KR101299073B1 - 사람 인터루킨-13에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 인터루킨-13 (IL-13), 특히 사람 IL-13에 결합하는 항체, 예를 들어 사람화된 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 IL-13에 의해 중재되는 면역 반응을 조절하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본원에 기술된 항체는 환자, 예를 들어 사람 환자에서 하나 이상의 IL-13-관련 장애, 예를 들어 호흡 장애 (예: 천식); 아토피 장애 (예: 알러지성 비염); 피부 (예: 아토피성 피부염) 및 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD))의 염증 및/또는 자가면역 질병, 섬유증 및 암을 진단, 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.
Figure R1020067025990
인터루킨-13, 사람화된 항체, IL-13-관련 장애

Description

사람 인터루킨-13에 대한 항체 및 이의 용도{Antibodies against human interleukin-13 and uses therefor}
관련 출원의 상호-참조
본원은 미국 특허원 제60/578,473호 (2004년 6월 9일 출원), 제60/581,375호 (2004년 6월 22일 출원), 및 제60/578,736호 (2004년 6월 9일 출원)을 우선권으로 주장한다. 이들 출원 모두의 전체 내용이 본원에 참조로 삽입된다. 또한, 미국 특허 출원 (utility patent application) (제목: Anti-IL13 Antibodies and Complexes, 출원일: 2005년 6월 9일, 발명자: Parris, K.D. 등, 대리인 참조 번호: 16163-029001/AM101750 (본원에서는 "출원 16163-029001"로 언급)도 참조로 삽입된다.
본원은 인터루킨-13 (IL-13), 특히 사람 IL-13에 결합하는 항체, 예를 들어 사람화된 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 IL-13에 의해 중재되는 면역 반응을 조절하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본원에 기술된 항체는 환자, 예를 들어 사람 환자에서 하나 이상의 IL-13-관련 장애, 예를 들어 호흡 장애 (예: 천식); 아토피 장애 (예: 알러지성 비염); 피부 (예: 아토피성 피부염) 및 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD))의 염증 및/또는 자가면역 질병, 섬유증 및 암을 진단, 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.
인터루킨-13 (IL-13)은 T 림프구 및 비만 세포에 의해 분비되는 사이토킨이다 (McKenzie et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41). IL-13은 IL-4와 수개의 생물학적 활성을 공유한다. 예를 들어, IL-4 또는 IL-13은 B 세포에서 IgE 이소타입 전환 (isotype switching)을 일으킬 수 있다 (Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800). 또한, 세포 표면 CD23 및 혈청 CD23 (sCD23)의 증가된 수준이 천식 환자에서 보고되었다 (Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc. 20:119-25). 또한, IL-4 또는 IL-13은 B 세포 및 단구 상의 MHC 제II형 및 저친화성 IgE 수용체 (CD23)의 발현을 상향 조절하여, 항원 제시를 향상시키고 대식구 기능을 조절한다 (Tomkinson et al., 상기 참조). 중요하게는, IL-4 또는 IL-13은 내피 세포상의 VCAM-1의 발현을 증가시켜 호산구(및 T 세포)의 기도 조직으로의 우선적인 보충을 촉진한다 (Tomkinson et al., 상기 참조). 또한, IL-4 또는 IL-13은 기도 점액 분비를 증가시켜 기도 반응성을 격화시킬 수 있다 (Tomkinson et al., 상기 참조). 이들 관측은, 비록 IL-13이 Th2 발달을 유도하는데 필수적이지는 않지만, 또는 비록 유도할 수 있다고 하더라도, IL-13이 기도 호산구증가증 및 AHR의 발달에 주요 역할자일 수 있다는 것을 제시한다 (Tomkinson et al., 상기 참조; Wills-Karp et al. (1998) Science 282:2258-61).
발명의 요지
본원은, 특히, IL-13, 특히 사람 IL-13에 고친화성 및 고특이성으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편을 포함하여, IL-13 길항제인 IL-13 결합제를 제공한다. 본원에서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 "항-IL-13 항체" 및 "이의 단편"으로도 언급된다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은, 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 감소, 중화 및/또는 길항한다. 예를 들어, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13, 예를 들어 IL-13의 에피토프에 결합하고, 상호작용, 예를 들어 IL-13과 IL-13 수용체 복합체 (IIL-13R"), 예를 들어 IL-13 수용체 α1 ("IL-13Rα1")와 인터루킨-4 수용체 알파 쇄 ("IL-4Rα") 또는 이의 서브유닛 (예를 들어, 각각 IL-13Rα1 또는 IL-4Rα)을 포함하는 복합체 사이의 결합을 방해할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 항체 및 이의 단편은 상호작용, 예를 들어 IL-13과 IL-13 수용체 복합체 또는 이의 서브유닛 사이의 결합을 방해하여 (예를 들어 억제, 차단 또는 감소시켜) 작용성 시그널링 복합체의 형성을 방해하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자는 중화성 항-IL-13 항체의 투여가, 예를 들어 비사람 영장류 및 양에서 특히 항원-유도된 폐렴, 각각 호산구증가증 및 기관지수축을 완화시킨다는 것을 밝혔다. 따라서, IL-13 길항제, 예를 들어 중화성 항-IL-13 항체 및 이의 단편은 생체 내에서 하나 이상의 IL-13-관련된 활성, 예를 들어 염증 질병 (예: 폐렴)을 완화시키는데 사용될 수 있다. 또한, 중화성 항-IL-13 항체 및 이의 단편은 IL-13에 대한 아토피성 환자의 세포의 향상된 민감성을 완화시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 계절성 알러지, 예를 들어 알러지성 비염의 치료를 위해 사용될 수 있다. 항-IL-13 항체 또는 이의 단편 (본원에 기술된 것들을 포함)은 환자, 예를 들어 사람 환자에서 하나 이상의 IL-13-관련된 장애, 예를 들어 호흡 장애 (예: 천식 (알러지성 및 비-알러지성 천식을 포함), 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 질병 (예: 낭포성 섬유증 및 폐 섬유증)); 아토피 장애 (알러지성 비염); 피부 (예: 아토피성 피부염), 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD)), 간 (예: 경화증)의 염증 및/또는 자가면역 질병; 바이러스 감염; 피부경화증 및 기타 기관의 섬유증, 예를 들어 간 섬유증을 진단, 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.
따라서, 하나의 양태에서, 본원은 IL-13 결합제, 예를 들어 IL-13 길항제를 특징으로 한다. IL-13 결합제는 단백질, 예를 들어 IL-13, 특히 포유동물 IL-13, 예를 들어 사람, 양 또는 비사람 영장류 IL-13과 상호작용, 예를 들어 이에 결합하고/하거나 중화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 펩티드 또는 스캐폴드 (scaffold) 도메인일 수 있다. 항체는 분리된 항체일 수 있다. 하나의 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 중화 항체여서, 예를 들어, 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 감소 및/또는 억제하며, 예를 들어, 당해 활성은 이로 제한됨이 없이, CD23 발현을 유도하거나; 사람 B 세포에 의한 IgE의 생성을 유도하거나; 전사 인자, 예를 들어 STAT 단백질 (예: STAT6 단백질)의 인산화를 유도하거나; 생체 내에서 항원-유도된 호산구증가증을 유도하거나; 생체 내에서 항원-유도된 기관지수축을 유도하거나; 생체 내에서 약물-유도된 기도 과반응성을 유도하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 IL-13 길항제, 예를 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 고친화성, 예를 들어 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 미만 또는 보다 우수한 값의 Kd를 갖는 고친화성으로 IL-13에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 50 내지 500 pM, 예를 들어 90 내지 120 pM, 예를 들어 95 내지 105 pM의 친화성으로 IL-13에 결합할 수 있다. 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 적어도 약 50 nM 내지 5 pM, 통상적으로 약 100 내지 250 pM의 IC50으로 또는 이보다 강하게 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화시킬 수 있다. 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 103 내지 107 M-1s-1, 통상적으로 104 내지 106 M-1s-1 범위의 반응속도로 IL-13과 결합한다. 예를 들어, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 5 x 104 내지 8 x 106 M-1s-1 범위의 반응속도로 IL-13과 화합할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 10-2 내지 10-6 s-1, 통상적으로 10-3 내지 10-6 s-1의 범위, 예를 들어 5 x 10-4 s-1, 예를 들어 9, 8, 6 x 10-5 s-1 보다 느린 해리 반응속도를 갖는다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13에 모노클로날 항체 13.2 ("mAb13.2") 또는 이의 변형된 형태, 예를 들어 키메릭 형태 (예: "ch13.2") 또는 이의 사람화된 형태 (예: "h13.2v1," "h13.2v2" 또는 "h13.2v3")와 유사한 친화성 및/또는 반응속도로 결합한다. 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 친화성 및 결합 반응속도는, 예를 들어 바이오센서 테크놀로지의 BIACORETM를 사용하여 시험될 수 있다 (하기 실시예 1.2 참조).
하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편 (예: Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)은 모노클로날 항체 또는 단일 특이성을 갖는 항체이다. 또한, 항체 또는 이의 단편은 사람, 사람화, 키메릭 또는 시험관 내에서 생성된 항체일 수 있다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람화된 항체이다. 하나의 양태에서, 항체는 효과적으로 사람 항체이다.
항-IL-13 항체의 중쇄 및 경쇄는 완전한 길이이거나 (예를 들어, 항체는 하나 이상, 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄 및 하나 이상, 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함할 수 있다), 항원-결합 단편 (예: Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역, 특히 gG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 영역, 보다 특히 IgG1 (예: 사람 IgG1)의 중쇄 불변 영역을 갖는다. 또 다른 양태에서, 항체는, 예를 들어 카파 또는 람다, 바람직하게는 카파 (예: 사람 카파)의 경쇄 불변 영역으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 갖는다. 하나의 양태에서, 불변 영역은 항체의 특성 (예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기 수, 이펙터 세포 작용, 또는 보체 작용 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키기 위해)을 변경시키기 위해, 예를 들어 돌연변이된다. 예를 들어, 사람 IgG1 불변 영역은 하나 이상의 잔기, 예를 들어 서열번호 17의 잔기 234 및 237 (위치 1의 세린이 (예를 들어, VH 쇄의 118개 아미노산의 다음에 이어지는) 잔기 119로 이동되는 경우에는 잔기 234 및 237; 서열번호 17에서 보여지는 바와 같이, 위치 1이 세린이면, 이들 동일 잔기는 116 및 119번이다) 중 하나 이상의 잔기에서 돌연변이될 수 있다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체는 서열번호 17에 나타낸 사람 IgG1 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체는 서열번호 18에 나타난 바와 같은 사람 카파 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13, 특히 포유동물, 예를 들어 비사람 영장류, 양 또는 사람 IL-13 (예를 들어, 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 사람 IL-13 (도 11)), 또는 서열번호 31의 약 20번 내지 132번 아미노산의 성숙한 사람 IL-13 서열 (도 11) (또한, 성숙한 사람 IL-13 서열 번호매김에 대해 서열번호 32를 참조), 또는 이들 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열에 특이적으로 결합한다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람 IL-13의 변이체, 예를 들어 서열번호 31의 위치 130에서 아르기닌 (R) 대신에 글루타민 (Q)를 갖는 사람 IL-13의 변이체 (도 11)에 결합한다. 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 IL-13의 단편, 예를 들어 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 10, 20, 50, 75, 100, 120 또는 130개 연속한 아미노산의 단편, 또는 이들과 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열에 특이적으로 결합한다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람 IL-13에 특이적으로 결합하고, 비사람 종으로부터의 IL-13과는 교차반응하지 않는다. 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 포유동물 IL-13의 2개 이상의 형태, 예를 들어 사람, 양 및/또는 비사람 영장류 IL-13에 결합한다.
하나의 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13, 예를 들어 특히 포유동물의 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13의 에피토프, 예를 들어 선형 또는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람 IL-13 (서열번호 31)의 잔기 81-93 및/또는 114-132를 포함하는 에피토프, 또는 이의 변형된 형태 (예: 단편 또는 이의 치환된 (예를 들어, 보존적으로 치환된) 형태)에 결합한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함하는 사람 IL-13의 에피토프에 특이적으로 결합한다: 서열번호 31 [성숙 서열에서의 위치; 서열번호 32]의 위치 68 [49]에서 글루타메이트, 위치 72 [53]에서 아스파라긴, 위치 88 [69]에서 글리신, 위치 91 [72]에서 프롤린, 위치 92 [73]에서 히스티딘, 위치 93 [74]에서 리신, 및 위치 105 [86]에서 아르기닌.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 IL-13와 IL-13Rα1 ("IL-13/IL-13Rα1"); IL-13와 IL-4Rα ("IL-13/IL-4Rα"); 및 IL-13와 IL-13Rα1와 IL-4Rα ("IL-13/IL-13Rα1/IL-4Rα") 중에서 선택되는 복합체에 결합한다. 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL- 13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, 상호작용, 예를 들어 IL-13과 IL-13 수용체 복합체, 예를 들어 IL-13Rα1과 IL-4Rα를 포함하는 복합체 사이의 결합을 방해 (예를 들어, 억제, 차단 또는 감소)한다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, 상호작용, 예를 들어 IL-13/IL-13Rα1와 IL-4Rα 사이의 결합을 방해 (예를 들어, 억제, 차단 또는 감소)한다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, 상호작용, 예를 들어 IL-13/IL-4Rα와 IL-13Rα1 사이의 결합을 방해 (예를 들어, 억제, 차단 또는 감소)한다. 통상적으로, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 상호작용, 예를 들어, IL-13/IL-13Rα1와 IL-4Rα의 결합을 방해 (예를 들어, 억제, 차단 또는 감소)한다. 예시적인 항체는 3원 복합체 IL-13/IL-13Rα1/IL-4Rα의 형성을 억제하거나 방지한다.
IL-13R (예를 들어, IL-13 수용체 복합체) 또는 이의 서브유닛에 대한 IL-13의 결합을 방해하는, IL-13 항체의 예는 "mAb13.2" 및 이의 변형된, 예를 들어 키메릭 또는 사람화된 형태를 포함한다. mAb13.2의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 13 및 서열번호 5에 나타나 있다. mAb13.2의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 9 및 서열번호 1에 나타나 있다. 예시적인 키메릭 형태 (예를 들어, mAb13.2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 형태)는 본원에서 "ch13.2"로 언급된다. ch13.2의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 14 (예: 도 15) 및 서열번호 6에 나타나 있다. ch13.2의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 10 (예: 도 16) 및 서열번호 2에 나타나 있다. 본원에서 "h13.2v1"으로 언급되는 서열 mAb13.2의 사람화된 형태는 각각 서열번호 15 (도 15) 및 서열번호 7로 나타낸 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 갖는다. h13.2v1의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 11 (도 16) 및 서열번호 3으로 나타낸다. 본원에서 "h13.2v2"로 언급되는 mAb13.2의 사람화된 형태는 각각 서열번호 16 (도 17) 및 서열번호 8로 나타낸 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 갖는다. h13.2v2의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 12 (도 18) 및 서열번호 4로 나타낸다. 본원에서 "h13.2v3"으로 언급되는 mAb13.2의 사람화된 형태는 각각 서열번호 36 (도 27) 및 서열번호 34로 나타낸 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 갖는다. h13.2v3의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 35 (도 28) 및 서열번호 33로 나타낸다.
하나의 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 IL-13, 예를 들어 사람, 비사람 영장류, 또는 양 IL-13에 특이적으로 결합하고, IL-13에 대한 제2 항체가 IL-13 (예: 사람, 비사람 영장류, 양 IL-13)상의 표적 에피토프에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 제2 항체는 본원에 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체일 수 있다.
하나의 양태에서, IL-13 항체 또는 이의 단편은 주사한 지 적어도 6주 후 양 모델에서 회충 항원에의 노출에 대해 주사 후 보호 효과를 부여할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체로부터의 하나 이상의 항원-결합 영역, 예를 들어 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체로부터의 적어도 하나 또는 2개의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체로부터의 적어도 하나 또는 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 적어도 특히 IL-13과 접촉하는 CDR로부터의 아미노산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개 또는 3개의 CDR, 또는 적어도 특히 IL-13과 접촉하는 CDR로부터의 아미노산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 을 포함한다.
하나의 바람직한 양태에서, 단백질은 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3로부터의 모든 6개의 CDR, 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예를 들어 동일하거나 하나 이상의 아미노산 변경을 가지나 2개, 3개 또는 4개 미만의 변경 (예: 치환, 결실 또는 삽입, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다. 임의로, 단백질은 본원에 기술된 어떠한 CDR이라도 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개 또는 3개의 초티아 (Chothia) 초가변 루프, 또는 특히 IL-13과 접촉하는 당해 초가변 루프로부터의 아미노산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개 또는 3개의 초가변 루프, 또는 IL-13과 접촉하는 초가변 루프로부터의 아미노산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술되는 바와 같이, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중에서 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 하나, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 초가변 루프를 포함한다.
하나의 바람직한 양태에서, 단백질은 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3으로부터의 모든 6개의 초가변 루프, 또는 밀접하게 관련된 초가변 루프, 예를 들어 동일하거나 하나 이상의 아미노산 변경을 가지나 2개, 3개 또는 4개 미만의 변경 (예: 치환, 결실 또는 삽입, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 초가변 루프를 포함한다. 임의로, 단백질은 본원에 기술된 어떠한 초가변 루프라도 포함할 수 있다.
또 다른 예시에서, 단백질은 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3의 상응하는 초가변 루프와 동일한 정준 (canonical) 구조, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 적어도 루프 1 및/또는 루프 2와 동일한 정준 구조를 갖는 적어도 하나, 2개 또는 3개의 초가변 루프를 포함한다. 초가변 루프 정준 구조의 기술에 대해 문헌 (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798)을 참조한다. 이들 구조는 이들 참조문헌에 기술된 표에 따라 결정될 수 있다.
하나의 양태에서, 중쇄 가변 주쇄 (framework) (예: 적어도 FR1, FR2, FR3, 및 임의로 FR4를 포함하는 영역)은 하기 중에서 선택될 수 있다: (a) 사람 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄로부터의 아미노산 잔기, 예를 들어 사람 성숙 항체, 사람 배선 (germline) 서열, 사람 컨센서스 서열 또는 본원에 기술된 사람 항체로부터의 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄 잔기 중 적어도 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98%, 또는 바람직하게는 100%를 포함하는 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄; (b) 사람 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄로부터의 아미노산 잔기, 예를 들어 사람 성숙 항체, 사람 배선 서열, 사람 컨센서스 서열로부터의 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄 잔기 중 20% 내지 80%, 40% 내지 60%, 60% 내지 90%, 또는 70% 내지 95%를 포함하는 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄; (c) 비-사람 주쇄 (예: 설치류 주쇄); 또는 (d) 예를 들어 항원성 또는 세포독성 결정자를 제거하기 위해 변형된, 예를 들어 탈면역화되거나 부분적으로 사람화된, 비-사람 주쇄. 하나의 양태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄 영역 (특히, FR1, FR2 및/또는 FR3)은 사람 배선 유전자, 예를 들어 DP-54 또는 DPK9의 VH 절편의 주쇄와 동일하거나 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일한 경쇄 또는 중쇄 가변 주쇄 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 중쇄 가변 영역은 하기 위치 중 하나 이상 (바람직하게는 적어도 4개, 10개, 12개 또는 전부)에서 사람 잔기 또는 사람 컨센서스 서열 잔기를 포함한다: (경쇄의 가변 도메인의 FR에서) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, 및/또는 (중쇄 가변 도메인의 FR에서) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, 및/또는 103H (카벳 (Kabat) 번호매김에 따름).
하나의 양태에서, 단백질은 하나 이상의 비-사람 CDR, 예를 들어 쥐 CDR, 예를 들어 mAb13.2로부터의 CDR 또는 이의 변이체, 및 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 적어도 5, 8, 10, 12, 15 또는 18개 아미노산이 mAb13.2의 주쇄와 상이한 하나 이상의 주쇄를 포함한다. 예를 들어, 단백질은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이러한 비-사람 CDR을 포함하고, HC FR1, HC FR2, HC FR3, LC FR1, LC FR2 및 LC FR3 중 적어도 3개에서 적어도 하나의 아미노산 차이를 포함한다.
하나의 양태에서, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인은, 본원에 기술된 항체, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3의 가변 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 본원에 기술된 항체, 예를 들어 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3의 가변 영역과 적어도 하나 또는 5개의 잔기가 상이하나 40, 30, 20 또는 10개 미만의 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 가변 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 비-사람 항체 (예: 쥐 항체, 예를 들어 mAb13.2) 및 사람 항체 또는 배선 서열 모두로부터 다양하게 유도되는 주쇄 영역에 있는 아미노산 위치를 포함한다. 예를 들어, 가변 도메인은, 아미노산 잔기가 비-사람 항체 및 사람 항체 (또는 사람 배선 서열) 모두에 대해 동일한 (이는 2개의 항체가 그 위치에서 동일하기 때문) 위치의 수를 포함할 것이다. 비-사람 및 사람이 상이한 나머지 주쇄 위치 중, 가변 도메인의 위치의 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%는 비-사람 보다는 사람 항체 (또는 사람 배선 서열)과 동일한 것이 바람직하다. 예를 들어, 이러한 나머지 주쇄 위치 중 0, 또는 적어도 1, 2, 3 또는 4개가 사람 보다는 비-사람 항체에 동일할 수 있다. 예를 들어, HC FR1에서, 1 또는 2개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있으며; HC FR2에서 1 또는 2개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있으며; FR3에서 1, 2, 3 또는 4개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있으며; LC FR1에서, 1, 2, 3 또는 4개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있으며; LC FR2에서 1 또는 2개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있으며; LC FR3에서 1 또는 2개의 이러한 위치가 비-사람일 수 있다.
하나의 양태에서, 단백질의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 본원에 기술된 핵산 서열 또는 본원에 기술된 핵산 서열 (예: 특정 핵산 서열 또는 본원에 기술된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열) 또는 이의 상보체에, 예를 들어 낮은 엄격 조건, 중간 엄격 조건, 높은 엄격 조건 또는 매우 높은 엄격 조건 하에 또는 본원에 기술된 기타 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화하는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 표 3에 나타낸 아미노산 서열 (VH에 대해 서열번호 13, 14, 15, 16 또는 36 및/또는 VL에 대해 서열번호 9, 10, 11, 12 또는 35), 또는 이와 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하거나, 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 35 또는 36과 1, 2, 5, 10 또는 15개 미만의 아미노산 잔기가 상이한 서열)을 갖는, 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 항원-결합 영역, 예를 들어 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 표 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 (VH에 대해 서열번호 5, 6, 7, 8 또는 34 및/또는 VL에 대해 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 33), 또는 이와 실질적으로 동일한 서열 (예: 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일하거나 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 33 또는 34와 3, 6, 15, 30 또는 45개 미만의 뉴클레오티드가 상이한 서열)을 갖는, 핵산에 의해 암호화되는 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 표 1에 나타낸 아미노산 서열 (VH CDR 1 내지 3에 대해 각각 서열번호 22, 23 또는 24), 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열 (예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나 하나 이상의 치환, 예를 들어 보존적 치환을 갖는 서열)을 갖는, 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 표 1에 나타낸 아미노산 서열 (VL CDR 1 내지 3에 대해 각각 서열번호 19, 20 또는 21) 또는 이와 실질적으로 상동인 서열 (예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나 하나 이상의 치환, 예를 들어 보존적 치환을 갖는 서열)을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 표 1에 나타낸 아미노산 서열 (VH CDR 1 내지 3에 대해 각각 서열번호 22, 23 또는 24; 및 VL CDR 1 내지 3에 대해 각각 19, 20 또는 21) 또는 이와 실질적으로 상동인 서열 (예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나 하나 이상의 치환, 예를 들어 보존적 치환을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 각각 VH 초티아 초가변 루프 1-3의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 상동인 서열 (예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나 하나 이상의 치환, 예를 들어 보존적 치환을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 초티아 초가변 루프를 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 각각 초티아 초가변 루프 1-3의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 상동인 서열 (예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나 하나 이상의 치환, 예를 들어 보존적 치환을 갖는 서열)을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2 또는 3개의 초티아 초가변 루프를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 상동인 서열 (예: 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일하거나 서열번호 17과 1, 2, 5, 10, 50 또는 100개 미만의 아미노산 잔기가 상이한 서열)을 갖는 사람 IgG1 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열 (예: 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일하거나 서열번호 18과 1, 2, 5, 10, 20 또는 50개 미만의 아미노산 잔기가 상이한 서열)을 갖는 사람 카파 불변 쇄를 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 본원에 기술되는 바와 같은, 사람 IgG1 불변 영역 및 사람 카파 불변 쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 17 참조)에 따라 도 29에 나타낸 중쇄 가변 영역의, 예를 들어 세린 50 (CDR2), 세린 53 (CDR2), 타이로신 101 (CDR3), 타이로신 102 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에서, 또는 중쇄 가변 도메인 중의 이러한 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 수소 결합을 통해 IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 17 참조)에 따라 도 29에 나타낸 중쇄 가변 영역의, 예를 들어 이소루이신 30 (CDR1), 세린 31 (CDR1), 알라닌 33 (CDR1), 트립토판 47, 세린 50 (CDR2), 세린 52 (CDR2), 세린 53 (CDR2), 타이로신 58 (CDR2), 루이신 98 (CDR3), 아스파테이트 99 (CDR3), 글리신 100 (CDR3), 타이로신 101 (CDR3), 타이로신 102 (CDR3), 페닐알라닌 103 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 잔기에서, 또는 중쇄 가변 도메인 중의 이러한 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 반데르발스력을 통해 IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 17 참조)에 따라 도 29에 나타낸 중쇄 가변 영역의, 예를 들어 세린 50 (CDR2), 세린 53 (CDR2), 타이로신 101 (CDR3), 타이로신 102 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환에서 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에서 수소 결합을 통해, 및 이소루이신 30 (CDR1), 세린 31 (CDR1), 알라닌 33 (CDR1), 트립토판 47, 세린 50 (CDR2), 세린 52 (CDR2), 세린 53 (CDR2), 타이로신 58 (CDR2), 루이신 98 (CDR3), 아스파테이트 99 (CDR3), 글리신 100 (CDR3), 타이로신 101 (CDR3), 타이로신 102 (CDR3), 페닐알라닌 103 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 잔기에서 또는 중쇄 가변 도메인 중의 이러한 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 반데르발스력을 통해, IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 18 참조)에 따라 도 30에 나타낸 경쇄 가변 영역의, 예를 들어 아스파라긴 31 (CDR1), 타이로신 32 (CDR1), 리신 34 (CDR1), 아스파라긴 96 (CDR3), 아스파테이트 98 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기에서 수소 결합을 통해 IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 18 참조)에 따라 도 30에 나타낸 경쇄 가변 영역의, 예를 들어 아스파라긴 31 (CDR1), 타이로신 32 (CDR1), 리신 34 (CDR1), 아르기닌 54 (CDR2), 아스파라긴 96 (CDR3), 아스파테이트 98 (CDR3), 트립토판 100 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 잔기에서 반데르발스력을 통해 IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 선형 서열 번호매김 계획 (예를 들어 도 18 참조)에 따라 도 30에 나타낸 경쇄 가변 영역의, 예를 들어 아스파라긴 31 (CDR1), 타이로신 32 (CDR1), 리신 34 (CDR1), 아스파라긴 96 (CDR3), 아스파테이트 98 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기에서 수소 결합을 통해 및 예를 들어 아스파라긴 31 (CDR1), 타이로신 32 (CDR1), 리신 34 (CDR1), 아르기닌 54 (CDR2), 아스파라긴 96 (CDR3), 아스파테이트 98 (CDR3), 트립토판 100 (CDR3) 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 잔기에서 반데르발스력을 통해 IL-13, 통상적으로 사람 IL-13과 접촉하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 수소 결합을 통해 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술되는 바와 같이, 반데르발스력을 통해 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은, 본원에 기술되는 바와 같이, 수소 결합 및 반데르발스력을 통해 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13과 접촉하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 서열번호 14의 위치 13, 19, 40, 42, 44, 75, 77, 83, 87, 92 또는 113에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 14의 위치 3에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 14의 하기 위치에서의 하기한 치환 중 하나 이상을 포함한다: 위치 3에서 리신이 글루타민으로 대체, 위치 13에서 리신이 글루타민으로 대체, 위치 19에서 리신이 아르기닌으로 대체, 위치 40에서 트레오닌이 알라닌으로 대체, 위치 42에서 글루타메이트가 글리신으로 대체, 위치 44에서 아르기닌이 글리신으로 대체, 위치 75에서 아르기닌이 리신으로 대체, 위치 77에서 이소루이신이 세린으로 대체, 위치 83에서 세린이 아스파라긴으로 대체, 위치 87에서 세린이 알라닌으로 대체, 위치 92에서 메티오닌이 발린으로 대체, 또는 위치 113에서 트레오닌이 루이신으로 대체.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 서열번호 10의 위치 3, 9, 12, 13, 15, 17, 19, 22, 46, 47, 62, 64, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87 또는 108에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 10의 하기 치환 중 하나 이상을 포함한다: 위치 3에서 발린의 글루타민에 의한 치환, 위치 4에서 루이신의 메티오닌에 의한 치환, 위치 9에서 알라닌의 세린에 의한 치환, 위치 12에서 알라닌의 세린에 의한 치환, 의치 13에서 발린의 알라닌에 의한 치환, 위치 15에서 루이신의 발린에 의한 치환, 위치 17에서 글루타민의 아스파테이트에 의한 치환, 위치 19에서 알라닌의 발린에 의한 치환, 위치 22에서 세린의 트레오닌에 의한 치환, 위치 46에서 글루타민의 리신에 의한 치환, 위치 47에서 세린의 알라닌에 의한 치환, 위치 62에서 이소루이신의 발린에 의한 치환, 위치 64에서 알라닌의 세린에 의한 치환, 위치 72에서 아르기닌의 글리신에 의한 치환, 위치 80에서 아스파라긴의 세린에 의한 치환, 위치 81에서 프롤린의 세린에 의한 치환, 위치 82에서 발린의 루이신에 의한 치환, 위치 83에서 글루타메이트의 글루타민에 의한 치환, 위치 84에서 알라닌의 프롤린에 의한 치환, 위치 85에서 아스파테이트의 글루타메이트에 의한 치환, 위치 87에서 발린의 페닐알라닌에 의한 치환, 또는 위치 108에서 루이신의 발린에 의한 치환.
