JP3621596B2 - ペプチド及び医薬組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドに関する。本発明に係る新規ペプチドは、アクアポリン５水チャンネル開口作用を有しており、医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜を介する水の透過は、通常は、細胞膜の主要構造である脂質２重層を拡散してゆっくりと行われる。しかしながら、近年、ある種の細胞において、細胞膜を通した早い水の移動が行われることが判明し、この現象には水を選択的に通す膜タンパク質の関与が想定された。その後、実際に各種のこのような膜タンパク質が単離され、このような膜タンパク質は、水チャンネルと称されている。なお、上記水チャンネルは、水のみを選択的に通過させるものであってもよく、水のみならず、例えば、グリセロールや尿素等の低分子量の分子をも通過させるものであってもよい。
【０００３】
このような水チャンネルタンパク質としては、アクアポリン（ＡＱＰ）として知られている一群の膜タンパク質が単離されている。また、現在までに、幾つかのアクアポリンの遺伝子がクローニングされ、ＡＱＰ１〜５、ＦＡ−ＣＨＩＰ、ＡＱＰ−γＴＩＰ等のアクアポリンが哺乳類、両生類、植物等から発見されている（例えば、「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年））。
【０００４】
このうち、ＡＱＰ５は、哺乳類の唾液腺、眼（涙腺、角膜上皮組織）、気管支等に存在していることが知られている（「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７０，Ｃ１２−Ｃ３０（１９９６））。
【０００５】
ＡＱＰ５は、リーら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，８５９９−８６０４（１９９６））によって、ヒト及びラットについて、遺伝子配列及びそのアミノ酸配列が報告されている。ＡＱＰ５は、そのアミノ酸配列上に、Ａ−キナーゼ、Ｃ−キナーゼによるリン酸化部位が存在し、交感神経系−ｃＡＭＰによる調節を受けている可能性のあることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１９０８−１９１２（１９９５））。
【０００６】
ＡＱＰ５は、近年、眼の涙腺組織細胞の頂端細胞膜に存在していることが示され（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２２４，１−４（１９９６））、涙液分泌に際しての細胞横断的な水の輸送に深く関与していることが示され、涙液放出の調節を行っていることが認められた（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２３８，８９１−８９５（１９９７））。Ｉｓｈｉｄａらは、上記文献中で、涙腺組織細胞のＡＱＰ５のＣ末端領域が、涙液分泌を昂進させる副交感神経刺激に対して免疫反応性を変化させることを観察しており、ＡＱＰ５のＣ末端領域に何らかの調節タンパク質が結合し、水チャンネルが開口される場合には解離する可能性を示唆している。
【０００７】
上記文献には、しかしながら、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する物質への言及はなく、ＡＱＰ５のＣ末端部分ペプチドへの言及も存在しない。
【０００８】
ところで、角結膜上皮障害、なかでも眼球乾燥症候群（ドライアイ）は、眼乾燥症状を呈する症状で、涙液の異常により発症するものと言われている。ドライアイは、眼乾燥症状、結膜充血、掻痒感、異物感等を感ずることから、日常生活に支障を来して種々の弊害がもたらされる。ドライアイは、重度になると視力障害を起こすこともあり、最近ではドライアイは眼精疲労も引き起こすともいわれている。
【０００９】
角結膜上皮障害の治療を目的として種々の試みが行われ、例えば、ドライアイの治療には、涙液の補填を目的とした人工涙液の点眼が用いられていた。しかしながら、人工涙液の点眼は、極めて狭い対症療法であり、発症を一時的に抑えるだけのものであった。
【００１０】
角結膜上皮障害の治療を目的として、ヒアルロン酸ナトリウムを含有する点眼剤が報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，１１，９８１（１９９２）等）。このものは、ヒアルロン酸ナトリウムの作用である、保水性及び上皮細胞の接着／伸展促進作用を利用するものであり、基礎試験において角膜上皮創傷治癒促進作用及び保水作用を有することが示されており、臨床においては、眼球乾燥症候群等に対する有用性が報告されている。
【００１１】
しかしながら、涙液の放出を促し、角結膜上皮障害を原因から治療し、即効性かつ持続性のある新規な角結膜上皮障害治療剤は存在しなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状に鑑み、本発明は、ＡＱＰ５の部分的アミノ酸配列を有する新規ペプチド、特に、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する新規ペプチドを提供することを目的とするものである。また、これを有効成分として含む新規医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的のために種々研究を重ねた結果、ＡＱＰ５のＣ末端に存在する特定の配列を有するペプチドが、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ａ）、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｂ）、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｃ）、及び、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｄ）
よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドである。
【００１５】
本発明はまた、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するペプチドであって、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ａ）、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｂ）、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｃ）、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｄ）、並びに、前記ペプチド（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、前記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドでもある。
【００１６】
本発明は、更に、本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤でもある。
以下に本発明を詳述する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、ペプチド（Ａ）、ペプチド（Ｂ）、ペプチド（Ｃ）及びペプチド（Ｄ）である。これらは、ＡＱＰ５のＣ末端領域の特定のアミノ酸配列を有するペプチドである。上記ペプチドは、いずれも文献未記載の新規ペプチドであることが確認されている。
【００１８】
本発明のペプチドは、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するペプチドである。本明細書中、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用とは、ＡＱＰ５水チャンネルを開口することによって、上記水チャンネルを通した細胞膜の水透過性を向上させる作用をいう。
【００１９】
上記ペプチド（Ａ）は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４１〜２５６番目に相当するアミノ酸配列のＣ末端に更にシステイン（Ｃｙｓ）が結合したものである。
上記ペプチド（Ｂ）は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２３１〜２４０番目のアミノ酸配列に相当する。
上記ペプチド（Ｃ）は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４５〜２５３番目のアミノ酸配列に相当する。
上記ペプチド（Ｄ）は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４７〜２５０番目のアミノ酸配列に相当する。
【００２０】
上記ペプチド（Ｃ）は、上記ペプチド（Ａ）のＮ末端側の４つのアミノ酸とＣ末端側の３つのアミノ酸を除外した中間領域のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである。しかも上記ペプチド（Ｃ）及び上記ペプチド（Ａ）は、ともにＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有している。上記ペプチド（Ｄ）は、上記ペプチド（Ｃ）のＮ末端側の２つのアミノ酸とＣ末端側の３つのアミノ酸を除外した中間領域のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである。しかも上記ペプチド（Ｄ）及び上記ペプチド（Ｃ）は、ともにＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有している。
