CN105233286B - 含酸敏感离子通道调控剂的制剂及其在治疗瘙痒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含酸敏感离子通道调控剂的制剂及其用途。具体地，本发明提供酸敏感离子通道调控剂在用于制备治疗或缓解瘙痒的制剂中的用途，以及含有酸敏感离子通道调控剂作为有效成分的制剂。本发明的实验表明，酸敏感离子通道调控剂可以显著地降低动物模型中的痒觉反应，缓解瘙痒。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体的涉及含酸敏感离子通道调控剂的治疗瘙痒的制剂及其用途。
背景技术
瘙痒，又称痒，被定义为一种能够诱发抓挠冲动的一种不愉快感受。痒觉的研究揭示了组胺依赖和不依赖的两类致痒机制。
作为理解最为透彻的致痒剂，组胺主要从免疫细胞和皮肤细胞释放出来，作用于一类同时表达组胺受体和辣椒素受体TRPV1通道蛋白的感觉神经元上，从而引起痒觉反应。然而，许多形式的痒觉对于抗组胺的治疗并不敏感。
非组胺依赖的痒觉在过去的数十年中被深入研究。比如，近年来，一类称之为Mas相关G蛋白偶联受体(Mas-related G protein-coupled receptor,Mrgpr)超家族被鉴定为一种新型组胺非依赖痒觉受体。Mrgpr受体特异性地表达在感觉神经元上，能够被一大类内源和外源的致痒剂所激活。比如，MrgprA3是抗寄生虫药物氯喹的受体，MrgprD则主要介导了β-丙氨酸引起的痒觉、刺痛、麻刺感和烧灼感。MrgprC11是内源性致痒多肽BAM8-22(bovine adrenal medulla 8-22peptide)的受体，这种多肽是脑啡肽原A(proenkephalinA)的蛋白水解产物。MrgprC11也介导了多肽SL-NH2引起的痒觉。显著的是，丝氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸序列是蛋白酶激活受体2(Proteinase-activated receptor 2,PAR2)上的内源性序列，在丝氨酸蛋白酶存在条件下被暴露出来，从而进一步激活PAR2受体。类似地，合成的SL-NH2多肽在蛋白酶不存在的条件下也能够激活PAR2受体，但是PAR2的激活过程并不直接产生痒觉。总之，Mrgprs构成了初级感觉神经元上一大类痒觉受体家族，不同的成员负责不同致痒剂引起的痒觉感受。尽管如此，各种各样生理和病理条件下痒觉感受的调节和机制大多还没有被深入研究。
目前，临床上对瘙痒，尤其是组胺不依赖型瘙痒尚缺乏有效的治疗手段，因此，本领域迫切需要开发有效治疗或缓解瘙痒(尤其是组胺不依赖型瘙痒)的方法和制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效治疗或缓解瘙痒的(尤其是组胺不依赖型瘙痒)的方法和制剂。
本发明的第一方面，提供了一种酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)调控剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进或缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的调控剂包括酸敏感离子通道的促进剂、或抑制剂。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道包括，ASIC1a，和/或ASIC3通道。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、ASIC3通道抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂为ASIC1a通道特异性促进剂。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道抑制剂选自下组：ASIC3通道抑制剂。
在另一优选例中，所述的调控剂为ASIC1a通道促进剂，并且所述制剂或组合物用于缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂选自下组：
(i)精胺、MitTx-α/β、或其组合；
(ii)促进ASIC1a通道相关蛋白的表达和/或活性的促进剂；
(iii)上述(i)和(ii)的任意组合。
在另一优选例中，所述的调控剂为ASIC3通道抑制剂，并且所述制剂或组合物用于缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的ASIC3通道抑制剂选自下组：
(i)阿米洛利、脒A-317567、萘莫司他(nafamostat mesilate)、非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、多肽APETx2、或其组合；
(ii)特异性抑制酸敏感离子通道相关蛋白的表达和/或活性的拮抗剂；
(iii)上述(i)和(ii)的任意组合。
在另一优选例中，所述的拮抗剂包括MicroRNA、siRNA、shRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的拮抗剂包括抗体。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道抑制剂还包含碱性中和剂。
在另一优选例中，所述的碱性中和剂选自下组：碱金属盐、碱土金属盐、或 其组合。