또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (출원 16163-029001의) 표 10±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 평균 제곱근 편차 (root mean square deviation; RMSD), (출원 16163-029001의) 표 11±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD, 또는 (출원 16163-029001의) 표 12±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD로 기술된 CDR의 골격 입체형태를 갖는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 CDR (예를 들어, 특히 CDR3, 또는 적어도 2개의 CDR, 예를 들어 CDR1 및 CDR3, CDR2 및 CDR3, 또는 모든 3개의 CDR)은 이들 구조에 대해 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD를 갖는다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인 (예를 들어, 특히 CDR1, 또는 적어도 2개의 CDR, 예를 들어 CDR1 및 CDR3, CDR1 및 CDR2, 또는 모든 3개의 CDR)은 이들 구조에 대해 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD를 갖는다. 이러한 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 전체로서 (출원 16163-029001의) 표 10±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD, (출원 16163-029001의) 표 11±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD 또는 (출원 16163-029001의) 표 12±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0 Å 이하의 RMSD로 기술된 CDR의 골격 입체형태를 갖는 가변 도메인을 포함한다. 또한, 가변 도메인은 본원에 기술된 항체에 대해, 예를 들어 CDR 영역 및/또는 주쇄 영역에서 적어도 70%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 서열번호 14의 위치 3, 13, 19, 40, 42, 44, 75, 77, 83, 87, 92 또는 113에서 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같은 돌연변이)를 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 10의 위치 3, 4, 9, 12, 13, 15, 17, 19, 22, 46, 47, 62, 64, 72, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87 또는 108에서 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이)를 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
IL-13 길항제, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 유도체화되거나 또 다른 작용성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예: Fab 단편)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 항체 또는 항원-결합부는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어 항체 (예: 이특이적 또는 다특이적 항체), 독소, 방사성 동위원소, 세포독성제, 세포증식억제제 등에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해) 작용적으로 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편, 또는 이의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 배합 치료로서, 즉 다른 제제, 예를 들어 IL-13-관련된 장애의 치료에 유용한 치료제와 배합하여 투여된다. IL-13-관련된 장애의 예는, 이로 제한됨이 없이, 본원에 기술되는, 호흡 장애, 예를 들어 천식 (에: 알러지성 및 비알러지성 천식 (예를 들어, 영유아에서, 예를 들어 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus; RSV)에 의한 감염에 의한 천식), 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 및 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 기타 질병, 예를 들어 낭포성 섬유증 및 폐 섬유증; 아토피성 장애, 예를 들어 IL-13에 대한 증가된 민감성으로부터 발생하는 아토피성 장애 (예: 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알러지성 비염 및 알러지성 위장염); 피부 (예: 아토피성 피부염), 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 및/또는 크론 질환), 간 (예: 간경화증, 간세포 암종)의 염증 및/또는 자가면역 질병 및 피부경화증; 종양 또는 암 (예: 연조직 또는 고형 종양), 예를 들어 백혈병, 아교모세포증 및 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종; 바이러스성 감염 (예: HTLV-1으로부터의 감염증); 기타 기관의 섬유증, 예를 들어 간의 섬유증 (예: B형 염 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 발병되는 섬유증); 및 (예를 들어, 백신 처리 동안) 보호적 1형 면역 반응의 발현의 억제 중 하나 이상으로부터 선택되는 장애를 포함한다.
배합 치료는, 본원에서 보다 더욱 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 하나 이상의 사이토킨 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제 (예: 전신성 소염제), 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포독성제 또는 세포증식억제제와 함께 공동-제형화되고/되거나 공동-투여되는, 하나 이상의 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
하나 이상의 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 함께 공동투여되고/되거나 공동제형화될 수 있는 하나 이상의 바람직한 추가 치료제의 예는, 이로 제한됨이 없이, 하나 이상의 흡입 스테로이드; 베타-효능제, 예를 들어 단기-작용 또는 장기-작용 베타-효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; 배합 약물, 예를 들어 ADVAIR®; IgE 억제제, 예를 들어 항-IgE 항체 (예: XOLAIR®); 포스포디에스테라제 억제제 (예: PDE4 억제제); 잔틴; 항콜린작동제; 비만세포 안정화제, 예를 들어 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; 및 항히스타민제 등을 포함한다. 이러한 배합물은 천식 및 기타 호흡 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 함께 공동투여되고/되거나 공동제형화될 수 있는 치료제에 대한 추가의 예는 하나 이상의 TNF 길항제 (예: TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들어 p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예를 들어 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBRELTM)); TNF 효소 길항제, 예를 들어 TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제; 무스카린 수용체 길항제; TGF-β 길항제; 인터페론 감마; 페르페니돈; 화학요법제, 예를 들어 메톡트렉세이트, 레플루노마이드, 또는 시롤리무스 (라파마이신) 또는 이의 동족체, 예를 들어 CCI-779; COX2 및 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제, TPL-2, Mk-2 및 NFκB 억제제 등을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 및 본원에 기술되는 하나 이상의 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물은 상술된 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편 중 2개 이상의 배합물을 포함한다. IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 약물, 예를 들어 치료제 (본원에 기술되는 바와 같이, 예를 들어 하나 이상의 사이토킨 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제 (예: 전신성 소염제), 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독성제 또는 세포증식억제제)의 배합물이 본 발명의 범위에 속한다.
또한, 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, 항-IL-13 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명은, 본원에 기술되는 바와 같이, mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2, 및/또는 h13.2v3 중 하나 이상으로부터 선택되는 항-IL-13 항체의 각각 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 제1 및 제2 핵산을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본원은 본원에 기술된 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 벡터를 특징으로 한다.
예를 들어, mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및/또는 h13.2v3d 중 하나 이상에 의해 인지되는 IL-13, 예를 들어 사람 IL-13의 에피토프로 특징지어진다. 하나의 양태에서, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람 IL-13 (서열번호 31)의 잔기 81-93 및/또는 114-132를 포함하는 에피토프 또는 이의 변형된 형태 (예를 들어, 이의 단편 또는 치환 (예: 보존적으로 치환된) 형태)에 결합한다. 하나의 양태에서, 사람 IL-13의 에피토프는 서열번호 32의 위치 49에 글루타메이트, 위치 53에 아스파라긴, 위치 69에 글리신, 위치 72에 프롤린, 위치 73에 히스티딘, 위치 74에 리신 및 위치 86에 아르기닌, 또는 이의 보존적 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본원은 IL-13과 동족 (cognate) IL-13 결합 단백질, 예를 들어 IL-13 수용체 복합체, 예를 들어 IL-13Rα1 및 IL-4Rα 또는 이의 서브유닛을 포함하는 복합체 사이의 상호작용, 예를 들어 결합을 조절, 예를 들어 방해 (예: 억제, 차단 또는 감소)하는 방법을 특징으로 한다. 조절은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, IL-13과 IL-13의 수용체 복합체, 예를 들어 개별적으로 IL-13Rα1 또는 IL-4Rα 사이의 상호작용, 예를 들어 결합을 방해 (예: 억제, 차단 또는 감소)한다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, IL-13/IL-13Rα1과 IL-4Rα 사이의 상호작용, 예를 들어 결합을 방해 (예: 억제, 차단 또는 감소)한다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13에 결합하고, IL-13/IL-4Rα과 IL-13Rα1 사이의 상호작용, 예를 들어 결합을 방해 (예: 억제, 차단 또는 감소)한다. 통상적으로, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 IL-13/IL-13Rα1과 IL-4Rα의 상호작용, 예를 들어 결합을 방해 (예: 억제, 차단 또는 감소)한다.
본 방법은 시험관 내 (예: 세포-유리 시스템)에서, 배양물 중에서, 예를 들어 시험관 내 또는 생체 외에서 세포에 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-13 수용체-발현 세포는 시험관 내에서 배양 배지 중에서 배양되고, 접촉 단계는, 항-IL-13 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 배양 배지에 가함으로써 수행될 수 있다. 달리는, 본 방법은 환자에 존재하는 세포에 대해, 예를 들어 생체 내 (예: 치료적 또는 예방적) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본원은 환자에서 IL-13-관련된 장애의 치료 (예: IL-13-관련된 장애의 발병의 치유, 억제, 개선, 지연 또는 방지, 또는 이의 재발 (recurrence 또는 relapse)의 방지) 또는 IL-13-관련 장애의 예방 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 IL-13-관련 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로, IL-13 결합제 (특히, 길항제), 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 단독으로 또는 본원에 기술되는 바와 같은 다른 치료 요법과 병행하여 환자에게 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 환자는, 본원에 기술된 바와 같이, 호흡 장애 (예: 천식 (알러지성 및 비-알러지성 천식을 포함), 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 질병; 아토피 장애 (아토피성 피부염 및 알러지성 비염); 피부, 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 및/또는 크론 질환) 및 간 (간경화증, 섬유증)의 염증 및/또는 자가면역 질병; 피부경화증; 종양 또는 암, 예를 들어 호지킨 림프종 중 하나 이상의 IL-13-관련된 장애를 앓는 포유동물, 예를 들어 사람이다. 따라서, 본 기술은 본원에 기술된 치료를 위한 IL-13 결합제(예: 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 사용 및 본원에 기술된 치료를 위한 약제의 제조를 위한 IL-13 길항제 (예: 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 사용을 포함한다.
IL-13-관련 장애의 예는, 이로 제한됨이 없이, 본원에 기술되는, 호흡 장애, 예를 들어 천식 (예: 알러지성 및 비알러지성 천식 (예를 들어, 영유아에서, 예를 들어 RSV (호흡기 합포체 바이러스)에 의한 감염에 의한 천식)), 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 및 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 기타 질병, 예를 들어 낭포성 섬유증 및 폐 섬유증; 아토피성 장애, 예를 들어 IL-13에 대한 증가된 민감성으로부터 발생하는 아토피성 장애 (예: 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알러지성 비염 및 알러지성 위장염); 피부 (예: 아토피성 피부염), 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 및/또는 크론 질환), 간 (예: 경화증, 간세포 암종) 및 피부경화증의 염증 및/또는 자가면역 질병; 종양 또는 암 (예: 연조직 또는 고형 종양), 예를 들어 백혈병, 아교모세포증 및 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종; 바이러스성 감염 (예: HTLV-1으로부터의 감염증); 기타 기관의 섬유증, 예를 들어 간의 섬유증 (예: B형 염 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 발병되는 섬유증); 및 (예를 들어, 백신 처리 동안) 보호적 1형 면역 반응의 발현의 억제 중 하나 이상으로부터 선택되는 장애를 포함한다.
다른 양태에서, 본원은 호흡 장애, 예를 들어 천식 (예: 알러지성 및 비알러지성 천식); 알러지; 만성 폐색성 폐 질환 (COPD); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생성을 수반하는 질병, 예를 들어 낭포성 섬유증 및 폐 섬유증과 관련된 하나 이상의 증후군을 치료 (예: 감소, 개선) 또는 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 천신의 증후군은, 이로 제한됨이 없이, 쌕쌕거림, 숨가쁨, 기관지수축, 기도 과반응, 감소된 폐용량, 섬유증, 기도 염증 및 점액 생산을 포함한다. 본 방법은 IL-13 길항제, 예를 들어 IL-13 항체 또는 이의 단편을 하나 이상의 증후군을 치료 (예: 감소, 개선) 또는 예방하기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. IL-13 항체는 치료적으로, 또는 예방적으로, 또는 둘 모두의 목적으로 투여될 수 있다. IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 단독으로 또는 본원에 기술된 바와 같은 다른 치료 요법과 병행하여 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 환자는 본원에 기술된 바와 같은 IL-13-관련된 장애를 앓는 포유동물, 예를 들어 사람이다.
또 다른 양상에서, 본원은 시험관 내에서 샘플 (예: 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청, 혈장, 조직, 생검) 중의 IL-13의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 장애, 예를 들어 면역 세포-관련된 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 본방법은 (i) 샘플 또는 대조군 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 샘플 또는 대조군 샘플 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 대조군 샘플과 비교해 샘플 중에서 복합체의 형성에 통계학적으로 유의한 변화가 샘플 중 IL-13의 존재를 나타낸다.
또 다른 양상에서, 본원은 생체 내에서 (예를 들어, 환자에서 생체 내 영상화로) IL-13의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 장애, 예를 들어 IL-13-관련된 장애를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 (i) 본원에 기술되는 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 항체 또는 단편의 IL-13에의 결합을 가능하게 하는 조건 하에서 환자 또는 대조군 환자에게 투여하는 단계; 및 (ii) 항체 또는 단편과 IL-13 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 환자와 비교해 환자에서 복합체의 형성에 통계학적으로 유의한 변화가 IL-13의 존재를 나타낸다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 적합한 검출 물질은 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다.
또한, 제제, 예를 들어 치료제 또는 세포독성제를 IL-13-발현 세포에 생체 내에서 전달 또는 표적화하는 방법이 기술된다.
또한, 치료적 및 진단적 이용을 위해 본원에 기술된 IL-13 길항제, 예를 들어 세포를 포함하는 키트가 본원의 범위에 포함된다.
또 다른 양상에서, 본원은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하는 방법을 제공한다. 이 방법은 DP-54 및 DPK-9로부터의 하나 이상의 주쇄 영역 또는 DP-54 및 DPK-9의 하나 이상의 주쇄 영역과 적어도 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97 또는 98% 동일한 주쇄 영역을 사용하여 항체(또는 이러한 항체를 암호화하는 핵산)을 제조하는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 이 방법은 CDR 또는 비-사람 항체로부터의 CDR의 일부를 각각 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인에 DP-54 및 DPK-9 주쇄를 포함하는 가변 도메인, 또는 DP-54 및 DPK-9의 하나 이상의 주쇄 영역과 적어도 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97 또는 98% 동일한 주쇄 영역을 포함하는 가변 도메인의 배경 (context)으로 조작하는 단계를 포함한다. 이러한 가변 도메인을 포함하는 단백질 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산은 포유동물, 예를 들어 조직 배양 세포에서 발현될 수 있다.
관련 양상에서, 본원은, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 예를 들어 인공 항체를 특징으로 하며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 DP-54로부터의 하나 이상의 주쇄 영역 또는 DP-54의 하나 이상의 주쇄 영역과 적어도 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97 또는 98% 동일한 주쇄 영역을 사용함을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 DPK-9로부터의 하나 이상의 주쇄 영역 또는 DPK-9의 하나 이상의 주쇄 영역과 적어도 75, 80, 82, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97 또 는 98% 동일한 주쇄 영역을 사용함을 포함한다. CDR 및/또는 초가변 루프 중 하나 이상은 일반적으로 비-사람, 예를 들어 비-사람 항체, 예를 들어 쥐 항체로부터의 것이다. 하나의 양태에서, 항체는 사람 항체, 예를 들어 IL-13 또는 IL-13 이외의 항원에 결합한다.
기타의 특징 및 이점이 하기 상술되는 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1: mAb13.2의 사람 IL-13에 대한 결합의 반응속도 변수. 69 RU 스트렙타비딘 칩에 고정화된 바이오티닐화된 (biotinylated) IL-13과 모노클로날 항체 mAb13.2, 모노클로날 항체 mAb13.4 또는 모노클로날 항체 mAb13.9 사이의 결합 상호작용이 시간 (x-축)에 대한 공명 단위 (RU: y-축)로 표현된다. 또한, mAb13.2에 대한 반응속도 변수가 나타나 있다.
도 2: mAb13.2의 사람 IL-13에 대한 결합의 반응속도 변수. 사람 IL-13이 다양한 용량과 BIACORETM 칩에 고정화된 모노클로날 항체 mAb13.2 사이의 결합 상호작용이 시간 (x-축)에 대한 공명 단위 (RU: y-축)로 표현된다. 또한, mAb13.2에 대한 반응속도 변수가 나타나 있다.
도 3: 모노클로날 항체 mAb13.2는 천연 사람 IL-13에 결합한다. 본 도면은 증가하는 농도의 (x-축) 재조합 사람 IL-13 (◆), 재조합 쥐 IL-13 (●) 또는 미토겐-활성화되고 Th2-편중된 (skewed) 제대혈 단핵구 세포로부터 분리된 천연 사람 IL-13 (△)의 존재 하에서, FLAG-사람 IL-13에 결합된 바이오티닐화된 mAb13.2의 평균 흡광도 값 (A450; y-축)를 나타낸다.
도 4: 모노클로날 항체 mAb13.2는 사람 IL-13의 ARG-변이체 형태에 결합하고 이를 중화한다. (A) BIACORETM 칩에 고정화된 바이오티닐화된 mAb13.2를 통과하는 사람 IL-13 또는 재조합적으로 발현된 ARG-변이체의 반응 (y-축)이 시간 (x-축)의 함수로서 나타난다. (B) mAb13.2 (x-축) 및 재조합 사람 IL-13 또는 IL-13의 재조합적으로 발현된 ARG-변이체의 증가하는 농도와 함께 인큐베이션되는 TF1 세포의 증식 (y-축)이 나타난다.
도 5: 모노클로날 항체 mAb13.2는 가용성 IL-13 수용체의 IC50에 필적하는 IC50로 사람 IL-13의 생물학적 활성을 억제한다. 3H-티미딘 혼입에 의해 측정되는 바와 같이, IL-13-의존적 TF1 세포주의 증식이, IL-13 및 증가하는 농도의 (x-축)의 mAb13.2 또는 가용성 IL-13 수용체 (rhuIL-13Rα2)와 함께 인큐베이션한 지 3일 후에 cpm (y-축)으로 측정된다.
도 6: 모노클로날 항체 mAb13.2는 정상 사람 단구에서 IL-13-중재된 CD23 발현은 억제하나 IL 4-중재된 CD23 발현을 억제하지 않는다. (A) 건강한 공여자로부터 분리된 말초혈 단핵구 (PBMC)를 재조합 사람 IL-13 (●) 또는 IL-4 (o)의 지시된 농도 (x-축)로 밤새 처리한 후 세포 표면 CD23을 발현하는 단구의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다. (B) 건강한 공여자로부터 분리된 PBMC를 IL-13 및 지시된 농도의 정제된 마우스 mAb13.2 (x-축)으로 처리한 후 세포 표면 CD23을 발현하는 단구의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다. (C) 건강한 공여자로부터 분리된 PBMC를 IL-4 및 지시된 농도의 정제된 마우스 mAb13.2 (x-축)으로 처리한 후 세포 표면 CD23을 발현하는 단구의 비율 (%) (y-축) 을 나타낸다.
도 7: 모노클로날 항체 mAb13.2는 사람 B 세포에 의한 IL-13-의존적 IgE 생성을 억제한다. 단독 배지 또는 PHA, IL-13, 대조군 항체 (ms IgG), mAb13.2 및 mAb13.8의 다양한 배합물 (x-축)에서 배양된 PBMC로부터 분리된 상등액 중의 IgE의 농도를 450 nm에서의 흡광도 (IgE (O.D.450); y-축)로 나타낸다.
도 8: 모노클로날 항체 mAb13.2는 사람 상피 세포에 의한 IL-13-중재된 STAT6 인산화를 억제한다. (A) 지시된 농도의 IL-13으로 처리된 HT-29 세포로부터 분리된 세포 용해물 중의 인산화된 STAT6에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. (B) 그래프는 유세포측정 분석으로 측정되는 HT-29 세포의 수 (카운트: y-축)를 나타내며, 이는 세포를 비처리 (어두운 히스토그램) 또는 IL-13으로 처리 (밝은 히스토그램)하고 인산화된 STAT6에 대한 ALEXATM Fluor 488-표지된 모노클로날 항체로 염색한 후의 형광 (포스포-STAT6; x-축)을 나타내었다. (C) 그래프는 유세포측정 분석을 측정되는 HT-29 세포의 수 (카운트: y-축)를 나타내며, 이는 세포를 비처리 (어두운 히스토그램); IL-13 (좌측 상단 그래프), IL-13 및 mAb13.8 (좌측 하단 그래프), IL-13 및 mAb13.2 (우측 상단 그래프) 또는 IL-13 및 대도군 항체 (msG1) (우측 하단 그래프)로 처리 (밝은 히스토그램)하고 ALEXATM Fluor 488로 염색한 후의 형광 (포스포-STAT6)을 나타내었다.
도 9: 모노클로날 항체 mAb13.2는 생체 내에서 회충-유도된 폐 호산구증가증을 방지한다. 본 도면은, 챌린지 (challenge) 전 (어두운 기호) 또는 돼지회충 (Ascaris suum) 항원으로 챌린지 또는 재챌린지한 지 24 시간 후 (밝은 기호), 비처리된 시노몰거스 원숭이 (회충/PBS) (●,●), mAb13.2로 처리된 시노몰거스 원숭이 (회충/mAb13.2) (◆,◆) 또는 미리 mAb13.2로 처리되고 돼지회충 (Ascaris suum) 항원으로 챌린지된 시노몰거스 원숭이 (회충/항체 처리한 지 약 3개월 후 재챌린지) (▲,▲)로부터 취한 기관지폐포 세척 (BAL) 샘플에서 발견되는 호산구의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다.
도 10: mAb13.2 Fab 단편의 사람 IL-13과의 공동결정 구조. mAb13.2 Fab 단편이 X-선 결정학은, 어두운 음영을 갖는 경쇄 및 보다 밝은 음영을 갖는 중쇄를 나타낸다. 또한, IL-13 구조 (우측)도 나타나 있다. 본 도면은 또한 IL-13의 C-알파 나선과 항체의 CDR 루프의 상호작용을 나타낸다.
도 11: mAb13.2 접촉 부위를 나타내는 사람 IL-13 서열 분석. 본 패널은 사람 IL-13의 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 화살표는 시그널 펩티드 절단 부위를 나타내며, 4개의 알파 나선은 밑줄 그어져 있으며, mAb13.2 Fab -IL-13 공동결정 구조로부터의 항체 접촉 부위는 밝은 박스에 강조되었으며, ARG-변이 잔기는 어두운 박스에 강조되어 있다.
도 12: mAb13.2의 Fab 단편은 사람 IL-13에 결합한다. 본 도면은 (A) pM 항체 또는 (B) pM 결합 부위로서 표현되는 증가하는 농도의 경쟁적 비표지된 mAb13.2 (◆), mAb13.2 Fab 단편 (●) 또는 비관련 항체 (*)의 존재 하에서 (x-축) FLAG-사람 IL-13에 결합되는 바이오티닐화된 mAb13.2의 평균 흡광도 (450 nm; y-축)를 나타낸다.
도 13: mAb13.2의 Fab 단편은 사람 단구에 의한 IL-13-중재된 TF1 증식 및 IL-13-중재된 CD23 발현을 중화한다. (A) 본 도면은, IL-13 및 mAb13.2 (◆) 또는 mAb13.2 Fab 단편 (●)에 의해 제공되는 증가하는 농도의 경쟁자 결합 부위 (x-축)와 함께 인큐베이션한 지 3일 후 달성되는 IL-13-의존적 TF1 세포주에 의한 최대 증식의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다. (B) 본 도면은, 건강한 공여자로부터 분리된 PBMC를 IL-13 1 ng/ml 및 mAb13.2 (◆) 또는 mAb13.2 Fab 단편 (●)에 의해 제공되는 지시된 농도의 경쟁자 결합 부위 (x-축)과 함께 밤새 처리한 후, 유세포측정 분석에 의해 측정되는 바와 같은, 세포 표면 CD23을 발현한 단구의 최대수의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다.
도 14: 마우스 모노클로날 항체 mAb13.2의 키메릭 버젼 (ch13.2)는 IL-13에 결합하고 이를 중화한다. (A) ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, IL-13-FLAG 및 바이오티닐화된 mAb13.2만을 함유한 샘플 ( - - ) 및 IL-13-FLAG, 바이오티닐화된 mAB13.2 및 증가하는 농도 (x-축)의 mAb13.8 (●), mAb13.2 (o) 또는 키메릭 mAb13.2 (ch13.2; ▲)를 함유한 샘플의 450 nm에서의 흡광도 (A450; y-축)를 나타낸다. (B) 건강한 공여자로부터 분리된 PBMC를 밤새 IL-13 1ng/ml 및 지시된 농도 (x-축)의 정제된 마우스 mAb13.2 (●) 또는 키메릭 mAb13.2 (ch13.2; ◆)로 처리한 후 세포 표면 CD23을 발현한 단구의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다.
도 15: 사람 DP-54 배선 유전자와 mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)의 가변 중쇄 (VH) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, DP-54, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 중쇄 영역 및 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 16: 사람 DPK9 배선 유전자와 mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)의 가변 경쇄 (VL) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, DPK-9, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 경쇄 영역 및 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 17: 사람 DP-54 배선 유전자와 mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)의 가변 중쇄 (VH) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, DP-54, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 중쇄 영역 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 18: 사람 DPK9 배선 유전자와, mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)의 가변 경쇄 (VL) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, DPK-9, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 경쇄 영역 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 19: 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)는 IL-13에 대한 완전한 결합 활성을 보유한다. (A) ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, IL-13-FLAG 및 바이오티닐화된 mAb13.2만을 함유한 샘플 ( - - ) 및 IL-13-FLAG, 바이오티닐화된 mAb13.2 및 증가하는 농도 (x-축)의 mAb13.2 (●), 키메릭 mAb13.2 (ch13.2; ●), 부분적으로 사람화된 mAb13.2 (h13.2v1; ▲) 또는 완전히 사람화된 mAB13.2 (h13.2v2; △)를 함유한 샘플의 450 nm에서의 흡광도 (A450; y-축)를 나타낸다. (B) 상이한 용량이 사람 IL-13과 BiacoreTM 칩에 고정화된 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2) 사이의 결합 상호작용이 시간 (x-축)에 대한 공명 차이 (RU; y-축)으로 나타나 있다. 또한, h13.2v2에 대한 반응속도 상수가 나타나 있다.
도 20: 키메릭 mAb13.2 (ch13.2), 부분적으로 사람화된 mAB13.2 (h13.2v1) 및 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)은 STAT6의 IL-13-중재된 CD23 발현 및 IL-13-중재된 인산화를 중화할 수 있다. (A) 건강한 공여자로부터 분리된 PBMC를 IL-13 1ng/ml 및 지시된 농도 (x-축)의 키메릭 mAb13.2 (ch13.2; ◆), 부분적으로 사람화된 mAb13.2 (h13.2v1;□) 또는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2; ●)와 함께 밤새 처리한 후 세포 표면 CD23 (y-축)을 발현한 단구의 비율 (%)을 나타낸다. (B) 유세포측정 분석에 의해 측정되는 바와 같이, IL-13 및 지시된 농도 (x-축)의 키메릭 mAb13.2 (ch13.2; ◆), 부분적으로 사람화된 mAb13.2 (h13.2v1;□) 또는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2; ●)와 함께 인큐베이션한 후 인산화된 STAT6를 발현한 HT-29 세포의 비율 (%) (y-축)을 나타낸다.
도 21: 사람 IL-13 중재된 CD23 발현을 중화하는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)의 능력은 동일한 수행을 하는 mAb13.2의 능력에 필적한다. (A) 재조합 사람 IL-13 또는 (B) 천연 사람 IL-13 및 증가하는 농도 (x-축)의 mAb13.2 (●) 또는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2; ◆)와 함께 인큐베이션한 후 세포 표면 CD232을 발현하는 개폐 (gated) 단구의 수를, 단독의 IL-13과 인큐베이션한 후 세포 표면 CD23을 발현하는 최대 수의 단구의 비율 (%) (최대 반응율 (%); y-축)로 나타낸다.
도 22: 비사람 영장류 또는 양 IL-13-중재된 CD23 발현을 중화하기 위한 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)의 능력은 동일한 수행을 하는 mAb13.2의 능력에 필적한다. (A) 재조합 비사람 영장류 IL-13 (rec NHP IL-13) 또는 (B) 재조합 양 IL-13 (rec 양 IL-13) 및 증가하는 농도 (x-축)의 mAb13.2 (●) 또는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2; ◆)와 함께 인큐베이션한 후 세포 표면 CD232을 발현하는 게이트된 단구의 수를, IL-13 단독으로 인큐베이션한 후 세포 표면 CD23을 발현하는 최대 수의 단구의 비율 (%) (최대 반응율%; y-축)로 나타낸다.
도 23: 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)는 양에서 후기 기관지수축을 감소시킨다. 돼지회충으로 챌린지하기 24시간 전(기선), 챌린지 동안 (회충) 및 챌린지한지 수시간 동안 (x-축) 측정되는 기도 내성 비율 (%) (y-축)이 비처리된 양 (대조군; ◆) 또는 (A) 20 mg/kg 또는 (B) 5 mg/kg 용량에서 완전히 사람화된 mAb13.2로 예방학적으로 처리된 양 (h13.2v2; ■)에 대해 나타나 있다. 제시된 자료는 그룹 당 3마리의 양에 대한 평균±표준편차이다.
도 24: 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)는 양에서 기도의 과반응성을 방지한다. 주어진 크기의 반응을 유도하는데 필요한 카르바콜의 용량 (%) (PC400; y-축)이, 돼지회충 챌린지 전 및 후에 (x-축) (A) 20 mg/kg 또는 (B) 5 mg/kg이 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2; ■)으로 예방적으로 처리된 양 또는 비처리된 (대조군; ■) 양에 대해 나타나 있다. 제시된 자료는 그룹 당 3마리의 양에 대한 평균±표준편차이다.
도 25: 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)는 비사람 영장류에서 항원-유도된 폐렴을 방지한다. 본 도면은 염수로 정맥 내 처리된 대조군 시노몰거스 원숭이 (●), 덱사메타손 2 mg/kg으로 근육 내 처리된 양성 대조군 시노몰거스 원숭이 (*), 비관련 사람 IgG (IVIG) 8 mg/kg으로 예비처리된 음성 대조군 시노몰거스 원숭이 (▲), 또는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)로 정맥 내 예비처리된 시노몰거스 원숭이 (▼)로부터, 챌린지 전 (O) 또는 돼지회충 항원으로 챌린지한 지 24시간 후 (24)에 취해진 기관지폐포세척물 (BAL) 중에서 발견되는 세포의 총수를 나타낸다. 또한, 막대는 각각의 그룹의 BAL 샘플 중에서 발견되는 세포의 평균수를 나타낸다. 또한, 쌍을 이루지 않은 T-시험 (unpaired T-test)을 이용하여 수득된 p-값이 나타나 있다.
