部分)代替抗体的保留部分来实现。见，例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：169-217，1994。人体工程技术的其它实例包括，但不限于在US 5,766,886公开的Xoma技术。
本文使用的术语“人体工程”指将非人抗体转化成设计的人抗体的方法(见，例如KaloBios’HumaneeringTM technology)。
如本文所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类型(例如，IgM、IgE、IgG例如IgG1或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”可以在本文中与“特异性结合抗原的抗体”交换的使用。
如本文使用，“特异性结合人TSLPR”的抗体指结合具有200×10-12M或更少、150×10-12M或更少、或100×10-12M或更少的KD的人TSLPR抗体。
本文使用的术语“结合特异性”指单独的抗体结合位点仅与一个抗原决定簇反应的能力。抗体的组合位点位于分子的Fab部分并且从重链和轻链的超变区构建。抗体的结合亲和力是在抗体的单独的抗原决定簇和单独的结合位点之间的反应强度。其为在抗原决定簇和抗体结合位点之间起作用的吸引力和排斥力的总和。亲和力是描述抗原-抗体反应的平衡常数。
在两个实体之间的特异性结合意指平衡常数(KA)为至少1×107M-1、108M-1、109M-1、或1010M-1的结合。短语“特异性(或选择性)结合”于抗体(例如，抗-hTSLPR抗体)指在蛋白质和其它生物制品的异源群体中同源抗体的存在起决定作用的结合反应。除了以上指出的平衡常数(KA)，本发明的抗-hTSLPR抗体通常也具有解离常数(Kd)为约1×10-2 s-1，1×10-3 s-1，1×10-4 s-1或更低，并且以至少两倍于结合非特异性抗原(例如，BSA)的亲和力结合人TSLPR。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在这里可以与术语“特异性结合抗原的抗体”交换的使用。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由例如氨基酸或糖侧链分子的化学活性的表面集团组成，并且通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。构象和非构象的表位可以以此区分，即在变性溶剂的存在下丧失与前者而非后者的结合。
本文使用的术语“核酸”与术语“多核苷酸”可以交换的使用并且指或者单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其为合成、天然存在和非天然存在的，其与参考的核酸具有相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式代谢。这样的类似物的实例包括，而不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，特定的核酸序列也无疑涵盖其保守的修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。特别的，如以下详述，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列获得简并密码取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608，1985；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98，1994)。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在氨基酸以相似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的，以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羟基谷氨酸和邻-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相似的碱基化学结构的化合物，即，α碳结合于氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的碱性化学结构。氨基酸模拟物指化学化合物，其具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
本文中术语“多肽”和“蛋白质”可以交换的使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物。除非另外指出，特定的多肽序列也无疑涵盖其保守修饰的变体。
术语“保守修饰的变体”同时用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸(或其中该核酸不编码氨基酸的序列)，指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意指定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个其中由密码子指定的丙氨酸的位置，该密码子可以被改变成为所述的任意对应的密码子而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其为一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每个可能的沉默变异。一个技术人员应该认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以提供功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异无疑包含在各个所述序列中。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括单独的取代、删除或添加于多肽序列，导致氨基酸用化学相似的氨基酸替代。提供功能相似的氨基酸的保守的替代表是本领域众所周知的。这样的保守修饰的变体是另外的，并且不排除本发明的多形态的变体、种间同系物和等位基因。以下八组含有彼此是保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton，Proteins(1984))。
在两个或多个核酸或多肽序列情况下，术语“相同的”或“同一性”百分数指相同的两个或多个序列或亚序列。当在比较窗口就最大对应进行比较和比对，或在指定测量的区域使用下列序列比较算法之一或通过人工比对和目测时，如果两个序列具有特定百分数的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，60％同一性，任选的在指定区域范围，或当未指定时，在整个序列，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性)，两个序列是“基本相同的”。任选的，该同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)或更优选长度在100至500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)范围的区域。
对于序列比对，通常一个序列作为参考序列，检测序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将检测和参考序列输入计算机，如果需要，指定匹配顺序，和指定序列算法程序参数。可以使用缺省的程序参数，或设计可选择的参数。基于程序参数，接着计算序列比对算法对于所测试序列的序列同一性百分数。
本文使用的“比较窗口”包括提及的任一连续位置数的片段，所述连续位置数选自从20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150组成的组，其中在两个序列被最佳比对之后，可以比较序列与连续位置的相同数值的参考序列。用于比较的序列的比对方法是本领域众所周知的，用于比较序列的最佳比对可以，例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1970)Adv.Appl.Math.2：482c，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48：443，1970，通过研究Pearson和Lipman的相似性方法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988，通过这些算法的计算工具(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA在威斯康辛遗传软件包，遗传计算组，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过人工比对和目测(见，例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.(ringbou编辑，2003))进行。
适用于确定序列同一性百分数和序列相似度的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别描述于Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977；和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。用于执行BLAST分析的软件是公众可以通过国家生物技术信息中心获得的。这一算法涉及通过鉴定在查询序列中长度W的短词首先鉴定高计分序列对(HSP)，当与在数据库序列中相同长度词比对时，其或者匹配或者满足一些正评估的阈值分数T。T被称为临近词阈值(Altschul等人，如上)。这些最初的临近词作为种子采样去起始搜索以寻找含有它们的更长HSP。采样词(the word hit)被沿着各个序列的两个方向延伸直至能够增加累积的比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；通常>0)和N(错配残基的罚分，通常<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用记分矩阵来计算累积的分数。当：累积的比对分数经过数值X从其获得的最大值跌落；由于一个或多个负分残基比对的积累，累积分数到达零或以下；或到达任一序列的末端时，沿着各个序列的两个方向延伸的采样词被停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，预期(E)为10，M＝5，N＝-4作为缺省，并且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3，预期(E)为10作为缺省，和BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)的比对(B)为50，预期(E)为10，M＝5，N＝-4，并且比较两条链。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个测量是最小总数概率(P(N))，其提供在两个核苷酸或氨基酸序列之间可能偶然出现的匹配的概率指征。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总数概率小于约0.2，更优选小于约0.01，和最优选小于约0.001，核酸被认为与参考序列相似。
除了以上指出的序列同一性百分数，两个核酸序列或多肽基本相同的另一指征是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体有免疫交叉反应，如下所述。因此，例如，其中两个肽仅通过保守替代而不同，肽与第二多肽通常基本相同。两个核酸序列基本相同的另一指征为两个分子或其互补在如下所述的严格条件下彼此杂交。然而，两个核酸序列基本相同的另一指征为可以使用相同的引物扩增该序列。
术语“有效连接”指两个或多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，其指转录条件序列与转录序列的功能关系。例如，启动子或增强子序列有效连接于编码序列，如果其在合适宿主细胞或其它表达系统中刺激或调节编码序列的转录。通常，有效连接于转录序列的启动子转录调节序列是与转录序列物理邻接的，即，它们是反式作用。然而，一些转录调节序列，例如，增强子，不需要物理邻接其增强转录的编码序列或位于其增强转录的编码序列的近似邻接的位置。
