ES2886123T3 - Anticuerpos anti-asic1 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al canal iónico 1 sensible a ácidos (ASIC1), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) contenidas en las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera (HCVR y LCVR) respectivamente, en donde, (a) la HCDR1 comprende la SEQ NO: 36; (b) la HCDR2 comprende la SEQ NO: 38; (c) la HCDR3 comprende la SEQ NO: 40; (d) la LCDR1 comprende la SEQ NO: 44; (e) la LCDR2 comprende la SEQ NO: 46; y (f) la LCDR3 comprende la SEQ NO: 48.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-asicl y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos, y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para el ASIC1 humano, y a métodos de producción de los mismos.
Antecedentes
Los canales iónicos sensibles a ácido (ASIC) son canales catiónicos activados por protones expresados en los sistemas nerviosos central y periférico. La familia ASIC en los seres humanos incluye subunidades ASIC1, ASIC2, ASIC3 y ASIC4 que se disponen en canales iónicos homo- o heteromultiméricos en las membranas neuronales. ASIC1, ASIC2 y ASIC3 se expresan significativamente en las neuronas sensoriales nociceptivas pequeñas y medianas que pueden detectar estímulos nocivos químicos, térmicos y mecánicos de alto umbral. ASIC2 y ASIC3 también se expresan en neuronas grandes que corresponden principalmente a mecanorreceptores de bajo umbral.
Los ASIC son permeables a iones Na+ y Ca2+ y se activan por variaciones externas del pH que oscilan de pH 6,8 a 4,0. Se cree que los ASIC juegan un papel importante en la detección de una acidosis local. La acidosis local de tejidos es una característica del dolor y la inflamación, y los tejidos inflamados a menudo presentan un bajo pH (de tan solo -4,7). Se ha propuesto el bloqueo de ASIC como un método para tratar una diversidad de trastornos y afecciones. En particular, se ha propuesto el bloqueo de ASIC1 como medio para tratar afecciones tales como el dolor, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades psiquiátricas.
Los inhibidores farmacológicos de ASIC1 incluyen el péptido de tarántula Psalmotoxina-1 (PcTx1), que inhibe específicamente homómeros ASIC1, y los inhibidores de ASIC no selectivos de molécula pequeña amilorida y A-317567. Se ha demostrado que la toxina peptídica de 40 aminoácidos APETx2, aislada de la anémona de mar, inhibe homómeros ASIC3 así como heterómeros ASIC3/1 y ASIC3/2.
En la actualidad, no se conocen anticuerpos que bloqueen específicamente los ASIC. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de nuevos inhibidores de ASIC, tales como anticuerpos anti-ASIC1, que puedan usarse para tratar enfermedades y afecciones mediadas por la señalización de ASIC. El documento WO 2011/051349 A1 describe un anticuerpo anti-canal iónico E1 o fragmento de unión del mismo, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y el uso de dichos anticuerpos en el tratamiento del dolor.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos que se unen específicamente a ASIC1 humano, entre los que se incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular. Los anticuerpos, de acuerdo con determinadas realizaciones, inhiben corrientes iónicas mediadas por ASIC1, inducidas por ácido, en células que expresan ASIC1 humano. Los anticuerpos son útiles, entre otras cosas, para inhibir la señalización mediada por ASIC1 y para tratar enfermedades y trastornos causados por o relacionados con la actividad y/o señalización de ASIC1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse a un paciente para el tratamiento o alivio del dolor y afecciones relacionadas.
Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol.
164:1925-1933).
La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al canal iónico 1 sensible a ácidos (ASIC1), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) contenidas en las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera (HCVR y LCVR) respectivamente, en donde: (a) la HCDR1 comprende la SEQ NO: 36; (b) la HCDr 2 comprende la Se Q NO: 38; (c) la HCDR3 comprende la Se Q NO: 40; (d) la lCd R1 comprende la SeQ No : 44; (e) la LCDR2 comprende la SEQ NO: 46 y (f) la LCDR3 comprende la SEQ NO: 48. También se desvela un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 386, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 394, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 y 386/394.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376 y 392, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384 y 400, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
En determinados casos, el anticuerpo o parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 376/384 y 392/400.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372 y 388, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374 y 390, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380 y 396, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382 y 398, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
Determinados anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, ejemplares, no limitativos, de la divulgación, comprenden dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H1M6712N); 20­ 22-24-28-30-32 (por ejemplo, H1M6716N); 36-38-40-44-46-48 (por ejemplo, H1M6718N); 52-54-56-60-62-64 (por ejemplo, H1M7101N); 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H2M7103N); 84-86-88-92-94-96 (por ejemplo, H3M6713N); 100-102-104-108-110-112 (por ejemplo, H3M6715N); 116-118-120-124-126-128 (por ejemplo, H3M6720N); 132-134­ 136-140-142-144 (por ejemplo, H3M6721N); 148-150-152-156-158-160 (por ejemplo, H3M6721N2); 164-166-168­ 172-174-176 (por ejemplo, H3M6726N); 180-182-184-188-190-192 (por ejemplo, H3M6760N); 196-198-200-204-206­ 208 (por ejemplo, H3M7102N); 212-214-216-220-222-224 (por ejemplo, H3M7118N); 228-230-232-236-238-240 (por ejemplo, H4H6362P); 244-246-248-252-254-256 (por ejemplo, H4H6363P); 260-262-264-268-270-272 (por ejemplo, H4H6364P) 276-278-280-284-286-288 (por ejemplo, H4H6366P) 292-294-296-300-302-304 (por ejemplo, H4H6372P) 308-310-312-316-318-320 (por ejemplo, H4H6374P) 324-326-328-332-334-336 (por ejemplo, H4H6375P) 340-342-344-348-350-352 (por ejemplo, H4H6379P) 356-358-360-364-366-368 (por ejemplo, H4H6380P) 372-374-376-380-382-384 (por ejemplo, H4H6381P) y 388-390-392-396-398-400 (por ejemplo, H4H6383P)
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a ASIC1 (por ejemplo, ASIC1 expresado en la superficie celular), en donde el anticuerpo o fragmento comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 y 386/394. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones ejemplares que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un compendio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-ASIC1 o fragmentos de los mismos. También se incluyen en la invención vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321,337, 353, 369 y 385, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201,217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361,377 y 393, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375 y 391, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191,207, 223, 239, 255, 271,287, 303, 319, 335, 351, 367, 383 y 399, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51,67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211,227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371 y 387, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373 y 389, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379 y 395, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381 y 397, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
De acuerdo con determinados casos, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1 y 9 (por ejemplo, H1M6712N), 17 y 25 (por ejemplo, H1M6716N), 33 y 41 (por ejemplo, H1M6718N), 49 y 57 (por ejemplo, H1M7101N), 65 y 73 (por ejemplo, H2M7103N), 81 y 89 (por ejemplo, H3M6713N), 97 y 105 (por ejemplo, H3M6715N), 113 y 121 (por ejemplo, H3M6720N), 129 y 137 (por ejemplo, H3M6721N), 145 y 153 (por ejemplo, H3M6721N2), 161 y 169 (por ejemplo, H3M6726N), 177 y 185 (por ejemplo, H3M6760N), 193 y 201 (por ejemplo, H3M7102N), 209 y 217 (por ejemplo, H3M7118N), 225 y 233 (por ejemplo, H4H6362P), 241 y 249 (por ejemplo, H4H6363P), 257 y 265 (por ejemplo, H4H6364P), 273 y 281 (por ejemplo, H4H6366P), 289 y 297 (por ejemplo, H4H6372P), 305 y 313 (por ejemplo, H4H6374P), 321 y 329 (por ejemplo, H4H6375P), 337 y 345 (por ejemplo, H4H6379P), 353 y 361 (por ejemplo, H4H6380P), 369 y 377 (por ejemplo, H4H6381P), 385 y 393 (por ejemplo, H4H6383P).
