JP3251673B2 - 酸化窒素生成の抑制方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は温血哺乳動物における酸
化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）生成の抑制方法に
関するものであり、さらに特に酸化窒素産生の抑制剤と
して、アミノグアニジンを投与することに関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】酸化窒素シンターゼはＬ−アルギニンの
Ｌ−シトルリンおよび酸化窒素（ＮＯ^. ）への混合機能
的酸化を触媒する（１，２）。ＮＯ^. は当該酸素のイソ
形に依存して、シグナル分子またはエフェクター分子と
して作用するものと見做される。構成イソ形の酸化窒素
シンターゼは少量のＮＯ^. を産生し、このＮＯ^. はグア
ニル酸シクラーゼを活性化して、内皮依存性弛緩（２）
および神経伝達（３）を仲介するｃＧＭＰの生成をもた
らす。ＮＯ^. はさらに大量にサイトカインおよび内毒素
誘導イソ形の酸化窒素シンターゼによって産生され、マ
クロファージにおいて、標的細胞に対するマクロファー
ジの細胞毒性作用を仲介するものと見做されるエフェク
ター分子として機能する（４）。

【０００３】ＮＯ^. は強力な血管拡張体であり、血流を
増加させるので、そしてまたＮＯ^.産生を刺激する血管
活性剤（たとえば、ヒスタミンおよびブラディキニン）
は血流および血管透過性の両方を増加させるので、ＮＯ
^. は糖尿病およびグルコース値上昇により誘発される血
流および血管透過性の増加に関与するものでありうる
（５）。

【０００４】最近に、インターロイキン−１（ＩＬ−
１）は膵島におけるサイトキン誘導イソ形の酸化窒素シ
ンターゼの発現を誘発させることが示された。ＮＯ^. の
産生は膵島機能に対するＩＬ−１の抑制作用を仲介する
エフェクター分子であるものとする提案がなされた
（６，７）。Ｎ^G −モノメチル−Ｌ−アルギニン（ＮＭ
ＭＡ）によって防止されるＩＬ−１誘発ＥＰＲ検出性鉄
−ニトロシルコンプレックスの発現は、膵島による酸化
窒素生成の確認に使用された（８）。また、タンパク質
合成抑制剤であるシクロヘキシミドはＩＬ−１−誘発ニ
トライト（ｎｉｔｒｉｔｅ）生成、ｃＧＭＰ蓄積および
膵島によるＥＰＲ検出性鉄−ニトロシルコンプレックス
生成を阻止することが示され、これによって、ＩＬ−１
が膵島においてサイトキン誘導イソ形の酸化窒素シンタ
ーゼを誘発することが確認された（７）。

【０００５】糖尿病合併症の病因はソルビトール、ｍｙ
ｏ−イノシトールおよび１，２−ジアシル−ｓｎ−グリ
セロールの代謝不均衡に、およびまた細胞および細胞外
の構成成分の非酵素的グリケーション（ｇｌｙｃａｔｉ
ｏｎ）に関連している（５）。このグリケーション関連
性は求核性ヒドラジン化合物であるアミノグアニジンが
これらのグリケーション生成物の生成を妨害し、そして
また数種の糖尿病により誘発される血管変質（５，
９）、神経変質（１０）およびコラーゲン変性（１１）
の発現を弱めるという証拠によって支持される。

【０００６】Ｂｕｃａｌａ等は最近になって（１２）、
グリケート化アルブミンによるインビトロＮＯ^. の抑制
がアミノグアニジン（これはアルブミンがグリケート化
剤にさらされるときに存在する）によって弱められるこ
とを報告し、そしてまたグリケーション生成物がＮＯ^.
活性を弱めることによって内皮依存性弛緩を減少させう
ることを示唆した。

【０００７】

【発明の開示】発明の簡単な説明 本発明にしたがい、温血哺乳動物における酸化窒素産生
の新規抑制方法が提供される。この方法は少量である
が、酸化窒素産生の抑制に有効な量のアミノグアニジン
を温血哺乳動物に投与することからなる。

【０００８】現時点で、糖尿病合併症の病因は不明のま
ま残されており、これらの合併病を防止することが証明
された公知処置方法は存在していない。糖尿病合併症は
血糖値およびグリケート化ヘモグロビンにより反映され
るように重篤な糖尿病に強く関連しており、血糖値を正
常にする努力によって、糖尿病合併症を防止および（ま
たは）後退させる試みの効果の実証は残されている。

【０００９】実験動物における糖尿病合併症がソルビト
ール回路を経るグルコースの増大した代謝に関連すると
いうかなりの証拠は存在するが、この代謝回路の阻害剤
がヒト糖尿病の合併症を防止するのに効果があるか否か
は不明のままである。糖尿病ラットにおける組織ソルビ
トールレベルはアミノグアニジンによって影響されない
ので、アミノグアニジンがソルビトール回路代謝に影響
を及ぼすようには見えない。