도 26: mAb13.2의 사람화는 V-BASE이 VH 그룹 3에서 다른 사람 배선 유전자의 서열 상동성에 기초할 수 있다. 데이타베이스의 VH 그룹 3에서 사람 배선 아미노산 서열에 대한 mAb13.2의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 굵게 표시된 서열은, mAb13.2의 사람화가 기초를 잡을 수 있는 서열로 제시된다.
도 27: 사람 DP-77 배선 유전자와 mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)의 가변 중쇄 (VH) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, DP-77, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 중쇄 영역 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 28: 사람 B1 배선 유전자와 mAb13.2의 키메릭 버젼 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)의 가변 경쇄 (VL) 아미노산 서열의 비교. 본 도면은 SEQWEBTM과 함께 정렬되고 비교되는, B1, mAb13.2의 키메릭 버젼 (키메릭 13.2)의 가변 경쇄 영역 및 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) (박스 영역) 및 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 mAb13.2의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v3)에 대해 이루어진 아미노산 치환은 음영 박스로 표시하고, 변화되지 않은 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 29: 다양한 계획에 따른 모노클로날 항체 mAb13.2의 가변 중쇄 아미노산 서열에 있는 각각의 잔기에 대한 번호 표시. 선형 서열 번호매김 계획, 초티아 (Chothia) 구조 번호매김 계획 및 카뱃 (Kabat) 서열 번호매김 계획에 따른, mAb13.2의 가변 중쇄 영역의 아미노산 서열에서 각각의 잔기에 대한 번호 표시가 나타나 있다.
도 30: 다양한 계획에 따른 모노클로날 항체 mAb13.2의 가변 경쇄 아미노산 서열에 있는 각각의 잔기에 대한 번호 표시. 선형 서열 번호매김 계획, 초티아 구조 번호매김 계획 및 카뱃 서열 번호매김 계획에 따른, mAb13.2의 가변 경쇄 영역의 아미노산 서열에서 각각의 잔기에 대한 번호 표시가 나타나 있다.
도 31: 회충 챌린지 8주 후 회충-특이적 IgE의 역가가 항-사람 IL-13 항체 (h13.2v2)로 처리된 시노몰거스 원숭이에서 감소하였다. 그래프는 돼지회충 항원으로 챌린지하기 전 및 8주 후 시노몰거스 원숭이에서 회충-특이적 IgE의 상대적 역가 (y-축)를 나타낸다. 챌린지 전의 값을 "100"으로 표준화하였다. (A) 동물을 사람화된 항-IL-13 항체 (h13.2v2)로 정맥 내로 처리하였다. (B) 대조군 동물을 염수 또는 비관련된 사람 IgG (IVIG)를 정맥 내로 투여하였다.
도 32: 항-IL-13 항체 (h13.2v2)는 생체 내에서 알레르겐 챌린지 후 호염구 민감성의 증가를 방지하였다. (A) 대표적인 대조군 및 항체-처리된 동물로부터의 최대치에 대한 비율 (%) (y-축)로 용량-의존적 히스타민 방출이 회충 항원 챌린지 전 및 챌린지한 지 24 시간 및 8 주 후의 동물에 대해 도시된다. (B) (a)에서 보여지는 용량 범위에 대한 총 히스타민 방출이 각각의 시점에서 각각의 동물에 대해 결정되었다. 본 도면은 대조군 및 항-IL-13-처리된 그룹에 대해 각각의 시점에서의 표준화된 히스타민 방출의 평균 및 표준편차를 나타낸다. Pre:항체 처리 전. 시간 0: 항체 처리 후 24시간, 회충 폐 챌린지 전. 24시간, 8주, 4개월 시점은 회충 챌린지 후의 시간을 말한다.
도 33: IL-13-로딩된 A375 세포에 대한 바이오티닐화된 13.2v2의 결합. 히스토그램은 A375 사람 흑색종 세포의 수 (카운트: y-축)를 나타내며, 이는, 유세포측정 분석으로 측정되는 바와 같이, 사람 IL-13 3ng/mL과 함께 예비-인큐베이션 후 바이오티닐화된 h13.2v2 (0.1㎍/ml, 1㎍/ml 또는 10㎍/ml)의 결합 (형광: x-축)을 입증한다.
도 34: h13.2v2의 야생형 Fc 복귀 돌연변이체는 IL-13의 존재 하에서 ADCC를 매개한다. (A) h13.2v2 (L234A/G237A; ●) 또는 이의 야생형 Fc 복귀 돌연변이체(O)의 지시된 농도 (x-축)로 처리된 A375 사람 흑색종 세포의 크롬-51 방출 (y-축) 비율 (%)이 나타나 있다. (B) IL-13의 존재 또는 부재 하에서 h13.2v2의 야생형 Fc 복귀 돌연변이체로 처리된 IL-13-로딩된 A375 세포에 대한 크롬-51 방출 (y-축) 비율 (%)이 나타나 있다.
도 35: h13.2v2의 야생형 Fc 복귀 돌연변이체는 IL-13Rα2-발현 A375 세포의 ADCC을 매개하나 IL-13Rα1-발현 HT-29 세포의 ADCC는 매개하지 않는다. (A) h13.2v2 (L234A/G237A; ◆) 또는 야생형 Fc 복귀 돌연변이체 (◇)의 지시된 농도 (x-축)로 처리된 IL-13-로딩된 A375 사람 흑색종 세포의 크롬-51 방출 (y-축) 비율 (%)이 나타나 있다. (B) h13.2v2 (L234A/G237A; ◆) 또는 이의 야생형 Fc 복귀 돌연변이체 (◇)의 지시된 농도 (x-축)로 처리된 IL-13-로딩된 HT-29 사람 상피 세포의 크롬-51 방출 (y-축) 비율 (%)이 나타나 있다.
IL-13 결합제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이의 약제학적으로 조성물, 상기 항체를 암호화하는 핵산, 및 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포가 기술된다. 상기 항체를 생산하는 방법, IL-13, 예를 들어 사람 IL-13에 결합하고 이의 수용체에의 결합을 감소시키거나 방지하는 항체를 사용하여 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 조절하는 방법이 기술된다. 항-IL-13 항체는 IL-13-중재된 장애의 경감을 위해, 예를 들어 호흡 장애 (예: 천식); 아토피성 장애 (예: 알러지성 비염); 피부 (예: 아토피성 피부염), 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD))의 염증 및/또는 자가면역 질병, 섬유증 및 암성 장애의 치료에 사용될 수 있다. 항-IL-13 항체는 단독으로 사용되거나, 동일 또는 또 다른 질환, 예를 들어 알러지성 반응을 치료하는데 사용되는 다른 치료법과 병행하여 사용될 수 있다.
특히, 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는, 본원에 기술되는 항체를 사용하여 IL-13의 활성을 감소시키면, 돼지회충에 대해 본래 알러지성인 시노몰거스 원숭이에서 기도 염증이 감소한다는 것이 밝혀졌다 (실시예 1.4 및 3.5 참조). 또한, 본원에 기술된 항-사람 IL-13 항체는 돼지회충에 대해 본래 알러지성인 양에서 후기 기관지수축을 방지하고, 양에서 카르바콜-유도된 기도의 과반응성을 방지한다 (실시예 3.5 참조). 따라서, 하나 이상의 IL-13-관련 활성을 중화하는 항-IL-13 항체를 사용하여 생체 내에서 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 감소, 예를 들어 IL-13-중재된 장애 (예: 천식, 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산)을 치료 또는 예방할 수 있다.
항-사람 IL-13 항체
하나 이상의 IL-13-관련된 활성, 특히 IL-13에 결합하여 IL-13의 시그널화 활성을 중화 및/또는 억제할 수 있는 항체가 IL-13-중재된 질환, 예를 들어 알러지성 천식, 비알러지성 천식 및 천식-관련된 병리, 예를 들어 섬유증, 호산구증가증 및 점액 생산을 치료하는데 유용하다.
하나의 양태에서, 본원에 기술된 항-IL-13 항체는 분리되거나 정제된다. "분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 "분리된 항체"는 자연 상태에서 존재하는 상태 보다 나은 상태로 정제된다. 예를 들어, "분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 "분리된 항체"는, 단백질이 유도되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염 단백질 중 하나 이상의 성분으로부터 분리되거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 기타 화합물 중 하나 이상의 성분으로부터 분리되는 단백질을 언급한다. 예를 들어, 분리된 단백질은 기타 단백질, 기타 세포성 물질 또는 화학적 전구체가 실질적으로 없을 수 있다. 일부 양태에서, 비-항체 단백질 (또한, 본원에서는 "오염 단백질'로도 언급됨) 또는 화학적 전구체를 약 50% 미만으로 갖는 항체 단백질의 제조가 "실질적으로 없는"으로 간주된다. 다른 양태에서, 40%, 30%, 20%, 10% 및 보다 바람직하게는 5% (건조 중량 기준)의 비-항체 단백질 또는 화학적 전구체가 실질적으로 없는 것으로 간주된다. 항체 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성 부분이 재조합적으로 생성되는 경우, 이는 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없다. 예를 들어, 배양 배지는 약 30% 미만, 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만 용적 또는 중량의 단백질 제제를 나타낸다. 본원에서 "재조합"으로 언급되는 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성되는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 단백질은 표준 방법 (예를 들어, 이온 교환 및 친화성 크로마토그래피를 포함)에 의해 정제되어 특정 단백질이 다른 단백질에 대해 또는 생물학적으로 활성인 성분에 대해 적어도 5, 10, 20, 25, 50, 75, 80, 90, 95, 98, 99%의 순도인 제제를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2 Fd, dAb 및 scFv 단편, 및 불변 및/또는 가변 영역에서 돌연변이된 (예를 들어, 키메릭, 부분적으로 사람화된, 또는 완전히 사람화된 항체를 생성하도록 돌연변이되거나, 목적하는 특성, 예를 들어 향상된 IL-13 결합 및/또는 감소된 FcR 결합을 갖는 항체를 생성하도록 돌연변이됨) 온전한 항체 및 단편을 포함한다. 예시적 항체는 IL-13에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하고/하거나 하나 이상의 IL-13-관련 활성을 중화 또는 억제할 수 있다.
본원에 기술된 항체는 효과적으로는 사람화될 수 있다. "효과적으로 사람화된" 항체는 당해 항체가 정상인에서 면역반응을 일으키지 않도록 충분한 수의 사람 아미노산 위치를 포함하는 항체이다. 바람직하게는, 단백질은 중화 항체 반응, 예를 들어 사람 항-쥐 항체 (HAMA) 반응을 일으키지 않는다. HAMA는 많은 상황에서, 예를 들어 항체가 만성 또는 재발된 질환의 치료에서 반복적으로 투여되는 것이 바람직한 경우, 문제가 될 수 있기 때문이다. HAMA 반응은 혈청으로부터 증가된 항체 제거에 때문에[참조: Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)] 그리고 잠정적인 알러지 반응 때문에[참조: LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)] 잠정적으로 효과적이지 않은 반복적인 항체 투여를 만들 수 있다.
보존적 치환은 통상적으로 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 하기 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신.
또한 면역글로불린으로도 공지된 항체는, 통상적으로, 각각 약 25 kDa의 2개의 경쇄 (L) 및 각각 약 50 kDa의 2개의 중쇄 (H)로 구성된 4량체의 글리코실화된 단백질이다. 람다 및 카파로 지칭되는 2가지 유형의 경쇄가 항체에서 발견될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 4개의 주요 부류 A, D, E, G 및 M로 분류될 수 있으며, 이들 중 일부는 아부류 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 분류될 수 있다. 각각의 경쇄는 N-말단의 가변 (V) 도메인 (VL) 및 불변 (C) 도메인 (CL)을 포함한다. 각각의 중쇄는 N-말단 V 도메인 (VH), 3개 또는 4개의 C 도메인 (CH) 및 힌지 영역을 포함한다. VH에 가장 가까운 CH 도메인이 CH1으로 지정된다. VH 및 VL 도메인은 주쇄 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 불리는 비교적 보존된 서열의 4개의 영역으로 이루어지며, 이들은 초가변 서열의 3개의 영역 (상보성 결정 영역, CDR)의 스캐폴드를 형성한다. CDR은 항체의 항원과의 특이적 상호작용에 책임이 있는 잔기의 대부분을 포함한다. CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3로 언급된다. 따라서, 중쇄 상의 CDR 구성성분은 H1, H2 및 H3로 언급되고 경쇄 상의 CDR 구성성분은 L1, L2 및 L3로 언급된다. CDR3은 통상적으로 항체-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, H3은 2개의 아미노산 잔기와 같이 짧거나 26개 아미노산 보다 클 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 당 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 항체 구조를 검토를 위해 문헌 (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988)을 참조한다. 각각의 서브유닛 구조, 예를 들어 CH, VH, CL, VL, CDR, FR 구조가 활성 단편, 예를 들어 항원에 결합하는 VH, VL 또는 CDR 서브유닛의 부분, 즉 항원-결합 단편, 또는 예를 들어 Fc 수용체 및/또는 보체에 결합 및/또는 활성화시키는 CH 서브유닛의 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. CDR은 통상적으로 문헌 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al)에 기술된 바와 같은 카뱃 CDR을 언급한다. 항원 결합 부위를 특징화하기 위한 또 다른 표준으로 문헌 (Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638)에 의해 기술되는 바와 같은 초가변 루프를 언급한다. 또 다른 표준은 옥스포드 분자의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (Oxford Molecular's AbM antibody modelling software)에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 일반적으로, 예를 들어 문헌 (Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg))을 참조한다. 카뱃 CDR에 대해 기술된 양태는 달리는 초티아 초가변 루프 또는 AbM-정의된 루프에 대해 유사하게 기술된 관계를 이용하여 수행될 수 있다.
항체에 대한 용어 "항원-결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv; (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-46); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 카멜리드 (camelid) 항체 및 카멜화된 (camelized) 항체도 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 본원에 기술된 가변 도메인 중 단지 하나로부터의 CDR을 포함할 수 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 분리된 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 서로 결합될 수 있다 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). 또한, 이러한 단일쇄 항체가 항체에 대한 용어 "항원-결합 단편" 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 이의 작용에 대해 평가된다.
천연 시스템에서 항체의 다양성은 가변 영역을 암호화하는 다수의 배선 유전자 및 다양한 체세포 이벤트에 의해 만들어진다. 체세포 이벤트는 완전한 VH 영역을 만들기 위한 다양성 (D) 및 연결 (J) 유전자 절편을 갖는 다양한 유전자 절편의 재조합,및 완전한 VL 영역을 만들기 위한 가변 및 연결 유전자 절편의 재조합을 포함한다. 재조합 과정 자체는 부정확하여 V(D)J 접합부(jucntion)에서 아미노산의 상실 또는 부가가 생길 수 있다. 다양성에 대한 이들 기작은 항원 노출 전에 발달 B 세포에서 발생한다. 항원 자극 후, B 세포에서 발현되는 항체 유전자는 체세포 돌연변이를 겪는다. 배선 유전자 절편, 이들 절편의 무작위 재조합 및 무작위 VH-VL 짝지음의 어림된 수에 기초하여, 1.6 x 107개의 상이한 항체가 생성될 수 있다 (Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y.). 항체 다양성에 기여하는 기타 과정 (예: 체세포 돌연변이)가 일어나는 경우, 1010개 이상의 상이한 항체가 생성될 수 있다 (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif.). 항체 다양성을 일으키는데 관여하는 많은 과정 때문에, 동일한 항원 특이성을 갖는 독립적으로 유도되는 모노클로날 항체는 동일한 아미노산 서열을 가질 것 같지 않다.
따라서, 본원은 특히 IL-13에 결합, 예를 들어 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본원에 기술된 항원-결합 단편, 예를 들어 CDR을 포함하는 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 활성 단편일 것이며, 여기서 CDR은 자연적으로 발생하는 VH 및 VL의 CDR에 상응하는 위치에 놓인다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.)에 기술되는 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에 기술되는 항체 분자 (항원-결합 단편을 포함), 즉 IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는 항체 분자는, 이로 제한됨이 없이, 쥐 모노클로날 항체, mAb13.2, 및 이의 변이체, 특히 키메릭 변이체 ch13.2, 부분적으로 사람화된 변이체 h13.2v1, 및 완전히 사람화된 변이체 h13.2v2 및 h13.2v3을 포함한다. 이들 항체 분자는 천식 (알러지성 천식 및 비알러지성 천식) 및 천식-관련된 병리의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다. mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열번호 9, 10, 11, 12 및 35에 나타나 있다. mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열번호 13, 14, 15, 16 및 36에 나타나 있다. mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 가변 경쇄에서 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열이 서열번호 19, 20 및 21에 나타나 있다. mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 가변 중쇄에서 3개의 CDR이 서열번호 22, 23 및 24에 나타나 있다.
상술되는 바와 같이, CDR은 항원과의 특이적 상호작용에 책임이 있는 잔기의 대부분을 포함하며, 각각 VH 및 VL 도메인, 즉 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내에 포함된다. 예시적 항체는 서열번호 19-24에 나타난 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR, 또는 선택된 잔기, 특히 이러한 CDR로부터의 IL-13 접촉 잔기를 포함한다. 이러한 항체는 또한 IL-13에 결합하고, 예를 들어 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해할 수 있다. 본원에서 기술되는, CDR의 활성 단편의 아미노산 서열, 즉 최소의 코어 CDR 서열이 서열번호 25-30에 나타나 있고, 표 1에 기술된다. 항체는 서열번호 19-21 또는 서열번호 25-27에 나타난 바와 같이 VL 쇄의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 항체는 서열번호 22-24 또는 서열번호 28-30에 나타난 바와 같이 VH 쇄의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 서열번호 19-30에 나타난 아미노산 서열 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 보여지는 바와 같이, X는, 표 1의 좌측 컬럼의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 같이, 임의의 아미노산, 예를 들어 비-시스테인 아미노산, 또는 유사한 전하, 소수성 및 또는 측쇄 길이를 갖는 아미노산일 수 있다.
Figure 112010036703431-pct00050
1VL CDR에 대한 번호매김은 도 30에서와 같은 선형 서열 번호매김 계획에 따른 것이다.
2VH CDR에 대한 번호매김은 도 29에서와 같은 선형 서열 번호매김 계획에 따른 것이다.
또한 상술되는 바와 같이, 항원-결합 단편은 VH 및 VL 도메인을 포함하는 Fv 단편일 수 있다. 따라서, mAb13.3, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 또는 h13.2v3의 Fv 단편은 본원에 기술된 항체를 구성할 수 있다. 이는 IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해할 수 있다. 기타 단편은 mAb13.3, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 또는 h13.2v3 항체 또는 서열번호 19-30에 나타낸 아미노산 서열 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 항체의 Fv 단편, 예를 들어 scFv 단편, Fab 단편 및 F(ab')2 단편을 포함한다.
이러한 항체 분자는 당업자에게 공지된 방법을 생성될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 제조될 수 있다. 이어서, 이러한 방식으로 형성되는 하이브리도마는, IL-13과 특이적으로 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하며 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화시키는 항체를 생성하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인하기 위해, 표준 기술, 예를 들어 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (BiacoreTM) 분석을 이용하여 스크리닝된다. 재조합 IL-13, 천연 발생 IL-13 (즉, IL-13의 프로세싱된 성숙한 형태), 이의 임의의 변이체 및 IL-13의 항원성 펩티드 단편이 면역원으로 사용될 수 있다.
IL-13의 항원성 펩티드 단편은 적어도 7개의 연속한 아미노산 잔기를 포함하고 에피토프를 포함하여, 당해 펩티드에 대해 생성된 항체가 IL-13과 특이적 면역 복합체를 형성한다. 바람직하게는, 항원성 펩티드는 적어도 10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가로, IL-13의 항원성 펩티드 단편은 IL-13 수용체-결합 부위 또는 IL-4 수용체 결합 부위를 포함한다.
모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 다른 방법으로서, 모노클로날 항체는 IL-13 (이의 변이체 및/또는 일부를 포함)로 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리 (예: 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 IL-13에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리함으로써 확인 및 분리될 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조 및 스크리닝하기 위한 기술 및 시판용 키트가 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 항체 디스플레이를 제조하고 스크리닝하는데 사용하기 위해 특히 변경 가능한 방법 및 시약에 대한 예가 문헌 (미국 특허 제5,658,727호, 미국 특허 제5,667,988호 및 미국 특허 제5,885,793호)에 기술되어 있다.
본원에 기술된 폴리클로날 혈청 및 항체는 적합한 대상을 IL-13, 이의 변이체 및/또는 이의 일부로 면역화시켜 생성될 수 있다. 면역화된 대상에서 항체의 역가는 고정화된 IL-13 또는 기타 마커 단백질 (FLAG)을 사용하는 표준 기술, 예를 들어 ELISA에 의해 시간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 항체는 동물 또는 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 널리 공지된 기술, 예를 들어 IgG 분획을 수득하기 위한 단백질 A 면역크로마토그래피의 이용을 포함한 다양한 방법이 항체를 정제하는데 이용될 수 있다.
특정 양태는 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 또는 h13.2v3의 Fv 단편의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 항체의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fd 및 dAb 단편은 항체의 절단 또는 재조합 조작에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역학적으로 활성인 Fab 및 F(ab')2 단편이 펩신과 같은 효소를 사용해 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다.
추가의 양태는, 서열번호 19 내지 30에 나타난 바와 같이, 이들 VH 및 VL 도메인의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 하나의 양태는 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 또는 h13.2v3의 VH 도메인의 H3 단편을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에서 기술되는 VH 및 VL 도메인은 배선일 수 있다. 즉. 이들 도메인의 주쇄 영역 (FR)은 하나 이상의 위치 (예: 주쇄 위치 중 적어도 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99%)에서 배선 유전자 또는 사람 배선 유전자의 컨센서스 아미노산 서열에 매칭되도록 통상의 분자 생물학 기술을 이용하여 변화될 수 있다. 다른 양태에서, 주쇄 서열은 배선으로부터 분기된다.
예를 들어, 사람 배선 서열은 문헌 (Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638)에 기술되어 있다. V BASE 디렉토리는 (문헌 (Tomlinson, I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)에 의해 집계된)) 사람 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리를 제공한다. 이들 서열은, 예를 들어 주쇄 영역 및 CDR에 대한 사람 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 컨센서스 사람 주쇄 영역은, 예를 들어 문헌 (미국 특허 제6,300,064호)에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
또한, 사람 및 비사람 부분 둘다를 포함하는, 본원에 기술되는 키메릭, 사람화된 및 단일쇄 항체가, 실시예에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 사람화된 항체는 사람 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현하나 내재성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없는 유전자이식 (transgenic) 마우스를 사용하여 제조될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 항체는 IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하며 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에 돌연변이를 갖는 항체를 포함한다. 때때로 불변 영역의 특정 단편을 돌연변이시키고 불활성화시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역의 돌연변이는 Fc 수용체 (FcR) 및/또는 보체에 대한 감소된 결합을 갖는 항체를 생성하기 위해 제조되며; 이러한 돌연변이는 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. IgG의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 대한 이러한 돌연변이의 예가 서열번호 17에 제공된다. CL 및 CH 서브유닛의 특정 활성 단편 (예: CH1)이 서로 공유적으로 결합된다. 추가의 양상은 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 돕는 IL-13의 도메인에 특이적인 항원-결합 도메인을 수득하는 방법을 제공한다.
예시적 항체는 서열번호 9, 10, 11, 12 또는 35에 나타난 VL 쇄 및/또는 서열번호 13, 14, 15, 16 또는 36에 나타난 VH 쇄의 서열을 포함하며, 또한 항원-결합능을 보유하는 이들 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 당해 기술 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 제공된 서열로부터 유도될 수 있다. 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 FR 또는 CDR에 생성될 수 있다. 항체의 안정성을 개선하고 면역원성을 감소시키기 위해 통상 주쇄 영역의 변화가 고안되지만, 항체의 이의 표적물에 대한 친화성을 증가시키기 위해 종종 CDR의 변화도 고안된다. 이러한 친화성-증가 변화는 통상적으로 CDR 영역을 변경시키고 항체를 시험함으로써 경험적으로 결정된다. 이러한 변경은 문헌 (Antibody Engineering, 2nd. ed. (1995), ed. Borrebaeck, Oxford University Press)에 기술된 방법에 따라 만들어질 수 있다.
본원에 기술된 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인, VH 도메인을 제조하기 위한 예시적 방법은 본원에 기술된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 추가, 결실, 치환 또는 삽입하고, 임의로 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합한 후, IL-13에 대한 특이적 결합에 대해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물을 시험하고 (바람직하게는) 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 조절하는 항원-결합 도메인의 능력을 시험하는 단계를 포함한다. VL 도메인은 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 기술된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 IL-13에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 대체될 CDR3를 포함하거나 CDR3 암호화 영역이 결여된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하고; (b) 상기 레퍼토리를 서열번호 24의 활성 단편을 포함하는 공여체 CDR을 암호화하는 공여체 핵산, 예를 들어 서열번호 30에 나타난 아미노산 서열을 암화화하는 공여체 핵산을 조합하여, VH 도메인을 암호화하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하도록 공여체 핵산을 레퍼토리의 CDR3 영역에 삽입하며; (c) 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키고; (d) IL-13에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편을 선별하며; (e) 특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이를 암호화하는 핵산을 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술되는 VL CDR3 (즉, L3)이 대체될 CDR3를 포함하거나 CDR3-암호화 영역이 결여된 VL 도메인을 암호화하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법이 이용될 수 있다. 본원에 기술되는 CDR의 암화화 서열 (예: CDR3)은 재조합 DNA 기술을 이용하여 CDR (예: CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Marks et al., Bio/Technology (1992) 10:779-83)은, 가변 도메인 구역의 5' 말단에 또는 이에 인접하게 지시되는 컨센서스 프라이머를 사람 VH 유전자의 제3의 주쇄 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여되는 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리 제조 방법을 기술한다. 이 레퍼토리는 특정 항체의 CDR3과 조합될 수 있다. 유사한 기술을 이용하여, CDR3-유도된 서열이 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링 (shuffling)될 수 있으며, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 특정한 항원-결합 단편을 제공하도록 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합될 수 있다. 이어서, 이 레퍼토리는 적합한 숙주 시스템, 예를 들어 문헌 (WO 92/01047)의 파아지 디스플레이 시스템에서 디스플레이되어 적합한 항원-결합 단편이 선별될 수 있다. 유사한 셔플링 (shuffling) 또는 조합 기술이 문헌 (Stemmer, Nature (1994) 370:389-91)에 기술되어 있다. 또 다른 대안책은, 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성하는 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 이용하여 변경된 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 문헌 (Gram et al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:3576-80)을 참조한다.
이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 직접적 돌연변이유발이다. 이러한 기술은 문헌[참조: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91:3809-13 및 Schier et al., J. Mol. Biol. (1996) 263:551-67]에 기술되어 있다. 유사하게, 하나 이상 또는 모든 CDR이 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 또는 일부 다른 스캐폴드 (예: 피브로넥틴 도메인)로 이식 (grafting)될 수 있다. 생성된 단백질은 IL-13에 결합하는 능력에 대해 평가된다.
하나의 양태에서, 표적물에 결합하는 결합 단백질은 변형된 결합 단백질의 푸울 (pool)을 제공하기 위해, 예를 들어 돌연변이유발에 의해 변형된다. 이어서, 변형된 결합 단백질은 변경된 작용 특성 (예: 개선된 결합, 개선된 안정성, 길어진 생체 내 안정성)을 갖는 하나 이상의 변경된 결합 단백질을 확인하기 위해 평가된다. 하나의 수행에서, 디스플레이 라이브러리 기술을 이용하여 변형된 결합 단백질의 푸울을 선별 또는 스크리닝한다. 이어서, 보다 높은 친화성 결합 단백질을, 예를 들어 보다 높은 엄격 또는 보다 경쟁적인 결합 및 세척 조건을 이용하여 제2 라이브러리로부터 확인한다. 기타 스크리닝 기술도 이용될 수 있다.
일부 양태에서, 돌연변이유발은 결합 경계면에 있는 것으로 공지되어 있거나 이러한 결합 경계면에 있음직한 영역으로 표적화된다. 예를 들어, 확인된 결합 단백질이 항체인 경우, 돌연변이유발은 본원에 기술되는 바와 같은 중쇄 또는 경쇄의 CDR 영역에 대해 지시될 수 있다. 추가로, 돌연변이유발은 CDR 근처 또는 인접한 주쇄 영역에 대해, 특히 CDR 접합부 (junction)의 10, 5 또는 3개 아미노산 내에서 이루어질 수 있다. 항체의 경우, 돌연변이유발은 또한, 예를 들어 단계적 개선을 위해 하나 또는 수개의 CDR에 제한될 수 있다.
하나의 양태에서, 돌연변이유발은 하나 이상의 배선 서열과 유사한 항체를 제조하는데 사용된다. 하나의 예시적 배선화 (germlining) 방법은, 분리되는 항체의 서열에 유사한 (예를 들어 특정 데이터베이스에서 가장 유사한) 하나 이상의 배선 서열을 포함할 수 있다. 이어서, (아미노산 수준에서) 돌연변이는 분리된 항체에서 증가하게, 조합하여 또는 둘 모두로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 일부 또는 모든 가능한 배선 돌연변이를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 제조된다. 이어서, 돌연변이된 항체는, 예를 들어 분리된 항체에 대해 하나 이상의 추가의 배선 잔기를 갖고 여전히 유용한 (예를 들어, 작용 활성을 갖는) 항체를 확인하기 위해 평가된다. 하나의 양태에서, 가능한 한 많은 배선 잔기가 분리된 항체로 가능하게 도입된다.
