KR20080061431A

KR20080061431A - 에이디피-라이보실 사이클레이즈 억제제를 이용한 고혈압 및 당뇨병성 신증의 치료제

Info

Publication number: KR20080061431A
Application number: KR1020060135890A
Authority: KR
Inventors: 김우현; 권호정; 임미재; 김선영; 박광현; 라소영; 남태식; 김병주; 룩사나걸
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-07-03
Also published as: US8314082B2; US20110281826A1; WO2008082169A1; EP2102149B1; EP2102149A4; EP2102149A1; US20100069619A1; KR100879253B1

Abstract

본 발명은 세포내 칼슘 증가와 관련된 신호전달 이차전령(second messenger) 분자를 생성하는 효소로 알려진 에이디피-라이보실 사이클레이즈 (ADP-ribosyl cyclase, 이하 ADPR cyclase라 함)의 강력한 억제작용을 갖는 하기 화학식 1의 신규한 비스페닐 유도체에 관한 것이다.

(상기 식에서, X와 Y 는 서로 단일결합 혹은 이중결합으로 이루어진 탄소, 질소, 및 황, 산소 등이고,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀은 독립적으로 히드록실기(OH), 수소 (H), 아민 (-NH₂), 아미드 (-NH), 니트로(-NO₂), 니트로소 (-NO), 카르복실 (-COOH), 알데히드 (-CHO), 카르보닐 (-C=O), 설포히드릴 (-SH), 설폭실 (-SO₃H) 로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다)

본 발명에 의하면, 세포내 칼슘 증가와 관련된 신호전달 이차전령(second messenger) 분자를 생성하는 효소로 알려진 ADPR cyclase의 강력한 억제작용을 갖고 있는 신규 화합물을 제공함으로써 이를 심장, 신장 또는 뇌 등의 질병 치료에까지 사용할 수 있다. 이 물질이 ADPR-cyclase를 억제하는 분자적 측면에서의 기전은, 기질인 NAD⁺ (nicotinamide adenine dinucleotided) 가 ADPR-cyclase의 활성부위 (active site)와의 결합을 억제하는 것이다. 따라서 NAD⁺를 기질 또는 조효소로 이용하는 모든 효소, mono ADP-ribose transferase, poly ADP-ribose polymerase, sirtuins 등, 들의 억제 또는 활성을 유도할 수 있다.

그러므로 이 물질은 ADPR-cyclase 억제제뿐만 아니라 NAD⁺를 기질로 하는 mono ADP-ribose transferase, poly ADP-ribose polymerase, sirtuins 등에 의하여 유발되는 질환, 예를 들어 암, 노화, 당뇨, 비만, 치매 등의 치료제로도 사용될 수 있다.

ADPR cyclase, ADPR cyclase 억제제, cADPR 길항제, 세포내 칼슘 유입, 세포내 칼슘 유리 억제제

Description

신규한 비스페닐 유도체, 그의 제조방법 및 그의 에이디피-라이보실 사이클레이즈 억제제로서의 용도{New bisphenyl derivatives, a method for preparing thereof, and use as ADP-ribosyl cyclase inhibitors}

도 1은 4,4'-디히드록시아조벤젠 (4,4'-dihydroxyazobenzene, 이하 4,4'-DHAB라 한다.), 안지오텐신 II 처리시 마우스 메산지알 (mesengial) 세포내 칼슘농도의 변화 및 cADPR 생성을 도시한 도면이다.

도 2는 2,2'-디히드록시아조벤젠 (2,2'-dihydroxyazobenzene, 이하 2,2'-DHAB라 한다.), 안지오텐신 II 처리시 쥐 심근 세포내 칼슘농도의 변화 및 cADPR 생성을 도시한 도면이다.

도 3은 2,2'-DHAB, 4,4'-DHAB, OKT3 처리시 T-세포내 (Jurkat T cell) 칼슘농도의 변화 및 cADPR 생성을 도시한 도면이다.

