PT1206942E - Composições para abertura de canal de água e composições medicinais para utilização oftálmica - Google Patents

Description

ΡΕ1206942 1 DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES PARA ABERTURA DE CANAL DE ÁGUA E COMPOSIÇÕES MEDICINAIS PARA UTILIZAÇÃO OFTÁLMICA"

ÁREA DA TÉCNICA A presente invenção relaciona-se com um abridor original de canal de água, compreendendo uma substância que se liga a lipocalinas, particularmente proteinas de ligação a odorantee (daqui em diante, OBP). 0 novo abridor de canal de água de acordo com a presente invenção possui actividade de abertura de canal de água aquaporina 5 e encontra aplicação em composições farmacêuticas, particularmente como fármaco terapêutico para comprometimento do epitélio ceratoconjuntival, por exemplo, um fármaco terapêutico para xeroftalmia (olho seco).

ESTADO DA TÉCNICA A permeação de água através da membrana celular ocorre lentamente por difusão através da camada lipidica dupla, que é um dos principais elementos estruturais da membrana celular. Contudo, recentemente, descobriu-se um movimento rápido de água através da membrana celular de determinados tipos de células, e os investigadores postularam que, neste fenómeno, estão envolvidas algumas pro- 2 ΡΕ1206942 teínas da membrana que são selectivamente permeáveis à água. Consequentemente, foram efectivamente isoladas algumas proteínas deste tipo da membrana, que começaram a ser chamadas de abridoras de canal de água.

Assim, como proteínas abridoras de canal, foi isolado um grupo de proteínas da membrana, chamadas aquaporinas (AQP), e até hoja, aquaporinas tais como as AQP 1 a 5, FA-CHIP e AQP-γΤΙΡ foram descobertas em mamíferos, anfíbios e plantas (e.g., Advances in Medicine, 173, 9_, 745-748 (1995)). Estre estas, sabe-se que a AQP5 existe na glâncula salivar, olho (glândula lacrimal, tecido epitelial córneo) e brônquio de mamíferos (Advances in Medicine, 173, 9, 745-748 (1995); Am. J. Physiol., 270, C12-C30 (1996)).

Verificou-se recentemente que a AQP5 existe na membrana apical do tecido celular da glândula lacrimal do olho (Ishida et al., Biochem. Biophys. Res. Comn., 224, 1-4 (1996)), e foi confirmado estar profundamente associado com o transporte intercelular de água na lacrimação e na modulação da libertação de fluido lacrimal (Ishida et al., Biochem. Biophys. Res. Comn., 238, 891-895 (1997))

De acordo com os resultados da investigação do presente inventor, uma experiência em que são utilizados oócitos de Xenopus laevis em que é expressa a AQP5, sugere que a abertura do canal de água da aquaporina é eberta e fechada por uma certa proteína com origem em células da glândula lacrimal. Foi então identificado pela primeira vez 3 ΡΕ1206942 um péptido parcial específico na vizinhança da região do terminal C da AQP5, como um abridor do canal de água.

Entretanto, foram realizados estudos sobre a OBP, em associação com a elucidação do olfacto. A OBP é uma proteína solúvel de baixo peso molecular que ocorre a níveis elevados no muco nasal de vertebrados e na linfa sensillum de insectos. A OBP possui afinidaes para as substâncias odorosas e feromonas considerando-se, por isso, como sendo relacionada com a percepção olfactiva, e sabe-se que pertence à super família das lipocalinas. A lipocalina é uma proteína secretória solúvel e conhecem-se diversos membros capazes de se ligarem a uma variedade de ligando hidrofóbicos, incluindo substâncias odorosas.

Apesar de terem sido isolados diversos tipos de OBP, de diversas fontes, muitos são dímeros cuja subunidade tem um tamanho de cerca de 2 0 kDa, e também existem monómeros. Quanto à OBP de vertebrados, tanto quanto se sabe, é sintetizada no tecido da passagem nasal, secretada extracelularmente e acumulada, nos níveis mais elevados, no epitélio respiratório nasal.

Também se sabe que ligandos das lipocalinas, particularmente substâncias odorosas possuindo actividade de ligação à OBP (daqui em diante, por vezes, referidas como "substâncias odorantes"), possuem certas actividades bioquímicas ou fisiológicas. Por exemplo, é relatado que derivados 2-cetoalcano e a carvona influenciam a ATPase 4 ΡΕ1206942 sodica-potássica no tecido olfactivo (Life Sciences, 2 0, 1051-1062 (1977)) e que os monoterpenos, como a carvona, inibem a lente de aldose redutase (Arch. Pharm. Res., 11, 312-314 (1988)), enquanto que a Japanese Kokai Publication Hei-2-193932 revela a promoção da actividade de absorção transdérmica e transmucosa da carvona e outros.

Em relação à OBP, a U.S.P. 5 030 722 revela uma proteína OBP derivada da glândula nasal lateral de rato.

Sabe-se que a OBT também existe em níveis elevados no fluido lacrimal do rato (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, 4942-4946 (1986)).

Também foi relatado que a pré-albumina lacrimal secretada pela glândula lacrimal humana possui homologia com a OBP na sequência de amino ácidos (Chem. Senses, 20, 69-76 (1995)). Adicionalmente, foi descoberta no muco nasal humano uma proteína de 19 kDa que se assemelha muito com a lipocalin lacrimal (Comp. Biochem. Physiol., 118B, 819-824 (1997)).

Foi detectada na urina e saliva de aminais, uma proteína capaz de se ligar a substância odorosa, que também é considerada como pertencendo à super família das lipocalinas (Finlayson et al., Science, 149, 981-982 (1965), Cell, 32, 755-761 (1983)).

