TWI391133B - 拮抗人體白介素-１３之抗體及彼之用途 - Google Patents

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TWI391133B TW094119110A TW94119110A TWI391133B TW I391133 B TWI391133 B TW I391133B TW 094119110 A TW094119110 A TW 094119110A TW 94119110 A TW94119110 A TW 94119110A TW I391133 B TWI391133 B TW I391133B
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Description

拮抗人體白介素－13之抗體及彼之用途 相關申請案之交互參考資料
本申請案主張於2004年6月9日提出之美國專利申請案序號第USSN 60/578,473號和2004年6月22日提出之USSN 60/581,375號，以及2004年6月9日提出之USSN 60/578,736號的優先權。其全部內容併為此文之參考資料。
本申請案關於結合白介素－13(IL－13)，尤其是人類IL－13之抗體(如：人類化之抗體)及其抗原結合片段，以及其於調節由IL－13傳介之免疫反應上的用途。此文中所揭示之抗體可用來診斷、預防及/或治療個體，如：人類患者體內一或多種與IL－13相關之病症，如：呼吸病症(如：氣喘)；特應性病症(如：過敏性鼻炎)；皮膚之發炎及/或自體免疫病況(如：異位性皮膚炎)，胃腸道器官之發炎及/或自體免疫病況(如：發炎性腸病(IBD))，以及纖維變性和癌症。
白介素－13(IL－13)為一種由T淋巴球和肥大細胞分泌的細胞活素(McKenzie et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：3735－39；Bost et al.(1996)lmmunology 87：663－41)。IL－13與IL－4共有數種生物反應。例如，IL－4或IL－13引起B細胞中IgE同種異構型之轉換(Tomkinson et al.(2001)J.Immunol. 166：5792－5800)。再者，在氣喘患者中曾有細胞表面CD23和血清CD23(sCD23)之水準增加的報告(Sanchez－Guererro et al.(1994)Allergy 49：587－92；DiLorenzo et al.(1999)Allergy Asthma Proc. 20：119－25)。另外，IL－4或IL－13可正調節B細胞和單核細胞上之第Ⅱ類MHC和低親和力IgE受體(CD23)之表抗，如此可增加抗原呈現，並調節巨噬細胞之功能(Tomkinson，等人，如上述)。重要地，IL－4或IL－13其中之一可增加內皮細胞上之VCAM－1的表現，此點可協助嗜伊紅細胞(及T細胞)優先補充至氣道組織(Tomkinson，等人，如上述)。IL－4或IL－13其中之一亦可增加氣道黏液之分泌，此點可惡化氣道之易感性(Tomkinson，等人，如上述)。這些觀察提出：雖然IL－13對誘導Th2之發展並非必要的，或者，其可誘導Th2發展，但IL－13在氣道嗜伊紅血球增多症和AHR之發展中可能扮演著關鍵角色。
本申請案特別提供以高親和力和特異性結合白介素－13("IL－13")，尤其是人類IL－13之IL－13拮抗劑，如：抗體及其抗原結合片段。本揭示內容之抗體及其抗原結合片段在此文中亦分別稱為"抗－IL－13抗體"和"其片段"。在一種實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段降低、中和，及/或拮抗至少一種與IL－13相關之活性。例如，抗－IL－13抗體或其片段可結合IL－13，如：IL－13之抗原決定部位，並干擾IL－13與IL－13受體複合物("IL－13R")(如：含有IL－13受體1("IL－13R1"))和干擾素－4受體α鏈("IL－4R1")或其次單位(如：IL－13R1或IL－4R之個別次單位)的複合物)間之交互作用(如：結合)。因此，此文所描述之抗體及其片段可用來干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13與IL－13受體之複合物，或其次單位間之交互作用(如：結合)，以藉此干擾功能性傳訊複合物之形成。
另外，本申請者已證明投服中和性抗－IL－13抗體可改善，尤其是，由抗原引起之肺部發炎，如：分別在非人類靈長類和綿羊體內之嗜伊紅血球增多症和支氣管縮小。因此，IL－13拮抗劑，如：中和性抗－IL－13抗體及其片段，可在活體內改善至少一種與IL－13相關之活性，如：發炎病況(如：肺部發炎)。另外，中和性抗－IL－13抗體及其片段，可用來改善從特應性患者分離出之細胞對IL－13之增強的敏感性，如：用於治療季節性過敏(如：過敏性鼻炎)。因此，此文所描述之抗－IL－13抗體或其片段可用來診斷、治療及/或預防個體(如：人類患者)內－或多種與IL－13相關之病症，如：呼吸病症(如：氣喘，包括過敏性和非過敏性氣喘，慢性梗阻性肺病(COPD))，以及涉及氣道發炎之病況、嗜伊紅血球增多症、纖維變性和黏液生成過量(如：囊性纖維變性和肺部纖維變性)；特應性病症(如：過敏性鼻炎)；皮膚(如：異位性皮膚炎)、胃腸道器官(如：發炎性腸病(IBD))、肝臟(如：硬化)之發炎及/或自體免疫病況；病毒感染；硬皮病和其它器官之纖維變性，諸如：肝臟纖維變性。
因此，在一種觀點中，本申請案描述與IL－13，尤其是哺乳動物IL－13(如：人類、綿羊、非人類靈長類IL－13)交互作用，如：結合及/或中和性IL－13拮抗劑，如：分離出之抗體或其抗原結合片段的特性。在一種實施態樣中，該抗體或其片段為一種中和性抗體，如：其降低及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性，包括，但不限於：誘導CD23表現：由人類B細胞產製IgE；轉錄因子，如：STAT蛋白質(如：STAT6蛋白質)之磷酸化；活體內由抗原引起之嗜伊紅血球增多症；活體內由抗原引起之支氣管縮小；或者，活體內由藥物引起之氣道反應過敏等。
此文所描述之IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可以高親和力結合IL－13，如：以少於10－ 7 M之Kd值結合IL－13，宜為10－ 8 M、10－ 9 M、10－ 1 0 M，更合適的為10－ 1 1 M，或更佳者。例如：抗－IL－13抗體或其片段可以介於50和500pM間(如：介於90和120pM間，如：介於95和105pM間)之親和力結合IL－13。在其它實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段可以至少約50nM至5pM(通常約100至250pM或更強)之IC5 0 中和一或多種與IL－13相關之活性。在其它實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段以在103 至107 M－ 1 s－ 1 (通常為104 至106 M－ 1 s－ 1 )之範圍內的動力值與IL－13結合。例如：抗－IL－13抗體或其片段以在5×104 至8×106 M－ 1 s－ 1 之範圍內的動力值與IL－13結合。而在另一種實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段之分離動力值在10－ 2 至10－ 6 s－ 1 (通常為10－ 3 至10－ 6 s－ 1 ，如：較5×10－ 5 s－ 1 為慢，如：9，8，6×10－ 5 s－ 1 )之範圍內的。在一種實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段以類似於單株抗體13.2("mAb 13.2")，或其修改型，如：嵌合型(如："ch 13.2")，或其人類化之形式(如："h13.2v1"、"h13.2v2"或"h13.2v3")之親和力及/或動力值結合IL－13。抗－IL－13抗體或其片段之親和力和結合動力可利用，如：生物感應器技術(拜爾可(Biacore))測試(見下列實例1.2)。
在一種實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段(如：Fab、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv片段)為一種單株抗體或具單一特異性之抗體。該抗體或其片段亦可為人類、人類化的、嵌合的，或在玻管中產生之抗體。在一種實施態樣中，抗－IL－13抗體或其片段為人類化的抗體。
抗－IL－13抗體之重和輕鏈可為全長(如：一抗體可包括至少一，宜為二種完整之重鏈，及至少一，宜為二種完整之輕鏈)，或可包括一抗原結合片段(如：Fab、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv片段)。而在其它實施態樣中，該抗體具有一選自，如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE之重鏈恆定區，尤其是選自，如：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4者，更特別的是IgG1(如：人類IgG1)。在另一實施態樣中，該抗體具有一選自，如：κ或λ，尤其是κ(如：人類κ)的輕鏈恆定區。在一種實施態樣中，該恆定區係經過改變，如：突變，以修改該抗體之性質(如：增加或減少下列之一或多項：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基之數目、效應子細胞功能或補體功能)。例如：人類IgG1恆定區可在一或多個殘基上發生突變，如：SEQ ID NO：17之一或多個殘基234和237，如：當位置1之絲胺酸移為第119號殘基(接著，如：VH鏈之118個胺基酸)時為殘基234和237；如SEQ ID NO：17中所示，當絲胺酸在位置1處時，這些相同殘基為第116和119號殘基。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體含有如SEQ ID NO：17所示之人類IgG1恆定區。在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體含有如SEQ ID NO：18所示之人類κ序列。
在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段特異結合IL－13，尤其是哺乳動物，如：非人類靈長類、綿羊、人類IL－13(如：具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的人類IL－13(第11圖)，或SEQ ID NO：31之從約胺基酸21至132的成熟人類IL－13序列(第11圖)(成熟人類IL－13序列之編號亦見於SEQ ID NO：32)或與其具有至少85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列)。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段結合人類IL－13之變異體，如：在SEQ ID NO：31之位置處以麩胺酸(Q)取代精胺酸(R)之人類IL－13的變異體(第11圖)。在其它實施態樣中，該抗體或其片段特異結合IL－13之片段，如：具有SEQ ID NO：31中所列之胺基酸序列的至少10、20、50、75、100、120或130個連續胺基酸的片段，或與其具有至少85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段特異結合人類IL－13，但不會與來自非人類物種之IL－13交叉反應。在其它實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段結合二或更多種形式之哺乳動物IL－13，如：人類、綿羊及/或非人類靈長類IL－13。
在一種實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段特異結合IL－13(如：尤其是，哺乳動物，如：人類IL－13)之一種抗原決定部位，如：線性或構造性抗原決定部位。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段結合包含人類IL－13之殘基81－93及/或114－132的抗原決定部位(SEQ ID NO：31)，或其經過修改之形式(如：其片段或經取代(如：經保留性取代)之形式)。在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段特異結合含有一或多種下列胺基酸殘基或其保留性胺基酸取代之人類IL－13的抗原決定部位：在SEQ ID NO：31之位置68[48]處的麩胺酸、在位置72[52]處之天門冬醯胺、在位置88[68]處之甘胺酸、在位置91[71]處之脯胺酸、在位置92[72]處之組胺酸、在位置93[73]處之賴胺酸及在位置105[85]處之精胺酸[在成熟序列中之位置；SEQ ID NO：32]。
在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合選自下列之複合物，如：IL－13和IL－13R1("IL－13/IL－13R1")；IL－13和IL－4R("IL－13/IL－4R1")；及IL－13，IL－13R1和IL－4R("IL－13/IL－13R1/IL－4R")。在其它實施態樣中，IL－13拮抗劑，如：抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13與IL－13受體複合物(如：含有IL－13R1和IL－4R)間的交互作用(如：結合)。在其它實施態樣中，IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13與IL－13受體複合物之次單位(如：個別地，IL－13R1和IL－4R)間的交互作用(如：結合)。在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－13R1和IL－4R間之交互作用(如：結合)。在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－4R和IL－13R1間之交互作用(如：結合)。典型上，該抗－IL－13抗體或其片段干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－13R1與IL－4R間之交互作用(如：結合)。
IL－13拮抗劑之非限制性實例，如：干擾IL－13結合IL－13R(即，IL－13受體複合物)，或其次單位之抗－IL－13抗體有"mAb13.2"及其經修改，如：嵌合型或人類化之形式。此文中mAb13.2之重鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：5所列者。mAb 13.2之輕鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：1所列者。此文中，嵌合型(即：包含mAb 13.2之重和輕鏈可變區的形式)稱為"ch13.2"。此文中，ch 13.2之重鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：14(如：第15圖)和SEQ ID NO：6所列者。此文中，ch 13.2之輕鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：10(如：第16圖)和SEQ ID NO：2中所列者。mAb13.2之人類化形式(此文中稱為"h13.2v1")之重鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：15(第15圖)和SEQ ID NO：7中所列者。此文中h13.2v1之輕鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：11(第16圖)和SEQ ID NO：3所列者。另一種mAb13.2之人類化形式(此文中稱為"h13.2v2")之重鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：16(第17圖)和SEQ ID NO：8所列者。h13.2v2之輕鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：12(第18圖)和SEQ ID NO4所列者。另一種mAb13.2之人類化形式(此文中稱為"h13.2v3")的重鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：36(第27圖)和SEQ ID NO：34所列者。h13.2v3之輕鏈可變區的胺基酸和核苷酸序列分別為如SEQ ID NO：35(第28圖)和SEQ ID NO：33所列者。
在一種實施態樣中，IL－13拮抗劑，如：特異結合IL－13(如：人類、非人類靈長類、綿羊IL－13)之抗體或其片段，競爭性地抑制第二種抗體結合IL－13，如：結合IL－13(如：人類、非人類靈長類、綿羊IL－13)上之靶的抗原決定部位。第二種抗體可為選自，如：此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3。
在一種實施態樣中，在綿羊模型中之IL－13抗體或其片段可於注射後至少6週在綿羊暴露於蛔蟲抗原時賦予其對抗該抗原之注射後保護效果。
在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一抗原－結合區來自，如：選自mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的可變區。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二、三或四種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v 1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的可變區。在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一或二種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的重鏈可變區。在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一或二種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的輕鏈可變區。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二或三種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的重鏈可變區的互補決定區(CDRs)。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二或三種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的輕鏈可變區的CDRs。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二、三、四、五或六種來自，如：選自此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3抗體的重鏈和輕鏈可變區的CDRs。
在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二、三或四種抗原－結合區，如：具有如表3中所列之胺基酸序列(VH方面為SEQ ID NO：13、14、15、16或36，及/或VL方面為SEQ ID NO：9、10、11、12或35)，或大體上與其一致之序列(如：與SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、35或36具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，或與其相差不超過1、2、5、10或15個胺基酸的序列)的可變區。在另一種實施態樣中，該抗體包括VH及/或VL結構區，此VH及/或VL結構區係由具有表2中所列之核苷酸序列(VH方面為SEQ ID NOs：5、6、7、8或34，及/或VL方面為SEQ ID NOs：1、2、3、4或33)，或大體上與其一致之序列(如：與SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、33或34具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，或與其相差不超過3、6、15、30或45個核苷酸的序列)的核酸所編碼。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二或三種CDRs，此CDRs係來自具有表1中所列之胺基酸序列(VH CDRs1－3分別為SEQ ID NO：22、23或24)，或大體上與其一致之序列(如：與其具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，及/或具有一或多個取代，如：經保留之取代)的重鏈可變區。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二或三種CDRs，此CDRs係來自具有表1中所列之胺基酸序列(VL CDRs1－3分別為SEQ ID NOs：19、20或21)，或大體上與其同源之序列(如：與其具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，及/或具有一或多個取代，如：經保留之取代)的輕鏈可變區。而在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有至少一、二、三、四、五或六種CDRs，此CDRs係來自具有表1中所列之胺基酸序列(VH CDRs1－3分別為SEQ ID NOs：22、23或24；而VL CDRs1－3分別為SEQID NOs：19、20或21)，或大體上與其同源之序列(如：與其具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，及/或具有一或多個取代，如：經保留之取代)的重鏈和輕鏈可變區。
在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有一人類IgG1恆定區，其具有如SEQ ID NO：17中所列之胺基酸序列，或大體上與其同源之序列(如：與SEQ ID NO：17具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，或與其相差不超過1、2、5、10、50或100個胺基酸殘基的序列)。在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有一人類κ恆定區，其具有如SEQ ID NO：18中所列之胺基酸序列，或大體上與其同源之序列(如：與SEQ ID NO：18具有至少約85%、90%、95%、99%或更高之一致性的序列，或與其相差不超過1、2、5、10、50或100個胺基酸殘基的序列)。在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有如此文所描述之人類IgG1恆定區和人類κ恆定區。
在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有一經由氫鍵在至少一、二、三或四個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的重鏈可變區：如，第29圖中所示之根據線性序列編號系統的重鏈可變區的絲胺酸50(CDR2)、絲胺酸53(CDR2)、酪胺酸101(CDR3)、酪胺酸102(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第17圖)。在一種實施態樣中，該抗體或其片段含有一經由凡得瓦爾力在至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的重鏈可變區：如，第29圖中所示之根據線性序列編號系統的重鏈可變區的異白胺酸30(CDR1)、絲胺酸31(CDR1)、丙胺酸33(CDR1)、色胺酸47、絲胺酸50(CDR2)、絲胺酸52(CDR2)、絲胺酸53(CDR2)、酪胺酸58(CDR2)、白胺酸98(CDR3)、天門冬胺酸99(CDR3)、甘胺酸100(CDR3)、酪胺酸101(CDR3)、酪胺酸102(CDR3)、苯丙胺酸103(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第17圖)。在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有一重鏈可變區，此重鏈可變區經由氫鍵在至少一、二、三或四個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸：如，第29圖中所示之根據線性序列編號系統的重鏈可變區的絲胺酸50(CDR2)、絲胺酸53(CDR2)、酪胺酸101(CDR3)、酪胺酸102(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第17圖)，及經由凡得瓦爾力在至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸：如，第29圖中所示之根據線性序列編號系統的重鏈可變區的異白胺酸30(CDR1)、絲胺酸31(CDR1)、丙胺酸33(CDR1)、色胺酸47、絲胺酸50(CDR2)、絲胺酸52(CDR2)、絲胺酸53(CDR2)、酪胺酸58(CDR2)、白胺酸98(CDR3)、天門冬胺酸99(CDR3)、甘胺酸100(CDR3)、酪胺酸101(CDR3)、酪胺酸102(CDR3)、苯丙胺酸103(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第17圖)。
