ES2524564T3 - Identificación de nuevas toxinas antagonistas de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica - Google Patents
Identificación de nuevas toxinas antagonistas de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica Download PDFInfo
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Abstract
Péptido de secuencia aminoacídica YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
Description
Identificación de nuevas toxinas antagonistas de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a una toxina antagonista de canales de calcio de tipo T ("canales de tipo T"). En particular, se refiere a un péptido compuesto por un péptido, a ácidos nucleicos que codifican este péptido y al uso de dicho péptido como antagonista y/o agonista inverso de canales de calcio de tipo T. La presente invención se refiere igualmente al uso de este péptido para la fabricación de un medicamento.
Encuentra aplicación especialmente en el tratamiento del dolor, en patologías cardiovasculares, en el tratamiento de la disfunción eréctil y potencialmente en el tratamiento de cánceres.
En la descripción siguiente, las referencias indicadas como " Ref. " remiten a la lista de referencias presentadas después de los ejemplos.
Estado de la técnica
La toma en consideración y el tratamiento del dolor son esenciales para la calidad de vida. El dolor afecta a un número significativo de personas. En Europa, se estima que 60 millones de personas están afectadas cada año por el dolor, lo que representa un coste anual de 1.000 millones de dólares en medicamentos para su tratamiento. Los gastos efectuados anualmente en medicamentos analgésicos pueden evaluarse en aproximadamente 25.000 millones de dólares y deberían alcanzar los 42.000 millones en 2010. El dolor se divide en dos categorías: el dolor agudo y el dolor crónico. El dolor agudo corresponde a un dolor rápido y breve, limitado en el tiempo, en contraposición con el dolor crónico, que es un dolor persistente y que puede estar ligado, por ejemplo, a una hiperalgesia.
Se han efectuado numerosos estudios referentes a la identificación de los mecanismos que permiten la transmisión del dolor. La transmisión de la señal de dolor por el sistema nervioso hace intervenir a receptores neuronales que transforman el estímulo doloroso en una señal eléctrica. Esta se transmitirá entonces al sistema nervioso central por los nervios, haciendo intervenir a receptores moleculares específicos.
Entre las diversas neuronas sensoriales, se pueden citar las neuronas nociceptivas, que reaccionan específicamente a los estímulos dolorosos.
A causa de su especificidad, las neuronas nociceptivas poseen un repertorio único de canales iónicos, que son proteínas responsables de la excitabilidad celular, y que representan una clase importante de dianas de medicamentos. Así, los canales iónicos expresados específicamente en las neuronas nociceptivas representan también dianas para el descubrimiento de nuevos analgésicos.
Las moléculas que inhiben el dolor, o analgésicos, son conocidas desde hace mucho tiempo. Se pueden citar, por ejemplo, la clase de los opiáceos, que actúan sobre la señalización de la señal de dolor y estimulan las vías nerviosas inhibidoras del dolor. Se usan otras moléculas para tratar los dolores crónicos. Son, por ejemplo, moléculas que actúan sobre los receptores de GABA como badofeno, diazepám, tizanidina y dartroleno.
Las moléculas analgésicas usadas actualmente presentan varios inconvenientes. Es bien conocido que los derivados de los opioides pueden provocar fenómenos alucinatorios y depresiones cardiorrespiratorias. Son igualmente fuente de dependencias, como por ejemplo dependencia de morfina, metadona, etc. Por último, el tratamiento con opiáceos está asociado a efectos indeseables como un estreñimiento grave.
Existen igualmente casos de habituación de estos medicamentos, es decir, que deba aumentarse la dosis necesaria para obtener un efecto constante. Esta habituación crece con el tiempo y conlleva por tanto la necesidad de aumentar las dosis y puede conllevar la ineficacia del medicamento. Efectivamente, la cantidad necesaria puede volverse superior a la dosis tóxica de dicho medicamento.
Por ejemplo, en el caso de dolores neuropáticos, que pueden aparecer en casos de diabetes, cáncer, tratamientos quimioterapéuticos, dolores inflamatorios crónicos, casos de síndrome del colon irritable, etc., el tratamiento del dolor con analgésicos y antálgicos conocidos induce frecuentemente un fenómeno de habituación y por tanto problemas de tratamiento de estos dolores.
Existe por tanto una necesidad real de encontrar nuevas moléculas analgésicas o antálgicas que palien estos defectos, inconvenientes y obstáculos de la técnica anterior con el fin de reducir los costes y mejorar el tratamiento del dolor y el bienestar de los pacientes.
Exposición de la invención
Los inventores han mostrado mediante experimentos de inhibición de la expresión del gen Cacna1h, que codifica el canal de calcio de tipo T Cav3.2 presente en los nocirreceptores, que dicho canal está implicado en la percepción del dolor.
Los canales Cav3.2 forman parte de la familia de los canales de calcio de "umbrales bajos" o "de tipo T" y se expresan en neuronas nociceptivas
Al usar un enfoque de represión génica por inyección intratecal de ADN anticodificante en rata, como se describe en Bourinet, E., et al., "Silencing of the CaV3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception". Embo J., 2005. 24(2) : pág. 315-24 (Ref 1), los inventores han demostrado que la disminución de los canales de calcio Cav3.2 en neuronas nociceptivas de animales sanos o en estado de neuropatía conlleva una analgesia espectacular. En consecuencia, los canales de calcio de tipo T representan una diana potencial para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos del tratamiento del dolor.
Por otro lado, se ha demostrado que los canales de calcio Cav3.2 están implicados en la proliferación celular (Taylor, J.T., Zeng, X.B., Pottle, J.E., Lee, K., Wang, A.R., Yi, S.G., Scruggs, J.A., Sikka, S.S. y Li, M. (2008) "Calcium signaling and T-type calcium channels in cancer cell cycling". World J. Gastroenterol., 14, 4984-4991 (Ref 8)) y en la regulación de la tensión sanguínea (Chen, C.C., Lamping, K.G., Nuno, D.W., Barresi, R., Prouty, S.J., Lavoie, J.L., Cribbs, L.L., England, S.K., Sigmund, C.D., Weiss, R.M., Williamson, R.A., Hill, J.A. y Campbell, K.P. (2003) "Abnormal coronary function in mice deficient in alpha1H T-type Ca2+ channels". Science, 302, 1416-1418. (Ref 9)). Los canales de calcio de tipo T representan una diana potencial para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos del tratamiento del de hipertensión y cánceres, por ejemplo cánceres ligados a una proliferación anárquica de las células cancerosas.
