CN116199743A - 抗焦亡多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗焦亡多肽及其应用，涉及生物医学技术领域，其技术方案要点是：抗焦亡多肽具体在制备预防和治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，抗焦亡多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次将抗焦亡多肽用于制备治疗或/和治疗动脉粥样硬化的药物，并且抗焦亡多肽用于控制动脉粥样硬化的效果在细胞模型和动物模型上得以验证。特别是，抗焦亡多肽能提升缺焦亡状态下内皮细胞细胞的活力、显著抑制焦亡相关的基因和蛋白的表达，同时能减少动脉粥样硬化小鼠血清胆固醇和低密度脂蛋白的水平，减少主动脉脂质沉积和斑块形成。并且，本发明的抗焦亡多肽作为药物成分时，还具有毒性低、分子量小、免疫原性小和成药性高等优势。

Description

抗焦亡多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地说，它涉及抗焦亡多肽及其应用。

背景技术

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以血脂异常和炎症为基础的慢性炎症性疾病。以AS为共同病理基础的心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)，是导致老年人死亡的首要原因。近年来，AS造成的CVDs死亡持续增加且有年轻化趋势，现有的抗AS药物并不能满足患者日益增长的需求。因此，急需寻求新的抗动脉粥样硬化的策略。

多肽由于其毒性低、分子量小、靶向性好和易进入细胞等特点，已成为生物药物研发的一大趋势。在心血管疾病的诊断及治疗方面，有关多肽的研究已有了广泛的临床应用。如：已有心血管疾病治疗的多肽类药物获批上市，如血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂依替巴肽(INTEGRILIN,商品名翰安)、作用于利尿钠肽受体的多肽类药物重组人脑钠肽(Recombinant human B-type natriuretic peptide,rhBNP,商品名新活素)。现有研究结果显示，多肽在心血管疾病诊断和治疗领域有巨大的潜力和广阔的应用前景。近年来GLP-1肽类似物利拉鲁肽在糖尿病临床治疗上的应用，更是为多肽药物的研发与转化研究注入了强心剂。

抗焦亡多肽是通过多肽组学技术，在焦亡的内皮细胞模型中，新发现的一个多肽序列，国内外未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供抗焦亡多肽及其应用，解决了背景技术中提到的技术问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：抗焦亡多肽，所述抗焦亡多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

与上述方案等同的替换的方案是：所述抗焦亡多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。

进一步的，所述抗焦亡多肽采用生物学方法合成。

进一步的，所述抗焦亡多肽采用化学方法合成。

本发明还提供了抗焦亡多肽在制备预防和治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

所述药物包括抗焦亡多肽和药学辅料。

进一步的，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、眼用制剂和外用制剂中的其中一种。

进一步的，所述辅料选自填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂中的至少一种。

进一步的，所述填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种。

进一步的，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

本方案涉及以下序列：

SEQ ID NO.1：

其通式为：X-P-Y，所述P为：

Gly-Gln-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val--Gly-Gly-Gln-Gly—Pro-Arg-Gly-Met-Gly-Pro(GQGGAGPVGGQGPRGMGP)(ASRP2)。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明首次将抗焦亡多肽用于制备治疗或/和治疗动脉粥样硬化的药物，并且抗焦亡多肽用于治疗动脉粥样硬化的效果在细胞模型和动物模型上得以验证。特别是，抗焦亡多肽能提升焦亡诱导的人脐静脉内皮细胞的活力，显著抑制焦亡相关的蛋白激活，同时可以减少动脉粥样硬化小鼠模型中，血清中胆固醇和低密度脂蛋白水平，减少主动脉根部脂质沉积和斑块面积；并且，本发明的抗焦亡多肽作为药物成分时，还具有毒性低、分子量小、免疫原性小和成药性高等优势。

附图说明

图1是本发明实施例1中抗焦亡多肽质谱图；

图2是本发明实施例3中各组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的活力测试结果图；

图3是本发明实施例3中各组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)焦亡相关基因水平的测试结果图；

图4是本发明实施例3中各组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)焦亡相关蛋白Caspase1和TUNEL荧光结果图；

图5A是本发明实施例4中抗焦亡多肽对动脉粥样硬化小鼠血清低密度脂蛋白水平的测试结果图；

图5B是本发明实施例4中抗焦亡多肽对动脉粥样硬化小鼠血清总胆固醇水平的测试结果图；

图6是本发明实施例4中抗焦亡多肽对各组动脉粥样硬化小鼠斑块面积和脂质沉积的结果图。

具体实施方式

以下结合附图1-6对本发明作进一步详细说明。

实施例1：一种抗焦亡多肽，抗焦亡多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：其通式为：X-P-Y，所述P为：

