CN1863820A - 包含lpa的化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的新的肽化合物，所述的化合物包括2个单独的氨基酸序列，其中2个氨基酸序列中的至少一个能够结合FGFR。本发明公开了该化合物的氨基酸序列并且记载了包括其的药物组合物。本发明也涉及该化合物和包括其的药物组合物用于治疗或预防其中FGFR在病理中起作用的不同病理学状况，和/或从该疾病康复的用途。本发明的新的肽化合物可通过配体呈递组装(LPA)方法获得。
Description
发明领域
本发明涉及能够结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的新的肽化合物，所述的化合物包括2个单独的氨基酸序列，其中2个氨基酸序列中的至少一个能够结合FGFR。本发明公开了该化合物的氨基酸序列并且记载了包括其的药物组合物。本发明也涉及该化合物和包括其的药物组合物用于治疗和/或预防其中FGFR在病理中起作用的不同病理学状况，和/或从该疾病康复的用途。本发明的新的肽化合物可通过配体呈递组装(Ligandpresenting assembly)(LPA)方法获得。
发明背景
脑适应性(plasticity)和控制适应性的机制对于学习和记忆以及脑损伤后的功能恢复是很重要的。显然神经营养性因子是在成人中枢神经系统(CNS)中持续调节脑适应性的分子种类中的一种，较少认识到但同样深远的是细胞粘附分子(CAMs)在适应性机制，例如长期增效作用、神经元保存和再生中的作用。然而反过来，CAMs也可改组细胞外空间并在例如阿尔茨海默氏病和多发性硬化状况中产生驱动脑病理发展的紊乱。候选分子包括共享经典CAM许多特性的淀粉样蛋白前体蛋白质，和可冒充为假CAM的β-淀粉样蛋白。β-淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏病中起形成衰老斑的病灶作用，并且类似于CAMs提供组织神经营养性因子和其它CAMs的环境。在该环境中发展炎症性应答并且可引发永久神经元损伤的恶性循环，所述损伤通过小神经胶质、补体和其它因子介导(Cotman等人(1998)Prog Neurobiol.55：659-69)。
免疫球蛋白超家族的神经细胞粘附分子(CAMs)起核作用并且在发育早期和成人中的关键位点维持细胞群。除其粘连特性外，CAMs同嗜性和异嗜性相互作用可影响胞内的信号传导。其可影响的事件包括细胞迁移、增殖、以及由其粘连性和信号传输特性所导致的分化。
神经细胞粘附分子NCAM是第一个被发现的神经CAM。由于已经集中研究过发现的NCAM，因此其现在已经被很好地表征(Ronn等人(2000)IntJ Dev Neurosci 18：193-9)，NCAM属于免疫球蛋白(Ig)超家族。其胞外部分由5个Ig-样和2个纤粘连蛋白III型(F3)模块(module)组成。NCAM帮助细胞-细胞和细胞-基底的相互作用。NCAM结合各种细胞外基质成分，例如肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素蛋白多糖、和不同类型的胶原。细胞-细胞相互作用主要通过NCAM同嗜性的相互作用而得到帮助。NCAM的不同模块已经显示实行不同的功能。因此，现在认为NCAM同嗜性结合依赖于最初的3个1g模块。肝素结合序列局部化至Ig2模块。NCAM也结合神经细胞粘附分子L1。认为这种相互作用发生在NCAM的第4个Ig模块和L1上表达的寡甘露糖苷部分之间。NCAM的2个膜近侧F3模块已经显示涉及成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合。
现在许多科研小组已经积累了大量证据表明支持NCAM-介导的轴突长出的胞内信号传输级联与由于刺激FGFR而活化的信号转导级联相似(Povisen等人(2003)Neurochem Res 1：127-41)。
成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是4个紧密相关的受体蛋白质酪氨酸激酶的家族，包括3个Ig-样的细胞外模块和1个分开的酪氨酸-激酶细胞内模块(Powers等人(2000)Endocr Relat Cancer 7：165-97)。该受体被认为是形态发生、发育、血管生成和伤口愈合的关键调节子。FGFR活化和信号传输依赖于受体的二聚作用，其由FGFR天然配体、成纤维细胞生长因子(FGF)的高亲合力结合诱导，并且它也需要细胞表面肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚酶的参与。成纤维细胞生长因子(FGFs)及其受体构成参与几乎所有哺乳动物组织的许多发育和修复过程的精细信号系统，特别地它们在外周和中枢神经系统的功能中发挥重要的作用。因此，在FGF家族的23个成员当中，已经在脑中鉴定了10个(Jungnickel等人，(2004)Mol Cell and vonBohlen und Halbach(2003)Cell Tissue Res.313：139-57)。
最近已经认为NCAM是FGFR的推定备选配体，低亲合力结合配体新类别的成员。已经获得证明NCAM和该受体之间的直接相互作用的证据(Kiselyov等人(2003)Structure(Camb)11：691-701)。
最近已经认为已鉴定的涉及NCAM和FGFR之间直接相互作用、具有序列EVYVVAENQQGKSKA(FGL肽)的NCAM片段是用于治疗多种病理失调的新候选药物，在这些病理失调中FGFR活性的调节可能发挥重要的作用(WO 03/016351)。WO 03/016351描述了FGL肽由于结合和活化FGFR所产生的一些生物效应。根据WO 03/016351，单个拷贝(单体)肽体外呈递至神经元细胞足够促进细胞存活和分化作用。然而，为了获得这种效果需要相当高浓度的这种肽。
肽序列，例如抗原性肽的多重呈递已经被证明是体外扩大肽序列生物应答的有用方式(Berezin和Bock(2004)J Mol Neurosci.22：33-39；Ronn等人(1999)NatBiotechnol 17：10005)，并且它也已经有效用于体内动物模型(Cambon等人(2004)J Neurosci.17：4197-204)。
现在生物学活性肽序列的合成的树枝状聚合物正用于研究和一些临床应用中。树枝状的聚合物由许多单体肽序列的拷贝组成，其在多个位点附着于核心分子由此形成支化聚合物。在核心基质中最常使用的氨基酸是赖氨酸，因为它具有2个可获得支化反应的反应性氨基。赖氨酸核心上的肽序列多聚化被认为是多重抗原肽(MAP)呈递(multiple antigen peptide(MAP)presentation)。在PCT/US90/02039中描述了MAP(s)(树枝状聚合的肽)的合成方法。
通常，2种途径可用于合成树枝状聚合肽，即直接和间接的途径。在两个情形中，在Boc化学的情况下最初利用双保护的Boc-Lys(Boc)，或在Fmoc化学的情况下利用Fmoc-Lys(Fmoc)将C-末端核心组装到固相支持体上以获得所需要程度的支化。
在直接途径中通过众所周知的Merrifield方法将特定的肽逐步组装到赖氨酸基核心上来进行合成。这种逐步法产生具有C至N方向的肽。可人工合成串联的肽链，或备选地可利用垂直去保护法将各个肽人工合成到核心的不同赖氨酸臂上。
尽管用于树枝状聚合肽合成的这个方法是便利的，最终产品的质量却可能有问题，而且获得明确产品的问题已经在文献中有广泛论述。在链式组装期间出现问题。MAP型树枝状聚合物是大分子，其中各个单个肽链相互之间可能不受抑制地相互作用并且由此阻碍了与核心的高效偶连而导致产生需要费力纯化的非同质化合物。通过例如电喷射质谱法(ES-MS)表示这些产品的特性是困难的，因此经常使用的树枝状的肽产品没有充分的特性表示。
在间接途径中通过使纯化的未保护肽片段与核心基质偶连来进行合成。可使用2种常规方法用于这类连接，其分别以硫醇和羰基化学为基础。
可通过在赖氨酸基质上掺入氯乙酰基基团然后偶连至纯化的合成N-末端半胱氨酰肽以产生具有明确结构的树枝状聚合物来进行硫醇化学。通过利用赖氨酰基核心上的S-乙酰基和肽上的卤代乙酰基可获得反转安置(reverse placement)而使硫醇在核心基质上。在羰基化学中在羰基和弱碱之间发生缩合。存在可用于这种反应的2类弱碱。第一种包括羟胺和肼，而第二种包括1，2-二-取代的部分，例如1，2-氨基乙硫醇和1，2-乙醇胺。分别在N-末端Cys和Thr或Ser中发现最后的2个基团，而缩合产物是噻唑烷和噁唑烷。可通过N-末端Ser、Thr或Cys的高碘酸盐氧化作用获得核心基质上的羰基。两种方法都是本领域已知的(参见例如Lu等，(1991)MolImmunol 28：623-630；Defoort等，(1992)Int J Pept Prot Res 40：214-221；Drijfhout等，(1991)Int J Pept Prot Res 37：27-32)。
与MAP型化合物相关的另一个问题是肽链的方向。在将所需要的肽逐步组装到赖氨酸基核心上的直接途径中仅仅只获得具有C至N方向肽链的化合物。间接途径提供两个方向，C至N和N至C，但是该方法具有其它的主要缺点，例如由于二硫化物的氧化作用产生不合需要的副反应，导致不纯的产品，存在于天然肽链中的半胱氨酸残基的干扰，并且该方法需要优化每个合成。
发现肽序列增殖的最佳数目是有待解决的另一个问题。已经利用四-或八-聚合多聚物进行经MAP法的人工合成的树枝状肽聚合物的大部分研究。然而，包括15个或15个以上氨基酸的4-8个序列的化合物的体内应用受到该化合物穿透血脑屏障的能力问题的挑战，如果该化合物用于治疗脑，这个问题是决定性的。如果二聚体具有树枝状的四聚类似物的生物活性，则肽序列的二聚体可以解决这个问题。包括不同接头的生物学活性肽二聚体的生产和用途也是本领域公知的(参见例如WO00/18791，WO00/24770)。
发明概述
尽管由FGL的4个序列组成的FGL肽树枝状聚合形式已经被证明在大鼠体内是有效的(Cambon等人(2004)J Neurosci.174197-204)，本发明的作者发现初步认为树枝状聚合物可作为治疗人类患者的药物候选者。FGL肽树枝状四聚物的最终纯化显示MAP合成的产品是高度异质的并且表征其特性是很困难的。为了解决这个问题本发明的作者试图利用已知的合成方法人工合成不同的FGF二聚体。令人惊讶地，具有与FGL树枝状聚合物相似生物活性的唯一FGL二聚体是通过如WO00/18791中所公开的配体呈递组装方法(LPA)产生的二聚体。其它的FGL二聚体，例如，如Goodwin等人(1998)Bioorg Med Chem Lett 8：2231-2234中公开的通过Cys残基，或如Rajagopalan等人(1995)Int J Pept Protein Res 45：173-179中公开的通过Lys残基连接FGL序列的二聚体不具有相同的活性。
因此，本发明的第一个方面涉及一种包括2个单独的肽序列的化合物，其中2个序列中的至少一个包括通式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5的氨基酸序列，其中
A、B、C、D中的一个选自疏水性的氨基酸残基，
A、B、C、D中的一个选自碱性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个选自酸性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个是Gly或Ala，以及
L1、L2、L3、L4和L5选自化学键或具有n个氨基酸残基的氨基酸序列，其中n是0至5的整数，
所述的肽序列通过通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]的接头相互连接
n和m独立地是1至20的整数，
X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m(CR2)p，其中p是0或1至20的整数，
A和B独立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、或取代的或未取代的芳香族部分。
通过LPA法获得本发明所述的上述化合物。
在另一个方面，本发明涉及包括上述限定的化合物的药物。
在另一个方面，本发明涉及利用上述化合物制造药物来用于
a)治疗与手术后神经损伤、外伤性神经损伤、神经纤维髓鞘化减少、缺血后损伤相关的中枢和外周神经系统病症，所述病症例如起因于中风、帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、亨廷顿(Huntington’s)病、痴呆，例如多血管梗塞痴呆，硬化症、与糖尿病相关的神经退化、影响昼夜节律钟或神经肌肉传递的疾病、以及精神分裂症、情绪失调，例如狂躁抑郁症；
b)治疗肌肉的疾病或病症，包括例如器官移植后伴有神经肌肉连接功能障碍的病症，或例如遗传的或外伤的萎缩性肌肉疾病；治疗各种器官的疾病或状况，例如生殖腺的退化病症、胰腺的退化病症，例如I型和II型糖尿病，肾的退化病症，例如肾病以及心、肝和肠的退化病症；
c)促进创伤-愈合；
d)例如在急性心肌梗塞或血管生成后防止心肌细胞死亡；
e)促进重建血管(revascularsation)；
f)刺激学习和/或短时和/或长时记忆能力；
g)防止由于局部缺血造成的细胞死亡；
h)防止由于醇消费造成的机体损伤；
i)治疗朊病毒疾病；
j)治疗癌症。
附图说明
图1显示合成LPA-型FGL二聚体(FGLL)的流程图)
图2显示了FGLL的HPLC纯化图谱
图3显示了FGLD的HPLC纯化图谱
图4表明FGL肽对用多种神经毒剂处理的原代神经元(primary neuron)存活的影响。
使来自15天龄大鼠胚胎的多巴胺能神经元(DN)(a和b)在没有或伴有各种浓度的肽的情况下以150,000个细胞/cm2的密度，在涂有聚-D-赖氨酸的24-孔细胞培养平板上生长6天再暴露于100μM 6-OHDA 2小时。改变培养基并加入多种浓度的FGLd。在固定培养物并用酪氨酸羟化酶免疫染色前使神经元另外生长24小时。
将来自19天龄大鼠胚胎的海马神经元(HN)(c和d)以40,000个细胞/cm2的密度接种在聚-L-赖氨酸涂覆的8-孔permanox小室载片上并在含有20μM淀粉样蛋白-β25-35肽(Aβ25-35)的培养基中，在存在多种浓度的FGLd的情况下生长24小时，再将其固定并用Hoechst 33258染色。
将来自出生后7天的大鼠的小脑粒状神经元(CGN)(e和f)以100,000个细胞/cm2的密度在聚-L-赖氨酸涂覆的微孔板上在含有40mM KCl的培养基中生长7天，然后将培养基替换为含有5mM KCl、补充有多种浓度FGLd的培养基。培养2天后，固定培养物并用Hoechst 33258染色。
(a)-10ng/ml GDNF对用6-OHDA处理的多巴胺能神经元存活的影响。
(b)各种浓度的FGLd对用6-OHDA处理的多巴胺能神经元存活的影响。
(c)50ng/ml BDNF对用Aβ25-35处理的海马培养物的影响。
(d)各种浓度的FGLd对用Aβ25-35处理的海马神经元存活的影响。
(e)50ng/mlIGF-1对通过去除神经元的高钾而诱导经受细胞程序性死亡的CGN培养物的影响。
(f)各种浓度的FGLd对被诱导经受细胞程序性死亡的CGN培养物的影响。
将来自针对各类培养物的至少4个独立实验的结果表示为与神经元总数相比较活的神经元的百分比±SEM。将被诱导经受细胞死亡而没有FGL-处理的对照培养物设置为100％。当与未处理的对照相比时+p＜0.05，++p＜0.01。当与被诱导经受细胞死亡的培养物相比时*p＜0.05，**p＜0.01以及***p＜0.001。
图5表明使神经元在高KCl培养基(40mM)生长6天后通过改变培养基至低KCl培养基(5mM KCl)而诱导经受细胞程序性死亡的CGN培养物中FGL肽对DNA-断裂的影响。利用Apo-Alert细胞程序性死亡检测试剂盒测量具有断裂DNA的神经元的数目，并且通过计数评估TUNEL-阳性神经元部份。来自至少4个独立实验的结果显示为DNA-断裂的细胞相对于细胞总数±SEM，其中将低KCl中的对照培养物设置为100％。
(a)去除CGN培养物的高KCl对经受细胞程序性死亡的细胞数目的影响。
(b)FGLd在被诱导细胞程序性死亡的CGN培养物中的影响。
当与低KCl-处理的CGN培养物相比时*p＜0.05，**p＜0.01以及** *p＜0.001。
图6显示FGL对Erk1/2磷酸化的影响。使CGN以290,000个细胞/cm2的密度在聚-L-赖氨酸涂覆的微孔板上生长3天，随后用FGLd处理10-90min，固定并用针对磷酸-p42/44的抗体染色。利用结晶紫染色剂评估神经元的总数。来自至少3个独立实验的结果表示为百分比±SEM，其中未处理的培养物设定为100％。当与对照相比时*p＜0.05以及**p＜0.01。
图7显示FGL对Akt磷酸化的影响。使CGN以290,000个细胞/cm2的密度在聚-L-赖氨酸涂覆的微孔板上生长3天，随后用各种浓度的FGLL分别处理10或30分钟，固定并用针对在Ser473上磷酸化的Akt的抗体染色。利用结晶紫染色剂评估神经元的总数。来自至少3个独立实验的结果表示为百分比±SEM，其中未处理的培养物设定为100％。当与对照相比时*p＜0.05。
图8显示FGFR、MEK和P13K的抑制剂对FGL-诱导的被诱导至经受细胞程序性死亡的CGN存活的影响。使CGN以100,000个细胞/cm2的密度在聚-L-赖氨酸涂覆的8-孔permanox载片上，含有40mM KCl的培养基中生长七天，此后将培养基改变为与FGLd一起的含有5mM KCl的培养基。此后加入各种浓度的MEK抑制剂PD98059(●)、P13K抑制剂LY294002(▲)和FGFR抑制剂SU5402(■)。在所有的情形中加入抑制剂后再加入10μg/ml FGLd。用肽和抑制剂培养2天后，固定培养物并用Hoechst 33258染色。来自至少4个单独实验的结果显示为活神经元的数目相对于神经元总数的百分比±SEM，其中用FGLd处理的对照培养物设置为100％。
图9显示FGL肽对从多巴胺能的(●)、海马(▲)和小脑颗粒神经元(■)突触长出的影响。使多巴胺能神经元以100,000个细胞/cm2的密度在聚-D-赖氨酸涂覆的24-孔细胞培养平板上与各种浓度的FGLd生长72小时。随后进行培养物的酪氨酸羟化酶免疫染色。将海马神经元和CGN以10,000个细胞/cm2的密度接种在8-孔permanox小室载片上并在存在各种浓度的FGLd时培养24小时。随后进行神经元的GAP-43免疫染色。来自各种神经元培养物的至少5个独立实验的结果显示为百分比±SEM，其中未处理的对照设置为100％。当与对照相比时*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。
图10显示3种二聚形式的FGL肽对来自新生大鼠的海马神经元突触生长的影响。使海马神经元的原代培养物以10,000个细胞/cm2的密度与各种浓度的FGLL(■)、FGLlys(▲)或FGLcys(●)生长24小时，然后进行GAP-43的免疫染色。来自至少4个独立实验的结果显示为百分比±SEM，其中未处理的对照设置为100％。当与对照相比时*p＜0.01。
图11显示FGFR、MEK和P13K的抑制剂对CGN培养物中FGL-诱导的突触长出的影响。使CGN以10,000个细胞/cm2的密度在8-孔permanox载片上，在存在FGL肽和抑制剂时生长24小时。加入浓度为12.5、25和50μM的PD98059(●)，同时加入10μg/ml的FGLd；再加入浓度为3.5、7和10μM的LY294002(▲)，同时加入27μg/ml的FGLd。加入浓度为20、40和80μM的SU5402(■)，同时加入27μg/ml的FGLd。固定处理的细胞后进行GAP-43免疫染色。来自至少4个独立实验的结果显示为百分比+SEM，其中FGLd-处理的对照培养物设置为100％。虚线表明没有FGLd-处理的培养物中的平均突触长度。当与FGLd-处理的对照相比时*p＜0.05，**p＜0.01。
图12显示FGLd、FGL对照和溶剂对来自E19大鼠的海马神经元原代培养物的FM 1-43脱色速率的影响。各个值表示4-8个实验的平均值和表明S.E.M的误差线。用5μg/ml FGLd处理任何时间段，以及用20μg/ml处理24小时对FM 1-43的卸载速率都没有任何影响。相比之下，当与对照培养物相比时用20μg/ml FGLd处理1小时和48小时的培养物中，突触显示FM1-43的卸载速率显著增长，表明在这些培养物中突触前的应答增强。利用不成对的t检验比较该值。*p＝0.04(1h)以及**p＝0.0032(48h)。FGL对照是由序列EVYVVAENAAGKSKA(SEQ ID NO：147)组成的对照肽。FGL序列的Gln残基变为Ala的突变已经显示消除了FGL活性(Kiselyov等人2003参见上文，cit)。
图13表明FGLL、FGLD和FGL对照的早期枕部下给药对大鼠记忆(社会认知测试)的影响，所述大鼠的认知损伤可通过脑室内(i.c.v.)-注射(25-35)β-淀粉样蛋白片段来诱导。结果来自于A-β-诱导神经毒性后第7、10、和13天进行每只大鼠每次给药5.0μg FGL的枕骨下给药实验。i.c.v.给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段后21天进行社会认知测试(Social Recognitiontest)，并且评估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期间确定幼仔所花费的时间之间的比率。小组中动物的数目为4至22不等。利用单向ANOVA(F(2，27)＝15.4，P＜0.0001)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(**p＜0.01)而定(Newman-Keuls post-test)。也在对照和V/V处理的小组之间与A-β/V小组(p＜0.001)相比观察到统计上显著的影响。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。′V/V′代表接受溶剂作为A-β和FGL的替代的大鼠。FGL对照如同上述。
图14显示FGLL和FGLd的早期枕骨下给药对在大鼠的具带皮层中形成淀粉样蛋白覆盖层的影响，其中在(25-35)β-淀粉样蛋白(A-β)片段-诱导的神经毒性后第7、10和13天通过i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉样蛋白片段(每只大鼠每次给药5.0μg FGL)诱导大鼠的认知损伤。小组中动物的数目为3至13不等。利用单向ANOVA(F(2，18))＝5.2，p＝0.016)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(*p＜0.05和**p＜0.01)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V处理小组和A-β/V处理小组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.05)。A′-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图15显示FGLL和FGLd的早期枕骨下给药对大鼠海马的CA3区域中形成淀粉样蛋白覆盖层的影响，其中在(25-35)β-淀粉样蛋白(A-β)片段-诱导的神经毒性后第7、10和13天通过i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉样蛋白片段(每只大鼠每次给药5.0μgFGL)诱导大鼠的认知损伤。小组中动物的数目为2至12不等。利用单向ANOVA(F(2，15))＝9.54，p＝0.002)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V处理小组和A-β/V处理小组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.01)。A′-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图16显示FGLL和FGLd的早期枕骨下给药对大鼠海马的神经元死亡的影响，其中通过i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉样蛋白片段诱导大鼠的认知损伤。在(25-35)β-淀粉样蛋白(A-β)片段-诱导的神经毒性后第7、10和13天每只大鼠每次枕骨下给药5.0μg FGL对大鼠海马的CA3区带中神经元细胞死亡的影响。小组中动物的数目为4至8不等。利用单向ANOVA(F(3，17))＝13.76，p＜0.001)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在对照小组和A-β/V处理小组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.01)。A′-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图17表明社会认知测试中在(25-35)β-淀粉样蛋白片段(A-β)-诱导的神经毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次给药)的影响。i.c.v.给药A-β片段后第44天进行社会认知测试，并且评估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期间确定幼仔所花费的时间之间的比率。每组动物的数目为4至5不等。当与A-β/V小组相比时，利用不成对的t检验分析结果，并且结果显著性视获得小于0.05的p-值(*p＜0.05)而定。通过用A-β处理诱导显著的短时记忆损伤(p＜0.05，对照和A-β/V之间的不成对t检验)。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图18显示在A-β片段诱导神经毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次给药)对大鼠具带皮层中淀粉样蛋白覆盖层的影响。每组动物的数目为3至13不等。利用单向ANOVA(F(2，12)＝18.6，P＝0.002)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(***p＜0.001)而定(Newman-Keuls post-test)。在V/V处理组和A-β/V处理组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.001)。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图19显示在(25-35)β-淀粉样蛋白(A-β)片段诱导神经毒性后第30、33和36天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次给药)对大鼠海马的CA3区域中淀粉样蛋白覆盖层(amyloid burden)的影响。每组动物的数目为3至5不等。利用单向ANOVA(F(2，9)＝10.6，P＝0.004)分析结果，当与A-β/V小组相比时，结果显著性视获得小于0.05(***p＜0.001)的p-值而定(Newman-Keuls post-test)。在对照处理组和A-β/V处理组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.01)。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图20显示在(25-35)β-淀粉样蛋白A-β片段诱导神经毒性后第7、10和13天枕骨下施用5.0μg FGLL(每只大鼠每次给药)对具带皮层中神经元细胞死亡的影响。每组动物的数目为4至8不等。利用单向ANOVA(F(2，9)＝26.9，P＜0.001，Newman-Keuls post-test分析结果：A-β/V小组与对照组相比(***p＜0.001)，以及与A-β/FGLL处理组相比(**p＜0.01)。当与A-β/V处理组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值而定(p＜0.001)。在对照处理组和A-β/V处理组之间观察到统计上显著的差异(p＜0.001)。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图21显示社会认知测试中在i.c.v.施用(25-35)β-淀粉样蛋白(A-β)片段后第7、10和13天对每只大鼠的溶剂、200μg FGLL、和400μg FGLL的3次鼻内给药的影响。(25-35)β-淀粉样蛋白(β-A)片段的i.c.v.给药后第21天进行社会认知测试，并且评估成年大鼠在第一(T1)和第二(T2)相遇期间确定幼仔所花费的时间之间的比率。小组中动物的数目为3至8不等。结果显示为平均值±SEM并且通过不成对的t检验加以分析(对照对A-β/V的p＜0.001)，单向ANOVA(F(2，19)＝5.6；p＝0.01；Newmann-Keulspost-test，A-β/V对A-β/FGLL，400的p＜0.05；以及A-β/V对A-β/FGLL，200的p＞0.05；而A-β/FGLL，400对A-β/FGLL，200的p＜0.05)。当与A-β/V处理组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p值而定(p＜0.05)。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图22显示在i.c.v.施用(25-35)β-淀粉样蛋白(β-A)后第7、10和13天对每只大鼠的溶剂、200μg FGLL、和400μg FGLL的3次鼻内给药对具带皮层中神经元细胞死亡的影响。小组中动物的数目为4至8不等。利用不成对t检验(对照组对A-β/V-处理组(p＜0.001)和单向ANOVA(F(2，16)＝8.6；p＝0.003)，具有Newman-Keuls post-test**p＜0.01的A-β/V对A-β/FGLL，400以及p＞0.05的A-β/V对A-β/FGLL，200)分析结果。当与A-β/V组相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(**p＜0.01)而定。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。
图23显示在开放场地测试(Open Field test)中5.9μg FGLd给药对待测定起跳活性(Rearing Activity)的大鼠的影响。在(25-35)β-淀粉样蛋白片段导致神经毒性后第7、10、和13天枕骨下应用所述肽。编号′1′、′2′、和′3′表明测量的周期：′1′表示1-3min.，′2′表示8-10min.，以及′3′表示18-20min。′V/V′表示接受溶剂作为(25-35)β-淀粉样蛋白片段和FGLd的替代物的大鼠，每组动物的数目从9至11不等。′A-β′和′V′分别是(25-35)β-淀粉样蛋白片段和溶剂的缩写。利用不成对的t检验分析结果，并且当与第一测量周期((1-3min)相比时，结果显著性视获得小于0.05的p-值(*p＜0.05，**p＜0.01)而定。
图24显示在PND1、2和3时，每只大鼠幼仔通过鼻内施用2.6μg FGLL、FGLd、或FGL对照后，在PND4进行表面复原反射(Surface Righting Reflex)检测的结果。各个处理组幼仔的数目是6。利用单向ANOVA(F＝4.05；P＝0.039)分析结果，并且Newman-Keuls测试显示当与对照-和FGL时照组相比，FGLL(P＜0.05)和FGLd(P＜0.05)的统计上显著的影响。FGL对照如同上述。
