MXPA06014299A - Anticuerpos contra interleucina-13 humana y uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos contra interleucina-13 humana y uso de los mismos.

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Tania Shane
Xiang-Yang Tan
Marion T Kasaian
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Geertruida M Veldman
Kimberly Ann Marquette
Amy Szepui Tam
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Lori J Fitz
Angela M Widom
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Abstract

Esta invencion se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanizados, y fragmentos de los mismos que se unen al antigeno, que se unen a INTERLEUCINA-13 (IL-13), en particular, IL-13 humana, y su usos en la regulacion de las respuestas inmunes mediadas por IL-13. Los anticuerpos descritos en la presente son utiles en el diagnostico, prevencion y/o tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un apaciente humano, uno o mas trastornos asociados con la IL-13, por ejemplo, trastornos respiratorios (por ejemplo, asma); desordenes atopicos (por ejemplo, rinitis alergica), condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, dermatitis atopica, y organos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias (IBD)), asi como trastornos fibroticos y cancerigenos.

Description

ANTICUERPOS CONTRA INTERLEUCINA-13 HUMANA Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanizados y fragmentos de mismos que se unen al antígeno, que se unen a la interleuquina -13 (IL-13), en particular, la IL-13 humana, y sus usos en la regulación de las respuestas inmunes mediadas por la IL-13. Los anticuerpos descritos en la presente invención son útiles para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, uno o más trastornos asociados con la I -13, por ejemplo, los trastornos respiratorios (por ejemplo, el asma) ; los trastornos atópicos (por ejemplo, la rinitis alérgica) ; las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, la dermatitis atópica) , y los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD)), al igual que los trastornos fibróticos y cancerosos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La INTERLEUCINA-13 (IL-13) es una citoquina segregada por los linfocitos T y los mastocitos (McKenzie et al. (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41). La IL-13 comparte diversas REF. 177501 actividades biológicas con la IL-4. Por ejemplo, ya sea la IL-4 o bien la IL-13 pueden provocar un cambio en el isotipo de la IgE de las células B (Tomkinson et al. (2001) J. Immunol . 166:5792-5800). De manera adicional, se informaron niveles más altos de la superficie celular CD23 y del suero CD23 (sCD23) en los pacientes asmáticos (Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc . 20:119-25) . Demás, ya sea la IL-4 o bien la IL-13 pueden regular regular por aumento la expresión de MHC de clase II y el receptor IgE de baja afinidad (CD23) en las células B y en los monocitos, lo cual da como resultado una mejor presentación de los antigenos y una función regulada de los macrófagos (Tomkinson et al., supra ) . Es importante que, ya sea la IL-4 o bien la IL-13 puede aumentar la expresión de VCAM-1 en las células del endotelio, lo cual facilita el reclutamiento preferencial de los eosinófilos (y de las células T) en los tejidos de las vías aéreas (Tomkinson et al., supra ) . Ya sea la IL-4 o bien la IL-13 también pueden incrementar la secreción de moco en las vías aéreas, lo cual puede exacerbar la sensibilidad de las vías aéreas (Tomkinson et al., supra ) . Estas observaciones sugieren que a pesar de que la IL-13 no es necesaria para, o inclusive capaz de, inducir el desarrollo de Th2, la IL-13 puede desempeñar un papel clave en el desarrollo de la eosinofilia en las vías aéreas y AHR (Tomkinson et al., supra ; ills-Karp et al. (1998) Science 282:2258-61) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud provee, entre otros, agentes aglutinantes que son antagonistas de la IL-13, incluyendo anticuerpos y los fragmentos de los mismos que se unen al antígeno, que se unen a IL-13, en particular, la IL-13 humana, con alta afinidad y especificidad. Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que se unen al antígeno de la presente descripción también se denominan en la presente invención como "anticuerpos anti-IL-13" y "fragmentos de los mismos," respectivamente. En una modalidad, el anticuerpo de anti-IL-13 o el fragmento del mismo reduce, neutraliza y/o antagoniza por lo menos una actividad asociada a la IL-13. Por ejemplo, el anticuerpo de anti-IL-13 o el fragmento del mismo se puede unir a la IL-13, por ejemplo, un epitope de la IL-13 e interferir con una interacción, por ejemplo, la unión, entre la IL-13 y un complejo IL-13 receptor ("IL-13R") , por ejemplo, un complejo que comprenda el receptor de la IL-13 II ("IL-13Ral") y la cadena alfa del receptor de la interleuquina 4 ("IL-4R ") , o una subunidad de la misma (por ejemplo, IL-13Ral o IL-4Ra, en forma individual) . Por consiguiente, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que se describen en la presente invención se pueden utilizar para interferir con (por ejemplo, inhibir, bloquear o reducir de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión, entre la IL-13 y un complejo del receptor de la IL-13, o una subunidad del mismo, que por lo tanto interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización. Además, hemos demostrado que la administración de un anticuerpo neutralizador de anti-IL-13 mejora, entre otras, la inflamación pulmonar inducida por el antígeno, por ejemplo, la eosinofilia y la broncoconstricción en los primates no humanos y las ovejas, respectivamente. Por consiguiente, los antagonistas de la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos neutralizadores de anti-IL-13 y los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar para mejorar por lo menos una actividad in vivo asociada con la IL-13, por ejemplo, una condición inflamatoria (por ejemplo, la inflamación pulmonar) . De manera adicional, los anticuerpos neutralizadores de anti-IL-13 y los fragmentos de los mismos se pueden utilizar para mejorar la sensibilidad principal de las células de pacientes atópicos a IL-13. De tal manera que los anticuerpos o sus fragmentos se pueden usar, por ejemplo, para el tratamiento de las alergias estacionales, por ejemplo, la rinitis alérgica. Los anticuerpos de anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos (incluyendo aquellos descriptos aquí) son útiles para el diagnóstico, el tratamietno y/o la prevención, en un paciente, por ejemplo, un paciente humano, uno o más trastornos asociados con la IL-13, por ejemplo, los trastornos respiratorios (por ejemplo, el asma, incluyendo el asma alérgica y no alérgica, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ) , al igual de las condiciones que comprenden la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco (por ejemplo, la fibrosis quística y la fibrosis pulmonar) ; los trastornos atópicos (por ejemplo, la rinitis alérgica) ; las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, la dermatitis atópica) , los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD)), el hígado (por ejemplo, la cirrosis) ; las infecciones virales; el escleroderma y la fibrosis de otros órganos tales como la fibrosis hepática. Por consiguiente, en un aspecto, esta solicitud presenta un agente aglutinante a IL-13 tal como un antagonista a IL-13. Un agente aglutinante a IL-13 puede ser una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo unido al antígeno, un péptido, o un dominio de andamiaje que interactúa con, por ejemplo, se une a y/o neutraliza, IL-13, en particular, la IL-13 de mamífero, por ejemplo, la IL-13 de primate no humano, oveja, humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado. En una modalidad, el anticuerpo o los fragmentos de los mismos es un anticuerpo neutralizador, por ejemplo, reduce y/o inhibe una o más actividades asociadas con la IL-13, que incluyen pero que no se limitan a, la inducción de la expresión de CD23; la producción de IgE por las células B humanas; la fosforilación de un factor de transcripción, por ejemplo, la proteína STAT (por ejemplo, la proteína STAT6) ; la eosinofilia in vivo inducida por el antígeno; la broncoconstricción in vivo inducida por el antígeno; o la hipersensibilidad de las vías aéreas in vivo inducida por el fármaco, entre otras. Los antagonistas de la IL-13 que se describen en la presente invención, por ejemplo, los anticuerpos de anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos, se pueden unir a la IL-13 con alta afinidad, por ejemplo, con un Kd menor a 10~7 M, 10" 8, 10"9, 10~10, 10"11 M o mejor. Por ejemplo, los anticuerpos anti IL-13 o los fragmentos de los mismos se pueden unir a la IL-13 con una afinidad comprendida entre 50 y 500 pM, por ejemplo, entre 90 y 120 pM, por ejemplo, entre 95 y 105 pM. En otras modalidades, los anticuerpos IL-13 o los fragmentos de los mismos pueden neutralizar una o más actividades asociadas con IL-13 con un CI5o de por lo menos aproximadamente 50 nM a 5 pM, de manera normal aproximadamente de 100 a 250 pM o más fuerte. En otras modalidades, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos se asocian con IL-13 con cinéticas comprendidas dentro del rango de 103 a 107 M"1s"1, de manera normal 104 a 106 M"1s~1. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos se pueden asociar con IL-13 con cinéticas comprendidas dentro del rango de 5xl04 a 8xl06 M"1s~ 1. Aún en otra modalidad, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos tienen cinéticas de disociación comprendidas dentro del rango de 10~2 a 10~6 s_1, de manera normal 10~3 a 10~6 s-1, por ejemplo, más lentas que 5xl0~4 s"1, por ejemplo, 9, 8, 6 xlO"5 s"1. En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos se unen a IL-13, por ejemplo, la IL-13 humana, con una afinidad y/o cinéticas similares al anticuerpo monoclonal 13.2 ("mAbl3.2"), o las formas modificadas del mismo, por ejemplo, las formas quiméricas (por ejemplo, "chl3.2"), o las formas humanizadas de las mismas (por ejemplo, "hl3.2vl," "hl3.2v2" o "hl3.2v3") . La afinidad y las cinéticas de unión del anticuerpo anti-IL-13 o del fragmento del mismo se puede probar utilizando, por ejemplo, la tecnología de biosensor (BIACORE) (ver el Ejemplo 1.2, más abajo). En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o el fragmento del mismo (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento de Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo con especificidad única. El anticuerpo o el fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico o generado in vi tro . En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o el fragmento del mismo es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el anticuerpo es efectivamente humano.
Las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-IL-13 pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir por lo menos una, y con preferencia dos, cadenas pesadas completas, y por lo menos una, y con preferencia dos, cadens ligeras completas) o pueden incluir un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena única). Aún en otras modalidades, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida a partir de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, e IgE; en particular, elegidas a partir de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, más particularmente, las regiones constantes de cadena pesada de IgGl (por ejemplo, IgGl humano) . En otra modalidad, el anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera elegida a partir de, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera de kappa o lambda, con preferencia, kappa (por ejemplo, kappa humana) . En una modalidad, la región constante es alterada, por ejemplo, mutada, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, hasta aumentar o reducir una o más de: unión al receptor de Fe, glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteína, función celular del efector, o función de complemento) . Por ejemplo, la región constante IgGl humana se puede mutar en uno o más residuos, por ejemplo, uno o más de los residuos 234 y 237 de la SEC ID NO: 17 (por ejemplo, los residuos 234 y 237 cuando la Serina en la posición no. 1 se cambia al residuo no. 119 (siguiendo, por ejemplo, 118 aminoácidos de la cadena VH) ; como se mostró en la SEC ID NO: 17, con la Serina en la posición no. 1, estos mismos residuos son los nos. 116 y 119) . En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 comprende la región constante IgGl humana como la SEC ID NO: 17. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 comprende la secuencia humana de kappa que se muestra como la SEC ID NO: 18. En otra modalidad, el antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o el fragmento del mismo, se une de manera específica a IL-13, en particular, mamífero, por ejemplo, IL-13 primate no humano, oveja o humano (por ejemplo, IL-13 humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 (FIG 11)), o la secuencia madura humana de IL-13 a partir de los aminoácidos de aproximadamente 20-132 de la SEC ID NO: 31 (FIG 11) (ver también la SEC ID NO: 32 para la numeración de la secuencia de IL-13 humana madura) , o una secuencia que es por lo menos el 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma) . En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo se une a una variante de IL-13 humana, por ejemplo, una variante de la IL-13 humana que tenga una Glutamina (Q) en lugar de una Arginina (R) en la posición 130 de la SEC ID NO: 31 (FIG 11) . En otras modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se une de manera específica a un fragmento de IL-13, por ejemplo, un fragmento de por lo menos 10, 20, 50, 75, 100, 120 ó 130 ácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 31, o una secuencia que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o el fragmento del mismo se une de manera específica a la IL-13 humana y no reacciona en forma cruzada con la IL-13 a partir de las especies no humanas. En otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-13 o el fragmento del mismo se une a dos o más formas de IL-13 de mamíferos, por ejemplo, IL-13 humanas, de oveja y/o de primates no humanos . En una modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une de manera específica a un epitope, por ejemplo, un epitope lineal o conformacional, de IL-13, por ejemplo, en particular, mamífero, por ejemplo, IL-13 humana. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo se une a un epitope que comprende los residuos 81-93 y/o 114-132 de IL-13 humana (SEC ID NO: 31), o una forma modificada de los mismos (por ejemplo, un fragmento o una forma sustituta (por ejemplo, sustituido de manera conservadora) del mismo) . En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo se une de manera específica a un epitope de IL-13 humana que comprende uno o más de los residuos de los aminoácidos siguientes: Glutamato en la posición 68 [49], Asparagina en la posición 72 [53] , Glicina en la posición 88 [69], Prolina en la posición 91 [72], Histidina en la posición 92 [73], Lisina en la posición 93 [74], y Arginina en la posición 105 [86] de la SEC ID NO: 31 [posición en la secuencia madura; SEC ID NO: 32], o una sustitución de aminoácidos conservada de los mismos. En otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a un complejo elegido a partir de, por ejemplo, IL-13 e IL-13R l ("IL-13/IL-13Ral") ; IL-13 e IL-4Ra ("IL-13/IL-4R "); e IL-13, IL-13R l, e IL-4Ra ("IL-13/IL-13Ral/IL-4Ra") . En otras modalidades, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo, se une a IL-13 e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre IL-13 y un complejo del receptor de IL-13, por ejemplo, un complejo que comprende IL-13R l e IL-4Ra. En otras modalidades, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a IL-13 e interfiera con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión, entre IL-13 y una subunidad del complejo del receptor de la IL-13, por ejemplo, IL-13Ral o IL-4R , de manera individual. Aún en otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a IL-13 e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre IL-13/IL-13Ral e IL-4Ra. En otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a IL-13, e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre IL-13/IL-4Ra e IL-13Ral. De manera normal, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión de IL-13/IL-13Ral con IL-4Ra. Los anticuerpos de los ejemplos inhiben o previenen la formación de complejos ternarios IL-13/IL-13Ral/IL-4Ra. Ejemplos de anticuerpos IL-13, que interfieren con la IL-13 que se une a la IL-13R (por ejemplo, un complejo del receptor de IL-13), o una subunidad del mismo, incluyen "mAbl3.2" y modificados, por ejemplo, las formas quiméricas o humanizadas de los mismos. Las secuencias de aminoácidos y nucleotides para una región variable de cadena pesada de mAbl3.2 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y nucleotides para la región variable de cadena ligera de mAbl3.2 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 1, respectivamente. Una forma quimérica (es decir, una forma que comprende la región variable de la cadena ligera de mAbl3.2) se denomina en la presente invención como "chl3.2." Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de cadena pesada de chl3.2 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 14 (por ejemplo, FIGURA 15) y SEC ID NO: 6, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la regióin variable de la cadena ligera de chl3.2 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 10 (por ejemplo, FIGURA 16) y SEC ID NO: 2, respectivamente. Una forma humanizada de mAbl3.2, a la cual se hace referencia en la presente invención como "hl3.2vl," tiene secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de cadena pesada establecida en la presente invención como SEC ID NO: 15 (FIGURA 15) y SEC ID NO: 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de la cadena ligera de hl3.2vl se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 11 (FIGURA 16) y SEC ID NO: 3, respectivamente. Otra forma humanizada de mAbl3.2, a la cual se hace referencia en la presente invención como "hl3.2v2," tiene secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de cadena pesada establecida en la presente invención como SEC ID NO: 16 (FIGURA 17) y SEC ID NO: 8, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de la cadena ligera de hl3.2v2 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 12 (FIGURA 18) y SEC ID NO: 4, respectivamente. Otra forma humanizada de mAbl3.2, a la cual se hace referencia en la presente invención como "hl3.2v3," tiene secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de cadena pesada establecida en la presente invención como SEC ID NO: 36 (FIGURA 27) y SEC ID NO: 34, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para la región variable de la cadena ligera de hl3.2v3 se establecen en la presente invención como SEC ID NO: 35 (FIGURA 28) y SEC ID NO: 33, respectivamente. En una modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo, se une de manera específica a IL-13, por ejemplo, IL-13 humana, de primate no humano u oveja y de manera competitiva inhibe la unión de un segundo anticuerpo a IL-13, por ejemplo, a un epitope que constituye el objetivo en IL-13 (por ejemplo, IL-13 humana, de primate no humano, de oveja) . El segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. En una modalidad, el anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo pueden conferir un efecto protector posterior a la inyección contra la exposición al antígeno Ascaris en un modelo de oveja por lo menos seis semanas después de la inyección. En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una región de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable, a partir de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye por lo menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye por lo menos una o dos regiones variables de cadena pesada de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2 y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una o dos regiones variables de cadena ligera de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye por lo menos una, dos, o tres regiones que determinan la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención, o al menos particularmente los amino ácidos de aquellas CDR que entran en contacto con IL-13. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención, o al menos particularmente los amino ácidos de aquellas CDR que entran en contacto con IL-13. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo elegido a partir de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. En una modalidad preferida, la proteína incluye todos las seis CDR de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3 o CDR estrechamente relacionadas, por ejemplo CDR que son idénticas o que tienen al menos una alteración de aminoácido, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) . Opcionalmente, la proteína puede incluir cualquier CDR descrita aquí. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o su fragmento incluye al menos uno, dos o tres bucles hipervariables de Chothia de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe aquí, o al menos particularmente los aminoácidos de aquellos bucles hipervariables que entran en contacto con IL-13. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o su fragmento incluye al menos uno, dos o tres bucles hipervariables de una región variable de cadena ligera seleccionada de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe aquí, o al menos incluye los aminoácidos de aquellos bucles hipervariables que entran en contacto con IL-13. Aún en otra modalidad, el anticuerpo o su fragmento incluye al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis bucles hipervariables de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras seleccionadas, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe aquí. En otra modalidad preferida, la proteína incluye todos los seis bucles hipervariables de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3 o bucles hipervariables estrechamente relacionados, por ejemplo, bucles hipervariables que son idénticos o que tienen al menos una alteración de aminoácido, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras). Opcionalmente, la proteína puede incluir cualquier bucle hipervariable que se describe aquí.
Aún en otro ejemplo, la proteína incluye al menos uno, dos o tres bucles hipervariables que tienen las mismas estructuras canónicas que los bucles hipervariables correspondientes de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, por ejemplo, las mismas estructuras canónicas de al menos el bucle 1 y/o el bucle 2 de los dominios de cadenas variables pesadas y/o ligeras de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3. Véase por ejemplo, Chothia et al. (1992) J. Mol . Biol . 227:799-817 ; Tomlinson et al. (1992) J. Mol . Biol . 227:776-798 para descripciones de estructuras canónicas de bucles hipervariables. Estas estructuras se pueden determinar por inspección de las tablas descritas en estas referencias. En una modalidad, la trama de cadenas variables ligeras o pesadas (por ejemplo, la región que comprende al menos FRl, FR2, FR3 y opcionalmente FR4 ) se puede seleccionar de: (a) una trama de cadenas variables ligeras o pesadas que incluya al menos 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98%, o preferiblemente 100% de residuos del amino ácido de una trama humano de cadenas variables ligeras o pesadas, por ejemplo, el residuo de una trama de cadenas variables ligeras o pesadas de un anticuerpo humano maduro, una secuencia de línea germinal humana, una secuencia humana de consenso o un anticuerpo humano como se describe aquí; (b) una trama de cadenas variables ligeras o pesadas incluyendo de 20% a 80%, 40% a 60%, 60% a 90%, o 70% a 95% de los residuos de amino ácido de una trama humano de cadenas variables ligeras o pesadas, por ejemplo, un residuo de trama de cadenas variables ligeras o pesadas de un anticuerpo humano maduro, una secuencia de línea germinal humana, una secuencia humana de consenso; (c) una trama no humano (por ejemplo, una trama de roedor) ; o (d) una trama no humano que ha sido modificado, por ejemplo, para remover determinantes antigénicos o citogénicos, por ejemplo, desinmunizado, o parcialmente humanizado. En una modalidad, la región de trama de cadena ligera o pesada (particularmente FRl, FR2 y/o FR3) incluye una secuencia de trama de cadena ligera o pesada de al menos 70, 75, 80, 85, 87, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica o idéntica a las tramas de un segmento VH o un gen germinal humano, por ejemplo, DP-54 o DPK9. En una modalidad, la región variable de cadena pesada incluye residuos humanos o residuos de secuencia de consenso humano en una o más de las posiciones siguientes (preferiblemente al menos cinco, diez, doce, o todas) : (en el FR del dominio variable de una cadena ligera) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, y/o (en el FR del dominio variable de una cadena pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, y/o 103H (de acuerdo con la numeración de Kabat) .
En una modalidad, la proteína incluye al menos una CDR no humana, por ejemplo, una CDR murina, por ejemplo, una CDR de mAbl3.2, o su mutante, y al menos una trama que difiere de una trama de mAbl3.2 por al menos un aminoácido, por ejemplo, al menos 5, 8, 10, 12, 15, o 18 aminoácidos. Por ejemplo, las proteínas incluyen uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis de tales CDR no humanas e incluye al menos una diferencia de amino ácido en al menos tres de HC FRl, HC FR2, HC FR3, LC FRl, LC FR2 , y LC FR3. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo incluye una secuencia de amino ácido, que al menos es idéntica en un 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más a una región variable de un anticuerpo descrito aquí, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3; o que difiere en al menos 1 ó 5 residuos, pero menos de 40, 30, 20, ó 10 residuos, de una región variable de un anticuerpo que se describe aquí, por ejemplos mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3. En una modalidad, uno o más dominios variables incluyen posiciones de amino ácidos en la región de trama que se derivan de forma variada tanto de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo murino como mAbl3.2) como de uno humano o de una secuencia germinal. Por ejemplo, el dominio variable incluirá un número de posiciones en las que el residuo de amino ácido es idéntico tanto al anticuerpo no humano como al anticuerpo humano (o una secuencia humana germinal) ya que ambos son idénticos en esa posición. De las posiciones restantes de la trama donde el humano y el no humano difieren, al menos 50, 60, 70, 80, o 90% de las posiciones del dominio variable son de forma preferente idénticas al anticuerpo humano (o secuencia germinal humana) y no al no humano. Por ejemplo, ninguno, o al menos una, dos, tres o cuatro de tales posiciones remanentes de la trama pueden ser idénticas al anticuerpo no humano en vez del humano. Por ejemplo, en HC FRl, una o dos de las posiciones pueden ser no humanas; en HC FR2, una o dos de las posiciones pueden ser no humanas; en FR3 una, dos, tres o cuatro de las posiciones pueden ser no humanas; en LC FRl, una, dos, tres o cuatro de las posiciones pueden ser no humanas; en LC FR2, una o dos de las posiciones pueden ser no humanas en LC FR3, una o dos de las posiciones pueden ser no humanas. En una modalidad, la región de cadena variable pesada o ligera de la proteína incluye una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico que se describe aquí o un ácido nucleico que se torna híbrido en una secuencia de ácido nucleico que aquí se describe (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico específica o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de amino ácido que aquí se describe) o su complemento, por ejemplo, bajo condiciones de rigor bajo, rigor medio, rigor alto, o de rigor muy alto, u otra condición de hibridación que se describe aquí. En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye por lo menos una, dos, tres o cuatro regiones de unión al antígeno, por ejemplo, regiones variables que tienen secuencias de aminoácidos como se establece en la Tabla 3 (SEC ID NOs: 13, 14, 15, 16, ó 36 para VH, y/o SEC ID NOs: 9, 10, 11, 12, ó 35 para VL) , o una secuencia esencialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos de aproximadamente 1 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o la cual difiere por no más de 1, 2, 5, 10, ó 15 residuos de aminoácidos de las SEC ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 35, ó 36). En otra modalidad, el anticuerpo incluye un dominio VH y/o VL codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se establece en la Tabla 2 (SEC ID NOs: 5, 6, 7, 8, ó 34 para VH, y/o SEC ID NOs:l, 2, 3, 4, ó 33 para VL) , o una secuencia esencialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o la cual difiere en no más de 3, 6, 15, 30, ó 45 nucleótidos de las SEC ID NOs:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 33, ó 34) . Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 (SEC ID NOs:22, 23, ó 24 para VH CDRs 1-3, respectivamente), o una secuencia esencialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idénticos a la misma, y/o que tenga una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 (SEC ID NOs: 19, 20, ó 21 para VL CDR 1-3, respectivamente), o una secuencia esencialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tenga una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 (SEC ID NO: 22, 23, 24 para VH CDR 1-3, respectivamente; y SEC ID NO: 19, 20, ó 21 para VL CDR 1-3, respectivamente), o una secuencia esencialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tenga una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende al menos uno, dos o tres bucles hipervariables de Chothia de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de bucles hipervariables VH Chothia 1-3, respectivamente, o una secuencia sustancialmente homologa (por ejemplo, una secuencia que sea idéntica aproximadamente en al menos un 85%, 90%, 95%, 99% o más, y/o que tenga una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende al menos uno, dos o tres bucles hipervariables de Chothia de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de bucles hipervariables VH Chothia 1-3, respectivamente, o una secuencia sustancialmente homologa (por ejemplo, una secuencia que sea idéntica aproximadamente en al menos un 85%, 90%, 95%, 99% o más, y/o que tenga una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas) . En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende una región humana IgGl constante que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 17 o una secuencia esencialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o la cual difiere en no más del 1, 2, 5, 10, 50, ó 100 residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: 17), o en posiciones correspondientes. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 comprende una cadena kappa humana constante que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 18 o una secuencia esencialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente del 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o la cual difiere en no más del 1, 2, 5, 10, 20, ó 50 residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: 18) . Aún en otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una región humana IgGl constante y una cadena kappa humana constante, por ejemplo, como se describe en la presente invención. Aún en otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende un domino variable de cadena pesada que se contacta con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno y por lo menos uno, dos, tres o cuatro residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Serina 50 (CDR2), Serina 53 (CDR2), Tirosina 101 (CDR3), Tirosina 102 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena pesada que se muestra en la FIGURA 29 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, FIGURA 17) o en posiciones que corresponden a los residuos de los aminoácidos en el dominio variable de cadena pesada. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que se pone en contacto con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las fuerzas de van der Waals en por lo menos, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Isoleucina 30 (CDR1), Serina 31 (CDR1), Alanina 33 (CDR1), Triptofano 47, Serina 50 (CDR2), Serina 52 (CDR2), Serina 53 (CDR2), Tirosina 58 (CDR2), Leucina 98 (CDR3) , Aspartato 99 (CDR3), Glicina 100 (CDR3), Tirosina 101 (CDR3), Tirosina 102 (CDR3), Fenilalanina 103 (CDR3) , o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena pesada que se muestra en la FIGURA 29 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, la FIGURA 17) o en posiciones que corresponden a los residuos de los aminoácidos en el dominio variable de cadena pesada. En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que se pone en contacto con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno en por lo menos uno, dos, tres o cuatro residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Serina 50 (CDR2), Serina 53 (CDR2), Tirosina 101 (CDR3), Tirosina 102 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, y por medio de las fuerzas de van der Waals siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Isoleucina 30 (CDR1), Serina 31 (CDR1), Alanina 33 (CDR1), Triptofano 47, Serina 50 (CDR2), Serina 52 (CDR2), Serina 53 (CDR2), Tirosina 58 (CDR2), Leucina 98 (CDR3) , Aspartato 99 (CDR3), Glicina 100 (CDR3), Tirosina 101 (CDR3) , Tirosina 102 (CDR3) , Fenilalanina 103 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena pesada que se muestra en la FIGURA 29 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, la FIGURA 17) o en posiciones que corresponden a los residuos de los aminoácidos en el dominio variable de cadena pesada . En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena ligera que se pone en contacto con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno en por lo menos uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Aspargina 31 (CDR1), Tirosina 32 (CDR1), Lisina 34 (CDR1), Aspargina 96 (CDR3), Aspartato 98 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena ligera que se muestra en la FIGURA 30 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, la FIGURA 18). Aún en otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena ligera que se pone en contacto con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las fuerzas de van der Waals en por lo menos uno, dos, • tres, cuatro, cinco, seis o siete residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Aspargina 31 (CDR1), Tirosina 32 (CDR1), Lisina 34 (CDR1), Arginina 54 (CDR2), Aspargina 96 (CDR3) , Aspartato 98 (CDR3), Triptofano 100 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena ligera que se muestra en la FIGURA 30 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, FIGURA 18). En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una región variable de cadena ligera que se pone en contacto con IL-13, de manera normal IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno en por lo menos uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Aspargina 31 (CDR1), Tirosina 32 (CDR1), Lisina 34 (CDR1), Aspargina 96 (CDR3), Aspartato 98 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena ligera, y por medio de las fuerzas de Van der Waals en por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete residuos elegidos a partir de, por ejemplo, Aspargina 31 (CDR1), Tirosina 32 (CDR1), Lisina 34 (CDR1), Arginina 54 (CDR2), Aspargina 96 (CDR3), Aspartato 98 (CDR3), Triptofano 100 (CDR3), o una sustitución conservadora de la misma, de la región variable de cadena ligera que se muestra en la FIGURA 30 de acuerdo con el esquema de numeración de secuencia lineal (ver también, por ejemplo, la FIGURA 18) . En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera que entran en contacto con IL-13, de manera normal, por ejemplo, IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno como se describe en la presente invención. Aún en otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera que entran en contacto con IL-13, de manera normal, por ejemplo, IL-13 humana, por medio de las fuerzas de van der Waals como se describe en la presente invención. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera que entran en contacto con IL-13, de manera normal, por ejemplo, IL-13 humana, por medio de las uniones de hidrógeno y de las fuerzas de van der Waals como se describe en la presente invención. Aún en otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tenga una o más mutaciones en la posiciones 13, 19, 40, 42, 44, 75, 77, 83, 87, 92, ó 113 de la SEC ID NO: 14. En otra modalidad, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende además una mutación en la posición 3 de la SEC ID NO: 14. En una modalidad, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende una o más de las siguientes sustituciones: Lisina reemplazada por Glutamina en la posición 3, Lisina reemplazada por Glutamina en la posición 13, Lisina reemplazada por Arginina en la posición 19, Treonina reemplazada por Alanina en la posición 40, Glutamato reemplazado por Glicina en la posición 42, Arginina reemplazada por Glicina en la posición 44, Arginina reemplazada por Lisina en la posición 75, Isoleucina reemplazada por Serina en la posición 77, Serina reemplazada por Aspargina en la posición 83, Serina reemplazada por Alanina en la posición 87, Metionina reemplazada por Valina en la posición 92, o Treonina reemplazada por Leucina en la posición 113 de la SEC ID NO: 14. En otra modalidad, el antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena ligera que tenga una o más mutaciones en las posiciones 3, 9, 12, 13, 15, 17, 19, 22, 46, 47, 62, 64, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, ó 108 de la SEC ID NO: 10. En otra modalidad, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-IL-13, o un fragmento del mismo, comprende además una o más mutaciones en las posiciones 4 ó 72 de la SEC ID NO: 10. En una modalidad, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo comprende una o más de las siguientes sustituciones: Valina reemplazada por Glutamina en la posición 3, Leucina reemplazada por Metionina en la posición 4, Alanina reemplazada por Serina en la posición 9, Alanina reemplazada por Serina en la posiciónl2, Valina reemplazada por Alanina en la posición 13, Leucina reemplazada por Valina en la posición 15, Glutamina reemplazada por Aspartato en la posición 17, Alanina reemplazada por Valina en la posición 19, Serina reemplazada por Treonina en la posición 22, Glutamina reemplazada por Lisina en la posición 46, Serina reemplazada por Alanina en la posición 47, Isoleucina reemplazada por Valina en la posición 62, Alanina reemplazada por Serina en la posición 64, Arginina reemplazada por Glicina en la posición 72, Aspargina reemplazada por Serina en la posición 80, Prolina reemplazada por Serina en la posición 81, Valina reemplazada por Leucina en la posición 82, Glutamato reemplazado por Glutamina en la posición 83, Alanina reemplazada por Prolina en la posición 84, Aspartato reemplazado por Glutamato en la posición 85, Valina reemplazada por Fenilalanina en la posición 87, o Leucina reemplazada por Valina en la posición 108 de la SEC ID NO: 10. En otra modalidad, el fragmento aglutinante del anticuerpo o antígeno incluye una o más CDR que tienen la estructura de conformación de una CDR descrita en la Tabla 10 (de la solicitud 16163-029001) ± una desviación media cuadrática (RMSD) de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms, la Tabla 11 (de la solicitud 16163-029001) ± una RMSD de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms, o la Tabla 12 (de la solicitud 16163-029001) ± una RMSD de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms. Por ejemplo, uno, dos, o tres de las CDR del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, particularmente en CDR3, o en al menos dos CDRs, por ejemplo, CDR1 y CDR3, CDR2 y CDR3, o en todas las tres CDR) tienen una RMSD de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms relativos a esas estructuras. En la modalidad, su fragmento aglutinante del anticuerpo o antígeno incluye un dominio variable que, como un todo, tiene una conformación central de una CDR descrita en la Tabla 10 (de la solicitud 16163-029001) ± una desviación media cuadrática (RMSD) de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms, la Tabla 11 (de la solicitud 16163-029001) ± una RMSD de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms, o la Tabla 12 (de la solicitud 16163-029001) ± una RMSD de no más de 1.5, 1.2, 1.1, o 1.0 Angstroms. El dominio variable también puede ser idéntico en un 70%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% al anticuerpo que se describe aquí, por ejemplo, en la región CDR y/o en las regiones de la trama. Aún en otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que tenga una o más mutaciones en las posiciones 3, 13, 19, 40, 42, 44, 75, 77, 83, 87, 92, or 113 de la SEC ID NO: 14 (por ejemplo, las mutaciones como se describen en la presente invención) , y una región variable de cadena ligera que tenga una o más mutaciones en las posiciones 3, 4, 9, 12, 13, 15, 17, 19, 22, 46, 47, 62, 64, 72, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, o 108 de la SEC ID NO: 10 (por ejemplo, las mutaciones como se describen en la presente invención) . El antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo descripto en la presente invención, puede ser derivado o vinculado con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab) . Por ejemplo, la proteína de fusión o un anticuerpo, o la porción de unión al antígeno, se pueden unir funcionalmente (por ejemplo, por medio de acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares tales como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico) , toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros. Aún en otra modalidad, el antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo que se describen en la presente invención, o una composición farmacéutica de los mismos, se administra solo o en terapia combinada, es decir, combinado con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, los cuales son útiles para tratar los trastornos asociados con la IL-13. Los ejemplos de trastornos asociados con la IL-13 incluyen, pero no se limitan a, los trastornos elegidos a partir de uno o más de: trastornos respiratorios, por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, asma debida a la infección con, por ejemplo, el virus sincitial respiratorio (RSV) , por ejemplo, en los niños de más corta edad)), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , y otras condiciones que implican inflamación de las vías aéreas, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar; trastornos atópicos, por ejemplo, que resultan de una mayor sensibilidad a la IL-13, (por ejemplo, dermatitis atópica, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica) ; condiciones inflamatorias y/ o autoinmunes de la piel (por ejemplo, dermatitis atópica) , los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD), tales como la colitis ulcerosa y/o la enfermedad de Crohn) , el hígado (por ejemplo, la cirrosis, el carcinoma hepatocelular) , y el escleroderma; los tumores o los cánceres (por ejemplo, los tumores de tejido blando), como la leucemia, el glioblastoma, y el linfoma, por ejemplo, el linfoma de Hodgkin; las infecciones virales (por ejemplo, de HTLV-1); la fibrosis de otros órganos, por ejemplo, la fibrosis hepática, (por ejemplo, la fibrosis provocada por una hepatitis B y/o el virus C) ; y la supresión de la expresión de las respuestas inmunes protectoras tipo 1, (por ejemplo, durante la vacunación), como se describe en la presente invención. La terapia combinada puede incluir uno o más antagonistas de la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos, formulados en forma conjunta con, y/o administrados en forma conjunta con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de la citoquina y del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, los agentes sistémicos antiinflamatorios), los inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas, y/o agentes citotóxicos o citostáticos, según se describe con mayor detalle en la presente invención. Los ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales preferidos que se pueden administrar en forma conjunta y/o formular en forma conjunta con uno o más antagonistas de la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos, incluyen pero no se limitan a, uno o más de: los esteroides inhalados; los agonistas beta, por ejemplo, los agonistas beta de corta duración o de acción prolongada; los antagonistas de los leucotrienos o los receptores de los leucotrienos; los fármacos combinados tales como ADVAIR ; Los inhibidores de IgE, por ejemplo, los anticuerpos anti-IgE (por ejemplo, XOLAIR®) ; los inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, Los inhibidores de PDE4); las xantinas; los fármacos anticolinérgicas; los agentes estabilizadores de los mastocitos tales como el cromolin; los inhibidores de la IL-4; los inhibidores de la IL-5; los inhibidores de la eotaxina / CCR3; y los antihistamínicos. Las combinaciones mencionadas se pueden utilizar para tratar el asma y otros trastornos respiratorios. Los ejemplos adicionales de los agentes terapéuticos que se pueden administrar en forma conjunta y/o formular en forma conjunta con uno o más de los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos incluyen uno o más de: Los antagonistas de TNF (por ejemplo, un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, el receptor p55 o p75 humano de TNF o los derivados del mismo, por ejemplo, 75 kd TNFR-IgG (proteína de fusión receptor-IgG TNF de 75 kD, ENBREL*") ) ; los antagonistas de la enzima del TNF, por ejemplo, los inhibidores de la enzima convertidora del TNFa (TACE) ) ; los antagonistas de los receptores muscarínicos; los antagonistas TGF-J; el interferón gamma; la perfenidona; los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, el metotrexato, la leflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, por ejemplo, CCI-779; C0X2 y los inhibidores de cPLA2; las NSAID; los inmunomoduladores; los inhibidores de p38, TPL-2, los inhibidores de Mk-2 y NFRB, entre otros. En otro aspecto, esta solicitud proporciona composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen un portador farmacéuticamente aceptable y por lo menos un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo que se describen en la presente invención. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, comprenden una combinación de dos o más de uno de los antagonistas de la IL-13 mencionada con anterioridad, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos. Las combinaciones del antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, y un fármaco, por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, uno o más inhibidores de la citoquina y del factor de crecimiento, los inmunosupresores, los agentes antiinflamatorios (por ejemplo, los agentes antiinflamatorios sistémicos), los inhibidores metabólicos, los inhibidores de las enzimas, y/o los agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe en la presente invención) están comprendidos dentro del alcance de la invención. Esta solicitud también presenta los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos, que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-IL-13, y los fragmentos de los mismos, como se describe en la presente invención. Por ejemplo, la solicitud presenta, una primer y segundo ácido nucleico que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente, de un anticuerpo anti-IL-13 elegido a partir de uno o más de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3, como se describe en la presente invención. En otro aspecto, la solicitud presenta las células huésped y los vectores que contienen los ácidos nucleicos que se describen en la presente invención. La solicitud también presenta el epitoto de la IL-13, por ejemplo, la IL-13 humana, reconocida por uno o más de, por ejemplo, mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y/o hl3.2v3. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo se une a un epitope que comprende los residuos 81-93 y/o 114-132 de IL-13 humana (SEC ID NO: 31), o una forma modificada de los mismos (por ejemplo, un fragmento o una forma sustituida (por ejemplo, sustituida de manera conservadora) del mismo) . En una modalidad, el epitope de la IL-13 humana comprende uno o más de: Glutamato en la posición 49, Aspargina en la posición 53, Glicina en la posición 69, Prolina en la posición 72, Histidina en la posición 73, Lisina en la posición 74, y Arginina en la posición 86 de la SEC ID NO: 32, o una sustitución de aminoácidos conservada de los mismos.
