KR102217972B1 - 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 류코트리엔 수용체 길항제로 알려진 자피르루카스트가 췌장 베타 세포에서는 베타 세포 내의 칼슘 채널을 활성화시킴으로써 칼슘 유입을 증가시켜 인슐린 분비를 증가시킬 수 있어, 그에 따라 혈당 수준이 감소함을 확인하였다. 이에, 기존 의약품인 자피르루카스트를 새로운 의약 용도인 당뇨병 예방 또는 치료 용도로 이용할 수 있다.

Description

자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES MELLITUS COMPRISING ZAFIRLUKAST OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AND USE OF THE SAME}

본 발명은 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

자피르루카스트는 천식 치료에 사용되는 의약이다. 자피르루카스트는 cysteinyl leukotriene receptor 1(CysLTR1)에서 류코트리엔, 특히 류코트리엔 D4형과 E4형의 작용을 차단하여 기도 수축과 폐 점액 분비를 완화시킨다. 다른 두 가지 류코트리엔 길항제인 프란루카스트와 몬테루카스트도 선택적으로 CysLTR1의 활성화를 억제한다. CysLTR1 길항제는 안전하다고 간주되며 항 염증 특성은 잘 알려져 있다.

한편, 인슐린은 신체의 혈당 수치를 조절하는 주요 호르몬이다. 포도당은 포도당 전달체에 의해 β 세포로 수송되고 대사되어 ATP를 생성한다. ATP : ADP 비율의 증가는 ATP-민감성 K⁺ 채널(KATP 채널)의 폐쇄, 막 탈분극 및 전압-의존성 Ca²⁺ 채널의 활성화를 초래한다. 세포 내 칼슘 ([Ca²⁺]_i) 수준의 증가는 Ca²⁺ 결합 막 단백질에 의한 인슐린 소포의 세포 외 배출을 유도한다. 인슐린 분비는 글루카곤 유사 펩티드 및 세로토닌과 같은 호르몬 및 신경계 인자의 존재 하에 증가될 수 있다. 기존에 알려지지 않았던 자피르루카스트가 인슐린 분비를 촉진하여 혈당 수치가 저하될 수 있음을 발견하여, 기존 의약품인 자피르루카스트의 새로운 의약 용도를 밝혀내기에 이르렀다.

한국공개특허 제10-2020-0079206호

일 양상은 자피르루카스트(Zafirlukast) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 자피르루카스트(Zafirlukast) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 자피르루카스트는 C₃₁H₃₃N₃O₆S의 분자식을 가지며, 575.676 g/mol g·mol^-1의 분자량을 가지는 화합물로서, 기존의 CysLTR1 길항제로서 주로 천식 치료 등에 사용되는 화합물이며, 천연으로부터 유래될 수도 있고, 공지의 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수도 있다.

상기 자피르루카스트는 비단백질 화합물, 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.

일 양상에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

용어 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

용어 "약학적으로 허용되는 염"이란, 일 양상에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다. 상기 화합물이 상대적으로 산성 관능기를 포함할 때, 순수 용액 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 염기를 이러한 화합물의 중성 형태와 접촉시킴으로써 염기 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민, 혹은 마그네슘의 염 또는 유사한 염이 포함된다. 상기 화합물이 상대적으로 염기성 관능기를 포함할 때, 순수 용액 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 산을 이러한 화합물의 중성 형태와 접촉시킴으로써 산 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 부가염은 염산, 브롬화 수소산, 질산, 탄산, 탄산 수소 이온, 인산, 인산 1수소 이온, 인산 2수소 이온, 황산, 황산 수소 이온, 요오드화 수소산 또는 아인산 등의 무기산의 염, 그리고 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 안식향산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 구연산, 주석산, 메탄술폰산 등의 유기산의 염을 들 수 있고, 나아가 아미노산(예를 들면 아르기닌 등)의 염 및 글루쿠론산 등의 유기산의 염도 포함된다.