Gly-Gln-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val--Gly-Gly-Gln-Gly—Pro-Arg-Gly-Met-Gly-Pro(NH₃-GQGGAGPVGGQGPRGMGP-OH)(ASRP2)；该ASRP2多肽具有18个氨基酸，位于人SFPQ蛋白第668-685位氨基酸，等电点(PI)为9.75，分子质量(MW)为1535.7263，半衰期为30h，不稳定系数(Instability Index)为15.52，表明该多肽较为稳定。

X为：NH₃或任意一种氨基酸或任意两种氨基酸的组合；

Y为：OH或任意一种氨基酸或任意两种氨基酸的组合；

由上海科肽生物技术公司通过固相化学合成，纯度在95％以上。

与上述技术方案等同的替换方案是抗焦亡多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％同源性。

实施例2：涉及抗焦亡多肽的新应用，具体涉及抗焦亡多肽在制备预防或/和治疗心脏病的药物中的应用，该药物包含抗焦亡多肽以及药学上可接接受的辅料，该药物包括但不限于静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、经皮给药等。

本实施例对药物的剂型不做特别限定，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、眼用制剂、外用制剂等。

本实施例对辅料的种类不做特别限定，包括但不限于如下种类：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂等。

其中填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种；或/和，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

本实施例对抗焦亡多肽的氨基酸序列构成进行限定的基础上，对该抗焦亡多肽的制备方式不做特别限定，可以是通过化学合成的方式，也可以通过生物合成的方式。化学合成的方式包括但不限于：固相合成法和液相合成法以及其他多肽合成方法包括氨基酸的羧内合酸酐法(NCA)和组合化学法。生物合成的方式包括但不限于：发酵法、酶解法、基因工程法等。

实施例3：细胞实验

1、实验细胞：人脐静脉内皮细胞HUVEC，购自ATCC；

2、细胞焦亡诱导方法：

1)HUVECs，以六孔板接种，采用DMEM培养基培养至待密度达到80％；

2)HUVECs细胞分组处理：

A、HUVECs换成无糖无血清的DMEM培养基，未做任何处理，计做Control组(C组)；

B、HUVECs，融合后培养20h，后加入LPS处理3.5h，继续加入5mmol/L的ATP处理0.5h，计做LPS+ATP(L/A)组；

C、以终浓度为1μmol/L ASRP2多肽预处理HUVECs20 h，后加入LPS处理3.5h，加入5mmol/L的ATP处理0.5h，计做LA+ASRP21μmol/L[L/A+A2(1μM)]组；

D、以终浓度为10μmol/L ASRP2多肽预处理HUVECs，20h后，加入LPS处理3.5h，后加入5mmol/L的ATP处理0.5h。计做L/A+ASRP2 10μmol/L(L/A+A2(10μM))组。

3、实验方法

3.1细胞活力检测

将HUVECs细胞种植于96孔板，按上述焦亡诱导方法处理后，按照cck-8检测试剂盒步骤进行检测，96孔板中每孔加入10μl的cck-8试剂，37℃避光孵育2h后，酶标仪检测450nm的吸光度。

3.2焦亡相关基因表达检测

(1)将HUVECs细胞种植于6孔板，按上述焦亡诱导方法处理后，使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)按照说明书从上述培养的细胞中提取总RNA；

(2)通过Bio-rad紫外光谱仪测定RNA浓度；

(3)总RNA(1μg)用Prime Script RT试剂盒进行逆转录，合成目的基因引物；以GAPDH作为内源对照进行基因表达分析；

(4)定量RT-PCR采用Bio-Rad CFX仪器进行，PCR循环条件为：95℃预变形3min，94℃5s，58℃15s，72℃15s，40个循环，72℃延伸30s，阈值周期Ct值定义为荧光通过固定阈值的循环周期数。

3.3免疫荧光

(1)细胞爬片，按上述焦亡诱导方法处理后，使用多聚甲醛固定；

(2)血清封闭：加入BSA孵育30min；

(3)加Caspasel抗体，孵育过夜；Caspase1(1:1000，Abcam)；

(4)洗片，加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，加入二抗，室温孵育60min；

(5)PI复染细胞核：加入PI染液，避光室温孵育10min；

(6)自发荧光淬灭：加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min；

(7)封片：用抗荧光淬灭封片剂封片；

(8)镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像或荧光显微镜下拍照；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；PI CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光，DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Caspasel阳性表达为相应荧光素标记的绿光。

3.4TUNEL染色

(1)细胞爬片，按上述焦亡诱导方法处理后，使用多聚甲醛固定；

(2)孵育tunel反应液；

(3)DAPI复染细胞核：加入DAPI染液，避光室温孵育10min；

(4)自发荧光淬灭：加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min；

(5)封片：用抗荧光淬灭封片剂封片；

(6)镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像或荧光显微镜下拍照。FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色。