【００２１】
上記のことから、上記ペプチド（Ｄ）のＮ末端側及びＣ末端側に、又は、Ｎ末端側若しくはＣ末端側に、１個又は数個のアミノ酸が付加したものがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることは、充分証明されていると言える。更に、上記ペプチド（Ｃ）のＮ末端側及びＣ末端側に、又は、Ｎ末端側若しくはＣ末端側に、１個又は数個のアミノ酸が付加したものがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることも、充分証明されているといえる。
【００２２】
これらのことはまた、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列を含む、少なくとも４〜１７の長さの配列のペプチドは、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることを証明する。
【００２３】
従って、上記ペプチド（Ｃ）に１個若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失又はは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、上記ペプチド（Ａ）から１個若しくは数個のアミノ酸が欠失し又は置換したアミノ酸配列からなるペプチド、上記ペプチド（Ｄ）に１個又は数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むところの、上記ペプチド（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものは本発明のペプチドである。
【００２４】
また、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列を含む、少なくとも４〜１７の長さの配列のペプチドも、本発明のペプチドである。
【００２５】
上記ペプチド（Ｂ）は、上記ペプチド（Ａ）及び（Ｃ）とは異なるラットＡＱＰ５の領域のペプチドであるにもかかわらず、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有していることは注目に値する。
【００２６】
本発明のペプチドのＡＱＰ５水チャンネル開口作用を、以下に詳細に説明する。生体組織細胞において、ＡＱＰ５による水透過作用は、各種の調節を受けていることが知られている。例えば、ＡＱＰ５の発現が確認されている涙腺組織細胞であっても、通常は、交感神経−副交感神経支配により涙液分泌が制御されている。従って、生体組織細胞におけるＡＱＰ５の発現とその水透過作用の発現とは同一の現象ではない。そこで、ＡＱＰ５による水透過作用の確認は、ＡＱＰファミリーの遺伝子が発現していないことが知られているアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞にＡＱＰ５遺伝子を注入して発現させたものを用いて、水透過性実験を行うことによって、以下のように確認することができる。
【００２７】
アフリカツメガエル卵母細胞に、ｍＲＮＡを注入することによって水透過性の上昇が引き起こされる。この水透過性の上昇は、容易に観察することができるので、水チャンネルの作用の確認に広く使用されている。例えば、石橋らは、ＡＱＰ３のｃＤＮＡをｐＳＰ６４Ｔ由来のＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターに挿入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した場合、注入後４８〜６２時間のインキュベーションにより水の透過性が増加し、また、体積増加が生じたことを確認して、水チャンネルを確認している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，６２６９−６２７３（１９９４））。類似の報告がＳｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）にもある。
【００２８】
そこで、これらと同様にして、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５を発現させる。その後、低張な培養液中に卵母細胞を移動して、その体積変化から水透過性を算出する。ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入しなかったコントロール群は、低い水透過性の実験値を示すが、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入した群の水透過性が上昇することによって、水チャンネルの作用を確認することができる。
【００２９】
一方、アフリカツメガエル卵母細胞に、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡ、及び、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡをマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５、及び、涙腺由来の全タンパク質を発現させた系においては、ＡＱＰ５による水透過作用は、後に実施例において詳細に説明するように、上述のＡＱＰ５のみを発現させた系に比べて大幅に低下する。従って、涙腺由来の未知のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制されることが判る。この涙腺由来の未知のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制される現象は、水チャンネルのゲートの開閉の変化によるものであると考えられる。
【００３０】
この系に、本発明のペプチドを共存させると、ＡＱＰ５による水透過作用が、抑制のない場合と同程度に回復する。従って、本発明のペプチドは、ＡＱＰ５の水チャンネルを開口する作用を有する。このように、ＡＱＰ５のＣ末端近傍の部分ペプチドである本発明のペプチドがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する物質として特定されたことは、上記部分ペプチドがＡＱＰ５タンパク質自体の一部に相当するペプチドであることを考えれば、全く予想外の事実である。本発明は、この意外な知見に基づいてなされたものである。
【００３１】
本発明のペプチドの調製方法としては特に限定されず、例えば、ペプチド合成装置等により固相上でペプチドを合成する方法、担体を用いない液相法によって合成する方法等の従来公知のペプチド合成方法等を使用することができる。また、このペプチドをコードするｃＤＮＡをベクターに組み込み、その形質転換体を発現させてペプチドを得る方法等の遺伝子工学的手法を利用したり、ＡＱＰ５タンパク質を適当なプロテアーゼによって加水分解して得ることも可能である。
【００３２】
上記方法によって調製したペプチドは、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製方法によって精製することができ、更に、エドマン法を利用したアミノ酸配列分析装置等によってそのアミノ酸配列を確認することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを有効成分とするものである。上述のように、本発明のペプチドは、涙腺組織細胞のＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有するので、涙液分泌促進作用を発揮し、涙液分泌促進剤として用いることができる。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの用途のみに限定されず、ＡＱＰ５の発現する組織や器官の疾病治療を用途とする医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することができるものである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、特に、眼科用剤として好適に用いることができる。本明細書中、「眼科用剤」とは、眼の疾病治療又は機能向上若しくは促進の目的のために、ヒト又は動物に適用される医薬品を意味する。このような眼科用剤としては、例えば、角結膜上皮障害治療剤、角結膜創傷治癒促進剤、角結膜上皮伸展促進剤、眼球乾燥症候群治療剤等を挙げることができる。なかでも、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療剤は、ＯＡ機器の発達に伴う眼の酷使等を原因とする疾病の治療剤として重要である。
【００３５】
本発明の角結膜上皮障害治療剤は、涙腺からの涙液の分泌を直接促進することが可能である。従って、涙液の補填を目的とした従来の人工涙液の点眼剤とは、その作用機序を全く異にするものである。しかも、即効性があると同時に、涙液分泌を改善するので、特に、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療に対して持続性をも有するという極めて有利な性質を有している。
【００３６】