상기 약학적으로 허용되는 염은 산성 또는 염기성 부분을 포함하는 모체 화합물로부터 통상적인 화학적 방법으로 합성할 수 있다. 일반적으로 이러한 염은 수중 또는 유기 용매 중 또는 이 2종의 혼합물 중에서, 이들 화합물의 유리산 또는 염기의 형태를 화학량론적으로 적량인 염기 또는 산과 반응시켜서 조제된다. 일반적으로 에테르, 아세트산에틸, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴 등의 비수성 매질이 바람직하다.

상기 용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 당뇨병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 당뇨병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

일 양상에 따르면, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 L-VDCC(L-Type Voltage-Dependent Calcium Channel)를 통해 세포 외 칼슘을 세포 내로의 유입을 증가시킬 수 있다. 또한, CaMKII(calmodulin-dependent protein kinase II), AKT(protein kinase B) 및 ERK(Extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 유도할 수 있고, 이를 통해 인슐린 분비를 증가시킬 수 있다. 나아가, 개체 내 혈당 수치를 저하시킬 수 있고, 이를 통해 당뇨병의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 구체적으로 췌장, 보다 구체적으로는 췌장의 β-세포에 작용하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.

상기 용어 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

또한, 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물과 병행하여 투여할 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 당뇨병을 보유할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

일 양상에 있어서, 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 0.01 내지 1000 mg/kg/day로, 보다 구체적으로 0.1 내지 500 ㎎/kg/day로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다.

구체적으로, 상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.

다른 양상은 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 건강기능식품에 있어서, 상기 “자피르루카스트”, “당뇨병”, "예방" 등에 대해서는 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 용어 "식품학적으로 허용되는"이란 상기 화합물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

상기 용어 “식품학적으로 허용되는 염”이란, 일 양상에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미하며, “염”에 관한 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 당뇨병의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 "개체", "투여", "약학적 조성물", "당뇨병" 등은 전술한 바와 같다.

류코트리엔 수용체 길항제로 알려진 자피르루카스트는 췌장 베타 세포에서 세포 내 칼슘 채널을 활성화시킴으로써 칼슘 유입을 증가시켜 인슐린 분비를 증가시키고, 그에 따라 혈당 수준이 감소시킬 수 있다. 이에 따라, 안정성이 보장된 기존 의약품인 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 새로운 의약 용도인 당뇨병 예방, 개선 또는 치료 용도로 이용할 수 있다.

도 1은 MIN6 세포 내 인슐린 분비의 자피르루카스트 의존성 증가를 확인한 도이다.
도 2는 CysLTR1(cysteinyl leukotriene receptor 1) 길항제 중 자피르루카스트의 인슐린 분비에 대한 구별되는 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 MIN6 세포에서 자피르루카스트 유발 세포 내 칼슘 농도([Ca²⁺]_i)의 증가를 나타낸 도이다.
도 4는 1차 췌장 섬에서 자피르루카스트의 자극에 따른 인슐린 분비 및 [Ca²⁺]_i의 증가를 나타낸 도이다.
도 5는 CaMKII, AKT 및 ERK의 자피르루카스트 유발 인산화를 나타낸 도이다.
도 6은 인산화된 AKT 및 인산화된 ERK의 발현을 억제하는 몬테루카스트의 효과를 나타내는 도이다.
도 7은 Ca²⁺ 없는 배지에서 탑시가르긴 및 자피르루카스트의 처리를 통해 자피르루카스트는 세포 내 보다는 세포 외 Ca²⁺의 유입을 유도한다는 것을 나타낸 도이다.
도 8은 L-VDCCs(L-type voltage dependent calcium channels)을 통한 세포 외 Ca²⁺ 유입에 의해 유발되는 인슐린 분비에 대한 자피르루카스트의 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 생체 내 증가된 인슐린 분비의 결과로서 자피르루카스트의 혈당 저하 효과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 자피르루카스트(Zafirlukast)의 인슐린 분비 증가 효과

본 실시예에서는 췌장 β-세포의 기능에 관한 자피르루카스트의 생리학적 역할을 조사하기 위해, MIN6(Mouse INsulinoma 6) 세포들을 자피르루카스트로 1시간 동안 처리하였고, 분비된 인슐린의 수준을 저농도(2.8 mM) 및 고농도(16.7 mM) 포도당 조건에서 측정하였다.

