KR20140125363A

KR20140125363A - 항-ａｓｉｃ1 항체 및 그 용도

Info

Publication number: KR20140125363A
Application number: KR20147020682A
Authority: KR
Inventors: 린 맥도날드; 민 가오; 마크 알. 모라; 니콜 엠. 알레산드리-하버; 미카엘 엘. 라크루아-프랄리쉬
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-10-28
Also published as: LT3453723T; IL233410A0; ES2886123T3; JP6302844B2; MX2014008541A; BR112014018651A2; SI2809681T1; AU2013215254A1; TW201335182A; HK1199269A1; HRP20190358T1; PH12014501613B1; UY34603A; PT3453723T; EP2809681B1; CN104093738B; JP2015508063A; EP2809681A1; DK3453723T3; HUE042531T2

Abstract

본 발명은 산 감지 이온 통로 1(ASIC1)을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체와 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 특정 구현 예에 따르면, 상기 항체는 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 산 유도 ASIC1 매개 이온 전류를 억제한다. 본 발명의 항체는 외과 수술과 다양한 질병 및 질환과 관련된 통증을 포함한 통증의 치료에 유용하다.

Description

항-ＡＳＩＣ1 항체 및 그 용도{ANTI-ASIC1 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 사람 ASIC1에 특이적인 항체와 이의 항원-결합 단편, 그리고 이의 사용 방법에 관한 것이다.

산 감지 이온 통로(ASIC: Acid Sensing Ion Channel)는 중추 및 말초 신경계에서 발현되는 양성자 관문 양이온 통로이다. 사람의 ASIC군에는 뉴런 멤브레인에서 동종 또는 이종다합체 이온 통로로 배열되는 ASIC1, ASIC2, ASIC3, ASIC4 소단위가 포함된다. ASIC1, ASIC2, ASIC3는 유해한 화학적 자극 및 열 자극, 그리고 고역치의 기계적인 자극을 감지할 수 있는 중소형 통증 감각 뉴런에서 두드러지게 발현된다. ASIC2 및 ASIC3는 주로 저역치 기계적 감각 수용기에 해당하는 대형 뉴런에서 또한 발현된다.

ASIC은 Na⁺나 Ca² ⁺ 이온을 투과하며 pH 6.8 내지 4.0 범위의 외부 pH 변화에 의해 활성화된다. ASIC은 국부 산과다증을 감지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 국부 조직 산증은 통증과 염증의 특징이며 염증 조직은 대개 낮은 pH를 보인다 (최저 ~4.7). ASIC 차단은 다양한 질환 및 증상의 치료법으로 제시되어왔다. 특히, ASIC1의 차단은 통증, 신경변성 질환 및 정신 질환과 같은 증상의 치료 수단으로 제시되어 왔다.

ASIC1의 약리학적 억제제에는 ASIC1 동성집합체(homomer)를 특이적으로 억제하는 거미독(tarantula) 펩티드 Psalmotoxin-1 (PcTx1), 그리고 소분자인 비선택적 ASIC 억제제 아밀로라이드 및 A-317567가 포함된다. 말미잘에서 분리된 40개의 아미노산 펩티드 독소인 APETx2은 ASIC3 동성집합체 및 ASIC3/1와 ASIC3/2 이성집합체(heteromer)를 억제하는 것으로 나타났다.

현재로서는 ASIC을 특이적으로 차단할 수 있는 항체가 알려져 있지 않다. 따라서, ASIC 신호로 매개되는 질환 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있는 항-ASIC1 항체와 같은 새로운 ASIC 억제제가 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 예를 들면 세포 표면에 발현된 ASIC1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하여 사람 ASIC1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 구현의 예에 따른 본 발명의 항체는 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 산으로 유도된 ASIC1 매개 이온 전류를 억제한다. 본 발명의 항체는 특히 ASIC1 매개 신호를 억제하고 ASIC1 활성 및/또는 신호에 기인하거나 이와 관련된 질환 및 질병을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 통증 및 관련 증상의 치료나 완화를 위해 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 항체는 전장(full-length)(예를 들어 IgG1 또는 IgG4 항체)일 수도 혹은 항원 결합 부분만으로 구성될 수도 있으며 (예를 들어 Fab, F(ab')₂ 또는 scFv 단편), 기능성에 영향을 주기 위해, 예를 들면 잔류 효과기 기능(residual effector function)을 제거하기 위해 변형될 수 있다 (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

본 발명은 SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)으로 구성되는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)으로 구성되는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394로 이루어진 그룹에서 선택된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 쌍으로 구성되는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 도메인으로 구성되는 항체나 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

특정 구현의 예로, SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 376/384, 392/400로 이루어진 그룹에서 선택된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍으로 구성되는 항체 또는 항체의 항원 결합 부분을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 도메인으로 구성되는 항체나 그 단편을 제공한다.

본 발명의 특정 항체 및 항원 결합 단편의 예로는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인이 포함되지만 이에 국한되지 않으며 상기 도메인은 각각 SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (예: H1M6712N); 20-22-24-28-30-32 (예: H1M6716N); 36-38-40-44-46-48 (예: H1M6718N); 52-54-56-60-62-64 (예: H1M7101N); 68-70-72-76-78-80 (예: H2M7103N); 84-86-88-92-94-96 (예: H3M6713N); 100-102-104-108-110-112 (예: H3M6715N); 116-118-120-124-126-128 (예: H3M6720N); 132-134-136-140-142-144 (예: H3M6721N); 148-150-152-156-158-160 (예: H3M6721N2); 164-166-168-172-174-176 (예: H3M6726N); 180-182-184-188-190-192 (예: H3M6760N); 196-198-200-204-206-208 (예: H3M7102N); 212-214-216-220-222-224 (예: H3M7118N); 228-230-232-236-238-240 (예: H4H6362P); 244-246-248-252-254-256 (예: H4H6363P); 260-262-264-268-270-272 (예: H4H6364P); 276-278-280-284-286-288 (예: H4H6366P); 292-294-296-300-302-304 (예: H4H6372P); 308-310-312-316-318-320 (예: H4H6374P); 324-326-328-332-334-336 (예: H4H6375P); 340-342-344-348-350-352 (예: H4H6379P); 356-358-360-364-366-368 (예: H4H6380P); 372-374-376-380-382-384 (예: H4H6381P); and 388-390-392-396-398-400 (예: H4H6383P)와 같은 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다:.

관련된 일 구현의 예로, 본 발명은 ASIC1와 특이적으로 결합하는 (예를 들어 세포 표면에 발현된 ASIC1) 항체나 항체의 항원 결합 단편을 포함하며, 이때 상기 항체나 단편은 SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394로 이루어진 그룹에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (HCVR/LCVR) 서열에 포함된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인으로 구성된다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하기 위한 방법 및 기술은 당 업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 게시된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하는데 사용할 수 있다. CDR의 경계를 식별하는데 사용할 수 있는 예시적인 규약의 예로는 Kabat 정의, Chothia 정의 및 AbM 정의가 있다. 일반적인 용어로 표현하자면, Kabat 정의는 서열 가변성에 근거하며, Chothia 정의는 구조 루프 영역의 위치에 근거하며, AbM 정의는 Kabat 접근법과 Chothia 접근법을 혼용한 것이다. 참고 문헌 예: Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al ., J. Mol . Biol . 273:927-948 (1997); 그리고 Martin et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 86:9268-9272 (1989). 항체 내의 CDR 서열 동정용 공개 데이터베이스도 나와있다.

다른 양상으로, 본 발명은 항-ASIC1 항체 또는 이의 단편을 부호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산을 운반하는 재조합 발현 벡터, 그리고 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포도 본 발명의 범주에 속하며, 그리고 항체의 생산을 가능케 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 방법과 생산된 항체를 채취하는 방법 또한 본 발명의 범주에 속한다.

일 구현의 예로, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열에 의해 부호화된 HCVR로 구성되는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 393, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열에 의해 부호화된 LCVR로 구성되는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 391, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 HCDR3 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 LCDR3 도메인으로 구성되는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 387, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 HCDR1 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 389, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 HCDR2 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 LCDR1 도메인; 그리고 SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 또는 이와 서열 상동성이 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%인, 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화된 LCDR2 도메인으로 구성되는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

특정 구현의 예에 따르면 상기 항체와 이의 단편은 SEQ ID NO: 1과 9 (예: H1M6712N), 17과 25 (예: H1M6716N), 33과 41 (예: H1M6718N), 49와 57 (예: H1M7101N), 65와 73 (예: H2M7103N), 81과 89 (예: H3M6713N), 97과 105 (예: H3M6715N), 113과 121 (예: H3M6720N), 129와 137 (예: H3M6721N), 145와 153 (예: H3M6721N2), 161과 169 (예: H3M6726N), 177과 185 (예: H3M6760N), 193과 201 (예: H3M7102N), 209와 217 (예: H3M7118N), 225와 233 (예: H4H6362P), 241과 249 (예: H4H6363P), 257과 265 (예: H4H6364P), 273과 281 (예: H4H6366P), 289와 297 (예: H4H6372P), 305와 313 (예: H4H6374P), 321과 329 (예: H4H6375P), 337과 345 (예: H4H6379P), 353과 361 (예: H4H6380P), 369와 377 (예: H4H6381P), 385와 393 (예: H4H6383P)의 핵산 서열에 의해 부호화된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열로 구성된다.

본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 일부 응용의 예로, 원치 않는 글리코실화 부위나 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 반족(moiety)이 결여된 항체를 제거하도록 변형하는 것이 유용할 수 있다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 ASIC1와 특이적으로 결합하는 재조합 사람 항체 또는 그 단편(예를 들어 세포 표면에 발현된 ASIC1)을 포함하는 약학적 조성물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. 관련된 일 양상으로, 본 발명은 항-ASIC1 항체와 제 2치료 제제가 결합된 조성물을 다룬다. 일 구현의 예로, 제 2치료 제제는 항-ASIC1 항체와 유익하게 병용되는 모든 제제이다. 항-ASIC1 항체와 유익하게 병용되는 제제의 예로는 ASIC1 활성을 억제하는 제제 (다른 항체 또는 그 항원 결합 단편, 펩티드 억제제, 소분자 길항제 등을 포함) 및/또는 ASIC1와 직접 결합하지는 않지만 세포 내의 ASIC1 매개 이온 전류를 방해하거나 차단, 또는 약화시키는 제제가 있으며 이에 국한되지는 않는다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 본 발명의 항-ASIC1 항체 또는 항체의 항원 결합 부분을 이용하여 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는 방법을 제공하며, 이 경우 본 발명의 치료적으로 유효한 양의 항체 또는 항체의 항원 결합 단편으로 구성된 약학적 조성물을 투여하는 치료법을 포함한다. 치료 대상 질환은 ASIC1 매개 이온 전류를 제거, 억제, 또는 감소함으로써 개선하거나 억제 또는 방지할 수 있는 모든 질환이나 증상이다. 본 발명의 항-ASIC1 항체 또는 항체 단편은 산 유도 ASIC1 매개 전류를 차단하거나, 또는 ASIC1의 신호 활성을 억제하는 기능을 수행할 수 있다.

또한 본 발명은 ASIC1 매개 이온 전류와 연관이 있거나 이로부터 기인한 질병이나 질환을 가진 환자를 치료하는 약제 제조에 있어서 본 발명의 항-ASIC1 항체 또는 항체의 항원 결합 부분의 이용을 포함한다.

기타 구현의 예들은 다음의 상세 설명을 통해 분명하게 될 것이다.

도 1은 항-ASIC1 항체(H1M6718N) 또는 아이소타입 대조 항체(isotype control antibody)로 처리한 생쥐의 꼬리(패널 A) 또는 비복근(패널 B)에 기계적 자극(mechanical pinch)을 주었을 때 반응하여 나타나는 움츠림 임계치를 나타낸다. 결과값은 그램당 자극에 대한 움츠림 임계치로 나타내었다 (각각의 생쥐 코호트의 경우 평균 ± SEM).
도 2는 산성 식염수에 의한 근육의 통각과민 상태에서 항-ASIC1 항체(H1M6718N) 또는 아이소타입 대조 항체로 처리한 생쥐의 움츠림 임계치가 기준치로부터 얼마나 변화하는지를 백분율로 보여준다.
도 3(패널 A와 B)은 카라기닌에 의한 근육의 통각과민 상태에서 항-ASIC1 항체(H1M6718N, 10 또는 40 mg/kg - 패널 A; 혹은 H4H6721N2, 10 또는 30 mg/kg - 패널 B) 또는 아이소타입 대조 항체로 처리한 생쥐의 움츠림 임계치가 기준치로부터 얼마나 변화하는지를 백분율로 보여준다.
도 4는 30 mg/kg (s.c.)의 아이소타입 대조 항체, 또는 30 mg/kg (s.c.)의 H1M6718N, 또는 100 mg/kg (s.c.)의 가바펜틴으로 처리한 생쥐에게 택솔(taxol)을 투여했을 때 시간의 경과에 따른 택솔에 의한 촉각성 이질통의 정도를 보여준다. 결과값은 폰 프라이 섬유(Von Frey fibers)로 측정한 움츠림 임계치(g)로 나타내었다 (실시예 10에 기술된 바와 같이).

본 발명을 설명하기 전에, 본 발명의 방법 및 조건은 다양할 수 있기 때문에 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 국한되지 않는다는 것을 이해할 필요가 있다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 범위가 부록의 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에 특정 구현의 예만 설명하기 위한 목적이며 제한적인 용도가 아님을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당 업계의 일반적인 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "약(about)"은 특정 인용된 수치와 관련하여 사용될 때, 그 수치가 인용된 수치의 1% 이상을 벗어나지 않음을 뜻한다. 예를 들면, 본 명세서에서 사용될 때, "약 100"이라는 표현은 99 및 101과 그 사이의 모든 수치(예: 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등)를 포함한다.