在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有一經由氫鍵在至少一、二、三、四或五個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的輕鏈可變區：如，第30圖中所示之根據線性序列編號系統的輕鏈可變區的天門冬醯胺31(CDR1)、酪胺酸32(CDR1)、賴胺酸34(CDR1)、天門冬醯胺96(CDR3)、天門冬胺酸98(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第18圖)。而在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有一經由凡得瓦爾力在至少一、二、三、四、五、六或七個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的輕鏈可變區：如，第30圖中所示之根據線性序列編號系統的輕鏈可變區的天門冬醯胺31(CDR1)、酪胺酸32(CDR1)、賴胺酸34(CDR1)、精胺酸54(CDR2)、天門冬醯胺96(CDR3)、天門冬胺酸98(CDR3)、色胺酸100(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第18圖)。在另一種實施態樣中，該抗體或其片段含有一輕鏈可變區，此輕鏈可變區經由氫鍵在至少一、二、三、四或五個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸：如，第30圖中所示之根據線性序列編號系統的輕鏈可變區的天門冬醯胺31(CDR1)、酪胺酸32(CDR1)、賴胺酸34(CDR3)、天門冬醯胺96(CDR3)、天門冬胺酸98(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第18圖)，及經由凡得瓦爾力在至少一、二、三、四、五、六或七個選自下列之殘基處與IL－13(通常為人類IL－13)接觸：如，第30圖中所示之根據線性序列編號系統的輕鏈可變區的天門冬醯胺31(CDR1)、酪胺酸32(CDR2)、賴胺酸34(CDR1)、精胺酸54(CDR2)、天門冬醯胺96(CDR3)、天門冬胺酸98(CDR3)、色胺酸100(CDR3)或其保留性取代(亦見，如：第18圖)。
在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有如此文所描述之經由氫鍵與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的重鏈和輕鏈可變區。而在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有如此文所描述之經由凡得瓦爾力與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的重鏈和輕鏈可變區。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段含有如此文所描述之經由氫鍵和凡得瓦爾力與IL－13(通常為人類IL－13)接觸的重鏈和輕鏈可變區。
而在另一種實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段含有一在SEQ ID NO：14之位置13、19、40、42、44、75、77、83、87、92或113處具有一或多種突變的重鏈可變區。在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段之重鏈可變區在SEQ ID NO：14之位置3處還含有一種突變。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段之重鏈可變區含有一或多種下列取代：在SEQ ID NO：14之位置3處的賴胺酸被麩醯胺取代、在位置13處之賴胺酸被麩醯胺取代、在位置19處之賴胺酸被精胺酸取代、在位置40處之蘇胺酸被丙胺酸取代、在位置42處之麩胺酸被甘胺酸取代、在位置44處之精胺酸被甘胺酸取代、在位置75處之精胺酸被賴胺酸取代、在位置77處之異白胺酸被絲胺酸取代、在位置83處之絲胺酸被天門冬醯胺取代、在位置87處之絲胺酸被丙胺酸取代、在位置92處之甲硫胺酸被纈胺酸取代、在位置113處之蘇胺酸被白胺酸取代。
在另一種實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段含有一在SEQ ID NO：10之位置3、9、12、13、15、17、19、22、46、47、62、64、80、81、82、83、84、85、87或108處具有一或多種突變之輕鏈可變區。在另一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段之輕鏈可變區在SEQ ID NO：10之位置4或72處還含有一或多種突變。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段之輕鏈可變區含有一或多種下列取代：在SEQ ID NO：10之位置3處的纈胺酸被麩醯胺取代、在位置4處之白胺酸被甲硫胺酸取代、在位置9處之丙胺酸被絲胺酸取代、在位置12處之丙胺酸被絲胺酸取代、在位置13處之纈胺酸被丙胺酸取代、在位置15處之白胺酸被纈胺酸取代、在位置17處之麩醯胺被天門冬胺酸取代、在位置19處之丙胺酸被纈胺酸取代、在位置22處之絲胺酸被蘇胺酸取代、在位置46處之麩醯胺被賴胺酸取代、在位置47處之絲胺酸被內胺酸取代、在位置62處之異白胺酸被纈胺酸取代、在位置64處之丙胺酸被絲胺酸取代、在位置72處之精胺酸被甘胺酸取代、在位置80處之天門冬醯胺被絲胺酸取代、在位置81處之脯胺酸被絲胺酸取代、在位置82處之纈胺酸被白胺酸取代、在位置83處之麩胺酸被麩醯胺取代、在位置84處之丙胺酸被脯胺酸取代、在位置85處之天門冬胺酸被麩胺酸取代、在位置87處之纈胺酸被苯丙胺酸取代或在位置108處之白胺酸被纈胺酸取代。
在另一種實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段含有一在SEQ ID NO：14之位置3、13、19、40、42、44、75、77、83、87、92或113處具有一或多種突變(如：此文所描述之突變)的重鏈可變區，和一在SEQ ID NO：10之位置3、4、9、12、13、15、17、19、22、46、47、62、64、80、81、82、83、84、85、87或108處具有一或多種突變(如：此文所描述之突變)的輕鏈可變區。
IL－13拮抗劑，如：此文所描述之抗－IL－13抗體或其片段可從另一功能性分子，如：其它肽或蛋白質(如：Fab片段)衍生，或與其連接。例如：融合蛋白質，或抗體或抗原－結合部分可功能性地連接(如：藉由化學偶合、遺傳融合、非共價性聯合或其它方式)一或多種其它分子實體，如：抗體(如：雙特異性或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細胞毒性劑或細胞抑制劑等。
而在另一種實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：此文所描述之抗－IL－13抗體或其片段，或其藥學組成物係單獨投藥，或與治療法組合，即，與其它作用劑組合，如：與可用來治療與IL－13相關病症的治療劑組合。與IL－13相關之病症的實例包括，但不限於選自下列之一或多種病症：如此文所描述之呼吸病症，如：氣喘(如：過敏性和非過敏性氣喘(如：在幼兒中因，如：呼吸道融合細胞病毒(RSV)感染所引起之氣喘))，慢性梗阻性肺病(COPD)及其它涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量，如：囊性纖維變性和肺部纖維變性；特應性病症，如：因對IL－13之敏感性增加所造成之病症(如：異位性皮膚炎、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎和過敏性腸胃炎)；皮膚(如：異位性皮膚炎)、胃腸道器官(如：發炎性腸病(IBD)，如：潰瘍性結腸炎及/或克隆氏病)、肝臟(如：硬化、肝細胞癌)之發炎及/或自體免疫病況和硬皮病；腫瘤或癌症(如：軟組織或實體腫瘤)，如：白血病、神經膠母細胞瘤和淋巴癌，如：霍吉金氏淋巴瘤；病毒感染(如：來自HTLV－1)；其它器官之纖維變性，如：肝臟纖維變性(如：由B型及/或C型肝炎病毒引起之纖維變性)；及第1型保護性免疫反應之表現受壓抑(如：在疫苗接種期間)。
組合治療可包括將一或多種IL－13拮抗劑(如：抗－IL－13抗體或其片段)與一或多種其它治療劑，如：此文中多次描述之一或多種細胞活素和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗發炎劑(如：系統性抗發炎劑)、代謝抑制劑、酶抑制劑，及/或細胞毒性劑或細胞抑制劑一起配製及/或共同投服。
可與一或多種IL－13拮抗劑(如：抗－IL－13抗體或其片段)共同投服及/或一起配製之較佳的其它治療劑實例包括，但不限於下列一或多種治療劑：吸入之類固醇，β一激動劑，如：短效或長效之β－激動劑；白三烯或白三烯受體之拮抗劑；組合藥物(如：艾德維(Advir))；IgE抑制劑，如：抗－IgE抗體(如：索雷爾(Xolair))；抗膽鹼能藥；肥大細胞－安定劑，如：克羅莫林(cromolyn)；IL－4抑制劑；IL－5抑制劑；嗜伊紅趨化素(eotoxin)/CCR3抑制劑；和抗組織胺。這類組合可用來治療氣喘和其它呼吸病症。其它可與一或多種抗－IL－13抗體或其片段共同投服及/或一起配製之治療劑包括下列一或多種治療劑：TNF拮抗劑(如：TNF受體之可溶性片段，如：p55或p75人類受體或其衍生物，如：75kd TNFR－IgG(75kD TNF受體－IgG融合蛋白質，(安布洛(Enbrel)))；TNF酶拮抗劑，如：TNFα轉化酶(TACE)抑制劑)；毒蕈鹼受體拮抗劑；TGF－拮抗劑；干擾素γ；普非尼酮(perfenidone)；化療劑，如：胺基甲基葉酸、來氟米特(leflunomide)，或西洛里莫(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))或其類似物，如：CCI－779；COX2和cPLA 2抑制劑；NSAIDs；免疫調節劑；p38抑制劑、TPL－2、Mk－2和NFiB抑制劑等。
在另一種觀點中，本申請案提供包括藥學上可接受之載體和至少一種IL－13拮抗劑，如：此文中所描述之抗－IL－13抗體或其片段的組成物，如：藥學組成物。在一種實施態樣中，該組成物，如：藥學組成物，含有二或多種前述之IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段的組合。IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段與藥物之組合亦在本發明之範圍內，該藥物係如：治療劑(如：此文中所描述之一或多種細胞活素和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗發炎劑(如：系統性抗發炎劑)、代謝抑制劑、酶抑制劑，及/或細胞毒性劑或細胞抑制劑)。
本申請案亦描述包含核苷酸序列之核酸的特性，該核苷酸序列係編碼此文所描述之抗－IL－13抗體或其片段的重鏈和輕鏈可變區。例如：本申請案描述分別編碼此文所描述之抗－IL－13抗體的重鏈和輕鏈可變區的第一和第二種核酸之特性，該抗－IL－13抗體係選自下列之一或多種抗體，如：mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3。
在另一種觀點中，本申請案描述含有此文中所描述之核酸的宿主細胞和載體的特性。
本發明之範圍亦包括可被下列之一或多種抗體，如：mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2及/或h13.2v3辨識之IL－13(如：人類IL－13)的抗原決定部位。在一種實施態樣中，該抗－IL－13抗體或其片段結合含有人類IL－13之殘基81－93及/或114－132(SEQ ID NO：31)，或其修改型(如：片段或其經取代(如：保留性取代)之形式)的抗原決定部位。在一種實施態樣中，該人類IL－13之抗原決定部位含有下列之一或多項：在SEQ ID NO：32之位置48處的麩胺酸、位置52處之天門冬醯胺、位置68處之甘胺酸、位置71處之脯胺酸、位置72處之組胺酸、位置73處之賴胺酸和位置85處之精胺酸，或其經保留之胺基酸取代。
在另一種觀點中，本申請案描述一種調節，如：干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13與IL－13受體複合物(如：含有IL－13R1和IL－4R之複合物)間之交互作用(如：結合)的方法的特性。在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13與IL－13受體複合物之次單位(如：個別地，IL－13R1或IL－4R)間的交互作用(如：結合)。而在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－13R1與IL－4R間之交互作用(如：結合)。在另一實施態樣中，該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段結合IL－13，並干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－4R與IL－13R1間之交互作用(如：結合)。典型上，該抗－IL－13抗體或其片段干擾(如：抑制、阻斷或降低)IL－13/IL－13R1與IL－4R間之交互作用(如：結合)。
本方法可用於玻管內(如：在不含細胞之系統中)，培養中(如：玻管內或活體外)之細胞中。例如：可將表現IL－13受體之細胞培養在玻管內之培養基質中，並經由將一或多種抗－IL－13抗體或其片段，如：此文中所描述之抗－IL－13抗體或其片段加入培養基質中來使接觸步驟生效。或者，此方法可在個體中之細胞中進行，如：作為活體內(如：治療性或預防性)實驗計劃的一部分。
在另一種觀點中，本申請案描述一種治療(如：治癒、壓抑、減輕、延遲或預防開始，或預防再發或復發)個體內與IL－13相關病症的方法的特徵。此方法包括：給予該個體一足夠治療或預防與IL－13相關病症的量的IL－13拮抗劑，如：此文中所描述之抗－IL－13抗體或其片段。該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可單獨投給該個體或與其它此文中所描述之治療用藥程式一起投服。在一種實施態樣中，該個體為一受苦於一或多種與IL－13相關病症的哺乳動物，如：人類，該與IL－13相關病症包括，如：此文中所描述之呼吸病症(如：氣喘(如：過敏性和非過敏性氣喘，慢性梗阻性肺病(COPD)及其它涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量；特應性病症(如：異位性皮膚炎和過敏性鼻炎)；皮膚之發炎及/或自體免疫病況、胃腸道器官之發炎及/或自體免疫病況(如：發炎性腸病(IBD)，如：潰瘍性結腸炎及/或克隆氏病)和肝臟之發炎及/或自體免疫病況(如：硬化、臟纖維變性)；硬皮病；腫瘤或癌症，如：霍吉金氏淋巴瘤。
與IL－13相關病症的實例包括，但不限於選自下列之一或多項的病症：呼吸病症，如：氣喘(如：過敏性和非過敏性氣喘(在如：幼兒中因，如：呼吸道融合細胞病毒(RSV)感染所引起之氣喘))，慢性梗阻性肺病(COPD)及其它涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量，如：囊性纖維變性和肺部纖維變性；特應性病症，如：因對IL－13之敏感性增加所造成之病症(如：異位性皮膚炎、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎和過敏性腸胃炎)；皮膚之發炎及/或自體免疫病況(如：異位性皮膚炎)、胃腸道器官之發炎及/或自體免疫病況(如：發炎性腸病(IBD)，如：潰瘍性結腸炎及/或克隆氏病)、肝臟之發炎及/或自體免疫病況(如：硬化、肝細胞癌)和硬皮病；腫瘤或癌症(如：軟組織或實體腫瘤)，如：白血病、神經膠母細胞瘤和淋巴癌，如：霍吉金氏淋巴瘤；病毒感染(如：來自HTLV－1之感染)；其它器官之纖維變性，如：肝臟纖維變性(如：由B型及/或C型肝炎病毒引起之纖維變性)；及第1型保護性免疫反應之表現受壓抑(如：在疫苗接種期間)。
在其它實施態樣中，本申請案提供一種治療(如：減輕、改善)或預防與下列病症相關之一或多種症狀的方法：呼吸病症(如：過敏性和非過敏性氣喘)；過敏；慢性梗阻性肺病(COPD)；涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量，如：囊性纖維變性和肺部纖維變性。例如，氣喘之症狀包括，但不限於：喘鳴、氣促、支氣管縮小、氣道反應過度、肺容量減少、纖維變性、氣道發炎和黏液生成。此方法包含：給予該個體一足夠治療(如：減輕、改善)或預防一或多種症狀之IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段。該IL－13抗體可以治療或預防方式，或此二種方式投服。該IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可單獨投給該個體或與其它此文中所描述之治療用藥程式一起投服。較合適的為，該個體為一受苦於如此文中所描述之與IL－13相關病症的哺乳動物，如：人類。
在另一種觀點中，本申請案提供一種在玻管中偵測樣本(如：生物樣本，如：血清、血漿、組織、切片)內是否有IL－13存在之方法。本方法可用來診斷病症，如：與免疫細胞相關之病症。此方法包括：(i)將樣本或對照組樣本與此文中所描述之抗－IL－13抗體或其片段接觸；及(ii))偵測抗－IL－13抗體或其片段與樣本或對照組樣本間是否形成複合物，其中，相對於對照組樣本而言，在樣本中形成複合物的情形具統計上之顯著改變時即表示樣本中有IL－13存在。
而在另一種觀點中，本申請案提供一種用於在活體內偵測是否有IL－13存在的方法(如：在個體中之活體內影像分析。本方法可用來診斷病症，如：與IL－13相關之病症。此方法包括：(i)在可令抗體或其片段與IL－13結合之條件下投給個體或對照組個體如此文中所描述之抗－IL－13抗體或其片段；及(ii)偵測該抗體或其片段與IL－13間是否形成複合物，其中，相對於對照組樣本而言，在樣本中形成複合物的情形具統計上之顯著改變時即表示有IL－13存在。
較合適的為，以可偵測之物質直接或間接標示該抗體或其片段以幫助偵測經結合或未結合之抗體。合適之可偵測的物質包括：多種不同之酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射活性物質。
本申請案亦揭示用於在活體內將作用劑(如：治療劑或細胞毒性劑)遞送至或瞄準IL－13－表現細胞的方法。
包含此文中所描述之IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段之用於治療和診斷的套組亦在本申請案之範圍內。
從下列詳細說明和申請專利範圍可清楚明白本申請案之其它特性和益處。
發明之詳細說明
揭示IL－13結合劑，如：抗－IL－13抗體及其抗原結合片段、其藥學組成物、編碼前述抗體之核酸以及含有前述核酸序列之載體和宿主細胞。亦揭示製造前述抗體之方法，以及利用結合IL－13，如：人類IL－13之抗體來調節一或多種與IL－13相關之活性，並減少或預防IL－13結合其受體的方法。抗－IL－13抗體可用來減輕由IL－13傳介之病症，如：用於治療呼吸病症(如：氣喘)；特應性病症(如：過敏性鼻炎)；皮膚之發炎及/或自體免疫病況(如：異位性皮膚炎)、胃腸道器官之發炎及/或自體免疫病況(如：發炎性腸病(IBD))以及纖維變性和癌症。抗－IL－13抗體可單獨使用或與其它用來治療該相同病症或其它病症，如：過敏性反應之治療劑組合使用。
現已發現，利用此文所描述之抗體(其干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成)降低IL－13活性可減低天生對蛔蟲敏感之獼猴體內的氣這發炎(下述之實例1.4和3.5)。另外，此文所描述之抗－人類IL－13抗體可預防天生對蛔蟲敏感之綿羊體內的晚期支氣管縮小，並預防由卡巴可(carbachol)引起之綿羊體內的氣道反應過度(下述之實例3.5)。因此，可在活體內使用能中和一或多種與IL－13相關之活性的抗－IL－13抗體來降低一或多種與IL－13相關之活性，如：治療或預防由IL－13傳介之病症(如：氣喘、氣道發炎、嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量)。
抗－人類IL－13抗體可中和及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性，尤其是IL－13之生物活性的抗體可用來治療由IL－13傳介之疾病，如：過敏性氣喘、非過敏性氣喘和與氣喘相關之病理，如：纖維變性、嗜伊紅血球增多症，和黏液生成。
在一種實施態樣中，此文所揭示之抗－IL－13抗體為經分離或純化。經"分離"或"純化"之多肽或蛋白質，如："經分離之抗體"係經純化至非其天然存在之狀態。例如：該經"分離"或"純化"之多肽或蛋白質，如："經分離之抗體"可為大體上不含細胞性物質或其它來自該蛋白質之衍生來源的細胞或組織的污染蛋白質，或者，當其係以化學方法合成時，其大體上不含化學先質或其它化學物質。在一些實施態樣中，具有少於約50%非抗體蛋白質(此文亦稱為"污染蛋白質")或化學先質之抗體蛋白質的製品被視為"大體上不含有"。在其它實施態樣中，40%、30%、20%、10%，宜為5%(以乾燥重量計)，之非抗體蛋白質或化學先質被視為大體上不含有。當抗體蛋白質或其生物活性部分係以重組方法製造時，其宜大體上不含培養基質，即，其中存在之培養基質少於約蛋白質製品之體積或質量的30%、20%，宜少於約10%，而以少於約5%最佳。此文中稱為"重組物"之蛋白質或多肽為經由表現重組核酸所製造之蛋白質或多肽。
此文所使用之"抗體"一詞包括完整之抗體，抗體之片段，如：Fab、F(ab')2 Fd、dAb和scFv片段，以及在其恆定及/或可變區曾發生突變(如：製造嵌合型、部分人類化或完全人類化之抗體之突變，及製造具有所需特性，如：增強之IL－13結合力及/或降低之FcR結合力的抗體的突變)之完整抗體和片段。可包括在本發明範圍內之抗體的先決條件為該抗體特異結合IL－13、干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成及中和或抑制一或多種與IL－13相關之活性。
完整抗體(亦稱為免疫球蛋白)典型上為由二個各約25kDa之輕(L)鏈和二個各約50kDa之重(H)鏈所組成的四聚體型糖基化蛋白質。在抗體中可發現二種類型之輕鏈，稱為λ和κ。根據重鏈恆定區之胺基酸序列可將免疫球蛋白分為五種主要類別：A、D、E、G和M，且這些中有數種可進一步分為子類(同種異構型)，如：IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 。各輕鏈係由一個N端可變(V)結構區(VL)和一個恆定(C)結構區(CL)所組成。各重鏈係由一個N端V結構區(VH)、三個或四個C結構區(CHs)和一個絞鏈區所組成。最接近VH之CH結構區稱為CH1。由四個具有經相當保留之序列的區域所構成的VH和VL結構區稱為框構區(FR1、FR2、FR3和FR4)，其形成三個具高變異序列之區域(互補決定區)的骨架。該CDRs含有大部分負責該抗體與抗原之特殊交互作用的殘基。CDRs稱為CDR1、CDR2和CDR3。因此，在重鏈上之CDR構成物稱為H1、H2和H3，而在輕鏈上之CDR構成物稱為L1、L2和L3。CDR3為抗體結合部位內之分子歧異性的最大來源。例如：H3可短如2個胺基酸殘基或超過26個胺基酸。不同類別之免疫球蛋白的次單位構造和三次元組態為本技藝所熟知。檢閱抗體之構造，見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,eds.Harlow et al.,1988。本技藝之技術熟習人士可察知各次單位構造，如：CH、VH、CL、VL、CDR、FR構造，包含活性片段，如：結合抗原之VH、VL或CDR次單位的部分，即抗原結合片段，或者，如：結合及/或活化，如：Fc受體及/或補體的CH次單位的部分。
包含在抗體之"抗原結合片段"一詞內的結合片段的實例包括：(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL和CH1結構區所組成之單價片段；(ii)F(ab')2 片段，其為包含二個在絞鏈區由二硫化物橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其係由VH和CH1結構區所組成；(iv)Fv片段，其係由抗體單臂之VL和VH結構區所組成；(v)dA片段(Ward et al.(1989)Nature 341：544－46)，其係由VH結構區所組成；以及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。再者，雖然Fv片段的二個結構區，VL和VH係由分開之基因編碼，但其可利用重組方法藉由合成之連接子來連結，該連接子可使單鏈蛋白質之VL和VH區配對形成單價分子，而為單一蛋白鏈之形式(稱為單鏈Fv(scFv)；見，如：Bird et al.(1988)Science 242：423－26；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：5879－83)。這類單鏈抗體亦包含在抗體之"抗原結合片段"一詞內。利用本技藝之技術熟習人士所已知之習知技術來取得這些抗體片段，並進行篩選以使其可與完整抗體以相同方式使用。
抗體歧異性係利用數種編碼可變區之種系基因和多種不同之體細胞過程產生。體細胞過程包括將具有歧異性(D)之可變基因節重組，並將基因節連接(J)，以製造完整的VL區。重組方法本身不正確時會造成V(D)J接合點處損失或加入胺基酸。這些歧異性之機制係在暴露於抗原前，於發展B細胞時發生。以抗原刺激後，表現在B細胞中之抗體基因會發生體細胞突變。根據種系基因節之估計數目可將這些基因節任意重組，將VH－VL任意配對來製造至多1.6×107 種不同抗體(Fundamental Immunology,3rd ed.(1993),ed.Paul,Raven Press,New York,NY)。當考慮其它造成抗體歧異性之程序(如：體細胞突變)時，則認為可產生至多1×101 0 種不同抗體(Immunoglobulin Genes,2nd ed.(1995),eds.Jonio et al.,Academic Press,San Diego,CA)。由於涉及產生抗體歧異性之程序很多，因此，獨立衍生出之具相同抗原特異性的單株抗體似乎不太可能具有一致之胺基酸序列。
因此，本發明提供結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成之新穎抗體及其抗原結合片段。此文所描述之抗原結合片段(如：含有CDR之構造)通常為抗體重鏈或輕鏈序列或其活性片段，其中該CDR係位於相當於天然產生之VH和VL的CDR的位置處。免疫球蛋白可變結構區之構造和位置可依Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services(1991),eds.Kabat et al中之描述來測定。