그 결과, 자피르루카스트가 기본 조건에서의 인슐린 분비 및 최대영향농도(E_max)인 약 50 μM의 자피르루카스트에서의 포도당 유발 인슐린 분비(16.7 mM 포도당, 대조군에 비해 약 1.7배 증가)를 현저하게 증가시킨다는 것을 발견하였다. 용량-반응 곡선에서, 반수영향농도(EC₅₀)는 기본 및 고농도 포도당 조건에서 각각 29.8 ± 1.6 μM 및 22.7 ± 2.3 μM였다(도 1A 및 1B).

다음으로, MIN6 세포주에서 자피르루카스트의 세포 독성을 평가하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.

그 결과, 거의 80 μM까지의 농도에서의 흡광도는 대조군과 자피르루카스트 처리 그룹이 유사하였고, 세포 생존력은 E_max에서 자피르루카스트에 노출된 후에도 변화되지 않았고, 이는 자피르루카스트가 세포 독성을 유발하지 않고 인슐린 분비를 촉진한다는 것을 나타낸다(도 1C).

따라서 자피르루카스트는 조절된 인슐린 소포의 세포 외 배출을 유발하고, 저농도 및 고농도 포도당 조건 모두에서 췌장의 β-세포에서의 인슐린 분비를 증가시킨다.

실시예 2. 자피르루카스트와 다른 CysLTR1 길항제들의 인슐린 분비 촉진의 비교 실험

본 실시예에서는 췌장 β 세포에 대한 자피르루카스트의 효과가 CysLTR1(Cysteinyl leukotriene receptor 1) 길항제로서 그의 내재적 기능과 관련이 있는지를 결정하기 위해, 다른 길항제, 즉 CysLTR1로서 작용하는 몬테루카스트(Montelukast) 및 프란루카스트(Pranlukast)와 함께 인슐린 분비 분석을 수행하였다. 이러한 길항제들의 화학 구조는 그들이 CysLTR1에 대한 유사한 수용체 결합 친화력을 가짐에도 불구하고 구별된다(도 2A).

그 결과, 자피르루카스트는 저농도(2.8 mM) 및 고농도(16.7 mM) 포도당 조건에서 용량 의존적 방식으로 인슐린 분비를 증가시켰다. 하지만, 프란루카스트의 처리 시 분비된 인슐린의 수준은 변화되지 않았고, 몬테루카스트는 포도당-자극 인슐린 분비(glucose-stimulated insulin secretion: GSIS)를 현저하게 억제하였다(도 2B).

또한, 내부 총 인슐린 함량의 차이가 인슐린 분비 반응의 변화를 유발하는지 평가하기 위해, 몬테루카스트, 프란루카스트 및 자피르루카스트 처리 후 총 인슐린 함량을 측정하였다.

그 결과, CysLTR1 길항제들 각각의 자극 이후, 총 인슐린 함량은 저농도 및 고농도 포도당 조건에서 모두 영향받지 않았다(도 2C). 게다가, 흡광도 값들은 표시된 농도에서 대조군 및 CysLTR1 길항제 처리 그룹이 유사하였고, 이는 세포 생존력은 다른 농도에서 CysLTR1 길항제 처리에 의해 영향받지 않는다는 것을 의미한다(도 2D).

따라서, CysLTR1 길항제 사이에서 오직 자피르루카스트만이 인슐린 분비를 촉진하고, CysLTR1 길항제로서 그의 내재적 기능을 나타내기 보다는 인슐린 분비 경로의 활성을 촉발함으로써 췌장의 β 세포에 작용하였다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 자피르루카스트를 포함하는 CysLTR1 길항제들의 MIN6 세포 내 [Ca ²⁺ ] _i 의 증가 여부의 비교 실험

[Ca²⁺]_i 수준의 증가는 그 후에 인슐린 분비를 유발하는 인슐린 세포 외 배출에 중요하다. 자피르루카스트는 고농도(16.7 mM) 포도당 조건에 비해 저농도(2.8 mM)에서 인슐린 분비를 크게 증가시켰고, 이는 자피르루카스트가 포도당 자극이 없이도 인슐린 분비의 조절에 직접 연관되어 있다는 것을 의미한다. 이에, 본 실시예에서는 자피르루카스트가 반응성을 변화시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 형광 칼슘 지시계 Fura-2AM로 칼슘 이미지화를 수행하였다. 해당 실험에서, 자피르루카스트는 인슐린 분비에서 포도당의 자극 효과를 제거한 저농도의 포도당 조건에서 시험되었다. 또한, Fura-2AM이 실행되는 동안 자피르루카스트, 프란루카스트 및 몬테루카스트의 처리에 의해 일시적인 칼슘 반응이 촉발되는지를 분석하였다.