하나의 양태에서, 돌연변이유발을 이용하여 하나 이상의 배선 잔기를 CDR 영역에 삽입하거나 치환시킨다. 예를 들어, 배선 CDR 잔기는 변형될 가변 영역과 유사한 (예를 들어 가장 유사한) 배선 서열로부터 것일 수 있다. 돌연변이유발 후, 항체의 활성 (예: 결합 또는 기타 작용 활성)을 평가하여, 배선 잔기 또는 잔기들이 허용되는지의 여부를 결정한다. 유사한 돌연변이유발이 주쇄 영역에서 수행될 수 있다.
배선 서열의 선별은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 배선 서열은 선택성 또는 유사성, 예를 들어 적어도 특정 비율 (%)의 동일성, 예를 들어 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일성에 대해 예정된 기준과 부합하는지의 여부에 대해 선별될 수 있다. 선별은 적어도 2, 3, 5 또는 10개의 배선 서열을 이용하여 수행될 수 있다. CDR1 및 CDR2의 경우, 유사한 배선 서열을 확인하는 것은 하나의 이러한 서열을 선별하는 것을 포함할 수 있다. CDR3의 경우, 유사한 배선 서열을 확인하는 것은 하나의 이러한 서열을 선별하는 것을 포함하며, 아미노-말단 부분 및 카복시-말단 부분에 각각 기여하는 2개의 배선 서열을 포함할 수 있다. 다른 수행으로, 예를 들어 컨센서스 서열을 형성하기 위해, 1 또는 2개 초과의 배선 서열이 사용된다.
하나의 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 본원에 기술된 항체의 CDR 서열과 단지 비실질적으로 상이한 CDR 서열을 갖는다. 비실질적 차이는 약간의 아미노산 변화, 예를 들어 CDR, 예를 들어 초티아 또는 카뱃 CDR의 서열 중 통상적으로 5-7개 아미노산 중 1 또는 2개의 아미노산의 치환을 포함한다. 통상적으로, 아미노산은 유사한 전하, 소수성 또는 입체화학적 특성을 갖는 관련된 아미노산에 의해 치환된다. 이러한 치환은 당업자의 기술 범위 내이다. CDR에서와는 달리, 구조적 주쇄 영역 (FR)에서의 보다 실질적인 변화가 항체의 결합 특성에 유해하게 영향을 끼치지 않으면서 이루어질 수 있다. FR에 대한 변화는, 이로 제한됨이 없이, 항원 접촉 또는 결합 부위의 안정화에 중요한 비사람-유도된 주쇄 또는 조작된 특정 주쇄 잔기의 사람화, 예를 들어 불변 영역의 클래스 또는 서브클래스의 변화, 이펙터 작용, 예를 들어 Fc 수용체 결합을 변경시킬 수 있는 특정 아미노산 잔기의 변화 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24), 또는 불변 영역이 유도되는 종의 변화를 포함한다. 항체는 이펙터 작용, 예를 들어 Fc 수용체 결합 및 보체 활성화를 감소 또는 변경시키는 중쇄의 CH2 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어, 항체는 문헌 (미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호)에 기술되는 바와 같은 돌연변이를 가질 수 있다. IgG1 또는 IgG2 중쇄에서, 예를 들어 이러한 돌연변이는 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열과 유사해지도록 수행될 수 있다. 또한, 항체는 면역글로불린의 2개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합을 안정화시키는 돌연변이, 예를 들어 문헌 (Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-08)에 기술된 바와 같이 IgG4의 힌지 영역에서 돌연변이를 가질 수 있다.
IL-13 결합 단백질은 온전한 항체, 항체의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fd, dAb 및 scFv 단편, 및 불변 및/또는 가변 영역에서 돌연변이된 (예를 들어, 키메릭, 부분적으로 사람화된, 또는 완전히 사람화된 항체를 생성하도록 돌연변이되거나, 목적하는 특성, 예를 들어 향상된 IL-13 결합 및/또는 감소된 FcR 결합을 갖는 항체를 생성하도록 돌연변이됨) 온전한 항체 및 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 면역글로불린 가변 도메인의 실질적 부분은 CDR 영역 중 적어도 하나 및, 임의로, 본원에 기술된 가변 영역 중의 이들의 개재 (intervening) 주쇄 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부분은 FR1 및 FR4 중 하나 또는 이둘 모두의 적어도 약 50, 60, 70, 80, 85, 87, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98%를 포함할 것이다. 예를 들어, 인접하거나 비인접할 수 있는 부분은 FR1의 C-말단 50% 및 FR4의 N-말단 50%을 포함할 수 있다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단에 있는 추가의 잔기는 자연 발생적인 가변 도메인 영역과 정상적으로 관련되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 특정한 항원-결합 단편의 제작에 의해 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하도록 도입되는 링커에 의해 암호화되는 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계는, 추가의 단백질 서열 (면역글로불린 중쇄를 포함), 기타 가변 도메인 (예: 디아바디 (diabody)의 생성에서의 가변 도메인) 또는 하기에서 보다 상세히 기술되는 단백질 표지물에 본원에서 기술되는 가변 도메인을 연결하기 위해 링커를 도입시키는 것을 포함한다.
실시예에 기술되는 양태는 VH 및 VL 도메인의 "매칭" 쌍을 포함하지만, 본 발명은 또한 VH 또는 VL 도메인 서열, 특히 VH 도메인으로부터 유도되는 단일 가변 도메인을 포함하는 결합 단편을 포함한다. 단일쇄 특이적 결합 도메인의 경우, 이들 도메인을 사용하여 IL-13을 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 도메인을 형성할 수 있는 상보적 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 이는, H 또는 L 쇄 클론을 포함하는 개개의 콜로니를 사용하여 기타 쇄 (L 또는 H)를 암호화하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고 생성된 2-쇄 특이적 항원-결합 도메인을 문헌 (WO 92/01047)에 기술되는 바와 같은 파아지 디스플레이 기술에 따라 선별하는 소위 계통적 (hierarchical) 이중 조합 접근법 (상기 문헌에 기술된 바와 같음)을 이용하는 파아지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 문헌 (Marks et al., 상기 참조)에 기술된다. 항체는 방사성핵종, 약물, 마크로분자 또는 기타 제제와 화학적 방법에 의해 접합될 수 있거나 본원에 기술된 하나 이상의 CDR을 포함하는 융합 단백질로 제조될 수 있다.
항체 융합 단백질은 VH-VL 쌍을 포함하며, 이들 쇄 중 하나 (종종 VH) 및 또 다른 단백질은 단일 폴리펩티드 쇄로서 합성된다. 이러한 유형의 생성물은 이들이 일반적으로 추가의 작용 요소, 예를 들어 소분자의 활성 잔기 또는 접합되거나 융합된 마크로분자의 주요 분자 구조 특징을 갖는다는 점에서 항체들과 상이하다.
상기 개요된 아미노산 서열에 대한 변화 이외에, 항체는 글리코실화되거나 페길화 (pegylation)되거나 알부민 또는 비단백질성 중합체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 항체는, 문헌 (미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호)에 기술된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 예를 들어 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 공유 접합에 의해 화학적으로 변형된다. 또한, 예시적 중합체, 및 펩티드에 이들을 부착시키는 방법이 문헌 (미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호)에 나타나 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 변경된 글리코실화 패턴 (예: 최초 또는 천연 글리코실화 패턴으로부터 변경)을 갖도록 변형될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "변경"은 하나 이상의 탄수화물 잔기가 결실되고/되거나 하나 이상의 글리코실화 부위가 최초 항체에 부가되는 것을 의미한다. 본원에 기술된 항체에 글리코실화 부위의 추가는 글리코실화 부위 컨센서스 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다; 이러한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 항체에서의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 글리코사이드를 항체의 아미노산 잔기에 화학적 또는 효소적 커플링시키는 것이다. 이들 방법은 문헌 (WO 87/05330, 및 Aplin and Wristonj, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:259-306)에 기술되어 있다. 항체에 존재하는 임의 탄수화물 잔기의 제거는 문헌 (Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131; 및 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350)에 기술된 바와 같이 화학적으로나 효소적으로 달성될 수 있다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 제공함으로써 생체 내 반감기를 증가시키는 변형에 대해 문헌 (미국 특허 제5,869,046호)을 참조한다.
또한, 본원에 기술된 항체는 검출가능한 또는 작용성 표지물로 태그 (tag)될 수 있다. 검출가능한 표지물은 131I 또는 99Tc와 같은 방사성표지물을 포함하며, 이들은 당업계에 공지된 통상의 화학을 이용하여 본원에 기술된 항체에 부착될 수 있다. 또한, 표지물은 효소적 표지물, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제를 포함한다. 또한, 표지물은 바이오틴과 같은 화학적 잔기를 추가로 포함하며, 이들은 특이적 동족 검출가능 잔기, 예를 들어 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있다.
본원에 기술된 항체의 결합 특성은 하기 방법을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다: 비아코어 (Biacore) 분석, 효소 연계된 면역흡착 분석 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA), x-선 결정학, 서열 분석 및 스캐닝 돌연변이유발 (하기 실시예에 기술됨). 본원에 기술된 항체의 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화 및/또는 억제하는 능력은 다음 방법에 의해 측정될 수 있다: IL-13 의존적 세포주의 증식을 측정하는 검정, 예를 들어 TFI; IL-13-중재된 폴리펩티드의 발현을 측정하는 검정, 예를 들어 CD23의 발현에 대한 유세포측정 분석; 다운스트림 시그널화 분자, 예를 들어 STAT6의 활성을 측정하는 검정; 본원에 기술된 항체의 관련 동물 모델, 예를 들어 시노몰거스 원숭이에서 천식을 방지하는 효능을 시험하는 검정; 당업계에 널리 공지된 기타 검정.
관심대상의 단백질 및 표적 (예: IL-13)의 결합 상호작용은 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance; SPR)을 이용하여 분석될 수 있다. SPR 또는 생체분자 상호작용 분석 (Biomolecular Interaction Analysis; BIA)은 실시간으로 어떠한 상호영향물도 표지하지 않고 생물특이적 상호작용을 검출한다. BIA 칩의 결합 표면에서의 중량의 변화 (결합 발생의 표시)로 표면 근처 광의 굴절 지수가 변화한다 (SPR의 광학 현상). 굴절율의 변화로 검출가능한 시그널이 발생하고, 이는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 표시로서 측정된다. SPR을 이용하는 방법이, 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,641,640호; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705) 및 BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)에 의해 제공되는 온-라인 제공자료에 기술되어 있다.
SPR로부터의 정보는 표적물에 대한 생체분자의 결합에 대한, Kon 및 Koff를 포함한, 평형 해리 상수 (Kd) 및 반응속도 변수의 정확하고 정량적인 측정치를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 자료는 상이한 생체분자를 비교하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 스트랜드의 라이브러리로부터 선택되는 핵산에 의해 암호화되는 단백질은 표적물에 대해 높은 친화성을 갖거나 느린 Koff를 갖는 개체를 확인하기 위해 비교될 수 있다. 또한, 이러한 정보는 구조-활성 상호관계 (SAR)을 발생시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 모 단백질의 성숙 버젼의 반응속도 및 평형 결합 변수를 모 단백질의 변수와 비교할 수 있다. 특정 결합 변수, 예를 들어 높은 친화성 및 느린 Koff와 관련되는 지정된 위치에서의 변이체 아미노산이 확인될 수 있다. 이러한 정보는 (예를 들어, 상동성 모델링, 에너지 최소화 또는 x-선 결정학 또는 NMR에 의한 구조 결정을 이용하는) 구조 모델링과 조합될 수 있다. 그 결과, 단백질과 이의 표적물 사이의 물리적 상호작용의 이해가 공식화되고 다른 디자인 과정을 안내하는데 이용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 IL-13을 결합하고/하거나 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 억제할 수 있는 항체를 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 다수의 항체 또는 항원 결합 단편을 IL-13과 접촉시키는 단계; b) IL-13에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 단계; c) IL-13이 IL-13 수용체에 결합하는 것을 방지하는 선택된 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 시험하는 단계; d) IL-13이 이의 수용체에 결합하는 것을 방지할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 선별하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 항체는 필요한 경우 더욱 변형될 수 있다. 하나 이상의 항체는, 예를 들어 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 항-IL-13 항체는 상등액, 세포 용해물 또는 세포 표면에 있는 IL-13을 분리, 정제 및/또는 검출하는데 유용하다. 본원에 기술된 항체는 임상적 시험 절차의 일부로서 IL-13 단백질 수준을 임상적으로 모니터링하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 항체는 하나 이상의 IL-13-관련된 활성의 중화 및/또는 억제를 필요로 하는 치료, 예를 들어 알러지성 또는 비알러지성 천식 및 관련 병리에 사용될 수 있다. 또한, 본원은 사람 IL-13에 대해 지시되는 신규한 항체와 관련되는 신규한 분리되고 정제된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 기술되는 유전자, 폴리뉴클레오티드, 단백질 및 폴리펩티드는 IL-13에 대한 쥐 항체 (mAb13.2) 및 이의 변이체를 포함한다.
항-IL-13 항체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
예를 들어, 본원은 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 조절하는 (예를 들어, IL-13 생물학적 활성을 중화시키는) IL-13에 대한 쥐 항체 (mAb13.2), mAb13.2의 키메릭 버젼 (ch13.2), mAb13.2의 부분적으로 사람화된 버젼 (h13.2v1) 및 mAb13.2의 2개의 완전히 사람화된 버젼 (h13.2v2 및 h13.2v3)의 가변 영역을 암호화하는 정제되고 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
뉴클레오티드 서열은 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함할 수 있으며, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 33에 나타나 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.3v3의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함할 수 있으며, 각각 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 34에 나타나 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 8, 33 및 34에 나타난 서열 또는 이의 상보체에 대해 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고/하거나 이들 서열에 의해 암호화되는 가변 영역의 실질적인 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드 (즉, 활성 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 적어도 21개의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 1-8, 33 및 34에 나타낸 서열의 연속한 부분을 포함할 수 있다. 표 2는 수개의 예시적 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 대한 서열번호를 요약한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열번호
mAB13.2 ch13.2 h13.2v1 h13.2v2 h13.2v3
VL 영역 서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 33
VH 영역 서열번호 5 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 34
mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열번호 9, 10, 11, 12 및 35에 나타나 있다. mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 13, 14, 15, 16 및 36에 나타나 있다. 또한, 본원에 기술되는 폴리펩티드는 적어도 4개의 연속한 아미노산을 포함하는, 서열번호 9-16, 35 및 36에 나타낸 서열의 연속 부분을 포함하고, 이들 가변 영역의 실질적인 생물학적 활성을 보유한다 (즉, 활성 단편). 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 5-7개의 아미노산을 포함하는 서열번호 9-16, 35 및 36에 나타낸 서열의 연속 부분을 포함한다. 본원의 보다 바람직한 폴리펩티드는 각각 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 생물학적 활성을 보유하는 서열번호 9 및 13, 서열번호 10 및 14, 서열번호 11 및 15, 서열번호 12 및 16, 및 서열번호 35 및 36에 나타낸 서열의 연속한 부분을 포함한다. 또한, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는, 상술된 폴리뉴클레오티드 이외에, 서열번호 9-16, 35 및 36에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 연속한 부분을 암호화하고, 단지 유전자 코드의 널리 공지된 축퇴에 의해 상술된 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표 3은 본원에 기술된 수개의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 서열을 요약한다. 예를 들어, 표 3은 항체 mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 및 h13.2v3의 가변 경쇄 (VL), 가변 중쇄 (VH), 불변 중쇄 (CH), 불변 경쇄 (CL), 가변 경쇄의 CDR1 (L1), 가변 경쇄의 CDR2 (L2), 가변 경쇄의 CDR3 (L3), 가변 중쇄의 CDR1 (H1), 가변 중쇄의 CDR2 (H2), 및 가변 중쇄의 CDR3 (H3)에 대한 아미노산 서열의 서열번호를 요약한다.
Figure 112006091252559-pct00002
본원에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드는 기술된 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 서열을 갖는 핵산을 확인하고 분리하기 위한 하이브리드화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 핵산을 확인 및 분리하기 위한 하이브리드화 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 서던 하이브리드화, 원위치 (in situ) 하이브리드화 및 노던 하이브리드화를 포함하며, 당업자에게 널리 공지되어 있다.
하이브리드화 반응은 상이한 엄격 조건 하에서 수행될 수 있다. 하이브리드화 반응의 엄격성은 임의의 2개의 핵산 분자가 서로 어렵게 하이브리드화하는 조건을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 하이브리드화 폴리뉴클레오티드는 감소된 엄격 조건 하에서, 보다 바람직하게는 엄격한 조건 하에서, 가장 바람직하게는 고도의 엄격 조건 하에서 이의 상응하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화한다. 엄격 조건의 예가 하기 표 4에 나타나 있다: 고도의 엄격 조건은 적어도, 예를 들어 조건 A-F와 같이 엄격한 조건이고; 엄격한 조건은 적어도, 예를 들어 조건 G-L과 같이 엄격한 조건이며; 낮아진 엄격 조건은 적어도, 예를 들어 조건 M-R과 같이 엄격한 조건이다.
Figure 112006091252559-pct00003
1하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화된 영역(들)에 대해 기대되는 길이이다. 폴리뉴클레오티드가 비공지된 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 경우, 하이브리드 길이는 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드의 길이로 추정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드가 하이브리드화되는 경우, 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬하고 최적 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 확인함으로써 결정될 수 있다.
2SSPE (1xSSPE는 0.15M NaCl, 10 mM NaH2PO4 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4이다)가 하이브리드화 및 세척 완충액 중의 SSC (1xSSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 나트륨 시트레이트이다) 대신에 대체될 수 있다; 세척은 하이브리드화가 완결된 지 15분 후에 수행한다.
TB*-TR*: 50개 염기쌍 미만의 길이로 예상되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 융점 (Tm) 보다 5-10 ℃ 낮아야 하며, 이때 Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 18개 염기쌍 미만의 길이의 하이브리드에 대해서는, Tm (℃)은 2(A + T 염기의 수) + 4(G + C 염기의 수)이다. 18 내지 49개 염기쌍 길이의 하이브리드에 대해서는, Tm (℃)은 81.5 + 16.6 (log10Na+) + 0.41 (% G + C) - (600/N)이며, 여기서 N은 하이브리드 중의 염기의 수이고, Na+는 하이브리드화 완충액 중의 나트륨 이온의 농도이다 (1X SSC에 대한 Na+ = 0.165 M).
폴리뉴클레오티드 하이브리드화에 대한 엄격 조건의 추가의 예는 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), 본원에 참조로 삽입됨)에 나타나 있다.
본원에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드는 기술된 폴리뉴클레오티드의 대립유전자 변이체를 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 확인 및 분리하기 위한 하이브리드화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 대립유전자 변이체는 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적 유사성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 기술된 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 대안적 형태이다. 바람직하게는, 대립유전자 변이체는 기술된 폴리뉴클레오티드와 적어도 90% 동일성 (보다 바람직하게는, 적어도 95% 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성)을 갖는다.
또한, 본원에 기술된 분리된 폴리뉴클레오티드는 기술된 폴리뉴클레오티드와 상동인 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 DNA를 확인 및 분리하기 위한 하이브리드화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 이들 상동체는 기술된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 종과 상이한 종으로부터 분리되는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이거나, 기술된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 상당한 서열 유사성을 갖는 동일 종 내의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 상동체는 기술된 폴리뉴클레오티드의 적어도 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열을 갖는다.
또한, 본원에 기술되는 분리된 폴리뉴클레오티드는 항체를 발현하는 세포 및 조직을 이들이 발현되는 조건 하에서 확인하기 위한 하이브리드화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다.
본원에 기술되는 분리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술되는 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 불변 영역, 예를 들어 다양한 항체 이소타입의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술되는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (예: 서열번호 1-4 및 33에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나)는 카파 경쇄 (예: 서열번호 18에 나타낸 경쇄) 또는 람다 경쇄의 불변 영역 (또는 이의 유도체)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어, 연결된 뉴클레오티드의 발현으로 IL-13에 특이적으로 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하며 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화하는 가변 영역을 갖는 완전한 카파 또는 람다 경쇄를 형성할 것이다. 유사하게, 본원에 기술된 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (예: 서열번호 5-8 및 34에 나타낸 폴리뉴클레오티드)는 중쇄 이소타입 (또는 이의 유도체), 예를 들어 IgM, IgD, IgE, IgG 및 IgA의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 재조합 단백질을 발현하는 일반적인 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 재조합 단백질은 IL-13-중재된 시그널 전달로부터 발병하는 장애 (예: 알러지성 및 비알러지성 천식)의 치료에 사용하기 위해 가용 형태로 발현될 수 있다.
본원에 기술되는 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예: 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호). 예를 들어, 통상적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr- 숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위해 사용)을 포함한다.
많은 세포주가 재조합 발현을 위한 적합한 숙주 세포이다. 포유동물 숙주 세포주는, 예를 들어 COS 세포, CHO 세포, 293T 세포, A431 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, HeLa 세포, L 세포, BHK21 세포, HL-60 세포, U937 세포, HaK 세포, Jurkat 세포 및 일차 조직 및 일차 이식체의 시험관 내 배양물로부터 유도된 세포 균주를 포함한다.
달리, 하등 진핵세포, 예를 들어 효모 (예: 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피키아 (Pichia), 클루베로마이세스 (Kluyveromyces) 균주 및 칸디다 (Candia) 균주) 또는 원핵세포 (예: 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 살로넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium))에서 폴리펩티드를 재조합적으로 생성할 수 있다. 효모 또는 세균에서 제조되는 폴리펩티드는 변형, 예를 들어 적합한 부위가 글리코실화될 수 있다.
또한, 폴리펩티드는 동물 세포, 예를 들어 곤충 또는 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 곤충 발현 벡터, 예를 들어 배큘로바이러스 벡터로 삽입되고, 곤충 세포 발현 시스템 (예: MAXBAC® 키트, Invitrogen, Carlsbad, Calif.)에서 사용될 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드는 공지된 정제 공정, 예를 들어 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 또한, 정제는 본원에 기술된 폴리펩티드를 결합하는 것으로 공지된 제제를 이용한 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
달리, 본원에 기술된 폴리펩티드는 또한 정제를 용이하게 하는 형태로 재조합적으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 단백질, 예를 들어 말토즈-결합 단백질 (MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 또는 티오레독신 (TRX)과의 융합물로서 또는 헥사-히스티딘, 펜타-히스티딘 또는 작은 에피토프 태그, 예를 들어 FLAG 에티토프에 대한 융합물로서 발현될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 폴리펩티드는 기술된 폴리펩티드와 구조적으로 상이한 (예를 들어, 약간 변경된 서열을 갖는), 그러나 기술된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생화학적 특성을 갖는 (예를 들어, 작용적으로 비필수적인 아미노산 잔기만이 변화된) 분자를 포함한다. 이러한 분자는 천연 발생의 대립유전자 변이체 및 변경, 치환, 대체, 삽입 또는 결실을 포함하는 섬세하게 조작된 변이체를 포함한다. 이러한 변경, 치환, 대체, 삽입 또는 결실을 위한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
IL-13 결합제
또한, 항체 및 이의 단편인 결합제 이외의, IL-13에 결합하는 결합제, 특히 IL-13에의 결합에 대해 mAb13.2 및 본원에 기술된 다른 항체와 경쟁하는 결합제가 제공된다. 예를 들어, 결합제는 IL-13 상의 mAb13.2와 동일한 에피토프 또는 겹치는 에피토프에 결합할 수 있다. 결합제는 바람직하게는 IL-13 활성을 억제하거나 중화한다. 예를 들어, 결합제는 IL-4Rα에 대한 IL-13의 결합을 억제하고, 예를 들어 IL-13Rα1에 대한 IL-13의 결합을 방지하지 않는다. 이러한 결합제는 본원에 기술된 방법, 예를 들어 장애를 치료 및 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 모든 양태는 IL-13 결합제와 함께 사용하기 위해 채택될 수 있다.
결합제는 본원에 기술된 가변 도메인을 변경시키거나 본원에 기술된 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 또 다른 스캐폴드에 이식하는 것을 포함한 다양한 수단에 의해 확인될 수 있다. 또한, 결합제는 다양한 라이브러리로부터, 예를 들어 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 하나의 방법은 파아지 디스플레이를 사용한다. 단백질의 특정 영역은 변화되며, IL-13과 상호작용하는 단백질은, 예를 들어 고체 지지체에 보유되거나 다른 물리적 결합에 의해 확인된다. IL-13에 대해 mAb13.2와 동일한 에피토프 또는 겹치는 에피토프에 결합하는 특정 결합제를 확인하기 위해, 결합제는 mAb13.2 (또는 관련 항체)를 가함으로써 용출되거나 결합제는 mAb13.2 (또는 관련 항체)와의 경쟁적 실험에서 평가될 수 있다. 또한, 라이브러리를 IL-13 및 mAb13.2 (또는 관련 향체)를 포함하는 복합체에 접촉시킴으로써 다른 에피토프에 결합하는 제제의 라이브러리를 소모시킬 수 있다. 이어서, 소모된 라이브러리는 IL-13에는 결합하나 mAb13.2에 의해 결합되는 경우의 IL-13에는 결합하지 않는 제제를 수득하기 위해 IL-13에 접촉될 수 있다. 또한, 표적물로서 mAb13.2 에피토프를 포함하는 IL-13으로부터의 펩티드를 사용할 수 있다.;
파아지 디스플레이가, 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,223,409호; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; WO 94/05781; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982)에 기술되어 있다. 효모 표면 디스플레이가 문헌 (Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557)에 기술되어 있다. 디스플레이의 또 다른 형태가 리보좀 디스플레이이다. 예를 들어, 문헌 (Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30 및 Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35)을 참조한다.
IL-13에 결합하는 결합제는 하나의 스캐폴드 단백질의 구조적 특징, 예를 들어 폴딩된 도메인을 가질 수 있다. 항체에 기초한 예시적인 스캐폴드 도메인은 모노클로날 항체의 중쇄 가변 도메인으로부터 3개의 베타 쇄를 결실하여 디자인된 "미니바디 (minibody)" 스캐폴드이다 (Tramontano et al., 1994, J. Mol. Recognit. 7:9; 및 Martin et al., 1994, The EMBO Journal 13, pp. 5303-5309). 이러한 도메인은 61개 잔기를 포함하고, 2개의 초가변 루프, 예를 들어 본원에 기술된 가변 도메인 또는 본원에 기술된 변이체의 하나 이상의 초가변 루프를 나타내도록 사용될 수 있다. 또 다른 접근으로, 결합제는 V-유사 도메인인 스캐폴드 도메인을 포함한다 (Coia et al. WO 99/45110). V-유사 도메인은 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 도메인에 대해 유사한 구조적 특징을 갖는 도메인을 언급한다. 또 다른 스캐폴드 도메인이 2개의 디설파이드 결합으로 함께 유지되는 74개 잔기의 6-쇄 베타 시트 샌드위치인 텐다미스타틴으로부터 유도된다 (McConnell and Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460). 이러한 모 단백질은 3개의 루프를 포함한다. 루프는, 예를들어 IL-13에 결합하는 도메인을 선별하기 위해, (예를 들어, 본원에 기술된 CDR 또는 초가변 루프를 사용하여) 변형되거나 변화된다. 문헌 (WO 00/60070)은 CTLA-4의 천연 발생 세포외 도메인으로부터 유도되는 β-샌드위치 구조가 스캐폴드로서 사용되는 것을 기술한다.
IL-13 결합제를 위한 또 다른 스캐폴드 도메인은 피브로넥틴 타입 III 도메인 또는 관련된 피브로넥틴-유사 단백질에 기초하는 도메인이다. 피브로넥틴 타입 III (Fn3) 도메인의 총 폴드는 가장 작은 작용성 항체 단편, 항체 중쇄의 가변 영역의 도메인과 밀접히 관련된다. Fn3은, 9개 대신 7개의 β-쇄를 갖는다는 것을 제외하고는, 항체 VH 도메인의 것과 유사한 β-샌드위치이다. Fn3의 말단에 3개의 루프가 있으며; BC, DE 및 FG 루프의 위치가 항체의 VH 도메인의 CDR1, 2 및 3의 것에 상응한다. Fn3은 디설파이드 결합을 갖지 않기 때문에 유리하다. 따라서, Fn3은 항체 및 이들의 단편과 달리 환원 조건 하에서 안정하다 (WO 98/56915; WO 01/64942; WO 00/34784). Fn3 도메인은, 예를 들어 IL-13에 결합하는 도메인을 선별하기 위해, (예를 들어, 본원에서 기술되는 CDR 또는 초가변 루프를 사용하여) 변형되거나 변화될 수 있다.
또 다른 예시적 스캐폴드 도메인은 T-세포 수용체; MHC 단백질; 세포외 도메인 (예: 피브로넥틴 타입 III 반복부, EGF 반복부); 프로테아제 억제제 (예: 쿠니츠 (Kunitz) 도메인, 에코틴, BPTI 등); TPR 반복부; 트리포일 구조물; 아연 핑거 도메인; DNA-결합 단백질; 특히 단량체성 DNA 결합 단백질; RNA 결합 단백질; 효소, 예를 들어 프로테아제 (특히 불활성화된 프로테아제), RNase; 샤페론, 예를 들어 티오레독신 및 열쇽 단백질; 및 세포내 시그널화 도메인 (예: SH2 및 SH3 도메인)을 포함한다. 문헌(U.S. 20040009530)은 일부 다른 스캐폴드에 대한 예를 기술한다.
작은 스캐폴드 도메인의 예는 다음을 포함한다: 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 (58개 아미노산, 3개 디설파이드 결합), 쿠쿠르비다 (Cucurbida) 최대 트립신 억제제 도메인 (31개 아미노산, 3개 디설파이드 결합), 구아닐린에 관련된 도메인 (14개 아미노산, 2개 디설파이드 결합), 그람 네가티브 세균으로부터의 열안정성 내독소 IA에 관련된 도메인 (18개 아미노산, 3개 디설파이드 결합), EGF 도메인 (50개 아미노산, 3개 디설파이드 결합), 크링글 도메인 (60개 아미노산, 3개 디설파이드 결합), 진균 탄수화물-결합 도메인 (35개 아미노산, 2개 디설파이드 결합), 엔도텔린 도메인 (18개 아미노산, 2개 디설파이드 결합) 및 스트렙토코커스 G IgG-결합 도메인 (35개 아미노산, 디설파이드 결합 없음). 작은 스캐폴드 도메인의 예는 SH2, SH3 및 EVH 도메인을 포함한다. 일반적으로, 세포내 또는 세포외의 어떠한 모듈 도메인도 사용될 수 있다.
