ES2883128T3 - Anticuerpos anti-survivina para la terapia contra el cáncer - Google Patents

Anticuerpos anti-survivina para la terapia contra el cáncer Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo que es específico para la survivina para el uso en un método para tratar un tumor que expresa la survivina en un individuo, el uso comprende administrar una composición al individuo que tiene un tumor que expresa la survivina, dicha composición comprende el anticuerpo que es específico para la survivina; en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde, a) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12; o b) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-survivina para la terapia contra el cáncer
Antecedentes de la divulgación
La survivina es una proteína intracelular que pertenece a una familia de inhibidores de la apoptosis. La survivina actúa en conjunto con el aparato del huso mitótico para regular la división celular. Se expresa en ciertas células durante la fase G2/M del ciclo celular y se asocia con el centro organizador de microtúbulos del huso durante esta fase de progresión del ciclo celular. La survivina tiene funciones críticas en diferentes loci celulares para regular el ciclo celular e inhibir la muerte celular apoptótica. Con frecuencia se expresa en células cancerosas de muchos diferentes tipos, pero con poca frecuencia en tejidos adultos normales. Se han utilizado secuencias de péptidos de survivina para desarrollar estrategias de vacunación. Si bien la supervivencia de los pacientes con algunos cánceres ha mejorado, persisten desafíos, particularmente para aquellos con enfermedad avanzada en el momento del diagnóstico. Como tal, sigue existiendo la necesidad de desarrollar estrategias adicionales para combatir el cáncer. WO2009012460A1 divulga composiciones y métodos para tratar cánceres que expresan survivina. Las composiciones contienen péptidos de survivina miméticos con características de unión a MHC-I mejoradas. El método implica la administración de un péptido de survivina mimético con características de unión a MHC-I mejoradas de un individuo para efectuar la inhibición del crecimiento de las células cancerosas que expresan survivina en el individuo
Resumen de la divulgación
La presente divulgación proporciona composiciones y composiciones para el uso en métodos para el tratamiento de tumores que comprenden células que expresan survivina. La divulgación proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de los mismos, composiciones que comprenden los anticuerpos, moléculas de ácido nucleico que codifican a los anticuerpos, vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico, células que comprenden los anticuerpos y/o moléculas de ácido nucleico, kits que comprenden uno o más anticuerpos o moléculas de ácido nucleico, y uso de los anticuerpos o moléculas de ácido nucleico o células que comprenden los anticuerpos o moléculas de ácido nucleico para inhibir el crecimiento de tumores.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, que puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal (mAb), que es específicamente reactivo contra uno o más epítopos de survivina. El anticuerpo puede generarse en respuesta a la administración de un péptido de survivina o una modificación del mismo. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo en respuesta a un péptido, que puede tener de 9 a 23 aminoácidos de longitud y comprender el núcleo de la secuencia QMFFCF (SEQ ID NO: 3).
Un anticuerpo de esta divulgación es un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región de determinante complementariedad (CDR) 1 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 7, una CDR2 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 8 y una CDR3 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 10, una CDR2 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 12; o un anticuerpo monoclonal que comprende un VH que comprende una CDR1 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 13, una CDR2 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 14 y una CDR3 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, y una VL que comprende una CDR1 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16, una CDR2 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una CDR3 que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados. En un anticuerpo quimérico o humanizado, algunas porciones de las cadenas pesadas y/o ligeras pueden ser idénticas u homólogas a secuencias de una especie mientras que otras porciones pueden ser idénticas u homólogas a secuencias de una especie diferente. Por ejemplo, pueden aislarse o generarse anticuerpos monoclonales murinos y luego usarse porciones de estos anticuerpos (o información de secuencia derivada de los mismos) para generar anticuerpos quiméricos o humanizados. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con uno o más péptidos de survivina y luego se pueden recolectar muestras de líquido ascítico. Las muestras se pueden cribar y seleccionar para desarrollar un panel de anticuerpos monoclonales y las líneas celulares de hibridoma correspondiente. Las porciones o secuencias de los anticuerpos monoclonales se pueden usar para generar anticuerpos quiméricos o humanizados. Un anticuerpo de la presente divulgación también puede ser un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, biespecífico o multiespecífico.
La divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican las secuencias de anticuerpos (incluidos mAb). La divulgación también proporciona células que comprenden las moléculas de ácido nucleico.
Esta divulgación proporciona una composición para el uso en un método de tratamiento de un tumor en un individuo que necesita tratamiento que comprende administrar al individuo una composición que comprende uno o más anticuerpos que son específicos para la survivina, tal como, por ejemplo, la survivina humana.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación del efecto del anticuerpo monoclonal anti-survivina en un modelo de glioma intracraneal en ratones C57BL/6 con glioma GL261. A los ratones se les administró anticuerpo anti-survivina una vez cada 7 días después de la implantación del tumor. El porcentaje de supervivencia se muestra en función del tiempo. IgG de ratón normal es una IgG no específica. El control son ratones implantados con tumor sin tratar. Figura 2. Representación del efecto de anticuerpos policlonales y monoclonales anti-survivina en un modelo de tumor subcutáneo en ratones C57BL/6 con glioma GL261. A los ratones se les administraron los tratamientos indicados una vez cada 7 días después de la implantación del tumor. SurVaxM es la vacuna de survivina; los sueros anti-survivina (anticuerpo) se obtuvieron de ratones agrupados que no portaban tumores que recibieron la vacuna activa de survivina o péptidos de survivina. El control son ratones implantados con tumor sin tratar. Figura 3. Representación del efecto de anticuerpos policlonales anti-survivina en un modelo de tumor subcutáneo en ratones C57BL/6 con glioma GL261. A los ratones se les administraron los tratamientos indicados una vez cada 7 días después de la implantación del tumor. SurVaxM es la vacuna de survivina; los sueros anti-survivina (anticuerpo) se obtuvieron de ratones agrupados sin tumor que recibieron la vacuna SurVaxM activa. Se siguió a los ratones hasta 50 días.
Figura 4. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el melanoma murino B16 en ratones atímicos (inmunocomprometidos). El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30. Cada punto representa un animal.
Figura 5. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el melanoma murino B16 en ratones C57B1/6 (inmunocompetentes). El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30. Cada punto representa un animal.
Figura 6. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales frente al melanoma murino B16 en ratones atímicos (inmunocomprometidos) en función del tiempo. El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30.
Figura 7. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el melanoma murino B16 en ratones C57B1/6 (inmunocompetentes) en función del tiempo. El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30.
Figura 8. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el glioma murino GL261 en ratones atímicos (inmunodeprimidos). El volumen tumoral se muestra para los grupos de control (sin tratar) que reciben IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30. Cada punto representa un animal.
Figura 9. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el glioma murino GL261 en ratones C57B1/6 (inmunocompetentes). El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben control, IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30. Cada punto representa un animal.
Figura 10. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el glioma murino GL261 en ratones C57B1/6 (inmunocompetentes) en función del tiempo. El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben control, IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30.
Figura 11. Representación del efecto de dos anticuerpos monoclonales contra el glioma murino GL261 en ratones atímicos (inmunocomprometidos) en función del tiempo. El volumen tumoral se muestra para los grupos que reciben control, IgG no específica, mAb 2C2 y mAb H30.