As EP-A-1 016 406 (SENJU PH ARMA CO. ) , de 5 de 5 ΡΕ1206942

Julho de 200 e a WO99/09968 de 4 de Março de 1999 (04.03.1999), revelam uma composição oftálmica compreendendo ligandos da lipocalina possuindo actividade de ligação a proteínas odorantes (i.e., mentol, borneol, etc.). As gotas oculares que contêm mentol reduzem a sensação de secura do olho. A EP-A-0 473 159 (SENJU PH ARMA CO. ) , de 4 de Março de 1992 (1992-03-04) revela uma composição oftálmica compreendendo retinol (que é um ligando da lipocalina possuindo actividade de ligação a proteínas odorantes) e sua utilização no tratamento do olho seco. A US-A-5 698 533 (KANG MENG-CHE), de 16 de Dezembro de 1997 (1997-12-15), revela uma composição oftálmica compreendendo mentol (que é um ligando da lipocalina possuindo actividade de ligação a proteínas odorantes) para o tratamento de olho seco.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Apesar da informação reunida sobre lipocalinas, incluindo a OBP, e substâncias odorosas, a sua relação com a lacrimação tinha sido desconhecida.

Contudo, no decurso da investigação da acção de ligandos de lipocalinas, incluindo a OBP, sobre a glândula lacrimal, os inventores da presente invenção verificaram, com surpresa, que diversas substâncias ligandas, incluindo 6 ΡΕ1206942 substâncias odorosas, exibem uma actividade estimulante da lacrimação.

Em presença do estado actual da técnica, a presente invenção tem por objecto proporcionar um abridor de canal de água original, possuindo a actividade de abertura de um canal de água AQP. Constitui outro objecto proporcionar uma composição farmacêutica, particularmente um estimulante da lacrimação, compreendendo o abridor como um ingrediente activo. 0 estimulante acima pode ser utilizado na terapia do epitélio ceratoconjuntival debilitado, tal como na xeroftalmia (olho seco). 0 primeiro aspecto da presente invenção é uma composição abridora de canal de água aquaporina que compreende um ligando da lipocalina.

Neste primeiro aspecto da invenção, o ligando de lipocalina é, preferencialmente, um composto possuindo actividade de ligação a proteínas de ligação a odorantes. 0 segundo aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica para utilização oftálmica, que compreende como ingrediente activo um ligando de lipocalina . A composição farmacêutica para utilização oftálmica, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, é, preferencialmente, uma composição estimulante da lacri- 7 ΡΕ1206942 maçao ou um fármaco terapêutico para o epitélio cerato-conjuntival debilitado.

No segundo aspecto da invenção, o fármaco terapêutico para o epitélio ceratoconjuntival debilitado é, preferencialmente, um fármaco terapêutico para a xero-ftalmia.

No segundo aspecto da invenção, o ligando de lipocalina é preferencialmente um composto possuindo actividade de ligação a proteínas de ligação a odorantes. 0 segundo aspecto da invenção compreeende ainda, preferencialmente, um fármaco parassimpatomimético.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico mostrando os resultados de uma experiência de permeabilidade à água, realizada com carvona no Exemplo 1. A Fig. 2 é um gráfico mostrando os resultados de experiências de permeabilidade à água, realizada com substância odorantes no Exemplo 2. A Fig. 3 é um gráfico mostrando o efeito da utilização combinada de cloridrato de pilocarpina na lacrimação de ratinho no Exemplo 4. ΡΕ1206942 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será agora descrita em detalhe. A composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é uma composição abridora de canal de água aquaporina, possuindo actividade para abertura de canal de água AQP5. Tal como utilizado nesta especificação, o termo actividade de abertura de canal de água AQP5, significa a potência para aumentar a permeabilidade da membrana celular à água, através do canal de água AQP5, e o termo abridor de canal de água aquaporina significa uma substância possuindo actividade para abertura de um canal de água aquaporina. 0 canal de água mencionado acima inclui canais que selectivamente permitem a passagem apenas de água e canais que permitem a passagem não apenas de água, mas permitem a passagem de moléculas de baixo peso molecular, como o glicerol ou a ureia. A actividade de abertura de canal de água AQP5 da composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção será agora descrita.

Sabe-se que, em células de tecido vivo, a actividade de permeação de água pela AQP5 é modulada de diversas formas. Por exemplo, mesmo nas células de tecido da glândula lacrimal com expressão verificada de AQP5, a lacrimação é normalmente controlada por inervação 9 ΡΕ1206942 simpática-parasimpática. Assim, a expressão de AQP5 numa célula de tecido vivo e a expressão da sua actividade de permeação de água não são um um acontecimento único. Consequentemente, a actividade de permeação de água pela AQP5 é confirmada por uma experiência de permeabilidade à água, utilizando oócitos de uma rã (Xenopus laevis) , que se sabe não possuírem aí expressos nenhum dos genes da família AQP, e são injectados com o gene AQP5 para expressão da proteína codificada, como se segue. A injecção de mRNA AQP5 em oócitos de Xenopus laevis dispara uma elevação da permeabilidade à água. Dado que esta elevação na permeabilidade à água pode ser facilmente observada, esta técnica tem sido extensivamente utilizada para a confirmação para confirmação da actividade de canal de água. Por exemplo, Ishibashi et al., inseriram o cDNA de AQP3 no vector pSP64T derivado do BlueScript, sintetizaram cRNA utilizando a polimerase T7RNA, injectaram este cRNA em oócitos de Xenopus laevis e confirmaram um aumento de volume em 48 a 62 horas de incubação após injecção, provando assim a existência do canal de água (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 9_1, 6269-6273 (1994)). Um relatório semelhante também se encontra em Science, 256, 385-387 (1992) .

Assim, de forma semelhante à de acima, os oócitos de Xenopus laevis são microinjectados com a extensão total de cRNA que codifica a AQP5 e cultivados para expressão do AQP5. Os oócitos são, depois, transferidos para um fluido 10 ΡΕ1206942 de cultura hipotónico e a permeabilidade à água é calculada a partir da alteração de volume. Enquanto que o grupo de controlo não injectado com a extensão total de cRNA que codifica a AQP5, mostra apenas uma baixa permeabilidade à água, a permeabilidade à água é elevada no grupo injectado com a extensão total de cRNA que codifica a AQP5, consubstanciando assim a actividade do canal de água.

Por outro lado, no sistema em que os oócitos de Xenopus laevis são microinjectados com a extensão total de cRNA que codifica a AQP5 e o poli (A) + RNA derivado da glândula lacrimal e são cultivados para provocar a expressão da proteína AQP5 e a proteína total original da glândula lacrimal, a actividade de permeação da água da AQP5 é drasticamente diminuída, em comparação com o acima mencionado sistema em que a AQP5 é expressa sozinha, como será descrito aqui abaixo com mais detalhe nos Exemplos. Consequentemente, é claro que a actividade de permeação de água da AQP5 é inibida pela presença da proteína com origem na glândula lacrimal. Considera-se que este fenómeno de actividade de permeação de água pela AQP5 ser inibido pela presença da proteína com origem na glândula lacrimal, "surge de alterações na abertura e fecho do canal de água.

Quando a composição, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é forçada a coexistir no sistema, a actividade de permeação de água da AQP5 recupera até um nível comparável ao observado na ausência de inibição. 0 facto de o ligando da lipocalina ser identificado como uma 11 ΡΕ1206942 substância possuindo uma actividade de abertura de canal de água é surpreendente, à luz do conhecimento até agora reunido sobre lipocalinas, particularmente a OBP.

As lipocalinas são proteínas solúveis comparativamente pequenas que ocorrem em diversos orgãos e fluidos corporais de vertebrados e invertebrados e mostram diversidade a nível da sequência de amino ácidos. Contudo, as lipocalinas no grupo chamado de lipocalinas de núcleo (kernel), conservam em comum 3 motivos sequenciais na vizinhança do terminal N, e as do grupo chamado lipocalinas externas (outlier), de que a OBP é membro, possuem em comum um dos referids motivos sequênciais. Adicionalmente, as lipocalinas possuem uma característica comum muito distintiva na estrutura de dimensão elçevada e a estrutrura típica da lipocalina compreende uma estrutura tubular β que consiste em 8 filamentos β anti-paralelos consecutivos, estanto uma hélice tipo 3io e uma hélice a ligadas às respectivas terminações de uma estrutura semelhante a uma bolsa. Os ligandos ligam-se ao tubo β hidrofóbico. Assim, as lipocalinas possuem afinidades elevadas com moléculas hidrofóbicas e suspeita-se que funcionem in vivo como veículos de ligandos hidrofóbicos nos fluídos corporais.

Como exemplos de substâncias conhecidas como lipocalinas, podem mencionar-se, por exemplo, OBP, a-1-microglobulina, αΐ-glicoproteína ácida, apolipoproteína, crustacianina, proteína CH21 do embrião, β-lactoglobulina, proteína urinária major, probasinas, proteína de ligação ao 12 ΡΕ1206942 retinol, albumina lacrimal, proteína da glândula de von Ebner, purpurina e outras.

Foi confirmado com OBP bovina, que a OBP possui o motivo tubular β típico, comum às lipocalinas. A OBP de ratinho é um heterodímero compreendendo duas subunidades Ia e Ib. As sequências nucleotídicas dos genes da OBP-Ia e OBP-Ib de ratinho (657bp e 669bp, respectivamente) e as sequências de amino ácidos das proteínas OBP-Ia e Ib (147 resíduos de amino ácidos e 146 resíduos de amino ácidos, respectivamente), são revelados em Gene, 212, 49-55 (1998). A OBP inclui as proteínas que se seguem. Assim, OBP bovina, OBP-I de rato, OBP-II de rato, OBP-I de coelho, OBP-II de coelho, OBP-I porcina, OBP-II porcina, OBP-I de ratinho, OBP-II de ratinho, OBP-III de ratinho, his-OBP-I (porco-espinho), his-OBP-II (porco-espinho) , OBP-I de veado, OBP-II de veado, BG de rã, OBP felina, etc, são exemplos de OBP que têm sido isoladas a partir de tecidos olfactivos de vertebrados.

Como molélucas hidrofóbicas que se ligam às pipocalinas como ligandos, podem mencionar-se, por exemplo, retinol (um ligando da albumina lacrimal, proteína de ligação ao retinol, purpurina, etc.), glicolípidos (ligandos da proteína VEG), porfirinas (ligandos da proteína HC), benzoato de denatónio (um ligando à proteína da glândula de von Ebner), e por aí adiante. Os ligandos são descritos abaico em detalhe, tomando a OBP como exemplo. 13 ΡΕ1206942 A OBP toma uma maior variedade de substâncias como ligandos, em comparação com outras lipocalinas, e liga-se reversivelmente com diversas substâncias odorosas e feromonas. A existência de actividade de ligação a 2-isobutil-3-metoxipirazina é uma das caracteristicas das proteínas OBP (contudo, a OBP felina é a única excepção conhecida). Apesar de uma substância odorosa ser uma substância que estimula a sensação olfactiva, o facto de possuir actividade de ligação à OBP não é necessáriamente o equivalente a elicitar uma sensação olfactiva. Consequentemente, na presente invenção, não importa se uma substância possuindo actividade de ligação à OBP evoca uma sensação olfactiva.Os ligando da OBP possuindo actividade de ligação à OBP possume, em geral, grupos polares tais como hidróxilo, carbonilo, etc., ou um heterociclo, e são moléculas de tamanho médio possuindo uma região hidrofóbica planar. Podem mencionar-se, mas não se limitando a, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilsele-nazole, acetato de citronelilo, carvona, 2-isopentilpi-razina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, mentol, 3,7-dime-tiloctanol, 2-nonenal, linalol, retinol, benzoato de benzi-lo, compostos tipo almíscar com 3 membros em anel, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldeído, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, β-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroani-sole, 5a-asdrost-16-en-3-ona, pentadecalactona, sulfito de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, bor-neol, por exemplo. 14 ΡΕ1206942

Estas substâncias possuem, geralmente, constantes de dissociação de cerca de 0,1 a 100 μΜ, Por exemplo a 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-isopentilpirazina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, mentol, 3,7-dimetiloctanol, 2-none-nal, linalol, retinol, benzoato de benzilo, compostos tipo almíscar com 3 aneis, etc., possuem constantes de desasso-ciação de cerca de 0,1 a 1 μΜ, como determinado com OBP bovina.

As composições farmacêuticas para utilização oftálmica, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, incluem, pelo menos, uma espécie dos ligandos referidos de lipocalina, particularmente ligandos da OBP, como ingrediente activo. Tal como utilizado nesta especificação, o termo "utilização oftálmica" significa a utilização em seres humanos ou animais para a terapia de uma doença do olho ou com a finalidade de melhorar ou promover a função do olho. Dado que a composição farmacêutica do segundo aspecto da invenção possui actividade de abertura de canal de água AQP5 nas células do tecido da glândula lacrimal, exibe uma actividade de estimulação da lacrimação que pode ser utilizada como composição estimulante da lacrimação. Adicionalmente, a duração do efeito pode ser prolongada utilizando, em combinação, um fármaco parasimpatomimético possuindo actividade secretomotora glandular, tal como o cloridrato de pilocarpina.

Como tal, as composições farmacêuticas para uti- 15 ΡΕ1206942 lização oftálmica podem ser mencionadas como, por exemplo, composição estimulante da lacrimação, fármaco terapêutico para o epitélio ceratoconjuntival deteriorado, acelarador da cicatrização de feridas ceratocunjuntivaids e um estimulante da elongação das células do epitélio ceratocon juntival. Estre estas o fármaco terapêutico para a xero-ftalmia (olho seco) é importante como fármaco terapêutico para doenças provocadas pelo abuso da visão associado com o desenvolvimento de equipamento OA. A composição farmacêutica para utilização oftálmica, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, pode estimular directamente a secreção de fluido lacrimal a partir da glândula lacrimal. Por isso, possui um mecanismo de acção muito diferente dos fármacos oftálmicos convencionais compreendendo lágrima artificial, na compensação das deficiências no fluído lacrimal, e reagindo não apenas rapidamente, mas também melhorando a lacrimação. 0 fármaco terapêutico para deterioração do epitélio ceratoconjuntival de acordo com o segundo aspecto da invenção, possui, tomando vantagem das características acima, propriedades muito vantajosas, tais como acção duradoura, particularmente para a terapia de xeroftalmia (olho seco). A doença a que o fármaco terapêutico para a deterioração do epitélio ceratoconjuntival se dirige, de acordo com o segundo aspecto da invenção, não se limita ao olho seco, mas inclui, por exemplo, o síndroma de Sjõgren, 16 ΡΕ1206942 síndroma de Stevens-Johnson, doenças pós-operatórias, doenças induzidas por fármacos, doenças traumáticas e doenças exógenas provocadas pela utilização de lentes de contacto.

Contudo, a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção não se limita às aplicações acima, mas pode ser administrado a seres humanos ou animais como uma composição farmacâutica para o tratamento de doenças de tecidos e orgâos em que é expressa a AQP5. A composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, pode ser administrado não apenas topicamente, mas também sistemicamente, o que quer dizer, oralmente ou parenteralmente. A forma de dosagem inclui fármacos oftálmicos tais como gotas oculares e pomadas oftálmicas, injecções, comprimidos, cápsulas e grânulos, por exemplo. Estas formas de dosagem podem ser preparadas com as tecnologias estabelecidas. As gotas oculares, por exemplo, podem ser preparadas numa forma de dosagem formulada com um agente isotónico, como o cloreto de sódio, glicerina concentrada ou outros do mesmo género; um tampão, como o fosfato de sódio, acetato de sódio ou outro do mesmo tipo; um surfactante, como o polioxietileno monooleato de sorbitano, estearato de polioxil 40, polioxietileno-óleo de rícino hidrogenado ou outro do mesmo tipo; um estabilizante, como o citrato de sódio, edetato de sódio ou outro do mesmo tipo; e um preservante, como o cloreto de benzalcónio, parabenos ou outro do mesmo tipo, como 17 ΡΕ1206942 necessário. O pH pode situar-se no intervalo aceitável para preparações farmacêuticas oculares, mas é preferido o intervalo de pH entre 4 e 8. Podem ser obtidas preparações orais, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos, etc., em em formas de dosagem, utilizando um excipiente como a lactose, amido, celulose cristalina, óleo vegetal ou outro do mesmo tipo; um lubrificante, como o estearato de magnésio, talco ou outro do mesmo tipo; um ligante, como a hidroxipropilcelulose, polivinilpirrolidona ou outro do mesmo tipo; um desintegrante, como a carboximetilcelulose cálcica ou outro do mesmo tipo; um agente de revestimento, tal como hidroxipropilmetilcelulose, macrogoles, resina de silicone ou outro do mesmo tipo; e um agente gelatinoso de formação de pelicula, como necessário. A dosagem da composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, pode ser adeguadamente seleccionado de acordo com os sintomas, idade, forma de dosagem, e outros. Quando a composição farmacêutica para utilização oftálmica, de acordo com o segundo aspecto da invenção, é utilizado como gotas oculares, por exemplo, é suficiente instilar uma composição contendo de 0,001 a 3% (p/v) de ingrediente activo do segundo aspecto da invenção, uma ou várias vezes por dia. Podem ser administrados 1 mg a 1000 mg de preparações orais por dia, de uma só vez ou em poucas doses divididas.

Verificou-se por administração intravenosa em ratinhos, que a composição farmacêutica de acordo com o 18 ΡΕ1206942 segundo aspecto da invenção, produz uma actividade estimuladora da lacrimação, in vivo.

MELHOR FORMA DE REALIZAR A INVENÇÃO

Os Exemplos Experimentais, Exemplos e Exemplos de Preparação do Fármaco que se seguem, ilustram a presente invenção com mais detalhe, sem limitar o âmbito da invenção.

Exemplo Experimental 1 Preparação de poly (A)+ RNA da glândula lacrimal

Isolou-se a glândula lacrimal de ratos SD machos e de ratinhos macho BALB/c e, utilizando um Pharmacia RNA Purification Kip (produto de Pharmacia) isolou-se o RNA total. A poly (A)+ RNA foi purificada por cromatografia de afinidade, utilizando uma coluna oligo (dl) celulose, na forma rotineira.

Exemplo Experimental 2 Construção do cDNA que codifica a AQP5

Sujeitou-se o poli (A)+ RNA de glândula lacrimal de rato obtido no Exemplo Experimental 1 a transcripção reversa utilizando um primer oligo (dT)is, e a cadeia simples de cDNA obtida foi utilizada como modelo para PCR. Tal como o primer para PCR, utilizou-se uma sequência contendo locais de digestão de enzimas de restrição, 19 ΡΕ1206942 permitindo a amplificação por PCR da grelha de leitura aberta do cDNA da AQP5 de rato. A cadeia simples de cDNA de acima foi utilizada como modelo e amplificada por PCR (94°C, 1 min., 60°C, 1 min., 72°C, 2 min., durante 30 ciclos). O produto de PCR foi subclonado em plasmídeo BlueScript II KS(+). Nesta experiência, para se obter o cDNA exacto, realizou-se esta subclonagem 10 vezes. A sequência nucleotídica do DNS foi confirmada pelo método de terminador da cadeia, Daqui em diante, este plasmídeo recombinante é referido como pBlueScript II KS (+)-AQP5.

Efectuou-se depois o desenho dos primers para amplificar toda a rewgião que codifica a AQP5 e para incluir a região não traduzida na extremidade 5' do gene β-globina de Xenopus laevis, cuja existência tinha sido relatada no J. Biol. Chem., 258, 7924-7927 (1983). Utilizando o referido pBlueScript II KS (+)-AQP5 DNA como modelo e 50 pmol de primer, efectuou-se a amplificação por PCR (94°C, 1 min., 50°C, 1 min., 72°C, 2 min., durante 30 ciclos). O produto da PCR foi subclonado no vector pSP64poly (A) (produto de Pro-Mega). Este plasmídeo recombinante será, daqui em diante, referido como pSP64poly(A)-AQP5.

Exemplo Experimental 3 Síntese de RNA

Utilizando 5 μρ de digesto EcoRl do referido pSP64poly(A)-AQP5 DNA e SP6RNA polimerase, efectuou-se uma transcrição in vitro em 100 μ]!., em presença do cap analog 20 ΡΕ1206942 m7G(5')ppp(5')G a 30°C durante 1 hora, para sintetizar o RNA complementar (cRNA). O DNA do plasmideo foi depois digerido com RNase-free DNasel (Pharmacia Biotech), extraído com fenol/clorofórmio e extraído duas vezes com etanol. O cRNA assim obtido foi suspenso em água destilada para ser injectado nos oócitos.

Exemplo Experimental 4 Preparação de oócitos e expressão da proteína

Prepararam-se os oócitos de acordo com o método descrito em Taylor et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 6585-6589(1989)), como se segue. Anestesiaram-se indivíduos fêmea adultos de Xenopus laevis, retiraram-se os oócitos (estádios V e VI) e colocaram-se em solução tamponada de Bart (5 mM de Tris-HCl, 88 mM de NaCl, 1 mM KC1, 2,4 mM de NaHC03, 0,33 mM de Ca(N03)2, 0,41 mM de CaCl2, 0,82 mM de

MgS04, penicilina + estreptomicina, 10 μq/mL, pH 7,2; esta solução tampão é, daqui em diante, referida como "MBS"). Dispersaram-se depois as células respectivas, por agitação suave durante 1 hora, em solução tamponada de Barth contendo 2 mg/mL de colagenase tipo II mas sem ião de cálcio. Lavaram-se cuidadosamente estes oócitos , em solução tamponada de Barth a 20°C, de um dia para o outro e no dia seguinte efectuou-se uma microinjecção segundo o procedimento que se segue.

Dissolveram-se, em 50 nL de água destilada, 5 ng da AQP5 cRNA obtido no Exemplo Experimental 3, só ou 21 ΡΕ1206942 conjuntamente com 25 ng de poly (A)+ RNA da glândula lacrimal, obtida no Exemplo Experimental 1, e microin-jectou-se a solução nos oócitos com uma micropiteta de vidro esterilizada utilizando um Drummond Microinjection System (produto de Drummond) . Injectaram-se 50 nL de água destilada no grupo de controlo. Cultivaram-se os oócitos em MBS a 20°C durante 3 dias, tendo-se mudado o fluido de cultura diariamente para provocar a expressão da AQP5 e da proteína da glândula lacrimal.

Confirmou-se a expressão da proteína AQP5, sujeitando a fracção da membrana dos oócitos a electro-forese de gradiente em gel de poliacrilamida SDS e efectuando uma análise blot Western, utilizando o antisoro de coelho obtido por utilização do terminal C da AQP5. Adicionalmente, utilizando um espécime imobilizado de oócito, confirmou-se a expressão da proteína AQP5 na membrana celular por uma técnica de imunofluorescência, utilizando um microscópio de fluorescência.

Exemplo 1 Teste sobre o efeito de carvona na permeabilidade à água

Incubaram-se os oócitos obtidos no Exemplo Experimental 4, em MBS isotónico contendo 5 mM de cAMP (concentração de sal, ca., 200 mOsm) durante 30 minutos. Os oócitos foram depois transferidos para MBS isotónico, tendo-se microinjectado nos oócitos 10”8M, 10“7M ou 10“6M de carvona e cultivado em MBS isotónico durante 4 horas. 22 ΡΕ1206942

Microinjectou-se água destilada no grupo de controlo. Realizou-se a experiência de permeabilidade à água de acordo com o protocolo que se segue. A experiência de permeabilidade à água foi realizada de acordo com o método descrito na literatura (Science, 256, 385-387 (1992; ) e Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 6269-6273 (1994)), como se segue.

Cultivaram-se os oócitos acima em MBS isotónico (200 mOsm) durante 4 horas e transferiram-se para MBS hipotónico (40 mOsm) e foram ai cultivados a 20°C, tendo-se efectuado fotografia em série, utilizando um microscópio de contraste de fase (produto de Olympus), com intervalos de 10 segundos. Calcularam-se o volume e as alterações de volume por tratamento computadorizado a partir da imagem de um sistema de análise de imagem (produto de Fuji Film). O valor da permeabilidade à água (Pf) foi calculado a partir do gradiente inicial V/V0 contra o tempo (d(V/V0)/dt) , o volume inicial do oócito (Vo = 9 x 1CT4 cm3) , a área inicial do oócito (S = 0,045 cm2) e o volume molar da água (Vw 0 18 cm3/mol), por meio da equação seguinte:

Pf (cm/seg) = [V0 x (d (V/V0) /dt ] / [S x Vw x (mOsmin - mOsmout]

Na equação, V representa o volume (cm3) do oócito após o tempo t; mOsmin representa a concentração inicial de sal no MBS, que era, neste caso, de 200 mOsm; mOsmout 23 ΡΕ1206942 representa a concentração de sal no MBS hipotónico, que era, neste caso, de 40 mOsm.

Os resultados são mostrados na Fig. 1. As experiências 1 a 8 nos desenhos de acordo com as condições 1 a 8 seguintes:

Oócitos Injecção Experiência 1 Injectado com cRNA Água destilada Experiência 2 Injectado com cRNA + poli (A) RNA Água destilada Experiência 3 Injectado com cRNA + poli (A) RNA Carvona 10“8 M Experiência 4 Injectado com cRNA + poli (A) RNA Carvona 10~7 M Experiência 5 Injectado com cRNA + poli (A) RNA Carvona 10“6 M Experiência 6 Injectado com água destilada Água destilada Experiência 7 Injectado com água destilada Carvona 1CT7 M Experiência 8 Injectado com água destilada Carvona 10~6 M

Exemplo 2 Teste sobre o efeito de substâncias odorantes sobre a permeabilidade à água

Efectuou-se a experiência de permeabilidade à água da mesma forma do Exemplo 1, utilizando 2-isobutil-3- 24 ΡΕ1206942 metoxipirazina, 1CT7 M ou 1(Γ6 M ou acetato de citronelilo, 10“7 M ou IO-6 M, cada uma delas como outra substância odorante, em substituição de carvona.

Os resultados são mostrados na Fig. 1. As experiências 1 a 9 nos desenhos foram realizadas de acordo com as condições experimentais 1 a 9 seguintes:

Oócitos Injecção Experiência 1 Injectado com cRNA Água destilada Experiência 2 Injectado com cRNA Água destilada + poli (A) RNA Experiência 3 Injectado com cRNA 2-isobuti1-3-meto + poli (A) RNA xipirazina 1CT7 M Experiência 4 Injectado com cRNA 2-isobuti1-3-meto + poli (A) RNA xipirazina 1CT6 M Experiência 5 Injectado com cRNA Acetato de + poli (A) RNA citronelilo IO-7 M Experiência 6 Injectado com cRNA Acetato de citro + poli (A) RNA nelilo IO-6 M Experiência 7 Injectado com Água destilada água destilada Experiência 8 Injectado com 2-isobuti1-3-meto água destilada xipirazina IO-6 M Experiência 9 Injectado com Acetato de citro água destilada nelilo 1CT6 M

Com referência ao Exemplo 1, a Experiência 1 mostrou a permeabilidade à água de oócitos nao injectados 25 ΡΕ1206942 com poli (A)+ RNA originária da glândula lacrimal expressando a proteína AQP5; o resultado indicou claramente a existência da actividade de um canal de água, quando comparado com as Experiências 6 a 8, em que a AQP5 não era expressa. As experiências 2 a 5 mostraram a permeabilidade à água de oócitos em presença tanto da proteína AQP5, como da proteína expressa por injecção de poli (A)+ RNA originária da glândula lacrimal. Tornou-se aparente, a partir da Experiência 2, que a permeabilidade à água foi consideravelmente diminuída em presença da proteína expressa por injecção de poli (A)+ RNA originária da glândula lacrimal. A comparação deste resultado com o resultado da Experiência 1 indicou que a proteína expressa por injecção de poli (A)+ RNA originária da glândula lacrimal inibia a permeabilidade à água da proteína AQP5.

Confirmou- -se, a partir da Experiências 3 a 5, que a injecção de carvona nos oócitos, nas condições acima, resultou na recuperação da permeabilidade à água até ao nível observado na Experiência 1.

Com referência ao Exemplo 2, as Experiências 3 a 6 indicam que, apesar de não tanto como a carvona, a 2-isobutil-3-metoxipirazina ou o acetato de citronelilo, também elevam a permeabilidade à água. A partir destes resultados, verificou-se que muitas substâncias diferentes, variando muito na estrutura química, tal como a carvona, que é um derivado hidrocarbonado cíclico (cetona mono-terpénica) , a 2-isobutil-3-metoxipirazina que um derivado 26 ΡΕ1206942 de composto heterocíclico e o acetato de citronelilo, que é um derivado hidrocarbonatado de cadeia, elevam a permeabilidade à água da AQP5 em medida notável.