4、实验结果

4.1抗焦亡多肽提高焦亡损伤后细胞的活力

通过应用cck-8检测试剂盒，检测活细胞内线粒体脱氢酶从而间接反映活细胞数目。图1是实施例2对HUVECs细胞的活力测试结果。根据图2可知：相比较对照组(Ctr组)，LPS+ATP组(L/A组)活细胞数显著减少(P<0.01)，而LPS+ATP加多肽组(L/A+ASRP2 10μM)的活细胞数比L/A组显著增加(P<0.01)。综上所述，该抗焦亡多肽可以有效提高焦亡诱导的HUVECs内皮细胞的生存率。单独多肽组对活细胞数没有显著影响。

4.2抗焦亡多肽降低HUVECs细胞焦亡相关基因表达水平

通过PCR法检测细胞焦亡相关基因表达。图3是实施例2对HUVECs焦亡相关基因表达情况的结果；其中，图3是焦亡相关CASP1、PYCAD、IL-1β、IL-18和GSDMD基因表达情况。根据结果显示，焦亡相关的基因在L/A组与Ctr组相比，均有显著增加((P<0.01)。多肽组，尤其是L/A+多肽组(10μM)组显著降低(P<0.01)，并且具有剂量依赖性。结果显示，多肽能显著抑制焦亡相关基因表达，对HUVEC细胞有保护作用。

4.3抗焦亡多肽抑制HUVECs焦亡相关蛋白表达，促进染色质完整性

细胞焦亡主要依靠caspase-1通路通过炎症小体感知危险，招募并活化caspase-1，caspase-1切割并激活IL-18，IL-1β等炎症因子，切割GSDMD的N端序列，使其结合到膜上产生膜孔，导致细胞肿胀，胞质外流，最终导致细胞膜破裂，细胞焦亡。

结果显示，免疫荧光结果显示，L/A组与Ctr组相比，焦亡相关的Caspase1表达显著增加，同时TUNEL结果显示，L/A组细胞出现显著的细胞死亡，抗焦亡肽组可以显著抑制Caspase1表达和细胞死亡。

实施例4：动物实验

1、实验动物：apoE^-/-小鼠，SPF，体重：20g-25g，由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供，饲养于成都先导药物开发有限公司SPF动物房；

2、实验分组：将apoE^-/-小鼠随机分成三组：高脂饮食组10只(HFD组)，高脂饮食+抗焦亡多肽低剂量组(5mg/kg)10只和高脂饮食+抗焦亡多肽高剂量组(10mg/kg)10只，多肽通过尾静脉注射给药，溶液由生理盐水为溶剂进行配置；

3、实验结果

3.1抗焦亡多肽降低动脉粥样硬化小鼠血清LDL和TC含量；

如图5A所示，与对照组相比，模型组小鼠血清LDL含量显著增加(P＜0.01)，抗焦亡肽可显著降低血清LDL含量。图5B结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清TC含量显著增加，抗焦亡多肽显著降低血清TC含量。并且，抗焦亡多肽的降血脂作用，具有剂量依赖性。综上所述，抗焦亡多肽可显著降低血清中LDL和TC的含量，并且这种作用具有剂量依赖性。

3.2多肽减少动脉粥样硬化脂质沉积和斑块形成的作用

如图6中A的HE染色结果显示，模型组小鼠主动脉根部斑块面积显著增加(P＜0.01)，抗焦亡多肽可以显著降低主动脉根部斑块面积(P＜0.01)；根据图6B结果显示，模型组小鼠主动脉根部脂质沉积显著增加(P＜0.01)，抗焦亡多肽可以显著降低主动脉根部脂质沉积(P＜0.01)。综上所述，该多肽可降低动脉粥样硬化小鼠主动脉根部斑块面积和脂质沉积，具有明显的抗动脉粥样硬化作用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.抗焦亡多肽，其特征是：所述抗焦亡多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的抗焦亡多肽，其特征是：所述抗焦亡多肽采用生物学方法合成。

3.根据权利要求1所述的抗焦亡多肽，其特征是：所述抗焦亡多肽采用化学方法合成。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗焦亡多肽在制备预防或/和治疗动脉粥样硬化及高血脂症的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述药物包括抗焦亡多肽和药学辅料。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、眼用制剂和外用制剂中的其中一种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征是：所述辅料选自填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、抑菌剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的抗焦亡多肽在制备预防和治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征是：所述填充剂选自淀粉类、糖类、纤维性类和无机盐类中的至少一种；所述润湿剂选自纯化水、乙醇中的至少一种；所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖粉与糖浆、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂中的至少一种；所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；所述色香味调节剂选自色素、香精、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；所述溶剂选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物中的至少一种；所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、葡萄糖、聚乙烯醇、触变胶中的至少一种；所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；所述抑菌剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油中的至少一种；所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；所述pH调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇中的至少一种。

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