그 결과, Ca²⁺ 반응 내 유의한 증가가 50 μM의 E_max의 자피르루카스트 처리 후 관찰되었고, 340 nm에서 380 nm의 형광의 비율이 증가하였다. 하지만, 몬테루카스트 및 프란루카스트의 처리 후 Ca²⁺ 반응에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았다(도 3A 내지 C).

이러한 결과들은 자피르루카스트가 [Ca²⁺]_i에서 급격하고 높은 증가를 특이적으로 유발하여, 췌장의 β 세포에서 인슐린 소포의 세포 외 배출을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 4. 자피르루카스트의 분리된 1차 섬(islet) 내 [Ca ²⁺ ] _i- 및 인슐린 분비 증가의 확인

본 실시예에서는 시험관 내에서 인슐린 분비에 대한 자피르루카스트의 효과를 확인하기 위해, 8주령 C57BL/6 쥐로부터 분리된 1차 섬을 이용하여 인슐린 분비 분석을 수행하였다.

그 결과, 분리된 췌장 섬에서, 자피르루카스트는 2.8 mM 포도당 조건에서 9.6 ± 0.9 에서 25.5 ± 1.2 ng·mL^-1로, 16.7 mM 포도당 조건에서 16.5 ± 1.4에서 25.8 ± 0.8 ng·mL^-1로 용량 의존적 방식으로 인슐린 방출이 상당히 증가하였다(도 4A).

또한, 췌장 섬에서 [Ca²⁺]_i에 대한 자피르루카스트의 영향을 평가하기 위해, 1차 췌장 섬에서 칼슘 반응을 기록한 후, 자피르루카스트 50 μM의 E_max를 처리하였다.

그 결과, 자피르루카스트의 첨가는 몇 초간 340 nm에서 380 nm의 비율을 증가시켰고, 이는 자피르루카스트가 [Ca²⁺]_i 수준을 유의하게 증폭시켰다는 것을 나타낸다. 자피르루카스트에 의해 촉발된 [Ca²⁺]_i의 증가는 처음에는 증가하였으며, 그 후에는 안정되었다(도 4B 및 C).

결론적으로, 자피르루카스트는 [Ca²⁺]_i 수준을 증가시킴으로써 췌장의 β 세포 내 인슐린 분비를 유의하게 증가시킨다.

실시예 5. 주요 분자 현상들의 활성화 유도하는 [Ca ²⁺ ] _i 의 자피르루카스트 의존성 증가

자피르루카스트에 의한 췌장의 β 세포의 자극은 [Ca²⁺]_i에서 증가를 유발한다. [Ca²⁺]_i에서의 증가는 CaMKII(calmodulin-dependent protein kinase II), AKT(protein kinase B) 및 ERK(Extracellular signal-regulated kinase) 신호전달 경로를 통해 주요 신호를 전달하며, 이는 인슐린 분비를 양성적으로 조절한다. 본 실시예에서는 자피르루카스트에 의한 주요 단백질들의 활성 및 조절을 특성화하기 위해, MIN6 세포에서 자피르루카스트 처리 후 용량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 CaMKII, AKT 및 ERK의 인산화를 시험하였다. 표시된 농도 및 시간에서 용해물은 인산화를 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석에 제공되었다.

