TWI591073B - 抗-asic1抗體及其用途 - Google Patents
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Description
本發明是有關對人類ASIC1具有特異性的抗體及其抗原-結合片段,及其使用方法。
酸敏感離子通道(acid sensing channels,ASICs)是在中樞神經系統與周邊神經系統中所表現的質子-閘控陽離子通道。人類中的ASIC家族包括ASIC1、ASIC2、ASIC3以及ASIC4次單位,其等在神經細胞膜中排列成同源多聚體或異源多聚體離子通道。ASIC1、ASIC2以及ASIC3在能夠偵測有毒化學物質、熱與高閾值機械刺激的小及中等痛覺神經元中被明顯表現。ASIC2與ASIC3亦在大多對應於低閾值機械受器的大神經元中表現。
ASIC對Na+以及Ca2+是可通透的且能夠被範圍在pH 6.8至4.0的外部pH變化所活化。咸信ASIC在感覺局部酸血症中扮演重要的角色。局部組織酸血症是疼痛與發炎的一個特徵,而發炎組織經常表現低pH(如~4.7那麼低)。阻斷ASIC已被提議作為用以治療各種病症與病況的一種方法。阻斷ASIC1尤其已被提議作為用以治療諸如疼痛、神經退化性疾病以及精神疾病之病況的方法。
ASIC1的藥理學抑制劑包括特異抑制ASIC1同聚體的狼蛛科肽狼蛛毒素-1(tarantula peptide Psalmotoxin-1,PcTx1),以及小分子,非選擇性ASIC抑制劑艾米洛(amiloride)與A-317567。分離自海葵之具有
40個胺基酸的肽毒素APETx2已顯示會抑制ASIC3同聚體還有ASIC3/1與ASIC3/2異聚體。
目前,沒有特異阻斷ASIC的已知抗體。因此,在本技藝中對於新穎的ASIC抑制劑(諸如可用於治療受ASIC信號傳遞所媒介之疾病與病況的抗-ASIC1抗體)存在有需要。
本發明提供特異結合人類ASIC1的抗體,包括例如特異結合細胞表面表現之ASIC1的抗體。依據某些具體例,本發明的抗體在表現人類ASIC1的細胞中抑制酸誘導性、ASIC1-媒介的離子流。本發明抗體尤其可用於抑制ASIC1-媒介的信號傳遞以及用於治療由ASIC1活性及/或信號傳遞所致或與ASIC1活性及/或信號傳遞相關的疾病與病症。舉例而言,本發明抗體可被投與給患者以供治療或減輕疼痛與相關病況。
本發明抗體可以是全長(例如,IgG1或IgG4抗體)或可含有僅僅抗原-結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段),且可經修飾而影響功能性,例如減少殘基效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本發明提供一種包含一重鏈可變區(HCVR)的抗體或抗體之抗原-結合片段,該重鏈可變區具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370,及386,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明亦提供一種包含一輕鏈可變區(LCVR)的抗體
或抗體之抗原-結合片段,該輕鏈可變區具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378,及394,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明亦提供一種包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群的HCVR與LCVR(HCVR/LCVR)序列對的抗體或其抗原-結合片段:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378,及386/394。
本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段,其包含一重鏈CDR3(HCDR3)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376,及392,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列;以及一輕鏈CDR3(LCDR3)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384,及400,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
在某些具體例中,該抗體或抗體之抗原-結合部分包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群的HCDR3/LCDR3胺基酸序
列對:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384,及392/400。
本發明亦提供一種抗體或其片段,其進一步包含一重鏈CDR1(HCDR1)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372,及388,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列;一重鏈CDR2(HCDR2)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374,及390,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列;一輕鏈CDR1(LCDR1)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380,及396,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列;以及一輕鏈CDR2(LCDR2)域,具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382,及398,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明的某些非限制性、例示性抗體及抗原-結合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域,各別具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:4-6-8-12-14-16(例如H1M6712N);20-22-24-28-30-32(例如H1M6716N);36-38-40-44-46-48(例如H1M6718N);52-54-56-60-62-64(例如H1M7101N);68-70-72-76-78-80(例如H2M7103N);84-86-88-92-94-96(例如H3M6713N);100-102-104-108-110-112(例如H3M6715N);116-118-120-124-126-128(例如H3M6720N);132-134-136-140-142-144(例如H3M6721N);148-150-152-156-158-160(e.g.,H3M6721N2);164-166-168-172-174-176(例如H3M6726N);180-182-184-188-190-192(例如H3M6760N);196-198-200-204-206-208(例如H3M7102N);212-214-216-220-222-224(例如H3M7118N);228-230-232-236-238-240(例如H4H6362P);244-246-248-252-254-256(例如H4H6363P);260-262-264-268-270-272(例如H4H6364P);276-278-280-284-286-288(例如H4H6366P);292-294-296-300-302-304(例如H4H6372P);308-310-312-316-318-320(例如H4H6374P);324-326-328-332-334-336(例如H4H6375P);340-342-344-348-350-352(例如H4H6379P);356-358-360-364-366-368(例如H4H6380P);
372-374-376-380-382-384(例如H4H6381P);及388-390-392-396-398-400(例如H4H6383P)。
在一個相關具體例中,本發明包括特異結合ASIC1(例如細胞表面表現的ASIC1)的抗體或抗體之抗原-結合片段,其中該抗體或片段包含選自下列SEQ ID NO所組成之群之重鏈與輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列中所含重鏈與輕鏈CDR域:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378,及386/394。用於鑑定HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDR的方法及技術為技藝中已知的,且可用於鑑定本文揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列中的CDR。可用於鑑定CDR邊界的例示性習知技術包括,例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性術語中,Kabat界定法是以序列變異性為基礎,Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎,而AbM界定法是一種介於Kabat與Chothia法之間的折衷法。參見,例如Kabat,”Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑定抗體內的CDR序列。
在另一個方面,本發明提供編碼抗-ASIC1抗體或其片段之核酸分子。帶有本發明核酸之重組型表現載體與引入該等載體的宿主細胞,與藉由在容許生產抗體的條件下培養宿主細胞
而生產抗體和回收所生產之抗體的方法亦被本發明所含括。
在一個具體例中,本發明提供一種抗體或其片段,其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核酸序列所編碼的HCVR:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369,及385,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供一種抗體或其片段,其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核酸序列所編碼的LCVR:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377,及393,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供抗體或抗體之抗原-結合片段,其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR3域:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375,及391,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;以及選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR3域:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383,及399,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供抗體或其片段,其進一步包含選自由
下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR1域:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371,及387,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR2域:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373,及389,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR1域:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379,及395,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列;以及選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR2域:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381,及397,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
依據某些具體例,該抗體或其片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列所編碼的重鏈與輕鏈CDR序列:1與9(例如H1M6712N)、17與25(例如H1M6716N)、33與41(例如H1M6718N)、49與57(例如H1M7101N)、65與73(例如H2M7103N)、81與89(例如H3M6713N)、97與105(例如H3M6715N)、113與121(例如H3M6720N)、129與137(例如
H3M6721N)、145與153(例如H3M6721N2)、161與169(例如H3M6726N)、177與185(例如H3M6760N)、193與201(例如H3M7102N)、209與217(例如H3M7118N)、225與233(例如H4H6362P)、241與249(例如H4H6363P)、257與265(例如H4H6364P)、273與281(例如H4H6366P)、289與297(例如H4H6372P)、305與313(例如H4H6374P)、321與329(例如H4H6375P)、337與345(例如H4H6379P)、353與361(例如H4H6380P)、369與377(例如H4H6381P)、385與393(例如H4H6383P)。
本發明包括抗-ASIC1抗體,其具有經修飾的糖化型態。在一些應用中,移除非所欲糖化位點的修飾可能是有用的,或缺乏存在於寡醣鏈上的岩藻糖部分的抗體。
在另一個方面,本發明提供一種醫藥組成物,其包含特異結合ASIC1(例如細胞表面表現的ASIC1)之重組型人類抗體或其片段,以及藥學上可接受載劑。在一個相關的方面,本發明特徵為一種組成物,其為抗-ASIC1抗體與第二治療劑的組合。在一個具體例中,該第二治療劑為任一種有利與抗-ASIC1抗體組合的藥劑。可有利與抗-ASIC1抗體組合的例示性藥劑包括,但不限於其他抑制ASIC1活性的藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)及/或不直接結合ASIC1但以其他方式在細胞中干擾、阻斷或減弱ASIC1-媒介之離子流的藥劑。
在又另一個方面,本發明提供使用本發明抗-ASIC1抗體或抗體之抗原-結合部分來抑制ASIC1-媒介之離子流的方法,其中該治療方法包含投與治療有效量之含有本發明抗體或抗
體之抗原-結合片段的醫藥組成物。所治療的病症是任一種藉由移除、抑制或降低ASIC1-媒介的離子流而被增進、改善、抑制或預防的疾病或病況。本發明抗-ASIC1抗體或抗體片段可具有阻斷酸誘導性ASIC1-媒介流或以其他方式抑制ASIC1信號傳導活性的功能。
本發明亦包括本發明抗-ASIC1抗體或抗體之抗原結合部分供製造用以在患者體內治療與ASIC1-媒介之離子流有關或由ASIC1-媒介之離子流所致的疾病或病症之藥物的用途。
其他具體例將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
第1圖顯示使用抗-ASIC1抗體(H1M6718N)或同型對照抗體處理的小鼠,對尾部(A區)或腓腸肌(B區)的機械捏擰反應所產生的縮爪閾值。結果表示為對以公克計之捏擰的縮爪閾值(每分組小鼠平均值±SEM)。
第2圖顯示使用在抗-ASIC1抗體(H1M6718N)或同型對照處理的小鼠中,就酸性食鹽水誘導的肌肉痛覺過敏相對於基線的縮爪閾值的百分比變化。
第3圖(A區與B區)顯示使用在抗-ASIC1抗體(H1M6718N,10或40 mg/kg-A區;或H4H6721N2 10或30 mg/kg-B區)或同型對照處理的小鼠中,就鹿角膠誘導的肌肉痛覺過敏相對於基線的縮爪閾值的百分比變化。