在另一优选例中，所述的碱性中和剂选自下组：碳酸氢钠、氯化铵、氢氧化铝、胃舒平、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、或食品组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物包含(a)酸敏感离子通道调控剂；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述食品组合物包含(a)酸敏感离子通道调控剂；和(b)食品学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
在另一优选例中，所述的外用药物剂型选自下组：溶液、乳剂、膏剂、洗剂、粉剂、糊剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的瘙痒由选自下组的因素所诱导：干皮症、炎症、损伤、感染、过敏、变态反应、或其组合。
在另一优选例中，所述的瘙痒包括急性痒、慢性痒、或系统性疾病引起的瘙痒。
在另一优选例中，所述的瘙痒包括抗组胺处理不敏感的瘙痒。
本发明的第二方面，提供了一种用于调控瘙痒的药物组合物，所述组合物包含活性成分(a)酸敏感离子通道调控剂；活性成分(b)碱性中和剂；和(c)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的调控瘙痒包括促进瘙痒、或缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、ASIC3通道抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂为ASIC1a通道特异性促进剂。
在另一优选例中，所述的碱性中和剂选自下组：碳酸氢钠、氯化铵、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:100至100:1，较佳地为1:20至20:1。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为组合物的 1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
本发明的第三方面，提供了一种用于调控瘙痒的药物组合物，所述组合物包含活性成分(a)酸敏感离子通道调控剂；活性成分(b)组胺抑制剂；和(c)药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种用于调控瘙痒的药盒，所述药盒含有第一药物组合物，所述组合物包含活性成分(a)酸敏感离子通道调控剂；和药学上可接受的载体；和
第二药物组合物，所述组合物包含活性成分(b)组胺抑制剂；和药学上可接受的载体，
其中所述第一药物组合物和第二药物组合物是独立的。
在另一优选例中，所述的调控瘙痒包括促进瘙痒、或缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的组胺抑制剂选自下组：非索非那丁、左旋西替利嗪、地氯雷他定、西替利嗪、氮卓斯丁、阿司米唑、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:100至100:1，较佳地为1:20至20:1。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
本发明的第四方面，提供了一种筛选缓解瘙痒的候选药物的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对酸敏感离子通道的影响，从而选出对所述酸敏感离子通道有调控作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及
(b)测试所述经初筛的化合物对瘙痒的缓解效果，从而选出对瘙痒具有缓解效果的化合物，作为候选药物。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的检测包括：在实验组中，在所述待测化合物存在下，培养细胞，并检测所述细胞中酸敏感离子通道相关蛋白的表达量、活性和/或ASIC样电流，并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，检测相同细胞中相同酸敏感离子通道相关蛋白的表达量、活性和/或ASIC样电流，并进行比较；如果实验组的检测值Vt显著高于或显著低于对照组的检测值Vc，则表明所述的待测化合物为对所述酸敏感离子通道有调控作用的待测化合物。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指Vt/Vc≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。
在另一优选例中，所述的“显著低于”指Vc/Vt≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。
在另一优选例中，所述的检测值Vt和Vc为ASIC样电流的电流密度。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道为ASIC1a通道、或ASIC3通道。
在另一优选例中，所述的“经初筛的化合物”为ASIC1a通道促进剂、或ASIC3通道抑制剂。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂为ASIC1a通道特异性促进剂。
在另一优选例中，所述的“酸敏感离子通道相关蛋白”包括与酸敏感离子通道直接或间接作用的蛋白，或者调控酸敏感离子通道活性的蛋白质。
在另一优选例中，所述的“酸敏感离子通道相关蛋白”选自下组：P2X受体、TRPV1、蛋白酶激活受体PAR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的细胞包括哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括神经细胞，尤其是背根神经节神经元。
