CN105087492B

CN105087492B - 培养原代海马神经元的方法

Info

Publication number: CN105087492B
Application number: CN201510420060.3A
Authority: CN
Inventors: 彭瑞云; 王惠; 高亚兵; 胡韶华; 赵黎; 王丽峰; 董霁; 谭胜芝
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: CN105087492A

Abstract

本发明公开了培养原代海马神经元的方法，该方法包括：(1)将海马组织进行消化处理；(2)将经过消化处理的海马组织进行吹打分散处理，获得细胞悬液；(3)将细胞悬液接种并进行第一培养2‑4小时，使细胞贴壁；(4)将培养皿中的第一培养液更换为第二培养液，进行第二培养24小时；(5)向培养皿中添加1～2μg/ml的阿糖胞苷，进行第三培养24小时；(6)利用第二培养液对所述培养皿进行半量换液，进行第四培养至少3天，期间每周半量换液2次，以便获得原代海马神经元。利用该方法能够快速、高效地制备获得原代海马神经元，并且获得的原代海马神经元细胞极其适于用作膜片钳实验的细胞模型。

Description

培养原代海马神经元的方法

技术领域

本发明涉及培养原代海马神经元的方法。

背景技术

膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起一种新技术，现已成为研究离子通道的“金标准”，该技术广泛应用于研究离子通道门控动力学、生理功能、药理学特性及结构与功能关系等方面。原代大鼠海马神经元是一种在离体水平上研究神经元电生理活动的重要细胞模型。而状态优良的原代大鼠海马神经元是膜片钳实验成功的重要先决条件，其对膜片钳记录中的封接和破膜极其重要。

目前，关于原代大鼠海马神经元的培养方法包括有血清培养和无血清培养两种，最新的研究多以无血清培养方法为主，但无血清培养的海马神经元细胞细胞膜脆性较大，破膜后易发生形变，不利于膜片钳等电生理信号的记录，因而不适用于膜片钳实验。因此，目前急需建立一种适合于膜片钳实验的原代神经元培养方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种适合于膜片钳实验的原代神经元培养方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种培养原代海马神经元的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将海马组织进行消化处理，以便获得经过消化处理的海马组织；

(2)将所述经过消化处理的海马组织进行吹打分散处理，并加入第一培养液，重悬细胞，以便获得细胞悬液；

(3)将所述细胞悬液接种至多聚赖氨酸包被的培养皿中，进行第一培养2-4小时，使细胞贴壁；

(4)将所述培养皿中的所述第一培养液更换为第二培养液，然后进行第二培养24小时；

(5)向所述培养皿中添加1～2μg/ml的阿糖胞苷，然后进行第三培养24小时；

(6)利用所述第二培养液对所述培养皿进行半量换液，然后进行第四培养至少3天，期间每周半量换液2次，以便获得原代海马神经元。

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够快速、高效地制备获得原代海马神经元，并且，获得的原代海马神经元细胞活性好，生理状态佳，示神经元突起丰富并交联成网状，胞体表面光滑，折光性强，立体感强，细胞膜韧性好，用于膜片钳实验时，破膜后细胞不易发生形变，因而尤其适于用作膜片钳实验的细胞模型。

另外，根据本发明上述实施例的培养原代海马神经元的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述海马组织是以温度为4摄氏度的DMEM培养基为解剖液，从离体非人哺乳动物大脑中剥离获得的。由此，有利于维持海马神经元细胞的活性和生理状态，后续培养效果好。

根据本发明的一些优选实施例，所述非人哺乳动物为大鼠。

根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：将所述海马组织切成1～2mm³的组织块；于37℃下，利用0.25％的胰蛋白酶液将所述组织块进行消化处理20min；以及利用胎牛血清终止消化。由此，消化处理效果好，且不影响细胞的生理状态和活性，有利于后续培养的进行。

根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：

a、将所述经过消化处理的海马组织进行吹打，每吹打10次后吸取上层悬液，然后利用200目细胞过滤网将所述上层悬液进行过滤，收集滤液；

b、向所述滤液中添加所述第一培养液，然后重复步骤a不超过3次；

c、收集最终滤液，并进行第一离心，弃上清并用所述第一培养液将沉淀进行吹打洗涤，然后进行第二离心，弃上清并向沉淀中添加所述第一培养液，吹打制备成细胞悬液。

由此，制备获得的细胞悬液易于进行后续培养。

根据本发明的实施例，所述第一离心和所述第二离心均是于1000rpm/min条件下进行2～5min。由此，离心效果好，且不影响细胞的生理状态。

根据本发明的实施例，所述第一培养、第二培养、第三培养和第四培养均是在37℃，5％ CO₂的条件下进行的。由此，细胞培养效果良好。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，细胞接种密度为3～7×10⁵/ml。由此，培养效果好，后续获得的原代海马神经元极其适于用作膜片钳实验的细胞模型。