본 명세서에 설명된 방법 및 물질과 유사하거나 동일한 모든 것들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 선호되는 방법 및 물질을 이제 설명한다.

정의

본 명세서에서 사용된 표현인 "ASIC1" 및 "ASIC1 단편"은 사람이 아닌 종들의 것이(예: "쥐의 ASIC1", "쥐 ASIC1 단편", "원숭이 ASIC1", "원숭이 ASIC1 단편" 등)라고 언급되지 않는 한, 사람의 ASIC1 단백질 또는 단편을 지칭한다. 사람 ASIC1는 SEQ ID NO:401로 시작되는 아미노산을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 표현 "ASIC1"은 세포 표면에서 발현된 ASIC1(그 용어의 정의가 아래의 명세서에 정의되어 있듯이) 뿐만 아니라 ASIC1 세포 외 영역의 용해성 단편(예: SEQ ID NO:401의 아미노산 63 - 424 이내에서 발견되는 적어도 30 개 이상의 연속된 아미노산으로 구성된 폴리펩티드)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 표현 "ASIC1과 결합하고 있는 항체" 또는 "항-ASIC1 항체"는 항체와 항원에 결합된 단편, 즉 ASIC1 단백질의 용해성 단편과 결합하고 있는 단편(예: ASIC1의 세포 외부 영역 부분) 또는 세포 표면에 발현된 ASIC1을 포함한다. "세포 표면에 발현된 ASIC1"이라는 표현은 하나 또는 그 이상의 ASIC1 단백질이 체외 또는 체내에서 세포의 표면에 발현되어서 적어도 ASIC1 단백질의 일정 부분(예: SEQ ID NO:401의 아미노산 63 - 424)이 세포막의 세포 바깥쪽에 노출 되어 항체의 항원 결합 부분에 접근할 수 있다는 것을 의미한다. "세포 표면에 발현된 ASIC1"은 세포막에 있는 기능적 ASIC1 이온 통로의 영역 내에 포함된 ASIC1 단백질을 포함한다. 어떤 경우에는 "세포 표면에서 발현된 ASIC1"은 세포의 표면에 있는 이형 다량체의 일부로서 발현된 ASIC1 단백질이다(예: ASIC1/2, ASIC1/3 또는 ASIC1/4 이형다량체). 다른 경우에는 "세포 표면에서 발현된 ASIC1"은 세포의 표면에서 동형 다량체의 일부로서 발현된 ASIC1 단백질이다. 뿐만 아니라 "세포 표면에서 발현된 ASIC1"은 일반적으로 ASIC1 단백질을 발현하는 세포의 표면에 발현된 ASIC1 단백질을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 그렇지 않은 경우에는 "세포 표면에 발현된 ASIC1"은 일반적으로 세포 표면에 사람 ASIC1을 발현하지 않지만 세포 표면에 ASIC1을 발현하도록 조작된 세포의 표면에 발현된 ASIC1 단백질로 구성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란 특정 항원(예: ASIC1)에 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 모든 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란 이황화 결합으로 서로 연결된 두 개의 H(무거운) 사슬 과 두 개의 L(가벼운) 사슬인 네 개의 폴리펩티드 사슬뿐만 아니라 이의 다량체(예: IgM)로 구성된 면역 글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 HCVR 또는 V_H로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기의 중쇄 불변부는 세 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부(이하 LCVR 또는 V_L로 약칭)와 경쇄 불변부로 구성된다. 상기의 경쇄 불변부는 하나의 도메인(C_L1)으로 구성된다. 상기의 V_H 및 V_L 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 과변이(hypervariability) 부위로 다시 나누어지며 골격 부위(FR)로 불리는 좀더 보존적인 부위와 교차 배치될 수 있다. 각각의 V_H 와 V_L 은 다음과 같은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 세 개의 CDR과 네 개의 FR로 구성된다. 본 발명의 다른 구현의 예로, 상기의 항-ASIC1 항체(또는 이의 항원-결합 부위)의 FR은 사람 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변경될 수 있다. 아미노산의 공통 서열은 둘 또는 그 이상의 CDR의 병렬 분석(side-by-side analysis)에 근거하여 정의될 수 있다.

또한 본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란 전체 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부위", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원을 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 모든 자연적으로 발생하는, 효소를 통해 획득 가능한, 합성, 또는 유전자 조작 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면 DNA 부호화 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인의 조작과 발현을 포함하는 단백질 가수분해 소화 또는 재조합 유전자 조작 기법과 같은 모든 적절한 표준 기법을 사용하여 전체 항체 분자에서 얻을 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있으며 그리고/또는 예를 들면, 상용 공급원, DNA 라이브러리(예를 들면, 파지-항체 라이브러리)로부터 쉽게 구할 수 있거나, 또는 합성할 수도 있다. 상기의 DNA는, 예를 들면 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 모양으로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 추가 또는 제거하는 등등의 화학적 방법 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 서열을 파악하고 조작할 수 있다.

항원-결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 그리고 (vii) 항체의 극가변부위(hypervariable region)를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어지는 최소 인식 단위(예를 들면, CDR3 펩티드와 같은 분리된 상보성 결정 영역(CDR)), 또는 억제된 FR3-CDR3-FR4 펩티드가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 도메인 특이 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies) (예: 1가 나노바디, 2가 나노바디, 등), 소형 규격 면역 약제(small modular immunopharmaceutical, SMIP), 그리고 상어 가변 IgNAR 도메인 등의 기타 유전자 조작 분자 역시 본 명세서에서 사용된 용어 "항원-결합 단편"에 포함된다.

항체의 항원-결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 가변 도메인은 어떠한 크기 또는 아미노산 구성물일 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 골격 서열에 인접하거나 골격을 이루는 적어도 하나의 CDR을 포함하게 된다. V_L 도메인과 연합한 V_H 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서 V_H 및 V_L 도메인은 모든 적절한 배열로 서로 상대적으로 위치할 수 있다. 예를 들면, 상기의 가변 영역은 이합체로 V_H-V_H, V_H-V_L 또는 V_L-V_L의2분자체를 포함할 수 있다. 아니면, 항체의 항원-결합 단편은 단량체인 V_H 또는 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

특정 구현의 예로, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 구성 예로는 (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; 그리고 (xiv) V_L-C_L이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 상기에 열거된 모든 예시적 구성을 포함하여 가변 및 불변 도메인의 모든 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로에게 직접 연결될 수도 있고 전체 또는 부분 경첩(hinge) 또는 연결(linker) 영역에 연결될 수도 있다. 경첩 영역(hinge region)은 단일 폴리펩티드 분자로 인접 가변 및/또는 불변 도메인 간에 유연(flexible) 또는 반유연(semi-flexible) 연결을 이루는 적어도 2개(예를 들면 5, 10, 15, 20, 40, 60 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-연결 단편은 서로 서로 공유 연합 및/또는 하나 이상의 단량체 V_H 또는 V_L 도메인과의 공유 연합(예를 들면, 이황화 결합(들))으로 위에 나열된 모든 가변 및 불변 도메인 구성의 동종-2량체 또는 이종-2량체(또는 기타 다량체)를 포함한다.

완전한 항체 분자들의 경우처럼, 항체 결합 단편은 단일 특이적이거나 다중 특이적일 수 있다(예: 이중 특이적). 항체의 다중 특이적 항원-결합 단편은 일반적으로 각 가변 도메인이 별도의 항원이나 동일한 항원의 다른 에피톱에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 두 개의 가변 도메인으로 구성된다. 본 명세서에 게시된 예시적 이중 특이적 항체 포맷을 포함하여 모든 다중 특이적 항체 포맷은 당 업계에서 알려진 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서의 사용을 위해 변형될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "사람 항체"란 사람 생식선(germline) 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 부위 및 불변 부위를 갖는 항체를 포함하기 위해 사용된다. 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면 CDR 및 특정 CDR3에서의 사람 생식선(germline) 면역글로불린 서열(예를 들면, 무작위 또는 체외에서 부위-특이 돌연변이에 의하거나 체내에서 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이)에 의해 부호화 되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나 본 명세서에서 사용된 용어 "사람 항체"는 생쥐와 같은 또 다른 포유 동물의 생식선(germline)에서 유래한 CDR 서열이 사람 골격 서열에 이식된 항체를 포함하기 위한 것이 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 사람 항체"는 숙주 세포로 감염시킨 재조합 발현 매개체(아래에서 자세히 설명됨), 재조합의 조합적인 사람 항체 라이브러리(아래에서 자세히 설명됨), 사람 면역글로불린 유전자용으로 형질전환 된 동물(예, 생쥐)에서 분리된 항체 등의 재조합 수단에 의해 준비, 발현, 생성 또는 분리된 모든 사람 항체(참고자료 예: Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing) 하는 것을 포함하는 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함하기 위한 것이다 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식선 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 구현의 예로, 이러한 재조합 사람 항체는 체외 돌연변이(또는, 사람 Ig 서열용으로 형질전환된 동물이 사용되는 경우에는, 체내 체세포 돌연변이)를 거치게 되고, 따라서 상기 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식선 V_H 및 V_L 서열에서 유래하고 이에 관련되는 반면 체내 사람 항체 생식선 레퍼토리(repertoire) 내에 자연적으로는 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

사람 항체는 경첩 비균질성(hinge heterogeneity)과 관련된 두 가지 형태로 존재할 수 있다. 한 형태의 예로, 면역글로불린 분자는 이량체가 사슬 간 중쇄 이황화 결합에 의해 맞붙어 있는, 약 150-160 kDa의 안정적인 네 개의 사슬 구조를 포함한다. 두 번째 형태의 예로, 상기의 2량체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 결합되는 것이 아니라 약 75-80 kDa의 분자는 공유 결합된 경쇄 및 중쇄(반-항체, half-antibody)로 구성되어 형성된다. 이러한 형태들은 비록 친화 정제(affinity purification) 후에도 분리하기가 매우 어려웠다.

두 번째 형태가 다양한 무손상 IgG 동형으로 나타나는 빈도는 항체의 경첩 영역 동형과 관련된 구조적 차이에 기인한 것이지만 이에 국한되지는 않는다. 사람 IgG4 경첩의 경첩 영역에서의 단일 아미노산 치환은 두 번째 형태가 나타나는 것을 유의하게 줄여(Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105)의 외형을 사람 IgG1 경첩을 사용하여 일반적으로 관찰되는 수준까지 감소시킬 수 있다. 본 청구 발명은 경첩인, C_H2 또는 C_H3 영역에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함하여, 예를 들면 생산 시 원하는 항체 형태의 생산량을 향상시키기에 바람직할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "분리된 항체"는 이의 자연적인 환경의 적어도 하나의 성분에서 동정 및 분리되고/또는 복구된 항체를 뜻한다. 예를 들면 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산된 조직이나 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는 본 발명의 목적상 "분리된 항체"이다. 또한 분리된 항체는 재조합 세포 내 in situ 항체도 포함한다. 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 분리 단계를 거친 항체이다. 특정 구현의 예에 따르면, 분리된 항체는 기타 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "중화" 혹은 "차단" 항체란 ASIC1에 결합하여 산에 의해 유도되는 ASIC1 매개 이온 전류를 감소하거나 억제하는 항체를 일컫는다. ASIC1 중화 혹은 차단 항체에 의한 억제는 적절한 분석법을 사용하여 감지되기만 한다면 완전할 필요는 없다. ASIC1 억제를 감지하기 위한 예시적 분석법은 본 명세서의 다른 곳에서 설명된다.

본 명세서에 게시된 항-ASIC1 항체는 항체가 유도된 해당 생식선(germline) 서열에 비해 골격부 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 부위에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 제거를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본 명세서에 게시된 아미노산을, 예를 들면 공개 항체 서열 데이터베이스에서 얻을 수 있는 생식선(germline) 서열에 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 게시된 모든 아미노산 서열에서 유래한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 이 때 하나 이상의 골격부 및/또는 CDR 부위 내의 하나 이상의 아미노산이 항체가 유래한 생식선(germline) 서열의 해당 잔기(들)로, 또는 또 다른 사람 생식선 서열의 해당 잔기(들)로, 또는 해당 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이 된다(이러한 서열 변경은 본 명세서에서 통합적으로 "생식선 돌연변이(germline mutations)"로 지칭한다). 당 업계의 통상의 기술자는 본 명세서에 게시된 중쇄 및 경쇄 가변부 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구현의 예로, V_H 및/또는 V_L 도메인 내의 모든 골격 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유래한 원래의 생식선 서열에서 발견된 잔기로 복귀 돌연변이 된다. 기타 구현의 예로, 특정 잔기들만, 예를 들면, FR1의 첫 번째 8개의 아미노산이나 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 발견된 돌연변이 잔기들만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이 잔기들만 원래의 생식선 서열로 복귀 돌연변이 된다. 기타 구현의 예로, 하나 이상의 골격 및/또는 CDR 잔기(들)은 다른 생식선 서열(즉, 항체가 원래 유래한 생식선 서열과는 다른 생식선 서열)의 해당 잔기(들)로 돌연변이 된다. 더욱이, 본 발명의 항체는 골격부 및/또는 CDR 부위 내에 둘 이상의 생식선 돌연변이의 모든 조합을 포함할 수 있는데, 예를 들면 이때 원래의 생식선 서열과는 다른 특정 기타 잔기들은 유지되거나 다른 생식선 서열의 해당 잔기로 돌연변이 되는 동안 특정 개별 잔기들은 특정 생식선 서열의 해당 잔기로 돌연변이 된다. 획득이 되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편은 개선된 결합 특이도, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 증강된 길항적 또는 작용적 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 검사될 수 있다. 이러한 일반적인 방법으로 획득된 항원 및 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.