도 4는 고혈압을 유도한 쥐에서 2,2'-DHAB 의 혈압강하 효과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 강력한 ADPR cyclase의 억제작용을 갖는 신규한 비스페닐 유도체 에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 세포내 칼슘 증가와 관련된 신호전달 이차전령(second messenger) 분자를 생성하는 효소로 알려진 ADPR cyclase의 강력한 억제작용을 갖고 있어 심장, 신장 또는 뇌 등의 질병 치료제로 사용할 수 있는 하기 화학식 1의 신규한 비스페닐 유도체에 관한 것이다.

[화학식 1]

ADPR cyclase는 NAD로부터 cADPR을 형성 하는데 이 cADPR은 식물에서부터 포유동물에 이르기까지 광범위하게 세포내 칼슘농도를 증가 시키는 이차전령으로 작 용함이 입증되었다 [Thompson, M., White, T., Chini, E.N Braz J. Med. Biol. Res. 39: 739~748, 2006]. 또한 세포내 칼슘농도 균형 조절은 정상생체 유지의 절대적인 필수 기능이다.

칼슘의 이상증가는 세포괴사 (necrosis), 세포비대 (hypertrophy), 세포증식 (proliferation) 등 다양한 생체병리에 요인으로 알려져 왔다. 그러나 지금까지 ADPR cyclase의 억제제는 알려진바 없다.

칼슘은 세포의 많은 기능을 직접 또는 간접적으로 조절하는 다기능성이온 (mutifunctional ion) 으로서, 안정한 상태에서는 세포내 칼슘농도는 10^-7M 정도로 유지된다. 그러나 질병 상태에서는 세포내 칼슘농도가 정상치의 10～100 배 정도로 증가되며, 만일 이와 같은 높은 농도가 지속적으로 유지되는 상태에서는 세포의 많은 기능이 영향을 받게 되며, 결과적으로 세포의 정상기능을 소실하게 된다.

고혈압 또는 고혈압을 동반한 당뇨병, 비만, 치매, 허열, 세포증식을 동반한 질환에서도 세포내의 칼슘대사조절에 이상이 생겨, 세포내의 칼슘농도가 정상보다 높게 유지된다 [Resnick, L.M. Ionic basis of hypertension, insulin resistance, vascular disease, and related disorders. The mechanism of Syndrome X. Am. J. Hypertens. 6:123S～134S, 1993].

일예로 고혈압과 같은 만성질환자를 살펴보면, 여러 가지 유전적, 환경적 혹은 어떤 질병의 이차적인 원인에 의해서 혈관 평활근세포내의 칼슘농도가 지속적으로 정상치보다 높은 수치를 나타내며, 그 결과 혈관 평활근의 수축을 유발시켜 말초혈관의 저항이 증가되어, 이로 인해 혈압이 정상혈압보다 상승된 상태로 지속적으로 유지되어 고혈압이 초래된다.

이와 같이 상승된 혈압은 이차적으로 혈관평활근세포와 섬유조직의 증식과 비대를 초래하고, 그 결과, 말초 혈관 저항과 혈압을 더욱 증가시켜, 심혈관계, 뇌 및 신장 등의 장기 기능이 저해되어 심근경색, 협심증, 중풍 및 만성 심부전증 등으로 사망에 이르게 한다고 알려져 있다 [Cowley, A.W.Jr. Long-term control of arterial blood pressure. Physiol. Rev. 72:231-300, 1992].

췌장으로부터 인슐린 분비에는 ADPR cyclase의 일종인 CD38 활성에 의한, 즉 cADPR에 의한, 칼슘증가가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 당뇨병 유발은 안지오텐신의 생성을 증가시키는데 이 펩타이드 호르몬은 신장질환, 고혈압 및 심장병을 유발시킬 뿐만 아니라 ADPR cyclase을 활성화시키는 (unpublished) 것으로 잘 알려져 있다.