本発明の角結膜上皮障害治療剤の対象疾病はドライアイに限定されず、例えば、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、術後疾患、薬剤性疾患、外傷性疾患、コンタクトレンズ装用外因性疾患等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の眼科用剤は、例えば、点眼剤として適用することができる。本発明の眼科用剤を点眼剤として用いる場合には、例えば、本発明のペプチドを０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する水性点眼液とする。このような水性点眼液は、例えば、蒸留水又は生理食塩水に本発明のペプチドの所定量と、必要に応じて、通常点眼剤に用いられる緩衝液、防腐剤、添加剤を適当量加えて調製することができる。上記添加剤としては特に限定されず、例えば、ε−アミノカプロン酸、エデト酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等を挙げることができる。
【００３８】
涙腺は、角膜及び結膜に涙液を供給し、これにより角膜及び結膜の機能を正常に保つ作用を有している。上記ＡＱＰ５は、当該涙腺及び角膜上皮細胞等の細胞膜に存在し、涙腺における涙液の分泌を調節している。本発明のペプチドは、ＡＱＰ５の涙腺における作用を促進、維持することが可能であり、従って、本発明の医薬組成物は、特に眼科疾病対策に有利な治療方法を提供することができる。
【００３９】
なお、本発明のペプチドは、マウスの涙腺に直接投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて涙液分泌促進作用があることが確認されている。
【００４０】
【実施例】
以下に実験例、実施例及び製剤例等を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４１】
実験例１ 涙腺ポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡの調製
雄性ＳＤラット及び雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスから涙腺を摘出し、ファルマシアＲＮＡピュリフィケーションキット（ファルマシア社製）によって、その全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡは、常法に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【００４２】
実験例２ ＡＱＰ５をコードするｃＤＮＡの構築
実験例１で得たラット涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いて逆転写し、その一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として使用した。ＰＣＲ法のプライマーとしては、制限酵素切断部位を含み、かつ、ラットＡＱＰ５のｃＤＮＡ中の読み取り枠（オープンリーディングフレーム）をＰＣＲ法によって増幅できるものを使用した。センスプライマーとして、５′−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣ−３′（配列表の配列番号５）を用いた。これは、ＥｃｏＲ１部位とコード領域に対応する１８塩基とを含むものである。アンチセンスプライマーとしては、５′−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴ−３′（配列表の配列番号６）を用いた。このものは、ＢａｍＨ１部位を含む。上記鋳型として用いる一本鎖ｃＤＮＡを、上記プライマー各５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲにより増幅させた（９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲにより増幅させたものは、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）のＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１切断部位にサブクローニングした。本実験では、正確なｃＤＮＡを得るために、サブクローニングを１０回行った。モデル３７３ＡオートマチックＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム社製）を使用して、チェーンターミネーター法によってＤＮＡの塩基配列を確認した。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）−ＡＱＰ５という。
【００４３】
次に、ＡＱＰ５全コード領域を増幅し、かつ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，７９２４−７９２７（１９８３）にその存在が報告されているアフリカツメガエルβ−グロビン遺伝子の５′側の非翻訳領域を含むように、プライマーを設計した。このように設計したセンスプライマーは、５′−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧ−３′（配列表の配列番号７）（上記β−グロビン部位は下線で示す）である。このものは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。また、アンチセンスプライマーとしては、５′−ＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣ−３′（配列表の配列番号８）を用いた。これは、ＢａｍＨ１部位を含むものである。鋳型として上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）−ＡＱＰ５のＤＮＡを用い、プライマー５０ｐｍｏｌを使って、ＰＣＲ法により増幅させた（９４℃１分、５０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲ法により増幅させたものは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１によって加水分解し、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（プロメガ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１切断部位にサブクローニングした。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５という。
【００４４】
実験例３ ＲＮＡ合成
上記ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５のＤＮＡのＥｃｏＲ１加水分解物５μｇ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１００μＬ中、キャップアナログのｍ７ Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下、３０℃にて１時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させ、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。その後、プラスミドＤＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ１（ファルマシアバイオテック）で加水分解した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで２回抽出した。このようにして得たｃＲＮＡは、卵母細胞に注入するために、蒸留水に懸濁した。
【００４５】
実験例４ 卵母細胞の調製及びタンパク質の発現
卵母細胞は、以下のようにテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）らに記載の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，６５８５−６５８９（１９８５））に準じて調製した。成熟した雌性アフリカツメガエルを麻酔し、卵母細胞（ステージＶ〜ＶＩ）を取り出し、バース（Ｂａｒｔｈ）緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ、８８ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＫＣｌ、２．４ｍＭＮａＨＣＯ３ 、０．３３ｍＭＣａ（ＮＯ３ ）２ 、０．４１ｍＭＣａＣｌ２ 、０．８２ｍＭＭｇＳＯ４ 、ペニシリン＋ストレプトマイシン１０μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２、以下この配合の緩衝液を「ＭＢＳ」という）中に入れた。次いで、タイプＩＩコラゲナーゼ２ｍｇ／ｍＬを含み、カルシウムイオンを含まないバース緩衝液中で、ゆっくりと１時間攪拌しながら、各細胞を分散させた。この卵母細胞をバース緩衝液で充分に洗浄した。卵母細胞は、バース緩衝液中、２０℃で終夜培養し、翌日に、以下の方法によって、マイクロインジェクションを行った。
【００４６】
実験例３で得たＡＱＰ５のｃＲＮＡを５ｎｇ、又は、これと実験例１で得た涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ２５ｎｇとを、蒸留水５０ｎＬに溶解させ、滅菌したガラス製マイクロピペットで、ドラモンドマイクロインジェクションシステム（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製）を使って、卵母細胞にマイクロインジェクションした。コントロール群としては、蒸留水５０ｎＬをマイクロインジェクションした。卵母細胞は、毎日、培養液を交換しながら、ＭＢＳ中、２０℃にて３日間培養し、ＡＱＰ５及び涙腺由来のタンパク質を発現させた。