또한 본 발명은 본 명세서에 게시된 하나 이상의 보존적 치환물을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이물을 포함하는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 일 예로, 본 발명은 예를 들면, 본 명세서에 게시된 모든 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해 보존적 아미노산 치환이 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 등인 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-ASIC1 항체를 포함한다.

용어 "에피톱"은 파라토프(paratope)로 알려진 항체 분자의 가변 영역의 특정 항원 결합 부위와 작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피톱을 가질 수 있다. 따라서 다른 항체들은 항원의 다른 부위에 결합할 수 있고 다른 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피톱은 입체형 또는 선형일 수 있다. 입체형 에피톱은 선형 폴리펩티드 사슬의 다른 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피톱은 폴리펩티드 사슬의 인접 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 특정 상황에서, 에피톱은 항원 상에 당류, 포스포릴기, 또는 설포닐기의 반족(moieties)을 포함할 수 있다.

핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때 "상당한 상동성" 또는 "실질적으로 동등한"이라는 용어는, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 통해 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 뉴클레오티드 서열 상동성이 아래에서 논의된 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 잘 알려진 모든 서열 알고리즘에 의해 측정했을 때 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 95%, 그리고 더 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상임을 나타낸다. 특정 경우에서는 기준 핵산 분자와 실질적인 상동성을 갖는 핵산 분자가 상기의 기준 핵산 분자에 의해 부호화되는 폴리펩티드로서 같거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 부호화 할 수도 있다.

폴리펩티드에 사용될 때, "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"이라는 표현은 두 개의 펩티드 서열이, 기본 갭 무게(default gap weight)를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의한 경우와 같이 최적으로 정렬된 경우, 적어도 95%의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 상동성을 공유한다는 의미이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기의 위치는 보존적 아미노산 치환별로 차이가 있다. 용어 "보존적 아미노산 치환"이란 아미노산 잔기가 비슷한 화학적 성질(예를 들면, 전하 또는 소수성)의 곁가지(R 그룹)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 크게 바꾸지 않는다. 보존적 치환에 의해 둘 이상의 아미노산 서열이 서로 다른 경우, 서열 상동성 백분율 또는 유사도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당 업계의 기술자에게 잘 알려져 있다(예: Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 참고). 유사한 화학적 성분을 갖는 측쇄를 가진 아미노산 그룹의 예로는 (1) 지방족 화합물 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족 화합물 수산기 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산, (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌 등이 있다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 그렇지 않은 경우, 보존적 대체는 다음의 문서에서 게시된 PAM250 로그 우도 행렬(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 가지는 모든 변화이다: Gonnet et al . (1992) Science 256: 1443-1445. "적절한 보존적" 대체는 PAM250 로그 우도 행렬에서 음수 값이 아닌 값을 갖는 모든 변화가 된다.

폴리펩티드의 서열 유사성은 서열 상동성으로도 언급되는데 이는 일반적으로 서열 분석 프로그램을 이용해서 측정된다. 단백질 분석 프로그램은 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 지정된 유사도의 측정치를 사용하여 유사한 서열들을 짝짓는다. 예를 들면, GCG 소프트웨어에는 서로 다른 종들로부터의 동질성의 폴리펩티드 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드들, 그리고 야생형 단백질과 돌연변이 단백질 사이에서 서열 동족 관계나 서열 상동성을 결정하는 초기 매개 변수와 함께 사용되는 Gap 그리고 Bestfit과 같은 프로그램들이 들어있다. 참고자료 예: GCG Version 6.1. 폴리펩티드 서열은 또한GCG 버전 6.1의 프로그램의 기본값 혹은 권장 매개변수를 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예: FASTA2 and FASTA3)는 질의 및 검색 서열 사이에서 가장 잘 중첩되는 영역의 배열 및 퍼센트 서열 상동성을 제공한다 (Pearson (2000) supra). 본 발명의 서열을 다른 생물체로부터의 많은 수의 서열을 담고 있는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 선호되는 알고리즘은 기본 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 참고자료 예: Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

본 항체의 생물학적 특성

본 발명은 세포 표면에 발현된 ASIC1을 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체가 자연적으로 혹은 인공적으로 ASIC1을 발현하는 세포에는 감지 가능한 세포 결합을 보여주지만 ASIC1을 발현하지 않는 동등한 세포에는 감지 가능한 결합을 보이지는 않는 경우 항체는 세포 표면에 발현된 ASIC1을 특이적으로 결합한다. 항체가 특히 세포 표면에 발현된 ASIC1에 특이적으로 결합하는지를 판정하는데 사용할 수 있는 분석법의 일 예로는 본 명세서의 실시 예 3에서 설명된 바와 같이 FACS(fluorescence activated cell sorting, 형광 활성 세포 분리 분석)이 있다. 표 2에서 보이는 바와 같이 ASIC1을 발현하는 세포에 대한 항체의 정성적 양성 FACS 결합능은 세포 표면에 발현된 ASIC1을 특이적으로 결합하면서 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 또한 FACS는 표3의 실시 에 3에서 보이는 바와 같이 ASIC1를 발현하는 세포에 결합하는 항체를 EC₅₀ 값으로 정량적으로 평가하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 구현 예에 따르면 항체가 실시 예 3의 FACS 분석 방식으로, 또는 이와 실질적으로 유사한 방식으로 시험되어 상기 항체가 약 5nM또는 그 이하(예: 약 5.0 nM, 4.5 nM, 4.0 nM, 3.5 nM, 3.0 nM, 2.5 nM, 2.0 nM, 1.5 nM, 1.4 nM, 1.3 nM, 1.2 nM, 1.1 nM, 1.0 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 85 pM, 80 pM, 75 pM, 70 pM, 또는 그 이하)의 EC₅₀값을 나타내는 경우, 항체는 "세포 표면에 발현된 ASIC1을 특이적으로 결합한다".

특정 구현의 예에 따른 본 발명의 항체는 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 산에 의해 유발되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는 기능도 (또는 대안적으로) 할 수 도 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "산에 의해 유발되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제한다"라는 표현은 산에 의해 유발되는 세포성 이온 전류나 흐름을 감지 및/또는 정량화시킬 수 있는 분석법에서 본 발명의 항체의 첨가가 항체가 없는 경우(예: 비특이적 음성 대조 항체가 있는 경우)에 관찰되는 이온 전류에 비해 산에 의해 유발되는 이온 전류를 감소시키거나 억제시킨다는 것을 의미한다. 항체가 "산에 의해 유발되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는지"를 결정하는데 사용할 수 있는 분석법의 예는 본 명세서의 실시 예 4에서 설명되며 이에 국한되지는 않는다. 상기의 실시 예에서, 낮은 pH에서 활성화되는 칼슘의 흐름은 항-ASIC1 항체가 있는 경우 ASIC1 발현 세포에서 측정된다. 상기의 분석 방법에서 사용되는 항체의 양을 다양화 시켜서 낮은 pH에 의해 유발되는 이온 전류의 50%를 막는데 필요한 항체의 양이 IC₅₀ 값으로 계산되고 표시될 수 있다(예: 표5의 실시 예 4 참고). 본 발명은 상기와 같이 약 5.0에서 약 6.0사이의 pH (예: pH 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0)에서 FLIPR 분석법, 또는 실질적으로 유사한 분석법으로 시험했을 때 약 10nM 이하의 IC₅₀를 갖는, 산에 의해 유도되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 상기와 같이 pH 5.5에서 FLIPR 분석법 또는 실질적으로 유사한 분석법에 의해 시험했을 때 약 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM 이하, 또는 그 이하인 IC₅₀를 보이는 항-ASIC1 항체를 포함한다.

항체가 "산에 의해 유발되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는 지"를 결정하는데 사용될 수 있는 다른 예시적 분석법들이 실시 예 5 및 6에서 설명된다. 상기 실시 예에서, 자동 전압 클램프(Automated voltage clamp)와 패치 클램프 분석법이 항-ASIC1 항체가 있는 경우 산성 pH에서 ASIC1을 발현하는 세포에서 전류 흐름의 억제를 항체가 없는 경우(예: 비 특이적 음성 대조 항체가 있는 경우) 동등한 환경에서 관찰된 전류 흐름과 비교하여 측정 및/또는 평가하는데 사용된다. 항체가 약 5.0 내지 약 6.0의 pH에서(예: pH 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0에서), 약 1 nM 내지 100 nM의 항체 농도에서 전압 클램프 및 패치 클램프 분석법으로 시험했을 때 적어도 10%의 전류 억제(예: 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 혹은 그 이상의 전류 흐름 억제; 예를 들면, 표6의 실시 예 5 참고)를 야기하는 경우 이 항체는 "산성에 의해 유도되는 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는" 것으로 간주된다. 어떤 경우에는 본 발명의 항체는 위에서 언급한 패치 클램프 분석법 또는 실질적으로 유사한 분석법에 의해 시험했을 때 전류의 흐름을 10nM 또는 그 이상(예: 100 nM)에서 완전히(100%) 억제한다.

본 발명은 또한 다양한 동물 통증 모형에서 통증 반응을 억제 또는 감소시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-ASIC1 항체를 특징짓는데 유용한 예시적 동물 통증 모델들이 본 명세서의 실시 예 7-9에서 설명된다. 예를 들면 본 발명은 생쥐 모델에서 산에 의해 유발되는 내장 통증에 대한 통증 반응을 완화 또는 감소시키는 항-ASIC1 항체를 포함한다. (예: 실시 예 7 참고). 특히 본 발명은 실시 예 7에서 보이는 바와 같이 생쥐 또는 실질적으로 유사한 모델에게 약 1 혹은 약 10 mg/kg의 용량으로 주입하였을 때 내장 통증 반응(예: 복강 내에 주입한 0.6%의 아세트산에 대한 반응으로서의 복부 수축)의 최소 20% 억제를 보이는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 특정 경우에 본 발명의 항체 투여로 인한 통증 반응의 억제 비율은 실시 예 7의 생쥐 동물 통증 모델 또는 실질적으로 유사한 모델에서 시험했을 때 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상이 될 수 있다. 본 발명의 항-ASIC 항체를 특징짓는데 사용될 수 있는 다른 동물 통증 모델들에는 실시 예 8의 기계적 통각 통증 반응 모델, 실시 예 9의 근육 통증 모델 및 다른 유사한 동물 모델들이 있다. 따라서 본 발명은 본 명세서의 실시 예의 적절한 동물 모델에서 설명된 대로 독성 기계적 자극(예: 실시 예 8 참고) 및/또는 산성 식염수 또는 카라게닌에 의해 유도된 근육 통각 과민(예: 실시 예 9 참고)에 대한 통증 반응을 완화 또는 감소시킬 수 있는 항-ASIC1 항체를 포함한다.

에피톱 맵핑 및 관련 기술

본 발명은 사람 ASIC1의 세포 외부 도메인 내에서 발견된 하나 또는 그 이상의 아미노산(SEQ ID NO: 401의 아미노산 63 -424)과 반응하는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피톱은 ASIC1의 세포 외부 도메인 내에 위치한 3 또는 그 이상(예: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)의 아미노산의 단일 연속 서열(single contiguous sequence)로 구성될 수 있다. 또는 상기 에피톱은 ASIC1의 세포 외부 도메인 내에 위치한 복수의 비연속적 아미노산들(또는 아미노산 서열)로 구성될 수 있다.

당 업계의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 기술들이 폴리펩티드나 단백질 내에서 항체가 “하나 혹은 그 이상의 아미노산들과 반응”하는 지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예시적 기술들의 예로는 Antibodies [Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에서 설명한 통상적인 교차 차단 분석법(cross-blocking assay), 알라닌 검사 변형 분석(alanine scanning mutational analysis), 펩티드 블롯 분석(peptide blots analysis), 그리고 펩티드 분할 분석(peptide cleavage analysis) 등이 있다. 또한, 에피톱 도려내기(excision), 에피톱 추출(extraction), 그리고 항원의 화학적 변형과 같은 방법들이 사용될 수 있다 (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). 항체가 반응하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 동정하는데 사용할 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의한 수소/중수소 교환법이다. 일반적인 용어로 표현하자면, 수소/중수소 교환법은 관심 단백질을 중수소로 표지한 후 중수소 표지 단백질에 항체를 결합시키는 것을 포함한다. 그 다음, 단백질/항체 복합물이 물로 전송되어 항체(여전히 중수소로 표지된 상태)에 의해 보호 되는 잔기를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 이루어진다. 항체의 분리 후 표적 단백질은 단백질 분해 효소 절단 및 질량 분광법에 의해 분석되어 항체가 반응하는 특정 아미노산에 해당하는 중수소 표지 잔기를 드러낸다. 참고자료 예: Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal . Chem . 73:256A-265A.

더 나아가 본 발명은 본 명세서에 기술된 모든 특정 예시적 항체(예: H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P 등)로서 상기의 동일한 에피톱에 결합되는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 마찬가지로 본 발명은 본 명세서에 기술된 모든 특정 예시적 항체들(예: H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P 등)과 ASIC1 또는 세포 표면에 발현된 ASIC1에 결합하기 위해 경쟁하는 항-ASIC1 항체들을 포함한다.

항체가 기준 항-ASIC1 항체로서 상기의 동일한 에피톱에 결합하는지, 또는 이와 결합을 놓고 경쟁하는지는 당 업계에 알려진 통상적인 방법을 사용하여 쉽게 판정할 수 있다. 예들 들면, 시험 항체가 본 발명의 기준 항-ASIC1 항체로서 상기의 동일한 에피톱에 결합하는 지를 판정하기 위해 상기의 기준 항체가 ASIC1 단백질(예: 세포 표면에 발현된 ASIC1)에 결합하도록 허용된다. 그 다음, 시험 항체의 ASIC1 분자에 대한 결합능이 평가된다. 상기의 시험 항체가 상기의 기준 항-ASIC1 항체와 포화 결합한 후 ASIC1에 결합할 수 있는 경우, 상기의 시험 항체는 상기의 기준 항-ASIC1 항체 외의 다른 에피톱에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에 상기의 시험 항체가 상기의 기준 ASIC1 항체에 포화 결합한 후 상기의 ASIC1 분자에 결합할 수 없는 경우, 상기의 시험 항체는 본 발명의 기준 항-ASIC1 항체에 의해 결합된 에피톱과 동일한 에피톱에 결합할 수도 있다. 관찰된 시험 항체의 결합능의 결여가 실제 기준 항체와 동일한 에피톱에 결합하기 때문인지 또는 구조 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여의 원인인지를 확인하기 위해 추가적인 일상적 실험(예를 들면, 펩티드 돌연변이 및 결합능 분석)을 수행할 수 있다. 이런 종류들의 실험들은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 분석법(flow cytometry), 또는 당 업계에 알려진 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구현 예들에 따르면, 한 항체의 예를 들면 1, 5, 10, 20 혹은 100배 과도가 다른 항체의 결합능을 경쟁적 결합 분석법에서 측정하였을 때 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 혹은 99%까지 억제하는 경우, 두 항체는 동일한 에피톱에 결합(또는 중첩)한다 (참고 자료 예: Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). 아니면, 하나의 항체의 결합능을 감소시키거나 제거하는 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합능을 감소시키거나 제거하는 경우 두 항체는 동일한 에피톱에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합능을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이 만이 다른 한 항체의 결합능을 감소시키거나 제거하는 경우 두 항체는 "중복되는 엡피톱"을 갖는 것으로 간주된다.

한 항체가 기준 항-ASIC1 항체와 결합을 놓고 경쟁하는지를 판정하기 위해, 상기에 기술된 결합 방식은 다음의 두 가지 방향으로 수행된다. 첫 번째 방향의 예로, 기준 항체가 포화 상태에서 ASIC1 분자(예: 세포 표면에 발현된 ASIC1)에 결합되도록 한 후 ASIC1 분자에 대한 시험 항체의 결합능이 평가된다. 두 번째 방향의 예로, 상기의 시험 항체가 포화 상태에서 ASIC1 분자에 결합되도록 한 후 ASIC1 분자에 대한 기준 항체의 결합능이 평가된다. 두 가지 방향 예 모두에서 첫 번째 항체(포화 상태) 만이 ASIC1 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체와 기준 항체가 ASIC1에 결합 부위를 놓고 경쟁하는 것으로 결론 지을 수 있다. 당 업계의 통상의 기술자에 의해 평가되겠지만, 기준 항체와 결합을 놓고 경쟁하는 항체는 반드시 기준 항체와 동일한 에피톱에 결합할 필요가 없지만, 중복 또는 인접 에피톱을 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수도 있다.

사람 항체의 조제

완전한 사람 단클론 항체를 포함하여 단클론 항체를 만드는 방법들은 당 업계에 알려져 있다. 이러한 알려진 모든 방법들은 사람 ASIC1에 특이적으로 결합하는 사람 항체들을 만들기 위해 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.

VELOCIMMUNE™ 기술 또는 단클론 항체를 생산하는 모든 다른 알려진 방법을 사용하여, 사람 가변 영역 및 생쥐의 불변 영역을 가진, ASIC1에 대한 고친화도 키메라 항체가 먼저 분리된다. 아래의 실험 부분에서처럼 상기 항체는 친화도, 선택성 및 에피톱 등을 포함한 바람직한 특성들을 위해 특징지어지고 선택된다. 상기 생쥐 불변 영역은 본 발명의 완전한 사람 항체, 예를 들면 표준(wild-type) 또는 변형된 IgG1이나 IgG4를 생성하기 위해 바라는 사람 불변 영역으로 대체된다. 상기의 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 다를 수 있는 반면, 고친화도 항원-결합 및 표적 특이도 특징들은 가변 영역에 있다.

생물학적 등가물

본 발명의 항-ASIC1 항체와 항체 단편들은 상기의 기술된 항체들의 아미노산 서열과는 다른 서열을 갖지만 사람 ASIC1에 결합하는 능력이 있는 단백질들을 포함한다. 이러한 변종 항체 및 항체 단편은 모 서열(parent sequence)과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산의 추가, 제거 또는 치환을 포함하지만 상기 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 보인다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 항-ASIC1 항체-부호화 DNA 서열은 상기의 게시된 서열과 비교했을 때 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 제거 또는 치환을 포함하지만, 본질적으로는 본 발명의 항-ASIC1 항체 또는 항체 단편과 생물학적으로 동등한 항-ASIC1 항체 또는 항체 단편을 부호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변종 아미노산 및 DNA 서열의 예는 위에서 고찰된다.

두 가지 항원-결합 단백질, 또는 항체는 예를 들면, 이들이 비슷한 실험 조건에서 동일한 몰 용량에서 단일 용량이나 다중 용량으로 투여되었을 때 이들의 흡수율 및 흡수 정도가 유의한 차이를 보이지 않는 제약학적 등가물 또는 제약학적 대체제인 경우 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 어떤 항체는 흡수 정도에서는 동등하고 흡수율에서는 그렇지 않지만 흡수율의 차이가 의도적이며 허가사항에 반영되어 있고, 예를 들면, 장기 사용 시 효과적인 신체 약물 농도의 달성에 필수적이지 않고, 그리고 연구되는 특정 약 제품에 의학적으로 유의하지 않기 때문에 생물학적으로 동등한 것으로 간주되는 경우 등가물 또는 제약학적 대체제로 간주된다.

일 구현의 예로, 두 가지 항원-결합 단백질이 안전성, 순도 및 역가에 있어서 임상적으로 유의한 차이가 없는 경우 이 둘은 생물학적으로 동등하다.

일 구현의 예로, 두 가지 항원-결합 단백질은 환자가 기준품(reference product)과 생물학적 제품(biological product) 간에 한 번 이상 바꾸어 사용해도 그러한 변경 없는 꾸준한 치료에 비해 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 또는 효능의 감소를 포함하여 부작용 위험의 증가가 예상되지 않는 경우 생물학적으로 동등하다.

한 실시 예에서는 두 개의 항원 결합 단백질이 만약 두 경우가 공통된 기전으로 작용하고 그러한 기전이 알려진 범위에서 같은 방법으로 이루어진다면 역시 생물학적으로 동등하다고 간주된다.

생물학적 등가성은 체내 및 체외 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 등가성 척도에는, 예를 들면, (a) 항체 또는 이의 대사물의 농도가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 기타 생체액 내에서 시간 함수로 측정되는 사람 또는 기타 포유류에서의 체내 시험; (b) 사람 체내 생체이용률 데이터와 상관관계가 있었고 합리적으로 이를 예측하는 체외 시험; (c) 항체(또는 그 표적)의 신속한 해당 약리학적 효과가 시간 함수로 측정되는 사람 또는 기타 포유류에서의 체내 시험; 그리고 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률이나 생물학적 등가성을 확립하는 잘 통제된 임상시험이 포함된다.

본 발명의 항-ASIC1 항체의 생물학적으로 동등한 변종은, 예를 들면 잔기나 서열을 다양하게 치환하거나, 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기나 서열을 제거함으로써 구축될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수 요소가 아닌 시스테인 잔기는 단백질 복원 시 불필요하거나 올바르지 않은 분자 내 이황화 연결의 형성을 방지하기 위해 제거되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 다른 경우에는 생물학적으로 동등한 항체들이 상기 항체들의 글리코실화 특징을 수정하는 아미노산 변화를 포함하는 항-ASIC1 항체 변이를 포함할 수 있다(예: 글리코실화를 제거하는 돌연변이).

종별 선택성 및 종별 교차 반응성

본 발명의 특정 구현의 예에 따르면, 상기 항-ASIC1 항체들은 사람의 ASIC1에는 결합하지만 다른 종들의 ASIC1에는 결합하지 않는다. 본 발명은 또한 사람 ASIC1과 하나 혹은 그 이상의 사람이 아닌 종들의 ASIC1에도 결합하는 항-ASIC1 항체를 포함한다. 예들 들면 본 발명의 항-ASIC1 항체들은 사람의 ASIC1에는 결합하지만 경우에 따라 생쥐, 래트, 구이니아 돼지, 햄스터, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 명주 원숭이, 붉은털 원숭이 혹은 침팬지 ASIC1에는 결합하거나 하지 않을 수 있다. 본 발명은 또한 사람의 ASIC1통로를 통해 산에 의해 유발되는 이온 전류를 선택적으로 차단하는 항-ASIC1 항체를 포함한다(그러나 사람이 아닌 ASIC1 통로를 통해서는 이루어지지 않는다). 대신에 특정 구현의 예에 따르면, 사람이 아닌(예: 생쥐, 래트 등) ASIC1 통로를 통해서뿐만 아니라 사람의 통로를 통해서도 산에 의해 유도되는 이온 전류를 차단할 수 있는 항-ASIC1 항체가 제공된다.

면역접합체

본 발명은 세포 독소, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사성동위원소와 같은 치료 성분(therapeutic moiety)("면역접합체")에 접합된 항-ASIC1 단일 클론 항체를 포함한다. 세포독성 제제는 세포에 유해한 모든 제제를 포함한다. 면역접합체 형성을 위한 적절한 세포독성 제제 및 화학치료 제제의 예는 당 업계에 알려져 있다. (예를 들면, WO 05/103081을 참고).

다중 특이적 항체

본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 또는 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 하나의 목표 폴리펩티드의 다양한 에피톱에 특이적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 포함할 수도 있다. 참고자료 예: Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. 본 발명의 항-ASIC1 항체들은 다른 기능적 분자(예: 다른 펩티드나 단백질)와 연결되거나 함께 발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 또 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 다른 분자물에 기능적으로 연결(예를 들면, 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 연합(noncovalent association) 또는 기타 방법으로)되어 두 번째 결합 특이도를 가진 이중 특이 또는 다중 특이 항체를 생산할 수 있다. 예들 들면, 본 발명은 하나의 면역 글로불린 한 분지(arm)가 사람 ASIC1 또는 이의 단편에 특이적이고, 면역 글로불린의 또 다른 분지는 두 번째 치료 표적에 특정적이거나 치료 성분(therapeutic moiety)에 접합되는 이중 특이적 항체들을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적 이중 특이적(결합) 항체 포맷은 첫 번째 면역글로불린(Ig) C_H3 도메인과 두 번째 Ig C_H3 도메인의 사용을 포함하며, 이때 첫 번째 및 두 번째 Ig C_H3 도메인은 적어도 하나의 아미노산이 서로 다르며, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중 결합 항체에 비해 단백질 A(Protein A)에 대한 이중 결합 항체의 결합능을 감소시킨다. 일 구현의 예로, 첫 번째 Ig C_H3 도메인은 Protein A를 결합하고, 두 번째 Ig C_H3 도메인은 H95R(IMGT 엑손 번호체계; EU 번호체계에 의해서는 H435R) 변형과 같은 Protein A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. 두 번째 C_H3는 또한 Y96F(IMGT에 의함; EU 체계에 의해서는 Y436F) 변형을 포함할 수 있다 . 두 번째 C_H3 내에서 발견될 수 있는 추가적인 변형은 다음과 같다. IgG1 항체의 경우: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I (IMGT에 의한 분류; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I - EU에 의한 분류); IgG2 항체의 경우: N44S, K52N 및 V82I (IMGT; N384S, K392N 및 V422I - EU에 의한 분류); 그리고 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I (IMGT에 의한 분류; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I - EU에 의한 분류). 상기의 이중 결합 항체 포맷의 변동은 본 발명의 범위 내에서 고려된다.

치료적 제형 및 투여

본 발명은 본 발명의 항-ASIC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 개선된 운반, 전달, 내성 등을 제공하는 적절한 운반체, 부원료, 및 기타 제제로 제조된다. 모든 제약 화학자에게 알려진 다음의 처방집에서 많은 적절한 제형을 찾아볼 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이러한 제형에는, 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 유제, 지질, 지질(양이온 또는 음이온) 함유 소구체(예: LIPOFECTIN™ Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수형 유형(oil-in-water) 및 유중 수형(water-in-oil) 유제, 유제 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 젤, 그리고 카보왁스를 함유하는 반고형 혼합물이 포함된다. 다음 내용도 참고: Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations (비경구용 제제를 위한 첨가제의 개요서)" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

환자에 투여되는 항체의 양은 환자의 나이, 체격, 표적 질환, 상태 및 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 선호되는 용량은 일반적으로 몸무게나 몸 표면 크기에 따라 계산된다. 본 발명의 항체가 성인 환자의 ASIC1 활성도와 연관된 증상이나 질환을 치료하는 데 사용되는 경우, 일반적으로 본 발명의 항체를 몸무게 1kg당 약 0.01 내지 약 20mg의 단일용량으로 정맥을 통해서, 또는 바람직하게는 몸무게 1kg당 약 0.02-7, 약 0.03-5 또는 약 0.05 내지 약 3 mg을 투여할 수 있다. 증상의 중증도에 따라서, 치료 횟수 및 기간이 조정될 수 있다. 항-ASIC1 항체를 투여하는데 있어서 효과적인 용량과 투약일정은 경험적으로 결정될 수 있다; 예들 들면, 환자의 호전상태가 정기적인 평가에 의해 모니터링 될 수 있으며 그에 따라 용량이 조정될 수 있다. 뿐만 아니라 용량의 종간 스케일링이 이 분야에서 잘 알려진 방법들을 사용해서 수행될 수 있다(예: Mordenti 외., 1991, Pharmaceut. Res . 8:1351).

다양한 전달 시스템, 예를 들면 리포좀 캡슐화, 극미립자, 마이크로캡슐, 변종 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 세포내 섭취 등이 알려져 있으며 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다 (참고자료 예: Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 주입 방법은 피내, 근내, 복강내, 정맥, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 모든 편리한 경로 - 예를 들면 점적 주사 및 일시 주사, 상피 또는 점막 벽(예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수 - 를 통해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성 제제와 병용하여 투여될 수 있다. 투약은 전신적으로 또는 국부적으로 시행될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 표준 주사기를 사용하여 피하 또는 정맥 경로로 전달될 수 있다. 또한, 피하 경로의 전달과 관련하여, 펜 전달 창치를 사용하면 본 발명의 약학적 조성물을 더 쉽게 전달할 수 있다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용하거나 일회용일 수 있다. 재사용 펜 전달 장치는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체 가능한 카트리지를 이용한다. 카트리지 내의 약학적 조성물이 모두 투여되고 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기하고 본 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지를 교체할 수 있다. 그런 다음 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교환용 카트리지가 없다. 대신 일회용 펜 전달 장치는 장치 내 저장통에 본 약학적 조성물이 충진되어 공급된다. 저장통에서 본 약학적 조성물이 비워지게 되면 전체 장치가 폐기된다.

수많은 재사용 펜 및 자동 주입 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 몇 가지 예를 들면 다음과 같지만 이에 국한되는 것은 아니다: AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NO VOPEN™ I, II, III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™ OPTIPEN PRO™ OPTIPEN STARLET™ OPTICLIK™(Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany). 본 발명의 약학적 조성물을 피하 경로로 전달하는데 사용되는 일회용 펜 전달 장치의 예를 몇 가지 든다면 다음과 같지만 이에 국한되는 것은 아니다: SOLOSTAR™ pen (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL).

특정 상황에서, 상기의 약학적 조성물은 조절(서방형) 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구현의 예로, 펌프가 사용될 수도 있다 (참고자료: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). 또 다른 구현의 예로, 고분자 물질이 사용될 수 있다; 참고자료: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. 또 다른 구현의 예로, 조절(서방형) 방출 시스템을 조성물의 표적 근방에 둠으로써 전신 용량의 일부분만 사용할 수 있다 (참고자료 예: Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). 기타 조절 방출 시스템은 다음의 검토자에 의해 논의 된다: Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

주사용 제제는 정맥, 피하, 피내 및 근내 주사, 점적 주사 등의 제형을 포함할 수 있다. 이러한 주사용 제제는 공개된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사용 제제는, 예를 들면 위에서 설명한 본 항체 또는 이의 염을 통상적인 주사용 무균 수성 용매 또는 유성 용매에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 조제될 수 있다. 주사용 수성 용매의 예로는 생리식염수, 글루코스 및 알코올(예: 에탄올), 다가 알코올(예: 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제[예: 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소 첨가 피마자유 폴리옥시에틸렌(50 mol) 부가 생성물)] 등과 같은 적절한 용해제와 조합하여 사용할 수 있는 기타 보조제 등이 들어있는 등장용액이 있다. 유성 용매로는, 예를 들면 벤질 벤조산, 벤질 알코올 등과 같은 용해제와 조합하여 사용할 수 있는 참깨 오일, 대두 오일 등이 사용된다. 이렇게 조제된 주사용제는 적절한 앰풀에 충진하는 것이 바람직하다.

안성맞춤으로, 위에 기술된 경구 또는 비경구용 약학적 조성물은 유효 성분 용량에 맞춘 단위 용량으로 조제된다. 이러한 단위 용량 제형에는, 예를 들면 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰풀), 좌제 등이 포함된다. 상기 항체의 내용양은 일반적으로 단위 용량의 제형 당 약 5 내지 약 500 mg이다; 특히 주사 제형의 경우 상기 항체는 약 5 내지 100 mg, 그리고 기타 제형의 경우 약 10 내지 250 mg이 담기는 것이 바람직하다.

항체의 치료적 사용

본 발명의 항체들은 특히 환자의 신경 세포 내 산에 의해 유발되는 ASIC1 매개 이온 전류를 막거나 약화시킴으로써 ASIC1 활성과 관련되거나 매개되는 모든 질환이나 질병의 치료, 예방 및/또는 완화에 효과적이다. 본 발명의 항-ASIC1 항체로 치료할 수 있는 질병이나 질환들의 예에는 염증 관련 통증(예: 염증성 근육통), 다발성 근염, 수술 후 절개(예: 수술 후 통증), 신경 병증(예: 당뇨 신경병증), 좌골 신경통, 대상 포진 후 신경통, 근막 동통 증후군(예: 만성 근막 동통), 관절염, 겸상 적혈구, 장관 신경 허혈, 파행 통증, 뼈 골절, 화상, 골다공증에 의한 골절, 통풍, 편두통, 섬유 근통, 복합 부위 통증 증후군, 급성 포진 통증 등등 뿐만 아니라 침해성 통증 및 내장 통증(예: 염증성 장 질환/과민성 대장 증후군, 간질성 방광염, 췌장염, 자궁 내막증, 만성 골반 통증 증후군 등으로 인한 통증)과 같은 통증 상태를 포함한다. 또한 본 발명의 항체들은 신경퇴행성 질환(예: 다발성 경화증이나 루게릭 병과 같은 탈수초성 질환), 뇌 손상(예: 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 산성혈증), 신경성 질환(예: 발작, 발작성 질환), 그리고 정신과 질환(예: 우울증, 불안증, 외상후 스트레스 장애, 공황 장애 등) 등과 같은 증상들을 치료, 예방 및/또는 완화하는 데 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 항-ASIC1 항체들은 암과 관련된 통증을 예방하고 치료하는 데에도 유용하다. "암 관련 통증"은 예를 들면, 골로 전이되는 암(예: 유방암, 전립선 암, 폐암, 육종, 신장암, 다발성 골수종 등)에 의한 통증을 포함하여 골암 통증을 포함한다. 또한 "암 관련 통증"은 신장암, 췌장암, 유방암, 두경부암, 전립선암, 악성 신경 교종, 골육종, 대장암, 위암, 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비 소세포성 폐암, 활막육종, 갑상선암 혹은 흑색종 등과 같은 암 증상에 일반적으로 관련된 통증을 포함한다. 또한 본 발명의 항-ASIC1 항체는 암 요법 또는 의료적 항암 치료에 기인하거나 관련된 통증(예: 파클리탁셀(Taxol™), 도세탁셀(Taxotere®); 니트로소우레아, 시클로포스파미드, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 토포테칸, 이리노테칸, 카르무스틴, 에스트라무스틴, 그리고 시스플라틴, 카르보플라틴, 이프로플라틴과 같은 백금 기반 화학 요법 치료 복합제에 기인하거나 관련된 통증 등의 항암 치료에 의해 유발된 통증을 치료하거나 예방하는 데에도 유용하다:.

병용 요법

본 발명은 본 발명의 항-ASIC1 항체를 적어도 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분과 조합하여 투여하는 치료적 투여 요법을 포함한다. 이러한 추가적인 치료적 활성 성분들의 예로는 이차 항-ASIC1 항체, 다른 ASIC 성분에 대항하여 작용하는 항체(예: 항-ASIC2 항체, 항-ASIC3 항체, 항-ASIC4 항체 등), 펩티드 ASIC 억제제(예: 살모톡신-1 [PcTx1], APETx2, 등) 및/또는 소 분자 ASIC 억제제(예: 아밀로라이드, A-317567, 등) 등과 같은 다른 ASIC 억제제들이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

본 발명의 항-ASIC1 항체와 함께 유익하게 투여될 수 있는 다른 제제들에는 사이토킨 억제제(소분자 사이토킨 억제제 및 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 등의 사이토킨이나 이들의 각각의 수용기에 결합하는 항체들을 포함), 항 바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드 및/또는 NSAID가 포함된다.

추가적인 치료적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-ASIC1 항체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다; (본 명세서의 게시 목적 상, 이러한 투여 요법들은 추가적인 치료적 활성 성분과 "조합하여" 항-ASIC1 항체를 투여하는 것으로 간주된다).

항체의 진단적 사용

본 발명의 항-ASIC1 항체들은 예들 들면, 진단 목적으로 검체 중의 ASIC1 또는 ASIC1을 발현하는 세포들을 검출 및/또는 측정하는데도 사용될 수 있다. 예들 들면, 항-ASIC1 항체 또는 이의 단편은 ASIC1의 이상 발현(예: 과발현, 저발현, 발현 부재 등)이 특징인 증상이나 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. ASIC1의 진단 분석법의 예로는 환자에게서 채취한 검체를 본 발명의 항-ASIC1 항체로 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 이 경우 상기의 항-ASIC1 항체는 감지가 가능한 표지 또는 보고자 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지 되지 않은 항-ASIC1 항체는 감지 가능하게 표지된 이차 항체와 조합하여 진단적 방법으로 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 보고자 분자는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인이소티오시안산염이나 로다민과 같은 형광 또는 화학발광성 성분(moiety); 또는 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제, 양고추냉이 과산화효소, 또는 발광효소와 같은 효소일 수 있다. 검체 내의 ASIC1을 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 구체적인 분석법들의 예로는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 그리고 형광 활성 세포 분리 분석법(FACS)이 있다.

본 발명에 따라 ASIC1 진단적 분석법에서 사용될 수 있는 검체에는 정상적이거나 병적인 상태에서 환자에게서 채취할 수 있는, 검출 가능한 양의 ASIC1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 모든 조직 또는 액상 검체가 포함된다. 일반적으로 건강한 환자(예: 비정상적인 ASIC1수준이나 활성도와 관련된 질환이나 증상이 없는 환자)에게서 채취한 특정 검체에서 ASIC1의 수준을 측정하여 먼저 ASIC1의 기본값, 즉 표준 수치를 설정하게 된다. 그런 다음 ASIC의 이러한 기본값 수치를 ASIC1 관련 질환이나 증상이 있는 것으로 의심되는 환자에게서 채취한 검체에서 측정된 ASIC1의 수치와 비교할 수 있다.

실시예

다음의 실시예는 당 업계의 일반적인 기술자에게 본 발명의 방법과 조성물의 제조법과 사용 방법에 대한 완전한 공개와 설명을 제공하기 위해 제안된 것으로, 본 발명자가 자신의 발명의 범위를 제한하는 용도가 아니다. 사용된 수치(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 기하려고 하였지만 약간의 실험적 오류와 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한 부분(part)은 무게당 부분이며, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압 근방이다.

실시 예 1. 사람 ASIC1 에 대한 사람 항체의 생성

항 사람 ASIC1 항체를 생성하기 위해, VELOCIMMUNE® 생쥐(Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY)에게 분리된 플라스미드 부호화 보강제와 함께 전장 사람 ASIC1을 부호화하는 DNA 플라스미드가 피내로 투여되는 DNA 면역화 절차가 사용되었다. 그 다음 주사 부위가 플라스미드의 숙주 세포의 형질주입(transfection)을 유도하기 위해 전기 천공되었다. 면역화를 위해 사용된 VELOCIMMUNE^® 생쥐는 사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 변이 영역을 부호화 하는 DNA를 포함하며 내생적 생쥐 asic1a 유전자가 결여되어 있다. 항체 면역 반응은 사람 ASIC1을 발현하도록 조작된 세포를 사용하는 세포 결합 분석법에 의해 관찰되었다. 바라는 면역 반응이 달성되었을 때 비장세포를 채취하여 생쥐 골수종 세포와 융합하여 이들의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. ASIC1 특이 항체들을 생산하는 세포주들을 동정하기 위해 상기의 하이브리도마 세포주들을 선별 검사하여 선택하였다. 이 기술을 이용하여 여러 개의 항-ASIC1 키메라 항체들(예: 사람의 가변 영역과 쥐의 불변 영역을 가공하는 항체들)이 얻어졌다; 이러한 방식으로 얻어진 예시적 항체들을 다음과 같이 명명하였다: H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, 와 H3M7118N.

또한 항-ASIC1 항체들은 US 2007/0280945A1에서 기술된 대로 골수종 세포와 융합하지 않고 항원 양성 B 세포에서 직접 분리하였다. 이 방법을 사용해서 여러 개의 완전한 사람 항-ASIC1 항체들(예: 사람 가변 영역과 사람 불변 영역을 가공하는 항체들)이 얻어졌다; 이러한 방법으로 생성된 예시적 항체들은 다음과 같이 명명하였다: H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, 그리고 H4H6383P.

이러한 실시 예의 방법들에 따라 생성된 예시적 항-ASIC1 항체의 특정 생물학적 특징들이 아래의 실시 예들에서 상세하게 설명된다.

실시예 2. 중쇄 및 경쇄 변이 영역 아미노산 서열

표 1은 특정 항-ASIC1 항체 및 이들의 해당 항체 식별자(antibody identifier)의 중쇄 및 경쇄 가변부 아미노산 서열쌍을 보여준다.

본 명세서에서 항체들은 일반적으로 다음의 명명법에 따라 지칭된다: Fc 접두사(예: "H4H", "H1M", "H2M")가 먼저 나오고, 그 다음 숫자 식별자(예: 표1에서 보이는 바와 같이 "6712" 또는 "6362"가 나오고, 그 다음 "P" 나"N" 접미사가 이어진다. 따라서 이 명명법에 따르면 본 명세서에서 한 항체는 예들 들면 "H1M6712N" 또는 "H4H6362P" 로 지칭될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 항체 명명법에서 H4H, H1M 및 H3M 접두사는 항체의 특정 Fc 부위를 나타낸다. 예를 들면, "H1M"항체는 쥐의 IgG1 Fc 를 갖는 반면 "H4H" 항체는 사람의 IgG4 Fc를 갖는다. 당 업계의 통상의 기술자라면 알 수 있듯이, H1M 또는 H3M 항체는 H4H 항체로 전환 될 수 있고 그 반대도 가능하다. 그러나 어떤 경우에도 - 표1에서 보여진 숫자 식별자에 의해 나타나듯이 - 가변 도메인들(CDR을 포함하여)은 동일하게 유지된다.

실시 예 3. 전장 사람 또는 생쥐 ASIC1 을 발현하는 세포에 결합하는 항체

항-ASIC1 항체들의 특징을 자세히 파악하기 위해 다음과 결합하는 능력이 유세포 분석법(FACS)을 통해 결정되었다: a) 전장 사람 ASIC1을 과발현하도록 안정적으로 형질감염된 생쥐 섬유 모세포 3T3 세포주(3T3/hASIC1; NCBI 접근 번호 NP_001086.2의 아미노산 1-528 [SEQ ID NO:401]), b) 전장 생쥐 ASIC1a를 과발현하도록 안정적으로 형질감염된 3T3 세포주(3T3/mASIC1a; NCBI 접근 번호 NP_033727의 아미노산 1-526), 또는 c) 생쥐 신경모 세포종 및 내생적으로 래트(rat) ASIC1을 발현하는 래트 배근 신경절의 융합 세포주인 ND7 세포주(ECACC, # 92090903). ND7 세포는 배양 배지를 1mM의 디부티릴-cAMP이 함유된 낮은 농도의 혈청 배지(0.5% FBS)로 대체함으로써 분화시켰다. FACS 결합능이 분화 ND7 세포 및 미분화 ND7 세포 양쪽 모두에서 몇몇 항체에 대해 검사되었다.

FACS 결합 실험을 수행하기 위해, PBS에서1mM의 EDTA를 사용하여 부착된 세포들을 수집한 다음 세척하였고, 5% FBS가 함유된 차가운 PBS에서 재부유 시켰다. 각각의 결합 실험을 위하여 각각의 항-ASIC1 항체(최종 농도가 정화된 항체의 경우 10nM, 또는 3T3/hASIC1 세포 결합용의 항체 상층액의 경우 3.3nM, 그리고 3T3/mASIC1a 또는 ND7 세포 결합용의 경우 5nM)가 5%의 FBS가 포함된 500 μL의 PBS 내에 담긴 250,000개의 세포들에 첨가되었다. 실온에서 20분간 배양 후, 사람 Fc(Cat. No. 109-136-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) 또는 생쥐 Fc(Cat. No. 550826, BD Biosciences, San Jose, CA)를 인식하고 알로파이코시아닌에 접합되는 이차 항체가 최종 농도 13.3nM의 세포 복합물에 첨가되었다. 얼음 위에서 20분간 배양한 후 세포들을 세척하고 5% FBS가 들어있는 PBS에서 재부유 시킨 다음 분류하였고 유세포 분석기(flow cytometer) (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA) 에서 분석하여 시험된 세포주에 대한 후보 항체들의 상대적 결합능을 측정하였다. 항-ASIC 항체로 염색된 세포들의 히스토그램이 이차 항체로만 염색된 세포들의 히스토그램과 비교되었다. 이차 항체 단독에 대한 ASIC1 신호의 백분율을 FlowJo 프로그램(Tree Star, Ashland, OR)을 사용하여 계산하였다. 항-ASIC1 항체로 염색된 검체들은 10% 이상 게이트 제어되었을 때 FACS 양성으로 기록되었다. 항-ASIC1 항체로 염색된 검체들은 1% 이하로 게이트 제어되었을 때 FACS 음성으로 기록되었다. 항-ASIC1 항체로 염색된 검체들은 1-10% 범위에서 게이트 제어되었을 때 약한 결합으로 기록되었다. 3T3/hASIC1 세포, 3T3/mASIC1a 세포 및 ND7 세포들에 대한 항-ASIC1 항체들의 결합 특이도가 표2에서 잘 요약되어 있다 (ND = 미정).

3T3/hASIC1 세포에 대한 특정 항체들의 결합 친화도가 대략적인 EC₅₀ 값들이 계산된 다중 항체 농도(67 nM, 6.7 nM, 0.67 nM, 67 pM, 6.7 pM)를 사용하는 FACS에 의해 더 자세히 검사되었다. 항-ASIC1 항체에 대해 관찰된 평균형광강도(MFI) 신호에서 배경 신호(이차 항체 단독)를 뺀 다음, GraphPad Prism 프리즘을 사용하여 EC₅₀ 값을 결정하기 위해 항체 농도의 함수 도표로 만들었다(표 3).

표 2에서 보이는 바와 같이, 시험된 25개의 항체 중에 17개가 3T3/hASIC1 세포주에 특이적인 결합능을 보였고, 시험된 10개의 항체 중 8개는 3T3/mASIC1a 세포들에 대한 양성 결합능을 보였고, 10개의 항체 중에 6개는 비분화된 ND7 세포주에 양성 결합능을 보였고, 그리고 7개의 항체 중에 5개는 분화된 ND7 세포주에 양성 결합능을 보였다. 특징적으로 하나의 항체(H3M7118N)는 3T3/mASIC1a 및 미분화 ND7 세포주에는 약한 결합능을 보였으나 3T3/hASIC1 세포에는 양성 결합능을 보였다. 표 3에서 보이는 바와 같이, 다양한 항체 농도에서 시험된 항-ASIC1 항체들은 EC₅₀ 값이 3T3/hASIC1 세포에 대한 결합능의 경우 대략 23 pM 만큼 낮은 매우 친화적인 FACS 결합능을 보였다.

실시 예 4. 항- ASIC1 항체는 세포성 칼슘 흐름 분석법에서 산성 매개 세포 신호 전달을 차단한다

항-ASIC1 항체에 의한 산성 매개 세포 신호 전달 체계의 차단능을 특징짓기 위해 세포성 칼슘 흐름을 측정하는 분석법이 사람 ASIC1을 발현하도록 일과적으로 형질감염된 세포주 HEK293 CL:1F10(1F10)을 사용하여 실시되었다 (NCBI 접근 번호 NP_0010862.2의 아미노산 1-528 [SEQ ID NO:401]). 이 세포주는 사람 Par2를 발현하도록 안정적으로 형질감염된 모세포주 HEK293/D9로부터 생성되었다. 형질감염된 세포들을 2일 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양한 다음 웰 당 100,000개 세포 농도에서 바닥이 검고 깨끗한 96개의 분석 플레이트(assay plate)로 재분주하였다. 세포들이 실온에서 20분 동안 접시에 부착되도록 한 다음 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양하였다.

Fluo-4 NW 칼슘 분석 키트(Invitrogen, # F36206)가 낮은 pH 완충액에 의해 활성된 세포 내에서 세포내의 칼슘 흐름의 정도를 측정하기 위해 사용되었다. 분석용 완충액은 제조사의 사양에 따라 조제되었다. 프로베네시드(77 ㎍/uL) 50μL를 5mL의 버퍼 C(2xHBSS)에 첨가한 다음. 이를 성분 A(Fluo-4 염색)에 첨가하였다. 항-ASIC1 항체들은 Fluo-4 염색에서 희석하여 단일점 차단 분석법(single point blocking assay)을 위한 250nM 농도로 낮추었다. 낮은 pH 완충액에 의해 자극된 칼슘 흐름을 차단했던 항체들은 다중 항체 농도를 사용하는 이러한 분석법에서 자세하게 특징이 파악되었다. 항-ASIC1 항체들은 상기 염색액에서 250nM의 농도로 희석하였고 8점 1:3 희석 시리즈(250-0.1 nM의 범위)가 각 항체의 IC₅₀ 차단을 측정하기 위해 사용되었다. 세포 배양 배지가 세포들이 들어있는 분석 플레이트에서 제거되었고 그 후 항-ASIC1 항체가 들어있는 Fluo-4 염색액 50 μL 마이크로 리터가 첨가되었다. 상기의 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 배양한 다음 FLIPR Tetra(Molecular Devices)로 판독하였다.

완충액 C의 pH를 pH 5.0 또는 pH 5.5로 조정한 다음 상기 세포에 첨가하기 전에 저장 플레이트에 첨가하였다. 그 다음 FLIPR Tetra가 낮은 pH 완충액 50 μL를 저장 플레이트에서 분석 플레이트 내의 세포로 초당 50 μl의 속도로 첨가하였다. 완충액을 첨가 전 약 10초 동안 (사전 판독), 그리고 완충액을 첨가 후 약 100초 동안 각 웰(well)에 의해 생성된 칼슘 신호는 470-490 nm의 여기 파장(excitation wavelength)과 515-575 nm의 배출 파장(emission wavelength)을 사용하는 FLIPR Tetra에 의해 측정되었다. 완충액 첨가 후 얻은 최고 관찰 값과 사전 판독 및 완충액 첨가 후를 모두 포함하는 전체 분석 기간 동안의 최소 값 사이의 차이는 GraphPad Prism을 사용하여 계산되고 그래프가 그려졌다. 결과는 표4와 5에 나와있다.

표 4에서 보이는 바와 같이 24개의 항체 중 두 개인 H3M6271N 및 H1M6718N은 pH 5.5 및 pH 5.0의 단일 농도 250nM에서 칼슘 흐름의 30% 이상의 차단능을 보였고 한 항체(H3M6760N)는 단지 PH 5.5에서만 30% 이상의 차단능을 보였다. 250nM의 단일 농도에서 시험되었을 때 pH 5.5에서는 24 개의 항체들 중 12개가, 그리고 pH 5.0에서는 24개의 항체들 중 17개가 차단능이 측정 범위 미만인 것으로 나타났다 (음성). 250nM의 단일 농도에서 시험되었을 때 pH 5.5에서는 24개의 항체 중 9개가, 그리고 pH 5.0에서는 24개의 항체 중 5개가 10-30%의 범위에서 칼슘 흐름의 감소를 보였다(약한 반응).

표 5에서 보이는 바와 같이 pH 5.5에서 용량 의존적 차단능에 대해 시험된 10개의 항체 중 8 개는 27-78% 범위의 칼슘 흐름 차단율과 0.1nM 내지 6nM 범위의 IC₅₀ 값을 보였다. pH 5.5에서 용량 의존적 칼슘 흐름 차단능에 대해 시험된 항체들 중 두 개는(H4H6380P 및 H4H6381P) 측정 가능한 차단능을 보이지 않았다. pH 5.0에서 용량 의존적 차단능에 대해 시험된 10개의 항체 중 2개(H3M6721N 및 H1M6718N)는 칼슘 흐름에 대해 각각 25%와 48%의 차단능을 보였다. 그러나 IC₅₀ 값들은 용량 의존적임을 보임에도 불구하고 측정될 수 없었다 (IC*). pH 5.0에서 용량 의존적 차단능에 대해 시험된 10개의 항체 중 하나의 항체 H3M6760N은 칼슘 흐름에 대해 56%의 차단능과 1nM의 IC₅₀ 값을 보였다. pH 5.0에서 용량 의존적 칼슘 흐름 차단능에 대해 시험된 10개의 항체 중에 5개는 용량 의존적 차단능을 보이지 않았지만 시험된 각각의 항체 농도에서 칼슘 흐름의 10-25%르 차단했다. pH 5.0에서 용량 의존적 차단능에 대해 시험된 10개의 항체 중에서 2개의 항체 H4H6380P 및 H4H6381P는 측정 가능한 차단을 보이지 않았다.

실시 예 5. 자동화된 전압 클램프 패치 클램프 분석법에서 산-유도 ASIC1 이온 전류를 차단하는 항- ASIC1 항체

마이크로칩에 기반한 자동 패치 클램프 장치인 Q-Patch(Sophion Bioscience, Inc., Ballerup, Denmark)가 전장 사람 ASIC1 통로를 발현하는 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포주(HEK/hASIC1; NCBI 접근 번호 NP_001086.2의 아미노산 1-528)에서 사람 ASIC1의 전류, 또는 전장 쥐 ASIC1a 통로를 발현하는 안정적으로 형질감염된 3T3 세포주(3T3/mASIC1a; NCBI 접근 번호 NP_033727의 아미노산 1-526)에서 생쥐 ASIC1a의 전류를 억제하는 항-ASIC1 항체의 능력을 측정하기 위해 사용되었다.

HEK/hASIC1 세포들을 DMEM 고 글루코스 배지, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 비-필수 아미노산 및 500 μg/mL Geneticin® (Invitrogen, # 10131)에서 배양하였다. 3T3/mASIC1a 세포들을 DMEM 고 글루코스 배지, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민(Invitrogen, #10378-016), 그리고 400ug/mL Geneticin®에서 배양하였다. 기록하는 날에 Detachin 세포 분리 용액(Genlantis, San Diego, CA, # T100100)으로 세포를 수확하여 원심분리한 다음, 1.4mL의 무혈청 용액(serum free solution)[CHO-SFM-II 배지 (Invitrogen, # 31033), HEPES 25 mM 및 페니실린/스트렙토마이신 100 units/mL]에서 재부유 시켰다. 그 다음 세포 현탁액을 실온(RT)에서 40분 동안 쉐이커에서 배양하였다. 둘 또는 셋의 항-ASIC1 항체들과 하나의 대조 항체가 하나의 실험에서 병렬로 시험되었다. 따라서, 배양이 끝났을 때 세포 현탁액을 4개의 튜브로 분배하였고(300 μL/튜브에서 대략 5x10⁵ 세포), 항체들은 단일점 실험용 튜브에서 100nM의 최종 농도로, 또는 용량 반응 실험용 농도의 범위에서 희석한 다음 실온에서 약 20분 동안 쉐이커에서 배양하였다. 배양이 끝났을 때 세포들을 Q-Patch에 장착하였다.

먼저 세포들을 0.2%(w/v)의 소 혈청 알부민(세포외 완충액)이 포함된 pH 7.4의 완충액(NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, 글루코스 5 mM 및 HEPES 10 mM)으로 관류하였다. 그리고 단일점 실험용의 최종 농도 100nM, 또는 용량 반응 실험용의 농도 범위의 관심 항체를 첨가하여 약 3분 동안 배양되도록 하였다. 그 다음 pH 6.0으로 조정된 세포외 완충액을 첨가하여 사람 ASIC1 전류를 1초 동안 유도하는 한편, 세포들은 유지 전위(holding potential) -80mV로 유지시켰다. 세포들이 이 분석법이 사용되는 동안 반응성이 있는지를 입증하기 위해 Q-Patch에서 매번 기록을 한 후 30 μM의 아밀로라이드가 첨가되었다. 세포내 기록 용액의 조성물은 CsCl 140 mM, MgCl₂ 4 mM, EGTA 10 mM 및 HEPES 10 mM 였고 CsOH를 사용하여 산도를 pH 7.3으로 조정하였다.

모든 항-ASIC1 항체들은 대조 무관 항체와 병렬로 4회 반복 시험되었다. 통로 차단능은 대조 무관 항체가 있을 때의 전류 흐름에 비해 항-ASIC1 항체가 있을 때의 전류 흐름의 억제능 백분율을 여러 번의 차단 실험에서 평균을 구하여 측정하였다. 결과들은 표 6에 요약되어 있다.

표 6에서 보이는 바와 같이, Q-Patch에서 100nM에서 시험된 23개의 항체 중 17개는 사람 ASIC1 전류의 억제능을 보였으며 상기의 17개 중에서 9개는 70% 이상의 차단능을 보여주었다. 11개의 항체들(H1M6718N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6726N, H4H6366P, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M7118N, H4H6718N, H4H6721N2)이 Q-Patch에서 서로 다른 농도에서 사람 ASIC1 전류의 억제능에 대해 자세히 시험되었고, 9개의 항체들(H4H6718N, H3M6720N, H3M6721N, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P, H3M7118N)이 생쥐 ASIC1 전류의 억제능에 대해 시험되었다. 이러한 항체들에 대해 관찰된 차단능의 백분율이 표7(사람 ASIC1)과 표8(생쥐 ASIC1)에 요약되어 있다.

표 7에서 보이는 바와 같이 하나의 항체 H3M6726N은 IC₅₀이 명백히 10nM 이상으로 나타나 사람 ASIC1전류를 차단하였고, 반면 6개의 항체(H3M6720N, H3M6721N, H4H6366P, H3M7102N, H2bM7103N, H3M7118N)는 IC₅₀이 명백히 10 nM 미만으로 나타나 사람 ASIC1 전류를 차단하였다. 항체들 중 4개 즉, H1M6718N, H1M7101N, H4H6718N, 그리고 H4H6721N2 는 IC₅₀이 명백히 1nM 미만으로 나타나 사람 ASIC1 전류를 차단하였다.

표8에서 보이는 바와 같이, 생쥐 ASIC1를 발현하는 세포에서 시험된 10개의 항-ASIC1 항체 중의 6개(H4H6718N, H3M6721N, H4H6721N2, H1M7101N, H3M7102N 및 H3M7118N)는 시험된 최고 항체 농도에서 생쥐 ASIC1 전류의 90 내지 100%를 억제한 반면, 4개의 항체(H3M6720N, H3M6726N, H4H6366P 및 H2bM7103N)는 대략 80% 이하로만 전류를 억제했다. H3M7118N, H2bM7103N, H3M6720N 및 H3M6721N는 IC₅₀가 명백히 25nM 이하로 나타나 생쥐의 ASIC1 전류를 차단하였다. H4H6718N는 IC₅₀가 명백히 1nM이하로 나타나 사람 ASIC1 전류를 차단하였다.

또한 Q-Patch를 사용하여 생쥐의 신경모세포종과 내생적으로 생쥐 ASIC1을 발현하는 래트 배근 신경절의 융합 세포주인 ND7/23 세포주(ECACC, # 92090903) 에서 항-ASIC1 항체 H4H6718N의 ASIC1 전류 억제력을 측정하였다.

ND7/23 세포는 10% FBS, 2Mm 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, # 10378-016)이 함유된 DMEM 고 글루코스 배지에서 배양하였다. 모종(seeding) 다음 날, ND7/23 세포들은 상기 배양 배지를 1mM 디부티릴-cAMP가 들어있는 저혈청 배지(0.5% FBS)를 가진 배양 배지로 대체함으로써 분화시겼다. 기록 당일에 StemPro Accutase세포 분리 시약(Invitrogen, # A11105-01)을 사용하여 세포를 수확하여 원심분리한 다음, 1mL의 세포외 완충액 재부유 시켰다. 그 다음 상기 세포 현탁액을 Q-Patch 에 장착하였다.

먼저 세포들을 0.2% (w/v) 소 혈청 알부민을 포함하는 pH 7.4의 세포외 완충액(NaOH를 사용하여 pH 7.4로 재조정된 NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, glucose 5 mM 및 HEPES 10 mM)으로 6분 동안 관류시켜 상기 패치를 안정화시켰다. 그 다음 pH 6.0으로 조정된 세포외 완충액을 첨가하여 래트 ASIC1 전류를 1초 동안 유도하는 한편, 상기 세포들을 유지 전위 -80 mV로 유지시켰다. 상기의 래트 ASIC1 전류를 pH 6의 세포외 완충액에서 2회 유도한 다음, 10 nM의 아이소타입 대조 항체 또는 10 nM의 항-ASIC1 항체(H4H6718N, H3M6720N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P 및 H3M7118N)를 포함하는 동일한 세포외 완충액에서 추가적으로 2회 더 유도하였다. 항-ASIC1 항체 기록 후 10 nM의 선택적 ASIC1 길항제 PcTx1(Alomone Labs, # STP-200)를 상기 세포에 첨가하여 pH 6의 세포외 완충액에 의해 유도된 전류에 대한 ASIC1 특이 전류의 기여도를 평가하였다. 세포내 기록 용액의 조성물은 CsF 120 mM, NaCl 15 mM, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM 였으며 CsOH를 사용하여 pH 7.3으로 조정되었다.

통로 차단능이 항-ASIC1 항체의 적용 전에 측정된 전류 흐름 대비 상기 항체가 있을 때의 전류 흐름의 억제율(%)로서 측정되었고, PcTx1가 존재할 때의 전류 흐름의 억제율(%)과 비교되었으며, 이것은 최대 ASIC1 특이 전류 차단능을 정의하는 데 사용되었다. 결과값은 표9에 나와있다.

표 9에서 보이는 바와 같이 H4H6718N은 10nM의 농도(n= 9)의 분화 ND7/23 세포에서 래트 ASIC1 전류의 100% 차단을 보인 반면, H3M6720N 및 H3M7118N은 각각 대략 43% 및 65%로 전류를 억제하였다. 이 실험들에서 3개의 항체(H2bM7103N, H3M6726N 및 H4H6366P)는 10 nM의 농도에서 래트 ASIC1 전류를 유의하게 억제하지 못한 것으로 나타났다.

실시 예 6. 항- ASIC1 항체는 자동화된 전압 클램프 패치 클램프 분석법[ Port -A- Patch ]에서 산 유도 ASIC1 이온 전류를 차단한다

마이크로칩에 기반한 자동 패치 클램프 장치인 Port-a-Patch(Nanion Technologies Inc., North Brunswick, NJ)를 사용하여 전장 사람 ASIC1 통로(HEK/hASIC1; NCBI 접근 번호 NP_001086.2의 아미노산 1-528)를 발현하는, 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포주에서 사람 ASIC1 전류를 억제하는 데 필요한 항-ASIC1 항체 H1M6718N의 반수 최대(half maximal) 억제 농도(IC₅₀)를 측정하였다.

HEK/hASIC1 세포들을 DMEM 고 글루코스 배지, 10% 소 태아 혈청, 1% 비-필수 아미노산 및 500 μg/mL Geneticin®(Invitrogen, # 10131)에서 배양하였다. 기록 당일, Detachin 세포 분리 용액(Genlantis, San Diego, CA, #T100100)으로 세포들을 수확하여 원심분리한 다음, 500 uL의 세포외 완충액(NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, glucose 5 mM 및 HEPES 10 mM; NaOH로 pH 7.4로 조정)에서 재부유 시켰다. 그 다음 상기의 세포 현탁액을 Port-a-Patch에 장착하였다.

먼저 세포들을 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민을 포함하는 pH 7.4의 세포외 완충액에서 약 5분간 관류시켜 상기 패치를 안정화시켰다. 그 다음 pH 6.0으로 조정된 세포외 완충액을 첨가하여 사람 ASIC1 전류를 3초 동안 유도하는 한편, 세포들은 유지 전위 -80 mV로 유지시켰다. 상기의 사람 ASIC1 전류를 pH 6의 세포외 완충액에서 3회(2분 간격으로) 유도한 다음 100 nM의 아이소타입 대조 항체 또는 10, 3, 1, 0.8 또는 0.6 nM의 항-ASIC1 항체 H1M6718N을 포함하는 pH 6의 세포외 완충액에서 3회 유도하였다. 상기 세포들이 이 분석법이 사용되는 동안 반응성이 있는지를 보이기 위해 pH-자극 측정을 완료한 후 pH 6의 세포외 완충액에 있는 아밀로라이드 30 μM가 첨가하였다. 세포내 기록 용액의 조성물은 CsF 120 mM, NaCl₂ 15 mM, EGTA 10 mM 및 HEPES 10 mM였고 CsOH를 사용하여 산도를 pH 7.3으로 조정하였다.

통로 차단능이 항-ASIC1 항체의 적용 전에 측정된 전류 흐름 대비 상기 항체가 있을 때의 전류 흐름의 억제율(%)로서 측정되었다. 이것은 다수의 차단 실험에서 얻은 평균값이었다.

H1M6718N의 농도 10, 3, 1, 0.8 그리고 0.6 nM에 의한 사람 ASIC1 전류의 차단 백분율이 표 10에 요약되어 있다.

H1M6718N은 IC₅₀ 값이 860 pM로 계산되어 사람 ASIC1 전류의 용량 의존적 억제능을 보인 반면, 아이소타입 대조 항체는 100 nM의 농도에서 전류의 억제능을 보이지 않았다.

실시 예 7. 항- ASIC1 항체는 생쥐 모델에서 내장 통증 반응들을 감소시킨다

이 실시 예에서는 아세틱 산에 의해 유도되는 복부 수축 모델에서 내장 통증을 완화시키는 항-ASIC1 항체 H1M6718N의 능력이 평가되었다. Jackson Laboratory의 야생형 C57BL/6 생쥐(Bar Harbor, ME)가 이 실험에서 사용되었다. 별도의 생쥐 코호트(n=10)는 10mg/kg의 아이소타입 대조 mAb (s.c.), 또는 1 또는 10 mg/kg의 H1M6718N (s.c.)을 투여 받았다. 항체를 투여 24시간 후 모든 코호트들은 0.6%의 아세트산을 복강 내 주사로 투여 받았으며 이로 인해 모두 하나같이 복강 스트레칭 행동(수축)을 유발하였는데, 이러한 양상들은 주사 후 약 30분간 눈가림 관찰자에 의해 계수되었다. 이 실험의 결과들은 복강 수축의 총 횟수에서의 퍼센트 변화로 표시되었는데 이들은 표11에 나와 있다(모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되어 있다).

이 실험은 산 유도 ASIC1 이온 전류의 차단능이 있는 것으로 나타난 항-ASIC1 항체(H1M6718N)(실시 예 4 - 6 참고)가 생쥐 모델에서 산에 의해 유도된 내장 통증 반응을 완화시키는데 효과가 있었다는 것을 보여준다. .

실시 예 8. 항- ASIC1 항체는 생쥐 모델에서 독성 기계적 자극에 대해 통각 상실을 일으킨다

이 실시 예에서 유해한 핀치/압박(noxious pinch/pressure) 자극에 대한 항-ASIC1 항체(H1M6718N)의 통각 상실 유발 능력이 평가되었다.

Jackson Laboratory의 야생형 C57BL/6 생쥐(Bar Harbor, ME)가 이 실험에서 사용되었다. 별도의 생쥐 코호트들은 1, 10 또는 40 mg/kg의 H1M6718N (s.c.), 또는 10mg/kg의 아이소타입 대조 항체(s.c)를 투여 받았다. 항체 투여 24시간 후, 별도의 코호트들(n=10)은 이들의 기계적 통각 역치에 대해 시험되었고, 이러한 역치는 비복근 또는 꼬리의 핀치에 대한 움츠림 역치로 측정되었다 (Model #2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). 꼬리에서의 기계적 통각은 1 mg/kg 및 10 mg/kg의 H1M6718N으로 처리된 생쥐에서뿐만 아니라 아이소타입 대조 항체로 처리된 생쥐들에서도 측정되었다. 비복근에서의 기계적 통각은 10 mg/kg 및 40 mg/kg의 H1M6718N으로 처리된 생쥐에서뿐만 아니라 아이소타입 대조 항체로 처리된 생쥐들에서도 측정되었다. 이들 실험의 결과는 자극(pinch)에 대한 움츠림 역치를 그램으로 표시하였으며(각각의 생쥐 코호트에 대해 평균 ± SEM), 도 1의 패널 A 및 B에 나타나 있다.

두 실험 모두에서 H1M6718N으로 처리한 결과, ANOVA(꼬리의 경우 p=0.0015, 그리고 비복근의 경우0.0228) 및 Bonferonni 사후 검정(* = p<0.05)으로 측정하였을 때, 아이소타입 대조군에 비해 시험된 최고 항체 농도(꼬리 실험에서10 mg/kg [도 1의 패널 A], 그리고 비복근 실험에서40 mg/kg [도 1의 패널 B])군에서 움츠림 역치가 유의하게 증가한 것으로 나타났다.