【００１０】アミノグアニジンは進行した非酵素的グリ
ケーション生成物の生成を防止することが報告されてい
るが、この作用を仲介するメカニズムは不明のままであ
る。非酵素的グリケーション生成物は多数の細胞および
細胞外の構成成分中に、およびまた糖尿病ではない、お
よび糖尿病のヒトおよび動物の組織中に見い出されてい
る。これらの生成物は、ほとんど全部の組織で非選択的
に生成され、蓄積するものと見做され、この組織は糖尿
病合併症に臨床的に重要な部位であるとは限らない。し
たがって、糖尿病合併症の病因における進行したグリケ
ーション最終生成物の重要性は不明のままである。

【００１１】アミノグアニジンによって阻止される血管
機能異常は糖尿病合併症の特徴であり、臓器損傷を伴な
う最終段階的構造変化に関連している（そしてまた関与
しうる）。

【００１２】アミノグアニジンの新規特徴は糖尿病ラッ
トの大動脈、神経および眼組織における血管機能障害の
発現を選択的に防止するが（血糖値は低下させない）、
糖尿病によってその血管機能が変性されていない組織に
おける血管機能には影響を及ぼさないことにある。同様
に、アミノグアニジンは（糖尿病に対して投与される同
一用量で）、対照ラットの組織のいずれにおいても、そ
の血管機能に対する作用を有しておらず、この組織には
糖尿病では血管機能障害がアミノグアニジンによって防
止される組織も含まれる。

【００１３】アミノグアニジンの第二の格別で予想外の
特徴は培養Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細胞（げっし動物インシュリ
ノーマ細胞系）におけるＩＬ−１β誘導酸化窒素シンタ
ーゼに対するその阻害能力の点でＮＭＭＡ（これは誘導
イソ形および構成イソ形の両方の酸化窒素シンターゼの
阻害剤として認められている）と均等の効力を有すると
ともに、他方では動脈血圧を高める点ではＮＭＭＡの効
力の僅か４０分の１以下であることにある。この事実は
当該医薬を血管および糖尿病進行によって打撃を受けた
他の組織の誘導酸化窒素シンターゼは阻害するが、血管
構成酸化窒素シンターゼは阻害しない（これが阻害され
ると高血圧が生じる）、投与量で投与することができる
ことからアミノグアニジンの治療的に極めて大きい利点
を示している。

【００１４】酸化窒素産生に対するアミノグアニジンの
有用な抑制活性の本発明による発見はまた、この医薬を
下記の目的で使用できることを示唆している： １． 糖尿病合併症の防止（これはアミノグアニジンが
糖尿病誘発血管機能障害を防止するという証拠にもとづ
いている）。 ２． 活性化したマクロファージおよびその他の細胞に
よる酸化窒素産生に関連しうる広範囲の急性および慢性
の疾患の予防／処置。このような疾患の例には、タイプ
１糖尿病、痛風、神経炎、神経学的障害、心不全、卒
中、糸球体腎炎、コラーゲン疾患、移植臓器拒絶反応お
よび免疫メカニズムによるその他の疾患が含まれる。

【００１５】３． 血圧降下、すなわち敗血症性ショッ
クの処置。 ４． 酸化窒素産生抑制用のアミノグアニジン類縁化合
物の開発。 ５． 酸化窒素産生の基質として働くことができ、従っ
て高血圧症、冠状動脈疾患、末梢血管疾患、血管けいれ
ん、および一般的眼血管系疾患の防止／処置に有用であ
ることができるアミノグアニジン類縁化合物の開発。

【００１６】発明の詳細な説明 本明細書は本発明の構成に係る主題を指摘し、特許請求
している請求の範囲によりまとめられているが、本発明
は添付図面と組合せた、下記の本発明の好適態様の詳細
な説明からさらに充分に理解することができる。

【００１７】これらの添付図面において、Ｆｉｇ１はＩ
Ｌ−１β誘導酸化窒素生成に対するアミノグアニジン
（ＡＧ）の作用効果を示すパネルＡ；Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細
胞によるｃＧＭＰ蓄積を示すパネルＢ；および膵島によ
るグルコース刺激分泌のＩＬ−１β誘発抑制を示すパネ
ルＣからなるグラフである。

【００１８】Ｆｉｇ２はＥＰＲ分光測定法による、膵島
によるＩＬ−１−誘発鉄−ニトロシルコンプレックス生
成に対するアミノグアニジン（ＡＧ）の作用効果を示す
グラフである。Ｆｉｇ３は平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対
するアミノグアニジン（ＡＧ）およびＮ^G −モノメチル
−Ｌ−アルギニン（ＮＭＭＡ）の作用効果を示すグラフ
である。Ｆｉｇ４はグルコース−（Ｇｌｕ）に対するア
ミノグアニジン（ＡＧ）およびＮ^G −モノメチル−Ｌ−
アルギニン（ＮＭＭＡ）の作用効果（パネルＡ）、およ
び血管アルブミン透過性（パネルＢ）および血流（パネ
ルＣ）の糖尿病誘発増加を示すグラフである。

【００１９】アミノグアニジンはＬ−アルギニンおよび
酸化窒素シンターゼの競合阻害剤、すなわちＮＭＭＡと
構造的に極めて類似しているから、すなわちこれらの化
合物は２個の化学的に均等なグアニド窒素基を有してい
るから、酸化窒素のＩＬ−１β誘発生成、およびＲｉｎ
ｍ５Ｆ細胞によるｃＧＭＰに対するアミノグアニジン
の作用効果を試験し、また同様の試験におけるＮＭＭＡ
の作用効果と比較した。