스캐폴드 도메인을 평가하기 위한 예시적 기준은 (1) 아미노산 서열, (2) 수개의 상동성 도메인의 서열, (3) 3차원적 구조, 및/또는 (4) pH, 온도, 염도, 유기용매, 산화제 농도의 범위에 걸친 안정성 자료를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 스캐폴드 도메인은 작고 안정한 단백질 도메인, 예를 들어 100, 70, 50, 40 또는 30개 미만의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. 도메인은 하나 이상의 디설파이드 결합을 포함하거나 금속, 예를 들어 아연을 킬레이트화할 수 있다.
또 다른 결합제는 펩티드, 예를 들어 30, 25, 24, 20, 18, 15 또는 12개 미만의 아미노산을 갖는 단백질에 기초한다. 펩티드는 보다 큰 단백질, 그러나 통상적으로 IL-13, 예를 들어 본원에 기술된 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있는 영역에 삽입될 수 있다. 펩티드는 파아지 디스플레이에 의해 확인될 수 있다 (참고: ).
IL-13 결합제는 비펩티드 연결물 및 기타 화학적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 또는 모든 결합제를 펩티드유사체 (peptidomimetic), 예를 들어 펩토이드로서 합성할 수 있다 (Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71 및 Horwell (1995) Trends Biotechnol. 13:132-4). 결합제는 하나 이상의 (예를 들어, 전부) 비-가수분해성 결합을 포함할 수 있다. 많은 비-가수분해성 펩티드 결합이 이러한 결합을 포함하는 펩티드의 합성에 대한 절차와 함께 당 기술 분야에 공지되어 있다. 비-가수분해성 결합의 예는 -[CH2NH]- 환원된 아미드 펩티드 결합, -[COCH2]- 케토메틸렌 펩티드 결합, -[CH(CN)NH]- (시아노메틸렌)아미노 펩티드 결합, -[CH2CH(OH)]- 히드록시에틸렌 펩티드 결합, -[CH2O]- 펩티드 결합 및 -[CH2S]- 티오메틸렌 펩티드를 포함한다 (미국 특허 제6,172,043호).
약제학적 조성물, 투여량 및 투여 방식
항-IL-13 항체 (또는 다른 IL-13 결합제)가, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 약제학적 조성물로 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 예를 들어 다양한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 기타 당해 기술 분야에 널리 공지된 물질들을 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 의존할 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 다른 인자, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 다른 항-사이토킨 항체 또는 기타 소염제를 포함할 수 있다 (하기에서 보다 상세히 기술됨). 이러한 추가의 인자 및/또는 제제는 본원에 기술된 항체와 함께 상승작용 효과를 달성하도록 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다. 예를 들어, 알러지성 천식의 치료에 있어, 약제학적 조성물은 또는, 예를 들어 항-IL-4 항체 또는 알러지성 반응을 감소시키는 것으로 공지된 약물을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 단독 생물학제 (예: 단독 단백질 성분)로서 또는 단독 생물학적 활성 성분으로서 항-IL-13 항체를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 중량 기준으로 25, 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1, 0.4 또는 0.1% 미만의 다른 단백질을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은, 항체가 다른 약제학적으로 허용되는 담체 이외에, 수용액 중에서 응집 형태, 예를 들어 미셀, 불용성 단층, 액정 또는 라멜라 층으로 존재하는 액체와 같은 양쪽성 제제와 함께 배합되는 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형을 위한 적합한 지질은, 이로 제한됨이 없이, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파티드, 리솔레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 당해 기술 분야의 수준에 속한다 (미국 특허 제4,235,871호; 제4,501,728호; 제4,837,028호; 및 제4,737,323호, 모두 본원에 참조로 삽입됨).
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 의미있는 환자 이점, 예를 들어 질병 증상의 경감, 치유 또는 치유 속도의 증가를 나타내기에 충분한 약제학적 조성물 또는 방법에 대한 각각의 활성 성분의 총량을 의미한다. 개별적 활성 성분이 단독으로 투여되는 경우, 상기 용어는 성분 단독의 양을 의미한다. 배합 적용되는 경우, 상기 용어는 배합하여 연속적으로나 동시에 투여되는 경우 치료 효과를 갖는 활성 성분의 배합량을 언급한다.
본원에 기술된 치료 또는 이용에 대한 예시적 방법을 실시함에 있어, IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는 (예를 들어, 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화 또는 억제하는) 항체의 치료학적 유효량을 환자, 예를 들어 포유동물 (예: 사람)에 투여할 수 있다. 항체는 단독으로 투여되거나 다른 치료제, 예를 들어 사이토킨, 림포카인 또는 다른 조혈 인자 또는 소염제를 사용하는 치료제와 함께 처방되는 방법에 따라 투여될 수 있다. 하나 이상의 제제와 공동투여되는 경우, 항체는 제2 제제와 동시에 투여되거나 분리하여, 예를 들어 연속적으로 투여될 수 있다. 분리하여, 예를 들어 연속적으로 투여되는 경우, 주치의가 다른 제제와 배합되는 항체의 투여에 대한 적합한 순서를 결정할 것이다.
약제학적 조성물 (예를 들어, IL-13에 결합하는 항체를 포함하는 약제학적 조성물)의 투여는 다양한 통상의 방법, 예를 들어 경구 섭취, 흡입, 또는 피부, 피하, 또는 정맥내 주사로 수행될 수 있다. 환자에 대한 피하 투여가 바람직하다.
IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는 치료학적 유효량의 항체를 경구 투여하는 경우, 결합제는 정제, 캡슐제, 산제, 액제 또는 엘릭서제의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 추가로 고형 담체, 예를 들어 젤라틴 또는 아주방트를 포함할 수 있다. 정제, 캡슐 및 산제는 약 5 내지 95%의 결합제, 바람직하게는 약 25 내지 90%의 결합제를 포함한다. 액체 형태로 투여되는 경우, 액체 담체, 예를 들어 물, 석유, 동물성유 또는 식물성유, 예를 들어 땅콩유, 광유, 대두유 또는 참깨유, 또는 합성유가 첨가될 수 있다. 약제학적 조성물의 액체 형태는 추가로 생리학적 염수 용액, 덱스트로즈 또는 기타 사카라이드 용액, 또는 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 액체 형태로 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 약 0.5 내지 90중량%의 결합제, 바람직하게는 약 1 내지 50중량%의 결합제를 포함한다.
IL-13에 결합하는 치료학적 유효량의 항체가 정맥내, 피부, 또는 피하 주사로 투여되는 경우, 결합제는 발열물-비함유의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH 면에서 등장성, 안정성 등을 갖는 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 당해 기술 분야의 범위에 속한다. 정맥 내, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 약제학적 조성물은, 결합제 이외에, 등장 비히클, 예를 들어 염화나트륨 주입믈, 링거 주입, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 주사액, 락테이트화된 링거 주사액 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 비히클을 포함해야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당업자에게 공지된 기타 첨가제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물 중 항체 (또는 다른 IL-13 결합제)의 양은 치료되는 상태의 특성 및 중증도, 및 환자가 이전 치료 내력에 의존할 수 있다. 궁극적으로, 주치의가 각각의 개별 환자를 치료하기 위한 항체의 양을 결정할 것이다. 먼저, 주치의는 저용량의 환자를 투여하고 환자의 반응을 관측할 것이다. 환자에 대해 최적 치료 효과가 달성될 때까지 보다 많은 용량의 항체가 투여될 것이며, 일반적으로 최적 치료 효과의 시점에서 그 용량은 추가로 증가되지 않는다. 예를 들어, 0.1-50 mg/kg, 0.5-50 mg/kg, 1-100 mg/kg, 0.5-25 mg/kg, 0.1-15 mg/kg 또는 1-8 mg/kg 체중의 범위 용량이 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어 예방적 방식으로 증상을 보이지 않는 환자 또는 정상 환자에게 투여될 수 있다.
흡입
IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물은 흡입 또는 폐 전달의 다른 방식을 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 화합물은 폐 조직에 대해 흡입에 의해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폐 조직"은, 달리 지시되는 경우를 제외하고는, 기도의 모든 조직을 언급하며, 상부 및 하부 기도 모두를 포함한다. IL-13 항체 또는 이의 단편은 폐 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 기존의 조절제와 함께 투여될 수 있다.
하나의 예시로써, 분무기에 사용하도록 제형화된다. 하나의 양태에서, 동결건조 형태로 (예를 들어, 실온에서) 저장되고, 흡입 전에 용액에 재구성될 수 있다.
또한, 의학적 장치, 예를 들어 흡입기를 사용한 흡입을 위해 제형화될 수 있다 (미국 특허 제6,102,035호 (분말 흡입기) 및 미국 특허 제6,012,454호 (건조 분말 흡입기)). 흡입기는 저장에 적합한 pH에서 활성 화합물을 위한 분리 구획물 및 중성화 완충액을 위한 또 다른 구획물, 및 분무 직전에 화합물을 중성화 완충액과 배합하는 메카니즘을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 흡입기는 계량 용량 흡입기이다.
폐 기도로 국소적으로 약물을 전달하는데 사용되는 3가지의 일반적인 시스템은 건조 분말 흡입기 (DPI), 계량식 흡입기 (MDI) 및 분무기를 포함한다. 흡입 투여에 가장 일반적인 방법으로 사용되는 MDI는 의약을 가용화된 형태로 또는 분산액으로 전달하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, MDI는 장치의 작동시 기도로 에오로졸화된 의약을 밀어내는 프레온 또는 기타 상대적으로 높은 증기압 추진제를 포함한다. MDI와는 달리, DPI는 일반적으로 폐로 건조 분말 형태의 의약을 도입하기 위한 환자의 흡입 노력에 전적으로 의존한다. 분무기는 액체 용액에 에너지를 가하여 흡입되도록 의약 에어로졸을 형성한다. 또한, 불소화합물 매질을 사용하는 폐 세척 또는 액체 통기 동안 약물의 직접적 폐 전달이 수행된다. 이러한 방법 및 기타 방법을 이용하여 IL-13 항체 또는 이의 단편을 전달할 수 있다. 하나의 양태에서, IL-13 항체 또는 이의 단편은 중합체, 예를 들어 화합물의 반감기를 증가시키거나 안정화시키는 중합체와 결합된다.
예를 들어, 흡입 투여를 위해, IL-13 항체 또는 이의 단편은 적합한 추진제 또는 분무기를 포함하는 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다. IL-13 항체 또는 이의 단편은 건조 입자 또는 액체의 형태일 수 있다. IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함하는 입자는, 예를 들어 분무 건조에 의하거나, IL-13 항체 또는 이의 단편의 수용액을 전하 중화제와 함께 건조시킨 후 건조된 분말로부터 입자를 생성하거나, 수용액을 유기 변형제 중에서 건조시킨 후 건조된 분말로부터 입자를 생성하여 제조될 수 있다.
화합물은 편리하게는 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스를 사용하여 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무물의 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브가 제공될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지는, 입자가 제형화된 입자인 경우, IL-13 항체 또는 이의 단편과 적합한 분말 기재, 예를 들어 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 포함하도록 제형화될 수 있다. 제형화되거나 제형화되지 않은 화합물 이외에, 이의 전달 및 분산을 촉진하기 위해 다른 물질, 예를 들어 100% DPPC 또는 다른 계면활성제를 IL-13 항체 또는 이의 단편과 혼합할 수 있다. 건조 입자를 제조하는 방법이, 예를 들어 문헌 (WO 02/32406)에 기술되어 있다.
IL-13 항체 또는 이의 단편은 투여시 신속히 흡수되고 신속한 국소적 또는 전신적 치료 결과를 나타낼 수 있도록, 예를 들어 건조 에어로졸 입자로서 에어로졸 전달을 위해 제형화될 수 있다. 투여는 투여한 지 2분, 5분, 1시간 또는 3시간 내에 검출가능한 활성을 제공하도록 조절될 수 있다. 일부 양태에서, 피크 활성은 매우 빠르게, 예를 들어 30분 내에, 심지어는 10분 내에 달성될 수 있다. IL-13 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어 PEG와 같은 중합체와 결합하여) 보다 긴 생물학적 반감기를 갖도록 제형화될 수 있으며, 예를 들어 화합물이 폐로부터의 순환에 들어가서 다른 기관 또는 특정한 표적 기관에 재분포되도록, 다른 투여 방식에 대한 대안으로써 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, IL-13 항체 또는 이의 단편은, 폴리펩티드 중량의 적어도 5%가 하부 기도 또는 심폐에 전달되도록 하는 양으로 전달된다. 심폐는 매우 많은 모세혈관 네트워크를 갖는다. 폐포 기공으로부터 모세혈관 내강을 분리시키는 호흡 막은 매우 얇으며 매우 투과적이다. 또한, 폐포 표면을 가득 채우는 액체층은 폐 계면활성제가 풍부하다. 또 다른 양태에서, IL-13 항체 또는 이의 단편의 조성물의 적어도 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%가 하부 기도 또는 심폐에 전달된다. 이들 조직 중 하나 또는 둘 모두에의 전달로 화합물의 효과적인 흡수 및 높은 생체이용율이 달성된다. 하나의 양태에서, 화합물은, 예를 들어 흡입기 또는 분무기를 사용하여 계량 용량으로 제공된다. 예를 들어, 화합물은 적어도 약 0.02, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 10, 20, 40 또는 50 mg/1회 호흡량 이상의 투여 단위 형태로 전달된다. 생체 이용률 (%)은 하기와 같이 계산될 수 있다:
생체이용율(%)=(AUC비침습/AUC정맥내 또는 피하)x(투여량정맥내 또는 피하/투여량비침습)x100
필수적인 것은 아니지만, 계면활성제와 같은 전달 증진제가 폐 전달을 더욱 증진시키는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 2개의 비혼화성 상 사이의 경계면과 상호작용함으로써 약물의 흡수를 촉진하는 친수성 및 친유성 잔기를 갖는 화합물을 언급한다. 계면활성제는 수개의 이유, 예를 들어 입자 응집의 감소, 대식구 식작용의 감소 등의 이유로 건조 입자에 유용한다. 폐 계면활성제와 커플링되는 경우, 계면활성제, 예를 들어 DPPC는 화합물의 확산을 상당히 용이하게 할 것이므로, 화합물의 보다 효과적인 흡수가 달성될 수 있다. 계면활성제는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 이로 제한됨이 없이, 포스포글리세라이드, 예를 들어 포스파티딜콜린, L-알파-포스파티딜콜린 디팔미토일 (DPPC) 및 디포스파티딜 글리세롤 (DPPG); 헥산데칸올; 지방산; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리옥시에틸렌-9- ; 아우릴 에테르; 팔미트산; 올레산; 소르비탄 트리올레에이트 (SPANTM 85); 글리코콜레이트; 서팍틴; 폴록소머; 소르비탄 지방산 에스테르; 소르비탄 트리올레에이트; 틸록사폴; 및 인지질을 포함한다.
안정화 및 보유
하나의 양태에서, IL-13 항체 또는 이의 단편은 순환, 예를 들어 혈액, 혈청, 림프, 폐기관지액, 기관지폐포액 또는 기타 조직 중에서, 예를 들어 1.5, 2, 5, 10 또는 50배로 이의 안정화 및/또는 보유를 개선하기 위한 잔기와 물리적으로 결합된다. 예를 들어, IL-13 항체 또는 이의 단편은 중합체, 예를 들어 실질적으로 비항원성인 중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 옥사이드 또는 폴리에틸린 옥사이드와 결합될 수 있다. 적합한 중합체는 중량이 실질적으로 다양할 것이다. 수평균 분자량이 약 200 내지 약 35,000 (또는 약 1,000 내지 약 15.000 또는 약 2,000 내지 약 12,500)인 중합체가 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-13 항체 또는 이의 단편은 수용성 중합체, 예를 들어 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들어 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈과 접합될 수 있다. 이러한 중합체의 비제한적 예는 폴리알킬렌 옥사이드 단독중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올, 이의 공중합체 및 이의 블록 공중합체 (단, 블록 공중합체의 수용성이 유지되는 경우)를 포함한다.
중합체의 분자량은 약 500,000 Da 이하, 바람직하게는 적어도 약 20,000 Da, 또는 적어도 약 30,000 Da 또는 적어도 약 40,000 Da의 범위일 수 있다. 선택된 분자량은 수득되는 접합체의 유효 크기, 중합체의 특성 (예: 구조, 예를 들어 선형 구조 또는 측쇄 구조), 유도체화 정도에 따를 수 있다. 공유 결합을 이용하여 IL-13 항체 또는 이의 단편을 중합체에 부착, 예를 들어 항체의 N-말단 아미노 그룹, 항체의 리신 잔기에 있는 엡실론 아미노 그룹 및 기타 아미노, 이미노, 카복실, 설프히드릴, 히드록실 또는 기타 친수성 그룹에 가교 결합할 수 있다. IL-13 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있는 작용화된 PEG 중합체가 Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)로부터 이용가능하다. PEG와 다른 중합체를 커플링하기 위한 반응 조건은 IL-13 항체 또는 이의 단편, 목적하는 페길화 정도 및 사용되는 중합체에 따라 달라질 수 있다. PEG 유도체의 선택에 관여하는 일부 인자는 목적하는 부착점 (예: 리신 또는 시스테인 R-그룹), 가수분해 안정성 및 유도체의 반응성, 결합물의 안정성, 독성 및 항원성, 분석물의 적합성 등을 포함한다. 임의의 특정 유도체의 사용에 대한 특별 지시가 제작자로부터 입수가능하다.
IL-13 항체 또는 이의 단편과 중합체의 접합체는. 예를 들어 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC에 의해 미반응된 출발 물질로부터 분리될 수 있다. 접합체의 이종 물질도 동일한 양상으로 또 다른 것으로부터 정제된다. (예를 들어, 하나 또는 2개의 PEG 잔기를 포함하는) 상이한 종도 비반응된 아미노산의 이온 특성 차이에 근거하여 분해될 수 있다 (WO 96/34015).
항-IL-13 항체의 치료적 및 예방적 이용
또 다른 양상에서, 본원은 IL-13에 결합하고/하거나 이를 중화시키는 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항체를 이의 활성을 억제하기에 충분한 양으로 투여함으로써 생체 내에서 IL-13의 하나 이상의 관련 활성을 중화 및/또는 억제하는 방법을 특징으로 한다. 또한, 이러한 항체는 IL-13-중재된 염증 반응의 억제가 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 이들 질병은, 예를 들어 기도 염도, 천식, 섬유증, 호산구증가증 및 증가된 점액 생성을 포함한다.
본 발명자는 IL-13에 결합하는 항체가 알레르겐 돼지회충에 노출된 시노몰거스 원숭이에서 기도 염증을 감소시킨다는 것을 밝혔다. 또한, 본 발명자는 사람 말초혈액 단구에서 CD23의 IL-13에 의한 상향 조절을 입증하였다. 따라서, IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하며 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화할 수 있는 본원에 기술된 항체가, 예를 들어 IL-13-관련된 병리 (천식 및/또는 이의 관련 증후군 및/또는 아토피성 장애 (예: IL-13에 대한 증가된 민감성으로부터 발병하는 아토피성 장애)를 포함)를 치료 또는 예방하기 위해 생체 내에서 IL-13-중재된 염증을 감소시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 항체는, 본원에 기술되는 바와 같이, IL-13-관련된 장애, 예를 들어 호흡 장애, 예를 들어 천식 (예: 알러지성 및 비알러지성 천식 (예를 들어, 영유아에서 예를 들어 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)의 감염에 의한 천식)), 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 및 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증, 및 점액 과다 생성을 수반하는 다른 질병, 예를 들어 낭포성 섬유증 및 폐 섬유증; 아토피성 장애, 예를 들어 IL-13에 대한 증가된 민감성으로부터 발병하는 아토피성 장애 (예: 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알러지성 비염 및 알러지성 위장염); 피부 (예: 아토피성 피부염) 및 위장 기관 (예: 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염 및/또는 크론 질환), 간 (예: 경화증, 간세포 암종)의 염증 및/또는 자가면역 질병 및 피부경화증; 종양 또는 암 (예: 연조직 또는 고형 종양), 예를 들어 백혈병, 아교모세포종 및 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종; 바이러스 감염 (예: HTLV-1 감염); 다른 기관의 섬유증, 예를 들어 간의 섬유증 (예: B형 간염 및/또는 C형 간염에 의한 섬유증); (예를 들어, 백신 처리 중) 보호적 1형 면역 반응의 발현의 억제 중 하나 이상으로부터 선택되는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
호흡 장애
IL-13 길항제 (예: IL-13 결합제, 예를 들어 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은, 이로 제한됨이 없이, 천식 (예: 알러지성 및 비알러지성 천식(예를 들어, 영유아에서 예를 들어, 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)의 감염에 의한 천식)); 기관지염 (예: 만성 기관지염); 만성 폐색성 폐 질환 (COPD) (예: 폐기종, 예를 들어 담배-유도된 폐기종); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 질병, 예를 들어 낭포성 섬유증, 폐 섬유증 및 알러지성 비염을 포함한 호흡 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
천식은 매우 많은 조건, 예를 들어 알레르겐의 흡입, 상부-호흡 또는 귀 감염의 존재 등에 의해 유발될 수 있다 (Opperwall (2003) Nurs. Clin. North Am. 38:697-711). 알러지성 천식은 다양한 특이적 및 비특이적 자극, 증가된 혈청 면역글로불린 E (IgE), 과다 기도 점액 생산, 부종 및 기관지 상피 손상에 대한 기도 과반응성 (AHR)으로 특징지어진다 (Wills-Karp, 상기 참조). 알러지성 천식을 알레르겐이 즉각적인 초기 기도 반응을 일으키는 경우에 시작되고, 이어서 종종 수시간 후 늦은 후기 기도 반응 (LAR)이 뒤따른다 (Henderson et al. (2000) J. Immunol. 164:1086-95). LAR 동안, 기도벽 및 기관지액을 통한 호산구, 림프구 및 대식구의 유입이 있다 (Henderson et al., 상기 참조). 폐 호산구증가증은 알러지성 천식의 특징이며, 호흡 상피에 대한 많은 손상에 대해 책임이 있다 (L1 et al. (1999) J. Immunol. 162:2477-87).
CD4+ T 헬퍼 (Th) 세포는 천식과 관련된 만성 염증에 중요하다 (Henderson et al., 상기 참조). 수개의 연구에서, 타입 2 T 헬퍼 (Th2) 세포에 대한 CD4+ 세포의 개입 및 타입 2 사이토킨 (예: IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13)의 후속한 생성이 AHR을 유도하는 알러지성 면역 반응에 중요하다는 것이 밝혀졌다 (Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800, 및 이에 참조로 인용된 문헌). 먼저, CD4+ T 세포는 쥐 모델에서 알러지-유도된 천식에 대해 필수적인 것으로 밝혀졌다. 두번째로, 타입 2 사이토킨을 생성하는 CD4+ T 세포는 이러한 동물 모델에서 뿐만 아니라 알러지성 천식을 앓는 환자에서도 증식된다. 세번째로, 타입 2 사이토킨 수준이 동물 모델 및 천식환자의 기도 조직에서 증가된다. 네번째로, Th2 사이토킨은 알러지성 천식의 쥐 모델에서 호산구 재소환에 중요한 역할을 하는 것으로 연루되었으며, 입양 전달된 Th2 세포가 폐에서의 에오탁신 (강력한 호산구 화학유도제)의 증가된 수준 및 폐 호산구증가증 (Wills-Karp et al., 상기 참조; L1 et al., 상기 참조)과 관련되었다.
본원에 기술된 천식의 치료 또는 예방 방법은 외인성 천식 (또한 알러지성 천식 또는 아토피성 천식으로도 공지됨), 내인성 천식 (또한 비알러지성 천식 또는 비아토피성 천식으로도 공지됨) 또는 이둘의 조합 (이는 혼합 천식으로도 언급됨)에 대한 치료 또는 예방법을 포함한다. 외인성 또는 알러지성 천식은, 예를 들어 알레르겐, 예를 들어 꽃가루, 포자, 풀 또는 잡초, 애완동물 비듬, 먼지, 진드기 등에 의해 발병되거나 이들과 관련되는 사건을 포함한다. 알레르겐 및 기타 자극물들이 년 중 다양한 시점에서 존재하기 때문에 이러한 유형의 사건은 계절적 천식으로도 언급된다. 또한, 기관지 천식 및 알러지성 기관지폐 아스페르길로스증이 외인성 천식의 그룹에 포함된다.
본원에 기술된 제제에 의해 치료되거나 경감될 수 있는 장애는, 감염 인자, 예를 들어 바이러스 (예: 감기 및 독감 바이러스, RSV, 파라믹소바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스)에 의해 발병되는 이러한 호흡 장애 및 천식을 포함한다. RSV, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스 감염이 어린이에서 일반적이며, 유아 및 영유아에서 호흡기 질환에 대한 주된 원인중 하나이다. 바이러스 세기관지염을 앓는 어린이는 만성 쌕쌕거림 및 천식을 발달시킬 수 있으며, 이는 본원에서 기술되는 방법을 이용하여 치료될 수 있다. 또한, 운동 및/또는 차가운 공기에 의해 일부 천식환자에서 발생될 수 있는 천식 증상이 포함된다. 본 방법은 연기 노출 (예: 담배-유도 및 산업 매연), 및 산업적 및 직업적 노출, 예를 들어 페인트, 플라스틱, 폴리우레탄, 니스 등으로부터의 연기, 오존, 유해 가스, 이산화황, 산화질소, 연무 (이소시아네이트 포함), 목재, 식물 또는 기타 유기 먼지 등과 관련된 천식에 대해서도 유용하다. 또한, 본 방법은 식품 첨가제, 방부제 또는 약리학적 제제와 관련된 천식 발생에 대해서도 유용하다. 또한, 무증상 천식 또는 기침 변경 천식으로도 언급되는 천식의 유형을 치료, 억제 또는 경감하는 방법이 포함된다.
또한, 본원에 기술된 방법은, 보존된 신체 분비, 억제된 기침과 함께 기관지수축을 자극할 수 있는 위식도역류 (GERD)와 관련된 천식의 치료 및 경감에 유용하며, 침실의 알레르겐 및 자극원에의 노출이 천식 질병에 원인이 될 수 있으며, 이는 총체적으로 야간 (nighttime 또는 nocturnal) 천식으로 불린다. GERD와 관련된 천식의 치료, 억제 또는 경감 방법에 있어, IL-13 길항제의 약제학적으로 허용되는 양은 본원에 기술되는 바와 같이 GERD를 치료하기 위한 제제의 약제학적으로 유효한 양과 배합하여 사용될 수 있다. 이들 제제는, 이로 제한됨이 없이, 양성자 펌프 억제제, 예를 들어 PROTONIX® 상표 (지연 방출 판토프라졸 나트륨 정제), PRILOSEC® 상표 (오메프라졸 지연 방출 캡슐), ACIPHEX® 상표 (레베프라졸 나트륨 지연 방출 정제) 또는 PREVACID® (지연 방출 란소프라졸 캡슐)을 포함한다.
아토피 장애 및 이의 증상
"아토피성"은 종종 알러지 반응을 발생시키는 유전적 경향이 있는 일군의 질환을 언급한다. 아토피성 장애의 예는, 알러지, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 천식, 건초열을 포함한다. 천식은 간헐적인 호흡 증후군, 예를 들어 기관지 과반응성 및 가역적 기류 폐색과 관련된 표현형적으로 이질적인 장애이다. 천식의 면역조직학적 특징은, 예를 들어 기도 상피의 노출, 기저막 아래의 콜라겐 침착, 부종, 비만 세포 활성화 및 (예를 들어, 호중구, 호산구 및 림프구에 의한) 염증 세포 침윤을 포함한다. 기도 염증은 추가로 기도 과반응성, 기류 제한, 급성 기관지수축, 점액 플러그 형성, 기도벽 리모델링 및 기타 호흡 증후군에 기여할 수 있다. IL-13 길항제 (예: 본원에 기술되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 IL-13 결합제)를 이러한 증상 중 하나 이상을 경감시키기 위해 투여할 수 있다.
알러지성 비염 (건초열)의 증후군은 가려움, 콧물 흐름, 재채기 또는 코막힘 및 눈가려움을 포함한다. IL-13 길항제는 하나 이상의 이러한 증후군을 경감하기 위해 투여될 수 있다. 아토피성 피부염은 피부에 영향을 주는 만성 (장기적) 질환이다. 아토피성 피부염에 대한 정보는 문헌 (NIH Publication No. 03-4272)에서 입수할 수 있다. 아토피성 피부염에서, 피부는 매우 가렵고, 붉게 되고, 부어오르고, 갈라지고, 투명액이 스며나오고, 마지막으로 딱지가 생기고 벗겨지게 될 수 있다. 많은 경우, 질환이 심해지는 기간 (소위 악화 또는 확대)에 이어서 피부가 개선되고 완전히 깨끗해지는 기간 (소위 관해)이 있다. 아토피성 피부염은 종종 수종의 피부 염증에 대한 일반명인 "습진"으로 언급된다. 아토피성 피부염은 많은 유형의 습진 중 가장 일반적이다. 아토피성 피부염의 예는 알러지성 접촉 습진 (피부염: 면역계가 외인성 물질로서 인식하는 물질, 예를 들어 옻나무 또는 크림 및 로션 중의 특정 보존제와 접촉하게 되는 경우의 붉고 가렵고 액이 나오는 반응); 접촉 습진 (피부가 알레르겐 (알러지-유발 물질) 또는 산, 세정제 또는 기타 화합물과 같은 자극물과 접촉하게 되는 경우 붉게되고 가렵고 화끈하게 되는 국소화된 반응); 발한장애성 습진 (가렵고 화끈거리는, 맑고 깊은 물집으로 특징지어지는 손바닥 및 발바닥의 피부의 자극); 신경피부염 (긁었을 때 심하게 자극되는 국소화 가려움 (예: 곤충에 물림)에 의해 야기되는 머리, 아래쪽 다리, 손목 또는 전박 피부의 벗겨지는 패치); 동전 습진 (딱딱하게 되고 딱지가 앉고 매우 가려울 수 있는 팔, 등, 둔부, 아래쪽 다리에서 가장 일반적인 자극된 피부의 동전 형태의 패치); 지루성 습진 (머리가죽, 얼굴 및 때때로 신체의 다른 부분의 피부에 대한 노랗고 기름지며 비늘로 덮인 패치)을 포함한다. 추가의 특별한 증후군은 울혈성 피부염, 아토피성 주름 (pleat) (Dennie-Morgan fold), 구순염, 잔금이 많은 손바닥 (hyperlinear palm), 과색소침착된 눈꺼풀 (염증 또는 건초열로부터 어둡게 된 눈꺼풀), 비늘증, 위축털, 태선화, 구진 및 두드러기를 포함한다. IL-13 길항제 (예: 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 IL-13 결합제)는 하나 이상의 이들 증상을 경감시키기 위해 투여될 수 있다.