【００４７】
ＡＱＰ５タンパク質の発現は、卵母細胞の膜成分をＳＤＳポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動し、ＡＱＰ５のＣ末端を用いて得たウサギ抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。また、卵母細胞を固定化したものを用いて、蛍光免疫細胞染色法により、細胞膜におけるＡＱＰ５タンパク質の発現を蛍光顕微鏡下に確認した。
【００４８】
実施例１ ペプチド（Ａ）及び水透過性実験
配列表の配列番号１のペプチドを固相合成法によって合成し、ペプチド（Ａ）を得た。
【００４９】
実験例４の卵母細胞を、５ｍＭジブチリルｃＡＭＰを含む等張なＭＢＳ（塩濃度約２００ｍＯｓｍ）中、３０分間インキュベートした。その後、等張なＭＢＳに卵母細胞を移し、５０ｎｇの上記ペプチド（Ａ）を卵母細胞にマイクロインジェクションし、等張なＭＢＳ中で４時間培養した。コントロール群としては、蒸留水をマイクロインジェクションしたものと、何も処理しなかったものとの２群を用いた。下記実験方法に従って、水透過性実験を行った。
【００５０】
水透過性実験は、以下のように、文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）、及び、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，６２６９−６２７３（１９９４））に記載されている方法に準じて行った。
【００５１】
等張なＭＢＳ（２００ｍＯｓｍ）中で４時間培養した上記卵母細胞を４０ｍＯｓｍの低張なＭＢＳに移し、２０℃で培養しながら、１０秒間隔で、位相差顕微鏡（オリンパス社製）による写真撮影を行った。体積及び体積変化は、画像解析システム（富士フィルム社製）の画像から計算した。水透過性（Ｐｆ）は、経過時間に対するＶ／Ｖ０ の初期の傾き（ｄ（Ｖ／Ｖ０ ）／ｄｔ）、卵母細胞の初期体積（Ｖ０ ＝９×１０−４ｃｍ３ ）、卵母細胞の初期面積（Ｓ＝０．０４５ｃｍ２ ）及び水のモル体積（ＶＷ ＝１８ｃｍ３ ／ｍｏｌ）から下記式により算出した。
【００５２】
Ｐｆ（ｃｍ／ｓｅｃ）＝〔Ｖ０ ×（ｄ（Ｖ／Ｖ０ ）／ｄｔ）〕／〔Ｓ×ＶＷ ×（ｍＯｓｍｉｎ−ｍＯｓｍｏｕｔ ）〕
式中、Ｖはｔ時間経過後の卵母細胞の体積（ｃｍ３ ）を表す。ｍＯｓｍｉｎは、初期のＭＢＳの塩濃度であり、この場合は２００ｍＯｓｍであった。ｍＯｓｍｏｕｔ は、低張なＭＢＳの塩濃度であり、この場合は４０ｍＯｓｍであった。
【００５３】
各群ともサンプル数６で行った結果を図１に示した。１〜９の実験は、表１の条件に従って行ったものを表す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例２ ペプチド（Ｂ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号２のペプチドを作成し、ペプチド（Ｂ）を得た。
【００５６】
ペプチド（Ｂ）を５０ｎｇ用いて、実施例１の方法に準じて水透過性実験を行った。
結果を図２に示した。
【００５７】
実施例３ ペプチド（Ｃ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号３のペプチドを作成し、ペプチド（Ｃ）を得た。
【００５８】
ペプチド（Ｃ）を５０ｎｇ用いて、実施例２と同様にして水透過性実験を行った。
結果を図２に示した。実施例２及び３においては、同一のコントロール群を用いた。図２中、コントロール群１０〜１２の実験及びペプチド（Ｂ）を用いた１３の実験、ペプチド（Ｃ）を用いた１４の実験は、それぞれ表２の条件に従って行ったものを表す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例４ ペプチド（Ｄ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号４のペプチドを作成し、ペプチド（Ｄ）を得た。
【００６１】
ペプチド（Ｄ）を５０ｎｇ用いて、実施例１に準じて水透過性実験を行った。結果を図３に示した。図３中、コントロール群１５、１６、１８の実験及びペプチド（Ｄ）を用いた１７の実験は、それぞれ表３の条件に従って行った。
【００６２】
【表３】
【００６３】
１〜３の実験は、涙腺由来のタンパク質が存在しない卵母細胞の極めて低い水透過性を示す。４〜６の実験は、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注入しない卵母細胞であって、ＡＱＰ５タンパク質が発現した場合の水透過性を示し、水チャンネルの作用の存在を明瞭に示している。７〜９の実験は、ＡＱＰ５タンパク質とともに、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合の卵母細胞の水透過性を示す。７〜８の実験が示すように、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合には、水透過性が大きく低下していることが判る。４〜６の実験の結果と比較して、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が、ＡＱＰ５タンパク質の水透過性を抑制していると理解できる。この条件の卵母細胞に、本発明のペプチド（Ａ）を注入することにより、水透過性が、４〜６の実験が示すレベルに回復することが、９の実験から確証された。
【００６４】
また、１３〜１４の実験から、本発明のペプチド（Ｂ）及びペプチド（Ｃ）もまた、水透過性のレベルを、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合（実験１１、１２）に比較して、このような涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現するタンパク質が存在せず、かつ、ＡＱＰ５タンパク質が発現している場合（実験１０）のレベルまで、回復、維持することが確証された。
【００６５】
また、本発明のペプチド（Ｄ）もまた、水透過性のレベルを、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合（実験１６）に比較して、このような涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現するタンパク質が存在せず、かつ、ＡＱＰ５タンパク質が発現している場合（実験１５）のレベルまで、回復、維持する（実験１７）ことが確証された。実験１８から、この水透過性は、ＡＱＰ５タンパク質が発現したことによる水チャンネルの作用であることが判る。
【００６６】
すなわち、本発明のペプチドは、このような、ＡＱＰ５タンパク質が存在している細胞の水透過性を、活性な状態に維持、回復する作用を有するものである。本明細書中における「水チャンネル開口作用」は、このような作用を含むものである。
【００６７】
実施例１〜４より、本発明のペプチド（Ａ）、ペプチド（Ｂ）、ペプチド（Ｃ）及びペプチド（Ｄ）は、涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ由来のタンパク質によるＡＱＰ５の水透過作用抑制に対して有効に働き、明瞭な水透過性の上昇をもたらすことが明らかであり、水チャンネル開口作用を有することが確認された。
また、これらの事実から、少なくとも配列表の配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列の長さが４〜１７のアミノ酸配列を有するペプチドは、水チャンネル開口作用を有するといえる。
【００６８】
製剤例１ 点眼剤の調製
ペプチド（Ａ）１００ｍｇを１００ｍｌの生理食塩水に溶解し、０．１％点眼剤とした。
【００６９】
製剤例２ 点眼剤の調製
ペプチド（Ａ）１ｇを１００ｍｌの生理食塩水に溶解し、１．０％点眼剤とした。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の新規ペプチドは、上述の構成よりなるので、ＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有する。また、これを使用して、医薬組成物、特に即効性及び持続性を同時に併せ有する角結膜上皮障害治療剤を提供することができる。
【００７１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行ったペプチド（Ａ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図２】実施例２及び実施例３で行ったペプチド（Ｂ）及びペプチド（Ｃ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図３】実施例４で行ったペプチド（Ｄ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【発明が属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドに関する。本発明に係る新規ペプチドは、アクアポリン５水チャンネル開口作用を有しており、医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜を介する水の透過は、通常は、細胞膜の主要構造である脂質２重層を拡散してゆっくりと行われる。しかしながら、近年、ある種の細胞において、細胞膜を通した早い水の移動が行われることが判明し、この現象には水を選択的に通す膜タンパク質の関与が想定された。その後、実際に各種のこのような膜タンパク質が単離され、このような膜タンパク質は、水チャンネルと称されている。なお、上記水チャンネルは、水のみを選択的に通過させるものであってもよく、水のみならず、例えば、グリセロールや尿素等の低分子量の分子をも通過させるものであってもよい。