【００２０】Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細胞系は、げっし類動物の
β細胞のインシュリノーマ細胞系であり、この細胞系は
サイトキン誘導イソ形の酸化窒素シンターゼを含有する
ことが最近に証明されたものである（１３）。Ｆｉｇ１
ＡはＩＬ−１β ５単位／ｍｌ±指定濃度のアミノグア
ニジンまたはＮＭＭＡとともに１８時間キンキュベート
したＲｉｎ ｍ５Ｆ細胞からのニトライト（酸化窒素の
酸化生成物）のＩＬ−１β誘発生成に対するアミノグア
ニジンおよびＮＭＭＡの投与量応答を示している。これ
らの化合物は両方ともに、投与量依存様相でＩＬ−１β
誘発ニトライト生成を抑制する。これらの化合物は両方
ともに、−１０μＭの濃度で最大の半分まで抑制する。

【００２１】次いで、ＮＯ^. 産生に係る非常に敏感な尺
度である、ＩＬ−１β−誘発ｃＧＭＰ蓄積に対するアミ
ノグアニジンの作用効果を試験した。Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細
胞は、５単位／ｍｌ ＩＬ−１β±０．５ｍＭ ＮＭＭ
Ａまたは０．５ｍＭアミノグアニジンにより１８時間処
理し、次いでホスホジエステラーゼ阻害剤であるイソブ
チル−メチルキサンチン（１ｍＭ）とともに３時間イン
キュベートした。Ｆｉｇ１Ｂは、Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細胞に
おけるｃＧＭＰのＩＬ−１β誘発蓄積がアミノグアニジ
ンによりおよびまたＮＭＭＡにより完全に阻止されるこ
とを示しており、さらにまたアミノグアニジンが酸化窒
素シンターゼを阻害する証拠を提供している。

【００２２】グルコース刺激インシュリン分泌のＩＬ−
１β誘発抑制に対するアミノグアニジンの効果をまた試
験した。Ｆｉｇ１Ｃは、グルコース刺激インシュリン分
泌が、膵島をＩＬ−１βにより１８時間予備処置するこ
とによって有意に抑制することを示している。アミノグ
アニジン（０．５ｍＭ）はこのインシュリン分泌に係る
ＩＬ−１β誘発抑制を完全に防止する。ＩＬ−１βが存
在しない場合には、アミノグアニジンは膵島によるイン
シュリン分泌を僅かに強めるが、この効果は非処置対照
膵島によるインシュリン分泌に比較して、統計学的に有
意ではない（ｐ＞０．０７５）。ＮＭＭＡはまた、イン
シュリン分泌の僅かな強化およびインシュリン分泌に係
るＩＬ−１β誘発抑制の完全な阻止を示している
（８）。このＮＭＭＡおよびアミノグアニジンにより誘
発されるインシュリン分泌に対する僅かな刺激は構成イ
ソ形および誘導イソ形の両方の酸化窒素シンターゼの阻
害によるものでありうる（７，８）。

【００２３】アミノグアニジンがＩＬ−１β誘発酸化窒
素シンターゼ活性を抑制することを確認するために、膵
島によるｇ＝２．０４ ＥＰＲ−検出性鉄−ニトロシル
特徴物質のＩＬ−１β誘発生成に対するアミノグアニジ
ンの効果を試験した。Ｆｉｇ２はアミノグアニジン
（０．５ｍＭ）がこのＩＬ−１β誘発鉄−ニトロシル特
徴物質の生成を完全に阻止することを証明している。こ
の図面はまた、ＥＰＲ分光測定法に使用されたものと同
一の膵島によるニトライトの併発的生成を示している。

【００２４】このｇ＝２．０４ 鉄−ニトロシルＥＰＲ
検出性特徴物質の生成は従来技術において、ＩＬ−１β
により処置された膵島における（７，８）、活性化した
マクロファージにおける（１４）、およびまた活性化し
たマクロファージにより認識される標的細胞における
（１５）、ＮＯ^. の生成の確認に使用されてきた。この
特徴物質（鉄−ジニトロシルコンプレックス）の生成は
酵素含有鉄からの非ヘム鉄の分離は、酸化窒素がインシ
ュリン分泌を抑制するのと同じメカニズムでありうる可
能性と一致している。これらの結果は、アミノグアニジ
ンが酸化窒素シンターゼのサイトキン誘導イソ形の強力
な阻害剤であることを確証するものである。

【００２５】構成（血管）酸化窒素シンターゼ活性に対
するアミノグアニジンの効果は、麻酔した正常なラット
にアミノグアニジンを静脈注射した後の平均動脈血圧
（ＭＡＰ）の変化を追跡することによって評価した。Ｆ
ｉｇ３には、アミノグアニジンおよびＮＭＭＡの投与量
応答が示されている。これらの化合物は両方ともに、投
与量依存様相でＭＡＰを高めるが、ＮＭＭＡはアミノグ
アニジンよりも少なくとも１０倍以上強力である。