따라서 ADPR cyclase는 면역세포, 심장근세포, 췌장 베타세포, 신장근세포 및 신경세포 등에 존재하면서 여러 호르몬의 수용체와 연관되어 세포내 칼슘농도의 증가 및 여러 생리활성을 조절함으로써 이 ADPR cyclase의 발현 또는 활성 조절에 이상이 있으면 생리현상 (면역, 신장기능, 인슐린분비, 심혈관 기능) 조절에 이상을 일으킬 수 있다.

이 외에 ADPR-cyclas와 같이 NAD⁺를 기질로 사용하는 효소는 mono ADP-ribose transferase, poly ADP-ribose polymerase, sirtuins 등이 있다. 예를 들어 poly ADP-ribose polymerase 가 비정상적으로 과발현 또는 활성화 되면 세포내 NAD⁺의 고갈을 유도하며, 결과적으로 세포죽음, 심장질환, 염증질환, 신경질환 등과 관련된 병을 일으키는 것으로 알려져 있다 [Belenky P., Bogan K. L., Brenner C. NAD+ metabolism in health and disease. Trends Biochem. Sci. (2006), doi:10.1016/j.tibs.2006.11.006).

이같은 ADPR cyclase는 여러 호르몬에 의하여 활성화되며 이 효소는 기질 β-NAD로부터 산물인 사이클릭 에이디피-라이보스 (cyclic ADP-ribose, 이하 "cADPR"라 함)를 생성하는데 이 cADPR은 거의 모든 장기에서 세포내 칼슘을 증가시킨다. 칼슘의 이상증가는 세포괴사 (necrosis), 인슐린분비 (insulin secretion), 세포비대 (hypertrophy), 세포증식 (proliferation) 등 다양한 생체병리에 요인으로 알려져 왔다.

그러나 아직까지 ADPR cyclase의 억제제는 알려진 바 없다. 현재까지 가장 잘 연구가 된 ADPR cyclase는 T-세표 표면 항원인 CD38로서 이 분자는 면역세포 뿐만 아니라 여러 장기에 널리 발현되어 있다.

그러나 심장, 신장, 뇌에는 CD38과 다른 ADPR cyclase가 발현된다고 밝혀졌다 [Partida-Sanchez S, Cockayne D. A., Monard S., Jacobson E. L., Oppenheimer N., Garvy B., Kusser K., Goodrich S., Howard M., Harmsen A., Randall T. D., Lund F. E. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat Med 7:1209-16, 2001].

따라서 장기 특이적 ADPR cyclase 억제제의 발견 또는 합성은 세포내 칼슘증가로 유발된 병을 치료하는데 도움이 될 것이다. 또한 ADPR cyclase에 활성기전은 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 억제제의 발견 또는 합성은 이 효소에 기전을 밝히는데 도움이 된다.

이에 본 발명자는 신규 ADPR cyclase 억제화합물을 합성하여 이 억제제가 가지는 효과를 시험하여 보았으며, 그 결과 특정한 신규 비스페닐 유도체가 강력한 ADPR cyclase의 억제작용 및 조직 세포별 선택성을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 신규 비스페닐 유도체를 사용하여 ADPR cyclase 억제 함으로써 각 조직 세포별 선택적 억제 효과를 제공하고자 하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명은 ADPR cyclase를 선택, 특이적으로 억제하는 저 분자량의 신규 비스페닐 유도체를 심장 혹은 신장 또는 뇌 등의 질병 예방 및/또는 치료에 이용하고자 하는데 있다.

본 발명의 일견지에 의하면, 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 비스페닐 유도체가 제공된다.

[화학식 1]

본 발명의 제2견지에 의하면, 또한 하기식 1의 신규한 비스페닐 유도체의 제조방법도 제공된다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 하기식 1의 디아조벤젠 유도체는 화학식 2의 니트로벤젠 유도체를 화학식 3의 페놀과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 다음과 같은 반응식으로도 나타낼 수 있다.

