KR101467996B1

KR101467996B1 - 에이디피-리보실 사이클라제 활성을 저해하는 퀴나졸린 유도체

Info

Publication number: KR101467996B1
Application number: KR1020100040417A
Authority: KR
Inventors: 김우현; 김선영; 남태식; 라소영; 김삼웅; 박광현
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2014-12-11
Also published as: KR20110121019A

Abstract

본 발명은 에이디피-리보실 사이클레이즈 (ADPR-cyclase)의 활성을 조절하는 퀴나졸린 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 퀴나졸린 유도체를 유효성분으로 하는 선택적 ADPR-cyclase 억제제 및 ADPR-cyclase 활성에 의한 세포내 칼슘증가 억제제에 관한 것이다.
상기 퀴나졸린 유도체는 ADPR-cyclase 효소 및 세포내 칼슘 증가를 억제함으로써, 심장, 신장 및 뇌 질환 등의 세포내 비정상적인 칼슘증가로 유발되는 질병 치료에도 사용될 수 있다.

Description

에이디피-리보실 사이클라제 활성을 저해하는 퀴나졸린 유도체 {The qhinazoline derivatives which are inhibitor of ADP-ribosyl cyclases}

본 발명은 강력한 에이디피-리보실 사이클라제(ADP-ribosyl cyclase, 이하 ADPR-cyclase라 함)의 활성을 조절하는 퀴나졸린 유도체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 퀴나졸린 유도체를 유효성분으로 하는 선택적 ADPR-cyclase 활성 억제제에 관한 것이다.

ADPR-cyclase는 NAD로부터 cADPR을 형성 하는데 이 cADPR은 식물에서부터 포유동물에 이르기까지 광범위하게 세포내 칼슘농도를 증가시키는 이차전령으로 작용함이 입증되었다 [Thompson, M., White, T., Chini, E.N Braz J. Med. Biol. Res. 39: 739~748, 2006]. 또한 세포내 칼슘농도 균형 조절은 정상생체 유지의 절대적인 필수 기능이다.

안정한 상태에서는 세포내 칼슘농도는 10^-7M 정도로 유지된다. 그러나 질병 상태에서는 세포내 칼슘농도가 정상치의 10-100 배 정도로 증가되며, 이와 같은 높은 농도가 지속적으로 유지되는 상태에서는 세포의 많은 기능이 영향을 받게 되며, 결과적으로 세포의 정상기능을 소실하게 된다.

고혈압 또는 고혈압을 동반한 당뇨병, 비만, 치매, 허열, 세포증식을 동반한 질환에서도 세포내의 칼슘대사조절에 이상이 생겨, 세포내의 칼슘농도가 정상보다 높게 유지된다 [Resnick, L.M. Ionic basis of hypertension, insulin resistance, vascular disease, and related disorders. The mechanism of Syndrome X. Am. J. Hypertens. 6:123S~34S, 1993].

일예로 고혈압과 같은 만성질환자를 살펴보면, 여러 가지 유전적, 환경적 혹은 어떤 질병의 이차적인 원인에 의해서 혈관 평활근세포내의 칼슘농도가 지속적으로 정상치보다 높은 수치를 나타내며, 그 결과 혈관 평활근의 수축을 유발시켜 말초혈관의 저항이 증가되어, 이로 인해 혈압이 정상혈압보다 상승된 상태로 지속적으로 유지되어 고혈압이 초래된다.

이와 같이 상승된 혈압은 이차적으로 혈관평활근세포와 섬유조직의 증식과 비대를 초래하고, 그 결과, 말초 혈관 저항과 혈압을 더욱 증가시켜, 심혈관계, 뇌 및 신장 등의 장기 기능이 저해되어 심근경색, 협심증, 중풍 및 만성 심부전증 등으로 사망에 이르게 한다고 알려져 있다 [Cowley, A.W.Jr. Long-term control of arterial blood pressure. Physiol. Rev. 72:231-300, 1992].

췌장으로부터 인슐린 분비에는 ADPR-cyclase의 일종인 CD38 활성에 의한, 즉 cADPR에 의한, 칼슘증가가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 당뇨병 유발은 안지오텐신의 생성을 증가시키는데 이 펩타이드 호르몬은 신장질환, 고혈압 및 심장병을 유발시킬 뿐만 아니라 ADPR-cyclase을 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다.

