KR20090049948A

KR20090049948A - 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1ｂ를 저해하는벤조나프토크산테논계 화합물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20090049948A
Application number: KR1020070116331A
Authority: KR
Inventors: 이홍금; 임정한; 김일찬; 홍순규; 김덕규; 이유경; 오현철; 손재학; 서찬곤
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2009-05-19
Also published as: KR100957205B1

Abstract

본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B를 저해하는 벤조나프토크산테논계 화합물 및 그 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 남극의 선태류인 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 또는 이로부터 분리한 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물들을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 및 벤조나프토크산테논계 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 저해 활성이 우수하므로, 당뇨병 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 제2형 당뇨병인 인슐린 비의존형 당뇨병에 대하여 치료효과가 뛰어나다.

폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum), 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(PTP1B), 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone), 당뇨병, 오히오엔신(ohioensin)

Description

단백질 타이로신 탈인산화 효소 1Ｂ를 저해하는 벤조나프토크산테논계 화합물 및 그 용도{Benzonaphthoxanthenones for Inhibiting Protein Tyrosine Phosphatase 1B and Use Thereof}

당뇨병은 췌장의 β-세포에서 분비되는 인슐린이 부족하거나 그 기능을 제대로 발휘하지 못하여 포도당이 근육이나 간 등의 세포에서 흡수되어 저장되지 않고 혈액 내에 고농도로 존재하다가 소변으로 배설되는 질환으로, 일반적으로 두 가지 형태로 알려져 있다.

제1형 당뇨병은 유전적 원인, 바이러스 감염 등에 의해 췌장의 β-세포의 기 능이 저하되어 거의 인슐린이 분비되지 않는 상태로, 인슐린을 주사로 공급해 주어야 혈당이 조절되기 때문에 인슐린 의존형 당뇨병이라고 한다.

이에 반하여, 제2형 당뇨병은 인슐린은 생성되나 인슐린의 활성이 떨어지거나 말초조직세포에서 작용감도가 약해져서 인슐린 내성이 생겨서 혈당조절에 문제가 되는 것으로, 인슐린 주사에 의해서는 혈당이 조절되지 않고 혈당강하제나 식이요법 등에 의해서 혈당을 조절해야 하기 때문에 인슐린 비의존성 당뇨병이라고 한다. 이러한 제2형 당뇨병은 생활수준이 향상되며 전반적인 식생활의 향상으로 섭취열량이 많이 증가하고, 운동부족 및 스트레스에 노출되는 생활이 지속하면서 인슐린의 성능이 떨어지며, 또한 이러한 생활습관으로 인한 비만이 발생하면서 발병이 증가되는 추세를 보이고 있는데, 전체 당뇨병 환자 중 95% 이상이 제2형 당뇨병에 해당한다.

현재 제2형 당뇨병의 치료제로 주로 사용되는 것은 혈당강하제로, 치료기전 및 작용약물의 작용점에 따라 설포닐우레아계(sulfonylureas) 약물, 비구아니드계(biguanides) 약물 및 티아졸리딘디온계(thiazolidinedione) 약물로 나눌 수 있다. 설포닐우레아 계통은 주로 췌장의 β-세포 안에 있는 인슐린을 함유한 과립포의 이동을 촉진하여 간접적으로 인슐린을 분비시키는 약물로 저혈당 유발 등 심각한 부작용이 보고되었으나, 최근에는 부작용을 최소화한 약물이 개발되고 있다. 비구아니드 계통은 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당이 만들어지지 못하게 하는 약물로 비만인 당뇨 환자에게 사용하는데 고령자와 심혈관 질환 환자에게는 주의해야 한다. 티아졸리딘디온 계통은 최근 개발된 것으로, 핵막 수용체이면서 유전자 전사 촉진인자인 피피에이알 감마(PPAR-γ)를 활성화하여 인슐린 내성을 개선시킨다. 그러나, 경구용 혈당강하제만으로는 혈당이 효과적으로 저하되지 않으며, 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로, 천연물 유래의 보다 안전한 당뇨병 치료제 또는 예방제의 개발이 요청되고 있다.

