CN102234316B - 具有增强酸感受离子通道1a电流作用的多肽及其用途 - Google Patents
具有增强酸感受离子通道1a电流作用的多肽及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组与酸感受离子通道1a(ASIC1a)亚基具有特异性结合能力及生物学活性的多肽类分子的序列。使用细胞电生理技术证明，其中一个多肽P13能明显增加胞外pH值下降诱发的ASIC1a同聚体电流。本发明还涉及编码这些多肽的基因序列以及含有多肽的融合蛋白。本发明还涉及这些多肽在制备酸感受离子通道1a靶向治疗药物中的用途以及多肽P13作为酸感受离子通道1a激动剂的用途。这些多肽在探索ASIC1a离子通道的生物学功能、研究ASIC1a相关疾病的病理机制及其治疗方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质学和分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一组能与酸感受离子通道(ASICs)特异性结合并增强ASIC1a同聚体电流的多肽。
背景技术
酸感受离子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是H+门控的阳离子通道，位于细胞膜上，在中枢和外周神经系统中广泛表达。ASICs通道是钠通道ENaC/DEG(epithelial Na+channel/degenerin)家族重要成员之一，虽然它们与家族中其他成员只有20％-25％的同源性，但却具有了家族成员的所有特征。到目前为止，共发现由4个基因编码的6个亚基，它们分别是ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和ASIC4。每个亚基的长度都在500个氨基酸左右。其结构包括两个疏水跨膜区，位于细胞内的羧基端和氨基端，以及胞外作为受体接受H+的刺激信号的一段富含半胱氨酸的长链。ASICs由3个亚基组成，通道位于它们中央。亚基组合形式多种多样，可以是同聚体也可以是异聚体通道(其中ASIC2b和ASIC4不能形成功能性同聚体)。这些由不同亚基组合形成的离子通道，其电生理学、药理学特性和离子选择性各有不同。当胞外组织液pH值下降时，ASICs被激活而开放，细胞外Na+或Ca2+通过其开放的离子通道进入胞内，导致细胞去极化而兴奋。ASICs在外周感觉神经元的生物学功能涉及痛觉、触觉、和酸味觉的形成；而在中枢神经元，其功能则涉及突触可塑性和学习记忆等活动。在病理情况下，如风湿性关节炎、心脑组织缺氧缺血、肌肉劳累、癫痫发作导致局部组织的酸增高或酸中毒时，ASICs开放，不仅形成和传导伤害性感受信息，同时还可加重这些病理因素对相关组织造成的损伤。
酸感受离子通道1a(ASIC1a)主要在中枢的大脑皮层、海马、小脑、上丘脑、脊髓和外周的背根节神经元等部位表达，在外周软骨组织、人类造骨细胞和味蕾细胞中也有表达。亚细胞定位发现，ASIC1a遍及胞体并沿着神经元轴突和树突的分支分布，但在突触小体或突触膜上分布很少。无论在中枢还是外周神经系统，神经活动很活跃的地方以及神经信号高频传导的局部，均为ASIC1a高表达区域。ASIC1a同聚体通道对H+敏感性较高(激活阈值pH为7.0-6.8)，对Na+和Ca2+都有较高的通透性。
近年来，ASIC1a亚基引起了越来越多研究者的注意。研究表明，ASIC1a参与了多种疾病的病例过程。首先，在大脑缺血过程中，由于血液供应不足，引起组织细胞缺氧，导致了组织液的酸化。这种酸化可激活ASIC1a同聚体通道，导致胞内Ca2+超载，进而形成神经元的损伤。在动物模型中，已经证实了该通道的特异性阻断剂狼蛛毒素PcTX1具有缺血性神经保护作用；该基因敲除后也可有效保护酸化所致的神经损伤。其次，该亚基同聚体还与癫痫发作的持续时间密切相关。过表达该基因可有效缩短癫痫的持续时间，传统的CO2疗法也依赖于ASIC1a。第三，该通道还涉及抑郁症病理，其拮抗剂对抑郁症有较好的治疗效果。综上所述，该通道已经成为了多种疾病的靶标分子，针对ASIC1a亚基进行激动剂或拮抗剂的筛选具有重要的意义。