그 결과, CaMKII, AKT 및 ERK의 인산화는 용량 의존적 방식으로 유의하게 증가하였고, 그의 인산화는 약 15분에서 증가하였고, 1시간까지 유지되었다(도 5A 및 5B). 또한, 프란루카스트의 처리는 ERK 경로를 점차적으로 유도하였으나, CaMKII 및 AKT 경로는 그렇지 아니하였고, 인슐린 분비에는 변화가 없었다. 하지만 몬테루카스트의 처리는 인산화된 AKT(phosphorylated AKT: p-AKT) 및 인산화된 ERK(phosphorylated ERK: p-ERK)의 발현을 현저하게 억제하였다(도 6A 및 6B). 이러한 결과들은 인슐린 분비 분석의 결과와 일치하며, 자피르루카스트가 인슐린 분비를 자극하는 반면, 프란루카스트는 인슐린 분비를 변화시키지 않고, 몬테루카스트는 GSIS를 억제한다는 것을 나타낸다.

이를 종합하면, 우리의 결과는 자피르루카스트는 췌장의 β 세포에서 주요 신호전달 단백질의 인산화를 유도한다는 것을 나타낸다.

실시예 6. 자피르루카스트의 L-형 Ca ²⁺ 채널을 통한 세포 외 칼슘 유입 유도의 확인

본 실시예에서는 [Ca²⁺]_i에서의 증가가 Ca²⁺의 공급원 중 세포 외 또는 세포 내로부터 유래되었는지를 결정하였다.

그 결과, 세포 외 Ca²⁺의 부재(Ca²⁺ 없는 KRB(Krebs Ringer Bicarbonate) 배지) 하에서 비록 [Ca²⁺]_i 수준은 탑시가르긴(Thapsigargin)에 의한 세포 내 Ca²⁺ 이동을 통해 상당히 증가되었지만, 자피르루카스트가 자극한 [Ca²⁺]_i 수준은 Ca²⁺을 포함하는 KRB에서 관찰된 바와 비교하였을 때 감소되었다(도 7). 따라서, 상기 결과는 인슐린 분비에 대한 자피르루카스트의 효과는 주로 소포체로부터의 세포 내 Ca²⁺ 보다는 세포 외 Ca²⁺의 유입에 의한다는 것을 나타낸다.

L-VDCC(L-Type Voltage-Dependent Calcium Channel)를 통한 Ca²⁺ 유입은 인슐린 분비에 중요하다. 따라서, GSIS를 억제하는 DHP L-VDCC 길항제인 니페디핀(nifedipine)을 이용하여 자피르루카스트 의존성 효과에서 이러한 채널의 관련성을 분석하였지만, Ca²⁺의 기본 수준에 아무런 영향이 없었다. 형광 칼슘 이미지화를 통해 니페디핀의 적용은 [Ca²⁺]_i에서 자피르루카스트 의존성 증가를 유의하게 억제한다는 것을 알 수 있었다(도 8A). 이와 일관되게, 니페디핀은 저농도(2.8 mM) 및 고농도(16.7 mM) 포도당 조건 모두에서 자피르루카스트 의존성 인슐린 분비를 저하게 감소시켰다(도 8B). 게다가, 자피르루카스트는 췌장의 β 세포에서 CaMKII, AKT 및 ERK의 인산화를 자극하였으나, 이러한 효과는 니페디핀의 존재 하에서는 방지되었다(도 8C).

이러한 발견들은 자피르루카스트는 L-VDCC를 통해 Ca²⁺ 유입을 유도하며, 췌장의 β 세포에서 인슐린 분비를 증진한다는 것을 나타낸다.

실시예 7. 자피르루카스트의 생체 내 인슐린 분비를 증가를 통한 혈당 수치의 저하

본 실시예에서는 자피르루카스트가 쥐에서 저혈당 효과를 유발하는지를 평가하기 위해, 8주령 C57BL/6J 쥐에 복강 내 주사를 통해 0.1 mg/g의 자피르루카스트를 투여하였고, 혈당 수치를 모니터링하였다.

그 결과, 자피르루카스트를 주사하는 경우, 정상 혈당의 쥐에서 혈당 수치는 떨어졌다(33.5 ± 0.6% 감소, 담체와 비교하였을 때 P = 0.01; 도 9A). 자피르루카스트의 포도당 저하 효과는 90분(담체 및 자피르루카스트에 대해 각각, 0.07 ± 0.01 및 0.14 ± 0.02 ng·ml^-1) 및 120분(담체 및 자피르루카스트에 대해 각각, 0.06 ± 0.003 and 0.16 ± 0.02 ng·ml^-1)에 혈장 인슐린 수준의 증가와 함께 이루어졌다. 이는 자피르루카스트의 효과는 췌장의 β 세포로부터의 증가된 인슐린 분비의 결과라는 것을 나타낸다(도 9B).