Puede tratarse de cánceres de diversos órganos, por ejemplo:
cáncer de próstata (véase Gackière F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, Dewailly E, Bavencoffe A, Van Chuoï-Mariot MT, Mauroy B, Prevarskaya N, Mariot P.(2008) "CaV3.2 T-type calcium channels are involved in calcium-dependent secretion of neuroendocrine prostate cancer cells". J. Biol. Chem., 283(15): 10162-73 (Ref 16),
glioma (véase Panner A, Cribbs LL, Zainelli GM, Origitano TC, Singh S, Wurster RD. (2005) "Variation of Ttype calcium channel protein expression affects cell division of cultured tumor cells". Cell Calcium, 37(2): 105-19 (Ref 11)),
carcinoma de esófago (véase Lu F, Chen H, Zhou C, Liu S, Guo M, Chen P, Zhuang H, Xie D, Wu S. (2008) "T-type Ca2+ channel expression in human esophageal carcinomas: a functional role in proliferation" Cell Calcium. 43(1): 49-58 (Ref 12))
cáncer de mama (véase Taylor JT, Huang L, Pottle JE, Liu K, Yang Y, Zeng X, Keyser BM, Agrawal KC, Hansen JB, Li M (2008) "Selective blockade of T-type Ca2+ channels suppresses human breast cancer cell proliferation". Cancer Lett., 18; 267(1): 116-24 (Ref 13).
En particular, es el objeto de la presente patente un enfoque farmacológico que usa antagonistas selectivos del canal Cav3.2 de tipo T.
La invención responde precisamente a la necesidad de encontrar nuevas moléculas analgésicas o antálgicas que proporcionen una nueva molécula capaz de inhibir especialmente una señal de dolor, más particularmente una molécula capaz de inhibir los receptores responsables de esta señal. Esta molécula es un péptido de secuencia: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
Se entiende por "derivado" que estos "fragmentos" o "derivados" son aquellos que conservan las propiedades del péptido de la presente invención. Puede considerarse igualmente que los derivados o fragmentos son análogos del péptido de la presente invención.
Por ejemplo, un derivado puede ser el péptido de secuencia ID NO1 con modificaciones en al menos uno de los aminoácidos. Las modificaciones son, por ejemplo, las siguientes:
-
- reemplazo de al menos un aminoácido por otro de la misma familia (aromática, hidrófoba, básica, etc.);
-
- reemplazo de un aminoácido natural (aminoácido L) por el mismo aminoácido en forma D;
-
- reemplazo de un enlace peptídico entre dos aminoácidos por un enlace seudopeptídico.
-
- modificación independiente de los extremos N y C terminales del péptido.
Estos derivados podrán comprender aminoácidos naturales, aminoácidos modificados, por ejemplo selenocisteínas, aminoácidos no naturales y/o modificaciones de la estructura del péptido como ciclaciones.
Los derivados pueden comprender igualmente, por ejemplo, péptidos modificados con vistas a un marcaje por agentes como biotina, agrupamientos fluoróforos o un isótopo radiactivo.
Las modificaciones de los extremos N o C terminales pueden ser, por ejemplo, isoprenilación, glipiación, miristoilación o palmitoilación. El extremo C terminal puede modificarse igualmente, por ejemplo, por amidación, que conduce a la formación de una función amida en el extremo C terminal. Se presentan ejemplos de modificaciones postraduccionales encontradas en péptidos en Han KK, Martinage A (1992) "Post-translational chemical modification(s) of proteins". Int. J. Biochem. 24(1): 19-28 y Walsh G, Jefferis R (2006) "Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins", Nature Biotechnology - 24, 1241-1252 (Ref 17)). Estas modificaciones son modificaciones que pueden encontrarse en toxinas de insectos (véase, por ejemplo, Escoubas
P. (2006) "Molecular diversification in spider venoms: a web of combinatorial peptide libraries". Mol Divers. 10(4): 545-54 (Ref 18)).
En la descripción siguiente, se entiende por péptido de secuencia ID NO 1 la secuencia peptídica ID NO 1 o una secuencia derivada de la misma.
La invención responde igualmente a la necesidad de encontrar nuevas moléculas antihipertensivas al proporcionar una nueva molécula especialmente capaz de disminuir la presión arterial.
La invención responde igualmente a la necesidad de encontrar nuevas moléculas para el tratamiento del cáncer al proporcionar una nueva molécula especialmente capaz de inhibir la proliferación celular.
La nueva molécula de la presente invención es un péptido. Este péptido se ha aislado por primera vez por los inventores a partir del veneno de una araña del género Paraphysa (Psp3) (Araneae: Theraphosidae).
También, la presente invención se refiere igualmente a cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
El ácido nucleico de la presente invención puede ser cualquier secuencia que codifica el péptido de secuencia SEQ ID NO 1, teniendo en cuenta la degeneración del código genético. Por ejemplo, puede tratarse de ácidos nucleicos de las secuencias siguientes:
en las que A es adenosina, C es citidina, G es guanosina, T es timidina y H es A o C o T, M es A o C, N es A o C o G o T, R es A o G, S es C o G, W es A o T e Y es C o T:
La invención se refiere igualmente a un sistema de expresión que comprende un plásmido y/o un vector de expresión que codifica el péptido de SEQ ID NO 1.
En la presente, el sistema de expresión puede comprender al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
Se entiende por "vector de expresión" en la presente una secuencia de ácidos nucleicos en la que es posible insertar uno o varios fragmentos de ácidos nucleicos que se desea expresar en un hospedador. El vector de expresión puede constar de elementos que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en el hospedador. Por ejemplo, el vector puede comprender una secuencia promotora o una secuencia que codifica un péptido señal. Los vectores pueden ser cualquier vector conocido por el especialista en la materia.
Por ejemplo, los vectores de expresión pueden elegirse del grupo que comprende plásmidos, virus, vectores bacterianos, cromosomas artificiales de levadura (YAC) y cromosomas artificiales de bacterias (BAC). Los vectores de expresión pueden ser igualmente vectores de sobreexpresión de proteínas recombinantes con o sin fusión con una proteína soluble como, por ejemplo, GST o tiorredoxina o cualquier otra proteína de fusión conocida por el especialista en la materia.
Por ejemplo, los vectores utilizables en la presente invención pueden elegirse especialmente del grupo que comprende el plásmido pT7-7 (SEQ ID NO 4, Figura 5), un plásmido de la serie pGEX (SEQ ID NO 5, Figura 6),
comercializado por ejemplo por la compañía Pharmacia, o un plásmido de la serie pET32 (SEQ ID NO 6, Figura 7), comercializado por ejemplo por la compañía Novagen.
Se describe un hospedador que comprende un vector de expresión del péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO1) .
En la presente, se entiende por "hospedador" cualquier célula que pueda transformarse con un vector de expresión o modificarse genéticamente con el fin de producir el péptido de la invención.
La transformación de dicho "hospedador" puede realizarse, por ejemplo, mediante electroporación o cualquier otro método conocido por el especialista en la materia. La secuencia que codifica el péptido de secuencia ID NO 1 usado en la transformación puede ser libre o incorporarse a uno de los vectores anteriormente citados. Después de la introducción, puede incorporarse dicha secuencia de ácidos nucleicos al genoma del hospedador mediante recombinación genética, permanecer en forma libre en el hospedador y/o permanecer en el vector, siendo reconocida a continuación dicha secuencia de ácidos nucleicos por las proteínas y/o enzimas del hospedador y expresándose por el mismo.