최근에는 제2형 당뇨병과 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(protein tyrosin phosphatase 1B, PTP1B)와의 관련성이 밝혀지며, 이의 저해물질의 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 주목받았다 (Exp . Opin . Invest . Drugs , 8:139, 1999). 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 유전자를 제거한 쥐의 경우 인슐린에 대해 민감한 성질을 보인다고 보고되었는데, 이는 쥐에게 인슐린을 투여하였을 때 간과 근육세포에서 인슐린 수용체의 인산화가 증가하고 오래 지속된다는 사실을 보였으며, 이는 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B가 활성화된 인슐린 수용체의 탈인산화에 결정적인 역할을 하여 이 효소의 억제가 제2형 당뇨병 치료에 매우 효과적임을 보였다 (Elchevly et al ., Science, 283:1544, 1999). 또한 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 저해물질이 제2형 당뇨병 질환모델 쥐에서 혈당강하나 인슐린 내성 극복 등 제2형 당뇨병에 효과가 있음이 보고되었다 (J. Med . Chem ., 42:3199, 1999; J. Biol . Chem., 275:10300, 2000). 이에 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 저해제를 당뇨병 치료제로 개발하기 위한 노력이 활발히 진행되고 있다(Nature Review Drug Discovery, 1,696~709).

한편, 선태식물(bryphytes) 중 우산이끼(liverworts)에 대해서는 그 화학적 특성에 대해 지난 수십 년간 연구되어 왔으나, 다양한 서식처에서 군집화된 대략 10,000종 이상으로 알려진 이끼류들에 대해서는 연구가 활성화되어 있지 않았다. 이끼류의 특성은 우산이끼와 달라서 우산이끼에서 공통적으로 발견되는 세포 내 유체(oil bodies)는 이끼류에서는 발견되지 않았다. 이에 이끼류는 상대적으로 미개발된 새로운 바이오활성 대사물질을 개발하기 위한 천연자원으로 나타났다. 특히, 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 등 남극의 이끼류에 대한 화학적 특성의 연구를 통한 새로운 생물학적 이차 대사산물의 가능성 있는 자원을 개발하기 위한 노력이 요청되었다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적으며, 제2형 당뇨병 치료에 효과적인 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(PTP1B)의 활성화를 억제하는 물질에 대하여 탐색하던 중, 남극의 이끼류인 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)의 추출물로부터 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계의 신규한 화합물인 오히오엔신 F (ohioensin F, 화학식 1) 및 G(화학식 2)를 분리하여 이들의 화학구조 및 물리화학적 특성을 규명한 다음, 이들 및 이들과 함께 분리된 오히오엔신 A(화학식 3) 및 C(화학식 4)의 PTP1B 저해활성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 활성을 저해능을 가지는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 및 이로부터 분리한 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 및 상기 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성 저해능을 갖는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음 화학식 1 또는 2로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 1로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법을 제공한다:

(a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 80%(v/v) 메탄올 수용액(메탄 올:물=80:20)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~60%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~60:60~40)에서 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 2 또는 다음 화학식 4로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법을 제공한다:

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 70%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=70:30)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~82%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~82:60~18)에서 다음 화학식 2 및 4로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 2]

[화학식 4]

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 3으로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법을 제공한다:

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 90%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=90:10)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~80%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~80:60~20)에서 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 3]

본 발명은 또한, 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물 을 제공한다.

본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 활성 저해능을 갖는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 및 이로부터 분리한 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한, 상기 추출물 및 화합물들을 유효성분으로 함유한 혈당강하용 약학 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 일 관점에서, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성 저해능을 갖는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물은 남극 선태류의 일종인 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 통상의 추출방법에 따라 추출함으로써 얻어질 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 사용할 수 있다. 여기서 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올이란 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등을 예시할 수 있는데, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올 수용액을 용매로서 사용한다.

추출 중 폴리트리카스트럼 알피넘은 그대로 또는 분쇄하여 사용할 수 있으며, 사용되는 용매의 사용량은 건조된 폴리트리카스트럼 알피넘 100g 당 0.1 내지 5L를 사용할 수 있다. 추출을 위한 온도로는 4 내지 120℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 추출시간은 특별히 한정되지 않으나 10분 내지 30일 일수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결 건조하여 용매를 제거할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성을 저해하는 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계 화합물은 상기 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물로부터 크로마토그래피를 이용하여 용출해 내어 분리된 것이다.

