KR20080065786A - 이매티니브 메실레이트의 당뇨병 치료 또는 예방제로서의신규한 용도 - Google Patents

이매티니브 메실레이트의 당뇨병 치료 또는 예방제로서의신규한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이매티니브 메실레이트의 당뇨병 예방 또는 치료제로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 당뇨병으로 인한 고혈당을 정상치 수준으로 떨어뜨리며, 동시에 지방산에 의한 췌장세포의 사멸 또는 인슐린 신호전달체계의 이상을 정상화시켜 당뇨병의 근본적인 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
당뇨병, 이매티니브 메실레이트, 자유 지방산, 세포사멸

Description

이매티니브 메실레이트의 당뇨병 치료 또는 예방제로서의 신규한 용도{A NOVEL USE OF IMATINIB MESYLATE FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF DIABETES MELLITUS}
도 1은 당뇨병 동물모델에 글리백을 투여한 결과 혈당이 정상으로 회복된 것을 보여주는 결과이다.
도 2a는 당뇨병이 유발된 동물에서 글리백의 투여에 의하여 손상된 췌장소도 세포가 정상으로 회복된 결과를 보여준다.
도 2b는 당뇨병이 유발된 동물에서 글리백의 투여에 의하여 손상된 췌장소도 세포가 정상으로 회복된 결과를 양적인 수치로 나타낸 그래프이다.
도 2c는 당뇨병이 유발된 동물에서의 글리백의 투여에 의한 췌장소도 세포의 증식을 나타내는 BrdU 염색 결과(오른쪽 사진, 화살표는 염색된 세포를 나타냄) 및 그래프(왼쪽 도면)이다.
도 2d는 당뇨병이 유발된 동물에서 글리백의 투여에 의한 췌장소도 세포의 사멸 억제를 나타내는 TUNNEL 염색 결과이다.
도 3은 세포배양 실험에서, 지방산에 의한 췌장소도의 세포사멸에 대한 글리백의 억제효과를 세포의 생활도(viability)로 나타낸 결과이다.
도 4는 글리백을 처리한 결과, 지방산에 의해 감소된 Akt 인산화가 정상으로 회복되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
상기 도면 중의 그래프에서 결과는 평균±SD (standard deviation)으로 나타내며, * 또는 **는 student t-test로 결정된 통계적 유의성을 나타내는 것으로, *: P<0.05, **: P<0.01이다.
　　　　　　　　본 발명은 이매티니브 메실레이트의 당뇨병 예방 및 치료제로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 탄수화물 대사 이상에 의한 질병으로, 체내에서 포도당이 에너지원으로 이용되지 못하여, 포도당이 혈액 내에 고농도로 남아 있으며, 또한 소변으로 배설되는 만성 대사성 질환이다.　
당뇨병은 범인류적 질병으로, 그 수가 매년 증가하는 추세이다 (Sathishsekar D, Subramanian S. Beneficial effects of Momordica charantia seeds in the treatment of STZ-induced diabetes in experimental rats. Biol Pharm Bull. 2005;28:978-83).　 2003년 국제당뇨병연맹 (IDF)의 조사에 따르면 전 세계 당뇨병 환자 수는 약 1억 9천 4백만 명으로 추산되고, 당뇨병이 발병되었음에도 진단되지 않은 경우까지 고려하면 실제 환자 수는 3억 명 이상이 될 것으로 추정되며, 2025년경에는 전 세계 당뇨병 환자 수가 최소한 현재의 약 2-3배 이상으로 늘어날 것으로 예상된다.
　　　　　　　　우리나라의 경우, 최근 보고된 대한당뇨병학회와 건강보험심사평가원의 공동조사 결과에 따르면, 2003년 현재 당뇨병 환자 수는 전인구의 8.29%인 401만 여명이며, 현재의 발생률을 감안하면 2010년에는 490만 명, 2020년 620만 명, 2030년 720만 명으로 추산되어, 전체 인구 7명당 1명이 당뇨병일 것으로 생각된다.