따라서 ADPR-cyclase는 면역세포, 심장근세포, 췌장 베타세포, 신장근세포 및 신경세포 등에 존재하면서 여러 호르몬의 수용체와 연관되어 세포내 칼슘농도의 증가 및 여러 생리활성을 조절함으로써 이 ADPR-cyclase의 발현 또는 활성 조절에 이상이 있으면 생리현상 (면역, 신장기능, 인슐린분비, 심혈관 기능) 조절에 이상을 일으킬 수 있다.

이와 같은 ADPR-cyclase는 여러 호르몬에 의하여 활성화되며 이 효소는 기질 β-NAD로부터 산물인 사이클릭 에이디피-라이보스 (cyclic ADP-ribose, 이하 "cADPR"라 함)를 생성하는데 이 cADPR은 거의 모든 장기에서 세포내 칼슘을 증가시킨다. 또한 ADPR-cyclase의 활성에 의한 칼슘의 이상증가는 인슐린분비 (insulin secretion)[Kim BJ, Park KH, Yim CY, Takasawa S, Okamoto H, Im MJ, Kim UH. Generation of nicotininc acid adenine dinucleotide phosphate and cyclic ADP-ribose by glucagon-like peptide-1 evokes Ca2+ signal that is essential for insuline secreation in mouse pancreatic islets. 57: 868-878, 2008], 세포비대 (hypertrophy) [Gul R, Ra가 JH, Kim SY, Jang KY, Chea JK, Ko JK, Kim UH. Inhibition of ADP-ribosyl cyclase attenuates antiotensin II-induced cardiac hypertrophy. 81: 582-591, 2009], 세포증식 (proliferation) [Kim SY, Gil R, Rah SY, Kim SH, Park SK, Im MJ, Kwon HJ, Kim UH. Molecular mechanism of ADP-ribosyl cyclase activation in angiotensin II signaling in murine mesangial cells. 294: F989-F989, 2008] 등 다양한 생체병리에 요인으로 알려져 왔다 .

현재까지 가장 잘 연구가 된 ADPR-cyclase는 T-세포 표면 항원인 CD38로서 이 분자는 면역세포 뿐만 아니라 여러 장기에 널리 발현되어 있다.

그러나 심장, 신장, 뇌에는 CD38과 다른 ADPR-cyclase가 발현된다고 밝혀졌다 [Partida-Sanchez S, Cockayne D. A., Monard S., Jacobson E. L., Oppenheimer N., Garvy B., Kusser K., Goodrich S., Howard M., Harmsen A., Randall T. D., Lund F. E. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat Med 7:1209-16, 2001].

이에 본 발명자는 신규 ADPR-cyclase 억제화합물을 라이브러리 스크리닝을 통하여 시험하여 보았으며, 그 결과 특정 퀴나졸린 유도체가 ADPR-cyclase의 억제효과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 퀴나졸린 유도체를 사용하여 ADPR-cyclase 활성을 억제함으로써 신장 유래 ADPR-cyclase의 활성을 억제하고자 함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 ADPR-cyclase를 억제하는 저 분자량의 퀴나졸린 유도체를 심장 혹은 신장 또는 뇌 등의 질병 예방 및/또는 치료에 이용하고자 하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신장 손실의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공함에 특징이 있다.

상기 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민의 유효농도는 0.01uM ~ 10uM인 것이 바람직하다.

삭제

상기 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민은 ADPR-cyclase 활성을 억제하는 것이 바람직하다.

삭제

상술한 바에 따르면, ADPR-cyclase의 억제제를 이용하여 인체 내 신장을 비롯한 각 장기에서 일어날 수 있는 질병의 기전을 연구할 수 있는 방법을 제공하고, 질병 치료제 개발에 기초가 될 것으로 기대한다.

도 1은 본 발명의 화합물에 의한 쥐의 신장에서 정제된 ADPR-cyclase 효소의 활성 저해를 나타낸 그래프이며,
도 2a와 도 2b는 마우스 메산지움 세포 (murine mesangial cells, MES-13 (ATCC cell line), 이하 MES-13 세포라 한다.) 에서 본 발명의 화합물이 안지오텐신 II에 의해 증가된 세포내 칼슘증가 억제를 나타낸 그래프이다.
도 3a와 도 3b는 MES-13 세포에서 본 발명의 화합물이 안지오텐신 II에 의해 증가된 세포내 cADPR 생성 억제를 나타낸 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퀴나졸린 유도체를 유효성분으로 하는 선택적 ADPR-cyclase 활성 억제제 또는 ADPR-cycalse 활성에 의해 증가된 세포내 칼슘증가 저해제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴나졸린 유도체를 유효성분으로 하는 ADPR-cyclase 효소 활성 억제제를 제공한다.