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-ASIC1 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para retirar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo que se une específicamente a ASIC1 (por ejemplo, ASIC1 expresado en la superficie celular) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-ASIC1 y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-ASIC1. Los agentes ejemplares que pueden combinarse de forma ventajosa con un anticuerpo anti-ASIC1 incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad de ASIC1 (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhibidores peptídicos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que no se unen directamente a ASIC1 pero, a pesar de ello, interfieren con, bloquean o atenúan las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 en las células.
En otro aspecto más, la divulgación proporciona métodos para inhibir corrientes iónicas mediadas por ASIC1 usando un anticuerpo anti- ASIC1 o una parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, mitigue, inhiba o prevenga por eliminación, inhibición o reducción de corrientes iónicas mediadas por ASIC1. Los anticuerpos anti-ASIC1 o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden funcionar bloqueando las corrientes mediadas por ASIC1 inducidas por ácido o inhibiendo de otro modo la actividad de señalización de ASIC1.
También se describe en el presente documento el uso de un anticuerpo anti-ASIC1 o parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o causado por corrientes iónicas mediadas por ASIC1 en un paciente.
Otras realizaciones se harán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa los umbrales de retirada de ratones tratados con un anticuerpo anti-ASIC1 (H1M6718N), o anticuerpo de control de isotipo, en respuesta a un pellizco mecánico de la cola (panel A) o del músculo gastrocnemio (panel B). Los resultados se expresan en términos de umbral de retirada al pellizco en gramos (media ± SEM para cada cohorte de ratones).
La Figura 2 muestra el porcentaje de cambio en el umbral de retirada desde el punto de referencia en hiperalgesia muscular inducida por solución salina ácida en ratones tratados con un anticuerpo anti-ASIC1 (H1M6718N) o control de isotipo.
La Figura 3 (paneles A y B) muestra el porcentaje de cambio en el umbral de retirada desde el punto de referencia en hiperalgesia muscular inducida por carragenina en ratones tratados con un anticuerpo anti-ASIC1 (H1M6718N, 10 o 40 mg/kg - panel A ; o H4H6721N2, 10 o 30 mg/kg - panel B), o control de isotipo.
La Figura 4 muestra el grado de alodinia táctil inducida por taxol a lo largo del tiempo en ratones que recibieron taxol y que se trataron con 30 mg/kg (s.c.) de un anticuerpo de control de isotipo, 30 mg/kg (s.c.) de H1M6718N o 100 mg/kg (s.c.) de gabapentina. Los resultados se expresan en términos de umbral de retirada (g) medido usando filamentos de Von Frey (como se describe en el Ejemplo 10).
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la cual pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, El término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar del valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, tal como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque en la práctica o el ensayo de la presente invención puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales preferidos.
Definiciones
Las expresiones "ASIC1" y "fragmento de ASIC1", tal como se usan en el presente documento, se refieren a la proteína ASIC1 humana o a un fragmento de la misma, salvo que se especifique que procede de una especie no humana (por ejemplo, "ASIC1 de ratón", "fragmento de ASIC1 de ratón," "ASIC1 de mono," "fragmento de ASIC1 de mono," etc.).
La proteína ASIC1 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 401). La expresión "ASIC1", tal como se usa en el presente documento, incluye fragmentos solubles del dominio extracelular de ASIC1 (por ejemplo, polipéptidos que comprenden o que consisten en al menos 30 aminoácidos contiguos que se encuentran entre los aminoácidos 63 a 424 de la SEQ ID NO: 401), así como a la proteína ASIC1 expresada en la superficie celular (como se define dicho término más adelante en el presente documento).
Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une a ASIC1" o un "anticuerpo anti-ASIC1" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a un fragmento soluble de una proteína ASIC1 (por ejemplo, una parte del dominio extracelular de ASIC1) y/o a la proteína ASIC1 expresada en la superficie celular. La expresión "ASIC1 expresada en la superficie celular" significa una o más proteínas ASIC1 que se expresan en la superficie de una célula in vitro o in vivo, de tal modo de al menos una parte de la proteína ASIC1 (por ejemplo, los aminoácidos 63 a 424 de la SEQ ID NO: 401) queda expuesta al lado extracelular de la membrana celular y accesible a una parte de unión antígeno de un anticuerpo. "ASIC1 expresada en la superficie celular" incluye la proteína ASIC1 contenida dentro del contexto de un canal iónico ASIC1 funcional en la membrana de una célula. En algunos casos, "ASIC1 expresada en la superficie celular" es una proteína ASIC1 que se expresa como parte de un heteromultímero en la superficie de una célula (por ejemplo, un heteromultímero ASIC1/2, ASIC1/3 o ASIC1/4). En otros casos, "ASIC1 expresada en la superficie celular" es una proteína ASIC1 que se expresa como parte de un homomultímero en la superficie de una célula. Por otra parte, "ASIC1 expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en la proteína ASIC1 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína ASIC1. Como alternativa, "ASIC1 expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en la proteína ASIC1 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa ASIC1 humana en su superficie pero se ha modificado genéticamente de forma artificial para expresar ASIC1 en su superficie.
El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, ASIC1). El término «anticuerpo» incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: f R1, Cd R1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, Fr 4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-ASIC1 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden haberse modificado de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos se puede definir basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, tal como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, que puede obtenerse enzimáticamente, sintética o modificada por ingeniería genética, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente en, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (entre las que se incluyen, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 constreñido. Dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, también se incluyen otras moléculas modificadas genéticamente, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de CDR injertada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios variables de IgNAR de tiburón.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones ejemplares no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (i) Vh-Ch 1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-CH2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra completa o parcial o conectora. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ejemplares divulgados en este documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en este campo.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o dirigida in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se han preparado, expresado, creado o aislado por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (descrito más adelante con más detalle), anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humana combinatoria recombinante (descrita más adelante con más detalle), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de, y están relacionadas con, las secuencias Vh y Vl de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe a, pero sin limitación, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles típicamente observados usando una bisagra de IgG1 humana. la presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en la que existe de forma natural o se produce de forma natural el anticuerpo, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a ASIC1 reduce o inhibe de manera detectable las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido. La inhibición causada por un anticuerpo neutralizante o bloqueante de ASIC1 no tiene que ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. En otra parte del presente documento se describen ensayos ejemplares para detectar la inhibición de ASIC1.