此文所揭示之抗體分子(包括抗原結合片段)，即，結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成之抗體分子包括，但不限於：老鼠單株抗體，mAb13.2，及其變異體，特別是該嵌合變異體ch13.2、部分人類化變異體h13.2v1及完全人類化變異體h13.2v2和h13.2v3。這些抗體分子可用於預防或治療氣喘(過敏性和非過敏性二者)，以及與氣喘相關之病理。mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之輕鏈可變區的胺基酸序列分別列於SEQ ID NOs：9、10、11、12和35中。mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之重鏈可變區的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：13、14、15、16和36中。mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之可變輕鏈中的三個互補決定區(CDRs)的胺基酸序列列於SEQ ID NOs：19、20和21中。mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之可變重鏈中的三個CDRs的胺基酸序列列於SEQ ID NOs：22、23和24中。
如上述，CDRs含有大部分負責與抗原特殊交互作用的殘基，且其包含在VH和VL結構區中，即，分別為重鏈可變區和輕鏈可變區。因此，當抗體包含至少一CDR，且此CDR含有選自SEQ ID NOs：19－24中所列之胺基酸序列的胺基酸序列或其活性片段時，該抗體可為此文所描述之抗體，即結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成之抗體。因此，本發明之一種實施態樣可包括含有一或多個CDRs之抗體，且該CDRs含有選自SEQ ID NOs：19－24中所列之胺基酸序列的胺基酸序列或其活性片段。此文所描述之CDRs的活性片段的胺基酸序列，即最小核心CDR序列列於SEQ ID NOs：25－30中，並揭示於表1中。因此，本技藝之技術熟習人士可察知此文所描述之抗體可包括其中該VL鏈之CDRs為列於SEQ ID NOs：19－24或SEQ ID NOs：25－27中之序列的抗體。類似地，此文所描述之抗體可包括其中該VH鏈之CDRs為那些SEQ ID NOs：22－24或SEQ ID NOs：28－30中之序列的抗體。另外，此文所描述之抗體可為一種其中該VL和VH鏈之一或多個CDRs具有選自SEQ ID NOs：19－30中所列之胺基酸序列的胺基酸序列的抗體。
1 VL CDRs之編號係根據如第30圖中之線性序列編號圖表。2 VH CDRs之編號係根據如第30圖中之線性序列編號圖表。
亦如上述，抗原結合片段可能為一種由VH和VL結構區所組成之Fv片段。因此，mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2或h13.2v3之Fv片段可構成此文所描述之抗體，其先決條件為其結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成。本技藝之技術熟習人士可察知任何含有此文所描述之mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2或h13.2v3抗體之Fv片段，如：scFv片段、Fab片段和F(ab')2 片段亦可為此文所描述之抗體。另外，任何含有一或多個具有選自SEQ ID NOs：19－30中所列之胺基酸序列的胺基酸序列的CDRs的Fv片段、scFv片段、Fab片段或F(ab')2 片段亦可為此文所描述之抗體。
這類抗體分子可藉由本技藝之技術熟習人士所已知的方法製造。例如：可根據已知方法經由產生雜交瘤來製造單株抗體。然後，利用標準方法，諸如：酶聯免疫吸附分析(ELISA)和表面細胞質基因組共振(拜爾可T M )分析篩選以此方式形成之雜交瘤，以鑑定一或多個可製造能特異結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成，且中和一或多種與IL－13相關之活性的抗體的雜交瘤。重組之IL－13、天然產生之IL－13、其任何變異體和IL－13之抗原肽片段均可作為免疫原。
IL－13之抗原肽片段包含至少7個連續胺基酸殘基且包含一抗原決定部位，如此，所產生之對抗該肽的抗體將與IL－13形成特殊之免疫複合物。較合適的為，該抗原肽包含至少10個胺基酸殘基，以至少15個胺基酸殘基較佳，而以至少20個胺基酸殘基更佳，且以至少30個胺基酸殘基最佳。另外，較合適的為，該IL－13之抗原肽片段包含IL－13受體結合部位或IL－4受體結合部位。
另一種製備分泌單株抗體之雜交瘤的替換方法為：以IL－13(包括其變異體及/或部分)篩選重組體之組合免疫球蛋白庫(如：抗體噬體顯示庫)，來分離出結合IL－13之免疫球蛋白庫成員，以鑑定並分離本發明之單株抗體。用於產生和篩選噬體顯示庫的技術和市售套組為本技藝之技術熟習人士所已知。另外，特別適於用來產生和篩選顯示之抗體的方法和試劑的實例包括那些描述於US5,658,727、US 5,667,988和US 5,885,793中者。
此文所描述之多株血清和抗體可經由下述方法製造：以IL－13、其變異體及/或部分將合適之個體進行免疫接種。在經免疫之個體中的抗體效價可利用固定之IL－13或其它標記蛋白質(如：FLAG)，藉由標準技術，諸如：酶聯免疫吸附分析(ELISA)監測一段時間。若需要時，可將本發明之抗體分子從個體或培養基質中分離出來，再藉由為人熟知之技術，例如：蛋白質A色層分析法進一步純化，以取得IgG之部分。
某些實施態樣包含mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2或h13.2v3之Fv片段的VH及/或VL結構區。本發明抗體之片段，如：Fab、F(ab')2 、Fd和dAb片段可根據本技藝所熟知之方法將抗體分裂來製得。例如：免疫活性之Fab和F(ab')2 片段可經由以酶，如：胃蛋白酶處理抗體來產生。
其它實施態樣包含這些VH和VL結構區中之任一結構區的一或多個互補決定區(CDRs)。一種實施態樣中包含mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2或h13.2v3之VH結構區的H3片段。
在某些實施態樣中可將此文所描述之VH和VL結構區種系化，即：這些結構區之框構區(FRs)可利用習知之分子生物學技術改變，以符合人類種系基因產物之一致胺基酸序列。在其它實施態樣中，該框構序列保持與種系歧異。
另外，此文所描述之包含人類和非人類部分的嵌合型、人類化的及單鏈抗體可利用標準重組DNA技術(如實例中所詳述者)來製造。人類化抗體亦可利用表現人類重和輕鏈基因，但無法表現內生性之老鼠免疫球蛋白重和輕鏈基因的基因轉殖小鼠來製造。
另外，此文所描述之抗體亦包括那些結合IL－13，並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成，且在重和輕鏈恆定區具有突變之抗體。有時，需令恆定區之某些片段發生突變及去活化。例如：有時需在重鏈恆定區中發生突變以製造對Fc受體(FcR)及/或補體之結合力降低的抗體；這類突變為本技藝所熟知。SEQ ID NO：17中提供一種在IgG之重鏈恆定區的胺基酸序列上發生的這類突變的實例。本技藝之技術熟習人士亦可察知測定CL和CH次單位之活性片段何者為必要者的程序係根據此文所描述之抗體的用途。例如：本技藝之技術熟習人士可察知涉及CL和CH次單位彼此之共價連接的活性片段對產生完整抗體而言很重要。
另一種觀點係提供用於取得抗體之抗原結合結構區的方法，此抗體之抗原結合結構區係特異於協助形成功能性IL－13傳訊複合物之IL－13的結構區。本技藝之技術熟習人士可感知本發明之抗體不限於具有如SEQ ID NOs：9、10、11、12或35中所列之VL鏈的特殊序列及/或如SEQ ID NOs：13、14、15、16或36中所列之VH鏈的特殊序列者，還包括這些序列之保留抗原結合能力的變異體。這類變異體可利用本技藝所熟知之技術從所提供之序列衍生出。可在FRs或CDRs中進行胺基酸取代、缺失或加入之工作。雖然在框構區中所設計之變化通常係用來改良抗體之穩定性並降低致免疫性，但CDRs中之變化通常係設計成用來增加抗體對其靶的的親和力。這類增加親和力之改變通常係憑經驗決定，並經由改變CDR區及測試該抗體來進行。這類改變可根據described in Antibody Engineering,2nd.ed.(1995),ed.Borrebaeck,Oxford University Press中所描述之方法製造。
用於製造為此文所列出之VH結構區的胺基酸序列變異體的VH結構區之方法包含下述步驟：在目前揭示之VH結構區的胺基酸序列中加入、删除、取代或插入一或多個胺基酸，隨意地將VH結構區和所提供之一或多個VL結構區組合，再測試該VH結構區或VH/VL之組合於特異結合IL－13方面之能力，並(較合適的為)測試這類抗原一結合結構區於調節一或多種與IL－13相關之活性的能力。VL結構區可具有大體上如此處所列者之胺基酸序列。類似方法可用於其中將此文所揭示之VL結構區的一或多種序列變異體與一或多種VH結構區組合的情況中。
本發明之另一種觀點係提供製備特異結合IL－13之抗原結合片段的方法，此方法包含：(a)提供編碼VH結構區之核酸的起始集庫，該VH結構區或者包括一將被取代之CDR3，或者缺少CDR3編碼區；(b)將集庫與編碼包含SEQ ID NO：24之活性片段的供給者CDR的供給者核酸(如：編碼SEQ ID NO：30中所列之胺基酸序列的供給者核酸)組合，如此，將該供給者核酸插入集庫中之CDR3區，以提供編碼VH結構區之核酸的產品集庫；(c)表現產品集庫的核酸；(d)選出特異於IL－13之特異性抗體或抗原結合片段；及(e)回收該特異性抗體或抗原結合片段或編碼彼之核酸。
在另一種實施態樣中，可使用類似之方法，其中將本發明之VL CDR3(即L3)與編碼VL結構區(其包括一將被取代之CDR3或者缺少CDR3編碼區)之核酸集庫組合。本發明之CDR(如：CDR3)的編碼序列可利用重組DNA技術引入缺少CDR(如：CDR3)之可變結構區的集庫中。例如：Marks等人(Bio/Technology(1992)10：779－83)描述製造抗體可變結構區之集庫的方法，其中係使用針對或鄰接可變結構區之5'端的一致引物加上用於人類VH基因之第三框構區的一致引物，以提供缺少CDR3之VH可變結構區的集庫。此集庫可與特殊抗體之CDR3組合。利用類似技術，本發明之從CDR3衍生的序列可與缺少CDR3之VH或VL結構區進行重排，而該重排之完整VH或VL結構區可與同源之VH或VL結構區組合，以提供特殊之抗原結合片段。然後，可在合適之宿主系統(如：WO 92/01047中之噬體顯示系統)中顯示出該集庫，以選出合適之抗原結合片段。Stemmer(Nature(1994)370：389－91)中亦揭示類似之重排或組合技術。
另一種替換方法係令一或多個選定之VH及/或VL基因進行隨機致突變作用，以在整個可變結構區內製造突變，而產生帶有本發明之從CDR衍生的序列的新穎VH或VL區。見，如：See,e.g.,Gram et al.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. (1992)89：3576－80。
另一種可使用之方法為指導VH或VL基因之CDR區產生突變。這類技術揭示於，如：Barbas et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. (1994)91：3809－13)and Schier et al.(J.Mol.Biol. (1996)263：551－67)中。
類似地，可將一或多個，或所有三個CDRs移植入VH或VL結構區內之集庫，再篩選出特殊結合搭檔，或特異於IL－13之結合片段。
在一種實施態樣中，經由，如：致突變作用來修改結合靶的之結合蛋白質，以提供經修改之結合蛋白質的累積體。然後，評估該經修改之結合蛋白質以鑑定具有改變之功能性質(如：改良之結合力，改良之穩定性，延長在活體中之穩定性)的一或多種經改變之結合蛋白質。在一種實施方法中係使用顯示集合庫技術來選擇或篩選經修改之結合蛋白質的累積體。然後，從第二個集合庫鑑定(如：使用較高之嚴格性或更競爭之結合及清洗條件)出具較高親和力之結合蛋白質。亦可使用其它篩選技術。
在一些實施態樣中，該致突變作用係瞄準已知或可能在結合界面之區域。例如：若鑑定出之結合蛋白質為抗體，則可將致突變作用針對如此文所描述之重或輕鏈的CDR區。再者，致突變作用可針對靠近或鄰接CDRs之框構區，如：尤其是在CDR接合點之10、5或3個胺基酸內的框構區。在抗體之情況中，亦可將致突變作用侷限於，如：一或更少之CDRs，以一步一步地改良。
在一種實施態樣中係使用致突變作用來使抗體更類似於一或多種種系序列。一種示範性之種系化方法可包括：鑑定一或多種類似(如：在一特殊之資料庫中最類似)該經分離之抗體的序列的種系序列。然後，可在經分離之抗體中，以增量或組合或為此二種方式製造突變(在胺基酸層級上)。例如：可製造一種核酸集合庫，其中包括編碼一些或所有可能之種系突變的序列。然後，評估突變之抗體，如：鑑定那些相對於該分離出之抗體而言具有一或多種額外之種系殘基，且仍可用(如：具功能性活性)的抗體。在一種實施態樣中，將儘可能多之種系殘基引入分離出之抗體內。
在一種實施態樣中，使用致突變作用來將一或多個種系殘基取代或插入CDR區中。例如：種系CDR殘基可來自類似(如：最類似)於被修改之可變區的種系序列。在致突變作用之後可評估抗體之活性(如：結合或其它功能性活性)，以決定該種系殘基是否為可容許之殘基。在框構區中亦可進行類似之致突變作用。
選擇種系序列時可以不同方式進行。例如：若一種系序列符合選擇性或類似性之預定標準，如：至少達某種百分比之一致性，如：至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%之一致性，則可將其選出。選擇時可使用至少2、3、5或10種種系序列來進行。在CDR1和CDR2的情況中，鑑定類似之種系序列時可包括選擇一種這類序列。在CDR3的情況中，鑑定類似之種系序列時可包括選擇一種這類序列，但可包括使用二種分別造就胺基－端部分和羧基－端部分之種系序列。在其它實行方法中係使用超過一或二種種系序列，如：以形成一致序列。
在一種實施態樣中，抗體或其片段所具有之CDR序列與此文所描述之抗體的CDR序列僅有非實質之差異。非實質之差異包括次要之胺基酸改變，諸如：在CDR(如：喬西亞或卡巴特CDR)序列中之任何典型的5－7個胺基酸中有1或2個胺基酸取代。典型之情況為，胺基酸係被具有類似之電荷、疏水性或立體化學特徵之相關胺基酸所取代。這類取代係在本技藝之一般技術範圍內。不似在CDRs中之情況，在構造框構區(FRs)內可有更實質之改變，但不會對抗體之結合性質有不良影響。FRs之改變包括，但不限於：將從非人類衍生之框構人類化或將某些對抗原接觸而言重要或用來穩定結合部位之框構殘基進行遺傳工程處理，如：改變恆定區之類別或子類，改變可能修改效應子功能(如：結合Fc受體)之特殊胺基酸殘基(Lund et al.(1991)J.Immun. 147：2657－62；Morgan et al.(1995)Immunology 86：319－24)，或改變衍生該恆定區之物種。抗體可在重鏈之CH2區中具有能降低或修改效應子功能(如：結合Fc受體及活化補體)之突變。例如：抗體可具有如美國專利第5,624,827和5,648,260號中所描述之突變。例如：在IgG1或IgG2重鏈中，可製造使其相似於SEQ ID NO：17中所列之胺基酸序列的這類突變。抗體亦可具有可穩定介於免疫球蛋白之二個重鏈間的二硫化物鍵的突變，如：本技藝中所揭示之在IgG4絞鏈區中的突變(如：Angal et al.(1993)Mol,Immunol 30：105－08)。
IL－13結合蛋白質可為完整抗體、抗體片段(如：Fab、F(ab')2 、Fd、dAb及scFv片段)和曾在其恆定及/或可變區發生突變(如：用來產生嵌合型、部分人類化或完全人類化的抗體，以及用來產生具有所需特性，如：增強IL－13結合力及/或降低FcR結合力之突變)之完整抗體和片段的型式。
在一些實施態樣中，免疫球蛋白可變結構區之實質部分可含有至少一CDR區及，隨意地，其來自如此文所提出之可變區的中介框構區。該部分亦包括至少約50%之FR1或FR4或此二者，該50%為FR1之C－端50%和FR4之N－端50%。在可變結構區之實質部分的N－端或C－端的其它殘基可為那些在正常情況下不會與天然產生之可變結構區聯結者。例如：藉由重組DNA技術所建構之本發明的特殊抗原結合片段可將由引入之連接子所編碼之N－或C－端殘基引入其中，該引入之連接子係用來協助選殖或其它操作步驟。其它操作步驟包括：引入連接予以將本發明之可變結構區連接其它蛋白質序列，包括：免疫球蛋白重鏈、其它可變結構區(如：雙功能抗體之製備方法的步驟)或如下列詳述之蛋白質標示。
雖然在實例中所說明之實施態樣包含VH和VL可變結構區之"配合"對，但本發明亦包含含有從VH或VL結構區(尤其是VH結構區)序列衍生之單一可變結構區的結合片段。在任一種單鏈特異性結合結構區的情況中，可使用這些結構區來篩選可形成能與IL－13結合之二－結構區特異性抗原－結合結構區的互補結構區。此可利用稱為分級雙重組合方法(hierarchical dual combinatoria methodl)(如WO 92/01047中所揭示者)的噬體顯示篩選法來達成，此方法中係使用含有H或L鏈選殖株之個別株落來感染編碼另一鏈(L或H)之株落的完整集合庫，再根據噬菌體顯示技術(如描述於該參考資料中者)來選擇所產生之二－鏈特異性抗原－結合結構區。此技術亦揭示於如上述之Marks，等人的著作中。
抗體可藉由化學方法與放射性核素、藥物、大分子或其它作用劑結合，或可製成含有一或多個本發明之CDRs的融合蛋白質。
抗體融合蛋白質中含有VH－VL對，其中這些鏈的其中之一(通常為VH)和另一蛋白質係合成為單一多肽鏈之形式。這些產物形式與抗體之差異在於其通常具有額外之功能元素：如，小分子之活性部分或該經結合或融合之大分子的主要分子構造特性。
除了上述內容中所概述之胺基酸變化外，可將該抗體糖基化、聚乙二醇化或連接鋁或非蛋白質聚合物。例如：可將目前揭示之抗體依美國專利第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337號中所提出之方法連接多種不同之非蛋白質聚合物的其中一種，如：聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯類。例如：抗體可經由共價結合聚合物來進行化學修改，以增加其循環半生期。示範性之聚合物及將其與肽連接之方法亦顯示於美國專利第4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546號中。
在其它實施態樣中，該抗體可經修改以具有改變之糖基化樣式(即，從原始或天然之糖基化樣式改變)。此處所使用之"改變"意指有一或多個碳水化合物部分缺失及/或有一或多個糖基化部位加入原始抗體。將糖基化部位加入目前所揭示之抗體中的程序經由改變胺基酸序列以使其含有糖基化部位一致序列來達成；這類技術為本技藝所熟知。其它增加抗體上之碳水化合物部分的數目的方法為將糖苷以化學或酶之方法偶合至抗體之胺基酸殘基上。這些方法描述於，如WO 87/05330，and Aplin和Wriston((1981)CRC Crit.Rev.Biochem. 22：259－306)中。去除存在於抗體上之任何碳水化合物部分的程序可依本技藝中之描述以化學或酶的方法來達成(Hakimuddin et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys. 259：52；Edge et al.(1981)Anal.Biochem. 118：131；and Thotakura et al.(1987)Meth.Enzymol. 138：350)。見，如：美國專利第5,869,046號中所描述之經由提供救援之受體結合抗原決定部位來增加活體內之半生期的修改方法。
此文所描述之抗體亦可加上可偵測之標示或功能性之標示。可偵測之標示包括，如：1 3 1 I或9 9 Tc，其可利用本技藝所已知之習知化學方法連接在本發明之抗體上。標示亦包括酶標示，如：辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶。標示還包括化學部分，如：生物素，其可經由結合在一特殊之同源的可偵測部分，如：經標示之卵白素而成為可偵測的。
此文所揭示之抗體的結合能力可藉下列方法測量：如下列實例中所描述之拜爾可分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、X－光結晶學分析、序列分析和掃描致突變作用，以及其它本技藝所熟知之方法。本發明抗體中和及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性的能力可藉下列方法測量：用於測量IL－13倚賴性細胞株之增殖的分析，如：TFI；用於測量由IL－13傳介之多肽的表現的分析，如：分析CD23之表現的流式細胞分析；用於測量下游傳訊分子之活性的分析，如：STAT6；用於測試本發明抗體在相關動物模型，如：獼猴中預防氣喘之效力的分析；如下列實例中所描述及本技藝所熟知之其它分析。
所關注之蛋白質和靶的(如：IL－13)間之結合交互作用可利用SPR來進行分析。SPR或生物分子交互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis)(BIA)偵測即時之生物特異性交互作用，而不需標示任何之交互作用劑。在BIA片之結合表面的質量變化(結合情況之指示)可使接近表面之光折射指數改變(表面胞質基因共振(SPR)之光學現象)。折射中之變化產生可偵測之訊號，所測量之訊號可作為生物分子間之即時反應的指示。利用SPR之方法描述於，如：U.S.Patent No.5,641,640；Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag；Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem. 63：2338－2345；Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol. 5：699－705，以及由拜爾可國際公司(瑞典，Uppsala)所提供之線上資源中。
來自SPR之資料可用來正確地定量測量生物分子結合靶的之平衡解離常數(Kd)和動力學參數，包括Kon和Koff。這類資料可用來比較不同之生物分子。例如：可將由選自多樣性股之集合庫的核酸所編碼的蛋白質加以比較，以鑑定那些對靶的具有高親和力或具有緩慢Koff值的個別體。此資料亦可用來發展構造－活性關係(SAR)。例如：可將母蛋白質之成熟變異體的動力學和平衡結合參數與母蛋白質之參數相比較。在指定位置上之變異胺基酸可經由與特殊結合參數，如：高親和力和緩慢Koff值進行相關比較來鑑定出。此資料可與構造性造型(如：使用同源造型、能量最小化或藉由X－光結晶學分析或NMR測定構造)組合。結果，可將對於蛋白質及其靶的間之物理交互作用的了解加以規劃，並用來指導其它設計過程。
在進一步之觀點中，此揭示內容提供選擇可結合和中和，及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性的抗體的方法。此方法包含：a)將多種抗體或抗原結合片段與IL－13相接觸b)選擇結合IL－13之抗體或抗原結合片段；c)測試所選出之抗體或抗原結合片段阻止IL－13與IL－13受體結合之能力；d)選出可阻止IL－13結合其受體之抗體或抗原結合片段。
此文所揭示之抗－IL－13抗體亦可用來分離、純化及/或偵測在上清液、細胞溶胞化物中或細胞表面上之IL－13。此文所揭示之抗體可用於診斷中，以監控IL－13蛋白質水準來作為臨床測試程序之一部分。另外，此文所揭示之抗體可用於需要中和及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性的治療法中，如：過敏性和非過敏性氣喘和相關病理。本揭示內容亦提供與拮抗人類IL－13之新穎抗體相關的新穎的分離且純化之多核苷酸和與多肽。此文所揭示之基因、多核苷酸、蛋白質和多肽包括，但不限於：老鼠抗IL－13抗體(mAb13.2)及其變異體。
抗－IL－13抗體多核苷酸和多肽類例如：本揭示內容提供純化且分離之多核苷酸，其編碼可調節一或多種與IL－13相關之活性(如：中和IL－13之生物活性)的抗IL－13老鼠抗體(mAb13.2)、mAb13.2之嵌合型變異體(ch13.2)、mAb13.2之部分人類化變異體(h13.2v1)和二種mAb13.2之完全人類化變異體(h13.2v2及h13.2v3)的可變區。較佳之本發明的DNA序列包括：基因組、cDNA和經化學合成之DNA序列。
該核苷酸序列可包括那些編碼mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之輕鏈可變區者，其分別列於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33中。該核苷酸序列亦可包括那些編碼mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之重鏈可變區者，且其分別列於SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：34中。該多核苷酸亦可包括那些在嚴格條件下與SEQ ID NOs：1－8、33和34中所列之任何序列或其補體雜交的多核苷酸，及/或編碼保留由這些序列所編碼之可變區的實質生物活性的多肽(即活性片段)的多核苷酸。該多核苷酸亦可包括SEQ ID NOs：1－8、33和34中所列之任何序列的連續部分(其中含有至少21個連續核苷酸)。表2中摘述數種本發明之多核苷酸的核苷酸序列之SEQ ID NOs。
mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之輕鏈可變區的胺基酸序列分別列於SEQ ID NOs：9、10、11、12和35中。mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之重鏈可變區的胺基酸序列分別列於SEQ ID NOs：13、14、15、16和36中。此文所揭示之多肽亦包括SEQ ID NO：9－16、35和36中所列之任何序列的連續部分，該連續部分含有至少4個連續胺基酸互保留這些可變區之實質生物活性(即活性片段)。較合適的為，本申請案之多肽包括SEQ ID NOs：9－16、35和36中所列之任何序列的含有5－7個胺基酸的連續部分。更合適的為，本申請案之多肽包括分別保留mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之實質生物活性的SEQ ID NOs：9和13、SEQ ID NOs：10和14、SEQ ID NOs：11和15、SEQ ID NOs：12和16及SEQ ID NOs：35和36中所列之任何序列的連續部分。除了上述之多核苷酸外，此文所揭示之多核苷酸亦包括那些編碼SEQ ID NOs：9－16、35和36中所列之任何胺基酸序列或其連續部分，且與上述多核苷酸之差異僅來自於吾人熟知之基因密碼的簡併性的多核苷酸。例如：表3中摘述數種此文所揭示之多肽的胺基酸序列之SEQ ID NOs。例如：表3中摘述抗體mAb13.2、ch13.2、h13.2v1、h13.2v2和h13.2v3之可變輕鏈(VL)、可變重鏈(VH)、恆定重鏈(CH)、恆定輕鏈(CL)、可變輕鏈之CDR1s(L1)、可變輕鏈之CDR2s(L2)、可變輕鏈之CDR3s(L3)、可變重鏈之CDR1s(H1)、可變重鏈之CDR2s(H2)和可變重鏈之CDR3s(H3)的胺基酸序列的SEQ ID NOs。
此文所揭示之經分離的多核苷酸可作為雜交探針和引物以鑑定和分離核酸，該核酸具有與編碼所揭示之多核苷酸的核酸一致或類似的序列。用於鑑定和分離核酸之雜交法包括聚合酶鏈反應(PCR)、南方雜交、原位雜交和北方雜交，且這些方法為本技藝之技術熟習人士所熟知。
雜交反應可在不同嚴格性之條件下進行。雜交反應之嚴格性包括使任何二種核酸分子彼此雜交之困難性。較合適的為，各雜交之多核苷酸在降低之嚴格條件下與其對應之多核苷酸雜交，更合適的為在嚴格條件下雜交，最合適的為在高度嚴格條件下雜交。嚴格性條件之實例顯示於下列表4中：高度嚴格條件為至少與，如：條件A－F同樣嚴格者；嚴格條件為至少與，如：條件G－L同樣嚴格者；而降低之嚴格性條件為至少與，如：條件M－R同樣嚴格者。
1 雜種長度為雜交多核苷酸之預期的雜交區。當將多核苷酸與未知序列之靶的多核苷酸雜交時，該雜種長度即假定為雜交多核苷酸之長度。當將已知序列之多核苷酸雜交時，可將多核苷酸之序列進行比對，以測定雜種長度並鑑定理想之序列互補性的區域。2 SSPE(1xSSPE為0.15M NaCl、10mM NaH2 PO4 和1.25Mm EDTA，pH7.4)可在雜交反應和清洗緩衝劑中取代SSC(1xSSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；清洗係在雜交完成後進行15分鐘。TB ＊ －TR ＊ ：預期之長度少於50個鹼基對之雜種的雜交溫度應為低於雜種之熔解溫度(Tm )5－10℃的溫度，其中Tm 係根據下列程式測定。在長度少於18個鹼基對之雜種方面，Tm (℃)＝2(A＋T之鹼基對#)＋4(G＋C鹼基對之#)。在長度介於18和49個鹼基對間之雜種方面，Tm (℃)＝81.5＋16.6(log1 0 Na＋ )＋0.41(%G＋C)－(600/N)，其中N為雜種中之鹼基對的數目，而Na＋ 為雜交緩衝劑中之鈉離子濃度(1xSSC之Na＋ ＝0.165M)。
多核苷酸雜交反應之嚴格性條件的其它實例提供於Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Chs.9 & 11,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989),and Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology, Sects.2.10 & 6.3－6.4,John Wiley & Sons,Inc.(1995)中，其併為此文之參考資料。
此文所揭示之經分離的多核苷酸可作為用來鑑定和分離DNA之雜交探針和引物，該DNA係具有編碼揭示之多核苷酸的對偶基因變異體的序列。對偶基因變異體為此文所揭示之多核苷酸所編碼的多肽的天然替換形式，其編碼與所揭示之多核苷酸所編碼的多肽一致或具有明顯類似性的多肽。較合適的為，對偶基因變異體與所揭示之多核苷酸具有至少90%之序列一致性(更合適的為，至少95%之一致性；最合適的為，至少99%之一致性)。
此文所揭示之經分離的多核苷酸亦可作為用來鑑定和分離DNA之雜交探針和引物，該DNA具有與所揭示之多核苷酸同源的編碼多肽的序列。這些同系物為從與所揭示之多肽和多核苷酸不同之物種分離出之多肽和多核苷酸，或為在相同物種之內，但與所揭示之多核苷酸和多肽具有明顯之序列類似性。較合適的為，多核苷酸同系物與所揭示之多核苷酸具有至少50%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性。
此文所揭示之經分離的多核苷酸亦可作為探針和引物，以用來鑑定可在能表現本發明之抗體的條件下表現該抗體的細胞和組織。
此文所揭示之經分離的多核苷酸可以可操作之方式連接表現控制序列，以重組製造此文所描述之多肽。另外，本技藝之技術熟習人士可察知本發明之多核苷酸可以可操作之方式連接為人熟知之編碼多種不同抗體的同種異構型之恆定區的核苷酸序列。例如：編碼此文所揭示之輕鏈可變區的多核苷酸(例如：SEQ ID NOs：1－4和33中所列之序列的任一序列)可以可操作之方式連接編碼κ輕鏈(例如：如SEQ ID NO：18中所列者)或λ輕鏈(或其衍生物)之恆定區的核苷酸序列，如此，當該經連接之核苷酸表現時可產生具有可變區之完整κ輕鏈或λ輕鏈，其可特異結合IL－13、干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成及中和一或多種與IL－13相關之活性。類似地，編碼此文所揭示之重鏈可變區的多核苷酸(如：SEQ ID NOs：5－8和34中所列之序列的任一種)可以可操作之方式連接編碼重鏈之同種異構型(或其衍生物)，如：IgM、IgD、IgE、IgG和IgA的恆定區的核苷酸序列。表現重組蛋白質之一般方法為本技藝所熟知。這類重組蛋白質可以可溶之形式表現出，以用來治療由IL－13傳介之傳訊作用所產生的病症(如：過敏性和非過敏性氣喘)。
此文所揭示之重組表現載體可帶有額外序列，例如：調節載體在宿主細胞中複製的序列(如：複製之起源)和可選擇之標記基因。該可選擇之標記基因可協助選擇已引入載體之宿主細胞(見，如：美國專利第4,399,216、4,634,665和5,179,017號)。例如：典型的情況為，該可選擇之標記基因提供已引入載體之宿主細胞對藥物(如：G418、潮黴素或胺基甲基葉酸)的抗性。較佳之可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(供用於以胺基甲基葉酸選擇/放大之dhfr－ 宿主細胞)和neo基因(供用於G418之選擇作用)。
多種細胞株為適合用於重組表現的宿主細胞。哺乳動物宿主細胞株包括，如：COS細胞、CHO細胞、293T細胞、A431細胞、3T3細胞、CV－1細胞、HeLa細胞、L細胞、BHK21細胞、HL－60細胞、U937細胞、HaK細胞、Jurkat細胞，以及從初級組織和初級移出物之活體外培養物衍生出的細胞品種。
或者，其可能以重組方式在較低真核細胞，如：酵母(如：酵母菌屬、畢赤酵母、克魯氏酵母菌屬(kluyveromyces strain)及念珠菌屬)或原核細胞(如：大腸桿菌、枯草桿菌和傷寒沙門氏菌)中產製。在酵母菌或細菌中產製之多肽可進行修改，如：將合適之部位糖位。亦可在動物細胞，如：昆蟲或哺乳動物細胞中產製多肽。例如：可將編碼多肽之序列插入昆蟲表現載體，如：桿狀病毒載體中，並用於昆蟲細胞之表現系統(如：MaxBac套組，加州卡斯巴市因維特金(Invitrogen)公司)中。
重組表現於合適之宿主細胞中後，再利用已知之純化過程，如：凝膠過濾法和離子交換色層分析法將此文所揭示之多肽從培養基質或細胞萃取物中純化。純化作用亦包括以已知可結合此文所揭示之多肽的作用劑進行親和力色層分析法。這些純化過程亦可用來純化來自天然來源之本發明多肽。
或者，此文所揭示之多肽亦可經由重組方法，以可促進純化之形式表現出。例如：可將多肽以與蛋白質(如：麥芽糖－結合蛋白質(MBP)，麩胺基硫－S－轉移酶(GST)或硫氧化還原蛋白(TRX))融合之形式，或與六－組織胺基酸、五－組織胺基酸或小抗原決定部位標籤(如：FLAG抗原決定部位)融合之形式表現出。
此文所揭示之多肽亦可藉已知之習知化學合成法產製。
此文所揭示之多肽亦包含那些構造上與揭示之多肽不同(如：具有稍微修改之序列)，但與所揭示之多肽具有大體上相同之生化性質(如：僅功能上非必須之胺基酸殘基中改變)的分子。這類分子包括天然產生之對偶基因變異體和含有修改、取代、更換、插入或刪除之經審慎的遺傳工程處理過的變異體。用於這類修改、取代、更換、插入或刪除之技術為本技藝之技術熟習人士所熟知。
藥學組成物、服用量和投服形式抗－IL－13抗體可在玻管中、活體外使用，或與藥學上可接受之載體組合而併入藥學組成物中。除了本發明之抗體和載體外，這類組成物可包含多種不同之稀釋劑、充填劑、鹽類、緩衝劑、安定劑、助溶劑及其它本技藝所熟知之物質。"藥學上可接受的"一詞意指不會干擾活性成分之生物活性的效力的非毒性物質。載體之特性將根據投服途徑而定。
藥學組成物亦可含有其它因子，如，但不限於：如下列詳述之其它抗細胞活素抗體或其它抗發炎劑。這類額外之因子及/或作用劑可包含在藥學組成物中，以與本發明抗體產生協同作用。例如：在治療過敏性氣喘時，本發明之藥學組成物可包括已知可降低過敏反應之抗－IL－4抗體或藥物。
藥學組成物可為脂粒之形式，其中本發明之抗體除了其它藥學上可接受之載體外還與兩性分子作用劑組合，該兩性分子作用劑有，如：在水溶液中時以膠質分子、不可溶之單層、液態結晶或薄層之聚集型式存在的脂質。用於脂粒調和物之合適脂質包括，但不限於：單酸甘油酯、二甘油酯、硫脂、脫脂酸卵磷脂、磷酯、植物皂質、膽酸，等。這類脂粒調和物之製備方法係在本技藝之技術水準內，如：揭示於美國專利第4,235,871；4,501,728；4,837,028和4,737,323號中者，其內容併為此文之參考資料。
此文所使用之"治療上有效量"一詞意指足夠顯示出有意義之患者利益的藥學組成物或方法中的各活性成分的總量，該患者利益為，如：減輕這類病況之症狀，癒合或增加癒合速度。當用在單獨投服之個別活性成分時，此一詞係單指該成分。當用在組合物時，此一詞係產生療效之活性成分的合併量，不論其為組合、依序或同時投服。
在執行此文所描述之治療方法或用途時，將治療上有效量之可結合IL－13並干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成(及，如：中和或抑制一或多種與IL－13相關之活性)的抗體投給個體，如：哺乳動物(如：人類)。抗體可根據所描述之方法單獨投服或與其它治療法組合，如：使用細胞活素、淋巴活素或其它造血因子，或抗發炎劑之治療。當與一或多種作用劑一起投服時，可將該抗體與該第二種作用劑同時或依序投服。若依序投服時，主治醫師將決定與其它作用劑組合之抗體的合適投服順序。
投服藥學組成物(如：包含結合IL－13之抗體)時可以多種不同習知方式進行，如：經口食入、吸入或經皮、皮下或靜脈內注射。以經皮下投給患者較佳。
當將治療上有效量之可結合IL－13並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成的抗體經口投服時，該結合劑為錠劑、膠囊、粉末、溶液或酏劑之形式。當以錠劑形式投服時，本發明之藥學組成物可另外包含固體載劑，如：凝膠或佐劑。該錠劑、膠囊和粉末含有從約5至95%之結合劑，宜含有從約25至90%之結合劑。當以液體形式投服時可加入液體載劑，如：水、石油，動物或植物來源之油類，如：花生油、礦物油、大豆油或芝麻油，或合成之油。藥學組成物之液體形式還可包含生理食鹽水溶液、右旋糖或其它糖之溶液，或甘醇，如：乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當以液體形式投服時，該藥學組成物可含有從約0.5至90重量%之結合劑，宜含有從約1至50重量%之結合劑。
當將治療上有效量之可結合IL－13及干擾功能性IL－13傳訊複合物形成的抗體經靜脈內、皮或皮下注射投服時，該結合劑為不含病原之腸胃道外可接受的水溶液形式。這類腸胃道外可接受，且具合適之pH值、等張性、穩定性，等的蛋白質溶液的製備方法係在本技藝之技術範圍內。用於靜脈內、皮或皮下注射之較佳藥學組成物除了結合劑外，還應包含等張載劑，如：氯化鈉注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液、乳酸化之林格氏注射液或其它本技藝所已知之載劑。本發明之藥學組成物亦可包含安定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑或其它本技藝之技術熟習人士所已知之添加劑。
藥學組成物中之本發明抗體的量可根據治療之病況的性質和嚴重性，以及該患者已接受之先前治療的性質決定。最終，主治醫師將決定用來治療各個別患者之抗體量。開始時，主治醫師將給予低劑量之抗體並觀察患者之反應。接著，可給予患者較大劑量之抗體直到其取得理想之療效，此時，通常不再繼續增加服用量。例如：可投服在0.1－50毫克/公斤、0.5－50毫克/公斤、1毫克/公斤－100毫克/公斤、0.5－25毫克/公斤、0.1－15毫克/公斤或1－8毫克/公斤體重之範圍內的劑量。
吸入包括IL－13抗體或其片段之組成物可調製成可供用於吸入或其它肺部遞送方式。因此，此文所描述之化合物可經由吸入投至肺部組織。除非另外指出，此文所使用之"肺部組織"一詞係指任何呼吸道之組織，包括上和下呼吸道。IL－13抗體或其片段可與一或多種現存之用於治療肺病的藥徵一起投服。
在一種實例中，該化合物係調製成可供用於噴霧器。在一種實施態樣中，可將化合物以凍乾形式貯存(如：在室溫)並在吸入前於溶液中重建。
亦可利用醫學裝置，如：吸入器(見，如：美國專利第6,102,035(粉末吸入器)和6,012,454號(乾燥粉末吸入器))將化合物調製成供吸入用。該吸入器可包括可供在合適之pH下貯存活性化合物之分開的隔室和另一供貯存中和緩衝劑的隔室，以及供霧化前將化合物與中和緩衝劑合併的機制。在一種實施態樣中，該吸入器為一種計量之劑量吸入器。
用於將藥物局部遞送至肺部氣道的三種常用系統包括乾燥粉末吸入器(DPIs)、計量之劑量吸入器(MDIs)和噴霧器。用於最受歡迎之吸入投服方法中之MDIs可用來遞送為溶化形式或為分散物形式之藥品。典型的情況為，MDIs包含Freon或其它可在裝置活化時將霧化藥品强力推進呼吸道之具有相當高之霧氣壓的推進劑。不像MDIs，DPIs通常完全倚賴患者之吸入努力來將乾燥粉末形式之藥品引入肺中。霧化劑係經由賦予液態溶液能量來形成供吸入之藥品霧化滴。現亦發展出在液體換氣或肺部灌洗期間利用螢光化學基質將藥物直接遞送至肺的方法。這些及其它方法均可用來遞送IL－13抗體或其片段。在一種實施態樣中係將IL－13抗體或其片段與聚合物(如：可穩定或增加化合物之半生期的聚合物)結合。
例如：在吸入投服方面，IL－13抗體或其片段係以霧化滴噴霧之形式從含有合適之推進劑或噴霧劑的加壓容器或分配器中遞送。該化合物可為乾燥顆粒或液體形式。製備包含該化合物之顆粒時可經由，如：噴霧乾燥法，將帶有電荷中和劑之IL－13抗體或其片段的水溶液乾燥，再從該乾燥粉末中製出顆粒，或者，可將在有機修改劑中之水溶液乾燥，再從該乾燥粉末製出顆粒。
傳統上，該化合物可利用合適之推進劑，如：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適之氣體從加壓包裝或噴霧器中以霧化滴噴霧形式呈現。在加壓之霧化滴的情況中，可經由提供活瓣決定劑量單位，以遞送計算好之量。若該顆粒係經調製之顆粒時，供用於吸入器或吹藥器之膠囊和藥匣可調製成含有IL－13抗體或其片段及合適之粉末基質(如：乳糖或澱粉)的粉末混合物。除了經調製或未調製之化合物外，可將其它物質，如：100%DPPC或其它界面活性劑與IL－13抗體或其片段混合，以促進遞送或散佈經調製或未調製之化合物。製備乾燥顆粒之方法描述於，如：PCT刊物WO 02/32406中。
IL－13抗體或其片段可調製成供霧化滴遞送之形式，如：為乾燥霧化滴顆粒之型式，如此，當投服時，其可被快速吸收，且快速產生局部或系統性療效。投藥時可經過調整以在投服後2分鐘、5分鐘、1小時或3小時內提供可偵測之活性。在一些實施態樣中，甚至可更快(如：在30分鐘，甚至10分鐘內)取得波峰活性。IL－13抗體或其片段可調製成具有較長之生物半生期者(例如：與聚合物，如：PEG聯合)，且可作為其它投服方式之替換物，如：使化合物從肺部進入循環，並分佈至其它器官或特殊之靶的器官。
在一種實施態樣中，該IL－13抗體或其片段之遞送量為可將至少5%質量之多肽遞送至下呼吸道或肺部深處之量。肺部深處具有非常豐富之微血管網路。將微血管腔與肺胞空氣空間分隔開之呼吸膜非常薄且非常容易滲透。另外，沿著肺胞表面排列之液體層富含肺部界面作用劑。在其它實施態樣中係將至少2%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之IL－13抗體或其片段的組成物遞送至下呼吸道或肺部深處。將組成物遞送至這些組織的其中之一，或二者時可使化合物能被有效吸收，並具有高度生物可利用性。在一種實施態樣中係利用，如：吸入器或吹藥器提供計算好劑量之化合物。例如：以劑量單位形式遞送至少約0.02、0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、20、40或50毫克/吹氣或更多之化合物。生物可利用性之百分比可依下式計算：生物可利用性百分比＝(AUC非 侵 入 性 /AUCi.v.或 s.c.)×(劑量i.v.或 s.c./劑量非 侵 入 性 )×100。
雖然並不一定需要，但可使用遞送增進劑，如：界面活性劑來進一步增進肺部遞送。此處所使用之"界面活性劑"係指一種具有親水性和親脂性部分的化合物，其可藉由與介於二種不相融合相間之界面交互作用來促進藥物吸收之。界面活性劑對乾燥顆粒之助益有數種原因，如：減少顆粒聚集、減少巨噬細胞之噬胞作用，等。當與肺部界面活性劑偶合時化合物可被更有效地吸收，因界面活性劑，如：DPPC可大大幫助化合物擴散。界面活性劑為本技藝所熟知，包括，但不限於：磷酸甘油化物，如：磷酯醯膽鹼、L－α－磷酯醯膽鹼二棕櫚醯(DPPC)和雙磷脂醯甘油(DPPG)；鯨蠟醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧化乙烯－9－；歐利醚(auryl ether)；棕櫚酸；油酸；山梨醇酐三油酸酯(SpanT M 85)；甘膽酸鹽；表面素(surfactin)；波洛索體(poloxomer)；山梨醇酐脂肪酸酯；山梨醇酐三油酸酯；泰洛沙波(tyloxapol)；及磷脂質。
穩定及滯留在一種實施態樣中，IL－13抗體或其片段與可改良其在循環(如：血液、血清、淋巴、支氣管與肺之洗出液或其它組織)中之穩定及/或滯留，如：至少1.5、2、5、10或50倍的部分以物理方式聯結。
例如：IL－13抗體或其片段可與聚合物，如：大體上非抗原性之聚合物(如：聚氧化烷烯或聚氧化乙烯)聯結。合適之聚合物大體上因重量而有所不同。可使用分子數平均重量在約200至約35,000(或約1,000至約15,000，或約2,000至約12,500)間之聚合物。
例如：可將IL－13抗體或其片段與水溶性聚合物，如：親水性聚乙烯聚合物，如：聚乙烯醇和聚乙烯吡咯啶酮。這類聚合物之非限制性列表包括：聚氧化烷烯同聚物，如：聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PEG)，聚氧化乙烯化之多元醇，其共聚物及其成塊共聚物，其先決條件為維持該成塊共聚物之水溶性。
聚合物之分子量的範圍至多可達約500,000D，較合適的為至少約20,000D，或至少約30,000D，或至少約40,000D。分子量可根據欲取得之結合物的有效尺寸，聚合物之性質(如：構造，如：線性或有支鏈的)及衍生度來選擇。
IL－13抗體或其片段可利用共價鍵與聚合物連接，例如：交叉連接至抗體之N－端胺基上，和在抗體之賴胺酸殘基上發現的ε胺基，以及其它胺基、亞胺基、羧基、硫氫基、羥基或其它親水性基團。
可連接IL－13抗體或其片段之官能化的PEG聚合物可從，如：席瓦特聚合物(Shearwater Polymer)公司(阿拉巴馬州杭茲維爾市)取得。用於偶合PEG和其它聚合物之反應條件可根據IL－13抗體或其片段、所需之聚乙二醇化程度和所使用之聚合物而有所變化。選擇PEG衍生物時所涉及的一些因子包括：所需之連接點(如：賴胺酸或半胱胺酸R－基團)、衍生物之水解穩定性和反應性、鍵合之穩定性、毒性和抗原性，分析之穩定性等。任何特別衍生物之特殊使用指示可從製造者取得。
IL－13抗體或其片段和聚合物之結合物可藉由，如：凝膠過濾或離子交換色層分析法(如：HPLC)與未反應之起始物質分開，結合物之異源物種係以相同方式從彼此純化。不同物種(如：含有一或二個殘基)亦可能藉由未反應之胺基酸的離子性質中的差異而進行解析(見，如：WO 96/34015)。
抗－IL－13抗體之治療和預防用途在另一種觀點中，本揭示內容描述用於在活體內中和及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性的方法，此方法係經由投服足夠抑制與IL－13相關活性之本發明抗體量來達成。亦可將本發明抗體投給需要抑制由IL－13傳介之發炎反應的個體。這些病況包括，如：氣道發炎、氣喘、纖維變性、嗜伊紅血球增多症和黏液生成過量。
本申請者證明本發明抗體減少暴露於蛔蟲過敏原之獼猴體內的氣道發炎(實例3.6)。本申請者亦證明IL－13在人類周圍血液單核細胞中對CD23之正調節作用。因此，此文所揭示之可結合IL－13、干擾功能性IL－13傳訊複合物形成且可中和一或多種與IL－13相關之活性的抗體可在活體內減少由IL－13傳介之發炎反應，如：治療或預防與IL－13相關之病理，包括氣喘及/或其相關之症狀，及/或特應性症狀(如：因對IL－13之敏感性增加所產生之症狀)。
因此，此文所揭示之抗體可用來治療與IL－13相關之病症，如，選自下列之一或多種病症：如此文所描述之呼吸病症，如：氣喘(如：過敏性和非過敏性氣喘(如：在幼兒中因，如：呼吸道融合細胞病毒(RSV)感染所引起之氣喘))，慢性梗阻性肺病(COPD)及其它涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量，如：囊性纖維變性和肺部纖維變性；特應性病症，如：因對IL－13之敏感性增加所造成之病症(如：異位性皮膚炎、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎和過敏性腸胃炎)；皮膚之發炎及/或自體免疫病況(如：異位性皮膚炎)、胃腸道器官之發炎及/或自體免疫病況(如：發炎性腸病(IBD)，如：潰瘍性結腸炎及/或克隆氏病)、肝臟(如：硬化、肝細胞癌)之發炎及/或自體免疫病況和硬皮病；腫瘤或癌症(如：軟組織或實體腫瘤)，如：白血病、神經膠母細胞瘤和淋巴癌，如：霍吉金氏淋巴瘤；病毒感染(如：來自HTLV－1之感染)；其它器官之纖維變性，如：肝臟纖維變性(如：由B型及/或C型肝炎病毒引起之纖維變性)；及第1型保護性免疫反應之表現受壓抑(如：在疫苗接種期間)。
IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可用來治療呼吸病症，包括，但不限於：氣喘(如：過敏性和非過敏性氣喘(如：在幼兒中因，如：呼吸道融合細胞病毒(RSV)所引起之感染；支氣管炎(如：慢性支氣管炎)；慢性梗阻性肺病(COPD)(如：肺氣腫(如：由吸煙引起之肺氣腫)；涉及氣道發炎之病況，嗜伊紅血球增多症，纖維變性和黏液生成過量，如：囊性纖維變性、肺部纖維變性和過敏性鼻炎。
氣喘可由種種狀況(如：吸入過敏原、出現上呼吸道或耳朵感染，等)觸發(Opperwall(2003)Nurs.Clin.North Am. 38：697－711)。過敏性氣喘之特徵為氣道對多種不同特殊和非特殊刺激反應過度(AHR)，血清免疫球蛋白E(IgE)提高，產生過量之氣道黏液，水腫及支氣管上皮受傷(Wills－Karp，如上述)。當過敏原誘導出立即性早期氣道反應時即開始過敏性氣喘，通常數小時後接著發生延遲性末期氣道反應(LAR)(Henderson et al.(2000)J.Immunol. 164：1086－95)。在LAR期間，嗜伊紅血球、淋巴球和巨噬細胞匯集通過氣道壁和支氣管液(Henderson，等，如上述)。肺嗜伊紅血球增多症為過敏性氣喘之特徵，且造成許多呼吸上皮受損(Li et al.(1999)J.Immunol. 162：2477－87)。
CD4＋ 輔助T(Th)細胞對與氣喘相關之慢性發炎而言很重要(Henderson，等，如上述)。數種研究顯示CD4＋ 細胞對第2型輔助T細胞(Th2)之貢獻，而接下去第2型細胞活素(如IL－4、IL－5、IL－10和IL－13)之產生對導致AHR之過敏性發炎反應而言很重要(Tomkinson et al.(2001)J.Immunol. 166：5792－5800,and references cited therein)。首先，CD4＋ T細胞在老鼠模型中顯示出對由過敏引之氣喘而言為必要的。第二，製造第2型細胞活素之CD4＋ T細胞不僅在這些動物模型中擴增，亦在具過敏性氣喘之患者體內擴增。第三，第2型細胞活素水準在動物模型和氣喘患者的氣道組織中增加。第四，Th2細胞活素涉及在過敏性氣喘之老鼠模型中的嗜伊紅血球補充方面扮演核心角色，而以收納方式轉移之Th2細胞顯示出與肺中之嗜伊紅趨化素(一種強效之嗜伊紅血球化學引誘劑)水準增加和肺部嗜伊紅血球增多症相關(Wills－Karp et al.,如上述；Li et al.,如上述)。
用於治療或預防氣喘之方法包括那些用於外因性氣喘(亦稱為過敏性氣喘或特應性氣喘)、內因性氣喘(亦稱為非過敏性氣喘或非特應性氣喘)或此二者之組合(其被稱為混合性氣喘)的方法。外因性氣喘或過敏性氣喘包括由，如：過敏原(諸如：花粉、孢子、青草或雜草、寵物毛髮皮屑、灰塵、蹣，等)所引起或與其相關之病況。由於過敏原及其它刺激物本身出現在一整年中之不同時點，因此這些病況亦稱為季節性氣喘。外因性氣喘之群體中亦包括支氣管氣喘和過敏性支氣管肺麴菌病。
可藉此文所描述之作用劑治療或緩和之病況包括那些由感染劑，如：病毒(如：感冒病毒、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、副黏液病毒、鼻病毒屬和流感病毒)引起之病況。RSV、鼻病毒和流感病毒感染常見於兒童，且為嬰兒和幼兒之呼吸道疾病的主要原因。患有病毒細支氣管炎之兒童可發展出慢性喘鳴和氣喘，而此可利用此文所描述之方法治療。可藉此文所描述之作用劑治療或緩和之病況還有由運動及/或冷空氣在一些氣喘患者中所造成之氣喘病況。此方法可用於與暴露於煙(如：由香煙引起之煙和工業之煙)，及暴露於工業和職業環境中之物質(如：來自油漆、塑膠、聚胺基甲酸酯、假漆，等之煙、臭氧、有害氣體、二氧化硫、氧化亞氮、烟霧(包括異氰酸化物))，木頭、植物或其它有機塵，等有關之氣喘。此方法亦可用於與食物添加劑、防腐劑或藥理學作用劑相關之情況。亦包括用來治療、抑制或緩和稱為靜默氣喘或咳嗽變異氣喘之類型的氣喘。