당뇨병은 크게 인슐린 의존성인 제1형 당뇨병과 비의존성 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있다.　 제1형 당뇨병 환자는 유전적 원인 또는 바이러스 감염 등에 의하여 인슐린을 거의 분비하지 못하며, 제2형 당뇨병 환자는 분비되는 인슐린의 양은 정상이다.　 특히, 비만을 동반하는 제2형 당뇨병은 혈중 내 지방산의 증가로 인하여 인슐린 저항성이 유도되어 포도당 대사에 이상이 발생하여 결국 혈중 내 혈당이 높아지는 질환으로, 이와 함께, 췌장소도의 기능 부전 및 이로 인한 인슐린 분비의 이상과 신호 전달 이상이 제2형 당뇨병의 원인으로 생각된다.
이와 같은 당뇨병의 심각한 문제점은 고혈당으로 인한, 당뇨병성 망막증, 신증, 신경병증, 고지혈증, 심혈관질환 (뇌졸중, 협심증, 심근경색증, 말초혈관질환)과 같은 만성 합병증의 발생이다.　 예를 들면, 당뇨병 환자의 경우, 정상인과 비교하여, 시력상실 위험성이 25배, 신부전 위험성 및 괴저로 인한 사지절단의 위험성이 각각 20배, 관상동맥심질환 및 허혈성 뇌질환위험성이 2 내지 6배 증가되는 것으로 보고되었다 (Wolff SP. Diabetes mellitus and free radicals. Free radicals, transition metals and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus and complications. Br Med Bull. 1993;49:642-52).
이러한 만성 합병증은 대부분, 일단 발생된 이후에는 비가역적인 진행과정을 밟게 되며, 아직까지는 이러한 과정을 완전히 차단할 수 있는 방법이 없어, 적절한 치료가 병행되지 않을 경우, 심각한 증상을 초래하여 환자를 죽음에까지 이르게 한다. 그러므로 심각한 합병증을 유발하는 당뇨병의 효과적인 관리 또는 치료를 위해서는 정상 혈당의 유지가 필수적이다.
현재 당뇨병 환자의 정상 혈당의 유지를 위한 다수의 약제가 개발되었거나, 개발 중에 있으며, 이는 크게 경구용 혈당강하제와 인슐린 주사제로 구분된다.　 일반적으로 인슐린이 분비되지 않는 제1형 당뇨병 환자는 인슐린 주사를, 인슐린 비의존형의 제2형 당뇨병 환자는 혈당강하제를 복용한다.　 제1형 당뇨병 환자의 경우, 인슐린 투여 이외에는 실질적으로 다른 치료 대안이 없기 때문에, 제2형 당뇨병의 치료 약물의 개발에 많은 노력이 경주되어왔다.
현재 제2형 당뇨병 환자의 주요 치료제로서는 경구용 혈당강하제로서 설포닐우레아제, 비구아니드제 및 아카보스제가 있으며, 인슐린에 대한 민감성 향상제로서 메트포르민제, 로시글리타존 등이 있다.
그러나 이들 약물은 혈당강하의 증상 완화에 초점을 맞춘 대증요법제로서, 제2형 당뇨병 발병의 한 원인으로 주목받고 있는 췌장소도 세포사멸의 억제 및 신호전달 이상의 회복 등 근본적 원인의 치료에 중점을 둔 당뇨병의 예방 또는 치료제는 전무한 상태이다.
본 발명은 당뇨병의 주요 원인인 췌장소도 세포의 사멸을 억제하여 당뇨병의 예방은 물론, 당뇨병의 주 증상인 혈당을 강하시킬 수 있는 당뇨병의 근원적 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.　