Los anticuerpos anti-ASIC1 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias correspondientes de la línea germinal de las que se obtuvieron los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. En este documento se describen anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se mencionan en el presente documento colectivamente como "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más de los restos marco y/o CDR están mutados a los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en las que determinados restos individuales están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, mejor especificidad de unión, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), menor inmunogenicidad, etc. Dentro de la presente invención se incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-ASIC1 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR desveladas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-ASIC1 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos igual o sustancialmente similar a la del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco por defecto, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se menciona como identidad de secuencia, se mide típicamente usando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Características biológicas de los anticuerpos
La presente invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo se une específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular si el anticuerpo muestra unión detectable a una célula que expresa ASIC1 de manera natural o artificial, pero no muestra unión detectable a una célula equivalente que no expresa ASIC1. Un formato de ensayo ejemplar que puede usarse para determinar si un anticuerpo se une específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular es la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), como se ilustra en el Ejemplo 3 del presente documento. La unión de un anticuerpo a células que expresan ASIC1, determinada por FACS positiva cualitativa, tal como se muestra en la Tabla 2, puede usarse para identificar un anticuerpo como un anticuerpo que se une específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular. También puede usarse FACS para evaluar cuantitativamente la unión de un anticuerpo a una célula que expresa ASIC1 en términos de un valor de CE50, como se muestra en el Ejemplo 3, Tabla 3. Por lo tanto, de acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, un anticuerpo "se une específicamente a ASIC1 expresado en la superficie celular" si el anticuerpo, cuando se ensaya en el formato de ensayo FACS del Ejemplo 3 o en un formato de ensayo sustancialmente similar, presenta un valor de CE50 de aproximadamente 5 nM o menor (por ejemplo, aproximadamente 5,0 nM, 4,5 nM, 4,0 nM, 3,5 nM, 3,0 nM, 2,5 nM, 2,0 nM, 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1,2 nM, 1,1 nM, 1,0 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 85 pM, 80 pM, 75 pM, 70 pM o menor).
Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden funcionar también (o como alternativa) inhibiendo corrientes iónicas mediadas por ASIC1, inducidas por ácido, en células que expresan ASIC1 humano. Como se usa en el presente documento, la expresión "inhibe corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido" significa que, en un ensayo en el que pueden detectarse y/o cuantificarse flujos o corrientes iónicas celulares inducidas por ácido, la adición de un anticuerpo de la invención reduce de manera detectable o inhibe las corrientes iónicas inducidas por ácido en comparación con las corrientes iónicas observadas en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, en presencia de un anticuerpo de control negativo no específico). En el Ejemplo 4 del presente documento se ilustra un ensayo ejemplar no limitante que puede usarse para determinar si un anticuerpo "inhibe las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido". En este ejemplo, se mide el flujo de calcio activado por un pH bajo en células que expresan ASIC1 en presencia de anticuerpos anti-ASIC1 ("ensayo FLIPR"). Variando la cantidad de anticuerpo usado en este formato de ensayo, puede calcularse la cantidad de anticuerpo necesaria para bloquear un 50 % del flujo de iones inducido por un bajo pH y expresarse como un valor de CI50 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4, Tabla 5). La presente invención incluye anticuerpos anti-ASIC1 que inhiben las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido con un valor de CI50 menor de aproximadamente 10 nM cuando se ensayan en un ensayo FLIPR a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 (por ejemplo, a pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0) como se ha descrito anteriormente, o en un ensayo sustancialmente similar. Por ejemplo, la invención incluye anticuerpos anti-ASIC1 que presentan una CI50 menor de aproximadamente 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM o menos, cuando se ensayan en un ensayo FLIPR a pH 5,5 como se ha descrito anteriormente, o en un ensayo sustancialmente similar.
En los Ejemplos 5 y 6 del presente documento se ilustran otros formatos de ensayo ejemplares que pueden usarse para determinar si un anticuerpo "inhibe las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido". En estos ejemplos, se usan ensayos de pinzamiento de voltaje y pinzamiento de membrana para medir y/o evaluar la inhibición del flujo de corriente en células que expresan ASIC1 a pH ácido en presencia de un anticuerpo anti-ASIC1, en comparación con el flujo de corriente observado en circunstancias equivalentes en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, en presencia de un anticuerpo de control negativo no específico). Se considera que un anticuerpo "inhibe las corrientes iónicas mediadas por ASIC1" si el anticuerpo, cuando se prueba en un ensayo de pinzamiento de voltaje y pinzamiento de membrana a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 (por ejemplo, a pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0), causa al menos una inhibición de corriente del 10 % (por ejemplo, una inhibición del flujo de corriente de al menos aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor; véase, por ejemplo, el Ejemplo 5, Tabla 6). En algunos casos, los anticuerpos de la invención inhiben completamente el flujo de corriente (inhibición del 100 %) a una concentración 10 nM o superior (por ejemplo, 100 nM), cuando se ensayan en un formato de ensayo de pinzamiento de membrana como se ha descrito anteriormente o en un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye anticuerpos que inhiben o reducen la respuesta o respuestas de dolor en diversos modelos animales de dolor. En los Ejemplos 7-9 del presente documento se ilustran modelos animales de dolor ejemplares útiles para caracterizar los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-ASIC1 que atenúan o inhiben las respuestas de dolor al dolor visceral inducido por ácido en un modelo de ratón. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 7). En particular, la presente invención incluye anticuerpos anti-ASIC1 que presentan una inhibición de al menos un 20 % de las respuestas de dolor visceral (por ejemplo, constricciones abdominales en respuesta a una inyección intraperitoneal de ácido acético al 0,6 %) cuando se administran a una dosis de aproximadamente 1 o 10 mg/kg a un modelo de ratón como el mostrado en el Ejemplo 7, o a un modelo sustancialmente similar. En ciertos casos, el porcentaje de inhibición de respuestas de dolor debida a la administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser de hasta aproximadamente un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % o superior cuando se ensaya en el modelo animal de ratón de dolor del Ejemplo 7, o en un modelo sustancialmente similar. Otros modelos animales de dolor que pueden usarse para caracterizar los anticuerpos anti-ASIC de la presente invención incluyen, por ejemplo, los modelos de respuesta de dolor de nocicepción mecánica del Ejemplo 8, los modelos de dolor muscular del Ejemplo 9 y otros modelos animales similares disponibles en la técnica. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos anti-ASIC1 capaces de atenuar o inhibir las respuestas de dolor a estímulos mecánicos nocivos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8); y/o hiperalgesia muscular inducida por solución salina ácida o por carragenina (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9), como se demuestra en modelos animales apropiados ejemplificados en el presente documento.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-ASIC1 que interaccionan con uno o más aminoácidos encontrados dentro del dominio extracelular de ASIC1 humano (aminoácidos 63 a 424 de la SEQ ID NO: 401). El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro del dominio extracelular de ASIC1. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) ubicados dentro del dominio extracelular de ASIC1.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de barrido con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos excepto los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-ASIC1 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P, etc.). Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-ASIC1 que compiten por la unión a ASIC1 o a ASIC1 expresado en la superficie celular con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P etc.).