此文所揭示之方法亦可用於治療和緩和與胃食道反射(GERD)相關之氣喘，此種氣喘可刺激支氣管縮小。GERD和止住之體分泌、壓抑之咳嗽和暴露於臥室中之過敏原及刺激物可造成氣喘病況，此病況已被統稱為夜間氣喘或夜間發生的氣喘。在治療、抑制或緩和與GERD相關之氣喘的方法中，使用藥學上有效量之如此文中所描述的IL－13拮抗劑加上藥學上有效量之用於治療GERD的作用劑。這些作用劑包括，但不限於：質子抽吸抑制劑，如：PROTONIX牌之延遲釋出的泮托拉唑鈉(pantoprazole sodium)錠劑、PRILOSEC牌之奧美拉唑(omeprazole)延遲釋出膠囊、ACIPHEX牌之利貝拉唑鈉(rebeprazole sodium)延遲釋出錠劑或PREVACID牌之延遲釋出的蘭索拉唑(lansoprazole)膠囊。
特應性病況及其症狀"特應性"係指一群疾病，其中通常有發展過敏反應之遺傳傾向。特應性疾病之實例包括過敏、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、氣喘和花粉熱。氣喘為與間歇性呼吸症狀(如：支氣管反應過度和可逆之氣流阻塞)相關之表型異質病況。氣喘之免疫組織病理學特性包括，如：氣道表皮剝落、膠原沈澱於基底膜下；水腫；肥大細胞活化；及發炎細胞浸潤(如：由嗜中性細胞、嗜伊紅血球和淋巴球浸潤)。氣道發炎還可進一步造成氣道反應過度、氣流限制、急性支氣管縮小、形成黏液塞、氣道壁重修復和其它呼吸症狀。可投服IL－13拮抗劑來緩和一或多種這些症狀。
過敏性鼻炎(花粉熱)之症狀包括：鼻子癢、流鼻涕、打噴嚏或鼻塞，和眼睛癢。可投服IL－13拮抗劑來緩和一或多種這些症狀。異位性皮膚炎為一種影響皮膚的慢性(長期持續)疾病。關於異位性皮膚炎之資料可從，如：NIH刋物第03－4272號中取得。在異位性皮膚炎中，皮膚可變得非常癢而導致發紅、腫大、龜裂、流出透明液體，最後結痂且鱗屑剝落。在許多情況中，有時疾病較惡化(稱為加劇或突發)然後皮膚再改進或完全無瑕(稱為緩解)。異位性皮膚炎通常稱為"濕疹"，其為數種皮膚發炎類型的通稱。異位性皮膚炎為多種濕疹類型中最常見的一種。異位性皮膚炎之實例包括：過敏性接觸濕疹(皮膚炎：發紅、癢、出水反應，其中皮膚與被免疫系統視為外來物之物質，如：毒藤或乳膏和乳劑中之某些防腐劑接觸)；接觸性濕疹(包括發紅、癢和灼燒之局部反應，其中皮膚與過敏原(引起過敏之物質)或刺激劑，如：酸、清潔劑或其它化學物質接觸)；汗疹濕疹(手掌和腳底皮膚之刺激，其特徵為：癢且灼燒之透明、位於深處的水泡)；神經性皮膚炎(因局部發癢(如：昆蟲咬)引起之頭部、下肢、腕或前臂皮膚上的鱗斑，其在抓傷時被強烈刺激)；錢幣形濕疹(受刺激之皮膚的錢幣形斑塊－最常出現在手臂、背部、屁股和下肢，其可能給痂、鱗屑剝落且非常癢)；皮脂溢濕疹(頭皮、臉，有時在身體其它部分之皮膚上的黃色、油性、鱗狀斑塊)。其它特殊症狀包括：鬱血皮膚炎、特應性摺疊(Dennis－Morgan褶)、唇炎、手掌過多紋線、眼皮染色過深：眼皮因發炎或花粉熱而顏色加深、魚鱗癬、毛髮角化症、苔蘚化、丘疹和蕁麻疹。可投服IL－13拮抗劑來緩和一或多種這些症狀。癌症IL－13及其受體涉及至少一些癌症類型之發展，如：從造血細胞衍生之癌症或從腦或神經元細胞(如：神經膠母細胞)衍生之癌症。例如：阻斷IL－13傳訊途徑(如：經由使用可溶之IL－13受體或STAT6－/－缺失老鼠)時可分別延遲腫瘤開始及/或何杰金氏淋巴瘤細胞株或轉移之乳癌生長。(Trieu et al.(2004)Cancer Res.64：3271－75；Ostrand－Rosenberg et al.(2000)J.Immunol.165：6015－6019)。此文所描述之IL－13抗體可特異瞄準表現IL－13R2之癌症(Husain and Puri(2003)J.Neurooncol.65：37－48；Mintz et al.(2003)J.Neurooncol.64：117－23)。IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可用來抑制癌細胞增殖或其它癌細胞活性。癌症係指對正常生長控制失去反應，且相對於對應之正常細胞而言，對其增殖之調節減少的一或多種細胞。
可使用IL－13拮抗劑對抗之癌症實例包括血癌，如：B－細胞慢性淋巴細胞性血癌、急性骨髓性血癌和人類T－細胞血癌第1型病毒(HTLV－1)轉化之T細胞；淋巴瘤，如：T細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤；神經膠母細胞瘤；胰臟癌；腎細胞癌；卵巢癌；和AIDS－卡波西肉瘤。
纖維變性IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段亦可用來治療發炎和纖維變性，如：肝臟纖維變性。IL－13之製造與朝向硬化，及可能，肝細胞癌的肝臟發炎(如：病毒性肝炎)之進展相關(de Lalla et al.(2004)J.Immunol. 173：1417－1425)。纖維變性在，如：當正常組織被疤痕組織取代時發生，通常係在發炎後發生。B型肝炎和C型肝炎病毒二者均引起肝臟中之纖維變性反應，此纖維變性反應可進展成硬化。接著，硬化可進展成嚴重之併發症，如：肝衰竭或肝細胞癌。利用IL－13拮抗劑，如：此文所描述之抗－IL－13抗體阻斷IL－13活性可減少發炎和纖維變性，如：與肝病，如：尤其是B型和C型肝炎相關之發炎、纖維變性和硬化。
發炎性腸病發炎性腸病(IBD)為引起小腸發炎之疾病的通稱。發炎性腸病之二種實例為克隆氏症和潰瘍性腸炎。現已發現IL－13/STAT6傳訊涉及由發炎引起之老鼠平滑肌的過度收縮(此為一種發炎性腸病之模型)(Akiho et al.(2002)Am.J.Physiol.Gastrointest.Lievr Physiol. 282：G226－232)。IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體可用來治療、預防或緩和發炎性腸病或一或多種發炎性腸病之症狀。
在一種實施態樣中，本發明之抗體，如：其藥學組成物係與可用來治療病理學病況或病症(如：過敏性和發炎性病症)之治療法，即：與其它作用劑，如：治療劑組合。"組合"一詞意指大體上同時期(同時或連續)給予作用劑。若連續給予時，宜在開始投服第二種化合物時仍可在治療部位偵測到有效濃度之該二種化合物中的第一種。
例如：組合治療可包括將一或多種本發明抗體(即：結合IL－13並干擾功能性IL－13傳訊複合物形成之抗體)與一或多種其它治療劑(如：下文中詳述之一或多種細胞活素和生長因子抑制劑、免疫壓抑劑、抗－發炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑及/或細胞毒性或細胞抑制劑)一起調製及/或一起投服。再者，此文所描述之一或多種抗－IL－13抗體可與二或多種此文所描述之治療劑組合使用。這類組合療法可有利地使用較低劑量之投服的治療劑，以避免與多種不同之單一療法有關的可能毒性或併發症。再者，此文所揭示之治療劑係作用在與IL－13/IL－13受體路徑相異之路徑上，因此，預期其可增進及/或協同IL－13抗體之效果。
其它可與一或多種IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段一起投服及/或一起調製之較佳的治療劑包括，但不限於下列之一或多種治療劑：吸入的類固醇；β－激動劑，如：短效或長效β－激動劑；白三烯拮抗劑或白三烯受體拮抗劑；組合藥物，諸如：艾德維；IgE抑制劑，如：抗－IgE抗體(如：索雷爾)；磷酸二酯酶抑制劑(如：PDE4抑制劑)；黃嘌呤；抗膽鹼能藥物；肥大細胞安定劑，如：克羅莫林；IL－4抑制劑；IL－5抑制劑；嗜伊紅趨化素/CCR3抑制劑；和抗組織胺。這類組合可用來治療氣喘及其它呼吸病症。其它可與一或多種抗－IL－13抗體或其片段一起投服及/或一起調製之治療劑的實例包括下列之一或多種治療劑：TNF拮抗劑(如：TNF受體之可溶性片段，如：p55或p75人類TNF受體或其衍生物，如：75kd TNFR－IgG(75kD TNF受體－IgG融合蛋白質，安貝爾T M (EnbelT M ))；TNF酶拮抗劑，如：TNFα轉化酶(TACE)抑制劑；毒蕈鹼受體拮抗劑；TGF－拮抗劑；γ干擾素；普非尼酮；化療劑，如：胺基甲基葉酸、來氟米特或西洛里莫(雷帕黴素)或其類似物，如：CCI－779；COX2和cPLA2抑制劑；NSAIDs；免疫調節劑；p38抑制劑，TPL－2、Mk－2和NFB抑制劑等。
因此，本發明之另一種觀點係關於用來將本發明之IL－13抗體與其它治療性化合物組合投服之套組，或可使用抗－IL－13抗體作為研究或治療工具，以測定生物樣本中是否存有IL－13及/或測定其水準的套組，如：ELISA套組。在一種實施態樣中，該套組包含一或多種調製在藥學載體中之抗－IL－13抗體，及至少一種作用劑，如：調製成適當之一或多種分開的藥學製劑的治療劑。
疫苗調和物IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體可用來增加疫苗調和物將個體免疫化之效力。例如：可在免疫接種之前、期間及/或之後投服IL－13拮抗劑，以增加疫苗效力。在一種實施態樣中，疫苗調和物含有一或多種IL－13拮抗劑及一種抗原，即，免疫原。在另一種實施態樣中，IL－13拮抗劑和該免疫原係分開投服，如：彼此係在1小時、3小時、1天或2天之內投服。
抑制IL－13可改良，如：細胞性疫苗，如：對抗疾病(如：癌症和病毒感染，如：逆轉錄病毒感染(如：HIV感染))之疫苗的效力。經由疫苗誘導之CD8＋細胞毒性T淋巴球(CTL)可能係透過細胞活素IL－13由CD4＋T細胞將其負調節。抑制IL－13顯示出可增進疫苗誘導CTL反應(Ahlers et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：13020－10325)。IL－13拮抗劑，如：此文所描述之抗－IL－13抗體或其片段可與疫苗一起使用以增加疫苗之效力。癌症和病毒感染(如：逆轉錄病毒(如：HIV)感染)為可使用細胞性疫苗反應有效對抗之示範性病症。疫苗之效力可經由在接種疫苗時阻斷IL－13傳訊來增强(Ahlers et al.(2002)Proc.Nat Acad.Sci.USA 99：13020－25)。
疫苗調和物可以藥學組成物或治療組成物之形成投給個體。包含此文所描述之IL－13拮抗劑和抗原的藥學組成物可藉由習知之混合、溶解、粒化、製造糖衣、磨粉、乳化、包囊、截留或凍乾過程製造。藥學組成物可利用一或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑來調製，這些藥學上可接受之作用劑可協助將此文所描述之抗原和拮抗劑處理成可用於製藥中之製劑。適當之調和物係取決於所選擇之投服途徑。
系統性調和物包括那些設計成供注射投服，如：皮下、皮內、肌肉內或腹膜內注射之調和物。
供注射方面，疫苗製劑可在水溶液中調製，該水溶液宜為生理上相容之緩衝液，如：漢克氏(Hank')液、林格氏液、磷酸鹽緩衝之生理食鹽水溶液或任何其它生理食鹽水緩衝液。溶液中可含有調製劑，諸如：懸浮劑、安定劑及/或分散劑。
或者，蛋白質可為供使用前以合適載劑，如：不含致熱原之無菌水構建之粉末形式。
供投服之疫苗調和物的有效量的測定方法係在本技藝之技術熟習人士的能力範圍內，尤其是可根據此文所提供之詳細揭示內容測定。
有效劑量可先利用動物模型估計。例如：可利用本技藝所熟知之技術在動物模型中調製劑量，以誘導免疫反應。服用量和間隔期可個別調整。例如：當作為疫苗時，可在1－36週之期間內投服1至3個劑量之疫苗調和物。較合適的情況為，在約3週至4個月之期間內投服1或2個劑量，之後再定期給予加強劑量之疫苗接種。替換方法可適合個別動物。合適之劑量為當依上述方法投服時可提升經免疫接種之個體內的免疫反應，使其足夠保護個體免於感染至少4至12個月的疫苗調和物的量。一般而言，一個劑量中所存在之抗原量係在每公斤宿主體重從約1微微克至約100毫克的範圍內，典型上為從約10微微克至約1克，宜為從約100微微克至約1毫克。合適之劑量範圍將根據注射途徑和患者尺寸而有所變化，但通常在約0.1毫升至約5毫升。
用於診斷、判斷預後和監控病症之方法結合IL－13之蛋白質，如：此文所描述之抗體具有活體外和活體內診斷用途。示範之方法包括：(i)將IL－13抗體投給個體；及(ii)偵測個體中之IL－13抗體。偵測方法包括測定IL－13抗體在個體中的位置。另一種示範方法包括將IL－13抗體與樣本，如：來自個體之樣本接觸。
在另一種觀點中，本發明提供用於在活體外(如：生物樣本，如：組織、切片)偵測是否存有IL－13的診斷方法。此方法包含：(i)將樣本與IL－13抗體接觸；及(ii)偵測IL－13抗體和樣本間是否形成複合物。此方法亦包括將參考樣本(如：對照樣本)與配體接觸，並測定相對於參考樣本與配體間所形成之複合物而言，配體和樣本間形成複合物的程度。相對於對照樣本或個體，樣本或個體中形成複合物的變化，如：統計上顯著之變化，可為樣本中存有IL－13之表示。
可將IL－13抗體以可偵測之物質直接或間接標示，以協助偵測結合或未結合之蛋白質。合適之可偵測的物質包括：不同之酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射活性物質。
IL－13抗體和IL－13間形成複合物之反應可藉由測量或目測結合IL－13之配體或未結合之配體來偵測。可使用之習知偵測分析有，如：酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學。進一步標示該IL－13抗體時，可利用以可偵測之物質標示的標準物和未標示之IL－13抗體，藉由競爭免疫分析來分析樣本中是否存有IL－13。
用於診斷、判斷預後、監控氣喘之進展的方法IL－13在氣喘中之涉入情形，申請者發現：與從非－特應性捐贈者分離出之循環的單核細胞和B細胞相較下，從特應性捐贈者分離出之這些細胞顯示出對IL－13之敏感性增加而正調節CD23之表現，隨後，本發明之新穎抗體的發現促使藉由測量生物樣本中之IL－13的水準來診斷、判斷預後、監控氣喘及/或特應性病症(如：從對IL－13之敏感性增加所產生者)之進展的方法成為可行。尤其是，本發明抗體可用於分辨患者是否受苦於過敏性或非過敏性氣喘之方法中。另外，此發現可用來鑑定新穎之IL－13傳訊抑制劑，此亦可用來治療氣喘。
本發明提供用於診斷過敏性或非過敏性氣喘之方法，其係藉由偵測生物樣本，如：血清、血漿、支氣管肺泡灌洗液、痰等中之IL－13降低或增加來進行。"診斷的"或"診斷"意指鑑定是否存有病原病況。診斷方法涉及藉由測定生物樣本(如：來自個體(人類或非人類哺乳動物)之支氣管肺泡灌洗液)中之IL－13多肽的測試量，並將此測試量與IL－13多肽之正常量或範圍(即來自已知未為氣喘所苦之個人的量或範圍)相比較。雖然特殊之診斷方法可能不提供氣喘之可靠診斷，但若該方法可提供協助診斷的確定指示時則其足夠提供可靠診斷。
本發明亦提供藉由偵測IL－13之正調節來判斷氣喘及/或特應性病況預後的方法。"預後的"或"判斷預後"意指預測病理病況之可能發展及/或嚴重性。判斷預後之方法涉及測定來自個體之生物樣本中的IL－13的測試量，並將此測試量與IL－13之預後量或範圍(即來自患有不同嚴重性之氣喘的個人的量或範圍)相比較。在測試樣本中之IL－13的不同量與氣喘之某些預後判斷相一致。偵測到為特殊預後水準量之IL－13可提供對個體之預後判斷。
本發明亦提供藉由偵測IL－13之正調節來監控氣喘及/或特應性病況之進程的方法。監控方法涉及測定第一次和第二次從個體取得之生物樣本中的IL－13的測試量，並比較這些量。第－次和第二次取得之生物樣本中的IL－13量間的變化表示氣喘及/或特應性病症之過程中的變化，IL－13量減少表示氣喘緩解，而IL－13量增加表未氣喘及/或特應性病況加劇。這類監控分析亦可用來評估在接受氣喘及/或特應性病症治療之患者中，特殊治療性介入的效力(如：疾病減弱及/或逆轉)。
可製備以螢光和發色團標示之蛋白質配體。由於抗體和其它蛋白質吸收波長長至約310nm之光，因此應選擇大體上吸收波長高於310nm之螢光部分，宜高於400nm。Stryer(Science(1968)162：526)和Brand等人(Annual Rev.Biochem.(1972)41：843－868)描述多種不同之合適螢光素和發色團。蛋白質配體可藉美國專利第3,940,475、4,289,747和4,376,110號中所揭示之習知程序以螢光發色團標示。黃嘌呤染料為一群具有多種上述所需性質的螢光素，其包括螢光和若丹明。另一群螢光化合物為萘胺。一旦以螢光或發色團將蛋白質配體標示後，可使用其來偵測(如：利用螢光顯微鏡，諸如：共焦顯微鏡或解纏繞顯微鏡)生物樣本中是否存有IL－13，及其位置。
免疫組織化學可利用此文所描述之蛋白質配體進行。例如：在抗體方面，抗體可與標示一起合成(如純化或抗原決定部位標籤)，或者，可如：經由與標示或標示－結合基結合來加上可偵測之標示。例如：可將螯合劑與抗體連接，然後，將抗體與組織學製品，如：在顯微鏡玻片上之固定好的組織切片接觸。在用於結合之溫育程序後，清洗製品以去除未結合之抗體。然後，分析製品，如：利用顯微鏡，以鑑定抗體是否與製品結合。
本技藝之技術熟習人士可感知抗體(或其它多肽或肽)在結合時可為未經標示。結合和清洗之後，再將抗體標示，以使其成為可偵測的。
亦可將IL－13抗體固定在蛋白質矩陣(protein array)上。蛋白質矩陣可作為診斷工具，如：篩選醫學樣本(如：經分離之細胞、血液、血清、活體切片，等)。蛋白質矩陣亦可包括其它配體，如：結合IL－13或其它靶的分子者。
製造多肽矩陣的方法描述於，如：De Wildt et al.(2000)Nat.Biotechnol. 18：989－994：Lueking et al.(1999)Anal.Biochem. 270：103－111；Ge(2000)Nucleic Acids Res. 28,e3,I－VII；MacBeath and Schreiber(2000)Science 289：1760－1763；WO 01/40803和WO 99/51773Al中。用於矩陣之多肽可利用市售之機器人裝置(robotic apparati)(如：來自基因顯微系統(Genetic MicroSystems)或生物機器人(Biorobotics)者)以高速點上。矩陣受質可為，如：硝基纖維素、塑膠、玻璃，如：經修改表面之玻璃。矩陣亦可包括多孔母質，如：丙烯醯胺、瓊質糖或其它聚合物。
例如：矩陣可為抗體之矩陣，如：De Wildt(如上述)所描述者。可將產製蛋白質配體之細胞生長在矩陣版式中的濾紙上。誘導產製多肽，並將表現出之多肽固定在濾紙的細胞位置處。
可將蛋白質矩陣與經標示之靶的接觸以測定靶的與來自多樣股集合庫(diversity strand library)之各固定之多肽的結合程度。若靶的為未經標示者，則可使用三明治法，如：利用經標示之探針來偵測未標示之靶的的結合情形。
關於矩陣之各位置處的結合程度的資料可以略圖形式貯存，如：存在電腦資料庫中。可複製蛋白質矩陣，並用來比較結合略圖，如：靶的和非靶的結合略圖。因此，蛋白質矩陣可用來鑑定對一或多種分子具有所需之結合性質的多樣股集合庫的個別成員。
IL－13抗體可用來標示細胞，如：在樣本(如：患者樣本)中之細胞。該配體亦連接(或可連接)螢光化合物。然後，利用經螢光活化之分類細胞來將細胞分類(如：利用從貝克通狄金森免疫細胞計數系統(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)，加州聖荷西)取得之分類器；亦見美國專利第5,627,037；5,030,002；和5,137,809號)。當細胞通過分類器時，雷射光束激發螢光化合物，而偵測器計算通過之細胞，並藉由偵測螢光來測定螢光化合物是否連接細胞。定量並分析結合各細胞之標示的量，以決定樣本的特徵。
分類器亦可將細胞偏轉，並將與配體結合之細胞和未與配體結合之細胞分開。可將分出之細胞進行培養及/或決定其特性。
在另一種實施態樣中，本發明提供用於在活體內偵測個體中是否存有IL－13的方法。此方法包括(i)給予個體(如：具有與IL－13相關之病症的患者)一與可偵測之標記結合的抗－IL－13抗體；(ii)將個體暴露於用來偵察該可偵測之標記的裝置。例如：藉由NMR或其它斷層X射線裝置將個體進行影像分析。
可用於診斷性影像分析之標示的實例包括放射標示，如：1 3 1 I、1 1 1 In、1 2 3 I、9 9 m Tc、3 2 P、3 3 P、1 2 5 I、3 H、1 4 C、1 8 8 Rh，螢光標示，諸如：螢光和若丹明，核磁共振活性標示，可被正子發射斷層X射線("PET")掃描器偵測到之正予發射同位素，化學發光劑，如：發光素和酶標記，如：過氧化酶或磷酸酶。亦可使用短範圍之放射發射劑，如：可被短範圍偵測器探針偵測到之同位素。例如：見Wensel and Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier,New York for techniques relating to the radioIabeling of antibodies及Colcher et al.(1986)Meth.Enzymol. 121：802816。
經放射標示之配體可用於活體外診斷試驗中。以同位素標示之配體的特殊活性取決於放射活性標示之半生期、同位素純度和該標示併入該抗體之方式。
以放射活性同位素(諸如：1 4 C、3 H、3 5 S、9 9 m Tc、1 2 5 I、3 2 P、3 3 P和1 3 1 I)標示多肽之程序廣為人知。見，如：美國專利第4,302,438號；Goding,J.W.(Monoclonal antibodies：principles and practice：production and application of monoclonal antibodies in cell biology,biochemistry,and immunology 2nd ed.London；Orlando：academic Press,1986.pp 124 126及其中所列出之參考資料；和A.R.Bradwell et al.,"Developments in Antibody Imaging",Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.,(eds.),pp 65 85(Academic Press 1985)。
此文所描述之IL－13抗體可與磁共振影像分析(MRI)對比劑結合。EP－A－0 502814中摘要一些MRI技術。
這些弛豫時間常數中之差異可由對比劑增強。這類對比劑包括數種磁性劑、順磁性劑(其主要改變T1)和含鐵磁性劑或超順磁性劑(其主要改變T2反應)。螫合劑(如：EDTA、DTPA和NTA螫合劑)可用來連接(及減少毒性)一些順磁性物質(如：Fe3 ＋ 、Mn2 ＋ 、Gd3 ＋ )。其它作用劑可為顆粒型式，如：直徑小於10毫米至約10奈米，且具有鐵磁性、抗鐵磁性或超順磁性。
亦可以含有NMR活性1 9 F原子或多種如Pykett((1982)Scientific American 246：78－88)所描述之該類原子的指示基團來標示IL－13抗體，以定位和影像分析IL－13之分佈。
含有結合IL－13之蛋白質配體和診斷用途之指示的套組亦在此文所描述之範圍內，該診斷用途係指，如：IL－13抗體(如：抗體或其抗原結合片段，或其它多肽或肽)於活體外(如：樣本中，如：來自具有與IL－13相關病症之患者的活體切片或細胞)，或於活體內(如：對個體進行影像分析)偵察IL－13的用途。此套組還可含有至少一種額外試劑，如：標示或額外之診斷劑。供活體內使用之配體可調製為藥學組成物。
套組IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段可提供於套組中，如：為套組的一種成分。例如：該套組包括(a)IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段，如：包括IL－13抗體或其片段的組成物，和隨意地(b)資訊物質。此資訊物質可為關於此文所描述之方法及/或IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段於此文所描述之方法中的用途的說明、指示、銷售或其它物質。
此套組之資訊物質不限於其形式。在一種實施態樣中，該資訊物質可包括關於該化合物之製造方法、化合物之分子量、濃度、有效日期、產品批號或製造處所之資訊等。在一種實施態樣中，該資訊物質關於使用配體來治療、預防或診斷此文所描述之病症。
在一種實施態樣中，該資訊物質可包括以合適方式投服IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段以進行此文所描述之方法的指示，如：投服之合適劑量、合適劑型或模式(如：此文所描述之投服劑量、劑型或模式)。在另一種實施態樣中，該資訊物質可包括將IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段投給合適個體的指示，該合適個體係如：人類，如：患有，或處於罹患下列疾病風險中之人類：過敏性氣喘、非過敏性氣喘，或由IL－13－傳介之病症，如：過敏性及/或發炎性病症，或HTLV－1感染。IL－13之產生與HTLV－1感染相關(Chung et al.,(2003)Blood 102：4130－36)。
例如：該物質可包括將IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段投給患者的指示，該患者係患有，或處於罹患下列疾病之風險中：過敏性氣喘、非過敏性氣喘，或由IL－13－傳介之病症，如：過敏性及/或發炎性病症，或HTLV－1感染。
該套組可包括一或多個用於該包含IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段之組成物的容器。在一些實施態樣中，該套組含有用於組成物和資訊物質之分開的容器、分配器或隔室。例如：可將組成物包含在瓶子、藥水瓶或注射器中，而資訊物質可包含在塑膠套或小包中。在其它實施態樣中，該套組之個別成分係包含在單一、未分割之容器中。例如：該組成物係包含在瓶子、藥水瓶或注射器中，其上附著為標示型式之資訊物質。在一些實施態樣中，該套組包括多個(如：一包)個別容器，各含有IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段之一或多個單位劑型(如：此文所描述之劑型)。例如：該套組包括多個注射器、小玻璃瓶、鋁箔小包、噴霧器或吸入裝置，其各含有IL－13拮抗劑，如：抗－IL－13抗體或其片段之單一單位劑量，或數個單位劑量。
該套組隨意地包括適合投服組成物之裝置，如：注射器、吸入器、吸量管、鑷子、量匙、點滴管(如：眼滴管)、拭子(如：棉籤或木籤)，或任何這類遞送装置。在一種較佳之實施態樣中，該裝置為一種分配計量好劑量之配體的可植入裝置。
下列提出之實例係用來協助了解本發明，但不欲，且不應用來在任一方面限制本發明範圍。
實例1