상기 목적달성을 위해 본 발명은 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 이매티니브 메실레이트는 글리백인것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 췌장소도 세포사멸 억제제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 세포사멸은 혈중 자유 지방산에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 세포사멸 억제제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 자유 지방산은 팔미테이트인 것을 특징으로 하는 췌장소도 세포사멸 억제제를 제공한다
본 발명은 또한, 상기 췌장소도 세포사멸 억제제는 당뇨병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 췌장소도 세포사멸 억제제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
　　　　　　본 발명은 당뇨병의 원인이 되는 췌장소도 세포의 사멸 억제와 동시에 혈당을 강하시킬 수 있는, 효과적인 당뇨병의 예방 또는 치료제를 탐색하던 중, 4-[(4-메틸-1-피레라지닐)메틸]-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]-페닐]벤즈아미드 메탄설포네이트 (이매티니브 메실레이트,imatinib Mesylate)가 당뇨병 치료 또는 예방에 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서 상기 이매티니브 메실레이트는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112007002526219-PAT00001
다른 구현예에서, 이매티니브 메실레이트는 글리백(GleevecTM , Novartis Pharmaceuticals, U.S.A.)이다. 이매티니브 메실레이트는 현재 필라델피아-염색체 양성 (Philadelphia-chromosome positive) 만성골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemis, CML)의 치료에 매우 효과적인 약물로 알려져 있다. 상기 약물은 치료적 투여량에서 Bcr-Abl 타이로신 카이나제에 대하여 선택적 억제효과를 나타낼 뿐만 아니라, 기타 다른 타이로신 카이나제, 예컨대 혈소판 유래 성장인자 수용체 베타 (PDGF-베타), Akt (단백질 카이나제 B), 세포외 조절성 카이나제 1 및 2(ERK 1 and ERK2) 및 c-kit에 대한 억제효과 활성을 갖는 것으로 나타났다 (Kantarjian H., Sawyers C, Hochhaus A, et al. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med. 2002; 346: 645-652; Bohmer FD, Karagyozov L., Uecker A, et al, A single amino acid exchange inverts susceptibility of related receptor tyrosine kinases for the ATP site inhibitor STI-571, J. Biol. Chem. 2003; 278:5148-55; Sanz-Gonzales SMCastro C, et al., Role of E2F and ERK1/2 in STI571-mediated smooth muscle cell growth arrest and cyclin A transcriptional repression. Biochem Biophys Res Commum 2004; 317:972-9). 종전에 글리백이 투여된 당뇨병을 갖는 CML 환자에서 혈당강하효과가 보고되었으나 (Veneri, D., Franchini M., and Bonora E, Imatinib and regression of type 2 diabetes. N Engl J Med 2005; 352:1049-1050), 이의 정확한 기전 및 글리백의 췌장소도 세포의 사멸억제 효과 및 인슐린의 신호전달 경로에 미치는 영향과 당뇨병의 근원적인 예방 및 치료가능성에 대하여는 전혀 알려진 바 없다.
본 발명의 한 구현예에서 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병이다. 본 발명의 약학 조성물은 당뇨병의 대표적 증상인 고혈당을 정상 수준으로 회복시키는 것은 물론 인슐린 저항성에서 제2형 당뇨병으로 진행하는데 있어 가장 중요한 기전인 췌장소도 세포의 사멸을 효과적으로 억제할 수 있어, 제2형 당뇨병 위험군에서의 당뇨병 예방 및 당뇨병 환자의 치료를 가능하게 하는 새로운 개념의 당뇨병 예방 또는 치료제이다. 이러한 본원 발명의 효과는 본 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 제2형 당뇨병의 주요 기전으로서 부각된 지방산에 의한 인슐린의 분비를 담당하는 췌장소도의 세포사멸의 억제와 관련이 있을 수 있다. 상기 이론에 의하면, 비만이 있는 대상체의 경우, 비인산화 형태의 비에스테르화 자유 지방산(Nonesterified free fatty acid)이 증가되고, 이러한 증가된 자유 지방산은 세라마이드 농도를 증가시키고 이는 이어서 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)와 산화질소(nitric oxide, NO)의 형성을 증가시켜 결국엔 췌장세포를 사멸시켜 당뇨병을 유발하거나, 인슐린에 의한 신호전달에 이상을 초래한다 (Cnop M, Hannaert JC, Hoorens A, Eizirik DL, Pipeleers DG. Inverse relationship between cytotoxicity of free fatty acids in pancreatic islet cells and cellular triglyceride accumulation. Diabetes, 2001; 50:1771-1777; Maedler K, Spinas GA, Dyntar D, Moritz W, Kaiser N, Donath MY. Distinct effects of saturated and monounsaturated fatty acids on cell turnover and function. Diabetes, 2001; 50:69-76; Shimabukuro M, Zhou YT, Levi M, Unger RH. Fatty acid-induced βcell apoptosis: a link between obesity and diabetes. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:2498-2502; Shimabukuro M, Ohneda M, Lee Y, Unger RH. Role of nitric oxide in obesity-induced beta cell disease. J. Clin. Invest 1997; 100:290-295).