다음 화학식 1로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법은 (a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 80%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=80:20)에서 용출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~60%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~60:60~40)에서 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

[화학식 1]

다음 화학식 2 또는 다음 화학식 4로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법은 (a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum )을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 70%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=70:30)에서 용출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~82%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~82:60~18)에서 다음 화학식 2 및 4로 표시되는 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

[화학식 2]

[화학식 4]

다음 화학식 3으로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법은 (a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 90%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=90:10)에서 용출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~80%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~80:60~20)에서 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

[화학식 3]

분리된 화학식 3 및 4의 화합물은 이들의 NMR 데이터를 기존에 보고된 문헌들(Zheng, G.Q. et al., J. Am . Chem . Soc ., 111:5500, 1989; Zheng, G.Q. et al., J. Org . Chem ., 58:366.1993)들과 대비할 때, 종래 알려진 화합물인 오히오엔신(ohioensins) A 및 C로 확인되었다.

한편, 분리된 화학식 1 및 2의 화합물은 NMR 및 HRESIMS 데이터를 이용하여 그 구조를 분석한 결과, 오히오엔신(ohioensins)이라고 불리는 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계로 분류할 수 있는 신규한 화합물임을 알 수 있었다. 즉, 화학식 1 및 2의 화합물의 경우 상기 오히오엔신(ohioensins) A 및 C와 같은 링 구조를 가지므로 상기 벤조나프토크산테논계 화합물로 보아, 본 발명자들은 각각 오히오엔신 F 및 G라 명명하였다.

화학식 2의 화합물인 오히오엔신 G를 화학식 4의 화합물인 오히오엔신 C에 대해 보고된 자료와 비교해 보면, 양자 모두 H-7b 및 H-14c (J=13.2Hz)와, H-14c 및 H-12b (J=7.7Hz)의 커플링 상수가 유사한 것으로 나타나, 화학식 2의 화합물에서도 상동한 트랜스(trans) H-7b/H-14c 및 시스(cis) H-14/H-12b의 구조를 볼 수 있었다. 한편, 화학식 2의 화합물의 H-12b 및 H-13간 관찰된 작은 J-값은 H-13이 사이클로핵세논(cyclohexenone) 링에 대하여 쉐도이큐토리얼(pseudequatorial) 방향을 채택함을 나타내며, H-12b 및 H-13간 상대적인 배치는 시스(cis)이었다.

벤조나프토크산테논계 대사산물은 천연물질로는 거의 보기 드문 것으로, 이끼류인 Polytrichum ohioense (Zheng, G.Q. et al ., J. Am . Chem . Soc., 111:5500, 1989; Zheng, G.Q. et al ., J. Org . Chem., 58:366, 1993) 및 P. pallidisetum (Zheng, G.Q. et al ., J. Nat . Prod ., 57:32, 1994)에서 보고된 바 있다.

오히오엔신 A - E는 이끼류로부터 신규한 바이오활성 대사산물을 발견하기 위한 목적으로 NCI 스크리닝 과정에서 발견된 것으로, 다양한 종양 세포에 대한 세포독성(cytotoxicity)을 보이는 것으로 알려져 있다 (Zheng, G.Q. et al ., J. Am . Chem. Soc., 111:5500, 1989; Zheng, G.Q. et al ., J. Org . Chem., 58:366, 1993; Zheng, G.Q. et al ., J. Nat . Prod ., 57:32, 1994).

본 발명은 또 다른 관점에서, 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물 및 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 혈당강하용 약학 조성물은 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 여기서 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 텍스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물 또는 벤조나프토크산테논계 (benzonaphthoxanthenone) 화합물의 일일 투여량은 약 10~500mg/kg(체중)이고, 바람직하게는 20~300mg/kg(체중)이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 또한, 당뇨병의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 폴리트리카스트럼 알피넘 ( Polytrichastrum alpinum ) 추출물의 제조

폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum (Hedw.) G.L. Sm.)은 2003년 1월 남국 킹 조지 섬의 세종기지(S 62°13.3', W58°47.0') 주위의 바튼 반도(Barton Peninsular)에서 발명자 중 한 명(J.H. Yim)이 직접 채취하였다.

채취된 Polytrichastrum alpinum (Hedw.) G.L. Sm.의 건조 샘플(50g)을 24시간 동안 메탄올(1L×2)로 추출한 후, 감압 농축하여 메탄올 조추출물(crude MeOH extract) 4.7g을 수득하였다.