En otro aspecto, esta solicitud presenta un método de modulación, por ejemplo, de interferencia con (por ejemplo, inhibir, bloquear o reducir de otra manera) , una interacción, por ejemplo, la unión, entre IL-13 y un cognado de proteína aglutinante IL-13, por ejemplo, un complejo receptor de la IL-13, por ejemplo, un complejo que comprenda la IL-13Ral y la IL-4Ra, o su subunidad. La modulación puede efectuarse in vivo o in vi tro . En otras modalidades, el antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a la IL-13, e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre la IL-13 y una subunidad del complejo receptor de la IL-13, por ejemplo, la IL-13Ral o la IL-4Ra, en forma individual. Aún en otra modalidad, el antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a la IL-13, e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre la IL-13/IL-13Ral y la IL-4Ra. En otra modalidad, el antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se une a la IL-13, e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión entre la IL-13/IL-4Ra y la IL-13Ral. De manera normal, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, la unión de IL-13/IL-13Ral con la IL-4Ra. El método de referencia se puede utilizar en células in vi tro (por ejemplo, en un sistema libre de células), en cultivos, por ejemplo ín vi tro o ex vivo . Por ejemplo, las células que expresan los receptores de la IL-13 se pueden cultivar in vi tro en el medio de cultivo y el paso de contacto se puede realizar por medio del agregado e uno o más de los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos como se describe en la presente invención, al medio de cultivo. De manera alternativa, el método se puede realizar sobre las células presentes en un paciente, por ejemplo, como parte de un protocolo in vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico) . En otro aspecto, esta solicitud presenta un método para tratar (por ejemplo, curar, suprimir, mejorar, demorar o evitar el inicio de, la recurrencia o la recidiva de) o prevenir un trastorno asociado con la IL-13, en un paciente. El método incluye: el hecho de administrar al paciente un agente aglutinante IL-13, (particularmente un antagonista) , por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en la presente invención, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el trastorno asociado con la IL-13. El antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se puede administrar al paciente, solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en la presente invención. En una modalidad, el paciente es mamífero, por ejemplo, un humano que sufre de uno o más trastornos asociados con la IL-13, que incluyan, por ejemplo, los trastornos respiratorios (por ejemplo, el asma (por ejemplo, el asma alérgica y no alérgica), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , y otras condiciones que implican la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco; los trastornos atópicos (por ejemplo, la dermatitis atópica y la rinitis alérgica) ; las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel, de órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD), tales como la colitis ulcerosa y/o la enfermedad de Crohn) , y el hígado (por ejemplo, la cirrosis, la fibrosis); el escleroderma; los tumores y los cánceres, por ejemplo, el linfoma de Hodgkin como se describe en la presente invención. De tal manera que la descripción incluye el uso de un agente aglutinante IL-13 (como un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en la presente invención) para el tratamiento que se describe en la presente invención y el uso de un agente aglutinante IL-14 (como un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en la presente invención) para la preparación de un medicamento para un tratamiento descrito en la presente invención. Los ejemplos de trastornos asociados con la IL-13 incluyen, pero no se limitan a un trastorno elegido a partir de uno o más de: los trastornos respiratorios, por ejemplo, el asma (por ejemplo, el asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, el asma debida a la infección con, por ejemplo, el virus sincitial respiratorio (RSV), por ejemplo, en los niños de más corta edad) ) , la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , y otras condiciones que implican la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco, por ejemplo, la fibrosis quística y la fibrosis pulmonar; los trastornos atópicos, por ejemplo, que resultan de una mayor sensibilidad a la IL-13 (por ejemplo, la dermatitis atópica, la urticaria, el eczema, la rinitis alérgica, y la enterogastritis alérgica) ; las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, la dermatitis atópica), de los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD), tales como la colitis ulcerosa y/o la enfermedad de Crohn) , del hígado (por ejemplo, la cirrosis, el carcinoma hepatocelular) , y el escleroderma; los tumores y los cánceres (por ejemplo, los tumores de tejido blando y sólido), como la leucemia, el glioblastoma, y el linfoma, por ejemplo, el linfoma de Hodgkin; las infecciones virales (por ejemplo, de HTLV-1); la fibrosis de otros órganos, por ejemplo, la fibrosis hepática, (por ejemplo, la fibrosis provocada por una hepatitis B y/o el virus C) ; y la supresión de la expresión de las respuestas inmunes protectoras tipo 1, (por ejemplo, durante la vacunación), como se describe en la presente invención. En otras modalidades, esta solicitud proporciona un método para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o evitar uno o más síntomas asociados con un trastorno respiratorio, por ejemplo, el asma (por ejemplo, asma alérgico y no alérgico) ; alergias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ; una condición que involucra la inflamación de vías aéreas, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar. Por ejemplo, los síntomas del asma incluyen, pero no se limitan a, la respiración con dificultad, falta de aliento, broncoconstricción, hipersensibilidad de las vías respiratorias, disminución de la capacidad respiratoria, fibrosis, inflamación de las vías respiratorias y producción de moco. El método comprende la administración al paciente de un antagonista de la IL-13, por ejemplo, un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo, en una cantidad suficiente para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas. El anticuerpo de la IL-13 se puede administrar con fines terapéuticos o profilácticos o ambos. El antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13, o un fragmento del mismo, se puede administrar al paciente, solo o combinado con otras modalidades terapéuticas como se describe en la presente invención. Con preferencia, el paciente es un mamífero, por ejemplo, un humano que sufre de un trastorno asociado con la IL-13 como se describe en la presente invención. En otro aspecto, esta solicitud proporciona un método para detectar la presencia de IL-13 en una muestra in vi tro (por ejemplo, una muestra biológica, como por ejemplo suero, plasma, tejido, biopsia). El método de referencia se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno inmune asociado con las células. El método incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en la presente invención; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, y la muestra o la muestra de control, en la cual un cambio significativo desde el punto de vista estadístico en la formación del complejo en la muestra relativa a la muestra de control es indicativo de la presencia de la IL-13 en la muestra. Aún en otro aspecto, esta solicitud proporciona un método para detectar la presencia de IL-13 in vivo (por ejemplo, imágenes in vivo en un paciente) . El método de referencia se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado con la IL-13. El método incluye: (i) administrar el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en la presente invención a un paciente o a un paciente de control en condiciones que permiten la unión del anticuerpo o de un fragmento a la IL-13; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo o un fragmento y la IL-13, en la cual un cambio significativo desde el punto de vista estadístico en la formación del complejo en el paciente relativo al paciente de control es indicativo de la presencia de IL-13. Con preferencia, el anticuerpo o un fragmento del mismo es directa o indirectamente etiquetado con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las substancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. También se describen los métodos para liberar o apuntar a un agente, por ejemplo, un agente terapéutico o citotóxico, a una célula in vivo que expresa la IL-13. Los kits que comprenden el antagonista de IL-13 que se describen en la presente invención, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o un fragmento de los mismos, para usos terapéuticos y diagnósticos también se encuentran dentro del alcance de la solicitud. En otro aspecto, la solicitud proporciona métodos para proveer un anticuerpo que incluye un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. Los métodos incluyen la preparación de un anticuerpo (o un ácido nucleico que codifica el anticuerpo) por medio del uso de una o más regiones de la trama de DP-54 y DPK-9 o regiones de la trama que son idénticas al menos en un 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, o 98% a una o más regiones de la trama de DP-54 y DPK-9. En una modalidad, el método incluye la ingeniería de CDR o porciones de CDR de un anticuerpo no humano en el contexto de un dominio variable que incluye tramas DP-54 y DPK-9 en el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, o un dominio variable que incluye regiones de trama idénticas en al menos un 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, o 98% o más regiones de trama de DP-54 y DPK-9. Los ácidos nucleicos que incluyen secuencias de codificación de cadenas de proteína que incluye tales dominios variables que pueden expresarse en células de mamíferos, por ejemplo, cultivos de células de tejido. En un aspecto relacionado, la solicitud presenta un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo artificial, que incluye un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, donde el dominio variable de cadena pesada incluye el uso de una o más regiones de trama de DP-54 o regiones de trama idénticas en al menos un 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, o 98% o más regiones de trama de DP-54, y el dominio variable de cadena ligera incluye el uso de una o más regiones de trama de DPK-9 o regiones de trama idénticas en al menos un 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, o 98% o más regiones de trama de DPK-9. Una o más de las CDR y/o bucles hipervariables generalmente no son humanos, por ejemplo, de un anticuerpo no humano tales como anticuerpos murinos. En una modalidad, el anticuerpo se une a un antígeno humano, por ejemplo, IL-13 o un antígeno que no sea IL-13. Otras características y ventajas se harán evidentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones que se detallan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1: Parámetros cinéticos de la unión de mAbl3.2 con la IL 13 humana. Interacciones de unión entre la IL-13 botinilada inmovilizada hasta un chip de estreptavidina 69 RU y el anticuerpo monoclonal mAbl3.2, el anticuerpo monoclonal mAbl3.4, o el anticuerpo monoclonal mAbl3.9 están representadas como unidades de resonancia (RU; eje y) en el tiempo (eje x) . También se muestran las constantes cinéticas para mAbl3.2.
FIGURA 2 : Parámetros cinéticos de la unión de mAbl3.2 a la IL-13. La interacción de la unión entre varias dosis de IL-13 humana y el anticuerpo monoclonal mAbl3.2 inmovilizado hasta un chip de BIACORE3 se representa como la diferencia de resonancia (RU; eje y) en el tiempo (eje x) . También se muestran las constantes cinéticas para mAbl3.2. FIGURA 3: Unión del anticuerpo monoclonal mAbl3.2 a la IL-13 nativa humana. La figura muestra el valor promedio de absorbencia (A450; eje y) de la unión de mAbl3.2 biotilizada a FLAG-IL-13 humana en presencia de mayores concentraciones (eje x) de la IL-13 recombinante humana (*), la IL-13 recombinante de murino(o), o de la IL-13 nativa humana (?) aislada a partir de células mononucleares de sangre medular activada por mitógenos, Th2 distorsionada. FIGURAS 4A-4B: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 se une a y neutraliza la forma de variante de ARG de la IL-13 humana. (FIGURA 4A) La respuesta (eje y) de la IL-13 humana o una variante de ARG de la IL-13 expresada en forma recombinante pasada sobre mAbl3.2 biotilinada inmovilizada hasta un chip BIACORE3 se muestra como una función de tiempo (eje x) . (FIGURA 4B) Se muestra la proliferación de las células TFl (eje y) incubadas con mayores concentraciones de mAbl3.2 (eje x) y ya sea IL-13 recombinante humana o bien una variante de ARG de la IL-13 expresada en forma recombinante. FIGURA 5: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 inhibe la bioactividad de la IL-13 humana con un CI50 comparable al de un receptor soluble de la IL-13. La proliferación de la línea celular TF1 dependiente de la IL-13, según se determinó por medio de la incorporación de 3H-timidina, se mide como cpm (eje y) después de 3 días de incubación con IL-13 y mayores concentraciones (eje x) ya sea de mAbl3.2 o el receptor soluble de IL-13 (rhuIL-13Ra2 ) . FIGURA 6: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 inhibe la expresión de CD23 mediada por la IL 13, pero no la expresión de la CD23 mediada por la IL 4, en los monocitos humanos normales. (A) Se muestra el porcentaje de monocitos que expresaron CD23 de superficie celular (eje y) después de que las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) aisladas a partir del donante sano fueron tratadas durante toda la noche con la concentración indicada (eje x) de la IL-13 recombinante humana (•) o la IL-4 (o) . (B) Se muestra el porcentaje de monocitos que expresaron la superficie celular CD23 (eje y) después de que se aislaron PBMC de un donante sano se trataron con IL-13 y concentraciones indicadas de mAbl3.2 purificado de ratón (eje x) . (C) Se muestra el porcentaje de monocitos que expresaron la superficie celular CD23 (eje y) después de PBMC aislados a partir de un donante sano se trataron durante toda la nochce con IL-4 y las concentraciones indicadas de mAbl3.2 purificado de ratón (eje x) .
FIGURA 7: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 inhibe la producción de IgE dependiente de la IL 13 por parte de las células B humanas. La concentración de IgE en el sobrenadante aislado a partir de las PBMC cultivadas en el medio solas o en varias combinaciones de PHA, IL-13, anticuerpo de control (ms IgG) , mAbl3.2, y mAbl3.8 (eje x) se muestra como la absorbencia a 450 nm (IgE (O.D.450); eje y). FIGURAS 8A-8C: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 inhibe la fosforilación de STAT6 mediada por la IL 13 por parte de las células epiteliales humanas. (FIGURA 8A) Se muestra el análisis de mancha de Western para STAT6 en los lisatos celulares aislados a partir de las células HT-29 tratadas con la concentración indicada de IL-13. (FIGURA 8B) Tel gráfico demuestra la cantidad de células HT-29 según lo determinado por medio del análisis citométrico de flujo (recuentos; eje y), que demostraron fluorescencia (fosfo-STAT6; eje x) después de que las células no recibieron tratamiento (histograma completo) o fueron tratadas (histograma incompleto) con IL-13 y manchadas con el anticuerpo monoclonal etiquetado con Fluor 488 Alexa3 para obtener STAT6 fosforilado. (FIGURA 8C) Los gráficos demuestran la cantidad de células HT-29 según lo determinado por medio del análisis citométrico de flujo (recuentos; eje y), que demostraron fluorescencia (fosf0-STAT6) después de que las células permanecieron sin tratamiento (histogramas completos); o fueron tratadas (histogramas incompletos) con IL-13 (gráfico superior de la derecha), IL-13 y mAbl3.8 (gráfico inferior a la izquierda), IL-13 y mAbl3.2 (gráfico superior a la derecha) , o IL-13 y el anticuerpo de control (msGl) (gráfico inferior a la derecha) y que se mancharon con Fluor 488 ALEXA3. FIGURA 9: El anticuerpo monoclonal mAbl3.2 evita la eosinofilia in vivo pulmonar inducida por Ascaris . La figura muestra el porcentaje de eosinófilos hallados en las muestras de lavado broncoalveolar (BAL) (eje y) tomadas de monos cynomolgus no tratados (ascaris/PBS) (#,0), monos cynomolgus previamente tratados con mAbl3.2 (ascaris/mAbl3.2) ( , ) o monos cynomolgus previamente tratados con mAbl3.2 y sometidos a prueba con el antígeno de Ascaris suum (ascaris/nueva prueba ~3 meses post-Ab) (D,k), antes de la prueba (símbolos oscuros) o 24 horas después de la prueba o de la nueva prueba (símbolos claros) con el antígeno de Ascaris suum . FIGURA 10: Estructura cocristal del fragmento de mAbl3.2 Fab con la IL-13 humana. La cristalografía de rayos X del fragmento mAbl3.2 Fab. revela la cadena ligera con sombreado oscuro y la cadena pesada en un sombreado más claro. También se muestra la estructura de la IL-13 (a la derecha) . La figura también representa la interacción de la hélice alfa C de la IL-13 con los bucles de CDR del anticuerpo.
FIGURA 11: Análisis de la secuencia de la IL-13 humana que muestra los sitios de contacto con mAbl3.2. El panel muestra la secuencia de aminoácidos de la IL-13 humana, en la cual la flecha indica el sitio de división del péptido señal, las cuatro hélices alfa están subrayadas, los sitios de contacto con el anticuerpo de la estructura de cocristal mAbl3.2 Fab - IL-13 están resaltados con cuadrados claros, y el residuo de variante de ARG está resaltado en un cuadrado oscuro. FIGURAS 12A-12B: Los fragmentos Fab de mAbl3.2 se unen a la IL-13 humana. La figura muestra el valor promedio de absorbencia (450 nm; eje y) de mAbl3.2 biotinilada unida a FLAG-IL-13 humana en presencia de mAbl3.2 competidora no etiquetada ( ( ) , los fragmentos de mAbl3.2 Fab (o), o el anticuerpo irrelevanta (*) a concentraciones mayores (eje x) expresadas como (FIGURA 12A) anticuerpo pM o (FIGURA 12B) sitios de unión pM. FIGURAS 13A-13B: Los fragmentos Fab de mAbl3.2 neutralizan la proliferación de TF1 mediada por la IL-13 y de la expresión CD23 mediada por la IL-13 por medio de los monocitos humanos. (FIGURA 13A) El gráfico muestra el porcentaje el porcentaje de proliferación máxima por la línea celular TF1 dependiente de IL-13 (eje y) logrado después de 3 días de incubación con IL-13 y concentraciones mayores de sitios de unión del competidor (eje x) provistos ya sea por fragmentos Fab de mAbl3.2 (*) o bien de mAbl3.2 (o). (FIGURA 13B) La figura muestra el porcentaje de la cantidad máxima de monocitos que expresaron la superficie celular CD23 (eje y) según lo determinado por el análisis citométrico de flujo después de que las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de un donante sano fueron tratadas durante toda la noche con 1 ng/ml IL-13 y las concentraciones indicadas de los sitios de unión del competidor (eje x) provistas por los fragmentos Fab de ya sea mAbl3.2 ( ) o bien de mAbl3.2 (©) . FIGURAS 14A-14B: La versión quimérica (chl3.2) del anticuerpo monoclonal de ratón mAbl3.2 se une y neutraliza a IL-13. (FIGURA 14A) Se muestra la absorbencia a 450 nm (A450; eje y) de las muestras que contienen IL-13-FLAG y mAbl3.2 biotinilada solamente (- -) y las muestras que contienen IL-13-FLAG, mAB13.2 biotinilada y mayores concentraciones (eje x) de mAbl3.8 (•) , mAbl3.2 (o), o mAbl3.2 quimérico (chl3.2; •) según se determinó por medio de ELISA. (FIGURA 14B) Se muestra el porcentaje de monocitos que extresaron la superficie celular CD23 (eje y) después de que las PBMC aisladas de un donante sano fueron tratadas durante toda la noche con 1 ng/ml IL-13 y las concentraciones indicadas (eje x) de mAbl3.2 purificado de ratón (o) o mAbl3.2 quimérico (chl3.2; o) . FIGURA 15: Comparación del gen humano DP-54 de las líneas germinales con las secuencias variables de cadenas pesadas (VH) de aminoácidos de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl). La figura muestra las regions que determinan la complementariedad (CDR) (regions recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de DP-54, la región pesada variable de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérico), y la región pesada variable de una versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl) como alineada y comparada con SEQWEB™, en la cual las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl) se indican con cuadrados sombreados y los residuos que se dejan sin modificar son indicados. FIGURA 16: Comparación del gen humano DPK9 de las líneas germinales con las secuencias variables de aminoácidos de cadena ligera (VL) de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl). La figura muestra las regions que determinan la complementariedad (CDR) (regions recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de DPK-9, la región variable ligera de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérica), y la región ligera variable de una versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl) según se alineó y se comparó con SEQWEB™, en donde las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl) se indican con cuadrados sombreados y los residuos que se dejaron sin modificar están indicados. FIGURA 17: Comparación del gen humano DP-54 de las líneas germinales con las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable (VH) de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2). La figura muestra las regiones que determinan la complementariedad (CDR) (regiones recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de DP-54, la región variable pesada de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérica), y la región pesada variable de una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2) según se alineó y se comparó con SEQWEB™, en la cual las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2) están indicadas con casilleros sombreados y los residuos que quedaron sin modificar están indicados. FIGURA 18: Comparación del gen DPK9 humano de las líneas germinales con las secuencias de aminoácidos de cadena ligera variable (VL) de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2). La figura muestra las regiones que determinan la complementariedad (CDR) (regiones recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de DPK-9, la región variable ligera de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérica), y la región variable ligera de una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2) según se alineó y se comparó con SEQWEB™, en donde las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v2) están indicadas con casilleros sombreados y los residuos que quedaron sin modificar están indicados. FIGURAS 19A-19B: El mAbl3.2 (hl3.2v2) completamente humanizado conserva la actividad de unión completa a la IL-13. (FIGURA 19A) Se muestra la absorbencia en 450 nm (A450; eje y), según se determinó por medio de ELISA, de las muestras que contienen IL-13-FLAG y mAbl3.2 biotinilado solo (- -) y las muestras que contienen IL-13-FLAG, mAB13.2 biotinilado y las concentraciones mayores (eje x) de mAbl3.2 (•) , mAbl3.2 quimérico (chl3.2; o), mAbl3.2 parcialmente humanizado (hl3.2vl; D) o mAB13.2 completamente humanizado (hl3.2v2; r) . (FIGURA 19B) La interacción de unión entre la IL-13 humana en diferentes rangos de dosis y mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) inmovilizada hasta un chip Biacore3 se representa como la diferencia de resonancia (RU; eje y) en el tiempo (eje x) . También se muestran las constantes cinéticas para hl3.2v2. FIGURAS 20A-20B: mAbl3.2 quimérica (chl3.2), mAB13.2 (hl3.2vl) parcialmente humanizada y mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) pueden neutralizar la expresión CD23 mediada por la IL-13 y la fosforilación de STAT6 mediada por IL-13. (FIGURA 20A) Se muestra el porcentaje de monocitos que expresaron la superficie celular CD23 (eje y) después de que PBMC aisladas de un donante sano fueron tratadas durante toda la noche con 1 ng/ml IL-13 y las concentraciones indicadas (eje x) de mAbl3.2 quimérica (chl3.2; ), mAbl3.2 parcialmente humanizada (hl3.2vl; D) , o mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; o). (FIGURA 20B) Está representado el porcentaje de células HT-29 que expresaron STAT6 fosforilado (eje y) después de la incubación con IL-13 y la concentración indicada (eje x) de mAbl3.2 quimérica (chl3.2; *), mAbl3.2 parcialmente humanizada (hl3.2vl; D) , o mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; o) según se determinó por medio del análisis citométrico de flujo. FIGURAS 21A-21B: La capacidad de mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) para neutralizar La expresión CD23 mediada por la IL-13 humana es comparable con la capacidad de mAbl3.2 para hacer lo mismo. La cantidad de monocitos encerrados que expresa la superficie celular CD23 después de la incubación con (FIGURA 21A) IL-13 recombinante humana o (FIGURA 21B) IL-13 nativa humana y las concentraciones mayores (eje x) de mAbl3.2 (•) o mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; F) se presenta como un porcentaje de la cantidad máxima de monocitos que expresan la superficie celular CD23 después de la incubación con IL-13 solamente (% de Respuesta Max.; eje y) .