进一步，根据本发明的实施例，在步骤(2)之后和步骤(3)之前，进一步包括：预先利用所述第一培养液将所述细胞悬液稀释至3～7×10⁵/ml的密度。

根据本发明的实施例，进行所述第一培养3小时。此时，细胞贴壁完成，且细胞的细胞膜韧性好，生理状态佳，易于进行后续步骤。

根据本发明的实施例，在步骤(4)中，按照每3～7×10⁵细胞采用2ml所述第二培养液的比例，将所述培养皿中的所述第一培养液更换为第二培养液。由此，细胞培养效果好。

根据本发明的实施例，所述第一培养液包括：

78.5体积％的DMEM培养基；

10体积％的胎牛血清；

10体积％的马血清；

1体积％的L-谷氨酰胺；以及

0.5体积％的青链霉素储备液，

所述第二培养液包括：

85.5体积％的DMEM培养基；

10体积％的马血清；

1体积％的N-2添加剂；

2体积％的B-27添加剂；

1体积％L-的谷氨酰胺；以及

0.5体积％的青链霉素储备液，

其中，所述青链霉素储备液中青霉素含量为10000U/ml，链霉素含量为100U/ml。

由此，细胞培养效果好。

根据本发明的实施例，所述半量换液是按照以下步骤进行的：

将培养皿中的废弃培养基吸入至离心管中，进行第三离心，并收集第三上清；

利用第二培养液对培养皿中的细胞进行洗涤；以及

向所述培养皿中分别加入第二培养液和所述第三上清，其中所述第二培养液和所述第三上清的添加量均为所述培养皿中所述废弃培养基体积的1/2。

由此，培养获得的原代海马神经元细胞的细胞膜韧性好，用于膜片钳实验时，能够更好地封接、破膜，且破膜后细胞不易发生形变，极其适于用作膜片钳实验的细胞模型。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：

(7)对所述原代海马神经元进行质量鉴定。

由此，能够进一步选取质量突出的原代海马神经元。

根据本发明的实施例，依据细胞形态，应用于膜片钳实验后细胞的封接、破膜情况和电活动记录，进行所述质量鉴定。由此，能够进一步筛选获得适于膜片钳实验的原代海马神经元细胞。

根据本发明的实施例，本发明的培养原代海马神经元的方法具有下列优点的至少之一：

1、本发明的方法，将细胞的接种密度提高至3～7×10⁵/ml，将阿糖胞苷的用量设置为1～2μg/ml，可使培养的细胞密度及生长状况更适合于膜片钳实验的要求。

2、本发明采用DMEM培养基作为解剖液，在细胞接种后2-4小时将第一培养液更换为第二培养液，培养24小时后加入阿糖胞苷，并且采用本发明特定的半量换液方法，可使获得的原代海马神经元细胞更适合于膜片钳实验，即细胞能够更好的封接和破膜，且不易形变。

3、本发明的方法制备获得的原代海马神经元，细胞生长状态良好，示神经元突起丰富并交联成网状，胞体表面光滑，折光性强，立体感强，细胞膜韧性好。

4、本发明的方法制备获得的原代海马神经元，能够满足膜片钳实验对细胞状态的需求，应用于膜片钳实验时，容易记录原代大鼠海马神经元全细胞基本电流及自发放电情况(sEPSC)，且封接速度快、破膜容易，破膜后细胞也不易发生形变，因而及极其适于用作膜片钳实验的细胞模型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，在普通倒置显微镜观察下的培养至7d的原代大鼠海马神经元(比例尺：50μm)；

图2显示了根据本发明一个实施例，在相差显微镜观察下的培养至7d的原代大鼠海马神经元(比例尺：20μm)；

图3显示了根据本发明一个实施例，原代大鼠海马神经元全细胞记录的基本过程；

图4显示了根据本发明一个实施例，原代大鼠海马神经元破膜后的细胞形态(比例尺：20μm)；

图5显示了根据本发明一个实施例，原代大鼠海马神经元全细胞电流的记录结果；以及

图6显示了根据本发明一个实施例，原代大鼠海马神经元自发电活动的记录结果。

具体实施方式

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

根据本发明的培养原代海马神经元的方法，进行原代海马神经元培养，具体如下：

首先，需要说明的是，本实施例中所述的“培养X d”、“培养至X d”或“培养的第Xd”中所述的天数是从“1.4组织剥离”的时间起开始计算的。

1、原代海马神经元培养

1.1 高压灭菌

使用前1d，选取若干玻璃离心管，90mm玻璃皿6个，50ml烧杯3个及200目不锈钢滤网2个，刻度吸管及细玻璃滴管若干，分别装入不锈钢饭盒内。选取大、中、小枪头盒各1，放入高压蒸汽灭菌器内。120℃高压灭菌2h，后放入烤箱，80℃烤2h。