[화학식 2] [화학식 3] [화학식 1]

(상기 식에서, R₁₁과 R₁₂ 는 화학식 1의 R₁~R₁₀에서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.)

본 발명의 방법에서 출발물질로 사용된 화학식 2의 아미노페놀 유도체는 당해 기술분야에서 공지된 화합물이며, 화학식 2를 화학식 3과 반응시킴으로써 편리하게 제조될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 화학식 2의 아미노페놀 유도체를 진한 염산과 증 류수 1:1 용액 중에서 화학식 3의 페놀 유도체와 반응시킴으로써 화학식 1의 화합물을 제조한다.

본 반응은 일반적으로 4 ℃ 의 온도, 바람직하게는 0 ℃ 이하의 온도에서 수행할 수 있다. 반응시간은 일반적으로 2 내지 6시간 바람직하게는 3 내지 4시간내이다.

반응이 완결된 후 수득된 화학식 1의 화합물은 필요에 따라 통상적인 후처리 방법, 예를 들면 재결정화 ,크로마토그래피 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 ADPR cyclase를 선택, 특이적으로 강력하게 억제하는 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 각 세포별 선택적 억제제, 나아가 심장 혹은 신장 또는 뇌 등의 질병 예방 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.

특히 화학식 1 유도체중 4,4´-디히드록시아조벤젠, 2,2´-디히드록시아조벤젠, 레스베라트롤을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

이하의 실험예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 이와 같이 심혈관계 질환에서 나타나는 ADPR-cyclase의 활성을 억제하는 기전을 경유하여 심혈관계 심장, 신장 질환을 선택, 특이적으로 억제하는데 기여하는 것으로 확인되었다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1에서 목적 화합물은 ADPR cyclase를 선택, 특이적으로 강력하게 억제하는 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 각 세포별 선택적 억제제, 나아가 심장 혹은 신장 또는 뇌 등의 질병 예방 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물 1을 임상적으로 이용하고자 할 경우에, 이 활성화합물은 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방법에 따라 약제학적인 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로치제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있도록 즉시 사용형의 주사용 건조분말 등의 형태인 주사제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다.

이러한 목적을 위해 사용되는 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를 들면, 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁제, 색소, 향료 등이 있으며, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다.

이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소 적용할 수 있다. 또한 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 제제를 장용피가 피복된 제제로 제형화하는 것이 바람직할 수도 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 목적으로 비스페닐 유도체의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료되어야 하는 질병의 상태 중증도에 따라 적절히 선택되나 일반적으로는 1일을 5mg 내지 35mg, 바람직하게는 10mg 내지 25mg의 양이 투여되도록 한다. 물론 환자 개개인의 상태나 질병의 상태 및 합병증 등을 고려하여 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하여 투여량을 적절히 증감시킬 수 있다.

활성성분의 1일 유효량은 1일 1회 투여하거나 일정시간 간격으로 수회, 바람직하게는 3-6회에 걸쳐 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에 의하면 세포내 칼슘 증가와 관련된 신호전달 이차 전령(second messenger) 분자를 생성하는 효소로 알려진 ADPR cyclase에 대한 강력한 억제제를 제공할 수 있으며, 이를 이용하여 심장, 신장 또는 뇌 등의 질병 치료에 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

이어서, 신장 조직 세포, 심장 조직 세포 및 T-세포에 대한 조성물의 선택적 인 억제 효과를 검증한 다음, 화학식 1 을 주성분으로 하는 억제제의 구조적 차이점을 검증하고자 한다. (하기 실시예 1-8은 화학식 1 유도체중 구체적으로 4,4'-디히드록시아조벤젠, 2,2'-디히드록시아조벤젠, 레스베라트롤을 사용한 결과이다.)