FIGURAS 22A-22B: La capacidad de mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) para neutralizar la expresión de CD23 mediada por la IL-13 en primates no humanos u ovejas es comparable con la capacidad de mAbl3.2 para hacer lo mismo. La cantidad de monocitos encerrados que expresan CD23 en la superficie celular CD23 después de la incubación con (FIGURA 22A) IL-13 recombinante de primates no humanos (rec NHP IL-13) o (FIGURA 22B) IL-13 recombinante de oveja (IL-13 rec de Oveja) y las concentraciones mayores (eje x) de mAbl3.2 (•) o mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; 0) se presenta como un porcentaje de la cantidad máxima de monocitos que expresan el CD23 de la superficie celular después de la incubación con IL-13 solamente (% de Respuesta Max. ; eje y) . FIGURAS 23A-23B: MAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) reduce la broncoconstricción en su fase tardía en las ovejas. El porcentaje de resistencia de las vías aéreas (eje y) según la medición 24 hours antes de la prueba de Ascaris suum (nivel basal), durante la prueba (ascaris), y durante muchas horas después del cambio (eje x) se muestra para las ovejas que no fueron sometidas a tratamiento (control; D) o que fueron tratadas en forma profiláctica con mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; i i) a una dosis de (FIGURA 23A) 20 mg/kg ó (FIGURA 23B) una dosis de 5 mg/kg. Los datos que se muestran son la media ± s.d. para un tamaño de muestra de tres ovejas por grupo. FIGURAS 24A-24B: La MAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) evita la hipersensibilidad de las vías aéreas en las ovejas. El porcentaje de dosis de carbcol que se requiere para elicitar una magnitud dada de respuesta (PC400; eje y) se muestra para las ovejas profilácticamente tratadas con (FIGURA 24A) 20 mg/kg o (FIGURA 24B) 5 mg/kg mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2; k) o las ovejas que permanecieron sin recibir tratamiento (control; D) pre- y post prueba Ascaris suum (eje x) . Los datos que se muestran son la media ± s.d. para una muestra de tres ovejas por grupo . FIGURA 25: MAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) evita la inflamación pulmonar inducida por antígenos en primates no humanos. La figura muestra la cantidad total de células encontradas en las muestras de lavado broncoalveolar (BAL) (eje y) obtenidas antes de la prueba (0) o 24 horas posteriores a la prueba (24) con el antígeno de Ascaris suum a partir de monos cynomolgus de control tratados por vía endovenosa con solución salina (f) , monos cynomolgus de control positivo tratados por vía intramuscular con 2 mg/kg dexametasona (k- ) , monos cynomolgus de control negativo previamente tratados con 8 mg/kg de IgG humano irrelevant (IVIG) (?), o monos cynomolgus previamente tratados por vía endovenosa con mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) ( ) . Una barra también representa la cantidad media de células encontradas en las muestras BAL de cada grupo. También se muestran los valores p obtenidos utilizando pruebas T impares. FIGURA 26: La humanización de mAbl3.2 se puede basar sobre la homología de la secuencia hasta otros genes de líneas germinales humanas en el Grupo VH 3 de la BASE V. Se muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de mAbl3.2 hasta las secuencias de aminoácidos de líneas celulares humanas dentro del grupo VH 3 de la base de datos, base V. Las secuencias que figuran en negrita se proponen como aquéllas en las cuales se puede basar la humanización de mAbl3.2 . FIGURA 27: La comparación del gen de las líneas germinales humanas DP-77 con las secuencias variables de aminoácidos de cadena pesada (VH) de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3). La figura muestra las regiones que determinan la complementariedad (CDR) (regiones recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de DP-77, la región variable pesada de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérica), y la región pesada variable de una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3) según se alineó y se comparó con SEQWEB™, donde las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3) están indicadas con casilleros sombreados y los residuos que quedaron sin modificar están indicados. FIGURA 28: Comparación del gen de las líneas germinales humanas Bl con las secuencias variables de aminoácidos de cadena ligera (VL) de una versión quimérica de mAbl3.2 y una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3). La figura, muestra las regiones que determinan la complementariedad (CDR) (regiones recuadradas) y las secuencias de aminoácidos de Bl, la región variable ligera de una versión quimérica de mAbl3.2 (13.2 quimérica), y la región variable ligera de una versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3) según se alineó y se comparó con SEQWEB™, donde las sustituciones de aminoácidos realizadas para la versión completamente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2v3) están indicadas con casilleros sombreados y los residuos que quedaron sin modificar están indicados. FIGURA 29: Designación del número para cada residuo en la secuncia variable de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo monoclonal mAbl3.2 de acuerdo con varios esquemas. Se muestra la designación del número para cada residuo en la secuencia de aminoácidos de la región variable pesada de mAbl3.2 de acuerdo con un esquema de numeración de secuencia lineal, el esquema de numeración de la estructura de Chothia y el esquema de numeración de la secuencia de Kabat. FIGURA 30: La designación del número para cada residuo en la secuencia variable de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo monoclonal mAbl3.2 de acuerdo con varios esquemas. Se muestra la designación del número para cada residuo en la secuencia de aminoácidos de la región variable ligera de mAbl3.2 de acuerdo con un esquema de numeración de secuencia lineal, el esquema de numeración de la estructura Clothia, y el esquema de numeración de la secuencia de Kabat. FIGURAS 31A-31B: Los títulos de IgE específicos de Ascaris a las 8 semanas posteriores a la prueba de Ascaris disminuyeron en los monos cynomolgus tratados con el anticuerpo anti-IL-13 humano (hl3.2v2). Los gráficos representan los títulos relativos de IgE específicos de Ascaris en monos cynomolgus (eje y) antes y 8 semanas después de la prueba con el antígeno de Ascaris suum . Los valores previos a la prueba se normalizaron hasta "100." (FIGURA 31A) Los animáis se trataron por vía endovenosa con el anticuerpo anti-IL-13 humanizado (hl3.2v2). (FIGURA 31B) A los animales de control se les administró solución salina o igG humano irrelevanta (IVIG) por vía endovenosa. FIGURAS 32A-32B: El anticuerpo anti-IL-13 (hl3.2v2) impidió el aumento de la sensibilidad basófila que siegue a la prueba in vivo del alérgeno. (FIGURA 32A) La liberación de histamina dependiente de la dosis como un porcentaje del máximo (eje y) de sangre de los animáis representatives de control y tratados con el anticuerpo se representa para los animales antes del tratamiento y 24 horas y 8 semanas después de la prueba con el antígeno de Ascaris. (FIGURA 32B) La liberación total de histamina sobre el rango de dosis que se muestra en (a) se determinó para cada animal en cada punto de tiempo. La figura muestra la media y el error standard de la liberación normalizada de histamina en cada punto de tiempo para los grupos de control y tratados con anti-IL-13. Pre = previamente tratados con el anticuerpo. Tiempo 0 = 24 hr posteriores al anticuerpo, previamente a la prueba pulmonar con Ascaris . Los puntos de tiempo de 24 horas, 8 semanas y 4 meses se refieren al tiempo posterior a la prueba de Ascaris . FIGURA 33: Unión de hl3.2v2 biotinilada a las células A375 cargadas con IL-13. Los histogramas representan la cantidad de células de melanoma humano A375 (recuentos; eje y) que demostraron la unión (fluorescencia; eje x) de hl3.2v2 biotinilado (0.1 Tg/ml, 1 Tg/ml, o 10 Tg/ml) después de la incubación previa con 3 ng/ml IL-13 humana, según lo determinado por medio del análisis citométrico de flujo. FIGURAS 34A-34B: El reversor de Fe de tipo silvestre de hl3.2v2 media ADCC en presencia de la IL-13. (FIGURA 34A) Se muestra el porcentaje de liberación de Cromo-51 (eje y) de células A375 de melanoma humano tratadas con la concentración indicada (eje x) de hl3.2v2 (L234A / G237A; ) o su reversor de Fe de tipo silvestre (0) . (FIGURA 34B) Se muestra el porcentaje de Cromo-51 liberado (eje y) para las células A375 cargadas con IL-13 tratadas con el reversor de Fe de tipo silvestre de hl3.2v2 en presencia o en ausencia de la IL-13. FIGURAS 35A-35B: El reversor de Fe de tipo silvestre de hl3.2v2 media ADCC de las células A375 que expresan la IL-13Ra2, pero no las células HT-29 que expresan la IL-13Ral. (FIGURA 35A) Se muestra el porcentaje de liberación de Cromo-51 (eje y) de ls células de melanoma humano A375 cargadas con IL-13 tratadas con la concentración indicada (eje x) de hl3.2v2 (L234A / G237A; ) o su reversor Fe de tipo silvestre (0) . (FIGURA 35B) Se muestra el porcentaje de liberación de Cromo-51 (eje y) de células epiteliales humanas HT-29 cargadas con IL-13 tratadas con la concentración indicada (eje x) de hl3.2v2 (L234A / G237A; ) o su reversor Fe de tipo silvestre (0).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen los agentes de unión a la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL13 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, las composiciones farmacéuticas de los mismos, los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anteriormente mencionados, al igual que los vectores y las células huésped que contienen las secuencias de ácidos nucleicos anteriormente mencionadas. También se describen los métodos para producir los anticuerpos mencionados anteriormente, al igual que los métodos para modular una o más actividades asociadas con la IL-13 que utilizan anticuerpos que se unen a la IL-13, por ejemplo, la IL-13 humana, y reducir y evitar su unión a su receptor. Los anticuerpos anti-IL-13 se pueden utilizar para mitigar los trastornos mediados por la IL-13, por ejemplo, para tratar los trastornos respiratorios (por ejemplo, el asma) ; los trastornos atópicos (por ejemplo, la rinitis alérgica); las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, la dermatitis atópica), de los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD)), al igual que los trastornos fibróticos y cancerosos. Los anticuerpos anti-IL-13 se pueden utilizar solos o combinados con otras terapias utilizadas para tartar la misma u otra enfermedad, por ejemplo, una respuesta alérgica. Se encontró, entre otras cosas, que una reducción de la actividad de la IL-13 utilizando los anticuerpos que se describen en la presente invención, la cual interfiere con la formación de un complejo de señalización funcional de IL-13, reduce la inflamación de las vías aéreas en los monos cynomolgus naturalmente alérgicos a Ascaris suum (Ejemplos 1.4 y 3.5, a continuación). De manera adicional, los anticuerpos anti-IL-13 humanos que se describen en la presente invención evitan la fase tardía de la broncoconstricción en ovejas naturalmente alérgicas a Ascaris suum, y evitan la hipersensibilidad de las vías aéreas inducida por carbacol en las ovejas (Ejemplo 3.5, a continuación) . Por consiguiente, los anticuerpos anti-IL-13 que neutralizan una o más actividades asociadas con la IL-13 se pueden utilizar para reducir una o más actividades in vivo asociadas con la IL-13, por ejemplo, para tratar o prevenir los trastornos mediados por la IL-13 (por ejemplo, el asma, la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco) .
Anticuerpos anti-IL-13 humanos Los anticuerpos que son capaces de unirse, de neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con la IL-13, en particular la actividad señalizadora de la IL-13, son útiles para tratar Las enfermedades mediadas por la IL-13, como el asma alérgica, el asma no alérgica, y las patologías relacionadas con el asma, tales como la fibrosis, la eosinofilia y la producción de moco. En una modalidad, los anticuerpos anti-IL13 que se describen en la presente invención son aislados o purificados. Un polipéptido o una proteína "aislada" o "purificada", por ejemplo, un "anticuerpo aislado," se purifica hasta un estado más allá de aquél en el cual existe en la naturaleza. Por ejemplo, el polipéptido o la proteína "aislada" o "purificada", por ejemplo, un "anticuerpo aislado, " se refiere a una proteína que está separada de al menos un componente de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular a partir de la cual se deriva la proteína, o esencialmente libre de precursores químicos o de otros químicos cuando se sintetiza desde el punto de vista químico. Por ejemplo, una proteína aislada puede estar sustancialmente libre de otras proteínas, otro material celular, o de precursores químicos. En otras modalidades, la preparación de la proteína del anticuerpo que tiene menos de aproximadamente 1 50% de la proteína no anticuerpo (a la cual también se hace referencia en la presente invención como una "proteína contaminante "), o de los precursores químicos, se considera que está "sustancialmente libre." En otras modalidades, 40%, 30%, 20%, 10% y con mayor preferencia 5% (por peso seco) , de la proteína no anticuerpo, o de los precursores químicos se considera que es sustancialmente libre. Cuando se produce en forma recombinante la proteína del anticuerpo o la porción biológicamente activa de la misma, también está con preferencia esencialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 1 30%, 20%, más preferentemente menos de aproximadamente 1 10%, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 1 5% del volumen o la masa de la preparación proteica. Las proteínas o los polipéptidos a los cuales se hace referencia en la presente invención como "recombinantes" son proteínas o polipéptidos producidos por medio de la expresión de ácidos nucleicos recombinantes. Las proteínas se pueden purificar por métodos convencionales (incluyendo, por ejemplo, intercambio de iones y afinidad cromatográfica) para brindar preparaciones en las que una proteína en particular es al menos pura en un 5, 10, 20, 25, 50, 75, 80, 90, 95, 98, 99% en relación con otros componentes biológicamente activos. El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente invención incluye los anticuerpos intactos, los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, los fragmentos Fab, F(ab')2 Fd, dAb y scFv y los anticuerpos intactos y los fragmentos que han sido mutados ya sea en su región constante y/o variable (por ejemplo, las mutaciones para producir anticuerpos quiméricos, parcial o completamente humanizados, aligual que para producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo, unión realzada a la IL-13 y/o unión reducida a FcR) . Ejemplos de anticuerpos que se unen una de manera específica a la IL-13, y pueden por ejemplo, interferir con la formación de un complejo de señalización funcional de la IL-13 y/o neutralizar o inhibir una o más actividades asociadas con la IL-13.
Los anticuerpos que se describen en la presente invención pueden ser "efectivamente humanos". Un anticuerpo efectivamente humano es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos humanos de tal forma que el anticuerpo no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Preferiblemente la proteína no debe evocar una respuesta neutralizante al anticuerpo, por ejemplo, una respuesta al anticuerpo humano anti-murino (HAMA) . La HAMA puede ser problemática en un número de circunstancias, por ejemplo, si se desean administrar los anticuerpos de forma reiterada, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente. Una respuesta HAMA puede hacer que la administración repetida de un anticuerpo sea potencialmente inefectiva, debido al aumento de aclaramiento del anticuerpo en el suero (ver, por ejemplo, Saleh et al., Cáncer Immunol . Immunother. , 32:180-190 (1990)) y también debido a las reacciones alérgicas potenciales (ver, por ejemplo, LoBuglio et al., Hybridoma , 5:5117-5123 (1986)). Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ejemplo, sustituciones dentro de los grupos siguientes: valina, glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparragina, glutamina; seina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.
Los anticuerpos, que también se conocen como inmunoglobulinas, son de manera normal proteínas tetraméricas glicosiladas compuestas por dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. Dos tipos de cadena ligera, denominadas lambda y kappa, se pueden encontrar en los anticuerpos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales: A, D, E, G, y M, y muchas de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, y IgA2. Cada cadena ligera incluye un dominio variable N-terminal (V) (VL) y un dominio constante (C) (CL) . Cada cadena pesada incluye un dominio V N-terminal (VH) , tres o cuatro dominios C (CHs), y una región bisagra. El dominio CH más proximal a VH se designa como CH1. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regions de secuencias relativamente conservadas denominadas regions de trama (FRl, FR2, FR3, y FR ) , las cuales forman un andamiaje para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones que determinan la complementariedad, CDR) . Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR son denominadas como CDRl, CDR2, y CDR3. Por consiguiente, las CDR constituyentes en la vadena pesada se denominan Hl, H2, y H3, mientras que las CDR en la cadena ligera son denominadas Ll, L2, y L3. La CDR3 es de forma normal la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión al anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o mayor de 26 aminoácidos. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas por las personas especializadas en la técnica anterior. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Una persona especializad en el arte precio reconocerá que la estructura de cada subunidad, por ejemplo, una estructura CH, VH, CL, VL, CDR, FR, comprende fragmentos activos, por ejemplo, la porción de la subunidad VH, VL, o CDR la unión al antígeno, es decir, el fragmento de unión al antígeno, o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une a y/o activa, por ejemplo, un receptor de Fe y/o el complemento. Las CDR de forma normal se refieren a CDR Kabat, como se describe en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (1991), eds. Kabat et al. Otro estándar para la caracterización del sitio de unión del antígeno consiste en referirse a los bucles hipervariables como los describe Chothia. Véase, por ejemplo, Chothia, D. et al. (1992) J. Mol . Biol . 227:799-817 ; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Aún otro estándar es la definición AbM usada por el software AbM de modelación de anticuerpos de Oxford Molecular. Véase, de forma general, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains . En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R. , Springer-Verlag, Heidelberg) . Las modalidades descritas con respecto de las CDR Kabat se pueden implementar, de forma alterna, utilizando relaciones descritas con respecto de bucles hipervariables de Chothia o de bucles definidos por AbM. Los Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por medio de un puente disulfido a la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Na ture 341:544-46), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) . También se pueden utilizar anticuerpos camélidos y anticuerpos camelizados. Los anticuerpos, por ejemplo, pueden incluir CDR de solo uno de los dominios variables que se describen en la presente invención. Además, a pesar de que los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por medio de genes separados, se pueden unir, utilizando los métodos recombinantes, por medio de un enlace sintético que permite hacerlos como una cadena de proteína única en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como la cadena única Fv (scFv) ; véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A . 85:5879-83). Tales anticuerpos de cadena única también están destinados a estar comprendidos dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos del anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por las personas especializadas en la técnica anterior y los fragmentos se evalúan para determinar su función de la misma manera que se hace con los anticuerpos intactos . La diversidad de anticuerpos, en un sistema natural, se crea por medio del uso de múltiples genes de las líneas germinales que codifican las regions variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos genéticos variables con diversidad (D) y segmentos genéticos de unión (J) para hacer una región VH completa y la recombinación de los segmentos genéticos variables y de unión para hacer una región VL completa. El proceso de recombinación puede ser impreciso, lo cual da como resultado la pérdida o la adición de aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad ocurren en la célula B en desarrollo ante de la exposición. Después de la estimulación antigénica, los genes del anticuerpo expresados en las células B atraviesan una mutación somática. Sobre la base de la cantidad estimada de segmentos genéticos de las líneas germinales, la recombinación randomizada de estos segmentos y el apareamiento aleatorio VH-VL, se podrían producir hasta 1.6 x 107 anticuerpos diferentes (Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, NY) . Cuando se tienen en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de los anticuerpos (tales como la mutación somática) , se piensa que más de lxlO10 se podrían generar los diferentes anticuerpos (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA) . En función de los diversos procesos involucrados en generar la diversidad del anticuerpo, no es probable que los anticuerpos monoclonales derivados en forma independiente con la misma especificidad del antígeno tengan secuencias idénticas de aminoácidos . Por consiguiente, esta descripción proporciona, entre otros, anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen al antígeno, que se unen a IL-13 y, por ejemplo, interfieren con la formación de un complejo funcional de señalización de IL-13. Los fragmentos que se unen al antígeno que se describen en la presente invención, por ejemplo, las estructuras que contienen un CDR, serán por lo general una secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, en el cual está ubicada la CDR en una ubicación correspondiente a la CDR de VH y VL que ocurren de manera natural. Las estructuras y las ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar de la manera como se describe en las Secuencias de Proteínas de Interés Inmunobiológico, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (1991), eds. Kabat et al. Las moléculas del anticuerpo (que incluyen los fragmentos que se unen al antígeno) se describen en la presente invención, es decir, las moléculas del anticuerpo que se unen a IL-13 e interfieren con la formación de un complejo funcional de señalización de IL-13, incluyen, pero no se limitan al anticuerpo monoclonal de murinos, mAbl3.2, y sus variantes, específicamente la variante quimérica chl3.2, la variante parcialmente humanizada hl3.2vl, y las variantes completamente humanizadas hl3.2v2 y hl3.2v3. Estas moléculas del anticuerpo pueden ser útiles para prevenir o tartar el asma (tanto alérgica como no alérgica) , al igual que las patologías relacionadas con el asma. La secuencia de aminoácidoss de la región variable de cadenas ligeras de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en la SEC ID NOs: 9, 10, 11, 12, y 35, respectivamente. La secuencia de aminoácidoss de la región variable de cadenas pesadas de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en la SEC ID NOs:13, 14, 15, 16, y 36, respectivamente. La secuencia de aminoácidoss de las tres regiones que determinan la complementariedad (CDRs) en las cadenas ligeras variables de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en las SEC ID NOs:19, 20, y 21. La secuencia de aminoácidoss de las tres CDRs en las cadenas pesadas variables de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en las SEC ID NOs:22, 23, y 24. Tal como se describió con anterioridad, las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas con el antígeno y están contenidas dentro de los dominios VH y VL, es decir, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, respectivamente. Los anticuerpos ejemplares incluyen por lo menos una CDR que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionados a partir de la secuencia de aminoácidoss establecida en las SEC ID NO: 19-24, o residuos seleccionados, particularmente residuos de contacto IL-13 de las CDR. Los anticuerpos también se pueden unir a IL-13 y, por ejemplo, interferir con la formación de un complejo funcional de señalización de IL 13. La secuencia de aminoácidos de los fragmentos activos de las CDR, es decir, las secuencias nucleares mínimas de CDR, que se describen en la presente invención se establecen en las SEC ID NO: 25-30, y se describen en la Tabla 1. Un anticuerpo pueden incluir una o más CDR de la cadena de VL como se establece en las SEC ID NO: 19-21 o las SEC ID NO: 25-27. Un anticuerpo incluir una o más CDR de la cadena VH como se establece en las SEC ID NO: 22-24 o las SEC ID NO: 28-30. De una manera adicional, un anticuerpo puede incluir uno o más de las CDR de la cadena VL y VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de la secuencia de aminoácidos establecida en las SEC ID Nos: 19-30. Como se muestra, X puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido que no sea cisteíno, o un aminoácido que tenga una carga similar, hidrofobicidad, y/o longitud de cadena lateral, como un aminoácido en la posición correspondiente en el lado izquierdo de la columna de la Tabla 1.
Tabla 1. CDR Ejemplares Secuencia de CDR Secuencia mínima central de CDR Cadena ligera CDR1 (Ll)SEC ID NO:1924- SEC ID NO:25 KASESVDNYGKSLMH-381 24-xxxxxxxNYxKxxxx-38 Light chain CDR2 (L2)SEC ID NO:2054-RASNLES-60 SEC ID NO:26 5 -Rxxxxxx-60 Cadena ligera CDR3 (L3)SEC ID NO:2193-QQSNEDPWT-101 SEC ID NO:27 93-xxxNxDxWx-101 Cadena pesada CDR1 (Hl)SEC ID NO:2230-ISYAMS-352 SEC ID NO:28 30-ISxAxx-35 Cadena pesada CDR2 (H2)SEC ID NO:2350- SEC ID NO:29 SISSGGNTYYPDSVKG-65 50-SxSSxxxxxYxxxxxx-65 Cadena pesada CDR3 (H3)SEC ID NO:2498-LDGYYFGFAY-107 SEC ID NO:30 98-LDGYYFxxxx-107 1 La numeración para las CDR VL está de acuerdo con un esquema de numeración de secuencia lineal como en la FIGURA . 2 La numeración para las CDR VH está de acuerdo con un esquema de numeración de secuencia lineal como en la FIGURA 29. También se describió con anterioridad, un fragmento de unión al antígeno puede ser un fragmento Fv, el cual incluye los dominios VH y VL. Por consiguiente, un fragmento Fv de mAbl3.3, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2 o hl3.2v3 puede constituir un anticuerpo que se describe en la presente invención. El anticuerpo se pueden unir con IL-13 e interferir con la formación de un complejo funcional de señalización de la IL-13. Otros fragmentos incluyen el fragmento Fv, por ejemplo, los fragmentos scFv, los fragmentos Fab y los fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos mAbl3.3, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, o hl3.2v3 o un anticuerpo que incluye una o más CDR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOs: 19-30. Tales moléculas del anticuerpo se pueden producir por medio de los métodos conocidos por aquellas personas especializadas en la técnica anterior. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir por medio de la generación de hibridomas de acuerdo con los métodos conocidos. Los hibridomas formados de esta manera luego se evalúan utilizando los métodos convencionales, como el ensayo inmunosorbente unido a la enzima (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmon de superficie (Biacore*") , para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une de manera específica a la IL-13, interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la II-13, y neutraliza una o más actividades asociadas con la IL-13. La IL-13 recombinante, la IL-13 que se produce de manera natural (es decir, la forma procesada madura de IL-13) , cualquiera de las variantes de los mismos, y los fragmentos peptídicos antigénicos de la IL-13 se pueden utilizar como el inmunogeno . Un fragmento peptídico antigénico de la IL-13 puede comprender por lo menos 7 residuos continuos de aminoácidos y abarca un epitope tal que un anticuerpo que se forma contra el péptido forma un complejo inmune específico con la IL-13. Con preferencia, el péptido antigénico comprende por lo menos 10 residuos de aminoácidos, con mayor preferencia por lo menos 15 residuos de aminoácidos, aún con mayor preferencia por lo menos 20 residuos de aminoácidos, y con mayor preferencia por lo menos 30 residuos de aminoácidos. De una manera adicional, es preferable que el fragmento peptídico antigénico de la IL-13 comprende el sitio de unión al receptor de la IL-13 o el sitio de unión al receptor de la IL-4. Como una alternativa para preparar los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal se puede identificar y aislar por medio de la selección de una biblioteca de inmunoglobulina recombinante combinatoria (por ejemplo, una biblioteca de exhibición de fagos) con la IL-13, que incluye las variantes y/o las porciones de la misma, para aislar por lo tante los miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen a la IL-13. Las técnicas y los kits que están disponibles desde el punto de vista comercial para generar y evaluar las bibliotecas que exhiben fagos son conocidas por aquellas personas especializadas en la técnica anterior. De una manera adicional, los ejemplos de los métodos y de los reactivos en particular convenientes para utilizar en la generación y la evaluación de los exhibidores de anticuerpos incluyen los que se describen en los documentos US 5,658,727, US 5,667,988, y US 5,885,793. Los sueros policlonales y los anticuerpos que se describen en la presente invención se pueden producir por medio de la inmunización de un paciente adecuado con la IL-13, sus variantes y/o las porciones de la misma. El título de anticuerpo en el paciente inmunizado puede monitorearse a través del tiempo por medio de las técnicas convencionales, tales como un Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado con la Enzima (ELISA) , utilizando la IL-13 inmovilizada u otros proteínas marcadoras (por ejemplo, FLAG). Los anticuerpos se pueden aislar a partir de un animal o del medio de cultivo. Se puede un utilizar una variedad de métodos para purificar los anticuerpos incluyendo las técnicas bien conocidas, tales como el uso de una gromatografía por proteína A; hasta obtener una fracción de IgG. Ciertas modalidades comprenden el dominio VH y/o VL del fragmento Fv de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2 o hl3.2v3. Los fragmentos de los anticuerpos, por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fd, y los fragmentos dAb, se pueden producir por medio del clivaje de los anticuerpos o por ingeniería recombinante. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 inmunológicamente activos se pueden generar por medio del tratamiento de los anticuerpos con una enzima tal como la pepsina. Otras modalidades comprenden una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cualquiera de estos dominios VH y VL, como se establece en las SEC ID NO: 19-30. Una modalidad comprende un fragmento de H3 del dominio VH de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, o hl3.2v3. Los dominios de VH y VL que se describen en la presente invención, en ciertas modalidades, pueden disponerse según la línea germinal, es decir, las regiones de la trama (FR) de estos dominios se pueden modificar utilizando las técnicas convencionales de biología molecular para coincidir con los genes humanos de la línea de germinación o con las secuencias de aminoácidos de consenso de los productos genéticos humanos de la línea de germinación, en una o más posiciones (por ejemplo, al menos en un 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, o 99% de la trama) . En otras modalidades, las secuencias de la trama permanecen con divergencias a partir de la línea germinal. Las secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, se describen en Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol . Biol . 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol . Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol.
Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. El directorio V BASE brinda un directorio integral de regiones de secuencia variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) . Estas secuencias se pueden usar como fuente de una secuencia humana, por ejemplo, para regiones de la trama y la CDR. También se pueden usar regiones de la trama humano de consenso, por ejemplo, como se describen en documentos US 6,300,064. De una manera adicional, los anticuerpos de cadena única quiméricos, humanizados que se describen en la presente invención, que comprenden tanto las porciones humanas como las no humanas se pueden producir utilizando las técnicas convencionales de ADN recombinante, tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos. También se pueden producir los anticuerpos humanizados utilizando ratones transgénicos que expresan los genes de cadena pesada y ligera, pero son incapaces de expresar los genes de cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina endógnena en el ratón. De una manera adicional, los anticuerpos que se describen en la presente invención también incluyen los que se unen a la IL-13, interfieren con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13, y tienen mutaciones en las cadenas pesadas y ligeras de las regiones constantes. A veces es deseable mutar e inactivar ciertos fragmentos de la región constante. Por ejemplo, se puede hacer que las mutaciones en la región pesada constante produzcan anticuerpos con unión reducida al receptor de Fe (FcR) y/o complemento; tales mutaciones son bien conocidas por las personas idóneas en la técnica anterior. Un Ejemplo de tal mutación a la secuencia de amino de la región constante de la cadena pesada de IgG se proporciona en la SEC ID NO: 17. Algunos fragmentos activos de las subunidades CL y CH (por ejemplo, CH1) se unen entre sí de forma covalente. Otro aspecto adicional proporciona un método para obtener el dominio de un anticuerpo de unión al antígeno específico para el dominio de IL-13 que colabora en la formación de un complejo funcional de señalización de la IL-13. Los anticuerpos ejemplares pueden incluir secuencias de las cadenas VL como se establece en las SEC ID NO: 9, 10, 11, 12, ó 35, y/o de las cadenas VH como se establece en las SEC ID NOs: 13, 14, 15, 16, ó 36, pero también pueden incluir variantes de estas secuencias que conservan la capacidad de unión al antígeno. Tales variantes se pueden derivar de las secuencias proporcionadas utilizando las técnicas bien conocidas en la técnica anterior. Se pueden efectuar sustituciones, eliminaciones o agregados de aminoácidos ya se aen las FR o bien en las CDR. Mientras que las modificaciones en las regines del marco de tiempo por lo general están diseñadas para mejorar la estabilidad y reducir la inmunogenicidad del anticuerpo, los cambios en las CDR por lo general se diseñan para aumentar la afinidad del anticuerpo para su objetivo. Tales cambios que aumentan la afinidad son de manera normal determinados en forma empírica mediante la alteración de la región CDR y la prueba del anticuerpo. Tales alteraciones se pueden realizar de acuerdo con los métodos que se describen en Antibody Engineering, 2nd. ed. (1995), ed. Borrebaeck, Oxford University Press. Un método ejemplar para hacer un dominio VH, que es una variante de la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se establece en la presente invención, comprende un paso de adición, eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VH que se describe en la presente invención, que combina de manera opcional el dominio VH así provisto con uno o más dominios VL, y prueba el dominio VH o la combinación de VH/VL o las combinaciones para la unión específica con la IL-13, y (con preferencia) probar la capacidad de tal dominio con unión al antígeno para modular una o más actividades asociadas a la IL-13. El dominio VL puede tener una secuencia aminoácidos que es esencialmente como se establece en la presente invención. Se puede utilizar un método análogo en el cual una o más variants de la secuencia de un dominio VL descrito en la presente invención se combinan con uno o más dominios VH.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para preparar un fragmento de unión al antígeno que se une de manera específica a la IL-13. El método comprende: (a) proporcionar un repertorio de inicio de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH que ya sea que incluya una CDR3 para reemplazarse o no tiene una región de CDR3; b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donante codificador de una CDR donante que comprende un fragmento activo de la SEC ID NO: 24, por ejemplo, un ácido nucleico donante que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 30, de manera tal que el ácido nucleico donante inserto dentro de la región CDR3 en el repertorio de manera tal de proporcionar un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio del producto; (d) seleccionar de un anticuerpo específico o fragmento de antígeno de unión específico para IL-13; y (e) recuperar del anticuerpo específico o un fragmento de antígeno de unión o un ácido nucleico que lo codifique. En otra modalidad, se puede utilizar un método análogo en el cual una CDR3 VL (es decir, L3) que aquí se describe se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican undominio VL, que ya sea incluye una CDR3 que se debe reemplazar o pierde una región codificadora de CDR3. Una secuencia codificadora de una CDR que aquí se describe (por ejemplo, CDR3) se puede introducir dentro de un repertorio de variables dominios que pierden una CDR (por ejemplo, CDR3) , utilizand la tecnología del ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. { Bio /Technology (1992) 10:779-83) describe los métodos de producción de los repertorios de los dominios variables de anticuerpos en los cuales los cebadores de consenso direccionados a o adyacentea al extremo 5' del are variable del dominio se utilizan en conjunción con los cebadores de consenso hasta la tercera región de marco de tiempo de los genes VH para proporcionar un repertorio de dominios variables de VH que pierden una CDR3. El repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Utilizando técnicas análogas, las secuencias derivadas de la CDR3 pueden arrastrarse con repertorios de dominios VH o VL que pierden una CDR3, y los dominios completos VH o VL arrastrados combinados con un dominio conocido VL o VH para proporcional los fragmentos específicos de unión al antígeno. El repertorio se puede entonces desplegar en un sistema huésped adecuado como el sistema de exhibición de fagos de WO 92/01047, de manera que los fragmentos de unión al antígeno adecuados se puedan seleccionar. Los arrstres análogos o las técnicas de combinación también se describen por parte de Stemmer {Na ture (1994) 370:389-91). Otra alternativa es generar regiones alternas de VH o VL utilizando mutagénesis aleatoria de uno o más genes seleccionados de VH y/o VL para generar mutaciones dentro de la totalidad del dominio variable. Véase, por ejemplo, Gram et al. Proc . Na t . Acad. Sci . U. S . A . (1992) 89:3576-80. Otro método que puede utilizarse consiste en direccionar la mutagénesis hacia las regions CDR de los genes VH o VL. Tales técnicas son descritas por, por ejemplo, Barbas et al. { Proc . Na t . Acad. Sci . U. S . A . (1994) 91:3809-13) and Schier et al. (J. Mol . Biol . (1996) 263:551-67). De forma similar una o más, de todas las tres CDR se pueden insertar en un repertorio de dominios de VH o VL, o aún en otro andamiaje (como un dominio fibronectino) . La proteína resultante se evalúa por su capacidad de unirse a IL-13. En una modalidad, una proteína de unión que se une a un objetivo se modifica, por ejemplo, por medio de mutagénesis, para proporcionar un conjunto de proteínas de unión modificadas. Las proteíans de unión modificadas luego se evalúan para identificar a una o más proteínas de unión alteradas las cuales han alterado las propiedades funcionales (por ejemplo, unión mejorada, estabilidad mejorada, estabilidad in vivo prolongada) . En una implementación, la tecnología de exhibición de la biblioteca se utiliza para seleccionar o evaluar el grupo de proteínas de unión modificadas. Las proteínas de unión de mayor afinidad son luego identificadas desde la segunda biblioteca, por ejemplo, por medio del uso de condicionnes más estrictas o condiciones de lavado y unión más competitivas. También se pueden utilizar otras técnicas de evaluación. En otras modalidades, la mutagénesis se dirige a las regions conocidas o probablemente que están en la interface de unión. Si, por ejemplo, las proteínas de unión identificadas son los anticuerpos, la mutagénesis se puede dirigir hacia las regiones CDR de las cadenas ligeras o pesadas como se describe en la presente invención. Además, la mutagénesis se puede direccionar hacia las regiones de la trama cercanas o adyacentes a las CDR, por ejemplo, las regiones del marco de tiempo, en particular dentro de 10, 5, ó 3 aminoácidos de una unión CDR. En el caso de los anticuerpos, la mutagénesis también se puede limitar a una o varias de las CDR, por ejemplo, para hacer mejoras de manera escalonada. En una modalidad, la mutagénesis se utiliza para hacer un anticuerpo más similar a una o más secuencias de la línea germinal. Un método para proporcionar en líneas germinales a modo de ejemplo puede incluir: identificar a una o más secuencias de la línea germinal que son similares (por ejemplo, más similares en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. Luego las mutaciones (en el nivel de los aminoácidos) se pueden efectuar en el anticuerpo aislado, ya sea mediante el incremento, en forma combinada, o ambas. Por ejemplo, se realiza una biblioteca de ácidos nucleicos que incluye las secuencias que codifican algunas o todas las mutaciones posibles de la línea germinal. Los anticuerpos mutados son luego evaluados, por ejemplo, para identificar un anticuerpo que tiene uno o más residuos de la línea germinal adicionales relativos al anticuerpo aislado y que aún sigue siendo útil (por ejemplo, tiene una actividad funcional). En una modalidad, se introducen tantos residuos en la línea germinal en la medida de lo posible. En una modalidad, la mutagénesis se utiliza para sustituir o insertar uno o más residuos de la línea germinal dentro de una región de CDR. Por ejemplo, el residuo de la línea germinal de CDR pueden ser de una secuencia de la línea germinal que sea similar (por ejemplo, la más similar) a la región variable que está siendo modificada. Después de la mutagénesis, la actividad (por ejemplo, la unión u otra actividad funcional) del anticuerpo se puede evaluar para determinar si el residuo o los residuos de la línea germinal son tolerados. Se pueden efectuar mutagénesis similares en las regiones de tramas. La selección de una secuencia de líneas germinales se puede efectuar de diferentes maneras. Por ejemplo, una secuencia de la línea germinal se puede seleccionar si satisface los criterios previamente determinados para la selectividad o la semejanza, por ejemplo, por lo menos un cierto porcentaje de identidad, por ejemplo, por lo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 99.5% de identidad. La selección se puede llevar a cabo utilizando por lo menos 2, 3, 5, ó 10 secuencias de líneas germinales. En el caso de CDR1 y CDR2, la identificación de la secuencia de la línea germinal similar se puede incluir seleccionando una secuencia de esa naturaleza. En el caso de CDR3, la identificación de una secuencia similar de la línea germinal puede incluir la selección de una secuencia tal, pero puede incluir la utilización de dos secuencias de la línea terminal que contribuyen en forma separada a la porción amino terminal y la porción carboxi terminal. En otras implementaciones se utilizan más de una o dos secuencias de la línea terminal, por ejemplo, para formar una secuencia de consenso. En una modalidad, un anticuerpo o un fragmento del mismo tiene secuencias de CDR que difieren solamente de manera no sustancial de aquéllas de los anticuerpos que se describen en la presente invención. Las diferencias no sustanciales incluyen los cambios menores de los aminoácidos, tales como las sustituciones d 1 o 2 de cualquiera de manera normal 5-7 aminoácidos en la secuencia de un CDR, por ejemplo, un CDR de Chothia o de Kabat. De manera normal un aminoácido es sustituido por un aminoácido relacionado que tenga una carga similar, características hidrofóbicas o estereoquímicas. Tales sustituciones estarían dentro de las capacidades habituales de una persona idónea en la técnica anterior. A diferencia de lo que sucede en las CDR, los cambios más sustanciales en las regiones de la trama de la estructura (FR) se pueden realizar sin afectar de manera adversa las propiedades de unión de un anticuerpo. Los cambios de las FR incluyen, pero no se limitan a, humanizar una trama derivado de no humano o construir ciertos residuos del marco de tiempo que son importantes para poner en contacto al antígeno o para estabilizar el sitio de unión, por ejemplo, cambiar la clase o la subclase de la región constante, cambiar los residuos específicos de aminoácidos que podrían alterar una función efectora tal como la unión al receptor de Fe (Lund et al. (1991) J. Immunol . 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24), o cambiar la especie de la cual deriva la región constante. Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región CH2 de la cadena pesada que reduce o altera la función efectora, por ejemplo, la unión al receptor de Fe y la activación del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones tales como las que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,624,821 y 5,648,260. En la cadena pesada de IgGl o IgG2, por ejemplo, tales mutaciones se pueden efectuar para parecerse a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 17. Los anticuerpos también pueden tener mutaciones que estabilizan la unión de disulfido entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, tales como las mutaciones en la región bisagra de IgG4, como se describe en la técnica anterior (por ejemplo, Angal et al. (1993) Mol . Immunol . 30:105-08). Las proteínas de unión a la IL-13 pueden estar en forma de anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2, Fd, dAb, y scFv y de anticuerpos intactos y fragmentos que han sido mutados ya sea en su región constante y/o variable (por ejemplo, mutaciones para producir anticuerpos quiméricos, parcialmente humanizados o completamente humanizados, al igual que para producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo, unión mejorada a la IL 13 y/o unión reducida a FcR) . En algunas modalidades, una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender por lo menos una de las regiones de la CDR y, de manera opcional, sus regiones de marco de tiempo intervinientes de las regiones variables según se establecen en la presente invención. La porción incluirá también por lo menos aproximadamente de 50, 60, 70, 80, 85, 87, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98% de cada una o de ambas de FRl y FR4. Por ejemplo, la porción que puede ser continua o no continua puede incluir el 50% de C-terminal de FRl y el 50% de N-terminal de FR . Los residuos en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte esencial del dominio variable pueden ser aquéllos que normalmente no están asociados con las regiones variables de dominio que se producen en forma natural. Por ejemplo, la construcción de los fragmentos de unión específica al antígeno de la presente invención realiza por medio de las técnicas de ADN recombínate puede dar como resultado la introducción de los residuos de N o de C terminal codificados por los enlaces introducidos para facilitar los pasos de clonación u otra manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlaces para unir los dominios variables que se describen aquí para promover secuencias de proteínas, que incluyen las cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de anticuerpos) o los rótulos de proteínas tal como se analiza con mayor detalle a continuación. A pesar de que las modalidades ilustradas en los Ejemplos comprenden un par de "combinaciones" de los dominios VH y VL, la invención también abarca los fragmentos de unión que contienen un dominio de variable única derivado ya se a de las secuencias de dominio VH o VL, especialmente los dominios VH. En el caso de cualquiera de los dominios específicos de unión a la cadena única, estos dominios se pueden utilizar para evaluar los dominios complementarios capaces de formar un dominio de unión específica al antígeno de dos dominios capaz de unirse a IL-13. Esto se puede lograr por medio de los métodos de evaluación de exhibición de fagos utilizando el enfoque denominado de combinatoria dual jerárquico (como se describe en la presente invención, por ejemplo, WO 92/01047) en la cual una colonia individual que contenga ya sea un clon H o L de la cadena se utiliza para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el dominio específico resultante de unión al antígeno de dos cadenas es seleccionado de acuerdo con las técnicas de exhibición de fagos tales como las que se describen en la referencia. Esta técnica se describe también en Marks et al., supra . Los anticuerpos se pueden conjugar por métodos químicos con radionúclidos, fármacos, macromoléculas u otros agentes, o se puede lograr como fusión de proteínas que comprenden uno o más de las CDR que se describen aquí. Una proteína de fusión del anticuerpo contiene un par VH-VL donde una de esas cadenas (por lo general VH) y otra proteína son sintetizadas como una cadena polipeptídica única. Estos tipos de productos difieren de los anticuerpos en que por lo general tienen un elemento funcional adicional: por ejemplo, la mitad activa de una molécula pequeña o la característica estructural molecular principal de la macromolécula conjugada o fusionada. De manera adicional a los cambios a la secuencia de aminoácidos que se señaló con anterioridad, los anticuerpos pueden ser glicosilados, pegilados o unidos a la albúmina o a un polímero no proteináceo. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente invención se pueden unir a uo de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera que se establece en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; ó 4,179,337. Los anticuerpos son modificados químicamente por medio de la conjugación covalente a un polímero hasta incrementar su vida media circulante, por ejemplo. Los polímeros que se ofrecen a modo de ejemplo y los métodos para unirlos a los polipéptidos también se muestran en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546. En otras modalidades, el anticuerpo puede modificarse para tener un patrón de glicosilación alterado (por ejemplo, la forma alterada del modelo original de glicosilación original o nativo) . Como se utiliza dentro de este contexto, "alterado" significa que tiene una o más mitades de carbohidratos eliminadas, y/o que tiene uno o más sitios de glicosilación agregados al anticuerpo original. El agregado de sitios de glicosilación a los anticuerpos que se describen en la presente invención se puede llevar a cabo por medio de la alteración de la secuencia de aminoácidos hasta contener las secuencias de consenso del sitio de glicosilación; tales técnicas son bien conocidas en la técnica anterior. Otro medio de aumentar la cantidad de mitades de carbohidratos en los anticuerpos es por medio de acoplamiento químico o enzimático de los glicosidos a los residuos de aminoácidos del anticuerpo. Estos métodos se describen, por ejemplo, en el documento WO 87/05330, y Aplin and Wriston ((1981) CRC Cri t . Rev. Biochem . 22:259-306). La eliminación de cualquiera de las mitades de carbohidratos presentes en los anticuerpos se puede llevar a cabo química o enzimáticamente tal como se describe en la técnica anterior (Hakimuddin et al. (1987) Arch . Biochem . Biophys . 259:52; Edge et al. (1981) Anal . Biochem . 118:131; and Thotakura et al. (1987) Meth . Enzymol . 138:350). Véase, por ejemplo, el documento U.S. 5,869,046 para una modificación que aumenta la vida media in vivo que proporciona un epitope de unión al receptor de salvataje. Los anticuerpos que se describen en la presente invención también pueden etiquetarse con un rótulo detectable o funcional. Los rótulos detectables incluyen los radiorótulos tales como 131I o 99Tc, los cuales se pueden unir a los anticuerpos que se describen aquí utilizando la química convencional conocida en la técnica anterior. Los de rótulos también incluyen los rótulos de las enzimas tales como la peroxidasa rábano picante o la fosfatasa alcalina. Los rótulos además incluyen las mitades químicas tales como la biotina, que se pueden detectar por medio de la unión a una porción detectable conocida, por ejemplo, la avidina etiquetada . Las características de unión de un anticuerpo descrito en la presente invención se puede medir por cualquier método apropiado, incluyendo los métodos siguientes: el análisis de Biacore, el Ensayo Enzimático Inmunoabsorbente (ELISA) , la cristalografía por rayos x, el análisis de la secuencia y la mutagénesis por barrido como se describe en los Ejemplos que figuran más abajo, y otros métodos que son bien conocidos en la técnica anterior. La capacidad de un anticuerpo que se describe aquí de neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con la IL-13 se puede medir por medio de los métodos siguientes: los ensayos para medir la proliferación de una línea celular dependiente de la IL-13, por ejemplo TFI; los ensayos para medir la expresión de los polipéptidos mediados por la IL-13, por ejemplo, el análisis citométrico de flujo de la expresión de CD23; los ensayos que miden la actividad de las moléculas de señalización corriente abajo, por ejemplo, STAT6; los ensayos que prueban la eficiencia de un anticuerpo que se describe aquí de evitar el asma en un modelo animal, por ejemplo, el mono cynomolgus; tal como se describe en los Ejemplos que figuran más abajo, y otros ensayos que son bien conocidos en la técnica. La interacción de la unión de una proteína de interés y un objetivo (por ejemplo, IL-13) se pueden analizar utilizando SPR. SPR o el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) detecta las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiqutar ninguno de los interactuantes . Los cambios de la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) del chip BIA dan como resultado alteraciones del índicce de refracción de luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmones superficiales (SPR) ) . Los cambios en la refractividad general una señal detectable, los cuales se miden como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas. Se describen los métodos para utilizar SPR, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,641,640; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal . Chem . 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin . Struct . Biol . 5:699-705 y los recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia) . La información de SPR se puede utilizar para proporcionar una medición exacta y cuantitativa de la constante de disociación de equilibrio (Kd) , y los parámetros cinéticos, que incluyen Kon y Koff, para la unión de una biomolécula a un objetivo. Tales datos se pueden utilizar para comparar diferentes biomoléculas. Por ejemplo, las proteínas codificadas por medio de ácido nucleico seleccionadas a partir de una biblioteca de diversidad de cepas se puede comparar hasta identificar individuos que tienen alta afinidad para el objetivo o que tienen un COF bajo. Esta información también se puede utilizar para desarrollar las relaciones actividad-estructura (SAR) . Por ejemplo, los parámetros de unión cinéticos y de equilibrio de las versiones maduras de una proteína madre se pueden comparar con los parámetros de la proteína madre. Se pueden identificar las variantes de aminoácidos en posiciones determinadas que correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y bajo Koff. Esta información se puede combinar con el modelado estructural (por ejemplo, utilizando el modelado de homología, la minimización de energía, o la determinación de estructura por medio de la cristalografía por rayos x o NMR) . Como resultado de ello, una comprensión de la interacción física entre la proteína y su objetivo se puede formular y utilizar para guir otros procesos de diseño. En otro aspecto, esta descripción proporciona un método para seleccionar anticuerpos capaces de unirse a la IL-13 y neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas a la IL-13. El método comprende: a) la contracción de una pluralidad de anticuerpos o de fragmentos de unión al antígeno con IL-13; b) la selección de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno que se unen a la IL-13;c) la prueba de la capacidad de los anticuerpos elegidos o de los fragmentos de unión al antígeno para evitar la unión de la IL-13 al receptor de la IL-13; y d) la selección de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno capaces de evitar la unión de IL-13 a su receptor. Uno o más de los anticuerpos se puede modificar aún más si se desea. Uno o más de los anticuerpos se puede formular, por ejemplo, como una composición farmacéutica. Los anticuerpos anti-IL-13 que se describen en la presente invención también resultan útiles para aislar, purificar y/o detectar la IL-13 en el sobrenadante, el lisato celular o en la superficie celular. Los anticuerpos que se describen en la presente invención se pueden utilizar en forma dignóstica para monitorear los niveles proteicos de IL-13 como parte de un procedimiento de pruebas clínicas. De una manera adicional, los anticuerpos descritos en la presente invención se pueden utilizar en los tratamientos que requieren la neutralización y/o la inhibición de una o más Actividades asociadas con la IL-13, por ejemplo el asma alérgica o no alérgica, y las patologías relacionadas. La presente descripción también proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados y purificados nuevos relacionados con los anticuerpos nuevos direccionados contra la IL-13 humana. Los genes, polinucleótidos, proteínas y polipéptidos descritos en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo murino a IL-13 (mAbl3.2) y las variantes del mismo. Polinucleótidos y Polipéptidos del anticuerpo anti-IL-13 Por ejemplo, la descripción proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican la región variable de un anticuerpo murino a IL-13 que modula una o más actividades asociadas con la IL-13 (por ejemplo, neutraliza la bioactividad de la IL-13) (mAbl3.2), una versión quimérica de mAbl3.2 (chl3.2), una versión parcialmente humanizada de mAbl3.2 (hl3.2vl) y dos versiones completamente humanizadas de mAbl3.2 (hl3.2v2 y hl3.2v3). Las secuencias de nucleótidos pueden incluir las que codifican las regiones variables de cadena ligera de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 y se establecen en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y SEC ID NO: 33, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos también incluyen las que codifican las regiones variables de cadena pesada de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.3v3 se establecen en la SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, y SEC ID NO: 34, respectivamente. Los polinucleótidos también pueden incluir los polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones muy estrictas a cualquiera de las secuencias establecidas en las SEC ID NOs: 1-8, 33, y 34, o los complementos de las mismas, y/o que codifican polipéptidos que conservan la actividad biológica sustancial (es decir, los fragmentos activos) de las regiones variables codificadas por estas secuencias. Los polinucleótidos tambiénpueden incluir porciones continuas de cualquiera de las seucencias establecidas en las SEC ID NOs: 1-8, 33, y 34, que comprenden por lo menos 21 nucleótidos consecutivos. La Tabla 2 sintetiza los Nos de ID de las SEQ para las secuencias de nucleótidos de muchos de los nucleótidos ejemplares.
Tabla 2: Números de Identificación de Secuencia (Nos de ID de la SEQ) de los Polinucleótidos de la invención mAB13.2 chl3.2 hl3.2vi hl3.2v 2 hl3.2v3 Región SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID VL NO:l NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO:33 Región SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID VH NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 8 NO:34 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadenas ligeras de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en las SEC ID NOs:9, 10, 11, 12, y 35, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadenas pesadas de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3 se establecen en las SEC ID NOs:13, 14, 15, 16, y 36, respectivamente. Los polipéptidos descritos en la presente invención también incluyen las porciones continuas de cualquiera de las secuencias establecidas en las SEC ID NOs: 9-16, 35, y 36 que comprenden por lo menos 4 aminoácidos consecutivos y que conservan la actividad biológica esencial (es decir, los fragmentos activos) de estas regiones variables. Con preferencia, los polipéptidos de la presente solicitud incluyen las porciones continuas de cualquiera de las secuencias establecidas en las SEC ID NOs: 9-16, 35, y 36 que comprenden 5-7 aminoácidos. Los polipéptidos que tienen mayor preferencia de la presente solicitud incluyen cualquiera de las porciones continuas de cualquiera de las secuencias establecidas en las SEC ID NOs : 9 y 13, SEC ID NOs:10 y 14, SEC ID NOs:ll y 15, SEC ID NOs:12 y 16, y SEC ID NOs: 35 y 36 que conservan la actividad biológica esencial de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, y hl3.2v3, respectivamente. Los polinucleótidos que se describen en la presente invención también incluyen, de manera adicional a aquellos polinucleótidos que se describieron con anterioridad, los polinucleótidos que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidos en las SEC ID NOs: 9-16, 35 y 36, o una porción continua de los mismos y que difieren de los polinucleótidos que se describieron con anterioridad sólo debido a la degeneración bien conocida del código genético. La Tabla 3 resume las SEC ID NOs para la secuencia de aminoácidos de muchos de los polipéptidos que se describen en la presente invención. Por ejemplo, la Tabla 3 resume los NOS de ID de la SEC ID para la secuencia de aminoácidos para las cadenas variables ligeras (VL) , las cadenas variables pesadas (VH) , las cadenas pesadas constantes (CH) , las cadenas ligeras constantes (CL) , las CDR1 de las cadenas variables ligeras (Ll), las CDR2 de las cadenas variables ligeras (L2), las CDR3 de las cadenas variables ligeras (L3) , las CDR1 de las cadenas variables pesadas (Hl), las CDR2 de las cadenas variables pesadas (H2), y las CDR3 de las cadenas variables pesadas (H3) de los anticuerpos mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2 y hl3.2v3.
Tabla 3: Números de ID de la Secuencia (SEC ID NOs) de los polipéptidos ejemplares. mAbl3. 2 chl3.2 hl3.2vl hl3.2v2 hl3.2v3 VL SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO: 9 NO:10 NO:ll NO: 12 NO:35 VH SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:13 NO:14 NO: 15 NO: 16 NO:36 CH SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:17 NO: 17 NO:17 NO:17 CL SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:18 NO:18 NO:18 NO:18 Ll SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:19 NO:19 NO: 19 NO: 19 NO:19 L2 SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:20 NO:20 NO:20 NO:20 NO: 20 L3 SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO: 21 NO:21 NO: 21 NO: 21 NO:21 Hl SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:22 NO:22 NO:22 NO:22 NO:22 H2 SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:23 NO:23 NO: 23 NO:23 NO:23 H3 SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID NO:24 NO:24 NO: 24 NO:24 NO:24 úa p? nuc eoL u?s disiauos que ae ues nuen en a presente invención pueden utilizarse como sondas de hibridación y cebadores para identificar y aislar los ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a o similares a las que codifican a los polinucleótidos descritos. Los métodos de hibridación para identificar y aislar los ácidos nucleicos incluyen la reacción de la cadena de polimerasa (PCR), la hibridización del Sur, la hibridización in si tu y la hibridización del Norte, y son bien conocidos por las personas idóneas en la técnica. Las reacciones de hibridización se pueden realizar bajo condiciones diferentes de exigencia. El carácter estricto de una reacción de hibridización incluye la dificultad con la cual cualquiera de las moléculas de ácido nucleico hibridizará a una de las otras. Con preferencia, cada polinucleótido hibridizante hibridiza a su polinucleótido correspondiente bajo condiciones reducidas de estrictez, con mayor preferencia con condiciones de estrictez y con mayor preferencia con altas condiciones de estrictez. Los ejemplos de las condiciones de estrictez se muestran en la Tabla 4 que figura a continuación: las condiciones de alta exigencia son aquéllas que son por lo menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones de estrictez son por lo menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de exigencia reducida son por lo menos tan estrictas como, por ejemplo, las condiciones M-R. TABLA 4 xLa longitud de los híbridos es la que se anticipó para la(s) región (es) hibridizadas de los polinucleótidos. Cuando se hibridiza a un polinucleótido hasta un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, la longitud del híbrido se supone que es la del polinucleótido hibridizante. Cuando los polinucleótidos de la secuencia conocida se hibridizan, la longitud del híbrido se puede determinar por medio del alineamiento de las secuencias de los polinucleótidos y de la identificación de la región o las regiones de complementariedad óptima de la secuencia. 2SSPE (lxSSPE es 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2P04, y 1.25 mM EDTA, pH 7.4 ) se puede sustituir por SSC (lxSSC es 0.15 M NaCl y 15 mM de citrato de sodio) en la hibridización y las soluciones amortiguadoras de lavado se realizan durante 15 min después de haber completado la hibridización. TB* _ TR* : La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipó que seria menor de 50 pares de base de longitud debe ser 5-10°C menor de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las ecuaciones siguientes. Para los híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(°C) = 2 (# of A + T bases) + 4(# de G + C bases). Para los híbridos de entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(°C) = 81.5 + 16.6 (log?0Na+) + 0.41 (%G + C) - (600/N), donde N es la cantidad de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones de sodio en la solución amortiguadora de hibridización (Na+ para IX SSC = 0.165 M) . Los ejemplos adicionales de las condiciones de estrictez para la hibridización de los polinucleótidos se proporcionan en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manual , Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), and Ausubel et al., eds., Curren t Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), que se incorporan en la presente invención a titulo de referencia. Los polinucleótidos que se describen en la presente invención se pueden utilizar como sondas de hibridización y sebadores para identificar y aislar el ADN que tenga secuencias que codifican las variantes alélicas de los polinucleótidos descritos. Las variantes alélicas son formas alternativas que se producen de manera natural de los polinucleótidos descritos que codifican a los polipéptidos que son idénticos a o tienen una semejanza significativa a los polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos. Con preferencia, las variantes alélicas tienen por lo menos una identidad de secuencia del 90% (con mayor preferencia, por lo menos una identidad del 95%; con mayor preferencia, por lo menos una identidad del 99%) con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados descritos en la presente invención también se pueden utilizar como sondas de hibridización y cebadores para identificar y aislar los ADN que tienen secuencias que codifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos descritos. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente de la de los polipéptidos y los polinucleótidos aislados, o dentro de la misma especia, pero con una semejanza significativa de la secuencia a la de los polinucleótidos y los polipéptidos descritos. Con preferencia, los homólogos de los polinucleótidos tienen por lo menos 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97&, 98%, ó 99%, secuencia con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados descritos en la presente invención también se pueden utilizar como sondas de hibridación y cebadores para identificar las células y los tejidos que expresan los anticuerpos y las condiciones bajo las cuales se expresan. Los polinucleótidos aislados que se describen en la presente invención pueden estar operativamente unidos a una secuencia de control de expresión para la producción recombinante de los polipéptidos que se describen en la presente invención. Un polinucleótido se puede unir de manera operativa a un nucleótido que codifica una región constante, por ejemplo, la región constante de uno de los varios isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera que se describe en la presente invención (por ejemplo, cualquiera de los que se establecen en las SEC ID NOs: 1-4, y 33) pueden unirse de manera operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica a la región constante (o a los derivados de la misma) o ya sea una cadena ligera de kappa (por ejemplo, como se establece en la SEC ID NO: 18) o la cadena ligera de lambda, de manera tal que la expresión de los nucleótidos unidos dará como resultado una cadena completa kappa o lambda ligera con una región variable que se une de manera especifica a la IL-13, interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la II-13, y neutraliza una o más de las actividades asociadas con la IL-13. De una manera similar, un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada que se describe en la presente invención (por ejemplo, cualquiera de las que se establecen en las SEC ID NOs:5-8, y 34) se pueden unir operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de un isotipo de cadena pesada (o los derivados de la msima) , por ejemplo, IgM, IgD, IgE, IgG e IgA. Los métodos generales de expresión de las proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica anterior. Tales proteínas recombinantes se pueden expresar en forma soluble para utilizarse en el tratamiento de los trastornos que resultan de la señalización mediada por la IL-13- (por ejemplo, el asma alérgica y no alérgica) . Los vectores de expresión recombinante que se describen en la presente invención pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células huéspedes (por ejemplo, los orígenes de la replicación) y los marcadors genéticos seleccionables . El marcador genético seleccionable facilita la selección de las células huéspedes dentro de las cuales el vector ha sido introducido (véanse, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, de manera normal el marcador genético seleccionable confiere resistencia al fármaco, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera dentro de la cual el vector ha sido introducido. Los marcadores genéticos seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para utilizar en las células huéspedes dhfr" con selección / amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418). Una cantidad de lineas celulares son células huéspedes adecuadas para la expresión recombinante. Las lineas celulares de céluls huéspedes de mamíferos incluyen, por ejemplo, las células COS, las células CHO, las células 293T, las células A431, las células 3T3, las células CV-1, las células HeLa, las céluls L, las células BHK21, las células HL-60, las células U937, las células HaK, las células Jurkat, al igual que las cepas celulares derivadas del cultivo in vi tro del tejido primario y de los explantes primarios.
Alternativamente, puede ser posible producir polipéptidos de manera recombinante en los eucariotas menores tales como la levadura (por ejemplo, las cepas Saccharomyces, Pi chia , Kluyveromyces, y Candida ) o en las procariotas (por ejemplo, Escherichia coli , Bacillus subtilis, y Salmonella typhimurium) . Los polipéptidos efectuados en las levaduras o en las bacterias se pueden modificar, por ejemplo, la glicosilación de los sitios adecuados. Los polipéptidos también se pueden producir en las células de animales, por ejemplo, las células de insectos o de mamíferos. Por ejemplo, una secuencia que codifica al polipéptido se pueden insertar dentro de un vector de expresión de un insecto, tal como el vector del baculovirus, y se puede utilizar en el sistema de expresión celular de un insecto (por ejemplo, el kit MAXBAC, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los polipéptidos que se describen en la presente invención pueden purificarse a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares utilizando los procesos conocidos de purificación, tales como el gel de filtración y la cromatografía de intercambio de iones. La purificación también puede incluir la cromatografía por afinidad con los agentes conocidos para unirse a los polipéptidos que se describen en la presente invención. De manera alternativa, los polipéptidos que se describen en la presente invención también se pueden expresar de manera recombinante en una forma que facilita la purificación. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden expresar como las fusiones con las proteínas tale scomo la proteina que se une a la maltosa (MBP) , glutatión-S-transferasa (GST) , o la tioredoxina (TRX) o como las fusiones con hexa-histidina, penta-histidina, o los pequeños rótulos de epitope, por ejemplo, el epitope de FLAG. Los polipéptidos que se describen en la presente invención también abarcan las moléculas que son estructuralmente diferentes de los polipéptidos descritos (por ejemplo, que tienen una secuencia ligeramente alterada), pero que tienen esencialmente las mismas propiedades bioquímicas que los polipéptidos descritos (por ejemplo, son modificadas sólo en los residuos de aminoácidos funcionalmente no esenciales) . Tales moléculas incluyen las variantes alélicas que se producen naturalmente y las variantes construidas deliberadamente que contienen alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o eliminaciones. Las técnicas para tales alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o eliminaciones son bien conocidas para las personas idóneas en la técnica. Agentes Aglutinantes de IL-13 También se proporcionan agentes aglutinantes, que no sean agentes aglutinantes consistentes en anticuerpos y sus fragmentos, que se unen a IL-13, particularmente agentes aglutinantes que compiten con mAbl3.2 y otros anticuerpos que se describen aqui para unirse con IL-13. Por ejemplo, los agentes aglutinantes se pueden unir al mismo epitope o un epitope superpuesto, tal como mAbl3.2 sobre IL-13. Los agentes aglutinantes preferiblemente inhiben o neutralizan la actividad de IL-13. Por ejemplo, los agentes aglutinantes inhiben la unión de IL-13 a IL-4R , y, por ejemplo, no previenen la unión de IL-13 a IL-13Ral. Los agentes aglutinantes se pueden utilizar en los métodos que se describen aqui, por ejemplo, los métodos para el tratamiento y prevención de desórdenes. Todas las modalidades que se describen aqui se pueden adaptar para su uso con agentes aglutinantes de IL-13. Los agentes aglutinantes se pueden identificar por un número de medios, incluyendo la modificación de un dominio variable que se describe aqui o la inserción de uno o más CDR de un dominio variable que se describe aqui sobre otro andamiaje. Los agentes aglutinantes también se pueden identificar a partir de diversas bibliotecas, es decir, por despistaje. Un método para el despistaje de bibliotecas de proteínas utiliza la exposición de fagos. Se varían algunas regiones en particular de proteínas y se identifican las proteínas que interactúan con IL-13, por ejemplo, por retensión sobre un soporte sólido y por otra asociación fisica. Para identificar los agentes aglutinantes particulares que se unen al mismo epitope o a un epitope superpuesto como mAbl3.2 sobre IL-13, los agentes aglutinantes se eluyen con la adición de mAbl3.2 (o un anticuerpo relacionado) , o los agentes aglutinantes se pueden evaluar en experimentos de competencia con mAbl3.2 (o un anticuerpo relacionado) . También se puede agotar la biblioteca de agentes que se unen a otros epitopes al poner en contacto la biblioteca con un complejo que contiene IL-13 y mAbl3.2 (o un anticuerpo relacionado). La biblioteca agotada se puede poner en contacto con IL-13 para obtener un agente aglutinante que se une a IL-13 pero no a IL-13 cuando está unido por mAbl3.2. También es posible usar péptidos de IL-13 que contienen el péptido de mAbl3.2 como objetivo. La exposición de fagos se describe por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; los documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; WO 94/05781; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Na ture 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol . 267:129-49; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982. La exposición del sustrato de levadura se describe, por ejemplo, en Boder and Wittrup (1997) Na t . Biotechnol . 15:553-557. Otra forma de exposición es la exposición de ribosama. Véase, por ejemplo, a Mattheakis et al. (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Na t Biotechnol . 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol . 328:404-30. y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods . 231(1-2) :119-35. Los agentes aglutinantes que unen al IL-13 pueden tener características estructurales de un andamiaje de proteínas, por ejemplo, un dominio doblado. Un dominio de andamiaje ejemplar, basado en un anticuerpo, es un andamiaje "minicuerpo" que se diseña por la supresión de tres cadenas beta de un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclónico (Tramontano et al., 1994, J. Mol . Recogni t . 7:9; y Martin et al., 1994, The EMBO Journal 13, pp. 5303-5309). Estos dominios incluyen 61 residuos y se pueden usar para presentar dos bucles hipervariables, por ejemplo, uno o más bucles hipervariables de un dominio variable que se describe aqui o una variante que se describe aqui. En otro enfoque, el agente aglutinante incluye un dominio de andamiaje que es un dominio V-like (Coia et al. WO 99/45110). Los dominios V-like se refieren a un dominio que presenta características estructurales similares a dominios de anticuerpos variables pesados (VH) o ligeros (VL) . Otro dominio de andamiaje se deriva de tendamistatina, un residuo 74, una hoja beta tipo sandwich de seis hebras que se mantiene unida por dos uniones de disulfidos (McConnell y Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460). Las proteínas padre incluyen tres bucles. Los bucles se pueden modificar (por ejemplo, utilizado los CDR o los bucles hipervariables que se describen aqui) o se pueden variar, por ejemplo, para seleccionar dominios que se unen a IL-13. El documento WO 00/60070 describe una estructura sandwich tipo ß derivada del dominio extracelular de CTLA-4 que ocurre en forma natural que se utiliza como andamiaje. Aún otro dominio de andamiaje para un agente aglutinante IL-13 es un dominio basado en un dominio de fibronectina tipo III o proteínas relacionadas similares a la fibronectina. El doblez global del dominio de la fibronectina tipo III (Fn3) está estrechamente relacionado con el de los fragmentos de los anticuerpos funcionales más pequeños, la región variable o el anticuerpo de cadena pesada. El Fn3 es un sandwich tipo D similar al del anticuerpo del dominio VH, excepto que el Fn3 tiene siete hebras D en vez de nueve. Hay tres bucles en la terminación del Fn3; las posiciones de los bucles BC, DE y FG aproximadamente corresponden a las de CDRl, 2 y 3 del dominio VH del anticuerpo. El Fn3 es muy ventajoso porque no tiene uniones de disulfidos. Por tanto, el Fn3 es estable bajo condiciones reducidas, al contrario de los anticuerpos y sus fragmentos (ver los documentos WO 98/56915; WO 01/64942; WO 00/34784). Un dominio Fn3 se puede modificar (por ejemplo, utilizando las CDR o bucles hipervariables que se describen aqui) o se puede variar, por ejemplo, para seleccionar dominios que se unen a IL-13. Aún otro andamiaje ejemplar incluye: receptores de células T; proteínas MHC; dominios extracelulares (por ejemplo, repeticiones de fibronectina Tipo III, repeticiones de EGF) ; inhibidores de la proteasa (por ejemplo, dominios Kunitz, ecotin, PBTI y similares); repeticiones de TPR; estructuras trifoil; dominios de dedos de zinc; proteínas que se unen al ADN; particularmente proteínas que se unen al ADN monomérico; proteínas que se unen al ARN; chaperones, por ejemplo, tioredoxina y proteínas de choque térmico; y dominios de señalización intracelular (tales como los dominios SH2 y SH3) . La patente Norteamericana No. 20040009530 describe ejemplos de andamiajes alternos. Algunos ejemplos de dominios de andamiajes pequeños incluyen: dominios Kunitz (58 aminoácidos, 3 uniones de disulfidos), dominios inhibidores de tripsina máxima cucurbida (31 aminoácidos, 3 uniones de disulfidos), dominios relacionados a la guanilia (14 aminoácidos, 2 uniones de disulfidos), dominios relacionados a la enterotoxina IA con estabilidad térmica de la bacteria gram negativa (18 aminoácidos, 3 uniones de disulfidos), dominios fúngicos que se unen a los carbohidratos (35 aminoácidos, 2 uniones de disulfidos), dominios de endotelina (18 aminoácidos, 2 uniones de disulfidos) y dominios de estreptococos G que se unen a IgG (35 aminoácidos, sin uniones de disulfidos) . Algunos ejemplos de dominios de andamiajes intracelulares pequeños incluyen SH2, SH3 y dominios EVH . De forma general se puede utilizar cualquier dominio intracelular o extracelular . Algunos ejemplos de criterios para evaluar un dominio de andamiaje pueden incluir: (1) secuencia de aminoácidos, (2) secuencias de varios dominios homólogos, (3) estructuras tridimensionales y/o (4) datos de estabilidad sobre un rango de pH, temperatura, salinidad, solvente orgánico, concentración de oxidantes. En una modalidad, el dominio de andamiaje es un dominio estable de proteínas, por ejemplo, una proteina de menos de 100, 70, 50, 40 o 30 aminoácidos. El dominio puede incluir una o más uniones de disulfidos o puede ser un quelado de un metal, por ejemplo, zinc. Aún otros agentes aglutinantes se basan en los péptidos, por ejemplo, proteínas con una secuencia de aminoácidos que es menor a 30, 25, 24, 20, 18, 15 o 12 aminoácidos. Los péptidos se pueden incorporar en una proteina más grande, pero de forma normal a una región que se puede unir de forma independiente a IL-13, por ejemplo, a un epitopo que se describe aqui. Los péptidos pueden identificarse por medio de exhibición de fagos. Un agente aglutinante de IL-13 puede incluir uniones que no sean péptidas y otras modificaciones químicas. Por ejemplo, el agente aglutinante se puede sintetizar en todo o en parte como un peptidomimético, por ejemplo, un peptoide (ver, por ejemplo, Simón et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367-71 y Horwell (1995) Trends Biotechnol .13 : 132-4 ) . Un agente aglutinante puede incluir una o más (por ejemplo, todas) uniones no hidrolizables. En la ciencia se conocen muchas uniones de péptidos no hidrolizables, junto con los procedimientos para la síntesis de péptidos que contienen las uniones. Ejemplos de uniones no hidrolizables incluyen uniones bajas en amidas - [CH2NH]--péptidas, uniones quetometilenas [COCH2] --péptidas, uniones -- [CH (CN) NH] -- (cianometileno) amino péptidas, uniones hidroxietilena -[CH2CH(OH)] —péptidas, uniones --[CH20]--péptidas y uniones tiometilena — [CH2S] --péptidas (ver por ejemplo, la patente de Norteamericana No. 6,172,043). Composición Farmacéutica, Dosificaciones y Modos de Administración Los anticuerpos anti-IL-13 (u otros agentes aglutinantes de IL-13) se pueden incorporar en una composición farmacéutica, por ejemplo, por combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición tal puede contener, por ejemplo, los diversos diluyentes, rellenos cargadores, sales, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica anterior. La denominación "farmacéuticamente aceptable" significa que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. Las características del portador pueden depender de la via de administración. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros factores, tales como, pero que no se limitan a, otros anticuerpos de anticitoquinas u otros agentes antiinflamatorios tal como se describe con mayor detalle más abajo. Tales factores adicionales y/o agentes pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergistico con un anticuerpo que se describe aqui. Por ejemplo, en el tratamiento del asma alérgico, una composición farmacéutica puede también incluir los anticuerpos anti-IL-4 o los fármacos conocidos para reducir una respuesta alérgica. En una modalidad, la composición farmacéutica incluye al anticuerpo IL-13 como el único ingrediente biológico (por ejemplo, el único componente proteinico) o el único ingrediente biológicamente activo. Por ejemplo, la composición puede incluir menos de 25, 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1, 0.4, o 0.1% de otros componentes proteinicos pero por peso respectivo. Las composiciones farmacéuticas pueden estar bajo la forma de un liposoma en el cual se combina un anticuerpo de la invención, de manera adicional con otros portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico, con agentes amfipáticos tales como los lipidos que existen en la forma agregada como las micelas, las monocapas insolubles, los cristales líquidos, o las capas lamelares mientras que están en solución acuosa. Los lipidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitaciones, los monoglicéridos, los diglicéridos, los sulfátidos, la lisolecitina, los fosfolipidos, la panonina, los ácidos biliares y otros similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de idoneidad en la técnica anterior, según se descrito, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; y 4,737,323, todas las cuales se incorporan a la presente invención a modo de referencia. Tal como se utiliza en la presente invención, la denominación "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o del método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo, la mejoría de los síntomas de, la sanación de, o el aumento de la velocidad de sanación de tales condiciones. Cuando se aqplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente sólo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado un efecto terapéutico, ya sea que se administre en forma combinada, en forma serial o simultánea. En la práctica de un método ejemplar de tratamiento o de uso que se describe en la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo que se une a la IL-13 e interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13 (y, por ejemplo, neutraliza o inhibe una o más actividades asociadas con la IL-13) , se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, mamífero (por ejemplo, un humano) . Un anticuerpo puede administrarse de acuerdo con los métodos que se describen ya sea solos o en combinación con otras terapias tales como los tratamientos que utilizan las citoquinas, las linfoquinas u otros factores hematopoyéticos, o los angentes antiinflamatorios. Cuando se administran en forma conjunta con uno o más agentes, el anticuerpo se puede adminsitrar ya sea de manera simultánea con el segundo agente, o separadamente, por ejemplo, en forma secuencial. En caso de administrarse separadamente, por ejemplo, en forma secuencial, el médico responsible decidirá sobre la secuencia adecuada de administración del anticuerpo combinado con los otros agentes. La administración de una composición farmacéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contenga un anticuerpo que se una a IL-13) se puede llevar a cabo en una variedad de maneras convencionales, tales como la ingesta oral, la inhalación o la inyección cutánea, subcutánea, o endovenosa. Se prefiere la administración subcutánea al paciente . Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a la IL-13 e interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la II-13 se administra por via oral, el agente de unión estará en la forma de un comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimidos, una composición farmacéutica puede contener de manera adicional un portador sólido como por ejemplo una gelatina o un adyuvante. El comprimido, la cápsula y el polvo contienen desde aproximadamente 1 5 hasta el 95% del agente de unión y con preferencia desde aproximadamente 1 25 hasta el 90% del agente de unión. Cuando se administra en forma liquida, se puede agregar un portador liquido tal como el agua, el petróleo, los aceites de origen animal o de una planta tales como el aceite de mani, el aceite mineral, el aceite de soja o el aceite de sésamo, o los aceites sintéticos. La forma liquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales com el etilenglicol, el propilenglicol o el polietilenglicol. Cuando se administra en forma liquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 hasta 90% por peso del agente de unión y con preferencia desde aproximadamente 1 a 50% del agente de unión. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une a la IL-13 se administra por medio de inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en la forma de una solución acuosa, libre de pirógenos, aceptable desde el punto de vista parenteral. La preparación de tales soluciones proteicas aceptables desde el punto de vista parenteral, que tienen debida consideración del pH, la isotonicidad, la estabilidad y otros similares, está dentro de la idoneidad del arte previo. Una composición farmacéutica preferida para las inyeccions endovenosas, cutáneas o subcutáneas deben contener, de manera adicional al agente de unión un vehículo isotónico tal como la Inyección de Cloruro de Sodio, la Inyección de Ringer, la Inyección de Dextrosa, la Dextrosa y la Inyección de Cloruro de Sodio, la Inyección de Lactato de Ringer u otro vehículo como los que se conocen en la técnica anterior. Una composición farmacéutica también puede contener estabilizadores, conservantes, soluciones amortiguadoras, antioxidants u otros aditivos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
La cantidad de un anticuerpo (u otro agente aglutinante de IL-13) en la composición farmacéutica puede depender de la naturaleza y la severidad de la condición que está siendo tratada, y de la naturaleza de los tratamientos previos a los cuales se sometió el paciente. En último término, el médico a cargo decidirá la cantidad de anticuerpo con el cual tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico a cargo administrará dosis bajas del anticuerpo y observará la respuesta del paciente. Las dosis más altas del anticuerpo se pueden adminsitrar hasta obtener el efecto terapéutico óptimo para el paciente y en ese punto la dosificación por lo general no aumenta más. Por ejemplo, se pueden adminsitrar dosis comprendidas dentro del rango de 0.1-50 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 1 -100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 0.1-15 mg/kg, o 1-8 mg/kg de peso corporal. La composición farmacéutica se puede administrar a pacientes normales o a pacientes que no muestran síntomas, por ejemplo, de modo profiláctico. Inhalación: Una composición que incluye un anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se pueden formular para la inhalación u otro modo de liberación pulmonar. Por consiguiente, los compuestos que se describen en la presente invención se pueden administrar por medio de inhalación hacia el tejido pulmonar. La denominación "tejido pulmonar" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier tejido del tracto respiratorio e incluye tanto el tracto respiratorio superior como el inferior, excepto cuando se indica de otra manera. Un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo se puede administrar en combinación con una o más de las modalidades existentes para tratar las enfermedades pulmonares. En un Ejemplo, el compuesto es formulado para un nebulizador. En una modalidad, el compuesto se puede almacenar en una forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituirse en la solución antes de la inhalación. También es posible formular el compuesto para la inhalación utilizando un dispositivo médico, por ejemplo, un inhalador (ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,102,035 (un inhalador en polvo) y 6.012.454 (un inhalador en polvo seco) . Elinhalador puede incluir compartimientos separados para el compuesto activo a un pH adecuado para el almacenamiento y otro compartimiento para una solución amortiguadora neutralizadora y un mecanismo para combinar el compuesto con una solución amortiguadora neutralizadora inmediatamente antes de la atomización. En una modalidad, el inhalador es un inhalador dosificador. Los tres sistemas comunes utilizados para liberar fármacos en forma local hacia los pasajes de aire pulmonar incluyen los inhaladores de polvo seco (DPIs) , los inhaladores dosificadores (MDI) y los nebulizadores. Los MDI, utilizados en el modo de administración por inhalación más popular, pueden utilizarse para liberar medicamentos en una forma solubilizada o como una dispersión. De manera normal los MDI comprenden un Feón u otro propelente de presión con vapor relativamente alto que fuerza la medicación en forma de aerosol dentro del tracto respiratorio ante la activación del dispositivo, a diferencia de los MDI, los DPI por lo general confian completamente en los esfuerzos respiratorios del paciente para introducir un medicamento en forma de un polvo seco hacia los pulmones. Los nebulizadores forman un aerosol del medicamento para inhalarse impartiendo energía a una solución liquida. La liberación pulmonar directa de los fármacos durante la ventilación del liquido o el lavado pulmonar utilizando el medio fluoroquimico también se ha explorado. Estos y otros métodos se pueden utilizar para liberar un anticuerpo IL-13 o un fragmento del mismo. En una modalidad, el anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se asocial con un polímero, por ejemplo, un polímero que estabiliza o aumenta la vida media del compuesto. Por ejemplo, para la adminsitración por inhalación, un anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se libera en forma de spray en aerosol desde un recipiente presurizado que contiene un propelente adecuado o un nebulizador. El compuesto puede estar en la forma de una partícula seca o un liquido. Las partículas que incluyen al compuesto se pueden preparar, por ejemplo, por secado con spray, por secado de una solución acuosa del anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo con un agente neutralizante de carga y luego creando partículas del polvo seco, o secando una solución acuosa en un modificador orgánico y luego creando partículas del polvo seco. El compuesto se puede liberar de manera conveniente en una forma de presentación de spray en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcinando una válvula para liberar una cantidad dosificada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos para utilizar en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla de polvo de un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo y una base de polvo adecuada tal como la lactosa o el almidón, si la partícula es una partícula formulada. De manera adicional al compuesto formulado o no formulado, otros materiales tales como el DPPC al 100% u otros tensioactivos se pueden mezclar con el anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo para promover la liberación del compuesto formulado o no formulado. Los métodos para preparar partículas secas se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT WO 02/32406. Un anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se pueden formular para la liberación en aerosol, por ejemplo, como partículas secas en aerosol, de manera tal que cuando se andministra puede absorberse rápidamente y puede producir un resultado terapéutico local o sistémico rápido. La adminsitración se puede ajustar a medida para proporcionar una actividad detectable a los 2 minutos, 5 minutos, 1 hora, o 3 horas de administración. En otras modalidades, la actividad pico se puede lograr aún más rápidamente, por ejemplo, dentro de los 30 minutos o aún dentro de los 10 minutos. Un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo se pueden formular para una vida media biológica más prolongada (por ejemplo, por asociación con un polímero tal como PEG) y se puede utilizar como una alternativa para otros modos de administración, por ejemplo, de manera tal que el compuesto ingrese a la circulación desde los pulmones y se distribuya a otros órganos o aun órgano objetivo en particular . En una modalidad, el anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se libera en una cantidad tal que por lo menos un 5% de la masa de los polipéptidos se libere al tracto respiratorio inferior o el pulmón profundo. El pulmón profundo tiene una red de capilares extremadamente rica. La membrana respiratoria que separa el lumen capilar del espacio de aire alveolar es muy delgada y extremadamente permeable. De manera adicional, la capa liquida que reviste la superficie alveolar es rica en tensioactivos pulmonares. En otras modalidades, por lo menos 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ó 80% de la composición de un anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo se libera hacia el tracto respiratorio inferior o el pulmón profundo. La liberación hacia cualquiera o ambos de estos tejidos da como resultado la absorción eficiente del compuesto y una alta biodisponibilidad. En una modalidad, el compuesto se proporciona en una dosis regulada utilizando, por ejemplo, un inhalador o un nebulizador. Por ejemplo, el compuesto se libera en una forma de unidad de dosificación de por lo menos aproximadamente de 0.02, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 10, 20, 40, ó 50 mg/puff o más. El porcentaje de biodisponibilidad se puede calcular de la manera siguiente: el porcentaje de biodisponibilidad = (AUCnoinvasivo/AUCi . v. o s.c.) x (dosisi.v. ó s . c. /dosisnoinvasiva) x 100. A pesar de no ser necesario, los realzadores de la liberación tales como los tensioactivos se pueden utilizar además para mejorar la liberación en el pulmón. Un "tensioactivo" como se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto que tenga mitades hidrofilicas y lipofilicas que promuevan la absorción de un fármaco por interactuación con una interface entre dos fases que no se pueden mezclar. Los tensioactivos son útiles con partículas secas por muchas razones, por ejemplo, la reducción de la aglomeración de partículas, la reducción de fagocitosis de los macrófagos, etc. Cuando se acopla con el tensioactivo pulmonar, se puede lograr una absorción más eficiente del compuesto debido a los tensioactivos, tales como DPPC, facilitarán en gran medida la difusión del compuesto. Los tensioactivos son bien conocidos en la técnica anterior e incluyen, pero no se limitan a, los fosfoglicéridos, por ejemplo, las fosfatidilcolinas, el L-alfa-fosfatidilcolina dipalmitoilo (DPPC) y el difosfatidil glicerol (DPPG) ; el hexadecanoi; los ácidos grasos, el polietilenglicol (PEG) ; el poloxietileno-9-; el éter de aurilo; el ácido palmitico; el ácido oleico; el sorbitan triolato (SPAN™ 85) ; el glicolato; el surfactin; el poloxómero; el éster de ácido graso sorbitano; el trioleato de sorbitano; el tiloxapol y los fosfolipidos .
Estabilización y Retención En una modalidad, un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo se asocia físicamente con una porción que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, por ejemplo, en la sangre, el suero, la linfa, el lavado broncopulmonar o broncoalveolar u otros tejidos, por ejemplo, mediante por lo menos 1.5, 2, 5, 10, ó 50 veces. Por ejemplo, un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo se puede asociar con un polímero, por ejemplo, un polímero esencialmente no antigénico, tal como los óxidos de polialquileno o los óxidos de polietileno. Los polímeros adecuados variarán de manera sustancial por el peso. Se pueden utilizar polímeros que tienen pesos moleculares de un número promedio comprendido desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente de 35.000 (o aproximadamente de 1.000 a aproximadamente de 15.000, o aproximadamente de 2.000 a aproximadamente de 12.500). Por ejemplo, un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo se pueden conjugar con un polímero soluble en agua, por ejemplo, los polímeros de polivinilo hidrofilicos, por ejemplo el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de tales polímeros incluye los homopolimeros de óxido de polialquileno tales como el polietilenglicol (PEG) o los propilenglicoles, los polioles polioxietilenados, los polioles, los copolimeros de los mismos y Iso copolimeros de los mismos en bloque , con tal que la solubilidad en agua de los copolimeros en bloque se mantenga. El peso molecular del polímero puede oscilar hasta aproximadamente de 500.000 Da, y con preferencia es por lo menos de aproximadamente 20.000 Da, o por lo menos de aproximadamente 30.000 Da, o por lo menos de aproximadamente 40.000 Da. El peso -molecular elegido puede depender del tamaño efectivo del conjugado que se debe lograr, la naturaleza (por ejemplo, la estructura, como lineal o ramificada) del polímero y el grado de derivación. Una unión covalente se puede utilizar para unir un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo con un polímero, por ejemplo, la unión cruzada con el grupo amino N-terminal del anticuerpo y los grupos amino epsilon hallados en los residuos de Lisina del anticuerpo, al igual que otros grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrofilicos. Los polímeros funcionalizados PEG que se pueden unir a un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo están disponibles, por ejemplo, en Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Las condiciones de reacción para el acomplamiento de PEG y otros polímeros puede variar en función del anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo, el grado deseado de PEGilación y el polímero utilizado. Algunos factores involucrados en la elección de los derivados de PEG incluyen: el punto de unión deseado (como por ejemplo los grupos R de la lisina o la cisteina) , la estabilidad hidrolitica y la reactividad de los derivados, la estabilidad, la toxicidad y la antigenicidad de la unión, la conveniencia de su análisis, etc. Las instrucciones especificas para el uso de cualquier derivado en particular están disponibles por parte del fabricante. Los conjugados de un anticuerpo de la IL-13 o un fragmento del mismo y un polímero se pueden separar de los materiales de inicio sin reaccionar, por ejemplo, por filtración por gel o cromatografía de intercambio de iones, por ejemplo, HPLC. Las especies heterólogas de los conjugados se pueden purificar de uno al otro de la misma manera. La resolución de especies diferentes (por ejemplo que contienen uno o dos residuos PEG) también es posible debido a la diferencia en las propiedades iónicas de los aminoácidos no sometidos a reacción (ver, por ejemplo, e documento WO 96/34015) .
Usos Terapéuticos y Profiláctivcos de los anticuerpos anti-IL-13 Aún en otro aspecto, esta descripción presenta un método para neutralizar y/o inhibir una o más actividades asocidadas de la IL-13 in vivo por medio de la administración de un anticuerpo que se una y/o neutralice al IL-13, por ejemplo, un anticuerpo descrito aqui en una cantidad suficiente para inhibir su actividad. Los anticuerpos también se pueden administrar a los pacientes para los cuales se requiere la inhibición de una respuesta inflamatoria mediada por la IL-13. Estas condiciones incluyen, por ejemplo, la inflamación de las vías aéreas, el asma, la fibrosis, la eosinofilia y la mayor producción de moco. Hemos mostrado que un anticuerpo que se une a IL-13 reduce la inflamación de las vías aéreas en los monos cynomolgus expuestos al alérgeno Ascaris suum (Ejemplo 3.6). También hemos demostrado la regulación por aumento por IL-13 de CD23 en los monocitos de sangre periférica humana. Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en la presente invención que se unen a IL-13, interfieren con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13, y pueden neutralizar una o más actividades asociadas con la IL-13, se pueden utilizar para reducir la inflamación in vivo mediada por la IL-13, por ejemplo, para tratar o prevenir las patologías asociadas con la IL-13, que incluyen el asma y/o sus síntomas asociados y/o los trastornos atópicos (por ejemplo, que resultan del aumento de sensibilidad a la IL-13) . Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en la presente invención se pueden utilizar para tratar un trastorno asociado con la IL-13, por ejemplo, un trastorno elegido a partir de uno o más de: los trastornos respiratorios, por ejemplo, el asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, el asma debida a la infección con, por ejemplo, el virus sincitial respiratorio (RSV) , por ejemplo, en los niños de menor edad) ) , la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , y otras condiciones que implican la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco, por ejemplo, la fibrosis quistica y la fibrosis pulmonar; los trastornos atópicos, por ejemplo, que resultan de una mayor sensibilidad a la IL-13, (por ejemplo, la dermatitis atópica, la urticaria, el eczema, la rinitis alérgica, y la enterogastritis alérgica) ; las condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel (por ejemplo, la dermatitis atópica), los órganos gastrointestinales (por ejemplo, las enfermedades intestinales inflamatorias (IBD), tales como la colitis ulcerosa y/o la enfermedad de Crohn), el higado (por ejemplo, la cirrosis, el carcinoma hepatocelular) , y el escleroderma; los tumores y los cánceres (por ejemplo, los tumores de tejido blando y sólido), como la leucemia, el glioblastoma, y el linfoma, por ejemplo, el linfoma de Hodgkin; las infecciones virales (por ejemplo, de HTLV-1); la fibrosis de otros órganos, por ejemplo, la fibrosis hepática, (por ejemplo, la fibrosis provocada por una hepatitis B y/o el virus C) ; y la supresión de la expresión de las respuestas inmunes protectoras de tipo 1, (por ejemplo, durante la vacunación), como se describe en la presente invención.
Trastornos respiratorios Los antagonistas de la IL-13, (por ejemplo, un agente que se una al IL-13 tal como un anticuerpo o un fragmento aglutinante de un antigeno que se describe aqui ) , se pueden utilizar para tratar o prevenir los trastornos respiratorios que incluyen, pero no se limitan al asma (por ejemplo, el asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, debida a la infección, por ejemplo, con el virus sincitial respiratorio (RSV) , por ejemplo, en los niños de menor edad) ) ; la bronquitis (por ejemplo, la bronquitis crónica) ; la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) (por ejemplo, el enfisema (por ejemplo, el enfisema inducido por el cigarrillo) ; las condiciones que implican la inflamación de las vías aéreas, la eosinofilia, la fibrosis y la producción excesiva de moco, por ejemplo, la fibrosis quistica, la fibrosis pulmonar y la rinitis alérgica. El asma se puede disparar por medio de innumerables condiciones, por ejemplo, la inhalación de un alérgeno, la presencia de una infección en el tracto respiratorio superior o de una infección auditiva, etc. (Opperwall (2003) Nurs . Clin . North Am . 38:697-711). El asma alérgico se caracteriza por la hipersensibilidad de las vias aéreas (AHR) a una variedad de estímulos específicos y no específicos, la elevada inmunoglobulina E (IgE) en suero, la excesiva producción de moco en las vias aéreas, el edema y la lesión epitelial bronquial (Wills-Karp, supra ) . El asma alérgica comienza cuando el alérgeno provoca una respuesta inmediata temprana de las vias aéreas, la cual con frecuencia es seguida muchas horas más tarde por una fase tardía demorada de la respuesta de las vias aéreas (LAR) (Henderson et al. (2000) J. Immunol . 164:1086-95). Durante la LAR, hay un influjo de los esosinófilos, los linfocitos, y los macrófagos a lo largo de la pared de las vias aéreas y el liquido bronquial. (Henderson et al., supra ) . La eosinofilia pulmonar es un sello distintivo del asma alérgico y es responsible de gran parte del daño del epitelio respiratorio (Li et al. (1999) J. Immunol . 162:2477-87) . Las células CD4+ T axuxiliares (Th) son importantes para la inflamación crónica asociada con el asma (Henderson et al., supra ) . Diversos estudios han demostrado que el compromiso de las células CD4+ con las células T helper de tipo 2 (Th2) y la producción subsiguiente de citoquinas de tipo 2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13) son importantes en la respuesta inflamatoria alérgica que conduce a AHR (Tomkinson et al. (2001) J. Immunol . 166:5792-5800, y las referencias que se citan en la presente invención) . En primer lugar, las células CD4+ T han demostrado que son necesarias para el asma inducida por alergi en los modelos murinos. En segundo lugar, las células CD4+ T que producen citoquinas de tipo 2 se someten a una expansión no solamente en estos modelos animales sino también en pacientes con asma alérgica. En tercer lugar, los niveles de citoquina de tipo 2 aumentan en los tejidos de las vias aéreas de modelos animales y en los asmáticos. En cuarto lugar, las citoquinas Th2 han estado involucradas al desempeñar un papel central en el reclutamiento de eosinófilos en modelos murinos de asma alérgico y las células Th2 transferidas de manera adoptiva han sido correlacionadas con mayores niveles de eotaxina (una sustancia que atrae químicamente eosinófilos de manera potente) en el pulmón al igual que la eosinofilia pulmonar (Wills-Karp et al., supra ; Li et al., supra ) . Los métodos para tratar o prevenir el asma que se describen aqui incluyen aquéllos para el asma extrínseca (que también se conocen como el asma alérgica o el asma atópica) , el asma intrínseca (que también se conoce como el asma no alérgica o el asma no atópica) o las combinaciones de ambas, la cual se ha denominado como asma mixta. El asma extrínseca o alérgica incluye los incidentes provocados por, o asociados con, por ejemplo, los alérgenos, como por ejemplo los pólenes, las esporas, los pastos o las malezas, caspa de las mascotas, polvo, ácaros, etc. Dado que los alérgenos y otros irritantes se presentan ellos mismos en distintos puntos que varían a lo largo del año, estos tipos de incidentes también se denominan asma estacional. También se incluye en el grupo del asma extrínseca el asma bronquial y la aspergilosis broncopulmonar alérgica. Los trastornos que se pueden tratar o aliviar por medio de los agentes que se describen en la presente invención incluyen los de los los trastornos respiratorios y el asma provocada por agentes infecciosos, tales como los virus (por ejemplo, los virus del resfrio y de la gripe, el virus sincitial respiratorio (RSV) , el paramixovirus, el rinovirus y los virus de la influenza. Las infecciones por RSV, rhinovirus y virus de la influenza son communes en los niños, y constituyen una causa principal de las enfermedades del tracto respiratorio en las criaturas y en los niños. Los niños con bronquiolitis viral pueden desarrolar la respiración dificultosa crónica y el asma, que se pueden tratar utilizando los métodos que se describen en la presente invención. También se incluyen las condiciones asmáticas que podrían desencadenarse en algunos asmáticos por medio del ejercicio y/o el aire frió. Los métodos son útiles para los casos de asma asociados con la exposición al humo del cigarrillo (por ejemplo, el humo inducido por el cigarrillo y el humo industrial), al igual que las exposiciones industriales y ocupacionales, como por ejemplo el humo, el ozono, los gases nocivos, el dióxido de azufre, el óxido nitroso, los vapores, que incluyen los isocianatos, de la pintura, los plásticos, los poliuretanos, los varnices, etc., la madera, los polvos de las plantas u otros polvos orgánicos, etc. Los métodos también son útiles para los incidents asmáticos asociados con los aditivos de los alimentos, los conservantes o los agentes farmacológicos.