Figura 12. Representación de la generación de IgG total en pacientes a los que se les administró una vacuna de survivina (SEQ ID NO: 4). Se muestran datos para 8 pacientes. Los estudios de ELISA con suero muestran un aumento progresivo en la reactividad de IgG en suero al péptido de survivina de tipo salvaje (aminoácidos 53-67 (SEQ ID NO: 27)).
Figura 13. Representación de la generación de IgG específica de survivina en pacientes a los que se les administró la vacuna de survivina (SEQ ID NO: 4). Se muestran datos para 8 pacientes. Los estudios de ELISA con suero muestran un aumento progresivo en la reactividad de IgG en suero al péptido de survivina modificado (aminoácidos 53-67/M57 - SEQ ID NO: 4).
Descripción detallada de la divulgación
La presente divulgación se basa en nuestras observaciones de que los antisueros de ratones vacunados con el péptido de survivina y los anticuerpos monoclonales murinos purificados contra la survivina inhiben significativamente el crecimiento tumoral en modelos animales. Esto es sorprendente porque la survivina es una proteína intracelular que se cree que no es secretada por las células ni expuesta en la superficie celular, excepto en el contexto de la presentación del MHC de clase I. Como tal, no se esperaría que la inmunoterapia con survivina mediada por anticuerpos (pasivos) sea efectiva. Sin embargo, hemos encontrado que lo es.
Esta divulgación proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de los mismos, moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican anticuerpos o fragmentos de los mismos, células que producen anticuerpos o fragmentos de los mismos, vectores o células que comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de los mismos, composiciones que comprenden cualquiera de los anteriores, métodos para preparar cualquiera de lo anterior, y usos de los anticuerpos y fragmentos de los mismos, o moléculas de ácido nucleico en el tratamiento de cánceres tales como los que implican tumores que expresan survivina.
Una descripción de los listados de secuencias con esta aplicación es la siguiente:
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos que representa un fragmento de 23 aminoácidos de la survivina humana.
SEQ ID NO: 2 es una variante de SEQ ID NO: 1 con un solo cambio de aminoácido
SEQ ID NO: 3 es un fragmento de seis aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 4 es un fragmento de quince aminoácidos de longitud de SEQ ID NO: 2 y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 es un fragmento de diez aminoácidos de longitud de SEQ ID NO: 2 y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 6 es un fragmento de nueve aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
C2E7.
2E7.
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3D2. (codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19).
SEQ ID NO: 24 es una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera de 2C2E7 (codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20).
SEQ ID NO: 25 es una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada de 30H3D2 (codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21).
SEQ ID NO: 26 es una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera de 30H3D2 (codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22).
SEQ ID NO: 27 es un fragmento de quince aminoácidos de longitud de survivina humana.
Si bien las vacunas proporcionan una forma de avanzar en la inmunoterapia contra el cáncer con anti-survivina, existen varias ventajas de usar una inmunoterapia pasiva con anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado: 1) no estaría restringido por HLA (a diferencia de las vacunas de péptidos), 2) podría tener una acción inmediata contra las células cancerosas en pacientes que están severamente inmunocomprometidos por sus tumores, 3) sería dosificable y 4) podría utilizarse junto con una vacuna u otros fármacos o terapias como, por ejemplo, la radioterapia, para aprovechar mecanismos de acción alternativos o complementarios. Una o más de las ventajas anteriores también son aplicables a los mAb en general, incluidos los anticuerpos quiméricos, humanos y humanizados.
El término "péptido de survivina" o "péptidos de survivina" como se usa en este documento significa fragmentos de survivina de longitud completa e incluye variantes de los péptidos que pueden generar anticuerpos que reaccionan con la survivina de tipo salvaje, tal como la survivina humana. El término "anticuerpos anti-survivina", como se usa en el presente documento, significa anticuerpos que se generan en respuesta a la survivina o uno o más péptidos de survivina (incluidos variantes de los mismos).
En un aspecto, esta divulgación proporciona composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluidos anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos, que son reactivos contra uno o más epítopos de survivina. Se proporcionan ejemplos de epítopos de survivina adecuados o variantes de los mismos en las patentes de Estados Unidos Nos. 7,943,138, y 8,580,269. Las composiciones de la presente divulgación comprenden anticuerpos generados en respuesta a la administración de un péptido que es idéntico a una secuencia de la survivina humana o es una variante de la misma (tal como al menos 95 % idéntica). Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse y aislarse de un individuo después de la administración de un péptido que es una variante de la siguiente porción de la secuencia de survivina ENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDD (SEQ
ID NO: 1). La variante puede ser ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD (SEQ ID NO: 2 - un cambio de C a M en la posición 9 de SEQ ID NO: 1). Los péptidos administrados pueden ser de 9 a 23 (incluidos todos los números enteros entre ellos) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, en los que el péptido comprende la secuencia central de QMFFCF (SEQ ID NO: 3). Los ejemplares de péptidos de survivina incluyen DLAQMFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 4), AQMFFCFKEL (SEQ ID NO: 5) y QMFFCFKEL (SEQ ID NO: 6). Los anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos se pueden usar sin modificaciones, o se pueden manipular por ingeniería genética, tal como, por ejemplo, para generar anticuerpos quiméricos o humanizados o varios fragmentos como se describe allí. En una realización, se generan anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos que son reactivos contra el péptido DLAQMFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 4).
El término "Anticuerpo" como se usa en este documento puede abarcar moléculas de anticuerpos completas, moléculas de inmunoglobulina de longitud completa, tales como moléculas de inmunoglobulina de longitud completa de origen natural o moléculas de inmunoglobulina de longitud completa formadas por procesos recombinantes de fragmentos de genes de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser fragmentos que comprenden al menos un sitio de unión anticuerpo-antígeno. Los fragmentos de anticuerpos pueden, por ejemplo, exhibir unión específica a la survivina o fragmentos de la misma que comprenden el motivo DLAQCFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 27). El término "anticuerpo" puede incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecífico (por ejemplo, biespecífico), recombinantes, humanos, quiméricos y humanizados. El término "anticuerpo" también puede abarcar proteínas de unión a antígeno expresadas de forma recombinante y péptidos sintéticos de unión a antígeno. Además, el término "anticuerpo" puede abarcar minicuerpos y diacuerpos, todos los cuales exhiben preferiblemente unión específica a la survivina de un fragmento de la misma, especialmente la survivina humana. El término "anticuerpo", como se usa en este documento, también puede abarcar inmunoglobulinas producidas in vivo, así como las producidas in vitro, como, por ejemplo, por un hibridoma. Un anticuerpo de la presente divulgación puede modificarse mediante, por ejemplo, acetilación, formilación, amidación, fosforilación o polietilenglicolación (PEGilación), así como glicosilación. El término "un anticuerpo" como se usa en este documento pretende cubrir todos los anticuerpos descritos en esta divulgación. Por ejemplo, el término "un anticuerpo" puede referirse a anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanos o humanizados, o fragmentos de unión a antígenos (es decir, survivina) de los mismos.