近几十年来，多肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视，涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。多肽类药物的主要特点是用量小、生物活性强，对癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压和某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效和广泛的应用前途。获取特异多肽最经典和最有效的手段是噬菌体肽库展示技术，该技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。利用靶分子采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体。目前已广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物开发等各个方面。这项技术通过“吸附—洗脱—扩增”的亲和筛选过程，可以将展示特异性外源肽的噬菌体从噬菌体肽库筛选出来，经扩增可以得到上千倍乃至108的倍的富集，从而可以很容易地对所筛选的克隆进行序列测定，最终确定表达的外源肽的氨基酸序列。
由于筛选ASIC1a亚基的激动剂或拮抗剂具有重要的实用价值，我们希望利用噬菌体表面肽库能够筛选到新的ASIC1a亚基的激动剂或拮抗剂。
发明内容
本发明的目的是利用噬菌体表面展示技术，以ASIC1a胞外区为靶标，筛选具有激动或抑制其电流的多肽。应用这些多肽，一方面可以开展ASIC1a相关的基础研究，另一方面还可以探索以其为靶标治疗相关疾病的可行性。
为了达到上述目的，本发明通过表达、纯化酸感受离子通道1a胞外区，得到纯化蛋白，然后以该蛋白为靶标，筛选环七肽库和十二肽库，得到了14种与胞外区结合活性较高的多肽，通过与GST融合表达，得到了相应的GST融合表达肽，将GST融合表达肽用GSTrap FF纯化柱进行纯化。通过爪蟾卵母细胞表达系统和体外急性分散培养的新生大鼠海马神经元系统，使用双电极电压钳和全细胞记录技术检测了融合表达肽和合成肽的活性。发现在特异性表达ASIC1a亚基的爪蟾卵母细胞和培养的海马神经元上，单纯使用GST-P13不能诱发出任何电流，但能够使胞外H+诱发的内向电流幅度明显增加，其作用是可逆的。
基于以上技术方案和实验结果，本发明涉及以下几个方面：
本发明的一个方面涉及一种具有酸感受离子通道1a结合活性的多肽，其选自SEQ ID NO：1-10中的至少一种。
序号 氨基酸序列
P1 MPSFNYQ(SEQ ID NO：1)
P2 HSILTTY(SEQ ID NO：2)
P3 PSHRPFM(SEQ ID NO：3)
P6 THHTHEH(SEQ ID NO：4)
P7 HHGSARH(SEQ ID NO：5)
P8 HYQHMHSRLGVH(SEQ ID NO：6)
P9 EGTVEMIWAYSI(SEQ ID NO：7)
P11 HYFSNQA(SEQ ID NO：8)
P13 ISWEIQYKSLPL(SEQ ID NO：9)
P14 AATLYQRPISPM(SEQ ID NO：10)。
根据以上所述的多肽，其为SEQ ID NO：9所示的多肽。
本发明另一方面涉及一种融合肽，其可操作地连接有一个或几个SEQ ID NO：1-10中所示的肽，所述肽可以相同或不相同。
本发明的另一方面涉及一种融合蛋白，其可操作地连接有一个或几个SEQ ID NO：1-10中所示的肽，所述肽可以相同或不相同，以及一种起靶向作用的蛋白或方便纯化的蛋白。
其中，起靶向作用的蛋白是指靶向于特异器官或细胞亚结构的分子，方便纯化的蛋白是指标签如谷胱甘肽S转移酶(GST)和多聚组氨酸(HIS)等。
本发明的另一方面涉及一种DNA或RNA序列，其编码如上所述的多肽或蛋白。
本发明的另一方面涉及一种载体，其含有上述的DNA或RNA序列。
本发明还涉及如上所述多肽或蛋白在制备酸感受离子通道1a靶向治疗药物中的用途。
本发明还涉及SEQ ID NO：9所示的多肽作为酸感受离子通道1a激动剂的用途。
本发明还涉及一种药物组合物，其含有如上所述多肽或蛋白，以及药学上可接受的载体。
发明的有益效果
本发明筛选出的多肽对ASIC1a具有较高的亲和力并且对ASIC1a功能有明显的影响，提示这些多肽对以ASIC1a为靶标的疾病防治具有潜在的应用价值。
附图说明
图1纯化的GST-ASIC1a胞外区SDS-PAGE图(A)及纯度图(B)。1.GST-ASIC1a胞外区；2.蛋白分子量标准(Da)
图2通过ELISA鉴定筛选噬菌体随机肽库得到的GST-ASIC1a胞外区结合噬菌体。
图3结合噬菌体展示的多肽序列。
图4纯化的GST融合多肽的SDS-PAGE图。
图5双电极电压钳实验检测GST-P13对爪蟾卵母细胞中表达的ASIC1a同聚体电流的激动作用。A图表示所记录的电流对阿米洛利(Amiloride)敏感，这与该电流特征相符；同时GST对该电流无明显影响，表明用GST融合多肽测试多肽对电流的影响是可行的。B所示GST-P13对ASIC1a同聚体电流的激动作用。