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-ASIC1 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-ASIC1 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido ASIC1 (por ejemplo, ASIC1 expresado en la superficie celular). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula de ASIC1. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a ASIC1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-ASIC1 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-ASIC1 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula de ASIC1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-ASIC1 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-ASIC1 de referencia de la invención. Entonces puede realizarse experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-ASIC1 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de ASIC1 (por ejemplo, ASIC1 expresado en la superficie celular) en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de ASIC1. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de ASIC1 en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de ASIC1. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula de ASIC1, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a ASIC1. Como apreciará un experto en la materia, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de anticuerpos humanos
En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a ASIC1 humano.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra ASIC1 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-ASIC1 y fragmentos de anticuerpos de la presente invención abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a ASIC1 humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-ASIC1 de la presente invención abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-ASIC1 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-ASIC1 o fragmento de anticuerpo de la invención. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en los que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-ASIC1 de la invención pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-ASIC1 que comprenden cambios de aminoácido que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
De acuerdo con ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-ASICI se unen a ASIC1 humano, pero no a ASIC1 de otras especies. La presente invención también incluye anticuerpos anti-ASICI que se unen a ASIC1 humano y a ASIC1 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-ASIC1 de la invención pueden unirse a ASIC1 humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más ASIC1 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé. La presente invención también incluye anticuerpos anti-ASIC1 que bloquean selectivamente las corrientes iónicas inducidas por ácido a través de canales ASIC1 humanos (pero no a través de canales ASIC1 no humanos). Como alternativa, de acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-ASIC1 que bloquean corrientes iónicas inducidas por ácido a través de canales ASIC1 humanos así como a través de canales ASIC1 no humanos (por ejemplo, de ratón, rata, etc.) (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 5 del presente documento).
Inmunoconjugados
La invención abarca anticuerpos monoclonales anti-ASIC1 humanos conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para ASIC1 humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Formulación terapéutica y administración
La divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-ASIC1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también, Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, las condiciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula típicamente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. Cuando un anticuerpo de la presente divulgación se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad ASIC1 en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente divulgación, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-ASIC1 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente por evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, aunque no de forma limitativa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y otras vías. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma preparado tiene aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Dicho dispositivo de administración de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de pluma entonces puede reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay un cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo de administración de pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma Bd ™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OpT iPEN PRO™, OPTlPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.), y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente citado; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en las proximidades de la diana de la composición, requiriendo por tanto solo una fracción de la dosis sistémica (véase,por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). En la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533, se mencionan otros sistemas de liberación controlada.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos para el público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descrita anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se introduce preferentemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos de la divulgación son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de ASIC1 o tratable mediante el bloqueo o atenuación de las corrientes iónicas mediadas por ASIC1 inducidas por ácido en células neuronales de un individuo. Las enfermedades y trastornos ejemplares que pueden tratarse con los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención incluyen afecciones relacionadas con el dolor tales como dolor nociceptivo y dolor visceral (por ejemplo, dolor por enfermedad inflamatoria del intestino/síndrome de intestino irritable, cistitis intersticial, pancreatitis, endometriosis, síndrome de dolor pélvico crónico, etc.), así como el dolor asociado con la inflamación (por ejemplo, dolor muscular inflamatorio), polimiositis, incisión postoperatoria (por ejemplo, dolor postquirúrgico), neuropatía (por ejemplo, neuropatía diabética), ciática, neuralgia posherpética, síndromes de dolor miofascial (por ejemplo, dolor miofascial crónico), artritis, células falciformes, isquemia nerviosa entérica, dolor de claudicación, fractura ósea, quemaduras, fractura osteoporótica, gota, dolor de cabeza de tipo migraña, fibromialgia, síndrome de dolor regional complejo, dolor herpético agudo, etc. También se desvela en el presente documento el uso de los anticuerpos de la invención para tratar, prevenir y/o mejorar afecciones tales como, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedades desmielinizantes tales como esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, etc.), lesión cerebral (por ejemplo, ictus, lesión traumática cerebral, acidosis cerebral), trastornos neurológicos (por ejemplo, ataques, trastornos convulsivos) y enfermedades psiquiátricas (por ejemplo, depresión, trastornos de ansiedad, trastorno de estrés postraumático, trastorno de pánico, etc.).
Los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención también son útiles para tratar o prevenir el dolor oncológico. "Dolor oncológico" incluye, por ejemplo, dolor oncológico óseo, incluyendo el dolor de un cáncer que ha metastatizado a hueso (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, sarcoma, cáncer de riñón, mieloma múltiple, etc.). El "dolor oncológico" también incluye el dolor asociado de forma más general con afecciones cancerosas tales como, por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma. Los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención también son útiles para tratar o prevenir el dolor causado por o asociado con una terapia para el cáncer o tratamientos médicos anticancerosos, por ejemplo, el dolor neuropático inducido por quimioterapia tal como el dolor causado por o asociado con el tratamiento con paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere®); nitrosourea, ciclofosfamida, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, topotecán, irinotecán, carmustina, estramustina y compuestos quimioterapéuticos a base de platino, tales como cisplatino, carboplatino e iproplatino.
Terapias de combinación
La presente divulgación incluye regímenes de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo anti-ASIC1 de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitantes de estos componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen otros inhibidores de ASIC tales como, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-ASIC1, un anticuerpo dirigido contra un componente de ASIC diferente (por ejemplo, anticuerpo anti-ASIC2, anticuerpo anti-ASIC3, anticuerpo anti-ASIC4, etc.), un inhibidor de péptido ASIC (por ejemplo, psalmotoxina-1 [PcTx1], APETx2, etc.) y/o un inhibidor de ASIC de molécula pequeña (por ejemplo, amilorida, A-317567, etc.).
Otros agentes que pueden administrarse de manera beneficiosa en combinación con los anticuerpos anti-ASIC1 de la invención incluyen inhibidores de citocinas (entre los que se incluyen inhibidores de citocinas de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, iL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, o a sus receptores respectivos), antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE.
El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración de un anticuerpo anti-ASIC1 de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-ASIC1" en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-ASIC1 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir ASIC1, o células que expresan ASIC1, en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpos anti-ASIC1, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de ASIC1. Los ensayos de diagnóstico ejemplares para ASIC1 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-ASIC1 de la invención, en donde el anticuerpo anti-ASIC1 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-ASIC1 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano rusticano o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que pueden usarse para detectar o medir ASIC1 en una muestra incluyen ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en el diagnóstico de ASIC1 como se describe en el presente documento incluyen cualquier muestra de tejido o de fluido que pueda obtenerse a partir de un paciente que contenga cantidades detectables de proteína ASIC1, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de ASIC1 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad de ASIC1 anómalos) para establecer un valor de referencia, o patrón, de ASIC1. Este nivel de referencia de ASIC1 después puede compararse con los niveles de ASIC1 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con ASIC1.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se ha intentado garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es o está cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra ASIC1 humano
Para generar anticuerpos anti-ASIC1 humano, se usó un procedimiento de inmunización con ADN en el que se inyectaron por vía intradérmica un plásmido de ADN que codificaba ASIC1 humano de longitud completa, junto con un plásmido distinto que codificaba un adyuvante, en un ratón VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY). El sitio de inyección después se sometió a electroporación para inducir la transfección de la célula hospedadora con los plásmidos. Los ratones VELOCIMMUNE® usados para la inmunización comprenden ADN que codifica regiones variables de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humana y carece del gen asicla endógeno de ratón. La respuesta inmunitaria de anticuerpos se supervisó mediante un ensayo de unión a células usando células modificadas genéticamente para expresar ASIC1 humano. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos para ASIC1. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-ASIC1 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos ejemplares generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N y H3M7118N.
También se aislaron anticuerpos anti-ASIC1 directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-ASIC1 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseían dominios variables humanos y dominios constantes humanos); denominándose los anticuerpos generados de esta manera como se indica a continuación: H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, and H4H6383P.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-ASIC1 ejemplares generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera
La tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-ASIC1 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes.