El hospedador puede elegirse del grupo que comprende células eucarióticas o procarióticas, por ejemplo bacterias como Escherichia coli, levaduras como Pichia pastoris, células de insectos como células de Drosophila o Spodoptera, células de mamíferos y cualquier otra célula conocida por el especialista en la materia que permita la producción de péptidos y/o de proteínas a partir de vectores de expresión.
Las células procarióticas o eucarióticas pueden permitir, de preferencia, la sobreexpresión del péptido que codifica el vector. Así, es utilizable cualquier célula hospedadora capaz de expresar un vector de expresión del péptido de la invención, por ejemplo, Escherichia coli.
Preferiblemente, las células eucarióticas o procarióticas elegidas son aquellas que permiten la sobreexpresión del péptido de la invención. Por ejemplo, se trata de células Sf9 de Spodoptera, de células S2 de Drosophile, de levaduras de tipo Pichia pastoris o de bacterias Escherichia coli.
Los inventores muestran en los ejemplos siguientes que el péptido de secuencia SEQ ID NO 1 es un antagonista o un antagonista parcial de los canales de tipo T.
También la presente invención se refiere igualmente al péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) como antagonista de un canal de calcio de tipo T.
También la presente invención se refiere igualmente al péptido que es antagonista de un canal de calcio de tipo T de secuencia de aminoácidos: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO:1).
Se entiende por "antagonista" un agente, por ejemplo una molécula química, una proteína, un péptido, etc., que interacciona con un sitio receptor sobre un canal y que impide funcionar dicho canal.
El antagonista puede disminuir eficazmente el efecto farmacológico del agonista, se trata entonces de un "antagonista parcial".
La invención tiene igualmente como objeto el uso del péptido de secuencia SEQ ID NO 1 como agonista inverso de un canal de tipo T. Se entiende por "agonista inverso" un agente, por ejemplo una molécula química, una proteína, etc., que interacciona con el mismo receptor que un agonista de este receptor pero que produce el efecto farmacológico opuesto.
En otros términos, el antagonista, antagonista parcial o agonista inverso puede ser una sustancia que se fija sobre los mismos receptores celulares al nivel de sitios idénticos o diferentes de una sustancia de referencia, impidiéndola producir todos o parte de sus efectos habituales o produciendo el efecto inverso.
En la presente, se entiende por "canales de calcio de tipo T" los canales de calcio de bajo umbral de activación, es decir, que tienen un potencial de activación comprendido entre -80 y -20 mV, de preferencia entre -70 y -50 mV
Por ejemplo, los canales de calcio de tipo T pueden ser canales de calcio generados por las subunidades Cav3.1, Cav3.2, Cav3.3 y todas sus variantes de corte y empalme en asociación con sus subunidades reguladoras o no.
Preferiblemente, el péptido se usa como antagonista y/o agonista inverso de los canales de calcio de tipo T.
Aún más preferiblemente, el péptido es un antagonista y/o agonista inverso de los canales de calcio Cav3.2 y/o de los canales de calcio Cav3.1 y/o Cav3.3.
La presente invención se refiere igualmente al péptido antagonista de un canal de calcio de tipo T de secuencia de aminoácidos: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO:1), siendo dicho canal un canal elegido del grupo que comprende el canal Cav3.2 y el canal Cav3.1.
La invención tiene igualmente como objeto el uso del péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) y/o de un ácido nucleico que codifica el péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) para la fabricación de un medicamento. Este medicamento puede ser para uso humano o veterinario.
En la presente, el péptido puede estar asociado a cualquier soporte farmacológicamente aceptable con el fin, por ejemplo, de mejorar su biodisponibilidad, su solubilidad, su estabilidad en solución y/o la fabricación del medicamento.
La presente invención se refiere igualmente al péptido de secuencia de aminoácidos: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO:1), para su uso como medicamento.
La presente invención se refiere igualmente al péptido de secuencia de aminoácidos: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO:1), para su uso en el tratamiento del dolor.
La presente invención se refiere igualmente al péptido de secuencia de aminoácidos: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO:1), para su uso como medicamento analgésico.
En la presente, se entiende por "soporte farmacéuticamente aceptable" cualquier compuesto conocido por el especialista en la materia por usarse en medicamentos. Puede tratarse, por ejemplo, de los compuestos citados en la obra "Pharmacie galénique" de A. LEHIR (Ed. Masson, 1992 (6ª edición)) (Ref 7).
En la presente, se entiende por "asociación" un enlace covalente con el soporte, un enlace por interacciones iónicas
o la presencia de una solución del soporte y del péptido de la invención.
El medicamento que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO 1 puede formularse de cualquier forma que permita su administración a un paciente o animal. Puede tratarse, por ejemplo, de una formulación que permita una administración por vía oral, intravenosa, peridural, cutánea o transdérmica.
En la presente, se entiende por "formulación" una formulación inyectable (por ejemplo, como por Octaplex (marca registrada) o Synergon (marca registrada)), una formulación oral, por ejemplo un jarabe, un polvo (por ejemplo, como por Octaplex (marca registrada)), gránulos, un comprimido (como, por ejemplo, por Estima (marca registrada), un comprimido con película (como por ejemplo por Provames (marca registrada)), una cápsula, un pulverizador, una formulación local como por ejemplo una crema (como por ejemplo por la crema Trophicrème (marca registrada)), una loción, un gel, una formulación ocular, por ejemplo un colirio, una formulación para inyección intravenosa, una formulación inyectable por dispositivos de autoinyección de tipo lápiz de insulina, un parche transdérmico, comprimidos disponibles orales, una formulación para ingestión sublingual o una formulación para inyección peridural.
Por ejemplo, puede tratarse igualmente de las diferentes composiciones farmacéuticas descritas en la obra "Pharmacie galénique" de A. LEHIR (Ed. Masson, 1992 (6ª edición)) (Ref 7).
El medicamento puede administrarse, por ejemplo, en forma de cápsulas, comprimidos, parches, soluciones inyectables, supositorios y/o polvos.
La concentración del péptido de la invención en el medicamento y/o el producto veterinario puede ser cualquier concentración eficaz desde el punto de vista farmacéutico y aceptable por el paciente o animal tratado, incluyendo por ejemplo entre 1 nM y 1000 nM.
El medicamento que comprende el péptido de la invención se administra de preferencia con el fin de obtener una concentración intravenosa que permita un efecto biológico. Esta concentración plasmática eficaz puede determinarse igualmente, por ejemplo, según el tiempo de semivida del péptido de la invención después de su inyección por vía intravenosa en un mamífero y por medida de su concentración por espectrometría de masas. El tiempo de semivida corresponde al tiempo necesario para que la concentración de dicho medicamento sea igual a la mitad de la concentración inicial.
El medicamento y/o el producto veterinario que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO 1 puede acondicionarse para una administración de una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cada dos días, cada tres días o una vez por semana.
El modo de administración y la cantidad administrada pueden adaptarse a cada individuo y pueden determinarse por el facultativo, especialmente en función de las características fisiológicas del individuo tratado.
En la presente, el medicamento puede ser un producto para el tratamiento de dolor, migraña, epilepsia, enfermedad de Parkinson, disritmias talámicas, trastornos del sueño y la vigilia, trastornos bipolares, patologías cardiovasculares (hipertrofia cardiaca, hipertensión), patologías ligadas a la liberación de aldosterona, disfunciones eréctiles y patologías cancerosas.
De preferencia, el medicamento de la presente invención es un producto para el tratamiento del dolor, por ejemplo un antálgico, un analgésico o un antialodínico.
Preferiblemente, el medicamento y/o el producto veterinario de la presente invención es un analgésico.
La presente invención tiene igualmente como objeto un procedimiento de síntesis del péptido de secuencia YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) que comprende una etapa de síntesis química sobre soporte sólido o una síntesis por recombinación genética.
El procedimiento de síntesis en la presente invención es un procedimiento de síntesis química sobre soporte sólido
o una síntesis por recombinación genética.
El procedimiento de síntesis por recombinación genética puede usar un sistema de expresión o un vector tal como se definen anteriormente.
El procedimiento de síntesis del péptido de la invención por recombinación genética puede comprender especialmente las etapas siguientes:
transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención,
cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones de cultivo tales que fabrique el péptido de la invención a partir de dicho vector de expresión y,
recuperar dicho péptido fabricado por la célula hospedadora.
Las etapas de transformación, de cultivo, así como de aislamiento del péptido pueden realizarse mediante técnicas habituales de la recombinación genética, por ejemplo, las técnicas descritas en el documento Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular cloning, A laboratory manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (Ref 3).
Por ejemplo, el péptido de secuencia SEQ ID NO 1 puede prepararse mediante técnicas clásicas de síntesis química en fase sólida, por ejemplo, según la metodología de síntesis peptídica sobre soporte sólido ("Fmoc solid Phase peptide synthesis, a practical approach", publicado por W.C. Chan y P. D.White, Oxford university press, 2000 (Ref 4)).
Otras características y ventajas de la invención surgirán con la lectura de la descripción siguiente, con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama que representa el perfil de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de veneno de Psp3 (columna de fase inversa) (parte superior) expresado en mUA en función del tiempo. El diagrama inferior representa el perfil de cromatografía de HPLC (columna de intercambio iónico) de las fracciones indicadas por la parte gris del diagrama superior. La parte gris del perfil de HPLC inferior corresponde a un pico puro que contiene la toxina Psp3Tx1.
La Figura 2 es un diagrama que representa la corriente generada por los canales Cav3.2 en nanoamperios (nA) en función del tiempo. La curva muestra el efecto de aplicación de una parte de la Psp3Tx1 purificada por HPLC presentado en la Figura 1 sobre la actividad del canal Cav3.2 expresado en ovocitos de Xenopus. La corriente se registra en una solución que contiene bario 5 mM como portador de cargas y se provoca por una despolarización a 30 mV a partir de un potencial de reposo de -100 mV.
La Figura 3 es un diagrama que representa varios registros de corrientes de tipo T en nanoamperios en función del tiempo generados por la subunidad CaV3.2 a varios potenciales antes (control) y durante la aplicación de la Psp3Tx1 (Psp3TX1).
La Figura 4 es un diagrama que representa las relaciones de corriente-potencial para los registros presentados en la Figura 3. La abscisa representa la corriente en nanoamperios en función del potencial en milivoltios (mV).
Figura 5: secuencia del plásmido pT7-7 (SEQ ID NO 4).
Figura 6: secuencia del plásmido de la serie pGEX (SEQ ID NO 5).
Figura 7: secuencia del plásmido de la serie pET32 (SEQ ID NO 6).
La Figura 8 es un diagrama que representa el porcentaje de inhibición de la corriente generada por los canales Cav3.2 en función de la concentración de la toxina. La ordenada representa el porcentaje de inhibición de la corriente generada por los canales Cav3.2 y la abscisa el logaritmo decimal de la concentración molar de la toxina. La curva
con círculos negros corresponde a la curva de inhibición con la toxina Psp3Tx1, la curva con círculos blancos corresponde a la curva de inhibición con la toxina sintética.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: caracterización del péptido de la invención
Se diluyó el veneno de PARAPHYSA SP3 a 1:1000 en la solución extracelular usada para análisis de fijación de membrana. Esta solución es de la composición siguiente (en mM): NaCl 135, TEACI 20, HEPES 10, CaCl2 2, MgCl2 1 (pH 7,3 con TEAOH).
Se transfectaron células HEK293 con un plásmido de expresión pcDNA3 que contenía ADN complementario del canal de calcio Cav3.2 humano y un gen informador (CD8) con la ayuda del reactivo jetPEI™ (distribuido por la compañía Q-biogen). Después de 48 horas de expresión, se dispersaron las células transfectadas con la ayuda de tripsina y se sembraron después a baja densidad en placas de cultivo para análisis de fijación de membrana.
Se localizaron las células transfectadas positivamente con la ayuda de bolas magnéticas recubiertas con un anticuerpo anti-CD8 (Dynal) como se describe anteriormente en Jiménez, C., Bourinet, E., Leuranguer, V., Richard, S., Snutch, T.P. y Nargeot, J. (2000) "Determinants of voltage-dependent inactivation affect Mibefradil block of calcium channels." Neuropharmacology, 39, 1-10 (Ref 2). Se realizan los registros electrofisiológicos por la técnica de "fijación de membrana" en configuración "célula entera" con la ayuda de un amplificador Axopatch200B guiado por una interfaz Digidata y el software pClamp9 (Molecular Devices). Se describe anteriormente la solución de registro extracelular que contiene calcio 2 mM. Se realizan los registros con la ayuda de pipetas de borosilicato (Sutter Instruments) estiradas para tener una resistencia de 1,5 a 2,5 mΩ. La solución intrapipeta usada para los registros tiene la composición siguiente: CsCl 130 mM, HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MgATP 4 mM, TrisGTP 0,3 mM (pH 7,3 con NaOH). Se realiza el análisis de los resultados con la ayuda del software Clampfit (marca comercial), Excel (marca comercial) y GraphPad Prism (marca comercial).
Los aparatos usados en este ejemplo para los registros electrofisiológicos son el amplificador Axopatch200B (Molecular Device), Digidata 1300 (Molecular Device), el software pClamp9 (Molecular Devices), el amplificador GeneClamp500 (Molecular Device), el microscopio inverso Olympus IX70 (Olympus France) y el micromanipulador Sutter (Sutter Instruments). Los compuestos, reactivos y células usados procedían, para los productos químicos, de la compañía Sigma-Aldrich France, siendo las células usadas células HEK293 (ATCC), las bolas Dynal anti-CD8 de la compañía Invitrogen France, el reactivo jetPEI (marca comercial) de la compañía Q-biogen France y el microorganismo Xenopus Laevis (CRBM - CNRS Montpellier France)
Para visualizar las corrientes de calcio de tipo T generadas por los canales Cav3.2 recombinantes expresados en las células transfectadas, se usa el protocolo de estimulación siguiente: a partir de un potencial de reposo de -100 mV, se aplica una despolarización de 100 ms a un potencial de -30 mV cada 10 segundos. Se mide la amplitud de corriente generada por esta estimulación en condiciones controladas y después de la aplicación del veneno de PARAPHYSA SP3. Para hacer esto, se aspira el veneno de PARAPHYSA SP3 en una pipeta idéntica a la pipeta de registro. Esta pipeta que contiene el veneno se conecta con un sistema de presión neumática que permite aplicar de 1 a 2 microlitros de veneno cerca de la célula registrada.
Se efectúa la caracterización de las fracciones de veneno de PARAPHYSA SP3 en un sistema de expresión diferente. Se inyecta el ADNc que codifica Cav3.2 humano en los ovocitos de Xenopus (Xenopus laevis) como se describe en Altier, C., Dubel, S.J., Barrère, C., Jarvis, S.E., Stotz, S.C., Spaetgens, R.L., Scott, J.D., Cornet, V., De Waard, M., Zamponi, G.W., Nargeot, J. y Bourinet, E. (2002) "Trafficking of L-type calcium channels mediated by the postsynaptic scaffolding protein AKAP79". J. Biol. Chem., 277, 33598-33603 (Ref 5) y en Dubel, S.J., Altier, C., Chaumont, S., Lory, P., Bourinet, E. y Nargeot, J. (2004) "Plasma Membrane Expression of T-type Calcium Channel {alpha}1 Subunits Is Modulated by High Voltage-activated Auxiliary Subunits." J. Biol. Chem., 279, 29263-29269 (Ref 6). Se registran las corrientes mediante la técnica de voltaje impuesto por doble microelectrodo con la ayuda de un amplificador GenClamp500 (marca comercial) (Molecular Devices (marca registrada)) guiado por el software pClamp9 (marca comercial). Se disuelven las diferentes fracciones cromatográficas obtenidas a partir del veneno en la solución extracelular que contiene (en mM): 5 BaOH2, 25 TEAOH, 25 NaOH, 2 CsOH, 30 NMDG, 5 HEPES (pH a 7,3 con ácido metanosulfónico). Se realizan los registros en una microcubeta de 15 µl. Se aplican manualmente las fracciones (10 µl), directamente sobre el ovocito registrado con la ayuda de una pipeta.
Desde la aplicación de la toxina purificada, se inhibe fuertemente la corriente del canal Cav3.2 al cabo de 30 segundos (Figura 2). En el lavado del efecto de la toxina, se obtiene la recuperación de la amplitud de la corriente de partida después de varios minutos.
Por otro lado, tal como se muestra en la Figura 4, la aplicación del extracto provoca un desplazamiento de aproximadamente 20 mMV hacia los potenciales positivos de la relación de corriente-potencial. Este desplazamiento es una característica de las toxinas que provocan una inhibición del "sensor de voltaje" de los canales iónicos. Este efecto clásico de la toxinas de araña se describe en Winterfield JR, Swartz KJ. (2000) "A hot spot for the interaction of gating modifier toxins with voltage-dependent ion channels". J. Gen. Physiol., 116(5): 637-44.) (Ref 10). Se trata de un bloqueo de la parte del canal que detecta la variación de potencial (el "sensor de voltaje"). La consecuencia es
que la apertura del canal se vuelve más difícil y requiere una despolarización más alta. Así, la relación de corrientepotencial se desplaza hacia potenciales más positivos.
Parece por tanto claro que el extracto consta de un antagonista de un canal de tipo T. Esta molécula es por tanto una nueva molécula que permite inhibir la señal de dolor.
Ejemplo 2: aislamiento y secuenciación del péptido de la invención
Se han aislado las fracciones de veneno que inhiben la actividad de los canales de calcio tales como se presentan en el ejemplo precedente, y se ha efectuado la búsqueda del compuesto responsable de esta inhibición mediante etapas sucesivas de ensayos de actividad acopladas con etapas de fraccionamiento.
Se obtuvo el veneno de PARAPHYSA SP mediante estimulación eléctrica de los quelíceros de hembras adultas. Se recogió el veneno en microtubos y se liofilizó.
La preparación del veneno para los análisis de actividad y para la separación cromatográfica consistió en una disolución del liofilizado en agua ultrapura a una dilución de 10 veces la del volumen de veneno inicial, una centrifugación (14.000 rpm, 20 min) y una filtración por membrana de 0,45 µm (SJHVL04NS Millipore (marca comercial)).
Purificación del componente activo del veneno por cromatografía: En una primera etapa, se fraccionó una alícuota de 100 µl de a dilución de veneno (10 µl equivalentes de veneno bruto) mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC-FI) sobre una columna semipreparativa C8 (5C8MS, 10x250 mm, Waters). El gradiente usado está compuesto por agua + 0,1 % de ácido trifluoroacético (A) / acetonitrilo + 0,1 % de ácido trifluoroacético (B). Se programa el gradiente como sigue: 0 % de B durante 5 min, 0 a 60 % de B en 60 min, 60 a 90 % de B en 10 min, caudal 2 ml/min. Se recogen manualmente las fracciones a la salida de la columna, vigilando la variación de absorbancia UV a 215 nm. Se liofilizan a continuación estas fracciones y se ensaya después su actividad sobre el canal de calcio de tipo T como se describe anteriormente.
Se realiza una segunda etapa de purificación como sigue, en las fracciones de HPLC-FI activas: se analizan estas fracciones en una segunda etapa de cromatografía de intercambio catiónico, sobre una columna Tosoh SP5PW (marca comercial) (4,6 x 70 mm) (Tosoh), con un gradiente lineal de acetato de amonio en agua (de 20 mM a 1 M en 50 min) con un caudal de 0,5 ml/min. Se liofilizan las fracciones recogidas y se ensaya después su actividad sobre el canal de calcio de tipo T como se describe anteriormente.
Después de la identificación de la fracción activa, se determinan la pureza y el peso molecular del péptido constituyente de la fracción activa mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción/ionización por láser asistida por matriz- tiempo de vuelo).
Se realizan las medidas de espectrometría de masas por espectrometría de masas MALDI-TOF con un espectrómetro de masas Voyager DE-Pro (marca comercial) (Applied Biosystems (marca registrada)) en modo reflector. Se mezclan los péptidos con la matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (α-CHCA, Sigma (marca registrada) 5 mg/ml en agua:acetonitrilo:TFA 50:50:0,1) y se analizan. Se calibran los espectros de masas con patrones internos y se analizan con el software Data Explorer (marca comercial).