본 발명의 한 구현예에 따르면 대표적인 제2형 당뇨병 동물모델로서, 당뇨병 위험인자를 갖는 당뇨병 발생 시작 초기의 비만이 동반된 당뇨병 (diabetic-obese) (db/db) 마우스에게 글리백을 투여한 결과 혈당이 정상수준으로 회복되고, 췌장소도 세포의 질량 증가 및 세포사멸의 감소가 수반된다(도 1 및 도 2a 내지 2d 참조). 이는 본 발명의 약학조성물이 당뇨병 발생을 예방하여 당뇨병을 근본적 치료할 수 있음을 나타내는 것이다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 췌장소도 유래의 세포를 이용한 시험관내 배양된 세포에 글리백의 처리시, 지방산에 의한 췌장소도 세포의 사멸이 억제되어 췌장소도 세포의 수가 증가되며, 아울러 지방산에 의한 인슐린의 Akt 단백질 인산화의 감소가 억제된다 (도 3 및 도 4 참조). 이는 이매티니브 메실레이트가 지방산에 의한 세포사멸의 억제는 물론, 인슐린 신호전달 체계의 이상을 회복시킬 수 있음을 나타내는 것으로서, 이는 당뇨병의 예방, 및 혈당강하에 의한 당뇨병의 치료와 합병증 예방 효과를 동시에 증명하는 것이다.
다른 관점에서 본 발명은 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 췌장소도 세포사멸 억제제를 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 세포사멸은 비에스테르화 지방산 또는 자유 지방산에 의해 유도된 것이며, 자유 지방산의 예로는 혈장에 가장 많이 존재하는 팔미테이트를 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 억제제는 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 췌장소도 세포사멸 억제제는, 상승된 혈당을 정상 수준으로 강하시킬 뿐아니라 지방산에 의한 췌장소도 세포의 사멸을 억제하며( 도1 내지 3 및 실시예 1, 2 참조), 지방산에 의한 인슐린 신호전달체 계의 이상을 정상으로 되돌리는 효과를 나타낸다 (도 4 및 실시예 3 참조).
본 발명의 약학 조성물 또는 췌장소도 세포사멸 억제제는 단독으로 또는 당뇨병, 당뇨병성 합병증 예를 들면 간병증 또는 신병증, 고지혈증, 고콜레스테롤증 등의 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 이매티니브 메실레이트를 포함하는 약학 조성물 또는 췌장소도 세포사멸 억제제는 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 이매티니브 메실레이트를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 세포사멸 억제제의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제형은 이매티니브 메실레이트에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 슈크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제형으로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
더 나아가 본 발명의 이매티니브 메실레이트를 포함하는 약학 조성물 또는 췌장소도 세포사멸 억제제는 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 이매티니브 메실레이트의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 약학 조성물 중 이매티니브 메실레이트를 유효 투여량은 통상적으로 성인(70kg)의 경우, 1일당 10 내지 1500mg, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질병의 경중, 신체적 상태 등 여러 가지 조건에 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투 여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
실시예
실시예 1 동물모델에서의 이매티니브 메실레이트의 혈당강하 효과
당뇨병 동물 모델로서 5~7주령의 db/db 마우스를 대전 화학 연구소로부터 수득하였다. 이들 마우스를 음성 대조군(12마리)(비투여 대조군)과 시험군(11마리)으로 나눈 후, 음성대조군(db/db-Veh)에는 PBS(phosphate buffered saline, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4)를 실험군(db/db-G25mg/kg)에는 글리백 (GleevecTM, Novartis Pharmaceuticals, U,S,A.) 25mg/kg을 동일한 부피로 4주 동안 하루에 한번 매일 같은 시각에 복강투여한 후, 매주 혈장의 포도당 농도(혈당)를 통상의 방법대로 측정하였다. 혈당 측정 결과는 도 1에 기재하였다. 대조군과 달리, 시험군에서는 글리백 주사 후, 혈당이 감소하기 시작하여 실험을 수행한 4주 동안 혈당강하 효과가 지속되었다. 이러한 글리백에 의한 혈당 강하효과는, 글리백의 당뇨병의 치료제로서 유용성을 증명하는 것이다.
실시예 2 동물모델에서의 이매티니브 메실레이트의 췌장소도 세포의 회복, 재생, 및 사멸억제 효과
이매티니브 메실레이트의 췌장소도 세포의 사멸억제 효과 및 재생 효과를 시험하기 위하여, 이매티니브 메실레이트 투여군 및 비투여 대조군 마우스에서의 췌 장 소도세포의 질량 증가, 췌장소도 세포의 증식 및 세포사멸 여부를 조사하였다.