또한, 생체 내 자피르루카스트(0.1 mg/g)의 포도당 저하 효과를 상세하게 평가하기 위해 C57BL/6J 쥐에서 포도당 투여 후 혈당 수준을 측정하였다.

그 결과, 자피르루카스트의 포도당 저하 효과 또한 쥐에게서 복강 내 당내성 평가 중 90분 및 120분에 관찰되었다(90분에서 29.3 ± 7.9% 감소, P = 0.01 및 120분에서 46.7 ± 6.6% 감소, P = 0.001; 도 9C).

이러한 결과들은 자피르루카스트는 인슐린 분비촉진제로서 기능하며, 생체 내 포도당 저하 효과를 나타낸다는 것을 나타낸다.

참조예

참조예 1. 동물들의 준비

모든 동물 실험들이 실험 동물들의 관리 및 이용에 대한 울산국립과학기술연구원의 지침에 따라 수행되었다. C57BL/6J 쥐는 21의 온도에서 12시간 명암 주기 하에서 병원균 없는 동물 시설에서 있었다. 그들에게 물과 음식은 자유였다. 8주령의 수컷 C57BL/6J 쥐가 6시간 동안 금식한 후, 동물들은 자피르루카스트(zafirlukast) 또는 담체 0.1 mg/g을 복강 내 주사하고, 혈당 및 인슐린 수치를 모니터링하였다. 포도당 내성 테스트를 위해 동물들은 밤새(16시간) 금식시켰고, 자피르루카스트 0.1 mg/g 및 2 mg/g D-포도당을 투여하였다. 혈당 수치는 포도당 측정기(glucometer) 상에서 꼬리 혈액에 의해 결정되었고, 혈청 인슐린 수준은 ELISA (Shibayagi)에 의해 측정되었다.

참조예 2. 인슐린 분비의 분석 방법

MIN6 세포를 96-웰 플레이트(4 × 10⁴ 세포/웰)에 위치시켰고, 3일간 배양하였다. 실험 전, 세포들은 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척하였고, Kreb’s buffer (KRB; 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 2.5 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃ 및 10 mM HEPES, 3 g/L의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)의 첨가 전에 NaOH로 pH 7.4로 조정됨)에서 1시간 동안 2.8 mM 포도당으로 평형화시켰다. 크기가 일치된 배지 섬(islet)은 KRB에서 2.8 mM 포도당으로 1시간 동안 평형화되었고, 48-웰 플레이트(20 섬/웰)에 옮겼다. MIN6 세포 및 췌장 섬은 1 mM의 포도당이 첨가된 KRB 300 ㎕에서 자피르루카스트(Z4152; Sigma), 프란루카스트(pranlukast, Sigma) 또는 몬테루카스트(montelukast, Sigma) 및 20 mM의 포도당으로 1시간 동안 자극되었다. 상등액을 수집하였고, 인슐린의 양이 인슐린 ELISA 키트(enzyme-linked immunosorbent assay, Shibayagi)로 정량화되었다. 모든 단계는 CO₂ 세포 배양기에서 수행되었다.

참조예 3. 3-(4,5-다이메틸싸이아졸-2-일)-2,5-다이페닐 테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide: MTT) 분석 방법

24시간 동안 화학적 자극 후, MIN6 세포에 MTT를 보충하고, 4시간 동안 배양하였다. 그후, 세포들은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)와 함께 배양되며 5분 간 진탕시켜 포르마잔(formazan)을 용해시켰고, 흡광도가 측정되었다.

참조예 4. 총 인슐린 함량의 측정 방법

자피르루카스트, 프란루카스트 및 몬테루카스트로 처리한 후, MIN6 세포들은 PBS로 세척되었고, 방사선 면역 침전 분석(radioimmunoprecipitation assay: RIPA) 완충액(#89900; Thermo Fisher Scientific)에서 용해되었다. 용해된 추출물의 총 인슐린 함량은 ELISA로 측정되었다.