실시예 2. 폴리트리카스트럼 알피넘 추출물로부터의 벤조나프토크산테논계 화합물의 분리

상기 실시예 1에서 제조된 폴리트리카스트럼 알피넘의 메탄올 조추출물 4.7g을 C₁₈ 기능성 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(C₁₈ functionalized silica gel flash column chromatography, 3×15㎝, Aldrich)에 로딩시킨 후, 물 400mL 당 각 20%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%(v/v) 메탄올의 혼합용매를 순차적으로 주입하여 각각의 분획물을 획득하였다.

80% 메탄올로 용출한 분획물(fraction, 41mg)은 다시 반-분취 역상(semi-preparative reverse-phase) HPLC에 주입한 후, 물(0.1% 포름산(formic acid))에 대해 CH₃CN을 40 내지 60%의 농도로 사용한 혼합용매를 27분 정도 사용하여 화학식 1의 화합물(3.9mg; t_R=22.4분)을 분리하였다.

또한, 70% 메탄올로 용출한 분획(32mg)은 반-분취 역상(semi-preparative reverse-phase) HPLC에 주입한 후, 물(0.1% 포름산(formic acid))에 CH₃CN을 40 내지 82%의 농도로 사용한 혼합용매를 42분 정도 사용하여 화학식 2의 화합물(2.6mg; t_R=29.5분) 및 화학식 4의 화합물(4.0mg; t_R=40.5분)을 분리하였다.

또한, 90% 메탄올로 용출한 분획 역시 반-분취 역상(semi-preparative reverse-phase) HPLC에 주입한 후, 물(0.1% 포름산(formic acid))에 CH₃CN을 40 내지 80%의 농도로 사용한 혼합용매를 30분 정도 사용하여 화학식 3의 화합물(4.5mg; t_R=16.0분)을 분리하였다.

실시예 3. 분리된 화합물의 구조분석

상기 실시예 2에서 분리한 화합물들의 화학구조를 규명하기 위하여 NMR 및 HRESIMS 데이터를 측정하여 분석하였다. NMR 데이터는 ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 분석하였다.

구체적인 분석 결과, 화학식 1 및 2의 화합물은 벤조나프토크산테논(benzonaphthoxanthenone)계로 분류할 수 있는 신규한 화합물임을 알 수 있었다. 또한, 함께 분리된 화학식 3 및 4의 화합물은 측정한 NMR 데이터를 기존에 보고된 문헌들 (Zheng, G.Q. et al., J. Am . Chem . Soc ., 111:5500, 1989; Zheng, G.Q. et al., J. Org . Chem ., 58:366.1993)과 대비할 때, 종래 알려진 화합물인 오히오엔신(ohioensins) A 및 C로 확인되었다.

먼저, 본 발명자들이 신규하게 밝혀낸 화학식 1 및 2의 화합물에 대한 구조분석 및 물성 등의 측정결과는 다음과 같다.

3-1. 화학식 1의 화합물: Ohioensin F

[화학식 1]

1) 물성: 황색 검 (yellow gum)

2) 분자식: C₂₃H₁₆O₆

3) [a]²⁵ _D +54 (c 0.52, MeOH); UV (CH₃OH) λmax (log ε) 367 (3.4), 273 (4.4), 215 (4.6); ¹H, ¹³C, 및 2D NMR data, 표 1 참조; ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 8.29 (d, J = 8.4 Hz, H-4), 7.61 (d, J = 7.6 Hz, H-12), 7.35 (br s, H-7), 7.26 (t, J = 7.5 Hz, H-10), 7.05 (t, J = 7.5 Hz, H-11), 7.04 (d, J = 7.5 Hz, H-9), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.35 (br s, H-2), 5.10 (d, J = 13.4 Hz, H-7b), 3.08 (d, J = 15.4 Hz, H-13), 3.03 (d, J = 15.4 Hz, H-13); H-14c에 대한 시그널은 잔존 용매 시그널과 오버랩되었다; ESIMS m/z 387 [(M - H)^-; rel int 100)]; HRESIMS m/z 389.1000 (M + H)⁺ (calc. for C₂₃H₁₇O₆, 389.1025).