图25显示在PND1、2和3时，每只大鼠幼仔通过鼻内施用2.6μg FGLL、FGLd、或FGL对照后，在PND6和PND9时进行负趋地性反射(NegativeGeotaxis Reflex)测试的结果。各个处理组幼仔的数目是6。利用单向ANOVA分析结果(FPND6＝5.14；PPND6＝0.008)。在PND6，当与对照-和FGLc(FGL对照)组相比时，对于FGLL(p＜0.05)和FGLd(**p＜0.01)组观察到统计上显著的影响。在PND 9时，没有观察到FGL的显著影响(单向ANOVA：FPND9＝0.94；PPND9＝0.44)。FGL对照如同上述。
图26显示体内试验时间过程的图解表示。
图27显示SEQ ID NO：2(EFloop)的肽在低KCl浓度情况下在大鼠脑颗粒神经元培养物中对存活的影响。在相同培养条件下用胰岛素生长因子1(IGF-1)处理对照细胞。
图28显示EFL肽(SEQ ID NO：2)对大鼠海马神经元的体外神经突发生(neuritogenic)的影响。将EFL处理的培养物中轴突的长度与用溶剂(磷酸盐缓冲盐水)处理的培养物中轴突的长度相比。
发明详述
1.化合物
就开发用于多种疾病和病理情况治疗的有效药物来说，能够调节成纤维细胞生长因子受体(FGFR)功能的化合物具有很大的重要性。因此，本发明的目的是提供能够结合FGFR并调节FGFR活性的新的化合物。根据本发明，该化合物包括至少2个肽序列，其中2个序列中的至少一个包括为能够低亲合结合FGFR的氨基酸序列所共有的结构性基序。
1.肽序列
因此，本发明的一个方面涉及2个单独的肽序列，其中2个单独肽序列中的至少一个包括通式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
的氨基酸序列，其中
A、B、C、D中的一个选自疏水性的氨基酸残基，
A、B、C、D中的一个选自碱性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个选自酸性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个是Gly或Ala，以及
L1、L2、L3、L4和L5选自化学键或具有n个氨基酸残基的氨基酸序列，其中n是0至5的整数。
在本文中应用表示氨基酸残基的标准一个字母代码以及标准的3字母密码。氨基酸的缩写与生化命名法则Eur.J.Biochem，1984，vol.184，第9-37页中IUPAC-IUB Joint Commission的建议一致。说明书和权利要求书自始至终使用天然氨基酸的3字母密码或1字母代码。其中没有具体说明L或D形式，可理解所述的氨基酸具有天然的L形式，参照Pure & Appl.Chem.Vol.(56(5)第595-624页(1984)或D形式，以便形成的肽可由L形或D形的氨基酸构成，或混合的L形和D形氨基酸的序列构成。
若没有具体说明，可理解本发明的肽的C-末端氨基酸以游离羧酸的形态存在，这也可说明为″-OH″。然而，本发明化合物的C-末端氨基酸可以是酰胺化的衍生物，其表示为″-NH2″。其中没有另外说明，多肽的N-末端氨基酸包括游离的氨基，这也可指定为″H-″。
若没有具体说明，氨基酸可选自任何氨基酸，不管是天然存在或非天然存在的，例如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。因此，该组包括但不限于：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His Aib、Nal、Sar、Orn、赖氨酸同系物、DAP、DAPA和4Hyp。
同时可修饰本发明所述的化合物/肽，例如进行氨基酸的糖基化和/或乙酰化。
本发明所述的碱性氨基酸残基由氨基酸Arg、Lys、和His的残基代表，酸性氨基酸残基由氨基酸Glu和Asp的残基代表，而疏水性的氨基酸残基由氨基酸Leu、Ile、Val、Phe、Trp、和Tyr的残基代表。在优选的实施方案中，碱性氨基酸残基由Arg或Lys代表。
1.1肽序列的长度
本发明的化合物可包括2个单独的肽片段，其一起包括6-160个氨基酸残基之间，例如6-150个氨基酸残基，例如6-140个氨基酸残基，例如6-130个氨基酸残基，例如6-120个氨基酸残基，例如6-110个氨基酸残基，例如6-100个氨基酸残基，例如6-90个氨基酸残基，例如6-80个氨基酸残基，例如6-70个氨基酸残基，例如6-60个氨基酸残基，例如6-50个氨基酸残基，例如6-40个氨基酸残基，例如6-30个氨基酸残基，例如6-20个氨基酸残基，例如6-10个氨基酸残基。因此，在一个实施方案中可改变化合物的2个单独肽片段中任何一个的氨基酸序列长度。在另一个实施方案中，化合物的各个肽片段的序列可以是相同的。
措辞″单独的肽片段/序列″在本文中指肽片段/序列(两个或两个以上)不是通过一个氨基酸序列中的肽键连续连接的，但它们可通过接头，例如下文论述的接头相互连接。
因此，化合物的任何一个单独的肽序列可独立地由3-80个氨基酸残基组成，例如3-70个，例如3-60个，例如3-50个氨基酸残基，例如3-30个氨基酸残基，例如3-20个氨基酸残基，例如3-15个氨基酸残基，例如3-10个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，化合物的任何一个肽序列可独立地具有为4--80个氨基酸残基的长度，例如4-70个，例如4-60个，例如4-50个氨基酸残基，例如4-40个氨基酸残基，例如4-30个氨基酸残基，例如4-20个氨基酸残基，例如4-15个氨基酸残基。
在进一步的实施方案中，该序列可独立地具有5--80个氨基酸残基的长度，例如5-70个，例如5-60个，例如5-50个氨基酸残基，例如5-40个氨基酸残基，例如5-30个氨基酸残基，例如5-20个氨基酸残基，例如5-15个氨基酸残基，例如5-10个氨基酸残基。
在更进一步的实施方案中，该序列可独立地具有6--80个氨基酸残基的长度，例如6-70个，例如6-60个，例如6-50个氨基酸残基，例如6-40个氨基酸残基，例如6-30个氨基酸残基，例如6-20个氨基酸残基，例如6-15个氨基酸残基，例如6-10个氨基酸残基。
本发明也涉及包括2个单独氨基酸序列的化合物，其可独立地具有7-80个氨基酸残基的长度，例如7-70个，例如7-60个，例如7-50个氨基酸残基，例如7-40个氨基酸残基，例如7-30个氨基酸残基，例如7-20个氨基酸残基，例如7-15个氨基酸残基，例如8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基。
单独序列的长度也可为8-80个氨基酸残基，例如8-70个，例如8-60个，例如8-50个氨基酸残基，例如8-40个氨基酸残基，例如8-30个氨基酸残基，例如8-20个氨基酸残基。或它也可能为9-80个氨基酸残基，例如9-70个氨基酸残基，例如9-60个氨基酸残基，例如9-50个氨基酸残基，例如9-40个氨基酸残基，例如9-30个氨基酸残基，例如9-20个氨基酸残基。
包括2个单独氨基酸序列的化合物，其中两个序列的任一个都具有10--80个氨基酸残基的长度，例如10-70个氨基酸残基，例如10-60个氨基酸残基，例如10-50个氨基酸残基，例如10-40个氨基酸残基，例如10-30个氨基酸残基，例如10-20个氨基酸残基，也在本发明的范围内。
在一个优选的实施方案中，化合物包括2个单独氨基酸序列，其中任何一个序列可独立地具有15-80个氨基酸残基的长度，例如15-70个氨基酸残基，例如15-60个氨基酸残基，例如15-50个氨基酸残基，例如15-40个氨基酸残基，例如15-30个氨基酸残基，例如15-20个。
在本发明另一个优选的实施方案中，化合物的2个氨基酸序列中任何一个的最小长度可独立地为16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基，以及最大的长度是36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。也优选化合物中2个单独序列中任何一个的长度为25和36个之间的氨基酸残基。
在另一个优选的实施方案中，化合物肽片段的长度可独立地具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。9至20个氨基酸残基范围中的单独肽片段长度是最优选的。
在本发明另一个优选的实施方案中，化合物的2个肽序列中的至少一个来源于选自细胞粘附分子、细胞-表面受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、以及金属蛋白酶、细胞外基质分子或生长因子的多肽序列。
2.2肽序列的起始
因此，优选化合物的2个肽序列中的至少一个来源于选自细胞粘附分子、细胞-表面受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、和金属蛋白酶、细胞外基质分子和生长因子的多肽序列。
本发明的作者最近已经鉴定了FGFR配体的新类别，其在1)结合FGFR的能力和2)其对于受体的结合位点的结构不同于FGFR的天然高亲合配体FGFs。新的FGFR配体能够在FGFR上的结合位点低亲合结合受体，这也不同于已知的受体FGF结合位点。根据本申请，新的低亲合FGFR配体的FGFR结合位点包括含有上述基序的序列。FGFR配体的新类别包括本申请所述的蛋白质，其可具有非依赖于FGFR活性的生物功能。此外，新的低亲合FGFR配体可具有1)由于其结合和活化FGFR而实现的功能，以及2)通过另外的机制而实现的功能。功能(1)和功能(2)可具有不同的生物意义。由于结合受体的相对低的亲合力，本发明所述的新配体不能够调节已经由FGF引发的受体活化。根据本发明，低亲合FGFR配体的新种类包括本领域已知的分子，如细胞粘附分子、细胞表面受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、以及金属蛋白酶、细胞外基质分子或生长因子。
根据本发明，细胞粘附分子可选自
-神经细胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.Nos：P13591、P13595-01、P13595)、
-神经细胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)，
-神经细胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.No：P36335)
-神经胶质细胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.No：Q03696；90933)，
-神经细胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No：000533)，
-神经胶质蛋白(Neuroglian)(Swiss-Prot Ass.No：P91767、P20241)，
-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92823、O15179、Q9QVN3
-轴突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q02246、P22063、P28685)、
-轴突-缔合的细胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.No：NP_031544.1；Swiss-Prot Ass.No：Q8TC35)，
-髓磷脂-缔合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.No：P20917)，
-神经细胞粘附分子BIG-1(Swiss-Prot Ass.No：Q62682)，
-神经细胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.No：Q62845)，
-成束蛋白(Fascilin)(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.No：P22648)，
-神经细胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)、
-神经细胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos：094779，P07409，P97527)，
-钙粘着蛋白(Cadherin)(Swiss-Prot Ass.No：Q9VW71)，
-连接粘着分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JKD5、088792)，
-神经细胞粘附F3/F11(接触蛋白(Contactin))(Swiss-Prot Ass.Nos：Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、093250)，
-神经束蛋白(Neurofascin)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q90924、Q91Z60；O42414)，
-B-淋巴细胞细胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.Nos；Q9R094、P20273)，
-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92859、P97603、Q90610、P97798)，
-细胞胞间细胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8TAM9、Q60625)或
-半乳糖结合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot，Q9JKX2、Q9NZ03)，
-半乳糖结合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.No：Q8K419；P38552)、
或其片段、或其变体。
功能性的细胞-表面受体可选自
-成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)(Swiss Prot Ass.Nos：Q9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)、
-成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96KM2、P21802、Q63241)，
-成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q95M13、AF487554、Q99052)，
-成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.No：Q91742)，
-神经营养蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.No：Q8WXJ5)，
-白细胞抗原相关蛋白质-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)，
-肾升压素(Nephrin)(nephrin)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q64699、Q13332、O75870)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体κ型(R-PTP-κ)(Swiss swissprot Prot Ass.No：Q15262)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)，
-Ephrin A型受体8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受体EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos：009127、P29322)，
-Ephrin A型-受体3(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受体ETK1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.No：P29318)，
-Ephrin A型-受体2(Swiss-Prot Ass.No：Q8N3Z2)
-胰岛素受体(IR)(Swiss-Prot Ass.No：Q9PWN6)
-胰岛素-样生长因子-1受体(IGF-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)
-胰岛素-相关的受体(IRR)(Swiss-Prot Ass.No：P14616)，
-酪氨酸-蛋白激酶受体Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos：06805、P35590、Q06806)，
-环形受体(Roundabout receptor)-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：044924、AF041082、Q9Y6N7)，
-神经烟酸乙酰胆碱受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptor)α3亚基(CHRNA3)(Swiss Prot Ass.Nos：Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)，
-神经乙酰胆碱受体α6亚基(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15825、Q9ROW9)，
-血小板源性生长因子受体β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R406、Q05030)，
-白细胞介素-6受体(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.No：Q00560)，
-白细胞介素-23受体(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.No：AF461422)，
-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同细胞因子受体(Swiss-Prot Ass.No：P32927)，
-细胞因子受体-样分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.No：Q9JM58)，
-I类细胞因子受体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.No：Q9UHH5)
-神经突起生长导向因子(Netrin)-1受体DCC(Swiss-Prot Ass.No：P43146)，
-白细胞Fc受体-样蛋白质(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96PJ6、Q96KM2)，
-巨噬细胞清除受体2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.No：Q91YK7)，或
-粒性白细胞集落刺激因子受体(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.No：Q99062)，或其片段、或其变体。
根据本发明的硫酸乙酰肝素蛋白聚酶是基底膜蛋白聚糖(perlecan)(Swiss Prot Ass.No：P98160)，或其片段或其变体。
金属蛋白酶可选自
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：Q05910)，
-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9H013、O35674)，
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：P78325)，
-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos：043184、Q61824)，
-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)，
-ADAM-33前体(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R533、Q923W9)，
-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.Nos：Q13433、Q61072)，
-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9H2U9、O35227、Q63180)
-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.No：Q8R533)
-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYV0、O88839、Q13444)，
-包含金属蛋白酶-去整合蛋白结构域的蛋白质(Metalloproteinase-desintegrin domain containing protein)(TECAM)(Swiss-Prot Ass.No：AF163291)，
-金属蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.Nos：O95204、Q9BS16)、或其片段或其变体。
细胞外基质分子可选自
-胶原蛋白VII型(Swiss-Prot Ass.No：Q63870)，
-纤粘连蛋白(Swiss-Prot Ass.Nos：Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)，或
-肌腱蛋白(tenascin)-R(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15568、O00531、Q90995、P10039)，或其片段、或其变体。
根据本发明的生长因子是细胞因子样因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.No：O75462，或其片段、或其变体。
本文中术语″片段″是指具有预定蛋白质/多肽氨基酸序列长度的大约25-99％的氨基酸序列的多肽，所述的多肽是选自上述小组的预定多肽的功能性同系物。
本文中术语″变体″是指具有i)与预定多肽的序列50-100％同源的、和/或ii)包括其它化学部分，如各种翻译后修饰的氨基酸残基，例如磷酸化、酰化作用、氨基酸残基的糖基化，和/或iii)与另外的生物分子，例如多肽、脂类或碳水化合物物理相关或化学结合，例如共价结合的氨基酸序列的多肽，所述的多肽是选自上述小组的预定多肽的功能同系物。术语″物理性缔合的″是指通过疏水性或静电相互作用缔合的分子。
本文中术语预定多肽的″功能性同系物″是指具有预定多肽的一种或多种生物功能的分子，在优选的实施方案中，所述一个或多个预定多肽的生物功能通过结合和活化FGFR的机制而实现。
如上述已经讨论到，本发明优选的功能性细胞-表面受体是选自成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)家族的受体。本发明所述的上述分子包括对FGFR的备选低亲合结合位点，其不同于FGFs的已知FGFR高亲合结合位点。
上述分子的低亲合FGFR结合位点的特征在于它包括与序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％同源性的氨基酸序列，序列EVYVVAENQQGKSKA来源于神经细胞粘附分子(NCAM)，并且在本领域中是已知的，如NCAM的FGL肽。将一个氨基酸序列与另外氨基酸序列的同源性定义为2个排序序列中相同氨基酸的百分比。可利用公知的算法计算氨基酸序列之间的同源性，例如BLOSMM 30、BLOSMM 40、BLOSMM 45、BLOSMM 50、BLOSMM 55、BLOSMM 60、BLOSMM 62、BLOSMM 65、BLOSMM 70、BLOSMM 75、BLOSMM 80、BLOSMM 85、或BLOSMM 90。
在另外的实施方案中，上述分子的FGFR结合位点包括与序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)相比具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％正性(positive)氨基酸相匹配的氨基酸序列。本申请定义这种序列为预定序列，例如SEQ IDNO：1的变体。正性氨基酸相匹配定义为2个比较序列中具有相同位置的氨基酸的物理和/或化学特性所限定的同一性或相似性。本发明优选的正性氨基酸相匹配是K至R、E至D、L至M、Q至E、I至V、I至L、A至S、Y至W、K至Q、S至T、N至S以及Q至R。
在另外的实施方案中，FGFR的FGFR新结合位点可包括如下序列的同系物或片段，该序列
i)与序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的同源性，或
ii)与序列EVYWAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)相比具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的正性氨基酸相匹配。
在另一实施方案中，本发明的新的低亲合FGFR配体的FGFR结合位点其特征在于特定的3D特性，就是它基本上可由一个或多个″链-环-链″结构性基序组成。它是上述讨论到的序列的优选特性。根据本发明，链-环-链结构是通式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
的氨基酸序列的优选3D结构，其中
A、B、C、D中的一个选自疏水性的氨基酸残基，
A、B、C、D中的一个选自碱性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个选自酸性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个是Gly或Ala，以及
L1、L2、L3、L4和L5选自化学键或具有n个氨基酸残基的氨基酸序列，其中n是从0至5的整数。
根据本发明，2个单独氨基酸序列的至少一个优选包括上述鉴定的结构性基序中的至少一个并且优选来源于任何上述分子。本发明所述的这种序列可选自SEQ ID NOs：1-146中的任何序列。在一些实施方案中，2个单独序列中的一个可选自下文鉴定的小组1至12中的一组序列，并且2个单独序列中的另一个可选自另外组的序列。在其它的实施方案中，所述序列可选自相同组的序列。
因此，在一个实施方案中，所述化合物的一个氨基酸序列或所述序列的任一个氨基酸序列可独立地选自第1组的序列：
EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)，
NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)，
ATNRQGKVKAFAHL(SEQ ID NO：3)，
RYVELYWADSQEFQK(SEQ ID NO：4)
VAENSRGKNVAKG(SEQ ID NO：5)，
GEYWCVAENQYGQR(SEQ ID NO：6)，
RLAALNGKGLGEIS(SEQ ID NO：7)，
KYIAENMKAQNVAKEI(SEQ ID NO：8)，
TIMGLKPETRYAVR(SEQ ID NO：9)。
在另一个实施方案中，至少2个肽序列中的至少一个可选自由如下序列组成的第2组的序列
NMGIWVQAENALG(SEQ ID NO：11)，
IWVQAENMLG(SEQ ID NO：12)，
EIWVEATNRLG(SEQ ID NO：13)，
VWVQAANALG(SEQ ID NO：14)，
EVWIEKDPAKGRI(SEQ ID NO：15)，
ATNKGGEVKKNGHL(SEQ ID NO：16)。
在另一个实施方案中，至少2个肽序列中的至少一个可选自由如下序列组成的第3组的序列
KYVELYLVADYLEFQK(SEQ ID NO：17)，
RYVELYVWDNAEFQ(SEQ ID NO：18)，
KYVELVIVADNREFQR(SEQ ID NO：19)，
KYIEYYLVLDNGEFKR(SEQ ID NO：20)，
RYLELYIVADHTLF(SEQ ID NO：21)，
KYVELFIVADDTVYRR(SEQ ID NO：24)，
KFIELFVVADEYVYRR(SEQ ID NO：25)，
KIVEKVIVADNSEVRK(SEQ ID NO：26)，
VELVIVADHSEAQK(SEQ ID NO：27)
另一个实施方案涉及选自由如下序列组成的第4组的序列
VAENSRGKNIAKG(SEQ ID NO：28)，
IAENSRGKNVARG(SEQ ID NO：29)，
AENSRGKNSFRG(SEQ ID NO：30)，
IASNLRGRNLAKG(SEQ ID NO：31)，
IPENSLGKTYAKG(SEQ ID NO：32)，
IAENMKAQNEAK(SEQ ID NO：33)。
在另一个实施方案中，该序列可选自由如下序列组成的第5组的序列
GEYWCVAKNRVGQ(SEQ ID NO：35)，
GSYTCVAENMVGK(SEQ ID NO：36)，
GKYVCVGTNMVGER(SEQ ID NO：37)，
GNYTCWENEYG(SEQ ID NO：38)，
GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO：39)，
QYYCVENGYG(SEQ ID NO：40)，
GEYYQEAEQNGYG(SEQ ID NO：41)，
GNYTCLVENEYG(SEQ ID NO：42)，
GMYQCLAENAYG(SEQ ID NO：43)，
GMYQCAENTHG(SEQ ID NO：44)，
GIYYCLASNNYG(SEQ ID NO：45)，
GGYYCTADNSYG(SEQ ID NO：46)，
GEYQCFARNDYG(SEQ ID NO：47)，
GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO：48)，
GEYQCFARNKFG(SEQ IDNO：49)，
GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO：50)，
GGYYCTADNNYG(SEQ ID NO：51)，
GNYSCEAENAWGTK(SEQ ID NO：52)，
GEYTCLAENSLG(SEQ ID NO：53)，
GEYECVAENGRLG(SEQ ID NO：54)，
GNYTCVVENKFGR(SEQ ID NO：55)，
GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO：56)，
GEYFCVASNPIG(SEQ ID NO：57)，
EYTCIANNQAGE(SEQ ID NO：58)，
GMYQCVAENKHLG(SEQ ID NO：59)，
GEYMCTASNTIGQ(SEQ ID NO：60)，
EYVCIAENKAGEQ(SEQ ID NO：61)，
GDYTLIAKNEYGK(SEQ ID NO：62)，
GFYQCVAENEAG(SEQ ID NO：63)，
GKYECVATNSAGTR(SEQ ID NO：64)，
GEYFCVYNNSLG(SEQ ID NO：65)，
GEYECAATNAHGR(SEQ ID NO：66)，
GAYWCQGTNSVGK(SEQ ID NO：67)，