참조예 5. 세포 내 Ca ²⁺ 의 결정 방법

MIN6 세포를 poly-L-lysin이 코팅된 유리 커버슬라이드 상에서 2일 간 키운 후, 세포들은 2회 세척되었고, KRB 내에서 Fura-2AM(fura-2-acetoxymethyl ester; 최종 농도 2 μM)를 1시간 동안 넣었다. 그 후, 커버슬라이드는 3회 세척되었고, 37℃에서 500 ㎕의 완충액에 접촉시키고 현미경 홀더에 삽입되었다. 화학 물질들(50 μM 자피르루카스트, 몬테루카스트 또는 프란루카스트; 1 μM 니페디핀(nifedipine); 1 μM 탑시가르긴(thapsigargin))은 도면 설명에서 나타난 바와 같이 이미지에 나타난 세포의 위에 처리되었다. 자극 신호는 Fura-2AM 형광(Olympus 전동 도립 현미경 IX81)을 모니터링하기 위해 형광측정기(fluorimeter)를 이용하여 측정되었다.

참조예 6. 섬의 분리 방법

8주령 수컷 C57BL/6J 쥐의 췌장은 25 mM HEPES로 변형시키고 NaOH로 pH 7.4로 조정된 HBSS(Hank’s buffered saline solution; Welgene)에서 3 mL의 1 mg/mL 콜라겐 분해효소(collagenase; Roche)로 팽창시켰고, 0.25% (w/v) BSA를 첨가하였다. 콜라겐 분해효소가 주입된 췌장은 37℃ 물이 담긴 욕조에서 15분 간 배양되었고, 매 5분마다 수동으로 흔들었다. 소화된 췌장은 수정된 HBSS로 얼음 위에서 3회 세척되었다. 섬은 Bicoll 용액(Biochrom)에서 밀도 구배에 의해 분리되었고, 해부 현미경 하에서 손으로 분리하였다. 섬들은 CO₂ 배양기 내 RPMI-1640 배지에서 밤새도록 배양되었다.

참조예 7. 웨스턴 블롯팅 방법

류코트리엔(leukotriene) 수용체 길항제로 처리된 MIN6 세포들은 제조사의 지시에 따라 단백질 분해효소(protease) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 억제제의 혼합물이 포함된 RIPA 완충액(Thermo Fisher Scientific)에서 용해되었다. 총 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 측정되었다. 총 단백질은 겔 전기영동에 의해 분리되었고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membranes; Millipore)에 옮겼다. 막은 5% (w/v) 무지방 우유로 차단되었고, 4℃에서 1차 항체와 밤새 배양되었다. Tween 20 완충액과 Tris 완충 식염수로 세척한 후, 막은 고추냉이 과산화효소 표지된 2차 항체와 배양되었고, 단백질들은 증진된 화학발광 시약(GE Healthcare Life Sciences)으로 시각화되었다. Anti-phospho-CaMKII (#3361), anti-phospho-AKT (#9271) 및 antiphospho-ERK (#9101)항체들은 Cell Signaling으로부터 얻었다. Anti-CaMKII (sc-5306), anti-AKT (sc-1619) 및 anti-ERK (sc-154)은 Santa Cruz Biotechnology로부터 얻었고, anti-β-actin (GTX109639) 항체는 GeneTex로부터 얻었다.

Claims (12)

1. 자피르루카스트(Zafirlukast) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 췌장의 β-세포에 작용하는 것인, 약학적 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 칼슘 채널을 통해 세포 외 칼슘의 세포 내 유입을 촉진하는 것인, 약학적 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 CaMKII(calmodulin-dependent protein kinase II), AKT(protein kinase B) 및 ERK(Extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 유도하는 것인, 약학적 조성물.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 인슐린 분비를 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 청구항 1에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 혈당 수치를 저하시키는 것인, 약학적 조성물.
   
8. 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
9. 청구항 8에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염은 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 것인, 건강기능식품.
   
10. 청구항 8에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염은 인슐린 분비를 증가시키는 것인, 건강기능식품.
    
11. 청구항 8에 있어서, 상기 자피르루카스트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염은 혈당 수치를 저하시키는 것인, 건강기능식품.
    
12. 삭제

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