<표 1>NMR Spectroscopic data for Ohioensin F(화학식 1) in DMSO-d ₆

position	δ_H (int, mult., J in Hz)^a	δ_C ^b	HMBC (H → C#)
1		160.4
2	6.39 (1H, s)	101.8	1, 3, 3a, 14a
3		162.7
3a		114.4
3b		121.3
4	8.25 (1H, d, 8.4)	129.0	3a, 6, 7a
5	6.77 (1H, dd, 8.7, 2.6)	113.7	3b, 7
6		156.1
7	7.26 (1H, br s)	110.8	3b, 5, 6, 7b
7a		139.1
7b	5.25 (1H, d, 14.3)	72.4	3b, 6,^c 7, 7a, 12b, 14b, 14c
8a		151.8
9	7.02 (1H, br d, 8.0)	116.5	8a, 10, 11, 12b^c
10	7.28 (1H, br t, 7.7)	128.6	8a, 12
11	7.05 (1H, br t, 7.7)	121.4	9, 10
12	7.62 (1H, dd, 7.7, 1.4)	127.8	8a, 12a, 12b
12a		129.3
12b		65.5
13	2.85 (1H, d, 15.2) 3.24 (1H, d, 15.2)	49.0	12b, 14, 14a, 14c 7b,^c 12b, 14
14		199.9
14a		109.4
14b		137.2
14c	3.28 (1H, d, 14.3)	46.6	3a, 7a, 13, 14a, 14b
1-OH	11.95 (1H, s)		1, 2, 14a

^aRecorded at 400 MHz. ^bRecorded at 100 MHz. ^cWeak four-bond correlations.

도 2 내지 도 7은 각각 화학식 1의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼, ¹³C NMR 스펙트럼, COSY 스펙트럼, HMQC 스펙트럼, HMBC 스펙트럼 및 NOESY 스펙트럼 결과를 나타내는 그래프이다.

3-2. 화학식 2의 화합물: Ohioensin G

[화학식 2]

1) 물성: 황색 검 (yellow gum)

2) 분자식: C₂₃H₁₇O₆

3) [a]²⁵ _D -12 (c 0.43, MeOH); UV (CH₃OH) λmax (log ε) 357 (3.6), 269 (4.1), 215 (5.1); ¹H, ¹³C, 및 2D NMR data in DMSO-d ₆ , 표 2 참조; ESIMS m/z 387 [(M - H)^-; rel int 100)]; HRESIMS m/z 389.1011 (M + H)⁺ (calc. for C₂₃H₁₇O₆, 389.1025).

<표 2> NMR Spectroscopic data for Ohioensin G(화학식 2) in DMSO-d ₆

position	δ_H (int, mult., J in Hz)^a	δ_C ^b	HMBC (H → C#)
1		163.5
2	5.81 (1H, s)	103.9	1, 3a, 14a
3		175.7
3a		118.3
3b		121.23
4		158.2
5	6.60 (1H, d, 8.3)	118.6	3b, 7
6	7.04 (1H, t, 8.3)	126.4	4, 7a
7	7.11 (1H, d, 8.3)	111.7	3b, 5
7a		140.1
7b	5.02 (1H, d, 13.2)	73.2	7a, 14c
8a		154.1
9	7.00 (1H, br d, 8.4)	116.4	8a, 12a
10	7.18 (1H, br t, 8.4)	127.5	8a, 12
11	6.95 (1H, br t, 8.4)	121.15	9, 12a
12	7.38 (1H, br d, 8.4)	129.2	8a, 10, 12b
12a		120.4
12b	3.42 (1H, m)	33.7	7b, 12a
13	4.17 (br s)	73.5
14		198.1
14a		103.3
14b		140.2
14c	2.95 (1H, dd, 13.2, 7.7)	36.2	3a, 12b, 13, 14b
1-OH	12.12 (1H, s)		1, 2, 14a

^aRecorded at 400 MHz. ^bRecorded at 100 MHz.

도 8 내지 도 12는 각각 화학식 2의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼, ¹³C NMR 스펙트럼, COSY 스펙트럼, HMQC 스펙트럼 및 HMBC 스펙트럼 결과를 나타내는 그래프이다.

한편, 화학식 3 및 4의 화합물의 측정한 NMR 데이터는 다음과 같다.