术语“载体”意指能够运输其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环形双链DNA环，额外的DNA片段可以被连入其中。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以被连入病毒基因组。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌和附加型哺乳动物载体的复制起始点的细菌载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在一旦被引入宿主细胞时整合进入宿主细胞基因组，并且由此跟随宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这类载体在本文被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以被交换的使用，因为质粒是使用载体的最普遍的形式。然而，本发明意在包括提供当量功能的这样的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)指已经引入重组表达载体的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定受试细胞，而且指这样细胞的子代。因为由于变异或环境影响，某些修饰可能在随后的世代中发生，这类子代可能实际上与母细胞不相同，但是仍然被包括在本文使用的术语“宿主细胞”范围之内。
术语“炎性疾病或状况”指在损伤或感染位置以局部炎症为表征的任何情况并且包括自体免疫疾病、某些形式的感染性炎症状态、器官移植或其它移植的不期望的嗜中性粒细胞活性特征和事实上在局部组织位点由不期望的嗜中性粒细胞积累表征的任何其它的情况。这些情况包括，但不限于脑膜炎、大脑水肿、关节炎、肾炎、成人呼吸窘迫综合征、胰腺炎、肌炎、神经炎、结缔组织疾病、静脉炎、动脉炎、脉管炎、过敏症、过敏性反应、埃利希菌病、痛风、器官移植和/或溃疡性结肠炎。
术语“受试者”包括人和非人的动物。非人动物包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人的灵长类、绵羊、狗、母牛、小鸡、两栖动物和爬行动物。除注明之外，术语“患者”或“受试者”可以在这里交换的使用。
术语“治疗”包括施用化合物或物质以预防或延迟疾病(例如，过敏炎性疾病)的综合征、并发症或生化指征的发作，缓解综合征、或阻止或抑制疾病、情况或紊乱的进一步发展。治疗可以是在显示疾病之后，预防性的(以预防或延迟疾病的发作，或以阻止其临床或亚临床综合征的现象)或治疗性的抑制或缓解综合征。
短语“信号转导通路”或“信号通路”(例如，TSLP信号通路)指至少一个生化反应，但是更通常为一系列生化反应，其从具有刺激化合物或物质的细胞相互作用产生。因此，刺激性化合物(例如，TSLP)与细胞的相互作用产生“信号”，其通过信号转导通路传递，最终产生细胞应答，例如，免疫应答。
II.针对人TSLPR的拮抗物抗体
1.综述
本发明提供特异性结合人TSLPR的抗体。这些抗-TSLPR抗体能够拮抗TSLPR介导的信号活性，例如，如在以下实施例中所述的TSLP介导的细胞增殖。制备单克隆或多克隆抗体的常用方法是本领域众所周知的。见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1998；Kohler和Milstein，Nature 256：495-497，1975；Kozbor等人，Immunology Today 4：72，1983；和Cole等人，第77-96页，在MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，1985。
优选的，本发明的抗-hTSLPR抗体是单克隆的，如在以下实施例中所述针对人TSLPR产生的小鼠单克隆抗体(克隆1D6.C9)。单克隆抗体指从单个克隆衍生的抗体。可以使用用于产生单克隆抗体的任何技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化来产生本发明的抗-TSLPR抗体。用于制备杂交瘤的一个动物系统是鼠系统。在小鼠中杂交瘤的产生是非常完善建立的方法。如在以下实施例中所说明的，可以通过用hTSLPR多肽或其片段、融合蛋白质或变体免疫非人动物(例如，小鼠)来产生单克隆的抗-hTSLPR抗体。接着，将来自动物的分离的B细胞融合入骨髓瘤细胞以产生抗体产生的杂交瘤。可以使用hTSLPR多肽或融合蛋白质通过在ELISA测定中筛选杂交瘤获得单克隆小鼠抗—hTSLPR抗体。分离用于融合的免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域公知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是本领域众所周知的，例如，Harlow和Lane，如上。
在图5中显示以下实施例中所述的示例性小鼠抗-TSLPR抗体的重链(SEQ ID NO：5)和轻链(SEQ ID NO：6)可变区的氨基酸序列。如在图中所示，这一抗体的重链可变区的CDR序列是TYGMS(CDR1；SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(CDR2；SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(CDR3；SEQ ID NO：9)。轻链可变区的CDR序列是KASQDVGTAVA(CDR1；SEQ ID NO：10)、WASTRHT(CDR2；SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(CDR3；SEQ ID NO：12)。
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。通常，本发明的抗-hTSLPR抗体具有与图5中所示相应CDR序列相同的至少一个其重链CDR序列或轻链CDR序列。一些本发明的这些抗-hTSLPR抗体具有与在以下实施例中公开的示例的小鼠抗-hTSLPR抗体(克隆1D6.C9)相同的结合特异性。这些抗体可以与小鼠抗-hTSLPR抗体(克隆1D6.C9)竞争结合于hTSLPR。一些本发明的抗-hTSLPR抗体分别在其重链和轻链的可变区具有与在图5中所示相应CDR序列相同的全部CDR序列。因此，这些抗-hTSLPR抗体具有三个重链CDR序列，分别与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9相同，和三个轻链CDR序列，分别与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12相同。
除了具有与小鼠抗-hTSLPR抗体(克隆1D6.C9)的相应CDR序列分别相同的CDR序列之外，本发明的一些抗-hTSLPR抗体具有其完整的重链和轻链可变区，分别与在图5中所示小鼠抗体的相应可变区序列相同(即，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)。在一些其它的实施方案中，除了相同的CDR序列，该抗体含有在可变区的构架部分中的氨基酸残基，其与在图5中所示相应氨基酸残基不同(例如，一些以下所述人源化的抗-hTSLPR抗体)。然而，这些抗体通常具有其完整的可变区序列，其与在图5中所示相应可变区序列基本相同(例如75％、85％、90％、95％或99％)。
本发明的抗-hTSLPR抗体可以是含有两个重链和两个轻链的完整的抗体。它们也可以是完整抗体或单链抗体的抗原结合片段。本发明的抗-hTSLPR抗体包括在非人动物中产生的抗体(例如，在图5中所示小鼠抗-hTSLPR抗体)。它们也包括修饰的抗体，其是在图5中所示小鼠抗-hTSLPR抗体的修饰的形式。通常，修饰的抗体是重组抗体，其相对于示例性的小鼠抗体具有相似的或改良的特性。例如，在以下实施例中示例的小鼠抗-hTSLPR抗体可以通过缺失恒定区和用能够导致增加抗体的半衰期(例如血清半衰期)、稳定性或亲和力的不同的恒定区替代。可以例如通过构建表达载体来产生修饰的抗体，所示表达载体包括来自从具有不同特性的不同抗体移植在构架序列的小鼠抗体的CDR序列(Jones等人.1986，Nature 321，522-525)。可以从公共DNA数据库获得这样的构架序列。
一些修饰的抗体是嵌合抗体，其含有部分的人免疫球蛋白序列(例如，恒定区)和部分的非人免疫球蛋白序列(例如，在图5中显示的小鼠抗-hTSLPR抗体可变区序列)。一些其它修饰的抗体是人源化的抗体。通常，人源化的抗体具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的，例如，美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人，Nature 321：522-25，1986；Riechmann等人，Nature332：323-27，1988；和Verhoeyen等人，Science 239：1534-36，1988。通过用来自非人抗-hTSLPR抗体的至少部分的CDR替代人抗体的相应区域，可以容易的实施这些方法以产生本发明的人源化的抗-hTSLPR抗体。在一些实施方案中，本发明的人源化的抗-hTSLPR抗体在各个免疫球蛋白链中具有全部三个CDR，其来自移植进入相应的人构架区的在图5所示的小鼠抗-hTSLPR抗体。
以上所述抗-hTSLPR抗体可能在可变区和恒定区经历非关键的氨基酸取代、添加或缺失而不丧失结合特异性或效应子功能，或结合亲和力的无法耐受的减少。通常，掺入这类改变的抗体与其衍生自的参考抗体(例如，图5中所示的小鼠抗-hTSLPR抗体)呈现基本的序列同一性。例如，本发明的一些抗-hTSLPR抗体的成熟的轻链可变区具有与图5中所示抗-hTSLPR抗体的成熟轻链可变区的序列至少75％或至少85％的序列同一性。相似的，抗体的成熟重链可变区通常显示具有与图5中所示抗-hTSLPR抗体的成熟重链可变区的序列至少75％或至少85％的序列同一性。一些修饰的抗-hTSLPR抗体具有与图5中所示小鼠抗-hTSLPR抗体(克隆1D6.C9)相比相同的特异性和增加的亲和力。通常，修饰的抗-hTSLPR抗体的亲和力(例如，人源化的抗体)具有与小鼠起源的抗体相同或更好的结合亲和力。修饰的抗体的结合亲和力是小鼠起源的抗体的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
2.嵌合和人源化的抗-hTSLPR抗体
本发明的一些抗-hTSLPR抗体是嵌合(例如，小鼠/人)抗体，由来自非人抗-hTSLPR抗体拮抗物连同人抗体区组成。例如，嵌合H链可以包括小鼠抗-TSLPR抗体的重链可变区的抗原结合区(例如，在SEQ ID NO：5中所示序列)连接于至少部分的人重链恒定区。这一嵌合重链可以与嵌合L链组合，所述L链包含小鼠抗-hTSLPR抗体的轻链可变区的抗原结合区(例如，在SEQ ID NO：6中所示)连接于至少部分的人轻链恒定区。
根据在以下实施例中的公开以及本领域公知的方法，可以引入本发明的嵌合抗-hTSLPR抗体。例如，可以用限制性酶消化编码鼠抗-hTSLPR单克隆抗体分子的重链或轻链的基因以除去鼠Fc区，和用编码人Fc恒定区的基因的当量部分替代。适合表达重组抗体和特别是人源化抗体的表达载体和宿主细胞是本领域众所周知的。表达编码抗-hTSLPR免疫球蛋白链的嵌合基因的载体可以使用标准重组技术，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(第3版编辑，2001)；和Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.(ringbou编辑，2003)构建。人恒定区序列可以选自多种参考来源，包括但不限于在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，U.S.Government Printing Office，1991所列举的那些。通过DNA重组产生嵌合抗体的更具体的教导已经在本领域中被教授，例如，Robinson等人，国际专利公布PCT/US86/02269；Akira，等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际申请WO 86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better(1988)Science 240：1041-1043；Liu(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura(1987)Canc.Res.47：999-1005；Wood(1985)Nature 314：446-449；Shaw(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)。