[화학식 1]

(여기서 식에서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵는 수소, 할로겐원자, 탄소수 1~6의 저급 알킬기, 치환기를 가져도 좋은 페닐기, 탄소수 1~4의 저급 알콕시기, 치환기를 가져도 좋은 옥시시클로펜탄기, 또는 탄소수 1~4의 저급 아세트아미드기다)

여기서 상기 화학식 1로 표시되는 유도체중 바람직한 퀴나졸린 유도체로는 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민(이하 화합물 1이라 한다.), 6-요오드-N-(2-메톡시벤질)퀴나졸린-4-아민(이하 화합물 2라 한다.)이다.

본 발명의 퀴나졸린 유도체는 ADPR-cyclase의 활성 억제 효과 및 ADPR-cyclase의 활성으로 증가된 세포내 칼슘 및 cADPR 생성 억제효과를 나타내고 있다. ADPR-cyclase의 활성을 억제함으로서 심장 및 신장 혹은 뇌질환을 위한 치료제로 사용할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 이와 같이 심혈관계 질환에서 나타나는 ADPR-cyclase의 활성을 억제하는 기전을 경유하여 심혈관계 심장, 신장 질환을 선택, 특이적으로 억제하는데 기여하는 것으로 확인되었다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1에서 목적 화합물은 ADPR-cyclase를 선택, 특이적으로 강력하게 억제하는 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 각 세포별 선택적 억제제, 나아가 심장 혹은 신장 또는 뇌 등의 질병 예방 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 임상 투여시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제도 사용된다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유지 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 1~1,000 mg/일이며, 바람직하게는 10~100 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 렛트 신장 ADPR - cyclase 활성 억제효과

(1) 실험방법

96-well plate에 렛트 신장 ADPR-cyclase와 0.1 M 인산나트륨 버퍼를 섞은 용액을 96-well plate에 넣고, 디메틸술폭시드 용매에 화합물을 1 ㎕씩 처리한 후, 실온에서 5분 방치한 뒤 4℃로 옮겨 다시 5분 방냉한다. 2 mM-NGD (Nicotinamide Guanine Dinucleotide)를 각 well에 2 ㎕씩 처리한다. 잘 섞이도록 plate의 각 면을 수 회 두드려 준 후 37℃에서 30분간 반응시킨다. 반응 완료 후 4℃에서 5분간 냉각하여 효소-기질 반응이 멈추도록 한다. 각 well에 200 ㎕ 버퍼를 첨가한 후 excitation 297 nm, emission 410 nm에서 형광 분석기로 흡광도를 측정하였다. 약제 무처리군에 비해 상대적으로 흡광도가 낮은 것을 효과적인 저해제로 판정하였다

(2) 실험결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보듯이 화합물 1과 2에 의해 렛트 신장 ADPR-cyclase의 활성이 100 uM 농도를 처리하였을 때 각각 51.9±1.4%, 51.2±0.2% 수준으로 억제되는 결과를 나타내었다.

실시예 2 : MES -13 세포내 칼슘농도 변화

(1) 실험방법

세포내 칼슘 농도 변화는 Xie et al [Xie GH, Rah SY, Yi KS, Han MK, Chae SW, Im MJ, Kim UH. Biochem Biophys Res Commun 307:713-718, 2003] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 칼슘 indicater인 5 uM fluo-3 AM을 HBSS (HEPES 20 mM, NaCl 145 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, D-Glucose 5 mM, pH 7.4) buffer에서 MES-13 세포에 30분 동안 처리한 다음 HBSS buffer로 3회 씻어준다.

화합물을 농도별로 30분간 전처리한 뒤 안지오텐신 II 150nM을 처리하여, 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하였다. 세포내 칼슘의 측정은 488 nm 의 excitation 파장과 530 nm의 emission 파장을 갖는 공초점 현미경에서 이루어졌으며 530nm에서의 이미지를 수집하여 칼슘의 농도를 산출하였다.

(2) 실험결과는 도 2a와 도 2b에 나타내었다. 도 2a와 도 2b에서 보듯이, 안지오텐신 II 만을 처리하면, 처리 후 10초 안에 세포내 칼슘농도가 증가하고, 증가된 상태로 200 초 이상 유지되었다.