También se incluyen los métodos para tratar, inhibir o aliviar los tipos de asma denominados como asma silente o asma con variante de tos. Los métodos que se describen en la presente invención también son útiles para el tratamiento y el alivio del asma asociada con el reflujo gastroesofágico (GERD) , el cual puede estimular la broncoconstricción. GERD, junto con las secreciones retenidas en forma corporal, suprimieron la tos y la exposición a los alérgenos y los irritantes en el dormitorio pueden contribuir a las condiciones asmáticas y han sido denominadas en forma colectiva como el asma de noche o e asma nocturna. En los métodos de tratamiento, la inhibición o el alivio del asma asociada con GERD, una cantidad efectiva desde el punto de vista farmacéutico del antagonista de IL-13 se puede utilizar como se describe en la presente invención en combinación con una cantidad efectiva desde el punto de vista farmacéutico de un agente para tratar GERD. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, los agents inhibidores de la bomba de protons como los comprimidos de la marca PROTONIX® de pantoprazol sódico de liberación lenta, las cápsulas de la marca PRILOSEC® de omeprazol de liberación lenta, los comprimidos de la marca ACIPHEX® de rebeprazol sódico de liberación lenta o las cápsulas de la marca PREVACID® de lansoprazol de liberación lenta.
Los trastornos atópicos y los Síntomas de los mismos "Atópico" se refiere a un grupo de enfermedades en las cuales a menudo existe una tendencia heredada a desarrollar una reacción alérgica. Los ejemplos de los trastornos atópicos incluyen la alergia, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, el asma y la fiebre del heno. El asma es un trastorno fenonormalmente heterogéneo asociado con síntomas respiratorios intermitentes tales como, por ejemplo, la hipersensibilidad bronquial y la obstrucción reversible del flujo de aire. Las características inmunohistopatológicas del asma incluyen, por ejemplo, la erosión del epitelio de las vias aéreas, la deposición de colágeno por debajo de la membrana del basamento, el edema, la activación de los mastocitos y la infiltración de las células inflamatorias (por ejemplo, por parte de los neutrófilos, los eosinófilos y los linfocitos) . La inflamación de las vias aéreas puede contribuir además a la hipersensibilidad de las vias aéreas, la limitación del flujo de aire, la broncoconstricción aguda, la formación de un tapón de moco, la remodelación de las paredes de las vias aéreas y otros síntomas respiratorios. Se puede administrar un antagonista de la IL-13 (por ejemplo, un agente aglutinante de IL-13 tal como un un anticuerpo o un fragmento de antigeno aglutinante) para mejorar uno o más de estos síntomas.
Los síntomas de la rinitis alérgica (fiebre del heno) incluyen picazón y goteo de nariz, estornudos o obstrucción en la nariz y picazón en los ojos. Se puede administrar un antagonista de la IL-13 para mejorar uno o más de estos síntomas. La dermatitis atópica es una enfermedad crónica (de duración prolongada) que afecta la piel. La información relacionada con la dermatitis atópica está disponible, por ejemplo, en la Publicación NIH No. 03-4272. En la dermatitis atópica, la piel puede llegar a picar extremadamente, producir enrojecimiento, inflamación, piel reseca, sudoración de liquido transparente, y finalmente, asperezas, escamación y engrosamiento. En muchos casos, estos son periodos de tiempo durante los cuales la enfermedad empeora (denominados exacerbaciones o brotes) seguidos por periodos durante los cuales la piel mejora o se limpia por completo (denominados remisiones). La dermatitis atópica a menudo se denomina "eczema," que es un término general para los diversos tipos de inflamación de la piel. La dermatitis atópica es el más común de los diversos tipos de eczemas. Los ejemplos de la dermatitis atópica incluyen: el eczema de contacto alérgico (la dermatitis: una reacción roja, con picazón, con sudoración entró en contacto con una sustancia que el sistema immune reconoce como extraña, como por ejemplo la hiedra venenosa o ciertos conservantes de cremas y lociones) ; el eczema de contacto (una reacción localizada que incluye el enrojecimiento, la picazón y el ardor en los cuales la piel entró en contacto con un alérgeno (una sustancia que provoca alergia) o con un irritante como un ácido, un agente de limpieza, u otro químico) ; el eczema dishidrótico (irritación de la piel en las palmas de las manos y las plantas de los pies caracterizada por ampollas transparentes, profundas que pican y arden) ; la neurodermatitis (parches en capas del cuero cabelludo, las extremidades inferiores, las muñecas o los antebrazos provocadas por una picazón localizada (como por ejemplo la picazón de un insecto, que se irrita con intensidad al rascarse ) ; el eczema numular (parches con forma cónica de la piel irritada - más común en brazos, espalda, nalgas y las extremidades inferiores - que pueden presentar escamaciones, en capas y con extrema picazón) ; el eczema seborreico (parches de piel amarillenta, oleosa, en capas en el cuero cabelludo, el rostro y ocasionalmente otras partes del cuerpo) . Los síntomas particulares adicionales incluyen la dermatitis de estasis, el pliegue atópico (pliegue de Dennie-Morgan) , quelitis, palmas hiperlineales, párpados hiperpigmentados : párpados que se han vuelto de color más oscuro por la inflamación o la fiebre del heno, CItiosis, queratosis pilaris, liquenificación, pápulas y urticaria. Un antagonista de la IL-13 (por ejemplo, un agente aglutinante de IL-13 tal como un anticuerpo o un fragmento de antigeno aglutinante descrito aqui) se puede administrar para mejorar uno o más de estos síntomas. Un método ejemplar para el tratamiento de la rinitis alérgica o de desórdenes alérgicos puede incluir el inicio de una terapia con un antagonista de IL-13 antes de la exposición a un alérgeno, por ejemplo, antes de la exposición estacional al alérgeno, por ejemplo, antes que los alérgenos proliferen. La terapia puede incluir una o más dosis, por ejemplo, dosis a intervalos regulares.
Cáncer La IL-13 en cáncer y sus receptores pueden estar involucrados en el desarrollo de por lo menos algunos tipos de cáncer, por ejemplo, un cáncer derivado de las células hematopoyéticas o un cáncer derivado de las células cerebrales o neuronales (por ejemplo, un glioblastoma). Por ejemplo, el bloqueo de la via de señalización de la IL-13, por ejemplo, por medio del uso de un receptor de IL-13 soluble o un ratón deficiente en STAT6 -, conduce a una demora en el inicio del tumor y/o el crecimiento de las lineas celulares del linforma de Hodgkins o un carcinoma mamario metastásico, respectivamente (Trieu et al. (2004) Cáncer Res. 64: 3271-75; Ostrand-Rosenberg et al. (2000) J. Immunol. 165: 6015-6019). Se puede apuntar de manera especifica a los cánceres que expresan IL-13R 2 (Husain and Puri (2003) J. Neurooncol. 65:37-48; Mintz et al. (2003) J. Neurooncol. 64:117-23) por medio de los anticuerpos anti-IL-13 que se describen en la presente invención. Los antagonistas de IL-13, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 y los fragmentos de los mismos, pueden ser útiles para inhibir la proliferación de las células cancerígenas u otra actividad de las células cancerígenas. Un cáncer se refiere a una o más células que tienen una pérdida de hipersensibilidad a los controles del crecimiento normal y de manera normal prolifera con una regulación reducida respecto de una célula normal que corresponde. Los ejemplos de cánceres contra los cuales los antagonistas de la IL-13 (por ejemplo un agente aglutinante de IL-13 tal como un fragmento aglutinante del antigeno que se describe aqui) pueden ser útiles, incluyen las leucemias, por ejemplo, la leucemia linfocitica crónica de la célula B, la leucemia mielógena agua y las células T transformadas por el virus tipo 1 (HTLV-1) de la leucemia de las células T humanas; los linfomas, por ejemplo, el linfoma de las células T, el linfoma de Hodgkin; los glioblastomas; los cánceres pancreáticos; el carcinoma de células renales; el carcinoma ovárico; y el sarcoma de Kaposi - SIDA.
Fibrosis Los antagonistas de la IL-13, (por ejemplo, un agente aglutinante de IL-13 tal como un anticuerpo o un fragmento de antigeno aglutinante que se describe aqui), también pueden ser útiles para el tratamiento de la inflamación y la fibrosis, por ejemplo, la fibrosis hepática. La producción de la IL-13 se correlacionó con la progresión de la inflamación hepática (por ejemplo, la hepatitis viral) por la cirrosisto y posiblemente, el carcinoma hepatocelular (de Lalla et al. (2004) J. Immunol . 173:1417-1425) . La fibrosis se produce, por ejemplo, cuando el tejido normal es reemplazado por el tejido marcado con cicatrices, a menudo después de la inflamación. Los virus de la hepatitis B y la hepatitis C provocan una reacción fibrótica en el hígado, la cual progresa hacia la cirrosis. La cirrosis, a su vez, puede evolucionar hacia complicaciones severas tales como la insuficiencia hepática o el carcinoma hepatocelular. El bloqueo de la actividad de la IL-13 mediante el uso del antagonista de la IL-13s, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13, que se describen en la presente invención, puede reducir la inflamación y la fibrosis, por ejemplo, la inflamación, la fibrosis y la cirrosis asociadas con las enfermedades hepáticas, específicamente la hepatitis B y C.
Enfermedad Intestinal Inflamatoria La enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) es el nombre general de las enfermedades que provocan inflamación de los intestinos. Dos ejemplos de enfermedad intestinal inflamatoria son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Se halló que la señalización de IL-13/STAT6 está invoucrada en la hipercontractividad del músculo liso del ratón inducida por la inflamación, a model of inflammatory bowel disease (Akiho et al. (2002) Am . J. Physiol . Gastroin test . Liver Physiol . 282 : G226-232 ) . Los antagonistas de la IL-13, (por ejemplo, un agente aglutinante de IL-13 tal como un anticuerpo o un fragmento de antigeno aglutinante que se describe aqui) , pueden ser útiles para tartar, prevenir, o aliviar la enfermedad intestinal inflamatoria o uno o más síntomas de la enfermedad intestinal inflamatoria. En una modalidad, un anticuerpo que se describe aqui, por ejemplo, una composición farmacéutica se administra en la terapia combinada, es decir, combinada con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar condiciones o trastornos patológicos, tales como los trastornos alérgicos e inflamatorios. El término "en combinación" en este contexto significa que los agents se dan esencialmente en forma contemporánea, ya sea en forma simultánea o secuencial. Si se dan en forma secuencial, en el inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos es preferentemente aún detectable a concentraciones efectivas en el sitio del tratamiento.
Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir uno o más anticuerpos descritos aqui, es decir, que se unen a la IL-13 e interfieren con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13, formulado en forma conjunta con, y/o administrado en forma conjunta con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de la citoquina y del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de las enzimas, y/o agentes citotóxicos o citostáticos, según se describe más abajo con mayor detalle. Además, uno o más de los anticuerpos anti-IL-13 que se describen en la presente invención se pueden utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos que se describen en la presente invención. Tales terapias combinadas pueden utilizar de manera ventajosa dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de ese modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias . Además, los agentes terapéuticos que se describen en la presente invención actúan sobre las vias que difieren de la via de IL-13 / IL-13-receptor, y de ese modo se espera que mejoren y/o sinergicen con los efectos de los anticuerpos de IL-13. Los ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales preferidos que se pueden administrar en forma conjunta y/o formular en forma conjunta con uno o más antagonistas de la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos, incluyen, pero no se limitan a, uno o más de: los esteroides inhalados; los agonistas beta, por ejemplo, los agonistas beta de corta duración o de acción prolongada; antagonistas de leucotrienos o antagonistas de los receptores de los leucotrienos; fármacos combinados tales como ADVAIR®; los inhibidores de IgE, por ejemplo, los anticuerpos anti-IgE (por ejemplo, XOLAIR®) ; los inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, los inhibidores de PDE4); las xantinas; los fármacos anticolinérgicas; los agentes estabilizadores de los mastocitos tales como un cromolin; los inhibidores de la IL-4; los inhibidores de la IL-5; los inhibidores de la eotaxina/CCR3; y los antihistaminicos . Las combinaciones mencionadas se pueden utilizar para tratar el asma y otros trastornos respiratorios. Los ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden administrar en forma conjunta y/o formular en forma conjunta con uno o más de los anticuerpos anti-IL-13 o los fragmentos de los mismos incluyen uno o más de: los antagonistas de TNF (por ejemplo, un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, p55 or p75 human TNF recepto o los derivados del mismo, por ejemplo, 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG proteina de fusión, ENBREL™) ) ; Los antagonistas de la enzima TNF, por ejemplo, los inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE) ) ; los antagonistas de los receptores muscarinicos; los antagonistas de TGF-J; el interferón gamma; la perfenidona; los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, el metotrexato, la leflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, por ejemplo, los inhibidores de CCI-779; C0X2 y cPLA2; los NSAID; los inmunomoduladores; los inhibidores de p38, los inhibidores de TPL-2, Mk-2 y NFRB, entre otros. También es posible proveer kits para portar la administración combinada de un anticuerpo de IL-13 con uno o más compuestos terapéuticos, o para utilizar los anticuerpos anti-IL-13 como una investigación o herramienta terapéutica para determinar la presencia y/o el nivel de IL-13 en una muestra biológica, como por ejemplo un kit ELISA. En una modalidad, the kit comprende uno más del anticuerpo anti-IL-13 formulado en un portador farmacéutico, y por lo menos un agente, por ejemplo, un agente terapéutico, formulado como corresponde, en una o más preparaciones farmacéuticas separadas .
Formulaciones de Vacunas Los antagonistas de la IL-13, (por ejemplo, un agente aglutinante de IL-13 tal como un anticuerpo o un fragmento de antigeno descrito aqui) , se pueden utilizar para incrementar la eficacia de una formulación de vacuna para inmunizar a un sujeto. Por ejemplo, un antagonista de la IL-13 se puede administrar ante, durante y/o después de una inmunización para aumentar la eficacia de la vacuna. En una modalidad, la formulación de la vacuna contiene uno o más antagonistas de la IL-13 y un antigeno, es decir, un inmunógeno. En otra modalidad, el antagonista de IL-13 y el inmunógeno se administrant por separado, por ejemplo, dentro de una hora, tres horas, un dia, o dos dias de cada uno de los otros . La inhibición de la IL-13 puede mejorar la eficacia de, por ejemplo, las vacunas celulares, por ejemplo, las vacunas contra las enfermedades tales como el cáncer y la infección viral, por ejemplo, la infección retroviral, por ejemplo, la infección por HIV. La inducción de CD8+ linfocitos T citotóxicos (CTL) por medio de vacunas es modulada por disminución por medio de CD4+ células T, probablemente a través de la la IL-13 de la citoquina. La inhibición de IL-13 ha demostrado que mejora la inducción por parte de la vacuna de la respuesta CTL (Ahlers et al. (2002) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 99:13020-10325). Un antagonista de la IL 13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL 13 o un fragmento del mismo, un anticuerpo que se describe en la presente invención, se puede utilizar en conjunto con una vacuna para aumentar la eficacia de la vacuna. El cáncer y la infección viral (como por ejemplo la infección retroviral (por ejemplo, HIV) ) son trastornos que constituyen un ejemplo contra los cuales puede ser efectiva una respuesta celular a la vacuna. La eficacia de la vacuna es mejorada mediante el bloqueo de la señalización de la IL-13 en el tiempo de la vacunación (Ahlers et al. (2002) Proc. Na t . Acad. Sci . USA 99:13020-25) . Una formulación de la vacuna se puede administrar a un paciente en la forma de una composición farmacéutica o terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el antagonista de IL-13s que se describen en la presente invención y un antigeno pueden elaborarse por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulado, elaboración de grageas, levigado, emulsificación, encapsulamiento, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares aceptables desde el punto de vista farmacéutico que facilitan el procesamiento de los antigenos y de los antagonistas que se describen en la presente invención en las preparaciones que se pueden utilizar desde el punto de vista farmacéutico. La formulación adecuada depende de la via de administración elegida. Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para la administración por medio de inyección. Por ejemplo subcutánea, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.
Para la inyección, las preparaciones de vacunas se pueden formular en soluciones acuosas, con preferencia en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, la solución de Ringeer, la solución amortiguadora salina fisiológica de fosfato. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De manera alterna, las proteínas pueden estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Una dosis efectiva se puede estimar en forma inicial utilizando modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animáis para locrar una inducicón de una respuesta immune utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica anterior. La cantidad de la dosis y el intervalo pueden ajustarse de manera individual. Por ejemplo, cuando se utiliza como una vacuna, las formulaciones de vacunas se pueden administrar en aproximadamente de 1 a 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Con preferencia, se administran 1 ó 2 dosis a intervalos de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente de 4 meses y las vacunas de refuerzo se pueden administrar periódicamente de allí en adelante. Los protocolos alternativos pueden ser adecuados para los animales. Una dosis adecuada es una cantidad de la formulación de la vacuna que, cuando se administra como se describió con anterioridad, es capaz de provocar una respuesta inmune en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de una infección durante por lo menos 4 a 12 meses. En general, la cantidad de antigeno presente en rangos de dosis de aproximadamente 1 pg a aproximadamente de 100 mg por kg de huésped, de manera normal de aproximadamente 10 pg a aproximadamente de 1 mg, y con preferencia de aproximadamente 100 pg a aproximadamente de 1 Tg. El rango de dosis adecuado variará con la via de inyección y el tamaño del paciente, pero de manera normal oscilará de aproximadamente 0.1 ml a aproximadamente de 5 ml .
Métodos de Diagnóstico, Pronóstico y Monitoreo de los Trastornos Las proteínas que se unen a la IL-13, por ejemplo, los anticuerpos, que se describen en la presente invención tienen diagnósticos y utilidades ín vi tro e in vivo . Un método que se ofrece a modo de ejemplo incluye: (i) administrar el anticuerpo de IL-13 a un paciente; y (ii) detectar el anticuerpo de IL-13 en el paciente. La detección puede incluir la determinación de la ubicación del anticuerpo de la IL-13 en el paciente. Otro método que se ofrece a modo de ejemplo incluye el contacto de un anticuerpo de la IL-13 con una muestra, por ejemplo, una muestra de un paciente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia de una IL-13, in vi tro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como tejido, biopsia) o in vivo (por ejemplo, imágenes in vivo imaging en un paciente) . El método incluye: (i) poner en contacto una muestra con el anticuerpo de la IL-13; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo de IL-13 y la muestra. El método también puede incluir el hecho de poner en contacto una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra de control) con el ligando, y determinar la extensión de la formación del complejo entre el ligando y la muestra con respecto a la misma para la muestra de referencia. Un cambio, por ejemplo, un cambio estadístico desde el punto de vista estadístico, en la formación del complejo en la muestra o el paciente relativo a la muestra de control o el paciente puede ser indicativo de la presencia de IL-13 en la muestra. El anticuerpo de IL-13 puede ser directa o indirectamente etiquetado con una sustancia detectable para facilitar la detección de la proteina unida o no unida. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materials fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. La formación del complejo entre el anticuerpo de IL-13 e IL-13 se pueden detectar midiendo o visualizando ya sea el ligando unido a la IL-13 o bien el ligando no unido. Se pueden utilizar ensayos convencionales de detección, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorbencia unido a la enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RÍA) o inmunohistoquimica de tejido. Además de etiqutar el anticuerpo de IL-13, la presencia de la IL-13 se pueden someter a ensayo en una muestra por medio de un inmunoensayo de competencia utilizando estándars etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo de IL-13 no etiquetado.
Métodos para Diagnosticar, Pronosticar y Monitorear el Progreso del Asma También es posible diagnosticar, pronosticar y/o monitorear el progreso del asma y/o los trastornos atópicos (por ejemplo, que resultan de una mayor sensibilidad a IL-13) midiendo el nivel de IL-13 en una muestra biológica. En particular, los anticuerpos descritos en la presente se pueden utiliza en un método para distinguir si un paciente está sufriendo de asma alérgica o asma no alérgica. Los métodos para diagnosticar el asma alérgica y no alérgica pueden incluir la detección de una altaración, (por ejemplo, la disminución o el aumento) de IL-13 en una muestra biológica, por ejemplo, suero, plasma, liquido de lavado broncoalveolar, sputum, etc. "Diagnóstico" o "diagnosticar" significa identificar la presencia o ausencia de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico comprenden la detección de la presencia de la IL-13 mediante la determinación de una cantidad de prueba del polipéptido de la IL-13 en una muestra biológica, por ejemplo, en el fluido del lavado broncoalveolar, de un paciente (mamífero humano o no humano) , y la comparación de la cantidad de prueba con una cantidad o rango normal (es decir, una cantidad o rango de un individuo del cual se sabe que no sufre de asma) para el polipéptido de la IL-13. Mientras que un método de diagnóstico en particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de asma, el mismo basta si el método proporciona una indicación positiva que contribuye al diagnóstico . Los métodos para pronosticar el asma y/o los trastornos atópicos pueden incluir la detección de la regulación por incremento de la IL-13, a nivel de la proteina o del ARNm. "Pronóstico" o "pronosticar" significa predecir el probable desarrollo y/o la severidad de una condición patológica. Los métodos de pronóstico implican determinar la cantidad de prueba de la IL-13 en una muestra biológica de un paciente y comparar la cantidad de prueba con una cantidad o rango pronóstico (es decir, una cantidad o rango de individuos con severidades variables de asma) para la IL-13. Varias cantidades de la IL-13 en una muestra de prueba son consistentes con ciertos pronósticos para el asma. La detección de una cantidad de IL-13 en un nivel pronóstico particular proporciona un pronóstico para el paciente. La presente invención también proporciona métodos para monitorear el curso del asma y/o los trastornos atópicos al detectar la regulación por incremento de IL-13. El monitoreo de los métodos implica determinar las cantidades de pruebas de IL-13 en las muestras biológicas obtenidas de un paciente en un primer y en un segundo tiempo y al comparar las cantidades. Un cambio en la cantidad de IL-13 entre el primer y el segundo tiempo indica un cambio en el curso del asma y/o el trastorno atópico, con una disminución en la cantidad que indica la remisión del asma y un aumento en la cantidad que indica la progresión del asma y/o el trastorno atópico. Los ensayos de monitoreo mencionados también resultan útiles para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica particular (por ejemplo, atenuación y/o reversión de la enfermedad) en los pacientes que están siendo tratados por asma y/o trastornos atópicos. Se pueden preparar ligandos de la proteina etiquetada con fluoroforo y cromoforo. Dado que los anticuerpos y otras proteínas abasorben luz que tienen longitudes de onda de hasta aproximadamente de 310 nm, las mitades fluorescentes se deben seleccionar para tener la absorción esencial a las longitudes de onda de aproximadamente 310 nm y con preferencia de aproximadamente 400 nm. Una variedad de agentes fluorescentes y cromoforos son descriptos por Stryer { Science (1968) 162:526) y por Brand et al. {Annual Rev. Biochem . (1972) 41:843 868). Los ligandos de la proteina se pueden etiqutar con grupos cromoforos fluorescentes por medio de los procedimientos convencionales tales como los que se describen en la Patente Norteamericanas Nos. 3,940,475, 4,289,747, y 4,376,110. Un grupo de agentes fluorescentes que tienen un número de las propiedades deseables que se describieron con anterioridad en las tinturas de xanteno, que incluye las floresceinas y las rhodaminas. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas . Una vez etiquetada con un fluoroforo o un cromoforo, el ligando de la proteina se puede utilizar para detectar la presencia o la localización de la IL-13 en una muestra, por ejemplo utilizando el microscopio fluorescente (tal como microscopía confocal o de espiras). Se puede realizar la inmunohistoquimica utilizando los ligandos de la proteina que se describen en la presente invención. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, el anticuerpo se puede sintetizar con un rótulo (tal como una señal de purificación o epitope) , o puede etiqutarse de manera detectable, por ejemplo por medio de la conjugación de un rótulo o de un grupo de unión al rótulo. Por ejemplo, un agente quelante se puede unir al anticuerpo. Luego el anticuerpo se prepara con una preparación histológica, por ejemplo una sección fija de tejido que está en un portaobjetos de un microscopio. Luego se analiza la preparación, por ejemplo utilizando microscopio, para identificar si el anticuerpo se une a la preparación. El anticuerpo (u otro polipéptido o péptido) pueda estar sin etiqutar en el momento de la unión. Después de la unión y el lavado, el anticuerpo es etiquetado con el objeto de volverlo detectable. El anticuerpo de IL-13 también se puede inmobilizar sobre una serie de proteínas. La serie de proteínas se puede utilizar como una herramienta diagnóstica, por ejemplo para evaluar las muestras médicas (tales como las células aisladas, la sangre, el suero, las biopsias y otros similares) . La serie de proteínas también puede incluir otros ligandos, por ejemplo, que se unan a IL-13 o a otras moléculas que constituyen el objetivo. Los métodos para producir series de péptidos se describen por ejemplo en De Wildt et al. (2000) Na t . Biotechnol . 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal . Biochem . 270:103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res . 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 and WO 99/51773A1. Los polipéptidos para la serie se pueden manchar a una velocidad alta, por ejemplo utilizando aparatos robóticos disponibles en el ámbito comercial, por ejemplo en Genetic MicroSystems o BioRobotics.
El substrato de serie puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, plástico, vidrio, por ejemplo modificado por superficie. La serie también puede incluir una matriz porosa, por ejemplo acrilamida, agarosa u otro polímero. Por ejemplo, la serie puede ser una serie de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en De Wildt, supra . Las células que producen los ligandos de la proteina pueden crecer sobre un filtro en un formato dispuesto. La producción de polipéptidos es inducida y los polipéptidos expresados son inmovilizados hasta el filtro en la ubicación de la célula. Una serie de proteínas se puede poner en contacto con un objetivo etiquetado para determinar la extensión de la unión del objetivo a cada polipéptido inmovilizado desde la biblioteca de diversidad de cepas. Si el objetivo no está etiquetado, se puede utilizar un método sandwich, por ejemplo, utilizando una sonda etiquetada para detectar la unión del objetivo sin etiqutar. La información acerca del grado de unión en cada dirección de la serie se puede almacenar un perfil, por ejemplo, en una base de datos de una computadora. La serie de proteínas se puede producir en replicados y utilizar para comprara los perfiles de unión como por ejemplo de un objetivo y un no objetivo. Por lo tanto, las series de proteínas se pueden utilizar para identificar los miembros individuales de la biblioteca de diversidad de cepas que han deseado propiedades de unión con respecto a una o más moléculas . El anticuerpo de IL-13 se puede utilizar para etiqutar las células, por ejemplo, las células de una muestra (por ejemplo, una muestra del paciente) . El lligando también está unido (o se puede unir) a un compuesto fluorescente. Las células entonces se pueden almacenar utilizando un distribuidor celular activado fluorescente (por ejemplo, utilizando un distribuidor que está disponible en Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José CA; véase también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,627,037; 5,030,002; y 5,137,809). Un haz de láser excita el compuesto fluorescente mientras que un detector cuenta las células que pasan a través de éste y determina si un compuesto fluorescente está ligado a la célula por medio de fluorescencia. La cantidad de unión de rótulo a cada célula se puede cuantificar y analizar para caracterizar la muestra. El distribuidor también puede desviar la célula y separar la unión de células por el ligando a partir de las células no unidas por el ligando. Las células separadas se pueden cultivar y/o caracterizar. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia de una IL-13 dentro de un paciente in vivo. El método incluye (i) administrar a un paciente (por ejemplo un paciente que tenga un trastorno asociado con la IL-13) un anticuerpo anti-IL-13, conjugado con un marcador detectable; (ii) exponer al paciente a un medio para detectar el marcador detectable. Por ejemplo, el paciente es sometido a imágenes, por ejemplo por NMR u otros medios tomográficos . Los ejemplos de rótulos útiles para diagnóstico por imágenes incluye los radiorótulos tales como los rótulos fluorescentes 131I, ?nIn, 123I, 99raTc, 32P, 33P, 125I, 3H, 14C, y 188Rh, tales como fluoresceina y rhodamina, los rótulos activos de resonancia magnética nuclear, los isótopos que emiten positrones detectables por medio de una tomografia de emisión de positrones ("PET"), quimiluminiscentes tales como la luciferina y los marcadores enzimáticos tales como la peroxidasa o la fosfatasa. Los emisores de radiación de rango corto, tales como los isótopos detectables pro medio de sondas de detectores de rango corto también pueden utilizarse. El ligando de la proteina se puede etiqutar con tales reactivos utilizando las técnicas conocidas. Por ejemplo, véase Wensel and Meares (1983) Radio immunoimaging and Radio immunotherapy, Elsevier, New York para las técnicas relacionadas con el radiorótulo de los anticuerpos y Colcher et al. (1986) Meth . Enzymol . 121: 802 816. También puede utilizarse un ligando radioetiquetado para las pruebas de diagnóstico in vivo . La actividad especifica de un ligando etiquetado isotópicamente depende de la vida media, la pureza isotópica del rótulo radioactivo y cómo se incorpora el rótulo dentro del anticuerpo. Los procedimientos para etiqutar los polipéptidos con los isótopos radioactivos (tales como 14C, 3H, 35S, 99mTc, 125I, 32P, 33P, y 131I) son generalmente conocidos. Véase, por ejemplo, U.S. 4.302.438; Goding, J.W. (Monoclonal antibodies : principies and practice : production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry, and immunology 2nd ed. London; Orlando: Academic Press, 1986. pp 124 126) y las referencias citadas en la presente invención; y A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65 85 (Academic Press 1985) . Los anticuerpos IL-13 que se describen en la presente invención se pueden conjugar con agentes de contraste de Resonancia Magnética por Imágenes (MRI) . Algunas técnicas de MRI se resumen en el documento EP-A-0 502 814. Las diferencias en estas constantes de tiempo de relajación se pueden mejorar por medio de agentes de contraste. Los ejemplos de tales agentes de contraste incluyen una cantidad de agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (los cuales principalmente alteran TI) y ferromagnéticos o superparamagnéticos (los cuales principalmente alteran la respuesta T2). Los quelatos (por ejemplo, EDTA, DTPA y los quelatos NTA) se pueden utilizar para unir (y reducir la toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (por ejemplo, Fe3+, Mn2+, Gd3+) . Otros agentes pueden estar en forma de partículas, por ejemplo, menos de 10 mm, aproximadamente de 10 mm de diámetro y tener propiedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas y superparamagnéticas . Los anticuerpos de IL-13 también se pueden etiqutar como con un grupo que indique que contienen el átomo 19F atom activo NMR o una pluralidad de tales átomos según lo descripto por Pykett ((1982) Scien tific American 246:78-88) para ubicar una imagen de distribución de IL-13. También dentro del alcance que se describe en la presente invención están los kits que comprenden el ligando de la proteina que se une a IL-13 y las instrucciones para el uso diagnóstico, por ejemplo el uso del anticuerpo IL-13 (por ejemplo, anticuerpo o el fragmento del mismo que se une al antigeno, u otro polipéptido o péptido) para detectar IL-13, in vi tro, por ejemplo, en una muestra, por ejemplo una biopsia o las células de un paciente que tenga un trastorno asociado con IL-13 o in vivo, por ejemplo, sometiendo a pruebas de diagnóstico por imágenes a un paciente. El kit además puede contener por lo menos un reactivo adicional tal como un rótulo o agente diagnóstico adicional. Para el uso in vivo, el ligando se puede formular como una composición farmacéutica .