在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括设置阳性对照组、和/或阴性对照组。
本发明的第五方面，提供了一种用于治疗或缓解瘙痒的方法，所述的方法包括步骤：
(i)给需要的哺乳动物施用酸敏感离子通道调控剂，其中调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、或ASIC3通道抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人。
在另一优选例中，所述阿米洛利的施用剂量为1-1000mg/次，较佳地5-100mg/次，更佳地10-50mg/次，最佳地50mg/次。
在另一优选例中，所述阿米洛利的施用频率为1-4次/天，较佳地2-3次/天。
在另一优选例中，所述阿米洛利的施用时间为2-14天，较佳地3-7天。
在本发明第六方面，提供了一种酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)调控剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于制造瘙痒的动物模型。
在另一优选例中，所述的调控剂包括酸敏感离子通道的促进剂、或抑制剂。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道包括，ASIC1a，和/或ASIC3通道。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、ASIC3通道抑制剂、或其组合，并且所述动物模型为瘙痒缓解型的动物模型。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道调控剂选自下组：ASIC1a通道抑制剂、ASIC3通道促进剂、或其组合，并且所述动物模型为瘙痒增强型的动物模型。
在另一优选例中，所述的制剂或组合物通过口服施用于所述的动物，
在另一优选例中，所述的动物包括非人哺乳动物，优选啮齿动物如大鼠、小鼠，和灵长动物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ASIC3对于颈背部皮肤干皮症模型导致的自发痒觉和表皮增生的贡献。其中图1A显示了小鼠颈背部干皮症的实验流程。图1B显示了小鼠颈背部皮肤区域的代表性图片。图1C显示了小鼠30分钟内的抓挠次数的量化统计结果。图1D显示了不同处理的野生型和ASIC3基因敲除小鼠的苏木精/伊红染色显微图像。图1E显示了不同处理皮肤样品表皮层厚度的量化统计结果。
图2显示了颈背部干皮症慢性痒模型中急性抑制酸敏感离子通道功能对于抓挠行为的影响。
图3显示了颈背部干皮症慢性痒模型对痒觉相关基因表达的影响以及ASIC3对调控这些基因表达的贡献。其中图3A显示了ASIC3的mRNA表达改变情况。图3B显示了TRPA1的mRNA表达改变情况。图3C显示了MrgprC1的mRNA表达改变情况。图3D显示了MrgprA 3的mRNA表达改变情况。
图4显示了ASIC3对于面颊部皮肤干皮症模型导致的自发痒觉和表皮增生的贡献。其中图4A显示了小鼠面颊部干皮症的实验流程。图4B显示了小鼠面颊部皮肤区域的代表性图片。图4C显示了小鼠30分钟测试时间内前爪的抓挠时间的量化统计。图4D显示了小鼠30分钟测试时间内用后爪的擦拭时间的量化统计。图4E显示了不同处理的野生型和ASIC3基因敲除小鼠苏木精/伊红染色的显微图像。图4F显示了不同处理皮肤样品表皮层厚度的量化统计结果。
图5显示了ASIC3参与酸增强SL-NH2痒觉的反应。其中图5A、5B、5C分别显示了注射不同致痒剂后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。图5D显示了注射不同致痒剂后第一个5分钟内的小鼠抓挠次数统计。图5E显示了注射不同致痒剂后30分钟内的小鼠抓挠次数统计。图5F显示了注射 BAM8-22后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。图5G显示了注射BAM8-22后第一个5分钟内的小鼠抓挠次数统计。图5H显示了注射BAM8-22后30分钟内的小鼠抓挠次数统计。
图6显示了增加酸性溶液的缓冲能力可以加剧酸化对SL-NH2痒觉的促进效应。其中图6A、6B分别显示了注射不同致痒剂后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。图6C显示了注射后的第一个5分钟内小鼠抓挠次数统计。图6D显示了注射后的30分钟内小鼠抓挠次数统计。
图7显示了对于酸增强SL-NH2痒觉和痛觉行为的鉴定。其中图7A显示了注射不同致痒剂后30分钟内小鼠用后爪抓挠注射部位的时间的量化统计。图7B显示了注射不同致痒剂后30分钟内小鼠用前爪擦拭注射部位的时间的量化统计。
图8显示了野生型和ASIC1a基因敲除小鼠中酸对于SL-NH2引起痒觉的影响。图8A、8B显示了注射不同致痒剂后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。图8C显示了注射后的第一个5分钟内小鼠抓挠次数统计。图8D显示了注射后的30分钟内小鼠抓挠次数统计。
各图中，“acid”或“Acid”表示酸，“Saline”表示生理盐水。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现酸敏感离子通道调控剂能够非常有效地治疗或缓解瘙痒。实验表明，通过调控酸敏感离子通道，可以显著地降低动物模型中的痒觉行为。在此基础上完成了本发明。
术语
瘙痒