반면, 화합물 1과 2를 전처리하였을 때 지속적으로 증가된 칼슘을 선택적으로 감소시키는 결과를 나타내었다.

실시예 3 : MES -13 세포내 cADPR 농도의 변화

(1) 실험방법

세포내 cADPR 농도 변화는 Graeff R et al [Graeff R, Lee HC. A novel cycling assay for cellular cADP-ribose with nanomolar sensitivity. Biochem J 361:379-84, 2002] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 MES-13 세포에 화합물을 농도별로 30분간 전처리한 뒤, 150 nM의 안지오텐신 II를 60초간 처리한 후 0.6 M 삼염화아세트산 (trichloroacetic acid)을 이용하여 세포내 cADPR을 추출한 뒤, 0.1 ml의 추출물과, cADPR 표준용액을 50 ㎕의 ADPR cyclase (0.3 ㎍/ml), 니코틴아미드(nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨(sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50 ㎕를 넣고, 상온에서 15 분간 반응시켰다.

이 혼합액에 에탄올(ethanol, 2%), 알콜디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, 100 ㎍/ml), 레자주린 (resazurin, 20 uM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 ㎍/ml), FMN(10 uM), 니코틴아미드(10 mM), 우혈청알부민(BSA, 0.1 mg/ml), 인산나트륨 (100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544 nm와 590nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 3a와 도 3b에 나타내었다. MES-13 세포에서 안지오텐신 II 에 의한 cADPR은 대조군에 약 2 배가량 생성량이 증가하였으나, 화합물 1과 2를 전처리하였을 경우 세포내 cADPR의 생성이 현저히 감소됨을 보였다.

실시예 4 : 제 1형 당뇨병성 신장 손실 마우스에서 화합물 1의 치료 효과

(1) 실험방법

웅성 마우스 (C57BL/6 mice, Orient, 한국) [체중 19-21g/마리]에 스트렙토조토신 (Streptozotocin, STZ, Sigma, USA) 75 mg/과 5일후에 100 mg/kg으로 정맥 주사하여 당뇨병을 유발시켰다 [Tay, Y.-C., Wang, Y., Kairaitis, L., Rangan, G. K., Zhang, C., Harris, D. C. H., Can murine diabetic nephropathy be separated from superimposed acute renal failure-Kidney international, 68:391-398, 2005].

스트렙토조토신을 투여한 다음날부터 군당 6마리씩으로 하여 실험하며, 각 군의 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 매일 정오에서 오후 2시 사이에 화합물 1 (327 ㎍/kg)을 대조군과 함께 2주간 복강 주사하였다.

혈당의 측정은 라이프스캔사 (Lifescan, Inc., USA) 의 One touch basic^TM을 사용하였으며 혈당측정 24시간 이전부터 약물 투여를 중지하였다.

마우스의 대사율 측정은 국내에서 생산 판매되는 메타볼릭 케이지 (metabolic cage)를 이용하여 24시간 동안의 사료와 물 섭취량, 소변량 등을 정량하였고, 채취된 소변의 생화학적 검사를 위해 단백질측정용 시액 (Bio-Rad, USA)을 사용하였다.

(2) 실험결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	정상 대조군	당뇨 대조군	약물단독투여군	약물투여당뇨군
혈중 글루코스 (mg/dl)	131.3 ± 4.5	396.0 ± 35.0	134.3 ± 2.3	403.3 ± 47.4
몸무게 (g)	23.3 ± 0.4	21.0 ± 2.4	23.7 ± 0.9	21.7 ± 0.8
신장 무게 (g)	0.344 ± 0.006	0.370 ± 0.021	0.343 ± 0.015	0.316 ± 0.020
몸무게 대비 신장무게 [(g*100)/g]	1.47 ± 0.02	1.77 ± 0.12	1.45 ± 0.04	1.45 ± 0.07
소변 단백량 (mg/day)	0.27 ± 0.03	2.54 ± 0.58	0.25 ± 0.02	1.33 ± 0.26

상기 표에서 보듯이, 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민은 당뇨에 의한 신장비대를 유의하게 억제하였으며, 당뇨병성 신증에 의해 증가된 24시간 소변의 단백질량도 약물 투여군에서 유의하게 감소하였다.

Claims

6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민의 유효농도는 0.01uM~10uM인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 6,8-디메틸-N-[1-(나프탈렌-1-일)에틸]퀴나졸린-1-아민은 ADPR-cyclase 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제