GTYSCVAENILG(SEQ ID NO：68)。
在另一实施方案中，一个或两个序列选自第6组：
RVAAVNGKGQGDYS(SEQ ID NO：69)，
RVAAINGCGIGPFS(SEQ ID NO：70)，
AVLNGKGLG(SEQ ID NO：71)，
RLAAKNRAGLGE(SEQ ID NO：73)，
RLGWTGKDLGEI(SEQ ID NO：74)。
在另一实施方案中，所述序列可选自第7组：
TVTGLKPETSYMVK(SEQ ID NO：75)，
TITGLQPSTRYRV(SEQ ID NO：77)，
TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO：78)，
TLQGLRPETAYELR(SEQ ID NO：79)，
TLRGLRPETAYELR(SEQ ID NO：80)，
TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO：81)，
TISGLKPDTTY(SEQ ID NO：83)，
TLQGLKPDTAY(SEQ ID NO：84)，
LRGLKPWTQYAV(SEQ ID NO：85)，
IDGLEPDTEYIVR(SEQ ID NO：86)，
LQGLKPWTQYAI(SEQ ID NO：87)，
TITGLEPGTEYTIQ(SEQ ID NO：88)，
GLKPWTQYAV(SEQ ID NO：89)，
TLASLKPWTQYAV(SEQ ID NO：90)，
LMGLQPATEYIV(SEQ ID NO：91)。
在其它的实施方案中，本发明可涉及包括第8、9、10或11组的序列的化合物，其中第8组由下列序列组成
KGMGPMSEAVQFRT(SEQ ID NO：92)，
TLTGLKPDTTYDVK(SEQ ID NO：93)，
ISGLQPETSYSL(SEQ ID NO：94)，
TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO：95)，
TISGLTPETTYSI(SEQ ID NO：96)，
GNYSCLAENRLGR(SEQ ID NO：97)，
GNYTCWENRVG(SEQ ID NO：98)，
NGVLTGYVLRY(SEQ ID NO：101)，
NGVLTGYNLRY(SEQ ID NO：102)，
NGNLTGYLLQY(SEQ ID NO：103)，
VDENGVLTGYKIYY(SEQ ID NO：104)，
THNGALVGYSVRY(SEQ ID NO：105)，
NGILTEYILKY(SEQ ID NO：106)，
NGILIGYTLRY(SEQ ID NO：107)，
THSGQITGYKIRY(SEQ ID NO：108)，
NGKITGYIIYY(SEQ ID NO：109)，
NGILTEYTLKY(SEQ ID NO：111)，
LDPNGIITQYEISY(SEQ ID NO：112)，
NGKITGYIIYY(SEQ ID NO：113)，
第9组由下列序列组成
HLEVQAFNGRGSGPA(SEQID NO：114)，
HLTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO：115)，
HLSVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO：116)，
HLAVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO：117)，
NLEVRAFNSAGDGP(SEQ ID NO：118)，
HLTVLAYNSKGAGP(SEQ ID NO：119)，
LRVLVFNGRGDGP(SEQ ID NO：120)，
HIDVSAFNSAGYGP(SEQ ID NO：121)，
HLAVELFNGR(SEQ ID NO：122)，
LELQSINFLGGQPA(SEQ ID NO：123)，
HFTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO：124)，
HLEVQAFNGRGSQPA(SEQ ID NO：125)，
第10组由下列序列组成
VIADQPTFVKYLIK(SEQ ID NO：126)，
TIKGLRPGWYEGQ(SEQ ID NO：127)，
TLDDLAPDTTYLVQ(SEQ ID NO：129)，
TVSDVTPHAIYTVR(SEQ ID NO：130)，
IIRGLNASTRYLFR(SEQ ID NO：131)，
TLMNLRPKTGYSVR(SEQ ID NO：132)，
TLTGLKPGTEYEVR(SEQ ID NO：133)，
RVTGLTPKKTYEFR(SEQ ID NO：135)，
LTGLKPGTEYEFR(SEQ ID NO：136)，
以及第11组由下列序列组成
EVRVQAVNGGGNGPP(SEQ ID NO：137)，
LIKVVAINDRGE(SEQ ID NO：138)，
WSIIAVNGREE(SEQ ID NO：139)，
WSVYAQNQNGE(SEQ ID NO：140)，
TISLVAEKGRHK(SEQ ID NO：141)，
HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO：142)，
HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO：143)，
HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO：144)，
EFRVRAVNGAGEG(SEQ ID NO：145)，
在一些实施方案中，该化合物可包括选自第12组序列的序列：
KYVEMFVWNHQRFQ(SEQ ID NO：22)，
RYVELFIWDKERY(SEQ ID NO：23)，
ALNGQGLGATS(SEQ ID NO：72)，
TLTGLKPSTRYRI(SEQ ID NO：76)，
TVSGLKPGTRY(SEQ ID NO：82)，
GTYHCVATNAHG(SEQ ID NO：99)，
LSHNGVLTGYLLSY(SEQ ID NO：100)，
LSHNGIFTLY(SEQ ID NO：110)，
TLTELSPSTQYTVK(SEQ ID NO：128)，
GPEHLMPSSTYVAR(SEQ ID NO：134)，
VARVRTRLAPGSRLS(SEQ ID NO：146)。
或
QFIAENMKSHNETKEV(SEQ ID NO：34)。
本发明也涉及具有SEQ ID NOS：1-146所示预定序列长度的至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％的上述肽序列的片段，其中片段和所述预定序列之间的氨基酸序列同源性是100％。本文中的变体定义为与选自SEQ ID NOS：1-146的序列具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选95％同源性的氨基酸序列，或与选自SEQ IDNOS：1-146的序列相比具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选95％正性氨基酸相匹配的氨基酸序列。正性氨基酸相配定义为2个比较序列中具有相同位置的氨基酸的物理和/或化学特性所限定的同一性或相似性。本发明优选的正性氨基酸相配是K至R、E至D、L至M、Q至E、l至V、l至L、A至S、Y至W、K至Q、S至T、N至S以及Q至R。将一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同源性定义为2个排序序列中相同氨基酸的百分比。本文中同系物定义为与SEQ ID NOS：1-146所示的任何序列具有小于60和大于19％，例如50-59％，例如55％，例如40-49％，例如45％，例如30-39％，例如35％，例如20-29％，例如25％同源性的氨基酸序列，其保持预定序列的一些物理特性，例如三维结构或一些功能特性，例如与另一个分子，特别是受体分子相互作用的能力。本文中同系物的变体定义为与选自SEQ ID NOS：1-146的任何序列的同系物相比具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选95％正性氨基酸相匹配的氨基酸序列。正性氨基酸相匹配的优选实施方案如上述所限定的。本发明涉及保持了预定序列与下文限定的细胞-表面受体相互作用能力的片段、变体和同系物。
在本发明的一个优选实施方案中，选择的序列是EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中优选的序列是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)。
根据本发明，该化合物可包括选自上述序列(SEQ ID NO：1-146)中任何的至少2个不同的单独肽序列。该化合物还可包括具有与选自任何上述序列的氨基酸序列相同的2个单独的序列。
在一个优选的实施方案中，该化合物包括2个相同的单独肽序列，其中该序列是EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO：1)。在另一个优选的实施方案中，该化合物包括2个相同的单独肽序列，其中该序列是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)。在另一个优选的实施方案中，该化合物包括2个不同的单独肽序列，其中该序列中的一个是EVYVVNAENQQGKSKA(SEQ ID NO：1)，而另一个是NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)。其它优选的实施方案包括包含2个单独氨基酸序列的化合物，该氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或2的片段、变体或同系物，其中所述的片段、变体和同系物如上述所限定。在优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的片段、同系物或变体选自上述鉴定的第1、6、11和12组的SEQ ID NOs：3-9、69-74、100、125和137-146的序列，而SEQ ID NO：2的片段、同系物或变体选自上述鉴定的第7、9和10组的SEQID NOs：75-91、114-123、126-132的序列。
在一个实施方案中化合物的2个单独氨基序列中的至少一个基本上包括或由两个或多个由一个肽链中的肽键共连接的SEQ ID NOS：1-146的连续肽序列组成。在其它的实施方案中，共连接的肽序列可以是相同的，例如SEQ ID NO：1在一个肽链中重复2至5次，或例如SEQ ID NO：2在肽链中重复2至5次，或例如序列SEQ ID NO：3-146中的任何序列在肽链中重复2至5次由此形成由相同单体组成的低聚物(多聚体)。在其它的实施方案中形成低聚物的肽片段单体可在氨基酸序列方面有差异，例如在由2个单体组成的低聚物(二聚体)中，其中一个具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而另一个具有SEQ ID NO：2，或SEQ ID NOS：3-146所示序列组的任何氨基酸序列。根据本发明，低聚物(多聚体)可由2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列(单体)组成。
由2个单独肽序列组成的化合物通过接头相互连接，其中所述的单独肽序列中的每一个是SEQ ID NOS：1-146中任何序列的单个拷贝，这是本发明优选的化合物。更优选的化合物中2个单独肽序列中的每一个是SEQID NO：1的序列，或化合物中2个单独肽序列中的每一个是SEQ ID NO：2的序列。
化合物中单独肽序列的方向可以是N至C，C至N或是混合的。措辞″N至C方向″是指2个单独的序列通过其N-末端氨基酸残基与接头相连，例如结构(COOH)肽序列(NH2)-接头-(NH2)肽序列(COOH)的化合物。措辞″C至N方向″是指2个预定的序列通过其C-末端氨基酸残基与接头相连，例如结构(NH2)肽序列(COOH)-接头-(COOH)肽序列(NH2)的化合物。术语″混合的方向″是指2个预定的序列通过其C末端氨基酸残基或N-末端与接头相连，例如一个肽序列通过其N-末端氨基酸残基而另一个通过其C-末端氨基酸残基，例如作为类型：(NH2)肽序列(COOH)-接头-(NH2)肽序列(COOH)的化合物。
1.3同类物
根据本发明，化合物的2个单独的肽序列通过接头相连接。根据本发明，接头分子选自非手性的二-、三-或四羧酸，所述的酸具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立地是从1至20的整数，
X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p、其中p是0或从1至20的整数，
A和B独立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分。
术语C1-10烷基是指具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基和叔丁基。
术语C2-10链烯基是指具有2-10个碳原子的直链或支链链烯基基团，例如乙炔基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
术语环状部分是指环己烷和环戊烷。
术语芳香族部分是指苯基。
措辞″A和B形成环状的、杂环的或芳香族部分″表示环己烷、哌啶、苯和吡啶。
根据本发明，使包括两个或多个上述限定的氨基酸序列的2个单独的肽序列相互连接以便这2个肽序列中的一个共价结合选自上述限定分子的接头分子的2个羧基中的一个，而另一个肽序列共价结合所述接头分子的另一个羧基。肽序列分别通过N-或C末端氨基酸残基的氨基或羧基基团共价结合接头。
因此，本发明的化合物具有通式
COOH/CONH2-肽序列-NH-CO-接头-CO-NH-肽序列-COOH/CONH2或NH2-肽序列-CO-NH-接头-NH-CO-肽序列-NH2。
2.化合物的生产
2.1单独的肽序列的生产
可通过任何常规的合成方法、重组DNA技术、该肽序列所来源的全长蛋白质的酶促裂解，或所述方法的组合来制备本发明的肽序列。
重组制剂
因此，在一个实施方案中使用重组DNA技术生产本发明的肽。
可通过已建立的标准方法合成制备编码肽或该肽所来源的相应全长蛋白质的DNA序列，例如由Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1869所描述的磷酸脒方法，或由Matthes等人，1984，EMBO J.3：801-805所描述的方法。根据磷酸脒方法，例如在自动的DNA合成仪中合成寡核苷酸，使其纯化、退火、连接和克隆到合适的载体中。
也可通过断裂编码肽起源的相应全长蛋白质的DNA序列，根据标准方法利用DNA酶I制备编码肽的DNA序列(Sambrook等人，Molecularcloning：A Laboratory manual.2 rd ed.，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本发明涉及选自上述鉴定的蛋白质组的全长蛋白质。备选地可利用特异的限制内切核酸酶使本发明的编码全长蛋白质的DNA变成片段。进一步利用Sambrook等人，分子克隆：A Laboratory manual.2rd ed.，CSHL Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所描述的标准方法纯化DNA的片段。
编码全长蛋白质的DNA序列也可具有基因组或cDNA起源，例如根据标准技术通过制备基因组或cDNA文库，以及利用合成的寡核苷酸探针杂交筛选编码全部或部分全长蛋白质的DNA序列而获得(cf.Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)。例如如US 4,683，202或Saiki等人，1988，Science 239：487-491所描述的，也可利用特异的引物通过聚合酶链式反应制备DNA序列。
然后将DNA序列插入重组的表达载体，其可以是任何载体，其可便利地经受重组DNA方法。载体的选择经常依赖于其将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组中并与已经整合进入其中的染色体一起复制的载体。
在载体中，编码肽或全长蛋白质的DNA序列应可操作地与合适的启动子序列连接。启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示转录活性并且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于在哺乳动物细胞中指导编码DNA序列转录的合适启动子的实例是SV 40启动子(Subramani等人，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等人，1983，Science 222：809-814)或腺病毒2的主要晚期启动子。用于昆虫细胞的合适启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan等人，1992，FEBS Lett.311：7-11)。用于酵母宿主细胞的合适启动子包括来自酵母糖分解基因(Hitzeman等人，1980，J.Biol.Chem.255：12073-12080；Alber和Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1：419-434)或乙醇脱氢酶基因(Young等人，1982，in Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals，Hollaender等人，eds.，Plenum Press，纽约)、或TPI1(US 4,599，311)或ADH2-4c(Russell等人，1983，Nature 304：652-654)启动子的启动子。用于丝状真菌宿主细胞的合适启动子是例如ADH3启动子(McKnight等人，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
也可将编码DNA序列与合适的终止子可操作连接，例如人生长激素终止子(Palmiter等人，op.cit.)或(用于真菌宿主)TPI1(Alber和Kawasaki，op.cit.)或ADH3(McKnight等人，op.cit.)终止子。载体可进一步包括例如多聚腺苷酸信号(例如来自SV 40或腺病毒5 Elb区域)、转录增强序列(例如SV 40增强子)和翻译增强序列(例如编码腺病毒VA RNAs元件)的元件。
重组表达载体可进一步包括能够使载体在所述的宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的实例(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是复制的SV40原点。载体也可包括可选择的标记，例如其产物补充宿主细胞中缺陷的基因，例如编码二氢叶酸还原酶的基因(DHFR)或赋予药物抗性的基因，例如新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。
用于连接分别编码肽或全长蛋白质、启动子和终止子的DNA序列，以及将其插入包含为复制所必需的信息的合适载体的方法是本领域的技术人员所公知的(参照，例如，Sambrook等人，op.cit.)。
为了获得本发明的重组肽，可将编码的DNA序列与第二个肽编码序列和蛋白酶裂解位点编码序列有效融合，产生编码融合蛋白质的DNA结构，其中将蛋白酶裂解位点编码序列置于HBP片段和第二个肽编码DNA之间，将其插入重组表达载体，并且在重组的宿主细胞中表达。在一个实施方案中，所述的第二肽选自但不限于谷胱甘肽-S-还原酶、小牛胸腺素、细菌硫氧还原蛋白或人泛素天然的或合成的变体、或其肽。在另一个实施方案中，包括蛋白酶裂解位点的肽序列可以是具有氨基酸序列IEGR的因子Xa、具有氨基酸序列DDDDK的肠激酶、具有氨基酸序列LVPR/GS的凝血酶、或具有氨基酸序列XE裂解位点的水解无色杆菌(Acharombacter lyticus)。
被导入表达载体的宿主细胞可以是能够表达肽或全长蛋白质的任何细胞，并且优选为真核细胞，例如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞，例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系的实例是HEK293(ATCCCRL-1573)、COS(ATCCCRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632，ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞并且表达被导入细胞的DNA序列的方法在例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等人，1978，Cell 14：725；Corsaro和Pearson，1981，in Somatic Cell Genetics 7，p.603；Graham and vander Eb，1973，Virol.52：456；和Neumann等人，1982，EMBO J.1：841-845中有描述。
备选地，真菌细胞(包括酵母细胞)可用作宿主细胞。合适的酵母细胞的实例包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的细胞。其它真菌细胞的实例是丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)或脉孢菌(Neurospora spp.)，特别是米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的细胞。在例如EP 238 023中描述了曲霉用于蛋白质表达的用途。
用于培养细胞的培养基可以是适于使哺乳动物细胞生长的任何常规培养基，例如含有适当添加物的含有血清或无血清的培养基，或用于使昆虫、酵母或真菌细胞生长的合适培养基。可从商业供应商获得合适的培养基或可根据公开的处方(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)制备合适的培养基。
然后可从培养基中通过常规方法回收由细胞重组产生的肽或全长蛋白质，包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，通过例如硫酸铵的盐方法沉淀上清液或滤出液的蛋白质成分，通过多种色谱分析方法，例如HPLC、离子交换色谱法、亲和色谱法等进行纯化。
合成的制剂
用于合成生产肽的方法是本领域公知的。可在Synthetic Peptides：AUser′s Guide(Advances in Molecular Biology)，Grant G.A.ed.，OxfordUniversity Press，2002中，或在Pharmaceutical Formulation：Development ofPeptides and Proteins，Frokjaer and Hovgaard eds.，Taylor和Francis，1999中发现生产合成肽的详细说明以及实际建议。
可例如利用Fmoc化学和Acm-保护的半胱氨酸合成肽。纯化后通过反相HPLC进一步加工肽以获得例如环状或C-或N-末端修饰的同工型。用于环化和末端修饰的方法是本领域已知的并且在上述引用的手册中有描述。
在优选的实施方案中，合成生产，特别地通过序列辅助的肽合成(SAPS)方法生产本发明的肽序列。
序列辅助的肽合成(SAPS)
可在装备有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯导管中分批合成肽，或以连续流动形式的聚酰胺固相法合成肽(Dryland，A.和Sheppard，R.C.，(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，125-137.)，其在完全自动的肽合成仪上利用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)作为N-a-氨基保护基以及用于侧链功能的合适共有保护基团而实现。
下列是当使用SAPS用于合成本发明的肽片段时可能有用的化合物的列表以及方法的描述。
化合物和方法
1.溶剂
可使DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedelde-Haen，德国)经过用强阳离子交换树脂填充的柱子，例如Lewatit S 100MB/H强酸，Bayer AG Leverkusen，德国进行纯化，并且如果存在游离的胺则在使用前通过加入3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-Oli)产生黄色(Dhbt-O-阴离子)来分析游离的胺。
可直接使用DCM(二氯甲烷，分析纯级，Riedelde-Maen，德国)而不用纯化。
2.氨基酸：
Fmoc-保护的氨基酸和相应的五氟代苯基(Pfp)酯可从MilliGen，英国、NovaBiochem，瑞士、和Bachem，瑞士购买，并且来自NovaBiochem，瑞士的Dhbt-酯是合适的侧链保护形式。
Boc保护的氨基酸可从Bachem，瑞士购买。
3.偶连试剂
二异丙基碳二亚胺(DIC)可从RiedeIde-Hen，德国购买并在使用前进行蒸馏。
二环己基碳二亚胺(DCC)可从Merck-Schuchardt，Niinchen，德国购买并通过蒸馏纯化。O-苯并三嗪基-N，N，N″，N″-四甲基脲阳离子四氟化碳(TBTU)(PerSeptive Biosystems Gmbtl Hamburg，德国)。
4.接头
HMPA，Novabiochem，瑞士；
4-羟甲基苯甲酸，Novabiochem；
4-甲氧基扁桃酸，Aldrich，德国；
HMPB，Novabiochem；AM，Novabiochem；
3-(4-羟甲基苯氧基)丙酸，Novabiochem，使其作为以DIC方式产生的预先1-羟基苯并三唑(HObt)酯与树脂偶连。
可直接使用外消旋的4-甲氧基扁桃酸(98％纯，Aldrich，德国)作为接头或通过用(+)-辛可宁碱(85％纯，Aldrich，德国)处理分解，产生旋光的接头(+)-4-甲氧基扁桃酸、la×20＝+146(水)，其光学纯度为95.8％，以及(-)-4-甲氧基扁桃酸，[al20＝-128.6(水)，光学纯度为88.1％。将(+/)-4-甲氧基扁桃酸(A.Me Kenzie，D.J.C.Pirie，(1936)，Berichte 69，868；E.Knorr，(1904)，Berichte 37，3172).(+/-)-4-甲氧基扁桃酸(10g，54.89mmol；Aldrich，98％)的溶解物溶于500ml热水(60-80℃)，轻轻倒出溶液并保持温热以除去不溶解的杂质。在60-80℃搅拌15分钟并在冰中冷却后溶液变得澄清。1h后通过过滤收集沉淀并在干燥器中干燥过夜，产生9.9g辛可宁碱盐。从沸水(80ml)再结晶盐；轻轻倒出溶液同时保持温热然后在冰中冷却。1h后过滤收集沉淀，用冷水洗涤3次，并且在干燥器中干燥过夜产生7.84g(16.45mmol)。将辛可宁碱盐(2g，4,2mmol)溶于40ml 2NHCl并且立刻用3×30ml二乙醚进行提取。用Na2SO4干燥并且蒸干乙醚相产生0.55g 4-甲氧基扁桃酸。评估释放的4甲氧基扁桃酸的光学纯度为18.5％([a]D20＝+270)。辛可宁碱盐的第二次再结晶后，再释放扁桃酸，如上所述评估光学纯度为69.0％([a]D20＝+100.80)。第三次再结晶后产生95,8％的光学纯度([a]D20＝4140.00)。
5.固相支持物
在3种不同类型的固相支持体上利用在DMF中的0.05M或更高浓度Fmoc-保护的活化氨基酸合成根据Fmoc-策略产生的肽。
1)PEG-PS(接枝于聚苯乙烯的聚乙二醇；TentaGel S NH2树脂，0.27mmol/g，Rapp Polymere，德国或NovaSyn TG树脂，0.29mmol/g，Novabiochem，瑞士)；2)PepSyn凝胶(用肌氨酸甲酯功能化的聚二甲基丙烯酰胺树脂，1.0mmol/g；MilliGen，英国)。
3)PepSyn K(硅藻土支持的用肌氨酸甲酯功能化的聚二甲基丙烯酰胺树脂，0.11mmol/g；MilliGen，英国)。
可在附着有第一个氨基酸的Merrifield-树脂(聚苯乙烯二乙烯基苯)(Novabiochem，瑞士)上合成根据Boc-策略合成的肽。
6.催化剂和其它试剂
可从Aldrich，德国购买二异丙基乙胺(DIEA)，乙二胺来自Fluka，瑞士，哌啶来自Riedel-de When，法兰克福，德国。
4-(N，N-二甲氨基)吡啶(DMAP)可从Fluka，瑞士购买并且用作涉及对称酸酐的偶联反应中的催化剂。
3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并-三嗪(Dhbt-OH)可从Fluka，瑞士获得，
I-羟基苯并三唑(HObt)来自NovaBiochem，瑞士。
7.偶连方法
第一个氨基酸作为产生自适当的N-cc-保护的氨基酸和DIC的DMF中的对称酸酐进行偶连。下列氨基酸作为从适当的N-保护的氨基酸和通过DIC方式或DMF中的TBTU制备的Pfp-或Dhbt-酯或预先HObt酯进行偶连。在Fmoc情况下通过在80℃进行茚三酮试验检验所有的酰化作用以免在测试期间Fmoc去保护。
8.N-末端氨基酸-氨基(N-a-氨基)保护基的去保护。
通过用DMF中的20％哌啶(当分批合成时1×3以及1×7min)处理或使去保护溶剂通过树脂(利用连续流动合成，10min，流速1ml/min)来进行Fmoc基团的去保护，然后用DMF洗涤直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后检测不到黄色(Dhbt-O-)。通过用DCM中的TFA处理10×1.5min和1×20min，然后每次用DCM洗涤6×9min，每次用DCM中的10％三乙胺(v/v)中和2×1.5min，然后用DCM洗涤6×9min进行Boc基团的去保护。
9.用酸从树脂切割肽。
通过用95％的三氟乙酸(TFA，Halocarbon Products Corporation，美国；Biesterfeld & Co.Hamburg，德国)-水v/v于r.t.处理2h从树脂切割肽。用95％TFA-水洗涤过滤的树脂并且在减压下蒸发滤出液和洗涤液。用乙醚洗涤残余物并从乙酸-水冷冻干燥。通过高效液相色谱(HPLC)分析粗制的冷冻干燥产物并通过飞行质谱(MALDI TOF MS)或电喷射电离作用质谱(ES-MS)的基质辅助的激光脱吸附电离时间进行鉴定。
10.用碱从树脂切割肽。
用1M氢氧化钠(10ml)于4℃处理干燥的树脂(1g)并且在室温下放置15min。将树脂过滤到含有10％含水乙酸的培养瓶中。通过冻干法并经受凝胶过滤来分离所述肽。
11.用TFMSA从树脂切割肽。
将干燥的树脂(250mg)置于具有搅拌棒的圆底烧瓶中。加入苯硫基甲烷/乙烷二硫酚(ethanedithiol)(2∶1，750FII)，在冰中冷却混合物，加入5ml TFA并且搅拌混合物5-10min。逐滴加入TFMSA(500KII)并且在室温下(r.t.)继续反应30-60min。加入乙醚后沉淀所述肽。
12.侧链保护基的去保护
优选地，使侧链去保护同时从树脂切割下肽。
13.预先形成的HObt-酯
方法a.
将3eq.的N-a-氨基保护的氨基酸与3eq.的HObt和3eq的DIC一起溶于DMF。将溶液在r.t.放置10分钟然后加入树脂，该树脂已经在加入预活化的氨基酸前用在DMF中的0.2Dhbt-OH溶液洗涤。
方法b.
将3eq.的N-a-氨基保护的氨基酸与3eq.的HObt，3eq的TBTU和4,5eq.的DIEA一起溶于DMF。将溶液放置在r.t.5分钟然后加入树脂。将预制的对称酸酐6eq.N-u-氨基保护的氨基酸溶于DCM并冷却至0℃。加入DCC(3eq.)使反应继续10min。真空除去溶剂，将剩余物溶于DMF。过滤溶液并立刻加入树脂然后加入0.1eq.的DMAP。
14.评估第一个N-a-氨基保护的氨基酸的偶连产率
用5ml DMF中的20倍哌啶于r.t.处理3-5mg干燥Fmoc-保护的肽-树脂10min，并且在301nm评估二苯并富烯哌啶(dibenzofulvenepiperidine)加合物的UV吸收。利用基于Fmoc-Ala-OH标准计算的附加系数(extensioncoefficient)e 301测定产率。在Boc-保护情况下，在除去Boc基团后根据茚三酮-方法评估偶连(Sarin，V.K.等人，(1981)，Anal.Biochem，117，147-157)。
15.在PepSyn K树脂上合成肽
通过乙二胺覆盖干燥的PepSyn K(大约500mg)并在rt放置过夜。
排干树脂并且用DMF 10×15ml洗涤，每次5min。排干后用DMF中的10％DIEA v/v洗涤树脂(2×15ml，每次5min)，并且最后用DMF洗涤直到向排干的DMF添加Dhbt-OH仍检测不到黄色。将3eq.的HMPA、3eq.的HObt和3eq.的DIC溶于10ml DMF并放置活化10min，其后将混合物加入树脂并且继续偶连24h。排干树脂并用DMF(10×15ml，每次5min)洗涤，通过茚三酮试验检验酰化作用。第一个氨基酸偶连为侧链保护的预先形成的对称酸酐(参见上文)，如上所述评估偶连产率。在所有情况中都超过70％。然后以如下所述的″连续的-流动方式″或″分批方式″继续合成。
16.在PepSyn K上利用连续的流动技术合成延伸的肽。
将附着第一个氨基酸的树脂(大约500mg)置于连接到完全自动的肽合成仪的柱子中。如上所述使Fmoc基团去保护。使剩余的该序列所述的氨基酸偶连为Fmoc-保护的，如果需要保护侧链，Pfp酯(3eq.)中加入Dhbt-OH(leq.)。通过分光光度监测Dhbt-OH阴离子的黄色消失，自动测定每个偶连的终点。完成合成后，用DMF(10min流速1ml/min)、DCM(3×5ml，每次3min)，最后用二乙醚(每次3×5ml)洗涤肽-树脂，从柱子移出并且在真空中干燥。
17.PepSyn K上继续进行分批肽合成。
将附着第一个氨基酸的树脂(大约500mg)置于装备有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯导管中，如上所述使Fmoc-基团去保护。使剩余的该序列所述的氨基酸偶连为预先Fmoc保护的，如果需要保护侧链，如上所述在DMF(5ml)中制备HObt酯(3eq.)。除非另作说明继续该偶联2h。然后通过DMF洗涤(12min，流速1ml/min)除去过量的试剂。通过在80℃进行茚三酮试验检验所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(10min流速1ml/min)、DCM(5×5ml，每次1min)，最后用二乙醚(5×5ml，每次1min)洗涤肽-树脂，并且在真空中干燥。
18.PEG-PS上的分批肽合成。
将TentaGel S NH2或NovaSyn TG树脂(250mg，0.27-0.29mmol/g)置于装备有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯导管中。使树脂在DMF(5ml)中膨胀，并用DMF中的20％哌啶处理以保证在树脂上存在未保护的氨基。排干树脂并用DMF洗涤直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后检测不到黄色。将HMPA(3eq.)偶连为如上所述的预先形成的HObt-酯，并且使偶连继续24h。排干树脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗涤，通过茚三酮试验检验酰化作用。如上所述将第一个氨基酸偶连为预先形成的对称酸酐。如上所述评估第一个Fmoc-保护的氨基酸的偶连产率。在所有情况中都超过60％。该序列所述的下列氨基酸偶连为预先Fmoc保护的，如果需要保护侧链，如上所述制备HObt酯(3eq.)。继续该偶联2h。排干树脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗涤，以除去过量的试剂。通过在80℃进行茚三酮试验检验所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×5ml，每次5min)、DCM(3×5ml，每次1min)，最后用二乙醚(3×5ml，每次1min)洗涤肽-树脂，并且在真空中干燥。
19.PepSyn凝胶上的分批肽合成
将干燥的PepSyn凝胶树脂(500mg，1mmol/g)置于装备有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯导管中。使树脂在乙二胺(15ml)中膨胀并通过摇动轻轻搅拌20h。排干树脂并且用DMF(10×15ml，每次5min)洗涤。排干后用DMF中的10％DIEA v/v洗涤树脂(2×15ml，每次5min)，最后用DMF(5×15ml，每次5min)洗涤直到向排干的DMF添加Dhbt-OH后检测不到黄色。将HMPA(3eq.)偶连为如上所述的预活化的HObt-酯(方法a)，并且使偶连继续24h。排干树脂并且用DMF(10×15ml，每次5min)洗涤。通过茚三酮试验检验酰化作用。如上所述将第一个氨基酸偶连为预先侧链保护的对称酸酐。如上所述评估第一个Fmoc保护的氨基酸的偶连产率。在所有情况中都超过70％。使该序列所述的剩余氨基酸偶连为预先Fmoc保护的，如果需要保护侧链，如上所述制备HObt酯(3eq.)(方法a)。继续偶联2h，必要时进行双重偶连过夜。排干树脂并用DMF(5×5ml，每次5min)洗涤，以除去过量的试剂。通过在80℃进行茚三酮试验检验所有的酰化作用。如上所述使Fmoc基团去保护。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5min)、DCM(3×15ml，每次2min)，最后用二乙醚(3×15ml，每次2min)洗涤肽-树脂，并且在真空中干燥。
19HPLC。
可在装备有具有Waters Radial Pak 8×100mm C18反相柱的Waters 996光电二极管阵列检测器的Waters 600E仪器上进行HPLC。缓冲液A是在水中的0.1vol％TFA，缓冲液B是90vol％乙腈，9.9vol％水和0.1vol％TFA。使缓冲液以1.5ml/min的流速泵出经过柱子，其中利用下列梯度：：0％-70％B的线性梯度(20min)，70-100％B的线性梯度(1min)，恒溶剂的100％B(5min)。2.恒溶剂的0％B(2min)，0-50％B的线性梯度(23min)，50-100％B的线性梯度(5min)，恒溶剂的100％B(5min)。
2.2化合物的LPA生产
根据本发明优选通过LPA方法获得令人感兴趣的化合物。
LPA方法
在WO 00/18791中公开了LPA方法。该方法基本上包括下列步骤：
(a)通过固相合成或片段偶连提供包括所需要序列的肽片段，该肽片段附着于固相；
(b)必要时，使任何N-末端氨基去保护，同时肽片段仍然附着于固相，
(c)使具有未保护N-末端基团的肽片段与非手性的二-三-或四羧酸起反应以提供具有环状结构的构建体，以及
(d)从固相切下该构建体以提供包括具有游离C-末端基团的该肽片段的LPA。
上述方法中，在步骤(d)前可进行下列步骤：
(c1)如果存在，使来源于步骤(c)中所使用的羧酸的任何N-保护基去保护，
(c2)继续固相合成或片段偶连以提供包括具有至少一个N-保护氨基末端氨基酸基团和/或附着的化学部分的所需要序列的肽片段，以及
(c3)如果存在，使任何N-末端氨基(在步骤(d)之前或之后)去保护。
本方法提供i.a.LPAs提供本发明具有N至C方向的所需要的序列(步骤(c))。以及同时提供具有C至n方向的序列(步骤(c2))。
因此，为了获得本发明的化合物，将附着于固相的2个肽链通过非手性的二-、三-或四羧酸方式进行组装。
用于本方法的合适的非手性二-、三-或四羧酸具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立地是从1至20的整数，X是HN，A和B独立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分。
在另一个实施方案中，用于本方法的合适的非手性二-、三-或四羧酸具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立地是0或从1至20的整数，X是H2N(CR2)pCR、或RHN(CR2)pCR，其中p是0或从1至20的整数，其中每个R是H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分。
在另一个实施方案中，用于本方法的合适的非手性二-、三-或四羧酸具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立地是0或从1至20的整数，X是HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，其中p是0或从1至20的整数，每个R独立地是H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分。
在另一实施方案中，用于本方法的合适的非手性二-、三-或四羧酸具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立地是0或从1至20的整数，X是H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p，其中p是0或从1至20的整数，每个R独立地是H、或取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分。
术语C1-10烷基是指具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基和叔丁基。
术语C2-10链烯基是指具有2-10个碳原子的直链或支链烯基基团，例如乙炔基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
术语环状部分是指环己烷和环戊烷。
术语芳香族部分是指苯基。
措辞″A和B形成环状、杂环或芳香族部分″表示环己烷、哌啶、苯和吡啶。
通过与羧酸起反应，获得类型
X(CO-序列)2-固相
的构建体，其中如上述限定X。
术语″序列″在本文中是指包括天然存在和/或非天然存在的氨基酸的肽、PNA-序列、或肽模拟物。″天然存在的氨基酸″是指在自然界中发现的L-和D-形式的20种氨基酸。非天然存在的氨基酸是例如修饰过的天然存在的氨基酸。术语序列进一步是指包括一个或多个这种序列。合适的肽模拟物的实例在Marshal G.R.，(1993)Tetrahedron，49：3547-3558中有描述。术语″化学部分″表示增强LPA的溶解度或生物活性的实体，和用于指导LPA到达其靶或标志物的实体。用于序列的优选实施方案如上所述。
基团X容许直接或间接地延续相同序列或一个或多个不同序列和/或部分的分步合成或片段偶连。LPA中肽片段的方向(N至C或C至N)定义为根据需要确定。在一个实施方案中，本发明描述了具有N至C方向的LPAs，在另一个实施方案中，本发明涉及同时具有N至C和C至N序列表示的化合物，而在另一实施方案中该序列具有C至N的方向。
在X包括临时保护的氨基功能的情况中，可直接在保护后进行合成或偶连。可利用半-当量的羧基酸保证所有含有羧基的基团的合适活化以提供环状系统的有效形成(在步骤(c)中，参见上文)。在三-或四羧酸的情况下，可用二胺，例如乙二胺或用于进一步反应的，例如巯基、含氧的基团、氧代基团或羧基的适当功能化的胺使活化的羧基进一步衍生化。在二胺的情况下，可根据所需要的序列或化学部分直接延续肽合成或片段偶连。在优选的实施方案中，使用fmoc保护策略，但可根据合成或偶连策略使用任何氨基保护基团。实例是Boc-保护基团策略。
因为用一个或在双官能化学部分的情况下用具有2个氨基酸基团的这种赖氨酸进行延续的分步合成或片段偶连，已经令人惊讶地发现与通过MAP合成获得的常规四聚合赖氨酸树枝状聚合物相比可获得更好的结果。此外，最佳的肽合成方法或偶连方法可用于附着于固相的单链，并且可在形成LPA前检验其均一性。可通过标准的肽合成方法同时进行固相切割和侧链去保护(如上所述)。因此可获得具有最佳的和清楚的组合物的最终产物。如果期望或需要，可容易地通过标准色谱法，例如HPLC或凝胶过滤来进行纯化。
用于提供环状结构的有利的二-、三-和四羧酸可选自亚氨基双乙酸、2-氨基丙二酸、3-氨基戊二酸、3甲氨基戊二酸、3-氯谷氨酸、3-甲氧基羰基戊二酸、3-乙酰基戊二酸、戊二酸、丙三羧酸、3，4-双-羧甲基己二酸、4-(2-羧乙基)-庚二酸、(3，5-双-羧甲基-苯基)-乙酸、3，4-双-羧甲基己二酸、苯-1，2，4，5-四羧酸、4-(3-羧基-烯丙氨基)-丁基-2-烯醇酸、4，4-亚氨基-二苯甲酸、1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸、5-氨基间苯二甲酸、2-氯丙二酸、3-羟基戊二酸、和苯-1，3，5-三羧酸。
可根据标准方法进行片段偶连(片段结合或片段缩合)，例如如PeptideSynthesis protocols，Methods in Molecular Biology Vol.，Chapter 15，303-316Nyfeler R，Pennington MW和Dunne BM Eds.，Humana Press，1994所描述的。因此，可在固相上合成片段，从固相切割具有完全保护基保护的片段，如上所述进行纯化和表征。也可经过如上所述的其它技术获得合适的片段。
本发明的优选实施方案是使用上述的LPA方法用于生产本发明的化合物。
3.生物活性
根据本发明，该化合物可通过位于化合物肽序列内的结合位点结合和调节细胞表面受体的活性，所述的结合位点包括通式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
的至少一个氨基酸序列，其中
A、B、C、D中的一个选自疏水性的氨基酸残基，
A、B、C、D中的一个选自碱性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个选自酸性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个是Gly或Ala，以及
L1、L2、L3、L4和L5选自具有n个氨基酸残基的化学键或氨基酸序列，其中n是从0至5的整数。
因此，具有4至80个氨基酸残基长度、包括上述受体结合结构性基序的所有肽序列都属于本发明的范围。肽序列的优选实施方案如上所述。在优选的实施方案中本发明涉及包括2个单独序列的化合物，所述序列的每一个包括上述基序并且能够结合FGFR。
受体
因此，本发明的化合物是受体的配体，特别是功能性的细胞-表面受体的配体。
在本发明的内容中，细胞-表面受体定义为包括至少一个多肽链的任何分子，所述的分子与细胞的质膜相缔合，其结合方式使得所述的分子能够在膜外侧接受信号，通过膜转导信号，并且进一步通过诱导细胞内部分子水平的特定作用传送所述的信号，例如诱导分子复合物的结合或解离，或引发生化反应，例如受体的自体磷酸化，或受体的蛋白水解切割来导致胞内信号转导的开始。
本发明涉及功能性的细胞-表面受体。″功能性的细胞-表面受体″是指本发明的细胞-表面受体具有配体的可识别基团，这些配体与受体的结合诱导胞内信号转导，其引起细胞的生理反应。生理反应，例如细胞的分化、增殖、存活、细胞程序性死亡或运动，依赖于涉及与受体相互作用的配体，和/或所述相互作用的特征，例如亲合性或持续时间，和/或表达该受体的细胞的种类。术语″配体″定义为能够结合受体并由此活化或抑制所述受体的化合物。受体的″活化″是指胞外结合配体后，所述受体变得能够将″配体结合″的效力传送进入生化反应级联，其统称为细胞内部的″受体信号传导″或″信号转导″，可引起上述的细胞生理学应答。受体的″抑制″是指胞外结合配体后，受体变得″沉默″或″失活″，而不再能引发通常启动应答受体配体结合的生化反应级联。根据本发明，上述特性的化合物能够活化或抑制功能性的细胞-表面受体。
在优选的实施方案中本发明的功能性的细胞-表面受体是成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)家族的受体，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。在大部分优选的实施方案中，本发明的受体是FGFR1或其功能性的同系物。
术语″受体的功能性同系物″是指能够
i)胞外结合FGFR的配体并由此在细胞中活化受体依赖的信号转导级联的分子，和/或
ii)胞内结合FGFR的适配分子并由此在细胞中活化受体依赖的信号转导级联的分子。
术语″结合″是指FGFR或FGFR同系物和具有FGFR结合位点的相对分子之间的直接或间接的相互作用。在本文中相对分子(counter molecule)是FGFR的胞外配体，或胞内适配分子(adapter molecule)。在本发明的内容中″适配分子″定义为能够识别受体″活化状态″的分子，其选择性地结合这种受体并在细胞中通过诱导信号转导反应级联传送″被活化的受体″的信号。可由例如STN、FRS、Grb、SHP2、PLCγ、或PIP3代表胞内适配分子。
受体的活化经常依赖于由配体结合诱导的受体二聚作用。因此，化合物促进受体分子的二聚作用(或多聚作用)的能力在本发明中是有益的特性。因此，在一个实施方案中本发明描述了能够使FGFR二聚的化合物。经本发明化合物的受体二聚作用可在例如当受体环境中缺乏受体的天然高亲合配体，例如FGF，以及受体是暂时性″沉默″、非活化的情况中发生。然而、在存在多种FGF之一时，受体被占据并且被这个FGF活化，因此本发明的化合物具有低的能力或根本不能调节通过FGF诱导的FGFR受体信号转导。尽管如此，如果受体已经在FGF暴露前暴露于该化合物，那么本发明的化合物可通过占据备选的结合位点减弱天然高亲合配体与FGFR的结合。由此可见本发明的化合物可调节依赖于FGF的受体信号传输。本领域中已知受体活化的细胞应答依赖于受体刺激的强度，其可例如通过配体与受体的相互作用亲合力的值，和/或通过这种相互作用的持续时间来加以表征。因此，FGF和受体的相互作用的亲合力和持续时间都可受本发明化合物的影响。因此，本发明的另一个实施方案是提供能够调节通过高亲合力配体诱导的受体信号传输的化合物。进一步的实施方案涉及1)能够通过与所述的FGFR结合配体在本发明的结合位点进行竞争而抑制由上述的低亲合力配体诱导的FGFR活化的化合物，2)能够活化由上述低亲合力配体或另一个分子抑制的FGFR的化合物，所述的另一个分子是天然的FGFR抑制剂或人工物质。
相互作用的亲合力
术语″相互作用″是指化合物与细胞-表面受体具有暂时的或永久的、直接或间接接触。
可通过相互作用的亲合力表征2个分子之间的相互作用。相互作用的亲合力通常由以摩尔(M)表示的离解平衡常数，Kd值表示。Kd反映了受体分子与配体分子解离的速率和所述的配体分子结合所述受体分子的速率之间的比率，因此表示这2个分子之间结合强度的测量值。结合越强，Kd的值越低。
本发明涉及具有与FGFR相对低亲合力结合的化合物。本发明的低亲合力相互作用由具有范围为10-3至10-8M值的Kd表征，例如从10-3至10-7M，例如从10-3至10-6M，例如从10-3至10-5M，或大约10-4M，或大约10-5M。
受体生物功能的调节
当配体结合时细胞-表面受体诱导和/或维持细胞过程的能力在此定义为受体的″生物功能″。
本发明描述了能够通过调节受体信号传输调节FGFR生物功能的化合物。″调节受体信号传输″是指活化或抑制信使分子级联的产生，其通常发生在通过胞外刺激应答受体活化的细胞中。
通常通过表达所述受体的细胞的生理反应来反映受体信号传输的活化或抑制。因此，通过调节受体信号有可能调节细胞应答。
本发明优选涉及FGFR1-相关的信号传输的活化或抑制，其例如可通过如下方面的变化来反映：i)FGFR1的酪氨酸磷酸化程度；ii)涉及任何FGFR1-相关的信号转导途径的一个或多个胞内蛋白质，例如STAT1、JNK、PLCy、ERK、STAT5、P13K、PKC、FRS2和/或GRB2蛋白质的活化状态；和/或iii)细胞应答。
当涉及FGFR依赖的细胞应答时，本发明涉及下列细胞应答，选自但不限于细胞分化或去分化的诱导/抑制、细胞程序性死亡或细胞存活的诱导/抑制、细胞运动的诱导/抑制。
药物
细胞死亡在正常的神经元发育以及神经变性病症的病理学，例如阿尔茨海默症和Parkinson′s疾病中发挥重要的作用，其中通过程序性细胞死亡有50％的正发育的神经元被消除。已经证明FGFRs及其配体是发育期间和成年期间神经元存活的重要决定因素(Reuss and yon Bohlen undHalbach(2003)Cell tissue Res，：139-57)。因此，能够通过结合和活化FGFR促进神经元细胞存活的化合物是非常需要的。因此，一方面本发明描述了促进神经细胞存活的化合物，其可用作治疗涉及神经细胞死亡病症的药物。然而，本发明的化合物还可用作促进另一类型细胞存活的药物，例如不同类型的肌细胞，或备选地，用于促进另一类型细胞的细胞死亡，例如癌细胞，因为已经证明FGFR信号是肌肉和癌细胞的存活因子(Ozen等人(2001)J NatCancerInst.93：1783-90；Miyamoto等人(1998)J Cell Physio.177：58-67Detilliux等人(2003)Cardiovasc Res.57：8-19)。
在健康的生物体中细胞-表面受体的活性受到严格调节。受体或受体的配体的突变、异常表达或加工导致受体活性的失常因此导致受体的机能障碍。受体的机能障碍随后成为细胞机能障碍的原因，因为该细胞使用该受体诱导和/或维持各种细胞代谢过程。后者是疾病的表现形式。也已经表明FGFR信号传输的衰减导致许多不同病理情况的发生，例如糖尿病(Hart等人，Nature 2000，408：864-8)。FGF受体的活化涉及正常的，以及病理的血管生成(Slavin，Cell Biol Int 1995，19：431-44)。它对于骨骼肌细胞、心肌细胞和神经元的发育、增殖、功能和存活是重要的(Merle等人，J Biol Chem1995，270 17361-7；Cheng和Mattson，Neuron 1991，7：1031-41；Zhu等人，Mech Ageing Dev 1999，108：77-85)。它在正常肾结构的维持中起作用(Cancilla等人，Kidney Int 2001，60：147-55)，并且它涉及伤口愈合和癌症疾病(Powers等人，Endocr Relat Cancer.2000，7：165-97)。
本发明提供能够调节FGFRs活性的化合物。因此，本发明涉及的所述化合物用做药物，该药物治疗的疾病中FGFRs活性的调节可能被认为是治愈的必要条件。
因此，本发明的药物在一个实施方案中是用于预防和/或治疗
1)中枢和外周神经系统、或肌肉或各种器官的疾病和状况，和/或
2)中枢和外周神经系统的疾病或状况，例如手术后的神经损伤、外伤性神经损伤、神经纤维髓鞘化减少、缺血性损伤，例如其起因于中风、帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、痴呆，例如多血管梗塞痴呆、硬化症、与糖尿病相关的神经退化、影响昼夜节律钟或神经肌肉传递的疾病、以及精神分裂症、情绪失调，例如狂躁抑郁症；
3)用于治疗肌肉的疾病或状况，包括例如在器官移植后的伴有神经肌肉连接功能减少的病症，或例如遗传的或外伤的肌肉萎缩性疾病；或用于治疗各种器官的疾病或状况，例如生殖腺的退化病症、胰腺的退化病症，例如I型和II型糖尿病，肾的退化病症，例如肾病，以及心、肝和肠的退化病症。
4)癌症疾病，和/或
5)朊病毒疾病。
本发明涉及需要新血管发生的任何类型的实体瘤癌症。
本发明涉及选自羊瘙痒病(scrapie)、Creutzfeldt-Jakob疾病的朊病毒疾病。已经表明FGFRs在朊病毒疾病中扮演明显的角色(Castelnau等人(1994)Exp Neurobiol.130：407-10；Ye和Carp(2002)J Mol Neurosci.18：179-88)。
在另一个实施方案中，本发明的化合物用于制造药物，该药物用于
1)促进创伤愈合，和/或
2)例如在急性心肌梗塞后、或血管生成后预防心肌细胞的细胞死亡，和/或
3)重新血管化(revassularsation)。
FGFRs及其配体在CNS中发挥重要作用，特别地它们涉及与记忆和学习相关的过程(Reuss and von Bohlen und Halbach(2003)Cell Tissue Res.313：139-57)。因此，在另一个实施方案中，本发明的化合物用于刺激学习和/或短期和/或长时记忆的能力。这个实施方案是本发明的优选实施方案之一。
在另一实施方案中本发明的化合物用于制造药物，该药物用于
1)预防由于局部缺血造成的细胞死亡；
2)预防由于饮酒造成的机体损伤；
在另一个实施方案中本发明的化合物用于制造治疗正常的、变性的或损伤的细胞的药物，该细胞一般在体内表达一种或多种选自下列的蛋白质：
神经细胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.Nos：P13591、P13595-01、P13595)，
-神经细胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)，
-神经细胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.No：P36335)
-神经胶质细胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.No：Q03696；Q90933)，
-神经细胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No：000533)，
-神经胶质蛋白(Swiss-Prot Ass.No：P91767、P20241)，
-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92823、O15179、Q9QVN3
-轴突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q02246、P22063、P28685)，
-轴突-相关的细胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.No：NP_031544.1；Swiss-Prot Ass.No：Q8TC35)，
-髓磷脂-结合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.No：P20917)，
-神经细胞粘附分子BIG-1(Swiss-ProtAss.No：Q62682)，
-神经细胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.No：Q62845)，
-成束蛋白(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.No：P22648)，
-神经细胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)，
-神经细胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos：094779，P07409，P97527)，
-钙粘着蛋白(Swiss-Prot Ass.No：Q9VW71)，
-连接粘着分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JKD5、088792)，
-神经细胞粘附F3/F11(接触蛋白)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、093250)，
-神经束蛋白(Swiss-Prot Ass.Nos：Q90924、Q91Z60；O42414)，
-B-淋巴细胞细胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9R094、P20273)，
-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92859、P97603、Q90610、P97798)，
-胞间的细胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8TAM9、Q60625)或
-半乳糖结合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q91VD1，Q9JKX2、Q9NZ03)，
-半乳糖结合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.No：Q8K419；P38552)，
-成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)(Swiss Prot Ass.Nos：Q9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)，
-成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96KM2、P21802、Q63241)，
-成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q95M13、AF487554、Q99052)，
-成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.No：Q91742)，
-神经营养蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.No：Q8WXJ5)，
-白细胞抗原相关蛋白质-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)，
-肾升压素(Swiss-Prot Ass.Nos：Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q64699、Q13332、O75870)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体κ型(R-PTP-κ)(Swiss swissprot Prot Ass.No：Q15262)，
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)，
-Ephrin A-型受体8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受体EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos：009127、P29322)，
-Ephrin A型-受体3(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受体ETK1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.No：P29318)，
-Ephrin A型-受体2(Swiss-Prot Ass.No：Q8N3Z2)
-胰岛素受体(IR)(Swiss-Prot Ass.No：Q9PWN6)
-胰岛素-样生长因子-1受体(IGF-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)
-胰岛素-相关的受体(IRR)(Swiss-Prot Ass.No：P14616)，
-酪氨酸-蛋白激酶受体Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos：06805、P35590、Q06806)，
-环形受体-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：044924、AF041082、Q9Y6N7)，
-神经元烟碱乙酰胆碱受体α3亚基(CHRNA3)(Swiss Prot Ass.Nos：Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)，
-神经元乙酰胆碱受体α6亚基(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15825、Q9ROW9)，
-血小板源性生长因子受体β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R406、Q05030)，
-白细胞介素-6受体(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.No：Q00560)，
-白细胞介素-23受体(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.No：AF461422)，
-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同细胞因子受体(Swiss-Prot Ass.No：P32927)，
-细胞因子受体-样分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.No：Q9JM58)，
-I类细胞因子受体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.No：Q9UHH5)
-神经突起生长导向因子(Netrin)-1受体DCC(Swiss-Prot Ass.No：P43146)，
-白细胞Fc受体-样蛋白质(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96PJ6、Q96KM2)，
-巨噬细胞清除受体2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.No：Q91YK7)，或
-粒性白细胞集落刺激因子受体(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.No：Q99062)，
-基底膜蛋白聚糖(Swiss Prot Ass.No：P98160)，
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：Q05910)，
-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9H013，O35674)，
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：P78325)，
-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos：043184，Q61824)，
-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JLN6，Q61824，Q9XSL6，Q9UKQ2)，
-ADAM-33前体(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R533、Q923W9)，
-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.Nos：Q13433，Q61072)，
-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.NoS：Q9H2U9，O35227，Q63180)，
-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.No：Q8R533)，
-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYV0，O88839，Q13444)，
-包含金属蛋白酶-去整合蛋白结构域的蛋白质(TECAM)(Swiss-ProtAss.No：AF163291)，
-金属蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.Nos：O95204、Q9BS16)，
-胶原VII型(Swiss-Prot Ass.No：Q63870)，
-纤粘连蛋白(Swiss-ProtAss.：Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)，或
-肌腱蛋白-R(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15568、O00531、Q90995、P10039)，
-细胞因子样因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.No：O75462)，
-或其片段、或其变体。
特别地，本发明涉及正常的、变性的或损伤的NCAM呈递细胞(presenting cell)。
本发明的药物包括有效量的上述限定的一种或多种化合物，或包括一种或多种化合物以及药物可接受的添加剂的药物组合物。
因此，在另一个方面本发明也涉及包括本发明的至少一种化合物的药物组合物。
本发明进一步的方面是生产药物组合物的方法，包括将有效量的本发明的一种或多种化合物，或本发明的所述的药物组合物与一种或多种药物学上可接受的添加剂或载体混合。在一个实施方案中该化合物用于与修复装置组合使用，其中该装置是修复神经的导向装置。因此，在进一步的方面，本发明涉及修复神经的导向装置(prosthetic nerve guide)，其特征在于它包括一种或多种如上限定的化合物或药物组合物。神经导向装置是本领域已知的。
本发明涉及包括本发明化合物的药物和/或药物组合物用于治疗或预防以下所论及的任何疾病和状况的用途。
可适当地配制这种药物和/或药物组合物用于口服、皮下、肌内的、静脉的、颅内的、鞘内的、脑室内的、鼻内的或肺内给药。
基于本发明化合物的药物和组合物的制剂发展中的策略一般相应于用于任何其它蛋白质基础的药物产物的制剂策略。在几个教科书中研究了克服这些问题的潜在问题和所需要的指导，例如″Therapeutic Peptides andProtein Formulation.Processing and Delivery Systems″，Ed.A.K.Banga，Technomic Publishing AG，Basel，1995。
注射剂通常制备为液体溶液或悬浮液，适于注射前的溶液中或悬浮液中的固体形式。也可对制剂进行乳化。经常将活性成分与赋形剂混合，该赋形剂是药物学上可接受的并且与活性成分相兼容。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。此外，如果需要，该制剂可包含少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增强制剂的有效性或转运的物质。
可通过本领域技术人员公知的技术制备本发明化合物的制剂。该制剂可包含药物学上可接受的载体和赋形剂，包括微球体、脂质体、微胶囊、纳米颗粒等。
可通过注射，任选地在活性成分发挥其效力的位点，适当地施用该制剂。适合于其它给药模式的其它制剂包括栓剂、鼻用、肺内施用以及有时为口服的制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚乙二醇或甘油三酯。这种栓剂可由包含0.5％至10％，优选1-2％范围的活性成分的混合物形成。口服的制剂包括常规使用的赋形剂，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式，并且一般包含10-95％，优选25-70％的活性成分。
其它的制剂适于鼻部和肺内给药，例如吸入剂和气雾剂。
活性化合物可配制为中性或盐形式。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽化合物的自由氨基形成)，以及其与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或与有机酸形成，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与自由羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物等，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
该制剂以与配药制剂相适合的方式施用，并且以治疗有效量加以给药。给药量依赖于待治疗的受试个体，包括例如受试个体的体重和年龄，待治疗的疾病和疾病的阶段。合适的剂量范围是每次给药每千克体重通常为几百μg量的活性成分，优选范围为每千克体重从大约0.1μg至5000μg的范围。利用单体形式的化合物，合适的剂量经常是每千克体重从0.1μg至5000μg的范围，例如每千克体重从大约0.1μg至3000μg的范围，以及特别是每千克体重大约0.1μg至1000μg的范围。利用多聚体形式的化合物，合适的剂量经常是每千克体重0.1μg至1000μg的范围，例如每千克体重大约0.1μg至750μg的范围，以及特别是每千克体重大约0.1μg至500μg的范围，例如每千克体重大约0.1μg至250μg的范围。特别地，当鼻部给药时比通过其它途径给药使用较少的剂量。可一次进行给药或可再加上后继的给药。剂量也可取决于给药途径并且可随着待治疗的受试个体的年龄和重量而变化。多聚体形式的优选剂量可在每70kg体重1mg至70mg的范围中。
对于一些适应症优选局部的或基本上局部的用药。
对于其它适应症，优选鼻内的用药。
本发明的一些化合物是具有足够活性的，但是对于其它一些，如果该制剂进一步包括药物学上可接受的添加剂和/或载体可增强效力。这种添加剂和载体是本领域已知的。有时，包括促进将活性物质递送至其靶的化合物是有益的。
在许多实例中，有必要多次施用该制剂。给药可以是连续的输注，例如心室内输注或以多剂量给药，例如一天多次，每日一次，一周多次，每周一次等。优选在个体已经经受可能导致细胞死亡的因素前或之后不久启动药物的给药。优选地从该因素开始8小时内，例如因素开始5小时内施用该药物。许多化合物显示出长期效应，由此可长间隔地进行化合物的给药，例如1周或2周。
在神经导向装置的使用方面，可连续给药或基于活性化合物的控制释放以小部分给药。此外，前体可用来控制释放速率和/或释放位点。另一种其它种植入物以及口腔给药可同样基于控制释放和/或前体的使用。
治疗
在一个实施方案中利用本发明所述化合物/组合物的治疗可用于诱导例如植入或移植的细胞的分化、调节增殖、刺激再生、神经元适应性(plasticity)和细胞存活。当利用具有长期效应的化合物时这是特别有用的。
在进一步的实施方案中，治疗可用于刺激细胞的存活，该细胞处于由多种因素造成的死亡风险中，例如创伤和损伤、急性疾病、慢性疾病和/或紊乱，特别是通常导致细胞死亡的退行性疾病，其它的外界因素，例如可能导致形成自由基或具有细胞毒效应的医药和/或外科治疗和/或诊断方法，例如X-射线和化疗。关于化疗本发明所述的FGFR载体在癌症治疗中是有用的。
因此，治疗包括治疗和/或预防涉及中枢和外周神经系统的细胞死亡疾病或状况，例如手术后神经损伤，外伤性的神经损伤，例如，起因于脊髓损伤、神经纤维髓鞘化减少、缺血后损伤，例如起因于中风、多血管梗塞痴呆、多发性硬化、与糖尿病相关的神经退化、神经肌肉变性、精神分裂症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、或亨廷顿病。
涉及肌肉的疾病或状况也包括伴有神经肌肉连通功能损害的状况，例如遗传的或外伤性的肌肉萎缩性疾病；或用于治疗各种器官的疾病或状况，例如生殖腺的退化状况、胰腺的退化状况，例如I和II型糖尿病、肾的退化状况，例如肾病，本发明所述的化合物可用于诱导分化、调节增殖、刺激再生、刺激神经元的适应性和存活，即刺激存活。
此外，该化合物和/或药物组合物可用于例如在急性心肌梗塞后预防心肌细胞的细胞死亡，以诱导血管生成。此外，在一个实施方案中该化合物和/或药物组合物可用于刺激心肌细胞的存活，例如急性心肌梗塞后的存活。在另一个方面，该化合物和/或药物组合物用于例如损伤后的新血管再生。
该化合物和/或药物组合物用于促进创伤愈合的用途也在本发明的范围内。本化合物能够刺激血管生成并且由此可促进伤口愈合过程。
本发明进一步公开了该化合物和/或药物组合物在癌症治疗中的用途。FGFR活化的调节对于肿瘤血管生成、增殖和扩散是重要的。
在进一步的实施方案中，化合物和/或药物组合物的用途是用于刺激学习的能力和/或短期和/或长期记忆的能力，因为FGFR对于神经细胞的分化是重要的。
在另一个实施方案中，本发明的化合物和/或药物组合物用于治疗由饮酒(alcohol consumption)所造成的机体损伤。特别涉及胎儿的发育畸形、长期神经行为改变、酒精肝疾病。
包括利用化合物和/或药物组合物的朊病毒疾病治疗是本发明的另一个实施方案。
特别地本发明的化合物和/或药物组合物可用于治疗临床状况，例如肿瘤，例如恶性肿瘤、良性赘生物、原位癌和不确定特性的肿瘤，内分泌腺的疾病，例如糖尿病、精神病，例如老年的和早老的器质性精神病、酒精中毒性精神病、药物性神经病、短暂的器质性精神病状况、阿尔茨海默氏病、大脑脂沉积症、癫痫症、麻痹性痴呆(general paresis)[梅毒]、肌震颤性综合征、亨廷顿病、慢性舞蹈病、痉挛性假硬化(Jakob-Creutzfeldtdisease)、多发性硬化、脑的Pick′s疾病、梅毒、精神分裂症、情感性精神病、神经紊乱、人格障碍，包括性格性神经机能病(character neurosis)、与器质性脑综合征相关的非精神病人格障碍、妄想狂样人格障碍、狂热人格、妄想狂样人格(紊乱)、妄想狂样的特征、性变态和紊乱、智力迟钝、神经系统和感觉器官中的疾病、认知异常、中枢神经系统的炎性疾病、例如脑膜炎、脑炎、大脑退化，例如阿尔茨海默氏病、Pick′s疾病、老年性脑退化、交通性脑积水、阻塞性脑积水、帕金森氏症包括其它附加的蹄骨锥突部骨炎和异常活动紊乱、脊髓小脑疾病、小脑运动失调、Marie′s，Sanger-Brown、肌阵挛性小脑协同失调、原发性小脑退化，例如脊髓性肌萎缩、家族性青少年的、成年的脊髓性肌萎缩、运动神经病、肌萎缩性侧索硬化、运动神经病、进行性延髓麻痹、假延髓病性麻痹、原发性脊髓侧索硬化、其它的前角细胞疾病、前角细胞疾病、非特定的其它脊髓疾病、脊髓空洞症和延髓空洞症、血管的脊髓病、急性脊髓梗塞(栓塞)(非栓塞性的)、脊髓的动脉血栓、脊髓的水肿、亚急性坏死性脊髓病、其它分类疾病中的脊髓亚急性联合变性、脊髓病、药物-诱导的、辐射诱导的脊髓炎、自主神经系统的紊乱、外周自主神经紊乱、交感神经、副交感神经、或植物性系统的紊乱、家族性自主神经异常[家族性植物神经失调综合征]、特发性的外周自主神经病、颈动脉窦晕厥或综合症、颈交感神经萎缩或麻痹、其它分类紊乱中的外周自主神经病、淀粉样变性、外周神经系统疾病、臂神经丛病变、颈肋综合征、肋骨锁骨综合征、前斜角肌综合症、胸部出口综合征(thoracic outlet syndrome)、臂神经炎或脊神经根炎、包括新生儿在内的。炎症性的和中毒的神经病，包括急性感染性多发性神经炎、格林-巴利综合征、感染后多神经炎、胶原血管病中的多发性神经病、影响眼睛多层结构的病症、化脓性的眼内炎、耳朵和乳突的疾病、慢性风湿性心脏病、缺血性心脏病、心律不齐、肺系中的疾病、新生儿中的器官和软组织异常，包括神经系统在内，分娩和生产中麻醉药或其它镇静物给药的并发症、皮肤疾病，包括感染、循环不足问题、损伤，包括在外科手术、挤压伤、灼烧后的皮肤疾病。对神经和脊髓的损伤，包括神经分裂、连续性病变(有或没有开放性创伤)、创伤性神经瘤(有或没有开放性创伤)、外伤性的暂时麻痹(有或没有开放性创伤)、医药方法期间的偶然穿刺或裂伤、对视神经和通路的损伤、视神经损伤、瞬间脑神经(second cranial nerve)、视交叉损伤、视路损伤、视皮层损伤、非特定的目盲、其它脑神经损伤、其它和非特定的神经损伤。由药物、医疗用品和生物物质造成的毒害、遗传的或外伤性的萎缩性肌肉紊乱；或用于治疗各种器官的疾病或状况，例如生殖腺的退化状况、胰腺的退化状况、例如I和II型糖尿病、肾的退化状况，例如变性肾炎。羊瘙痒病、Creutzfeldt-Jakob疾病、Gerstmann-Straussler-Sheinker(GSS)疾病。根据本发明上述状况和症状的治疗和/或预防包括将有效量的化合物和/或药物组合物施用于需要其的个体的步骤。
实施例
实施例1.本发明的FGL肽(SEQ ID NO：1)和其它肽的不同制剂的制备
FGL的单独肽链的固相合成
通过如上所述的标准Fmoc-固相方法合成本发明的FGL和其它肽序列的单独肽链，例如EFL肽。在TentaGel S RAM树脂(90mg，0.22mmol/g)上进行用于实验的肽的合成。将树脂置于装备有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯导管中。使树脂在DMF中膨胀，并用DMF中的20％哌啶处理以保证在树脂上出现未保护的氨基。然后排干树脂并用DMF洗涤直到向排干的DMF加入Dhbt-OH后检测不到黄色。轮流除去Fmoc-基团使氨基酸一次一个地结合上去。在结合到延长的树脂-结合的肽链前，经TBTU/HOBt在DMF中预活化Fmoc-氨基酸。为了除去Fmoc-基团，使用DMF中的哌啶溶液。
FGL二聚体的LPA生产
通过利用如WO 00/18791中所描述的，利用TBTU/HOBt使Boc-亚氨基二乙酸结合至树脂上的肽来制备本申请的FGL(FGLL)的LPA-型二聚体。为了减少副反应，用Boc-亚氨基二乙酸作为限制成分进行多重偶连。从树脂切下肽，在存在TES时以水作为清除剂在TFA中的侧链上同时使肽去保护以产生肽酰胺。通过蒸发减少TFA的量而使肽沉淀。通过反相HPLC进行FGLL的最后纯化。HPLC的条件如下：
柱： YMC ODS-AMQ，5μM，4.6×250mm，200A
流量： 1.0ml/min
流动相： A：0.12％TFA，95％H2O，5％ACN
B：0.1％TFA，95％ACN，5％H2O
梯度： 15％B至35％B 20min，
35％B至95％B 1min并且保持5min。
检测： 二极管阵列检测器190-400nm
波长： 220nm
注射体积： 20μl，
FGLL的浓度 0.5mg/ml
通过冻干分离HPLC纯化的FGLL。FGLL合成的流程图如图1所示。图2描绘了FGLL最后纯化的HPLC洗脱图谱。
缩写
氨基酸的缩写与生化命名法则Eur.J.Biochem，1984，vol.184，第9-37页中IUPAC-IUB Joint Commission的建议一致。
其它缩写：
AcOH 乙酸
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子四氟化碳
Ida Boc亚氨基二乙酸
MTBE t-丁基甲醚
DMF 二甲基甲酰胺
EtOH 乙醇，99,9％
DIPEA N-乙基-二异丙胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
NMP N-甲基吡咯烷酮
TFA 三氟乙酸
TES 三乙基硅烷
Boc N-叔丁氧羰基
Fmoc 9-芴基甲氧羰基
TBu 叔丁基
HPLC 高压液相色谱法
R 酰胺-TG-树脂
AA 氨基酸
FGLL的理化性质
FGLL具有结构式：
它由其N-末端上的接头基团，氨基乙酸(N-(羧甲基)甘氨酸)共连接的15个氨基酸残基的2个相同肽序列组成。FGLL的分子量是3394.8道尔顿。通过加入乙酸来防止肽化合物在浓缩水溶液(高于0,5mg/ml)中的非共价聚集。
FGLcys和FGLlys二聚物合成
利用Goodwin等人(1998)Bio-org Med Chem Lett 8：2231-2234中所描述的固相合成来合成FGLcys二聚体，该二聚体由2个单独的FGL序列组成，每个FGL序列中在通过S-S键结合的N-末端包含附加的半胱氨酸残基。
利用Rajagopalan等人(1995)Int J Pept Protein Res.45：173-179中所描述的固相合成制备FGLlys二聚体，该二聚体由2个单独FGL单体序列构建，该单体序列通过其C-末端结合至赖氨酸。
FGL(FGLd)的树枝状聚合四聚物的合成
根据例如PCT/US90/02039中所描述的标准方法合成FGL，FGLd的MAP-型树枝状聚合物。
图3表明了最后纯化FGLD的HPLC洗提图谱。阴影部分表示了合成产品的异质性的水平。
实施例2.FGL的不同制剂对神经元体外存活的影响
在本领域公知的存活测定中比较FGL肽的不同制剂的生物活性，并且如下进行详细描述。
多巴胺能神经元(DN)
从15天胚胎的Wistar大鼠胚胎制备多巴胺能神经元(Charles River，Sulzfeld，德国或Mollegaard，丹麦)。杀死怀孕的大鼠，取出子宫并且保存在冰上的Hank′s平衡盐溶液中(HBSS；Gibco，BRL)。从胚胎的脑解剖中脑的腹侧部分，在冰上的补充有5g葡萄糖/l(Sigma-Aldrich)的Gey′s平衡盐溶液(GBSS；Gibco，BRL)中匀浆，然后进行胰蛋白酶消化。在存在DNAse1和大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)时洗涤解离的细胞。
对于存活测定，如上所述将分离的神经元以150,000个细胞/cm2的密度接种在涂有聚-D-赖氨酸的24-孔细胞培养平板中。在没有或具有各种浓度的FGL肽条件下放置神经元分化6天，其后加入100μM浓度的6-OHDA 2小时。通过将6-OHDA以10mM的浓度溶解在0.1％(w/v)焦亚硫酸钠中以免氧化来制备原液。加入6-OHDA 2小时后，使培养基转换为具有添加物和肽的Neurobasal培养基，并且使细胞培养物进一步培养24小时，固定并进行酪氨酸羟化酶免疫染色。如下文多巴胺能轴突向外生长测定中所描述的，自动记录每个个体实验中各个试验条件的98个图像。
海马神经元(HN)
为了实验，如Ronn等人(1999)Nat Biotechnol.17：1000-5所描述的，从19天胚胎的Wistar大鼠胚胎或新生大鼠分离解离的海马神经元。
简而言之，从在冰冷的改进的Krebs Ringer溶液中的脑分离海马，清除血管，通过破碎粗略地匀浆然后进行胰蛋白酶消化。在存在DNAse 1和大豆胰蛋白酶抑制剂时洗涤解离的细胞。
为了测定，将神经元以40,000个细胞/cm2的密度接种在涂有10μg/ml聚-L-赖氨酸的8-孔permanox载片上的Neurobasal培养基中。接种后15分钟，加入终浓度为20μM的Aβ25-35。在接种前将Aβ25-35溶于无菌去离子水中至浓度为3mM，并根据Pigino等人(2001)J Neurosci.21：834-42在37℃培养4天。这种处理诱导Aβ-肽片段的纤维化，由此增加其神经毒活性。如Kruman等人(1997)所描述的，用含有FGL肽的Neurobasal培养基培养神经元70小时，用4(v/v)甲醛固定，并用Hoechst 33258染色25分钟。如海马轴突向外生长测定所描述的在各个实验中利用计算机辅助的荧光显微术随机记录各组1000-1500个神经元的图像。利用ProteinLaborator，哥本哈根大学开发的软件包Prima计数来自死的和活的神经元的细胞核，并且评估活的神经元相对于神经元总数的百分率。
小脑颗粒神经元(CGN)
如Drejer和Schousboe(1989)Neurochem Res.14：751-4先前所描述的，从出生后7天的Wistar大鼠制备小脑颗粒神经元(cerebellar granule neuron)(CGN)。
为了实验，在保存在冰上的改进的Krebs-Ringer溶液中解剖小脑组织，并且如上述对海马神经元所描述的进行处理。在含有5％CO2的加湿环境中于37℃培养所有的细胞培养物。根据国家的动物保护原则处理所有的动物。
将CGN的原始培养物以100,000个细胞/cm2的密度接种在Neurobasal-A培养基(Gibco，BRL)中的涂有聚-L-赖氨酸的8-孔permanox载片上，其补充有2％(v/v)的B27，0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和KCl，使得培养基中KCl的终浓度为40mM。
接种后24小时，加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C；Sigma-Aldrich)至终浓度为10μM以避免胶质细胞增殖，其后容许神经元进一步在37℃分化6天。通过排干两次和将培养基改变为补充有1％(v/v)谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、3.5g D-葡萄糖/l和1％(v/v)丙酮酸钠(Gibco BRL)、与各种浓度的肽一起的Basal Medium Eagle(BME；Gibco BRL)诱导程序性细胞死亡。由此培养物中钾的浓度减少为5mM KCl。诱导细胞程序性死亡后2天，如使用海马神经元的存活测定所描述的用4％甲醛固定细胞并用Hoechst 33258染色。
如D′Mello等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA.90：10989-93所描述的进行测定。
利用CGN培养物的其它存活测定。
1.PACE测定
根据Versteeg等人(2000)FEBS Lett.465：69-73进行磷酸化的Erk1/2和Akt相对于CGN总数的检测。
为了实验，将CGN以290,000个细胞/cm2的密度接种在涂有聚-L-赖氨酸的96-孔微孔板中。使神经元生长在补充有0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Neurobasal-A培养基中。接种后24小时，如上所述向培养物加入Ara-C。培养72小时后，将培养基的一半替换为含有待测试肽的Neurobasal-A培养基。对于Erk1/2磷酸化测定，使培养物进一步培养0-90分钟，以70g离心8分钟，用4％(v/v)甲醛固定，并利用磷酸-p42-44兔第一抗体和过氧化物酶-偶联的抗兔第二抗体进行免疫染色。对于磷酸化Akt的检测，使培养物进一步培养10或30分钟，以70g离心8分钟，用4％(v/v)甲醛固定，并利用针对在Ser473磷酸化的Akt多克隆抗体和过氧化物酶-偶联的第二抗体。通过用结晶紫染色评估两个磷酸化测定中的神经元总数。
2.TUNEL测定
将CGN以60,000个细胞/em2的密度接种在涂有聚-L-赖氨酸的8-孔permanox载片上。使培养物生长在补充有2％(v/v)B27，0.5％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和40mM KCl(终浓度)的Neurobasal-A培养基中6天，并如上述CGN存活测定所描述的诱导细胞程序性死亡。诱导细胞程序性死亡24小时后，固定培养物并且利用ApoAlert细胞程序性死亡检测试剂盒，基本上如制造商所描述的测量DNA-断裂的程度。简而言之，用荧光素-dUTP酶促标记双链DNA分子的钝末端，并且用浓度为750ng/ml的碘化丙啶染色所有的神经元。利用与装备有油浸60×1.4NA物镜的Nikon Eclipse TE 200共聚焦显微镜偶连(Nikon，东京，日本)的BioRad辐射激光扫描系统2000从各个实验中的各组获得至少200个神经元的图像。通过计数测定TUNEL-阳性神经元的分数。
结果
FGL促进多巴胺能的、海马和小脑颗粒神经元的存活
因为FGL是具有生长因子-样活性的FGF受体的拮抗剂，研究FGL是否可在各种神经毒状况下起神经保护剂的作用。通过添加6-OHDA诱导多巴胺能神经元中的细胞死亡。在图4a中能够看出与未处理的对照相比暴露于6-OHDA后强烈减少了活的多巴胺能神经元的数目。加入10ng/ml神经胶质衍生的神经营养性因子(GDNF)部分地预防了这种神经元损失(与设置为100％的6-OHDA-处理的对照细胞相比为150％)。当存在各种浓度的FGLd而使培养物生长时(图4b)，用6-OHDA处理的多巴胺能神经元在浓度为1μg/ml的FGLd下其存活在统计学上显著增加大约135％的最大挽救并且该效果显示出圆锥形的剂量反应关系。
因此，在使用6-OHDA作为神经毒化合物的存活模型中FGLd能够挽救多巴胺能神经元至与GDNF大约相同的程度。
也测试FGLd是否能够保护海马神经元免于由Aβ25-35诱导的死亡。用与各种浓度的FGLd一起的预聚集的Aβ25-35培养海马神经元的培养物。在图4c中能够看出用20μM Aβ25-35处理海马细胞培养物可诱导中-低程度的神经元细胞的损失。这种损失可部分地通过50ng/ml脑衍生的神经营养性因子(BDNF)挽救。如图4d所示，用0.1-50μg/ml浓度范围的FGLd处理也从由20μM Aβ25-35诱导的神经退化部分地挽救了海马神经元。FGLd-诱导的神经保护达到浓度为0.3μg/ml FGLd(与Aβ25-35-处理的对照相比为110％)的最大水平，保持多于或少于在FGLd浓度达到50μg/ml时的恒定值。
因此，FGLd可保护海马神经元抵抗Aβ25-35肽的神经毒作用，其达到用BDNF处理所获得的相同程度。
先前已经表明如果CGN的原始培养物生长在高水平的KCl中，并且随后减少KCl的浓度，可诱导细胞程序性死亡。在于40mM KCl中诱导分化七天的CGN培养物中研究FGLd的神经保护效果。随后KCl浓度减少为5mM，2天后评估细胞存活力。如图4e所示，低KCl浓度诱导CGN培养物中的细胞死亡，并且这可通过用胰岛素-样生长因子1(IGF-1)处理而加以挽救。如图4f所示，也可通过用FGLd处理部分地防止细胞死亡。在肽浓度为1-10μg/ml之间看到与生长在低KCl浓度下的对照相比达到135％的最大神经保护。
因此，该结果表明FGL能够体外促进多巴胺能的、海马和小脑颗粒神经元的存活。
FGL保护小脑颗粒神经元抵抗细胞程序性死亡
为了进一步表征FGLd的神经保护作用机制，测量去除KCl的CGN中DNA-断裂(通常与细胞程序性死亡相关)的程度(如Eldadah等人，(2000)J Neurosci.20：179-86所描述的)。维持在高KCl培养基中的CGN显示具有断裂DNA的极少神经元。大部分用低KCl处理的细胞显示DNA-断裂。在用浓度为10-20μg/ml的FGLd处理的CGN培养物中，当除去KCl时几乎没有神经元显示断裂的DNA。相比之下，对照的肽、FGL9、具有双重丙氨酸取代的10diAlad没有显示出神经保护作用。随后定量FGLd的神经保护作用，并且在图5中能够看出与维持在高KCl培养基中的CGN相比，除去KCl导致含有断裂DNA的CGN的数目明显增加。用对照的肽、FGL9、10diAlad进行处理不能从细胞程序性死亡挽救CGN。加入各种浓度的FGLd减少了细胞程序性死亡的CGN的数目，FGLd在10-15μg/ml的浓度时，相对于没有FGLd处理的，其对细胞程序性死亡的神经元有40％的最大挽救。
FGL-诱导的信号转导导致Erk和Akt的磷酸化
FGL肽已经显示结合和活化FGFR。起源于FGFR的信号通路-途径尤其包括Ras-MAPK途径，如MAPK Erk1/2和P13K途径的活化所反映的，其活化了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt。已知两个途径都涉及神经元的分化和存活。因此FGL的轴突长出和存活促进效果可取决于MAPK和P13K途径的活化。因此研究Erk1/2和Akt是否应答了FGL肽对CGN培养物的处理而被磷酸化。从图8看来与5μg/ml的浓度相比浓度为10μg/ml的肽诱导Erk1/2的持续磷酸化，其不能诱导Erk1/2的磷酸化。用FGLd刺激10分钟后可看到这种活化(与对照培养物相比为115-120％)并且持续至少90分钟。
将CGN培养物暴露于该肽10或30分钟后分析经FGL的Akt磷酸化(图7)。在0.5μg/ml以上浓度中暴露10分钟时间段导致与未处理的对照相比Akt磷酸化的显著增加。在肽浓度为1μg/ml磷酸化水平达到最大量，并且在剂量增加达到20μg/ml时保持相对恒定。在30分钟的暴露时间，没有检测到Akt的磷酸化，表明Akt的活化与Erk1/2的磷酸化反应相比是暂时的并且在30分钟内终止。
因此，该结果表明FGL诱导MAPK途径的持续(至少90分钟)活化以及Akt的暂时(10分钟)活化。
FGL通过FGFR、MEK和P13K促进神经元细胞存活
为了研究FGFR、MEK和P13K是否也涉及FGL-诱导的存活，用上文描述的抑制剂处理被诱导经受细胞程序性死亡的CGN培养物。如图8所示，用FGLd但没有抑制剂处理的细胞程序性死亡-诱导的CGN培养物中细胞的存活设置为100％，并且未用FGLd处理的细胞程序性死亡-诱导的对照神经元(用虚线标记)与FGLd-处理的神经元相比具有更低的存活率。FGFR抑制剂、SU5402(■)显著抑制了对FGLd浓度已经为20μM的存活应答，并且40μM SU5402的浓度减少了FGLd-诱导的存活至未处理的细胞程序性死亡-诱导的对照神经元的存活率。MEK抑制剂、PD98059(●)抑制了经FGLd诱导的细胞存活至浓度为12.5μM的对照培养物的水平。P13K抑制剂LY294002(▲)显著抑制了浓度为3.5μM的FGLd-诱导的细胞存活。表明LY294002是神经元存活的非常有效的和全身性的抑制剂。
因此，CGN培养物除去KCl后，FGL-诱导的存活取决于FGFR和胞内激酶MEK和P13K的活化。结果表明LY294002是神经元存活的最有效的抑制剂，然后是MEK抑制剂，PD98059，其在轴突长出测定中比在存活测定(见下文)中有效性似乎差一些，可能表明FGL-诱导的MEK活化的主要功能是神经保护，而不是分化。
实施例3.通过FGL的不同制剂体外刺激轴突向外生长
如上所述制备DN、HN和CGN的原代培养物。
多巴胺能神经元(DN)
将DN以100,000个细胞/cm2的密度接种在24-孔细胞培养平板中(先前涂有12.5μg/ml聚-D-赖氨酸；Sigma-Aldrich)的含有50％(v/v)Optimem1(Gibco，BRL)、25％(v/v)马血清(Gibco，BRL)、25％(v/v)HBSS和5g葡萄糖/1的培养基中。在将培养基转换为补充有2％(v/v)B27 Neurobasal添加物、0.5％(v/v)谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(所有的来自Gibco，BRL)，没有或具有各种浓度肽的Neurobasal培养基前放置细胞以贴附1-2小时。培养72小时后，用4％(v/v)甲醛固定神经元并利用针对酪氨酸羟化酶的第一小鼠单克隆抗体和生物素化的羊抗小鼠第二抗体，然后用过氧化物酶偶联的链霉抗生物素培养进行免疫染色。利用由Walmod等人(2002)Toxicol Appf Pharmacol.181：1-15描述的计算机化的显微镜操作装置自动记录各个个体实验中每个试验条件的98个图像。简而言之，操作装置由装备有机动的、可动显微镜载物台(LUDL Electronic ProductionLtd，Hawthorne，NY，美国)、10x物镜和1100模拟设备b/w CCD摄像机(DFA，丹麦)的Eclipse TE 300倒置显微镜(Nikon东京，日本)组成。根据Ronn等人，(2000)J Neurosci Methods.100：25-32)使用Protein Laboratory(哥本哈根大学，丹麦)开发的软件包Prima进行轴突长度的立体空间基础的测定。
海马神经元(HN)和小脑颗粒神经元(CGN)
将生后的HN或CGN以10,000个细胞/cm2的密度接种在于Neurobasal培养基中的未涂覆的8-孔permanox Lab-Tek小室载片上，其中补充有0.4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)、2％(v/v)B27 Neurobasal添加物、1％(v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2％1M HEPES(所有的来自Gibco，BRL)。加入没有或具有各种信号转导途径的抑制剂的肽溶液至总体积为300μl/cm2，并且于37℃培养载片。24小时后，用4％(v/v)甲醛固定神经元20分钟，此后利用针对GAP-43的第一兔抗体和Alexa Fluor第二山羊抗-兔抗体进行免疫染色。通过利用如先前描述的计算机辅助的荧光显微术系统地获得各个单独实验中各组的至少200个神经元的图像(Ronn等人，2000op.cit.)。简而言之，使用具有与摄像机偶连的Nikon Plan 20×物镜(Nikon，东京，日本)的Nikon Diaphot倒置显微镜进行记录。使用如上所述用于多巴胺能轴突向外生长测定的相同软件包加工记录的图像。
结果
FGL诱导多巴胺能的、海马和小脑颗粒神经元原始培养物的轴突向外生长
已经表明单体形式的FGL可诱导从初始海马神经元长出轴突。众所周知多聚体形式的肽配体比单体形式具有针对受体活化的更高效力(上文所述)。因此，制备各种二聚和四聚形式的FGL并且使用多巴胺能的、海马和小脑颗粒神经元(CGN)的原代培养物测试其轴突长出刺激能力。
在缺乏或存在四聚(树枝状聚合)的FGL肽(FGLd)时使培养物生长。随后定量通过所有3类神经元的FGLd诱导的轴突长出并且显示在图9中。用FGLd (●)处理的多巴胺能神经元显示出统计学上显著的剂量依赖方式的轴突长度增加，其在浓度为1μg/ml FGLd时获得最大的平均轴突长度(与未处理的对照相比为125％)。用FGLd(▲)处理的海马神经元在0.04μg/ml剂量的FGLd时显示出轴突长度增加，达到类似平台期的水平，与使用浓度达到20μg/ml的FGLd的未处理的对照培养物相比具有大约150％的刺激。用FGLd(■)处理的CGN培养物也显示出剂量依赖的轴突长出反应。与未处理的对照相比在50μg/ml FGLd的浓度时可看到255％的最大刺激。
选择海马神经元的原代培养物来测试3种不同二聚形式的FGL肽、FGLL、FGLlys和FGLcys对轴突长出的影响。如图10所示，二聚的赖氨酸树枝状聚合物、FGLlys(▲)和FGLcys(·)都不能以所测试的任何浓度刺激轴突长出。相比之下，FGLL(■)诱导显著的轴突长出反应，其显示剂量依赖的关系，具有在1μg/ml浓度时达到最大刺激的钟形曲线。与未处理的对照相比最大刺激是155％(图10)，其与由FGLd诱导的反应粗略相同(参见图9)。
由FGL诱导的轴突长出涉及FGFR、MEK和PI3K的活化
为了阐明FGFR、MEK和P13K活化的生物相关性，测试这些激酶的抑制剂对CGN中由FGLd诱导的轴突长出的影响。已知FGFR抑制剂，SU5402，通过与受体催化结构域的相互作用抑制FGFR亚类1的酪氨酸激酶活性。在图11中将FGLd-处理的CGN培养物中平均的轴突长度设置为100％，并且将未用FGLd处理的对照神经元的平均轴突长度标记为虚线。看来SU5402(■)在80μM浓度时显著抑制FGLd-诱导的轴突长出(至初始值的35％)。用MEK抑制剂PD98059(●)以上述25μM的浓度处理统计学上显著地减少由FGLd诱导的轴突长出至75％。P13K抑制剂LY294002(▲)也已经以3.5μM的浓度显著地抑制FGLd-诱导的轴突长出至90％，在10μMLY294002的浓度时轴突长出对FGLd的应答几乎减少至50％，其比未处理的对照神经元更低。SU5402和LY294002对未用FGLd处理的对照培养物中的轴突长出没有显著的影响(数据未显示)。先前已经发现PD98059不影响CGN中基底(basal)轴突的长出。因此，CGN的FGLd-诱导的轴突长出应答取决于FGFR的活化和MEK和P13K胞内信号传输途径的随后活化。
表1.FGL肽的不同制剂对通过撤回高钾或加入6-羟基多巴胺(6-OHDA)或(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段而被诱导经受细胞死亡的大鼠CGN、DN和HN的原代培养物中神经元存活的影响总结。
| 诱导细胞死亡的机制 | 组织来源(大鼠的年龄) | FGL肽/有效浓度 | 神经元存活(对照的％)a |
| 低K+(5mM) | CGN(PND 3-4) | FGLm：250μg/mL | 125％* |
| 低K+(5mM) | CGN(PND 3-4) | FGLd：5μg/mL20μg/mL | 110％*117％** |
| 低K+(5mM) | CGN(PND 3-4) | FGLd：1μg/mL10μg/mL | 131％*132％* |
| 低K+(5mM) | CGN(PND 7-8) | FGLm：10μg/mL50μg/mL250μg/mL | 110％*119％*142％* |
| 低K+(5mM) | CGN(PND 7-8) | FGLd：20μg/mL | 175％* |
| 6-OHDA | DA(E14) | FGLd：1μg/mL | 143％* |
| β-淀粉样蛋白 | 海马的(E19) | FGLd：0.01μg/mL3μg/mL9μg/mL | 109％**107％**107％** |
| β-淀粉样蛋白 | 海马的(E19) | FGLL：0.3μg/mL | 108％* |
a将没有FGL处理被诱导经受细胞死亡的培养物中的存活指定为100％(对照)并且与加入FGL的培养物相比较。
统计数值(+FGL vs.对照处理)：*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001
表2.FGL肽对大鼠CGN、DN和HN原代培养物中轴突长出的影响总结。
统计数值(+FGL vs.对照处理)：*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001
PND＝生后天数；E＝胚胎的天数
| 测定 | 组织来源/大鼠年龄 | 肽浓度(μg/mL) | 对轴突长度的影响(增加的百分数vs.对照) |
| 原代培养物；温育：24h+/-FGL；分析：计算机辅助的荧光显微术 | CGN/-PND 2-4-PND 5-8 | FGLd-9FGLd-3，9，27FGLd-10，25，50，100 | 24％**30％**，93％**，121％*37％*，79％*，179％**，96％** |
| 原代培养物；温育：72h+/-FGL；分析：计算机辅助的荧光显微术 | DN/E14 | FGLd-0.04，0.2，1，5FGLL-0.3，1，3，FGLm-10，50，250 | 12％***，23％***，24％***，13％*19％*，34％**，33％**15％*，23％***，28％*** |
| 原代培养物；温育：24h+/-FGL；分析：计算机辅助的荧光显微术 | HN/-E19-新生-新生 | FGLd-3，9，27FGLd-0.04，5FGLL-0.2，1，5 | 65％*，51％*，69％*38％**，45％*35％**，53％**，30％** |
结论
1.FGL肽是多种神经元细胞类型的体外存活促进化合物，其在神经退化紊乱的治疗中是必需的.
2.FGL肽能够体外诱导多种神经元细胞类型的轴突长出，并且FGL具有促进轴突和树突生长的潜能，这在神经退化紊乱的治疗中是必需的。
3.所有的单体FGLm，二聚FGLL和树枝状聚合的FGLD，FGL肽的制剂在促进存活和神经突长出中是有效的。
4.FGLL和FGLD在神经突长出的促进中比FGLm是多出200倍有效的。
5.FGLL在神经突长出的促进和存活中与FGLD一样有效。
6.其它的FGL肽制剂，例如二聚的FGLlys和FGLcys在神经突长出的促进中是失活的。
实施例4.FGL对大鼠海马神经元的初始细胞培养物的突触适应性的影响
在成人神经系统中，例如海马的结构连续地经受适应性改变(plasticchange)以调整结构和功能。特别地，认为记忆的获得需要已经建立的神经元连通的结构性和功能性变化。NCAM已经显示在发育期间以及学习和记忆的神经元适应性中起重要作用(Weizl和Stork，(2003)News Physiol Sci.18：147-50)；然而，这些影响的机制是未知的。本研究中探查了FGL肽是否能够影响突触的适应性(synaptic plasticity)。
在来自胚胎大鼠(E19)的海马神经元的原代培养物中评估FGLd对囊泡翻转的影响。如上所述制备培养物。体外13-16天后，向培养物加入FGLd并且培养1、24或48小时。培养48小时后，将FGFR-抑制剂(SU 5402)与FGLd一起同时加入一些培养物。
如Kiryushko等人(2003)J Biol Chem.278：12325-34所描述的，用FGLd处理后用荧光膜探针FM 1-43标记神经元。然后利用Radiance 2000扫描系统和Nikon eclipse TE200共聚焦显微镜进行定时的图像获取来评估通过用90mM钾去极化诱发的FM 1-43释放(细胞脱色)的速率。
进一步利用在培养物中生长13天的初始胚胎(E19)海马神经元中的神经突和突触的双重免疫染色来评估FGLd对突触形成的影响。在固定和免疫染色前用FGLd培养细胞48或96小时。通过针对突触素(synapto physin)的抗体检测突触并且通过针对生长-关联的蛋白质-43的抗体(GAP-43-也称为B-50或F1)标记神经突。如Ronn等人(2000)(op.cit.)所描述的检验免疫染色并通过共聚焦荧光显微术定量。
结果
用20μg/ml的FGLd处理海马神经元1h和48h导致与对照相比，FM1-43脱色速率在统计上显著增加(分别从0.008sec-1至0.016sec-1，和从0.013sec-1至0.028sec-1)；而24h处理没有产生显著的影响(图12)。这表明FGLd导致递质释放的短期促进(1h)和突触效力的长期增加(48h)。FGFR抑制剂SU5402消除FGLd的影响表明FGLd的影响是通过与FGFR相互作用而介导的。
海马神经元的突触素和GAP-43的双重免疫染色表明将FGLd(20μg/ml)施用于海马培养物48和96小时显著增加了突触的数目，反映为每100μM长度的轴突突触素阳性斑点的数目增加大约20％(分别为2.40至2.96和2.73至3.24)。
这些结果表明FGL肽通过增加突触前囊泡翻转的比率和突触数目来影响突触的适应性。
实施例5.FGL对暴露于缺血性状况的器官性海马神经元切片培养物和分离的海马原代培养物的影响
脑对氧和葡萄糖的具有高消耗，并且几乎唯一地依赖于用于能量产生的氧化磷酸化。缺氧和缺乏葡萄糖供给导致神经元的细胞损坏和死亡。对缺血性损伤的敏感度在脑的不同部分当中以及甚至不同的神经元群体中是不同的。海马CA1区域的神经元是易受伤部位脑中的一个区域。
方法
在本研究中，根据Stoppini等人的方法(1991)Neurosci Methods 37：173-82研究了来自7-天龄Wistar大鼠的器官性(organotypic)海马神经元切片培养物(OHSC)，以及根据Maar等人的方法(1997)J Neurosci Res.47：163-72.研究来自1天龄大鼠的分离的海马神经元原代培养物中除去氧和葡萄糖后(OGD)FGL肽对突触适应性、神经元功能和易受伤部位的影响。在加入FGLd前维持原代细胞培养物11-12天并且维持OHSC 12-14天。
将原代细胞培养物和OHSC暴露于OGD 10和20分钟。OGD后，再次用氧和葡萄糖供给培养物并且在导入OGD暴露后在1，4或24小时的时间点进行分析。在OGD之前24hr、即刻、或OGD后1hr或24hr加入FGLd(或对照的肽FGL)。在OGD前给药，导入OGD时，从培养基移出FGLd。有时，只在OGD后4hr用FGLd处理切片培养物。此外，在一些设置组中与FGLd一起加入FGFR抑制剂，SU5402(25μM)。
在海马神经元的培养物中，使用FM 1-43染色剂来评估突触前的功能(如上所述)。根据Malich等人，(1997)Toxicology.124：179-92利用MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴化物]测定测量原代细胞培养物和OHSC中的细胞的活力。此外，根据Laake等人(1999)Brain Res BrainRes Protoc.4：173-84利用碘化丙啶(PI)染色测量OHSC中的细胞的活力。
结果
通过MTS测定所测量的，20min的OGD后1小时(31％)和4小时(30％)后分离的海马细胞培养物的代谢活力与对照培养物相比显著减低。当用FGLd处理细胞培养物(在OGD前24小时或OGD后即刻)时，减弱了OGD对代谢活力的影响。OHSC中的代谢活力显示对OGD的不同应答。OGD后1小时，与对照相比代谢活力显著增加(19％)，同时更长周期的恢复氧供应(24小时)导致代谢活力降低(24％)。在两个时间点，在OGD前24小时用FGLd处理与对照相比导致海马切片中代谢活力的正常化。在分离的细胞培养物和OHSC中，单独的FGLd处理导致代谢活力增加。此外，如果FGFR-抑制剂SU 5402与FGLd一起存在，用FGLd预处理24小时没有减弱OGD-诱导的代谢活力下降，表明FGLd可能通过FGFR活化影响代谢活力。
在分离的海马细胞培养物中，高钾刺激时前突触小泡释放(FM1-43脱色)的速率在统计学上通过FGLd处理是显著增强的(0.04sec-1至0.06sec-1)，而OGD后在1h和4h分析时是降低的(两者都为0.04sec-1至0.02sec-1)。如果在OGD前或OGD后即刻用FGLd处理细胞培养物24小时，FM1-43释放比率中OGD诱导的降低受到减弱。此外，FGFR-抑制剂SU 5402消除了FGLd对FM1-43释放中OGD-诱导的降低的影响。
在OHSC中，通过碘化丙啶(PI)染色评估OGD诱导延迟细胞损坏10分钟。OGD后在4小时(0.3％至5.0％)和24小时(0.6％至23.1％)存在OHSC PI染色的显著增加(全部CA1区域的％)。可通过用FGLd预处理切片24小时可几乎完全消除这种影响。也通过在OGD后即刻用FGLd处理切片避免细胞损坏，但如果在OGD后推迟FGLd处理4小时则不能避免。对照肽FGLC没有影响由OGD诱导的细胞损坏，如果用FGFR-抑制剂SU 5402与FGLd一起预培养切片，则PI染色与单独的OGD相似。
讨论
当在暂时除去氧和葡萄糖前24小时或除去后即刻应用在两个不同的体外模型系统中时，FGLd肽具有神经保护影响。OGD导致分离的海马细胞培养物和OHSC中代谢活力减少，在两个情况中用FGLd处理可部分地或完全地使OGD后代谢活力正常化。
已经报道缺血导致突触传递增强或突触传递减少，取决于所使用的模型和缺血性攻击的严重度。在用于该研究的模型中，当钾刺激时，20分钟的OGD导致突触前囊泡释放减少，并且这种减少通过在OGD前24小时或OGD后即刻施用FGLd肽而减弱。
因此，对于所有的3种参数研究(代谢活力、突触前囊泡释放和细胞活力)，FGL肽可部分地或完全地抑制OGD的影响。此外，在所有的3种情况中通过FGFR-抑制剂SU 5402抑制FGL的这种神经保护能力，表明FGFR活性是为FGL作用所必需的。
实施例6.FGL对大鼠的社会行为和β-淀粉样蛋白诱导神经毒性的体内影响。
模型的说明
本研究使用大鼠模型，其中通过(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段诱导神经毒性和认知损伤(参见Maurice T.等人(1996)(Brain Res.706：181-93)和Delobette S.，等人(1997)Eur JPharmacol.319：1-4)。通过大鼠中(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段诱导的短时记忆缺失对于研究具有特殊的重要性，正如其类似于阿尔茨海默氏病的一个临床表现。利用3种不同的行为测试评估大鼠中的短时记忆缺失：Social Recognition(Kogan等人，(2000)Hippocampus10：47-56)、Open Field(Cerbone和Sadile，(1994)Neurosci Biobehav Rev.18：497-518.；Vianna等人，(2000)Learn Mem.7：333-40)和Y-maze(Clayton &Williams，(2000)Neurobiol Learn Mem.74：135-45)测试，此外，对处死时收集的脑组织进行神经病理学的研究。枕骨下或鼻内施用FGL肽。
方法
具有早期处理的代表性的社会认知研究的时间安排用图解显示在图26(A)中。
适应环境5天时间后，用(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段(A-β)处理大鼠(每个动物25μg)，在脑的右侧脑室(第0天)进行i.c.v.注射。
在第7、10和13天或在第30、33和36天枕骨下(每个动物每次给药5μg)或鼻内(每个动物每次给药400μg)施用FGL肽(FGLL或FGLd)。利用Social Recognition测试、Open Field 测试或Light-dark DiscriminatingY-maze评估动物的行为。在第28-30天或第51天，在(25-35)β-淀粉样蛋白片段的i.c.v.给药后，处死动物，并且在选择的研究中，收集脑组织，用A-β特异的抗体免疫染色组织切片，计算淀粉样蛋白-覆盖层作为A-β阳性区域的百分比。此外，利用几何学方法计算脑切片中所选择区域中神经元的数目。
(25-35)A-β/载体-给药对社会行为和记忆的影响
在Social Recognition测试中，与接受载体(V)的对照动物相比，在接受(25-35)β-淀粉样蛋白片段的大鼠中发现在第二试验期间确定年幼大鼠花费的时间有增加。在Open Field测试中，(25-35)β-淀粉样蛋白片段-处理的大鼠与对照动物组中所表明的降低相比，没有降低20-分钟测试期间探查的活力。在用阳性食物加强的Light-dark Discriminating Y-maze中，用(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理的大鼠表明了误差(进入错误的桥臂)数目的增加。
因此，在所有的3个测试中，(25-35)β-淀粉样蛋白片段的i.c.v.给药导致如短时记忆损伤所呈现的认知缺失。
FGL给药对通过i.c.v.-给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段诱导认知损伤的大鼠的行为和记忆的影响
在几个独立研究中如下所述的不同体内测试中评估FGL的影响。
社会认知测试和神经组织病理学
研究1：i.c.v.给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段后，在第7、10和13天枕骨下施用FGL。在第14天，FGLd最后给药的次日在社会认知测试中没有观察到FGLd的效果，并且安慰剂-处理的大鼠相对于单独接受(25-35)β-淀粉样蛋白片段或FGLd的大鼠在海马CA3区域的神经组织病理学评估中没有观察到显著的影响。
研究2：i.c.v.给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段后在第7、10和13天枕骨下施用FGL。施用(25-35)β-淀粉样蛋白片段导致与对照大鼠相比，大鼠在第二次相遇时探查幼鼠所花费时间，以及在淀粉样蛋白覆盖层和神经元细胞死亡方面统计学上显著增加。然而，用FGLL和FGLd处理与只用β-淀粉样蛋白肽片段处理的动物相比时显著减少了第二试验期间处理动物探查幼大鼠所花费时间的增加。用FGLL和FGLd处理也显著减少了具带皮层(分别为从100％至39％ & 42％)和海马CA3区域中(分别为从100％至17％& 44％)的淀粉样蛋白覆盖层。此外，当与只用(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理的大鼠组相比时，FGLL和FGLd导致海马CA3区带中神经元密度增加(分别为15至21 & 22个神经元/mcm2×10-4)。图解结果如图13-16所示。
研究3：i.c.v.给药(25-35)β-淀粉样蛋白酶片段后，在第30、33和36天枕骨下施用FGLL。在第44天，FGLL最后给药后一星期，当枕骨下施用FGLL时观察到第二次暴露时大鼠探查新目标(年幼大鼠)所花费的时间与(25-35)A-β溶剂处理的对照大鼠相比的比率在统计学上显著减少(从0.50至0.41)。此外，神经病理学研究显示具带皮层(从100％至24％)和海马CA3区域(从100％至29％)中淀粉样蛋白覆盖层的统计上显著的减少。此外，与只用(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理的大鼠组相比，在具带皮层中观察到损伤神经元的百分比在统计上显著减少(从27至21个神经元/mcm2×10-4)。图解结果显示在图17-20中。
研究4：i.c.v.给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段后，在第7、10和13天鼻内施用FGLL。用淀粉样蛋白β肽诱导的处理诱导短期记忆缺失，其可通过用FGL-肽处理消除。在具带皮层中，与只用(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理的大鼠组相比，在应答FGLL给药中观察到神经元密度的统计学上显著的增加(从11至14μM2×10-4)。图解结果显示在图21-23中。
Open Field研究
i.c.v.-给药(25-35)β-淀粉样蛋白片段后，在第7、10和13天接受枕骨下施用FGLd的大鼠显示与在第14天，FGL最后给药次日的第一次测量期间相比探测孔穴的时间在统计学上显著减少(3.3s至0.1s)，在最后测量期间中进行繁殖(从7.0s至0.7s)所花费时间的统计学上显著的减少。只用(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理的大鼠组显示2个测量周期之间没有统计上显著的差异。在第14天运动活性未受影响。
伴随阳性食物-加强的Light-dark Discriminating Y-maze研究
接受FGLd枕骨下给药的大鼠显示在第25天，训练的最后一天误差数目在统计上显著减少(从3.8至1.7)，同时与(25-35)β-淀粉样蛋白片段处理得对照大鼠比较，在训练的第21-24天没有观察到显著差异。
讨论
用于这个研究的模型，(25-35)β-淀粉样蛋白片段诱导神经毒性反映了在Alzheimer′s患者中看到的神经病理和认知损伤的许多方面。在这个模型中，(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段的i.c.v.给药导致在(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段给药后第14天开始β-淀粉样蛋白肽的沉积，其导致神经元细胞死亡和认知损伤(短时记忆缺失)。
FGL肽的早期给药实验(在(25-35)β-淀粉样蛋白片段的i.c.v.注射后第7、10和13天)清楚地表明枕骨下和鼻内施用FGL可防止短时记忆缺失、减少各种脑区域中β-淀粉样蛋白覆盖和减少神经元细胞死亡。在i.c.v.-注射(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段后第30、33和36天，较后阶段FGL肽的给药改善了脑组织中神经病理学的变化和记忆缺失。
这些研究的重要方面是为了比较FGL给药的不同途径的有效性。获得的结果清楚地表明FGL肽的鼻内给药有效地减少了由用(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段处理诱导的记忆缺失，尽管鼻内施用FGL肽的效价与枕骨下施用该肽的效力相比要低很多。应该注意到鼻内施用FGL对记忆的影响是剂量依赖的。
总之，这些结果合起来表明FGL肽有减少由用(25-35)β-淀粉样蛋白肽片段处理诱导的神经病理学和减少记忆缺失的潜能。这些发现也表明FGL肽具有用于治疗患有阿尔茨海默氏病的患者中与β-淀粉样蛋白沉积作用相关的认知缺失的治疗学潜力。
实施例7.大鼠幼仔中感觉运动控制的发育
未成熟啮齿类的新生CNS是用于研究影响脑功能成熟的药物的有用模型。位置调整(移动)的成熟需要运动和感觉系统的整合。分娩后第一个星期期间位置和运动功能的成熟与从脑干和皮层脊髓束在出生后(PND)3天到达胸水平和在出生后(PND)第6天到达腰水平的下行通路的生长有关。因此，可认为PND 3和PND 6之间的时间是对能够改变感觉运动系统的出生后整合的因素效果敏感的时期。许多运动控制试验是有效的，其可用于确定神经活性药物，例如FGL的效果。在本研究中，选择大鼠幼仔的表面复原反应表现(Surface Righting Response performance)(Tilney，1933)、支点运动表现(Pivoting Locomotion performance)(Altman等，(1975)Anim Behav.；23：896-920)、负趋地性表现(Negative Geotaxis performance)[Henck等，(2001 Toxicol Sci.62：80-91)、和前蹄悬挂表现(Forepaw Suspensionperformance)[Kimler等，(1998)Brain Res Dev Brain Res.107：49-55)来评估FGL对感觉运动控制发育的影响。如图26(B)所示图解实验的时程。
剂量-反应研究。评估大鼠幼仔在出生后(PND)第1、2和3天鼻内每天施用0.026、0.26和2.6μg FGLd对表面正位反射表现的影响。在这个研究中使用总共5窝幼仔，每窝由10个幼仔组成(5个雄性和5个雌性)。
与载体-处理的对照动物相比，在PND第5天给药FGLd(每个幼仔每次施用2.6μg浓度)显著改善了表面正位反射的表现(从3.4s至1.3s)。
感觉运动控制发育研究。评估在PND 1、2和3天鼻内每日接受2.6μg肽的大鼠幼仔中FGL对感觉运动控制发育(表面正位反射、负趋地性反射、支点运动和前蹄悬挂性能)的影响。在这个研究中使用总共6窝幼仔，每窝由10个幼仔组成(5个雄性和5个雌性)。
FGL的给药与载体-处理的对照大鼠相比较，在PND 4天表面正位反射表现有统计上显著的改善(从2.1s至1.6s)(图24)以及在PND 6天负趋地性反射表现有统计上显著的改善(从56.7％至80.0％)(图25)，对支点运动活动或前蹄悬挂表现没有影响。这表明FGL促进出生后的感觉运动控制发育，而不干扰其它的功能。另外，在PND 9天没有观察到对负趋地性表现有重要的影响，表明在PND 9天已经完成运动控制发育。
讨论
该结果证明FGL肽在出生后发育期间对CNS适应性起始过程调节的影响，并且表明FGL肽通过刺激FGF受体可能具有加速感觉-运动机能发育潜能。
实施例8.关联性条件化恐惧实验和Morris水迷宫实验
关联性条件化恐惧实验(Cordero等，(2003 Horm Be-hav.2003 Nov；44(4)：338-45)和Morris水迷宫实验(Morris R.(1984)J Neurosci Methods.1147-60)是评估学习和记忆的项目，并且用来比较正常对照大鼠和用药物处理的大鼠的特性。
在关联性条件化恐惧实验中，当大鼠处于*导致由特有的不动性或′僵硬反应′组成的条件性恐惧反应发育的新环境条件下，后来又再次暴露于相同的环境，大鼠经受不可避免的打击。
在Morris水迷宫实验中，在发现隐藏平台以逃避在水中游泳的空间训练作业中评估大鼠。
本研究调查了训练后给药FGLd肽是否在嫌恶物和/或新处境的记忆巩固调整中是有效的。
关联性条件化恐惧实验
在第一天的实验前每日处理大鼠120秒连续3天。在(训练)第1天，大鼠接受每分钟1-秒的冲击(无条件刺激)，进行2分钟。动物训练后立即注射5μl FGLd(5μg)、对照肽(5μg)或溶剂。各个处理组由11-14只大鼠组成。总共评估39个动物。在第2、7和30天通过将它们放置在用于处理但没有冲击的小室中8分钟来测试动物。每2秒使用随时间取样方法将每个大鼠列为″僵硬″或″活跃″。
如图26(C)所示图解实验的时程。
当在处理后第2天(从50.5％至73.5％)和第7天(从30.0％至60.3％)测试动物时检测到与接受安慰剂的大鼠或对照相比FGLd给药后僵硬时间百分数有统计显著的增加。这表明当在成年雄性Wistar大鼠中训练后给药时，FGLd能够改善条件恐惧反应的长期保持力。
Morris水迷宫实验
在Morris水迷宫实验(Morris Water Maze test)研究中，在实验前通过每日训练120秒，进行5天(从第一4至0天)预训练大鼠定位隐藏的平台。在第1和2天，给大鼠其中平台位置保持不变的3次连续试验。120秒的最大测试期间内记录大鼠能够定位平台的时间。在每个训练试验后的第1和2天使大鼠立即接受5μl FGLd肽(5μg)、对照肽(5μg)、或溶剂溶液。
训练后24小时(第3天)和7天(第10天)测试动物。训练后14天(第17天)，变化平台的位置。在3个连续试验中训练大鼠发现平台的新位置(″倒序学习(reversal learning)″)。总共评估48个动物。将动物分为3组，每试验组由12-18个大鼠组成。
施用FGLd如同在Morris水迷宫实验(Morris Water Maze test)中所评估的改善了大鼠的长时记忆的巩固。在第2天，FGLd、FGL、或溶剂第一次给药的那一天，FGLd-处理的大鼠比未处理的大鼠(93.0s)能够统计上显著更快定位平台(65.8s)。在第17天该影响也是统计学显著的、表明改善了学习能力。
如图26(D)所示图解实验的时程。
Open Field测试中的附加实验表明FGLd没有影响大鼠的情绪或运动行为。
讨论
CFC/MWM的研究结果证明FGLd对正常大鼠学习和记忆的长期效应。FGL可能通过触发涉及长时记忆形成的信号传导级联来发挥作用。如上文所显示的，FGL可调整通过FGFR的突触适应性行为，其导致突触前小泡翻转(pre-synaptic vesicle turnover)的增加。这些结果一同表明FGL在患有学习和记忆损伤的患者治疗中具有很好的治疗学潜力。
实施例9.FGLL的体内药学动力学：血浆和CSF中FGLL的评估
通过放射免疫测定评估大鼠和狗的血浆和CSF中所施用的FGLL的水平。
测定
a)大鼠和狗的血浆样品包含作为抗凝剂的肝素锂。
b)FGLL是碘化的。使用lodogen方法进行碘化作用。在C18柱上从未掺入的I125纯化碘化的肽。
c)重复进行测量。
1.将血浆(或CSF)样品(20μl)加入含有EDTA的试管(n＝2)。使用包含非免疫性的兔血清(或来自对照动物的CSF)(20μl)的非特异结合(NSB)试管作为对照。
2.加入稀释的放射性标记的FGLL(100μl；大约20,000cpm/试管的示踪剂)。也制备只包含示踪剂的对照管。
3.向所有的试管(除了对照试管)加入稀释的抗血清样品(1∶20,000的PAb268；100μl)。涡旋混合内容物。
4.在4℃孵育试管过夜。
5.向除包含示踪剂的试管外的所有试管加入抗兔SAC-细胞溶液(0.1ml)。涡旋混合内容物然后在室温下孵育30min。
6。向除包含示踪剂的试管外的所有试管加入洗涤缓冲液(2ml)并且以3000rpm离心试管5分钟。
7.弃去上清液控干试管不超过1分钟。
8.再次向试管加入洗涤缓冲液(1.5ml)并且以3000rpm离心试管5分钟。
9.弃去上清液控干试管不超过1分钟。其后以3000rpm离心试管1分钟。
10.所有的试管计数两次：第一次3分钟，第二次10分钟。
结果
在FGLL浓度范围为0.080ng/ml至20.48ng/ml的大鼠血浆中重复(n＝6)制备校准曲线的精确图形。在整个浓度范围内观察到很好的精确性，直到0.160ng/ml都有可接受的准确度(＜25％)，其表示大鼠血浆中该量化测定的潜在下限(LLOQ)。增加计数时间提高了测定的精确性。
在FGLL浓度范围为0.080ng/ml至20.48ng/ml的狗血浆中重复(n＝6)制备校准曲线的精确图形。
利用计算机程序WinNonlin Pro 3.3版(Pharsight Corporation，美国)计算药物动力学参数。低于量化极限(BLQ)的值在平均值计算中以0输入。
也定义一些毒性动力学参数。测量的毒性动力学参数包括FGLL的最大血浆浓度(Cmax)，其出现时间(Tmax)，给药后(post-dose)24小时的血浆浓度(C24)。通过线性梯形法则评估24小时剂量间隔(AUC24)内血浆FGLL.浓度-时间曲线下的面积。在鼻内给药后AUC24值的计算中，样品时间以给药开始为基准(假设5次给药过程中的每次之间有10分钟的间断)。通过拟合log浓度对于时间的线性回归评估终速率常量(k)。终点半衰期(t1/2)计算为In2/k。
来自用50mg/kg静脉内处理的2个大鼠的CSF中FGLL水平是321和269ng/ml。来自用100mg/kg皮下处理的其它大鼠的CSF中FGLL水平是242，92和81ng/ml。当肠胃外给药时，这些数据提供FGLL进入CNS的证明。
第一剂量给药后的毒性动力学取样显示：
组合的雄性和雌性暴露(50mg/kg/日，i.v.)：
AUC＝51,026h.ng/mL；Cmax＝20,951ng/mL.
组合的雄性和雌性暴露(100mg/kg/日，s.c.)：
AUC＝50，119h.ng/mL；Cmax＝8,346ng/mL.
表12显示在接受剂量为15，30和75mg/kg s.c.的FGLL狗中计算的毒性动力学参数。
| 剂量 | 狗的编号 | 天 | Cmax(ng/ml) | Tmax(hr) | AUC(0-24)(hr*ng/ml) | AUC(hr*ng/ml) |
| 15mg/kg | 2 | 1 | 7132 | 2.0 | 62965 | 84829 |
| 7 | 2204 | 2.0 | 41531 | 70416 | ||
| 30mg/kg | 3 | 1 | 9863 | 2.0 | 81243 | 104608 |
| 7 | 2709 | 4.0 | 38208 | 58518 | ||
| 75mg/kg | 4 | 1 | 9222 | 4.0 | 130497 | 161489 |
| 7 | 2281 | 8.0 | 70642 | 63191 |
来自3只狗的CSF在第8天最后剂量后1小时取样)中FGLL的平均水平为从动物编号2的4.1ng/ml至动物编号3的8.1ng/ml，表明皮下给药后FGLL穿透进入CNS。
实施例10.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的肽片段的体外影响
SEQ ID NO：2的单个单体肽，EFL肽，能够在如上所述的实验设置组中强烈刺激大鼠海马神经元的神经突长出并且刺激大鼠小脑神经元的存活(该效果相应地由图27和28所示)。EFL肽来源于NCAM的Fn 3，2模块(module)并且代表该模块的E链-环-G链部分。为了实验如上所述合成该肽。肽的神经突发生活性是FGFR1依赖的，因为经该肽的刺激受到FGFR1抑制剂，SU54402的特异阻断。该肽也能够在表达该受体的细胞中结合和刺激FGFR1，其中该肽诱导受体磷酸化作用(在浓度为20μg/ml时大于300％)。利用下列测定研究FGFR1的磷酸化。通过使用从大鼠PC12细胞系分离的RNA的RT-PCR克隆大鼠FGFR1(IIIC同工型)的cDNA，并将其插入pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)，该质粒容许表达与六组氨酸N-末端融合的FGFR1。在60mm平皿的完全培养基(补充有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg ml链霉素和58.4g/l Glutamax的DMEM 1965)中培养～8×105个HEK293细胞24h，然后利用Lipofect AMINPLUStm试剂盒按照制造商的指导(Gibco BRL)用0.2μg质粒(具有FGFR)进行转染。在完全培养基中使细胞再生长24hrs、然后转入饥饿培养基(DMEM 1965)过夜。用溶解在8M尿素、1mM原钒酸盐(在PBS中)中的EFL单体刺激FGFR转染的细胞20min，并且如下借助于His-tag从溶解产物进行纯化：将溶解产物加载到Ni2+/NTA-琼脂糖凝胶(Qiagen)上，用溶解缓冲液加上10mM咪唑洗涤，用溶解缓冲液加上250mM咪唑洗提FGFR。通过使用抗pentahis(Qiagen)或抗磷酸酪氨酸(PY20，Transduction Laboratories)抗体的免疫印迹法分析纯化的FGFR。通过化学荧光显示条带，使用GeneGnome仪器(SynGene)测量条带密度。
在如上所述的测定中还研究了来源于轴突-缔合的细胞粘着分子[NCBI：NP_031544.1]序列的肽。所选择的肽是SEQ ID NO：5所示的序列的11个氨基酸的片段，其从C-末端具有2个氨基酸截短。类似于FGL和EFL肽，该肽在体外能够显著刺激大鼠海马神经元的神经突向外生长。在0.3μg/ml浓度的肽观察到轴突长度增加500％的最大效果。
序列表
<110>恩卡姆医药公司(ENKAM Pharmaceutical A/S)
<120>包含LPA的化合物
<130>P 770 PC00
<160>146
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM Fn III，2[Swiss-Prot：P13591]：FGFR结合基序
<400>1
Glu Val Tyr Val Val Ala Glu Asn Gln Gln Gly Lys Ser Lys Ala
1 5 10 15
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>白细胞介素-6受体β链[Swiss-Prot：Q00560]：FGFR结合基序
<400>2
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn A1a Leu G1y Lys Lys Val
1 5 10 15
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>硫酸乙酰肝素蛋白聚糖基底膜蛋白聚糖[Swiss-Prot：P98160]：FGFR结合基序
<400>3
Ala Thr Asn Arg Gln Gly Lys Val Lys Ala Phe Ala His Leu
1 5 10
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>解聚素和金属蛋白酶区域8(ADAM-8)[Swiss-Prot：Q05910]：FGFR结合基序
<400>4
Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Val Val Ala Asp Ser Gln Glu Phe Gln Lys
1 5 10 15
<210>5
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轴突相关的细胞粘附分子[NCBI：NP_446331]：FGFR结合基序
<400>5
Val Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Val Ala Lys Gly
1 5 10
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>髓磷脂相关糖蛋白(MAG)[Swiss-Prot：P20917]：FGFR结合基序
<400>6
Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln Arg
1 5 10
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM的区域FIII，1[Swiss-Prot：P13591]：FGFR结合基序
<400>7
Arg Leu Ala Ala Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser
1 5 10
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经烟酸乙酰胆碱受体α3亚基(CHRNA 3)[Swiss-Prot：Q8VHH6/P04757：/Q8R4G9/P32297]：FGFR结合基序
<400>8
Lys Tyr Ile Ala Glu Asn Met Lys Ala Gln Asn Val Ala Lys Glu Ile
1 5 10 15
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM的FTTT，1区域(Swiss-Prot：P13591)：FGFR结合基序
<400>9
Thr Ile Met Gly Leu Lys Pro Glu Thr Arg Tyr Ala Val Arg
1 5 10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>粒细胞集落刺激因子受体前体(G-CSF-R；CD114抗原)[Swiss-Prot：Q99062]：FGFR结合基序
<400>10
Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser Ala Ala Thr Glu Phe Lys Thr
1 5 10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM Fn III，1[Swiss-Prot：P13591]：FGFR结合基序
<400>11
Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly
1 5 10
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>粒细胞集落刺激因子受体前体(G-CSF-R；CD114抗原)[Swiss-Prot：P40223]：FGFR结合基序
<400>12
Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly
1 5 10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>细胞因子样因子-1前体(CLF-1)[Swiss-Prot：O75462]：FGFR结合基序
<400>13
Glu Ile Trp Val Glu Ala Thr Asn Arg Leu Gly
1 5 10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>白细胞介素-23受体(IL-23R)[Q8NFQ9]：FGFR结合基序
<400>14
Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly
1 5 10
<210>15
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>补体因子1q，α多肽(ClQA)[Swiss-Prot：Q9DCM6]：FGFR结合基序
<400>15
Glu Val Trp Ile Glu Lys Asp Pro Ala Lys Gly Arg Ile
1 5 10
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成束蛋白II前体(FAS2)[Swiss-Prot：P22648]：FGFR结合基序
<400>16
Ala Thr Asn Lys Gly Gly Glu Val Lys Lys Asn Gly His Leu
1 5 10
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-19前体(EC 3.4.24.-)[Swiss-Prot：Q9H013/O35674]：FGFR结合基序
<400>17
Lys Tyr Val Glu Leu Tyr Leu Val Ala Asp Tyr Leu Glu Phe Gln Lys
1 5 10 15
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-8前体(EC 3.4.24.-)[Swiss-Prot：P78325]：FGFR结合基序
<400>18
Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Val Val Val Asp Asn Ala Glu Phe Gln
1 5 10 15
<210>19
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-12前体(EC 3.4.24.-)[Swiss-Prot：O43184；Q61824]：FGFR结合基序
<400>19
Lys Tyr Val Glu Leu Val Ile Val Ala Asp Asn Arg Glu Phe Gln Arg
1 5 10 15
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>包含蛋白质TECADAM的金属蛋白酶解聚素区域[AF163291]：FGFR结合基序
<400>20
Lys Tyr Ile Glu Tyr Tyr Val Val Leu Asp Asn Gly Glu Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210>21
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-33前体(EC 3.4.24.-)[Swiss-Prot：Q9BZ11/Q923W9]：FGFR结合基序
<400>21
Arg Tyr Leu Glu Leu Tyr Ile Val Ala Asp His Thr Leu Phe
1 5 10
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-1A受精蛋白α[Swiss-Prot：Q8R533]：FGFR结合基序
<400>22
Lys Tyr Val Glu Met Phe Val Val Val Asn His Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
<210>23
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-9[Swiss-Prot：Q13433；Q61072]：FGFR结合基序
<400>23
Arg Tyr Val Glu Leu Phe Ile Val Val Asp Lys Glu Arg Tyr
1 5 10
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-7前体[Swiss-Prot：Q9H2U9]：FGFR结合基序
<400>24
Lys Tyr Val Glu Leu Phe Ile Val Ala Asp Asp Thr Val Tyr Arg Arg
1 5 10 15
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-7前体[Swiss-Prot：O35227；Q63180]：FGFR结合基序
<400>25
Lys Phe Ile Glu Leu Phe Val Val Ala Asp Glu Tyr Val Tyr Arg Arg
1 5 10 15
<210>26
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-15前体[Swiss-Prot：Q9QYV0；O88839]：FGFR结合基序
<400>26
Lys Ile Val Glu Lys Val Ile Val Ala Asp Asn Ser Glu Val Arg Lys
1 5 10 15
<210>27
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ADAM-15前体[Swiss-Prot：Q13444]：FGFR结合基序
<400>27
Val Glu Leu Val Ile Val Ala Asp His Ser Glu Ala Gln Lys
1 5 10
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附蛋白BIG-2前体[Swiss-Prot：Q62845]：FGFR结合基序
<400>28
Val Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Ile Ala Lys Gly
1 5 10
<210>29
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经元糖蛋白CNTN3[Swiss-Prot：Q07409]：FGFR结合基序
<400>29
Ile Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Val Ala Arg Gly
1 5 10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NB-2(HNB-2/NB-2)，接触蛋白的神经细胞识别分子/F3亚组[Swiss-Prot：O94779/P97527]：FGFR结合基序
<400>30
Ala Glu Asn Ser Arg Gly Lys Asn Ser Phe Arg Gly
1 5 10
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HNB-3/NB-3[Swiss-Prot：Q9UQ52/P97528/Q9JMB8]：FGFR结合基序
<400>31
Ile Ala Ser Asn Leu Arg Gly Arg Asn Leu Ala Lys Gly
1 5 10
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>推定的脂肪样钙粘蛋白前体(Drosiphila)[Swiss-Prot：Q9VW71]：FGFR结合基序
<400>32
Ile Pro Glu Asn Ser Leu Gly Lys Thr Tyr Ala Lys Gly
1 5 10
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经烟酸乙酰胆碱受体α3亚基(CHRNA3)[Swiss-Prot：Q8VHH6/P04757/Q8R4G9/P32297]：FGFR结合基序
<400>33
Ile Ala Glu Asn Met Lys Ala Gln Asn Glu Ala Lys
1 5 10
<210>34
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经乙酰胆碱受体蛋白，α-6链前体(CHRNA6)[Swiss-prot：Q15825]：FGFR结合基序
<400>34
Gln Phe Ile Ala Glu Asn Met Lys Ser His Asn Glu Thr Lys Glu Val
1 5 10 15
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ROBO-1[O44924]：FGFR结合基序
<400>35
Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Lys Asn Arg Val Gly Gln
1 5 10
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ROBO-1[AF041082；Q9Y6N7]：FGFR结合基序
<400>36
Gly Ser Tyr Thr Cys Val Ala Glu Asn Met Val Gly Lys
1 5 10
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ROBO-1[AF041082；Q9Y6N7]：FGFR结合基序
<400>37
Gly Lys Tyr Val Cys Val Gly Thr Asn Met Val Gly Glu Arg
1 5 10
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FGFR2[Q96KM2；P21802]：FGFR结合基序
<400>38
Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Glu Tyr Gly
1 5 10
<210>39
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FGFR2[Q63241]：FGFR结合位点
<400>39
Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly
1 5 10
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fc受体样蛋白1[Q96KM2]/IFGP 1片段[Q96PJ6]：FGFR结合基序
<400>40
Gln Tyr Tyr Cys Val Ala Glu Asn Gly Tyr Gly
1 5 10
<210>41
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接合粘附分子(JAM-1)[Q9JKD5/O88792]：FGFR结合基序
<400>41
Gly Glu Tyr Tyr Gln Glu Ala Glu Gln Asn Gly Tyr Gly
1 5 10
<210>42
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>42
Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Glu Tyr Gly
1 5 10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接触蛋白前体(神经粘附分子F3)[Q63198；/P1260；Q12860]：FGFR结合基序
<400>43
Gly Met Tyr Gln Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly
1 5 10
<210>44
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接触蛋白前体(神经粘附分子F3/F11)[Q28106]：FGFR结合基序
<400>44
Gly Met Tyr Gln Cys Ala Glu Asn Thr His Gly
1 5 10
<210>45
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接触蛋白前体(神经粘附分子F3/F11)[Q28106]：FGFR结合基序
<400>45
Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Ser Asn Asn Tyr Gly
1 5 10
<210>46
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFGP2[Q96PJ5]：FGFR结合基序
<400>46
Gly Gly Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Ser Tyr Gly
1 5 10
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白前体[Q90924]：FGFR结合基序
<400>47
Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Asp Tyr Gly
1 5 10
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白[Q90924]：FGFR结合基序
<400>48
Gly Glu Tyr Phe Cys Leu Ala Ser Asn Lys Met Gly
1 5 10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白155Da同种型[Q91Z60]：FGFR结合基序
<400>49
Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Lys Phe Gly
1 5 10
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白155Da同种型[Q91Z60]：FGFR结合基序
<400>50
Gly Glu Tyr Phe Cys Leu Ala Ser Asn Lys Met Gly
1 5 10
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>巨噬细胞消除受体2(MSR2)[Q91YK7]：FGFR结合基序
<400>51
Gly Gly Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Asn Tyr Gly
1 5 10
<210>52
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>巨噬细胞消除受体2(MSR2)[Q91YK7]：FGFR结合基序
<400>52
Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Glu Asn Ala Trp Gly Thr Lys
1 5 10
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子L1[Q9QYQ7；Q9QY38；P11627；Q05695；P32004]：FGFR结合基序
<400>53
Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Glu Asn Ser Leu Gly
1 5 10
<210>54
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经胶质细胞粘附分子Ng-CAM[Q03696]：FGFR结合基序
<400>54
Gly Glu Tyr Glu Cys Val Ala Glu Asn Gly Arg Leu Gly
1 5 10
<210>55
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FGFR3[Q95M13；AF487554；Q99052]：FGFR结合基序
<400>55
Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Lys Phe Gly Arg
1 5 10
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FGFR3[Q95M13；Q99052]：FGFR结合基序
<400>56
Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly
1 5 10
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子2(NCAM2)[P36335]：FGFR结合基序
<400>57
Gly Glu Tyr Phe Cys Val Ala Ser Asn Pro Ile Gly
1 5 10
<210>58
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子2(NCAM2)[P36335]：FGFR结合基序
<400>58
Glu Tyr Thr Cys Ile Ala Asn Asn Gln Ala Gly Glu
1 5 10
<210>59
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Axonin-1(TAG-1)[Q02246；P22063；P28685]：FGFR结合基序
<400>59
Gly Met Tyr Gln Cys Val Ala Glu Asn Lys His Leu Gly
1 5 10
<210>60
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子NCAM-140[P13595]：FGFR结合基序
<400>60
Gly Glu Tyr Met Cys Thr Ala Ser Asn Thr Ile Gly Gln
1 5 10
<210>61
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子NCAM-140[P13595]：FGFR结合基序
<400>61
Glu Tyr Val Cys Ile Ala Glu Asn Lys Ala Gly Glu Gln
1 5 10
<210>62
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经营养因子受体酪氨酸激酶型2(NTRKT)[Q8WXJ5]：FGFR结合基序
<400>62
Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Lys
1 5 10
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>结肠直肠癌抑制素DCC[P43146]：FGFR结合基序
<400>63
Gly Phe Tyr Gln Cys Val Ala Glu Asn Glu Ala Gly
1 5 10
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>酪氨酸磷酸酶LAR(ptprf)[Q9EQ17；Q64604；P23468]：FGFR结合基序
<400>64
Gly Lys Tyr Glu Cys Val Ala Thr Asn·Ser Ala Gly Thr Arg
1 5 10
<210>65
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>血小板衍生的生长因子受体β(PDGFRB)[Q8R406；Q05030]：FGFR结合基序
<400>65
Gly Glu Tyr Phe Cys Val Tyr Asn Asn Ser Leu Gly
1 5 10
<210>66
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>细胞间粘附分子-5(ICAM-5，telencephalin)[Q8TAM9；Q60625]：FGFR结合基序
<400>66
Gly Glu Tyr Glu Cys Ala Ala Thr Asn Ala His Gly Arg
1 5 10
<210>67
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>B细胞受体CD22前体(Leu-14；B淋巴细胞粘附分子)[P20273]：FGFR结合基序
<400>67
Gly Ala Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys
1 5 10
<210>68
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>B细胞受体CD22前体(Leu-14；B淋巴细胞粘附分子)[P20273]：FGFR结合基序
<400>68
Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly
1 5 10
<210>69
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM-2[Swiss-Prot：015394；035136]：FGFR结合基序
<400>69
Arg Val Ala Ala Val Asn Gly Lys Gly Gln Gly Asp Tyr Ser
1 5 10
<210>70
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HCF-2(宿主细胞因子2)[Swiss-Prot：Q9Y5Z7]：FGFR结合基序：FGFR结合基序
<400>70
Arg Val Ala Ala Ile Asn Gly Cys Gly Ile Gly Pro Phe Ser
1 5 10
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ICLN(氯化物途径调节器，诱导物)[Swiss-Prot：P97506；Q9NRD2；Q61189；P54105]：FGFR结合基序
<400>71
Ala Val Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly
1 5
<210>72
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>半乳凝素-12[Swiss-Prot：Q91VD1；Q9JKX2；Q9NZ03]：FGFR结合基序
<400>72
Ala Leu Asn Gly Gln Gly Leu Gly Ala Thr Ser
1 5 10
<210>73
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人受体样蛋白酪氨酸磷酸酶白细胞共同抗原抗原相关分子(PTPRF)[Swiss-Prot：P10586]：FGFR结合基序
<400>73
Arg Leu Ala Ala Lys Asn Arg Ala Gly Leu Gly Glu
1 5 10
<210>74
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>天然抗性相关的巨噬细胞蛋白质1(NRAMP-1，SLC11 A1)[Swiss-Prot：077741]：FGFR结合基序
<400>74
Arg Leu Gly Val Val Thr Gly Lys Asp Leu Gly Glu Ile
1 5 10
<210>75
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NCAM2(180kDa同种型前体)[Swiss-Prot：P36335]：FGFR结合基序
<400>75
Thr Val Thr Gly Leu Lys Pro Glu Thr Ser Tyr Met Val Lys
1 5 10
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肾升压素(Nephrin)[Swiss-Prot：Q925S5；Q9JIX2；Q9ET59；Q9R044；Q9QZS7]：FGFR结合基序
<400>76
Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Ser Thr Arg Tyr Arg Ile
1 5 10
<210>77
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肾升压素[Swiss-Prot：O60500]：FGFR结合基序
<400>77
Thr Leu Thr Gly Leu Gln Pro Ser Thr Arg Tyr Arg Val
1 5 10
<210>78
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>酪氨酸磷酸酶LAR(PTPRF)[Swiss-Prot：Q9EQ17]：FGFR结合基序
<400>78
Thr Leu Leu Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Ile Lys
1 5 10
<210>79
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>白细胞共同抗原相关磷酸酶ptp2前体(LAR-PTP2)[Swiss-Prot：Q64605]：FGFR结合基序
<400>79
Thr Leu Gln Gly Leu Arg Pro Glu Thr Ala Tyr Glu Leu Arg
1 5 10
<210>80
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，S前体(EC 3.1.3.48)(蛋白酪氨酸磷酸酶sigma)
(RPTP-sigma)[Swiss-Prot：Q64699]：FGFR结合基序
<400>80
Thr Leu Arg Gly Leu Arg Pro Glu Thr Ala Tyr Glu Leu Arg
1 5 10
<210>81
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>酪氨酸蛋白激酶受体Tie-1前体(TIE1.)(EC 2.7.1.112)[Swiss-Prot：Q06805；P35590]：FGFR结合基序
<400>81
Thr Leu Met Asn Leu Arg Pro Lys Thr Gly Tyr Ser Val Arg
1 5 10
<210>82
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肾升压素A型受体8前体(EPHA8..)(EC 2.7.1.112)(酪氨酸蛋白激酶受体EEK)(EPH-和ELK-相关激酶)]：
[Swiss-Prot：O09127；O09127；P29322]；FGFR结合基序
<400>82
Thr Val Ser Gly Leu Lys Pro Gly Thr Arg Tyr
1 5 10
<210>83
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肾升压素A型受体3前体(EC 2.7.1.112)(酪氨酸蛋白激酶受体ETK1)(CEK4)(EPHA 3..)
[tn：P29318]：FGFR结合基序
<400>83
Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr
1 5 10
<210>84
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶受体型S前体(EC 3.1.3.48)(蛋白酪氨酸磷酸酶sigma，PTPRS)
[Swiss-Prot：Q13332]：FGFR结合基序
<400>84
Thr Leu Gln Gly Leu Lys Pro Asp Thr Ala Tyr
1 5 10
<210>85
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素受体[Swiss-Prot：Q9PWN6]：FGFR结合基序
<400>85
Leu Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val
1 5 10
<210>86
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VII型胶原[Swiss-Prot：Q63870]：FGFR结合基序
<400>86
Ile Asp Gly Leu Glu Pro Asp Thr Glu Tyr Ile Val Arg
1 5 10
<210>87
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素样生长激素-1受体前体[Swiss-Prot：O73798]：FGFR结合基序
<400>87
Leu Gln Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile
1 5 10
<210>88
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>纤连蛋白[Swiss-Prot：Q95KV4；Q95KV5；P07589；Q28377；U42594；O95609]：FGFR结合基序
<400>88
Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Gln
1 5 10
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素样生长激素I受体(IGF I受体β-亚单位，IGF I受体α-亚单位)[Swiss-Prot：Q9QVW4；P08069；P2
4062；Q60751；P15127；P15208]：FGFR结合基序
<400>89
Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val
1 5 10
<210>90
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素受体相关的蛋白前体(EC 2.7.1.112)(IRR)(IR-相关受体)[Swiss-Prot：P14616]：FGFR结合基序
<400>90
Thr Leu Ala Ser Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Val
1 5 10
<210>91
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肌腱蛋白-R结合腕蛋白-R(restrictin)[Swiss-Prot：Q15568；O00531]：FGFR结合基序
<400>91
Leu Met Gly Leu Gln Pro Ala Thr Glu Tyr Ile Val
1 5 10
<210>92
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Neogenin前体(NEO1..)[Swiss-Prot：Q92859；P97603；Q90610；P97798]：FGFR结合基序
<400>92
Lys Gly Met Gly Pro Met Ser Glu Ala Val Gln Phe Arg Thr
1 5 10
<210>93
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(PTPRD，BA175E13.1)[Swiss-Prot：Q8WX65；Q9IAJ1；
P23468；Q64487]：FGFR结合基序
<400>93
Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Val Lys
1 5 10
<210>94
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(PTPRD，BA175E13.1)[Swiss-Prot：
Q8WX65；Q9IAJ1；P23468；Q64487]：FGFR结合基序
<400>94
Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Thr Ser Tyr Ser Leu
1 5 10
<210>95
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶受体型F前体(EC 3.l.3.48)(LAR蛋白)(与白细胞抗原相关的)
[Swiss-Prot：Q64604；Q9QW67；P10586]：FGFR结合基序
<400>95
Thr Leu Leu Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr Tyr Asp Ile Lys
1 5 10
<210>96
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶受体型F前体(EC 3.1.3.48)(与白细胞抗原相关的)
[Swiss-Prot：Q64604；Q9QW67；P10586]：FGFR结合基序
<400>96
Thr Ile Ser Gly Leu Thr Pro Glu Thr Thr Tyr Ser Ile
1 5 10
<210>97
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CD22[Q9R094]：FGFR结合基序
<400>97
Gly Asn Tyr Ser Cys Leu Ala Glu Asn Arg Leu Gly Arg
1 5 10
<210>98
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FGFR-4[Q91742]：FGFR结合基序
<400>98
Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu Asn Arg Val Gly
1 5 10
<210>99
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ICAM-5[Q8TAM9]：FGFR结合基序
<400>99
Gly Thr Tyr His Cys Val Ala Thr Asn Ala His Gly
1 5 10
<210>100
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ll的FIII，4：FGFR结合基序[Swiss-Prot：Q9QY38]
<400>100
Leu Ser His Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Ser Tyr
1 5 10
<210>101
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经元-神经胶质细胞粘附分子(Ng-CaM)前体。[Gallus gallus]；
[Swiss-Prot：Q90933]：FGFR结合基序
<400>101
Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Val Leu Arg Tyr
1 5 10
<210>102
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白前体。[Gallus gallus]；[Swiss-Prot；O42414]：FGFR结合基序
<400>102
Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Asn Leu Arg Tyr
1 5 10
<210>103
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>(CALL)神经细胞粘附分子[人(Homo sapiens)][Swiss-Prot：O00533]：FGFR结合基序
<400>103
Asn Gly Asn Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Gln Tyr
1 5 10
<210>104
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>f神经胶质蛋白[Manduca sexta][Swiss-Prot：P91767]：FGFR结合基序
<400>104
Val Asp Glu Asn Gly Val Leu Thr Gly Tyr Lys Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210>105
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶sigma[Swiss-Prot：O75870]；和[Swiss-Prot：Q13332][人(Homo sapiens)]：FGFR结合基序
<400>105
Thr His Asn Gly Ala Leu Val Gly Tyr Ser Val Arg Tyr
1 5 10
<210>106
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NR-CaM 12[Rattus sp]，[Swiss-Prot：Q9QVN3]：FGFR结合基序
<400>106
Asn Gly Ile Leu Thr Glu Tyr Ile Leu Lys Tyr
1 5 10
<210>107
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经束蛋白155kDa同种型[Rattus norvegicus]，[Swiss-Prot：Q91Z60]：FGFR结合基序
<400>107
Asn Gly Ile Leu Ile Gly Tyr Thr Leu Arg Tyr
1 5 10
<210>108
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Neogenin(片段)。[Gallus gallus]，[Swiss-Prot：Q90610]：FGFR结合基序
<400>108
Thr His Ser Gly Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Ile Arg Tyr
1 5 10
<210>109
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Neogenin(片段)。[Gallus gallus]，[Swiss-Prot：Q90610]：FGFR结合基序
<400>109
Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>金属蛋白酶1(pitrilysin家族).[人(Homo sapiens)][Swiss-Prot：Q9BSI6]：FGFR结合基序
<400>110
Leu Ser His Asn Gly Ile Phe Thr Leu Tyr
1 5 10
<210>111
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBRAVO/Nr-CaM.[人(Homo sapiens)].[Swiss-Prot：Q92823；O15179]：FGFR结合基序
<400>111
Asn Gly Ile Leu Thr Glu Tyr Thr Leu Lys Tyr
1 5 10
<210>112
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酪氨酸磷酸酶κ前体(EC 3.1.3.48)(R-PTP-kappa)。[人(Homo sapiens)]
[Swiss-Prot：Q15262]：FGFR结合基序
<400>112
Leu Asp Pro Asn Gly Ile Ile Thr Gln Tyr Glu Ile Ser Tyr
1 5 10
<210>113
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Neogenin前体(NEO1..).[Homo sapiens and Mus musculus][Swiss
-Prot：Q92859；P97798]：FGFR结合基序
<400>113
Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210>114
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附分子L1(SPLICE ISOFORM 2)[Homo sapiens[Swiss-P
rot：P32004]；[Mus musculus Swiss-Prot：Q9QY38]：FGFR结合基序
<400>114
His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gly Pro Ala
1 5 10 15
<210>115
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NB-2.[Rattus norvegicus][Swiss-Prot：P97527]：FGFR结合基序
<400>115
His Leu Thr Val Arg Ala Tyr Asn Gly Ala Gly Tyr Gly Pro
1 5 10
<210>116
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘附蛋白BIG-2前体。[Rattus norvegicus][Swiss-Prot：Q62845]：FGFR结合基序
<400>116
His Leu Ser Val Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Gly Pro Ser
1 5 10 15
<210>117
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轴突相关的细胞粘附分子。[Homo sapiens].[Swiss-Prot：Q8TC35]：FGFR结合基序
<400>117
His Leu Ala Val Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Gly Pro Ser
1 5 10 15
<210>118
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接触蛋白A/F3/F11[Xenopus laevis][Swiss-Prot：O93250]：FGFR结合基序
<400>118
Asn Leu Glu Val Arg Ala Phe Asn Ser Ala Gly Asp Gly Pro
1 5 10
<210>119
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经细胞粘连因子CALL[Homo sapiens][Swiss-Prot：O00533]：FGFR结合基序
<400>119
His Leu Thr Val Leu Ala Tyr Asn Ser Lys Gly Ala Gly Pro
1 5 10
<210>120
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经元-神经胶质细胞粘附分子(Ng-CaM)前体[Gallus gallus][Swiss-Prot：Q909339]：FGFR结合基序
<400>120
Leu Arg Val Leu Val Phe Asn Gly Arg Gly Asp Gly Pro
1 5 10
<210>121
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接触蛋白前体(神经细胞识别分子F11)[Gallus gallus][Swiss-Prot：P14781]：FGFR结合基序
<400>121
His Ile Asp Val Ser Ala Phe Asn Ser Ala Gly Tyr Gly Pro
1 5 10
<210>122
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SLIT[Drosophila melanogaster][Swiss-Prot：Q9XYV4]：FGFR结合基序
<400>122
His Leu Ala Val Glu Leu Phe Asn Gly Arg
1 5 10
<210>123
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>半乳凝素-4[Mus musculus][Swiss-Prot：Q8K419，P38552]：FGFR结合基序
<400>123
Leu Glu Leu Gln Ser Ile Asn Phe Leu Gly Gly Gln Pro Ala
1 5 10
<210>124
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HNB-2.[Homo sapiens]Swiss-Prot：O94779：FGFR结合基序
<400>124
His Phe Thr Val Arg Ala Tyr Asn Gly Ala Gly Tyr Gly Pro
1 5 10
<210>125
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>EFL肽(来自L1的FIII，3区)[Swiss-Prot：P32004]：FGFR结合基序
<400>125
His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gln Pro Ala
1 5 10 15
<210>126
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>神经胶质蛋白片段(Drosophila)[Swiss-prot：P202419]：FGFR结合基序
<400>126
Val Ile Ala Asp Gln Pro Thr Phe Val Lys Tyr Leu Ile Lys
1 5 10
<210>127
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>纤连蛋白片段(牛的)[Swiss-prot：P07589]：FGFR结合基序
<400>127
Thr Ile Lys Gly Leu Arg Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln
1 5 10
<210>128
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肌腱蛋白(鸡的)[Swiss-prot：P10039]：FGFR结合基序
<400>128
Thr Leu Thr Glu Leu Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Thr Val Lys
1 5 10
<210>129
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肾升压素A型2[Swiss-prot：Q8N3Z2]：FGFR结合基序
<400>129
Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln
1 5 10
<210>130
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LAR[Swiss-prot Q9VIS8]：FGFR结合基序
<400>130
Thr Val Ser Asp Val Thr Pro His Ala Ile Tyr Thr Val Arg
1 5 10
<210>131
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RTK(Tie-1，hu)[Swiss-prot P35590]：FGFR结合基序
<400>131
Ile Ile Arg Gly Leu Asn Ala Ser Thr Arg Tyr Leu Phe Arg
1 5 10
<210>132
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RTK(Tie-1，hu)[Swiss-prot P35590]：FGFR结合基序
<400>132
Thr Leu Met Asn Leu Arg Pro Lys Thr Gly Tyr Ser Val Arg
1 5 10
<210>133
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列(保守的区域数据库)：FGFR结合基序
<400>133
Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Glu Val Arg
1 5 10
<210>134
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-3，I1-5和GmCsf的beta共同细胞因子受体[Swiss-prot P32927]：FGFR结合基序
<400>134
Gly Pro Glu His Leu Met Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ala Arg
1 5 10
<210>135
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Unc-22(C.Elegance)[Swiss-prot：Q23550]：FGFR结合基序
<400>135
Arg Val Thr Gly Leu Thr Pro Lys Lys Thr Tyr Glu Phe Arg
1 5 10
<210>136
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列(保守的区域数据库)：FGFR结合基序
<400>136
Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Glu Phe Arg
1 5 10
<210>137
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列(保守的区域数据库)：FGFR结合基序
<400>137
Glu Val Arg Val Gln Ala Val Asn Gly Gly Gly Asn Gly Pro Pro
1 5 10 15
<210>138
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Drosophila Neuroglian [Swiss-prot：P20241]：FGFR结合基序
<400>138
Leu Ile Lys Val Val Ala Ile Asn Asp Arg Gly Glu
1 5 10
<210>139
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>纤连蛋白(小鼠)[Swiss-prot：P11276]：FGFR结合基序
<400>139
Val Val Ser Ile Ile Ala Val Asn Gly Arg Glu Glu
1 5 10
<210>140
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>纤连蛋白(牛)[Swiss-prot：P07589]：FGFR结合基序
<400>140
Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn Gln Asn Gly Glu
1 5 10
<210>141
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肌腱蛋白(鸡)[Swiss-prot：Q90995]：FGFR结合基序
<400>141
Thr Ile Ser Leu Val Ala Glu Lys Gly Arg His Lys
1 5 10
<210>142
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L1(人，F3，EFL)[Swiss-prot：P32004]：FGFR结合基序
<400>142
His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Ser Gly Pro Ala
1 5 10 15
<210>143
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L1(小鼠，F3，EFL)[Swiss-prot：P11627]：FGFR结合基序
<400>143
His Val Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Leu Gly Pro Ala
1 5 10 15
<210>144
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L1(rat，F3，EFL)[Swiss-prot：Q05695]：FGFR结合基序
<400>144
His Val Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg Gly Leu Gly Pro Ala
1 5 10 15
<210>145
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列(保守的区域数据库)：FGFR结合基序
<400>145
Glu Phe Arg Val Arg Ala Val Asn Gly Ala Gly Glu Gly
1 5 10
<210>146
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-3，I1-5和GmCsf的beta共同细胞因子受体[Swiss-prot：P32927]：FGFR结合基序
<400>146
Val Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ser Arg Leu Ser
1 5 10 15
<210>147
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>对照肽(突变的FGL-肽)
<400>1
Glu Val Tyr Val Val Ala Glu Asn Ala Ala Gly Lys Ser Lys Ala
1 5 10 15
Claims (34)
1.一种包括2个单独的肽序列的化合物，其中2个序列中的至少一个包括通式
L1-A-L2-B-L3-C-L4-D-L5
的序列，其中
A、B、C、D中的一个选自疏水性的氨基酸残基，
A、B、C、D中的一个选自碱性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个选自酸性氨基酸残基、Asn或Gln，
A、B、C、D中的一个是Gly或Ala，以及
L1、L2、L3、L4和L5选自化学键或具有n个氨基酸残基的氨基酸序列，其中n是0至5的整数，其中
所述的肽序列通过通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
的接头相互连接
n和m独立地是1至20的整数，
X是HN、H2N(CR2)pCR、RHN(CR2)pCR、HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素-(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、RCO(CR2)pCR、[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR、H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、RCO(CR2)p、或[HOOC(A)n][HOOC(B)m(CR2)p，其中p是0或1至20的整数，
A和B独立地是取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10链烯基、取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、取代的或未取代的芳香族部分，或A和B一起形成取代的或未取代的环状部分、取代的或未取代的杂环部分、或取代的或未取代的芳香族部分。
2.根据权利要求1的化合物，其中2个肽序列中的至少一个能够结合功能性的细胞表面受体。
3.根据权利要求2的化合物，其中功能性的细胞表面受体是选自成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)家族的受体，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，或其功能性的同系物。
4.根据权利要求2的化合物，其中2个肽序列中的至少一个来源于选自细胞粘附分子、细胞-表面受体、硫酸乙酰肝素蛋白聚酶、和金属蛋白酶、细胞外基质分子或生长因子的多肽序列。
5.根据权利要求4的化合物，其中细胞粘附分子选自
-神经细胞粘附分子(NCAM)(Swiss-Prot Ass.Nos：P13591、P13595-01、P13595)、
-神经细胞粘附分子L1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYQ7、Q9QY38、P11627、Q05695、P32004)、
-神经细胞粘附分子-2(NCAM-2)(Swiss-Prot Ass.No：P36335)
-神经-胶质细胞粘附分子(Ng-CAM)(Swiss-Prot Ass.No：Q03696；Q90933)、
-神经细胞粘附分子CALL(Swiss-Prot Ass.No：000533)、
-神经胶质蛋白(Swiss-ProtAss.No：P91767、P20241)、
-Nr-CAM(HBRAVO，NRCAM，NR-CAM 12)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92823、O15179、Q9QVN3
-轴突蛋白-1/TAG-1(Swiss-Prot Ass.Nos：Q02246、P22063、P28685)、
-轴突-缔合的细胞粘附分子(AxCAM)(NCBI Ass.No：NP_031544.1；Swiss-Prot Ass.No：Q8TC35)、
-髓磷脂-缔合的糖蛋白(MAG)(Swiss-Prot Ass.No：P20917)、
-神经细胞粘附分子BIG-1(Swiss-Prot Ass.No：Q62682)、
-神经细胞粘附分子BIG-2(Swiss-Prot Ass.No：Q62845)、
-成束蛋白(FAS-2)(Swiss-Prot Ass.No：P22648)、
-神经细胞粘附分子HNB-3/NB-3(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9UQ52、P97528、Q9JMB8)
-神经细胞粘附分子HNB-2/NB-2(Swiss-Prot Ass.Nos：094779、P07409、P97527)、
-钙粘着蛋白(Swiss-Prot Ass.No：Q9VW71)、
-连接粘着分子-1(JAM-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JKD5、O88792)、
-神经细胞粘附F3/F11(接触蛋白)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q63198、P1260、Q12860、Q28106、P14781、O93250)、
-神经束蛋白(Swiss-Prot Ass.Nos：Q90924、Q91Z60；O42414)、
-B-淋巴细胞粘附分子CD22(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9R094、P20273)、
-Neogenin(NEO1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q92859、P97603、Q90610、P97798)，
-细胞胞间细胞粘附分子-5(ICAM-5/telencephalin)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8TAM9、Q60625)或
-半乳糖结合凝集素-12(半乳糖凝集素-12)(Swiss-Prot，Q9JKX2、Q9NZ03)、
-半乳糖结合凝集素-4(半乳糖凝集素-4)(Swiss-Prot Ass.No：Q8K419、P38552)、或其片段、或其变体。
6.根据权利要求4的化合物，其中细胞-表面受体选自
-成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)、
-成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96KM2、P21802、Q63241)、
-成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q95M13、AF487554、Q99052)、
-成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass.No：Q91742)、
-神经营养蛋白酪氨酸激酶2型(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass.No：Q8WXJ5)、
-白细胞抗原相关蛋白-酪氨酸磷酸酶(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)、
-肾升压素(Swiss-ProtAss.Nos：Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体S型(PTPRS)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q64699、Q13332、O75870)、
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体κ型(R-PTP-κ)(Swiss-Prot Ass.No：Q15262)、
-蛋白质-酪氨酸磷酸酶受体D型(PTPRD)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8WX65、Q91AJ1、P23468、Q64487)、
-Ephrin A型受体8(EPHA8/酪氨酸-蛋白激酶受体EEK)(Swiss-Prot Ass.Nos：009127、P29322)、
-Ephrin A型受体3(EPHA3/酪氨酸-蛋白激酶受体ETK-1/CEK4)(Swiss-Prot Ass.No：P29318)、
-Ephrin A型受体2(Swiss-Prot Ass.No：Q8N3Z2)
-胰岛素受体(IR)(Swiss-Prot Ass.No：Q9PWN6)
-胰岛素-样生长因子-1受体(IGF-1)(Swiss-ProtAss.Nos：Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)
-胰岛素-相关受体(IRR)(Swiss-Prot Ass.No：P14616)
-酪氨酸蛋白激酶受体Tie-1(Swiss-Prot Ass.Nos：06805、P35590、Q06806)、
-环形受体-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass.Nos：044924、AF041082、Q9Y6N7)、
-神经烟酸乙酰胆碱受体α3亚基(CHRNA3)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)
-神经乙酰胆碱受体α6亚基(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15825、Q9ROW9)
-血小板源性生长因子受体β(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R406、Q05030)、
-白细胞介素-6受体(IL-6R)(Swiss-Prot Ass.No：Q00560)、
-白细胞介素-23受体(IL-23R)(Swiss-Prot Ass.No：AF461422)、
-IL-3、IL5和GmCsf的β-共同细胞因子受体(Swiss-Prot Ass.No：P32927)、
-细胞因子受体-样分子3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass.No：Q9JM58)、
-I类细胞因子受体(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass.No：Q9UHH5)
-神经突起生长导向因子-1受体DCC(Swiss-Prot Ass.No：P43146)、
-白细胞Fc受体-样蛋白质(IFGP2)(Swiss-Prot Ass.Nos：Q96PJ6、Q96KM2)、
-巨噬细胞清除受体2(MSR2)(Swiss-Prot Ass.No：Q91YK7)、或
-粒性白细胞集落刺激因子受体(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass.No：Q99062)、
或其片段、或其变体。
7.根据权利要求4的化合物，其中硫酸乙酰肝素蛋白聚酶是基底膜蛋白聚糖(Swiss-ProtAss.No：P98160)，或其片段或其变体。
8.根据权利要求4的化合物，其中金属蛋白酶选自
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：Q05910)、
-ADAM-19(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9H013，O35674)、
-ADAM-8(Swiss-Prot Ass.No：P78325)、
-ADAM-12(Swiss-Prot Ass.Nos：043184，Q61824)、
-ADAM-28(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9JLN6，Q61824，Q9XSL6，Q9UKQ2)、
-ADAM-33前体(Swiss-Prot Ass.Nos：Q8R533、Q923W9)、
-ADAM-9(Swiss-Prot Ass.Nos：Q13433，Q61072)、
-ADAM-7(Swiss-Prot Ass.NoS：Q9H2U9、O35227、Q63180)、
-ADAM-1A受精蛋白(Fertilin)α(Swiss-Prot Ass.No：Q8R533)
-ADAM-15(Swiss-Prot Ass.Nos：Q9QYV0、O88839、Q13444)
-包含金属蛋白酶-去整合蛋白结构域的蛋白质(TECAM)(Swiss-ProtAss.No：AF163291)、
-金属蛋白酶1(Swiss-Prot Ass.Nos：O95204、Q9BS16)、
或其片段或其变体。
9.根据权利要求4的化合物，其中细胞外基质分子选自
-胶原VII型(Swiss-Prot Ass.No：Q63870)、
-纤粘连蛋白(Swiss-ProtAss.：Q95KV4、Q95KV5、P07589、Q28377、U42594、095609、P11276)、或
-肌腱蛋白-R(Swiss-Prot Ass.Nos：Q15568、O00531、Q90995、P10039)、或其片段、或其变体。
10.根据权利要求4的化合物，其中生长因子是细胞因子样因子-1(CLF-1)(Swiss-Prot Ass.No：O75462)、或其片段、或其变体。
11.根据权利要求1至10中任一项的化合物，其中2个肽序列中的至少一个是具有选自下列氨基酸序列的肽片段
EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO 1)、
NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)、
ATNRQGKVKAFAHL(SEQ ID NO：3)、
RYVELYWADSQEFQK(SEQID NO：4)
VAENSRGKNVAKG(SEQ ID NO：5)、
GEYWCVAENQYGQR(SEQ ID NO：6)、
RLAALNGKGLGEIS(SEQ ID NO：7)、
KYIAENMKAQNVAKEI(SEQ ID NO：8)、
TIMGLKPETRYAVR(SEQ ID NO：9)、
KGLGEISAATEFKT(SEQ ID NO：10)、
NMGIWVQAENALG(SEQ ID NO：11)、
IWVQAENMLG(SEQ ID NO：12)、
EIWVEATNRLG(SEQ ID NO：13)、
VWVQAANALG(SEQ ID NO：14)、
EVWIEKDPAKGRI(SEQ ID NO：15)、
ATNKGGEVKKNGHL(SEQ ID NO：16)、
KYVELYLVADYLEFQK(SEQ ID NO：17)、
RYVELYVWDNAEFQ(SEQ ID NO：18)、
KYVELVIVADNREFQR(SEQ ID NO：19)、
KYIEYYLVLDNGEFKR(SEQ ID NO：20)、
RYLELYIVADHTLF(SEQ ID NO：21)、
KYVEMFWVNHQRFQ(SEQ ID NO：22)、
RYVELFIWDKERY(SEQ ID NO：23)、
KYVELFIVADDTVYRR(SEQ ID NO：24)、
KFIELFVVADEYVYRR(SEQ ID NO：25)、
KIVEKVIVADNSEVRK(SEQ ID NO：26)、
VEIVIVADHSEAQK(SEQ ID NO：27)、
VAENSRGKNIAKG(SEQ ID NO：28)、
IAENSRGKNVARG(SEQ ID NO：29)、
AENSRGKNSFRG(SEQ ID NO：30)、
IASNLRGRNLAKG(SEQ ID NO：31)、
IPENSLGKTYAKG(SEQ ID NO：32)、
IAENMKAQNEAK(SEQ ID NO：33)、
QFIAENMKSHNETKEV(SEQ ID NO：34)、
GEYWCVAKNRVGQ(SEQ ID NO：35)、
GSYTCVAENMVGK(SEQ ID NO：36)、
GKYVCVGTNMVGER(SEQ ID NO：37)、
GNYTCWENEYG(SEQ ID NO：38)、
GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO：39)、
QYYCVAENGYG(SEQ ID NO：40)、
GEYYQEAEQNGYG(SEQ ID NO：41)、
GNYTCLVENEYG(SEQ ID NO：42)、
GMYQCLAENAYG(SEQ ID NO：43)、
GMYQCAENTHG(SEQ ID NO：44)、
GIYYCLASNNYG(SEQ ID NO：45)、
GGYYCTADNSYG(SEQ ID NO：46)、
GEYQCFARNDYG(SEQ ID NO：47)、
GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO：48)、
GEYQCFARNKFG(SEQ ID NO：49)、
GEYFCLASNKMG(SEQ ID NO：50)、
GGYYCTADNNYG(SEQ ID NO：51)、
GNYSCEAENAWGTK(SEQ ID NO：52)、
GEYTCLAENSLG(SEQ ID NO：53)、
GEYECVAENGRLG(SEQ ID NO：54)、
GNYTCWENKFGR(SEQ ID NO：55)、
GEYTCLAGNSIG(SEQ ID NO：56)、
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EYTCIANNQAGE(SEQ ID NO：58)、
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GDYTLIAKNEYGK(SEQ ID NO：62)、
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TVTGLKPETSYMVK(SEQ ID NO：75)、
TLTGLKPSTRYRI(SEQ ID NO：76)、
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TLLGLKPDTTYDIK(SEQ ID NO：78)、
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KGMGPMSEAVQFRT(SEQ ID NO：92)、
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LSHNGVLTGYLLSY(SEQ ID NO：100)、
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NGILTEYILKY(SEQ ID NO：106)、
NGILIGYTLRY(SEQ ID NO：107)、
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NGILTEYTLKY(SEQ ID NO：111)、
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NGKITGYIIYY(SEQ ID NO：113)、
HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO：114)、
HLTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO：115)、
HLSVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO：116)、
HLAVKAYNSAGTGPS(SEQ ID NO：117)、
NLEVRAFNSAGDGP(SEQ ID NO：118)、
HITVLAYNSKGAGP(SEQ ID NO：119)、
LRVLVFNGRGDGP(SEQ ID NO：120)、
HIDVSAFNSAGYGP(SEQ ID NO：121)、
HLAVELFNGR(SEQ ID NO：122)、
LELQSINFLGGQPA(SEQ iD NO：123)、
HFTVRAYNGAGYGP(SEQ ID NO：124)、
HLEVQAFNGRGSQPA(SEQ ID NO：125)、
VIADQPTFVKYLIK(SEQ ID NO：126)、
TIKGLRPGWYEGQ(SEQ ID NO：127)、
TLTELSPSTQYTVK(SEQ ID NO：128)、
TLDDLAPDTTYLVQ(SEQ ID NO：129)、
TVSDVTPHAIYTVR(SEQ ID NO：130)、
IIRGLNASTRYLFR(SEQ ID NO：131)、
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TLTGLKPGTEYEVR(SEQ ID NO：133)、
GPEHLMPSSTYVAR(SEQ ID NO：134)、
RVTGLTPKKTYEFR(SEQ ID NO：135)、
LTGLKPGTEYEFR(SEQ ID NO：136)、
EVRVQAVNGGGNGPP(SEQ ID NO：137)、
LIKWAINDRGE(SEQ ID NO：138)、
VVSIIAVNGREE(SEQ ID NO：139)、
WSVYAQNQNGE(SEQ ID NO：140)、
TISLVAEKGRHK(SEQ ID NO：141)、
HLEVQAFNGRGSGPA(SEQ ID NO：142)、
HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO：143)、
HVEVQAFNGRGLGPA(SEQ ID NO：144)、
EFRVRAVNGAGEG(SEQ ID NO：145)、或
VARVRTRLAPGSRLS(SEQ ID NO：146)，或
或其片段、或其变体、或同系物。
12.根据权利要求1至10的化合物，其中2个肽序列中的至少一个是SEQ ID NO：1(EVYVVAENQQGKSKA)，或所述序列的片段、变体、或同系物。
13.权利要求12的化合物，其中SEQ ID NO：1的变体或同系物选自SEQ ID NOs：2-9、100或125，
14.根据权利要求1至10的化合物，其中2个肽序列中的至少一个是SEQ ID NO：2(NIEVWVEAENALGKKV)，或所述序列的片段、变体、或同系物。
15.根据前述任一权利要求的化合物，其中该化合物包括2个含有不同氨基酸序列的单独肽片段，所述的不同氨基酸序列选自权利要求11中任何的肽片段。
16.根据前述任一权利要求的化合物，其中该化合物包括2个含有相同氨基酸序列的单独肽片段，所述的氨基酸序列选自权利要求11中任何的肽片段。
17.根据权利要求16的化合物，其中肽片段独立地具有序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO：1)。
18.根据权利要求16的化合物，其中肽片段独立地具有序列NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)。
19.根据权利要求15的化合物，其中2个肽片段中的一个具有序列EVYVVAENQQGKSKA(SEQ ID NO：1)，而另一个具有序列NIEVWVEAENALGKKV(SEQ ID NO：2)。
20.根据前述任何权利要求的化合物，所述的化合物通过制备能够呈现如权利要求11中所限定序列的LPA的方法来获得，包括步骤：
(a)提供包括所需要序列的固相合成或片段偶连配体，该配体附着于固相，
(b)如果需要，使N-末端氨基酸基团去保护，同时该配体仍然附着于该固相，
(c)使具有未保护N-末端基团的配体与非手性的二-三-或四羧酸起反应，以提供具有环状结构的构建体，以及
(d)从固相切下该构建体以提供包括具有游离C-末端基团的配体的LPA。
21.一种包括如权利要求1-20中所限定的化合物的药物组合物。
22.权利要求1-20任一项所限定的化合物用于制造治疗如下疾病的药物中的用途：与手术后神经损伤、外伤性神经损伤、神经纤维髓鞘化减少、缺血性损伤相关的中枢和外周神经系统病症，该中枢和外周神经系统病症例如起因于中风、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、痴呆，例如多血管梗塞痴呆，硬化症、与糖尿病相关的神经退化、影响昼夜节律钟或神经肌肉传递的紊乱、以及精神分裂症、情绪失调，例如狂躁抑郁症；肌肉的疾病或病症，包括例如器官移植后伴有神经肌肉连接功能受损的病症，例如器官移植后的神经肌肉连接受损或例如遗传的或外伤的肌肉萎缩性疾病；或各种器官的疾病或状况，例如生殖腺的退化病症、胰腺的退化病症，例如I型和II型糖尿病，肾的退化病症，例如肾病以及心、肝和肠的退化病症。
23.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造治疗手术后神经损伤、外伤性神经损伤、神经纤维髓鞘化减少、缺血后的损伤，例如起因于中风、帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、痴呆，例如多血管梗塞痴呆，硬化症、与糖尿病相关的神经退化、影响昼夜节律钟或神经肌肉传递的紊乱、以及精神分裂症、情绪失调，例如狂躁抑郁症的药物的用途。
24.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造促进创伤愈合的药物的用途。
25.权利要求1-20中任一项限定的化合物用于制造治疗癌症的药物的用途。
26.根据权利要求25的用途，其中癌症是需要新血管发生的任何类型的实体瘤。
27.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造例如在急性心肌梗塞后、或血管生成后预防心肌细胞死亡的药物的用途。
28.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造再血管化的药物的用途。
29.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造刺激学习能力和/或短时和/或长时记忆能力的药物的用途。
30.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造预防由于局部缺血造成细胞死亡的药物的用途。
31.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造预防由于醇消耗造成机体损伤的药物的用途。
32.权利要求1-20中任一项所限定的化合物用于制造治疗朊病毒疾病的药物的用途。
33.权利要求22-31中任一项的药物或权利要求21所述的药物组合物用于治疗如权利要求22-31中任一项所限定的疾病或病症的用途。
34.一种治疗有需要的个体的方法，包括步骤：将权利要求1至20中任一项所限定的化合物、和/或权利要求21中所限定的药物组合物、和/或权利要求22-31中任一项所限定的药物施用于所述的个体。
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|---|---|---|---|---|
| CN105087492A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-11-25 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 培养原代海马神经元的方法 |
| CN108715833A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-10-30 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种负载血小板裂解液的微球制备方法 |
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