【００２６】この感受性の差違はジアミンオキシダーゼ
活性（１６）に対するアミノグアニジンの阻害効果によ
るようには見えない。何故ならば、ジフェンヒドラミン
（Ｈ ₁ レセプターブロッカー）による前処置がＭＡＰの
アミノグアニジン誘発増加に対し効果を有していないか
らである（１３）。これらの観測結果は、アミノグアニ
ジンおよびＮＭＭＡはインビトロサイトキン誘発酸化窒
素シンターゼの均等な阻害剤であるが、構成イソ形酸化
窒素シンターゼのインビボ阻害剤としては、アミノグア
ニジンが予想外にかつまた有利に、ＮＭＭＡよりも効力
が低いことを示唆している。

【００２７】グルコース誘発血管機能障害の仲介に係る
ＮＯ^. の推定される役割を評価するために、 ¹³¹Ｉ−ア
ルブミンの血管クリアランスにおける３０ｍＭグルコー
ス誘発増加に対する１ｍＭアミノグアニジンまたは１ｍ
Ｍ ＮＭＭＡの作用効果を糖尿病でないラットの皮膚腔
肉芽組織モデルで試験した。Ｆｉｇ４Ａに示されている
ように、新しく調製した肉芽組織を３０ｍＭグルコース
に１日２回で６〜７日間さらすと、 ¹³¹Ｉ−アルブミン
クリアランスの増加は−２倍（ｐ＜０．００５）になっ
た。これはアミノグアニジンまたはＮＭＭＡの同時投与
によって完全に阻止される。

【００２８】同様に、５週間持続しているストレプトゾ
トシン誘発糖尿病に被患しているラットにおいて、アミ
ノグアニジン（５０ｍｇ／ｋｇ／日、皮下注射）は、網
膜を含む眼組織（ｐ＜０．００１）（Ｆｉｇ４Ｂ）、坐
骨神経（９）および大動脈（１３）における ¹³¹Ｉ−ア
ルブミンクリアランスを２〜４倍阻止する。同様に、４
ヶ月持続している糖尿病に被患しているラットにおい
て、アミノグアニジンは網膜（Ｆｉｇ４Ｃ）およびその
他の眼組織ならびに坐骨神経（１３）における血流増加
を防止した（ｐ＜０．００１）。これらの試験におい
て、アミノグアニジンは血圧または組織ソルビトールに
対して、およびまたｍｙｏ−イノシトールレベルに対し
て（１３）、作用性を有していなかった。

【００２９】アミノグアニジンおよびＮＭＭＡが ¹³¹Ｉ
−アルブミン透過性に係る糖尿病誘発およびグルコース
誘発増加を防止するという発見は糖尿病による損傷した
血管障壁機能および増加した血流の調整におけるＮＯ^.
の役割を示唆している。この考え方は次の証拠と一致す
る：１）糖尿病でない動物において、ヒスタミンおよび
ブラディキニンなどの血管系活性剤により生じる増加し
た血管透過性および血流は増加したＮＯ^. 産生と組合さ
れていること、および２）ＮＯ^. はこれが産生された細
胞の代謝および機能に関与すること（２，４）。

【００３０】これらの試験における血管機能の正常化は
進行したグリケーション最終生成物の阻止よりはむしろ
アミノグアニジンによる酸化窒素シンターゼ活性の阻害
を反映するものであるという推定は肉芽組織モデルにお
ける高められたグルコースの短時間持続（最大４８時
間）（１７）および糖尿病でないラットの肉芽組織にお
ける１ｍＭソルビトール誘発による高められた血管アル
ブミン透過性のアミノグアニジンによる防止（１８）に
よって強力に支持されている。

【００３１】これらの発見はピルビン酸塩およびソルビ
トール回路の阻害剤がまたグルコース誘発による高めら
れた血管透過を防止するという証明（１７，１８）と組
合されて、ＮＡＤ（Ｐ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ⁺ におけるソル
ビトール回路−関連レドックス不均衡（５）とＮＡＤＰ
Ｈ依存酸化窒素合成とＮＯ^. による酸化的代謝の阻止
（４）との間の相互関係は糖尿病合併症の病因に関して
重要でありうることを示唆している。

【００３２】

【実施例】本発明をさらに説明するために、下記の詳細
な例を行なったが、本発明をこれらの特定の例に、ある
いは本明細書の詳細な記載に制限されるものではないと
理解されるべきである。これらの例で得られた結果を添
付するＦｉｇ１〜４に示す。

【００３３】例１ この例はＩＬ−１β−誘発ニトライト生成、およびＲｉ
ｎ ｍ５Ｆ細胞によるｃＧＭＰ蓄積、およびまた膵島に
よるグルコース刺激インシュリン分泌のＩＬ−１β−誘
発抑制（Ｆｉｇ１Ａ）に対するアミノグアニジンの作用
効果を例示するものである。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｃｅｎｔｅｒから入手したＲｉｎ ｍ
５Ｆ細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ処理によって増殖フ
ラスコから取り出し（５５〜８０百万細胞／フラス
コ）、次いで１ｍｌペトリ皿に適量づつ分けた（１〜２
百万Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細胞／条件）。これらの細胞を完全
ＣＭＲＬ−１０６６組織培養培地（１０％加熱不活性化
した牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／
ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイ
シンを追加したＣＭＲＬ）またはアミノグアニジンまた
はＮＭＭＡを追加した完全ＣＭＲＬ−１０６６１ｍｌ中
で１８時間（９５％空気および５％ＣＯ₂ の雰囲気の下
に）、インキュベートした。