如本文所用，“瘙痒”、“痒”、“痒觉”可互换使用，是一种能够诱发抓挠冲动的一种不愉快感受。痒觉包括组胺依赖和不依赖的两类致痒机制。Mas相关G蛋白偶联受体(Mas-related G protein-coupled receptor,Mrgpr)超家族是初级感觉神经元上的一大类组胺非依赖痒觉受体，不同的成员负责不同致痒剂引起的痒觉感受。
酸敏感离子通道
术语“酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)”或“ASIC”可互换使用，指一类广泛存在于细胞膜上的通透阳离子的蛋白复合体，属于上皮通道蜕变蛋白离子通道超家族，在感受体液pH值和调控痛觉、酸味觉等多项生理机能方面有着重要作用。炎症可诱导ASICs转录并产生转录后调节，从而影响神经元兴奋性，参与痛觉感受的敏感化过程。
组织酸化能够激活一类称之为酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)的膜受体，后者隶属于上皮钠通道/退化素(epithelial sodium channel/degenerin,ENaC/DEG)超家族成员。
分子克隆表明，ASIC有四条基因编码的至少六种亚基(ASIC1a，1b，2a，2b，3和4)，这些亚基形成同或异三聚体功能复合物。ASIC亚基表达和分布的不同以及亚基组成和通道门控的变化，使得通道的功能呈现出多样性。
ASIC1a在中枢和外周神经系统都有分布，主要参与突触传递和可塑性。ASIC1a的功能异常跟多种神经疾病如缺血性细胞死亡、癫痫、神经退行性疾病等。本发明所指的ASIC1a通道，是指主要由ASIC1a亚基组成的同聚体或异聚体，所述的异聚体不包含ASIC3亚基。
ASIC3在外周感觉神经元和非神经组织广泛表达，参与多重感知觉过程，包括伤害性感受，机械感受和化学感受。本发明所指的ASIC3通道，是指主要由ASIC3亚基组成的同聚体或异聚体。
本发明的研究揭示，酸敏感离子通道(尤其是ASIC1a和ASIC3)与瘙痒密切相关。
酸敏感离子通道调控剂
“酸敏感离子通道调控剂”指能够调控酸敏感离子通道的物质，所述调控剂可以是小分子化合物，也可以是大分子化合物。
在本发明中，所述的调控剂包括促进剂(或激动剂)、或抑制剂(或拮抗剂)。
代表性的酸敏感离子通道调控剂包括阿米洛利、碱性中和剂、脒A-317567、萘莫司他(nafamostat mesilate)、非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、多肽APETx2、多肽MitTx-α/β、精胺、干扰RNA、抗体等。
一种典型的ASIC3通道的抑制剂是阿米洛利。阿米洛利的分子式为C6H8ClN7O，结构式如下：
如本文所用，“阿米洛利”即Amiloride，包括阿米洛利或其药学上可接受的盐。一种常用的阿米洛利的药学上可接受的盐是盐酸阿米洛利。目前，阿米洛利已 知是一类强效保钾利尿药，留钾排钠不依赖于醛固酮，它作用于肾小管远端，阻断钠-钾交换机制，促使钠、氯排泄而减少钾、氢离子分泌，其本身促尿钠排泄和抗高血压活性较弱，具有较高安全性。
如本文所用，“碱性中和剂”指能够升高组织pH以阻断酸化过程的碱性物质，包括药学上可接受的碱或碱性盐。碱性中和剂可以是有机和无机化合物，代表性的例子包括(但并不限于)：如碳酸氢钠、氯化铵等。
如本文所用，脒，即amidine，以A-317567为例，包括(但并不限于)其药学上可接受的盐。A-317567的IPUAC名称是6-{2-[2-methyl-1-(propan-2-yl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yl]cyclopropyl}naphtha lene-2-carboximidamide，结构式如下：
如本文所用，萘莫司他，即nafamostat，包括萘莫司他或其药学上可接受的盐(包括但并不限于甲磺酸萘莫司他)。
如本文所用，非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)，包括但并不限于水杨酸(salicylic acid)、阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)等。
如本文所用，多肽APETx2，为提取自海葵(sea anemone Anthopleuraelegantissima)或人工合成的包含42个氨基酸残基的多肽。
如本文所用，多肽MitTx-α/β，为一种源自于Texas coral snake的毒素，能够直接激活ASIC1a通道。
如本文所用，内源性的多胺如精胺显著促进酸敏感离子通道ASIC1a对酸的敏感性。
RNA干扰(RNAi)
在本发明中，一类有效的酸敏感离子通道调控剂是干扰RNA。
如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指：一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。
如本文所用，术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。
在本发明中，干扰RNA包括siRNA、shRNA以及相应的构建物。
一种典型的构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为酸敏感通道中相关基因或片段的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq 反向不互补。
在本发明的一个优选例中，Seq正向、Seq反向的长度为19-30bp，较佳地为20-25bp。
在本发明中，一种典型的shRNA如式II所示，
式中，
Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，所述的间隔序列X的长度为3-30bp，较佳地为4-20bp。
其中，Seq正向序列所针对的靶基因包括(但并不限于)：Beclin-1、LC3B、ATG5、ATG12、或其组合。
调控瘙痒的制剂或药物组合物
本发明提供了含有活性成分(a)酸敏感离子通道调控剂；活性成分(b)碱性中和剂；以及(c)药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还提供了含有活性成分(a)酸敏感离子通道调控剂；活性成分(b)组胺抑制剂；以及(c)药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一优选例中，所述的调控瘙痒包括促进瘙痒、或缓解瘙痒。
在另一优选例中，所述的酸敏感离子通道调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、ASIC3通道抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂为ASIC1a通道特异性促进剂。
在另一优选例中，所述的碱性中和剂选自下组：碳酸氢钠、氯化铵、或其组 合。
在另一优选例中，所述的组胺抑制剂选自下组：非索非那丁、左旋西替利嗪、地氯雷他定、西替利嗪、氮卓斯丁、阿司米唑、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:100至100:1，较佳地为1:20至20:1，更佳地为1:5至5:1。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。一种优选的剂型是口服制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
治疗或缓解瘙痒的方法
本发明提供了一种用于治疗或缓解瘙痒的方法，所述的方法包括步骤：
(i)给需要的哺乳动物施用酸敏感离子通道调控剂，其中调控剂选自下组：ASIC1a通道促进剂、或ASIC3通道抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ASIC1a通道促进剂为ASIC1a通道特异性促进剂。
在另一优选例中，所述酸敏感离子通道调控剂(以阿米洛利为例)的施用剂量为1-1000mg/次，较佳地5-100mg/次，更佳地10-50mg/次，最佳地50mg/次。
在另一优选例中，所述酸敏感离子通道调控剂(以阿米洛利为例)的施用频率为1-4次/天，较佳地2-3次/天。
在另一优选例中，所述酸敏感离子通道调控剂(以阿米洛利为例)的施用时间为每个疗程2-14天，较佳地3-7天。
当本发明药物组合物被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
本发明的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药，涂抹给药。
此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗瘙痒的药物(如抗组胺药物)联用。
本发明的主要优点包括：
(a)酸敏感离子通道调控剂能够有效调控瘙痒，尤其是可用于治疗或缓解瘙痒，改善皮肤增生等病理症状。
(b)酸敏感离子通道调控剂可以和碱性中和剂协同作用，治疗或缓解瘙痒，改善皮肤增生等病理症状。
(c)酸敏感离子通道可能是皮肤和系统性疾病相关的瘙痒相关症状的理想治疗靶点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法和材料
1.动物和痒觉相关的行为范式
动物护理和实验步骤得到了上海交通大学医学院动物伦理委员会的批准。所有实施例中的行为学测定在清醒的、自由活动的C57BL/6J小鼠，ASIC3基因敲除及野生型同窝对照小鼠，ASIC1a基因敲除及野生型同窝对照小鼠(均为2–3个月龄，C57BL/6J遗传背景)上进行。尾背部的急性痒模型评价是通过分析抓挠次数实现的。所有实施例中的行为学实验是在对基因型或药物处理双盲的条件下开展和评价的。
2.电生理
电生理记录采用了电压钳条件下的传统全细胞和巨大膜片记录模式。
3.组织学
动物处死后，皮肤样本被立即取下并放置在4％的多聚甲醛里进行4℃过夜，随后在70％的乙醇里进行脱水处理，然后在最适切割温度化合物(Optimal CuttingTemperature Compound,Tissue-Tek)中包埋。随后进行切片，厚度为10μm，接下来进行苏木精和伊红染色。切片分别在奥林巴斯显微镜(IX71,Olympus)的10倍放大(数值孔径为0.3)和20倍放大(数值孔径为0.45)的镜头上进行成像。样本处理和成像是在对基因型或药物处理双盲的条件下开展和评价的。表皮层厚度是在20倍放大镜头上获得的图像上利用ImageJ软件进行测量的，每张切片随机挑选2–3个视野进行统计和分析。
4.试剂
如无特别说明，所有实施例中的药物都购自于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。SL-NH2及其类似物多肽由吉尔生化公司(上海)合成。
5.实时定量反转录PCR
第C1-T1阶段的背根神经节取出后，利用TRIzol试剂(Thermo FisherScientific,USA)提取总的RNA。共6μg的总RNA被用作模板进行反转录和扩增，这里采用了SuperScript III First-Stand Synthesis System(Thermo Fisher Scientific,USA)试剂盒并根据厂商说明进行操作的。
6.定点突变
质粒的定点突变按照常规条件进行操作。Quik-Change突变试剂盒(Stratagene)根据厂商说明进行操作。