1.2 培养皿包被

使用前2d，在无菌条件下取35mm塑料培养皿，加多聚赖氨酸(分子量为7-15万)1ml/皿，放置过夜，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥备用。

1.3 试剂配置

1.3.1 多聚赖氨酸：

取分子量在7-15万的多聚赖氨酸25mg，用双蒸水溶解并稀释至250ml，浓度为0.1mg/ml，用0.22μm的微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

1.3.2 谷氨酰胺储备液：

称取谷氨酰胺2.92g，用PBS溶解并稀释至100ml，浓度为200mM，用0.22μm的微孔滤膜过滤，-20℃冻存备用。

1.3.3 阿糖胞苷储备液：

取10mg阿糖胞苷，用双蒸水溶解并稀释到10ml，用0.22μm的微孔滤膜过滤，-20℃冻存备用。

1.3.4 原代大鼠海马神经元种植液(即第一培养液)：

DMEM培养基	78.5体积％
		胎牛血清	10体积％
马血清	10体积％
		L-谷氨酰胺	1体积％
青链霉素储备液(Thermo Lot:J13004)	0.5体积％

1.3.5 原代大鼠海马神经元饲养液(即第二培养液)：

DMEM培养基	85.5体积％
		马血清	10体积％
N-2添加剂	1体积％
		B-27添加剂	2体积％
L-谷氨酰胺	1体积％
		青链霉素储备液(Thermo Lot:J13004)	0.5体积％

1.4 组织剥离

取12h内新生的Wistar乳鼠，置于75％酒精中浸泡消毒。在无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤及颅骨，暴露出大脑，用弯镊小心取出全脑，用预冷的DMEM培养基(温度为4℃)冲洗以去除血液，后浸于滴加了预冷DMEM培养基的玻璃平皿中。在解剖显微镜下，用眼科直镊和弯镊配合，取出海马组织，具体方法为沿正中夹断双侧半球，用弯镊将一侧皮层掀开，两镊配合，玻璃出完整的海马组织，并去除海马周围粘附的皮层及血管。另一侧同前，待双侧海马均取出后置于预冷的DMEM培养基内。

1.5 消化与分散

待所有乳鼠的海马均取出后，吸出大部分DMEM培养基，用小剪刀剪碎海马组织成1～2mm³的组织块。加入0.25％的胰蛋白酶液在37℃温箱内消化20min，后加入等量的胎牛血清终止消化过程。用剖光过的细玻璃滴管吹打细胞悬液(慢吸快吹)，每吹打10次后吸取上层悬液，用200目的不锈钢滤网过滤至烧杯内，后加入适量种植液继续吹打，此步骤重复不超过3次。将烧杯内滤过的细胞悬液倒入玻璃离心管中，1000rpm/min离心2～5min后弃上清，后加入适量种植液吹打洗涤，再离心一次弃上清。将适量种植液加入离心管内，吹打制备成细胞悬液。

1.6 计数和接种

用种植液对少量细胞悬液稀释，用台盼蓝染色以观察细胞存活率，并采用细胞计数板计数。利用种植液将细胞悬液稀释为3～7×10⁵/ml的密度，接种于多聚赖氨酸包被的35mm塑料培养皿中，再按照前后、左右的方向晃动培养皿(切忌顺时针或逆时针方向晃动)，使细胞均匀贴服在培养皿内，然后置于37℃，5％ CO₂培养箱内培养3h，至细胞完全贴壁。

1.7 换液

待细胞完全贴壁后，立即更换培养基，将种植液全部吸掉，加入约2ml饲养液。为抑制胶质细胞的过度增殖，维持细胞的生长状态，在培养的第2d向培养基中加入阿糖胞苷储备液，使阿糖胞苷的终浓度为1～2μg/ml，作用24h后半量换液。之后，每周半量换液2次。