Assim, a composição da presente invenção restaura e mantém o nível de actividade de permeabilidade à água de células deprimidas pela proteína expressa pela injecção de poly (A)+ RNA com origem na glândula lacrimal, em presença de AQP para um estado mais activo.

Exemplo 3 Actividade de estimulação da lacrimação por substâncias odorosas no ratinho

Utilizando (R)-(-)-carvona, (+)-pregona, borneol, trans-A-metilciclo-hexanol e mentol, todas substâncias odorantes, dissolvidas em 0,1% de óleo de rícino hidrogenado-salina, avaliaram-se in vivo as actividades estimulantes da lacrimação destas substâncias. 0 método utilizado foi o que se segue.

Recolheu-se o fluido lacrimal a partir do olho esquerdo de ratinhos, a intervalos de 15 min., utilizando um tubo microcapilar de vidro (capacidade de aspiração de 0,5 μΊ^/32 mm). A quantidade de fluido lacrimal aspirado foi medido em comprimento (mm) utilizando uma craveira e convertido em μΐϋ para utilização como um marcador do débito lacrimal. Os ratinhos foram anestesiados por administração intraperitoneal de Solução Anestésica de Nembutal (0,2 mL/10 g de peso corporal, dosagem de 60 mg/kg) . Após 27 ΡΕ1206942 confirmação da perda do reflexo à dor nos ratinhos, iniciou-se a medida do débito lacrimal. As medições foram invariavelmente efectuadas a intervalos de 15 min., desde o principio ao fim. Após duas medidas iniciais efectuadas com 15 minutos de intervalo, foi imediatamente administrada cada uma das substâncias de teste (dosagem de 30 mg/kg) pela veia caudal dos ratinhos com uma dose de 0,1 mL/10 g de peso corporal, após o que a colecção de fluido lacrimal foi efectuada a intervalos de 15 min.

Como resultado, observaram-se aumentos marcados na lacrimação 15 minutos após administração intravenosa de cada uma das substâncias odorantes. Os resultados são mostrados na Tabela 1. A alteração do débito de lacrimação foi expressa em percentagem do débito lacrimatório a cada medida, em relação à média de débito lacrimatório em duas medidas iniciais antes da administração de cada substância de teste.

Tabela 1

Substância de teste Alteraçao no débito lacrimal após 15 minutos (%) (R)-(-)-carvona 61,5 (+)-pregona 70,2 Borneol 97,5 rrans-4-metilciclo-hexanol 85, 4 Mentol 88, 1 Veiculo 2, 8 28 ΡΕ1206942

Exemplo 4 Efeito da utilização combinada de uma substância odorante e cloridrato de policarpina sobre o débito lacrimal em ratinhos

Avaliou-se o efeito da utilização combinada de (R)-(-)-carvona, i.e., a substância odorante utilizada no Exemplo 1, e cloridrato de pilocarpina. 0 método utilizado foi o que se segue. (Determinação do débito lacrimal)

Recolheu-se o fluido lacrimal a partir do olho esquerdo de ratinhos, a intervalos de 15 min., utilizando um tubo microcapilar de vidro (capacidade de aspiração de 0,5 μΙ-,/32 mm). A quantidade de fluido lacrimal aspirado foi medido em comprimento (mm) utilizando uma craveira e convertido em μ]1, para utilização como um marcador do débito lacrimal. Os ratinhos foram anestesiados por administração intraperitoneal de Solução Anestésica de Nembutal (0,2 mL/10 g de peso corporal, dosagem de 60 mg/kg). Após confirmação da perda do reflexo à dor nos ratinhos, iniciou-se a medida do débito lacrimal. As medições foram invariavelmente efectuadas a intervalos de 15 min., desde o principio ao fim. Após duas medidas iniciais efectuadas com 15 minutos de intervalo, foi imediatamente administrada a substância de teste pela veia caudal dos ratinhos por uma dose de 0,1 mL/10 g de peso corporal, após o que a colecção 29 ΡΕ1206942 de fluido lacrimal foi efectuada a intervalos de 15 min. Imediatamente após a medida do débito de lacrimação 15 minutos após a administração da substância de teste, administrou-se subcutâneamente cloridrato de pilocarpina a 0,005% a 0,1 mL/10 g de peso corporal (dosagem de 5 mg/kg). A colheita foi efectuada mais 4 vezes a intervalos de 15 minutos.

Como resultado, notaram-se aumentos marcados da lacrimação desde 10 e minutos pares, até dezenas de minutos após administração intravenosa, e que o efeito foi mantido durante um período longo de tempo. Os resultados de (R)—(— )-carvona (dosagem de 30 mg/kg) são mostrados no gráfico da Fig. 3. A alteração do débito de lacrimação foi expressa em percentagem do débito lacrimatório a cada medida, em relação à média de débito lacrimatório em duas medidas iniciais antes da administração da substância de teste. A dimensão do tempo representa o tempo depois da administração de carvona.

Pode ser observado a partir do Exemplo 3 que a administração de carvona provoca um aumento, não inferior a 60%, no débito da lacrimação durante um curto espaço de tempo, tal como de 15 a 30 minutos. Adicionalmente, o efeito diminuiu gradualmente com o tempo. O Eexemplo 4 mostrou que a utilização combinada de pilocarpina resultou num maior prolongamento do efeito. 30 ΡΕ1206942

EXEMPLOS DE PREPARAÇÃO DE FÁRMACOS São dados abaixo alguns exemplos gerais de formulação para gotas oculares, destinando-se estes a auxiliar a compreensão da presente invenção, não definindo São dados abaixo alguns exemplos gerais de formulação para gotas oculares, destinando-se estes a auxiliar a compreensão da presente invenção, não definindo de algum modo o âmbito da invenção.