Tabla 1
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Los anticuerpos se denominan típicamente en este documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H4H", "HIM", "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "6712" o "6362" como se muestra en la Tabla 1), seguido por un sufijo "P" o "N". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H1M6712N" o "H4H6362P". Los prefijos H4H, H1M y H3M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M o H3M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR) - que se indican por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1 - permanecerán iguales.
Ejemplo 3. Unión de anticuerpos a células que expresan ASIC1 humano o de ratón de longitud completa
Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-ASIC1, se determinó por citometría de flujo (FACS) su capacidad de unirse a (a) una línea celular 3T3 de fibroblastos de ratón transfectada de manera estable para sobreexpresar ASIC1 humano de longitud completa (3T3/hASIC1; aminoácidos 1-528 del número de acceso del NCBI NP_001086.2 [SEQ ID NO: 401]), (b) una línea celular 3T3 transfectada de manera estable para sobreexpresar ASIC1a de ratón de longitud completa (3T3/mASIC1a; aminoácidos 1-526 del número de acceso del NCBI NP_033727) o (c) una línea celular ND7 (ECACC, n.° 92090903) que es una línea celular de fusión de neuroblastoma de ratón y ganglio de raíz dorsal de rata que expresa de manera endógena ASIC1 de rata. Las células ND7 se diferenciaron reemplazando el medio de cultivo por medio de bajo contenido de suero (0,5 % de FBS) que contenía dibutiril-AMPc 1 mM (n.° de Cat. sc-201567A, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Se ensayó la unión mediante FACS para algunos anticuerpos tanto en células ND7 no diferenciadas como en células ND7 diferenciadas.
Para realizar los experimentos de unión mediante FACS, se recogieron células adherentes usando EDTA 1 mM en PBS, después se lavaron y se resuspendieron en PBS frío que contenía un 5 % de FBS. Para cada experimento de unión, se añadió cada anticuerpo anti-ASIC1 (a concentraciones finales de 10 nM de anticuerpos purificados o de 3,3 nM en el caso de sobrenadantes de anticuerpos para la unión a células 3T3/hASIC1 y de 5 nM para la unión a células 3T3/mASIC1a o ND7) a 250.000 células en 500 pl de PBS con un 5 % de FBS. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla de células un anticuerpo secundario que reconocía Fc humana (n.° de Cat. 109-136-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) o Fc de ratón (n.° de Cat. 550826, BD Biosciences, San Jose, CA) y que estaba conjugado con aloficocianina, a una concentración final de 13,3 nM. Después de incubar durante 20 minutos en hielo, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía un 5 % de FBS, después se clasificaron y se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA) para determinar la unión relativa por los anticuerpos candidatos a las líneas celulares ensayadas. Se compararon los histogramas de células teñidas con anticuerpos anti-ASICI con los de células teñidas únicamente con anticuerpo secundario. Se calculó el porcentaje de señal de ASIC1 con respecto al anticuerpo secundario solo usando el programa informático FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Las muestras teñidas con anticuerpos anti-ASIC1 se registraron como positivas en el FACS cuando se aplicó una puerta (gate) mayor del 10 %. Las muestras teñidas con anticuerpos anti-ASIC1 se registraron como negativas en el FACS cuando se aplicó una puerta (gate) menor del 1 %. Las muestras teñidas con anticuerpos anti-ASIC1 se registraron como débiles cuando se aplicó una puerta (gate) entre el 1 % y el 10 %. Las especificidades de unión de los anticuerpos anti-ASIC1 a células 3T3/hASIC1, células 3T3/mASIC1a y células ND7 se resumen en la Tabla 2 (ND = no determinado).
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También se examinó la afinidad de unión de anticuerpos seleccionados a células 3T3/hASIC1 por FACS usando múltiples concentraciones de anticuerpo (67 nM, 6,7 nM, 0,67 nM, 67 pM y 6,7 pM) a partir de la cual se calcularon los valores de CE50 aproximados. A la señal de intensidad media de fluorescencia (MFI) observada para los anticuerpos anti-ASIC1 se le restó la señal de fondo (anticuerpo secundario solo) y se representó como una función de la concentración de anticuerpo para determinar los valores de CE50 usando GraphPad Prism (Tabla 3).
Tabla 3: Valores de CE 50 ara la unión de anticuer os anti-ASIC1 seleccionados a células 3T3/hASIC1
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Como se muestra en la Tabla 2, diecisiete de los 25 anticuerpos ensayados demostraron unión específica a la línea celular 3T3/hASIC1; ocho de 10 anticuerpos ensayados demostraron unión positiva a las células 3T3/mASIC1a; seis de 10 anticuerpos ensayados demostraron unión positiva a la línea celular ND7 no diferenciada; y cinco de 7 anticuerpos ensayados demostraron unión positiva a la línea celular ND7 diferenciada. De forma destacable, un anticuerpo (H3M7118N) demostró una unión débil a las líneas celulares tanto 3T3/mASIC1a como ND7 no diferenciada pero positiva a las células 3T3/hASIC1. Como se muestra en la Tabla 3, los anticuerpos anti-ASIC1 ensayados a múltiples concentraciones de anticuerpo demostraron unión por FACS de alta afinidad con valores aproximados de CE50 de tan solo 23 pM para la unión a las células 3T3/hASIC1.
Ejemplo 4. Los anticuerpos anti-ASICI bloquean la señalización celular mediada por ácido en un ensayo celular de flujo de calcio
Para caracterizar el bloqueo funcional de la señalización celular mediada por ácido por anticuerpos anti-ASIC1, se puso en práctica un ensayo que mide el flujo de calcio celular, usando una línea celular HEK293 CL:1F10 (1F10), que se transfectó de manera transitoria para expresar ASIC1 humano (aminoácidos 1-528 del número de acceso del NCBI NP_0010862.2 [SEQ ID NO: 401]). Esta línea celular se creó a partir de la línea parenta1HEK293/D9 que se transfectó de manera estable para expresar Par2 humano. Se incubaron células transfectadas a 37 °C, con 5 % de CO2 durante 2 días, antes de volver a cultivar en una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo transparente a una concentración de 100.000 células por pocillo. Se dejó que las células se adhirieran a la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos y después se incubaron durante una noche a 37 °C, con un 5 % de CO2.
Se usó el kit de ensayo de calcio Fluo-4 NW (Invitrogen, n.° F36206) para determinar el nivel de flujo de calcio intracelular dentro de células activado por tampones de bajo pH. Se preparó tampón de ensayo de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se añadieron cincuenta pl de probenecid (77 pg/ul) a 5 ml de tampón C (HBSS 2x), que después se añadió al componente A (colorante Fluo-4). Se diluyeron anticuerpos anti-ASIC1 en el colorante Fluo-4 a una concentración de 250 nM para el ensayo de bloqueo de un solo punto. Los anticuerpos que bloqueaban el flujo de calcio estimulado por tampones de bajo pH se caracterizaron adicionalmente en este ensayo usando múltiples concentraciones de anticuerpo. Se diluyeron anticuerpos anti-ASIC1 a una concentración de 250 nM en el colorante y se usó una serie de dilución 1:3 de 8 puntos (que varaba de 250 a 0,1 nM) para determinar la CI50 de bloqueo de cada anticuerpo. Se retiró el medio de cultivo celular de la placa de ensayo que contenía células y después se añadieron 50 pl del colorante Fluo-4 que contenía anticuerpo anti-ASIC1. Las placas se incubaron a 37 °C, con un 5 % de CO2 durante 1 hora antes de la lectura por FLIPR Tetra (Molecular Devices).