La administración de péptidos de survivina puede usarse para la generación de anticuerpos policlonales. Por ejemplo, a los animales adecuados se les puede administrar uno o más péptido de survivina y se puede recolectar suero. Además, las células humanas que expresan anticuerpos anti-survivina pueden aislarse de animales inmunizados o pacientes vacunados con survivina o péptidos de survivina, por ejemplo, de individuos que pueden estar participando en ensayos clínicos. Las células B de memoria IgG de muestras de pacientes pueden expandirse e inducirse para que se diferencien en células secretoras de IgG, que pueden seleccionarse para la unión de un cribado de alta afinidad (péptido de survivina). Las células también pueden usarse para la generación de hibridomas. Se pueden clonar regiones variables de genes de anticuerpos a partir de células aisladas mediante RT-PCR utilizando el método PIPE (Dodev TS y otros (2014) Scientific Reports 4.5885, doi: 10.1038/srep058853). Los mAb humanos recombinantes, humanizados o quiméricos pueden construirse a partir de estas moléculas y pueden expresarse y cribarse en función de los ensayos de menor afinidad de unión y para la actividad antitumoral. En este sentido, hemos podido detectar anticuerpos específicos mediante ELISA en varios pacientes en un estudio clínico. Las muestras se pueden congelar para el uso posterior para el aislamiento de células B de memoria.
Los anticuerpos de la divulgación pueden ser moléculas de inmunoglobulina completas tales como anticuerpos policlonales o monoclonales o pueden ser fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluidos, entre otros, Fab, F (ab'), F (ab') 2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de CDR, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos fagos monocatenarios, diacuerpos, nanocuerpos y similares. Los fragmentos de los anticuerpos se pueden producir sintéticamente o mediante fragmentación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o se pueden manipular genéticamente mediante técnicas de ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica.
En una realización, esta divulgación proporciona anticuerpos aislados. Por el término "aislado" se entiende que el anticuerpo o el fragmento del mismo se separan y/o recuperan de su entorno natural. El aislamiento del anticuerpo de su entorno natural puede ser tal que el anticuerpo pueda usarse sin interferencia de otros agentes activos (como otras proteínas) que normalmente están presentes en su entorno natural.
En un ejemplo, esta divulgación proporciona la generación y aislamiento de anticuerpos de dominio único o nanocuerpos producidos por camélidos en respuesta a la introducción de survivina o péptidos de survivina en los camélidos. Los nanocuerpos son típicamente anticuerpos de cadena pesada y, por tanto, contienen homodímeros de cadena pesada y no contienen cadenas ligeras de anticuerpos. Estos anticuerpos comprenden típicamente un único dominio variable y dos dominios constantes (CH2 y CH3).
Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden obtener de un animal humano o no humano. En muchos mamíferos, las inmunoglobulinas intactas tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada una de las cadenas ligeras está unida covalentemente a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro. Las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro adicionales. La cadena ligera tiene típicamente un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada también puede tener un dominio variable (VH). Los dominios variables contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR). La cadena pesada puede tener además tres o cuatro dominios constantes (CHI, CH2, CH3 y CH4). La variabilidad de los resultados de los dominios constantes es de varios isotipos como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
Las CDR son las principales responsables de unirse a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente comenzando desde el extremo N-terminal, y típicamente se identifican por la cadena en la que se encuentra la CDR particular. Así, una VH CDR3 (o VH-CDR3) se ubica en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una Vl CDR1 (o VL-CDR1) es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Un anticuerpo que se une a los péptidos de survivina o survivina, por ejemplo, tendrá una región VH específica y la secuencia de la región VL y, por lo tanto, secuencias CDR específicas. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR.
Los términos VH o VH como se usan en este documento se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluida una cadena pesada de un Fv, scFv, dsFv o Fab, y los términos VL o VL se refieren a la región variable de una inmunoglobulina de cadena ligera, que incluye una cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de cadena ligera y/o pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, haciendo células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones (u otros animales adecuados) con uno o más péptidos de survivina y luego se pueden recolectar muestras de líquido ascítico. Las muestras se pueden cribar y seleccionar para desarrollar un panel de anticuerpos monoclonales y las líneas celulares de hibridoma correspondiente. Los anticuerpos monoclonales murinos (u otros) pueden aislarse o generarse y luego humanizarse, si se desea.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo de cualquier clase. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser IgG2b. El término "isotipo", como se usa en este documento, puede referirse en particular a la clase de anticuerpos (tal como, por ejemplo, IgG) que está codificada por genes de región constante de cadena pesada. Las secuencias de regiones constantes de inmunoglobulina humana se conocen en la técnica y están disponibles en bases de datos públicas tales como el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de estructura de una especie, como humano, y CDR (que generalmente confieren unión a antígeno) de otra especie, como un anticuerpo murino que se une específicamente a survivina. En un anticuerpo quimérico, algunas porciones de las cadenas pesadas y / o ligeras pueden ser idénticas u homólogas a secuencias de una especie particular, mientras que otras porciones pueden ser idénticas u homólogas a secuencias de una especie diferente. Los anticuerpos quiméricos generalmente exhiben inmunogenicidad disminuida y estabilidad aumentada. Técnicas para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina conocidas en la técnica, como, por ejemplo, ver Orlandi y otros, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989), y Leung y otros, Hybridoma 13: 469 (1994). Como ejemplo de un anticuerpo quimérico, los polinucleótidos que codifican los dominios variables de la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo derivado de un animal (por ejemplo, ratón, rata o pollo) que no sea humano pueden unirse a polinucleótidos que codifican los dominios constantes de la cadena ligera o la cadena pesada derivada de un anticuerpo humano para producir un polinucleótidos (tal como ADN) que codifica un anticuerpo quimérico. Los ejemplos de anticuerpos quiméricos incluyen los que comprenden las s Eq ID NO: 19 y 20, y los que comprenden las SEQ ID NO: 20 y 21.
Un anticuerpo "humano" (también llamado anticuerpo "completamente humano") es un anticuerpo que incluye regiones estructurales humanas y todas las CDR de una inmunoglobulina humana única o diferente. Por tanto, las estructuras de un anticuerpo humano se pueden diseñar para incluir CDR de un anticuerpo humano diferente. Los métodos para producir anticuerpos humanos son conocidos en la técnica, como, por ejemplo, ver Mancini y otros, 2004, New Microbiol. 27: 315-28; Conrad y Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8: 117-26.