실시예 1 : 마우스 메산지알 세포내 칼슘의 농도 변화

(1) 실험방법

세포내 칼슘 농도 변화는 Xie et al [Xie GH, Rah SY, Yi KS, Han MK, Chae SW, Im MJ, Kim UH. Biochem Biophys Res Commun 307:713-718, 2003] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 칼슘 indicater인 5 μM fluo-3 AM 을 HBSS (HEPES 20 mM, NaCl 145 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, D-Glucose 5 mM, pH 7.4) buffer에서 마우스 메산지알 세포에 30분 동안 처리한 다음 HBSS buffer로 3회 씻어준다.

4, 4'-DHAB를 30분간 전처리한 뒤 안지오텐신 II 150 nM을 처리하여, 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하였다. 세포내 칼슘의 측정은 488nm 의 excitation 파장과 530nm의 emission 파장을 갖는 공초점 현미경에서 이루어졌으며 530nm에서의 이미지를 수집하여 칼슘의 농도를 산출하였다.

(2) 실험결과는 도 1 에 나타내었다. 도 1에서 보듯이, 안지오텐신 II 만을 처리하면, 처리 후 10초안에 세포내 칼슘농도가 증가하고, 증가된 상태로 200 초 이상 유지되었다.

반면, 10 nM의 4,4'-DHAB를 전처리하였을 때 (초기 칼슘을 제외한) 지속적으로 증가된 칼슘을 선택적으로 감소시키는 결과를 나타내었다.

실시예 2 : 쥐 심근 세포내 칼슘의 농도 변화

(1) 실험방법

쥐에서 심근 세포의 분리는 Xie et al [Xie GH, Rah SY, Yi KS, Han MK, Chae SW, Im MJ, Kim UH. Biochem Biophys Res Commun 307:713-718, 2003] 에 의해 보고된 방법으로 분리하였다.

구체적으로 200-250g의 쥐 (Sprague Dawley rat) 심장을 분리하여 랑겐도르프 (langandorff) 관에 매단 후 1 mM의 칼슘이 포함된 Krebs-Henseleit (KH) buffer (NaCl 119 mM, KCl 4.7 mM, CaCl₂ 2.5 mM, MgSO₄ 1.2 mM, KH₂PO₄ 1.2 mM, NaHCO₃ 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 11 mM, pH 7.4 at 37 ℃)로 관류시킨 후, 칼슘을 제거한 KH buffer로 5 분 동안 관류시켜 심장의 박동을 정지시킨다.

박동이 정지된 심장에 0.075% collagenase Type II와, (Worthington Biochemical Co, Lakewood, NJ), 0.08 protease Type IV가 포함된 KH buffer로 7분 동안 digestion시킨 후 좌심방을 분리하여 잘게 자른 다음 37 ℃에서 흔들어 주며 10분 간격으로 심근 세포를 수집한다.

분리되지 않은 조직은 200 mm mesh를 이용하여 제거한 다음 칼슘을 제거한 KH buffer를 이용하여 각각 40g에서 2분간 원심 분리하여 칼슘의 농도를 1.25 mM 까지 단계적으로 올린다.

세포외 칼슘의 농도를 올린 세포는 1%의 우혈청알부민 (bovine serum albumin) 이 함유된 KH buffer에서 1시간 반 동안 안정화시킨다. 안정화된 심근세포를 최소 영양 배지(minium essential media, MEM)로 원심분리를 이용하여 3회 씻어 주고 10 μg/ml 의 라미닌 (laminin)이 도포된 공초점 접시 (confocal dish)에 붙인 다음 세포내 칼슘을 측정하기 전까지 5% 의 이산화탄소와 95% 공기가 공급되는 37 ℃ 배양기에 보관한다.

심근세포의 viability test는 현미경을 이용한 막대모양의 심근세포와 트립판 블루 (tryphan blue)에 의한 염색을 기준으로 한다. 2,2'-DHAB를 전처리한 뒤, 세포내 칼슘농도의 측정은 실시예 1 과 같은 방법으로 실시하였다.