El pH del tampón C se ajustó a pH 5,0 o pH 5,5 y se añadió a una placa de depósito antes de la adición a las células. En el FLIPR Tetra después se añadieron 50 pl del tampón de bajo pH desde la placa de depósito a las células en la placa de ensayo a una velocidad de 50 pl por segundo. La señal de calcio producida por cada pocillo durante 10 segundos antes de la adición de tampón (prelectura) y durante 100 segundos después de la adición de tampón se midió por FLIPR Tetra usando una configuración de longitud de onda de excitación de 470-490 nm y una configuración de longitud de onda de emisión de 515-575 nm. Se calculó la diferencia entre el valor máximo observado obtenido después de la adición del tampón y el valor mínimo durante el ensayo entero incluyendo tanto la prelectura como la lectura después de la adición del tampón y se representó en un gráfico usando GraphPad Prism. Los resultados se muestran en las tablas 4 y 5.
Tabla 4: Bloqueo de flujo de calcio celular mediado por ácido por 250 nM de anticuerpos anti-ASIC1 a pH 5,5
Figure imgf000019_0001
continuación
Figure imgf000020_0002
Tabla 5: Bloqueo dependiente de la dosis del flujo de calcio celular mediado por ácido por anticuerpos anti-
A I 1 H
Figure imgf000020_0001
Como se muestra en la Tabla 4, dos de los 24 anticuerpos, H3M6721N y H1M6718N, mostraron un bloqueo mayor del 30 % del flujo de calcio (Pos) a una sola concentración de 250 nM tanto a pH 5,5 como a pH 5,0, y un anticuerpo (H3M6760N) mostró un bloqueo mayor del 30 % solo a pH 5,5. Doce de los 24 anticuerpos a pH 5,5 y 17 de los 24 anticuerpos a pH 5,0 ensayados a una sola concentración de 250 nM no mostraron bloqueo medible (Neg). Nueve de los 24 anticuerpos a pH 5,5 y 5 de los 24 anticuerpos a pH 5,0, ensayados a una sola concentración de 250 nM, mostraron una reducción en el flujo de calcio entre el 10 y el 30 % (Débil).
Como se muestra en la Tabla 5, ocho de los 10 anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo dependiente de la dosis a pH 5,5 mostraron un porcentaje de bloqueo del flujo de calcio que variaba del 27 % al 78 % y valores de CI50 que variaban de 0,1 nM a 6 nM. Dos de los anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo del flujo de calcio dependiente de la dosis a pH 5,5, H4H6380P y H4H6381P, no mostraron un bloqueo medible. Dos de los 10 anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo dependiente de la dosis a pH 5,0, H3M6721N y H1M6718N, mostraron un bloqueo del 25 % y del 48 % del flujo de calcio, respectivamente, pero no pudieron determinarse valores de CI50 (CI*) a pesar de demostrar dependencia de la dosis. Uno de los 10 anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo dependiente de la dosis a pH 5,0, H3M6760N, mostró un bloqueo del 56 % del flujo de calcio y un valor de CI50 de 1 nM. Cinco de los 10 anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo del flujo de calcio dependiente de la dosis a pH 5,0 no mostraron un bloqueo dependiente de la dosis, pero bloquearon entre el 10 % y el 25 % del flujo de calcio a cada una de las concentraciones de anticuerpo ensayadas. Dos de los 10 anticuerpos ensayados con respecto al bloqueo dependiente de la dosis a pH 5,0, H4H6380P y H4H6381P, no mostraron un bloqueo medible.
Ejemplo 5. Los anticuerpos anti-ASIC1 bloquean las corrientes iónicas de ASIC1 inducidas por ácido en un ensayo automático de pinzamiento de voltaje y pinzamiento de membrana [Q-Patch]
Se usó el Q-Patch (Sophion Bioscience, Inc., Ballerup, Dinamarca), un sistema automático de pinzamiento de membrana basado en microchip, para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-ASIC1 para inhibir la corriente a través de ASIC1 humano en una línea celular HEK293 transfectada de manera estable que expresa el canal ASIC1 humano de longitud completa (HEK/hASIC1; aminoácidos 1-528 del número de acceso del NCBI NP_001086.2) o una corriente a través de ASIC1 de ratón en una línea celular 3T3 transfectada de manera estable que expresa el canal ASIC1a de ratón de longitud completa (3T3/mASIC1a; aminoácidos 1-526 del número de acceso del NCBI NP_033727).
Se cultivaron células HEK/hASIC1 en medio DMEM de alto contenido de glucosa, 10 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de aminoácidos no esenciales y 500 |jg/ml de Geneticin® (Invitrogen, n.° 10131). Se cultivaron células 3T3/mASIC1a en medio DMEM de alto contenido de glucosa, 10 % de FBS, 1 % de penicilina / estreptomicina / glutamina (Invitrogen, n.° 10378-016) y 400 ug/ml de Geneticin®. El día de los registros, se recogieron las células con solución de separación de células Detachin (Genlantis, San Diego, CA, n.° T100100), se centrifugaron y se resuspendieron en 1,4 ml de solución sin suero [medio CHO-SFM-II (Invitrogen, n.° 31033), HEPES 25 mM y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina]. Después, la suspensión celular se incubó en un agitador durante 40 minutos a temperatura ambiente (TA). En un experimento se procesaron en paralelo dos o tres anticuerpos anti-ASIC1 y un anticuerpo de control. Por lo tanto, al final de la incubación, la suspensión celular se distribuyó en 4 tubos (aproximadamente 5 x 105 células en 300 jl/tubo) y los anticuerpos se diluyeron a una concentración final de 100 nM directamente en los tubos para experimentos de un solo punto, o a un intervalo de concentraciones para experimentos de respuesta a la dosis y después se incubaron en un agitador durante 20 minutos a TA. Al final de la incubación, las células se cargaron en el Q-Patch.
Las células primero se perfundieron con un tampón a pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCb 1 mM, CaCb 2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM) que contenía un 0,2 % (p/v) de albúmina de suero bovino (tampón extracelular) y se añadió el anticuerpo de interés a una concentración final de 100 nM para experimentos de un solo punto, o a un intervalo de concentraciones para los experimentos de respuesta a la dosis, y se dejó incubar durante aproximadamente 3 minutos. Después, se indujo la corriente a través de ASIC1 humano durante un segundo mediante la adición del tampón extracelular ajustado a pH 6,0 mientras que las células se mantenían a un potencial de retención de -80 mV. Se añadió amilorida treinta jM después de cada registro en el Q-Patch para demostrar que las células respondían a lo largo de la duración del ensayo. La composición de la solución de registro intracelular era CsCI 140 mM, MgCl24 mM, EGTA 10 mM y HEPES 10 mM; ajustada a pH 7,3 con CsOH.