Kits Un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, se puede proporcionar en un kit, como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) un antagonista de IL-13 o un fragmento del mismo, por ejemplo, una composición que incluye un anticuerpo de IL-13 o un fragmento del mismo, y, opcionalmente (b) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de comercialización u otro material que se refiera a los métodos que se describen en la presente invención y/o al uso de un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, para los métodos que se describen en la presente invención. El material informativo de los kits no se limita a su forma. En una modalidad, el material informativo puede incluir información acerca de la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de vencimiento, la información sobre el lote o el sitio de producción y asi sucesivamente. En una modalidad, el material informativo se refiere al uso del ligando para tratar, prevenir, diagnosticar un trastorno que se describe en la presente invención. En una modalidad, el material informativo puede incluir las instrucciones necesarias para administrar un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, en una manera adecuada para realizar los métodos que se describen en la presente invención, por ejemplo, en una dosis adecuada, forma de dosificación adecuada, o modo de administración adecuado (por ejemplo, una dosis, una forma de administración o un modo de administración que se describen en la presente invención) . En otra modalidad, el material informativo pueden incluir las instrucciones necesarias para administrar un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, un paciente adecuado, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano que tenga, o esté en riesgo de padecer, asma alérgica, asma no alérgica o un trastorno mediado por la IL-13, por ejemplo, un trastorno alérgico y/o inflamatorio, o la infección HTLV-1. La producción de IL-13 se correlacionó con la infección HTLV-1 (Chung et al., (2003) Blood 102: 4130-36) . Por ejemplo, el material puede incluir las instrucciones necesarias para administrar un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, a un paciente, un paciente con o en riesgo de padecer asma alérgica, asma no alérgica o un trastorno mediado por la IL-13, por ejemplo, un trastorno alérgico y/o inflamatorio, o la infección HTLV-1. El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo. En otras modalidades, el kit contiene los recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición o el material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida dentro de una botella, una ampolla o una jeringa y el material informativo puede estar contenido en una manga o paquete de plástico. En otras modalidades, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un recipiente único sin divisiones. Por ejemplo, la composición está contenida dentro de una botella, ampolla o jeringa que tiene unido a la misma el material informativo en forma de una etiqueta. En otras modalidades, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, cada uno de los cuales contiene una o más formas de dosificación por unidad (por ejemplo, una forma de dosificación que se describe en la presente invención) de un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de foil, atomizadores o dispositivos de inhalación, cada uno de los cuales contiene una dosis de unidad única de un antagonista de la IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo, o dosis de unidades múltiples. El kit incluye de manera opcional un dispositivo adecuado para la administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, inhalante, pipeta, fórceps, cuchara medidora, gotero (por ejemplo, gotero para ojos) , aposito (por ejemplo, un aposito de algodón o un tapón de madera) , o cualquiera de tales dispositivos de liberación. En una modalidad preferida, el dispositivo es un dispositivo implantable que dispensa dosis reguladas del ligando. Los Ejemplos que siguen se establecen para contribuir a la comprensión de las invenciones pero no están destinados a, y no deberían interpretarse como, limitantes de su alcance de ninguna manera. Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo monoclonal murino especifico para la IL-13 humana. Ejemplo 1 . 1 : Aislamiento de un anticuerpo monoclonal murino que se une a la IL-13 humana (mAbl3. 2) Se prepararon antisueros policlonales por medio de inmunización de hembras de ratones BALB/c con IL-13 recombinante humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Los sueros fueron evaluados para unirse a la IL-13 humana por medio de ELISA. Los esplenocitos de un ratón demostraron los titers con alta cantidad del anticuerpo en suero, fueron fusionados con el mieloma P3X63_AG8.653 (ATCC), y se colocaron en bandejas de medios selectivos. Las fusiones se aislaron con 3 vueltas de subclonante por medio de la limitación de la dilución y se evaluaron para la producción de anticuerpos que tienen una afinidad de unión a la IL-13 humana. Tres anticuerpos monoclonales que fueron capaces de unirse a la IL-13, interferir con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13 y neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con la IL-13, el anticuerpo de mAbl3.2 (IgGl kappa) se eligieron para un estudio posterior.
Ej emplo 1 . 2 : An ticuerpo monoclonal murino, mAbl3. 2 , se une a la IL-13 humana con al ta afinidad y especificidad. Se tomaron diversas medidas para confirmar que el anticuerpo monoclonal murino aislado en el Ejemplo 1.1, es decir, mAbl3.2, se une con alta afinidad y especificidad a la IL-13 humana. En primer lugar, los análisis de BIACORE™ de los tres anticuerpos monoclonales a la IL-13 humana (mAbl3.2, mAbl3.4, y mAbl3.9) se realizaron utilizando un chip de streptavidin 69 RU en el cual se inmovilizó IL-13 inmovilizada. Los tres anticuerpos se pasaron de manera individual sobre el chip y cada uno de ellos mostró una unión rápida (FIGURA 1). Después del intercambio de la solución amortiguadora, la disociación fue lenta (FIGURA 1). En segundo lugar, el análisis BIACORE™ de mAbl3.2 se realizó utilizando un chip de Biacore chip en el cual se inmovilizó mAbl3.2. Diferentes concentraciones de la IL-13 se pasaron sobre el chip. Nuevamente, la unión rápida y la disociación lenta se demostró (FIGURA 2) . En tercer lugar, el análisis por medio de ELISA determinó que mAbl3.2 se une a todas las formas de la IL-13 humana probada, que incluye la IL-13 nativa dericada de las células T de sangre de médula (FIGURA 3) . Las placas fueron revestidas con el anticuerpo anti-FLAG M2. La unión de FLAG-IL-13 humana se detectó con mAbl3.2 biotilizada y streptavidin-peroxidasa . ELISA demostró que la unión entre mAbl3.2 y la IL-13 se podría completar con la IL-13 humana aislada a partir de las células mononucleares de sangre de médula, con distorsión de Th2, activada por mitógenos y la IL-13 recombinante humana (FIGURA 3). No hubo ninguna unión detectable de mAbl3.2 a la IL-13 recombinante de murino (FIGURA 3). Para confirmar los resultados hallados por ELISA, el anticuerpo monoclonal, mAbl3.2, se recubrió sobre un chip Biacore, y las soluciones que contenían IL-13 recombinante humana o una forma polimórfica de IL-13 (variante de ARG) , que se expresa en una alta frecuencia en los pacientes que sufren de asma (Heinzmann et al. (2000) Hum . Mol . Genet . 9:594), fueron pasadas sobre el chip. Ambas formas mostraron una unión rápida y una disociación no detectable a partir del anticuerpo (FIGURA 4A) . Finalmente, durante un estudio preliminar de reactividad cruzada realizado bajo condiciones de GLP (buenas prácticas de laboratorio), mAbl3.2 no demostraron ninguna reacción cruzada significativa cuando se evaluaron contra un panel de 37 tejidos humanos normales obtenidos en una autopsia o biopsia, es decir, un tejido que incluye a todos los tejidos en la "lista sugerida de tejidos humanos que se deben utilizar para las investigaciones inmunohistoquimicas de reacción cruzada" en el Anexo II de los Lineamientos DC CPMP 111/5271/94 Borrador 5, "Production and quality control of monoclonal antibodies" y todos los tejidos que se recomiendan en la Tabla 2 de 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing del anticuerpo monoclonal Products for Human Use".
Ejemplo 1 . 3 : El anticuerpo monoclonal mAbl3. 2 de murino neutraliza las actividades asociadas con la IL-13 in vi tro La capacidad de mAbl3.2 para neutralizar una o más actividades asociadas asociadas con la IL-13 in vi tro se confirmó utilizando el bioensayo TFl, los monocitos de sangre humana periférica y las células B de sangre humana periférica. En condiciones adecuadas, la proliferación de la linea celular humana TFl de eritroleucemia se puede hacer dependiente de IL-13. Primero se determinó si la proliferación de la linea celular TFl dependiente de la citoquina inducida con concentraciones subóptimas de cualquiera de las IL-13 recombinantes humanas o la forma de variante de ARG de IL-13 humana podrían inhibirse por medio de mAbl3.2. La FIGURA 4B demuestra que la mAB13.2 inhibió las capacidades de ambas IL-13 humana recombinante y la forma de variante de ARG para estimular la proliferación de TFl. En segundo lugar, la linea celular se recogió para IL-13, luego se expuso a una concentración subóptima de IL-13 humana recombinante hasta inducir la proliferación en presencia de ya sea mAbl3.2 purificada de ratón o IL-13 soluble del receptor (rhuIL-13Ra2) . Las células fueron incubadas durante 3 dias y la incorporación de 3H- después de las 4 horas finales se determinó por medio del recuento del liquido de centelleo. A concentraciones subóptimas de IL-13, mAbl3.2 provocó una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de TFl (FIGURA 5) . La CI50 para este efecto, 250 pM, es altamente comparable con la de rhuIL-13Ra2 soluble (FIGURA 5). Los anticuerpos ejemplares tienen un CI50 para este efecto entre 50 -500 pM, o 120-300 pM, ó 240-350 pM. Dado que los monocitos de sangre periférica humana responden en una manera dependiente de la dosis a IL-13 o IL- 4 mediante el incremento de la expresión de la superficie celular del receptor de IgE de baja afinidad (CD23) (FIGURA 6A) , los monocitos humanos fueron utilizados para confirmar la capacidad de mAbl3.2 para neutralizar esta actividad asociada con la IL-13. Para determinar si mAbl3.2 podría neutralizar la expresión de la superficie celular de CD23 mediada por la IL-13 por los monocitos, las células mononucleares de sangre periférica fueron aisladas de un donante sano e incubadas con mayores cantidades de IL-13 solamente, mayores cantidades de IL-4 solamente, 1 ng/ml IL-13 y mayores cantidades de mAbl3.2, ó 0.3 ng/ml IL-4 y mayores cantidades de mAbl3.2. Al dia siguiente, se recogieron las células y se mancharon con CYCHROME3-etiquetado anti-CDllb (marcador de monocito) y PE-letiquetado anti-CD23. Gated CDllb+ monocitos fueron sometidos a ensayo para la expresión de CD23 por medio de citometria de flujo. Según se esperaba, mAbl3.2 inhibió la expresión CD23 mediada por la IL-13 (FIGURA 6B) pero no inhibió la expresión de CD23 inducida por IL-4 (FIGURA 6C) .
Los efectos de mAbl3.2 también se probaron en un modelo de producción de IgE mediada por IL-13- por células B de sangre periférica humana. En respuesta a IL-13 y el mitógeno de célula T, PHA, las células B se someten a una recombinación de cambio de isotipo Ig a IgE, dando como resultado mayores niveles de IgE en el cultivo. Este efecto se puede observar como un aumento de la frecuencia de las células B que producen IgE. PBMC de un donante sano fueron cultivados en cavidades de microtiters en presencia de PBMC irradiados autólogos como alimentadores y estimulados con PHA y IL-13. Después de 3 semanas, cada cavidad se sometió a ensayo para las concentraciones de IgE por medio de ELISA. PHA + IL-13 aumentaron la frecuencia de los clones de células B que producen IgE (FIGURA 7). Este efecto fue inhibido por medio de mAbl3.2, pero no por medio de un anticuerpo no neutralizador especifico de IL-13 (mAbl3.8) o por medio de IgG de ratón de control (msIgG) (FIGURA 7), demostrando que mAbl3.2 bloqueó de manera eficiente el cambio de isotipo IgE mediado por IL-13 por medio de las células B cultivadas.
Finalmente, la capacidad de mAbl3.2 para bloquear una respuesta celular temprana a IL-13 se sometió a prueba mediante del examen de sus efectos sobre el transductor y activador de transcripción (STAT) 6 fosforilación. Después de la interacción de IL-13 con el receptor de su superficie celular, STAT6 dimeriza, se vuelve fosforilado y se transloca a partir del citoplasma al núcleo, donde activa la transcripción de los genes sensibles a la citoquina (Murata et al. (1995) J. Biol . Chem . 270:30829-36). Los anticuerpos específicos para STAT6 pueden detectar esta activación por medio del análisis de mancha de Western y/o el análisis citométrico de flujo dentro de los 30 minutos de exposición a IL-13. La linea celular epitelial humana HT-29 se utilizó para someter a ensayo la fosforilación de STAT6. Las células HT-29 se incubaron en mayores concentraciones de IL-13 durante 30 minutos a 37 °C. El análisis de mancha de Western de los lisatos celulares demostró la fosforilación dependiente de la dosis de STAT6 mediada por IL-13 (FIGURA 8A) . De una manera similar, el análisis citométrico de flujo demostró STAT6 fosforilada en las células HT-29 que fueron tratadas con una concentración saturadora de IL-13 durante 30 minutos a 37 °C, fija, permeabilizada y manchada con un mAb ALEXA3 etiquetada con Fluor 488 hasta fosfo -STAT6 (FIGURA 8B) . Las células tratadas se mancharon con un anticuerpo de control de isotipo no demostraron fluorescencia. Finalmente, cuando las células se trataron con una concentración subóptima de IL-13 sola, IL-13 y mAbl3.8, IL-13 y mAB13.2, o IL-13 y un anticuerpo msIgGl de control, el análisis citométrico de flujo demostró la abrogación completa de la fosforilación de STAT6 sólo cuando las células fueron tratadas en presencia de mAbl3.2, es decir, teniendo en cuenta que mAbl3.2 bloqueó la fosforilación de STAT6, un anticuerpo no neutralizador especifico de IL-13 (mAbl3.8) y un IgGl de ratón de control no tuvo efecto (FIGURA 8C) . Estos estudios demostraron que mAbl3.2 inhibió la fosforilación de STAT6 mediada por IL-13. Ejemplo 1 . 4 : El anticuerpo monoclonal murino mAbl3.2 neutraliza las actividades asociadas con la IL-13 in vivo La eficacia de mAbl3.2 de ratón para neutralizar una o más actividades asociadas con la IL-13 in vivo se sometió a prueba utilizando un modelo de inflamación de las vias aéreas inducida por antigeno en monos cynomolgus naturalmente alérgicos a Ascaris suum . En este modelo, la prueba de un mono alérgico con antigeno de Ascaris suum da como resultado un influjo de las células inflamatorias, especialmente los eosinófilos en las vias aéreas. Para probar la capacidad de mAbl3.2 para prevenir este influjo de células, el anticuerpo se administró 24 horas antes de la prueba con el antigeno de Ascaris suum . El dia de la prueba, se obtuvo una muestra del lavado broncoalveolar (BAL) del pulmón izquierdo en el nivel basal. Luego el antigeno se instiló en forma endotraqueal en el pulmón derecho. Veinticuatro horas más tarde, el pulmón derecho se sometió a un lavado, y el liquido de BAL se animales tratados por via endovenosa con 8 mg/kg mAbl3.2 purificados con ascitis se comparó con el liquido BAL de los animales que no recibieron tratamiento. Los recuentos de eosinófilos aumentaron en 4 de 5 animales no tratados después de la prueba, según se comparó con 1 de 6 animales tratados con mAbl3.2 (FIGURA 9). El porcentajes de eosinófilos de BAL aumentó de manera significativa para el grupo que no recibió tratamiento (p < 0.02), pero no para el grupo tratado con el anticuerpo. Estos resultados confirman que mAbl3.2 efectivamente evita la eosinofilia en las vias aéreas en los animales alérgicos sometidos a prueba con un alérgeno. La vida media promedio del suero de mAbl3.2 de ratón fue menor de una semana en los monos. En el punto de tiempo de 3 meses, cuando todas las huellas de mAbl3.2 hubieran ido al suero, los animales tratados con mAbl3.2 volvieron a someterse a una prueba con Ascaris suum para confirmar la hipersensibilidad de Ascaris de tales individuos. Se halló que dos de seis monos en el grupo tratado no respondieron.
Ej emplo 1 . 5 : El an ticuerpo monoclonal de murinos mAbl3. 2 se une a una región de IL-13 que normalmen te se une a IL-4Ra Las actividades asociadas con la IL-13 presumiblemente están mediadas por un complejo receptor que consiste en las cadenas de IL-13Ral y IL-4Ra. La citoquina primero se somete a una interacción de afinidad relativamente baja con IL-13Ral en la superficie de las células. El complejo IL-13/IL-13Ral luego recluta IL-4Ra para formar un receptor IL-13 completo, el cual se une a su ligando (IL-13) con alta afinidad (Zurawski et al. (1993) EMBO J. 12:2663; Zurawski et al. (1995) J. Biol . Chem . 270:23869). La unión de IL-13 con el receptor de alta afinidad luego envía corriente abajo las señales a través de la cadena IL-4R que involucra al transductor de señal quinasa de Janus y la via del activador de la transcripción (JAK-STAT) , por ejemplo, por medio de la fosforilación de STAT6, la cual se puede monitorear como una de las respuestas celulares más tempranas a IL-13 (Murata et al., supra ) . Diversos enfoques, tales como el mapeo de epitopes, la cristalografía por rayos x y el análisis adicional de BIACORE se utilizaron para elucidar la interacción entre el anticuerpo murino mAbl3.2 y la IL-13 humana y para luego examinar la base subyacente a la capacidad de mAbl3.2 para modular una o más actividades asociadas con la IL-13. La interacción entre mAbl3.2 y la IL-13 se estudió por medio de cristalografía de rayos x. La IgG total de ascitis se aisló sobre una columna de proteina A y se digirió con papaina para generar fragmentos de mAbl3.2 Fab, los cuales luego fueron altamente purificados. Los fragmentos Fab en si mismos fueron cristalizados, y los análisis estructurales se obtuvieron a una resolución de 2.8 Á utilizando radiación de sincotrones. De manera adicional, los fragmentos de mAbl3.2 Fab fueron cocristalizados con IL-13 humana, y esta estructura de cristal se resolvió a una resolución de 1.8 Á. Los principales sitios de contacto entre mAbl3.2 y la IL-13 fueron identificados como agrupados principalmente en los bucles de la CDR del anticuerpo y la región terminal C de la hélice C de IL-13 (FIGURA 10) . De acuerdo con la secuencia de numeración que se muestra en la FIGURA 11 para la proteina madura de IL-13, es decir, la proteina de IL-13 a partir de la cual el péptido señal ha sido dividido, los principales residuos de IL-13 que entran en contacto con mAbl3.2 son GLU49, ASN53, GLY69, PR072, HIS73, LYS74, y ARG86 de la SEC ID NO: 32. La capacidad de los fragmentos Fab de mAbl3.2 para unirse a la IL-13 humana se confirmó por medio de ELISA. La unión de FLAG-IL-13 humana a las placas de ELISA que estuvieron recubiertas durante toda la noche con el anticuerpo anti-FLAG M2 se detectó utilizando mAbl3.2 biotinilada. mAbl3.2 no etiquetada, los fragmentos Fab aislados de mAbl3.2 o el anticuerpo irrelevante se itnrodujeron para completar con mAbl3.2 biotnilada unida a FLAG-IL-13 humana. Los datos demuestran que los fragmentos Fab de mAbl3.2 y de mAbl3.2 sin etiqutar fueron capaces de completarse con mAbl3.2 biotinilada para unirse a la FLAG-IL-13 humana (FIGURA 12). De una manera adicional, a pesar de que parecía que se requería una concentración mayor de fragmentos Fab para lograr un grado similar de competición como mAbl3.2 sin etiqutar (FIGURA 12A) , esta discrepancia se resolvió cuando la competencia se analizó como una función de la concentración de los sitios de unión, por ejemplo, suponiendo un sitio de unión po cada fragmento Fab aislado y dos sitios de unión por cada mAbl3.2 sin etiqutar (FIGURA 12B) . En contraste con los fragmentos Fab sin etiqutar mAbl3.2 y mAbl3.2, el anticuerpo irrelevante no fue capaz de competir con mAbl3.2 biotinilada para unirse a la FLAG-IL-13 humana (FIGURA 12) . La capacidad de los fragmentos Fab de mAbl3.2 para neutralizar una o más actividades asociadas con la IL-13 in vi tro se confirmó por medio de la determinación de la proliferación de las células TFl y la expresión de CD23 por medio de los monocitos de sangre periférica humana, tal como se describió con anterioridad, en ausencia o presencia de los fragmentos Fab de mAbl3.2. La FIGURA 13A demuestra que los fragmentos Fab de mAbl3.2, de manera similar a mAbl3.2, inhibieron la capacidad de la IL-13 recombinante para estimular la proliferación de TFl en un sitio de unión de modo dependiente de la concentración. De una manera adicional, los fragmentos Fab de mAbl3.2, de manera similar a mAbl3.2, inhibieron La expresión de CD23 mediada por la IL-13 en un sitio de unión que depende del modo de concentración (FIGURA 13B) . Los análisis de cristalografía por rayos x, mapeo de epitopes, ELISA, proliferación de TFl y la expresión de CD23 que se describieron con anterioridad indicaron que mAbl3.2 se une a la región terminal C de la hélice de IL-13, es decir, la región de unión a la IL-4R. Para confirmar este análisis, la interacción entre mAbl3.2 y IL-13 se analizó con un chip de BIACORE™. Este análisis se realizó en diversos formatos. En primer lugar, IL-4R se unió al chip de BIACORE™, y un complejo de IL-13 previamente unido a IL-13Ral se dejó fluir sobre el chip. En ausencia de mAbl3.2, se demostró la formación de un complejo trimolecular . Sin embargo, la adición de mAbl3.2 a la mezcla de IL-13 previamente unida a IL-13Ral impidió la unión a IL-4R en el chip. En segundo lugar, mAbl3.2 se inmovilizó en el chip y la IL-13 unida se agregó en la fase de solución. A pesar de que se detectó IL-13Ral para interactuar con la IL-13 unida, no se detectó ninguna interacción de la IL-4R con la IL-13 unida. En tercer lugar, se demostró que mAbl3.2 podría unirse a la IL-13 que se unió a la IL-13R l-Fc o bien al monómero de IL-13Ral inmovilizado en el chip. Estas observaciones soportan la hipótesis de que mAbl3.2 no inhibe la interacción de IL-13 con IL-13R l pero quiebra la interacción de la IL-13R l con la IL-4Ra. Se piensa que este quiebre interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la 11-13. Estas observaciones proporcionan un modelo teórico para la actividad neutralizadora de este anticuerpo. La demostración in vi tro de un complejo de mAbl3.2 con la IL-13 y la IL-13Ral sugiere que mAbl3.2 se podría unir de manera potencial a la IL-13 asociada al receptor en la superficice celular. A fin de determinar si mAbl3.2 unida a la célula podría detectarse en condiciones de saturación de IL-13 unida al receptor, la linea celular epitelial humana HT-29 se trató con varias concentraciones de IL-13 a 4 °C seguido del agregado del anticuerpo monoclonal mAbl3.2, mAbl3.8 o la IgGl del ratón de control. Se detectó la unión mediante el análisis citométrico de flujo utilizando IgGl de anti-ratón biotinilado y PE-streptavidin. A pesar de que las células de HT-29 expresan IL-13Ral, la unión de mAbl3.2 a la IL-13 unida a la superficie celular no se detectó a concentraciones de mAbl3.2 de hasta 2 mg/ml. Esta observación, junto con la demostración de que mAbl3.2 es un potente neutralizador de una o más actividades asociadas con IL-13, indica que el funcionamiento normal del complejo de señalización IL-13, es decir el receptor de IL-13, se quiebra por medio de mAbl3.2. Los hallazgos que se describieron con anterioridad confirman que el anticuerpo monoclonal de murinos mAbl3.2, se une con una alta afinidad y especificidad a IL-13, y exhibe una actividad potente de neutralización, es decir, mAbl3.2 bloquea de manera eficiente cada actividad asociada con IL-13 que fue aprobada. Estas observaciones se correlacionaron con el hallazgo de que mAbl3.2 puede interactuar con el sitio de unión de IL-4Ra y no con el sitio de unión de IL-13Ral de la IL-13 humana.
Ejemplo 2: Generación del anticuerpo mAbl3.2 quimérico (ch!3.2) Ejemplo 2. 1 : Aislación de un anticuerpo mAbl3.2 quimérico (chl3.2) Los genes variables pesados (VH) y variables ligeros (VL) que codifican mAbl3.2 fueron clonados y sometidos a secuencia del ARNm aislados a partir del hibridoma que produce el anticuerpo. La secuencia VH se subclonó en el vector de expresión pED6 huIgGl_mut, el cual codifica la IgGl que contiene dos puntos de mutación (L234A y G237A) hasta reducir la unión a los recpetores Fe humanos y complementar los componentes (SEC ID NO: 17; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24; Shields et al (2001) J. Biol . Chem . 276:6591-604). La secuencia VL de mAbl3.2 se subclonó en el vector de expresión Kappa pED6. Los vectores de expresión que contienen las secuencias mAbl3.2 VH y VL fueron cotransfectadas dentro de las células COS-1 y el anticuerpo quimérico mAbl3.2 se purificó a partir del medio acondicionado (chl3.2). Ejemplo 2.2 : El anticuerpo mAbl3.2 (chl3.2) quimérico neutraliza las actividades asociadas con la IL-13 in vi tro El anticuerpo quimérico, chl3.2, se sometió a prueba para la unión a IL-13. El anticuerpo monoclonal mAbl3.2, la forma quimérica de mAbl3.2 (chl3.2), y un anticuerpo de control (13.8) fueron sometidos a prueba para evaluar sus capacidades de competir con mAbl3.2 biotinilado de ratón para unirse a la IL-13 FLAG-humana inmovilizada sobre una placa ELISA con un anticuerpo anti-FLAG. El anticuerpo quiméroco, chl3.2, fue capaz de unirse de manera competitiva a IL-13 en forma similar a mAbl3.2 (FIGURA 14A) . En otra prueba, los monocitos de sangre periférica humana fueron tratados durante toda la noche con IL-13 para inducir la expresión de CD23 en presencia de varias concentraciones de mAbl3.2 o chl3.2 de ratón. Como se muestra en la FIGURA 14B, chl3.2 impidió la expresión de CD23 mediada por la IL-13 por parte de Iso monocitos en el mismo grado que mAbl3.2.
Ejemplo 3: Generación de los anticuerpos mAbl3.2 parcial y completamente humanizados (h!3.2yl y h!3.2v2) Ejemplo 3. 1 : Aislamiento de un anticuerpo mAbl3.2 parcialmente humanizado (hl3.2vl) La humanización de mAbl3.2 se basó sobre la homología de la secuencia de aminoácidos, el análisis del CDR, la frecuencia de uso entre los anticuerpos humanos expresados y la información disponible sobre las estructuras de cristal de los anticuerpos humanos. La humanización se basó sobre los genes de la linea germinal humanos DP-54 variables pesados (VH) y DPK-9 variables ligeros (VL) (que se muestran por ejemplo en las Figuras 16 y 17, respectivamente) . Teniendo en cuenta los posibles efectos sobre la unión del anticuerpo, el apareamiento VH-VL y otros factores, los residuos murinos fueron mutados a residuos humanos donde los residuos de la trama murinos y humanos eran diferentes, con unas pocas excepciones. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cadena chl3.2 VH con la secuencia de aminoácidos prevista del gen de la linea germinal humana DP-54 y la secuencia de aminoácidos de la cadena VH hl3.2vl parcialmente humanizada se muestra en la FIGURA 15. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cadena VL chl3.2 con la secuencia de aminoácidos prevista de DPK-9 humana y la cadena VL hl3.2vl resultante parcialmente humanizada se muestran en la FIGURA 16. Como se puede ver en las Figuras 16 y 17, las cadenas hl3.2vl VH y VL conservaron las regiones que determinan la complementariedad (CDR) , o las regiones de unión al antigeno de las cadenas VH y VL de chl3.2 respectivamente. De una manera adicional, sólo un residuo de la trama VH y dos en la trama de VL se conservaron murinos para reducir el riesgo de cambiar de manera drástica la región de unión al antigeno y el apareamiento VH-VL (Figuras 16 y 17) . La humanización parcial de mAbl3.2 se logró mutando la secuencia de nucleótidos que codifica mAbl3.2 (murinos) de manera tal que los aminoácidos corresponden a los genes de la linea germinal humana serian sustituidos en las posiciones de la trama indicadas. Para cada cambio de aminoácidos que debe introducirse, se previeron sustituciones adecuadas de nucleótidos, con codones optimizados para la expresión en las células CHO. La humanización de VH se hizo por medio de un proceso de mutagénesis de PCR en cuyas mutaciones que incorporan cegadores de oligonucleótidos para uno o dos aminoácidos a la vez utilizados para ampliar la secuencia genética del patrón murino. Diversas vueltas de mutagénesis de PCR se requirieron para lograr la humanización parcial. La humanización de VL se realizó por parte de PCR utilizando un panel de nueve oligonucleótidos superpuestos correspondientes a la secuencia de VL de murinos con las sustituciones adecuadas de nucleótidos. La regiones superpuestas sirvieron como patrones y PCR se utilizó para llenar los espacios vacios cebadores en las cepas de sentido y antisentido. El anticuerpo resultante parcialmente humanizado se denominó hl3.2vl. Las secuencias de nucleótidos que codifican VL y VH de hl3.2vl se designan en la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 7, respectivamente. Ej emplo 3. 2 : Aislamien to de mAbl 3. 2 completamente humanizada (hl 3. 2v2) Como se indica en la FIGURA 15 y la FIGURA 16, hl3.2vl conservó 3 residuos murinos en las regions de la trama: uno en la cadena VH y dos en la cadena VL. El trabajo y el análisis preliminares de la estructura de cocristal de mAbl3.2 Fab con IL-13 humana confirmaron que los 3 residuos podrían ser mutados a humanos. Estos fueron los residuos #3 en la cadena VH (K en el ratón, Q en humanos), el residuo #4 en la cadena VL (L en ratones, M en humanos) y el residuo #72 en lacadena VL (#68 en la linea germinal; R en ratones, G en humanos) . Por lo tanto, para producir una versión completamente humanizada de mAbl3.2, hl3.2v2, se utilizó la mutagénesis PCR para introducir las mutaciones K3Q en la cadena VH de hl3.2vl, y L4M y R72G en la cadena VL de hl3.2vl. Las secuencias finales VH y VL hl3.2v2 se muestran en la FIGURA 17 y la FIGURA 18, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifican VL y VH de hl3.2v2 se designan SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 8, respectivamente. De acuerdo con la secuencia que se muestra en la FIGURA 29 (utilizando el esquema de numeración lineal), se determinó que los principales residuos de la cadena pesada de mAbl3.2 que hacen contacto con las uniones de hidrógeno con IL-13 son SER50 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR101 (CDR3) , y TYR102 (CDR3) . De una manera adicional, los residuos principales de la cadena pesada de mAbl3.2 que hacen contactos Van der Waals con IL-13 son ILE30 (CDR1), SER31 (CDR1), ALA33 (CDR1), TRP47, SER50 (CDR2), SER52 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR58 (CDR2), LEU98 (CDR3), ASP99 (CDR3), GLY100 (CDR3), TYR101 (CDR3), TYR102 (CDR3), y PHE103 (CDR3) (sobre la base de la FIGURA 29 utilizando el esquema de numeración lineal). De acuerdo con la secuencia que se muestra en la FIGURA 30 (utilizando el esquema de numeración lineal), se determinó que los residuos principales de la cadena ligera de mAbl3.2 que hacen contactos de uniones de hidrógeno con IL-13 son ASN31 (CDR1), TYR32 (CDRl), LYS34 (CDR1), ASN96 (CDR3), y ASP98 (CDR3) . Los residuos principales de la cadena ligera mAbl3.2 que hacen contactos Van der Waals con IL-13 son ASN31 (CDRl), TYR32 (CDRl), LYS34 (CDRl), ARG54 (CDR2), ASN96 (CDR3), ASP98 (CDR3), y TRP100 (CDR3) (Sobre la base de la FIGURA 30 que utiliza el esquema de numeración lineal) .
Ejemplo 3. 3 : MAbl3. 2 completamente humanizada (hl3. 2v2) conserva toda la actividad agl utinante a IL-13 La capacidad de mAbl3.2 completamente humanizada (hl3.2v2) para competir con mAbl3.2 biotinilado para unirse a IL-13-FLAGse determinó por ELISA como se describió en el Ejemplo 2. Los datos demostraron que las versions quiméricas (chl3.2), paracialmente humanizadas (hl3.2vl) y completamente humanizadas de mAbl3.2 fueron capaces de competir con mAbl3.2 biotinilada para unirse a FLAG-IL-13 en grados similares (FIGURA 19A) . El análisis BIACORE también confirmó que IL-13 tenia unión rápida y disociación lenta a hl3.2v2 inmovilizada (FIGURA 19B) .