(2) 실험결과는 도 2 에 나타내었다. 도 2에서 보듯이, 안지오텐신 II 에 의한 칼슘농도 변화는 마우스 메산지알 세포에서 나타난 결과와 동일하였다. 1 μM의 2, 2'-DHAB를 전처리한 뒤, 안지오텐신 II를 처리한 결과 (초기 칼슘을 제외한) 지속적으로 증가된 칼슘을 선택적으로 감소시키는 결과를 나타내었다.

실시예 3 : T- 세포내 칼슘 농도의 변화

(1) 실험방법

T-세포에서의 칼슘농도 변화는 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

10 μM의 2,2'-DHAB와 30 μM의 4,4'-DHAB를 전처리한 뒤 5 μg의 OKT3(T-세포 수용체 항체)를 처리하였을 때 세포내 칼슘농도의 변화를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 3 에 나타내었다. OKT3에 의한 T-세포내에서 칼슘농도의 변화는 마우스 메산지알 세포와, 심근세포에서의 경우와 동일하게 급격히 증가된 농도가 200초 이상 유지되었다.

2,2'-DHAB와 4,4'-DHAB를 전처리하였을 때 마우스 메산지알 세포 및 심근세포와 다르게 증가된 칼슘농도의 변화를 보이지 않았다.

이같은 결과는 2,2'-DHAB와 4,4'-DHAB는 각각 마우스 메산지알 세포로 대변된 신장 및 심근 세포로 대변된 심장의 칼슘증가를 선택적으로 억제하는 유도체임을 입증하는 것이라 여겨진다.

실시예 4 : 마우스 메산지알 세포내 cADPR 농도의 변화

(1) 실험방법

세포내 cADPR 농도 변화는 Graeff R et al [Graeff R, Lee HC. A novel cycling assay for cellular cADP-ribose with nanomolar sensitivity. Biochem J 361:379-84, 2002] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 마우스 메산지알 세포에 10 nM의 4,4'-DHAB를 30분간 전처리한 뒤, 150nM의 안지오텐신 II를 60초간 처리한 후 0.6M 삼염화아세트산 (trichloroacetic acid)을 이용하여 세포내 cADPR을 추출한 뒤, 0.1ml의 추출물과, cADPR 표준용액을 50㎕의 ADPR cyclase(0.3 μg/ml), 니코틴아미드(nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨(sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50㎕를 넣고, 상온에서 15 분간 반응시켰다.

이 혼합액에 에탄올(ethanol, 2%), 알콜디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, 100 μg/ml), 레자주린(resazurin, 20 μM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 μg/ml), FMN(10 μM), 니코틴아미드(10 mM), 우혈청알부민(BSA, 0.1mg/ml), 인산나트륨(100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544nm와 590nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 1에 나타내었다. 마우스 메산지알 세포에서 안지오텐신 II 에 의한 cADPR은 대조군에 약 2 배가량 생성량이 증가하였으나, 10nM의 DHAB를 전처리하였을 경우 세포내 cADPR의 생성이 현저히 감소됨을 보였다.

실시예 5 : 쥐 심근 세포내 cADPR 농도의 변화

(1) 실험방법

심근 세포내에서의 cADPR 농도의 변화는 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였다. 1μM의 2, 2'-DHAB를 30분간 전처리하고, 150nM의 안지오텐신 II를 15초간 처리하였을 때 cADPR의 농도 변화를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 2 에 나타내었다. 쥐 심근 세포에서 안지오텐신 II 에 의한 cADPR의 농도는 대조군에 비해 약 5배가량 증가하였으나, 2,2'-DHAB를 전처리하면 cADPR의 증가가 억제되었다.