图6膜片钳实验检测合成P13对大鼠海马神经元ASIC电流的激动作用。当胞外液pH值下降时，可记录到ASIC电流，给予合成的P13后，电流增大，而重新给予低pH值刺激时，电流恢复，表明P13对海马中表达的ASIC电流的增强作用是可逆的。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 ASIC1a胞外区的克隆、表达与纯化
1.材料：GSTrap FF纯化柱购自于Pharmacia Biotech公司；溶菌酶购自于Promega公司；超声破碎仪购自于宁波新芝科技有限公司，高保真Taq酶和内切酶购自TAKARA公司。原核表达载体pGEX-4T2购自于Pharmacia Biotech公司。
2.实验方法
(1)PCR和表达载体的构建
以大鼠全脑总RNA为模板进行扩增。上游引物为：5′-CGCGGATCCACTgAgCgTgTgCAgTACT-3′(SEQ ID NO：11)；下游引物为5′-GCGCTCGAGTCATTCAgCgCTgCAggCCTC-3′(SEQ ID NO：12)，PCR扩增程序为：95℃，5分钟；以94℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃，1分钟，进行35个循环。将得到的PCR产物纯化，然后和pGEX-4T2同时用XhoI和BamHI酶切，连接后转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。对转化子进行酶切鉴定和测序。
(2)表达菌株的培养与目标蛋白的诱导表达
取上述构建好的载体菌株20μl接种于LB培养基中，37℃空气摇床培养过夜，次日按5％(体积百分比)的比例转种于LB培养基，37℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导4-5个小时，收获细菌。
(3)ASIC1a胞外区蛋白的纯化
将上述收获的细菌离心后弃去上清，将菌体进行超声破碎，将超声处理后的菌液于4℃，12,000r/min离10min。SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式，证明目的蛋白以可溶性形式存在，分子量约为38kD。将离心上清用GSTrap FF亲和纯化柱进行纯化。首先将样品结合于纯化柱，然后用10倍体积的PBS洗去非特异结合的杂蛋白，用10mmol/L还原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制，pH8.0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE检测纯化效果，并进行了纯度测定(图1)。结果表明获得了与预期分子量相符并且纯度较高的靶标蛋白。
实施例2 ASIC1a胞外区结合肽的筛选
1.材料：噬菌体随机环七肽库和十二肽库均购自New EnglandBiolab。
2.实验方法
在得到实施例1中纯化的ASIC1a胞外区蛋白的基础上，以其为靶标从噬菌体随机环七肽库和十二肽库中，分别经过三轮筛选得到了特异的与ASIC1a胞外区蛋白结合的肽(筛选方法参照随机肽库说明书)。利用ELISA对筛选得到的结合肽噬菌体进行鉴定。具体方法为，用浓度为50μg/ml的GST-ASIC1a胞外区融合蛋白和50g/ml的GST蛋白100μl 4℃包被酶联板过夜，每个孔设平行对照。10％奶粉37℃封闭1h；然后每孔各加100μl(约1011 pfu/ml)单克隆噬菌体上清，37℃作用1h；每孔加1∶5000倍稀释的HRP-抗M13二抗100μl，37℃反应1h；加入100μl TMB显色液显色，反应10min后加50μl 2M的H2SO4终止反应，测OD(450nm)值。由图2可以看出，有10个噬菌体克隆表现出了对靶标融合蛋白较高的亲和力，与阴性对照(标签蛋白GST)的亲和力差异显著，表明它们与ASIC1a胞外区结合而不是与标签蛋白GST结合。
通过DNA序列分析，推断出相应的结合肽氨基酸序列，共得到了10种ASIC1a胞外区结合肽(图3)。
实施例3 GST-多肽融合蛋白的表达和纯化
为了探讨筛选到的ASIC1a胞外区结合肽能否具有调控ASIC1a电流的活性，将多肽(ASIC1a胞外区结合肽)分子分别与GST融合表达并纯化。
1.材料：GSTrap FF纯化柱购自于Pharmacia Biotech公司；溶菌酶购自于Promega公司；超声破碎仪购自于宁波新芝科技有限公司。原核表达载体pGEX-4T2购自于Pharmacia Biotech公司。