Ej emplo 3. 4 : MAbl 3. 2 completamen te humanizada (hl3. 2v2) neutraliza las actividades in vi tro asociadas con IL-13 De una manera adicional, la capacidad de las versiones quiméricas (chl3.2) parcialmente humanizada (hl3.2vl) y completamente humanizada de (hl3.2v2) del mAbl3.2 para inhibir la expresión de CD23 la superficie celular mediada por IL-13-por medio de monocitos humanos y reducir la fosforilación STAT6 inducida por IL-13 en las células HT-29 se determinó por medio del análisis citométrico de flujo, tal como se describió en el Ejemplo 1.3. En síntesis, los monocitos de sangre periférica humana se incubaron durante toda la noche con una concentración subóptima de IL-13 humana recombinante en presencia de mayores concentraciones de chl3.2, hl3.2vl o hl3.2v2. Los monocitos fueron encerrados y sometidos a ensayo para detectar la expresión de CD23 como una indicación de la hipersensibilidad a IL-13. El análisis citométrico de flujo demostró que las 3 versiones de mAbl3.2, es decir, chl3.2, hl3.2vl, y 13.2v2, fueron capaces de mitigar la expresión de CD23 mediada por la IL-13 por medio de monocitos de un modo dependiente de la dosis (FIGURA 20A) . Para probar la fosforilación de STAT6, la linea celular epiterial humana HT-29 se incubó durante 30 minutos a 37 °C con una dosis subóptima de IL-13 humana recombinante y mayores concentraciones de chl3.2, hl3.2vl, o hl3.2v2, Luego se sometieron a ensayos para detectar la expresión de STAT6 fosforilado utilizando el anticuerpo monoclonal etiquetado con Fluor 488 Alexa3 hasta STAT6 fosforilado. El análisis citométrico de flujo demostró que las 3 versiones de mAbl3.2, es decir, chl3.2, hl3.2vl, y hl3.2v2, fueron capaces de mitigar la fosforilación de STAT6 mediada por la IL-13 (FIGURA 20B) . Dado que hl3.2v2 fue capaz de inhibir las actividades in vi tro asociadas con la IL-13 humana nativa y asociadas con la IL-13 recombinante (FIGURA 21), se sometió a prueba para detectar su habilidad para inhibir los trastornos asociados con IL-13 en modelos animales. En la preparación para probar mAbl3.2 completamente humanizada, hl3.2v2, en modelos no humanos de primates (NHP) y ovejas de enfermadad respiratoria, se sometió a ensayo la capacidad del anticuerpo para neutralizar la IL-13 recombinantes de monos o de ovejas. Se clonó la IL-13 de monos cynomolgus o de ovejas. Se expresó la NHP IL-13 en E . coli , se purificó y replegó como para la IL-13 humana. En contraste, la IL-13 recombinante de ovejas se expresó en las células de Ovarios de Hamsters Chinos (CHO). La capacidad de mAbl3.2 o hl3.2v2 para inhibir una o mas actividades asociadas con la forma recombinante de NHP de monos cynomolgus de IL-13 o de la forma recombinante de oveja de IL-13 se sometió a pruebas in vi tro . La FIGURA 22 demuestra que la hl3.2v2 neutraliza con firmeza la capacidad de NHP IL-13 en los monos cynomolgus para inducir la expresión de CD23 en la superficie celular por medio de los monocitos. Sin embargo, hl3.2v2 sólo neutralizó en forma escasa la IL-13 en ovejas, dado que la neutralización de la actividad asociada con la IL-13 en ovejas requirió concentraciones mucho mayores de anticuerpos (FIGURA 22).
Ej emplo 3. 5 : MAbl 3. 2 completamente humanizada (hl 3. 2v2) neutraliza las a ctividades de IL-13 en un modelo de asma de ovejas A pesar de su potencia relativamente baja para neutralizar la bioactividad de la forma de oveja de IL-13, hl3.2v2 se sometió a prueba para detectar la eficacia en un modelo de oveja de hipersensibilidad de las vias aéreas inducidas por Ascaris-induced airway hyperreactivity . Las ovejas fueron sensibilizadas con el parásito de ascáride, Ascaris suum, por medio de la exposición natural. Cuando se los sometió una prueba de pulmón con el antigeno de Ascaris, los animales padecieron broncoconstricción similar a la respuesta de los humanos asmáticos ante la prueba de antigenos. La respuesta consiste en una reacción inmediata seguida por una respuesta en la fase tardía, que comenzó 4-5 horas después de la prueba. Se pensó que la fase temprana es una respuesta del músculo liso, mientras que la fase tardía es una reacción inflamatoria. Para probar la capacidad de hl3.2v2 para reducir la broncoconstricción inducida por Ascaris, a las ovejas se les administró 20 mg/kg, 5 mg/kg, ó 2 mg/kg de anticuerpos por via de infusión endovenosa (i.v.). Veinticuatro horas después de la infusión, los animales recibieron una prueba endotraqueal con antigeno de Ascaris suum . Los resultados indicaron que hl3.2v2 a 20 mg/kg o 5 mg/kg atenuaron la respuesta de la fase tardía al antigeno (FIGURA 23). hl3.2v2 a 2 mg/kg no tuvo ningún efectos significativo sobre la respuesta al antigeno en comparación con el control, presumiblemente debido a la escasa actividad de neutralización de hl3.2v2 en la IL-13 de ovejas. De manera adicional, se probó la capacidad de hl3.2v2 para reducir la hipersensibilidad de las vias aéreas inducida por la prueba de las vias aéreas con el agonista colinérgico, carbacol, en ovejas. Carbacol elicita la broncoconstricción, medida como una disminución del volumen expiratorio forzado (FEV) y la dosis del estimulo requerido para elicitar una determinada magnitud de respuesta (PC400) es normalmente menor para los asmáticos que para los pacientes sanos. Las ovejas permanecieron sin recibir tratamiento o recibieron 20 mg/kg, 5 mg/kg, o 2 mg/kg de hl3.2v2 por via endovenosa 24 horas antes de la prueba de inhalación con carbacol y PC400 se determinó en la prueba previa y posterior de ovejas con Ascaris suum . Los datos demuestran que hl3.2v2 a 20 mg/kg o 5 mg/kg evitaron la caida de PC400 inducida por la prueba con Ascaris suum (FIGURA 24). De manera similar a los resultados del experimento de respuesta al antigeno, hl3.2v2 a 2 mg/kg no tuvo ningún efecto significativo sobre PC400 en comparación con el control .
Ej emplo 3. 6: MAbl 3. 2 completamente humanizada (hl 3. 2v2) neutraliza las actividades de IL-13 en un modelo prima te no humano de asma Para probar la capacidad de hl3.2v2 para evitar la inflamación pulmonar inducida por Ascaris en primates no humanos, se trataron monos cynomolgus de control con solución salina, 8 mg/kg de IgG humano irrelevante (IVIG), o 2 mg/kg de dexametasona por via intramuscular (como un control positivo) . A los monos cynomolgus de prueba se les administró por via endovenosa 10 mg/kg de hl3.2v2. Al dia siguiente, las muestras BAL previas a la prueba se obtuvieron del pulmón derecho y se sometió a prueba a los animales con el antigeno Ascaris suum por via endotraqueal en el pulmón derecho. Veinticuatro horas después de la prueba, se recolectaron las muestras de BAL del pulmón derecho y se sometieron a ensayo para infiltrado celular. Los resultados mostraron que el pretratamiento de animales con hl3.2v2 evitaron la inflamación de las vias aéreas inducidas por el alérgeno Ascaris suum (FIGURA 25) . En un experimento paralelo, IL-5 y eotaxina fueron inducidas en el BAL siguiente a la prueba de Ascaris. El pretratamiento de los animales con hl3.2v2 redujo el nivel de inducción de IL-5 y eotaxina . [0308] Los primates no humanos sensibilizados con Ascaris suum desarrollaron IgE al antigeno de Ascaris. Este IgE se une a FcDRI en los basófilos circulantes, de manera tal que la prueba in vi tro de basófilos de sangre periférica con el antigeno Ascaris indujo la desgranulación y la liberación de histamina. La reiterada exposición del antigeno reforzó la sensibilización del basófilo dando como resultado mejores respuestas de liberación de histamina. Para probar los efectos de hl3.2v2 en este proceso, a los monos cynomolgus dosificados con hl3.2v2 o solución salina o controles IVIG de la manera como se describió se les extrajo sangre 8 semanas después de la prueba con Ascaris , y los niveles de IgE especifico de Ascarisy totales en plasma se determinaron por medio de ELISA. Los niveles de IgE especifico de Ascaris se incrementaron 8 semanas después de la prueba en los animales de control tratados con solución salina o IVIG (FIGURA 31B) . En contraste, los animáis tratados con hl3.2v2 mostraron una reducción significativa en los niveles de IgE circulante especifico para Ascaris (FIGURA 31A) . No hubo ningún cambio significativo en el titer total de IgE para cualquiera de los grupos de tratamiento. Para evaluar los efectos sobre la liberación de histamina en basófilos, a los animales se les extrajo sangre a las 24 horas, 8 semanas y 4 meses después de la prueba de Ascaris . Se probó la sangre completa con el antigeno de Ascaris durante 30 minutos a 37 °C, y la histamina liberada en el sobrenadante se cuantificó por medio de ELISA (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . Tal como se muestra en la FIGURA 32A, estos animales sensibilizados demostraron algún nivel de liberación de histamina en basófilos inducida por Ascaris aún antes de la prueba de segmento de antigenos. Después de la prueba, los animales de control mostraron el aumento esperado en la sensibilidad del basófilo. En contraste, los animales tratados con hl3.2v2 no pudieron someterese a este aumento de sensibilización del basófilo, de manera tal que 2-4 meses después de la prueba, registraron una respuesta a Ascaris de liberación de histamina in vi tro significativamente menor (FIGURA 32B) . Por lo tanto, una administración única de hl3.2v2 tuvo una actividad modificadora de la enfermedad a largo plazo en este modelo.
Ejemplo 4: Humanización de mAbl3.2 basada sobre varios genes de linea germinal humana El Ejemplo 3 proporcionó un método y resultado para la humanización de mAbl3.2 sobre la base de los genes de la linea germinal DP-54 y DPK9; en este Ejemplo, la humanización de mAbl3.2 basada sobre otros genes de la linea germinal se detalla en forma sintética.
Se diseñaron estrategias adicionales de humanización sobre la base de un análisis de las secuencias del anticuerpo de la linea germinal humana o de un subgrupo de las mismas que poseía un alto grado de homología, es decir, la semejanza de la secuencia, con la secuencia real de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo de murino. Por ejemplo, el grupo VH 3 de BASE V mostró un alto grado de semejanza de la secuencia con mAbl3.2. Se determinó que las CDR de la región variable de cadena pesada se podría transferir a cualquiera de un subgrupo de genes de linea germinal dentro del grupo VH 3, es decir 3-53 (DP-42), 3-48 (DP-51), 3-09 (DP-31), 3-13 (DP-48), 3-15 (DP-38), 3-20 (DP-32), 3-21 (DP-77), 3-23 (DP-47), 3-30 y 3-30.5 (DP-49), 3-64 (DP-45), 3-66 (DP-86), y 3-73 (YAC-9) (FIGURA 26). También se muestra en la figura 26 la secuencia para DP-61, la cual también se puede utilizar para humanizar mAbl3.2. Se determinó que las sustituciones de aminoácidos comunes siguientes se podrían introducir en mAbl3.2 para convertir su marco de tiempo VH en cualquiera de los marcos de tiempo de las lineas germinales humanas propuestas: K3Q, K13Q or K13R, K19R, T40A, E42G, R44G, R75K, I77S o I77T, S83N, S87A o S87D, M92V o M92L, y T113L. Las sustituciones individuales de aminoácidos para la humanización sobre la base de un gen particular de linea germinal también fueron delineadas, por ejemplo la humanización basada en DP-47 puede involucrar las mutaciones adicionales de V5L, A49S, y A74S; la humanización basada sobre DP-42 puede involucrar las mutaciones adicionales de V12I, A49S, y A74S; la humanización basada sobre DP-51 puede involucrar la mutación adicional de A49S; la humanización basada sobre DP-48 puede involucrar las mutaciones adicionales de P41T, D72E, y E88G; la humanización basada sobre DP-53 puede involucrar las mutaciones adicionales de E46V y A49S; la humanización basada sobre DP-32 puede involucrar las mutaciones adicionales de L11V, A49S, y Y94H; la humanización basada sobre DP-38 puede involucrar las mutaciones adicionales de A49G, A74D, R75S, N76K, R86K, y S87T; la humanización basada sobre DP-31 puede involucrar las mutaciones adicionales de G16R, A49S, y R97K; la humanización basada sobre DP-61 puede involucrar las mutaciones adicionales de W47Y, A49S, A74S, y T90M; y la humanización basada sobre DP-45 puede involucrar las mutaciones adicionales de E6Q, A24G, A49S, y T90M. Por ejemplo, cuando la humanización de mAbl3.2 se basa sobre el gen DP-47 de la linea germinal humana, el cual tiene una identidad de secuencia del 79%, las siguientes mutaciones, K3Q, V5L, K13Q, K19R, T40A, E42G, R44G, A49S, A74S, R75K, I77T, S83N, S87A, M92V, y T113L, se pueden introducir en mAbl3.2. La introducción de las sustituciones comunes de aminoácidos solas, o en combinación con las sustituciones individuales de aminoácidos basadas sobre un gen particular de la linea germinal humana, en mAbl3.2 durante la humanización debe dar como resultado un anticuerpo activo. Por ejemplo, un anticuerpo activo, hl3.2v3, resultó cuando la humanización de mAbl3.2 se basó en 3-21 (DP-77), tal como se describe a continuación. Una humanización alternativa de mAbl3.2 se basó sobre los genes de la linea germinal DP-77 y Bl. La alineación entre la secuencia de aminoácidos prevista de DP-77, la secuencia variable de aminoácidos de cadena pesada de chl3.2, y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo mAbl3.2 completamente humanizado (hl3.2v3) se muestra en la FIGURA 27. La alineación entre la secuencia prevista de aminoácidos de Bl, la secuencia variable de aminoácidos de cadena ligera de chl3.2, y la secuencia variable de aminoácidos de cadena ligera de hl3.2v3 se muestran en la FIGURA 28. Las secuencias previstas de aminoácidos de DP-77 y Bl demostraron una identidad de aminoácidos del 80.4% con la cadena pesada variable de mAbl3.2 y la identidad de aminoácidos del 77.5% con la cadena ligera variable de mAbl3.2, respectivamente. Si bien las diferencias de aminoácidos entre DP-77 y la cadena pesada de mAbl3.2 (y la cadena pesada de chl3.2, del mismo modo), y entre Bl y la cadena ligera de mAbl3.2 (y la cadena ligera de chl3.2, de igual modo), se hallaron en varios de trabajo y regiones de determinación de la complementariedad, las diferencias en los CDR permanecieron sin modificar. Por el contrario, donde un aminoácido se halló en la región de la trama de la cadena pesada mAbl3.2 difirió del aminoácido en la misma posición en DP-77, el aminoácido de la región pesada variable de mAbl3.2 se cambió al aminoácido en DP-77. De una manera similar, donde un aminoácido se encontró en la región de la trama de la cadena ligera de mAbl3.2 difirió del aminoácido en la misma posición en Bl, el aminoácido en la cadena ligera variable de mAbl3.2 se cambió por el aminoácido en Bl. Dos vueltas de mutagénesis de PCR, como se describió con anterioridad, introdujeron los cambios . Después de la primera vuelta de cambios en las cadenas pesadas y ligeras, se realizó ELISA como se describió en el Ejemplo 2, tpara asegurar que los cambios no afectaron la capacidad del anticuerpo para unirse a la IL-13. Después de la segunda vuelta de cambios, las secuencias de aminoácidos de las regiones de la trama dentro de las cadenas pesada y ligera del mAbl3.2 fueron idénticas a las secuencias de aminoácidos de las regiones de la trama de DP-77 y Bl, respectivamente. El anticuerpo mAbl3.2 humanizado, hl3.2v3 también fue capaz de inhibir las actividades in vi tro asociadas con IL-13. hl3.2v3 se probó ELISA y el ensayo de proliferación TFlpara determinar su capacidad de para determinar su capacidad de para unir e inhibir una o más actividades asociadas a la IL-13. Se demostró que hl3.2v3 podría competir de manera similar con mAbl3.2 para unirse a la IL-13 cuando se comparó con chl3.2 y hl3.2vl. De manera adicional, hl3.2v3 fue capaz de inhibir la proliferación de TFl hasta el mismo grado que mAbl3.2 y hl3.2vl.
Ejemplo 5: Actividad del efector mediada por el Fe de tipo silvestre reversor de h!3.2v2 La forma de señalización celular y el receptor de IL-13 que incluye los polipéptidos IL-13Ral y IL-4Ra se encuentra en la superficie de los tipos celulares que responden a la citoquina. IL-13Ra2 no se expresa normalmente en la superficie de las células sensibles a la IL-13 pero se informó en tumores de cerebro, cabeza y cuello (Kawakami et al. (2003) Clin . Cáncer Res . 9:6381-8; Mintz et al. (2002) Neoplasia 4:388-99; Liu et al. (2000) Cáncer Immunol . Immunother . 49:319-24). La expresión de IL-13Ro¡2 también se puede inducir en los monocitos humanos primarios tratados con IFND (Daines et al. (2002) J. Biol . Chem . 277 :10387-93) , o TNFD- o los fibroblastos humanos primarios (Yoshikawa et al. (2003) Biochem . Biophys . Res . Commun . 312:1248-55). Este receptor no es competente para mediar las respuestas de señalización con IL-13 (Kawakami et al. (2001) Blood 97:2673-9) , sino que en su lugar parece actuar como un receptor decoy, que compite por las interacciones productivas de IL-13 con IL-13Ral (Feng et al. (1998) Lab . Invest . 78:591-602).
IL-13ROÍ2 tiene una alta afinidad por IL-13 (Andrews et al. (2002) J. Biol . Chem . 277:46073-8), y parece interactuar principalmente con la región terminal C de la citoquina (Madhankumar et al. (2002) J. Biol . Chem . 277:43194-205), la cual no está prevista para incluir al sitio de unión hl3.2v2. Por lo tanto, se examinó si hl3.2v2 podía interactuar con IL-13 capturada por IL-13R 2 sobre la superficie celular. A375 es una linea celular de melanoma humano que expresa IL-13Ra2. IL-13 recombinante humano (3 ng/ml) se contactó con estas células a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron y se probaron para la unión de hl3.2v2 biotinilado. Los resultados mostraron una unión dependiente de la dosis del anticuerpo en estas células en presencia de IL-13, iindicando que hl3.2v2 se une a IL-13 que se unió a su receptor (FIGURA 33) . A fin de determinar si hl3.2v2 podría promocionar la función efectora dependiente de Fe, los residuos mutados de Fe de hl3.2v2 (L234A / G237A; residuos 116 y 119 de la SEC ID NO: 17) se revirtieron hasta el tipo silvestre y los anticuerpos que expresan Fe de tipo silvestre o mutado se expresaron y se purificaron. La función efectora se probó en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) utilizando células A375 cargadas con IL-13 como objetivos. Las células objetivo A375 fueron etiquetadas con cromo 51 y se incubaron con 10 ng/nl de IL-13 recombinante humana. PBMC humana enriquecida para las células exterminadoras naturales (NK) por medio del tratamiento con ROSETTESEP® Human NK Enrichment Cocktail (StemCell Technologies, Seattle, WA) se utilizaron como efectores. El efector y las células objetivo se incubaron juntas en presencia de cantidades mayores de hl3.2v2 o su Fe reversor de tipo silvestre durante 5 horas a 37 °C. Se midió la citotoxicidad como la liberación de cromo 51 en el sobrenadante y se expresó como un porcentaje de la liberación máxima, determinado por la lisis de las células objetivo A375 con TRITÓN® X-100. Los resultados mostraron que el Fe reversor de tipo silvestre fue capaz de mediar ADCC de las células objetivo A375 cargadas de IL-13, teniendo en cuenta que hl3.2v2 no estaba (FIGURA 34A) . No se observó ninguna cicotoxicidad en ausencia de IL-13 (FIGURA 34B) . Se observaron resultados similares utilizando las células del efector de 3 donantes diferentes. Estos resultados indican que, debido a la presencia de las mutaciones L234A y G237A Fe, hl3.2v2 no es capaz de mediar ADCC, aún bajo condiciones óptimas in vi tro . Tomadas juntas, estas observaciones indican que hl3.2v2 se puede unir a las células que expresan IL-13Ra2 (FIGURA 33), pero no a las que expresan IL-13Ro¡l. Los experimentos se realizaron para probar si el hl3.2v2 reversor de tipo silvestre podia mediar ADCC en las células HT-29 que expresan la IL-13 y IL-13Ral, aún en ausencia de la unión detectable. Las células HT-29 fueron utilizadas como objetivos en un ensayo de ADCC realizado de la manera como se describió con anterioridad. Los resultados mostraron que en condiciones que conducen a la citolisis de las células A375 que expresan IL-13Ra2, las células HT-29 que expresan IL-13Ral no fueron sometidas a lisis (FIGURA 35) . Estos resultados también demuestran que, mientras que los anticuerpos que incluyen las mutaciones L234A y G237A Fe no inducen ADCC, los anticuerpos con la función del efector Fe de tipo silvestre pueden ser útiles para el tratamiento de ciertos cánceres que expresan IL-13Ra2. Ejemplo 6: Expresión de un anticuerpo 13.2 humanizado en células COS Con el fin de evaluar la expresión de anticuerpos de anti-IL13 humanizados en el sistema mamífero recombinado, las regiones variables de ratón 13.2 (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 13), hul3.2 VI (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 15), y hul3.2 V2 (SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 16) se subclonaron en una expresión vectorial pED6 que contenia regiones humanas constantes kappa y IgGlmut. Se cultivaron células COS-1 de riñon de mono en un medio DME (Gibco) que contenia 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1 mF de glutamina y 0.1 mg/ml de Penicilina/Estreptomicina. Se realizó la transfección de células COS utilizando un reactivo de transfección TRANSITITCD-LT1 (Mirus Bio Corp., Madison, Wl) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las células COS transfectadas se incubaron por 24 horas a 37 °C en la presencia de un 10% de C02, se lavaron con PBS estéril y se cultivaron en un medio R1CD1 (Gibco) sin suero por 48 horas para permitir la secreción del anticuerpo y su acumulación en el medio condicionado. La expresión del anticuerpo 13.2 se calificó por la cantidad total de IgG ELISA humano utilizando como norma IgGl/kappa humano purificado. El anticuerpo quimérico 13.2 asi como ambas versiones humanizadas se expresaron bien en las células COS. Tabla 5. Expresión transitoria de anticuerpos 13.2 humanizados en células COS Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, caracterizado porque se une a la IL-13 con un KD de menos de 10"7 M y tiene una o más de las propiedades siguientes : (a) la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende una CDR3 de cadena pesada de mAbl3.2 (SEC ID
  2. NO: 24), o una CDR3 de cadena pesada que difiere por menos de 3 sustituciones de aminoácidos de una CDR3 correspondiente de mAbl3.2; (b) la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende una CDRl de cadena ligera de mAbl3.2 (SEC ID
  3. NO: 19), o una CDRl de cadena ligera que difiere por menos de 3 sustituciones de aminoácidos de una CDRl de cadena ligera correspondiente de mAbl3.2; (c) la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones muy rigurosas hasta el complemento de un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada de hl3.2 (SEC ID NO: 15, 16, ó 36); (d) la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende una secuencia codificada por un ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones muy rigurosas hasta el complemento de un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena ligera de hl3.2 (SEC ID NO: 11, 12, o 35); (e) la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada es por lo menos 90% idéntica a un dominio variable de cadena pesada de hl3.2 (SEC ID NO: 15, 16, ó 36); (f) la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera es por lo menos 90% idéntica a un dominio variable de cadena ligera de hl3.2 (SEC ID NO: 11, 12, ó 35); (g) el anticuerpo, o un fragmento del mismo de unión al antigeno, compite con mAbl3.2 para unirse a la IL-13 humana; (h) el anticuerpo, o un fragmento del mismo de unión al antigeno, entra en contacto con uno o más residuos de aminoácido de IL-13 seleccionados a partir del grupo que consiste en 68, 72, 88, 91, 92, 93, y 105 de la SEC ID NO: 31; (i) la región variable de cadena pesada tiene la misma estructura canónica que mAbl3.2; (j) la región variable de cadena ligera tiene la misma estructura canónica que mAbl3.2; (k) la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera tiene regiones marco de FRl,
  4. FR2, y FR3 de segmentos de VH codificados por la linea germinal de genes de DP-54 y DPK-9 respectivamente o una secuencia al menos 95% idéntica a segmentos de VH codificados por la linea germinal de genes DP-54 y DPK-9; (1) confiere un efecto protector posterior a la inyección contra la exposición al antigeno de Áscaris en un modelo de oveja por lo menos 6 semanas después de la inyección . 2. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es purificado. 3. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un IgG recombinante, de longitud completa . . Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un Fab o un scFv.
  5. 5. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende regiones de la trama que son por lo menos 90% idénticas a las regiones de trama de lineas germinales humanas.
  6. 6. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las regiones humanas de la trama, una región humana Fe, o ambas.
  7. 7. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada tiene la misma estructura canónica que mAbl3.2 (como en (i)), y el dominio variable de cadena pesada comprende por lo menos cuatro IL-13 residuos de contacto de aminoácidos de mAbl3.
  8. 8. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la IL-13 humana con un KD de entre 90 y 120 pM.
  9. 9. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la IL-13 humana con un koff de menos de lxlO-4 s"1.
  10. 10. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la IL-13 humana con un kon de entre 5xl04 y 8xl05 M"1s"1.
  11. 11. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque reduce la capacidad de IL-13 para unirse a la IL-4Ra.
  12. 12. Anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la IL-13 que está en un complejo in vi tro con la IL-13R l.
  13. 13. Anticuerpo aislado, recombinante de IgG, caracterizado porque comprende dos cadenas de inmunoglobulina: una cadena ligera que incluye las SEC ID NO: 9, 10, 11, 12, ó 35 y una cadena pesada que incluye las SEC ID NO: 13, 14, 15, 16, ó 36.
  14. 14. Anticuerpo IgG recombinante, aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la cadena pesada además incluye la SEC ID NO: 17 y la cadena ligera adicionalmente incluye la SEC ID NO: 18.
  15. 15. Anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une al antigeno, caracterizado porque tiene una o más de las propiedades siguientes: (a) se une de manera especifica a un epitope que comprende los residuos 81-93 ó 114-132 de IL-13 humana (SEC ID NO: 31), o una forma de la misma sustituida de manera conservadora ; (b) se une de manera especifica a un epitope de IL-13 humana que comprende uno o más de los residuos' de los aminoácidos siguientes: Glutamato en la posición 49, Aspargina en la posición 53, Glicina en la posición 69, Prolina en la posición 72, Histidina en la posición 73, Lisina en la posición 74, y Arginina en la posición 86 de la SEC ID NO: 32, o una sustitución conservadora de aminoácidos de la misma; (c) se une a un complejo de IL-13 e IL13R l; (d) interfiere con una interacción de la unión entre IL-13 y IL-4Ra; (e) interfiere con una interacción de unión entre IL-13/IL-13Ral y IL-4R ; y (f) se une de manera especifica a la IL-13 humana e inhibe de manera competitiva la unión de un segundo anticuerpo al humano, donde el mencionado segundo anticuerpo es elegido a partir de mAbl3.2, chl3.2, hl3.2vl, hl3.2v2, o hl3.2v3.
  16. 16. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque tiene una región constante mutada hasta reducir uno o más de: la unión del receptor de Fe, la glicosilación del anticuerpo, la cantidad de residuos de cisteina, la función celular efectora o la función de complemento.
  17. 17. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente comprende una región humana IgGl constante mutada en uno o más residuos 116 y 119 de la SEC ID NO: 17.
  18. 18. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente comprende una cadena ligera humana kappa.
  19. 19. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente comprende por lo menos una región de determinación de la complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 21, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 22, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 23, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 24.
  20. 20. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fragmento es un scFv, Fab, o un fragmento F(ab')2.
  21. 21. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente comprende una cadena ligera que comprende una región constante kappa humana o un fragmento activo de la misma, y una cadena pesada que comprende una región constante de IgG humano o un fragmento activo del mismo.
  22. 22. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la región constante humana kappa de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 18, o un fragmento activo del mismo.
  23. 23. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la región constante de IgG humano de la cadena pesada es mutada para reducir FcR y complementar la unión.
  24. 24. Anticuerpo, o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la región constante del IgG humano mutada de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 17, o un fragmento activo de la misma.
  25. 25. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1 ó 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  26. 26. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque se adapta para la administración subcutánea, inhalatoria o tópica.
  27. 27. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que (i) codifica un polipéptido que comprende una secuencia variable de dominio de inmunoglobulina de cadena pesada que: (a) comprende una CDR3 pesada de mAbl3.2 (SEC ID NO: 24), o una CDR3 que difiere por menos de 3 sustituciones de aminoácidos de una CDR3 correspondiente de mAbl3.2; o (b) es por lo menos 90% idéntica a un dominio variable de cadena pesada de hl3.2 (SEC ID NO: 15, 16, ó 36); ó (ii) hibridiza bajo condiciones muy rigurosas al complemento de un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada de hl3.2 (SEC ID NO: 15, 16, ó 36) .
  28. 28. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que (i) codifica un polipéptido que comprende una secuencia variable de dominio de inmunoglobulina de cadena ligera que: (a) comprende a una CDR3 de cadena ligera de mAbl3.2 (SEC ID NO: 19), o una CDRl que difiere por menos en 3 sustituciones de aminoácidos de una CDRl correspondiente de mAbl3.2; ó (b) es por lo menos 90% idéntica a un dominio variable de cadena ligera de hl3.2 (SEC ID NO: 11, 12, ó 35); ó (ii) hibridiza bajo condiciones muy rigurosas al complemento de un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada de hl3.2 (SEC ID NO: 11, 12, ó 35).
  29. 29. Célula hospedera, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1 ó 15.
  30. 30. Método para proporcionar un anticuerpo recombinante, caracterizado porque comprende: proporcionar a una célula hospedera una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o un fragmento del mismo de unión al antigeno, y mantener la célula bajo condiciones en las cuales se expresan el anticuerpo, o un fragmento del mismo de unión al antigeno
  31. 31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque adicionalmente comprende el aislamiento de la proteina de la célula hospedera o del medio en el cual se mantiene la célula hospedera.
  32. 32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque adicionalmente comprende la formulación de la proteina aislada como una composición farmacéutica .
  33. 33. Método para tratar un trastorno asociado con IL-13, caracterizado porque comprende: administrar a un sujeto que tenga o esté en riesgo de contraer el trastorno, una cantidad efectiva del anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, de conformidad con la reivindicación 1.
  34. 34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque los trastornos asociados a la IL-13 se seleccionan a partir del grupo que consiste de trastornos asmáticos, trastornos atópicos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , condiciones que implican la inflamación de las vias aéreas, eosinofilia, fibrosis y la producción excesiva de mucocidad, condiciones inflamatorias, condiciones autoinmunes, tumores o cánceres, infección viral, y supresión de la expresión de las respuestas inmunes protectoras tipo 1.
  35. 35. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno es un trastorno asmático o rinitis alérgica.
  36. 36. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno es la enfermedad intestinal inflamatoria.
  37. 37. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno es enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) .
  38. 38. Método de la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno es un trastorno atópico.
  39. 39. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la proteina se administra via subcutánea, por inhalación o por via tópica.
  40. 40. Método para tratar un trastorno asociado con IL-13, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto de un anticuerpo que se une a la IL-13, donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes propiedades: (i) confiere un efecto protector post-inyección contra la exposición a un antigeno Áscaris en un modelo de oveja por al menos 6 semanas tras la inyección, o (ii) previene la unión de IL-13 a IL-4Ra, pero no previene la unión de IL-13 a IL-13Ral.
  41. 41. Método para detectar la presencia de IL-13 en una muestra, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto a la muestra con un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo y la muestra, donde la formación del complejo en la muestra es indicadora de la presencia de IL-13 en la muestra.
  42. 42. Método de la reivindicación 41, caracterizado porque la muestra es de un sujeto.
  43. 43. Método para tratar a un sujeto que presenta un síntoma de asma seleccionado a partir del grupo que consiste en respiración dificultosa, falta de aliento, broncoconstricción, hipersensibilidad de las vias aéreas, disminución de la capacidad pulmonar, fibrosis, inflamación de las vias aéreas, y producción de moco, caracterizado porque comprende el paso de administrar al paciente un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 15, donde el anticuerpo se une a la IL-13 e interfiere con la formación de un complejo funcional de señalización de la IL-13.
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