KR20110133329A - 시닥나무 추출물을 함유하는 에이디피-리보실 사이클라제 활성을 저해하는 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시닥나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 에이디피-리보실 사이클레이즈 (ADP-ribosyl cyclase, 이하 ADPR-cyclase라 함)의 활성 조절제에 관한 것으로, 구체적으로 시닥나무 추출물의 유효성분이 간세포 특이적 ADPR-cyclase 억제제 및 ADPR-cyclase 활성에 의한 세포내 칼슘증가 억제제에 관한 것이다. 상기 시닥나무 추출물은 ADPR-cyclase 효소 및 세포내 칼슘 증가를 억제함으로써, 간 섬유화 및 간 질환 등의 세포내 비정상적인 칼슘증가로 유발되는 질병 치료에로도 사용될 수 있다.

Description

시닥나무 추출물을 함유하는 에이디피-리보실 사이클라제 활성을 저해하는 억제제 {An inhibitor of ADP-ribosyl cyclases activation inclding the extract of Acer tschonoskii var. rubripes}

본 발명은 간세포 선택적 ADPR-cyclase 활성을 억제하는 시닥나무 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 시닥나무 추출물을 유효성분으로 하는 간세포 선택적 ADPR-cyclase 활성 억제제에 관한 것이다.

ADPR-cyclase는 NAD로부터 cADPR을 형성 하는데 이 cADPR은 식물에서부터 포유동물에 이르기까지 광범위하게 세포내 칼슘농도를 증가 시키는 이차전령으로 작용함이 입증되었다 [Thompson, M., White, T., Chini, E.N Braz J. Med. Biol. Res. 39: 739~748, 2006]. 또한 세포내 칼슘농도 균형 조절은 정상생체 유지의 절대적인 필수 기능이다.

안정한 상태에서는 세포내 칼슘농도는 10^-7 M 정도로 유지된다. 그러나 질병 상태에서는 세포내 칼슘농도가 정상치의 10-100 배 정도로 증가되며, 이와 같은 높은 농도가 지속적으로 유지되는 상태에서는 세포의 많은 기능이 영향을 받게 되며, 결과적으로 세포의 정상기능을 소실하게 된다.

간 섬유화 및 간경화 질환에서도 세포내의 칼슘대사조절에 이상이 생겨, 세포내의 칼슘농도가 정상보다 높게 유지된다. 간성상세포는 간 섬유화에 핵심적인 역할을 하는 세포로 알려졌다. 활성화된 간성상세포는 다양한 사이토카인의 분비를 촉진시켜 extracellular matrix의 생성을 촉진시켜 metallopreoteinase와 collagenae등의 extracellular matrix 분해효소의 생성을 억제함으로써 간조직 중 결합조직의 과다 축적을 유도한다 [Friedman, S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J. Biol. Chem. 275:2247-2250, 2000].

활성화된 간성상세포에는 ADPR-cyclase의 일종인 CD38이 세포표면 분자로 발현되어 있으며, CD38이 대부분의 사이토카인 분비를 촉진하고 간 섬유화가 진행됨에 CD38의 활성 증가로 세포내 cADPR이 증가되어 칼슘이 증가되고 간 섬유화 및 간경변을 초래한다 [Kim SY, Cho BH, Kim UH. CD38-mediated Ca2+ signaling contributes to angiotensin II-induced activation of hepatic stellate cells: attenuation of hepatic fibrosis. J Biol Chem. 285(1):576-582. 2010]

췌장으로부터 인슐린 분비에는 ADPR-cyclase의 일종인 CD38 활성에 의한, 즉 cADPR에 의한, 칼슘증가가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 당뇨병 유발은 안지오텐신의 생성을 증가시키는데 이 펩타이드 호르몬은 간질환, 신장질환, 고혈압 및 심장병을 유발시킬 뿐만 아니라 ADPR-cyclase을 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다.

따라서 ADPR-cyclase는 간성상세포, 면역세포, 심장근세포, 췌장 베타세포, 신장근세포 및 신경세포 등에 존재하면서 여러 호르몬의 수용체와 연관되어 세포내 칼슘농도의 증가 및 여러 생리활성을 조절함으로써 이 ADPR-cyclase의 발현 또는 활성 조절에 이상이 있으면 생리현상 (간기능, 면역, 신장기능, 인슐린분비, 심혈관 기능) 조절에 이상을 일으킬 수 있다.