2.实验方法：
(1)GST-多肽融合蛋白重组质粒的构建
为了不影响结合肽本身的结构，在合成结合肽编码序列时引入了三个甘氨酸和一个丝氨酸密码子，并在此序列的两端加上了BamH I和Xho I酶切位点。将合成的多肽基因片段的两互补序列分别溶于灭菌的去离子水中，使其终浓度为1μg/μl，各取5μl，加入40μl灭菌去离子水中，终体积为50μl，混匀后放入95℃水浴中5分钟，然后缓慢降至室温使两互补片段退火。将经BamH I和Xho I酶切回收的pGEX-4T2载体片段与上述退火的结合多肽基因片段按1∶5的摩尔比连接，并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑单克隆测序。
(2)GST-多肽融合蛋白的表达与纯化
将上述经测序鉴定正确的重组菌菌液按1∶100接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.5，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG诱导表达3小时，离心后，弃去上清，将菌体进行超声破碎，将超声处理后的菌液于4℃，12,000r/min离心10min。
将离心上清用GSTrap FF亲和纯化柱进行纯化。首先将样品结合于纯化柱，然后用10倍体积的PBS洗去非特异结合的杂蛋白，用10mmol/L还原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制，pH8.0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE检测纯化效果(图4)，表明已得到GST-多肽融合蛋白。
实施例4 GST-融合多肽对ASIC1a电流的影响
为了进一步探索这些GST-融合多肽对ASIC1a电流的影响，需要将转录好的ASIC1a cRNA注射入爪蟾卵母细胞，记录电流，观察多肽对电流产生的效应。
1.材料：反转录试剂盒Reverse Transcription System A3500购自Promega公司；成熟雌性非洲爪蟾购自中国科学院；双电极电压钳装置(放大器、示波器、AD转换板、两电极探头)购自美国AxonInstrument；胶原酶(type1A)购自SIGMA公司；微电极拉制仪(pp-830型)购自日本Narishige公司。pcDNA3.1载体购自Invitrogen公司。
2.实验方法
(1)ASIC1a表达载体pcDNA3.1-rASIC1a的构建
以大鼠全脑总RNA为模板进行扩增。所用引物为上游：5’-CggATCCATggAATTgAAgACCgAggA-3′(SEQ ID NO：13)和下游：5’-CgATATCTgCAggTAAAgTCCTCAAACg-3′(SEQ ID NO：14)，PCR程序为：95℃，5分钟；以94℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃，2分钟，进行35个循环。将得到的PCR产物纯化，然后和pcDNA 3.1同时用EcoRV和BamHI酶切，连接后转化，对转化子进行酶切鉴定和测序，即获得ASIC1a表达载体pcDNA3.1-rASIC1a。
(2)目标基因的体外转录
按照反转录试剂盒Reverse Transcription System的要求，首先将上述获得的pcDNA3.1-rASIC1a线性化，按试剂盒所述体系将cDNA体外转录成cRNA，然后纯化cRNA，测浓度备用。
(3)爪蟾卵母细胞的注射
手术器械在75％乙醇溶液中浸泡30分钟，取出晾干，沸水中消毒5-0丝线10分钟；将爪蟾掩埋于碎冰下40分钟使其麻醉；把已麻醉的爪蟾腹部向上放置于碎冰托盘上，用碎冰掩埋其头部和四肢；酒精棉球消毒下腹部皮肤，然后用针头挑起下腹部皮肤，用眼科剪剪开一个1cm左右小口，再剪开肌肉层；小心取出1cm3左右的卵巢小叶，放入OR-2溶液(NaCl 82mM；KCl 2.5mM；MgCl2 1.0mM；HEPES 5.0mM，pH7.6)中，分别缝合肌肉层和皮肤层。用干净的移液管将卵母细胞转入无菌的玻璃离心管中，反复用OR-2溶液清洗，去除残留血液，然后加入胶原酶溶液振摇1小时，再更换新的胶原酶溶液继续振摇1小时；除去消化液，用OR-2溶液清洗5～6次，转入盛有ND-96溶液(NaCl 96mM；KCl 2.0mM；CaCl2 1.8mM；MgCl2 1.0mM；HEPES 5.0mM；Na-pyrnvate 2.0mM，pH7.6)的培养皿中，在显微镜下观察并挑选出外型较圆、色泽清晰、有一定张力、细胞表面光滑、无残留纤维组织及毛细血管的V、VI期成熟卵母细胞，将挑选出的好的细胞放入盛有ND-96溶液的培养皿中，置于生化培养箱中18～22℃保存备用。