特異於人類IL－13之老鼠單株抗體的產製方法實例1.1：結合人類IL－13之老鼠單株抗體(mAb13.2)的分離方法以重組之人類IL－13(R&D系統，明尼蘇達州明尼亞波里市)將雌BALB/c小鼠免疫化，以製備多株抗血清。藉由ELISA篩選結合人類IL－13之血清。將來自老鼠，顯示出高血清抗體力價之脾細胞與P3X63_AG8.653骨髓瘤(ATCC)融合，並接種在選擇性基質中。經由限制稀釋分殖3次來分離融合物，並篩選產製出之對人類IL－13具結合親和力的抗體。雖然有三種單株抗體可結合IL－13、干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成且中和及/或抑制一或多種與IL－13相關之活性，但我們選擇抗體mAb13.2(IgG1κ)供進一步研究。
實例1.2：以高親和力和特異性結合人類IL－13之老鼠單株抗體，mAb13.2進行數種測量以確定在實例1.1中分離出之老鼠單株抗體，即mAb13.2係以高親和力和特異性結合人類IL－13。首先，利用其上已固定著生物素化之IL－13的69RU抗生蛋白鏈菌素片來進行三種拮抗人類IL－13之單株抗體(mAb13.2、mAb13.4和mAb13.9)的拜爾可T M 分析。將三種抗體個別通過抗生蛋白鏈菌素片，其各自顯示出可快速結合(第1圖)。在交換緩衝劑時，分解作用會緩慢下來(第1圖)。第二，利用其上已固定著mAb13.2之拜爾可片來進行mAb13.2的拜爾可T M 分析。將不同濃度之IL－13通過拜爾可片。同樣地顯示出快速結合和緩慢分離(第2圖)。第三，藉由ELISA分析測定出可結合所有測試形式之人類IL－13的mAb13.2，包括從臍帶血T細胞衍生之天然IL－13(第3圖)。以抗－FLAG M2抗體塗覆在板上。以生物素化之mAb13.2和抗生蛋白鏈菌素－過氧化酶偵測FLAG－人類IL－13之結合情形。ELISA證明mAb13.2和IL－13間之結合可與那些從經有絲分裂因子活化、Th2－偏態之臍帶血單核細胞分離出之天然人類IL－13和重組之人類IL－13相競爭(第3圖)。重組之老鼠IL－13與mAb13.2並無可測得之結合(第3圖)。為了確定從ELISA得到之結果，將單株抗體mAb13.2塗覆在拜爾可片上，並將含有重組人類IL－13或IL－13之多形型(ARG變異體)(其在為氣喘所苦之患者的表現頻率高)的溶液通過該拜爾可片(Heinzmann et al.(2000)Hum.Mol.Genet. 9：594)。二種形式皆顯示出快速結合及無法偵測之從抗體分離的情況(第4A圖)。最後，在GLP(良好實驗室操作)的條件下進行初步交叉反應性研究的期間，mAb13.2顯示出當在包含37個從屍體剖驗或活體切片取得之正常人類組織的嵌板(即：包括所有在DC CPMP指導方針Ⅲ/5271/94草案5之附錄Ⅱ，"單株抗體之產製方法和品質控制"(Annex Ⅱ of the DC CPMP Guideline Ⅲ/5271/94 Draft 5，"Production and quality control of monoclonal antibodies")中之"用於交叉反應性之免疫組織化學檢查之人類組織建議表"上的所有組織，以及所有1997 US FDA/CBER"供人類使用之單株抗體產物的製造和試驗方法中的考量要點"("Points to consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use")之表2中所建議的所有組織的組織嵌板)上進行篩選時並無顯著之交叉－反應性。
實例1.3：於活體外以老鼠單株抗體mAb13.2中和與IL－13相關之活性利用TF1生物分析、人類周圍血液單核細胞和人類周圍血液B細胞確認mAb13.2在活體外中和一或多種與IL－13相關之活性的能力。在合適之條件下，可使人類TF1紅白血病細胞株之增殖成為IL－13－倚賴性。首先，測定由重組人類IL－13或人類IL－13之ARG－變異型的次理想濃度所引起之細胞活素－倚賴性TF1細胞株的增殖是否可被mAb13.2抑制。第4B圖顯示mAb13.2抑制重組人類IL－13或人類IL－13之ARG－變異型二者刺激TF1細胞增殖的能力。第二，使TF1細胞株匱乏IL－13，然後暴露於次理想濃度之重組人類IL－13中，以在純化之老鼠mAb13.2或可溶性IL－13受體(rhuIL－13R2)之存在下誘導TF1細胞增殖。將細胞培養3天，並藉由液體閃爍計數測定在最後4小時間併入之3 H－胸腺核苷。在次理想IL－13濃度下，mAb13.2對TF1之增殖造成劑量倚賴性抑制作用(第5圖)。此作用之IC5 0 ，250pM與可溶性rhuIL－13R2之IC5 0 值高度相當(第5圖)。
由於人類周圍血液單核細胞係藉由增加細胞－表面之低親和力IgE受體(CD23)的表現，以劑量－倚賴方式反應IL－13或IL－4(第6A圖)，因此使用人類單核細胞來確認mAb13.2中和此與IL－13相關之活性的能力。為了測定mAb13.2是否可中和由IL－13傳介之單核細胞在細胞表面上的CD23表現，從健康捐贈者分離出周圍血液單核細胞，並將其與單獨之逐漸增加量的IL－13、單獨之逐漸增加量的IL－4、1奈克/毫升IL－13和逐漸增加量之mAb13.2，或0.3奈克/毫升IL－4和逐漸增加量之mAb13.2一起培育。第二天，收成細胞，並以經CyChrome標示之抗－CD11b(單核細胞標記)和經PE標示之抗－CD23染色。藉由流式細胞儀分析限制進出之CD11b＋單核細胞的CD23表現。如所預期者，mAb13.2抑制由IL－13傳介之CD23表現(第6B圖)，但不會抑制由IL－4引起之CD23表現(第6C圖)。
亦在由IL－13傳介之人類周圍血液B細胞產製IgE的模型中測試mAb13.2之效果。當對IL－13和T細胞有絲分裂因子、PHA反應時，人類B細胞發生Ig同種異構型轉換重組成IgE，而使培養中之IgE水準較高。此效果可被視為產製IgE之B細胞的出現率增加。在作為餵食者之自體經放射照射的PBMCs的存在下將來自健康捐贈者之PBMCs培養在微量滴定盤中，並以PHA和IL－13刺激之。三週後，藉由ELISA分析各槽中之IgE濃度。PHA＋IL－13可增加產製IgE之B細胞株的出現率(第7圖)。mAb13.2可抑制此效果，但IL－13－特異性非中和性抗體(mAb13.8)或對照組老鼠IgG(msIgG)則無法抑制此效果(第7圖)，這證明mAb13.2可有效阻斷由IL－13傳介之經由培養之B細胞的IgE同種異構型轉換。
最後，經由檢查mAb13.2對訊號轉導因子和轉錄活化因子(STAT)6磷酸化之效果來測試mAb13.2阻斷細胞對IL－13之早期反應的能力。當IL－13與其細胞表面受體交互反應時，STAT6二聚體化，而成為磷酸化，並從細胞質轉位至細胞核，其在此處活化細胞活素－反應性基因之轉錄作用(Murata et al.(1995)J.Biol.Chem. 270：30829－36)。在暴露於IL－13後30分鐘內可使用抗磷酸化STAT6之特異性抗體，藉由西方點墨及/或流式細胞分析來偵測此活化作用。
使用HT－29人類表皮細胞株來分析STAT6磷酸化作用。將HT－29細胞在37℃下培養在逐漸增加濃度之IL－13中30分鐘。由西方點墨分析細胞溶胞化物可證明由IL－13傳介之STAT6的劑量倚賴性磷酸化作用(第8圖)。類似地，以飽和濃度之IL－13在37℃處理HT－29細胞30分鐘，並將其固定，使其可滲透化後，以對抗磷酸－STAT6之經AlexaFlour488標示的mAb染色後，經由流式細胞分析證明HT－29細胞中之磷酸化的STAT6(第8B圖)。以同種異構型對照組抗體染色之經處理過的細胞未顯現螢光。最後，當以次理想濃度之單獨的IL－13、IL－13和mAb13.8、IL－13和mAb13.2或IL－13和對照組msIgG1抗體處理細胞時，流式細胞分析顯示出僅有在mAb13.2之存在下處理細胞時才能完全停止STAT6磷酸化，即：雖然mAb13.2可阻斷STAT6磷酸化，但IL－13特異性非中和抗體(mAb13.8)和對照組老鼠IgG1不具效果(第8C圖)。這些研究證明mAb13.2可抑制由IL－13傳介之STAT6磷酸化。
實例1.4：於老鼠單株抗體mAb13.2在活體內中和與IL－13相關之活性利用天生對蛔蟲過敏之獼猴體內由抗原引起之氣道發炎模型測試老鼠mAb13.2中和一或多種與IL－13相關之活性的能力。在此模型中，以蛔蟲抗原挑戰過敏性獼猴可造成發炎細胞，尤其是嗜伊紅血球流入氣道。為了測試mAb13.2預防此細胞流入之能力，在以蛔蟲抗原挑戰前24小時投予抗體。挑戰當天，從左肺取出基線支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣本。然後，經由氣管內途徑將抗原滴入右肺中。24小時後，灌洗右肺，並從經由靜脈內途徑，以8毫克/公斤腹水劑量之純化mAb13.2處理過的動物中取出BAL流體，再將其與來自未處理之動物的BAL流體相比較。與六隻以mAb13.2處理之動物中僅有一隻嗜伊紅血球增加相較下，五隻未處理之動物中於接受挑戰後有四隻嗜伊紅血球增加(第9圖)。未處理群之BAL嗜伊紅血球的百分比顯著增加(p<0.02)，而經抗體處理群則否。這些結果確認mAb13.2可有效預防以抗原挑戰之過敏性動物體內的氣道嗜伊紅血球增多症。
猴子體內之老鼠mAb13.2的平均血清半生期少於一週。在3個月之時間點時，當所有微量mAb13.2皆從血清消褪後，再以蛔蟲重新挑戰經mAb13.2處理過之動物，以確認這些個體之蛔蟲－反應性。在六隻經mAb13.2處理之動物群中有二隻被發現為非反應者。
實例1.5：老鼠單株抗體mAb13.2結合在正常狀態下結合IL－4R之IL－13區域與IL－13相關之活性係假設為透過由IL－13R1和IL－4R鏈所組合之受體複合物傳介。細胞活素先與在細胞表面上之IL－13R1以相當低之親和力進行交互作用。然後，IL－13/IL－13R1複合物吸收IL－4R以形成完整之IL－13受體，此受體以高親和力結合其配體(IL－13)(Zurawski et al.(1993)EMBO J. 12：2663；Zurawski et al.(1995)，J.Biol.Chem. 270：23869)。IL－13與高親和力受體之結合再通過IL－4R鏈傳送訊號至下游，其涉及轉錄(JAK－STAT)途徑之傑尼斯(Janus)激酶－訊號轉導因子和活化因子(如：經由STAT6之磷酸化作用，監控此作用可作為對IL－13之最早的細胞反應之－)(Murata，等，如上述)。數種方法，諸如：抗原決定部位繪圖、X－光結晶學，以及拜爾可分析可用來說明介於老鼠mAb13.2抗體和人類IL－13間之交互作用，並進一步檢查mAb13.2調節一或多種與IL－13相關活性之能力的基本基礎。
藉由X－光結晶學來研究介於mAb13.2和IL－13間之交互作用。在蛋白質A管柱上分離出來自腹水的總IgG，並以木瓜蛋白酶分解之，以產生mAb13.2 Fab片段，再將其高度純化。將Fab片段本身結晶化，再利用同步加速器放射照射，在2.8分析處取得構造分析。另外，將mAb13.2 Fab片段與人類IL－13共同結晶化，再將結晶構造解析至1.8。mAb13.2和IL－13間之主要接觸部位經鑑定主要係在抗體之CDR環，和IL－13之C－螺旋的C－端區群聚成簇(第10圖)。根據第11圖中所顯示之成熟IL－13蛋白質(即分裂出訊號肽之IL－13蛋白質)的編號序列，接觸mAb13.2之IL－13的主要殘基為SEQID NO：32之GLU48、ASN52、GLY68、PRO71、HIS72、LYS73和ARG85。
藉由ELISA確認mAb13.2 Fab片段結合人類IL－13之能力。利用生物素化之mAb13.2偵測FLAG－人類IL－13結合ELISA盤之情況，該ELISA盤係以抗－FLAG M2抗體塗覆一整夜。將未標示之mAb13.2、分離出之mAb13.2 Fab片段或不相關之抗體引入其中，以與生物素化之mAb13.2競爭結合FLAG－人類IL－13。此數據顯示出未標示之mAb13.2和mAb13.2Fab片段可與生物素化之mAb13.2競爭結合合FLAG－人類IL－13(第12圖)。另外，雖然顯示出需要較高濃度之Fab片段來取得與未標示之mAb13.2相同之競爭程度(第12A圖)，但此差異可經由在分析時以競爭作為結合部位之濃度的函數來解決此間題，如：假設各分離出之Fab片段有一個結合部位，各未標示之mAb13.2有二個結合部位(第126B圖)。相對於未標示之mAb13.2和mAb13.2 Fab片段，不相關之抗體無法與生物素化之mAb13.2競爭結合至FLAG－人類IL－13(第12圖)。
如上述，在有或無mAb13.2 Fab片段之存在下，經由測定TF1細胞之增殖和人類周圍血液單核細胞之CD23表現來確認mAb13.2 Fab片段在活體外中和一或多種與IL－13相關之活性的能力。第13A圖顯示出：類似於mAb13.2，mAb13.2 Fab片段可以結合部位濃度－倚賴方式抑制重組人類IL－13刺激TF1增殖之能力。另外，類似於mAb13.2，mAb13.2Fab片段可以結合部位濃度－倚賴方式抑制由IL－13傳介之CD23表現(第13B圖)。
上述之X－光結晶學、抗原決定部位繪圖、ELISA、TF1增殖和CD23表現分析指出mAb13.2結合IL－13螺旋之C－端區，即，IL－4R結合區。為了確認此分析，以拜爾可T M 片來分析介於mAb13.2和IL－13間之交互作用。此分析可以數種形態完成。首先，將IL－4R結合在拜爾可T M 片上，讓預先結合IL－13R1之IL－13複合物流過該拜爾可片。無mAb13.2存在時顯示出可形成三分子複合物。然而，將mAb13.2加入預先結合IL－13R1之IL－13的混合物中時可阻止IL－4R結合至片上。第二，將mAb13.2固定在片上，加入溶液相之結合的IL－13。雖然偵測出IL－13R1與結合之IL－13交互作用，但未偵測出IL－4R與結合之IL－13交互作用。第三，mAb13.2顯示出可結合已與固定在片上之IL－131－Fc或IL－13R1單體的IL－13。這些觀察支持mAb13.2不會抑制IL－13與IL－13R1交互作用，但會干擾IL－13R1與IL－4R間之交互作用。此擾亂作用被認為會干擾功能性IL－13傳訊複合物之形成。這些觀察提供此抗體之中和活性的理論模型。
mAb13.2與IL－13和IL－13R1之複合物的活體外論證提出mAb13.2可結合在細胞表面上之與受體聯結之IL－13結合的可能性。為了測定是否可在飽和之與受體結合之IL－13的條件下偵測到與細胞結合之mAb13.2，以不同濃度之IL－13在4℃處理HT－29人類表皮細胞，再加入單株抗體mAb13.2、mAb13.8或對照組老鼠IgG1。利用生物素化之抗－老鼠IgG1和PE－抗生蛋白鏈菌素藉由流式細胞分析來偵測結合。雖然HT－29細胞可表現IL－13R1，但當mAb13.2之濃度高至2毫克/毫升時則無法偵測到mAb13.2與結合在細胞表面上之IL－13結合。此觀察以及mAb13.2為一或多種與IL－13相關之活性的有效中和劑的論證：指出IL－13傳訊複合物，即：IL－13受體的正常功能可被mAb13.2中斷。
上述之發現確認老鼠單株抗體mAb13.2以高親和力和特異性結合IL－13，並顯現有效之中和活性，即：mAb13.2可有效阻斷所測試之每一與IL－13相關之活性。這些觀察與mAb13.2可與人類IL－13之IL－4R結合部位交互作用，不與IL－13R1結合部位交互作用的發現相關。
實例2
嵌合型mAb13.2抗體(ch13.2)之產製方法實例2.1：嵌合型mAb13.2抗體(ch13.2)之分離方法選殖編碼mAb13.2之可變重鏈(VH)和可變輕鏈(LH)基因，並將從產生該抗體之雜交瘤分離出的mRNA定序。將VH序列分殖入pED6huIgG1_mut表現載體中，其編碼含有二個單點突變(L234A和G237A)之人類IgG1，以減少與人類Fc受體和補體成分(SEQIDNO：17；Morgan et al.(1995)Immunology 86：319－24；Shields et al(2001)J.Biol.Chem. 276：6591－604)結合。將mAb13.2之VL序列分殖入pED6κ表現載體中。將此含有mAb13.2VH和VL序列之表現載體轉染入COS－1細胞中，並從條件基質中純化出嵌合型mAb13.2抗體(ch13.2)。
實例2.2：活體外以嵌合型mAb13.2抗體(ch13.2)中和與IL－13相關之活性測試嵌合型抗體ch13.2結合IL－13之能力。測試單株抗體mAb13.2、mAb13.2之嵌合型(ch13.2)和對照組抗體(13.8)與生物素化之老鼠mAb13.2競爭與固定在具有抗－FLAG抗體之ELISA板上的人類IL－13－FLAG結合的能力。類似於mAb13.2，嵌合型抗體ch13.2可競爭性地結合IL－13(第14圖)。在另一試驗中，以IL－13處理人類周圍血液單核細胞一整夜，以在不同濃度之老鼠mAb13.2或ch13.2的存在下誘導CD23之表現。如第14B圖所示，ch13.2可以與mAb13.2相同之程度來阻止由IL－13所傳介之單核細胞的CD23表現。
實例3
部分和完全人類化之mAb13.2抗體(h13.2v1和h13.2v2)的產製方法實例3.1：部分人類化之mAb13.2抗體(h13.2v1)的分離方法根據胺基酸序列之同源性、CDR集群分析、表現之人類抗體間的使用頻率和人類抗體之結晶構造的可用資訊來將mAb13.2人類化。根據人類DP－54可變重鏈(VH)和DPK－9可變輕鏈(LH)種系基因(分別顯示於，如：第16和17圖中)進行人類化。考量對抗體結合之可能效果、VH－VL配對和其它因子，使老鼠殘基突變成人類殘基，其中老鼠和人類框構殘基相異，但有一些例外。將ch13.2 VH鏈胺基酸序列與預測之人類DP－54種系基因的胺基酸序列相比較，所產生之部分人類化h13.2v1 VH鏈胺基酸序列顯示於第15圖中。將ch13.2 VL鏈胺基酸序列與預測之人類DPK－9的胺基酸序列相比較，所產生之部分人類化h13.2v1 VL鏈顯示於第16圖中。從第16和17圖中可見到，h13.2v1 VH和VL鏈分別保留ch13.2 VH和VL鏈之互補決定區(CDR)或抗原決定區。另外，在VH框構中僅保留－個，在VL框構中僅保留二個老鼠殘基，以降低徹底改變抗原－結合區和VH－VL配對的風險。
經由將編碼(老鼠)mAb13.2之核苷酸序列進行突變以取得部分人類化之mAb13.2，如此，相當於人類種系基因之胺基酸可在指出之框構位置被取代。設計具有最適合在CHO細胞中表現之密碼子的合適核苷酸取代，以引入所欲引入之各胺基酸變化。藉由PCR致變作用之過程完成VH之人類化，其中係使用一次併入一或二個胺基酸之突變的寡核苷酸引物，以將老鼠模板基因序列增數。需進行數回合之PCR致變作用，以達到部分人類化。使用含有9個重疊之寡核苷酸(其相當於具有合適之核苷酸取代的老鼠VL序列)的控制組，藉由PCR完成VL之人類化作用。以重疊區作為模板，使用PCR來填充介於意義和反義股上之引物間的溝隙。所產生之部分人類化的抗體稱為h13.2v1。編碼h13.2v1之VL和VH的核苷酸序列分別定名為SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。
實例3.2：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)的分離方法如第15圖和第16圖中所指示，h13.2v1在框構區中保留3個老鼠殘基：－個在VH鏈中，二個在VL鏈中。mAb13.2Fab與人類IL－13之共同結晶構造的初步工作和分析確認所有3個殘基均可突變成人類殘基。這些為VH鏈中之殘基#3(在老鼠中為K，在人類中為Q)，VL鏈中之殘基#4(在老鼠中為L，在人類中為M)和VL鏈中之殘基#72(在種系中之#68；在老鼠中為R，在人類中為G)。因此，為了製造mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v2)，使用PCR致變作用將突變K3Q引入h13.2v1之VH鏈，將突變L4M和R72G引入h13.2v1之VL鏈中。h13.2v2之最終VH和VL序列分別顯示於第17圖和第18圖中。編碼h13.2v2之VH和VL的核苷酸序列分別定名為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8。
根據第29圖中所示之序列(利用線性編號方案)，測定出使氫鍵與IL－13接觸之mAb13.2重鏈的主要殘基為SER50(CDR2)、SER53(CDR2)、TYR101(CDR3)和TYR102(CDR3)。另外，使凡得瓦與IL－13接觸之mAb13.2重鏈的主要殘基為ILE30(CDR1)、SER31(CDR1)、ALA33(CDR1)、TRP47、SER50(CDR2)、SER52(CDR2)、SER53(CDR2)、TYR58(CDR2)、LEU98(CDR3)、ASP99(CDR3)、GLY100(CDR3)、TYR101(CDR3)、TYR102(CDR3)和PHE103(CDR3)(根據第29圖，利用線性編號方案)。
根據第30圖中所示之序列(利用線性編號方案)，測定出使氫鍵與IL－13接觸之mAb13.2輕鏈的主要殘基為ASN31(CDR1)、TYR32(CDR1)、LYS34(CDR1)、ASN96(CDR3)和ASN98(CDR3)。另外，使凡得瓦與IL－13接觸之mAb13.2輕鏈的主要殘基為ASN31(CDR1)、TYR32(CDR1)、LYS34(CDR1)、ANG54(CDR2)、ASN96(CDR3)、ASN98(CDR3)和TYR100(CDR3)(根據第30圖，利用線性編號方案)。
實例3.3：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)保留全部與IL－13結合之活性依實例2中之描述，藉ELISA測定完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)與生物素化之mAb13.2競爭與IL－13－FLAG結合的能力。數據顯示mAb13.2之嵌合型(ch13.2)、部分人類化(h13.2v1)和完全人類化(h13.2v2)變化體可以類似程度之能力與生物素化之mAb13.2競爭結合FLAG－人類IL－13(第19A圖)。拜爾可分析亦確認IL－13可快速結合固定之h13.2v2，並與其慢速分解(第19B圖)。
實例3.4：完全人類化mAb13.2抗體(h13.2v2)可於活體外中和與IL－13相關之活性另外，依實例1.3之描述藉由流式細胞分析測定mAb13.2之嵌合型(ch13.2)、部分人類化(h13.2v1)和完全人類化(h13.2v2)變化體抑制由IL－13所傳介之人類單核細胞之細胞表面的CD23表現，並減少HT－29細胞中由IL－13引起之STAT6磷酸化的能力。簡單地說，將人類周圍血液單核細與次理想濃度之重組人類IL－13在逐漸增加濃度之ch13.2、h13.2v1或h13.2v2的存在下培育一整夜。限制單核細胞的進出，並分析CD23之表現，以作為IL－13反應性之指示。流式細胞分析顯示出所有三種mAb13.2之變化體，即ch13.2、h13.2v1和h13.2v2均可以劑量倚賴方式減少由IL－13所傳介之單核細胞的CD23表現。
為了測試STAT6磷酸化作用，將HT－29細胞在37℃下與次理想劑量之重組人類IL－13和逐漸增加濃度之ch13.2、h13.2v1或h13.2v2一起培育30分鐘，然後，利用抗磷酸化STAT6的AlexaFlour488－標示單株抗體來分析磷酸化之STAT6的表現。經由流式細胞分析證明所有三種mAb13.2之變化體，即ch13.2、h13.2v1和h13.2v2均可減少由IL－13所傳介之STAT6磷酸化作用(第20B圖)。
由於h13.2v2可在活體外抑制與重組IL－13相關的活性和與天然人類IL－13相關的活性(第21圖)，因此，在動物模型中測試其抑制與IL－13相關之病症的能力。在用於測試完全人類化之mAb13.2，h13.2v2的準備工作中，分析該抗體在呼吸疾病之非人類靈長類(NHP)和綿羊模型中於中和源自獼猴或源自綿羊之重組IL－13的能力。從獮猴或綿羊選殖IL－13。將NHP IL－13表現在大腸桿菌中，依製備重組人類IL－13之程序純化及使之倍量。相對地，將重組之綿羊IL－13表現在中國大頰鼠卵巢(CHO)細胞中。在活體外測試mAb13.2或h13.2v2抑制一或多種與IL－13之重組NHP獮猴型相關活性的能力。第22圖顯示h13.2v2可強力中和獮猴NHP IL－13誘導人類單核細胞之細胞表面的CD23表現之能力。然而，由於中和與綿羊IL－13相關之活性需要更高濃度之抗體，因此h13.2v2僅微弱中和綿羊IL－13(第22圖)。
實例3.5：完全人類化mAb13.2(h13.2v2)在綿羊之氣喘模型中可中和IL－13活性儘管h13.2v2中和綿羊型IL－13之生物活性的效力相當低，測試h13.2v2在由蛔蟲引起之氣道反應過度的綿羊模型中的效力。綿羊可經由自然暴露於圓蟲寄生蟲(蛔蟲)而對其敏感化。當以蛔蟲抗原進行肺部挑戰時，該動物發生類似於氣喘之人們對抗原挑戰之反應的支氣管縮小。此反應由立即反應和挑戰開始後4－5小時之接下去的末期反應所組成。早期反應被認為係一種平滑肌反應，而末期反應為一種發炎反應。
為了測試h13.2v2減輕由蛔蟲引起之支氣管縮小的能力，經由靜脈內(i.v.)注入投給綿羊20毫克/公斤、5毫克/公斤或2毫克/公斤抗體。注入後24小時，以蛔蟲抗原給予動物氣管內挑戰。結果指出20毫克/公斤或5毫克/公斤之h13.2v2可減弱動物對抗原之末期反應(第23圖)，與對照組相較下，2毫克/公斤之h13.2v2對抗原反應無顯著效果，推測此係由於h13.2v2對綿羊IL－13之微弱中和活性。
另外，在綿羊中測試h13.2v2減輕以膽鹼能激動劑卡巴可進行氣道挑戰所引起之氣道反應過度的能力。卡巴可引起之支氣管縮小係經由測量用力呼氣量(FEV)所減低之數值來測定，而在氣喘患者中引起指定幅度之反應的所需刺激劑量通常低於在正常個體中所需者。使綿羊保持未經處理，或在卡巴可－吸入挑戰前24小時，經由靜脈內途徑投給綿羊20毫克/公斤、5毫克/公斤或2毫克/公斤之h13.2v2，在以蛔蟲挑戰前和挑戰後測定PC400。數據顯示20毫克/公斤或5毫克/公斤之h13.2v2可預防以蛔蟲進行挑戰所引起之PC400快速下降(第24圖)。類似於抗原反應實驗之結果，與對照組相較下，2毫克/公斤之h13.2v2對PC400無顯著效果。
實例3.6：完全人類化mAb13.2(h13.2v2)在非人類靈長類氣喘模型中可中和IL－13活性為了測試h13.2v2在非人類靈長類中預防由蛔蟲引起之肺部感染的能力，以生理食鹽水、8毫克/公斤不相關之人類IgG(IVIG)或2毫克/公斤地塞米松(dexamethasone)(作為陽性對照組)經由肌肉內途徑處理對照組獼猴。經由靜脈內途徑投給測試獼猴10毫克/公斤h13.2v2。第二天，從左肺收集挑戰前BAL樣本，並以蛔蟲抗原經由氣管內途徑在動物右肺進行挑戰。挑戰後24小時，從右肺收集BAL樣本並分析細胞浸潤液。結果顯示以h13.2v2預先處理動物可預防由蛔蟲過敏原所引起之氣道感染(第25圖)。在一種平行實驗中，在蛔蟲挑戰後可在BAL中誘導出IL－5和嗜伊紅趨化素。以h13.2v2預先處理動物可降低所誘導出之IL－5和嗜伊紅趨化素的水準。