3-3. 화학식 3의 화합물: Ohioensin A

<표 3>NMR Spectroscopic data for Ohioensin A(화학식 3) in DMSO-d ₆

position	δ _H ( int , mult ., J in Hz)^a	δ_C
1		160.8
2	6.45 (1H, s)	101.8
3		162.2
3a		114.3
3b		121.1
4	8.21 (1H, d, 8.4)	129.3
5	6.77 (1H, dd, 8.7, 2.6)	113.7
6		156.2
7	7.28 (1H, br s)	111.0
7a		139.2
7b	5.09 (1H, d, 13.5)	69.5
8a		152.3
9	7.04 (1H, br d, 8.0)	116.9
10	7.23 (1H, br t, 7.7)	127.9
11	6.99 (1H, br t, 7.7)	121.2
12	7.41 (1H, dd, 7.7, 1.4)	129.7
12a		123.8
12b	3.58 (1H, m)	27.5
13	2.78 (1H, dd, 4.8, 15.0) 2.98 (1H, t, 15.0)	41.9
14		201.0
14a		110.5
14b		139.3
14c	3.24 (1H, dd, 13.9, 7.7)	37.5
1-OH	12.07 (1H, s)

도 13 및 도 14는 화학식 3의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 결과를 나타내는 그래프이다.

3-4. 화학식 4의 화합물: Ohioensin C

<표 4>NMR Spectroscopic data for Ohioensin C(화학식 4) in DMSO-d ₆

position	δ _H ( int , mult ., J in Hz)^a	δ_C
1		162.7
2	5.76 (1H, s)	103.8
3		175.2
3a		118.3
3b		121.4
4		158.1
5	6.62 (1H, d, 8.3)	118.7
6	7.06 (1H, t, 8.3)	126.5
7	7.13 (1H, d, 8.3)	112.2
7a		139.5
7b	4.93 (1H, d, 13.6)	69.8
8a		152.2
9	7.01 (1H, br d, 8.4)	116.8
10	7.18 (1H, br t, 8.4)	127.7
11	6.93 (1H, br t, 8.4)	120.6
12	7.33 (1H, br d, 8.4)	129.7
12a		124.0
12b	3.45 (1H, m)	28.2
13	2.60 (1H, dd, 4.5, 14.6) 2.78 (1H, t, 14.6)	42.0
14		197.6
14a		106.0
14b		139.2
14c	2.99 (1H, dd, 13.2, 7.7)	37.1
1-OH	12.12 (1H, s)

도 15 및 도 16은 화학식 4의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 결과를 나타내는 그래프이다.

실시예 3: 단밸질 타이로신 탈인산화 효소 1B( PTP1B ) 저해 활성 확인

단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B(human, recombinant)는 BIOMOL Research Laboratories, Inc.로부터 구입하여 실험에 사용하였으며, 효소활성을 측정하기 위하여 ρ-니트로페닐 포스페이트(pNTT)를 기질로서 사용하였다.

0.05~0.1㎕의 PTP1B와 2mM pNPP를 완충용액(50mM citrate(pH 6.0), 0.1M NaCl, 1mM EDTA 및 1mM DTT(dithiothreitol)를 포함한 반응 혼합물(최종 부피 100 ㎕)에 저해제로서 상기 분리한 화학식 1, 2, 3 및 4의 화합물을 첨가하였다. 양성 대조군으로서 상기 화학식의 화합물 대신 이미 알려진 탈인산화 효소(phosphatase) 저해제인 RK-682 (BIOMOL)를 사용하였다.

반응혼합물은 30분간 30℃ 인큐베이터에 정치 후, 1M NaOH 용액(10㎕)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 그 후, 제조된 p-니트로페놀(nitrophenol)의 양은 405nm에서 흡광도를 측정함으로서 계산하였다. 2mM pNPP의 비효소적 가수분해는 PTP1B 효소를 넣지 않은 상태에서 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 보정하였다. 효소 저해율은 하기의 수학식 1과 같이 계산하였으며, IC₅₀값은 효소 활성의 저해율이 50%에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

저해율(%)= [(A-B) / (A-C)] * 100

A: 효소를 넣은 것의 반응 후 흡광도

B: 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

C: 저해제와 효소를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

화학식 1, 2, 3 및 4의 화합물들의 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B 활성을 50% 저해하는 농도를 측정한 결과는 다음의 표 5와 같다.