第4圖顯示在使用30 mg/kg(s.c.)同型對照抗體、30 mg/kg(s.c.)H1M6718N,或100 mg/kg(s.c.)佳巴本汀處理之投與太
平洋紫杉醇的小鼠中,太平洋紫杉醇誘導之觸誘發痛隨著時間的程度。
在說明本發明之前,應理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件,因為這些方法以及條件可能會改變。亦應理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用,而不是限制性的,因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
除非另有定義,否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。如本文所用,術語”約”,當使用在有關特定引用的數值時,表示該數值可自所引用的數值起改變達不超過1%。舉例而言,如本文所用,詞句”約100”包括99與101以及其間的所有數值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於實施或測試本發明,現將說明較佳的方法以及材料。
詞句”ASIC1”與”ASIC1片段”,如本文所用意指人類ASIC1蛋白或片段,除非指明來自非人類物種(例如,”小鼠ASIC1”、小鼠”ASIC1片段”、”猴ASIC1”、”猴ASIC1片段”等)。人類ASIC1具有顯示於如SEQ ID NO:401所示胺基酸序列。詞句”ASIC1”,如本文所用,包括ASIC1細胞外域的可溶性片段(例如包含或由SEQ ID NO:401的胺基酸63至424中所發現之至少
30個連續胺基酸所構成的多肽),以及細胞表面表現的ASIC1(如同下文中所定義的術語)。
如本文所用,”結合ASIC1的抗體”或”抗-ASIC1抗體”包括結合ASIC1蛋白之可溶性片段(例如,ASIC1的細胞外域的一部分)及/或細胞表面表現的ASIC1的抗體及其抗原-結合片段。詞句”細胞表面表現的ASIC1”表示在活體外或活體內被表現在細胞表面上之一或多種ASIC1蛋白,以使得ASIC1蛋白的至少一部分(例如SEQ ID NO:401的胺基酸63至424)暴露在細胞膜的細胞外側且可被抗體之抗原-結合部分所接近。”細胞表面表現的ASIC1”包括細胞膜中的功能性ASIC1離子通道中所含的ASIC1蛋白。在一些情況下,”細胞表面表現的ASIC1”是一種在細胞表面上表現為異聚體(例如ASIC1/2、ASIC1/3或ASIC1/4異聚體)一部分的ASIC1蛋白。在其他情況下,”細胞表面表現的ASIC1”是一種在細胞表面上表現為同聚體一部分的ASIC1蛋白。此外,”細胞表面表現的ASIC1”可包含在細胞表面上表現的ASIC1蛋白或由在細胞表面上表現的ASIC1蛋白所構成,該細胞通常表現ASIC1蛋白。或者,”細胞表面表現的ASIC1”可包含在細胞表面上表現的ASIC1蛋白或由在細胞表面上表現的ASIC1蛋白所構成,該細胞通常不在其表面上表現ASIC1蛋白,但經人造工程化而在其表面上表現ASIC1。
術語”抗體”,如本文所用,意指特異結合至抗定抗原(例如ASIC1)或與特定抗原交互作用的任一種抗原-結合分子或分子複合物,其包含至少一個互補決定區(CDR)。術語”抗體”包括免疫球蛋白分子,其含有4個多肽鏈,藉由雙硫鍵交互連結的2
個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈,以及其集合體(例如IgM)。各個重鏈含有1個重鏈可變區(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有3個結構域,CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有1個結構域(CL1)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區(命名為互補決定區(CDRs)),散佈有較為保守的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由3個CDR以及4個FR所構成,按下列順序從胺基端往羧基端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的不同具體例中,抗-ASIC1抗體(或其抗原-結合部分)的FR可能與人類生殖系序列相同,或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDR來定義。
術語”抗體”,如本文所用,亦包括完整抗體分子的抗原-結合片段。如本文所用,術語抗體的”抗原-結合部分”、抗體的”抗原-結合片段”及類似者包括任何天然存在的、以酵素所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白,其特異結合抗原而形成複合物。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變與視情況恆定域之DNA的重組遺傳工程技術)而衍生自例如完整抗體分子。這樣的DNA是已知的及/或易於從例如商業來源、DNA庫(包括,例如噬菌體-抗體庫)獲得或可合成。DNA可以被定序且以化學的方式或使用分子生物技術來操作,例如將一或多個可變及/或恆定域排成適當構形,或引入會產生半胱胺酸殘基的密碼子、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限制性實施例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab’)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)單鏈Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的最小辨識單元(例如單離的互補決定區(CDR),諸如CDR3肽),或限制FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程化的分子(諸如域特異性抗體、單域抗體、域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小調節分子免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域)亦含括在如本文所用詞句”抗原-結合片段”中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少1個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成,且通常含有至少1個鄰近1或多個骨架序列或在1或多個骨架序列中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原-結合片段中,VH以及VL域可相對另一者位在適當排列處。舉例而言,可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者,抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中,抗體的抗原-結合片段可含有至少1個共價連結至少1個恆定域的可變域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定域的非限制例示性構形包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構形),可變與恆定域可以是彼此直接
連結或藉由完整或部分樞紐(hinge)或連接子(linker)區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成,它在單一多肽分子中的相鄰可變及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外,本發明抗體的抗原-結合片段可包含上列可變與恆定域構形的任一者彼此及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言,抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少兩個不同可變域,其中各個可變域能夠特異結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多特異性抗體形式,包括此處所揭示的例示性雙特異性抗體形式,可使用該技藝中可取得之慣用技術而改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
術語”人類抗體”,如本文所用,欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變),例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是,術語”人類抗體”,如本文所用,不意欲要包括已被移植至人類骨架序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的抗體。
術語”重組型人類抗體”,如本文所用,欲包括所有藉由重組方法所製備、表現、產生或分離的人類抗體,諸如使用被轉染至宿主細胞中之重組型表現載體而被表現的抗體(進一步說
明如下)、組合型人類抗體庫(進一步說明如下)、分離自經人類免疫球蛋白基因轉基因的動物(例如小鼠)的抗體(參見,例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295),或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之方法所製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組型人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區及恆定區。但是,在某些具體例中,此等重組型人類抗體經活體外致突變(或,當使用經人類Ig序列基因轉基因的動物時為活體內體細胞致突變),而因此該等重組型抗體之VH區與VL區的胺基酸序列為可能在活體內人類抗體生殖系本中非天然存在的序列,儘管它們是衍生自人類生殖系VH與VL序列或與其相關。
人類抗體以兩種與樞紐異質性相關的形式存在。在一種形式中,免疫球蛋白分子包含約150-160 kDa的穩定四鏈建構物,其中二聚體藉由鏈間重鏈雙硫鍵而被約束在一起。在第二種形式中,二聚體不是經由鏈間雙硫鍵連結,且形成一個由共價偶合輕鏈及重鏈組成的約75-80 kDa分子(半抗體)。此等形式即使是在親和力純化之後也相當難以分離。
第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率是因為(但不限於)與抗體之樞紐區同型有關的結構差異。在人類IgG4樞紐的樞紐區中,單個胺基酸置換可能將第二種形式的出現明顯降低至一般使用人類IgG1樞紐所觀察到的程度(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)。本發明含括具有一或多個在樞紐CH2或CH3區中的突變的抗體,其可能是所要的,例如在製造時,俾以增進所欲抗體形式的產率。
”分離的抗體”,如本文所用,表示一種已被鑑定且分離及/或由其天然環境的至少一組分中被回收而來的抗體。例如,已被分離或由生物的至少一組分中,或由其中天然存在或天然生產之抗體的組織或細胞來的抗體就本發明之目的來說是一種”分離的抗體”。分離的抗體亦包括在重組型細胞內的原位抗體。分離抗體是已進行至少一個純化或分離步驟的抗體。依據某些具體例,分離的抗體基本上不含其他細胞物質及/或化學品。
”中和”或”阻斷”抗體,如本文所用,欲意指一種結合至ASIC1而降低或可偵測到地抑制酸誘導性ASIC1-媒介之離子流的抗體。由ASIC1中和或阻斷抗體所致的抑制不必然是完全的,只要其可使用適當分析被測得即可。偵測ASIC1抑制的例示性分析於本文中說明。
相較於抗體所衍生而來之對應生殖系序列,本文揭示的抗-ASIC1抗體可在重鏈及輕鏈可變域之骨架及/或CDR區中含有一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而容易確認。本發明包括抗體及其抗原結合片段,其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列,其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸突變成對應該抗體所源自的生殖系序列之對應殘基,或另一人類生殖系序列的對應殘基,或對應生殖系殘基的保守性胺基酸置換(諸如序列改變在本文中全意指為”生殖系突變”)。本技藝中具有通常技術者從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列開始,可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中,VH及
/或VL域中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成在抗體衍生而來之原有生殖系序列中所發現的殘基。在其他具體例中,僅有某些殘基突變回復成原有生殖系序列,例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基,或僅有CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。在其他具體例中,骨架及/或CDR殘基的一或多者突變成不同生殖系序列的對應殘基(亦即,不同於抗體原有衍生而來之生殖系序列的生殖系序列)。此外,本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系突變的組合,例如某些個別殘基突變成特定生殖系序列的對應殘基,而不同於原有生殖系序列的某些其他殘基維持原狀或突變成不同生殖系序列的對應殘基。在得到後,含有一或多個生殖系突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括抗-ASIC1抗體,該抗體含有本文揭示之具有一或多個保守性置換的HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列任一者的變體。例如,本發明包括具有HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列的抗-ASIC1抗體,該抗體相對於本文揭示之任一HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等的保守性胺基酸置換。
術語”抗原決定位(epitope)”意指一個與已知為抗原決定簇(paratope)之抗體分子的可變區中的特定抗原結合位點交互作用的抗原決定基。單獨一個抗原可能有超過一個抗原決定位。
因此,不同抗體可結合至抗原的不同區域且可能具有不同的生物效用。抗原決定位可以是具有構像或線性的。構像抗原決定位可透過在空間上並列的胺基酸由不同線性多肽鏈的區段所產生。線性抗原決定位是由多肽鏈中的相鄰胺基酸殘基所產生。在某些情況下,抗原決定位可包括抗原上的醣類、磷氧基或磺醯基的部分。
當意指核酸或其片段時,”實質同一性”或”實質相同”表示若藉由任何序列同一性的已知演算法(諸如FASTA、BLAST或Gap,如上所述)來測定時,當在有適當核苷酸插入或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時,在至少約95%,及更佳至少約96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基中有核苷酸序列同一性。在某些情況下,與參考核酸分子具有實質同一性的核酸分子可編碼具有與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質類似胺基酸序列的多肽。
當應用於多肽時,術語”實質相似性”或”實質相似”表示當兩個肽序列最佳地排列時(諸如按照程式GAP或BESTFIT使用預設空位權重),共有至少95%序列同一性,甚至更佳至少98%或99%序列同一性。較佳地,不相同的殘基位置因為保守性胺基酸置換而有所差異。”保守性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說,保守性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的官能性質。在2或多個胺基酸序列彼此因為保守性置換而有所不同的情況下,序列同一性百分比或相似性程度可以向上調整而校正置換的保守性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見,例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.