알러지성 비염 또는 다른 알러지성 장애를 치료하기 위한 예시적 방법은 알레르겐에 노출 전, 예를 들어 알레르겐에 대한 계절적 노출 전, 예를 들어 알레르겐 과분 (果粉) 전에 IL-13 길항제로 치료를 시작하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료는 1회 이상의 투여, 예를 들어 일정 간격을 둔 투여를 포함할 수 있다.
암
IL-13 및 이의 수용체는 적어도 일부 유형의 암, 예를 들어 조혈 세포로부터 유도되는 암 또는 뇌 또는 뉴론 세포로부터 유도되는 암 (예: 아교모세포종)의 발달에 수반될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 가용성 IL-13 수용체 또는 STAT6-/- 결핍 마우스의 사용을 통해 IL-13 시그널화 경로를 차단하면, 각각 종양 발병 및/또는 호지킨 림프종 세포주의 성장 또는 전이성 유방암이 지연된다 (Trieu et al. (2004) Cancer Res. 64: 3271-75; Ostrand-Rosenberg et al. (2000) J. Immunol. 165: 6015-6019). IL-13Rα2을 발현하는 암 (Husain and Puri (2003) J. Neurooncol. 65:37-48; Mintz et al. (2003) J. Neurooncol. 64:117-23)은 본원에 기술되는 항-IL-13 항체에 의해 특이적으로 표적될 수 있다. IL-13 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체 및 이의 단편은 암 세포 증식 또는 다른 암 세포 활성을 억제하는데 유용할 수 있다. 암은 정상적 성장 대조군에 대한 반응성을 상실하고 통상 상응하는 정상 세포에 비해 조절이 감소되게 증식하는 하나 이상의 세포를 언급한다.
IL-13 길항제 (예: 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 IL-13 결합제)가 치료를 위해 사용될 수 있는 암의 예는, 백혈병, 예를 들어 B-세포 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 사람 T-세포 백혈병 바이러스 타입 1 (HTLV-1) 전환된 T 세포; 림프종, 예를 들어 T 세포 림프종, 호지킨 림프종; 아교모세포종; 췌장암; 신장세포암; 난소암; AIDS-카포시 육종을 포함한다.
섬유증
또한, IL-13 길항제 (예: 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 IL-13 결합제)는 염증 및 섬유증, 예를 들어 간 섬유증의 치료에 유용할 수 있다. IL-13의 생성은 경화증으로 진행되는 간의 염증 (예: 바이러스성 간염) 및 가능하게는 간세포 암종의 진행과 관련되었다 (de Lalla et al. (2004) J. Immunol. 173:1417-1425). 섬유증은, 예를 들어 정상 조직이 종종 염증 후 흉터 조직에 의해 대체되는 경우에 발생한다. B형 간염 및 C형 간염 바이러스 모두, 간에서 섬유증 반응을 유발하며, 이는 경화증으로 진행할 수 있다. 경화증은 간 기능상실 또는 간세포 암종과 같은 심각한 합병증을 일으킬 수 있다. IL-13 길항제, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체를 사용한 IL-13 활성의 차단으로 염증 및 섬유증, 예를 들어 간 질환, 특히 B형 및 C형 간염과 관련된 염증, 섬유증 및 경화증을 감소시킬 수 있다.
염증성 장 질환
염증성 장 질환 (IBD)는 장의 염증을 일으키는 질환에 대한 일반명이다. 염증성 장 질환의 2가지 예는 크론 질병 및 궤양성 결장염이다. IL-13/STAT6 시그널화는 염증성 장 질환의 모델에서 마우스 평활근의 염증-유도된 과수축성에 관여하는 것으로 밝혀졌다 (Akiho et al. (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282:G226-232)). IL-13 길항제 (예: 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 IL-13 결합제)는 염증성 장 질환 또는 염증성 장 질환의 하나 이상의 증후군을 치료, 예방 또는 경감하는데 유용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 기술된 항체, 예를 들어 이의 약제학적 조성물은 배합 치료로, 즉 다른 제제, 예를 들어 병리 상태 또는 장애, 예를 들어 알러지성 및 염증 장애를 치료하는데 유용할 수 있는 치료제와 배합하여 투여될 수 있다. 본원에서 용어 "배합하여"는 제제가 실질적으로 동시에 (일제히 또는 연속적으로) 투여되는 것을 의미한다. 연속적으로 투여되는 경우, 제2 화합물의 투여를 개시할 때 2개의 화합물 중 제1의 화합물이 치료 부위에 유효한 농도로 여전히 검출가능하게 존재하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 배합 치료는 본원에 기술된 하나 이상의 항체, 즉 IL-13에 결합하고 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하며, 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 하나 이상의 사이토킨 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제, 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포독성 및 세포증식억제제와 함께 공동제형화되고/되거나 공동투여되는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 하나 이상의 항-IL-13 항체는 본원에 기술된 2개 이상의 치료제와 함께 배합하여 사용될 수 잇다. 이러한 배합 치료는 유리하게는 투여되는 치료제를 보다 적은 용량으로 사용할 수 있게 하여, 다양한 단독 치료와 관련된 가능한 독성 및 합병증을 피할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 치료제는 IL-13/IL-13-수용체 경로와 상이한 경로에 작용하여 IL-13 항체의 효과를 향상시키고/시키거나 상승작용하는 것으로 기대된다.
하나 이상의 IL-13 길항제, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 함께 공동투여되고/되거나 공동제형화될 수 있는 바람직한 추가의 치료제의 예는, 이로 제한됨이 없이, 흡입되는 스테로이드; 베타-효능제, 예를 들어 단기 작용 또는 장기 작용 베타-효능제; 류코트리엔 길항제 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 배합 약물, 예를 들어 ADVAIR®; IgE 억제제, 예를 들어 항-IgE 항체 (예: XOLAIR®); 포스포디에스테라제 억제제 (예: PDE4 억제제); 잔틴; 항콜린작동성 약물; 비만 세포 안정화제, 예를 들어 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에노탁신/CCR3 억제제; 및 항히스타민제 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 배합물은 천식 및 다른 호흡 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 함께 공동투여되고/되거나 공동제형화될 수 있는 치료제에 대한 추가의 예는, TNF 길항제 (예: TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들어 p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예를 들어 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBRELTM)); TNF 효소 길항제, 예를 들어 TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제; 무스카린 수용체 길항제; TGF-β 길항제; 인터페론 감마; 페르페니돈; 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노마이드 또는 시롤리무스 (라파마이신) 또는 이의 동족체, 예를 들어 CCI-779; COX2 및 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제, TPL-2, Mk-2 및 NFκB 억제제 중 하나 이상을 포함한다.
또한, IL-13 항체를 하나 이상의 다른 치료 화합물과 배합 투여하거나 항-IL-13 항체를 생물학적 샘플 중 IL-13의 존재 및/또는 수준을 측정하기 위한 연구 또는 치료적 수단으로서 사용하기 위한 키트, 예를 들어 ELISA 키트를 제공할 수 있다. 하나의 양태에서, 키트는 약제학적 담체에 제형화되는 하나 이상의 항-IL-13 항체 및 하나 이상의 분리된 약제학적 제제에 적당하게 제형화되는 하나 이상의 제제, 예를 들어 치료제를 포함한다.
백신 제형
IL-13 길항제 (예를 들어, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 IL-13 결합제)가 환자를 면역화하기 위한 백신 제형의 효능을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-13 길항제는 백신의 효능을 증가시키기 위해 면역화 전, 동안 및/또는 후에 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 백신 제형은 하나 이상의 IL-13 길항제 및 항원, 즉 면역원을 포함한다. 또 다른 양태에서, IL-13 길항제 및 면역원은, 예를 들어 서로 1시간, 3시간, 1일 또는 2일 내에 별도로 투여된다.
IL-13의 억제는, 예를 들어 세포성 백신, 예를 들어 암 및 바이러스 감염, 예를 들어 레트로바이러스 감염, 예를 들어 HIV 감염과 같은 질환에 대한 백신의 효능을 개선할 수 있다. 백신에 의한 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)의 도입은, 가능하게는 사이토킨 IL-13을 통해 CD4+ T 세포에 의해 하향 조절된다. IL-13의 억제는 CTL 반응의 백신 유도를 향상시키는 것으로 밝혀졌다 (Ahlers et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13020-10325). IL-13 길항제, 예를 들어 본원에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 백신 효율을 증가시키기 위해 백신과 함께 사용될 수 있다. 암 및 바이러스 감염 (예: 레트로바이러스 (예: HIV) 감염)은 세포성 백신 반응이 효과적일 수 있는 예시적 장애이다. 백신 효율은 백신처리 시에 IL-13 시그널화를 차단함으로써 향상된다 (Ahlers et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:13020-25).
백신 제형은 약제학적 또는 치료학적 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 기술된 IL-13 길항제 및 항원을 포함하는 약제학적 조성물은 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의제-제조, 분말화 (levigating), 유화, 캡슐화, 트랩핑화 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 항원 및 본원에 기술된 항체의 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 선택되는 투여 경로에 의존한다. 전신 제형은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 근육내, 복강내 주사로 투여하기 위해 디자인된 제형을 포함한다. 주사를 위해, 백신 제제는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크 용액, 링거 용액, 인산염 완충된 염수 또는 기타 다른 생리학적 염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 달리, 단백질은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열물-비함유 물을 사용하여 구성하기 위한 산제 형태일 수 있다.
유효 용량은 처음에는 동물 모델을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 당해 기술 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 면역 반응을 유도하기 위한 동물 모델에서 조제될 수 있다. 용량 및 간격은 개별적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 백신으로 사용되는 경우, 백신 제형은 1 내지 36주 동안 약 1 내지 3회 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1 또는 2회 용량이 약 3주 내지 약 4개월의 간격으로 투여되며, 그 후 부스팅 백신 처리가 주기적으로 이루어질 수 있다. 또 다른 프로토콜은 개별적 동물에 대해 적합하게 하는 것이다. 적합한 투여량은, 상술한 바와 같이 투여되었을 때 적어도 4 내지 12개월 동안 환자를 보호하기에 충분한 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 제형의 양이다. 일반적으로, 투여량 중의 항원의 양은 약 1 pg 내지 약 100 mg/숙주 kg, 통상적으로 약 10 pg 내지 약 1mg, 바람직하게는 약 100pg 내지 약 1㎍의 범위이다. 적합한 투여량 범위는 주사 경로, 환자의 체격에 따라 다를 것이나 통상적으로 약 0.1 mL 내지 약 5 mL의 범위일 것이다.
장애를 진단, 예후 및 모니터링하는 방법
IL-13에 결합하는 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 항체는 시험관 내 및 생체 내 진단 유용성을 갖는다. 예시적 방법은 (i) IL-13 항체를 환자에게 투여하고, (ii) IL-13 항체를 환자에서 검출하는 것을 포함한다. 검출은 환자에서 IL-13 항체의 위치를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적 방법은 IL-13 항체를 샘플, 예를 들어 환자로부터의 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시험관 내 (예: 생물학적 샘플, 예를 들어 조직, 생검) 또는 생체 내 (예: 환자에서의 생체 내 영상화)에서 IL-13의 존재를 검출하는 진단 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 샘플을 IL-13 항체와 접촉시키고, (ii) IL-13 항체와 샘플 사이의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다. 또한, 이 방법은 참조 샘플 (예: 대조군 샘플)을 리간드와 접촉시키고, 참조 샘플에 대한 것과 비교하여 리간드와 샘플 사이의 복합체 형성 정도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 대조군 샘플 또는 환자와 비교한 샘플 또는 환자에서의 복합체의 형성 변화, 예를 들어 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 중 IL-13의 존재를 나타낼 수 있다.
IL-13 항체는 결합되거나 결합되지 않은 단백질의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 물질로 직접적으로나 간접적으로 표지될 수 있다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다.
IL-13 항체와 IL-13 사이의 복합체의 형성은 IL-13에 결합된 리간드 또는 결합되지 않은 리간드를 측정 또는 가시화함으로써 검출될 수 있다. 통상의 검출 검정, 예를 들어 ELISA, 방사성면역검정 (RIA) 또는 조직 면역조직학을 이용할 수 있다. IL-13 항체를 표지하는 것 이외에, IL-13의 존재는 검출가능한 물질을 사용하여 표지된 표준물질 및 비표지된 IL-13 항체를 사용하는 경쟁적 면역검정에 의해 샘플 중에서 검정될 수 있다.
천식 과정을 진단, 예후 및 모니터링하는 방법.
생물학적 샘플 중의 IL-13의 수준을 측정함으로써 천식 및/또는 아토피성 장애 (예: IL-13에 대한 증가된 민감성으로부터 발생하는 장애)의 경과를 진단, 예후 및/또는 모니터링할 수 있다. 특히, 본원에 기술된 항체는 환자가 알러지성 또는 비알러지성 천식을 앓는지의 여부를 구별하는 방법에 사용될 수 있다.
알러지성 및 비알러지성 천식을 진단하는 이러한 방법은 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청, 혈장, 기관지폐포세척액, 가래 등 중 IL-13의 변화 (예: 감소 또는 증가)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. "진단" 또는 "진단하는"은 병리 상태의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 환자 (사람 또는 비사람 포유동물)로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 기관지폐포세척액 중의 IL-13 폴리펩티드의 시험량을 측정하고, 시험량을 IL-13 폴리펩티드에 대한 정상적인 양 또는 범위 (즉 천식을 앓지 않는 것으로 알려진 개체(들)로부터의 양 또는 범위)와 비교하여 IL-13의 존재를 검출하는 것을 수반한다. 특별한 진단 방법이 천식에 대해 명확한 진단을 제공할 수는 없지만, 그 방법이 진단을 보조하는 양성 표시를 제공한다면 충분하다.
천식 및/또는 아토피성 장애를 예후하는 방법은 mRNA 또는 단백질 수준에서 IL-13의 상향 조절을 검출하는 것을 포함할 수 있다. "예후" 또는 "예후하는"는 병리 상태의 가능한 발생 및/또는 중증도를 예측하는 것을 의미한다. 예후 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 IL-13의 시험량을 측정하고, 시험량을 IL-13에대한 예후 양 또는 범위 (즉, 천식의 다양한 중증도를 갖는 개체로부터의 양 또는 범위)와 비교하는 것을 수반한다. 시험 샘플 중의 IL-13의 다양한 양이 천식의 특정 예후와 일치한다. 특정 예후 수준의 IL-13의 양의 검출은 환자에 대한 예후를 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-13의 상향조절을 검출함으로써 천식 및/또는 아토피성 장애의 과정을 모니터링하는 방법을 제공한다. 모니터링 방법은 환자로부터 취한 생물학적 샘플 중의 IL-13의 시험량을 첫번째 및 두번째에 측정하고, 그 양을 비교하는 것을 수반한다. 첫번째와 두번째 사이의 IL-13의 양 변화가 천식 및/또는 아토피성 장애의 과정에 있어 변화를 나타내며, 양의 감소는 천식의 경감을 나타내고 양의 증가는 천식 및/또는 아토피성 장애의 진행을 나타낸다. 이러한 모니터링 검정은 천식 및/또는 아토피성 장애의 치료가 필요한 환자에서 특별한 치료적 조정(예: 질환 약화 및/또는 반전)의 효능을 평가하는데도 유용하다.
형광단- 및 발색단-표지된 단백질 리간드가 제조될 수 있다. 항체 및 다른 단백질은 약 310 nm 이하의 파장을 갖는 광을 흡수하므로, 형광 잔기는 310 nm 초과, 바람직하게는 400 nm 초과의 파장에서 실질적인 흡수를 갖도록 선택되어야 한다. 다양한 적합한 형광단 및 발색단이 문헌 (Stryer, Science (1968) 162:526) 및 Brand et al., Annual Rev. Biochem. (1972) 41:843 868)에 기술되어 있다. 단백질 리간드는 문헌 (미국 특허 제3,940,475호, 제4,289,747호 및 제4,376,110호)에 기술되어 있는 바와 같은 통상의 절차에 의해 형광 발색 그룹으로 표지될 수 있다. 상술되는 다수의 목적하는 특성을 갖는 형광단의 한 그룹은 잔텐 염료이며, 이는 플루오레세인 및 로다민을 포함한다. 또 다른 그룹의 형광 화합물은 나프틸라민이다. 일단 형광단 또는 발색단으로 표지되면, 단백질 리간드는, 예를 들어 형광 현미경 (예: 공초점 또는 디컨볼루션 (deconvolution) 현미경)을 사용하여 샘플 중의 IL-13의 존재 또는 위치를 검출하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 단백질 리간드를 사용하여 면역조직화학을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체의 경우, 항체를 표지물 (예: 정제 또는 에피토프 태그)을 갖도록 합성하거나, 예를 들어 표지물 또는 표지물-결합 그룹을 접합시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 예를 들어, 킬레이트제가 항체에 부착될 수 있다. 이어서, 항체는 조직학적 제제, 예를 들어 현미경 슬라이드 상에 놓인 조직의 고정편과 접촉된다. 결합을 위해 인큐베이션한 후, 제제를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다. 이어서, 제제를, 예를 들어 현미경으로 분석하여 제제에 결합된 항체가 있는 지의 여부를 확인한다.
항체 (또는 다른 폴리펩티드 또는 펩티드)는 결합시에 표지되지 않을 수 잇다. 결합 및 세척 후, 항체를 표지하여 검출가능하게 한다.
또한, IL-13 항체는 단백질 어레이 (array)에 고정될 수 있다. 단백질 어레이는, 예를 들어 의약 샘플 (예: 분리된 세포, 혈액, 혈청, 생검 등)을 스크리닝하기 위해 진단 도구로써 사용될 수 있다. 또한, 단백질 어레이는 다른 리간드, 예를 들어 IL-13 또는 다른 표적 분자에 결합하는 다른 리간드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 어레이를 제조하는 방법이 문헌 (De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 및 WO 99/51773A1)에 기술되어 있다. 어레이를 위한 폴리펩티드는, 예를 들어 시판되는 로보트 장치 (예를 들어, Genetic MicroSystems 또는 BioRobotics로부터의 장치)를 사용하여 고속으로 스폿팅될 수 있다. 어레이 기판은, 예를 들어 니트로셀룰로즈, 플라스틱, 유리, 예를 들어 표면-변형된 유리일 수 있다. 또한, 어레이는 다공성 매트릭스, 예를 들어 아크릴아미드, 아가로즈 또는 또 다른 중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 어레이는 문헌 (De wildt, 상기 참조)에 기술되어 있는 바와 같은 항체의 어레이일 수 있다. 단백질 리간드를 생성하는 세포는 어레이 포맷 내의 필터에서 성장될 수 잇다. 폴리펩티드 생성이 유도되고, 발현된 폴리펩티드는 세포의 위치에 있는 필터에 고정된다.
단백질 어레이는 다양한 스트랜드의 라이브러리로부터 각각의 고정된 폴리펩티드에 표적물의 결합 정도를 측정하기 위해 표지된 표적물과 접촉될 수 있다. 표적물이 표지되지 않는 경우, 비표지된 표적물의 결합을 검출하기 위해, 샌드위치 방법, 예를 들어 표지되게 프로빙되는 방법이 이용될 수 있다.
어레이의 각각의 어드레스 (address)에서의 결합 정도에 대한 정보는, 예를 들어 컴퓨터 데이터베이스에 프로필로서 저장될 수 있다. 단백질 어레이는 복제물로서 제조되고 결합 프로필, 예를 들어 표적물 및 비-표적물의 결합 프로필을 비교하는데 사용될 수 있다. 따라서, 단백질 어레이는 하나 이상의 분자에 대해 목적하는 결합 특성을 갖는 다양한 스트랜드의 라이브러리의 개별적 구성원을 확인하는데 사용될 수 있다.
IL-13 항체는 샘플, 예를 들어 샘플 (예: 환자 샘플) 중의 세포를 표지하는데 사용될 수 있다. 또한, 리간드는 형광 화합물에 부착된다. 이어서, 세포는 형광 활성화된 세포가 분류되는 (예를 들어, Becton Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose Calif.)로부터 입수가능한 세포분류기를 사용하여) 분류될 수 있다 (미국 특허 제5,627,037호; 제5,030,002호; 및 제5,137,809호). 세포가 세포분류기를 통과하면, 레이저 빔이 형광 화합물을 여기시키며 검출기는 통과된 세포를 계수하고 형광을 검출함으로서 형광 화합물이 세포에 부착되었는지의 여부를 결정한다. 각각의 세포에 결합된 표지물의 양은 샘플을 특징화하도록 정량되고 분석된다.
또한, 세포분류기는 세포를 빗나가게 하여 리간드에 의해 결합되지 않은 세포로부터의 리간드에 의해 결합된 세포를 분리시킬 수 있다. 분리된 세포는 배양되고/되거나 특징분석될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생체 내에서 환자 내의 IL-13의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 환자 (예를 들어 IL-13-관련된 장애를 갖는 환자)에게 검출가능한 마커에 접합된 항-IL-13 항체를 투여하고; (ii) 환자를 검출가능한 마커를 검출하기 위한 수단에 노출시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 환자는, 예를 들어 NMR 또는 다른 단층 X-선 사진 촬영 수단에 의해 영상 처리된다.
진단 영상화에 유용한 표지물의 예는 방사성 표지물, 예를 들어 131I, 111In, 123I, 99 mTc, 32P, 33P, 125I, 3H, 14C 및 188Rh, 형광 표지물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 핵자기공명 활성 표지물, 양전자 방출 단층 X선 사진 촬영 ("PET") 스캐너에 의해 검출가능한 양전자 방출 동위원소, 화학적발광체, 예를 들어 루시페린, 및 효소적 마커, 예를 들어 퍼옥시다제 또는 포스파타제를 포함한다. 짧은 범위 방사선 방출자, 예를 들어 짧은 범위 검출자 프로브에 의해 검출가능한 동위원소가 사용될 수도 있다. 단백질 리간드는 공지된 기술을 이용하여 이러한 시약들로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. for techniques relating to the radiolabeling of antibodies 및 Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol. 121: 802 816)을 참조한다.
또한, 방사선표지된 리간드는 시험관 내 진단 시험에 사용될 수 있다. 동위원소적으로 표지된 리간드의 특이 활성은 반감기, 방사성 표지물의 동위원소적 순도, 및 표지물이 항체에 삽입되는 방식에 의존적이다.
폴리펩티드를 방사성 동위원소 (예: 14C, 3H, 35S, 99mTc, 125I, 32P, 33P 및 131I)로 표지하는 절차는 널리 공지되어 있다 (미국 특허 제4,302,438호; Goding, J. W. (Monoclonal antibodies: principles and practice: production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry, and immunology 2nd ed. London; Orlando: Academic Press, 1986. pp 124 126) 및 이에 인용된 참조문; 및 A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp 65 85 (Academic Press 1985)).
본원에 기술된 IL-13 항체는 자기 공명 영상화 (MRI) 조영제에 접합될 수 있다. 일부 MRI 기술이 문헌 (EP-A-0 502 814)에 요약되어 있다.
이러한 완화 (relaxation) 시간 상수의 차이는 조영제에 의해 향상될 수 있다. 이러한 조영제의 예는 많은 자기제, 상자성제 (주로 T을 변경시킴) 및 강자성제 또는 초상자성제 (주로 T2를 변화시킴)을 포함한다. 킬레이트 (예: EDTA, DTPA 및 NTA 킬레이트)는 일부 상자성 물질 (예: Fe3+, Mn2+, Gd3+)에 부착 ( 및 이의 독성을 감소)시키는데 사용될 수 있다. 다른 제제는 입자, 예를 들어 직경이 10 mm 내지 약 10 nm 미만인 입자의 형태이고 강자성, 반강자성 또는 초상자성을 가질 수 있다.
또한, IL-13 항체는 NMR 활성 19F 원자를 포함하는 지시 그룹 또는 IL-13의 분포를 위치화하고 영상화하기 위해 문헌 (Pykett, (1982) Scientific American 246:78-88)에 기술되어 있는 바와 같은 다수의 원자로 표지될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 범위 내에는 IL-13에 결합하는 단백질 리간드 및 진단적 사용, 예를 들어 시험관 내에서, 예를 들어 샘플, 예를 들어 IL-13 관련된 장애를 갖는 환자로부터의 생검 또는 세포에서, 또는 생체 내에서, 예를 들어 환자의 영상화에 의해, IL-13을 검출하기 위한 IL-13 항체 (예: 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 다른 폴리펩티드 또는 펩티드)의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트가 포함된다. 또한, 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들어 표지물 또는 추가의 진단제를 포함할 수 있다. 생체 내에서의 사용을 위해 리간드는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
키트
IL-13 항체, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편이 키트 내에, 예를 들어 키트의 성분으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 (a) IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 및, 임의의, (b) 정보 물질을 포함한다. 정보 물질은 설명하는 지시적인 마케팅, 또는 본원에 기술된 방법 및/또는 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 이용에 관련된 다른 물질일 수 있다.
키트의 정보 물질은 이러한 형태에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 정보 물질은 화합물의 생성, 화합물의 분자량, 농도, 만료일, 뱃치 또는 생성 위치 정보 등에 관한 정보를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 정보 물질은 본원에 기술된 장애를 치료, 예방, 진단, 예후 또는 모니터링하기 위한 리간드의 사용에 관련된다.
하나의 양태에서, 정보 물질은 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 본원에 기술된 방법을 수행하기에 적합한 방식으로, 예를 들어 적합한 용량, 투여 형태 또는 투여 방식 (예: 본원에 기술된 투여량, 투여 형태 또는 투여 방식)으로 투여하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 정보 물질은 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 적합한 환자, 예를 들어 사람, 예를 들어 알러지성 천식, 비알러지성 천식 또는 IL-13-중재된 장애, 예를 들어 알러지성 및/또는 염증 장애 또는 HTLF-1 감염을 앓거나 걸릴 위험이 있는 사람에게 투여하기 위한 지침을 포함할 수 있다. IL-13 생성은 HTLV-1 감염과 관련되어 있다 (Chung et al., (2003) Blood 102: 4130-36).
예를 들어, 정보 물질은 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 환자, 예를 들어 알러지성 천식, 비알러지성 천식 또는 IL-13-중재된 장애, 예를 들어 알러지성 및/또는 염증성 장애 또는 HTLV-1 감염을 앓거나 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
키트는 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 키트는 조성물 및 정보 물질을 위한 분리된 용기, 디바이더 또는 구획물을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 병, 바이알 또는 주사기에 포함되며, 정보 물질은 플라스틱 슬리브 또는 팩킷에 포함될 수 있다. 다른 양태에서, 키트의 분리된 요소는 단일의 비분리된 용기 내에 포함된다. 예를 들어, 조성물은 라벨의 형태로 정보 물질을 부착한 병, 바이알 또는 주사기에 포함된다. 일부 양태에서, 키트는 다수 (예: 팩)의 개별 용기를 포함하며, 각각의 용기는 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편의 하나 이상의 단위 투여 형태 (예: 본원에 기술된 투여 형태)를 포함한다. 예를 들어, 키트는 다수의 주사기, 앰플, 포일 패킷, 분무기 또는 흡입 장치를 포함하며, 각각은 단일 단위 용량의 IL-13 길항제, 예를 들어 항-IL-13 항체 또는 이의 단편, 또는 다수 단위 용량을 포함한다.
키트는 임의로 조성물의 투여에 적합한 장치, 예를 들어 주사기, 흡입기, 피펫, 겸자, 계량 스푼, 점적기 (예: 점안기), 솜 (예: 면솜 또는 모솜) 또는 임의의 이러한 전달 장치를 포함한다. 바람직한 양태에서, 장치는 계량된 용량의 리간드를 분배하는 이식가능한 장치이다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로써, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며 그러한 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 사람 IL-13에 특이적인 쥐 모노클로날 항체의 생성
실시예 1.1: 사람 IL-13에 결합하는 쥐 모노클로날 항체 (mAb13.2)의 분리
재조합 사람 IL-13으로 암컷 BALB/c 마우스를 면역화시켜 폴리클로날 항혈청을 제조하였다 (R&D Systems, Minneapolis, Minn.). 혈청을 ELISA로 사람 IL-13에 결합하는 것에 대해 스크리닝하였다. 높은 혈청 항체 역가를 나타내는 마우스로부터의 비장세포를 P3X63_AG8.653 골수종 (ATCC)과 융합시키고, 선별 배지에 플레이팅하였다. 융합물을 제한 희석시켜 3회의 서브클로닝으로 분리하고 사람 IL-13에 대해 결합 친화성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝하였다. 이들 모노클로날 항체는 IL-13과 결합하여 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하고/하거나 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화시키고/시키거나 억제할 수 있었다: 항체 mAb13.2 (IgG1 카파)을 더욱 조사하기 위해 선별하였다.