Todos los anticuerpos anti-ASIC1 se ensayaron por cuadruplicado en paralelo con el anticuerpo de control irrelevante. Se midió el bloqueo del canal como un porcentaje de inhibición del flujo de corriente en presencia de anticuerpo anti-ASIC1 con respecto al flujo de corriente en presencia del anticuerpo de control irrelevante, promediado de múltiples experimentos de bloqueo. Los resultados se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6: Porcentaje de inhibición de corrientes a través de ASIC1 humano inducidas por ácido mediante anticuer os^ anti-ASIC1 a 100 nM
Figure imgf000021_0001
Como se muestra en la Tabla 6, diecisiete de los 23 anticuerpos ensayados a 100 nM en el Q-Patch demostraron inhibición funcional de la corriente a través de ASIC1 humano, mostrando 9 de los 17 anticuerpos un bloqueo mayor del 70 %. Once anticuerpos (H1M6718N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6726N, H4H6366P, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M7118N, h 4h 6718N y H4H6721N2) se ensayaron adicionalmente con respecto a su capacidad de inhibir la corriente a través de ASIC1 humano a diferentes concentraciones en el Q-Patch, y nueve anticuerpos (H4H6718N, H3M6720N, H3M6721N, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P y H3M7118N) se ensayaron con respecto a su capacidad de inhibir la corriente a través de ASIC1 de ratón. El porcentaje de bloqueo observado para estos anticuerpos se resume en la Tabla 7 (ASIC1 humano) y en la Tabla 8 (ASlC1 de ratón).
Tabla 7: Porcentaje de inhibición de corrientes a través de ASIC1 humano inducidas por ácido a diversas concentraciones de anticuer o
Figure imgf000022_0002
Tabla 8: Porcentaje de inhibición de corrientes de ASIC1a de ratón inducidas por ácido a diversas concentraciones de anticuerpo a través de ASIC1 a de ratón inducidas por ácido a diversas concentraciones de anticuer o
Figure imgf000022_0001
continuación
Figure imgf000023_0001
Como se muestra en la Tabla 7, un anticuerpo, H3M6726N, bloqueó la corriente a través de ASIC1 humano con una CI50 aparente mayor de 10 nM, mientras que seis anticuerpos (H3M6720N, H3M6721N, H4H6366P, H3M7102N, H2bM7103N y H3M7118N) bloquearon la corriente a través de ASIC1 humano con una CI50 aparente de 10 nM o menor. Cuatro de los anticuerpos, H1M6718N, H1M7101N, H4H6718N y H4H6721N2, bloquearon la corriente a través de ASIC1 humano con una CI50 aparente menor de 1 nM.
Como se muestra en la Tabla 8, seis de los 10 anticuerpos anti-ASIC1 (H4H6718N, H3M6721N, H4H6721N2, H1M7101N, H3M7102N y H3M7118N) ensayados en células que expresaban ASIC1 de ratón inhibieron del 90 al 100 % de la corriente a través de ASIC1 de ratón a la máxima concentración de anticuerpo ensayada, mientras que cuatro anticuerpos (H3M6720N, H3M6726N, H4H6366P y H2bM7103N) solo inhibieron la corriente aproximadamente en un 80 % o menos. H3M7118N, H2bM7103N, H3M6720N y H3M6721N bloquearon la corriente a través de ASIC1 de ratón con una CI50 aparente menor de 25 nM. H4H6718N bloqueó la corriente a través de ASIC1 humano con una CI50 aparente menor de 1 nM.
El Q-Patch también se usó para determinar la capacidad del anticuerpo anti-ASIC1 H4H6718N para inhibir la corriente de ASIC1 en la línea celular ND7/23 (ECACC, n.° 92090903), que es una línea celular de fusión de neuroblastoma de ratón y ganglio de raíz dorsal de rata que expresa de manera endógena ASIC1 de rata.
Se cultivaron células ND7/23 en medio DMEM de alto contenido de glucosa que contenía un 10 % de FBS, glutamina 2 mM y un 1 % de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, n.° 10378-016). El día después de la siembra, las células ND7/23 se diferenciaron reemplazando el medio de cultivo por medio de bajo contenido de suero (0,5 % de FBS) que contenía dibutiril-AMPc 1 mM (Santa Cruz, # sc-201567A). El día de los registros, las células se recogieron usando reactivo de disociación de células StemPro Accutase (Invitrogen, n.° A11105-01), se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de solución de tampón extracelular. La suspensión celular después se cargó en el Q-Patch.
Las células primero se perfundieron con una solución tampón extracelular a pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCh 1 mM, CaCl22 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, ajustada a pH 7,4 con NaOH) que contenía un 0,2 % (p/v) de albúmina de suero bovino durante 6 minutos para estabilizar el parche. Después se indujo la corriente a través de ASIC1 de rata durante un segundo mediante la adición del tampón extracelular, que se ajustó a pH 6,0, mientras las células se mantenían a un potencial de retención de -80 mV. La corriente a través de ASIC1 de rata se indujo 2 veces en tampón extracelular a pH 6 y después 2 veces más en el mismo tampón extracelular que contenía 10 nM de un anticuerpo de control de isotipo o 10 nM del anticuerpo anti-ASIC1 (H4H6718N, H3M6720N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P y H3M7118N). Después de los registros de anticuerpo anti-ASIC1, se añadió una concentración 10 nM del antagonista selectivo de ASIC1 PcTxl (Alomone Labs, n.° s TP-200) a las células para evaluar la contribución de corrientes específicas de ASIC1 a la corriente inducida por tampón extracelular a pH 6. La composición de la solución de registro intracelular era CsF 120 mM, NaCl 15 mM, EGTA 10 mM y HEPES 10 mM; ajustada a pH 7,3 con CsOH.
El bloqueo de los canales se midió como el porcentaje de inhibición del flujo de corriente en presencia de anticuerpo anti-ASlC1 con respecto al flujo de corriente medido antes de la aplicación del anticuerpo y se comparó con el porcentaje de inhibición del flujo de corriente en presencia de PcTx1, que se usó para definir el máximo bloqueo de corriente específico de ASIC1. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9 : Porcentaje de inhibición de corrientes a través de ASICIa de rata inducidas por ácido en células ___________________ ______________ND7 por anticuerpos anti-ASIC1_________________________________ ibición de
Figure imgf000024_0001
SEM
Figure imgf000024_0002
Como se muestra en la Tabla 9, H4H6718N demostró una inhibición del 100 % de las corrientes a través de ASIC1 de rata en células ND7/23 diferenciadas a una concentración de 10 nM (n = 9) mientras que H3M6720N y H3M7118N inhibieron la corriente aproximadamente en un 43 % y 65 %, respectivamente. Tres anticuerpos (H2bM7103N, H3M6726N y H4H6366P) no demostraron una inhibición significativa de las corrientes a través de ASIC1 de rata a 10 nM en estos experimentos.
Ejemplo 6. Un anticuerpo anti-ASIC1 bloquea las corrientes iónicas de ASIC1 inducidas por ácido en un ensayo automático de pinzamiento de voltaje y pinzamiento de membrana [Port-A-Patch]
Se usó el Port-a-Patch (Nanion Technologies Inc., North Brunswick, NJ), un sistema automático de pinzamiento de membrana basado en microchip, para determinar la concentración inhibidora semimáxima (CI50) del anticuerpo anti-ASIC1 H1M6718N necesaria para inhibir la corriente a través de ASIC1 humano en una línea celular HEK293 transfectada de manera estable que expresa el canal ASIC1 humano de longitud completa (HEK/hASIC1; aminoácidos 1-528 del número de acceso del NCBI NP_001086.2).