對蛔蟲產生敏感之非人類靈長類可對蛔蟲抗原發展出IgE。此IgE與循環之嗜鹼細胞上的FcεRI結合，如此，在活體外以蛔蟲抗原挑戰周圍血液嗜鹼細胞時可引起去顆粒作用及釋出組織胺。重覆暴露於抗原可加強嗜鹼細胞之敏感化，而增強組織胺釋出反應。為了測試h13.2v2對此過程之作用，在蛔蟲挑戰後8週抽取接受如上述之h13.2v2或生理食鹽水或IVIG對照劑量之獼猴的血液，並藉由ELISA測定血漿中全部和蛔蟲－特異性IgE的水準。在接受挑戰後8週，以生理食鹽水或IVIG處理之對照組動物的蛔蟲－特異性IgE的水準增加(第31B圖)。相對的，以h13.2v2處理之動物顯示出特異於蛔蟲之循環IgE的水準顯著降低(第31A圖)。在任何處理群中，全部IgE滴定度均無顯著變化。
為了評估對嗜鹼細胞組織胺釋出之效果，在蛔蟲挑戰後24小時、8週和4個月抽取動物血液。在37℃，以蛔蟲抗原挑戰全血30分鐘，並藉由ELISA定量釋入上清液中之組織胺(Beckman Coulter,Fullerton,CA)。如第32A圖所示，這些敏感化之動物顯示出即使在分段抗原挑戰前蛔蟲亦可誘導嗜鹼細胞釋出一些組織胺。挑戰後，對照組動物顯示出所預期之嗜鹼細胞反應性增加。相對的，以h13.2v2處理之動物無法增加嗜鹼細胞敏感度，如此，挑戰後2－4個月，其於活體外對蛔蟲所產生之組織胺釋出反應顯著降低(第32B圖)。因此，在此模型中，單次投服h13.2v2之可具有長期之疾病改善活性。
實例4
根據不同人類種系基因之mAb13.2人類化方法實例3提供根據DP－54和DPK9種系基因將mAb13.2人類化，且成功將其人類化的方法；在此實例中扼要描述根據其它種系基因將mAb13.2人類化的方法。
根據人類種系抗體序列，或其次群的分析來設計其它人類化策略，該次群序列與老鼠抗體可變區之確實胺基酸序列擁有高度同質性，即序列類似性。例如：V－基座之第3群VH顯示出與mAb13.2具高度之序列類似性。mAb13.2之重鏈可變區的CDRs經測定出可轉移入在第3群VH內之種系基因內的任一次群中，即：3－53(DP－42)、3－48(DP－51)、3－09(DP－31)、3－13(DP－48)、3－15(DP－38)、3－20(DP－32)、3－21(DP－77)、3－23(DP－47)、3－30和3－30.5(DP－49)、3－64(DP－45)、3－66(DP－86)和3－73(YAC－9)(第26圖)。第26圖中亦顯示DP－61之序列，其可用來將mAb13.2人類化。下列共通之胺基酸取代經測定出可引入mAb13.2中，以將其VH框構轉化成任一種所提出之人類種系化框構：K3Q、K13Q或K13R、K19R、T40A、E42G、R44G、R75K、177S或177T、S83N、S87A或S87D、M92V或M92L和T113L。用於根據特殊種系基因進行人類化之個別胺基酸取代有，如：根據DP－47之人類化作用可能涉及V5L、A49S和A74S之額外突變；根據DP－42之人類化作用可能涉及V12I、A49S和A74S之額外突變；根據DP－51之人類化作用可能涉及A49S之額外突變；根據DP－48之人類化作用可能涉及P41T、D72E和E88G；根據DP－53之人類化作用可能涉及E46V和A49S之額外突變；根據DP－32之人類化作用可能涉及L11V、A49S和Y94H之額外突變；根據DP－38之人類化作用可能涉及A49G、A74D、R75S、N76K、R86K和S87T之額外突變；根據DP－31之人類化作用可能涉及G16R、A49S和R97K之額外突變；根據DP－61之人類化作用可能涉及W47Y、A49S、A74S和T90M之額外突變；及根據DP－45之人類化作用可能涉及E6Q、A24G、A49S和T90M之額外突變。例如：當mAb13.2之人類化作用係根據具有79%之序列一致性的人類種系基因DP－47時，可將下列突變引x mAb13.2中：K3Q、V5L、K13Q、K19R、T40A、E42G、R44G、A49S、A74S、R75K、177T、S83N、S87A、M92V和T113L。在人類化作用期間根據特殊之人類種系基因將共通之胺基酸取代單獨引入或與個別之胺基酸取代一起引入mAb13.2中應可產生活性抗體。例如：當依下述根據3－21(DP－77)將mAb13.2進行人類化時可產生活性抗體，h13.2v3。
一種將mAb13.2人類化之替換方法係以種系基因DP－77和B1為基礎。第27圖中顯示介於DP－77之預測的胺基酸序列、ch13.2之可變重鏈胺基酸序列和完全人類化之mAb13.2抗體(h13.2v3)的重鏈胺基酸序列間的比對。第28圖中顯示介於B1之預測的胺基酸序列、ch13.2之可變輕鏈胺基酸序列和h13.2v3的可變輕鏈胺基酸序列間的比對。DP－77和B1之預測的胺基酸序列分別顯示出與mAb13.2之可變重鏈具有80.4%之胺基酸一致性，與mAb13.2之可變輕鏈具有77.5%之胺基酸一致性。雖然DP－77與mAb13.2之重鏈(以及ch13.2之重鏈)間的胺基酸差異，和B1與mAb13.2之輕鏈(以及ch13.2之輕鏈)間的胺基酸差異可在框構和互補決定區二者中發現，但CDRs中之差異仍保持不變。相對的，當在重鏈mAb13.2之框構區中所發現之胺基酸與在DP－77之相同位置中的胺基酸不同時，mAb13.2之可變重鏈中的胺基酸變更為DP－77中之胺基酸。類似地，當在mAb13.2之輕鏈的框構區中所發現的胺基酸與在B1之相同位置中的胺基酸不同時，則mAb13.2之可變輕鏈中的胺基酸變更為B1中之胺基酸。在重鏈和輕鏈中之第一回合的改變之後依實例2中之描述進行ELISA，以確定該變化不會影響抗體結合IL－13之能力。在第二回合的改變之後，mAb13.2之重和輕鏈內的框構區的胺基酸序列分別與DP－77和B1之框構區的胺基酸序列相一致。
人類化之mAb13.2抗體，h13.2v3亦可在活體外抑制與IL－13相關之活性。藉由ELISA和TF1增殖分析測試h13.2v3，以測定其結合IL－13並抑制一或多種與IL－13相關之活性的能力。結果顯示：與ch13.2和h13.2v1相較下，h13.2v3可以類似程度與mAb13.2競爭結合IL－13。另外，h13.2v3可以與mAb13.2和h13.2v1相同之程度抑制TF1增殖。
實例5
由h13.2v2之野生型Fc回復株傳介的效應子活性IL－13受體之細胞傳訊型(其包括IL－13Rα1和IL－4Rα多肽)係在可對細胞活素反應之細胞類型的表面上發現。IL－13Rα2通常不會表現在IL－13－反應性細胞之表面上，但已有在腦部、頭部和頸部腫瘤上出現的報導(Kawakami et al.(2003)Clin.Cancer Res. 9：6381－8；Mintz et al.(2002)Neoplasia 4：388－99；Liu et al.(2000)Cancer Immunol.Immunother. 49：319－24)。亦可在經IFNγ處理之初級人類單核細胞(Daines et al.(2002)J.Biol.Chem. 277：10387－93)或經TNFα－或IL－13處理之初級人類纖維母細胞(Yoshikawa et al.(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun. 312：1248－55)上誘導IL－13Rα2表現。此受體無法傳介傳訊反應給IL－13(Kawakami et al.(2001)Blood 97：2673－9)，但顯示出可作為誘蝕受體，與IL－13Rα1競爭與IL－13交互作用(Feng et al.(1998)Lab.Invest. 78：591－602)。IL－13Rα2對IL－13具高親和力(Andrews et al.(2002)J.Biol.Chem. 277：46073－8)，並顯示出主要與細胞活素之C－端區作用(Madhankumar et al.(2002)J.Biol.Chem. 277：43194－205)，而該區預期並不包括h13.2v2結合部位。因此，檢查h13.2v2是否可與被細胞表面上之IL－13Rα2所捕捉之IL－13交互作用。A375為一種表現IL－13Rα2之人類黑色瘤細胞株。在4℃，將重組之人類IL－13(3奈克/毫升)與這些細胞接觸20分鐘。清洗該細胞，並測試其與生物素化之h13.2v2的結合情形。結果顯示出抗體在IL－13之存在下，以劑量－倚賴方式結合這些細胞，這表示h13.2v2係與該與其受體結合之IL－13結合(第33圖)。
為了測定h13.2v2是否可促進Fc－倚賴性效應子之功能，將突變之h13.2v2的Fc殘基(L234A/G237A；SEQ ID NO：17之殘基116和119)回復成野生型，並將表現抗體之野生型或突變之Fc表現出及純化。使用裝載IL－13之A375細胞作為靶的，在抗體－倚賴性細胞性細胞毒性分析(ADCC)中測試效應子之功能。以鉻－51標示A375細胞，並將其與10奈克/毫升之重組人類IL－13一起培育。使用藉由羅塞特沙普人類NK加濃混合物(RosetteSepHuman NK Enrichment Cocktail)來增濃其中之天然殺傷(NK)細胞的人類PBMC作為效應子。將效應子和靶的細胞在逐漸增加濃度之h13.2v2或其野生型Fc回復株的存在下一起在37℃培養5小時。當鉻－51釋入上清液時測量細胞毒性，並以最大釋出量之百分比表示結果，而該最大釋出量係經由以三通(Triton)X－100溶解該A375靶的細胞來測定。
結果顯示出野生型之Fc回復株可傳介裝載IL－13之A375靶的細胞的ADCC，而h13.2v2則否(第34A圖)。無IL－13存在時則未觀察到細胞毒性(第34B圖)。利用來自三種不同捐贈者之效應子細胞可見到類似結果。這些結果指出：由於存有L234A和G237A Fc突變，因此，h13.2v2即使在理想之活體外條件下亦無法傳介ADCC。
綜合這些觀察結果指出：h13.2v2可結合表現IL－13Rα2之細胞(第33圖)，但不會結合表現IL－13Rα1之細胞。進行實驗以測試h13.2v2之野生型回復株是否可傳介表現IL－13Rα1之HT－29細胞的ADCC，即使是無可偵測之結合存在時。在依上述進行之ADCC分析中使用HT－29細胞作為靶的。結果顯示在導致表現IL－13Rα2之A375細胞發生細胞溶解的條件下，表現IL－13Rα1之HT－29細胞不會溶解(第35圖)。這些結果亦顯示出：雖然包括L234A和G237A Fc突變之抗體不會引起ADCC，但具野生型Fc效應子功能之抗體可用來治療某些表現IL－13R2之癌症。
實例6
在COS細胞中表現人類化之13.2抗體為了評估人類化抗－IL－13抗體在哺乳動物重組系統中之表現情況，將老鼠13.2之可變區(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13)、hu13.2V1(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15)及hu13.2V2(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16)分殖入含有人類κ和IgG1 mut恆定區的pED6表現載體中。將猴腎COS－1細胞生長在含有下列物質之DME介質(吉布可(Gibco))中：10%加熱去活化之胎牛血清、1mM麩醯胺和0.1毫克/毫升之青黴素/鏈黴素。根據供應者建議之議定書，利用TransitIT－LT1轉染試劑(Mirus Bio Corp.,Madison,WI)進行COS細胞之轉染工作。將經轉染之COS細胞在37℃，10%CO2 的存在下培養24小時，以無菌PBS清洗之，然後將其生長在不含血清之介質R1CD1(吉布可)中48小時，以使其分泌抗體，並使抗體在條件介質中累積。利用純化之人類IgG1/κ抗體作為標準，藉由全部人類IgG ELISA來定量13.2抗體之表現。嵌合型13.2抗體以及二種人類化之變化體可在COS細胞中表現良好。
表5. 人類化之13.2抗體在COS細胞中之過渡表現
第1圖：mAb13.2結合人類IL－13之動力學參數。以在一段期間內(x－軸)之共振單位(RU；y－軸)說明固定於69RU抗生蛋白鏈菌素片上之生物素化的IL－13與單株抗體mAb13.2、單株抗體mAb13.4或單株抗體mAb13.9間之交互作用。亦顯示mAb13.2之動力學常數。
第2圖：mAb13.2結合人類IL－13之動力學參數。以在－段期間內(x－軸)之共振差異(RU；y－軸)說明不同劑量之人類IL－13與固定於拜爾可片上之單株抗體mAb13.2間的交互作用係。亦顯示mAb13.2之動力學常數。
第3圖：單株抗體mAb13.2結合天然之人類IL－13。此圖形顯示：在逐漸增加濃度(x－軸)之重組人類IL－13(◆)、重組老鼠IL－13(●)或天然人類IL－13(△)(其係從經有絲分裂因子活化、Th2－偏態的臍帶血單核細胞分離出)之存在下，結合FLAG－人類IL－13之生物素化mAb13.2的平均吸收值(A4 5 0 ；y－軸)。
第4圖：單株抗體mAb13.2結合並中和人類IL－13之ARG－變異型。(A)將人類IL－13或IL－13之經重組表現的ARG－變異體通過固定在拜爾可片上之生物素化的mAb13.2的反應(y－軸)係以時間之函數(x－軸)顯示。(B)顯示出與逐漸增加濃度之mAb13.2(x－軸)及重組之人類IL－13或經重組表現之IL－13的ARG－變異體一起培育的TF1細胞的增殖情形。
第5圖：單株抗體mAb13.2抑制人類IL－13之生物活性的IC50值與可溶性IL－13受體之IC50值相當。將TF1細胞株與IL－13和逐漸增加濃度(x－軸)之mAb13.2或可溶性IL－13受體(rhuIL－13Ra2)一起培育三天後，經由併入3 H－胸腺核苷來測量cpm(y－軸)，以測定IL－13－倚賴性之TF1細胞株之增殖情形。
第6圖：單株抗體mAb13.2會抑制正常人類單核細胞上由IL－13傳介之CD23的表現，但不會抑制由IL－4傳介之CD23的表現。(A)顯示出將從健康捐贈者分離出之周圍血液單核細胞(PBMCs)以指示濃度(x－軸)之重組人類IL－13(●)或IL－4(○)處理一整夜後，表現細胞表面CD23之單核細胞的百分比(y－軸)。(B)顯示出將從健康捐贈者分離出之PBMCs以IL－13和指示濃度(x－軸)之經純化的老鼠mAb13.2(x－軸)處理後，表現細胞表面CD23之單核細胞的百分比(y－軸)。(C)顯示出將從健康捐贈者分離出之PBMCs以IL－4和指示濃度(x－軸)之經純化的老鼠mAb13.2(x－軸)處理一整夜後，表現細胞表面CD23之單核細胞的百分比(y－軸)。
第7圖：單株抗體mAb13.2會抑制人類B細胞製造IL－13－倚賴性IgE。從培養在單獨之基質，或不同組合之PHA、IL－13、對照組抗體(ms IgG)、mAb13.2和mAb13.8(x－軸)中的PBMCs分離出的上清液中，其中之IgE濃度係以450nm處之吸收值表示(IgE(O.D.450)；y－軸)。
第8圖：單株抗體mAb13.2會抑制由IL－13傳介之人類表皮細胞的STAT6磷酸化作用。(A)顯示出從以指示之IL－13濃度處理過之HT－29細胞分離出的細胞溶胞化物中，磷酸化之STAT6的西方點墨分析結果。(B)此圖形說明經由流式細胞分析所測定之HT－29細胞數(計數；y－軸)，其顯示未經處理(填色之長條圖)或以IL－13處理(未填色之長條圖)之細胞，以抗磷酸化STAT6之經AxlexaFlour488標示的mAb染色後的螢光(磷酸－STAT6；x－軸)。(C)此圖形說明經由流式細胞分析所測定之HT－29細胞數(計數；y－軸)，其顯示保持未處理(填色之長條圖)；或以下列各項處理(未填色之長條圖)之細胞：IL－13(左上圖)，IL－13和mAb13.8(左下圖)，IL－13和mAb13.2(右上圖)，或IL－13和對照組抗體(msG1)(右下圖)，以經AxlexaFlour488標示之mAb染色後的螢光(磷酸－STAT6)。
第9圖：單株抗體mAb13.2可在活體內抑制由蛔蟲引起之肺部嗜伊紅血球增多症。此圖形說明在支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣本中(y－軸)所發現之嗜伊紅血球的百分比，該BAL樣本係採自未經處理之獼猴(蛔蟲/PBS)(●，●)、以mAb13.2預先處理之獼猴(蛔蟲/mAb13.2)(◆，◆)或以mAb13.2預先處理並以蛔蟲抗原挑戰之獼猴(蛔蟲/給予抗體後~3個月再挑戰)(▲，▲)，包括以蛔蟲抗原挑戰前(暗色符號)或挑戰後24小時，或再挑戰(淡色符號)之樣本。
第10圖：mAb13.2 Fab片段與人類IL－13之共同結晶構造。mAb13.2 Fab片段之X－光結晶學揭露具暗影之輕鏈和為淡影之重鏈。圖中亦顯示IL－13構造(在右邊)。此圖形亦描述IL－13之C－α螺旋與抗體之CDR環間的交互作用。
第11圖：顯示mAb13.2接觸部位之人類IL－13序列分析。此嵌表顯示人類IL－13之胺基酸序列，其中該箭頭指出訊號肽分裂部位，四個α螺旋為下方劃線者，源自mAb13.2Fab－IL－13共同結晶構造之抗體接觸部位突顯於淡色框中，而ARG－變異體則突顯於暗色框中。
第12圖：mAb13.2之Fab片段結合人類IL－13。此圖形顯示在以(A)pM抗體或(B)pM結合部位表示之逐漸增加濃度的競爭性未經標示的mAb13.2(◆)、mAb13.2 Fab片段(●)或不相關之抗體(*)的存在下，結合FLAG－人類IL－13之生物素化的mAb13.2的平均吸收值(450nm；y－軸)。
第13圖：mAb13.2之Fab片段中和由IL－13傳介之TF1細胞增殖和由IL－13傳介之人類單核細胞的CD23表現。(A)此圖形顯示將IL－13－倚賴性TF1細胞株與IL－13和逐漸增加濃度之競爭子結合部位(x－軸)(其係由mAb13.2(◆)或mAb13.2 Fab片段(●)所提供)一起培育3天後，IL－13－倚賴性TF1細胞株所達到之最大增殖百分比(y－軸)。(B)此圖形顯示以1奈克/毫升IL－13和指示濃度之競爭子結合部位(x－軸)(其係由mAb13.2(◆)或mAb13.2 Fab片段(●)所提供)處理從健康捐贈者分離出之周圍血液單核細(PBMCs)一整夜後，藉由流式細胞分析所測定之表現細胞表面CD23的最大單核細胞數的百分比(y－軸)。
第14圖：老鼠單株抗體mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)結合並中和IL－13。(A)此圖形顯示經由ELISA所測定之僅含IL－13－FLAG和生物素化之mAb13.2的樣本(－－)及含有IL－13－FLAG、生物素化之mAb13.2和逐漸增加濃度(x－軸)之mAb13.8(●)、mAb13.2(○)或嵌合型mAb13.2(ch13.2；▲)之樣本在450nm處之吸收(A4 5 0 ；y－軸)(B)此圖形顯示以1奈克/毫升IL－13和指示濃度(x－軸)之純化的老鼠mAb13.2(●)或嵌合型mAb13.2(ch13.2；◆)處理從健康捐贈者分離出之PBMCs一整夜後，表現細胞表面CD23的單核細胞百分比(y－軸)。
第15圖：人類DP－54種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)的可變重鏈(VH)胺基酸序列的比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，DP－54、mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)的可變重鏈區和mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)的可變重鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中為該mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為下方劃線者。
第16圖：人類DPK9種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)的可變輕鏈(VL)胺基酸序列的比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，DPK9、mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)的可變輕鏈區和mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)的可變輕鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中為該mAb13.2之部分人類化變化體(h13.2v1)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為下方劃線者。
第17圖：人類DP－54種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v2)的可變重鏈(VH)胺基酸序列的比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，DP－54、mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)的可變重鏈區和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v12)的可變重鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中為該mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v2)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為下方劃線者。
第18圖：人類DPK9種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v2)的可變重鏈可變輕鏈(VL)胺基酸序列的比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，DPK9、mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)的可變輕鏈區和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v12)的可變輕鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中為該mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v2)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為下方劃線者。
第19圖：完全人類化mAb13.2(h13.2v2)保留對IL－13之完全結合活性。(A)此圖形顯示經由ELISA所測定之僅含IL－13－FLAG和生物素化之mAb13.2的樣本(－－)和含有IL－13－FLAG、生物素化之mAb13.2及逐漸增加濃度(x－軸)之mAb13.2(●)、嵌合型mAb13.2(ch13.2；○)、部分人類化之mAb13.2(h13.2v1；▲)或完全人類化之mAb13.2(h13.2v2；△)的樣本在450nm處之吸收(A4 5 0 ；y－軸)(B)此圖形以在一段期間內(x－軸)之共振差異RU；y－軸)說明在不同劑量範圍內之人類IL－13和固定在拜爾可片上之完全人類化mAb13.2(h13.2v2)間的結合交互作用。其中亦顯示h13.2v 2之動力學常數第20圖：嵌合型mAb13.2(ch13.2)、部分人類化之mAb13.2(h13.2v1)和完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)可中和由IL－13所傳介之CD23表現和由IL－13傳介之STAT6的磷酸化作。(A)此圖形顯示將從健康捐贈者分離出之PBMCs以1奈克/毫升IL－13和指示濃度(x－軸)之嵌合型mAb13.2(ch13.2；◆)、部分人類化之mAb13.2(h13.2v1；□)或完全人類化之mAb13.2(h13.2v2；●)處理一整夜後，表現細胞表面CD23之單核細胞的百分比(y－軸)。(B)圖形說明與IL－13和指示濃度(x－軸)之嵌合型mAb13.2(ch13.2；◆)、部分人類化之mAb13.2(h13.2v1；□)或完全人類化之mAb13.2(h13.2v2；●)一起培育後，經由流式細胞分析所測定之表現磷酸化之STAT6的HT－29細胞的百分比(y－軸)。
第21圖：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)中和由人類IL－13傳介之CD23表現的能力與mAb13.2之該能力相當。該與(A)重組之人類IL－13或(B)天然人類IL－13和逐漸增加濃度(x－軸)之mAb13.2(●)或完全人類化之mAb13.2(h13.2v2；◆)一起培育後，表現細胞表面CD23之經限制出入的單核細胞的數目係以僅與IL－13一起培育後，表現細胞表面CD23之最大單核細胞數的百分比表示(%最大反應；y－軸)。
第22圖：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)中和由非人類靈長類或綿羊IL－13傳介之CD23表現的能力與mAb13.2之該能力相當。該與(A)重組之非人類靈長類IL－13(rec NHP IL－13)或(B)重組之綿羊IL－13(rec綿羊IL－13)和逐漸增加濃度(x－軸)之mAb13.2(●)或完全人類化之mAb13.2(h13.2v2；◆)一起培育後，表現細胞表面CD23之經限制出入的單核細胞的數目係以僅與IL－13一起培育後，表現細胞表面CD23之最大單核細胞數的百分比表示(%最大反應；y－軸)。
第23圖：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)可減輕綿羊之末期支氣管縮小。所顯示者為未處理(對照組；◆)，或以(A)20毫克/公斤或(B)5毫克/公斤劑量之完全人類化mAb13.2(h13.2v2；■)預防性處理的綿羊在蛔蟲抗原挑戰前24小時(基線)、挑戰期間(蛔蟲)和挑戰後數小時(x－軸)所測量之氣道抵抗力百分比(y－軸)。所顯示之數據為每群三隻綿羊之樣本大小的平均值＋s.d.。
第24圖：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)可預防綿羊體內之氣道反應過度。此圖形顯示在蛔蟲挑戰前和後(x－軸)，在以(A)20毫克/公斤或(B)5毫克/公斤之完全人類化mAb13.2(h13.2v2；□)預防性地處理或保持未處理(對照組；■)之綿羊中引起指定幅度之反應(PC400；y－軸)所需的卡巴可的劑量百分比。所顯示之數據為每群三隻綿羊之樣本大小的平均值＋s.d.。