24:307-331。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的基團實施例包括(1)脂肪族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸;(2)脂肪族-羥基側鏈:絲胺酸與蘇胺酸;(3)含醯胺的側鏈:天門冬醯胺酸與麩醯胺酸;(4)芳族側鏈:苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸與組胺酸;(6)酸性側鏈:天門冬胺酸與麩胺酸;以及(7)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸置換基團為:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸,以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者,保守性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256:1443-1445中揭示的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的變化。”中度保守”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
有關多肽的序列相似性,其亦可意指為序列同一性,典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括保守性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例如,GCG軟體含有諸如Gap與Bestfit的程式,它們可以與預設參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見,例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採預設或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最佳重複區域的排列以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時,另一個較佳的演算法是電腦程式
BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN,使用預設參數。參見,例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410以及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
本發明包括特異結合細胞表面表現之ASIC1的抗體。如本文所用,若抗體顯示可偵測到結合至天然或人造表現ASIC1但不顯示可偵測到結合至不表現ASIC1的相同細胞,則該抗體特異結合細胞表面表現的ASIC1。一個可用於決定抗體是否會特異結合細胞表面表現之ASIC1的例示性分析形式為螢光活化細胞分選(FACS),如本文實施例3中所示。抗體定性陽性FACS結合至表現ASIC1的細胞,如表2中所示,可用於鑑別特異結合細胞表面表現之ASIC1之細胞。FACS亦可用於定量評估結合至表現ASIC1之細胞的抗體,亦即EC50值,如實施例3、表3中所示。因此,依據本發明的某些具體例,若抗體當在實施例3的FACS分析形式或實質相似的分析形式中測試時,表現約5 nM或更少(例如,約5.0 nM、4.5 nM、4.0 nM、3.5 nM、3.0 nM、2.5 nM、2.0 nM、1.5 nM、1.4 nM、1.3 nM、1.2 nM、1.1 nM、1.0 nM、900 pM、800 pM、700 pM、600 pM、500 pM、400 pM、300 pM、200 pM、100 pM、90 pM、85 pM、80 pM、75 pM、70 pM或更少)的EC50值,則該抗體”特異性地結合細胞表面表現之ASIC1”。
依據某些具體例,本發明抗體亦可(或另外)起抑制表現人類ASIC1的細胞中之酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流的作用。如本文所用,詞句”抑制酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流”表
示在一個可偵測及/或定量酸誘導性細胞離子流或流動的分析中,添加本發明抗體可偵測到相較於不存在抗體下所觀察到之離子流(例如,存在非特異性陰性對照抗體下),降低或抑制酸誘導性離子流。可用於決定一個抗體是否會”抑制酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流”的非限制性例示性分析說明於本文的實施例4中。在此實施例中,在表現ASIC1的細胞中,於抗-ASIC1抗體存在下測量低pH-活化的鈣流(”FLIPR分析”)。藉由改變此分析形式中所用的抗體量,可計算出阻斷50%的低pH誘導之離子流所需抗體量且表示為IC50值(參見,例如實施例4,表5)。本發明包括當在如上述FLIPR分析或實質相似的分析中在約5.0至約6.0的pH(例如,在pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9,或6.0)下,以低於約10 nM的IC50抑制酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流的抗-ASIC1抗體。舉例而言,本發明包括當在如上述FLIPR分析或實質相似的分析中在約5.5的pH下,表現低於下列之IC50的抗-ASIC1抗體:9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、0.1 nM或更低。
可用於決定一個抗體是否會”抑制酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流”的其他例示性分析形式說明於本文的實施例5及6中。在此等實施例中,自動電壓箝制、膜片箝制分析可用來與相同環境抗體不存在(例如,非特異性陰性對照抗體存在下)下所觀察到之流動流相比較,在表現ASIC1的細胞中測量及/分析於酸性pH下在抗-ASIC1抗體存在下流動流的抑制。當在一個電壓-箝制、膜片-箝制分析中,濃度為約1 nM至約100 nM、pH為約5.0至約
6.0(例如在pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9,或6.0)下造成至少10%流抑制(例如至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的流抑制;參見,例如實例5,表6),則該抗體被視為是”抑制酸誘導性、ASIC1-媒介的離子流”。在一些情況下,當在如上述膜片箝制分析形式或實質相似的分析中測試時,本發明抗體在10 nM或更高濃度(例如100 nM)下完全抑制流動流(100%抑制)。
本發明亦包括在各種動物疼痛模型中抑制或減低疼痛反應的抗體。可用於鑑定本發明抗-ASIC1抗體的例示性動物疼痛模型說明於本文的實施例7-9中。舉例而言,本發明包括在小鼠模型中減弱或抑制對酸誘導性內臟疼痛的疼痛反應的抗-ASIC1抗體。(參見,例如實施例7)。具體而言,本發明包括當以約1或10 mg/kg的劑量投與給如實施例7中所示小鼠模型或實質相似模型時,表現抑制至少20%內臟疼痛反應(例如,對腹膜內注射0.6%乙酸所反應的腹縊)的抗-ASIC1抗體。在某些情況下,在實施例7的小鼠動物疼痛模型或實質相似模型中測試時,因為投與本發明抗體所致之疼痛反應抑制百分比可如約30%、35%、40%、45%、50%或更高這麼高。可用來鑑定本發明抗-ASIC抗體的其他動物疼痛模型包括,例如,實施例8的機械痛覺疼痛反應、實施例9的肌肉疼痛模型,以及本技藝中可用的其他類似動物模型。因此,本發明包括能夠減弱或抑制對有害機械刺激之疼痛反應(例如,參見實施例8);及/或酸-食鹽水或鹿角膠-誘導之肌肉痛覺過敏(參見,例如實施例9)的抗-ASIC1抗體,如在本文例示的合宜動物模型中所
證實。
本發明包括與人類ASIC1細胞外域中所發現的一或多個胺基酸(SEQ ID NO:401的胺基酸63至424)交互作用的抗-ASIC1抗體。抗體結合的抗原決定位可由在ASIC1細胞外域中具有3個或多個(例如,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)胺基酸的單一連續序列所構成。或者,該抗原決定位可由數個ASIC1細胞外域中之非連續胺基酸(或胺基酸序列)所構成。
可使用技藝中具有通常技術者所熟知的各種技術來決定一個抗體是否會與多肽或蛋白質中的”一或多個胺基酸交互作用”。例示性技術包括,例如Harlow and Lane的”Antibodies”所述的慣用交叉-阻斷分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)、丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-463)及肽切割分析。此外,可以採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一種可用於鑑別與抗體交互作用之多肽中的胺基酸的方法為透過質譜偵測氫/氘交換。在通常術語中,氫/氘交換法涉及將感興趣的蛋白質標記氘,然後透過將抗體結合至經氘標記的蛋白質。接下來,蛋白質/抗體複合物被轉移至水中以容許氫-氘交換在受抗體保護之殘基(其維持經氘標記)以外的所有殘基發生。在抗體解離後,目標蛋白質被進行蛋白酶切割與質譜分析,從而揭開經氘標記的殘基,其對應於抗體交互作用
的特定胺基酸。參見,例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259;Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本發明進一步包括結合至與本文所述特定例示性抗體任一者相同之抗原決定位的抗-ASIC1抗體(例如H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、H3M6715N、H3M6720N、H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N、H3M7118N、H4H6362P、H4H6363P、H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、H4H6380P、H4H6381P、H4H6383P等)。相同地,本發明亦包括與本文所述特定例示性抗體任一者競爭結合至ASIC1或細胞表面表現之ASIC1的抗-ASIC1抗體(例如H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、H3M6715N、H3M6720N、H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N、H3M7118N、H4H6362P、H4H6363P、H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、H4H6380P、H4H6381P、H4H6383P等)。