具有来自非人抗体的完整可变区的嵌合抗体可以进一步被人源化以减少抗体在人中的抗原性。这通常通过用来自人Fv可变区的当量序列或氨基酸残基替代在Fv可变区(构架区或非-CDR区)的某些序列或氨基酸残基来完成。这些另外的替代序列或氨基酸残基通常不直接涉及抗原结合。更普遍的，通过仅用非人抗体的CDR(例如，在图5中所示小鼠抗体)替代人抗体中的CDR进行非人抗体的人源化。在一些情况下，接着用来自非人供体抗体的相应残基替代在人构架区的一些额外的残基。通常需要这样的额外的移植以提高与抗原的结合。这是因为仅具有从非人抗体移植的CDR的人源化抗体与非人供体抗体相比具有较不完善的结合活性。因此，除了CDR，本发明的人源化的抗-hTSLPR抗体通常在人构架区具有以来自非人供体抗体(例如，在图5中所示小鼠抗体)的相应残基替代的一些氨基酸残基。通过CDR替代产生人源化抗体的方法，包括选择替代所用构架残基的标准，是本领域众所周知的。例如，除了以上提到的涉及产生嵌合抗体的技术，制备人源化的抗体的额外指导提供在，例如，Winter等人，英国专利申请GB 2188638A(1987)，美国专利5,225,539；Jones(1986)Nature321：552-525；Verhoeyan等人.1988Science 239：1534；和Beidler(1988)J.Immunol.141：4053-4060。也可以使用寡核苷酸定向诱变进行CDR取代，如在例如，WO 94/10332标题为，针对人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G的Fc受体的人源化抗体(Humanized Antibodies to Fc Receptors forImmunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)中所述。
本发明的嵌合或人源化抗-hTSLPR抗体可以是单价、二价或多价的免疫球蛋白。例如，单价嵌合抗体是如上所述由嵌合H链和嵌合L链通过二硫键连接形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是由通过至少一个二硫键连接的两个HL二聚体形成的四聚体(H2 L2)。多价嵌合抗体是基于链的聚集。
3.人抗-hTSLPR抗体
除了嵌合或人源化的抗-hTSLPR抗体，在本发明中也包括呈现相同结合特异性和相当的或更好的结合亲和力的完整人抗体。例如，相对于参考的含有重链可变区序列SEQ ID NO：5和轻链可变区序列SEQ ID NO：6的非人抗体，人抗体能够具有相同或更好的结合特征。相对于嵌合或人源化的抗体，本发明的抗-hTSLPR抗体当施用于人受试者时具有更减少的抗原性。
可以使用本领域公知的技术产生人抗-hTSLPR抗体。例如，用抗体中的人可变区替换非人抗体可变区而与美国专利申请系列号10/778,726(公布号20050008625)中公开的非人抗体保持相同的或提供更好的结合特性的体内方法。该方法在于用完整的人抗体对非人参考抗体的可变区的表位指导的替代。产生的人抗体通常是与参考非人抗体结构无关的，但是与参考抗体结合在相同抗原的相同表位。简言之，在应答测试抗体与抗原结合的报道系统存在下，通过建立细胞中“竞争者”与参考抗体的多种杂种库(“测试抗体”)之间结合有限量的抗原的竞争，使该系列表位指导的互补替代方法成为可能。竞争者可以是参考抗体或其衍生物，例如单链Fv片段。竞争者也可以是抗原的天然或人工的配体，其与参考抗体结合于相同的表位。竞争者的唯一要求是其结合于与参考抗体相同的表位，并且其与参考抗体竞争对抗原的结合。测试抗体通常具有一个来自非人参考抗体的抗原结合V区，和来自不同来源，例如人抗体文库的随机选择的另一V区。来自参考抗体的普通V区用作指导，将测试抗体定位在相同抗原的相同表位上，并且在相同方向，从而选择偏向于参考抗体的最高抗原结合精确度。通过绘制表位图鉴定TSLPR结合结构域，并且显示在图8中。TSLPR抗体结合于不连续的表位。
可以使用许多类型的报道系统检测在测试抗体和抗原之间期望的相互作用。例如，可以将互补报告片段与抗原和测试抗体分别连接，从而仅当测试抗体结合至该抗原时发生通过片段互补引起的报告基因活化。当测试抗体和抗原报告基因融合片段与竞争者共表达时，报道基因激活变得依赖于测试抗体与竞争者的竞争能力，其与测试抗体对抗原的亲和力成比例。可以使用的其它报道基因系统包括如在美国专利申请系列号10/208,730(公开号20030198971)公开的自动抑制的报道基因反应系统的反应器，或在美国专利申请系列号10/076，845(公开号20030157579)公开的竞争性激活系统。
使用系列表位指导的互补替代系统，进行选择以鉴定连同竞争者、抗原和报道基因成员一起表达单一测试抗体的细胞。在这些细胞中，各个测试抗体与竞争者一对一的竞争结合有限量的抗原。报道基因的活性与结合测试抗体的抗原量成比例，其依次与测试抗体对抗原的亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当作为测试抗体表达时，首先基于测试抗体相对于参考抗体的活性选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组“杂交”抗体，其各自由来自参考抗体的相同的非人V区和来自文库的人V区组成，并且其各自结合于与参考抗体相同的抗原表位。在第一轮选择的一个或多个杂交抗体将具有与参考抗体相当或更高的抗原亲和力。
在第二个V区替代步骤中，使用在第一步骤中选择的人V区作为指导来用于用同源的人V区不同文库替代剩余的非人参考抗体V区的人替代选择。在第一轮选择的杂交抗体也可以用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组全长人抗体，其结构上与参考抗体不同，但是其与参考抗体竞争结合相同的抗原。一些选择的人抗体结合于与参考抗体相同的抗原的相同表位。在这些选择的人抗体中，一个或多个以与参考抗体相当或更高的亲和力结合于相同的表位。
使用如上所述的小鼠或嵌合的抗-hTSLPR抗体作为参考抗体，可以容易的使用该方法产生具有相同的结合特异性和相同的或更好的结合亲和力的结合人TSLPR的人抗体。此外，这样的人抗-hTSLPR抗体也可以从通常生产人抗体的公司，例如，KaloBios，Inc.(Mountain View，CA)商业获得。
4.其它类型的抗-hTSLPR抗体
本发明的抗-hTSLPR抗体也包括单链抗体，双特异性抗体和多特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。单链抗体在单个稳定折叠的多肽链中含有来自重链和轻链的抗原结合区。象这样，单链抗体通常保留单克隆抗体的结合特异性和亲和力，但是比常规免疫球蛋白小得多。对于某些申请，本发明的抗-hTSLPR单链抗体与完整的抗-hTSLPR抗体相比，可以提供许多有利的特性。这些包括，例如，更快的身体清除、对于诊断成像和治疗更大的组织浓度，和当与基于小鼠的抗体相比时，免疫原性的显著下降。使用单链抗体其它可能的益处包括以高通量筛选的提高的筛选能力和用于非注射应用的可能性。
可以使用本领域中描述的方法制备本发明的单链抗-hTSLPR抗体。这类技术的实例包括那些描述在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88，1991；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995-7999，1993；和Skerra等人，Science 240：1038-1040，1988。
在一些实施方案中，本发明提供衍生或连接于另一功能性分子的抗-hTSLPR抗体以产生结合于多结合位点或靶标表位的双特异性或多特异性分子。功能性分子包括另一肽或蛋白质(例如，细胞因子、细胞毒物质、免疫刺激或抑制物质、Fab片段或如上讨论的其它抗体结合片段)。例如，抗-hTSLPR抗体或其抗原结合部分能够功能性的连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接或其它)到一个或多个其它的结合分子，例如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物。因此，本发明的双特异性和多特异性抗-hTSLPR抗体包括至少一个单克隆抗-hTSLPR抗体或其抗原结合片段，具有对人TSLPR的第一结合特异性和对第二靶标表位的第二结合特异性。第二靶标表位可以是Fc受体，例如，人FcγRI或人Fcγ受体。因此，本发明包括能够同时结合表达FcγR1、FcγR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和结合表达人TSLPR的靶标细胞(例如，人CD11c+树突细胞)的双特异性和多特异性分子。这些多特异性(例如，双特异性或多特异性)分子靶向人TSLPR表达细胞至效应细胞，并且诱发Fc受体介导的效应细胞激活，例如人TSLPR表达细胞的吞噬作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧负离子的产生。
本发明的双特异性和多特异性抗-hTSLPR分子可以通过本领域所述方法来制备。这些包括化学技术(见，例如Kranz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：5807，1981)、多巢技术(见，例如美国专利号4,474,893)、或重组DNA技术。还可以使用本领域公知的和如本文所述的方法，通过偶联组分结合特异性，例如，抗FcR和抗人TSLPR结合特异性，来制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，可以分别产生双特异性和多特异性分子的各自的结合特异性和然后彼此结合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联或交联物质用于共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺酰-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、N-琥珀酰亚胺酰-3-(2-吡啶二硫)丙酸盐(SPDP)、和硫代琥珀酰亚胺酰4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(硫代-SMCC)。当结合特异性是抗体(例如，两个人源化的抗体)时，它们可以经由两个重链的C末端铰链区的巯基键连接。在结合之前，可以修饰铰链区以含有奇数(例如，一个)巯基残基。
可以通过酶连接的免疫吸收测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或免疫印迹测定来确定双特异性和多特异性分子与其特异性靶标的结合。这些测定各自通常通过使用对目的复合物特异性的标记的试剂(例如，抗体)来检测特定目标的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以使用，例如，酶连接的抗体或抗体片段(其识别和特异性结合抗体-FcR复合物)检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用任意的多种其它的免疫测定检测该复合物。例如，可以将抗体放射性标记并且用于放射免疫测定(RIA)(见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986)。可以通过这样的手段，如使用γ计数器或闪烁计数器或通过自显影来检测放射性同位素。
III.用于产生抗-hTSLPR抗体的多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明提供了基本纯化的多核苷酸(DNA或RNA)，其编码包含上述抗-hTSLPR抗体链的片段或结构域的多肽。一些本发明的多核苷酸包含在SEQ ID NO：13所示的重链可变区的核苷酸序列和/或在SEQ ID NO：14所示的轻链可变区的核苷酸序列。一些本发明的其它多核苷酸包含与SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14的核苷酸序列基本相同(例如，至少65％、80％、95％或99％)的核苷酸序列。当从合适的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够呈现抗原结合能力。
本发明中还提供了多核苷酸，其编码来自图5中所示的抗-hTSLPR抗体的重链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区。一些其它的多核苷酸编码图5中所示的抗-hTSLPR抗体的重链和/或轻链的全部或基本全部可变区序列。例如，这些多核苷酸中的一些编码在SEQ ID NO：5中所示的重链可变区的氨基酸序列和/或在SEQ ID NO：6中所示的轻链可变区的氨基酸序列。因为密码子的简并性，多种核酸序列编码各个免疫球蛋白氨基酸序列。