이같은 ADPR-cyclase는 여러 호르몬에 의하여 활성화되며 이 효소는 기질 β-NAD로부터 산물인 사이클릭 에이디피-라이보스 (cyclic ADP-ribose, 이하 "cADPR"라 함)를 생성하는데 이 cADPR은 거의 모든 장기에서 세포내 칼슘을 증가시킨다. 또한 ADPR-cyclase의 활성에 의한 칼슘의 이상증가는 인슐린분비 (insulin secretion)[Kim BJ, Park KH, Yim CY, Takasawa S, Okamoto H, Im MJ, Kim UH. Generation of nicotininc acid adenine dinucleotide phosphate and cyclic ADP-ribose by glucagon-like peptide-1 evokes Ca2+ signal that is essential for insuline secreation in mouse pancreatic islets. 57: 868-878, 2008], 세포비대 (hypertrophy) [Gul R, Ra가 JH, Kim SY, Jang KY, Chea JK, Ko JK, Kim UH. Inhibition of ADP-ribosyl cyclase attenuates antiotensin II-induced cardiac hypertrophy. 81: 582-591, 2009], 세포증식 (proliferation) [Kim SY, Gil R, Rah SY, Kim SH, Park SK, Im MJ, Kwon HJ, Kim UH. Molecular mechanism of ADP-ribosyl cyclase activation in angiotensin II signaling in murine mesangial cells. 294: F989-F989, 2008] 등 다양한 생체병리에 요인으로 알려져 왔다 .

현재까지 가장 잘 연구가 된 ADPR-cyclase는 T-세포 표면 항원인 CD38로서 이 분자는 면역세포 뿐만 아니라 여러 장기에 널리 발현되어 있다.

이에 본 발명자는 신규 ADPR-cyclase 억제제를 천연물 라이브러리 스크리닝을 통하여 시험하여 보았으며, 그 결과 천연물인 시닥나무 추출물이 간성상세포 선택적ADPR-cyclase의 효소 활성 억제효과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 시닥나무 추출물를 사용하여 ADPR-cyclase 활성을 억제함으로써 간성상세포 선택적 ADPR-cyclase의 활성을 억제하고자 함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 ADPR-cyclase를 억제하는 시닥나무 추출물을 간 섬유화 및 간경변 등의 질병 예방 및/또는 치료에 이용하고자 하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시닥나무 추출물를 유효성분으로 하는 선택적 ADPR-cyclase 활성 억제제 또는 ADPR-cyalse 활성에 의해 증가된 세포내 칼슘증가 저해제를 제공한다.

상술한 바에 따르면, ADPR-cyclase의 억제제를 이용하여 인체 내 간조직을 비롯한 각 장기에서 일어날 수 있는 질병의 기전을 연구할 수 있는 방법을 제공하고, 질병 치료제 개발에 기초가 될 것으로 기대한다.

도 1은 본 발명의 시닥나무 추출물에 의한 정제된 ADPR-cyclase 효소의 활성 저해를 나타낸 그래프이다.
도 2는 마우스 간성상세포 (hepatic stellate cells) 에서 본 발명의 시닥나무 추출물이 안지오텐신 II에 의해 증가된 세포내 cADPR 생성 억제를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마우스 간성상세포에서 본 발명의 시닥나무 추출물이 안지오텐신 II에 의해 증가된 세포내 칼슘증가 억제를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마우스 간성상세포에서 본 발명의 시닥나무 추출물에 의해 세포독성이 없음을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 시닥나무 추출물은 ADPR-cyclase의 활성 억제 효과 및 ADPR-cyclase의 활성으로 증가된 세포내 칼슘 및 cADPR 생성 억제효과를 나타내고 있다. ADPR-cyclase의 활성을 억제함으로서 간 섬유화 및 간경변 등의 간질환을 위한 치료제로 사용할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 시닥나무 추출물은 이와 같이 간조직 관계 질환에서 나타나는 ADPR-cyclase의 활성을 억제하는 기전을 경유하여 간 질환을 선택, 특이적으로 억제하는데 기여하는 것으로 확인되었다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 시닥나무 추출물은 ADPR-cyclase를 선택, 특이적으로 강력하게 억제하는 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 각 세포별 선택적 억제제, 나아가 간 섬유화 및 간경변 등의 간질환 예방 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.