Un "anticuerpo humanizado" es típicamente un anticuerpo humano que tiene uno o más residuos de aminoácidos importados en él (es decir, introducidos en él) de una fuente que no es humana. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie como roedor, conejo, perro, cabra o caballo se importan en dominios variables pesados y ligeros humanos. Los dominios constantes (también denominados regiones marco) de la molécula de anticuerpo son generalmente los mismos que los de un anticuerpo humano. La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se puede denominar "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se puede denominar "aceptor". Por ejemplo, todas las CDR pueden ser de la inmunoglobulina del donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que las regiones constantes estén siempre presentes, pero si lo están, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos tomados del marco donante. Los anticuerpos monoclonales humanizados o de otro tipo pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas adicionales que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la unión de antígenos u otras funciones de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas humanizadas se pueden construir mediante ingeniería genética (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 5,585,089, y la publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0196266). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales murinos pueden aislarse o generarse y luego humanizarse. Los ejemplos de anticuerpos humanizados incluyen aquellos que comprenden CDR que tienen secuencias de SEQ Id NO: 7 a 12, y aquellos que comprenden CDR que tienen secuencias de SEQ ID NO: 13 a 18.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden producir mediante digestión enzimática. Por ejemplo, la digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab" y un fragmento "Fc". El fragmento Fab contiene una cadena L completa y el dominio de región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada. Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión al antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento grande F (ab' ) 2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tienen actividad de unión al antígeno divalente y es capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo y Fv monocatenario también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en un solo polipéptido cadena. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv con conectores cortos entre los dominios VH y VL de manera que se logre el emparejamiento entre cadenas pero no intracatenario de los dominios V, lo que da como resultado un fragmento bivalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de unión al antígeno. Un anticuerpo de dominio único (sdAb) es un fragmento de anticuerpo que tiene un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Los ScAb se pueden fabricar a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en los camélidos. Un fragmento de anticuerpo puede ser una única región variable o un péptido que consiste en o comprende una única CDR. Un anticuerpo monocatenario tiene un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera unidos linealmente entre sí mediante un enlazador. Se puede producir un polinucleótido (como ADN) que codifica el anticuerpo monocatenario uniendo un polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena pesada, un polinucleótido que codifica el enlazador (típicamente 10-20 nucleótidos) y un polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena ligera, siendo ambos el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera derivados de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos (diacuerpos) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes de un antígeno, como dos epítopos diferentes de survivina. Por ejemplo, un polinucleótido (como ADN) que codifica un anticuerpo biespecífico se puede producir, por ejemplo, uniendo en orden un polinucleótido que codifica una región variable A de cadena pesada, un polinucleótido que codifica una región variable B de cadena ligera, un polinucleótido que codifica una región variable pesada dominio variable de cadena B, y un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena ligera A. Preferiblemente, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera derivan ambos de un anticuerpo humano.
La presente divulgación proporciona células T transducidas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Las moléculas CAR de la presente divulgación combinan la especificidad basada en anticuerpos para la survivina con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmunitaria celular anti-survivina específica y, por lo tanto, antitumoral. Una molécula de CAR puede comprender una o más CDR de las regiones variables pesadas o ligeras. Esta divulgación proporciona además células T genéticamente modificadas para expresar de forma estable el CAR. Las células T que expresan un CAR se denominan en el presente documento células T con CAR o células T modificadas con CAR. Por ejemplo, las células T pueden modificarse genéticamente para expresar de manera estable el CAR que combina un dominio de reconocimiento de survivina de un anticuerpo específico, como un anticuerpo monoclonal descrito en este documento, con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta en una única proteína quimérica.
Como ejemplo, esta divulgación proporciona anticuerpos monoclonales, que pueden ser anticuerpos monoclonales aislados, que se unen específicamente a la survivina, que puede ser la survivina humana. Como ejemplo, se proporcionan un mAb designado 2C2 y un mAb designado H30 (o 30H3). Un subclon de mAb 2C2 utilizado para la secuenciación final del anticuerpo y la purificación de IgG se denominó 2C2E7, y un subclon de mAb H30 utilizado para la secuenciación final del anticuerpo y la purificación de IgG se denominó 30H3D2. Un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera. La región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1, una VH CDR 2 y una VH CDR3, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3. Como se reivindica en este documento, el VH CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos TYGMS (SEQ ID NO: 7), el VH CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos WINPYSGVPTYAVDFKG (SEQ ID NO: 8) y el VH CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos GGRRGDFGY (SEQ ID NO: 9); y el VL CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos SASSSISYMH (SEQ ID NO: 10), el VL CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO: 11) y el VL CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos HQRSSHHT (SEQ ID NO: 12). Como también se reivindica en este documento, el VH CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 13), el VH CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos TISSGGSHTYYPDSVRG (SEQ ID NO: 14), y el Vh CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos HPIYYYISSYAMDY (SEQ ID NO: 15); y el VL CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSTGNTYLH (SEQ ID NO: 16), el VL CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 17) y el VL CDr3 tiene una secuencia de aminoácidos SQSTHVPPT (SEQ ID NO: 18).
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo en el que la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20. En la secuencia de SEQ ID NO: 19, los aminoácidos 1 a 19 representan una secuencia líder, los aminoácidos 20 a 49 representan la región marco (FR) 1, los aminoácidos 50 a 54 representan CDR1, los aminoácidos 55 a 68 representan FR2, amino los ácidos 69 a 85 representan CDR2, los aminoácidos 86 a 117 representan FR3, los aminoácidos 118 a 126 representan CDR3 y los aminoácidos 127 a 137 representan FR4. En la secuencia de SEQ ID NO: 20, los aminoácidos 1 a 22 representan una secuencia líder, los aminoácidos 23 a 45 representan FR1, los aminoácidos 46 a 55 representan CDR1, los aminoácidos 56 a 70 representan FR2, los aminoácidos 71 a 77 representan CDR2, los aminoácidos 78 a 109 representan FR3, los aminoácidos 110 a 117 representan CDR3 y los aminoácidos 118 a 127 representan FR4.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de sEq ID NO: 22. En la secuencia de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 1 a 19 representan una secuencia líder, los aminoácidos 20 a 49 representan FR1, los aminoácidos 50 a 54 representan CDR1, los aminoácidos 55 a 68 representan FR2, los aminoácidos 69 a 85 representan CDR2, los aminoácidos 86 a 117 representan FR3, los aminoácidos 118 a 131 representan CDR3 y los aminoácidos 132 a 142 representan FR4. En la secuencia de SEQ ID NO: 22, los aminoácidos 1 a 19 representan una secuencia líder, los aminoácidos 20 a 42 representan FR1, los aminoácidos 43 a 58 representan CDR1, los aminoácidos 59 a 73 representan FR2, los aminoácidos 74 a 80 representan CDR2, los aminoácidos 81 a 112 representan FR3, los aminoácidos 113 a 121 representan CDR3 y los aminoácidos 122 a 131 representan FR4.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 19 y que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 7, una CDR2 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera que, como secuencia, es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 20 y que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 12.
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 21 y que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 13, una CDR2 que tiene una secuencia de sEq ID NO: 14 y una CDR3 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 15, y una región variable de cadena ligera que, como secuencia, es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 20 y que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 16, una CDR2 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 17 y una CDR3 que tiene una secuencia de
Un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo quimérico, humano o humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 10, 11 y 12 respectivamente, o que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13, 14 y 15 respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 16, 17 y 18 respectivamente.
La presente divulgación también proporciona las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena pesada para anticuerpos específicos de survivina. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID nO: 23 o 25. La molécula de nucleótidos de la presente divulgación puede codificar las regiones variables de cadena ligera para anticuerpos específicos de survivina. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 24 o 26.