本发明的多核苷酸能够仅编码抗-hTSLPR抗体的可变区序列。它们也能够同时编码抗体的可变区和恒定区。本发明核酸的一些多核苷酸序列编码成熟的重链可变区序列，其与在SEQ ID NO：5中所示1D6.C9小鼠抗-hTSLPR抗体的成熟的重链可变区序列基本相同(例如，至少80％、90％或99％)。一些其它的多核苷酸序列编码成熟的轻链可变区序列，其与在SEQ ID NO：6中所示1D6.C9小鼠抗体的成熟轻链可变区序列基本相同。一些多核苷酸序列编码同时包含小鼠抗体的重链和轻链的可变区的多肽。一些其它多核苷酸编码两个多肽片段，其分别与小鼠抗体的重链和轻链的可变区基本相同。
可以通过从头固相DNA合成或通过对编码抗-hTSLPR抗体或其结合片段的现存序列(例如，在以下实施例中所述序列)的PCR诱变产生多核苷酸序列。可以通过本领域公知的方法，例如Narang等人，1979，Meth.Enzymol.68：90的磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109，1979的磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.，22：1859，1981的二乙基磷酰胺酸法；和美国专利号4,458,066的固相支持法实现核酸的直接化学合成。可以如在例如，PCR技术：DNA扩增的原则和应用，H.A.Erlich(编辑)，Freeman Press，NY，NY，1992；PCR操作手册：方法和应用指南，Innis等人(编辑)，Academic Press，San Diego，CA，1990；Mattila等人，NucleicAcids Res.19：967，1991；和Eckert等人，PCR方法和应用1：17，1991所述，通过PCR将突变引入多核苷酸序列。
本发明中也提供用于产生上述抗-hTSLPR抗体的表达载体和宿主细胞。可以使用多种表达载体来表达编码抗-TSLPR抗体链或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病毒和非病毒的表达载体以在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括通常具有表达蛋白质或RNA的表达盒的质粒、附加型载体，和人的人工染色体(见，例如，Harrington等人，NatGenet 15：345，1997)。例如，在哺乳动物(例如，人)细胞中表达抗-hTSLPR多核苷酸和多肽可以使用非病毒载体，包括pThioHis A、B和C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，San Diego，CA)，MPSV载体和多种本领域公知的表达其它蛋白质的其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP非洲淋巴细胞瘤病毒、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒(SFV)的载体。见Brent等人，如上；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等人，Cell 68：143，1992。
表达载体的选择依赖于该载体在其中被表达的目的宿主细胞。通常，表达载体含有启动子和其它调节序列(例如，增强子)，其被有效连接于编码抗-hTSLPR抗体链或片段的多核苷酸。在一些实施方案中，使用可诱导的启动子以阻止插入序列在除了诱导条件之外的情况表达。可诱导的启动子包括，例如，阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化的生物的培养物可以在无诱导条件下扩增而不偏离编码序列的种群，所述编码序列的表达产物被宿主细胞更好的耐受。除启动子之外，也可以需要或期望其它的调节元件用于有效表达抗-hTSLPR抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。此外，可以通过包括适用于所使用的细胞系统的增强子提高表达效率(见，例如Scharf等人，Results Probl.CellDiffer.20：125，1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子以增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体也可以提供分泌信号序列位置从而与由插入的抗-hTSLPR抗体序列编码的多肽形成融合蛋白质。更常见的，将插入的抗-hTSLPR抗体序列在被包括在载体中之前连接于信号序列。用来获得编码抗-hTSLPR抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这样的载体允许将可变区作为与恒定区的融合蛋白表达，由此产生完整的抗体或其片段。通常，这样的恒定区是人的。
用于包含和表达抗-hTSLPR抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明的多核苷酸的一个原核宿主。适用的其它微生物宿主包括杆菌，例如芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其它肠杆菌科，例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起始点)。此外，可以存在任何数量的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常控制表达，任选的具有操纵基因序列，并且具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。也可以使用其它微生物，例如酵母来表达本发明的抗-hTSLPR多肽。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一些优选的实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞表达和产生本发明的抗-hTSLPR多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，在实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或包含外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何普通可死亡的动物或人细胞或普通或异常的永生化的动物或人细胞。例如，已经开发的能够分泌完整的免疫球蛋白的多种合适的宿主细胞系包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。通常在例如，Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987中讨论用于表达多肽的哺乳动物细胞的使用。哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达对照序列，例如复制起始点，启动子和增强子(见，例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68，1986)，和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有从哺乳动物基因或哺乳动物病毒衍生的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的和/或可修饰的或可调节的。有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地赛米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素可诱导的CMV启动子(例如，人即早CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域公知的启动子-增强子的组合。
引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主类型而改变。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而可以使用磷酸钙处理或电穿孔用于其它细胞宿主。(通常见Sambrook，等人，如上)。其它的方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和微注射、弹道法、病毒体、免疫脂质体、多聚阳离子:核酸轭共轭物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白质VP22融合(Elliot和O′Hare，Cell 88：223，1997)、提高DNA摄取的物质、和活体外转导。为了长期、高产量的产生重组蛋白质，通常期望稳定的病毒。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达抗-hTSLPR抗体链或结合片段的细胞系，所述本发明的表达载体含有复制的病毒起始点或内源的表达元件和可选择的标记基因。导入载体之后，可以使细胞在转移到选择性培养基之前在富集培养基中生长1-2天。可选择标记物的目的是赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达导入序列的细胞在选择培养基中生长。使用适用于该细胞类型的组织培养技术可以增殖有抗性的稳定转染的细胞。
IV.抗-hTSLPR抗体的特性
一旦在宿主细胞中的表达载体表达或在杂交瘤中内源的表达上述抗-hTSLPR抗体，可以从培养基和宿主细胞中容易的纯化它们。通常，被表达的抗体链具有信号序列和因此被释放到培养基。然而，如果抗体链不是由宿主细胞天然的分泌，通过用温和的去污剂处理可以释放抗体链。接着，可以通过常规方法，包括硫酸铵沉淀、固定靶标的亲和色谱法、柱色谱法、凝胶电泳等等来纯化抗体链。这些方法是众所周知的并且在本领域被常规的操作，例如Scopes，蛋白质纯化，Springer-Verlag，NY，1982；和Harlow & Lane，如上。
通过实例，表达本发明的抗-hTSLPR抗体的选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升的旋转烧瓶中生长。可以在用蛋白质A-琼脂糖或蛋白质G一琼脂糖的亲和色谱(法玛西亚(Pharmacia)，Piscataway，NJ)之前过滤和浓缩上清。可以通过凝胶电泳和高通量色谱检查洗脱的IgG以保证纯度。可以将缓冲液溶液交换为PBS，和通过OD280读数确定浓度。将单克隆抗体整分试样并且贮存在-80℃。
无论其制备方法，本发明的抗-hTSLPR单克隆抗体特异性结合hTSLPR或其抗原片段。当抗体结合hTSLPR或其抗原片段的解离常数≤1μM，优选≤100nM，且最优选≤1nM时，存在特异性的结合。可以通过直接标记目的抗体检测抗体结合hTSLPR的能力，或抗体可以是未标记的和可以使用多种三明治测定形式间接检测结合。见，例如Harlow和Lane，同上。具有这类结合特异性的抗体更可能享有以下实施例中讨论的1D6.C9小鼠抗hTSLPR抗体呈现的有利特性。
本发明的抗TSLPR单克隆抗体能够拮抗由TSLP介导的信号活性。这些活性包括，例如，由树突细胞，例如TARC和MDC分泌吸引TH2的化学因子；激活树突细胞、天然CD4+T细胞扩增和极化为TH2表型，产生前过敏性细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-13、TNFα。可以使用多种测定以确定抗TSLPR抗体是否抑制TSLP介导的细胞活性。这些包括，例如，在实施例中所述的任何测定，例如使用Ba/F3/hTSLPR/hIL7Rα细胞的细胞增殖测定、使用Ba/F3/hTSLPR/IL7Rα/Stat5-Luc细胞的萤光素酶报告基因测定、和TARC分泌测定。在本领域中已经有用于测量TSLP信号活性的另外测定的描述。见，例如，Reche等人，J.Immunol.，167：336-43，2001；和Isaksen等人，J Immunol.168：3288-94，2002。
在某些实施方案中，本发明的抗-hTSLPR抗体阻断或竞争具有图5中所示可变区的参考抗-hTSLPR抗体(例如，在以下实施例所述的小鼠1D6.C9抗体或其嵌合抗体)与hTSLPR多肽的结合。这些可以是上述的完整抗-hTSLPR抗体。它们也可以是其它的小鼠、嵌合或人源化的抗-hTSLPR抗体，其结合于与参考抗体相同的表位。阻断参考抗体结合或与参考抗体竞争结合的能力表明检测的抗-hTSLPR抗体结合于与参考抗体所定义的相同或相似的表位，或结合于与参考的抗-hTSLPR抗体的结合表位足够接近的表位。这样的抗体尤其可能享有鉴定的参考抗体的有利特性。可以通过例如竞争结合测定来确定阻断或与参考抗体竞争的能力。使用竞争性结合测定，检测待测试抗体抑制参考抗体与常用抗原(例如TSLPR多肽)的特异性结合的能力。如果过量的测试抗体基本抑制参考抗体的结合，测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑制意指测试抗体通常以至少10％、25％、50％、75％或90％减少参考抗体的特异性结合。