Se cultivaron células HEK/hASIC1 en medio DMEM de alto contenido de glucosa, 10% de suero fetal bovino, 1 % de aminoácidos no esenciales y 500 pg/ml de Geneticin® (Invitrogen, n.° 10131). El día de los registros, se recogieron las células con solución de separación de células Detachin (Genlantis, San Diego, CA, n.° T100100), se centrifugaron y se resuspendieron en 500 ul de solución de tampón extracelular (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCb 1 mM, CaCb 2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH 7,4 con NaOH). La suspensión celular después se cargó en el Port-a-Patch.
Las células primero se perfundieron con tampón extracelular a pH 7,4 que contenía un 0,1 % (p/v) de albúmina de suero bovino durante aproximadamente 5 minutos para estabilizar el parche. Después, se indujo la corriente a través de ASIC1 humano durante tres segundos mediante la adición del tampón extracelular ajustado a pH 6,0 mientras que las células se mantenían a un potencial de retención de -80 mV. La corriente a través de ASIC1 humano se indujo 3 veces (separadas por 2 minutos) en tampón extracelular a pH 6,0 y 3 veces en tampón extracelular a pH 6,0 que contenía 100 nM de un anticuerpo de control de isotipo o 10, 3, 1, 0,8 o 0,6 nM del anticuerpo anti-ASIC1 H1M6718n . Se añadió amilorida treinta pM en tampón extracelular a pH 6 después de finalizar las mediciones estimuladas por el pH para demostrar que las células respondían a lo largo de la duración del ensayo. La composición de la solución de registro intracelular era CsF 120 mM, NaCb 15 mM, EGTA 10 mM y HEPES 10 mM; ajustada a pH 7,3 con CsOH.
Se midió el bloqueo del canal como un porcentaje de inhibición del flujo de corriente en presencia de anticuerpo anti-ASIC1 con respecto al flujo de corriente antes de la aplicación del anticuerpo. Esto se promedió a partir de múltiples experimentos de bloqueo.
El porcentaje de bloqueo de la corriente a través de ASIC1 humano por concentraciones 10, 3, 1, 0,8 y 0,6 nM de H1M6718N se resume en la Tabla 10.
Tabla 10: Porcentaje de inhibición de corriente a través de ASIC1 humano por un anticuerpo anti-ASICI a diversas concentraciones
Figure imgf000025_0001
H1M6718N mostró una inhibición dependiente de la dosis de la corriente a través de ASIC1 humano con una CI50 calculada de 860 pM, mientras que el anticuerpo de control de isotipo no mostró inhibición de la corriente a una concentración de 100 nM.
Ejemplo 7. Un anticuerpo anti-ASIC1 reduce las respuestas de dolor visceral en un modelo de ratón
En este ejemplo, se evaluó la capacidad del anticuerpo anti-ASIC1 H1M6718N para atenuar el dolor visceral en un modelo de constricciones abdominales inducidas por ácido acético. En este experimento se usaron ratones C57BL/6 de tipo silvestre de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Cohortes separadas de ratones (n=10) recibieron 10 mg/kg (s.c.) de un mAb de control de isotipo o 1 o 10 mg/kg (s.c.) de H1M6718N. Veinticuatro horas después de dosificar el anticuerpo, todas las cohortes recibieron una inyección intraperitoneal de ácido acético al 0,6 %, que produjo comportamientos estereotipados de estiramiento abdominal (por ejemplo, constricciones) que se contaron por un observador desconocedor de los tratamientos durante hasta 30 minutos después de la inyección. Los resultados de este experimento, expresados en términos del porcentaje de cambio en el número total de constricciones abdominales, se muestran en la Tabla 11 (todos los datos se representan como media ± SEM).
Tabla 11: Efecto de anticuerpo anti-ASIC1 sobre constricciones abdominales inducidas por inyección de ácido acético
Figure imgf000025_0002
Este ejemplo demuestra que el anticuerpo anti-ASIC1 (H1M6718N) que, según se mostró, bloqueaba de manera potente las corrientes iónicas de ASIC1 inducidas por ácido (véanse los Ejemplos 4 a 6), era eficaz en el alivio de las respuestas de dolor visceral inducidas por ácido en un modelo de ratón.
Ejemplo 8. Un anticuerpo anti-ASIC1 produce analgesia ante un estímulo mecánico nocivo en un modelo de ratón
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de un anticuerpo anti-ASIC1 (H1M6718N) para producir analgesia en respuesta a estímulos nocivos de pellizco/presión.
En este experimento se usaron ratones C57BL/6 de tipo silvestre de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Cohortes separadas de ratones recibieron 1, 10 o 40 mg/kg (s.c.) de H1M6718N, o 10 mg/kg (s.c.) de un anticuerpo de control de isotipo. Veinticuatro horas después de la dosificación de anticuerpo, se ensayaron en cohortes separadas (n=10) sus umbrales de nocicepción mecánica, que se midieron por el umbral de retirada ante un pellizco del músculo gastrocnemio o de la cola (Modelo n.° 2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). La nocicepción mecánica en la cola se midió en ratones tratados con 1 mg/kg y 10 mg/kg de H1M6718N además de los tratados con un control de isotipo. La nocicepción mecánica en el músculo gastrocnemio se midió en ratones tratados con 10 mg/kg y 40 mg/kg de H1M6718N además de los tratados con un control de isotipo. Los resultados de estos experimentos, expresados como umbral de retirada ante el pellizco en gramos (media ± SEM para cada cohorte de ratones), se muestran en la Figura 1, paneles A y B.
En ambos experimentos, el tratamiento con H1M6718N produjo un aumento significativo en el umbral de retirada a la máxima dosis de anticuerpo ensayada (10 mg/kg en el experimento de la cola [Figura 1, panel A] y 40 mg/kg en el experimento del músculo gastrocnemio [Figura 1, panel B]) en comparación con el control de isotipo, según se determina por ANOVA (p=0,0015 en el caso de la cola 0,0228 en el caso del músculo gastrocnemio) y por la prueba post-hoc de Bonferonni (* = p<0,05).
Ejemplo 9. Un anticuerpo anti-ASIC1 atenúa el dolor muscular en modelos de ratón
En este ejemplo se evaluó la capacidad de anticuerpos anti-ASIC1 H1M6718N y H4H6721N2 para atenuar el dolor muscular debido a la inyección de solución salina ácida (pH 5,5) o carragenina al 3 %. En estos experimentos se usaron ratones C57BL/6 de tipo silvestre de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al canal iónico 1 sensible a ácidos (ASIC1), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) contenidas en las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera (HCVR y LCVR) respectivamente, en donde,
(a) la HCDR1 comprende la SEQ NO: 36;
(b) la HCDR2 comprende la SEQ NO: 38;
(c) la HCDR3 comprende la SEQ NO: 40;
(d) la LCDR1 comprende la SEQ NO: 44;
(e) la LCDR2 comprende la SEQ NO: 46; y
(f) la LCDR3 comprende la SEQ NO: 48.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde las secuencias de HCVR/LCVR comprenden la SEQ ID NO: 34/42.
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde la HCVR comprende una HCDR1 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35, una HCDR2 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37 y una HCDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39 y/o en donde la LCVR comprende una LCDR1 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43, una LCDR2 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 45 y una LCDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47.
4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33.
5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41.
6. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una célula hospedadora recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.
8. Un método de producción de un anticuerpo anti-ASIC1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento así producido.
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