실시예 1의 투여군 및 비투여 대조군 마우스 각각으로부터 췌장 조직의 후미부분을 적출한 후 이를 고정액에서 1일간 고정하였다. 그 후, 상기 조직을 파라핀으로 포매한 후 마이크로톰을 이용해 5-10 마이크로미터 두께의 얇은 절편으로 잘라 유리 슬라이드에 옮긴 후 헤마톡실린(Haematoxylin, H, Sigma, U.S.A.) 용액과 에오신 (Eosin, E, Sigma, U.S.A.)용액으로 염색하였다. 상기 염색된 절편을 광학현미경에서 200배의 배율로 관찰하였다.
결과는 도 2a 내지 2d에 나타내었다. 투여군에서만 정상적인 췌장소도 세포를 관찰할 수 있었으며, 글리백으로 처리되지 않은 비투여 대조군(db/db-Veh)에서는 췌장소도 세포의 수가 투여군과 비교하여 현저하게 감소한 것을 관찰할 수 있었다 (도 2a). 이러한 결과는 글리백 처리군에서의 췌장소도 세포의 양 (도 2b) 및 세포 증식 증가(도 2c, BrdU 염색법으로 확인하였으며, DNA 분열 및 세포 증식이 활발할수록 BrdU의 DNA로의 혼입이 증가되며, BudU 검출의 증가는 활발한 세포증식을 나타냄) 및 세포사멸 억제(도 2d, TUNNEL 염색방법으로 확인, TUNNEL 염색 양성인 세포는 세포의 사멸이 일어난 것을 나타냄)의 결과와 일치하는 것이다. 상기 결과는 대증치료가 아닌 근원적 당뇨병 예방 및 치료제로서의 이매티니브 메실레이트의 우수한 효과를 증명하는 것이다.
췌장소도 세포의 양 측정, BrdU (Bromodeoxyuridine) 염색을 이용한 췌장소도 세포 증식 및 TUNNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labelling) 염색을 이용한 세포사멸여부 측정은 공지된 방법대로 수행되었다 (예를 들면, Pyruvate inhibits zinc-mediated pancreatic islet cell death and diabetes Diabetologia, 2003; Volume 46, Number 9 참조).
실시예 3 시험관내 세포배양에서의 이매티니브 메실레이트의 지방산에 의한 췌장소도 세포의 사멸 억제
3-1 세포의 생활도(viability)에 미치는 영향
제2형 당뇨병의 기전 중의 하나로 보고된 자유 지방산에 의한 췌장소도세포의 사멸에 미치는 이매티니브 메실레이트의 효과를 관찰하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
인슐린 분비세포로서, 마우스 췌장소도 세포(베타 세포) 유래의 인슐리노마 세포인 NIT-1 세포 (ATCC No:CRL-2055, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 사용하였다. 상기 세포를 1X104 cell/well 의 농도로 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 이어서, 24시간 후에, 세포내를 잘 통과할 수 있도록 2% BSA (Bovine serum albumin, Sigma, U.S.A)로 컨쥬게이션된 팔미테이트(P-0500, Sigma, U.S.A)를 1000μM의 농도로 상기 세포에 48시간 동안 처리하였다. 글리백 처리군의 경우, 팔미테이트 처리 전에, 글리백(Novartis Pharmaceuticals)을 1 및 10μM의 농도로 1시간 동안 처리하였다. 이어서, 통상의 방법대로, 48시간 후에 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분 석을 하여 세포 생활도(Cell viability)를 측정하였다 (Mosmann, T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Meth. 1983; 65: 55-63).
결과는 도 3에 나타내었다. NIT-1 세포에 1000μM 팔미테이트를 48 시간 처리한 경우(도 3의 PA 1000)는 40%의 세포가 사멸한 반면 (도 3의 No.2), 글리백을 10μM의 농도로 전처리한 후, 팔미테이트로 처리한 경우에는 대부분의 세포가 정상 수준으로 살아 있었으며 (도 3의 No.4, No.1과 비교), 글리백만을 투여한 경우는 세포가 사멸되지 않았다 (도 3의 No. 5 및 6). 이는 이매티니브 메실레이트가 지방산에 의한 췌장소도 세포의 사멸을 억제함으로서, 당뇨병의 근원적 치료 또는 예방에 효과적인 치료제로서 작용할 수 있음을 증명하는 것이다.