有大量公知的竞争结合测定，能够用于评估抗-hTSLPR抗体与参考抗体对人TSLPR的结合的竞争。这些包括，例如，固相直接或间接的放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接的酶免疫测定(EIA)、三明治竞争测定(见Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253，1983)、固相直接生物素-亲和素EIA(见Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619，1986)、固相直接标记的测定、固相直接标记的三明治测定(见Harlow和Lane，如上所述)、使用I-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15，1988)、固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，Virology176：546-552，1990)、和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82，1990)。通常，这样的测定涉及使用结合于固体表面的纯化的抗原或带有任意的这些(未标记的测试抗-hTSLPR抗体和标记的参考抗体)的细胞。在测试抗体存在下，通过确定结合于固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常测试抗体以过量存在。由竞争测定(竞争抗体)鉴定的抗体包括与参考抗体结合于相同表位的抗体和结合于与参考抗体的结合表位足够接近发生立体阻碍的临近表位的抗体。
为了确定是否选择的抗-hTSLPR单克隆抗体结合于单一表位，各个抗体可以是使用可商购的试剂(例如，来自皮而森(Pierce)、(罗克福德)Rockford、IL的试剂)生物标记的。可以使用TSLPR多肽包被的ELISA平板来进行使用未标记的单克隆抗体和生物素标记的单克隆抗体的竞争性研究。可以使用链霉素-亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素标记的MAb结合。为了确定纯化的抗-hTSLPR抗体的同种型，抗原使用同种型ELISA。例如，可以使用1μg/ml的抗人IgG在4℃过夜包被微量平板的孔。当用1％BSA阻断之后，该平板与1μg/ml或更少的单克隆抗-hTSLPR抗体或纯化的同种型对照在室温下反应一至二个小时。接着可以将孔与人IgG1或人IgM-特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。接着孵育平板并且分析，从而能够确定纯化的抗体的同种型。
为了证明单克隆抗-hTSLPR抗体与表达hTSLPR多肽的肝细胞的结合，可以使用流式细胞计。简言之，将表达hTSLPR的细胞系(在标准生长条件下生长)与多种浓度的抗-hTSLPR抗体在含有0.1％ BSA和10％胎牛血清的PBS中混合，并且在37℃孵育1小时。清洗之后，使细胞在与第一抗体染色相同条件下与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。通过FACScan仪器使用光和侧散射特性建立单细胞闸门来分析样品。除了或替代流式细胞计测定，可以使用荧光显微镜作为可选的测定。可以准确染色细胞如上并且通过显微镜检查。该方法允许可视单个细胞，但是依赖于抗原密度可能具有减少的敏感度。
还可以通过免疫印迹进一步检测本发明的抗-hTSLPR抗体与hTSLPR多肽或抗原片段的反应。简言之，可以制备纯化的hTSLPR多肽或融合蛋白质，或来自表达TSLPR细胞的细胞提取物，并且应用于十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移到用10％胎牛血清封闭的硝酸纤维素膜上，并且用待测试的单克隆抗体做探针检测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并且用BCIP/NBT底物片剂显影(希格玛化学有限公司(Sigma Chem.Co.)，St.Louis，MO)。
V.非免疫球蛋白支架
可以使用多种的抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要产生的多肽包括至少一个对靶标蛋白质特异性的结合区。这样的构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段(例如，在本文其它地方公开的那些)的5个主要的独特型，并且包括其它动物种的免疫球蛋白，优选具有人源化的方面。单个的重链抗体，例如那些在camelids中鉴定的那些在这方面是特别感兴趣的。新的构架、支架和片段持续被发现并且由本领域技术人员开发。
一方面，本发明有关于使用非免疫球蛋白支架产生基于抗体的非免疫球蛋白，本发明的CDR可以被移植到所述非免疫球蛋白的支架上。可以使用已知的或未来的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对SEQ IDNO：X的靶标蛋白质特异性的结合区。这样的化合物在本文称为“包含靶标特异性结合区的多肽”。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括，但不限于Adnectins(纤连蛋白)(化合物治疗公司，altham，MA)、锚蛋白(分子配偶体，Zurich，瑞士)、结构域抗体(德曼提斯公司(Domantis，Ltd)(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，比利时))、脂质运载蛋白(Anticalin)(皮尔森蛋白实验室AG(Pieris Proteolab AG)，Freising，德国)、小模块免疫药物(楚宾药物公司(Trubion Pharmaceuticals Inc.)，Seattle，WA)、maxybodies(爱薇迪阿公司(Avidia，Inc.)(Mountain View，CA))、蛋白质A(Affibody AG，瑞典)和affilin(γ-晶状体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)。
(i)Adnectins-化合物治疗
Adnectin支架是基于纤连蛋白类型III结构域，例如，纤连蛋白类型III的第十模块(10 Fn3结构域)。纤连蛋白类型III结构域具有分布在两个β片层之间的7或8个β链，其针对彼此自身折叠以形成蛋白质的核心，并且还含有环(CDR的类似物)，其与β链彼此连接并且暴露于溶剂。在β片层三明治的每个边缘有至少三个这样的环，其中该边缘是蛋白质垂直于β链方向的边界(US 6,818,418)。
尽管其整体折叠与重链可变区，最小功能性抗体片段的折叠近似，这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，所述最小功能性抗体片包含在骆驼和美洲驼羊IgG中完整的抗原识别单位。因为这一结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗原结合的特性在特征和亲和力上与其它抗体相似。这些支架可以用于体外的环随机化和重分配(shuffling)策略，其与体内抗体亲和力成熟的过程相似。可以使用这些基于纤连蛋白的分子作为支架，可以使用标准克隆技术用本发明的CDR替代其中该分子的环区。
(ii)锚定蛋白-分子配偶体
该技术是基于使用具有锚定蛋白衍生的重复模块的蛋白质作为载有可变区的支架，所述可变区可以用于结合不同的靶标。锚定蛋白重复模块是33个氨基酸的多肽，由两个反向平行的α螺旋和一个β转角组成。通过使用核糖体展示来最优化可变区的结合。
(iii)Maxybodies/Avimers-爱薇迪阿(Avidia)
Avimers衍生自天然含有A-结构域的蛋白质，例如LRP-1。这些结构域被天然用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中超过250个蛋白质在结构上是基于A结构域的。Avimers由经由氨基酸接头连接的多个不同的“A-结构域”单体组成。使用在例如，20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中所述方法可以产生结合于靶标抗原的avimers。
(vi)蛋白质A-Affibody
Figure A200780003091D0038104701QIETU
亲和配体是基于蛋白质A的IgG结合结构域之一的支架的三-螺旋束组成的小的简单蛋白质。蛋白质A来自金黄色葡萄球菌细菌的表面蛋白质。这一支架结构域由58个氨基酸组成，其中的13个是随机化的以产生具有大量配体变体的
Figure A200780003091D0038104711QIETU
文库(见例如，US 5,831,012)。
Figure A200780003091D0038104722QIETU
分子模拟抗体，与150kDa的抗体分子量相比，其具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小，
Figure A200780003091D0038104731QIETU
分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
(v)Anticalins-皮尔森
Figure A200780003091D0038104740QIETU
是由皮尔森蛋白质实验室AG开发的产品。它们从脂质运载蛋白衍生，是广泛的一组小的和有力的蛋白质，其通常涉及化学敏感或不溶解化合物的生理运载或储存。许多天然的脂质运载蛋白在人组织或体液中存在。
该蛋白质结构暗示其为在刚性构架顶端具有高可变环的免疫球蛋白。然而，与抗体或其重组片段相反，脂质运载蛋白是由具有160到180个氨基酸残基的单个多肽链组成，恰好边缘大于单个免疫球蛋白结构域。
构成结合口袋的四个环系列显示显著的结构可塑性和容忍多种侧链。该结合位点因此可以是在专利药物加工中重塑的，从而以高亲和力和特异性来识别规定的不同形状的靶标分子。
已经使用脂质运载蛋白家族的一个蛋白质，Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)，通过诱变该四个环系列以开发anticalins。描述“anticalins”的专利申请的一个实例是PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil蛋白质
AffilinTM分子是小的非免疫球蛋白，设计其用于对蛋白质和小分子的特异性亲和力。新的AffilinTM分子可以从两个文库中被非常快速的选出，其各自是基于不同的人衍生支架蛋白质。AffilinTM分子不显示与免疫球蛋白的任何结构同源性。Scil蛋白质使用两个AffilinTM支架，其中一个是γ晶状体，人的结构晶状体蛋白质，而另一个是“泛素”超家族蛋白质。两个人支架是非常小的，显示高的温度稳定性并且几乎对pH改变和变性剂具有抗性。这一高稳定性主要由于蛋白质的扩展的β片层结构。γ晶状体衍生蛋白的实例被描述于WO200104144，并且“类泛素”蛋白质的实例被描述于WO2004106368。
VI.抗-hTSLPR抗体的治疗应用
可以通过抑制TSLP信号活性将抗-hTSLPR抗体应用于许多治疗或预防应用。这些包括治疗通过TSLP信号介导的疾病或病症，例如，影响B细胞发育、T细胞发育、T细胞受体基因重排、或Stat5转录因子的调节的那些。例如，抗-hTSLPR拮抗物抗体可以用于抑制或减少由TH2细胞介导的不期望的免疫应答。特别是，它们适合用于治疗患有与TSLP信号有关或由其介导的过敏炎性紊乱的人患者。适于用本发明的抗-hTSLPR抗体治疗的过敏炎性疾病包括，例如，(1)哮喘，与气流阻塞和支气管高应答有关的呼吸道的慢性炎症；(2)特应性皮炎，需要长期间歇治疗的慢性、恶化炎性皮肤病；和(3)变态反应性鼻炎，由与遗传性过敏症有关的TH2淋巴细胞介导的鼻黏膜的炎性紊乱。在美国和许多主要的欧洲国家中，据判断，从现在到2013年，对于哮喘、特应性皮炎和变态反应性鼻炎的流行性诊断分别从目前的46000000增加到53000000，从目前的31700000增加到37200000，和从55900000增加到64500000。约百分之50至80的特应性皮炎患者将发展为哮喘或过敏性鼻炎。
目前大多数可用于治疗过敏的药物目标是提供症状缓解而相对较少的对提供长期疾病改善的免疫调节领域起作用。本发明的抗-hTSLPR抗体可以对患有任何这些过敏疾病的受试者(特别是人患者)提供新型和有效的治疗。通过预防TSLP激活TSLP受体信号转导通路，它们可以阻断TH2应答和负责过敏性炎症的引发和维持的细胞因子的产生。因此这一方法对患有特应性皮炎、哮喘和变态反应性鼻炎的患者具有诱导长期的治疗效果和疾病改善益处的潜力。
在另一实施方案中，本发明提供具有至少一个以上任意的抗体或功能性片段或保守变体的药物组合物，和药物可接受的载体或其赋形剂。