7.数据分析
所有的结果是以平均值±标准误的形式进行表述的。统计学比较采用了非配对或配对的Student’s t检验或双向重复测量的方差分析方法。其中，P<0.05，P<0.01，和P<0.001被认为是有显著差异。电流脱敏的动力学是通过单指数拟合得到的，拟合公式为I＝I0+Ae-t/τ，其中τ是表征脱敏的时间常数。ASIC3的平台电流是定义为开始给酸以后10秒时的电流幅度。
实施例1ASIC3在痒觉转导中的作用
为了检查ASIC3在痒觉转导中的病理生理意义，我们采用了一种称之为干皮症的慢性瘙痒模型。选取野生型小鼠和ASIC3基因缺陷的同窝小鼠进行实验，每组10只小鼠，在小鼠的颈背部连续5天涂抹乙醚、丙酮和水(图1A,B)，对其自发抓挠行为进行量化统计。在第5天对小鼠痒觉行为评价结束后，取出处理过的皮肤区域进行后续的组织学分析。
结果如图1C所示，ASIC3基因缺陷型小鼠处理后的自发抓挠行为显著低于野生型小鼠。野生型小鼠在第五天处理后发展出严重的抓挠行为，而给予ASIC3基因缺陷的同窝小鼠相同处理后却表现出显著降低的自发抓挠行为(***P<0.001，###P<0.001，图1C)。上述结果表明，酸敏感离子通道的激活对于慢性干皮症条件下的痒觉转导是必需的。
此外，如图1D,E所示，丙酮、乙醚和水的联合处理相比水的单独处理增加了表皮层的厚度。这种表皮增生在ASIC3基因敲除小鼠上显著弱于野生型对照小鼠，提示ASIC3不仅贡献于干皮症的慢性痒症状，而且贡献于表皮的内稳态增生过程。
实施例2ASIC3通道抑制剂阿米洛利对自发抓挠行为的影响
如实施1所述方法建立慢性瘙痒模型，在测试前，往处理过的皮肤处皮下分别注射生理盐水、阿米洛利(200微摩尔/升，溶解在生理盐水)或碳酸氢钠(75微克/微升，溶解在生理盐水)(体积均为50微升)。动物数目为每组11–12只小鼠。
结果如图2所示，在丙酮、乙醚和水联合处理的小鼠皮下注射阿米洛利或碳酸氢钠显著降低了痒觉行为。*P<0.05，跟对照的生理盐水组进行统计分析后，存在显著性差异，进行统计比较得出的P值小于0.05。上述结果表明，抑制ASIC3通道可以缓解瘙痒。
实施例3ASIC3对感觉神经元上痒觉相关基因的表达改变的影响
为进一步了解ASIC3贡献于慢性痒的分子机制，利用实时定量反转录PCR的手段，对经过水或醚、丙酮和水的野生型和ASIC3基因敲除小鼠感觉神经元上ASIC3、TRPA1、MrgprC11和MrgprA3的mRNA表达改变情况进行量化统计。mRNA的表达量表示为临界温度差异的相对值，以水处理过的小鼠进行比较。动物数目为每组4只小鼠。
结果如图3A所示，丙酮、乙醚和水的联合处理相比水的单独处理使得野生型小鼠背根神经节神经元上ASIC3mRNA表达显著增加，支持了在干皮症导致 的慢性痒进展过程中，ASIC3发生了主动的敏化调控(***P<0.001，###P<0.001)。
如图3B-3D所示，野生型小鼠中，丙酮、乙醚和水的联合处理显著促进了TRPA1、MrgprC11和MrgprA3的表达，TRPA1、MrgprC11和MrgprA3均为组胺非依赖的痒觉转导的关键组分，而且被认为在干皮症诱导的慢性痒过程中发挥关键作用。然而，这些基因的上调表达在ASIC3基因敲除小鼠要么大部分被抑制(TRPA1)，要么被完全阻断(MrgprC11和MrgprA3)，表明ASIC3在干皮症导致的感觉神经元上痒觉相关基因的表达改变中发挥了关键作用(***P<0.001，###P<0.001)。
实施例4ASIC3介导皮肤异常的研究
为了进一步定义ASIC3在慢性痒中的作用，我们在面颊模型上(图4A,B)重复了实施例所述的干皮症导致的慢性痒和皮肤增厚表型。分别对小鼠30分钟测试时间内的用前爪的抓挠时间(反映痒觉行为)和用后爪的擦拭时间(反映痛觉行为)进行量化统计。
结果如图4C所示，经过每天的丙酮、乙醚和水的联合处理，相比水的单独处理，野生型小鼠发展出显著的自发痒觉抓挠行为，而ASIC3基因敲除小鼠表现出显著降低的自发痒觉抓挠行为(***P<0.001，###P<0.001)。
同时，如图4D所示，联合处理的野生型小鼠发展出显著的自发痛觉擦拭行为，而ASIC3基因敲除小鼠表现出显著降低的自发痛觉擦拭行为(***P<0.001， ###P<0.001)。
上述结果验证了ASIC3的确显著贡献于干皮症导致的异常感觉行为。
此外，如图4E和4F所示，与颈背部模型类似，丙酮、乙醚和水的联合处理，相比水的单独处理，促发了面颊部皮肤的显著增厚。重要的是，ASIC3基因敲除小鼠的表皮增生显著降低，这强调了ASIC3在慢性痒中的表皮稳态调节中发挥关键作用。
实施例5ASIC3参与酸增强SL-NH2痒觉的反应
通过在野生型小鼠和ASIC3基因敲除小鼠颈背部注射生理盐水(saline)或实验制剂(体积均为50微升)，观察和定量统计注射后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。数据以平均值±标准误的形式进行展示。动物数目为每组9–13只小鼠。
所述实验制剂选自下组：
(i)Acid，即为0.6％体积比的醋酸，溶于生理盐水，pH值为3.5～4.0；
(ii)SL-NH2，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
(iii)SL-NH2+Acid，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
(iv)BAM8-22，即3毫摩尔/升多肽致痒剂BAM8-22，溶于生理盐水；
(v)BAM8-22+Acid，即3毫摩尔/升多肽致痒剂BAM8-22和0.6％体积比醋酸的混合物；
(vi)SL-NH2+Acid+AMI,即7毫摩尔/升SL-NH2、0.6％体积比醋酸和200微摩尔/升阿米洛利的混合物，溶于生理盐水。