시닥나무 추출물은 임상 투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제도 사용된다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유지 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 시닥나무 추출물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 1~1,000 mg/일이며, 바람직하게는 10~100 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : ADPR - cyclase 활성 억제효과

(1) 실험방법

96-well plate에 ADPR-cyclase와 0.1 M 인산나트륨 버퍼를 섞은 용액을 96-well plate에 넣고, 디메틸술폭시드 용매에 화합물을 1 ul씩 처리한 후, 실온에서 5분 방치한 뒤 4 ℃로 옮겨 다시 5분 방냉한다. 2 mM-NGD (Nicotinamide Guanine Dinucleotide)를 각 well에 2 ul씩 처리한다. 잘 섞이도록 plate의 각 면을 수 회 두드려 준 후 37 ℃에서 30 분간 반응시킨다. 반응 완료 후 4 ℃에서 5 분간 냉각하여 효소-기질 반응이 멈추도록 한다. 각 well에 200 ul 버퍼를 첨가한 후 excitation 297 nm, emission 410 nm에서 형광 분석기로 흡광도를 측정하였다. 약제 무처리군에 비해 상대적으로 흡광도가 낮은 것을 효과적인 저해제로 판정하였다

(2) 실험결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보듯이 시닥나무 추출물에 의해 ADPR-cyclase의 활성이 20 ug/ml 농도를 처리하였을 때 50 ± 5.6% 수준으로 억제되는 결과를 나타내었다.

실시예 2: 간성상 세포내 cADPR 농도의 변화

(1) 실험방법

세포내 cADPR 농도 변화는 Graeff R et al [Graeff R, Lee HC. A novel cycling assay for cellular cADP-ribose with nanomolar sensitivity. Biochem J 361:379-84, 2002] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 마우스 간성상 세포에 20 ug/ml 농도의 시닥나무 추출물을 20 분간 전처리한 뒤, 100 nM의 안지오텐신 II를 60초간 처리한 후 0.6M 삼염화아세트산 (trichloroacetic acid)을 이용하여 세포내 cADPR을 추출한 뒤, 0.1 ml의 추출물과, cADPR 표준용액을 50의 ADPR cyclase(0.3 ug/ml), 니코틴아미드(nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨(sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50 ul를 넣고, 상온에서 15 분간 반응시켰다.

이 혼합액에 에탄올(ethanol, 2%), 알콜디하이드로게네이즈(alcohol dehydrogenase, 100 ug/ml), 레자주린(resazurin, 20 uM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 ug/ml), FMN(10 uM), 니코틴아미드(10 mM), 우혈청알부민(BSA, 0.1 mg/ml), 인산나트륨(100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544 nm와 590 nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 2에 나타내었다. 마우스 간성상세포에서 안지오텐신 II 에 의한 cADPR은 대조군에 약 2 배가량 생성량이 증가하였으나, 시닥나무 추출물을 20 ug/ml 전처리하였을 경우 세포내 cADPR의 생성이 현저히 감소됨을 보였다.

실시예 3 : 간성상 세포내 칼슘농도 변화

(1) 실험방법

세포내 칼슘 농도 변화는 Xie et al [Xie GH, Rah SY, Yi KS, Han MK, Chae SW, Im MJ, Kim UH. Biochem Biophys Res Commun 307:713-718, 2003] 에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.

구체적으로는 칼슘 indicater인 5 uM fluo-3 AM을 HBSS (HEPES 20 mM, NaCl 145 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, D-Glucose 5 mM, pH 7.4) buffer에서 간성상세포에 30분 동안 처리한 다음 HBSS buffer로 3회 씻어준다.

세포에 20 ug/ml 농도의 시닥나무 추출물을 20 분간 전처리한 뒤 안지오텐신 II 100 nM을 처리하여, 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하였다. 세포내 칼슘의 측정은 488 nm의 excitation 파장과 530 nm의 emission 파장을 갖는 공초점 현미경에서 이루어졌으며 530 nm에서의 이미지를 수집하여 칼슘의 농도를 산출하였다.

(2) 실험결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보듯이, 시닥나무 추출물을 농도 의존적으로 전처리하면 안지오텐신 II에 의한 세포내 칼슘농도 증가가 유의하게 억제되었다.

실시예 4 : 간성상세포에서 세포독성 평가

(1) 실험방법

치료제로 사용할 경우 세포 독성이 없어야 한다. 시닥나무 추출물에 대한 세포독성 효과에 대해 간성상 세포를 이용하여 MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 실험을 하였다.

구체적으로는 마우스 간성상 세포에 시닥나무 추출물을 농도별로 24 시간 처리 후 다음날 MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 용액을 1 mg/m 농도로 4시간 반응 후 570 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과는 도 4에 나타내었다. 마우스 간성상 세포에서 시닥나무 추출물에 대한 세포독성은 100 ug/ml 이하 농도에서는 나타나지 않았다.

Claims (2)

1. 시닥나무 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 ADPR-cyclase 억제제.
   
2. 시닥나무 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 간조직 선택적 ADPR-cyclase 활성으로 유도된 간 질환의 예방 및 치료제.
   

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