在某些实施方案中，本发明提供治疗关于具有受体靶标hTSLP的细胞存在的紊乱或状况的方法。该方法涉及按受试者所需向其施用有效量的任意上述药物组合物。在有关的实施方案中，要治疗的紊乱或病症是呼吸紊乱。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是支气管哮喘，其是以呼吸道高反应性(AHR)、粘液产生过度、纤维化和增加的血清IgE水平为特征的普遍持续性肺部炎性疾病。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是遗传(过敏性)皮炎，其是儿童期最常见的皮肤疾病，并且以强烈的瘙痒和慢性湿疹性斑点为表征。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是选自其它炎性或呼吸道阻塞疾病和病症，例如COPD、急性肺损伤(ALI)、急性/成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸困难、过敏性呼吸道炎症、小气管疾病、肺癌、在患有镰刀形红细胞病和肺性高血压的患者中的急性胸腔综合征，以及由于其它药物治疗，特别是其它吸入药物治疗导致的气道高反应性的恶化。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是无论任何类型或起源的支气管炎，包括，例如，急性、花生的(arachidic)、鼻黏膜炎的、哮吼性的、慢性或结核性支气管炎。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症包括无论何种类型或起源的肺尘症(肺的炎性，通常职业性的疾病，无论慢性或急性，常伴随着气道堵塞，并且由反复吸入粉尘引起)，包括例如，矾土肺、煤肺病、石棉肺、石末肺、驼鸟毛尘肺、铁尘肺、矽肺、烟草尘肺和棉尘肺。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症选自特应性鼻炎(花粉症)和慢性窦炎。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症选自皮肤的其它炎性病症，例如，银屑病或红斑狼疮。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是炎性肠病，例如，溃疡性结肠炎和克隆病。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症选自其它的纤维化病症，例如全身性硬化症、肝纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化或纤维化肺。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是肿瘤复发或迁移。已经表明，抑制Th2细胞因子增加在动物模型中的抗病毒疫苗并且可能有利于HIV和其它感染疾病的治疗[Ahlers，J.D.，等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2002]。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是呼吸性病毒感染，其在慢性条件例如哮喘、慢性支气管炎、COPD、中耳炎、和窦炎情况下恶化。该呼吸道病毒感染的治疗可以结合继发性细菌感染，例如，中耳炎、窦炎或肺炎。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是选自其它疾病或病症，特别是具有炎症性成份的疾病或病症，例如，骨和关节的疾病，包括风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和其它疾病，例如动脉粥样硬化、多发性硬化和(例如在移植心、肾、肝、肺或骨髓之后)急性和慢性同种异体移植排斥。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是内毒素性休克、肾小球肾炎、脑和心肌缺血、阿尔茨海默尔病、囊性纤维化、病毒感染和与其相关的恶化、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、多发性硬化(MS)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)相关的胃炎、和癌症，特别是卵巢癌的生长。
在另一实施方案中，要治疗的紊乱或病症是由在人中的病毒感染引起的症状，其由人鼻病毒、其它肠道病毒、冠状病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒引起。
根据本发明的治疗可以是症状的或预防的。
本发明的物质在抑制炎性病症，例如炎性呼吸道疾病中的有效性可以在动物模型(例如，小鼠、大鼠或兔子模型)的呼吸道炎症或其它炎性病症，例如Wada等人，J.Exp.Med(1994)180：1135-40；Selkido等人，Nature(1993)365：654-57；Modelska等人，Am.J.Respir.Crit.Care.Med(1999)160：1450-56；和Laffon等人(1999)Am.J.Respir.Crit.Care Med.160：1443-49所述中得到证明。
在另一实施方案，本发明提供鉴定具有hTSLP受体的细胞的方法。这一方法涉及将细胞与还具有可检测标记的任何以上抗体或抗体片段接触。该标记是放射性的、荧光的、有磁性、顺磁的或化学荧光的。该方法还涉及任何以上的对标记细胞的成像或分离。
在另一实施方案中，任何以上人或人源化的抗体或抗体片段是合成的。
在另一实施方案中，本发明提供药物组合物和另外的治疗物质。
另外的治疗物质可以选自抗炎、支气管扩张、抗组织胺或止咳药物质组成的组，特别是例如前述治疗堵塞性或炎性气道疾病的那些，例如作为这类药物的治疗活性的增强剂，或作为减少这样的药物的所需剂量或潜在副作用的方法。本发明的治疗物质可以与其它药物物质以固定的药物组合物混合或可以与其它药物物质在之前、同时或之后分开的施用。因此，本发明包括如前所述的本发明物质与抗炎、支气管扩张、抗组织胺或止咳药物质、在相同或不同药物组合物中的本发明的所述物质和所述药物物质的组合。
合适的抗炎性药物包括甾类，特别是糖皮质激素，例如布地奈德、丙酸倍氯米松、丙酸氟替卡松、环索奈德或糠酸莫米松；或描述于WO02/88167、WO 02/12266、WO 02/100879、WO 02/00679(特别是在实施例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99和101中所述的那些)、WO 03/35668、WO 03/48181、WO 03/62259、WO03/64445、WO 03/72592、WO 04/39827和WO 04/66920的甾类；非类固醇类糖皮质激素受体激动剂，例如描述于DE 10261874、WO 00/00531、WO 02/10143、WO 03/82280、WO 03/82787、WO 03/86294、WO 03/104195、WO 03/101932、WO 04/05229、WO 04/18429、WO 04/19935和WO04/26248的那些；LTB4拮抗物，例如BIIL 284、CP-195543、DPCI1870、LTB4乙醇酰胺、LY 293111、LY 255283、CGS025019C、CP-195543、ONO-4057、SB 209247、SC-53228和描述于US 5451700的那些；LTD4拮抗物，这类包括孟鲁司特(montelukast)、普仑司特(pranlukast)、扎鲁司特(zafirlukast)、安可来(accolate)、SR2640、Wy-48，252、ICI 198615、MK-571、LY-171883、Ro 24-5913和L-648051；PDE4抑制剂，如西洛司特(葛兰素史克)、罗氟司特(Byk Gulden)、V-11294A(Napp)、BAY19-8004(拜尔)、SCH-351591(Schering-Plough)、阿罗茶碱(AlmirallProdesfarma)、PD189659/PD168787(Parke-Davis)、AWD-12-281(AstaMedica)、CDC-801(Celgene)、SelCID(TM)CC-10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe)、KW-4490(Kyowa HakkoKogyo)，和描述于WO 92/19594、WO 93/19749、WO 93/19750、WO93/19751、WO 98/18796、WO 99/16766、WO 01/13953、WO 03/104204、WO 03/104205、WO 03/39544、WO 04/000814、WO 04/000839、WO04/005258、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/018431、WO 04/018449、WO 04/018450、WO 04/018451、WO04/018457、WO 04/018465、WO 04/019944、WO 04/019945、WO 04/045607和WO 04/037805的那些；A2A激动剂，例如描述于EP 1052264、EP1241176、EP 409595A2、WO 94/17090、WO 96/02543、WO 96/02553、WO 98/28319、WO 99/24449、WO 99/24450、WO 99/24451、WO 99/38877、WO 99/41267、WO 99/67263、WO 99/67264、WO 99/67265、WO 99/67266、WO 00/23457、WO 00/77018、WO 00/78774、WO 01/23399、WO 01/27130、WO 01/27131、WO 01/60835、WO 01/94368、WO 02/00676、WO 02/22630、WO 02/96462和WO 03/086408的那些；和A2B拮抗物，例如描述于WO02/42298的那些。
合适的支气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱物质，特别是异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵盐和CHF 4226(Chiesi)、以及格隆溴铵，还有那些描述于EP 424021、US 3714357、US 5171744、WO 01/04118、WO02/00652、WO 02/51841、WO 02/53564、WO 03/00840、WO 03/33495、WO 03/53966、WO 03/87094、WO 04/018422和WO 04/05285的那些；和β-2肾上腺受体激动剂，例如沙丁胺醇(舒喘灵(salbutamol))、奥西那灵、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、丙卡特罗，和特别是福莫特罗、卡莫特罗(carmoterol)及其药物可接受的盐，和WO 00/75114的式I的化合物(以游离或盐或溶化物的形式)，其文件在本文被引入作为参考，优选其实施例的化合物，特别是化合物(5-[(R)-2-(5，6-二乙基-茚满-2-基氨基)-1-羟基-乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮)及其药物可接受的盐，以及WO 04/16601的式I的化合物(以游离或盐或溶化物的形式)，以及还有EP 1440966、JP05025045、WO 93/18007、WO 99/64035、US 2002/0055651、WO 01/42193、WO 01/83462、WO 02/66422、WO 02/70490、WO 02/76933、WO 03/24439、WO 03/42160、WO 03/42164、WO 03/72539、WO 03/91204、WO 03/99764、WO 04/16578、WO 04/22547、WO 04/32921、WO 04/33412、WO 04/37768、WO 04/37773、WO 04/37807、WO 04/39762、WO 04/39766、WO 04/45618、WO 04/46083、WO 04/80964、EP1460064、WO 04/087142、WO 04/089892、EP 01477167、US 2004/0242622、US 2004/0229904、WO 04/108675、WO04/108676、WO 05/033121、WO 05/040103和WO 05/044787的化合物。
合适的双抗炎和支气管扩张药物包括二元β-2肾上腺素受体激动剂/毒蕈碱拮抗物，例如在US 2004/0167167、WO 04/74246和WO 04/74812公开的那些。