【００３４】インキュベーションの後に、上澄液を採取
し、すでに開示されている慣用の方法（８、１９）によ
って、１００μｌづつに関してニトライトを測定した。
これらの結果は少なくとも３回の独立した試験のデータ
から平均値±ＳＥＭとして表わした（Ｆｉｇ１Ｂ）。ｃ
ＧＭＰ蓄積は上記のとおりに、５単位／ｍｌ ＩＬ−１
β、０．５ｍＭアミノグアニジン−ＨＣｌまたは０．５
ｍＭ ＮＭＭＡ、またはＩＬ−１βとアミノグアニジン
−ＨＣｌ、あるいはＩＬ−１βとＮＭＭＡを追加した完
全ｃＧＲＬ−１０６６ １ｍｌ中で１８時間インキュベ
ートした８百万のＲｉｎ ｍ５Ｆ細胞に対して測定し
た。この１８時間の処理の後に、これらのＲｉｎ ｍ５
Ｆ細胞を１ｍＭイソブチル−メチルキサンチン含有完全
ｃＭＲＬ−１０６６ １ｍｌ中でさらに３時間インキュ
ベートした。ＩＬ−１βによって誘発されたｃＧＭＰ生
成を、ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔから市販されている慣用の
ｃＧＭＰ ＲＩＡキットを用いて測定した（７）。デー
タは３回の独立した試験の平均値±ＳＥＭで表わされる
（Ｆｉｇ１Ｃ）。

【００３５】インシュリン分泌試験では、雄のＳｐｒａ
ｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）から
すでに開示されている慣用の方法（２０）によって、コ
ラゲナーゼ消化により、膵島を単離した。この単離した
膵島（１２０／ｍｌ）を３７℃で９５％空気および５％
ＣＯ₂ の雰囲気の下に、完全ＣＭＲＬ−１０６６中で、
あるいは５単位／ｍｌ ＩＬ−１β、０．５ｍＭアミノ
グアニジン−ＨＣｌまたはＩＬ−１βとアミノグアニジ
ン−ＨＣｌとを含有する完全ＣＭＲＬ−１０６６中で予
備処理した。この予備処理後に、この膵島を、３ｍＭ
Ｄ−グルコースおよび０．５％ＢＳＡを含有するＫｒｅ
ｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩緩衝液（ＫＲＢ：２５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、２４ｍＭ Ｎａ
ＨＣＯ₃、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２．
５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、ｐＨ７．４）１ｍｌ／洗浄で３回
洗浄した。

【００３６】一群２０の膵島を１０×７５ｍｍのシリコ
ン処理したホウケイ酸ガラス管中に数え入れ、同一緩衝
液２００μｌ中で３０分間予備インキュベートした。こ
の予備インキュベーション緩衝液を分離し、３ｍＭ Ｄ
−グルコースまたは２０ｍＭＤ−グルコースを含有する
新鮮なＫＲＢ２００μｌの添加により、グルコース刺激
インシュリン分泌を開始させ、引続いて３０分間インキ
ュベートした。

【００３７】この予備インキュベーションおよびインキ
ュベーションは両方ともに、９５％空気および５％ＣＯ
₂ の雰囲気の下に３７℃で行なった。このインキュベー
ション液中のインシュリン含有量を放射免疫検定法によ
って測定した。これらの結果を３回の独立した試験のデ
ータから平均値±ＳＥＭとして表わす。統計学的有意値
（ｐ＜０．０５）はＳｔｕｄｅｎｔｓ ｔ−テストによ
って決定した。

【００３８】例２ この例は膵島によって生成されるＩＬ−１−誘発鉄−ニ
トロシルコンプレックスに対するアミノグアニジンの作
用効果を例示するものである。単離した膵島（２４０
０）を完全ＣＭＲＬ−１０６６、または５単位／ｍｌ
ＩＬ−１β、０．５ｍＭアミノグアニジン−ＨＣｌ、ま
たはＩＬ−１βおよびアミノグアニジン−ＨＣｌの両方
を含有する完全ＣＭＲＬ−１０６６ ３ｍｌ中で、９５
％空気および５％ＣＯ₂ の雰囲気の下に３７℃において
１８時間培養した。これらの膵島を遠心分離し、−７０
℃で凍結させた。

【００３９】この膵島に対して、９．５ＧＨｚマイクロ
ウェーブブリッジを備えたＶａｒｉａｎ Ｅ−１０９分
光測光計を用いるＥＰＲ分光測光を７７Ｋで行なった。
この電力は１ｍＷであり、変調周波数は１００ＫＨｚで
あり、変調増幅数は８ガウスであり、そしてマイクロ波
周波数は９．１０９ＧＨｚであった。このＥＰＲ分光測
光に使用したものと同一の膵島培養上澄液の１００μｌ
づつに対して、例１（Ｆｉｇ１Ａ）に記載のとおりにし
て、ニトライトを測定した。１条件当りで少なくとも２
４００の膵島を含む３回の独立した試験のデータをＦｉ
ｇ２に示す。ＩＬ−１β−誘発鉄−ニトロシルｇ＝２．
０４コンプレックスおよび非局在化電子ｇ＝２．００２
３特徴（全ての細胞に見い出される）は矢印で示されて
いる。