La divulgación proporciona células que comprenden un vector de expresión u otra secuencia polinucleotídica que codifica los anticuerpos proporcionados en el presente documento (incluidos los mAb) o fragmentos de unión a survivina de los mismos. Las secuencias de nucleótidos que codifican los mAb o los fragmentos de unión a survivina de los mismos pueden expresarse mediante el uso de cualquier vector de expresión adecuado, muchos de los cuales se conocen en la técnica y/o están disponibles comercialmente. Un vector generalmente incluye secuencias de ácido nucleico, como el origen o la replicación, que le permite replicarse en una célula huésped. Un vector también puede incluir genes marcadores seleccionables. Las cadenas pesada y ligera pueden expresarse en un único vector de expresión, como un plásmido o las cadenas pesada y ligera pueden expresarse en plásmidos distintos en la misma célula, tras lo cual las cadenas pesadas y ligeras expresadas pueden formar la arquitectura de mAb convencional. Los mAb o fragmentos de unión a survivina de los mismos pueden aislarse y/o purificarse mediante técnicas convencionales, dado el beneficio de la presente divulgación.
Los anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos pueden marcarse, por ejemplo, con etiquetas enzimáticas, fluorescentes o radiactivas o pueden conjugarse con moléculas efectoras como, por ejemplo, toxinas. La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de los mismos y un portador farmacéuticamente adecuado. Los portadores adecuados incluyen excipientes o estabilizadores que no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol; aminoácidos como la glicina, la glutamina; la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; tonificantes como la trehalosa y el cloruro sódico; azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; tensioactivos como el polisorbato; contraiones formadores de sal como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos como el Tween o el polietilenglicol (PEG). Las composiciones farmacéuticas pueden comprender otros agentes terapéuticos.
Las composiciones de la presente divulgación pueden comprender un tipo de anticuerpo monoclonal o más de un tipo de anticuerpo monoclonal. Una composición de la divulgación puede tener uno o más de un anticuerpo o fragmento o variante del mismo. Una composición puede tener un anticuerpo monoclonal y policlonal. Una composición puede comprender uno o más subtipos de anticuerpos. Por ejemplo, una composición puede comprender una mezcla de IgG o IgM o una mezcla de uno o más de IgG1, IgG2 e IgG2b. Una composición de la presente divulgación puede comprender un anticuerpo como único ingrediente activo, en donde el anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimérico, humano, humanizado o combinaciones de los mismos. Por "ingrediente activo" se entiende que el ingrediente tiene un efecto antitumoral al inhibir el crecimiento del tumor.
Una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender uno o más anticuerpos en un rango de concentración de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, 1 mg/ml a 10 mg/ml, 1 mg/ml a 50 mg/ml, 1 mg/ml a 100 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml o 50 mg/ml a 100 mg/ml de cada uno de los anticuerpos o anticuerpos totales. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender al menos o aproximadamente 0,1 mg/ml, al menos o aproximadamente 1 mg/ml, al menos o aproximadamente 5 mg/ml, al menos o aproximadamente 10 mg/ml, al menos o aproximadamente 50 mg/ml, al menos o aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo.
Las composiciones de la presente divulgación pueden ser administradas mediante métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por vías de inhalación, o por vía intracerebral o intraespinal mejorada por convección o inyección intratumoral directa. Los anticuerpos se pueden administrar por vía parenteral directamente en el sitio diana (tal como en o dentro de un tumor). Las composiciones pueden introducirse como una sola administración o como múltiples administraciones y pueden introducirse de manera continua durante un período de tiempo. En un ejemplo, la composición se puede administrar diariamente durante un período de al menos 2 días como, por ejemplo, durante un período de 2 a 30 días (y todos los períodos intermedios). En un ejemplo, se administra diariamente durante 7-10 días. Alternativamente, puede administrarse a intervalos deseados (como cada 2, 3, 4, 5 días y similares).
Los expertos en la técnica reconocerán que la forma y el carácter del régimen de dosificación particular empleado en las composiciones para el uso en la invención vendrán dictadas por la vía de administración y otras variables bien conocidas, tales como el tamaño del individuo y la etapa de la enfermedad. Además, las composiciones se pueden proporcionar en forma de formas de dosificación unitarias para su administración a un individuo que necesite tratamiento. Los anticuerpos se pueden proporcionar en forma liofilizada para ser reconstituidos antes de la administración. El medio de reconstitución puede ser una solución salina estéril al 0,9 % o un tampón fisiológico adecuado o agua, o cualquier otra solución conocida en la técnica para reconstituir proteínas antes de la administración.
La divulgación también proporciona kits que pueden usarse para la administración a individuos que necesitan tratamiento. Un kit, por ejemplo, puede comprender uno o más anticuerpos, que pueden estar en forma liofilizada, opcionalmente un medio de reconstitución e instrucciones para la administración. Un kit puede comprender una dosis única o múltiples dosis.
La divulgación proporciona composiciones para el uso en un método para tratar tumores que comprenden células que expresan survivina. Dichos tumores pueden denominarse en el presente documento "tumores que expresan survivina". El término "tratamiento" se refiere a la reducción de uno o más síntomas o características asociadas con la presencia de la afección particular que se está tratando. El tratamiento no significa necesariamente una remisión completa, ni excluye la recurrencia o las recaídas. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona una composición para el uso en un método para reducir el tamaño de un tumor o detener el crecimiento de un tumor o reducir la tasa de crecimiento de un tumor (como un tumor que comprende células que expresan survivina) o reducir cualquier otro síntoma que esté asociado con un individuo que padece el tumor, todos los cuales se consideran como "tratamiento", que comprende administrar a un individuo que necesita tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende anticuerpos, o fragmentos de los mismos como se describe aquí. En un ejemplo, las composiciones se utilizan en un método de inmunización pasiva.
Los ejemplos de tumores que se pueden tratar con las presentes composiciones incluyen, pero no se limitan a, glioma, glioblastoma, meduloblastoma, mieloma múltiple, melanoma, meningioma, adenocarcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, leucemia, linfoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de riñón, sarcoma y similares.
El uso de la invención se puede realizar junto con el uso de péptidos de survivina como vacuna. Las composiciones de la invención se pueden administrar antes, al mismo tiempo o después de otras terapias.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo aislado que es reactivo contra uno o más epítopos de survivina donde el anticuerpo aislado o su fragmento de unión a antígeno se unen a uno o más epítopos de survivina. El anticuerpo puede ser generado en respuesta a la administración de un péptido que tiene la secuencia ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD (SEQ ID NO: 2), o un fragmento del mismo (como s Eq ID NO: 4), donde el fragmento tiene de 9 a 23 (incluidos todos los números enteros entre ellos) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y en el que el péptido comprende la secuencia central de QMFFCF (SEQ ID NO: 3). La composición puede ser tal que el único anticuerpo o anticuerpos presentes sea/son el anticuerpo/anticuerpos aislados generados en respuesta a la administración de péptidos de survivina. La composición puede tener otras proteínas, como proteínas transportadoras. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, humano o humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un anticuerpo monocatenario o multiespecífico.
La reactividad de los anticuerpos frente a antígenos específicos puede medirse mediante métodos rutinarios como, por ejemplo, ELISA. La reactividad es una indicación de la afinidad de unión. La afinidad de unión también se puede medir mediante tasas de disociación de antígeno/anticuerpo o radioinmunoensayos de competición y similares. La unión específica de un anticuerpo a un antígeno significa que se une al antígeno con alta afinidad y no se une específicamente a antígenos no relacionados.