【０００３】
このような水チャンネルタンパク質としては、アクアポリン（ＡＱＰ）として知られている一群の膜タンパク質が単離されている。また、現在までに、幾つかのアクアポリンの遺伝子がクローニングされ、ＡＱＰ１〜５、ＦＡ−ＣＨＩＰ、ＡＱＰ−γＴＩＰ等のアクアポリンが哺乳類、両生類、植物等から発見されている（例えば、「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年））。
【０００４】
このうち、ＡＱＰ５は、哺乳類の唾液腺、眼（涙腺、角膜上皮組織）、気管支等に存在していることが知られている（「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５〜７４８頁（１９９５年）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７０，Ｃ１２−Ｃ３０（１９９６））。
【０００５】
ＡＱＰ５は、リーら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，８５９９−８６０４（１９９６））によって、ヒト及びラットについて、遺伝子配列及びそのアミノ酸配列が報告されている。ＡＱＰ５は、そのアミノ酸配列上に、Ａ−キナーゼ、Ｃ−キナーゼによるリン酸化部位が存在し、交感神経系−ｃＡＭＰによる調節を受けている可能性のあることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１９０８−１９１２（１９９５））。
【０００６】
ＡＱＰ５は、近年、眼の涙腺組織細胞の頂端細胞膜に存在していることが示され（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２２４，１−４（１９９６））、涙液分泌に際しての細胞横断的な水の輸送に深く関与していることが示され、涙液放出の調節を行っていることが認められた（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２３８，８９１−８９５（１９９７））。Ｉｓｈｉｄａらは、上記文献中で、涙腺組織細胞のＡＱＰ５のＣ末端領域が、涙液分泌を昂進させる副交感神経刺激に対して免疫反応性を変化させることを観察しており、ＡＱＰ５のＣ末端領域に何らかの調節タンパク質が結合し、水チャンネルが開口される場合には解離する可能性を示唆している。
【０００７】
上記文献には、しかしながら、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する物質への言及はなく、ＡＱＰ５のＣ末端部分ペプチドへの言及も存在しない。
【０００８】
ところで、角結膜上皮障害、なかでも眼球乾燥症候群（ドライアイ）は、眼乾燥症状を呈する症状で、涙液の異常により発症するものと言われている。ドライアイは、眼乾燥症状、結膜充血、掻痒感、異物感等を感ずることから、日常生活に支障を来して種々の弊害がもたらされる。ドライアイは、重度になると視力障害を起こすこともあり、最近ではドライアイは眼精疲労も引き起こすともいわれている。
【０００９】
角結膜上皮障害の治療を目的として種々の試みが行われ、例えば、ドライアイの治療には、涙液の補填を目的とした人工涙液の点眼が用いられていた。しかしながら、人工涙液の点眼は、極めて狭い対症療法であり、発症を一時的に抑えるだけのものであった。
【００１０】
角結膜上皮障害の治療を目的として、ヒアルロン酸ナトリウムを含有する点眼剤が報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，１１，９８１（１９９２）等）。このものは、ヒアルロン酸ナトリウムの作用である、保水性及び上皮細胞の接着／伸展促進作用を利用するものであり、基礎試験において角膜上皮創傷治癒促進作用及び保水作用を有することが示されており、臨床においては、眼球乾燥症候群等に対する有用性が報告されている。
【００１１】
しかしながら、涙液の放出を促し、角結膜上皮障害を原因から治療し、即効性かつ持続性のある新規な角結膜上皮障害治療剤は存在しなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状に鑑み、本発明は、ＡＱＰ５の部分的アミノ酸配列を有する新規ペプチド、特に、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する新規ペプチドを提供することを目的とするものである。また、これを有効成分として含む新規医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的のために種々研究を重ねた結果、ＡＱＰ５のＣ末端に存在する特定の配列を有するペプチドが、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ａ）、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｂ）、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｃ）、及び、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｄ）
よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドである。
【００１５】
本発明はまた、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するペプチドであって、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ａ）、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｂ）、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｃ）、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｄ）、並びに、前記ペプチド（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、前記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドでもある。
【００１６】
本発明は、更に、本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物、特に眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療用剤等の角結膜上皮障害治療用剤でもある。
以下に本発明を詳述する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、ペプチド（Ａ）、ペプチド（Ｂ）、ペプチド（Ｃ）及びペプチド（Ｄ）である。これらは、ＡＱＰ５のＣ末端領域の特定のアミノ酸配列を有するペプチドである。上記ペプチドは、いずれも文献未記載の新規ペプチドであることが確認されている。
【００１８】
本発明のペプチドは、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するペプチドである。本明細書中、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用とは、ＡＱＰ５水チャンネルを開口することによって、上記水チャンネルを通した細胞膜の水透過性を向上させる作用をいう。
【００１９】
上記ペプチド（Ａ）は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４１〜２５６番目に相当するアミノ酸配列のＣ末端に更にシステイン（Ｃｙｓ）が結合したものである。
上記ペプチド（Ｂ）は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２３１〜２４０番目のアミノ酸配列に相当する。
上記ペプチド（Ｃ）は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４５〜２５３番目のアミノ酸配列に相当する。
上記ペプチド（Ｄ）は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ラットＡＱＰ５の２４７〜２５０番目のアミノ酸配列に相当する。
【００２０】
上記ペプチド（Ｃ）は、上記ペプチド（Ａ）のＮ末端側の４つのアミノ酸とＣ末端側の３つのアミノ酸を除外した中間領域のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである。しかも上記ペプチド（Ｃ）及び上記ペプチド（Ａ）は、ともにＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有している。上記ペプチド（Ｄ）は、上記ペプチド（Ｃ）のＮ末端側の２つのアミノ酸とＣ末端側の３つのアミノ酸を除外した中間領域のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである。しかも上記ペプチド（Ｄ）及び上記ペプチド（Ｃ）は、ともにＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有している。