【００４０】例３ この例は平均動脈血圧に対するアミノグアニジンおよび
ＮＭＭＡの作用効果を例示するものである。正常な雄の
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１００ｍｇ／体
重ｋｇのイナクチン（Ｉｎａｃｔｉｎ）により麻酔し、
その左大腿静脈（トレーナー注入用）および右腸骨動脈
（血圧測定用）に、ヘパリン処理塩類溶液を満したポリ
エチレン製管を付け、そしてまた気管にカニューレを付
け、連続排気補助用の小型げっし動物用呼吸器に連結し
た。

【００４１】動脈血圧を安定にした後に、アミノグアニ
ジンまたはＮＭＭＡを、その量を増加しながら、別々の
動物に静脈注入し、血圧増加最高値を記録した。これら
の結果をＦｉｇ３に示す。この結果はベースラインより
上の血圧の増加パーセントとして表わされており、アミ
ノグアニジンに関してはｎ＝６の、そしてＮＭＭＡに関
してはｎ＝５の平均値±ＳＥＭを示す。

【００４２】例４ この例は血管アルブミン透過性および血流におけるグル
コース−誘発および糖尿病−誘発の増大に対するアミノ
グアニジンおよびＮＭＭＡの作用効果を例示するもので
ある（Ｆｉｇ４Ａ）。血管アルブミン透過性に係るグル
コース−誘発増大は慣用の肉芽組織、皮膚腔モデル（１
７）で評価した。簡単に言えば、麻酔した正常な糖尿病
ではないラットの背中の中心の両側から２ｃｍの円形の
皮膚を切り取った。ステンレス鋼ねじ込キャップを備え
たプラスチック容器（このキャップは容易に取りはづす
ことができ、このプラスチック容器の内部を構成してい
る管状肉芽組織に薬剤を添加できるようにするものであ
る）を傷口の境界線の部位で皮膚に縫合した。

【００４３】これらの容器挿入後の７日目に、５ｍＭグ
ルコース、または３０ｍＭグルコース、または３０ｍＭ
グルコース＋１ｍＭアミノグアニジン、または３０ｍＭ
グルコース＋１ｍＭ ＮＭＭＡを含有するＨｅｐｅｓ緩
衝液（ｐＨ７．４）１．５ｍｌ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．２ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、０３．ｍＭ Ｌ−アルギニン、１
００μｇ／ｍｌペニシリンＧ、１０μｇ／ｍｌゲンタマ
イシン）を各管のそれぞれに加えた（各試験毎にｎ＝
４）。

【００４４】溶液は毎日新しく調製し、各管中に一日２
回（９：００ＡＭおよび５：００ＰＭ）、７日間加え
た。最後の処置の１時間以内に、すでに開示されている
慣用の方法（２１）によって、アルブミンクリアランス
を評価した（Ｆｉｇ４Ｂ）。初期体重〜２５０ｇの雄の
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、糖尿病でない
対照（ｎ＝８）と、５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジ
ンにより処置した対照（ｎ＝８）と非処置の糖尿病群
（ｎ＝１１）と同一用量のアミノグアニジンにより処置
した糖尿病群（ｎ＝９）とに分けた。

【００４５】糖尿病はストレプトゾトシンの静脈注射に
よって発症させ、この時点で、第２群および第４群のラ
ットにアミノグアニジンを一日一回、皮下投与した。こ
れらのラットは糖尿病発病の５週間後に血管透過性試験
に使用した。網膜血管のアルブミン透過性はすでに開示
されている（２１）慣用の定量的アイソトープ−稀釈技
法によって評価した。この技法は血管アルブミン透過性
の評価のために ¹³¹Ｉ−ＢＳＡを注入し（循環時間１０
分）、そしてまた血管内 ¹³¹Ｉ−ＢＳＡ組織活性を補正
するために、血管空間参考トレーサー（ｖａｓｃｕｌａ
ｒ ｓｐａｃｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｒａｃｅｒ）と
して ¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ（循環時間２分）を注入することに
もとづいている。

【００４６】¹³¹Ｉ−ＢＳＡ血管クリアランス（μｇ血
漿／ｇ組織含水重量／分）を計算するためには、網膜の
¹³¹Ｉ−ＢＳＡ活性を網膜血管内に含まれているトレー
サーに関して補正した；この血管−補正した ¹³¹Ｉ−Ｂ
ＳＡ血漿活性を、トレーサー注入後の１分、５分および
１０分の時点で採取した血漿試料から得た時間−平均
¹³¹Ｉ−ＢＳＡ血漿活性により割算し、引続いてトレー
サー循環時間（１０分）により割算し、次いで組織含水
重量１ｇあたりに標準化した（Ｆｉｇ４Ｃ）。

【００４７】糖尿病発病の４ヶ月後に、すでに開示され
ている慣用の技法（２２）によって、⁸⁵Ｓｒ−標識した
微球体を用いて、網膜血流を測定した（各群当りｎ＝
７）。この網膜血流を測定するためには、網膜の⁸⁵Ｓｒ
の総活性を採取注射器から得た対照血液試料の⁸⁵Ｓｒの
総活性により割算し、次いでポンプ採取速度を掛算す
る。この総活性はｍｌ／組織含水重量ｇ／分の単位で表
わされる。

【００４８】本明細書に記載の酸化窒素生成に対するア
ミノグアニジン抑制剤は慣用の手段によって、好ましく
は医薬的に許容される稀釈剤および担体とともに組成物
として、温血哺乳動物に投与するために使用することが
できる。この活性抑制剤の投与量は有効量でなければな
らない。すなわち医薬的に有益であるが、その使用にと
もなう利益を超える毒性作用が存在しない量であるべき
である。

【００４９】成人に対する一日薬用量は通常、約１ｍｇ
の医薬／体重ｋｇから上の範囲であるものと予想され
る。適当な投与経路はカプセル、錠剤、シロップ、エリ
キシルなどの形態で経口投与であるが、非経口投与、た
とえば静脈、腹腔または皮下投与も使用することができ
る。水性溶液、たとえば生理食塩水中の医薬を静脈投与
することもできる。医薬を医薬的に許容される稀釈剤お
よび担体に入れた治療用量形態の適当な製剤は当分野の
一般的参考書、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｔｈ
ｕｒ Ｏｓｏｌ編、１６版、１９８０、Ｍａｃｋ出版
社、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．を参考にして調製することが
できる。

【００５０】種々のその他の例は、本発明の精神および
範囲から逸脱することなく、本明細書を読むことによっ
て、当業者にとり明白であろう。これらの例の全部が、
特許請求の範囲内に包含されるものとする。

【００５１】本明細書中で数字で表わされている参考刊
行物は下記のとおりであり、これらの記載をここに追加
する： １． Ｄ．Ｊ．Ｓｔｕｅｈｒ，Ｈ．Ｊ．Ｃｈｏ，Ｎ．
Ｓ．Ｋｗｏｎ，Ｍ．Ｆ．Ｗｅｉｓｅ，Ｃ．Ｆ．Ｎａｔｈ
ａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８，７７７３（１９９１）． ２． Ｓ．Ｍｏｎｃａｄａ，Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｐａｌｍｅ
ｒ，Ｅ．Ａ．Ｈｉｇｇｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ４３，１０９（１９９１）． ３． Ｊ．Ｇａｒｔｈｗａｉｔｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅ
ｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４：６０（１９９１）． ４． Ｊ．Ｂ．Ｈｉｂｂｓ，Ｊｒ．，等、ｉｎ Ｎｉｔ
ｒｉｃ Ｏｘｉｄｅｆｒｏｍ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ：
ａ Ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓ．
Ｍｏｎｃａｄａ ａｎｄ Ｅ．Ｈｉｇｇｓ，編、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０）１８９−
２２３頁． ５． Ｇ．Ｐｕｇｌｉｅｓｅ，Ｒ．Ｇ．Ｔｉｌｔｏｎ，
Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７，３５（１９
９１）． ６． Ｃ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｄ．Ｓｃｈｕｌｓｔｅ
ｒ，Ｉ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎ，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．２７
６，４２（１９９０）．

【００５２】７． Ｊ．Ａ．Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｊ．Ｌ．
Ｗａｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｓｗｅｅｔｌａｎｄ，Ｊ．Ｒ．Ｌａ
ｎｃａｓｔｅｒ，Ｊｒ．，Ｍ．Ｌ．ＭｃＤａｎｉｅｌ，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．（付録）． ８． Ｊ．Ａ．Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．Ｌａｎｃｅｓ
ｔｅｒ，Ｊｒ．Ｍ．Ａ．Ｓｗｅｅｔｌａｎｄ，Ｍ．Ｌ．
ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，
２１３５１−２１３５４（１９９１）． ９． Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ等、Ｄｉａｂｅｔ
ｅ ＆ Ｍｅｔａｂ．１６，３３６９（１９９０）．
Ｔ．Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａ，Ｍ．Ｃｏｏｐｅ
ｒ，Ｄ．Ｐａｐａｚｏｇｌｏｕ，Ｂ．Ｃｌａｒｋｅ，
Ｇ．Ｊｅｒｕｍｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０，１３２８
（１９９１）． １０． Ｍ．Ｋｉｈａｒａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，６１０７（１９９
１）． １１． Ｍ．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，
Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
１８，１３１５（１９８８）． Ｍ．Ｂｒｏｗｎｌｅ
ｅ，Ｈ．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ａ．Ｋｏｏｎｅｙ，Ｐ．Ｕ
ｌｒｉｃｈ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
２，１６２９（１９８６）． １２． Ｒ．Ｂｕｃａｌａ，Ｋ．Ｊ．Ｔｒａｃｅｙ，
Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８
７，４３２（１９９１）． １３． 公開されていない。