吾人可容易地藉由使用技藝中已知的例行方法決定一個抗體是否會與參考抗-ASIC1抗體結合至相同的抗原決定位,或與參考抗-ASIC1抗體競爭結合。例如,為決定一測試抗體是否會結合至與本發明參考抗-ASIC1抗體相同的抗原決定位,容許該參考抗體結合至ASIC1蛋白(例如細胞表面表現的ASIC1)。接著,評估測試抗體結合至ASIC1分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-ASIC1抗體飽合結合之後結合至ASIC1,則可推論該測試抗體
結合至與參考抗-ASIC1抗體不同的抗原決定位。另一方面,若測試抗體無法在參考抗-ASIC1抗體飽合結合後結合至ASIC1分子,則該測試抗體可能結合至與本發明參考抗-ASIC1抗體所結合之抗原決定位相同的抗原決定位。接而可進行其他例行實驗(例如肽突變與結合分析)以確認觀察測試抗體沒有結合是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定位,或若沒有觀察到結合是因為其空間障礙(或另一現象)。這類實驗係使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或技藝中可供使用的其他任何定量或定性抗體結合分析來進行。依據本發明的某些具體例,若例如在一個競爭性結合分析中測量一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一個抗體達至少50%,但較佳75%、90%或甚至99%,則兩個抗體結合至相同(或重疊)抗原決定位(參見,例如Junghans et al.,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者,若基本上所有在抗原中會減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合,則兩個抗體被視為是結合至相同抗原決定位。若減少或消除一抗體結合之僅有一部份胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合,則兩個抗體被視為具有”重疊的抗原決定位”。
為測定一個抗體是否與參考抗-ASIC1抗體競爭結合,以兩個方面來進行上述結合方法學:在第一個方面,容許參考抗體在飽和條件下結合至ASIC1分子(例如細胞表面表現的ASIC1),繼而評估測試抗體對ASIC1分子的結合。在第二個方面,容許測試抗體在飽和條件下結合至ASIC1分子,繼而評估參考抗體對ASIC1分子的結合。若在兩個方面中,僅有第一(飽和)抗體能夠結合至ASIC1分子,則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至
ASIC1。如技藝中具有通常技術者所了解,與參考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定位,但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰抗原決定位來阻斷參考抗體的結合。
用於製造單株抗體(包括完整人類單株抗體)的方法為技藝中已知的。任何此等已知方法可用於本發明的上下文中以製造特異結合至人類ASIC1的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他用於生成單株抗體的已知方法,首先分離出帶有人類可變區以及小鼠恆定區之對ASIC1具高親和力的嵌合抗體。如同在下面實驗節中,鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性,包括親和力、選擇性、抗原決定位等。小鼠恆定區取代成所欲的人類恆定區以生成本發明的完整人類抗體,例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4。儘管篩選出的恆定區可能會依據特定用途、可變區中的高親和力抗原-結合以及標的特異性特性而改變。
本發明的抗-ASIC1抗體以及抗體片段含括帶有由那些所述抗體變化而來,但仍保有結合人類ASIC1能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相較之下,此等變異抗體以及抗體片段包含有一或多個胺基酸添加、刪除或置換,但仍展現出基本上與所述抗體相等的生物活性。同樣地,當與所揭示的序列相較之下,本發明之抗-ASIC1抗體編碼DNA序列含括具有一或多個核苷
酸添加、刪除或置換,但仍編碼基本上與本發明之抗-ASIC1抗體或抗體片段生物等效的抗-ASIC1抗體或抗體片段的序列。上面詳述此等變異胺基酸以及DNA序列的實施例。
舉例而言,若2個抗原-結合蛋白或抗體是藥學等效物或藥學代用品,當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投與的吸收速率與程度未顯示出明顯差異(不論是單一劑量或多劑量),它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上沒有,它們將會被視為等效物或藥學代用品但不被視為生物等效,因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映出來,對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的,並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中,若兩個抗原-結合蛋白在臨床上就其安全性、純度以及效力而言並無有意義的差異,它們是生物等效的。
在一個具體例中,若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續治療而沒有這樣切換的情況下相比,在免疫原性上的臨床顯著變化,或減低有效性)時,它們是生物等效的。
在一個具體例中,若兩個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制而作用達致此等機制已知的程度,它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內和活體外方法證實。生物等效性測量法包括,例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體
內測試,其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度;(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測的活體外測試;(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試,其中隨著時間函數測量抗體(或其標的)之適當急性藥理學效用;以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明之抗-ASIC1抗體的生物等效變體可以藉由例如,製造各種殘基或序列置換,或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言,對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後防止形成不必要或不正確分子內雙硫橋的胺基酸。在其他上下文中,生物等效抗體可包括抗-ASIC1抗體變體,其含有會修飾抗體之糖化特性的胺基酸變化(例如消除或移除糖化的突變)。
依據本發明的某些具體例,抗-ASIC1抗體結合至人類ASIC1而不會結合至其他物種的ASIC1。本發明亦包括結合至人類ASIC1以及一或多個非人類物種的ASIC1的抗-ASIC1抗體。舉例而言,本發明的抗-ASIC1抗體可以結合至人類ASIC1並且視情況可能結合或不結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、馬來猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩ASIC1的一或多者。本發明亦包括透過人類ASIC1通道(但不是透過非人類ASIC1通道)選擇性阻斷酸誘導性離子流的抗-ASIC1抗體。或者,依據某些具體例,提供透過人類ASIC1通
道以及非人類(例如小鼠、大鼠等)ASIC1通道阻斷酸誘導性離子流的抗-ASIC1抗體(參見,例如本文實例5)。
本發明含括接合至一治療部分(”免疫接合物”)(諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)的抗-ASIC1單株抗體。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。用於形成免疫接合物的適當細胞毒性劑以及化學治療劑的實施例在該技藝中是已知的(參見例如WO 05/103081)。
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以是對一個標的多肽的不同抗原決定位具有特異性或者可能含有對超過一個標的多肽具有特異性的抗原-結合域。參見例如Tutt et al.,1999,J.Immunol.147:60-69;Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本發明的抗-ASIC1抗體可以連結至另一個功能性分子(例如另一個肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子一起表現。舉例而言,抗體或其片段在功能上可以連結(例如,藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體,諸如另一個抗體或抗體片段,以產生帶有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。舉例而言,本發明包括雙特異性抗體,其中免疫球蛋白的一臂對於人類ASIC1或其片段具有特異性,而免疫球蛋白的另一臂對第二治療標的具有特異性或接合至一個治療部分。
可以使用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域,其中第一與第二Ig CH3域因為至少1個胺基酸而彼此不同,以及其中與缺乏該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下,至少一個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中,該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有1個會減低或消除蛋白質A結合的突變,諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號;按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT;按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括:在IgG1抗體的情況下,D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT;按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I);在IgG2抗體的情況下,N44S、K52N以及V82I(IMGT;按照EU為N384S、K392N以及V422I);以及在IgG4抗體的情況下,Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT;按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式方面的變異在本發明範圍中是可預想的。