合适的抗组胺药物物质包括盐酸西替利嗪、醋氨酚、富马酸氯马斯汀、异丙嗪、氯雷他定、地氯雷他定、苯海拉明和盐酸非索那定、activastine、阿司咪唑、氮卓斯汀、依巴斯汀、依匹斯汀、咪唑斯汀和tefenadine，以及在JP 2004107299、WO 03/099807和WO 04/026841公开的那些。
也可以使用本发明的治疗物质与抗胆碱能或抗毒蕈碱物质、甾类、β-2激动剂、PDE4抑制剂、多巴胺受体激动剂、LTD4拮抗物或LTB4拮抗物的组合。本发明的物质与抗炎药物的其它有用的组合是那些与化学因子受体的其它拮抗物的那些，例如CCR-1、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9和CCR10，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5，特别是CCR-5拮抗物，例如先灵-葆雅(Schering-Plough)拮抗物SC-351125、SCH-55700和SCH-D，武田(Takeda)拮抗物，例如N-[[4-[[[6，7-二氢-2-(4-甲基苯基)-5H-苯并环庚三烯-8-基]羰基]氨基]苯基]-甲基]-四氢-N，N-二甲基-2H-吡喃-4-氯化铵(TAK-770)、CCR-5拮抗物描述于US 6166037(特别是权利要求18和19)、WO 0066558(特别是权利要求8)、WO 0066559(特别是权利要求9)、WO 04/018425和WO 04/026873中。
另外的治疗物质还可以选自由其它细胞因子结合分子(特别是其它细胞因子的抗体)组成的组，尤其是与抗-IL4抗体(例如在PCT/EP2005/00836所述)、抗-IgE抗体(例如
Figure A200780003091D00451
)、抗-IL31抗体、抗-IL31R抗体、抗-IL13抗体(例如在WO05/007699所述)、抗内皮因子抗体、抗-IL1b抗体、抗-TSLP抗体或另一抗-hTSLPR抗体的组合。
本发明的抗-hTSLPR拮抗物抗体可以用于对受试者进行治疗性和预防性的治疗。在治疗应用中，将包含抗-hTSLPR拮抗物抗体(例如，人源化的抗-hTSLPR抗体)的组合物施用于已经受到由TSLP信号引起或有关的过敏疾病影响的受试者。该组合物含有的抗体量足以治愈、部分阻止或可检测的延缓病症的进程，和其并发症。在预防应用中，将含有单克隆抗-hTSLPR抗体的组合物施用于尚未患有过敏炎性紊乱的患者。更正确的，将其定向于有发展过敏性炎性紊乱风险或具有倾向的受试者。这样的应用允许受试者增加患者抵抗力或延迟由TSLP信号介导的过敏炎性紊乱的发展进程。
VII.药物组合物
本发明提供包含抗-hTSLPR单克隆抗体(完整或结合的片段)与药物可接受的载体一起配制的药物组合物。该组合物可以另外含有适用于治疗或预防指定的过敏性紊乱的其它治疗物质(例如以上指出的公知的抗过敏物质)。药用的载体增加或稳定该组合物，或者有利于该组合物的制备。药物可接受的载体包括溶剂、分散剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等生理上可配伍的载体。
可以通过本领域公知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和/或模式依赖于期望的结果而改变。优选是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，或临近靶标位点施用。药物可接受的载体应该适用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠道外、脊柱或表皮的施用(例如，通过注射或灌注)。依赖于施用的途径，可以以材料包被该活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)以保护该化合物免受酸和其它可能灭活该化合物的自然条件的作用。
该化合物应该是无菌和液体的。可以通过使用例如卵磷脂包被，通过维持需要的分散颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)，和氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质，例如，单硬脂酸铝或明胶来获得可注射组合物的长期吸收。
本发明的药物组合物可以根据本技术领域众所周知和常规操作的方法来制备。见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Co.，第20版，2000；和Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。优选在GMP条件下制备药物组合物。通常，在本发明的药物组合物中使用抗-hTSLPR抗体的药物有效剂量。通过本领域技术人员公知的常规方法将抗-hTSLPR抗体配制为药物可接受的剂量形式。调整给药方案以提供最佳期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单个的丸剂，可以随时间施用许多分份剂量或可以由治疗情况的紧迫性指示来按比例的减少或增加剂量。尤其最好制备单元剂量形式的胃肠外组合物以方便剂量的施用和一致性。本文使用的单元剂量形式指适合待治疗受试者的作为单一剂量的物理上不连续的单位；每个单元含有计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。
可以改变本发明的药物组合物中活性成份的实际剂量水平以获得对于特定患者、组合物和施用方式而言有效获得期望的治疗应答而没有对患者产生毒性的活性成份的量。选择的剂量水平依赖于多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺类的活性，施用的途径，施用的时间，使用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，被治疗患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康和先前病史等因素。
医师或兽医可以在药物组合物中以低于获得期望治疗效果需要的水平使用本发明的抗体的开始剂量并且逐步增加剂量直至获得期望的效果。通常，用于治疗本文所述的过敏炎性紊乱的本发明组合物的有效量依赖于许多不同因素而改变，包括施用手段、靶标位点、患者的生理状态、患者是否是人或动物、施用的其它药物和是否治疗是预防或治疗性的。需要逐步增加治疗剂量以优化安全性和有效性。对于抗体施用，剂量范围从约0.0001到100mg/kg宿主体重，和更通常0.01到5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每两周施用一次、或一个月一次，或每3-6个月一次。
通常在多种场合施用抗体。单个剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量在患者中的抗-hTSLPR抗体的血液水平所示。在一些方法中，调整剂量以获得1-1000μg/ml和在一些方法中25-300μg/ml的血浆抗体浓度。或者，可以以持续释放配方施用抗体，在该情况下需要较少频繁的施用。剂量和频率依赖于抗体在患者中的半衰期而改变。通常，人源化的抗体显示比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施用的剂量和频率可以依赖于治疗是否是预防或治疗性而改变。在预防的应用中，在长期时间以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量直至疾病的发展被减少或终止，并且优选直至患者显示部分或全部的疾病征状的改善。此后，可以向该患者施用预防的方案。
实施例
提供下列实施例以进一步说明本发明而非限制其范围。本发明的其它变种对于一个本领域普通技术人员是显而易见的，并且包含在所附权利要求之内。
实施例1.小鼠抗-hTSLPR拮抗物抗体的开发
该实施例描述小鼠抗-hTSLPR拮抗物抗体的开发。用购自R&D系统(Minneapolis，MN)(产品号981-TR，批号EDY1312A)的人TSLPR(Met1-Lys231)/人IgG1 Fc(Pro 100-Lys 330)融合蛋白质免疫Bcl2 Wehi22小鼠(#1770)。该免疫在18天内以总共8次注射进行。从外周淋巴结分离B细胞并且融合于F0骨髓瘤细胞(ATCC，Manassas，VA)。通过ELISA针对hTSLPR/Fc蛋白质筛选抗体产生。获得产生特异性识别hTSLPR的抗体的总共24个克隆。以FACS测定(BD生物科学，San Jose，CA)分析hTSLPR抗体与细胞表面TSLPR的结合。简言之，将BaF3/hTSLPR/hIL7Rα细胞与杂交瘤培养物上清液孵育，接着加入FITC-缀合的抗小鼠IgG，并且在FACS仪器上分析。结果显示24个克隆中14个杂交瘤克隆能够结合于细胞表面受体。
接着使用在BaF3/hTSLPR/hIL7Rα细胞中的依赖hTSLP的细胞增殖测定来筛选hTSLP拮抗物抗体。该细胞表达人TSLP和IL7Rα，并且能够应答人TSLP的刺激(Reche等人，J.Immunol.，167：336-43，2001)。基本按照Reche等人所述进行细胞增殖测定。简言之，将BaF3/hTSLPR/hIL7R细胞与来自培养上清液的抗体预孵育1小时，和以在图1中所示指定浓度的hTSLP诱导。使用Alamar Blue(TREK诊断系统，Cleveland，OH)测量细胞增殖。对于每个亲本克隆，在测定中使用一到三个亚克隆。结果如在图1中所示，表明来自克隆1D6的三个亚克隆显示强的拮抗物活性。
对来自亚克隆之一(1D6.C9)的单克隆抗体(mAb)进行纯化(图2C)。简言之，用Cleanascite(LigoChem，Fairfield，NJ)处理来自Miniperm培养(Vivascience，Carlsbad，CA)的无血清条件培养基。接着通过蛋白G树脂(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)，Piscataway，NJ)纯化抗体。在如上所述细胞增殖测定中测试纯化的抗体。在加入1ng/ml hTSLP之前，用不同浓度的抗体处理Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα细胞或Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc细胞1小时。结果表明，通过加入小鼠抗-hTSLPR抗体以剂量依赖的方式抑制Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα细胞(图3A)和Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc细胞(图3B)的TSLP-依赖的增殖。
此外，还使用萤光素酶报道基因测定检测抗体对TSLP-介导的信号活性的影响。TSLP在Baf3/hTSLPR/hIL7Ra细胞中诱导Stat3和Stat5的磷酸化(Reche等人，如上)。设计该测定以测量应答TSLP信号在Baf3/hTSLPR/hIL7Ra/Stat5-Luc细胞中Stat5控制下报道基因的表达。简言之，通过将Stat一致性结合位点插入不含有启动子和增强子的pGL2基本Luc报道基因载体(普若麦格(Promega)，Madison，WI)中产生报道基因构建体。插入的Stat结合位点含有8个拷贝的GATTTCCCCGAAATG序列元件(SEQ ID NO：15)其包含核心Stat结合序列TTCCCGGAA(SEQ IDNO：16)(Yan等人，Cell.84：421-30，1996；和Saylors等人，Gene Ther.6：944-6，1999)。将Stat-Luc报道基因构建体引入BaF3/hTSLPR-hIL7Rα细胞。在加入1ng/ml的hTSLP之前，用不同浓度的小鼠抗体处理产生的BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc细胞1小时。使用Bright Glo(普若麦格，Madison，WI)测量萤光素酶活性。从该测定获得的结果显示于图3C。与来自细胞增殖测定的结果相似，来自Stat5-Luc报道基因测定的数据也证明小鼠抗-hTSLPR抗体的剂量依赖的拮抗物活性。
通过RT-PCR克隆出mAb 1D6.C9重链(VH)和轻链(VL)的可变区。用于鉴定重链和轻链的可变区的引物序列如下。VH的引物为：(1)VH9：GATGGCAGCWGCYCAAAG(SEQ ID NO：1)；和(2)H-恒定：GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC(SEQID NO：2)。VL的引物为：(1)LCV3：GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA(SEQID NO：3)；和L-恒定：GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG(SEQ ID NO：4)。