【００５３】１４． Ｊ．Ｒ．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｊ
ｒ．，Ｊ．Ｂ．Ｈｉｂｂｓ，Ｊｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１２２３（１９
９０）． １５． Ｊ．Ｃ．Ｄｒａｐｉｅｒ，Ｃ．Ｐｅｌｌａｔ，
Ｙ．Ｈｅｎｒｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１
０１６２（１９９１）． １６． Ｍ．Ａ．Ｂｅａｖｅｎ，Ｒ．Ｅ．Ｓｈａｆｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４，９７９
（１９７５）． １７． Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，１１６７（１９９０）．
Ｂ．Ａ．Ｗｏｌｆ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８
７，３１（１９９１）． １８． Ｋ．Ｃｈａｎｇ，Ｗ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ
ａｒｌｏｗ，Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ ４０，２１０Ａ（１９９１）． １９． Ｌ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１２６，１３１（１９８２）． ２０． Ｍ．Ｌ．ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｒ．Ｃｏｌｃ
ａ，Ｎ．Ｋｏｔａｇａｌ，Ｐ．Ｅ．Ｌａｃｙ，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９８，１８２（１９８３）． ２１． Ｇ．Ｐｕｇｌｉｅｓｅ等、Ｄｉａｂｅｔｏｌｇ
ｉａ ３２，８４７（１９９０）． Ｇ．Ｐｕｇｌｉｅ
ｓｅ等、Ｍｅｔａｂｏｌ ３９，６９０（１９９０）． ２２． Ｒ．Ｇ．Ｔｉｌｔｏｎ，Ｋ．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．
Ｗｅｉｇｅｌ，Ｃ．Ｋｉｌｏ，Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓｏｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍａｌ．Ｖｉ
ｓ．Ｓｃｉ．２９，８６１（１９８８）．

【００５４】政府支援の証明 本研究は部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ認可ＤＫ０６１８１、Ｔ３
２ＤＫ０７２９６、ＥＹ０６６００、ＨＬ３９９３４お
よびＤＫ２０５７９によって支援された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＬ−１β−誘発ニトライト生成に対するアミ
ノグアニジンの効果を示すグラフ（Ｆｉｇ．１Ａ）。

【図２】Ｒｉｎ ｍ５Ｆ細胞によるＣＧＭＰ蓄積に対す
るアミノグアニジンの効果を示すグラフ（Ｆｉｇ．１
Ｂ）。

【図３】膵島によるグルコース刺激分泌のＩＬ−１β−
誘発抑制に対するアミノグアニジンの効果を示すグラフ
（Ｆｉｇ．１Ｃ）。

【図４】膵島によるＩＬ−１−誘発鉄−ニトロシル コ
ンプレックス生成に対するアミノグアニジンの効果を示
すグラフ（Ｆｉｇ．２）。

【図５】平均動脈血圧に対するアミノグアニジンの効果
およびＮ^G −モノメチル−Ｌ−アルギニンの効果を示す
グラフ（Ｆｉｇ．３）。

【図６】血管アルブミン透過性に係るグルコース−誘発
増大に対するアミノグアニジンおよびＮ^G −モノメチル
−Ｌ−アルギニンの効果を示すグラフ（Ｆｉｇ．４
Ａ）。

【図７】血管アルブミン透過性に係る糖尿病誘発増大に
対するアミノグアニジンおよびＮ^G −モノメチル−Ｌ−
アルギニンの効果を示すグラフ（Ｆｉｇ．４Ｂ）。

【図８】血流に係る糖尿病誘発増加に係るアミノグアニ
ジンおよびＮ^G −モノメチル−Ｌ−アルギニンの効果を
示すグラフ（Ｆｉｇ．４Ｃ）。

【符号の説明】

ＡＧ アミノグアニジン ＮＭＭＡ Ｎ^G −モノメチル−Ｌ−グアニジン ＭＰＡ 平均動脈血圧 Ｇｌｕ グルコース

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 37/00 37/00 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ (72)発明者 マイクル リン マックダニエル アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ウオリック レーン 820 (72)発明者 ロナルド ジーン ティルトン アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，ウエスト パイン 4302 (56)参考文献 特開 昭62−142114（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−56614（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．232，Ｎｏ 4758（1986），ｐ．1629−1632 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/155 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノグアニジンを有効成分として含有
   する酸化窒素シンターゼ阻害剤。
2. 【請求項２】 アミノグアニジンを有効成分として含有
   する酸化窒素シンターゼ阻害剤（ただし、二次グリコシ
   ル化最終産物生成抑制剤ではない）。
3. 【請求項３】 アミノグアニジンを有効成分として含有
   する、高血圧を生じさせる構成血管酸化窒素シンターゼ
   を阻害することなく、疾患の進行により打撃を受けた組
   織における誘導酸化窒素シンターゼを阻害する、酸化窒
   素シンターゼ阻害剤。
4. 【請求項４】 アミノグアニジンを有効成分として含有
   する、神経炎、神経学的障害、心筋梗塞、卒中、血圧降
   下、糸球体腎炎または免疫系の疾患を治療するための医
   薬組成物（ただし、前記糸球体腎炎は、酸化窒素シンタ
   ーゼ阻害剤ではない、二次グリコシル化最終産物生成抑
   制剤による治療に対しては抵抗性である）。
5. 【請求項５】 免疫系の疾患が、移植臓器拒絶反応また
   は慢性関節リウマチである請求項４に記載の医薬組成
   物。
6. 【請求項６】 血圧降下が敗血症によるものである請求
   項４に記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 疾患が、酸化窒素シンターゼ阻害剤では
   ない、二次グリコシル化最終産物生成抑制剤による治療
   に対しては抵抗性である、請求項４〜６のいずれか１項
   に記載の医薬組成物。