Se divulga un método de inmunización pasiva que comprende administrar a un individuo que necesita tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición que comprende uno o más anticuerpos generados en respuesta a la administración de un péptido que tiene la secuencia ENEPDLAQMFFCFKELEGWEPDD (SEQ ID NO: 2), o un fragmento del mismo (como SEQ ID NO: 4), donde el fragmento tiene de 9 a 23 (incluidos todos los números enteros entre ellos) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y donde el péptido comprende la secuencia central de QMFFCF (SEQ ID NO: 3), y que anticuerpos se han aislado del sujeto (humano o no humano) en el que se generaron o se obtuvieron a partir de un sobrenadante de hibridoma, o pueden ser anticuerpos manipulados usando secuencias de los anticuerpos aislados.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, y no pretenden ser limitantes.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe estudios en animales que demuestran un efecto de los anticuerpos anti-survivina sobre el crecimiento tumoral.
A los ratones se les administra DLAQMFFCFKELEGW- hemocianina de lapa californiana (KLH) (SurVaxM) (SVN53-67/M57-KLH) (SEQ ID NO: 4) como inmunización. A los ratones se les inyectó por vía subcutánea 100 pg de péptido. Los ratones se inmunizaron repetidamente una vez cada 7 días durante un período de 28 días. Se sacrificaron dos semanas después de ratones última inmunización se recogieron a través de asfixia con CO2 y la sangre a través de punción cardiaca. Se dejó coagular la sangre y se centrifugó a 10.000 x g para producir suero clarificado. Se utilizó antisuero de survivina para inmunizar pasivamente ratones en modelos de implantación de tumores.
Se utilizaron modelos de tumores subcutáneos intracraneales para mostrar la eficacia del anticuerpo anti-survivina contra el crecimiento tumoral. Los estudios intracraneales utilizaron ratones C57BL/6 anestesiados implantados con 1x105 células de glioma GL261 a través de una aguja de calibre 26 que se avanzó a través de un orificio de trépano intracraneal colocado a 1 mm anterior, 2 mm lateral y 3 mm de profundidad a la sutura del cráneo bregma como punto de referencia anatómico. Después de 3 días, los ratones se aleatorizaron en grupos y se inyectaron con 10 pg de anticuerpo anti-survivina o 10 pg de IgG normal como control. Los anticuerpos se administraron cada 5 días hasta un total de 4 dosis en un período de 20 días. Se siguió a los ratones en busca de signos de déficits neurológicos como indicador del crecimiento tumoral y se sacrificaron de acuerdo con los criterios establecidos. Los datos se representan como supervivencia y se muestran en el gráfico de Kaplan-Meier, p<0,0001.
Modelos de tumores subcutáneos se establecieron a través de la implantación de 1x106 GL261 células de glioma de flanco por vía subcutánea a través de una aguja intradérmica de calibre 23. Se dejó que los tumores crecieran durante 7 días hasta que alcanzaron aproximadamente 2 mm de diámetro. A continuación, se administró a los ratones el día 7100 pg de vacuna de survivina SurVaxM (SVN53-67/M57-KLH); o 50 pl de anticuerpo anti-survivina en forma de suero de ratón de ratones a los que se les había administrado previamente SurVaxM o 10 pg de mAb (anticuerpo) derivado de ratones agrupados sin tumor que recibieron la vacuna SurVaxM survivina, o un anticuerpo monoclonal reactivo contra survivina. El tratamiento se volvió a administrar cada 7 días durante 4 dosis durante un período de 28 días. Los tumores se midieron diariamente y los volúmenes se calcularon usando la fórmula "V = XY2/2". Se siguió a los ratones durante 60 días. Los datos se muestran como volúmenes tumorales combinados (Figura 1) y progresión tumoral individual (Figura 2), p<0,0001. La vacuna SurVaxM se refiere a una vacuna en la que el péptido tiene la secuencia DLAQMFFCFKElEgW (SEQ ID NO: 4).
Los resultados de estos estudios fueron los siguientes. Como se muestra en la Figura 1, en ratones modelo C57BL/6 de glioma intracraneal con gliomas GL261, a los que se les administró anticuerpo anti-survivina una vez cada 7 días después de la implantación del tumor, los ratones que recibieron anticuerpo anti-survivina sobrevivieron significativamente más que los controles. La IgG utilizada es la IgG no específica de ratón normal. La Figura 2 muestra el modelo de tumor subcutáneo en ratones C57BL / 6 con glioma GL261. A los ratones se les administraron los tratamientos indicados una vez cada 7 días después de la implantación del tumor. De manera similar a los estudios intracraneales, los ratones que recibieron mAb purificado o antisuero tenían tumores que eran significativamente más pequeños que los controles y rivalizaban con el efecto antitumoral observado por la propia vacuna activa. La Figura 3 muestra un modelo de tumor subcutáneo en ratones C57BL/6 con glioma GL261. A los ratones se les administraron los tratamientos indicados una vez cada 7 días después de la implantación del tumor. SurVaxM es la vacuna de survivina; los sueros anti-survivina (anticuerpo) se obtuvieron de ratones agrupados sin tumor que recibieron la vacuna SurVaxM activa. Los datos muestran el crecimiento de tumores individuales durante 50 días. (n = 4 por grupo)
Estos datos demuestran que la administración de anticuerpos de survivina es eficaz para reducir el volumen tumoral y prolongar la supervivencia.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la generación de anticuerpos monoclonales y la eficacia de los anticuerpos para inhibir el crecimiento tumoral.
Métodos:
Líneas celulares y condiciones de cultivo: las células de glioma murino GL261 y las líneas celulares de melanoma murino B16f1 se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 100 mm en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) que contiene suero de ternero fetal al 10 %, 5.000 unidades de penicilina/estreptomicina, 50 pM 2-mercaptoetanol, HEPES 25 mM y 1 x aminoácidos no esenciales a 37 °C en CO2 al 5 % con cambios de medio dos o tres veces por semana.
Péptidos: La síntesis de péptidos se realizó usando química Fmoc y una resina de soporte sólido (Genscript, Piscataway, NJ). Cada péptido se almacenó a -20 °C hasta su uso y se diluyó en DMSO. Secuencia de antígeno 1: DLAQMFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 4); Secuencia de antígeno 2: DLAQCFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 27); Inmunógeno: Péptido (lote: 614429-1)-conjugado KLH.