【００２１】
上記のことから、上記ペプチド（Ｄ）のＮ末端側及びＣ末端側に、又は、Ｎ末端側若しくはＣ末端側に、１個又は数個のアミノ酸が付加したものがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることは、充分証明されていると言える。更に、上記ペプチド（Ｃ）のＮ末端側及びＣ末端側に、又は、Ｎ末端側若しくはＣ末端側に、１個又は数個のアミノ酸が付加したものがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることも、充分証明されているといえる。
【００２２】
これらのことはまた、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列を含む、少なくとも４〜１７の長さの配列のペプチドは、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものであることを証明する。
【００２３】
従って、上記ペプチド（Ｃ）に１個若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失又はは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、上記ペプチド（Ａ）から１個若しくは数個のアミノ酸が欠失し又は置換したアミノ酸配列からなるペプチド、上記ペプチド（Ｄ）に１個又は数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むところの、上記ペプチド（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有するものは本発明のペプチドである。
【００２４】
また、上記ペプチド（Ｄ）のアミノ酸配列を含む、少なくとも４〜１７の長さの配列のペプチドも、本発明のペプチドである。
【００２５】
上記ペプチド（Ｂ）は、上記ペプチド（Ａ）及び（Ｃ）とは異なるラットＡＱＰ５の領域のペプチドであるにもかかわらず、ＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有していることは注目に値する。
【００２６】
本発明のペプチドのＡＱＰ５水チャンネル開口作用を、以下に詳細に説明する。生体組織細胞において、ＡＱＰ５による水透過作用は、各種の調節を受けていることが知られている。例えば、ＡＱＰ５の発現が確認されている涙腺組織細胞であっても、通常は、交感神経−副交感神経支配により涙液分泌が制御されている。従って、生体組織細胞におけるＡＱＰ５の発現とその水透過作用の発現とは同一の現象ではない。そこで、ＡＱＰ５による水透過作用の確認は、ＡＱＰファミリーの遺伝子が発現していないことが知られているアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞にＡＱＰ５遺伝子を注入して発現させたものを用いて、水透過性実験を行うことによって、以下のように確認することができる。
【００２７】
アフリカツメガエル卵母細胞に、ｍＲＮＡを注入することによって水透過性の上昇が引き起こされる。この水透過性の上昇は、容易に観察することができるので、水チャンネルの作用の確認に広く使用されている。例えば、石橋らは、ＡＱＰ３のｃＤＮＡをｐＳＰ６４Ｔ由来のＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターに挿入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した場合、注入後４８〜６２時間のインキュベーションにより水の透過性が増加し、また、体積増加が生じたことを確認して、水チャンネルを確認している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，６２６９−６２７３（１９９４））。類似の報告がＳｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）にもある。
【００２８】
そこで、これらと同様にして、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５を発現させる。その後、低張な培養液中に卵母細胞を移動して、その体積変化から水透過性を算出する。ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入しなかったコントロール群は、低い水透過性の実験値を示すが、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡを注入した群の水透過性が上昇することによって、水チャンネルの作用を確認することができる。
【００２９】
一方、アフリカツメガエル卵母細胞に、ＡＱＰ５をコードする全長ｃＲＮＡ、及び、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡをマイクロインジェクションして培養し、ＡＱＰ５、及び、涙腺由来の全タンパク質を発現させた系においては、ＡＱＰ５による水透過作用は、後に実施例において詳細に説明するように、上述のＡＱＰ５のみを発現させた系に比べて大幅に低下する。従って、涙腺由来の未知のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制されることが判る。この涙腺由来の未知のタンパク質の存在によってＡＱＰ５による水透過作用が抑制される現象は、水チャンネルのゲートの開閉の変化によるものであると考えられる。
【００３０】
この系に、本発明のペプチドを共存させると、ＡＱＰ５による水透過作用が、抑制のない場合と同程度に回復する。従って、本発明のペプチドは、ＡＱＰ５の水チャンネルを開口する作用を有する。このように、ＡＱＰ５のＣ末端近傍の部分ペプチドである本発明のペプチドがＡＱＰ５水チャンネル開口作用を有する物質として特定されたことは、上記部分ペプチドがＡＱＰ５タンパク質自体の一部に相当するペプチドであることを考えれば、全く予想外の事実である。本発明は、この意外な知見に基づいてなされたものである。
【００３１】
本発明のペプチドの調製方法としては特に限定されず、例えば、ペプチド合成装置等により固相上でペプチドを合成する方法、担体を用いない液相法によって合成する方法等の従来公知のペプチド合成方法等を使用することができる。また、このペプチドをコードするｃＤＮＡをベクターに組み込み、その形質転換体を発現させてペプチドを得る方法等の遺伝子工学的手法を利用したり、ＡＱＰ５タンパク質を適当なプロテアーゼによって加水分解して得ることも可能である。
【００３２】
上記方法によって調製したペプチドは、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製方法によって精製することができ、更に、エドマン法を利用したアミノ酸配列分析装置等によってそのアミノ酸配列を確認することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを有効成分とするものである。上述のように、本発明のペプチドは、涙腺組織細胞のＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有するので、涙液分泌促進作用を発揮し、涙液分泌促進剤として用いることができる。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの用途のみに限定されず、ＡＱＰ５の発現する組織や器官の疾病治療を用途とする医薬組成物として、ヒト又は動物に投与することができるものである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、特に、眼科用剤として好適に用いることができる。本明細書中、「眼科用剤」とは、眼の疾病治療又は機能向上若しくは促進の目的のために、ヒト又は動物に適用される医薬品を意味する。このような眼科用剤としては、例えば、角結膜上皮障害治療剤、角結膜創傷治癒促進剤、角結膜上皮伸展促進剤、眼球乾燥症候群治療剤等を挙げることができる。なかでも、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療剤は、ＯＡ機器の発達に伴う眼の酷使等を原因とする疾病の治療剤として重要である。
【００３５】
本発明の角結膜上皮障害治療剤は、涙腺からの涙液の分泌を直接促進することが可能である。従って、涙液の補填を目的とした従来の人工涙液の点眼剤とは、その作用機序を全く異にするものである。しかも、即効性があると同時に、涙液分泌を改善するので、特に、眼球乾燥症候群（ドライアイ）治療に対して持続性をも有するという極めて有利な性質を有している。
【００３６】
本発明の角結膜上皮障害治療剤の対象疾病はドライアイに限定されず、例えば、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、術後疾患、薬剤性疾患、外傷性疾患、コンタクトレンズ装用外因性疾患等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の眼科用剤は、例えば、点眼剤として適用することができる。本発明の眼科用剤を点眼剤として用いる場合には、例えば、本発明のペプチドを０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する水性点眼液とする。このような水性点眼液は、例えば、蒸留水又は生理食塩水に本発明のペプチドの所定量と、必要に応じて、通常点眼剤に用いられる緩衝液、防腐剤、添加剤を適当量加えて調製することができる。上記添加剤としては特に限定されず、例えば、ε−アミノカプロン酸、エデト酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等を挙げることができる。