실시예 1.2: 높은 친화성 및 특이성으로 사람 IL-13에 결합하는 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2
수회 측정하여 실시예 1.1에서 분리된 쥐 모노클로날 항체, 즉 mAb13.2가 사람 IL-13에 높은 친화성 및 특이성으로 결합하는지를 확인하였다. 먼저, 사람 IL-13에 대한 3개의 모노클로날 항체(mAb13.2, mAb13.4 및 mAb13.9)에 대한 BIACORETM 분석을 바이오티닐화된 IL-13이 고정화된 69 RU 스트렙타비딘 칩을 사용하여 수행하였다. 3개의 항체를 칩 상에 개별적으로 통과시켰으며, 각각 신속한 결합을 보였다 (도 1). 완충액 교환시, 해리는 느렸다(도 1). 두번째로, mAb13.2에 대한 BIACORETM 분석을 mAb13.2가 고정화된 비아코어 (Biacore) 칩을 사용하여 수행하였다. 상이한 농도의 IL-13을 칩 상에 통과시켰다. 다시 신속한 결합 및 느린 해리가 나타났다 (도 2). 세번째로, ELISA에 의한 분석으로 mAb13.2가 제대혈 T 세포로부터 유도되는 천연 IL-13을 포함하여 시험되는 모든 형태의 사람 IL-13에 결합한다는 것을 확인하였다 (도 3). 평판을 항-FLAGTM M2 항체로 코팅하였다. FLAGTM-사람 IL-13의 결합을 바이오티닐화된 mAb13.2 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제로 검출하였다. ELISA로 mAb13.2와 IL-13 사이의 결합이 미토겐-활성화되고 Th2-빗나간 제대혈 단핵구 및 재조합 사람 IL-13으로부터 분리된 천연 사람 IL-13과 경쟁한다는 것을 확인하였다 (도 3). mAb13.2가 재조합 쥐 IL-13에 대해서는 어떠한 검출가능한 결합이 없었다 (도 3). ELISA에 의해 밝혀진 결과를 확인하기 위해, 모노클로날 항체 mAb13.2를 비아코어 칩에 코팅하고, 재조합 사람 IL-13 또는 천식을 앓는 환자에서 높은 빈도로 발현되는 다형성 형태의 IL-13 (ARG 변이체) (Heinzmann et al. (2000) Hum. Mol. Genet. 9:594)을 포함하는 용액을 칩 상에 통과시켰다. 두 형태 모두 신속한 결합 및 항체로부터 검출가능하지 않은 해리를 보였다 (도 4A). 마지막으로, 예비적 교차-반응성 조사를 우수 실험실 기준(good laboratory practice; GLP) 조건 하에서 수행하는 동안, 부검 또는 생검을 수득된 37명의 정상 사람 조직의 패널에 대해 스크리닝하는 경우 mAb13.2는 어떠한 유의한 교차-반응성도 나타내지 않았다. 상기 조직 패널은 문헌 (the DC CPMP Guideline 111/5271/94 Draft 5)의 첨부물 II의 "교차-반응성의 면역조직화학 조사에 사용될 사람 조직에 대한 제시된 리스트" 상의 모든 조직 및 문헌 (the 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use")의 표 2에서 권장되는 모든 조직을 포함하였다.
실시예 1.3: IL-13-관련된 활성을 시험관 내에서 중화하는 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2
시험관 내에서 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화하는 mAb13.2의 능력을 TF1 생검정, 사람 말초혈액 단구 및 사람 말초혈액 B 세포를 사용하여 확인하였다. 적합한 조건 하에서, 사람 TF1 적백혈병 세포주의 증식을 IL-13에 의존적하도록 할 수 있다. 먼저, 준최적 농도의 재조합 사람 IL-13 또는 사람 IL-13의 ARG-변이체 형태로 유도되는 사이토킨-의존성 TF1 세포주의 증식이 mAb13.2에 의해 억제될 수 있는지의 여부를 결정하였다. 도 4B는 mAb13.2가 TF1 증식을 자극하는 재조합 사람 IL-13 및 사람 IL-13의 ARG-변이체 형태 모두의 능력을 억제하였다는 것을 입증한다. 두번째로, TF1 세포주에서 IL-13을 없애고, 준최적 농도의 재조합 사람 IL-13에 노출시켜 정제된 마우스 mAb13.2 또는 가용성 IL-13 수용체(rhuIL-13Rα2)의 존재 하에 증식을 유도하였다. 세포를 3일 동안 배양하고, 마지막 4시간에 걸쳐 3H-티미딘 삽입을 액체 섬광 계수로 측정하였다. 준최적 IL-13 농도에서, mAb13.2는 TF1 증식을 용량-의존적으로 억제하였다 (도 5). 이러한 효과에 대한 IC50인 250 pM은 가용성 rhuIL-13Rα2의 IC50에 매우 필적할만하다(도 5). 예시적 항체는 약 50 내지 500 pM, 또는 120 내지 300 pM, 또는 240 내지 350 pM 사이의 IC50을 갖는다.
사람 말초혈액 단구는 저친화성 수용체(CD23)의 세포-표면 발현을 증가시킴으로써 용량-의존적 방식으로 IL-13 또는 IL-4에 반응하므로 (도 6A), 사람 단구를 사용하여 이러한 IL-13-관련된 활성을 중화하는 mAb13.2의 능력을 확인하였다. mAb13.2가 단구에 의한 IL-13 중재된 CD23 세포 표면 발현을 중화할 수 있는 지를 결정하기 위해, 말초혈액 단핵구 세포를 건강한 공여자로부터 분리하고, 증가량의 IL-13 단독, 증가량의 IL-4 단독, 1 ng/ml IL-13 및 증가량의 mAb13.2, 또는 0.3 ng/ml IL-4 및 증가량의 mAb13.2와 함께 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하고, CYCHROMETM-표지된 항-CD11b (단구 마커) 및 PE-표지된 항-CD23로 염색하였다. 게이트된 CD11b+ 단구를 유세포측정으로 CD23 발현에 대해 검정하였다. 예상되는 바와 같이, mAb13.2는 IL-13-중재된 CD23 발현을 억제하였으나 (도 6B), IL-4-유도된 CD23 발현을 억제하지 않았다 (도 6C).
또한, mAb13.2의 효과를 사람 말초혈액 B 세포에 의한 IL-13-중재된 IgE 생성 모델에서 시험하였다. IL-13 및 T 세포 미토겐, PHA에 반응하여, 사람 B 세포는 IgE에 대한 Ig 이소타입 전환 재조합을 수행하여 배양물 중 보다 높은 IgE 수준을 이끌었다. 이러한 효과는 IgE-생성 B 세포의 증가된 빈도로서 보여질 수 있다. 건강한 공여자로부터의 PBMC를 공급물로서 방사선 조사된 자가 PBMC의 존재 하에서 미세역가 웰에서 배양하고, PHA 및 IL-13으로 자극하였다. 3주 후, 각각의 웰을 ELISA로 IgE 농도에 대해 검정하였다. PHA+IL-13은 IgE-생성 B 세포 클론의 빈도를 증가시켰다(도 7). 이러한 효과는 mAb13.2에 의해서는 억제되었으나, IL-13-특이적 비중화 항체(mAb13.8) 또는 대조군 마우스 IgG (msIgG)에 의해서는 억제되지 않았으며 (도 7), 이는 mAb13.2가 배양된 B 세포에 의한 IL-13-중재된 IgE 이소타입 스위칭을 차단하였다는 것을 입증한다.
마지막으로, mAb13.2가 IL-13에 대한 조기 세포 반응을 차단하는 능력을 전사의 시그널 전달인자 및 활성화인자(signal transducer and activator of transcription; STAT) 6 인산화에 대한 효과를 조사함으로써 시험하였다. IL-13의 이의 세포 표면 수용체와의 상호작용 시, STAT6는 이량체화하고, 인산화되어, 세포질로부터 핵으로 이동하며, 여기서 사이토킨-반응성 유전자의 전사를 활성화한다 (Murata et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:30829-36). 인산화된 STAT6에 대한 특이적 항체는 웨스턴 블롯 및/또는 유세포측정 분석에 의해 IL-13 노출 30분 내에 이의 활성화를 검출할 수 있다.
HT-29 사람 상피 세포주를 사용하여 STAT6 인산화를 검정하였다. HT-29 세포를 증가 농도의 IL-13과 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석으로 STAT6의 용량-의존적 IL-13-중재된 인산화를 입증하였다 (표 8A). 유사하게, 유세포측정 분석으로 37 ℃에서 30분 동안 포화 농도의 IL-13으로 처리되고, 고정되며, 투과성 처리되고, 포스포-STAT6에 대해 ALEXATM Fluor 488-표지된 mAb로 염색된 HT-29 세포에서 인산화된 STAT6을 측정하였다 (도 8B). 이소타입 대조군 항체로 염색된 처리된 세포는 형광을 보이지 않았다. 마지막으로, 세포를 준최적 농도의 IL-13 단독, IL-13 및 mAb13.8, IL-13 및 mAB13.2, 또는 IL-13 및 대조군 msIgG1 항체로 처리하는 경우, 유세포측정 분석은, 세포를 mAb13.2의 존재 하에 처리하는 경우에만 STAT6의 완전한 방해를 보였다. 즉, mAb13.2는 STAT6 인산화를 차단하는 반면, IL-13-특이적 비중화 항체(mAb13.8) 및 대조군 마우스 IgG 1은 어떠한 효과도 없었다 (도 8C). 이러한 연구는 mAb13.2가 IL-13-중재된 STAT6 인산화를 억제한다는 것을 입증한다.
실시예 1.4: IL-13-관련된 활성을 생체 내에서 중화하는 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2
마우스 mAb13.2의 생체 내에서 하나 이상의 IL-13-관련 활성을 중화하는 효능을 돼지회충에 대해 본래 알러지성인 시노몰거스 원숭이에서 항원-유도된 기도 염증 모델을 사용하여 시험하였다. 이러한 모델에서, 돼지회충으로의 알러지성 원숭이를 챌린지한 결과 염증 세포, 특히 호산구가 기도로 유입되었다. mAb13.2가 이러한 세포 유입을 방지하는 능력을 시험하기 위해, 돼지회충 항원으로 챌린지하기 24시간 전에 항체를 투여하였다. 챌린지한 날에, 기선의 기관지폐포세척액 (BAL) 샘플을 좌측 폐로부터 취하였다. 이어서, 항원을 우측 폐에 기관내로 주입하였다. 24시간 후, 우측 폐를 세척하고, 8 mg/kg 복수-정제된 mAb13.2로 정맥 내 처리된 동물로부터의 BAL 유체를 비처리된 동물로부터의 BAL 유체와 비교하였다. 호산구 수가, mAb13.2로 처리된 6마리의 동물 중 1마리와 비교하여, 챌린지 후에 5마리의 비처리된 동물 중 4마리에서 증가하였다 (도 9). BAL 호산구 비율(%)은 비처리 그룹에 비해 상당히 증가하였으나 (p<0.02), 항체-처리된 그룹에 비해서는 증가하지 않았다. 이러한 결과는, mAb13.2가 알레르겐으로 챌린지된 알러지성 동물에서 기도의 호산구증가증을 방지한다는 것을 확인한다.
마우스 mAb13.2의 평균 혈청 반감기는 원숭이에서 1주 미만이었다. mAb13.2의 모든 흔적이 혈청으로부터 없어지는 3개월 시점에서, mAb13.2-처리된 동물을 돼지회충으로 다시 챌린지하여 이들 개체에서 회충-반응성을 확인하였다. 처리된 그룹의 6마리 원숭이 중에서 2마리가 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 1.5: IL-4Rα에 정상적으로 결합하는 IL-13의 영역에 결합하는 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2
IL-13-관련된 활성은 IL-13Rα1 및 IL-4Rα 쇄로 이루어진 수용체 복합체를 통해 중재되는 것으로 추정된다. 먼저, 사이토킨은 세포 표면의 IL-13Rα1 와 비교적 낮은 친화성으로 상호작용한다. 이어서, IL-13/IL-13Rα1 복합체는 IL-4Rα를 소집하여 높은 친화성으로 이의 리간드 (IL-13)에 결합하는 완전한 IL-13 수용체를 형성한다 (Zurawski et al. (1993) EMBO J. 12:2663; Zurawski et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:23869). 이어서, IL-13의 고친화성 수용체와의 결합으로 야누스 (Janus) 키나제-시그널 전달인자 및, 예를 들어 STAT6의 인산화를 통한 전사 (JAK-STAT) 경로의 활성자를 수반하는 IL-4Rα 쇄를 통해 다운스트림 시그널을 전달한다 (이는 IL-13에 대한 가장 조기의 세포 반응 중의 하나로서 모니터링될 수 있다) (Murata et al., 상기 참조). 수개의 접근법, 예를 들어 에피토프 맵핑, x-선 결정학 및 추가로 BIACORETM 분석을 이용하여, 쥐 mAb13.2 항체와 사람 IL-13 사이의 상호작용을 밝히고, mAb13.2의 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 조절하는 능력에 대한 기초를 조사하였다.
mAb13.2와 IL-13 사이의 상호작용을 x-선 결정학으로 조사하였다. 복수로부터의 총 IgG를 단백질 A 컬럼 상에서 분리하고, 파파인으로 분해하여 mAb13.2 Fab 단편을 생성한 후, 고도로 정제하였다. Fab 단편 자체를 결정화하고, 싱크로트론 방사선을 사용하는 2.8 Å 분해능으로 구조적 분석을 수행하였다. 또한, mAb13.2 Fab 단편을 사람 IL-13과 함께 공동결정화하고, 이러한 결정 구조를 1.8 Å 분해능으로 분해하였다. mAb13.2와 IL-13 사이의 주요 접촉 부위가 주로 항체의 CDR 루프와 IL-13의 C-나선의 C-말단 영역에 밀집되는 것을 확인되었다 (도 10). 성숙한 IL-13 단백질, 즉 시그널 펩티드가 절단된 IL-13 단백질에 대한 도 11에서 보여지는 번호매김 서열에 따라, mAb13.2와 접촉하는 IL-13의 주요 잔기는 서열번호 32의 GLU49, ASN53, GLY69, PRO72, HIS73, LYS74 및 ARG86이다.
mAb13.2 Fab 단편의 사람 IL-13에 결합하는 능력을 ELISA로 확인하였다. FLAG-사람 IL-13의 항-FLAG M2 항체로 밤새 코팅된 ELISA 평판에의 결합을 바이오티닐화된 mAb13.2로 검출하였다. 비표지된 mAb13.2, 분리된 mAb13.2 Fab 단편 또는 비관련 항체를 도입하여 FLAG-사람 IL-13에 대한 바이오티닐화된 mAb13.2 결합과 경쟁시켰다. 그 결과, 비표지된 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편은 FLAG-사람 IL-13에 대한 결합에 대해 바이오티닐화된 mAb13.2와 경쟁할 수 있었다 (도 12). 추가로, 비표지된 mAb13.2와 유사한 정도의 경쟁을 달성하기 위해서는 보다 높은 농도의 Fab 단편이 필요하였지만 (도 12A), 예를 들어 각각의 분리된 Fab 단편에 대해 하나의 결합 부위 및 각각의 비표지된 mAb13.2에 대해 2개의 결합 부위를 가정할 때, 결합 부위에 대한 농도의 함수로서 경쟁을 분석하는 경우 이러한 불일치가 해결되었다 (도 12B). 비표지된 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편과는 대조적으로, 비관련 항체는 FLAG-사람 IL-13에 대한 결합에 대해 바이오티닐화된 mAb13.2와 경쟁할 수 없었다 (도 12).
mAb13.2 Fab 단편의 시험관 내에서 하나 이상의 IL-13-관련된 활성을 중화하는 능력을 mAb13.2 Fab 단편의 부재 또는 존재 하에서, 상술되는 바와 같이, 사람 말초혈액 단구에 의한 CD23의 발현 및 TF1 세포의 증식을 측정하여 확인하였다. 도 13A는 mAb13.2와 유사하게 재조합 mAb13.2 Fab 단편이 결합 부위 농도-의존적 방식으로 TF1 증식을 자극하는 능력을 억제한다는 것을 입증한다. 또한, mAb13.2 Fab 단편은 mAb13.2와 유사하게 결합 부위 농도-의존적 방식으로 CD23의 IL-13-중 재된 발현을 억제하였다 (도 13B).
상술된 x-선 결정학, 에피토프 맵핑, ELISA, TF1 증식 및 CD23 발현 분석은, mAb13.2가 IL-13 나선의 C-말단 영역, 즉 IL-4R 결합 영역에 결합한다는 것을 나타내었다. 이러한 분석을 확인하기 위해, mAb13.2와 IL-13 사이의 상호작용을 BIACORETM 칩을 사용하여 분석하였다. 이러한 분석은 수개의 포맷으로 수행하였다. 먼저, IL-4R을 BIACORETM 칩에 결합시키고, IL-13Rα1에 미리결합된 IL-13의 복합체를 칩 상으로 유동시켰다. mAb13.2의 부재 하에서, 삼분자 복합체의 형성을 입증하였다. 그러나, IL-13Rα1에 미리결합된 IL-13의 혼합물에 mAb13.2의 첨가는 칩 상의 IL-4R에 대한 결합을 방지하였다. 두번째로. mAb13.2를 칩 상에 고정화시키고, 결합된 IL-13을 용액 상에 첨가하였다. IL-13Rα1이 결합된 IL-13과는 상호작용하는 것으로 검출되었지만, IL-4R과 결합된 IL-13과의 상호작용은 검출되지 않았다. 세번째로, mAb13.2는 칩 상에 고정화된 IL-13Rα1-Fc 또는 IL-13Rα1 단량체에 결합된 IL-13에 결합할 수 있는 것으로 입증되었다. 이들 관측은 mAb13.2가 IL-13과 IL-13Rα1의 상호작용을 억제하지 않으나 IL-13Rα1와 IL-4Rα의 상호작용은 파괴한다는 가정을 지지한다. 이러한 파괴는 작용성 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 방해하는 것으로 생각된다. 이러한 관측은 이러한 항체의 중화 활성에 대한 이론적 모델을 제공한다.
mAb13.2와 IL-13 및 IL-13Rα1와의 복합체의 시험관 내 입증은, mAb13.2가 잠정적으로 세포 표면에서 수용체-관련된 IL-13에 결합될 수 있다는 것을 제시한다. 세포-결합된 mAb13.2가 수용체-결합된 IL-13을 포화시키는 조건 하에서 검출될 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해, HT-29 사람 상피 세포주를 4 ℃에서 다양한 농도의 IL-13으로 처리한 후, 모노클로날 항체 mAb13.2, mAb13.8 또는 대조군 마우스 IgG1을 첨가하였다. 결합을 바이오티닐화된 항-마우스 IgG1 및 PE-스트렙타비딘을 사용하는 유세포측정 분석에 의해 검출하였다. HT-29 세포가 IL-13Rα1을 발현하지만, mAb13.2의 세포 표면-결합된 IL-13에의 결합은 2 mg/ml 이하의 mAb13.2의 농도에서는 검출되지 않았다. 이러한 관측은, mAb13.2가 하나 이상의 IL-13-관련된 활성에 대한 강력한 중화제라는 입증과 함께, IL-13 시그널링 복합체, 즉 IL-13 수용체의 정상적 작용화가 mAb13.2에 의해 파괴된다는 것을 나타낸다.
상술된 발견은, 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2가 IL-13에 대해 높은 친화성 및 특이성으로 결합하고, 강력한 중화 활성을 나타낸다는 것, 즉 mAb13.2가 시험되는 모든 IL-13-관련된 활성을 효과적으로 차단한다는 것을 확인시킨다. 이들 관측은 mAb13.2가 사람 IL-13의 IL-4Rα 결합 부위와는 상호작용할 수 있으나 IL-13Rα1 결합 부위와는 상호작용할 수 없다는 발견과 관련된다.
실시예 2: 키메릭 mAb13.2 항체(ch13.2)의 생성
실시예 2.1: 키메릭 mAb13.2 항체(ch13.2)의 분리
mAb13.2를 암호화하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 유전자를 클로닝하고, 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 분리된 mRNA로부터 서열분석하였다. VH 서열을 pED6 huIgG1_mut 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 상기 벡터는 사람 Fc 수용체 및 보체 성분에 대한 결합을 감소시키기 위해 2개의 포인트 돌연변이 (L234A 및 G237A)를 포함하는 사람 IgG1을 암호화한다 (서열번호 17; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24; Shields et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604). mAb13.2의 VL 서열을 pED6 Kappa 발현 벡터로 서브클로닝하였다. mAb13.2 VH 및 VL 서열을 포함하는 발현 벡터를 COS-1 세포로 공동-형질감염시키고, 조건화된 배지로부터 키메릭 mAb13.2 항체(ch13.2)를 정제하였다.
실시예 2.2: IL-13-관련된 활성을 시험관 내에서 중화하는 키메릭 mAb13.2 항체(ch13.2)
키메릭 항체 ch13.2를 IL-13 결합에 대해 시험하였다. 모노클로날 항체 mAb13.2, mAb13.2의 키메릭 형태 (ch13.2) 및 대조군 항체(13.8)을, 항-FLAG 항체를 갖는 ELISA 평판에 고정화된 사람 IL-13-FLAG에 대한 결합에 대해 바이오티닐화된 마우스 mAb13.2와 경쟁하는 능력에 대해 시험하였다. 키메릭 항체 ch13.2는 mAb13.2와 유사하게 IL-13에 경쟁적으로 결합할 수 있었다 (도 14A). 또 다른 시험에서, 사람 말초혈액 단구를 밤새 IL-13으로 처리하여 다양한 농도의 마우스 mAb13.2 또는 ch13.2의 존재 하에서 CD23 발현을 유도하였다. 도 14B에 나타난 바와 같이, ch13.2는 mAb13.2와 동일한 정도로 단구에 의한 IL-13-중재된 CD23 발현을 방지하였다.
실시예 3: 부분적으로 및 완전히 사람화된 mAb13.2 항체(h13.2v1 및 h13.2v2)의 생성
실시예 3.1: 부분적으로 사람화된 mAb13.2 항체(h13.2v1)의 분리
mAb13.2의 사람화는 아미노산 서열 상동성, CDR 클러스터 분석, 발현되는 사람 항체 중에서의 사용 빈도 및 사람 항체의 결정 구조에 대해 이용가능한 정보에 기초하였다. 사람화는 사람 DP-54 가변 중쇄(VH) 및 DPK-9 가변 경쇄(VL) 배선 유전자(각각 도 16 및 도 17에 나타남)에 기초하였다. 항체 결합에 대한 가능한 효과, VH-VL 짝지음 및 기타 인자들을 고려하여, 쥐 및 사람 주쇄 잔기가 소수를 제외하고는 상이한 경우, 쥐 잔기를 사람 잔기로 돌연변이시켰다. ch13.2 VH 쇄 아미노산 서열과 사람 DP-54 배선 유전자의 예측된 아미노산 서열 및 생성된 부분적으로 사람화된 h13.2v1 VH 쇄 아미노산 서열의 비교가 도 15에 나타나 있다. ch13.2 VL 쇄 아미노산 서열과 사람 DPK-9의 예측된 아미노산 서열 및 생성된 부분적으로 사람화된 h13.2v1 VL 쇄 아미노산 서열의 비교가 도 16에 나타나 있다. 도 16 및 17에서 알 수 있는 바와 같이, h13.2v1 VH 및 VL 쇄는 각각 ch13.2 VH 및 VL 쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 항원-결합 영역을 보유하였다. 추가로, VH 주쇄의 단지 하나의 잔기 및 VL 주쇄의 2개의 잔기는 항원-결합 영역 및 VH-VL 짝지음을 크게 변화시키는 위험을 감소시키기 위해 쥐의 것으로 유지시켰다 (도 16 및 17).
mAb13.2의 부분적 사람화는 사람 배선 유전자에 상응하는 아미노산이 지시된 주쇄 위치에서 치환되도록 (쥐) mAb13.2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시킴으로써 달성하였다. 도입될 각각의 아미노산 변화를 위해, CHO 세포에서의 발현에 최적화된 코돈을 사용하는 적합한 뉴클레오티드 치환이 고안되었다. VH의 사람화는 PCR 돌연변이 과정에 의해 수행하였으며, 여기서 동시에 하나 또는 2개의 아미노산에 대한 돌연변이를 삽입하는 올리고뉴클에오티드 프라이머를 쥐 주형 유전자 서열을 증폭시키는데 사용하였다. 수회 라운드의 PCR 돌연변이유발이 부분적 사람화를 달성하는데 필요하였다. VL의 사람화는 적합한 뉴클레오티드 치환으로 쥐 VL 서열에 상응하는 9개의 중첩되는 올리고뉴클레오티드의 패널을 사용하여 PCR로 수행하였다. 중첩 영역을 주형으로서 사용하였으며, PCR을 이용하여 센스 및 안티센스 쇄 상의 프라이머 사이의 갭을 충전하였다. 생성된 부분적으로 사람화된 항체를 h13.2v1으로 명명하였다. h13.2v1의 VL 및 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호 3 및 서열번호 7로 표시하였다.
실시예 3.2: 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)의 분리
도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, h13.2v1은 주쇄 영역에서 3개의 쥐 잔가를 보유하였다: VH 쇄에 하나 및 VL 쇄에 2개. 사람 IL-13을 갖는 mAb13.2 Fab의 공동결정 구조에 대한 예비적 작업 및 분석으로 모든 3개의 잔기가 사람의 것으로 돌연변이될 수 있음을 확인하였다. 이들은 VH 쇄에서는 3번 잔기 (마우스에서는 K, 사람에서는 Q), VL 쇄에서는 4번 잔기 (마우스에서는 L, 사람에서는 M) 및 VL 쇄에서의 72번 잔기 (배선에서는 68번 잔기; 마우스에서는 R, 사람에서는 G)였다. 따라서, mAb13.2, h13.2v2의 완전히 사람화된 버젼을 생성하기 위해, PCR 돌연변이유발을 이용하여 h13.2v1의 VH 쇄에 돌연변이 K3Q 및 h13.2v1의 VL 쇄에 돌 연변이 L4M 및 R72G를 도입하였다. h13.2v2의 최종 VH 및 VL 서열이 각각 도 17 및 도 18에 나타나 있다. h13.2v2의 VL 및 VH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 4 및 서열번호 8로 표시된다.
(선형 번호매김 계획을 이용하는) 도 29에 나타난 서열에 따라, IL-13과 수소 결합 접촉하는 mAb13.2 중쇄의 주요 잔기가 ER50 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR101 (CDR3) 및 TYR102 (CDR3)임을 확인하였다. 또한, IL-13과 반데르발스 접촉하는 mAb13.2 중쇄의 주요 잔기가 ILE30 (CDR1), SER31 (CDR1), ALA33 (CDR1), TRP47, SER50 (CDR2), SER52 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR58 (CDR2), LEU98 (CDR3), ASP99 (CDR3), GLY100 (CDR3), TYR101 (CDR3), TYR102 (CDR3) 및 PHE103 (CDR3) (선형 번호매김 계획을 이용하는 도 29에 기초함)이다.
(선형 번호매김 계획을 이용하는) 도 30에 나타난 서열에 따라, IL-13과 수소 결합 접촉하는 mAb13.2 경쇄의 주요 잔기가 ASN31 (CDR1), TYR32 (CDR1), LYS34 (CDR1), ASN96 (CDR3) 및 ASP98 (CDR3)임을 확인하였다. 또한, IL-13과 반데르발스 접촉을 만드는 mAb13.2 경쇄의 주요 잔기는 ASN31 (CDR1), TYR32 (CDR1), LYS34 (CDR1), ARG54 (CDR2), ASN96 (CDR3), ASP98 (CDR3) 및 TRP100 (CDR3) (선형 번호매김 계획을 이용하는 도 30에 기초함)이다.
실시예 3.3: IL-13에 대한 완전한 결합 활성을 보유하는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)
완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)가 IL-13-FLAG에 대한 결합에 대해 바이 오티닐화된 mAb13.2와 경쟁하는 능력을 실시예 2에 기술된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. mAb13.2의 키메릭 (ch13.2), 부분적으로 사람화된 (h13.2v1) 및 완전히 사람화된 버젼은 유사한 정도로 FLAG-사람 IL-13에 결합하도록 바이오티닐화된 mAb13.2와 경쟁할 수 있다는 것이 확인되었다 (도 19A). 또한, BIACORE 분석으로 IL-13이 고정화된 h13.2v2에 신속히 결합하고 느리게 해리한다는 것을 확인하였다 (도 19B).
실시예 3.4: IL-13-관련 활성을 시험관 내에서 중화하는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)
또한, mAb13.2의 키메릭 (ch13.2), 부분적으로 사람화된 (h13.2v1) 및 완전히 사람화된 (h13.2v2) 버젼이 사람 단구에 의한 CD23의 IL-13-중재된 세포 표면 발현을 억제하고 HT-29 세포에서 IL-13-유도된 STAT6 인산화를 감소시키는 능력을 실시예 1.3에서 기술된 바와 같이 유세포측정 분석으로 측정하였다. 간단히 설명하며, 사람 말초혈액 단구를 증가하는 농도의 ch13.2, h13.2v1 또는 h13.2v2의 존재하에서 준최적 농도의 재조합 사람 IL-13과 함께 밤새 배양하였다. 단구를 게이팅하고, IL-13 반응성의 표시로써 CD23 발현에 대해 검정하였다. 유세포측정 분석으로 mAb13.2의 모든 3개의 버젼, 즉 ch13.2, h13.2v1 및 h13.2v2이 용량 의존적 방식으로 단구에 의한 IL-13-중재된 CD23 발현을 경감시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (도 20A).