Inmunización de ratones para la producción de anticuerpos: Se utilizaron diez ratones por ronda de producción de anticuerpos. Se utilizaron 5 ratones Balb/c y 5 ratones C57B1/6 para producir antisuero reactivo contra el antígeno 1 (SVN53-67/M57). Los ratones se inmunizaron con conjugado inmunógeno: péptido-KLH (SVN53-67/M57-KLH). Se obtuvieron muestras de suero después de 4 rondas de inmunización. Tras la confirmación del antisuero reactivo con survivina mediante análisis ELISA indirecto, se seleccionaron ratones con pruebas positivas para la producción de hibridoma. Se produjeron varias líneas celulares de hibridoma con células de cada ratón reactivo fusionadas con células de mieloma SP2/0. De estas líneas celulares, se aislaron y caracterizaron adicionalmente 2 subclones. ELISA indirecto para reactividad de anticuerpos: placas de ELISA de 96 pocillos se recubrieron con 1 pg/ml, 100 pl/pocillo de cualquiera de los antígenos de recubrimiento: A: (SVN53-67/M57) DLAQMFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 4) o B: (tipo salvaje SVN53-67) DLAQCFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 27) en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Se aplicó 100 ul/pocillo de sobrenadante de cultivo de células de hibridoma o antisuero murino a placas recubiertas y se incubó. Anticuerpo secundario: Se añadió entonces IgG anti-ratón de cabra anti-ratón de peroxidasa AffiniPure, Fcy seguido de detección estándar.
Secuenciación de hibridoma: Se aisló el ARN total de las células de hibridoma siguiendo el manual técnico del reactivo TRIzol® (Ambion, Cat. No. :15596-026). El ARN total se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. El ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando cebadores antisentido específicos de isotipo o cebadores universales siguiendo el manual técnico del kit de síntesis de ADNc de primera hebra PrimeScriptTM (Takara, Cat. No. : 6110A). Los fragmentos de anticuerpos de VH y VL se amplificaron de acuerdo con el procedimiento operativo estándar de RACE de GenScript. Los fragmentos de anticuerpos amplificados se clonaron por separado en un vector de clonación estándar usando procedimientos de clonación molecular estándar. Se realizó un cribado por PCR de colonias para identificar clones con insertos de tamaños correctos. Se secuenciaron no menos de cinco colonias individuales con insertos de tamaños correctos para cada fragmento de anticuerpo. Se enviaron para secuenciación cinco colonias individuales con tamaños de inserto VH y VL correctos. Los genes VH y VL de cinco clones diferentes se encontraron casi idénticos. Se cree que la secuencia consenso es la secuencia del anticuerpo producido.
Mediciones de anticuerpos en suero del paciente: El suero del paciente se recogió y se almacenó a -80 °C. Se aplicaron diluciones en serie de suero clarificado al péptido de survivina no conjugado, KLH libre y péptido aleatorio (20 pg/ml, 1 pg/pocillo) en placas de ELISA pre-revestidas (fondo plano, Nunc) por triplicado. Las muestras se incubaron a 4 °C durante la noche y se lavaron (PBS, BSA al 1 %). Se añadió anticuerpo de detección anti-IgG humana conjugado con HRP (Bio-Rad) durante 1 hora a 25 °C. Las placas se lavaron 4 veces y se añadió solución colorimétrica TMB (Biolegend) a temperatura ambiente y se desarrolló durante 15 minutos y se leyó en un lector de placas automático Bio-Rad a 450 nm.
Inmunización de ratones para estudios de crecimiento tumoral: Se realizaron estudios de prueba de principio en ratones con 100pl de sobrenadante de hibridoma anti-SVN53-67/M57 o 10pg de anticuerpo monoclonal purificado. En primer lugar, se implantaron a los ratones células de glioma murino GL261 o células de melanoma murino B16f1 por vía intracraneal o subcutánea. Cuatro días después de la implantación del tumor, los ratones recibieron inyecciones intraperitonial de anticuerpo repetidas una vez a la semana durante un máximo de 5 semanas y se les siguió el crecimiento del tumor.
Inyección intracerebral de células tumorales GL261 y análisis de supervivencia: Se anestesiaron ratones macho C57BL/6 (Charles River, Horsham, PA) con isofluorano gaseoso y se fijaron en un marco de cabeza estereotáctico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Se hizo una incisión en la línea media del cuero cabelludo y se identificó el bregma. Se midieron las coordenadas estereotácticas (2,0 mm lateral y 1,2 mm anterior al bregma) para la implantación de células en la sustancia blanca frontal profunda. Un orificio de trepanación fue perforado en este punto y se inyectaron 1x105 GL261 células suspendidas en 2,5 pl de DMEM a través de una jeringa Hamilton con una, aguja de calibre 25 fijada a una profundidad de 3,0 mm con respecto a la duramadre. Las inyecciones se realizaron a 1 pl/min. Se retiró la aguja y se suturó la incisión. Se trazaron gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier y se determinaron los tiempos de supervivencia medios para todos los grupos n=8 ratones por grupo.
Estudios de crecimiento tumoral subcutáneo: Una suspensión de 2x107 G1261 células o 1x106 B 16F1 células en 100pL de PBS se inyectó ratones macho en el flanco derecho afeitado piel subcutánea de C57B1/6 (inmunocompetentes) (Charles River, Horsham, PA) así como ratones atímicos (inmunocomprometidos) NCr -nu/nu (Charles River, Horsham, PA). El crecimiento del tumor se midió diariamente con calibradores y los volúmenes se calcularon de acuerdo con la fórmula V = (a- (b2))/2, donde V es el volumen y a y b son los diámetros perpendiculares del tumor. Los datos se presentan como crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, así como volúmenes tumorales medios comparativos n = 4, 5 o 10 ratones por grupo en varios estudios presentados como se indica.
Resultados:
Se usó un péptido de survivina modificado de SEQ ID NO: 4 para generar hibridomas. A diez ratones se les administró una vacuna peptídica de 15pg/ml que comprendía el péptido de SEQ ID NO: 4. De estos 9 ratones desarrollaron títulos de anti-survivina. Se generaron varias líneas de hibridomas que produjeron anticuerpos que eran reactivos contra el péptido de la SEQ ID NO: 4 y un péptido de survivina DLa Qc FFCFKELEGW (SEQ ID NO: 27) en el que la secuencia es idéntica a una porción de survivina humana. De los hibridomas, se seleccionaron dos en particular para una caracterización adicional. Estos se denominan 2C2 y 30H3. De estos hibridomas, se caracterizó adicionalmente un clon de cada uno. Estos se denominan 2C2E7 y 30H3D2 respectivamente. Se encontró que 2C2E7 tenía el isotipo IgG2b y 30H3D2 tenía el isotipo IgG1. Por lo tanto, se secuenciaron unas pocas colonias individuales con tamaños de inserto de región variable de cadena ligera y pesada correctos. Se encontró que las secuencias eran casi idénticas y se generaron secuencias consenso. La secuencia de aminoácidos consensuada para las regiones variables de cadena pesada y ligera del mAb 2C2E7 se proporciona en las SEQ ID NO: 19 y 20 respectivamente. La secuencia de aminoácidos de consenso para las regiones variables de cadena pesada y ligera del mAb 30H3D2 se proporciona en las SEQ ID NO: 21 y 22 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos correspondientes para las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19, 20, 21 y 22 se proporcionan en las SEQ ID NO: 23, 24, 25 y 26 respectivamente.