其中，半量换液的方法为：

先将培养皿中所有的培养基(即废弃培养基)吸入至离心管中，离心，收集上清；

用少量的饲养液将所述培养皿中的细胞进行洗涤，以便洗去细胞表面的细胞碎片；

之后，向所述培养皿中加入1ml饲养液，再加入上述收集获得的上清约1ml，混匀。

2、膜片钳实验

培养至7d的原代大鼠海马神经元即可用于膜片钳实验，也可根据实验需求适当的延长培养天数。

将上述培养至7d的原代大鼠海马神经元用于膜片钳实验(膜片钳实验的具体步骤请参见：Xu S,Ning W,Xu Z,et al.Chronic exposure to GSM 1800-MHz microwavesreduces excitatory synaptic activity in cultured hippocampalneurons.Neuroscience letters,2006,398(3):253-257，通过参照将其全文并入本文)。其中，在全细胞膜片钳实验中，先将细胞外液(“细胞外液“即为膜片钳实验的记录液)置于37℃温箱内，再将培养基更换为细胞外液，细胞经封接、破膜后可进行全细胞电流或电压的记录。

2 结果

2.1 原代大鼠海马神经元倒置显微镜观察结果

培养至7d可见神经元突起丰富，并交联成网状，胞体表面光滑，折光性强，见图1。

2.2 原代大鼠海马神经元相差显微镜下观察结果

培养至7d可见神经元突起交织成网状，胞体表面洁净、光滑，折光性强，立体感强，见图2。

2.3 原代大鼠海马神经元在膜片钳实验中的应用

该方法培养下的原代大鼠海马神经元能够更好地封接、破膜，满足膜片钳实验对于细胞质量较高的要求。细胞可快速封接，并顺利破膜。以全细胞记录为例，见图3，A：示记录电极刚入液时的测试方波，Rp为5.7MΩ；B：示记录电极轻轻接触细胞膜，测试方波变矮，Rp增大为13.4MΩ；C：示高阻封接形成，Rp为1GΩ；D：示破膜形成全细胞记录，Rp约为450MΩ。且破膜后细胞不易形变，见图4。

2.4 原代大鼠海马神经元基本电活动记录

全细胞跨膜总电流包括内向的电流成分及外向的电流成分。内向电流主要发生在刺激初期，考虑主要为Na⁺电流，及而外向的电流主要考虑为K⁺电流，见图5。此外，还可记录到神经元自发放电情况(即sEPSC)，见图6。

3 结论

(1)本实施例成功培养了原代大鼠海马神经元，该细胞生长状态良好，可交织成网状，细胞胞体表面光滑，折光性强。

(2)由结果可知，本发明的培养方法能够满足膜片钳实验对细胞状态的需求，可成功记录到原代大鼠海马神经元全细胞基本电流及sEPSC。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种用于膜片钳实验的原代海马神经元的培养方法，其特征在于，包括：

(3)将所述细胞悬液接种至多聚赖氨酸包被的培养皿中，进行第一培养2-4小时，使细胞贴壁，其中细胞接种密度为3～7×10⁵/ml；

(6)利用所述第二培养液对所述培养皿进行半量换液，然后进行第四培养至少3天，按照每周半量换液2次的频率进行换液，以便获得原代海马神经元；

步骤(1)进一步包括：

将所述海马组织切成1～2mm³的组织块；

于37℃下，利用0.25％的胰蛋白酶液将所述组织块进行消化处理20分钟；以及

利用胎牛血清终止消化；

所述半量换液是按照以下步骤进行的：

利用第二培养液对培养皿中的细胞进行洗涤；以及

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海马组织是以温度为4摄氏度的DMEM培养基为解剖液，从离体非人哺乳动物大脑中剥离获得的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为大鼠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一离心和所述第二离心均是于1000rpm/min条件下进行2～5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养、第二培养、第三培养和第四培养均是在37℃，5％CO₂的条件下进行的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后和步骤(3)之前，进一步包括：

预先利用所述第一培养液将所述细胞悬液稀释至3～7×10⁵/ml的密度。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述第一培养3小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，按照每3～7×10⁵细胞采用2ml所述第二培养液的比例，将所述培养皿中的所述第一培养液更换为第二培养液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养液包括：

78.5体积％的DMEM培养基；

10体积％的胎牛血清；

10体积％的马血清；

1体积％的L-谷氨酰胺；以及

0.5体积％的青链霉素储备液，

所述第二培养液包括：

85.5体积％的DMEM培养基；

10体积％的马血清；

1体积％的N-2添加剂；

2体积％的B-27添加剂；

1体积％L-的谷氨酰胺；以及

0.5体积％的青链霉素储备液，

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(7)对所述原代海马神经元进行质量鉴定。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，依据细胞形态，应用于膜片钳实验后细胞的封接、破膜情况和电活动记录，进行所述质量鉴定。