将专用注射针用两步法电极拉制仪拉制好后，在干净的薄面巾纸上刺一下，使针尖的口径变粗，并在抛光仪上抛光，使得针尖光滑平整。根据上述所得原始cRNA的浓度，调整注射浓度大约为2ng/nl。取1μl混合好的cRNA小心滴在干净的parafilm上，用微量注射仪将cRNA吸入到注射用针中。将挑选好的健康的V、VI期成熟卵母细胞置入底部粘有网格的培养皿中。仔细调节三维微操纵仪，使针尖接触细胞表面。将50nl cRNA注射入卵母细胞，注射后细胞会轻微鼓胀。注射好的卵母细胞置于ND-96溶液中，在生化培养箱(20℃左右)培养48h后，可记录表达电流。
(3)GST-融合多肽对ASIC1a电流的影响
卵母细胞置于容积约1ml的记录槽中，各种不同细胞外液持续灌流的速度为3ml/min。使用微电极拉制仪拉制玻璃微电极，灌充3mol/LKCl溶液，电阻为0.5～5MΩ。将拉制好的两根玻璃微电极分别插入到放大器的探头上。使用微操动仪分别将两只电极放入记录槽中，当电极尖端进入液面后，将放大器面板上的mV、V2调节至零电位，同时测量电极的电阻是否满足实验需要。采样软件为pClamp7.0(AxonInstruments公司产品)。所有实验在室温(21～23℃)下进行。GST-融合多肽及GST的工作浓度为5μM，其中GST为阴性对照。由图5A可以看出，当胞外液pH值下降时，可记录ASIC1a电流，该电流对阿米洛利敏感，符合文献报道中的电流特性，融合多肽GST-P13对ASIC1a电流有增强作用(n＝3，图5B)，而单独的标签蛋白GST则对电流没有影响。
实验结果表明，在筛选得到的十个多肽中，多肽P13具有增强H+诱发ASIC1a同聚体电流激动活性的作用。
实施例5多肽P13对海马神经元ASIC电流的影响
为进一步求证P13对ASIC1a的作用，本实验选择海马神经元作为模型。根据文献报告，海马神经元中酸感受离子通道电流中ASIC1a同聚体所占比例较大。另外，为去除其它因素的干扰，本实验所用的多肽为公司合成的纯品。
1.材料：Wistar大鼠(出生12h以内)，二级，由军事医学科学院动物中心提供。L-多聚赖氨酸和阿糖胞苷购自Sigma公司。N-2添加剂和B-27添加剂购自Gibcol。放大器(Axopatch 1-D)、AD转换板(1200series)和电极探头(CV-4)均购自美国Axon公司。微操纵仪(Mo-203)购自日本Narishige公司。P13多肽由赛百盛公司合成。
2.实验方法
(1)大鼠海马神经元培养
取当天新生Wistar大鼠，用75％乙醇消毒。在无菌条件下取脑，剥离出海马置于冰浴的解剖液(葡萄糖3.0g，蔗糖7.5g，NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 0.03g，青链霉素个10万单位，用含9.0mM HEPES的缓冲液溶解，加水到1000ml，调pH值为7.3。用0.2μm的微孔滤膜过滤，4℃保存备用)中。将海马剪成1-2mm3的组织块，用含0.25％(质量/体积百分比)胰蛋白酶的解剖液在37℃下消化30min，然后将消化好的组织块移入种植液(DMEM培养基79％，马血清10％，胎牛血清10％，谷氨酰胺储备液1％，青链霉素100单位/ml，使用前2h配制，放在37℃10％CO2培养箱中备用)中终止消化，在种植液中用适当口径(尖端直径2mm)的滴管吹打细胞，使之均匀分散，制成细胞悬液，取少量悬液以台盼蓝染液记数细胞。加入适量种植液，将细胞按1×105/ml的密度接种在涂有多聚赖氨酸的35mm培养皿中，置于36℃10％的二氧化碳培养箱中过夜，24h后更换培养基，将种植液换为2ml饲养液(DMEM培养基约86％，马血清10％，N-2 1％，B-27 2％，谷氨酰胺储备液1％，青链霉素100单位/ml，使用前2h配制，放在37℃、10％CO2培养箱中备用)。以后每3天半量换液一次，培养细胞在12-15天期间用于膜片钳实验。为抑制非神经元过度增殖，在培养的第3天向培养基中加入适量阿糖胞苷。
(2)膜片钳方式记录ASIC电流