本發明提供包含有本發明之抗-ASIC1抗體或其抗原-結合片段的醫藥組成物。本發明的醫藥組成物可與適當載體、賦形劑以及其他提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起調配。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的配方:Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing
Company,Easton,PA。這些配方包括,例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳劑、乳化卡波蠟(具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
投與給患者的抗體劑量可以視患者的年齡與身材、標的疾病、病況、投藥途徑以及類似者來改變。較佳劑量通常是依據體重或體表面積來計算。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療與ASIC1活性有關的病況或疾病時,通常以約0.01至約20 mg/kg體重、更佳約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至3 mg/kg體重的單一劑量靜脈內投與本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。用於投與抗-ASIC1抗體的有效劑量與時間表可按經驗來決定;例如,可透過定期評估來監測患者進展,並據此調整劑量。此外,劑量的物種間標度可使用技藝中已知的方法來進行(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.5:1351)。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物,例如封裝在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見,例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括,但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與,例如藉由輸注或團
注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收,並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。
本發明的醫藥組成物可以使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外,關於皮下遞送,筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣空了,空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說,沒有可換式卡匣。更確切地來說,拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物,整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆型以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括,但不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTMI、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany),僅舉幾個為例。在皮下投遞
本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆型遞送裝置的實例包括,但不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL),僅舉幾個為例。
在某些情況下,醫藥組成物以控制釋放系統的方式被投遞。在一個具體例中,可使用泵(參見Langer,上文;Sefton 1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一具體例中,可使用聚合材料;參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一個具體例中,控制釋放系統被置放在組成物標的鄰近處,因此僅需要全身性劑量的一部分(參見,例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp.115-138中)。其他控制釋放系統在Langer,1990,Science 249:1527-1533的回顧中被討論。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公知方法製備。例如,可注射製品可例如,藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質,例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等,其可與適當助溶劑(諸如醇(乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50 mol)加合物)]等組合使用。有
關油性介質,採用例如芝麻油、大豆油等,其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
有利地,上述供口服或非經口使用的醫藥組成物被製備為呈適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括,例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。在1個單位劑量中,所含前述抗體的數量通常每劑型約5至約500 mg;尤其是呈注射型式,前述抗體就其他劑型而言較佳含有約5至約100 mg以及約10至約250 mg。
本發明的抗體尤其可應用於治療、預防及/或改善任何在個體之神經細胞中與ASIC1活性有關或由ASIC1活性所媒介或可藉由阻斷或減弱酸誘導性、ASIC1-媒介之離子流而治療的疾病或病症。可使用本發明抗-ASIC1抗體治療的例示性疾病及病症包括諸如下列的疼痛病況:痛覺疼痛及內臟疼痛(例如來自發炎性腸病/大腸急躁症、間質性膀胱炎、胰臟炎、子宮內膜異位、慢性骨盆疼痛症候群等的疼痛),以及與發炎有關的疼痛(例如發炎性肌肉疼痛)、多發性肌炎、手術後切口(例如外科手術後疼痛)、神經病變(例如糖尿病性神經病變)、坐骨神經痛、皰疹後神經痛、肌筋膜疼痛症候群(例如慢性肌筋膜疼痛)、關節炎、鐮狀細胞、腸神經缺血症、跛行性疼痛、骨折、燒傷、骨質疏鬆性骨折、痛風、偏頭痛、肌纖維痛、複雜性區域疼痛症候群、急性皰疹性疼痛等。本發明抗體亦可用於治療、預防及/或改善諸如下列的病況:例如
神經退化性疾病(例如脫髓鞘病,例如多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化等)、腦損傷(例如中風、創傷性腦損傷、腦酸血症)、神經學病症(例如痙攣、痙攣性疾患),以及精神疾患(例如抑鬱、焦慮症、創傷後壓力疾患、恐慌症等)。
本發明抗-ASIC1抗體亦可用於治療或預防與癌症有關的疼痛。”與癌症有關的疼痛”包括,例如骨癌疼痛,包括源自已轉移至骨之癌症(例如,乳癌、前列腺癌、肺癌、肉瘤、腎癌、多發性骨髓瘤等)的疼痛。”與癌症有關的疼痛”亦包括更普遍與諸如下列癌腫病況有關的疼痛:例如腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經膠瘤、骨肉瘤、結腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。本發明抗-ASIC1抗體亦可用於治療或預防由癌症療法或抗-癌醫藥治療所致或與癌症療法或抗-癌醫藥治療有關的疼痛,例如化療-誘發的神經病性疼痛,諸如由使用下列的治療所致或有關:太平洋紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇(Taxotere®);亞硝基脲、環磷醯胺、杜薩魯比辛、依畢魯比辛、5-氟尿嘧啶、托普替康、伊立替康、卡氮芥、雌氮芥,以及以鉑為主的化療化合物,諸如順鉑、卡鉑與異丙鉑。
本發明包括治療投藥方案,其包含將本發明抗-ASIC1抗體與至少一種其他治療有效成分組合投與。該等其他治療有效成分的非限制性實例包括其他ASIC抑制劑,諸如第二抗-ASIC1抗體、指向對抗不同ASIC組分的抗體(例如抗-ASIC2抗
體、抗-ASIC3抗體、抗-ASIC4抗體等)、肽ASIC抑制劑(例如狼蛛毒素-1[PcTx1]、APETx2等),及/或小分子ASIC抑制劑(例如艾米洛、A-317567等)。
其他可與本發明抗-ASIC1抗體組合而被有利投與的藥劑包括細胞激素抑制劑(包括小分子細胞激素抑制劑與抗體,其結合至諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18的細胞激素或其個別受體)、抗病毒劑、抗生素、止痛劑、皮質類固醇及/或NSAID組合。
其他治療活性成分可在本發明抗-ASIC1抗體投與之前、同時或之後被投與;(為本揭示內容之用,此等投與方案被視為本發明”組合”額外治療有效成分投與抗-ASIC1抗體)。
本發明的抗-ASIC1抗體也可以用來偵測及/或測量樣本中的ASIC1,或表現ASIC1的細胞,以供診斷之用。舉例而言,抗-ASIC1抗體或其片段可以用來診斷特徵在於ASIC1異常表現(例如過度表現、不足表現、缺乏表現等)的病況或疾病。有關ASIC1的例示性診斷分析可包含,例如令得自於一患者的樣本與本發明之抗-ASIC1抗體接觸,其中抗-ASIC1抗體標定有可偵測到的標記或報導分子。或者,未標定的抗-ASIC1抗體可以組合本身可被偵測到標定之二級抗體一起組合使用於診斷應用。可偵測到的標記或報導分子可以是放射性同位素,諸如3H、14C、32P、35S或125I;螢光或化學發光部分,諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅;或酵素,諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶,或螢光素
酶。可用來偵測或測量樣本中的ASIC1的特定例示性分析包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞選別(FACS)。
依據本發明,可用於ASIC1診斷分析中的樣本包括任何可得自於患者的組織或體液樣本,其在正常或病理狀態下含有可偵測數量的ASIC1蛋白或其片段。一般來說,測量ASIC1在自健康患者(例如未罹患與異常ASIC1濃度或活性有關之疾病或病況的患者)所得到之特定樣本中的濃度以在開始時建立基線,或標準ASIC1濃度。ASIC1的這個基線濃度接而可以與得自於被懷疑帶有與ASIC1相關疾病或病況之個體的樣本中所測得的ASIC1濃度來比對。
提出下列實施例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者,且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的正確性,但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明,否則份為重量份,分子量為平均分子量,溫度為攝氏度,而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