STAT6 인산화를 시험하기 위해서, HT-29 사람 상피 세포주를 준최적 농도의 재조합 사람 IL-13 및 증가하는 농도의 ch13.2, h13.2v1 또는 h13.2v2와 함께 37 ℃에서 30분 동안 배양한 후, 인산화된 STAT6에 대한 ALEXATM Fluor 488-표지된 모노클로날 항체를 사용하여 인산화된 STAT6 발현에 대해 검정하였다. 유세포측정 분석으로 mAb13.2의 모든 3개의 버젼, 즉 ch13.2, h13.2v1 및 h13.2v2이 IL-13-중재된 STAT6 인산화를 경감시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (도 20B).
h13.2v2는 시험관 내에서 재조합 IL-13-관련된 활성 및 천연 사람 IL-13-관련된 활성을 억제할 수 있었기 때문에(도 21), 동물 모델에서 IL-13-관련된 장애를 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 호흡 질환을 갖는 비사람 영장류 (NHP) 및 양 모델에서 완전히 사람화된 mAb13.2인 h13.2v2를 시험하기 위한 준비에서, 시노몰거스 원숭이 또는 양으로부터 재조합 IL-13을 중화하는 항체의 능력을 검정하였다. IL-13은 시노몰거스 원숭이 또는 양으로부터 클로닝하였다. NHP IL-13을 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하여, 재조합 사람 IL-13을 위해 재폴딩하였다. 이와는 대조적으로, 재조합 양 IL-13을 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현하였다. mAb13.2 또는 h13.2v2가 IL-13의 재조합 시노몰거스 원숭이 형태 또는 IL-13의 재조합 양의 형태와 관련된 하나 이상의 활성을 억제하는 능력을 시험관 내에서 시험하였다. 도 22는 h13.2v2가 시노몰거스 원숭이 NHP IL-13의 능력을 강하게 중화시켜 사람 단구에 의한 CD23의 세포 표면 발현을 유도하였다는 것을 입증한다. 그러나, h13.2v2는, 양 IL-13-관련된 활성의 중화에 매우 높은 농도의 항체가 필요하였기 때문에, 단지 약하게 양 IL-13을 중화하였다 (도 22).
실시예 3.5: 천식 양 모델에서 IL-13의 활성을 중화하는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)
IL-13의 양의 형태의 생물학적 활성을 중화하는데 있어서의 이의 낮은 효력에도 불구하고, h13.2v2을 회충-유도된 기도 과반응성에 대한 양 모델에서 효능에 대해 시험하였다. 양을 회충 기생충인 돼지회충에 자연 노출시켜 감작화시켰다. 회충 항원으로 폐를 챌린지하는 경우, 동물은 항원 챌린지에 대해 천식 환자인 사람의 반응과 유사하게 기관지수축을 겪는다. 반응은 즉각적 반응에 이어지는 챌린지한 지 4 내지 5시간 후에 개시하는 후기 반응으로 구성된다. 초기 반응은 평활근 반응으로 생각되며, 후기 반응은 염증 반응이다.
h13.2v2가 회충-유도된 기관지수축을 감소시키는 능력을 시험하기 위해, 양에게 정맥 내 주입으로 20 mg/kg, 5 mg/kg 또는 2 mg/kg의 항체를 투여하였다. 주입한 지 24시간 후, 동물을 돼지회충 항원으로 기관내 챌린지하였다. 그 결과, 20 mg/kg 또는 5 mg/kg의 h13.2v2가 항원에 대한 후기 반응을 경감시켰다 (도 23). 2 mg/kg의 h13.2v2는, 아마도 양 IL-13에 대한 h13.2v2의 약한 중화 활성 때문에, 대조군에 필적하게 항원 반응에 대해 유의하지 않은 효과를 나타내었다.
또한, 콜린작동성 효능제(agonist)인 카바콜을 사용한 기도 챌린지에 의해 유도된 기도 과반응성을 감소시키는 h13.2v2의 능력을 양에서 시험하였다. 카바콜은, 강압 호기량(forced expiratory volume; FEV)의 감소로 측정되는 바와 같이 기관지수축을 유도하며, 지정된 크기의 반응 (PC400)을 유도하는데 필요한 자극의 양이 통상적으로 건강한 환자에 대한 것보다 천식 환자에 대해 낮다. 양은 비처리되거나 카바콜-흡입 챌린지하기 24시간 전에 정맥 내로 20 mg/kg, 5 mg/kg 또는 2 mg/kg의 h13.2v2를 투여하고, 돼지회충으로 챌린지하기 전 및 후에 양에서 PC400을 측정하였다. 그 결과는 20 mg/kg 또는 5 mg/kg의 h13.2v2가 돼지회충을 사용한 챌린지에 의해 유도되는 PC400의 감소를 방지하였음을 입증한다 (도 24). 항원 반응 실험의 결과와 유사하게, 2 mg/kg의 h13.2v2가 대조군과 필적하게 PC400에 유의하지 않은 효과를 나타내었다.
실시예 3.6: 천식의 비사람 영장류 모델에서 IL-13의 활성을 중화하는 완전히 사람화된 mAb13.2 (h13.2v2)
h13.2v2가 비사람 영장류에서 회충-유도된 폐렴을 방지하는 능력을 시험하기 위해, 대조군 시노몰거스 원숭이를 (양성 대조군으로) 염수, 8 mg/kg 비관련 사람 IgG (IVIG) 또는 2 mg/kg 덱사메타손으로 근육 내 처리하였다. 시험 시노몰거스 원숭이에 10 mg/kg h13.2v2를 정맥 내 투여하였다. 다음날, 챌린지되지 않은 BAL 샘플을 좌측 폐로부터 수집하고, 동물의 우측 폐를 돼지회충 항원으로 기관내로 챌린지하였다. 챌린지한 지 24시간 후, BAL 샘플을 우측 폐로부터 수집하고, 세포 침윤물에 대해 검정하였다. 그 결과, h13.2v2로 동물을 전처리함으로써 돼지회충 항원에 의해 유도되는 기도 염증이 방지되는 것으로 나타났다 (도 25). 병행 실험에서, 회충을 챌린지한 후 IL-5 및 에오탁신을 BAL에 유도하였다. h13.2v2로 동물을 전처리함으로써 IL-5 및 에오탁신 모두의 유도 수준을 감소시켰다.
돼지회충에 감작화된 비사람 영장류에서는 회충 항원에 대해 IgE가 발생하였 다. 이러한 IgE는 순환하는 호염구 상의 FcεRI에 결합하므로, 회충 항원을 사용한 말초혈액 호염구의 시험관 내 챌린지에 의해 탈과립화 및 히스타민 방출을 유도한다. 반복된 항원 노출은 호염구 감작화를 부스팅하여, 히스타민 방출 반응을 증진시킨다. 이러한 과정에 대한 h13.2v2의 효과를 시험하기 위해, 기술된 바와 같이 h13.2v2 또는 염수 또는 IVIG 대조군이 투여된 시노몰거스 원숭이를 회충으로 챌린지한 지 8주 후에 채혈하고, 혈장 중 총 IgE 및 회충-특이적 IgE의 수준을 ELISA로 측정하였다. 회충-특이적 IgE의 수준은 염수 또는 IVIG로 처리된 대조군 동물에서 챌린지한 지 8주 후에 증가하였다 (도 31B). 이와는 대조적으로, h13.2v2로 처리된 동물은 회충에 대해 특이적인 순환 IgE의 수준에 있어 상당한 감소를 나타내었다 (도 31A). 어떠한 처리 그룹에 대해서도 총 IgE 역가에는 유의한 변화가 없었다.
호염구 히스타민 방출에 대한 효과를 평가하기 위해서, 회충을 챌린지한 지 24시간, 8주 및 4개월 후에 동물로부터 채혈하였다. 전혈을 37 ℃에서 30분 동안 회충 항원으로 챌린지하고, 상등액 중으로 방출된 히스타민을 ELISA (Beckman Coulter, Fullerton, Calif.)로 정량하였다. 도 32A에 나타나 바와 같이, 이들 감작화된 동물은 부분적인 항원 챌린지 전에도 어느 정도의 회충-유도된 호염구 히스타민 방출을 나타내었다. 챌린지 후, 대조군 동물은 호염구 반응성에 있어 예측된 증가를 보였다. 이와는 대조적으로, h13.2v2으로 처리된 동물은 호염구 감작화에 있어 이러한 증가가 나타나지 않았으므로, 챌린지한 지 2 내지 4개월 후 회충에 대한 시험관 내 히스타민 방출 반응이 상당히 낮았다 (도 32B). 따라서, h13.2v2의 단독 투여는 이러한 모델에서 장기간의 질환-변형 활성을 가졌다.
실시예 4: 다양한 사람 배선 유전자에 기초한 mAb13 .2의 사람화
실시예 3은 DP-54 및 DPK9 배선 유전자에 기초하여 mAb13.2을 사람화하는 방법 및 그 결과를 제공하였으며, 본 실시예에서는 다른 배선 유전자에 기초한 mAb13.2의 사람화를 간단히 설명한다.
쥐 항체 가변 영역의 실제 아미노산 서열에 대해 높은 상동성, 즉 서열 유사성을 갖는 사람 배선 항체 서열 또는 이의 서브그룹의 분석에 기초하여, 사람화 계획이 고안되었다. 예를 들어, V-BASE의 VH 그룹 3은 mAb13.2에 대해 높은 서열 유사성을 나타내었다. mAb13.2의 중쇄 가변 영역의 CDR을 VH 그룹 3 내의 배선 유전자의 서브그룹 즉, 3-53 (DP-42), 3-48 (DP-51), 3-09 (DP-31), 3-13 (DP-48), 3-15 (DP-38), 3-20 (DP-32), 3-21 (DP-77), 3-23 (DP-47), 3-30 및 3-30.5 (DP-49), 3-64 (DP-45), 3-66 (DP-86), 및 3-73 (YAC-9) (도 26) 중 하나에 전달할 수 있는 것으로 결정되었다. mAb13.2을 사람화하는데 사용될 수 있는 DP-61에 대한 서열이 도 26에 나타나 있다. 하기의 일반적인 아미노산 치환을 mAb13.2에 도입하여 이의 VH 주쇄를 제안된 사람 배선 주쇄 K3Q, K13Q 또는 K13R, K19R, T40A, E42G, R44G, R75K, I77S or I77T, S83N, S87A 또는 S87D, M92V 또는 M92L, 및 T113L으로 전환할 수 있는 가를 결정하였다. 또한, 특정 배선 유전자에 기초하여 사람화하기 위한 개별적 아미노산 치환을 고안하였다. 예를 들어, DP-487에 기초하는 사람화는 V5L, A49S 및 A74S의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있고; DP-42에 기초하는 사람화 는 V12I, A49S 및 A74S의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-51에 기초하는 사람화는 A49S의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-48에 기초하는 사람화는 P41T, D72E 및 E88G의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-53에 기초하는 사람화는 E46V 및 A49S의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-32에 기초하는 사람화는 L11V, A49S 및 Y94H의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-38에 기초하는 사람화는 A49G, A74D, R75S, N76K, R86K 및 S87T의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-31에 기초하는 사람화는 G16R, A49S 및 R97K의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-61에 기초하는 사람화는 W47Y, A49S, A74S 및 T90M의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있으며; DP-45에 기초하는 사람화는 E6Q, A24G, A49S 및 T90M의 추가의 돌연변이를 수반할 수 있다. 예를 들어, mAb13.2의 사람화가 79% 서열 동일성을 갖는 사람 배선 DP-47에 기초하는 경우, 하기 돌연변이가 mAb13.2로 도입될 수 있다: K3Q, V5L, K13Q, K19R, T40A, E42G, R44G, A49S, A74S, R75K, I77T, S83N, S87A, M92V 및 T113L. 특정 사람 배선 유전자에 기초하여 단독으로 또는 개별적 아미노산 치환을 조합하여 공통적 아미노산 치환을 사람화 동안 mAb13.2로 도입하면, 활성 항체가 생성된다. 예를 들어, 후술되는 바와 같이 mAb13.2의 사람화가 3-21 (DP-77)에 기초하는 경우, 활성 항체 h13.2v3가 생성된다.
mAb13.2의 대안적 사람화는 배선 유전자 DP-77 및 B1에 기초하였다. DP-77의 예측된 아미노산 서열, ch13.2의 가변 중쇄 아미노산 서열 및 완전히 사람화된 mAb13.2 항체(h13.2v3)의 중쇄 아미노산 서열 사이의 정렬이 도 27에 나타나 있다. B1의 예측된 아미노산 서열, Ch13.2의 가변 경쇄 아미노산 서열 및 h13.2v3의 가변 경쇄 아미노산 서열 사이의 정렬이 도 28에 나타나 있다. DP-77 및 B1의 예측된 아미노산 서열은 mAb13.2의 가변 중쇄와는 80.4%의 아미노산 동일성, mAb13.2의 가변 경쇄와는 77.5% 아미노산 동일성을 나타내었다. DP-77과 mAb13.2의 중쇄(및 ch13.2의 중쇄) 사이의 아미노산 차이 및 B1과 mAb13.2의 경쇄(및 ch13.2의 경쇄) 사이의 아미노산 차이가 주쇄 및 상보성 결정 영역 모두에서 나타나지만, CDR에서의 차이는 변화되지 않았다. 이와는 대조적으로, 중쇄 mAb13.2의 주쇄에서 나타나는 아미노산이 DP-77의 동일 위치에 있는 아미노산과 상이한 경우, mAb13.2의 가변 중쇄 영역의 아미노산을 DP-77에 있는 아미노산으로 변화시켰다. 유사하게, mAb13.2의 경쇄의 주쇄에서 나타나는 아미노산이 B1에서의 동일 위치에 있는 아미노산과 다른 경우, mAb13.2의 가변 경쇄의 아미노산을 B1의 아미노산으로 변화시켰다. 상술된 바와 같이, 2회 라운드의 PCR 돌연변이유발로 변화를 도입하였다. 중쇄 및 경쇄에서 제1 라운드의 변화 후, 실시예 2에 기술된 바와 같이, ELISA를 수행하여, 변화에 의해 항체가 IL-13에 결합하는 능력에 영향이 없었음을 확인하였다. 제2 라운드의 변화 후, mAb13.2의 중쇄 및 경쇄의 주쇄 영역의 아미노산 서열은 각각 DP-77 및 B1의 주쇄의 아미노산 서열과 동일하였다.
또한, 사람화된 mAb13.2 항체인 h13.2v3는 시험관 내에서 IL-13-관련된 활성을 억제할 수 있었다. h13.2v3를 ELISA 및 TF1 증식 검정으로 시험하여, 하나 이상의 IL-13-관련 활성을 억제하고 결합하는 능력을 측정하였다. h13.2v3는, ch13.2 및 h13.2v1와 비교하여, IL-13에 결합하는데 있어 mAb13.2와 유사하게 경쟁 할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, h13.2v3는 mAb 13.2 및 h13.2v 1와 동일한 정도로 TF1 증식을 억제할 수 있었다.
실시예 5: h13 .2 v2 의 야생형 Fc 복귀돌연변이체에 의해 중재되는 이펙터 활성
IL-13Rα1 및 IL-4Rα 폴리펩티드를 포함하는 IL-13 수용체의 세포 시그널화 형태가 사이토킨에 대해 반응하는 세포 유형의 표면에서 나타난다. IL-13Rα2는 통상적으로 IL-13-반응적 세포의 표면에서 발현되지 않으나, 뇌, 머리 및 목의 종양에서는 보고되었다 (Kawakami et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:6381-8; Mintz et al. (2002) Neoplasia 4:388-99; Liu et al. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49:319-24). 또한, IL-13Rα2 발현은 IFNγ-처리된 일차 사람 단구 (Daines et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:10387-93) 또는 TNFα- 또는 IL-13-처리된 일차 사람 섬유모세포 (Yoshikawa et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 312:1248-55)에서 유도될 수 있다. 이러한 수용체는 IL-13에 대한 시그널화 반응을 중재하는데 있어 경쟁적이지 않으나 (Kawakami et al. (2001) Blood 97:2673-9), 데코이(decoy) 수용체로서 작용하여 IL-13Rα1와의 생산적 IL-13의 상호작용에 대해 경쟁하는 것으로 보인다 (Feng et al. (1998) Lab. Invest. 78:591-602), IL-13Rα2 는 IL-13에 대해 고친화성을 가지며 (Andrews et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:46073-8), 사이토킨의 C-말단 영역과 주로 상호작용하는 것으로 보이며 (Madhankumar et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:43194-205), h13.2v2 결합 부위를 포함하는 것으로 예측되지는 않는다. 따라서, h13.2v2이 세포 표면 상의 IL-13Rα2에 의해 포획되는 IL-13과 반응하는지를 조사하였다. A375는 IL-13Rα2를 발현하는 사람 흑색종 세포주이다. 재조합 사람 IL-13 (3 ng/ml)을 20분 동안 4 ℃에서 이들 세포와 접촉시켰다. 세포를 세척하고 바이오티닐화된 h13.2v2의 결합에 대해 시험하였다. 그 결과, IL-13의 존재 하에서 이들 세포에 항체가 용량-의존적으로 결합하였으며, 이는 h13.2v2가 이의 수용체에 결합된 IL-13에 결합된다는 것을 나타낸다 (도 33).
h13.2v2가 Fc-의존적 이펙터 기능을 촉진할 수 있는지를 측정하기 위해, h13.2v2의 돌연변이된 Fc 잔기 (L234A/G237A; 서열번호 17의 잔기 116 및 119)를 야생형으로 복귀돌연변이시키고, 야생형 또는 돌연변이된 Fc를 발현하는 항체를 발현시켜 정제하였다. 이펙터 작용을 표적물로서 IL-13-로딩된 A375 세포를 사용하는 항체-의존적 세포의 세포독성 검정(ADCC)으로 시험하였다. A375 표적 세포를 크롬-51로 표지시키고, 10 ng/ml 재조합 사람 IL-13와 함께 배양하였다. ROSETTESEP® 사람 NK 농축 Cocktail (StemCell Technologies, Seattle, Wash.)로 처리하여 천연 킬러 (NK) 세포가 집적된 사람 PBMC를 이펙터로 사용하였다. 이펙터 및 표적 세포를 증가하는 농도의 h13.2v2 또는 야생형 Fc 복귀돌연변이체의 존재 하에서 37 ℃에서 5시간 동안 배양하였다. 세포독성을 상등액으로의 크롬-51의 방출로 측정하고, A375 표적 세포를 TRITON® X-100으로 용해시켜 측정되는 최대 방출율 (%)로서 나타내었다.
그 결과는 야생형 Fc 복귀돌연변이체가 IL-13-로딩된 A375 표적 세포의 ADCC를 중재할 수 있으나, h13.2v2는 중재하지 못함을 보여주고(도 34A). IL-13의 부재 하에서는 어떠한 세포독성도 관측되지 않았다 (도 34B). 3개의 상이한 공여체로부터의 이펙터 세포를 사용하여 유사한 결과가 나타났다. 이들 결과는, L234A 및 G237A Fc 돌연변이의 존재에 의해, 최적의 시험관 내 조건 하에서 조차도 h13.2v2가 ADCC를 중재할 수 없다는 것을 나타낸다.
종합하면, 이들 관측은 h13.2v2가 IL-13Rα2를 발현하는 세포에 결합할 수 있으나 (도 33), IL-13Rα1을 발현하는 세포에는 결합할 수 없다는 것을 나타낸다. h13.2v2 야생형 복귀돌연변이체가 검출가능한 결합의 부재하에서 조차도 IL-13Rα1-발현 HT-29 세포의 ADCC를 중재할 수 있는지를 시험하였다. HT-29 세포는 상술되는 바와 같이 수행되는 ADCC 검정에서 표적물로서 사용되었다. 그 결과, IL-13Rα2-발현 A375 세포의 세포용해를 이끄는 조건 하에서, IL-13Rα1-발현 HT-29 세포는 용해되지 않았다 (도 35). 이러한 결과는, L234A 및 G237A Fc 돌연변이를 포함하는 항체가 ADCC를 유도하지는 않으나, 야생형 Fc 이펙터 작용을 갖는 항체는 IL-13Rα2을 발현하는 특정 암의 치료에 유용할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 6: COS 세포에서 사람화된 13.2 항체의 발현
포유동물 재조합 시스템에서 사람화된 항-IL-13 항체의 발현을 평가하기 위해서, 마우스 13.2 (서열번호 9 및 서열번호 13), hu13.2 V1 (서열번호 11 및 서열번호 15) 및 hu13.2 V2 (서열번호 12 및 서열번호 16)의 가변 영역을 사람 카파 및 IgG1mut 불변 영역을 포함하는 pED6 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 원숭이 신장 COS-1 세포를 10%의 열-불활성화된 우태 혈청, 1 mM의 글루타민 및 0.1 mg/ml의 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DME 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 공급자에 의해 제시되는 프로토콜에 따라 TRANSITIT®-LT1 형질감염 시약 (Mirus Bio Corp., Madison, Wis.)을 사용하여 COS 세포의 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 COS 세포를 10% CO2의 존재 하에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양하고, 멸균 PBS로 세척한 후, 무혈청 배지 R1CD1 (Gibco)에서 48시간 동안 성장시켜 조건화된 배지에 항체를 분비하게 하고 이를 축적시켰다. 13.2 항체의 발현을 표준물로서 정제된 사람 IgG1/카파 항체를 사용하는 총 사람 IgG ELISA로 정량화하였다. 키메릭 13.2 항체 및 두가지 사람화된 버젼 모두 COS 세포에서 발현되었다.
COS 세포에서 사람화된 13.2 항체의 일시적 발현
N 작제물 발현
㎍/ml, 48시간
1 키메릭 13.2 14.5
2 부분적으로 사람화된 13.2(V1) 13.2
3 완전히 사람화된 13.2.2 (V2) 14.9
<110> WYETH <120> Antibodies against human interleukin-13 and uses therefor <130> 16158-048WO1 / AM101493-PCT <150> US 60/578,473 <151> 2004-06-09 <150> US 60/581,375 <151> 2004-06-22 <150> US 60/578,736 <151> 2004-06-09 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg 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Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partially humanized antibody heavy chain <400> 15 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> fully humanized antibody heavy chain <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> The "S" in position #1 represents amino acid residue #119 when the sequence follows residue #118 of, e.g., SEQ ID NOs:15 or 16. In this representation of the sequence, mutated amino acids are at residue #s 234 and 237 [instead of 116 and 119, respectively]. <220> <221> MISC_FEATURE <223> "S" at 1 (as shown) - L116A and G119A "S" at 119 -- L234A and G237A <220> <221> MUTAGEN <222> (116)..(116) <220> <221> MUTAGEN <222> (119)..(119) <400> 17 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> The "R" in position #1 represents amino acid residue #112 when the sequence follows residue #111 of, e.g., SEQ ID NOs:11 or 12. <400> 18 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 24-38 (linear) of, e.g., Figure 30. <400> 19 Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Lys Ser Leu Met His 1 5 10 15 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 54-60 (linear) of, e.g., Figure 30. <400> 20 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 93-101 (linear) of, e.g., Figure 30. <400> 21 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 30-35 (linear) of, e.g., Figure 29. <400> 22 Ile Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 50-65 (linear) of, e.g., Figure 29. <400> 23 Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 98-107 (linear) of, e.g., Figure 29. <400> 24 Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 24-38 (linear) of, e.g., Figure 30; also corresponds to SEQ ID NO:19. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 54-60 (linear) of, e.g., Figure 30; also corresponds to SEQ ID NO:20. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 93-101 of, e.g., Figure 30; also corresponds to SEQ ID NO:21. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 27 Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Asp Xaa Trp Xaa 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 30-35 of, e.g., Figure 29; also corresponds to SEQ ID NO:22. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 28 Ile Ser Xaa Ala Xaa Xaa 1 5 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 50-65 (linear) of, e.g., Figure 29; also corresponds to SEQ ID NO:23. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 29 Ser Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> minimum core CDR sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> This fragment corresponds to residues 98-107 (linear) of, e.g., Figure 29; also corresponds to SEQ ID NO:24. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 30 Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Arg Phe Asn 130 <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu 1 5 10 15 Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser 20 25 30 Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu 35 40 45 Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln 50 55 60 Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe 65 70 75 80 Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val 85 90 95 Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe 100 105 110 Asn <210> 33 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fully humanized antibody light chain <400> 33 gacatcgtgc tcactcagtc tccagcttct ttggctgtgt ctccagggca gagggccacc 60 ataacctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggagg ctaatgatac tgcaaactat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gagggaccaa ggtggaaata aaa 333 <210> 34 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fully humanized antibody heavy chain <400> 34 gaggtccagc tggtggagtc agggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctatacctg 240 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 35 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> fully humanized antibody light chain <400> 35 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> fully humanized antibody heavy chain <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Glu Trp Pro Ala Arg Leu Cys Gly Leu Trp Ala Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln 20 25 30 Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val 35 40 45 Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu 50 55 60 Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro 65 70 75 80 Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu 85 90 95 Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile 100 105 110 Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala 115 120 125 Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys 130 135 140 Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile 165 170 175 Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp 195 200 205 Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser 210 215 220 Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn 225 230 235 240 Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg 245 250 255 Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His 260 265 270 Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu 275 280 285 Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro 290 295 300 Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys 305 310 315 320 Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile 325 330 335 Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val 340 345 350 Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys 355 360 365 Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys Ile 370 375 380 Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys 385 390 395 400 Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val 405 410 415 Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln 420 425

Claims (46)

  1. 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance; SPR)으로 측정시 10-7 M 미만의 KD로 IL-13에 결합하는, 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는, 정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    (a) 상기 경쇄 면역글로불린 가변 도메인이
    (i) CDR1에 KASESVDNYGKSLMH (서열번호 19),
    (ii) CDR2에 RASNLES (서열번호 20) 및
    (iii) CDR3에 QQSNEDPWT (서열번호 21)의 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) 상기 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이
    (i) CDR1에 SYAMS (서열번호 22),
    (ii) CDR2에 SISSGGNTYYPDSVKG (서열번호 23), 및
    (iii) CDR3에 LDGYYFGFAY (서열번호 24)의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 경쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 11, 12 또는 35의 잔기 ASN31 (CDR1), TYR32 (CDR1), LYS34 (CDR1), ARG54 (CDR2), ASN96 (CDR3), ASP98 (CDR3) 및 TRP100 (CDR3)에서 IL-13과 접촉하고,
    상기 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 15, 16 또는 36의 잔기 ILE30, SER31 (CDR1), ALA33 (CDR1), TRP47, SER50 (CDR2), SER52 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR58 (CDR2), LEU98 (CDR3), ASP99 (CDR3), GLY100 (CDR3), TYR101 (CDR3), TYR102 (CDR3) 및 PHE103 (CDR3)에서 IL-13과 접촉하는, 정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, Fab 또는 scFv인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 사람 주쇄 영역, 사람 Fc 영역 또는 둘 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 7, 8 또는 34의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 경쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 3, 4 또는 33의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 15, 16 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 경쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 11, 12 또는 35의는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 15, 16 또는 36의 아미노산 잔기 SER50 (CDR2), SER53 (CDR2), TYR101 (CDR3) 및 TYR102 (CDR3)에서 IL-13과 수소 결합으로 접촉하고; 경쇄 면역글로불린 가변 도메인이 서열번호 11, 12 또는 35의 아미노산 잔기 ASN31 (CDR1), TYR32 (CDR1), LYS34 (CDR1), ASN96 (CDR3) 및 ASP98 (CDR3)에서 IL-13과 수소 결합으로 접촉하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 서열번호 32의 잔기 GLU49, ASN53, GLY69, PRO72, HIS73, LYS74 및 ARG86에서 IL-13과 접촉하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 측정시 90 내지 120 pM의 KD로 사람 IL-13에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 측정시 5 x 104 내지 8 x 105 M-1s-1의 kon 으로 사람 IL-13에 결합하고 1 x 10-4 s-1 미만의 koff로 사람 IL-13에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 32의 49번 위치의 글루타메이트, 53번 위치의 아스파라긴, 69번 위치의 글리신, 72번 위치의 프롤린, 73번 위치의 히스티딘, 74번 위치의 리신 및 86번 위치의 아르기닌의 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함하는 사람 IL-13의 에피토프 또는 이의 보존적 아미노산 치환체에 특이적으로 결합하며;
    (b) IL-13와 IL13Rα1의 복합체에 결합하며;
    (c) IL-13와 IL-4Rα 사이의 결합 작용을 방해하며;
    (d) IL-13/IL-13Rα1와 IL-4Rα 사이의 결합 작용을 방해하며;
    (e) 사람 IL-13에 특이적으로 결합하고, mAb13.2, ch13.2, h13.2v1, h13.2v2 또는 h13.2v3 중에서 선택되는 제2 항체의 상기 사람 IL-13에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하며;
    (f) 말초혈 단핵구에서 저친화성 IgE 수용체 (CD23)의 세포 표면 발현을 감소키기며;
    (g) 배양된 B 세포에서 IL-13-매개된 IgE 이소타입 전환을 감소시키며;
    (h) STAT6의 IL-13-의존적 인산화를 유도하며;
    (i) 항원-유도된 기도 염증을 갖는 시노몰거스 원숭이에서 호산구 유입을 중화시키는 특징 중 하나 이상을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 서열번호 12를 포함하는 경쇄 및 서열번호 16을 포함하는 중쇄인 2개의 면역글로불린 쇄를 포함하는 분리된 재조합 IgG 항체.
  17. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 또는 정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 갖는 항체.
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  25. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, IL-13 관련된 천식 장애 또는 알레르겐에 의해 매개된 IL-13 관련된 호산구증가증을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 피하, 흡입 또는 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  27. (i) CDR1에 SYAMS (서열번호 22),
    (ii) CDR2에 SISSGGNTYYPDSVKG (서열번호 23), 및
    (iii) CDR3에 LDGYYFGFAY (서열번호 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 서열번호 15, 16 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 7, 8 또는 34의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  29. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 시험관내 숙주 세포.
  30. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 상기 세포를 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 발현되는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함하여, 재조합 항체를 제공하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 숙주 세포 또는 숙주 세포가 유지되는 배지로부터 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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  41. (i) 시험관내 샘플을 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 샘플 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 샘플 중 복합체의 형성이 샘플 중 IL-13의 존재를 나타내는 것인, 시험관내 샘플 중 IL-13의 존재를 검출하는 방법.
  42. 삭제
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  44. (i) CDR1에 KASESVDNYGKSLMH (서열번호 19),
    (ii) CDR2에 RASNLES (서열번호 20) 및
    (iii) CDR3에 QQSNEDPWT (서열번호 21)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  45. 제44항에 있어서, 서열번호 11, 12 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 3, 4 또는 33의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  46. 제27항, 제28항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
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