Gotas oculares 1 (por 100 mL)_

Carvona 100 mg

Óleo de rícino 1% hidrogenado 1 mL

Soro fisiológico q.s.

Gotas oculares 2 (por 100 mL)_

Benzoato de denatonium 100 mg

Óleo de rícino 1% hidrogenado 1 mL

Soro fisiológico q.s.

Gotas oculares 3 (por 100 mL)_

Carvona 100 mg

Glicerina concentrada 2500 mg

Polissorbato 80 2000 mg

Di-hidrogenofosfato de sódio 2H2O 200 mg

Hidróxido de sódio IN q.s. Ácido clorídrico IN q.s. Água purificada estéril q.s.

Também podem ser preparadas, de modo similar, gotas oculares contendo carvona em concentrações de 0,001%, 0,005%, 0,05%, 0,1% e 3,0% (p/v), ajustando adequadamente na formulação os níveis de carvona e aditivos. 31 ΡΕ1206942

Gotas oculares 4 (por 100 mL)__ 2-Isobutil-3-metoxipirazina 10 mg

Glicerina concentrada 2500 mg

Polissorbato 80 2000 mg

Di-hidrogenofosfato de sódio 2H2O 200 mg Hidróxido de sódio IN q.s. Ácido clorídrico IN q.s. Água purificada estéril q.s.

Gotas oculares 5 (por 100 mL)__

Acetato de citronelilo 10 mg

Glicerina concentrada 2500 mg

Polissorbato 80 2000 mg

Di-hidrogenofosfato de sódio 2H20 200 mg

Hidróxido de sódio IN q.s. Ácido clorídrico IN q.s. Água purificada estéril q.s.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

As novas composições abridoras de canal de água de acordo com o primeiro aspecto da invenção, constituídas como acima, possuem actividade como abridoras de canal de água AQP5. A composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção, é capaz estimular e manter a actividade do canal de água AQP5 na glândula lacrimal, e, pela sua utilização, pode proporcionar-se uma composição 32 ΡΕ1206942 farmacêutica para utilização oftálmica, particularmente uma composição estimulante da lacrimação possuindopropriedades de acção rápida e duradoura, e um fármaco terapêutico para a deficiência do epitélio ceratoconjuntival.

Lisboa, 22 de Novembro de 2006

Claims (5)

1. ΡΕ1206942 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um ligando da lipocalina para a manufactura de uma composição para tratamento de uma deficiência do epitélio ceratoconjuntival, em que o referido ligando da lipocalina é um composto seleccionado do grupo que consiste em glicolípidos, porfirinas, benzoato de denatónio, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilselenazole, acetato de citronelilo, carvona, 2-iso-pentilpirazina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, 3,7-dimetiloctanol, 2-nonenal, linalol, benzoato de benzilo, compostos tipo almiscar com 3 membros em anel, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldeido, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, β-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroani-sole, 5-a-asdrost-16-en-3-ona, pentadecalactona, sulfito de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, ( + )-pregona e trans-4-metilciclo-hexanol.
2. 2. Utilização de um ligando da lipocalina para a manufactura de uma composição para acelaramento da cicatrização de uma ferida ceratoconjuntival, em que o referido ligando da lipocalina é um composto seleccionado do grupo que consiste em glicolípidos, porfirinas, benzoato de denatónio, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilselenazole, acetato de citronelilo, carvona, 2-iso-pentilpirazina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, 3,7-dime-tiloctanol, 2-nonenal, linalol, benzoato de benzilo, com- 2 ΡΕ1206942 postos tipo almíscar com 3 membros em anel, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldeído, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, β-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroaniso-le, 5-a-asdrost-16-en-3-ona, pentadecalactona, sulfito de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, (+)-pregona e trans-4-metilciclo-hexanol.
3. 3. Utilização de um ligando da lipocalina para a manufactura de uma composição para tratamento de elonga-mento das células do epitélio ceratoconjuntival, em que o referido ligando da lipocalina é um composto seleccionado do grupo que consiste em glicolípidos, porfirinas, benzoato de denatónio, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilselenazole, acetato de citronelilo, carvona, 2-iso-pentilpirazina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, 3,7-dime-tiloctanol, 2-nonenal, linalol, benzoato de benzilo, compostos tipo almíscar com 3 membros em anel, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldeído, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, β-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroaniso-le, 5-a-asdrost-16-en-3-ona, pentadecalactona, sulfito de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, (+)-pregona e trans-4-metilciclo-hexanol.
4. 4. Utilização de um ligando da lipocalina para a manufactura de uma composição para tratamento de xero-ftalmia, em que o referido ligando da lipocalina é um composto seleccionado do grupo que consiste em glico- 3 ΡΕ1206942 lípidos, porfirinas, benzoato de denatónio, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2-amino-4-butil-5-propilselenazole, acetato de citronelilo, carvona, 2-iso-pentilpirazina, 4-butil-5-propiltiazole, timol, 3,7-dimetiloctanol, 2-nonenal, linalol, benzoato de benzilo, compostos tipo almíscar com 3 membros em anel, 2-metil-3-metoxipirazina, benzaldeído, quinolina, 2-feniletanol, cineol, isovalerato de isobutilo, ácido isovalérico, β-ionona, 2-trans-6-cis-nonadienal, geosmina, tricloroanisole, 5-a-asdrost-16-en-3-ona, penta-decalactona, sulfito de dimetilo, 4-hidroxioctanolactona, acetato de etilo, (+)-pregona e trans-4-metilciclo-hexanol.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido ligando da lipo-calina é utilizado em combinação com um fármaco paras-simpatomimético. Lisboa, 22 de Novembro de 2006