실시예 6 : T- 세포내 cADPR 농도의 변화

(1) 실험방법

T-세포내에서의 cADPR 농도의 변화는 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였다. 10μM의 2,2'-DHAB와 30μM의 4,4'-DHAB를 각각 30분간 전처리하고, 5μg의 OKT3를 60초간 처리하였을 때 cADPR의 농도 변화를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보듯이, T-세포에서 OKT3에 의한 cADPR의 농도는 대조군에 약 2배가량 증가하였고, 2,2'-DHAB와 4,4'-DHAB를 고농도로 각각 전처리하였을 때 cADPR의 증가는 전혀 억제되지 않았다.

이같은 결과로부터, 각 유도체는 신장 세포와, 심근 세포의 ADPR cyclase를 선택적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 7 : 고혈압 유도 쥐에서 2,2'- DHAB 의 혈압강하 효과

(1) 실험방법

고혈압을 유도시키기 위한 방법은 Nobre F. et al[Nobre, F., da Silva, C., Coelho, E., Slgado, H., Fazan, Jr. Antihypertensive Agents Have Different Ability to Modulate Arterial Pressure and Heart Rate Variability in 2K1C Rats. Am. J Hypertens 10:1079-1083, 2006]에 의해 보고된 방법으로 수행하였다.

구체적으로 마취시킨 쥐의 (8주령, 체중; 200-220 g, Orient, 한국) 왼쪽 신장 동맥을 0.2mm 직경의 은 소재의 클립으로 묶었다. 신장 동맥을 묶지 않고, 기타의 조건이 동일한 그룹을 대조구로 하였다. 처치 2주 후 수축기 혈압을 측정하여 혈압이 135-140 mmHg가 되는 쥐를 약물 투여군과 고혈압 대조군으로 사용하였다.

한 군당 쥐는 3마리씩으로 하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 약물 투여군은 58% 디메틸술목시드 (Dimethyl sulfoxide) 식염수 용액에 녹인 2, 2'-DHAB(428㎍/200g) 를 매일 4주간 복강 주사하였다. 대조군은 58% 디메틸술폭시드 식염수 용액만 매일 4주간 복강 주사하였다. 매주 혈압을 측정하여 비교하였다.

(2) 실험결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보듯이, 고혈압 대조군은 2주 후 수축기 혈압이 유의하게 증가한 반면 2,2'-DHAB 투여군은 정상 대조군 수준의 혈압 감소효과를 보였다.

실시예 8 : 제 1형 당뇨병성 신장 손실 마우스에서 4,4'- DHAB 과 레스베라트롤( resveratrol )의 치료 효과

(1) 실험방법

웅성 마우스(C57BL/6 mice, Orient, 한국) [체중 19-21g/마리]에 스트렙토조토신 (Streptozotocin, STZ, Sigma, USA) 75 mg/㎏과 5일후에 100 mg/kg으로 정맥 주사하여 당뇨병을 유발시켰다 [Tay, Y.-C., Wang, Y., Kairaitis, L., Rangan, G. K., Zhang, C., Harris, D. C. H., Can murine diabetic nephropathy be separated from superimposed acute renal failure-Kidney international, 68:391-398, 2005].

스트렙토조토신을 투여한 다음날부터 군당 6마리씩으로 하여 실험하며, 각 군의 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 매일 정오에서 오후 2시 사이에 약물 (21.4 μg/kg)을 대조군과 함께 2주간 복강 주사하였다.

혈당의 측정은 라이프스캔사 (Lifescan, Inc., USA) 의 One touch basic^TM을 사용하였으며 혈당측정 24시간 이전부터 약물 투여를 중지하였다.

마우스의 대사율 측정은 국내에서 생산 판매되는 메타볼릭 케이지 (metabolic cage)를 이용하여 24시간 동안의 사료와 물 섭취량, 소변량 등을 정량 하였고, 채취된 소변의 생화학적 검사를 위해 단백질측정용 시액 (Bio-Rad, USA), 크레아치닌 측정용 키트(아산제약, 한국)를 사용하였다.