将培养好的海马细胞加入1.5-2.0ml细胞外液(NaCl 150mM，KCl5mM，MgCl2 2mM，CaCl2 2mM，葡萄糖10mM，HEPES 10mM，pH7.45，CNQX20mM，犬尿烯酸10mM)。在倒置相差显微镜下，通过微操纵仪将充满电极内液的记录电极轻轻压向细胞表面，并通过示波器和放大器的声音监控装置监测电极电阻的变化。通过记录电极内部施加10-30cmH2O负压，使电极和细胞表面形成紧密封接。调节放大器进行电容补偿，建立细胞贴附式记录，在此基础上继续施加负压或用1.5V 5-10ms的短时脉冲击破细胞膜，即形成全细胞记录。在给予酸性细胞外液(pH6.0)后，可记录到ASIC电流，在酸性胞外液中加入浓度为10μM的P13多肽，发现该多肽对海马神经元本身的ASIC电流也有刺激作用(n＝3)，当换回酸性胞外液时，可见电流恢复，表明这种增强作用是可逆的，见图6。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
<120>具有增强酸感受离子通道1a电流作用的多肽及其用途
<130>IDC100020
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Pro Ser Phe Asn Tyr Gln
1 5
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
His Ser Iie Leu Thr Thr Tyr
1 5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Pro Ser His Arg Pro Phe Met
1 5
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Thr His His Thr His Glu His
1 5
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
His His Gly Ser Ala Arg His
1 5
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
His Tyr Gln His Met His Ser Arg Leu Gly Val His
1 5 10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Glu Gly Thr Val Glu Met Ile Trp Ala Tyr Ser Ile
1 5 10
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
His Tyr Phe Ser Asn Gln Ala
1 5
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Ile Ser Trp Glu Ile Gln Tyr Lys Ser Leu Pro Leu
1 5 10
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Ala Ala Thr Leu Tyr Gln Arg Pro Ile Ser Pro Met
1 5 10
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cgcggatcca ctgagcgtgt gcagtact 28
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gcgctcgagt cattcagcgc tgcaggcctc 30
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
cggatccatg gaattgaaga ccgagga 27
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cgatatctgc aggtaaagtc ctcaaacg 28
Claims (7)
1.一种具有酸感受离子通道1a结合活性的多肽，其为SEQ ID NO：9所示的多肽。
2.一种融合蛋白，其由SEQ ID NO：9所示的肽，以及一种起靶向作用的蛋白或方便纯化的蛋白组成。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中起靶向作用的蛋白是指靶向于特异器官或细胞亚结构的分子，方便纯化的蛋白是指谷胱甘肽S转移酶和多聚组氨酸。
4.一种DNA或RNA序列，其编码权利要求1-3所述的多肽或蛋白。
5.一种载体，其含有权利要求4中所述的DNA或RNA序列。
6.权利要求1-3中所述多肽或蛋白在制备酸感受离子通道1a靶向治疗药物中的用途。
7.一种药物组合物，其含有权利要求1-3中所述多肽或蛋白，以及药学上可接受的载体。
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