【００３８】
涙腺は、角膜及び結膜に涙液を供給し、これにより角膜及び結膜の機能を正常に保つ作用を有している。上記ＡＱＰ５は、当該涙腺及び角膜上皮細胞等の細胞膜に存在し、涙腺における涙液の分泌を調節している。本発明のペプチドは、ＡＱＰ５の涙腺における作用を促進、維持することが可能であり、従って、本発明の医薬組成物は、特に眼科疾病対策に有利な治療方法を提供することができる。
【００３９】
なお、本発明のペプチドは、マウスの涙腺に直接投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて涙液分泌促進作用があることが確認されている。
【００４０】
【実施例】
以下に実験例、実施例及び製剤例等を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４１】
実験例１ 涙腺ポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡの調製
雄性ＳＤラット及び雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスから涙腺を摘出し、ファルマシアＲＮＡピュリフィケーションキット（ファルマシア社製）によって、その全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡは、常法に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
【００４２】
実験例２ ＡＱＰ５をコードするｃＤＮＡの構築
実験例１で得たラット涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いて逆転写し、その一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として使用した。ＰＣＲ法のプライマーとしては、制限酵素切断部位を含み、かつ、ラットＡＱＰ５のｃＤＮＡ中の読み取り枠（オープンリーディングフレーム）をＰＣＲ法によって増幅できるものを使用した。センスプライマーとして、５′−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣ−３′（配列表の配列番号５）を用いた。これは、ＥｃｏＲ１部位とコード領域に対応する１８塩基とを含むものである。アンチセンスプライマーとしては、５′−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴ−３′（配列表の配列番号６）を用いた。このものは、ＢａｍＨ１部位を含む。上記鋳型として用いる一本鎖ｃＤＮＡを、上記プライマー各５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲにより増幅させた（９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲにより増幅させたものは、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）のＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１切断部位にサブクローニングした。本実験では、正確なｃＤＮＡを得るために、サブクローニングを１０回行った。モデル３７３ＡオートマチックＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム社製）を使用して、チェーンターミネーター法によってＤＮＡの塩基配列を確認した。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）−ＡＱＰ５という。
【００４３】
次に、ＡＱＰ５全コード領域を増幅し、かつ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，７９２４−７９２７（１９８３）にその存在が報告されているアフリカツメガエルβ−グロビン遺伝子の５′側の非翻訳領域を含むように、プライマーを設計した。このように設計したセンスプライマーは、５′−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧ−３′（配列表の配列番号７）（上記β−グロビン部位は下線で示す）である。このものは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。また、アンチセンスプライマーとしては、５′−ＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣ−３′（配列表の配列番号８）を用いた。これは、ＢａｍＨ１部位を含むものである。鋳型として上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）−ＡＱＰ５のＤＮＡを用い、プライマー５０ｐｍｏｌを使って、ＰＣＲ法により増幅させた（９４℃１分、５０℃１分、７２℃２分を３０サイクル）。ＰＣＲ法により増幅させたものは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１によって加水分解し、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（プロメガ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１切断部位にサブクローニングした。以下、この組み換えプラスミドを、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５という。
【００４４】
実験例３ ＲＮＡ合成
上記ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）−ＡＱＰ５のＤＮＡのＥｃｏＲ１加水分解物５μｇ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１００μＬ中、キャップアナログのｍ７ Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下、３０℃にて１時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させ、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。その後、プラスミドＤＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ１（ファルマシアバイオテック）で加水分解した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで２回抽出した。このようにして得たｃＲＮＡは、卵母細胞に注入するために、蒸留水に懸濁した。
【００４５】
実験例４ 卵母細胞の調製及びタンパク質の発現
卵母細胞は、以下のようにテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）らに記載の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，６５８５−６５８９（１９８５））に準じて調製した。成熟した雌性アフリカツメガエルを麻酔し、卵母細胞（ステージＶ〜ＶＩ）を取り出し、バース（Ｂａｒｔｈ）緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ、８８ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＫＣｌ、２．４ｍＭＮａＨＣＯ３ 、０．３３ｍＭＣａ（ＮＯ３ ）２ 、０．４１ｍＭＣａＣｌ２ 、０．８２ｍＭＭｇＳＯ４ 、ペニシリン＋ストレプトマイシン１０μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２、以下この配合の緩衝液を「ＭＢＳ」という）中に入れた。次いで、タイプＩＩコラゲナーゼ２ｍｇ／ｍＬを含み、カルシウムイオンを含まないバース緩衝液中で、ゆっくりと１時間攪拌しながら、各細胞を分散させた。この卵母細胞をバース緩衝液で充分に洗浄した。卵母細胞は、バース緩衝液中、２０℃で終夜培養し、翌日に、以下の方法によって、マイクロインジェクションを行った。
【００４６】
実験例３で得たＡＱＰ５のｃＲＮＡを５ｎｇ、又は、これと実験例１で得た涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ２５ｎｇとを、蒸留水５０ｎＬに溶解させ、滅菌したガラス製マイクロピペットで、ドラモンドマイクロインジェクションシステム（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製）を使って、卵母細胞にマイクロインジェクションした。コントロール群としては、蒸留水５０ｎＬをマイクロインジェクションした。卵母細胞は、毎日、培養液を交換しながら、ＭＢＳ中、２０℃にて３日間培養し、ＡＱＰ５及び涙腺由来のタンパク質を発現させた。
【００４７】
ＡＱＰ５タンパク質の発現は、卵母細胞の膜成分をＳＤＳポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動し、ＡＱＰ５のＣ末端を用いて得たウサギ抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。また、卵母細胞を固定化したものを用いて、蛍光免疫細胞染色法により、細胞膜におけるＡＱＰ５タンパク質の発現を蛍光顕微鏡下に確認した。