第25圖：完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)可在非人類靈長類體內預防由抗原引起之肺部發炎。此圖形顯示以蛔蟲抗原挑戰前(0)或挑戰後24小時(24)，於從下列各組中所取出之支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣本中找到的總細胞數(y－軸)：以生理食鹽水經由靜脈內途徑處理之對照組獼猴(●)、以2毫克/公斤地塞米松(dexamethasone)經由肌肉內途徑處理之陽性對照組獼猴(*)、以8毫克/公斤不相關之人類IgG(IVIG)預先處理之陰性對照組獼猴(▲)或以完全人類化之mAb13.2(h13.2v2)經由靜脈內途徑預先處理之獼猴(▼)。橫槓亦記述在各組BAL樣本中所發現之平均細胞數。圖中亦顯示利用不成對T檢驗所取得之p值。
第26圖：mAb13.2可根據與其它人類種系基因之V－座第3群VH中的序列同質性進行人類化。此圖形顯示mAb13.2之胺基酸序列與資料庫V－座之第3群VH內的人類種系胺基酸序列的比對結果。黑體序列為所提出之在將mAb13.2人類化時可作為根據的序列。
第27圖：人類DP－77種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)的可變重鏈(VH)胺基酸序列之比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，DP－77、mAb13.2之嵌合型變化體(嵌合型13.2)的可變重鏈區和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)的可變重鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中該為mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為在下方劃線者。
第28圖：人類B1種系基因與mAb13.2之嵌合型變化體和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)的可變輕鏈(VL)胺基酸序列的比較。此圖形顯示以SeqWebT M 比對和比較時，B1、mAb13.2之嵌合型變化體(ch13.2)的可變輕鏈區和mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)的可變輕鏈區的互補決定區(CDR)(加框區)和胺基酸序列，其中為該mAb13.2之完全人類化變化體(h13.2v3)所做的胺基酸取代以有陰影之方框指示，而保持未改變之殘基則為在下方劃線者。
第29圖：單株抗體mAb13.2之可變重鏈胺基酸序列中的各殘基根據不同方案編號的號碼。此圖形顯示mAb13.2之可變重鏈區的胺基酸序列中之各殘基根據線性序列編號方案、Chothia構造編號方案和Kabat序列編號方案的編號。
第30圖：單株抗體mAb13.2之可變輕鏈胺基酸序列中的各殘基根據不同方案編號的號碼。此圖形顯示mAb13.2之可變輕鏈胺基酸序列中的各殘基根據線性序列編號方案、喬西亞(Chothia)構造編號方案和卡巴特(Kabat)序列編號方案的編號。
第31圖：以抗－人類IL－13抗體(h13.2v2)處理過之獼猴在蛔蟲挑戰後8週，其體內的蛔蟲－特異性IgE滴定度降低。此圖形說明以蛔蟲抗原挑戰前和8週後，獼猴體內之蛔蟲－特異性IgE的相關滴定度。將挑戰前之數值標準化為"100"。(A)以人類化之抗－IL－13抗體(h13.2v2)經由靜脈內途徑處理過之動物。(B)經由靜脈內途徑投服生理食鹽水或不相關之人類IgG(IVIG)的對照組動物。
第32圖：抗－IL－13抗體(h13.2v2)可預防活體內過敏原挑戰所引起之嗜鹼細胞敏感性增加。(A)此圖形說明在以蛔蟲抗原處理前和挑戰24小時和8週後之動物中，從代表性對照組和經抗體處理之動物的血液中釋出的劑量－倚賴性組織胺，係其以最大量的百分比表示。(B)測定各動物在各時間點時於(a)中所示之劑量範圍內的全部組織胺釋出量。圖形顯示對照組和經抗－IL－13處理群在各時間點之標準化的組織胺釋出量的平均值和標準差。Pre＝抗體處理前。時間0＝抗體後24小時，以蛔蟲挑戰肺部前。24小時、8週和4個月之時間點係指蛔蟲挑戰後之時間。
第33圖：生物素化之h13.2v2與裝載IL－13之A375細胞的結合情形。此長條圖說明將A375人類黑色瘤細胞(細胞數；y－軸)預先與3奈克/毫升之人類IL－13一起培育後，經由流式細胞分析所測定出之那些顯示出與生物素化之h13.2v2(0.1克/毫升、1克/毫升或10克/毫升)結合的A375人類黑色瘤細胞數(螢光；x－軸)。
第34圖：h13.2v2之野生型Fc回復株可在IL－13之存在下傳介ADCC。(A)此圖形顯示以指示濃度(x－軸)之h13.2v2(L234A/G237A；●)或其野生型Fc回復株處理過之A375人類黑色瘤細胞所釋出之鉻－51的百分比(y－軸)。(B)此圖形顯示在有或無IL－13存在時，以h13.2v2之野生型Fc回復株處理過之裝載IL－13的A375細胞所釋出之鉻－51的百分比(y－軸)。
第35圖：h13.2v2之野生型Fc回復株可傳介表現IL－13R2之A375細胞的ADCC，但不會傳介表現IL－13R1之HT－29細胞的ADCC。(A)此圖形顯示以指示濃度(x－軸)之h13.2v2(L234A/G237A；◆)或其野生型Fc回復株(◇)處理過之裝載IL－13的A375人類黑色瘤細胞所釋出之鉻－51的百分比(y－軸)。(B)此圖形顯示以指示濃度(x－軸)之h13.2v2(L234A/G237A；◆)或其野生型Fc回復株(◇)處理過之裝載IL－13的HT－29人類表皮細胞所釋出之鉻－51的百分比(y－軸)。
<110> Kasaian,Marion T. Tchistiakova,Lioudmila Veldman,Geertruida M. Marquette,Kimberly A. Tan,Xiang－Yang Parris,Kevin D. Donaldson,Debra D. Goldman,Samuel J. Cook,Timothy A. Lin,Laura L. Tam,Amy S. Feyfant,Eric Bree,Andrea G. Schlerman,Franklin J. Wood,Nancy L. Lu,Zhijian Piche,Nicole M. Benander,Christina M. Fitz,Lori J. Lee,Julie M. Widom,Angela M. <120> 拮抗人體白介素－13之抗體及彼之用途<130> 01997.032000 <160> 36 <170> 3.3版<210> 1 <211> 333 <212> DNA <213> 家鼠<400> 1<210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> 家鼠<400> 2<210> 3 <211> 333 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 部分人類化之抗體輕鏈<400> 3<210> 4 <211> 333 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體輕鏈<400> 4<210> 5 <211> 351 <212> DNA <213> 家鼠<400> 5<210> 6 <211> 351 <212> DNA <213> 家鼠<400> 6<210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 部分人類化之抗體重鏈<400> 7<210> 8 <211> 354 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體重鏈<400> 8<210> 9 <211> 111 <212> PRT <213> 家鼠<400> 9 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> 家鼠<400> 10<210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 部分人類化之抗體輕鏈<400> 11 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體輕鏈<400> 12<210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> 家鼠<400> 13 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> 家鼠<400> 14<210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 部分人類化之抗體重鏈<400> 15 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體重鏈<400> 16<210> 17 <211> 329 <212> PRT <213> 現代人<220> <221> MISC_FEATURE <223> The"S"in position #1 represents amino acid residue #119 when the sequence follows residue #118 of,e.g.,SEQ ID NOs：15 or 16. In this representation of the sequence,mutated amino acids are at residue #s 234 and 237[instead of 116 and 119, respectively]. <220> <221> MISC_FEATURE <223> "S" at 1(as shown)－L116A and G119A "S" at 119－－L234A and G237A <220> <221> MUFAGEN <222> (116)..(116) <220> <221> MUTAGEN <222> (119)..(119) <400> 17 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> 現代人<220> <221> MISC_FEATURE <223> 當該序列跟隨著,如：SEQ ID NOS ：11或12之殘基#111時,在位置1中之"R"代表胺基酸殘基#112. <400> 18<210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基24－38(線性)<400> 19<210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基54－60(線性)<400> 20<210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基93－101(線性)<400> 21<210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第30圖之殘基30－35(線性)<400> 22<210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第30圖之殘基50－65(線性)<400> 23<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> 家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第30圖之殘基98－107(線性)<400> 24<210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基24－38(線性)；亦相當於SEO ID NO：19. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 25<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基54－60(線性)；亦相當於SEQ ID NO：20. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 26<210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第31圖之殘基93－101；亦相當於SEQ ID NO；21. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc feature <222> (5)..(5) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc feature <222> (7)..(7) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc feature <222> (9)..(9) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 27<210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第30圖之殘基30－35；亦相當於SEQ ID NO：22. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 28<210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於,如：第30圖之殘基50_65(線性)；亦相當於SEQ ID NO：23. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (5)..(9) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 29<210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 最小核心CDR序列<220> <221> MISC_FEATURE <223> 此片段相當於，如：第30圖之殘基98－107(線性)；亦相當於SEQ ID NO：24. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸<400> 30<210> 31 <211> 132 <212> PRT <213> 現代人<400> 31 <210> 32 <211> 132 <212> PRT <213> 現代人<220> <221> mat_peptide <222> (21)..(132) <400> 32<210> 33 <211> 333 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體輕鏈<400> 33 <210> 34 <211> 354 <212> DNA <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體重鏈<400> 34<210> 35 <211> 111 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體輕鏈<400> 35<210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> 人工合成<220> <223> 完全人類化之抗體重鏈<400> 36

Claims (34)

  1. 一種經純化之抗體或彼之保留抗體活性之抗原結合片段，其包含重鏈免疫球蛋白可變結構區和輕鏈免疫球蛋白可變結構區，且經表面電漿子共振(SPR)測定，係以低於10-7 M之KD 值結合IL-13，(a)其中該輕鏈免疫球蛋白可變結構區包含胺基酸序列：(i)CDR1內KASESVDNYGKSLMH(SEQ ID NO：19)，(ii)CDR2內RASNLES(SEQ ID NO：20)，及(iii)CDR3內QQSNEDPWT(SEQ ID NO：21)；且(b)其中該重鏈免疫球蛋白可變結構區包含胺基酸序列：(i)CDR1內ISYAMS(SEQ ID NO：22)，(ii)CDR2內SISSGGNTYYPDSVKG(SEQ ID NO：23)，及(iii)CDR3內LDGYYFGFAY(SEQ ID NO：24)。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其係Fab、F(ab')2 或scFv。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其包含人框構區、人Fc區或該兩者。
  4. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其中該重鏈免疫球蛋白可變區包含由核酸所編碼之胺基 酸序列，該核酸包含SEQ ID NO：7、8或34之核苷酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其中該輕鏈免疫球蛋白可變區包含由核酸所編碼之胺基酸序列，該核酸包含SEQ ID NO：3、4或33之核苷酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其中該重鏈免疫球蛋白可變結構區包含SEQ ID NO：15、16或36之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其中該輕鏈免疫球蛋白可變結構區包含SEQ ID NO：11、12或35之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其更包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其更包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其含有經突變以減少下述之一或多者之恆定區：Fc受體結合作用、抗體醣化作用、半胱胺酸殘基數目、效應子細胞功能或補體功能。
  11. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其更包含人IgG1恆定區，該人IgG1恆定區係於SEQ ID NO：17之殘基116和119之一或多者處經突變。
  12. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片 段，其中該重鏈免疫球蛋白可變結構區於SEQ ID NO：15、16或36之胺基酸SER50(CDR2)、SER53(CDR2)、TYR101(CDR3)及TYR102(CDR3)處與IL-13經氫鍵鍵接；且，該輕鏈免疫球蛋白可變結構區於SEQ ID NO：11、12或35之胺基酸ASN31(CDR1)、TYR32(CDR1)、LYS34(CDR1)、ASN96(CDR3)及ASP98(CDR3)處與IL-13經氫鍵鍵接。
  13. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其中該輕鏈免疫球蛋白可變結構區於SEQ ID NO：11、12或35之胺基酸ASN31(CDR1)、TYR32(CDR1)、LYS34(CDR1)、ARG54(CDR2)、ASN96(CDR3)、ASP98(CDR3)及TRP100(CDR3)處與IL-13鍵接；且，該重鏈免疫球蛋白可變結構區於SEQ ID NO：15、16或36之胺基酸ILE30、SER31(CDR1)、ALA33(CDR1)、TRP47、SER50(CDR2)、SER52(CDR2)、SER53(CDR2)、TYR58(CDR2)、LEU98(CDR3)、ASP99(CDR3)、GLY100(CDR3)、TYR101(CDR3)、TYR102(CDR3)及PHE103(CDR3)處與IL-13鍵接。
  14. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其係於SEQ ID NO：32之胺基酸GLU49、ASN53、GLY69、PRO72、HIS73、LYS74及ARG86處與IL-13鍵接。
  15. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其經表面電漿子共振(SPR)測定，係以介於90至120 pM之KD 值結合人IL-13。
  16. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其經表面電漿子共振(SPR)測定，係以介於5x104 至8x105 M-1 s-1 之kon 值和低於1x10-4 s-1 之koff 值結合人IL-13。
  17. 如申請專利範圍第1項之抗體或彼之抗原結合片段，其具有一或多個下述之性質：(a)專一性結合人IL-13之抗原決定基，該抗原決定基包含一或多個下述之胺基酸殘基：SEQ ID NO：32的位置49之麩胺酸、位置53之天冬胺酸、位置69之甘胺酸、位置72之脯胺酸、位置73之組胺酸、位置74之離胺酸及位置86之精胺酸，或彼等之保守性胺基酸取代；(b)與IL-13和IL13Rα1之複合體結合；(c)干擾IL-13與IL-4Rα之結合交互作用；(d)干擾IL-13/IL-13Rα1與IL-4Rα之結合交互作用；(e)專一性結合人IL-13；(f)減少低親和性IgE受體(CD23)於周圍血液單核細胞之細胞表面表現；(g)減少經培養之B細胞內由IL-13媒介之IgE同型轉換；(h)減少STAT6之依賴IL-13之磷酸化作用；或(i)於顯現因抗原引起之呼吸道發炎的馬來猴體內中和嗜伊紅白血球之流入。
  18. 一種經分離之重組IgG抗體，其包含兩條免疫球蛋白鏈：輕鏈和重鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：12且該重鏈包含SEQ ID NO：16。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段，其係經重組或純化。
  20. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段及藥學上可接受之載體。
  21. 如申請專利範圍第20項之藥學組成物，其係適於供皮下、吸入或局部投予。
  22. 一種藥學組成物，其包含與一或多種附加之治療劑共同調製的如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段及藥學上可接受之載體，該一或多種附加之治療劑選自：吸入性類固醇、β 激動劑、白三烯或白三烯受體之拮抗劑、IgE抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、黃嘌呤、抗膽鹼能藥、肥大細胞安定劑、IL-4抑制劑、IL-5抑制劑、嗜伊紅趨化素(eotoxin)/CCR3抑制劑、抗組織胺、TNF拮抗劑、TNF酶拮抗劑、TGFβ拮抗劑、干擾素γ、普非尼酮(perfenidone)、化學治療劑、NSAIDs、免疫調節劑、p38抑制劑及NFKB抑制劑。
  23. 一種如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體於製備供治療與IL-13相關之病症的藥學組成物之用途，該與IL-13相關之病症選自：氣喘病症、特應性病症、過敏性鼻炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆(Crohn)氏病、慢性梗阻性肺病(COPD)、涉及呼吸道發炎之徵狀、嗜伊紅血球增多症、纖維變性和黏液生成過量、發炎徵狀、自體免疫徵狀、腫瘤或癌症、病毒感染、及第1型保護性免 疫反應之表現受壓抑。
  24. 如申請專利範圍第23項之用途，其中該病症係發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆(Crohn)氏病。
  25. 一種偵測活體外樣本中是否存有IL-13之方法，其包含：(a)令樣本與如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗IL-13抗體或彼之片段接觸；及(b)偵測該抗IL-13抗體或彼之片段與該樣本是否形成複合物，其中於該樣本中形成該複合物即表示該樣本中存有IL-13。
  26. 一種核酸，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列(1)編碼多肽，該多肽包含如申請專利範圍第1項所述之重鏈免疫球蛋白可變區，該重鏈免疫球蛋白可變區(a)包含胺基酸序列：(i)CDR1內ISYAMS(SEQ ID NO：22)，(ii)CDR2內SISSGGNTYYPDSVKG(SEQ ID NO：23)，及(iii)CDR3內LDGYYFGFAY(SEQ ID NO：24)。
  27. 如申請專利範圍第26項之核酸，其包含編碼重鏈可變結構區之核苷酸序列或SEQ ID NO：7、8或34之核苷酸序列，該重鏈可變結構區包含SEQ ID NO：15、16或36之胺基酸序列。
  28. 一種核酸，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列(1)編碼多肽，該多肽包含如申請專利範圍第1項所 述之輕鏈免疫球蛋白可變區，該輕鏈免疫球蛋白可變區(a)包含胺基酸序列：(i)CDR1內KASESVDNYGKSLMH(SEQ ID NO：19)，(ii)CDR2內RASNLES(SEQ ID NO：20)，及(iii)CDR3內QQSNEDPWT(SEQ ID NO：21)。
  29. 如申請專利範圍第28項之核酸，其包含編碼輕鏈可變結構區之核苷酸序列或SEQ ID NO：3、4或33之核苷酸序列，該輕鏈可變結構區包含SEQ ID NO：11、12或35之胺基酸序列。
  30. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第26至29項中任一項之核酸。
  31. 一種活體外宿主細胞，其包含核酸序列，該核酸序列編碼如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段。
  32. 一種提供重組抗體之方法，其包含：提供宿主細胞，該宿主細胞包含核酸序列，該核酸序列編碼如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體或彼之抗原結合片段；及於表現該抗體或彼之抗原結合片段的條件下維持該細胞。
  33. 如申請專利範圍第32項之方法，其更包含自該宿主細胞或維持該宿主細胞之基質中分離該抗體或彼之抗原結合片段。
  34. 一種抗體，其包含：含有胺基酸序列SEQ ID NO：16之重鏈可變區、含有胺基酸序列SEQ ID NO：17之重鏈恆定區、含有胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈可變區、及含有胺基酸序列SEQ ID NO：18之輕鏈恆定區。
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