為製造抗-人類ASIC1抗體,使用DNA免疫程序,其中編碼全長人類ASIC1的DNA質體與編碼佐劑的個別質體一起被皮內注射至VELOCIMMUNE®小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,
Inc.,Tarrytown,NY)。接著注射部位被電穿孔以引起質體的宿主標轉染。VELOCIMMUNE®小鼠被用來免疫,其包含編碼人類免疫球蛋白重鏈與κ輕鏈可變區但缺少內源性小鼠asicla基因的DNA。使用經工程化以表現人類ASIC1的細胞藉由細胞結合分析監控抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時,收取脾臟細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞株。篩選並挑選融合瘤細胞株而鑑定出會生產ASIC1-特異性抗體的細胞株。使用此技術獲得數種抗-ASIC1嵌合抗體(亦即具有人類可變域及小鼠恆定域的抗體);以此方法所製造的例示性抗體命名如下:H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、H3M6715N、H3M6720N、H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N,及H3M7118N。
如US 2007/0280945A1中所述,亦在不融合至骨髓瘤細胞的情況下直接由抗原-陽性B細胞分離抗-ASIC1抗體。使用此方法,獲得數種完整人類抗-ASIC1抗體(亦即具有人類可變域與人類恆定域的抗體);以此方法所製造的例示性抗體命名如下:H4H6362P、H4H6363P、H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、H4H6380P、H4H6381P,及H4H6383P。
依據本實施例方法所製造的例示性抗-ASIC1抗體的某些生物特性詳細描述於下面的實施例中。
表1顯示所選抗-ASIC1抗體的重鏈與輕鏈可變區胺
基酸序列及其對應抗體標識符號。
抗體在本文中通常以下列命名法來意指:Fc前綴(例如”H4H”、”H1M”、”H2M”),接著是數字標識符號(例如表1中所示的”6712”或”6362”),然後為”P”或”N”字尾。因此,依據這個命名法,抗體在本文可參照為例如”H1M6712N”或”H4H6362P”。本文中所用抗體命名的H4H、H1M及H3M前綴表示抗體的特定Fc區。例如,”H1M”抗體具有小鼠IgG1 Fc,而”H4H”抗體具有人類IgG4 Fc。如同技藝中具有通常技術者所理解,H1M或H3M抗體可轉換成H4H抗體,且反之亦然,但在任何情況下,可變域(包括CDR)-由表1中所示數字標識符號所指-維持相同。
為了進一步鑑別抗-ASIC1抗體,使用流式細胞儀(FACS)測定其結合下列的能力:(a)經穩定轉染以過度表現全長人類ASIC1(3T3/hASIC1;NCBI存取編號NP_001086.2的胺基酸1-528[SEQ ID NO:401])的小鼠纖維母細胞3T3細胞株、(b)經穩定轉染以過度表現全長小鼠ASIC1a(3T3/mASIC1;NCBI存取編號NP_033727的胺基酸1-526)的3T3細胞株,或(c)ND7細胞株(ECACC,#92090903),其為小鼠神經母細胞瘤與內源性地表現大鼠ASIC1的大鼠背根神經節的融合細胞株。ND7細胞是藉由以含有1 mM二丁醯基-cAMP(Cat.No.sc-201567A,Santa Cruz
Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)的低血清培養基(0.5% FBS)置換培養基而分化。FACS結合是測試一些抗體皆結合至未分化ND7細胞以及已分化ND7細胞。
為實施FACS結合實驗,使用PBS中的1 mM EDTA收集貼附細胞,接著洗滌,並且再懸浮於含有5% FBS的冷PBS中。關於個別結合實驗,將各抗-ASIC1抗體(呈10 mM純化抗體之最終濃度,或就結合至3T3/hASIC1細胞為3.3 nM抗體上清液而就結合至3T3/mASIC1或ND7細胞為5 nM)添加至含有5% FBS之500 μl PBS中的250,000個細胞。在室溫下培育20分鐘之後,繼而將辨識人類Fc(Cat.No.109-136-098,Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)或小鼠Fc(Cat.No.550826,BD Biosciences,San Jose,CA)並接合至異藻藍素的二級抗體以13.3 nM的最終濃度添加至細胞混合物。在冰上培育20分鐘之後,洗滌細胞並且再懸浮於含有5% FBS的PBS中,然後在流式細胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences,San Jose,CA)上分選並分析,以測定候選抗體對測試細胞株的相對結合。比較以抗-ASIC1抗體染色之細胞的直方圖與彼等以單獨二級抗體染色之細胞的直方圖。使用FlowJo軟體(Tree Star,Ashland,OR)計算ASIC1訊號對單獨二級抗體的百分比。若被圈閘超過10%,則以抗-ASIC抗體染色的樣本被記錄為FACS陽性。若被圈閘低於1%,則以抗-ASIC1抗體染色的樣本被記錄為FACS陰性。若被圈閘介於1%至10%,則以抗-ASIC1抗體染色的樣本被記錄為弱。抗-ASIC1抗體對3T3/hASIC1細胞、3T3/mASIC1細胞以及ND7細胞的結合特異性被歸納在表2中(ND=未測定)。
選定抗體對3T3/hASIC1細胞的結合親和力係進一步使用自其可估算約略EC50值的多重抗體濃度(67 nM、6.7 nM、0.67 nM、67 pM及6.7 pM)藉由FACS來檢驗。抗-ASIC1抗體所觀察到的平均螢光強度(MFI)訊號扣除背景訊號(單獨二級抗體)並且使用GraphPad Prism作為抗體濃度的函數來作圖,以決定EC50值(表3)。
如表2中所示,25個測試抗體中的十七個證實特異性結合至3T3/hASIC1細胞株;10個測試抗體中的八個證實陽性結合至3T3/mASIC1a細胞;10個測試抗體中的六個證實陽性結合至未分化ND7細胞株;而7個測試抗體中的五個證實陽性結合至已分化ND7細胞株。值得注意的是,某一個抗體(H3M7118N)證實弱結合至3T3/mASIC1以及未分化ND7細胞株兩者,但陽性結合至3T3/hASIC1細胞。如表3中所示,以多重抗體濃度來測試之抗-ASIC1抗體證實對於結合至3T3/hASIC1細胞具有約略EC50值低至23 pM的高親和力FACS結合。
為鑑定抗-ASIC1抗體對酸媒介之細胞訊號傳遞的功能性抑制,使用細胞株HEK293 CL:1F10(1F10)實施細胞鈣流測量的分析,細胞株HEK293 CL:1F10(1F10)經暫時轉染以表現人類ASIC1(NCBI存取號碼NP_0010862.2的胺基酸1-528[SEQ ID NO:401])。這個細胞株是由經穩定轉染以表現人類Par2的親代株HEK293/D9所產生。經轉染細胞培育在37℃、5% CO2下兩天,接著以每孔100,000個細胞的濃度重新置入96孔黑色透明底部分析盤中。在室溫下容許細胞貼附至盤20分鐘,接著在37℃、5% CO2下培育過夜。
Fluo-4 NW鈣分析套組(Invitrogen,# F36206)被用來
測定受低pH緩衝液所活化的細胞中,細胞內鈣流的程度。分析緩衝液是依據製造商說明書來製備。將五十μl丙磺舒添加至5 mL緩衝液C(2xHBSS)中,其接而被加入組分A(Fluo-4染料)。在Fluo-4染料中將抗-ASIC1抗體稀釋至250 nM的濃度以供單點阻斷分析使用。阻斷因低pH緩衝液刺激所致之鈣流的抗體在這個分析中進一步使用多重抗體濃度來鑑定。在染料中將抗-ASIC1抗體稀釋至250 nM的濃度,而1:3連續稀釋的8個點(範圍為250至0.1 nM)被用來測定各抗體的阻斷EC50。自分析盤移除含有細胞的細胞培養基並添加50 μL的Fluo-4染料,其含有抗-ASIC1抗體。在37℃、5% CO2下培育盤歷時1小時,之後以FLIPR Tetra(Molecular Devices)讀取。
將緩衝液C的pH調整至pH 5.0或pH 5.5並在添加至細胞前添加至貯存盤。接著,FLIPR Tetra以每秒鐘50 μL的速度將50 μL的低pH緩衝劑從貯存盤加至分析盤中的細胞。在緩衝液添加前(讀取前)10秒至緩衝液添加後歷時100秒鐘每孔所產生的鈣訊號係由FLIPR Tetra使用激發波長設定為470-490 nm以及發射波長設定為515-575 nm來測定。計算在緩衝液添加之後所觀察到的最大值以及在整個分析期間(包括讀取前以及緩衝液添加後)的最小值間的差異並使用GraphPad Prism繪圖。結果顯示於表4與5中。
表5:在pH 5.5與5.0下由抗-ASIC1抗體所致的酸媒介之細胞性鈣流的劑
量依賴性阻斷
如表4中所示,24個抗體中的兩個,H3M6721N與H1M6718N,在pH 5.5以及pH 5.0下於250 nM的單一濃度皆表現出大於30%的鈣流阻斷(陽性),而某一個抗體(H3M6760N)僅在pH 5.5下表現大於30%阻斷。在pH 5.5下24個抗體中的十二個以及在pH 5.0下24個抗體中的17個於250 nM的單一濃度測試未表現可測得的阻斷(陰性)。在pH 5.5下24個抗體中的9個以及在pH 5.0下24個抗體中的5個於250 nM的單一濃度測試表現降低鈣流介於10-30%(弱)。
如表5中所示,在pH 5.5下劑量依賴性阻斷所測試的10個抗體中的八個表現27%至78%的鈣流阻斷百分比以及0.1 nM至6 nM的IC50值。在pH 5.5下劑量依賴性鈣流阻斷所測試的抗體中的兩個,H4H6380P與H4H6381P,表現無可測得的阻斷。在pH 5.0下劑量依賴性阻斷所測試的10個抗體中的兩個,H3M6721N與H1M6718N,分別表現25%與48%的鈣流阻斷,但IC50值無法測定(IC*),儘管顯示為劑量依賴性。在pH 5.0下劑量依賴性阻斷所測試的10個抗體中的一個,H3M6760N,顯示56%的鈣流阻斷以及1 nM的IC50值。在pH 5.0下劑量依賴性阻斷所測試的10個抗體中的五個顯示無劑量依賴性阻斷,但在各個測試抗體濃度下阻斷10%至25%的鈣流。在pH 5.0下劑量依賴性阻斷所測試的10個抗體中的兩個,H4H6380P與H4H6381P,表現無可測得的阻斷。
Q-Patch(Sophion Bioscience,Inc.,Ballerup,Denmark),一種以微晶片為基礎的自動膜片-箝制系統,被用來測定在經穩定轉染HEK293細胞株(表現全長人類ASIC1通道(HEK/hASIC1;NCBI存取編號NP_001086.2的胺基酸1-528))中抑制人類ASIC1流的能力,或在經穩定轉染3T3細胞株(表現全長小鼠ASIC1a通道(3T3/mASIC1;NCBI存取編號NP_033727的胺基酸1-526)中抑制小鼠ASIC1a流的能力。
HEK/hASIC1細胞培養於DMEM高葡萄糖培養基、