Se determina la secuencia del péptido purificado mediante secuenciación automática usando un secuenciador en fase gaseosa (Applied Biosystems Procise) mediante degradación de Edman.
Antes del análisis, se reducen los puentes disulfuro del péptido purificado con DTT (ditiotreitol 10 mM, 55 ºC, 45 min) y se alquilan con IAA (ácido yodoacético, 50 mM, a 20 ºC, 30min) según un protocolo conocido por el especialista en la materia (véase John M. Walker. "The Protein Protocols Handbook", Humana Press 1996 (ISBN 0-89603-339-2) (Ref 14). Se somete el péptido reducido/alquilado a un desalado mediante cromatografía HPLC-FI C18 sobre una columna Merck Chromolith Speed-Rod (marca comercial) (0,46x50 mm). Se determina a continuación la secuencia del péptido reducido/alquilado mediante secuenciación N-terminal automática en fase gaseosa en un secuenciador peptídico de modelo Applied Biosystems 477A (marca comercial) (Applied Biosystems (marca registrada)).
La secuencia peptídica obtenida es YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1)
Este ejemplo demuestra claramente por tanto que la molécula antagonista de los canales de tipo T es el péptido de secuencia ID N°1.
Este péptido representa por tanto una nueva molécula susceptible de inhibir la señal de dolor.
Ejemplo 3: síntesis química del péptido de secuencia SEQ ID NO 1.
La compañía Altergen (marca registrada) sintetiza químicamente el péptido de la invención según el protocolo siguiente: síntesis en fase sólida según la técnica de Merifield, estrategia de Fmoc.
Se ensaya la actividad inhibidora del péptido identificado en el ejemplo 2 in vitro sobre diferentes canales de calcio de tipo T (resultados no proporcionados).
Ejemplo 4: síntesis química del péptido de secuencia SEQ ID NO 1.
La compañía Genepep (marca registrada) sintetizó químicamente el péptido de la invención según el protocolo siguiente: síntesis en fase sólida según la técnica de Merifield, estrategia de Fmoc. (Ref 4).
La compañía Synprosis (marca registrada) replicó el péptido lineal producido por la compañía Genepep según el protocolo siguiente: incubación de péptido lineal Psp3-Tx1 10 µM en un tampón que contiene glutation reducido (GSH) 1 mM, glutation oxidado (GSSG) 1 mM, trishidroximetilaminometano (TRIS) 100 mM pH 9, 25 % de glicerol. Se realizó la incubación durante 24 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Se realizó la purificación de la toxina Psp3-Tx1 sintética en cromatografía HPLC en fase inversa sobre columna RP-C18 Chromolith (marca registrada) usando un gradiente de 10 a 50 % de acetonitrilo (ACN) en una solución con 0,1 % de trifluoroacetato (TFA).
Se realizó la verificación de la masa del péptido sintético replicado mediante espectrometría de masas, dando un valor de 3398,0 dalton (Da) de acuerdo con la formación de 3 puentes disulfuro entre las 6 cisteínas.
Ejemplo 5: caracterización del péptido sintético de la invención producido en el ejemplo 4.
Se ensayó la actividad inhibidora del péptido sintético del ejemplo 4 in vitro sobre el canal Cav3.2. Se realizó la comparación de inhibiciones con el péptido natural (Psp3-Tx1) en las mismas condiciones. Se diluyeron el péptido sintético y el péptido natural (toxina natural) a una concentración madre de 10-3 molar en agua destilada. A partir de esta concentración madre, se diluyeron los péptidos en una solución correspondiente a la solución extracelular usada para el análisis de fijación de membrana. Esta solución es de la composición siguiente (en mM): NaCl 135, TEACI 20, HEPES 10, CaCl2 2, MgCl2 1 (pH 7,3 con TEAOH). Las concentraciones ensayadas fueron las siguientes: para el péptido sintético: 10-8, 10-7 y 10-6 molar; para el péptido natural: 10-9, 10-8, 3x10-8, 10-7, 3x10-7 y 10-6 molar.
Se usaron células HEK293 (ATCC) que expresan de manera estable la secuencia de ADN complementaria del canal de calcio Cav3.2 humano. A cada pasada de la línea celular, se sembraron células a baja densidad sobre placas de cultivo para análisis de "fijación de membrana" (electrofisiología molecular).
Se localizaron las células transfectadas positivamente con la ayuda de bolas magnéticas recubiertas con un anticuerpo anti-CD8 (Dynal) como se describe anteriormente en Jiménez, C., Bourinet, E., Leuranguer, V., Richard, S., Snutch, T.P. y Nargeot, J. (2000) "Determinants of voltage-dependent inactivation affect Mibefradil block of calcium channels." Neuropharmacology, 39, 1-10 (Ref 2).
Se realizan los registros electrofisiológicos por la técnica de "fijación de membrana" en configuración de "célula entera" con la ayuda de un amplificador Axopatch200B guiado por una interfaz Digidata y el software pClamp10 (Molecular Devices). Se describe anteriormente la solución de registro extracelular que contiene calcio 2 mM.
Se realizan los registros con la ayuda de pipetas de borosilicato (Sutter Instruments) estiradas para tener una resistencia de 1,5 a 2,5 mΩ.
La solución intrapipeta usada para los registros es de la composición siguiente: CsCl 130 mM, HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MgATP 4 mM, TrisGTP 0,3 mM (pH 7,3 con NaOH). Se realiza el análisis de los resultados con la ayuda del software Clampfit (marca comercial), Excel (marca comercial) y GraphPad Prism (marca comercial).
Los aparatos usados en este ejemplo para los registros electrofisiológicos son el amplificador Axopatch200B (Molecular Device), Digidata 1440 (Molecular Device), el software pClamp10 (Molecular Devices), el amplificador GeneClamp500 (Molecular Device), el microscopio inverso Olympus IX70 (Olympus France) y el micromanipulador Sutter (Sutter Instruments). Los compuestos, reactivos y células usados procedían, para los productos químicos, de la compañía Sigma-Aldrich France, siendo las células usadas células HEK293 (ATCC), las bolas Dynal anti-CD8 de la compañía Invitrogen France y el reactivo jetPEI (marca comercial) de la compañía Q-biogen France.
Para visualizar las corrientes de calcio de tipo T generadas por los canales Cav3.2 recombinantes expresados en las células transfectadas, se usa el protocolo de estimulación siguiente: a partir de un potencial de reposo de -100 mV, se aplica una despolarización de 100 ms a un potencial de -30 mV cada 10 segundos.
Se mide la amplitud de la corriente generada por esta estimulación en condiciones controladas desde la aplicación de concentraciones crecientes del péptido sintético del ejemplo 4, o de concentraciones creciente de la toxina nativa Psp3-Tx1. Para hacer esto, se reparten las soluciones que contienen las diferentes concentraciones del péptido sintético o la toxina Psp3-Tx1 en tubos de perfusión conectados con un colector que permite aplicar estas diferentes soluciones cerca de la célula registrada.
Se asimila así la actividad inhibidora de cada concentración de péptido sintético o de toxina nativa midiendo la amplitud de la corriente CaV3.2 de la célula registrada en la meseta del efecto.
Se presentaron los efectos inhibidores del péptido sintético y del péptido natural en forma de porcentaje de bloqueo de cada concentración para construir las curvas de "efecto-dosis" presentadas en la Figura 8. Estas curvas de "efecto-dosis" se analizaron con el software GrapPad Prism (marca comercial) con la función de análisis sigmoideo "log(antagonista) frente a respuesta - pendiente variable". que permite calcular la dosis que inhibe un 50 % de la corriente (CE50), así como la pendiente de la curva correspondiente o número de Hill.
La Figura 8 representa la curvas de dosis-respuesta para el péptido natural (Psp3Tx1) (curva con círculos negros) y el péptido sintético (curva con círculos blancos).
Así, en la Figura 8, la CE50 para la toxina natural es de 1,1 µM con un número de Hill de 0,87 (el número de células analizadas es de 6), y la CE50 para el péptido sintético es de 2,01 µM con un número de Hill de 0,89 (el número de células analizadas es igual a 20).
Los resultados muestran por tanto que el péptido sintético y el péptido nativo inhiben las corrientes del canal Cav3.2. Los resultados se describen con un coeficiente de Hill igual a aproximadamente 1, lo que implica una interacción 1:1 entre canal y péptidos.
Este ejemplo demuestra por tanto claramente que el péptido de secuencia ID NO 1, extraído de veneno de araña como se presenta en el ejemplo 1 y/o sintetizado químicamente, inhibe las corrientes del canal Cav3.2
Ejemplo 6: efecto analgésico del péptido de la invención
Se usaron ratones con el fin de observar el efecto analgésico del péptido de la invención frente a dolores inducidos por estímulos térmicos.
Los ratones son ratones C57BL/6J silvestres y ratones C57BL/6J CaV3.2-/-. El número total de ratones es de 10 silvestres y 10 CaV3.2-/-.
Se usan dos grupos de ratones (C57BL/6J), un grupo en el que se ha inyectado por vía intratecal una solución fisiológica que comprende el péptido de la invención a una concentración de 10 y 100 nM y un segundo grupo (grupo testigo) que solo recibe la inyección intratecal de la solución fisiológica sola. Se someten a continuación los ratones al ensayo de inmersión de la cola en baño María a 46 ºC. Este experimento tiene como objetivo determinar el tiempo al cabo del cual reaccionan los ratones al calor doloroso, mostrando así el umbral de aparición de la señal de dolor ligado a la percepción del calor. Se realiza el mismo experimento en paralelo con otros dos grupos de ratones C57BL/6J desprovistos del gen que codifica el canal de calcio de tipo T codificado por la subunidad CaV3.2. Este experimento tiene como objetivo mostrar la selectividad del péptido de la invención.
Los resultados muestran una diferencia significativa del tiempo de reacción al calor entre el grupo de ratones en el que se ha inyectado el péptido y el grupo de ratones testigo, siendo el tiempo de reacción al calor significativamente mayor en los ratones que reciben el péptido de secuencia SEQ ID NO 1.
Se usaron ratones con el fin de observar el efecto analgésico del péptido de la invención frente estímulos mecánicos.
Los ratones son ratones C57BL/6J silvestres y ratones C57BL/6J CaV3.2-/-. El número total de ratones es de 10 silvestres y 10 CaV3.2-/-.
Se usan dos grupos de ratones (C57BL/6J), un grupo en el que se ha inyectado por vía intratecal una solución fisiológica que comprende el péptido de la invención a una concentración de 10 y 100 nM y un segundo grupo (grupo testigo) que solo recibe la inyección intratecal de la solución fisiológica sola. Se sometieron a continuación los ratones al experimento de estimulación mecánica por filamentos de von Frey. Este experimento tiene como objetivo determinar el umbral de reacción a un estímulo mecánico de intensidad creciente aplicado sobre la bóveda plantar. El umbral de reacción de los animales está correlacionado con la aparición de la señal de dolor ligada a la percepción de la presión mecánica. Se realiza el mismo experimento en paralelo con otros dos grupos de ratones C57BL/6J desprovistos del gen que codifica el canal de calcio de tipo T codificado por la subunidad CaV3.2. Este experimento tiene como objetivo mostrar la selectividad del péptido de la invención.
Los resultados muestran una diferencia significativa del umbral de percepción a la presión mecánica entre el grupo de ratones en el que se ha inyectado el péptido y el grupo de ratones testigo, siendo el umbral de presión significativamente más elevado en los ratones que reciben el péptido de secuencia SEQ ID NO 1.
El péptido de la invención tiene por tanto el efecto analgésico esperado frente a los estímulos dolorosos térmicos y mecánicos.
Este ejemplo demuestra por tanto que el péptido de secuencia SEQ ID NO 1, identificado en el ejemplo 2, es una nueva molécula para el tratamiento del dolor.
Ejemplo 7: comparación del efecto analgésico del péptido de la invención con el de un analgésico de referencia.
Los ratones y el protocolo experimental usados en el presente ejemplo son idénticos a los descritos en el ejemplo 4.
Se ensayan dos grupos de ratones suplementarios:
un grupo en el que se ha inyectado por vía intratecal una dosis de morfina (1 µg/kg), y
un grupo en que lo ha sido el péptido de secuencia SEQ ID NO 1 (10 nM).
Ejemplo 8: efecto antihipertensivo del péptido de la invención
Los ratones usados en el presente ejemplo son idénticos a los descritos en el ejemplo 4.
Se usan ratones con el fin de observar el efecto antihipertensivo del péptido de la invención. Se usan dos grupos de ratones (C57BL/6J), un grupo en el que se inyecta por vía intravenosa una solución fisiológica que comprende el péptido de la invención a una concentración de 10 y 100 nM y un segundo grupo (grupo testigo) que solo recibe la inyección intravenosa de la solución fisiológica sola. Se realiza la medida de la presión arterial por el principio del método del manguito caudal (Plehm, R., Barbosa, M.E. y Bader, M. (2006) "Animal models for hypertension/blood pressure recording". Methods Mol. Med., 129, (Ref 15)).
Ejemplo 9: efecto antiproliferativo del péptido de la invención
Se usan células cancerosas de próstata LNCAP con el fin de observar el efecto antiproliferativo del péptido de la invención.
El medio de cultivo usado es el medio RPMI 1640 (BioWhittaker SA, Verviers, Bélgica), suplementado con Lglutamina 5 mM (Sigma-Aldrich, L'Isle d'Abeau, Francia) y 10 % de FBS (Applera France SA, Courtaboeuf, Francia) como se indica en el documento Gackière F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, Dewailly E, Bavencoffe A, Van Chuoï-Mariot MT, Mauroy B, Prevarskaya N, Mariot P. (2008) "CaV3.2 T-type calcium channels are involved in calcium-dependent secretion of neuroendocrine prostate cancer cells". J. Biol. Chem., 283(15): 10162-73. (Ref 16).
Se usan dos condiciones de células:
una condición en la que las células se cultivan en diferentes ensayos en presencia del péptido de la invención a concentraciones de 10, 30, 100, 300, 1000 nM, y
una segunda condición (testigo) sin péptido.
Se realiza la medida de la proliferación celular mediante el método CellTrace (marca comercial) CFSE (Invitrogen (marca registrada)) basado en la incorporación del trazador fluorescente CFSE por las células cultivadas y por una medida por citometría de flujo de las células marcadas.
Listas de referencias
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Ref 5 Altier, C., Dubel, S.J., Barrère, C., Jarvis, S.E., Stotz, S.C., Spaetgens, R.L., Scott, J.D., Cornet, V., De Waard, M., Zamponi, G.W., Nargeot, J. y Bourinet, E. (2002) "Trafficking of L-type calcium channels mediated by the postsynaptic scaffolding protein AKAP79". J. Biol. Chem., 277, 33598-33603.
Ref 6 Dubel, S.J., Altier, C., Chaumont, S., Lory, P., Bourinet, E. and Nargeot, J. (2004) "Plasma Membrane Expression of T-type Calcium Channel {alpha}1 Subunits Is Modulated by High Voltage-activated Auxiliary Subunits".
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CNRS
Université de Nice Sophia-Antipolis
5 BOURINET, Emmanuel
ESCOUBAS, Pierre
MARGER, Fabrice
NARGEOT, Joîl
LAZDUNSKI, Michel
<120> Identificación de una nueva toxina antagonista de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica
<130> BIP133347PC00
<151>
<160> 6
20 <170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Péptido analgésico
30 <400> 1
- 35
- <210> <211> <212> <213> 2 84 ADN Artificial
- 40
- <220> <223> Secuencia de ácidos nucleicos que codifican el péptido analgésico
- <400>
- 2
- 50
- <210> <211> <212> <213> 3 84 ADN Artificial
- <220> <223>
- Secuencia que codifica un péptido analgésico
- 55
- <220> <221> <222> <223> característica_misc (3)..(3) Y es C o T
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (6)..(6)
- <223>
- Y es C o T
- 5
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (9)..(9)
- <223>
- R es A o G
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (12)..(12)
- <223>
- R es A o G
- 15
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (15)..(16)
- <223>
- Y es C o T
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (18)..(18)
- <223>
- n es a, c, g o t
- 25
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (24)..(24)
- <223>
- n es a, c, g o t
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (27)..(27)
- <223>
- Y es C o T
- 35
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (30)..(30)
- <223>
- Y es C o T
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (31)..(31)
- <223>
- W es A o T
- 45
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (32)..(32)
- <223>
- S es C o G
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (33)..(33)
- <223>
- n es a, c, g o t
- 55
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (36)..(36)
- <223>
- R es A o G
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (37)..(37)
- <223>
- M es A o C
- 65
- <220>
<221> característica_misc
<222> (39)..(39)
<223> n es a, c, g o t
5 <220>
<221> característica_misc
<222> (42)..(42)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> característica_misc
<222> (45)..(45)
<223> Y es C o T
<221> característica_misc
<222> (48)..(48)
<223> Y es C o T
<220>
<221> característica_misc
<222> (51)..(51)
<223> R es A o G
<221> característica_misc
<222> (54)..(54)
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<220>
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<223> Y es C o T
<221> característica_misc
<222> (57)..(57)
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<220>
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<222> (60)..(60)
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<221> característica_misc
<222> (63)..(63)
<223> Y es C o T
<220>
<221> característica_misc
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<223> M es A o C
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<222> (66)..(66)
<223> n es a, c, g o t
<220>
<221> característica_misc
<222> (67)..(67)
<223> Y es C o T
65 <220>
<221> característica_misc
- <222> <223>
- (69)..(69) n es a, c, g o t
- 5
- <220> <221> <222> <223> característica_misc (75)..(75) Y es C o T
- 10
- <220> <221> <222> <223> característica_misc (78)..(78) R es A o G
- 15
- <220> <221><222> <223> característica_misc (81)..(81) H es A o C
- 20
- <220> <221> <222> <223> característica_misc (84)..(84) Y es C o T
- 25
- <400> 3
- <210>
- 4
- <211>
- 2481
- 30
- <212> ADN
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Plásmido pT7-7
- 35
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (428)..(428)
- <223>
- n es a, c, g o t
- 40
- <220>
- <221>
- característica_misc
- <222>
- (435)..(435)
- <223>
- n es a, c, g o t
- 45
- <400>
- 4
- 5
- <210> <211> <212> <213> 5 4969 ADN Artificial
- 10
- <220> <223> <400> Plásmido pGex-4-T1 5
<210> 6
<211> 5900
- <212> <213>
- ADN Artificial
- 5
- <220> <223> Plásmido pET32
- <400>
- 6
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Péptido de secuencia aminoacídica YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
-
- 2.
- Ácidos nucleicos que codifican el péptido definido en la reivindicación 1.
-
- 3.
- Ácido nucleico según la reivindicación 2, en el que la secuencia de ácido nucleico es
en las que A es adenosina, C es citidina, G es guanosina, T es timidina y H es A o C o T, M es A o C, N es A o C o G o T, R es A o G, S es C o G, W es A o T e Y es C o T: - 4. Sistema de expresión que comprende un plásmido y/o un vector de expresión que comprende un ácido 10 nucleico según la reivindicación 2.
-
- 5.
- Péptido antagonista de un canal de calcio de tipo T de secuencia aminoacídica: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).
-
- 6.
- Péptido antagonista de un canal de calcio de tipo T según la reivindicación 5, en el que dicho canal es un canal elegido del grupo que comprende el canal Cav3.2 y el canal Cav3.1.
15 7. Péptido según la reivindicación 1, para su uso como medicamento. -
- 8.
- Péptido según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento del dolor.
-
- 9.
- Péptido según la reivindicación 1, para su uso como medicamento analgésico.
-
- 10.
- Procedimiento de síntesis del péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una etapa de síntesis química sobre soporte sólido o una etapa de síntesis por recombinación genética.
Figura 1Figura 2Figura 3Figura 4Figura 5Secuencia de pT7-7:Figura 6 (1/2)Secuencia de pGex-4-T1:Figura 6 (2/2)Figura 7 (1/3)Secuencia de pET32Figura 7 (2/3)Figura 7 (3/3)Figura 8 Inhibición de Cav3.2 recombinante Péptido sintético frente al natural
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