结果如下(野生型小鼠用填充图表示、ASIC3基因敲除小鼠用空白图表示)：
如图5A所示：颈背部皮下注射酸性溶液(pH 3.5～4.0)，相比生理盐水仅引起较弱的抓挠行为，表明质子本身并不是致痒剂。针对在试剂注射后整个30分钟内以每5分钟为一段对酸化引起的抓挠次数进行双因素方差分析，发现野生型和ASIC3基因敲除小鼠之间并无显著差异(WT vs.ASIC3KO,F(1,138)＝0.007,P＝0.933,图1A)。
MrgprC11激动剂SL-NH2(图5A，5D和5E)和BAM8-22(图5F-5H)在野生型和ASIC3基因敲除小鼠上都能引起显著的抓挠行为，在30分钟内总的抓挠次数并无显著差异。进一步对30分钟测试时间内每5分钟的抓挠次数进行双因素方差分析(SL-NH2:WT vs.ASIC3KO,F(1,138)＝0.442,P＝0.507,图1A；BAM8-22:WT vs.ASIC3KO,F(1,144)＝1.090,P＝0.298,图5F)表明，ASIC3在MrgprC11依赖的痒觉转导过程中并不发挥显著作用。
然而，当致痒剂SL-NH2和Acid共处理时相比致痒剂本身，在野生型小鼠上显著地促进了痒觉行为，但是在ASIC3基因敲除小鼠却无此增加现象(图5B，5D和5E)，这表明酸化能够增加SL-NH2引起的痒觉以及ASIC3对于这种效应至关重要(SL-NH2+Acid:WTvs.ASIC3KO,F(1,144)＝20.085,P<0.001,图5B)。给予ASICs非选择性抑制剂阿米洛利，取消了这种ASIC3依赖的酸化对SL-NH2痒觉的促进效应(SL-NH2+Acid+AMI:WT vs.ASIC3KO,F(1,126)＝0.022,P＝0.882，图5C-5E)。相比之下，野生型和ASIC3基因缺陷小鼠在BAM8-22和酸化共处理时整个30分钟内以及30分钟测试期每5分钟的时间段里(BAM8-22+Acid:WTvs.ASIC3KO,F(1,108)＝1.476,P＝0.227)均无显著差异，说明上述酸化引起 的痒觉易化效应是一种MrgprC11非依赖的机制。总之，这些结果表明ASIC3通道而不是MrgprC11信号途径在酸化协同SL-NH2引起的痒觉反应中发挥重要作用。
值得注意的是，酸化协同SL-NH2引起痒觉增加的效应主要在共同注射后第一个5分钟内最为明显，这种增加效应随后逐渐平息(图5B)，因此在整个30分钟内SL-NH2单独注射与SL-NH2和酸共同注射引起的总抓挠次数并无显著差异(图5E)。
实施例6.增加酸性溶液的缓冲能力加剧酸化对SL-NH2痒觉的促进效应
通过往野生型和ASIC3基因敲除小鼠颈背部注射生理盐水或实验制剂(体积均为50微升)，观察和定量统计小鼠在注射后30分钟内每5分钟的时间段里抓挠注射皮肤部位的次数。数据以平均值±标准误的形式进行展示。动物数目为每组9–12只小鼠。
所述实验制剂选自下组：
(i)HEPES，即150毫摩尔/升的HEPES溶液(pH值为7.4)；
(ii)MES，即150毫摩尔/生的MES溶液(pH值为3.5)；
(iii)SL-NH2+HEPES，即为7毫摩尔/升的SL-NH2溶解在150毫摩尔/升HEPES溶液中的混合液。
(iv)Acid，即0.6％体积比的醋酸，溶于生理盐水，pH值为3.5～4.0；
(v)SL-NH2+Acid+MES，即为7毫摩尔/升的SL-NH2、0.6％体积比醋酸溶解在150毫摩尔/生的MES溶液中。
结果如下(野生型小鼠用填充图表示，ASIC3基因敲除小鼠用空白图表示)：
颈背部单独注射MES缓冲酸性溶液或致痒剂SL-NH2，相比注射中性pH的HEPES溶液，引起的动物抓挠次数增加在野生型和ASIC3基因敲除小鼠上无差异(图6A)。颈背部注射溶解在MES缓冲酸性溶液中的SL-NH2相比中性多肽引起的抓挠次数增加效应不仅发生在第一个5分钟(图6B、6C)，而且发生于整个30分钟测试时间内(图6D)。同时，在ASIC3基因敲除小鼠上，这种抓挠次数增加并不明显。这些结果表明，酸化协同促进SL-NH2导致的痒觉依赖于持续组织酸化的程度和持续时间，而持续酸化又是炎症的重要特征。通过参与酸化调控的痒觉行为，ASIC3通道适于影响组织损伤和/化酸化引起的病理生理性痒觉反应，而不仅仅是痛觉反应。
实施例7对于酸化协同促进SL-NH2所引起痛痒觉反应的鉴定
通过在野生型和ASIC3基因敲除小鼠面颊部注射生理盐水或如图所示的致痒剂(体积均为10微升)，分别观察和定量统计在注射后30分钟内小鼠用后爪抓挠注射部位(表示为痒觉行为)和用前爪擦拭注射部位(表示为痛觉行为)的时间。数据以平均值±标准误的形式进行展示。动物数目为每组9–12只小鼠。
所述实验制剂选自下组：
(i)Acid，即为0.6％体积比的醋酸，溶于生理盐水，pH值为3.5～4.0；
(ii)SL-NH2，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
(iii)SL-NH2+Acid，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
(iv)SL-NH2+Acid+AMI,即7毫摩尔/升SL-NH2、0.6％体积比醋酸和200微摩尔/升阿米洛利的混合物，溶于生理盐水。
结果如下(野生型小鼠用填充图表示，ASIC3基因敲除小鼠用空白图表示)：