10%胎牛血清(FBS)、1%非必需胺基酸以及500 μg/mL Geneticin®(Invitrogen,# 10131)中。3T3/mASIC1a細胞培養在DMEM高葡萄糖培養基、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(Invitrogen,#10378-016以)及400 μg/mL Geneticin®中。在記錄當天,以Detachin細胞脫離溶液(Genlantis,San Diego,CA,# T100100)收取細胞,離心並再懸浮於1.4 mL無血清溶液[CHO-SFM-II培養基(Invitrogen,# 31033)、HEPES 25 mM與青黴素/鏈黴素100單位/mL]中。接著在室溫(RT)下於振動器上培育細胞懸浮液40分鐘。在一個實驗中同時進行兩個或三個抗-ASIC1抗體以及一個對照抗體。因此,在培育結束時,將細胞懸浮液分散至4個管中(每管300 μL中約5x105個細胞)並在管中將抗體稀釋至最終濃度100 nM以供單點實驗之用,或一個濃度範圍以供劑量反應實驗之用,並接著在RT下於振動器上培育20分鐘。在培育結束時,將細胞加載至Q-Patch上。
首先在pH 7.4下以含有0.2%(w/v)牛血清白蛋白的緩衝液(NaCl 140 mM、KCl 4 mM、MgCl2 1 mM、CaCl2 2 mM、葡萄糖5 mM及HEPES 10 mM)(細胞外緩衝液)灌注細胞,並添加針對單點實驗最終濃度為100 nM或針對劑量反應實驗某個濃度範圍的感興趣抗體且允許培育約3分鐘。接著,當細胞維持在-80 mV保持電位,藉由添加細胞外緩衝液調整至pH 6.0引起人類ASIC1流歷時一秒鐘。在每次於Q-Patch上記錄之後添加三十μM的艾米洛以證實細胞在整個分析持續期間均具有反應性。細胞內紀錄溶液的組成為CsCl 140 mM、MgCl2 4 mM、EGTA 10 mM及HEPES 10 mM;以CsOH調整至pH 7.3。
以四重複的方式同時測試所有抗-ASIC1抗體與對照不相干抗體。通道阻斷係測定為在抗-ASIC1抗體存在下的流抑制百分比相對於在對照不相干抗體存在下之流抑制百分比,相對於多阻斷實驗來進行平均。結果歸納於表6中。
如表6中所示,於Q-Patch上在100 nM下所測試23個抗體中的十七個證實人類ASIC1流的功能性抑制,而17個抗體中的9個顯示大於70%的阻斷。進一步測試十一個抗體(H1M6718N、H3M6720N、H3M6721N、H3M6726N、H4H6366P、H1M7101N、H3M7102N、H2bM7103N、H3M7118N、H4H6718N及H4H6721N2)在不同濃度下於Q-Patch上抑制人類ASIC1流的能力,並測試9個抗體(H4H6718N、H3M6720N、H3M6721N、H1M7101N、H3M7102N、H2bM7103N、H3M6726N、H4H6366P,及H3M7118N)抑制小鼠ASIC1流的能力。這些抗體所觀察到的阻斷百分比歸納於表7(人類ASIC1)及表8(小鼠ASIC1)中。
如表7中所示,某一個抗體,H3M6726N,以大於10 nM的表觀IC50阻斷人類ASIC1流,而六個抗體(H3M6720N、H3M6721N、H4H6366P、H3M7102N、H2bM7103N及H3M7118N)以10 nM或更低的表觀IC50阻斷人類ASIC1流。這些抗體中的四個,H1M6718N、H1M7101N、H4H6718N及H4H6721N2,以小於1 nM的表觀IC50阻斷人類ASIC1流。
如表8中所示,針對表現小鼠ASIC1的細胞測試9個抗ASIC-抗體中的五個(H4H6718N、H3M6721N、H1M7101N、H3M7102N及H3M7118N)在最高抗體測試濃度下抑制90至100%的小鼠ASIC1流,而四個抗體(H3M6720N、H3M6726N、H4H6366P,及H2bM7103N)僅抑制流達約80%或更少。H3M7118N、H2bM7103N、H3M6720N及H3M6721N以小於25 nM的表觀IC50阻斷小鼠ASIC1流。H4H6718N以小於1 nM的表觀IC50阻斷人類ASIC1流。
Q-Patch亦用來測定抗-ASIC1抗體H4H6718N在ND7/23細胞株(ECACC,#92090903)中抑制ASIC1流的能力,ND7/23細胞株是小鼠神經母細胞瘤與內源性地表現大鼠ASIC1的大鼠背根神經節的融合細胞株。
ND7/23細胞培養在含有10% FBS、2 mM麩醯胺酸、1%青黴素-鏈黴素(Invitrogen,#10378-016)的DMEM高葡萄糖培養基。在種植後之日,藉由將培養基置換為含有1 mM二丁醯基
-cAMP(Santa Cruz,#sc-201567A)的低血清培養基(0.5% FBS)。在記錄當天,使用StemPro Accutase細胞解離試劑(Invitrogen,# A11105-01)收取細胞、離心,並再懸浮於1 mL細胞外緩衝液。接著將細胞懸浮液加載至Q-Patch上。
首先在pH 7.4下以含有0.2%(w/v)牛血清白蛋白的細胞外緩衝液(NaCl 140 mM、KCl 4 mM、MgCl2 1 mM、CaCl2 2 mM、葡萄糖5 mM及HEPES 10 mM,以NaOH調整至pH 7.4)灌注細胞6分鐘以穩定膜片。接著,當細胞維持在-80 mV保持電位,藉由添加細胞外緩衝液調整至pH 6.0引起大鼠ASIC1流歷時一秒鐘。在pH 6下於細胞外緩衝液中引起大鼠ASIC1流2次,接著在相同細胞外緩衝液(含有10 nM同型對照抗體或10 nM抗-ASIC1抗體(H4H6718N、H3M6720N、H2bM7103N、H3M6726N,H4H6366P及H3M7118N))中引起另外兩次。在抗-ASIC1抗體紀錄後,對細胞添加10 nM的選擇性ASIC1拮抗劑PcTx1(Alomone Labs,# STP-200)以評估ASIC1-特異性流對於細胞外緩衝液在pH6所引起的流的影響。細胞內紀錄溶液的組成為CsCl 120 mM、NaCl 15 mM、EGTA 10 mM及HEPES 10 mM;以CsOH調整至pH 7.3。
通道阻斷係測定為在抗-ASIC1抗體存在下流抑制百分比相對於在施用抗體前對照不相干抗體存在下之流抑制百分比,並且與在PcTx1存在下流抑制百分比相比較,其被用來定義最大ASIC-1特異性流阻斷。結果歸納於表9中。
如表9中所示,H4H6718N證實在已分化ND7/23細胞中以10 nM的濃度100%抑制大鼠ASIC1流(n=9),而H3M6720N以及H3M7118N分別抑制流達約43%以及65%。三個抗體(H2bM7103N、H3M6726N及H4H6366P)在這些實驗中未證實於10 nM下明顯抑制大鼠ASIC1流。
Port-a-Patch(Nanion Technologies Inc.,North Brunswick,NJ),一種以微晶片為基礎的自動膜片-箝制系統,被用來測定在經穩定轉染HEK293細胞株(表現全長人類ASIC1通道(HEK/hASIC1;NCBI存取編號NP_001086.2的胺基酸1-528))中抑制人類ASIC1流所需的抗-ASIC1抗體H1M6718N半最大抑制濃度(IC50)。
HEK/hASIC1細胞培養於DMEM高葡萄糖培養基、10%胎牛血清(FBS)、1%非必需胺基酸以及500 μg/mL Geneticin®(Invitrogen,# 10131)中。在記錄當天,以Detachin細胞脫離溶液(Genlantis,San Diego,CA,# T100100)收取細胞,離心並再懸浮於
500 μL細胞外緩衝液(NaCl 140 mM、KCl 4 mM、MgCl2 1 mM、CaCl2 2 mM、葡萄糖5 mM及HEPES 10 mM,以NaOH調整至pH 7.4)中。將細胞懸浮液加載至Port-a-Patch上。
首先在pH 7.4下以含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白的細胞外緩衝液灌注細胞歷時5分鐘以穩定膜片。接著,當細胞維持在-80 mV保持電位,藉由添加細胞外緩衝液調整至pH 6.0引起人類ASIC1流歷時三秒鐘。在pH 6.0細胞外緩衝液中引起人類ASIC1流3次(間隔2分鐘)而在pH 6.0細胞外緩衝液(含有100 nM同型對照抗體或10、3、1、0.8或0.6 nM抗-ASIC1抗體H1M6718N)中引起3次。在完成pH刺激的測量後添加三十μM的艾米洛以證實細胞在整個分析持續期間均具有反應性。細胞內紀錄溶液的組成為CsCl 120 mM、NaCl2 15 mM、EGTA 10 mM及HEPES 10 mM;以CsOH調整至pH 7.3。
通道阻斷係測定為在抗-ASIC1抗體存在下流相對於在施用抗體前之流的抑制百分比,相對於多阻斷實驗來進行平均。
人類ASIC1流受10、3、1、0.8及0.6 nM之H1M6718N阻斷的百分比歸納於表10中。
H1M6718N在860 pM的估算IC50時顯示人類ASIC1的劑量依賴性抑制,而同型對照抗體在100 nM濃度下顯示不抑制流。
在本實施例中,在乙酸誘發的腹縊模型中評估抗-ASIC1抗體H1M6718N減弱內臟疼痛的能力。來自Jackson實驗室(Bar Harbor,ME)的野生型C57BL/6小鼠被使用於本實驗中。分組小鼠(n=10)接受10 mg/kg(s.c.)同型對照mAb或1或10 mg/kg(s.c.)的H1M6718N。在抗體投與24小時之後,所有組別接受腹膜內注射0.6%乙酸,乙酸會產生刻板的腹部抽蓄行為(例如束緊),其由盲化觀察人員計數至多到注射後30分鐘。這個實驗的結果,表示為在腹縊總數中的變化百分比,顯示於表11中(所有數據表示為平均值±SEM)。
這個實施例證實,顯示會強力阻斷酸誘導性ASIC1離子流的抗-ASIC1抗體(H1M6718N)(參見實施例4至6)在小鼠模
型中有效減少酸誘導性內臟疼痛反應。
在本實施例中,評估抗-ASIC1抗體(H1M6718N)對於有害捏擰/壓力刺激反應產生拮抗作用的能力。
來自Jackson實驗室(Bar Harbor,ME)的野生型C57BL/6小鼠被使用於本實驗中。分組小鼠接受1、10或40 mg/kg(s.c.)的H1M6718N或10 mg/kg(n=10)同型對照抗體。在抗體投與24小時之後,各分組(n=10)測試其機械痛覺閾值,其是藉由對於腓腸肌或尾巴捏擰的縮爪閾值(模型#2455,IITC Life Science,Woodland Hills,CA)來測量。除了彼等以同型對照處理的小鼠以外,在以1 mg/kg以及10 mg/kg的H1M6718N處理的小鼠中測量尾巴機械痛覺。除了彼等以同型對照處理的小鼠以外,在以10 mg/kg以及40 mg/kg的H1M6718N處理的小鼠中測量腓腸肌的機械痛覺。這些實驗的結果,表現為呈公克之捏擰的縮爪閾值(各分組小鼠的平均值±SEM),顯示於第1圖中,A區與B區。
就兩個實驗而言,相較於同型對照,H1M6718N處理在所測試的最高抗體濃度下縮爪閾值如藉由ANOVA(尾部為p=0.0015而腓腸肌為p=0.0228)以及邦弗朗尼事後檢定(*-p<0.05)所測定明顯增加(在尾巴實驗中10 mg/kg[第1圖,A區]以及在腓腸肌實驗中40 mg/kg[第1圖,B區])。
在本實施例,評估抗-ASIC1抗體H1M6718N與H4H6721N2減弱因為注射酸性食鹽水(pH 5.5)或3%鹿角膠所引起的肌肉疼痛的能力。來自Jackson實驗室(Bar Harbor,ME)的野生型C57BL/6小鼠被使用於這些實驗中。
在第一個實驗中,分組小鼠接受10 mg/kg(s.c.)的同型對照抗體或10 mg/kg(s.c.)的H1M6718N。在抗體投與24小時之後,所有小鼠接受肌肉內注射酸性食鹽水(pH 5.5)至腓腸肌,其造成數日的強烈原始機械痛覺過敏,如藉由對肌肉捏擰的縮爪閾值(模型#2455,IITC Life Science,Woodland Hills,CA)來測量。結果顯示於第2圖中。