简言之，从1D6.C9克隆分离总RNA。使用针对信号序列的重链或轻链可变区的正向引物和针对重链CH1区或轻链κ恒定区的反向引物进行RT-PCR。将PCR产物克隆进入pCR II或pcDNA3.1/V5-His-TPOP-TA载体用于测序。然后确定这一抗体克隆的重链和轻链可变区序列的多核苷酸序列(图4)。可变区(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)的相应氨基酸序列显示于图5中。在图5中也表明根据Kabat等人，如上的编号系统推出的CDR区和构架区。
实施例2.嵌合抗-hTSLPA抗体的产生
本实施例描述嵌合抗-hTSLPR抗体的产生和特征。该嵌合抗体含有来自以上指出的小鼠抗-hTSLPR抗体1D6.C9克隆的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区。
为了产生嵌合抗体，使用PCR技术和在实施例1中描述的用于克隆进入盒载体的引物序列制备抗人TSLPR的小鼠抗体1D6.C9克隆的可变区。接着使用表1中的序列，将PCR产物分别克隆进入盒载体，该载体含有符合读码框的融合人免疫球蛋白前导序列、J-片段和剪接-供体信号。然后将该序列转移进入含有人免疫球蛋白恒定区的哺乳动物表达载体，例如，SP2/0载体。
表1.用于克隆进入IgG1κ表达载体的引物序列
 
引物 序列
NV115-3B-VH正向 5′磷酸化的CAGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGSEQ ID NO：18              
NV115-3B-VH反向 GGAGCTCACGGTCACCAGGG SEQ ID NO：19
NV115-3B-VK正向 GAGTACGCGTTGTGACATCCAGATGACCCAGSEQ ID NO：20                     
NV115-3B-VK-反向 GCTCAAGCTTCGTACCTTGGCCAAACGSEQ ID NO：21                 
选择表达重链的克隆是基于新霉素选择，而表达轻链的克隆是使用dhfr选择。使用氨甲喋呤开始基因扩增。将重链的可变区盒分别转移到人IgG1和IgG4哺乳动物表达载体。
亚克隆之后，为了产生IgG1嵌合抗体，将嵌合IgG1重链和κ轻链的DNA质粒共电穿孔转入SP2/0骨髓瘤细胞。同样，为了产生IgG4嵌合抗体，将嵌合IgG4重链和κ轻链的DNA质粒共电穿孔转入SP2/0骨髓瘤细胞。用遗传霉素选择细胞，然后在含有遗传霉素和甲氨喋呤的生长培养基中培养和扩增。向细胞加入用于抗体纯化的无血清培养基。纯化从转染的SP2/0细胞分泌的嵌合IgG1和IgG4抗体(图2A和图2B)。在Luc报道基因测定中，将纯化的嵌合IgG1和IgG4抗体的拮抗物活性与小鼠抗体的拮抗物活性进行比较。使用抗死亡受体5(DR5)的IgG1嵌合抗体作为阴性对照。如在过表达hTSLPR、hIL7Rα和Stat5-Luc的Ba/F3细胞中通过报道基因表达所测量的，结果表明嵌合的抗-hTSLPR抗体呈现与小鼠IgG1抗体相似的拮抗物活性(图6)。
实施例3.抗-hTSLPR抗体抑制TSLP-介导的TARC分泌
本实施例描述通过抗-hTSLPR拮抗物抗体对来自人单核细胞的TSLP-介导的TARC分泌的抑制。检测以上指出的小鼠和嵌合的抗-hTSLPR抗体对人单核细胞的TH2-诱集的胸腺和激活可调节化学因子(TARC)的TSLP-介导的分泌的影响。除了加入抗-hTSLPR抗体，基本按照Soumelis等人，NatImmunol.3：673-80，2002中所述进行TARC分泌测定。结果在图7中显示。图的上面两栏分别显示用TSLP刺激人单核细胞和CD11+树突细胞的TARC分泌。底下三栏分别显示三个不同的抗-hTSLPR抗体对人单核细胞的TSLP介导的TARC分泌的影响。如在图中证明的，小鼠抗-hTSLPR抗体和嵌合的抗-hTSLPR抗体(IgG1和IgG4同种型)都能以剂量依赖的形式抑制人单核细胞分泌TARC。这进一步验证抗-hTSLPR抗体对TSLP信号的拮抗作用。
使用标准Biacore胞质团共振分析来测量“开”(ka)和“关”(kd)速率进行确定抗-hTSLPR抗体的结合亲和力的结合研究。这些测量导致对抗体结合常数(KD)的计算。还使用ForteBiop进行进一步的分析以检测溶液结合动力学。此外，使用细胞测定来确定抗体的IC50。这些研究的结果总结在表3中。
表3.靶标抗体的亲和力、生物活性、特异性和cyno反应性(cynoreactivity)数据
Figure A200780003091D00521
抗体序列
NV115-3B序列
VH
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGL
EWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAED
TAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：
22)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYST
YPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：23)
NV115-3E序列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGL
EWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAED
TAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：
24)
VK
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLL
IHWAVTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTY
PTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：25)
NV115-3E序列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGL
EWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAED
TAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：
26)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASODIHTRLAWYQQKPGQPPKL
LIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQYST
YPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：27)
尽管已经通过说明和以清楚理解为目的的实施例对上述发明进行了详细描述，在本发明的教导下，对本领域的普通技术人员应该显而易见的是可以对本发明做出某些改变和修饰而不背离所附权利要求的精神或范围。
在本说明书中引用的全部公开、数据、基因库序列、专利和专利申请在这里被并入作为参考，如被特别的和单独的引入作为参考。
序列表
Figure A200780003091E00542
Figure A200780003091E00551

Claims (32)

1.分离的抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区序列SEQ ID NO：5。
2.分离的抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区序列SEQ ID NO：5和轻链可变区序列SEQ ID NO：6。
3.权利要求2的抗体，其包含重链互补决定区(CDR)序列TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)、或EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；或轻链CDR序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)、或QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
4.权利要求2的抗体，其包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
5.权利要求2的抗体，其包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的重链可变区氨基酸序列，和与SEQ ID NO：6具有至少80％同一性的轻链可变区氨基酸序列。
6.权利要求2的抗体，其是小鼠抗体。
7.权利要求2的抗体，其是嵌合抗体。
8.权利要求1的抗体，其包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
9.权利要求2的抗体，其是人源化的抗体。
10.权利要求2的抗体，其是人抗体。
11.权利要求2的抗体，其是单链抗体。
12.权利要求2的抗体，其是Fab片段。
13.权利要求2的抗体，其是IgG1或IgG4同种型的。
14.分离或重组的多核苷酸，其编码包含权利要求2的抗体的重链可变区或轻链可变区的多肽。
15.权利要求14的多核苷酸，其中该抗体是人抗体。
16.权利要求14的多核苷酸，其中该多核苷酸编码的抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
17.权利要求14的多核苷酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO：5的成熟区具有至少80％同一性的成熟重链可变区序列；和与SEQ ID NO：6的成熟区具有至少80％同一性的成熟轻链可变区序列。
18.权利要求14的多核苷酸，其中该抗体包含与SEQ ID NO：5的成熟区相同的成熟重链可变区序列，和与SEQ ID NO：6的成熟区相同的成熟轻链可变区序列。
19.权利要求14的多核苷酸，其为DNA。
20.分离的宿主细胞，其包含(1)编码权利要求2的抗体的重链的重组DNA片段，和(2)编码该抗体的轻链的第二重组DNA片段；其中所述DNA片段分别有效连接于第一和第二启动子，并且能够在所述宿主细胞中被表达。
21.权利要求20的宿主细胞，其中单克隆抗体是人抗体。
22.权利要求20的宿主细胞，其中单克隆抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQ ID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
23.权利要求20的宿主细胞，其中该抗体包含与SEQ ID NO：5的成熟区具有至少80％同一性的成熟重链可变区序列；和与SEQ ID NO：6的成熟区具有至少80％同一性的成熟轻链可变区序列。
24.权利要求20的宿主细胞，其中单克隆抗体包含与SEQ ID NO：5的成熟区相同的成熟重链可变区序列，和与SEQ ID NO：6的成熟区相同的成熟轻链可变区序列。
25.权利要求20的宿主细胞，其是非人的哺乳动物细胞系。
26.治疗受试者中的炎性紊乱的方法，该方法包括向受试者施用包含有效量的权利要求2的抗体的药物组合物。
27.权利要求26的方法，其中该抗体是人抗体。
28.权利要求26的方法，其中该抗体包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为TYGMS(SEQ ID NO：7)、WINTYSGVPRYADDFKG(SEQID NO：8)和EGFITTVVGAAGRFVY(SEQ ID NO：9)；和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，分别为KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：10)、WASTRHT(SEQ ID NO：11)和QQYSTYPT(SEQ ID NO：12)。
29.权利要求26的方法，其中该抗体包含(i)与SEQ ID NO：5的成熟区相同的成熟重链可变区序列；和(ii)与SEQ ID NO：6的成熟区相同的成熟轻链可变区序列。
30.权利要求26的方法，其中该受试者是人。
31.权利要求26的方法，其中该受试者患有过敏炎性疾病。
32.权利要求31的方法，其中该过敏炎性疾病是特应性皮炎、哮喘或变态反应性鼻炎。
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