<표 5>

저해제	IC₅₀(μM)
화학식 1의 화합물(Ohioensins F)	3.5±0.2
화학식 2의 화합물(Ohioensins G)	5.6±0.7
화학식 3의 화합물(Ohioensins A)	4.3±0.3
화학식 4의 화합물(Ohioensins C)	7.6±0.7
RK-682 (양성대조군)	4.5±0.5

표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물들은 양성대조군과 대비할 때, 더 우수하거나 비슷한 IC₅₀값을 가지는 것으로 측정되었다.

상기의 실험결과는 본 발명의 화학식 1, 2, 3 및 4의 화합물들이 모두 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B에 대한 저해 활성이 우수함을 나타낸다.

실시예 5: PTP1B 활성 저해 모습 분석

벤조나프토크산테논계(benzonaphthoxanthenone) 화합물의 저해 방식을 설명하기 위하여, 화학식 1의 화합물을 각각 1.5μM, 3.0μM, 4.4μM, 6.0μM의 농도로 하여 상기 실시예 3과 같이 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 저해 실험을 수행하였다.

이때, PTP1B 효소의 Km(Michaelis-Menten constant) 및 최대속도 (V_max)는 GraphPad Prism^® 4 프로그램(GraphPad Software Inc., USA)을 사용한 Lineweaver-Burk 플롯에 의해 결정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, pNPP가 기질로서 사용되었을 때, 화학식 1의 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B의 최대속도 값은 감소시키나, K _m 값은 실험조건 하에서 변하지 않는 것으로 나타났다. 즉, 화학식 1의 화합물은 1.5μM의 K _i값을 갖는 비경쟁적 저해제로 나타났다.

한편, 화학식 2 내지 4의 화합물 역시 화학식 1이 화합물과 구조상 유사하므로, 단백질 탈인산화 효소 1B의 저해 방식은 유사한 것으로 보인다.

제조예 1: 캡슐제의 제조

유효성분 100mg

옥수수 전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 2: 정제의 제조

유효성분 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기 성분들을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 3: 산제의 제조

유효성분 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)에 의한 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(PTP1B) 저해의 운동 분석을 나타내는 것으로, Lineweaver-Burk 플롯이다.

도 2은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 3은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 4은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 COSY 스펙트럼이다.

도 5은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 HMQC스펙트럼이다.

도 6은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 HMBC 스펙트럼이다.

도 7은 오히오엔신 F(화학식 1의 화합물)의 NOESY 스펙트럼이다.

도 8은 오히오엔신 G(화학식 2의 화합물)의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 9은 오히오엔신 G(화학식 2의 화합물)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 10은 오히오엔신 G(화학식 2의 화합물)의 COSY 스펙트럼이다.

도 11은 오히오엔신 G(화학식 2의 화합물)의 HMQC 스펙트럼이다.

도 12은 오히오엔신 G(화학식 2의 화합물)의 HMBC 스펙트럼이다.

도 13은 오히오엔신 A(화학식 3의 화합물)의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 14은 오히오엔신 A(화학식 3의 화합물)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 15은 오히오엔신 C(화학식 4의 화합물)의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 16은 오히오엔신 C(화학식 4의 화합물)의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

Claims

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성 저해능을 갖는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물.
제1항에 있어서, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물.
다음 화학식 1 또는 2로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물:

[화학식 1]

[화학식 2]
다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 1로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법:

(a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 80%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=80:20)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~60%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~60:60~40)에서 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 1]
다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 2 또는 4로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법:

(a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 70%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=70:30)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~82%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~82:60~18)에서 다음 화학식 2 및 4로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 2]

[화학식 4]
다음의 단계를 포함하는 다음 화학식 3으로 표시되는 벤조나프토크산테논 (benzonaphthoxanthenone)계 화합물의 분리방법:

(a) 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum)을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출된 폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum) 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 90%(v/v) 메탄올 수용액(메탄올:물=90:10)에서 용출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계에서 용출된 분획물을 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 40~80%(v/v) 아세토니트릴(CH₃CN) 수용액(CH₃CN:물=40~80:60~20)에서 다음 화학식 3으로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.

[화학식 3]
폴리트리카스트럼 알피넘(Polytrichastrum alpinum ) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물.
다음 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈당강하용 약학 조성물:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]