3-2 Akt 인산화에 미치는 영향
래트의 골격근 세포인 L6 myoblast 세포(American Type Culture Collection,USA: ATCC CRL 1458)를 공지의 방법대로 6 웰 플레이트에서 마이오튜브로 분화시킨뒤 (E Hajduch, DR Alessi, BA Hemmings, and HS Hundal Constitutive activation of protein kinase B alpha by membrane targeting promotes glucose and system A amino acid transport, protein synthesis, and inactivation of glycogen synthase kinase 3 in L6 muscle cells, Diabetes, 1998; 47: 1006-1013; Mitsumoto Y, Klip A. Development regulation of the subcellular distribution and glycosylation of GLUT1 and GLUT4 glucose transporters during myogenesis of L6 muscle cells. J Biol Chem. 1992;267(7):4957-62), 100nM 인슐린(인간유래, I-9278, Sigma U.S.A.), 800μM 팔미테이트(Sigma) 및 10μM 글리백(Novartis Pharmaceuticals)을 도 4에 표시된 조합으로 처리하였다. 상기 세 가지를 모두 처리하는 경우는, 글리백을 해당 세포에 10μM의 농도로 1 시간 전처리한 후 팔미테이트를 800μM의 농도로 12시간 처리하고, 이어서, 4시간 동안 혈청을 결핍 (serum starvation)시킨 다음 인슐린을 100nM 농도로 15분 처리하였다. 각 처리 후 세포에서 총단백질을 공지의 방법대로 추출한 후, 200㎍의 총단백질 추출물에 대하여 Akt 및 인산화된 Akt에 특이적인 항체 (phospho-Akt and total Akt; Cell singaling Technology Inc., MA, USA)를 사용하여 통상의 방법대로 웨스턴블롯을 수행하였다 (Inik Chang, Namjoo Cho, Sunshin Kim, Ja Young Kim, Eunshil Kim, Ji-Eun Woo, Joo Hyun Nam, Sung Joon Kim and Myung-Shik Lee, Role of Calcium in Pancreatic Islet Cell Death by IFN-gamma/TNF-alpha, The Journal of Immunology, 2004, 172: 7008-7014).
결과는 도 4에 나타내었다. 정상적인 상태의 근육세포, 즉 팔미테이트를 처리하지 않은 경우에는 인슐린 처리시, 인슐린 신호가 정상적으로 전달되어 Akt가 인산화가 되지만 (도 4, 레인 2), 이와 대조적으로 팔미테이트로 처리 한 경우에는 인슐린을 처리하여도 팔미테이트가 인슐린의 신호 전달을 방해함으로써 인슐린에 의한 Akt의 인산화가 정상적으로 일어나지 않는다 (도 4의 레인 4, 레인 2와 비교). 하지만 글리백으로 처리한 경우에는, 인슐린의 Akt 인산화가 정상수준으로 회복되었다(도 4, 레인 6). 즉, 팔미테이트는 인슐린 신호전달을 방해하여 인슐린에 의한 Akt 인산화가 정상적으로 일어나지 않게 하지만, 글리백의 투여에 의해 이러한 현상을 방해함으로써, 정상적인 Akt의 인산화를 유도하는 것이다. 따라서, 상기 결과는 인슐린 표적 조직인 근육세포에서 팔미테이트와 같은 지방산에 의한 인슐린 저항성이 글리백의 투여를 통해 저해되어 인슐린에 의한 Akt의 정상적인 인산화를 유도하여 신호전달을 정상화시킴으로서, 당뇨병을 근원적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 증명하는 것이다.
본 발명의 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 당뇨병 환자의 혈당을 정상화시킬 수 있어, 당뇨병 치료제로서 뿐만 아니라, 췌장소도 세포사멸을 억제함으로써, 당뇨병 위험군에서의 당뇨병 발생의 예방에도 효과적으로 사용될 수 있는, 새로운 개념의 근본적인 당뇨병 치료제이다.

Claims (8)

  1. 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이매티니브 메실레이트는 글리백 (Gleevec TM)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 이매티니브 메실레이트를 유효성분으로 포함하는 췌장소도 세포사멸 억제제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 세포사멸은 혈중 자유 지방산에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 자유 지방산은 팔미테이트인 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 췌장소도 세포사멸 억제제는 당뇨병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
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