【００４８】
実施例１ ペプチド（Ａ）及び水透過性実験
配列表の配列番号１のペプチドを固相合成法によって合成し、ペプチド（Ａ）を得た。
【００４９】
実験例４の卵母細胞を、５ｍＭジブチリルｃＡＭＰを含む等張なＭＢＳ（塩濃度約２００ｍＯｓｍ）中、３０分間インキュベートした。その後、等張なＭＢＳに卵母細胞を移し、５０ｎｇの上記ペプチド（Ａ）を卵母細胞にマイクロインジェクションし、等張なＭＢＳ中で４時間培養した。コントロール群としては、蒸留水をマイクロインジェクションしたものと、何も処理しなかったものとの２群を用いた。下記実験方法に従って、水透過性実験を行った。
【００５０】
水透過性実験は、以下のように、文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，３８５−３８７（１９９２）、及び、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，６２６９−６２７３（１９９４））に記載されている方法に準じて行った。
【００５１】
等張なＭＢＳ（２００ｍＯｓｍ）中で４時間培養した上記卵母細胞を４０ｍＯｓｍの低張なＭＢＳに移し、２０℃で培養しながら、１０秒間隔で、位相差顕微鏡（オリンパス社製）による写真撮影を行った。体積及び体積変化は、画像解析システム（富士フィルム社製）の画像から計算した。水透過性（Ｐｆ）は、経過時間に対するＶ／Ｖ０ の初期の傾き（ｄ（Ｖ／Ｖ０ ）／ｄｔ）、卵母細胞の初期体積（Ｖ０ ＝９×１０−４ｃｍ３ ）、卵母細胞の初期面積（Ｓ＝０．０４５ｃｍ２ ）及び水のモル体積（ＶＷ ＝１８ｃｍ３ ／ｍｏｌ）から下記式により算出した。
【００５２】
Ｐｆ（ｃｍ／ｓｅｃ）＝〔Ｖ０ ×（ｄ（Ｖ／Ｖ０ ）／ｄｔ）〕／〔Ｓ×ＶＷ ×（ｍＯｓｍｉｎ−ｍＯｓｍｏｕｔ ）〕
式中、Ｖはｔ時間経過後の卵母細胞の体積（ｃｍ３ ）を表す。ｍＯｓｍｉｎは、初期のＭＢＳの塩濃度であり、この場合は２００ｍＯｓｍであった。ｍＯｓｍｏｕｔ は、低張なＭＢＳの塩濃度であり、この場合は４０ｍＯｓｍであった。
【００５３】
各群ともサンプル数６で行った結果を図１に示した。１〜９の実験は、表１の条件に従って行ったものを表す。
【００５４】
【表１】
実施例２ ペプチド（Ｂ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号２のペプチドを作成し、ペプチド（Ｂ）を得た。
【００５６】
ペプチド（Ｂ）を５０ｎｇ用いて、実施例１の方法に準じて水透過性実験を行った。
結果を図２に示した。
【００５７】
実施例３ ペプチド（Ｃ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号３のペプチドを作成し、ペプチド（Ｃ）を得た。
【００５８】
ペプチド（Ｃ）を５０ｎｇ用いて、実施例２と同様にして水透過性実験を行った。
結果を図２に示した。実施例２及び３においては、同一のコントロール群を用いた。図２中、コントロール群１０〜１２の実験及びペプチド（Ｂ）を用いた１３の実験、ペプチド（Ｃ）を用いた１４の実験は、それぞれ表２の条件に従って行ったものを表す。
【００５９】
【表２】
実施例４ ペプチド（Ｄ）及び水透過性実験
実施例１と同様にして配列表の配列番号４のペプチドを作成し、ペプチド（Ｄ）を得た。
【００６１】
ペプチド（Ｄ）を５０ｎｇ用いて、実施例１に準じて水透過性実験を行った。結果を図３に示した。図３中、コントロール群１５、１６、１８の実験及びペプチド（Ｄ）を用いた１７の実験は、それぞれ表３の条件に従って行った。
【００６２】
【表３】
１〜３の実験は、涙腺由来のタンパク質が存在しない卵母細胞の極めて低い水透過性を示す。４〜６の実験は、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注入しない卵母細胞であって、ＡＱＰ５タンパク質が発現した場合の水透過性を示し、水チャンネルの作用の存在を明瞭に示している。７〜９の実験は、ＡＱＰ５タンパク質とともに、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合の卵母細胞の水透過性を示す。７〜８の実験が示すように、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合には、水透過性が大きく低下していることが判る。４〜６の実験の結果と比較して、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が、ＡＱＰ５タンパク質の水透過性を抑制していると理解できる。この条件の卵母細胞に、本発明のペプチド（Ａ）を注入することにより、水透過性が、４〜６の実験が示すレベルに回復することが、９の実験から確証された。
【００６４】
また、１３〜１４の実験から、本発明のペプチド（Ｂ）及びペプチド（Ｃ）もまた、水透過性のレベルを、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合（実験１１、１２）に比較して、このような涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現するタンパク質が存在せず、かつ、ＡＱＰ５タンパク質が発現している場合（実験１０）のレベルまで、回復、維持することが確証された。
【００６５】
また、本発明のペプチド（Ｄ）もまた、水透過性のレベルを、涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現したタンパク質が存在する場合（実験１６）に比較して、このような涙腺由来のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの注入により発現するタンパク質が存在せず、かつ、ＡＱＰ５タンパク質が発現している場合（実験１５）のレベルまで、回復、維持する（実験１７）ことが確証された。実験１８から、この水透過性は、ＡＱＰ５タンパク質が発現したことによる水チャンネルの作用であることが判る。
【００６６】
すなわち、本発明のペプチドは、このような、ＡＱＰ５タンパク質が存在している細胞の水透過性を、活性な状態に維持、回復する作用を有するものである。本明細書中における「水チャンネル開口作用」は、このような作用を含むものである。
【００６７】
実施例１〜４より、本発明のペプチド（Ａ）、ペプチド（Ｂ）、ペプチド（Ｃ）及びペプチド（Ｄ）は、涙腺ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ由来のタンパク質によるＡＱＰ５の水透過作用抑制に対して有効に働き、明瞭な水透過性の上昇をもたらすことが明らかであり、水チャンネル開口作用を有することが確認された。
また、これらの事実から、少なくとも配列表の配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列の長さが４〜１７のアミノ酸配列を有するペプチドは、水チャンネル開口作用を有するといえる。
【００６８】
製剤例１ 点眼剤の調製
ペプチド（Ａ）１００ｍｇを１００ｍｌの生理食塩水に溶解し、０．１％点眼剤とした。
【００６９】
製剤例２ 点眼剤の調製
ペプチド（Ａ）１ｇを１００ｍｌの生理食塩水に溶解し、１．０％点眼剤とした。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の新規ペプチドは、上述の構成よりなるので、ＡＱＰ５の水チャンネル開口作用を有する。また、これを使用して、医薬組成物、特に即効性及び持続性を同時に併せ有する角結膜上皮障害治療剤を提供することができる。
【００７１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行ったペプチド（Ａ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図２】実施例２及び実施例３で行ったペプチド（Ｂ）及びペプチド（Ｃ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
【図３】実施例４で行ったペプチド（Ｄ）を用いた水透過性実験の結果を表すグラフである。
Claims (6)
- 配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ａ）、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｂ）、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｃ）、及び、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｄ）
よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチド。 - 請求項１記載のペプチドを有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。
- 医薬組成物が、眼科用剤である請求項２記載の医薬組成物。
- 眼科用剤が、角結膜上皮障害治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
- 角結膜上皮障害治療剤が、眼球乾燥症候群治療剤である請求項４記載の医薬組成物。
- 少なくとも配列表の配列番号４のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列の長さが４〜１７のアクアポリン５水チャンネル開口作用を有するペプチドを含有してなる医薬組成物。
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