在第二個實驗中,各分組小鼠接受10 mg/kg(s.c.)同型對照mAb;10或40 mg/kg(s.c.)的H1M6718N;或10或30 mg/kg(s.c.)的H4H6721N2。在抗體投與24小時之後,所有小鼠接受肌肉內注射3%鹿角膠(w/v)至腓腸肌,其造成數日的強烈原始機械痛覺過敏,如藉由對肌肉捏擰的縮爪閾值(模型#2455,IITC Life Science,Woodland Hills,CA)來測量。結果顯示於第3A圖(10及40 mg/kgH1M6718N)以及第3B圖(10及30 mg/kg H4H6721N2)中。
這些實驗的結果,如第2圖及第3圖中所示,表示為相對於基線的縮爪閾值的變化百分比(所有數據表示為平均值±SEM)。就兩個實驗而言,藉由重複測量ANOVA觀察H1M6718N處理的明顯主要效用(酸性食鹽水為p=0.0363而鹿角膠為0.0193)。就第二個實驗來說,藉由重複測量ANOVA觀察H1M6721N2處理的明顯主要效用(p=0.0018)。就指定時間點來說,依據邦弗朗尼事後檢定*=p<0.05而**=p<0.01。因此,兩種抗體均
證實在本文所用實驗系統中減輕肌肉疼痛的實質效力。
在本實施例中,評估抗-ASIC1抗體H4M6718N減輕由於全身性暴露於化療劑紫杉醇所致的神經病性疼痛的能力。來自Jackson實驗室(Bar Harbor,ME)的野生型C57BL/6小鼠被使用於此等實驗中。在基線行為試驗後,所有小鼠在開始治療給藥前接受紫杉醇(4 mg/kg,每隔一天總計4次給藥)。分組小鼠接受30 mg/kg(s.c.)的同型對照mAb、30 mg/kg(s.c.)的H1M6718N或100 mg/kg(s.c.)佳巴本汀。在每週行為試驗前24小時投予抗體,且在每週行為試驗前2小時投與佳巴本汀。使用佛瑞纖維(#58011,Stoelting Co.,Wood Dale,IL)依據狄克森的上下法(Chaplan et al.,J Neurosci Methods.53(1):55-63)測量所有分組的觸誘發痛。這個實驗的結果顯示於第4圖中(所有數據表示為平均值±SEM)。
如第4圖中所示,相較於同型對照組,藉由重複測量ANOVA觀察H1M6718N處理以及佳巴本汀的明顯主要效用(H4H6718N為p=0.0003,佳巴本汀為p<0.0001)。因此,本實施例暗示本發明抗-ASIC1抗體在減弱化療誘發的疼痛反應高度有效。
總結來說,前述實施例的結果支持抗-ASIC1阻斷抗體使用於治療各種疼痛病況。
本發明就範圍來說並不受到此處所述的特定具體例囿限。更確切地說,除了此處所述者以外,本發明的各種修飾對於那些習於技藝者來說由前面發明說明以及隨附圖式來說是清楚
的。此等修飾意欲落在隨附申請專利範圍的範疇內。
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<223> 合成
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<212> PRT
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 379
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 385
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 386
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 390
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 391
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 392
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 393
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 394
<210> 395
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 395
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 396
<210> 397
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 397
<210> 398
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 398
<210> 399
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 399
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 400
<210> 401
<211> 528
<212> PRT
<213> 人類
<400> 401
Claims (16)
- 一種單離抗體或其抗原-結合片段,其特異性地結合細胞表面表現的酸敏感離子通道-1(acid sensing ion channel 1;ASIC1)(SEQ ID NO:401),其中該抗體或抗原-結合片段包含:(a)重鏈可變區(HCVR)的三個互補決定區(CDR),該重鏈可變區具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:2、34、50、66、114、130、146、162、194、210、242、258,及274;以及(b)輕鏈可變區(LCVR)的三個CDR,該輕鏈可變區具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:10、42、58、74、122、138、154、170、202、218、250、266及282。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段,其中使用螢光活化細胞分選(FACS)測量,該抗體或其抗原-結合片段以1nM或更低的EC50特異性地結合細胞表面表現的ASIC1。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段在表現人類ASIC1的細胞中抑制酸誘導性、ASIC1-媒介的離子流。
- 如申請專利範圍第3項之抗體或抗原-結合片段,其中使用FLIPR分析測量,該抗體或其抗原-結合片段在表現ASIC1的細胞中於約5.0至約6.0的pH下,以6nM或更低的IC50抑制酸誘導性細胞鈣流。
- 如申請專利範圍第3項之抗體或抗原-結合片段,其中使用膜片-箝制分析測量,該抗體或其抗原-結合片段於約5.0 至約6.0的pH下,以10nM或更低的IC50抑制酸誘導性離子流。
- 一種醫藥組成物,包含如申請專利範圍第3項之抗體或抗原-結合片段以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
- 一種如申請專利範圍第6項之醫藥組成物於製備治療或減輕疼痛的醫藥品的用途。
- 如申請專利範圍第7項之用途,其中該疼痛為痛覺疼痛或內臟疼痛。
- 如申請專利範圍第8項之用途,其中該疼痛與選自由下列所組成之群的病況相關:發炎、手術後切口、神經病變、骨折、燒傷、骨質疏鬆性骨折、骨癌、痛風、偏頭痛以及肌纖維痛。
- 如申請專利範圍第7項之用途,其中該疼痛為與癌症有關的疼痛或化療誘發的疼痛。
- 一種單離抗體或其抗原-結合片段,其與一參考抗體競爭結合至細胞表面表現的ASIC1,該參考抗體包含選自由SEQ ID NO:2/10;34/42;50/58;66/74;114/122;130/138;146/154;162/170;194/202;210/218;242/250;258/266及274/282所組成群組之含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR之HCVR/LCVR序列對(sequence pair),其中該單離抗體或其抗原-結合片段包含含SEQ ID NO:34/42之HCVR/LCVR序列對的三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR。
- 如申請專利範圍第11項之抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段在表現人類ASIC1的細胞中抑制酸誘導性ASIC1-媒介的離子流。
- 一種單離抗體或其抗原-結合片段,其特異性地結合細胞表面表現的ASIC1(SEQ ID NO:401),其中該抗體或抗原-結合片段包含選自由SEQ ID NO:2/10;34/42;50/58;66/74;114/122;130/138;146/154;162/170;194/202;210/218;242/250;258/266及274/282所組成之HCVR/LCVR胺基酸序列對群組的三個重鏈及三個輕鏈CDR。
- 如申請專利範圍第13項之單離抗體或抗原-結合片段,其中該抗體或抗原-結合片段包含分別選自由下列所組成之群的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域:SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16;36-38-40-44-46-48;52-54-56-60-62-64;68-70-72-76-78-80;116-118-120-124-126-128;132-134-136-140-142-144;148-150-152-156-158-160;164-166-168-172-174-176;196-198-200-204-206-208;212-214-216-220-222-224;244-246-248-252-254-256;260-262-264-268-270-272及276-278-280-284-286-288。
- 一種特異性地結合細胞表面表現之ASIC1(SEQ ID NO:401)的抗體或其抗原-結合片段於製備治療或減輕疼痛的醫藥品之用途,其中該抗體或抗原-結合片段包含選自由SEQ ID NO:2/10;34/42;50/58;66/74;114/122;130/138;146/154;162/170;194/202;210/218;242/250;258/266及274/282所組成之HCVR/LCVR胺基酸序列對群組的重鏈及輕鏈CDR。
- 如申請專利範圍第15項之用途,其中該抗體或其抗原-結 合片段包含分別選自由下列所組成之群的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域:SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16;36-38-40-44-46-48;52-54-56-60-62-64;68-70-72-76-78-80;116-118-120-124-126-128;132-134-136-140-142-144;148-150-152-156-158-160;164-166-168-172-174-176;196-198-200-204-206-208;212-214-216-220-222-224;244-246-248-252-254-256;260-262-264-268-270-272及276-278-280-284-286-288。
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