실시 예 9. 항- ASIC1 항체는 쥐 모델에서 근육 통증을 완화시킨다

이 실시 예에서는 산성 염분(pH 5.5) 또는 3%의 카라기난의 주사를 통해 항-ASIC1 항체 H1M6718 및 H4H6721N2가 달성하는 근육 통증 완화 능력이 평가되었다. Jackson Laboratory의 야생형 C57BL/6 생쥐(Bar Harbor, ME)가 이들 실험에서 사용되었다.

첫 번째 실험에서 별도의 생쥐 코호트들은 10 mg/kg의 아이소타입 대조 항체(s.c) 또는 10 mg/kg의 H1M6718N(s.c.)을 투여 받았다. 항체 투여 24 시간 후, 모든 생쥐들은 비복근 내에 산성 식염수(pH 5.5)를 근내 주사로 투여 받았으며, 이로 인해 근육의 핀치에 대한 움츠림 역치로 측정하였을 때 몇 일간의 강력한 일차적 기계적 통각과민이 발생하였다 (Model #2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). 결과값은 도 2에 나와있다.

두 번째 실험에서 별도의 생쥐 코호트들이 10 mg/kg의 아이소타입 대조 mAb(s.c.), 또는 10 또는 40 mg/kg의 H1M6718N (s.c.), 또는 10 또는 30 mg/kg의 H4H6721N2(s.c.)를 투여 받았다. 항체 투여 24 시간 후, 모든 생쥐들은 비복근 내에 3% 카라기닌(w/v)을 근내 주사로 투여 받았으며, 이로 인해 근육의 핀치에 대한 움츠림 역치로 측정하였을 때 몇 일간의 강력한 일차적 기계적 통각과민이 발생하였다 (Model #2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). 결과값들은 도 3A (10 및 40 mg/kg H1M6718N) 및 3B (10 및 30 mg/kg H4H6721N2)에 나와 있다.

이 실험들의 결과들은 도 2 및 3에서 보이는 바와 같이 기본값으로부터 움츠림 역치의 퍼센트 변화율로 표시되어 있다 (모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다). 두 실험 모두에서 H1M6718N 처리의 유의한 주요 효과는 반복된 ANOVA 측정에 의해 관찰되었다(산성 식염수의 경우 p=0.0363, 그리고 카라기난의 경우 0.0193) 두 번째 실험의 경우 H1M6721N2 처리의 유의한 주요 효과는 반복된 ANOVA 측정에 의해 관찰 되었다(p=0.0018). 주어진 시점에 대한 Bonferonni 사후 검증의 결과 * = p<0.05 그리고 ** = p <0.01이다. 따라서 두 항체는 모두 본 실시 예에서 사용된 실험 시스템에서 근육통을 완화하는데 실질적인 효능을 보인다.

실시 예 10. 화학 요법으로 인한 신경병증 유사 통증 모델에서 항- ASIC1 항체의 효능

이 실시 예에서는 항암 화학치료제 택솔의 전신 노출로 인한 신경병증 유사 통증을 완화시키는 항-ASIC1 항체 H4M6718N의 능력이 평가되었다. Jackson Laboratory의 야생형 C57BL/6 수컷 생쥐(Bar Harbor, ME)가 이들 실험에서 사용되었다. 기본적 행동 양식 시험 후 모든 생쥐가 치료적 용량 접종 개시 전에 택솔(이틀에 한 번 4mg/kg 씩 총 4회 용량)을 투여 받았다. 별도의 생쥐 코호트들은 30 mg/kg의 아이소타입 대조 mAb (s.c.), 30 mg/kg의 H1M6718N (s.c.), 또는 100 mg/kg의 가바펜틴(s.c.)을 투여 받았다. 상기의 항체는 매주마다 시행되는 행동기능검사 24시간 전에 투여되었고 가바펜틴은 행동기능검사 2시간 전에 투여되었다. 촉각성 이질통을 Dixon의 업-다운 방법(up-down method)에 따라 von Frey fiber(#58011, Stoelting Co., Wood Dale, IL)를 사용하여 모든 코호트에서 측정하였다 (Chaplan et al., J Neurosci Methods. 53(1):55-63). 이 실험의 결과들은 도 4에 나와있다 (모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다).

도 4에서 설명되었듯이, H1M6718N 처리군과 가바펜틴 처리군 모두에서의 유의한 주요 효과는 반복된 ANOVA 측정(H4H6718N의 경우 p=0.0003; 가바펜틴의 경우 p<0.00001)에 의한 아이소타입 대조 코호트와 비교해 관찰되었다. 따라서 본 실시 예는 본 발명의 항-ASIC1 항체들은 항암화학요법으로 인한 통증 반응들을 완화시키는데 매우 효과적이라는 것을 제시한다.

전체적으로 보아 상기 실시 예들의 결과들은 다양한 종류의 통증 상태를 치료하기 위해 항-ASIC1 차단 항체의 사용을 뒷받침한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 구현의 예에 의하여 범위가 한정되지 않는다. 실로, 본 명세서에 기술된 실시 예들 외에 본 발명의 다양한 실시 예들은 상기의 설명 및 부수 도면으로부터 당 업계의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 실시 예는 부속 청구항의 범위 내에 속하게 된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-ASIC1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 7250A-WO <150> US 61/592,837 <151> 2012-01-31 <150> US 61/644,038 <151> 2012-05-08 <150> US 61/692,925 <151> 2012-08-24 <160> 401 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc aatgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc atttatgata tcaactgggt gcgccaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atgaacccta ggagtggtag cacaggctat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataaa cacagccttc 240 atggaactga gtagcctcag gtctgatgac acggccgtgt attactgtgt gagagggcaa 300 ctcgtcctgg gctactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val 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ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc atttatgata tcaactgggt gcgccaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atgaacccta ggagtggtag cacaggctat 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataaa cacagccttc 240 atggagctga gtagcctcag atctgaggac acggccgtct attactgtgt gagagggcaa 300 ctcgtcctgg gctactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348 <210> 18 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Arg Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gln Leu Val Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 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gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc cgcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggcg gtttattact gtcagcaata tttttctact 300 ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 26 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Val Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Thr Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 cagagtgttg tatacagttc caacactaag aactac 36 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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<220> <223> Synthetic <400> 385 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caagtacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgaagacacg gccgtgtatt actgtgggag acaaagtggg 300 agctactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 386 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 386 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Arg Gln Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 387 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 387 ggtggctcca tcagtagtta ctac 24 <210> 388 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 388 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 389 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 389 atctattaca gtgggagcac c 21 <210> 390 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 390 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 391 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 391 gggagacaaa gtgggagcta ctactactac ggtatggacg tc 42 <210> 392 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 392 Gly Arg Gln Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 393 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 393 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca aagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 394 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 394 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 395 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 395 caaagcatta gcagctat 18 <210> 396 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 396 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 397 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 397 gctgcatcc 9 <210> 398 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 398 Ala Ala Ser 1 <210> 399 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 399 caacagagtt acagtacccc gtacact 27 <210> 400 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 400 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 401 <211> 528 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 401 Met Glu Leu Lys Ala Glu Glu Glu Glu Val Gly Gly Val Gln Pro Val 1 5 10 15 Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu His Gly Leu Ala His 20 25 30 Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser Leu Lys Arg Ala Leu Trp Ala Leu 35 40 45 Cys Phe Leu Gly Ser Leu Ala Val Leu Leu Cys Val Cys Thr Glu Arg 50 55 60 Val Gln Tyr Tyr Phe His Tyr His His Val Thr Lys Leu Asp Glu Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu Asn 85 90 95 Glu Phe Arg Phe Ser Gln Val Ser Lys Asn Asp Leu Tyr His Ala Gly 100 105 110 Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Asn Arg Tyr Glu Ile Pro Asp Thr Gln 115 120 125 Met Ala Asp Glu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Gln Asp Lys Ala Asn Phe 130 135 140 Arg Ser Phe Lys Pro Lys Pro Phe Asn Met Arg Glu Phe Tyr Asp Arg 145 150 155 160 Ala Gly His Asp Ile Arg Asp Met Leu Leu Ser Cys His Phe Arg Gly 165 170 175 Glu Val Cys Ser Ala Glu Asp Phe Lys Val Val Phe Thr Arg Tyr Gly 180 185 190 Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Arg Asp Gly Arg Pro Arg Leu Lys 195 200 205 Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp Ile 210 215 220 Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp Glu Pro Pro 245 250 255 Phe Ile Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr Phe 260 265 270 Val Ala Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Pro Pro Trp Gly 275 280 285 Thr Cys Lys Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Leu Asp Phe Phe Asp Ser 290 295 300 Tyr Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val 305 310 315 320 Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Tyr 325 330 335 Cys Thr Pro Glu Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe 340 345 350 Leu Val Glu Lys Asp Gln Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro Cys Asn 355 360 365 Leu Thr Arg Tyr Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys 370 375 380 Ala Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gln Tyr 385 390 395 400 Ile Gly Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val Leu Asn 405 410 415 Tyr Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly Leu Leu 420 425 430 Gly Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu 435 440 445 Thr Val Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ile Lys His Lys 450 455 460 Leu Cys Arg Arg Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser Ser Ala 465 470 475 480 Asp Lys Gly Val Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His Asn Pro 485 490 495 Cys Glu Ser Leu Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala Ala Asn 500 505 510 Ile Leu Pro His His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe Thr Cys 515 520 525 1

Claims

세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)에 특이적으로 결합하는 격리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기의 항체나 이의 항원 결합 단편이 세포 표면에 발현된ASIC1과 특이적으로 결합하면서 형광활성 세포 분류법(FACS)을 사용하여 측정하였을 때 EC₅₀가1 nM 이하인, 항체나 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 항체나 이의 항원 결합 단편이 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 산 유도 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는, 항체나 항원 결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체나 이의 항원 결합 단편이 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 pH가 약 5.0 내지 약 6.0일 때 산 유도 세포 칼슘 흐름을 억제하면서 FLIPR 분석법을 사용하여 측정하였을 때 IC₅₀가 6 nM 이하인, 항체나 항원 결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체나 이의 항원 결합 단편이 pH가 약 5.0 내지 6.0일 때 산 유도 이온 전류를 억제하면서 패치 클램프 분석법을 사용하여 측정하였을 때 IC₅₀가 10 nM 이하인, 항체나 항원 결합 단편.
세포 표면에 발현된 ASIC1과 결합하기 위해 SEQ ID NO: 2/10; 34/42; 50/58; 66/74; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 194/202; 210/218; 242/250; 258/266; 274/282로 이루어진 그룹에서 선택된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 쌍으로 구성되는 기준 항체와 경쟁하는 격리된 항체나 이의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, 상기의 항체나 이의 항원 결합 단편이 사람 ASIC1을 발현하는 세포에서 산 유도 ASIC1 매개 이온 전류를 억제하는, 항체나 항원 결합 단편.
세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)과 특이적으로 결합하는 격리된 항체나 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체나 항원 결합 단편이 (a) SEQ ID NO: 2, 34, 50, 66, 114, 130, 146, 162, 194, 210, 242, 258, 274로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)과, (b) SEQ ID NO: 10, 42, 58, 74, 122, 138, 154, 170, 202, 218, 250, 266, 282로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역으로 구성된, 세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)과 특이적으로 결합하는 격리된 항체나 이의 항원 결합 단편.
제8항에 있어서, 상기 항체나 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 2/10; 34/42; 50/58; 66/74; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 194/202; 210/218; 242/250; 258/266; 274/282로 이루어진 그룹에서 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성된, 격리된 항체나 항원 결합 단편.
제8항에 있어서, 상기의 항체나 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288로 이루어진 그룹에서 각각 선택된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인으로 구성된, 격리된 항체나 항원 결합 단편.
세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)과 특이적으로 결합하는 격리된 항체나 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체나 항원 결합 단편이 (a) SEQ ID NO: 2, 34, 50, 66, 114, 130, 146, 162, 194, 210, 242, 258, 274로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)과 (b) SEQ ID NO: 10, 42, 58, 74, 122, 138, 154, 170, 202, 218, 250, 266, 282로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)으로 구성된, 세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)과 특이적으로 결합하는 격리된 항체나 이의 항원 결합 단편.
제11항에 있어서, 상기 항체나 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 2/10; 34/42; 50/58; 66/74; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 194/202; 210/218; 242/250; 258/266; 274/282로 이루어진 그룹에서 선택된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍으로 구성된, 격리된 항체나 항원 결합 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체나 항원 결합 단편으로 구성된, 약학적 조성물과 약학적으로 유효한 담체 또는 희석제.
환자의 통증 치료나 완화에 사용되는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체나 항원 결합 단편으로 구성된 약학적 조성물.
제14항에 있어서, 침해성 통증이나 내장통을 위한, 약학적 조성물.
제15항에 있어서, 염증, 수술 후 절개, 신경병증, 골절, 화상, 골다공증성 골절, 골암, 통풍, 편두통 및 섬유근통 증세와 연관된 통증을 위한, 약학적 조성물.
제14항에 있어서, 암 관련 통증이나 항암 화학요법으로 인한 통증을 위한, 약학적 조성물.
투약을 필요로 하는 환자에게 세포 표면에 발현된 ASIC1(SEQ ID NO:401)과 특이적으로 결합하는 항체나 이의 항원 결합 단편을 투여하는 방법으로 이루어진 통증 치료 또는 완화법.
제18항에 있어서, 상기 항체나 이의 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 2/10; 34/42; 50/58; 66/74; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 194/202; 210/218; 242/250; 258/266; 274/282로 이루어진 그룹에서 선택된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성된, 방법.
제19항에 있어서, 상기 항체나 이의 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288로 이루어진 그룹에서 각각 선택된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인으로 구성된, 방법.