(2) 실험결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	정상 대조군	당뇨 대조군	4, 4'-DHAB 투여군	레스베라트롤 투여군
혈중 글루코스 (mg/dl)	134.67 ± 8.62	509 ± 95.29	342 ± 36.06	441 ± 48.67
몸무게 (g)	24.23 ± 0.65	20.97 ± 1.86	22.13 ± 0.58	22.63 ± 0.70
사료 섭취량 (mg)	0.67 ± 0.26	3.25 ± 0.85	2.27 ± 0.61	3.12 ± 0.79
물 섭취량 (ml)	1.67 ± 1.15	12.00 ± 1.73	2.00 ± 1.73	5.67 ± 3.21
소변량 (ml/day)	1.22 ± 0.20	7.28 ± 1.98	2.27 ± 1.80	2.55 ± 2.09
소변 단백량 (mg/day)	3.82 ± 3.40	11.68 ± 3.63	4.01 ± 3.61	2.97 ± 2.11
크레아티닌 청소율 (ml/min/100g)	0.61 ± 0.17	3.90 ± 0.78	1.07 ± 1.02	0.91 ± 0.59

상기 표에서 보듯이, 4,4'-DHAB군과 레스베라트롤 (resveratrol)은 당뇨에 의한 체중감소를 유의하게 억제하였으며, 물과 사료 섭취량이 정상 실험군의 결과와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 당뇨병성 신증 (Diabetic nephropathy)에 의해 증가된 24시간 소변량과 소변의 단백질량도 약물 투여군에서 유의하게 감소하였다.

혈청내 크레아치닌 농도는 실험군별 차이가 없었으며 (data not shown) 당뇨에 의해 증가된 크레아치닌 청소율 (Creatinine clearance)을 비교해본 결과 약물 처리군에서 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

상술한 바에 따르면, ADPR cyclase의 억제제를 이용하여 인체 내 신장 및 심 장을 비롯한 각 장기에서 일어날 수 있는 질병의 기전을 연구할 수 있는 방법을 제공하고, 각 장기별 특이적인 억제제로서 보다 뛰어나고, 선택적인 질병 치료제 개발에 기초가 될 것으로 기대한다.

Claims

하기 화학식 1의 신규한 비스페닐 유도체.

[화학식 1]

(상기 식에서, X와 Y 는 서로 단일결합 혹은 이중결합으로 이루어진 탄소, 질소, 및 황, 산소 등이고,

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀은 독립적으로 히드록실기(OH), 수소 (H), 아민 (-NH₂), 아미드 (-NH), 니트로(-NO₂), 니트로소 (-NO), 카르복실 (-COOH), 알데히드 (-CHO), 카르보닐 (-C=O), 설포히드릴 (-SH), 설폭실 (-SO₃H) 로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다)
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 유도체가 4,4'-디히드록시아조벤젠인 것을 특징으로 하는 신규한 비스페놀 유도체
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 유도체가 2,2'-디히드록시아조벤젠인 것을 특징으로 하는 신규한 비스페놀 유도체
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 유도체가 레스베라트롤인 것을 특징으로 하는 신규한 비스페놀 유도체
화학식 2의 아미노페놀 유도체를 화학식 3의 페놀 유도체와 반응시킴을 특징으로 하여 청구항 1내 화학식 1의 디아조벤젠 유도체를 제조하는 방법

[화학식 2]

[화학식 3]

(상기 식에서, R₁₁ 과 R₁₂ 는 청구항 1내 화학식 1의 R₁~R₁₀에서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.)
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 비스페닐 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 ADPR cyclase 억제제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 비스페닐 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 mono ADP-ribose transferase, poly ADP-ribose polymerase, sirtuins 억제제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 비스페닐 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 신장 및 심혈관계 질환의 예방 및 치료제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 비스페닐 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 제7항에서 제시된 효소들에 의해 유도된 암, 노화, 당뇨, 비만, 치매 등의 예방 및 치료제.