La secuencia de aminoácidos consenso para la región variable de cadena pesada del anticuerpo 2C2E7 se muestra a continuación:
MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSW
VKQAPGRGLKWMGWINPYSGVPTYAVDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTA
TYFCARGGRRGDFGYWGQGTTLTVSS (SEO. ID NO: 19)
La secuencia de aminoácidos consenso para la región variable de cadena ligera del anticuerpo 2C2E7 se muestra a continuación:
MDFQVQIFSFLLISASVILSSGQIGLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQ
KPGTSPKTWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSHHT
FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)
La secuencia de aminoácidos consenso para la región variable de cadena pesada del anticuerpo 30H3D2 se muestra a continuación:
MNFGLSLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVR
LTPDKRLEWVATISSGGSHTYYPDSVRGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYY
CARHPIYYYISSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEO. ID NO: 21)
La secuencia de aminoácidos consenso para la región variable de cadena ligera del anticuerpo 30H3D2 se muestra a continuación:
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSTGNTYLH
WYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFGGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQST
HVPPTFGGGTKLEIK(S(SEQIDNO:22)
A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 19 del mAb 2C2E7:
ATGGGTTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAG
CACAGATCCAGTTGGTACAATCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAG
TCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACCTATGGAATGAGCTG
GGTGAAACAGGCTCCAGGAAGGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACCCCTA
CTCTGGAGTGCCAACATATGCTGTTGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGG
AAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACA
CGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGAGGGCGGAGGGGGGACTTTGGCTACTGGG
GCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 23)
A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 20 del mAb 2C2E7:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACT
GTCCAGCGGACAAATTGGTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCA
GGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTACATGCAT
TGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAAAACATGGATTTATGACACATCC
AAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTT
ATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCA
TCAGCGGAGTAGTCACCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
(SEQ ID NO: 24)
A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 21 del mAb 30h3d2:
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTG
TGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCT
GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGG
GTTCGCCTGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGCAGTGGT
GGTAGTCACACCTACTATCCAGACAGTGTGAGGGGGCGATTCACCATCTCCAGA
GACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGAC
ACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACACCCAATTTATTACTACATTAGTAGCTATG
CTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 25)
A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 22 del mAb 30H3D2:
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAG
TGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAA
GCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTACTGGAAACACCT
ATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAA
AGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGGATCAGGG
ACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTAT
TTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG
AAATCAAA (SEQ ID NO: 26)
Se ensayó la unión de los anticuerpos contra el péptido usado para inmunizar a los animales (SEQ ID NO: 4) y contra una secuencia de survivina humana (SEQ ID NO: 27). La concentración de anticuerpo de 15 ng/ml de 2C2E7 fue suficiente para unir el péptido de survivina modificado de SEQ ID NO: 4 con una DO de 1,019 y el péptido de survivina de tipo salvaje de SEQ ID NO: 27 con una DO de 0,891. El título de 2C2E7 en su dilución más alta con una relación de señal a blanco de >2:1 es 1:512 000 consistente con el esperado para un anticuerpo de alta afinidad. Además, la concentración de anticuerpo de 31 ng/ml de 30H3D2 fue suficiente para unir el péptido de survivina modificado de SEQ ID NO: 4 con una DO de 1,021 y el péptido de survivina de tipo salvaje de s Eq ID NO: 27 con una DO de 0,874. El título de 30H3 en su dilución más alta con una relación de señal a blanco de >2:1 es 1:512000 es consistente con el esperado para un anticuerpo de alta afinidad.
Luego, los anticuerpos se usaron en modelos animales para determinar el efecto del crecimiento de tumores. Los modelos animales fueron los mismos que los usados en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figuras 4 a 11. Se realizaron estudios de anticuerpos anti-survivina 2C2 y H30 en modelos de tumores murinos subcutáneos. Se permitió que los ratones establecieran un tumor implantable, después de lo cual comenzaron el tratamiento con 2C2, H30 o IgG no específica cada 5-7 días durante un período de 30 días. Se utilizaron dos cepas de ratón huésped, NCr-nu/nu (Atímico) en las Figuras 4, 6, 8, 10 y ratones C57B1/6 en las Figuras 5, 7, 9, 11. Los ratones atímicos representan un modelo inmunocomprometido en el que se esperaría que la actividad de los anticuerpos dependiera específicamente de la unión directa del anticuerpo a la diana sin el apoyo del sistema inmunológico. Los ratones C57B1/6 representan un modelo inmunocompetente en el que los anticuerpos pueden beneficiarse de la participación adicional de mecanismos de apoyo inmunológico como macrófagos, células dendríticas y células T. Melanoma B16 Figuras 4-7 y células de glioma GL261 Se demostró que las Figuras 8-11 inhibían el crecimiento en el modelo C57B1/6 (inmunocompetente) (Figuras 5, 7) y, en menor medida, también inhibían el crecimiento en el modelo atímico (inmunodeprimido) (Figuras 4, 6) cuando se trata con anticuerpos 2C2 o H30. Esta observación muestra una fuerte respuesta inmunomediada dependiente de anticuerpos en ratones C57B1/6 (Figuras 5, 7, 9, 11) que no se anula por completo por la falta de apoyo inmunológico en ratones atímicos (Figuras 4, 6, 8, 10). En modelos inmunocomprometidos (Figuras 4, 6, 8, 10) la persistencia de la inhibición del crecimiento dependiente de anticuerpos sugiere fuertemente un componente inhibidor del crecimiento directo o independiente del sistema inmune añadido por el anticuerpo por sí mismo. Pacientes con glioma inscritos en un ensayo clínico de fase I en el Roswell Park Cancer Institute of SurVaxM (SVN53-67/M57-KLH) SEQ. ID NO: 4 (aprobado por la FDA/I171010) para producir una respuesta inesperada de anticuerpos al péptido SurVaxM durante el período de protocolo de su ensayo

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que es específico para la survivina para el uso en un método para tratar un tumor que expresa la survivina en un individuo, el uso comprende administrar una composición al individuo que tiene un tumor que expresa la survivina, dicha composición comprende el anticuerpo que es específico para la survivina;
en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde,
a) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID nO: 11 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12; o
b) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18.
2. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se ha generado en respuesta a un péptido que tiene una longitud de 9 a 23 aminoácidos y comprende la secuencia QMFFCF (SEQ ID NO: 3); en donde, opcionalmente, el anticuerpo se ha generado en respuesta a un péptido que tiene la secuencia DLAQMFFCFKELEGW (SEQ ID NO: 4).
3. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 20.
5. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22.
6. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a la survivina que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde,
a) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID nO: 11 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12; o
b) la región variable de cadena pesada comprende una VH CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, una VH CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una VH CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15, y la región variable de cadena ligera comprende una VL CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16, una VL CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 y una VL CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 20.
8. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22.
9. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1 o el anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.
10. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 1 o el anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo tiene un isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE;
en donde, opcionalmente, el anticuerpo tiene un isotipo de IgG2b o IgG1.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 6 y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. Una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6;
en donde, opcionalmente, el anticuerpo monoclonal es de isotipo IgG2b o IgG1.
13. Una célula transformada en la que se han introducido las secuencias polinucleotídicas que codifican la secuencia de cada una de las SEQ ID NO: 19 y 20 o de las SEQ ID NO. 21 y 22.
14. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende el anticuerpo de la reivindicación 6.
15. El CAR de la reivindicación 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.
16. Una célula T transformada que comprende el CAR de la reivindicación 14.
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