在野生型和ASIC3基因敲除小鼠的面颊部注射SL-NH2引起动物产生强烈的痒觉抓挠行为(图7A)，但是引起的痛觉擦舐反应程度明显较弱(图7B)。相比之下，面颊部单独注射酸在野生型和ASIC3基因敲除小鼠上引起了相似的较弱的痒觉抓挠反应(图7A)，但是在野生型小鼠上引起的痛觉擦舐反应明显高于ASIC3基因敲除小鼠(图7B)，这支持ASIC3在酸化导致的痛觉中发挥作用，然而在致痒剂不存在时，ASIC3并不参与痒觉感受。当在面颊部同时注射酸和SL-NH2时，在野生型小鼠尚相比单独注射SL-NH2显著促进了抓挠行为(图3A)，但在ASIC3基因敲除小鼠上并没有此效应。酸化促进SL-NH2痒觉的效应能够被同时注射阿米洛利所取消(图7A)。此外，共注射酸和SL-NH2，相比单独注射酸或SL-NH2本身，在野生型小鼠上也增加了痛觉擦舐行为，而在ASIC3基因敲除小鼠上并没有增加(图7B)。而且，共注射酸和SL-NH2在野生型小鼠上对痛觉擦舐行为增加的效应同样被阿米洛利所阻断(图7B)。总之，ASIC3通道通过感受酸化和特定致痒剂而介导了一种复合的痛痒感受。
实施例8ASIC1a基因敲除促进SL-NH2引起的痒觉反应
通过在野生型和ASIC1a基因敲除小鼠颈背部注射生理盐水(Saline)或实验制剂(体积均为50微升)，观察和定量统计在注射后30分钟内每5分钟的时间段里小鼠抓挠注射皮肤部位的次数。数据以平均值±标准误的形式进行展示。动物 数目为每组8–12只小鼠。
所述实验制剂选自下组：
(i)Acid，即为0.6％体积比的醋酸，溶于生理盐水，pH值为3.5～4.0；
(ii)SL-NH2，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
(iii)SL-NH2+Acid，即7毫摩尔/升SL-NH2和0.6％体积比醋酸的混合物，溶于生理盐水；
结果如下(野生型小鼠用填充图表示、ASIC3基因敲除小鼠用斜纹图表示)：
ASIC1a基因敲除小鼠相比其同窝对照的野生型小鼠，表现出对酸或SL-NH2同样的痒觉反应(图8A)，但是对于酸和SL-NH2的共注射却表现出更加显著的增加效应(图8B-8D)，这表明ASIC1a并不负责酸化协同促进SL-NH2引起的痒觉反应(***P<0.001，###P<0.001)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)调控剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于缓解干皮症诱导的慢性瘙痒；并且，所述的酸敏感离子通道调控剂为ASIC3通道抑制剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ASIC3通道抑制剂选自下组：
(i)阿米洛利、脒A-317567、萘莫司他、非甾体类抗炎药(NSAID)、多肽APETx2、或其组合；
(ii)特异性抑制酸敏感离子通道相关蛋白的表达和/或活性的拮抗剂；
(iii)上述(i)和(ii)的任意组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ASIC3通道抑制剂还包含碱性中和剂。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的碱性中和剂选自下组：碱金属盐、碱土金属盐、或其组合。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的碱性中和剂选自下组：碳酸氢钠、氯化铵、氢氧化铝、胃舒平、或其组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为药物组合物、或食品组合物。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的瘙痒包括抗组胺处理不敏感的干皮症诱导的慢性瘙痒。
9.一种筛选缓解干皮症诱导的慢性瘙痒的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对ASIC3通道的影响，从而选出对所述ASIC3通道有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及
(b)测试所述经初筛的化合物对干皮症诱导的慢性瘙痒的缓解效果，从而选出对瘙痒具有缓解效果的化合物，作为候选药物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的检测包括：在实验组中，在所述待测化合物存在下，培养细胞，并检测所述细胞中ASIC3通道相关蛋白的表达量、活性和/或ASIC样电流，并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，检测相同细胞中相同ASIC3通道相关蛋白的表达量、活性和/或ASIC样电流，并进行比较；如果实验组的检测值Vt显著低于对照组的检测值Vc，则表明所述的待测化合物为对所述ASIC3通道有抑制作用的待测化合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的“显著低于”指Vc/Vt≥1.5。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的检测值Vt和Vc为ASIC样电流的电流密度。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的“ASIC3通道相关蛋白”包括与ASIC3通道直接或间接作用的蛋白，或者调控ASIC3通道活性的蛋白质。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的“ASIC3通道相关蛋白”选自下组：P2X受体、TRPV1、蛋白酶激活受体PAR2、或其组合。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括神经细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的神经细胞是背根神经节神经元。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |