KR20070034487A - 항il-13 항체, 항il-13 항체의 결정 및 이를 함유하는복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항IL-13 항체, 항IL-13 항체의 결정, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정, IL-13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정, 및 관련 방법과 소프트웨어 시스템에 관한 것이다.
항IL-13 항체, 항IL-13 항체의 결정, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정, IL-13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정
Description
관련 출원
본 출원은 2004년 6월 9일에 출원된 미국 가특허출원 제60/578,736호, 2004년 6월 9일에 출원된 미국 가특허출원 제60/578,473호 및 2004년 6월 22일에 출원된 미국 가특허출원 제60/581,375호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 항IL-13 항체, 항IL-13 항체의 결정, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정, IL-13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체, IL-13Rα1 폴리펩타이드/IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 결정 및 관련 방법과 소프트웨어 시스템에 관한 것이다.
인터루킨-13(IL-13)은 면역반응 증상, 예컨대 아토피, 천식, 알레르기 및 염증 반응 등에 관여하는 다면발현성 사이토킨이다. 면역 반응에서의 IL-13의 역할은 세포 시그널링 경로에 미치는 영향을 통해 촉진된다. 예를 들어, IL-13은 B 세포 증식을 촉진하고, IgE를 생산하도록 B 세포를 유도하며 전염증성 사이토킨의 생산을 하향 조절할 수 있다. 또한, IL-13은 내피 세포에서의 VCAM-1의 발현을 증가시키고 단핵구에서의 클래스 II MHC 항원과 다양한 접착 분자의 발현을 증가시킬 수 있다.
IL-13 기능은 조혈 세포 및 다른 종류의 세포에 존재하는 IL-13 수용체와의 상호작용을 통해 매개된다. 사람 IL-13 수용체(IL-13R)는 인터루킨-4 수용체 α 쇄인 IL-4Rα 및 IL-13 결합 쇄인 IL-13Rα1을 포함하는 이종이량체이다. IL-13과 이의 수용체와의 연합은 IL-4Rα쇄와의 결합 상호작용을 통해 STAT6(전사 6의 시그널 전달인자 및 활성인자) 및 JAK1(야누스 계열 키나제)의 활성화를 유도한다. 세포 표면에서 발견되거나 혈행 중에 가용성 형태로 발견되기도 하는 IL-13Rα2는 높은 친화성으로 IL-13에 결합하지만, IL-13에 대한 세포 반응을 매개하지 않는다. 이것은 유인 수용체(decoy receptor)로서 작용하기 때문인 것으로 생각한다.
개요
제1 관점에서, 본 발명은 결정형 항체를 특징으로 한다. 이 결정형 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다.
제2 관점에서, 본 발명은 항체를 함유하는 결정형 조성물을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다.
제3 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드와 항체를 함유하는 결정형 복 합체를 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다.
제4 관점에서, 본 발명은 IL-13Rα1 폴리펩타이드 및 IL-13 폴리펩타이드를 함유하는 결정형 복합체를 특징으로 한다.
제5 관점에서, 본 발명은 항체의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제(agent)를 설계하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다.
제6 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
제7 관점에서, 본 발명은 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 결합한 IL-13 폴리펩타이드의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
제8 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체의 3차원 구조를 가지고 이상적인 약물 설계를 수행하여 제제를 선별하는 단계; 그 제제를 IL-13 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계 및 그 제제가 IL-13 폴리펩타이드와 결합하는 능력을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
제9 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드를 항체와 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계 및 이러한 조성물을 결정화하여 상기 항체가 IL-13 폴리펩타이드에 결합되어 있는 결정형 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이고, 상기 결정형 복합체는 적어도 약 3.5Å의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
제10 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드를 항체 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 접촉시켜 조성물을 형성하고, 이 조성물을 결정화하여 상기 항체와 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 IL-13 폴리펩타이드에 각각 결합되어 있는 결정형 복합체를 제조하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이고, 상기 결정형 복합체는 적어도 약 3.5Å의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
제11 관점에서, 본 발명은 컴퓨터 시스템이 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하게 하는 명령을 포함하는 소트프웨어 시스템에 관한 것이다. 또한, 상기 명령은 컴퓨터 시스템이 후보 제제에 관한 정보를 수용하여 후보 제제의 IL-13 폴리펩타이드에 대한 결합 특성을 측정하게 한다. 결합 특성의 측정은 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 후보 제제에 관한 정보를 기초로 한다.
제12 관점에서, 본 발명은 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램을 특징으로 한다. 이 컴퓨터 판독 매체에는 복수의 명령이 저장되어 있다. 이러한 명령들이 하나 이상의 프로세서에 의해 실행되는 경우에, 하나 이상의 프로세서는 항IL-13 폴리펩타이드 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편인 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고; 후보 제제에 관한 정보를 수용하며; 후보 제제의 IL-13 폴리펩타이드에 대한 결합 특성을 측정한다. 결합 특성의 측정은 IL- 13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 후보 제제에 관한 정보를 기초로 한다.
제13 관점에서, 본 발명은 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하는 단계 및 후보 제제와 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다. 정보를 수용하여 결합 특성을 모델링하는 방법은 소프트웨어 시스템에 의해 실행된다.
제14 관점에서, 본 발명은 복수의 명령들을 포함하는 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램을 특징으로 한다. 상기 명령들이 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편인 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고; 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 모델링한다.
제15 관점에서, 본 발명은 컴퓨터 시스템이 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하여 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하게 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이다.
제16 관점에서, 본 발명은 결정형 항체를 특징으로 한다. 이 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다.
제17 관점에서, 본 발명은 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결정형 조성물을 특징으로 한다.
제18 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드와 항체를 포함하는 결정형 복합체를 특징으로 한다. 이 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다.
제19 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드, IL-13Rα1 폴리펩타이드 및 항체를 포함하는 결정형 복합체를 특징으로 한다. 이 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다.
제20 관점에서, 본 발명은 항체의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 결합 부위에 결합할 수 있다.
제21 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드와 항체를 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계; 및 이 조성물을 결정화하여 상기 항체가 IL-13 폴리펩타이드에 결합되어 있는 결정형 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 상기 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있고, 상기 결정형 복합체는 적어도 약 3.5Å의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
제22 관점에서, 본 발명은 IL-13 폴리펩타이드와 항체 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 접촉시켜 조성물을 제조하는 단계, 및 이러한 조성물을 결정화하여 상기 항체 및 상기 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 각각 결합되어 있는 결정형 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있고, 상기 결정형 복합체는 적어도 약 3.5Å의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
제23 관점에서, 본 발명은 컴퓨터 시스템이 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고 후보 제제에 관한 정보를 수용하여 상기 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 측정하게 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다. 후보 제제의 결합 특성에 대한 측정은 상기 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제에 관한 정보를 기초로 한다.
제24 관점에서, 본 발명은 복수의 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램을 특징으로 한다. 이러한 명령이 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고 후보 제제에 관한 정보를 수용하여 상기 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 측정할 것이다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다. 후보 제제의 결합 특징에 대한 측정은 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 후보 제제에 관한 정보를 기초로 한다.
제25 관점에서, 본 발명은 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하는 단계 및 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다. 이러한 정보를 수집하고 결합 특성으로 모델링하는 방법은 소프트웨어 시스템에 의해 실행된다.
제26 관점에서, 본 발명은 복수의 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램을 특징으로 한다. 이러한 명령이 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하여 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 모델링한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다.
제27 관점에서, 본 발명은 컴퓨터 시스템이 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하여 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하게 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템을 특징으로 한다. 여기서, 항체는 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있다.
제28 관점에서, 본 발명은 검체의 IL-13 활성을 조절하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 이상적인 약물 설계를 이용하여 IL-13 활성을 조절할 수 있는 제제를 선별하는 단계 및 이러한 제제의 치료적 유효량을 상기 검체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제29 관점에서, 본 발명은 IL-13 활성과 관련 있는 증상을 보유한 검체의 치료방법을 특징으로 한다. 이 치료방법은 적합한 약물 설계를 이용하여 IL-13 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제를 선별하는 단계 및 상기 제제의 치료적 유효량을 상기 검체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제30 관점에서, 본 발명은 IL-13 활성과 관련된 증상에 민감한 검체의 예방적 치료방법을 특징으로 한다. 이 예방적 치료방법은 검체가 IL-13 활성과 관련 있는 증상에 민감한 지를 측정하는 단계, 적합한 약물 설계를 이용하여 IL-13 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제를 선별하는 단계 및 상기 제제의 치료적 유효량을 상기 검체에게 투여하는 단계를 포함한다.
폴리펩타이드 또는 이에 대응하는 리간드의 구조 정보는 그 폴리펩타이드가 생체내에서 작용하는 방식에 관하여 더 많이 이해할 수 있게 한다. 예를 들어, 단백질이나 이에 대응하는 리간드의 구조에 관한 지식은 그 단백질과 이의 리간드, 예컨대 다른 단백질, 항체, 작동 분자(예, 호르몬) 및 핵산과의 상호작용을 촉진시키는 성질을 밝힐 수 있다. 구조를 기초로 한 모델링은 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 리간드를 동정하는데 사용될 수 있는 바, 비용이 많이 들고 시간 소모적인 선별 분석의 필요를 없애준다. 또한, 구조 정보는 성질이 더욱 바람직한, 예컨대 결합성 또는 특이성이 더욱 큰, 대체 리간드를 만들기 위하여 IL-13과 상호작용하는 것으로 공지된 리간드의 변형을 유도하는 데에도 사용될 수 있다.
항IL-13 항체와 IL-13 폴리펩타이드 사이, 그리고 IL-13 폴리펩타이드와 이의 수용체 사이의 상호작용에 관한 연구는 생체내 IL-13의 활성을 조절할 수 있는 리간드(예컨대, 약물)의 설계 또는 선별을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 이러한 연구들은 치료제의 설계에 유용할 수 있다. 활성 분석은 mAb13.2가 시험관내 및 생체내에서 IL-13 기능을 차단(이하 실시예 1 및 2 참조)하는 것뿐만 아니라 이 단백질의 정상적인 기능을 방해할 수 있는 IL-13 결합제를 동정하는 항체의 용도도 보여주었다. 따라서, mAb13.2Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2Fab 단편 복합체, 및 사람 Il-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정 구조(이하, 표 10-12 참조)가 IL-13 및 IL-13 수용체 폴리펩타이드인 IL-13Rα1과 상호작용할 수 있는 제제를 설계하거나 동정하는데 유용할 것으로 생각되었다. 이러한 제제는 면역 반응 증상, 예컨대 천식(예, 비알레르기성 천식 또는 알레르기성 천식, 때로 만성 알레르기 기도 질환이라 불리기도 한다), 만성 폐색성 폐병(COPD), 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과도한 점액 생산(예, 낭성 섬유증, 폐 섬유증 및 알레르기 비염), 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 증상(예, 염증장병(IBD) 및/또는 크론병), 간(예, 경화증), 혈관 또는 결합 조직의 염증성 및/또는 자가면역 증상(예, 피부경화증), 및 종양이나 암(예, 연조직 또는 고형암), 예컨대 호지킨스 림프종, 아교모세포종 및 림프종 등에서의 IL-13 활성의 조절에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 특징과 장점은 이하 도면의 설명 및 상세한 설명과 청구의 범위를 통해 분명하게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에서 인용된 참고문헌, 공계류중인 특허 출원과 공개된 특허의 내용은 본 발명에 참고적으로 인용된 것이 분명하다. 분쟁 시 본 명세서 및 여기에 포함된 정의가 조정 역할을 할 것이다.
도 1A는 mAb13.2 Fab(단편 항원 결합) 단편의 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.
도 1B는 mAb13.2 Fab 단편의 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
도 2A는 전장의 사람 IL-13의 아미노산 서열(Swiss-Prot 수탁번호 P35225)(서열번호 3)이다. 시그널 펩타이드 절단 부위는 사선으로 표시한 부분이다. 알파 나선 A, B, C 및 D는 밑줄 친 부분이다. 나선 A는 아미노산 25-42 부분이다. 나선 B는 아미노산 62-71 부분이다. 나선 C는 아미노산 78-89 부분이다. 나선 D는 아미노산 112-127 부분이다.
도 2B는 시그널 펩타이드 절단 후의 사람 IL-13의 아미노산 서열(서열번호 4)이다. 알파 나선 A, B, C 및 D는 밑줄 친 부분이다. 나선 A는 아미노산 6-23 부분이다. 나선 B는 아미노산 43-52 부분이다. 나선 C는 아미노산 59-70 부분이다. 나선 D는 아미노산 93-108 부분이다.
도 3은 mAb13.2 Fab 단편의 결정 구조(왼쪽)와 사람 IL-13의 프로세싱된 형태(오른쪽)(도 2B 참조)를 도시한 리본 다이아그램이다. mAb13.2 Fab 단편의 경쇄는 어둡게 음영 표시되고 중쇄는 밝게 음영 표시된 부분이다. IL-13 구조의 나선 A, B, C 및 D가 표시되어 있다.
도 4는 Biacore 분석을 통해 측정된 바와 같은 사람 IL-13에 결합하는 3가지 다른 항IL-13 항체(mAb13.2, mAb13.4 및 mAb13.9)의 반응속도 변수(kinetic parameter)를 예시한 그래프이다. mAb13.2의 반응속도 상수도 함께 나타냈다.
도 5는 재조합 및 천연 사람 IL-13에 대한 비오틴화된 mAb13.2의 결합성을 예시한 그래프이다. ELISA 평판을 항FLAG M2 항체로 코팅했다. FLAG-사람 IL-13의 결합을 비오틴화된 mAb13.2와 스트렙트아비딘-퍼옥시다제로 검출했다. 이 결합은 유사분열물질 활성화되고 Th2 편중된 제대혈 단핵세포에서 분리된 천연 사람 IL-13(삼각형); 및 재조합 사람 IL-13(마름모형)과 경쟁할 수 있다. mAb13.2에 대한 재조합 쥐 IL-13(원형)의 결합은 관측할 수 없었다.
도 6은 사람 IL-13의 생활성에 미치는 mAb13.2 및 공지된 억제제 rhuIL-13Rα2의 영향을 예시한 그래프이다. "cpm"은 IL-13 및 다양한 농도의 mAb13.2 또는 rhuIL-13Rα2(x축)의 존재 하에서 증식된 TF1 세포로 흡수된 3H-티미딘의 측정값이다.
도 7A는 CD11b+ 단핵구에서의 CD23 발현에 미치는 재조합 사람 IL-13 및 IL-4의 효과를 예시한 그래프이다. 상기 단핵구는 건강한 제공자에게서 채취한 정상적인 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 이 세포를 재조합 사람 IL-13 또는 IL-4 1ng/ml로 하룻밤 동안 처리한 뒤, 유동세포측정법으로 CD23 발현에 대해 분석했다.
도 7B는 CD11b+ 단핵구에서의 IL-13 유도성 CD23 발현에 미치는 mAb13.2의 효과를 예시한 그래프이다.
도 7C는 CD11b+ 단핵구에서의 IL-4 유도성 CD23 발현에 미치는 mAb13.2의 효과를 예시한 그래프이다.
도 8은 사람 B 세포에 의한 IL-13 의존적 IgE 생산에 미치는 mAb13.2의 효과를 예시한 그래프이다. 건강한 제공자 유래의 PBMC를 PHA 및 IL-13으로 자극했다. 3주 후, 각 웰의 IgE 농도를 ELISA로 분석했다. PHA + IL-13은 IgE 생산성 B 세포 클론의 빈도를 증가시켰다. 이러한 효과는 mAb13.2에 의해서 억제되었지만, IL-13 특이적인 비중화 항체(mAb13.8) 또는 대조용 마우스 IgG(msIgG)에 의해서는 억제되지 않았다.
도 9A는 HT-29 사람 상피 세포를 제시된 IL-13 농도로 37℃에서 30분 동안 처리한 후, 인산화된 STAT6 단백질을 검출한 웨스턴 블롯이다.
도 9B는 IL-13으로 처리한 후 세포의 인산화된 STAT6 단백질의 농도를 측정한 유동세포측정 실험의 히스토그램이다. IL-13으로 처리 시 이동된 포스포-STAT6 염색 강도는 밝은 음영 선으로 표시했다.
도 9C는 최적 농도 이하의 사람 IL-13 및 제시된 항체로 처리한 후 나타나는 세포의 인산화된 STAT6 단백질의 농도를 측정한 유동세포측정 실험의 히스토그램 패널이다. IL-13과 항체로 처리된 세포는 진한 선으로 표시했다. 음영 표시된 히스토그램은 처리되지 않은 세포를 나타낸다. mAb13.2 외에도, IL-13 특이적인 비중화 항체(mAb13.8) 및 대조용 마우스 IgG1도 역시 검사했다.
도 10은 폐 분절에 회충(Ascaris) 항원을 투여한 후 돼지 회충(Ascaris suum)에 대해 민감화된 필리핀 원숭이 유래의 BAL에서 관측된 호산구의 백분율을 보여주는 그래프이다. 투여 24시간 전에 동물에게 mAb13.2를 i.v.로 투여(마름모형)하거나 또는 처리하지 않았다(원형). 삼각형은 mAb13.2 처리되고, Ab 투여 3개월 후 회충 항원으로 재투여한 경우를 나타낸다. 호산구는 탈분극 측방 산란 분석(depolarized side scatter analysis)을 사용하여 유동세포측정법으로 검출했다.
도 11A는 ELISA 분석에서 표지되지 않은 mAb13.2(마름모형) 또는 mAb13.2 Fab 단편(원형)이 비오틴화된 mAb13.2와 결합 경쟁할 수 있음을 보여주는 그래프이다. "무관련 항체"(IL-13에 결합하지만 활성을 중화시키지 않는 모노클로날 항체 mAb13.8)(별표)는 결합 경쟁할 수 없다. 경쟁자 농도는 항체 또는 Fab 피코몰(pM)로 나타냈다.
도 11B는 ELISA 분석에서 표지되지 않은 mAb13.2(마름모형) 또는 mAb13.2 Fab 단편(원형)이 비오틴화된 mAb13.2와 결합 경쟁할 수 있음을 보여주는 그래프이다. "무관련 항체"(모노클로날 항체 mAb13.8)(별표)는 결합 경쟁할 수 없다. 경쟁자 농도는 온전한 IgG당 2개의 결합 부위이고 Fab 단편당 1개의 결합부위임을 가정하여 피코몰(pM) 결합 부위로서 표시한다.
도 12A는 mAb13.2(마름모형) 및 mAb13.2 Fab 단편(원형)이 IL-13 의존적 TF1 세포 분열을 억제한다는 것을 보여주는 그래프이다. "경쟁자 농도"는 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편 농도이며, 그 농도는 온전한 IgG당 결합 부위가 2개이고 Fab 단편당 결합 부위가 1개임을 가정하여 경쟁자 결합 부위 pM로서 나타냈다.
도 12B는 mAb13.2(마름모형) 및 mAb13.2 Fab 단편(원형)이 사람 PBMC에서의 IL-13 CD23 발현을 억제한다는 것을 보여주는 그래프이다. 경쟁자 농도는 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편 농도이며, 그 농도는 완전한 IgG당 결합 부위 2개 및 Fab 단편당 결합 부위 1개로 가정하고 경쟁자 결합 부위 pM로서 나타냈다.
도 13은 사람 IL-13 cDNA 삽입체(hIL13coli)를 포함하는 발현 벡터 pAL-981(서열번호 5)의 DNA 서열이다. IL-13을 암호하는 cDNA 서열은 밑줄친 부분이다. 이 cDNA 서열 양 측면에는 제한 부위 Nde1(뉴클레오타이드 위치 2722) 및 Xba1(뉴클레오타이드 위치 3070)이 존재한다.
도 14는 사람 IL-13Rα1(Swiss-Prot 수탁 번호 P78552)의 아미노산 서열(서열번호 12)이다.
도 15는 mAb13.2 Fab/IL-13/IL-13Rα1 삼량 복합체의 구조를 예시한 리본 다이아그램이다.
도 16은 IL-13과 IL-13Rα1의 Ig 도메인 1 사이의 상호작용을 예시한 리본 다이아그램이다.
도 17은 IL-13과 IL-13Rα1의 Ig 도메인 3 사이에 상호작용을 예시한 리본 다이아그램이다.
쥐 모노클로날 항IL-13 항체, mAb13.2의 항원 결합 단편(Fab)의 구조는 X선 결정학으로 확인했다(이하 표 10 참조). mAb13.2 Fab 단편과 복합체를 이룬 사람 IL-13의 결정 구조, 및 mAb13.2 Fab 단편 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드 단편과 복합체를 이룬 사람 IL-13의 결정 구조도 역시 X선 결정학으로 확인했다(이하, 각각 표 11과 12 참조).
도 1A 및 도 1B는 mAb13.2 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열 정보를 제공한다. 도 2A 및 도 2B는 사람 IL-13의 아미노산 서열 정보를 제공한다. 도 3은 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정에 대한 구조 정보를 제공한다. mAb13.2 Fab 단편은, 서열번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산 Ser7, Thr8, Ala9, Glu12, Leu48, Glu49, Ile52, Asn53, Arg65, Met66, Ser68, Gly69, Phe70, Cys71, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86을 함유하는 사람 IL-13의 IL-4R(IL-4Rα) 결합 도메인에 결합한다.
도 14는 사람 IL-13 수용체 폴리펩타이드인 사람 IL-13Rα1의 아미노산 서열 정보를 제공한다. 도 15, 도 16 및 도 17은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정에 대한 구조 정보를 제공한다. 사람 IL-13과 mAb13.2 Fab 단편 사이에 전술한 상호작용 외에도, 사람 IL-13은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 2군데 접촉을 형성하는데, 그 하나는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 Ig 도메인 1과의 접촉이고 다른 하나는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 Ig 도메인 3과의 접촉이다. Ig 도메인 1과의 상호작용은 서열번호 4에 기재된 바와 같은 사람 IL-13의 잔기 Thr88, Lys89, Ile90 및 Glu91, 및 서열번호 12에 기재된 바와 같은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 잔기 Lys76, Lys77, Ile78 및 Ala79를 수반한다(도 16 참조). Ig 도메인 3과의 상호작용은 서열번호 4에 기재된 바와 같은 잔기 Arg11, Glu12, Leu13, Ile14, Glu15, Lys104, Lys105, Leu106, Phe107 및 Arg108; 및 서열번호 12에 기재된 바와 같은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 잔기 Ile254, Ser255, Arg256, Lys318, Cys320 및 Tyr321을 수반한다(도 17 참조).
일반적으로, mAb13.2 Fab 단편의 결정은 바람직한 경우 제조할 수 있다. 전형적으로, 이 방법은 먼저 mAb13.2 Fab 단편을 분리하는 단계, 및 그 다음 이 mAb13.2 Fab 단편을 함유하는 결정을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 양태에 따르면, mAb13.2 Fab 단편을 함유하는 결정은 다음과 같이 제조할 수 있다. 완전한 항체를 적당한 단백분해 효소(예, 파파인)로 절단한 뒤, Fc(단편 결정성) 단편으로부터 분리하여 mAb13.2 Fab 단편을 수득한다. 분리된 mAb13.2 Fab 단편은 적당한 용액에 용해시키고 이 용액을 결정화한다. 이 용액은 예컨대 하나 이상의 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 하나 이상의 염(예, 황산칼륨) 및 선택적으로 하나 이상의 유기 용매를 함유할 수 있다. 결정은 예컨대 시팅(sitting) 또는 현수 적가(hanging drop) 증기 확산법과 같은 각종 방법으로 성장시킬 수 있다. 일반적으로, 결정화는 약 4℃ 내지 60℃ 범위(예, 약 4℃ 내지 약 45℃ 범위, 예컨대 약 4℃, 약 15℃, 약 18℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 32℃, 약 35℃, 약 37℃)의 온도에서 수행할 수 있다. mAb13.2 Fab 단편의 결정을 나타내는 구조 데이터는 예컨대 X선 회절로 수득할 수 있다. X선 회절 데이터는 구조 좌표를 수득하기 위한 다양한 수단을 사용하여 수집할 수 있다. 적당한 X선 근원에는 회전 양극 및 싱크로트론 공급원(예컨대, 캘리포니아 버클리에 있는 Advanced Light Source(ALS); 또는 일리노이 아르곤느에 있는 Advanced Photon Source(APS))이 있다. 특정 양태에 따르면, 회절 데이터를 제공하는 X선은 파장이 약 0.5Å 내지 약 1.6Å 범위(예컨대, 약 0.7Å, 약 0.9Å, 약 1.0Å, 약 1.1Å, 약 1.3Å, 약 1.4Å, 약 1.5Å, 약 1.6Å)일 수 있다. 적당한 X선 검출기, 예컨대 면적 검출기 및/또는 전하 결합 소자(CCD)가 검출기로서 사용될 수 있다.
일반적으로, mAb13.2 Fab 단편의 결정은 약 3.5Å 이하(예컨대, 약 3.2Å 이하, 약 3.0Å 이하, 약 2.8Å 이하, 약 2.5Å 이하, 약 2.4Å 이하, 약 2.3Å 이하, 약 2.2Å 이하, 약 2.1Å 이하, 약 2.0Å 이하, 약 1.9Å 이하, 약 1.8Å 이하, 약 1.7Å 이하, 약 1.6Å 이하, 약 1.5Å 이하, 약 1.4Å 이하)의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, mAb13.2 Fab 단편의 결정은 약 1.6Å 내지 약 2.5Å(예를 들어, 약 1.8Å 내지 약 2.2Å)의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
특정 양태에 따르면, mAb13.2 Fab 단편의 결정은 스페이스 그룹 P212121 및 단위 셀 치수 a=54.4, b=98.0, c=108.5 및 α=β=γ=90°인 사방정계일 수 있다.
일반적으로, 바람직하다면 사람 IL-13과 mAb13.2 Fab 단편을 함유하는 복합체를 제조하여 결정화할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 그 방법은 다음과 같다. 사람 IL-13을 DNA 플라스미드로부터 발현시킨다. 그 발현은 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 사람 IL-13은 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST), myc, HA, 헥사히스티딘 또는 FLAG 태그와 같은 적당한 태그(예컨대, 세포로부터 사람 IL-13의 분리를 촉진하기 위한 용도)를 보유한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 융합 단백질에 유전자 조작된 프로테아제 부위, 예컨대 폴리펩타이드와 태그 사이의 융합 부위 또는 그 부근에서 절단될 수 있다. 사람 IL-13은 정제 전에(예컨대, 폴리펩타이드 태그의 절단 전에) mAb13.2 Fab 단편과 mAb13.2 Fab 단편과 혼합할 수도 있고, 또는 정제 후에 mAb13.2 Fab 단편과 혼합할 수도 있다. 일부 양태에 따르면, mAb13.2 Fab 단편은 정제 전에 그리고 다시 정제 후에 사람 IL-13과 혼합할 수도 있다. 일부 양태에 따르면, 사람 IL-13 폴리펩타이드 및 mAb13.2 Fab 단편은 복합체의 스펙트럼 데이터 또는 복합체의 NMR 데이터를 수집하기 위한 용액이나 또는 복합체의 결정을 성장시키기 위한 용액에서 혼합될 수 있다. 이러한 용액은, 예컨대 하나 이상의 염(예, 칼륨 염), 하나 이상의 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 및/또는 하나 이상의 유기 용매를 함유할 수 있다. 결정은 다양한 방법, 예컨대 시팅 드랍(sitting drop) 또는 현수 적가(hanging drop) 증기 확산법과 같은 각종 방법으로 성장시킬 수 있다. 일반적으로, 결정화는 약 16℃ 내지 24℃ 범위(예, 약 17℃ 내지 약 23℃ 범위, 또는 18℃ 내지 21℃)의 온도에서 수행할 수 있다.
사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정을 나타내는 구조 정보는 X선 회절로 수득할 수 있다. 일반적으로, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 약 3.5Å 이하(예컨대, 약 3.2Å 이하, 약 3.0Å 이하, 약 2.8Å 이하, 약 2.5Å 이하, 약 2.4Å 이하, 약 2.3Å 이하, 약 2.2Å 이하, 약 2.1Å 이하, 약 2.0Å 이하, 약 1.9Å 이하, 약 1.8Å 이하, 약 1.7Å 이하, 약 1.6Å 이하, 약 1.5Å 이하, 약 1.4Å 이하)의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다. 일부 양태에 따르면, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 약 1.6Å 내지 약 2.5Å(예컨대, 약 1.8Å 내지 약 2.2Å) 범위의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
특정 양태에 따르면, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 스페이스 그룹 P213 및 단위 셀 치수 a=b=c=125.3 및 α=β=γ=90°인 정육면체일 수 있다. 복합체의 구조는 1.8Å의 분해능으로 나타낼 수 있다.
일반적으로, 바람직하다면 사람 IL-13, mAb13.2 Fab 단편 및 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 함유하는 복합체를 제조하여 결정화할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 그 방법은 다음과 같다. 발현된 폴리펩타이드가 글리코실화되도록 효모 종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 중의 DNA 플라스미드로부터 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 발현시킨다. 상기 DNA 플라스미드로부터의 발현은 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST), myc, HA, 헥사히스티딘 또는 FLAG 태그와 같은 적당한 태그(예컨대, 세포로부터 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 분리를 촉진하기 위한 용도)를 보유한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 융합 단백질에 유전자 조작된 프로테아제 부위, 예컨대 상기 폴리펩타이드와 태그 사이의 융합 부위 또는 그 부근에서 절단될 수 있다. 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 사람 IL-13과 혼합되어 복합체를 형성한 다음, 이러한 복합체의 폴리펩타이드를 엔도글리코시다제 H와 같은 효소로 처리하여 탈글리코실화할 수 있다. 이와 같이 탈글리코실화된 복합체에 mAb13.2 Fab 단편을 첨가하여 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 복합체를 형성할 수 있다.
일부 양태에 따르면, 사람 IL-13Rα1, 사람 IL-13 및 mAb13.2 Fab 단편은 복합체의 스펙트럼 데이터 또는 복합체의 NMR 데이터를 수집하기 위한 용액이나 또는 복합체의 결정을 성장시키기 위한 용액에서 혼합된다. 이러한 용액은, 예컨대 하나 이상의 염(예, 칼륨 염), 하나 이상의 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 및/또는 하나 이상의 유기 용매를 함유할 수 있다. 결정은 다양한 방법, 예컨대 시팅 드랍(sitting drop) 또는 현수 적가(hanging drop) 증기 확산법과 같은 각종 방법으로 성장시킬 수 있다. 일반적으로, 결정화는 약 16℃ 내지 24℃ 범위(예, 약 17℃ 내지 약 23℃ 범위, 또는 18℃ 내지 21℃)의 온도에서 수행할 수 있다.
사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정을 나타내는 구조 데이터는 X선 회절로 수득할 수 있다. 일반적으로, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 약 3.5Å 이하(예컨대, 약 3.2Å 이하, 약 3.0Å 이하, 약 2.8Å 이하, 약 2.5Å 이하, 약 2.4Å 이하, 약 2.3Å 이하, 약 2.2Å 이하, 약 2.1Å 이하, 약 2.0Å 이하, 약 1.9Å 이하, 약 1.8Å 이하, 약 1.7Å 이하, 약 1.6Å 이하, 약 1.5Å 이하, 약 1.4Å 이하)의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다. 일부 양태에 따르면, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 약 1.6Å 내지 약 2.5Å(예컨대, 약 1.8Å 내지 약 2.2Å) 범위의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있다.
특정 양태에 따르면, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정은 스페이스 그룹 I4 및 단위 셀 치수 a=b=164.9Å, c=74.8Å 및 α=β=γ=90°인 정육면체일 수 있다. 이 복합체의 구조는 2.2Å의 분해능으로 분리될 수 있다.
mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 결정의 X선 회절 데이터는 상기 항체 또는 복합체에 존재하는 원자들의 구조 좌표를 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 구조 좌표는 3차원 공간에서 복합체의 다른 원자들에 상대적으로 원자들의 위치를 설명해주는 데카르트(Cartesian) 좌표이다. 일 예로서, 표 10에 열거된 구조 좌표들은 결정형 mAb13.2 Fab 단편의 구조 좌표이다. 이러한 구조 좌표는 mAb13.2 Fab 단편의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해준다. 다른 예로서, 표 11에 열거된 구조 좌표들은 결정형 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표이다. 이러한 구조 좌표들은 사람 IL-13의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해주고, 사람 IL-13의 원자들의 위치를 mAb13.2 Fab 단편의 원자들에 상대적으로 설명해주며, mAb13.2Fab 단편의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해준다. 또 다른 예로서, 표 12에 열거된 구조 좌표들은 결정형 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표이다. 이러한 구조 좌표들은 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해주고, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 원자들의 위치를 사람 IL-13의 원자들에 상대적으로 설명해주며, 사람 IL-13의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해주고, 사람 IL-13의 원자들의 위치를 mAb13.2Fab 단편의 원자들에 상대적으로 설명해주고, mAb13.2 Fab 단편의 원자들의 위치를 서로에 상대적으로 설명해준다.
결정의 구조 좌표는 수학적 조작, 예컨대 역위나 정수 첨가 또는 삭제를 통해 변형시킬 수 있다. 구조 좌표 그 자체는 상대적 좌표이다. 일 예로서, mAb13.2 Fab 단편의 원자들의 위치를 설명해주는 구조 좌표는 표 10의 실제 x, y 및 z 좌표에 의해서만 특별히 제한되는 것은 아니다. 다른 예로서, mAb13.2 Fab 단편에 결합된 사람 IL-13의 원자들의 위치를 설명해주는 구조 좌표는 표 11의 실제 x, y 및 z 좌표에 의해서만 특별히 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예로서, mAb13.2 Fab 단편과 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 양자에 결합된 사람 IL-13의 원자들의 위치를 설명해주는 구조 좌표는 표 12의 실제 x, y 및 z 좌표에 의해서만 특별히 제한되는 것은 아니다.
mAb13.2 Fab 단편 또는 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표는 mAb13.2 Fab 단편, mAb13.2 Fab 단편의 단편, 사람 IL-13, 사람 IL-13의 단편, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 어느 한 복합체의 단편에 대한 표상(예컨대, 2차원 표상 또는 3차원 표상)를 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 표상은 다양한 용도, 예컨대 폴리펩타이드 활성 부위의 가시화, 동정 및 특성분석 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특정 양태에 따르면, 3차원 표상은 표 10에 기재된 mAb13.2 Fab 단편의 구조 좌표 ± 아미노산의 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근(root mean square) 약 1.5Å 이하(예컨대, 약 1.0Å 이하, 또는 약 0.5Å 이하)를 포함할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 3차원 표상은 표 11에 기재된 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표 ± 아미노산의 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근(root mean square) 약 1.5Å 이하(예컨대, 약 1.0Å 이하, 또는 약 0.5Å 이하)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 3차원 표상은 표 12에 기재된 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표 ± 아미노산의 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근(root mean square) 약 1.5Å 이하(예컨대, 약 1.0Å 이하, 또는 약 0.5Å 이하)를 포함할 수 있다. 편차 제곱 평균의 제곱근(rms 편차 또는 rmsd)은 평균으로부터 편차의 제곱에 대한 산술 평균의 제곱근이며, 구조 좌표로부터의 편차를 나타내는 방식이다. 아미노산의 보존적 치환은 전술한 편차 제곱 평균의 제곱근 내의 구조 좌표를 보유한 분자 표상을 제공할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환에 의해 서로 다른 두 폴리펩타이드 분자 모델은 전술한 rms 편차, 예컨대 약 1.5Å 이하(예컨대, 약 1.0Å 이하, 약 0.5Å 이하)의 주쇄 원자의 좌표를 보유할 수 있다. 폴리펩타이드의 주쇄 원자는 알파 탄소(Cα 또는 CA) 원자, 카보닐 탄소(C) 원자 및 아미드 질소(N) 원자를 포함한다.
다양한 소프트웨어 프로그램은 구조 좌표 세트의 도식적 표상으로 mAb13.2 Fab 단편이나 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체와 같은 분자 또는 분자 복합체의 표상을 제공할 수 있다. 일반적으로, 그러한 표상은 구조 좌표나 구조 좌표 유래의 정보, 예컨대 특징부 사이의 거리 또는 각도 등을 정확하게(상대적 및/또는 절대적으로)나타내어야 한다. 표상은 2차원 형상, 예컨대 입체적인 2차원 형상이거나, 또는 상호작용성 2차원 디스플레이(예컨대, 분자 또는 분자 복합체의 여러 측면을 보여줄 수 있는 컴퓨터 디스플레이), 또는 상호작용성 입체 2차원 디스플레이일 수 있다. 상호작용성 2차원 디스플레이는 예컨대 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 복합체 및/또는 복합체의 단편의 여러 측면을 보여주기 위해 회전할 수 있는 컴퓨터 디스플레이일 수 있다. 일부 양태에 따르면, 표상은 3차원 표상이다. 일 예로서, 3차원 모델은 분자 구조의 물리적 모델(예컨대, 구와 막대 모델)일 수 있다. 다른 예로서, 3차원 표상은 분자 구조의 도식적 표상일 수 있다(예컨대, 컴퓨터 디스플레이 상의 그림이나 형상). 2차원의 도식적 표상(예컨대, 그림)은 2차원 표상이 3차원 정보를 나타내는 경우, 예컨대 관측자로부터 더 먼 특징부를 관측자로부터 더 가까운 특징부로 원근 표시하거나 음영 표시하거나 방해 표시하여 3차원 표상에 해당할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 표상은 하나 이상의 레벨에서 모델링될 수 있다. 일 예로서, 3차원 표상이 mAb13.2 Fab 단편에 결합된 사람 IL-13과 같은 폴리펩타이드를 포함하면, 이 폴리펩타이드는 하나 이상의 여러 구조 레벨, 예컨대 1차 구조(아미노산 서열), 2차 구조(예, α-나선 및 β-시트), 3차 구조(전체 접힘) 및 4차 구조(올리고머화 상태)로서 표시될 수 있다. mAb13.2 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드도 또한 하나 이상의 여러 구조 레벨로서 표시될 수 있다. 표상은 여러 레벨의 세부항목을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표상은 원자의 위치를 특정하여 표시하지 않고 단백질의 2차 구조 특징부의 상태적 위치를 포함할 수 있다. 더욱 상세한 표상은 예컨대 원자의 위치를 포함할 수도 있다.
일부 양태에 따르면, 표상은 mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체에 존재하는 원자들의 구조 좌표외의 정보를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표상은 용매가 접근할 수 있는 표면의 형태, 모델 원자의 반데르발스 반경 및 용매(예, 물)의 반데르발스 반경에 관한 정보를 제공할 수 있다. 표상으로부터 수득할 수 있는 다른 특징부에는, 예컨대 정전기적 전위, 거대분자 구조 내의 공극 또는 포켓의 위치 및 수소 결합과 염 가교의 위치가 포함된다.
mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제는 mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 단편 복합체의 표상을 사용하는 것을 포함하는 방법을 통해 동정하거나 또는 설계할 수 있다. 표상의 예시적인 종류에는 앞에서 논의한 표상들이 포함된다. 일부 양태에 따르면, 표상은 유사 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 단편, 복합체 또는 복합체 단편의 표상일 수 있다. 이러한 표상과 상호작용하는 후보 제제는 그 표상과 후보 제제의 컴퓨터 피팅(fitting) 분석을 수행하여 설계하거나 동정할 수 있다. 일반적으로, 제제는 분자이다. 제제의 예에는 폴리펩타이드 핵산(예컨대 DNA 또는 RNA), 또는 소분자(예컨대, 작은 유기분자)가 포함된다. 제제는 리간드일 수 있고, 예컨대 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 폴리펩타이드(예컨대, 사람 IL-13, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드)와 상호작용하는 제제는 그 폴리펩타이드와 일시적으로 또는 안정적으로 상호작용할 수 있다. 이러한 상호작용은 본 명세서에서 언급된 임의의 힘, 예컨대 수소 결합, 정전기적 힘, 소수성 상호작용 및 반데르발스 상호작용 등을 통해 매개될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, X선 결정학은 mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표를 수득하는데 사용될 수 있다. 하지만, 이러한 구조 좌표들은 NMR 기술을 비롯한 다른 기술에 의해서도 수득될 수 있다. 부가적인 구조 좌표는 스펙트럼 기술(예컨대, 광학 회전 분산(ORD), 원편광 이색성(CD)), 상동성 모델링, 및 분자 역학 분석 및 동역학 분석 유래의 데이터를 포함하는 것과 같은 계산 방법으로부터 수득할 수 있다.
일부 양태에 따르면, X선 회절 데이터는 mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 전자 밀도 지도를 제작하는데 사용될 수 있다. 전자 밀도 지도는 mAb13.2 Fab 단편, mAb13.2 Fab 단편의 단편, 사람 IL-13 또는 사람 IL-13 단편, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 어느 한 복합체의 단편의 표상(예컨대 2차원 표상 또는 3차원 표상)을 수득하는데 사용될 수 있다. 전자 밀도 지도의 제작은 일반적으로 X선 산란의 상에 관한 정보를 이용하는 것을 포함한다. 상 정보는 예컨대 전자 밀도 지도 제작을 완성하기 위한 보충 회절 실험이나 회절 데이터 등으로부터 구할 수 있다. X선 회절 데이터로부터 상을 계산하는 방법은 다파장 이상 분산(MAD), 다동형 치환(MIR), 다동형 치환과 이상 산란(MIRAS), 단동형 치환과 이상 산란(SIRAS), 역공간 용매 편평화(reciprocal space solvent flattening), 분자 치환 또는 이의 조합 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 방법들은 천연 단백질에 구조의 동형 변형을 조성하여, 예컨대 중원자(heavy atom)를 첨가하거나 기존 중원자의 산란 강도를 변화시킨 뒤, 천연 단백질과 변형된 각 형태의 회절 진폭을 측정하여 상 정보를 수득할 수 있다. 첨가된 중원자의 위치 또는 이의 산란 강도에서의 변화가 알려져 있는 경우에는, 각각 회절된 X선의 상은 연립 상 방정식 세트를 풀어 측정할 수 있다. 중원자 부위의 위치는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 SHELXS(Sheldrick, Institut Anorg. Chemie, Gottingen, Germany)를 사용하여 동정할 수 있고, 회절 데이터는 MOSFLM, SCALA, SOLOMIN 및 SHARP와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 처리할 수 있다("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography", Acta Crystallogr. Sect. D., 54: 905-921, 1997; deLa Fortelle and Brigogne, Meth. Enzym. 276: 472-494, 1997). 상 측정 시, 복합체의 전자 밀도 지도가 제작될 수 있다.
전자 밀도 지도는 폴리펩타이드 또는 복합체(예컨대, 항체에 결합된 폴리펩타이드를 함유하는 복합체)의 3차원 모델을 상기 전자 밀도 지도와 정렬시킴으로써 폴리펩타이드, 복합체, 또는 폴리펩타이드나 복합체의 단편의 표상을 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 정렬 방법은 계산된 전자 밀도 지도가 종래 공지된 폴리펩타이드 또는 종래 공지된 복합체의 모델과 다를 수 있는 정도를 보여주는 비교 모델을 제시한다. 이러한 비교 모델은 1회 이상의 사이클(예컨대, 2 사이클, 3 사이클, 4 사이클, 5 사이클, 6 사이클, 7 사이클, 8 사이클, 9 사이클, 10 사이클)을 통해 개량하여 전자 밀도 지도와 더 우수한 피트의 모델을 수득할 수 있다. 이러한 모델의 개량에는 CNS(Brunger et al., Acta Crystallogr. D54: 905-921, 1998)와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있다. 비교 모델에서 피트의 특성은 예컨대 Rwork 또는 Rfree 값을 통해 측정할 수 있다. 일반적으로 Rwork 또는 Rfree 값이 작을수록 더 우수한 피트를 나타낸다. 비교 모델에서의 부정정렬은 변형된 비교 모델과 더 낮은 Rwork 또는 Rfree 값을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 이러한 조정은 사람 IL-13, 사람 IL-13Rα1, mAb13.2 Fab 단편, 종래 공지된 폴리펩타이드 및/또는 공래 공지된 복합체에 관한 정보에 기초할 수 있다. 이러한 정보에는 예컨대 아미노산 서열, 상동성 모델링 및 스펙트럼 데이터 등으로부터 수득할 수 있는 나선 EH는 베타 시트 함유량 추정치, 소수성 및 친수성 도메인, 및 단백질 접힘 패턴 등이 포함된다. 일 예로서, 종래 공지된 리간드에 결합된 폴리펩타이드 복합체 모델이 사용되는 양태에 따르면, 조정은 종래 공지된 복합체 중의 리간드를 mAb13.2 단편으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 특정 양태에 따르면, 조정은 종래 공지된 폴리펩타이드 중의 아미노산을 사람 IL-13의 대응 부위에 존재하는 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 변형된 비교 모델에 대한 조정이 전자 밀도 지도에 대한 최상의 피트를 충족시키면, 결과적으로 수득되는 모델이 X선 데이터가 수득된 항체, 폴리펩타이드 또는 복합체(예컨대, 사람 IL-13/mAb 13.2 Fab 단편 복합체)인 것으로 측정된다. 이러한 과정의 방법은 예컨대, 문헌[Carter and Sweet, eds., "Macromolecular Crystallography" in Methods in Enzymology, Vol.277, Part B, New York: Academic Press, 1997, 및 여기에 인용된 문헌, 예컨대 Jones and Kjeldgaard, "Electron-Density Map Interpretation", p. 173, and Kleywegt and Jones, "Model Building and Refinement Practice", p. 208]에 게시되어 있다.
일부 양태에 따르면, mAb13.2 Fab 단편의 표상은 X선 회절 데이터로부터 수득된 mAb13.2 Fab 단편의 전자 밀도 지도와 종래 측정된 다른(그러나 유사한) 항체 Fab 단편(예컨대, 2E8 Fab 항체 단편, Protein Databank Identification No. 12E8)의 구조 모델을 정렬시켜 수득할 수 있다. 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 표상은 그 다음 이 복합체의 전자 밀도 지도와 종래 측정된 mAb13.2 Fab 단편의 구조 모델을 정렬시켜 수득할 수 있다. 그 다음, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 표상은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 전자 밀도 지도와 종래 측정된 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 모델을 정렬시켜 수득할 수 있다.
컴퓨터와 같은 기계는 이 기계에 연결된 디스플레이 상에 구조 좌표의 3차원의 도식적 표상을 생성할 수 있는 프로그램과 함께 mAb13.2 Fab 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 구조 좌표가 기억장치에 프로그램될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 구조 좌표를 입력 및 저장하기 위하여 소프트웨어 시스템을 설계 및/또는 활용할 수 있다. 이러한 소프트웨어 시스템은 구조 좌표의 도식적 표상을 생성할 수 있다. 또한, 소프트웨어 시스템은 외부 데이터베이스에 접속하여 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1과 유사한 구조 특징부를 보유한 화합물(예컨대, 폴리펩타이드)을 동정하고(하거나) 후보 제제가 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1과 상호작용할 가능성이 있게 할 수 있는 특징을 보유한 하나 이상의 후보 제제를 동정할 수도 있다. 또한, 소프트웨어 시스템은 외부 데이터베이스에 접속하여 mAb13.2 Fab 단편이나 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 구조 및 사람 IL-13과의 상호작용에 관한 정보를 통해서 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1과 상호작용하는 화합물을 동정할 수 있다.
구조 데이터를 함유하는 기억장치가 있는 기계 또는 그러한 데이터를 함유한 소프트웨어 시스템은 효능제 또는 길항제와 같은 IL-13 리간드의 적당한 설계 또는 선택을 원조할 수 있다. 예를 들어, 그러한 기계 또는 소프트웨어 시스템은 사람 IL-13과 결합하는 제제의 능력 평가를 원조할 수 있고, 사람 IL-13과 구조 또는 서열 상동성을 통해 관련 있는 화합물이나 단백질의 모델링을 원조할 수 있으며, 또는 사람 IL-13의 생활성을 방해하는 제제의 능력 평가를 원조할 수 있다. 사람 IL-13의 생활성은 생체내 또는 시험관내에서 그 폴리펩타이드가 세포 또는 조직 상이나 내에 유도하는 임의의 효과일 수 있다. 사람 IL-13의 생활성의 예는 본 명세서, 예컨대 실시예 1과 2에 기술되어 있다.
구조 데이터를 함유하는 기억장치가 있는 기계 또는 그러한 데이터를 함유한 소프트웨어 시스템은 효능제 또는 길항제와 같은 IL-13Rα1 리간드의 적당한 설계 또는 선택을 원조할 수 있다. 예를 들어, 그러한 기계 또는 소프트웨어 시스템은 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 결합하는 제제의 능력 평가를 원조할 수 있고, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 구조 또는 서열 상동성을 통해 관련 있는 화합물이나 단백질의 모델링을 원조할 수 있으며, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 생활성을 방해하는 제제의 능력 평가를 원조할 수 있다. 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 생활성은 생체내 또는 시험관내에서 그 폴리펩타이드가 세포 또는 조직 상이나 내에 유도하는 임의의 효과일 수 있다. 사람 IL-13Rα1의 생활성의 예는 본 명세서, 예컨대 실시예 3에 기술되어 있다.
상기 기계는 mAb13.2 Fab 단편, mAb13.2 Fab 단편의 단편, 사람 IL-13, 사람 IL-13의 단편, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 어느 한 복합체의 단편에 대한 표상(예컨대, 2차원 표상 또는 3차원 표상)을 제공할 수 있다. 소프트웨어 시스템은 예컨대 상기 기계가 그러한 정보를 제공할 수 있게 할 수 있다. 기계는 기계가 판독할 수 있는 데이터로 암호화된 데이터 저장물이 포함된 기계 판독식 데이터 저장 매체를 구비할 수 있다. 기계 판독식 데이터는 mAb13.2 Fab 단편의 원자 또는 mAb13.2Fab 단편의 단편의 원자, 사람 IL-13의 원자 또는 사람 IL-13 단편의 원자, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 원자, 사람 IL-13Rα폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체의 원자, 또는 어느 한 복합체의 단편의 원자에 대한 구조 좌표를 포함할 수 있다. 데이터 저장물을 포함하는 기계 판독식 저장 매체는 통상의 컴퓨터 하드 드라이브, 플로피 디스크, DAT 테이프, CD-ROM, DVD 및 다른 자기, 자기 광학, 광학 매체 및 컴퓨터에 사용할 수 있게 개조된 다른 매체를 포함할 수 있다. 또한, 기계는 기계 판독식 데이터를 원하는 3차원 표상으로 처리하기 위한 목적으로, 기계 판독식 데이터를 처리하는 명령을 저장하기 위한 실행 기억장치, 뿐만 아니라 이러한 작업 기억장치 및 기계 판독식 데이터 저장 매체에 연결된 중앙처리장치(CPU)를 보유할 수 있다. 마지막으로, 디스플레이가 상기 CPU에 연결될 수 있고, 이로써 3차원 표상은 사용자에게 가시화될 수 있다. 따라서, 데이터 사용에 대한 명령이 프로그램된 기계(예, 본 명세서에 기술된 종류의 하나 이상의 프로그램이 설치된 컴퓨터)를 사용할 때, 그 기계는 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 단편, 복합체 또는 복합체 단편 중 임의의 도식적 표상(예컨대, 2차원의 도식적 표상, 3차원의 도식적 표상)을 디스플레이할 수 있다.
디스플레이(예, 컴퓨터 디스플레이)는 mAb13.2 Fab 단편, mAb13.2 Fab 단편의 단편, 사람 IL-13 또는 사람 IL-13의 단편, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 또는 어느 한 복합체의 단편의 표상을 보여줄 수 있다. 또한, 표상은 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 결합된 제제를 포함할 수 있고, 또는 사용자가 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 표상 위에 제제의 3차원 모델을 중첩시킬 수 있다. 제제는 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1의 효능제(예컨대, 후보 효능제)이거나 또는 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1의 길항제(예컨대, 후보 길항제)일 수 있다. 일부 양태에 따르면, 제제는 공지의 화합물이거나 화합물의 단편일 수 있다. 특정 양태에 따르면, 제제는 종래 공지되지 않은 화합물이거나, 종래 공지되지 않은 화합물의 단편일 수 있다.
사용자는 결과적으로 수득되는 표상을 조사할 수 있다. mAb13.2 Fab 단편, mAb13.2 Fab 단편의 단편, 사람 IL-13 또는 사람 IL-13의 단편, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 단편, 사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13/mAb13.2 Fab 단편 복합체 또는 어느 한 복합체의 단편의 표상은 예를 들어 그러한 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 복합체에 대한 기존의 표상을 변경시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 복합체 또는 복합체 단편의 새로운 표상을 고찰해 보면, 항체의 원자와 사람 IL-13의 원자 사이에 바람직한 거리 또는 거리의 범위가 있을 수 있다. 다른 예로서, 복합체나 복합체 단편의 새로운 표상을 고찰해 보면, 사람 IL-13과 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 원자들 사이에 바람직한 거리 또는 거리의 범위가 존재할 수 있다. 바람직한 거리보다 긴 거리는 제제와 활성 부위(예, IL-13 폴리펩타이드 상의 IL-13 수용체 결합 부위(예컨대 IL-13Rα1 수용체 폴리펩타이드 또는 IL-13 수용체 폴리펩타이드에 대한 결합 부위)) 사이의 약한 상호작용과 관련이 있을 수 있다. 바람직한 거리보다 짧은 거리는 제제와 상기 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 약화시킬 수 있는 반발력과 관련이 있을 수 있다. 원자 사이의 거리가 너무 짧으면 입체 충돌이 일어날 수 있다. 입체 충돌은 두 원자의 위치가 부적절하게 가까울 때, 예컨대 두 원자가 반데르발스 반경의 합보다 짧은 거리만큼 이격되어 있을 때 일어난다. 입체 충돌이 있다면, 사용자는 입체 충돌이 경감될 때까지 사람 IL-13에 대한 제제의 위치를 조정할 수 있다(예컨대, 제제의 강체 이동 또는 회전). 사용자는 입체 충돌을 경감시키기 위하여 제제의 입체형태 또는 제제 부근에 있는 사람 IL-13의 입체형태를 조정할 수 있다. 입체 충돌은 제제의 구조 변경을 통해, 예컨대 방향족 고리와 같은 "부피가 큰 기"를 메틸 기 또는 하이드록시 기와 같은 부피가 작은 기로 변화시키거나, 또는 강성 기를 입체 충돌을 나타내지 않는 입체형태를 수용할 수 있는 연성 기로 변화시키는 등을 통해 제거할 수도 있다. 또한, 정전기력도 제제와 폴리펩타이드(예컨대, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 또는 사람 IL-4R 폴리펩타이드와 같은 수용체 폴리펩타이드와 상호작용하는 폴리펩타이드의 일부) 사이의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 정전기적 성질은 제제와 IL-13 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 약화시킬 수 있는 반발력과 관련이 있을 수 있다. 제제의 전하를 변경시키면, 예컨대 양하전 기를 중성 기로 치환하면 정전기적 반발을 경감시킬 수 있다. 유사한 방법을 수행하여, 예컨대 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 사람 IL-13 사이의 상호작용 부근에서, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계할 수 있다.
mAb13.2 Fab 단편과 사람 IL-13 사이의 결합 강도에 영향을 미치는 힘은 폴리펩타이드/제제 모델에서 평가할 수 있다. 이와 마찬가지로, 사람 IL-13과 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 사이의 결합 강도에 영향을 미치는 힘은 폴리펩타이드/제제 모델에서 평가할 수 있다. 이러한 힘에는 예컨대 수소 결합, 정전기력, 소수성 상호작용, 반데르발스 상호작용, 쌍극자 상호작용, π 적층 힘 및 음이온-π 상호작용이 포함될 수 있다. 사용자는 이러한 힘을, 예컨대 수소 결합에 적합한 거리와 각도로 배열된 수소결합 제공자/수용자 쌍을 주시하여 육안으로 관찰할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여, 사용자는 사람 IL-13, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 제제 사이에 더욱 바람직한 상호작용이 이루어지도록 모델을 변경할 수 있다. 이러한 모델 변경은 화학적 구조 변경 없이 폴리펩타이드 3차원 구조의 변경, 예컨대 아미노산 측쇄 입체형태 또는 주쇄 양면각을 변경시키는 것을 포함할 수 있다. 모델 변경은 전술한 바와 같이 제제의 입체형태 또는 위치 변경을 포함할 수 있다. 모델 변경은 또한 기의 치환, 첨가 또는 제거 등과 같은 제제의 화학적 구조 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13에 존재하는 수소 결합 제공자가 제제에 존재하는 수소 결합 제공자 부근에 위치한다면 사용자는 제제에 존재하는 수소 결합 제공자를 수소 결합 수용자로 치환할 수 있다.
제제와 사람 IL-13의 상대적 위치 또는 이들의 입체형태는 IL-13 폴리펩타이드에 대한 특정 제제의 최적 결합 기하형태를 찾기 위해 조정할 수 있다. 이와 마찬가지로, 제제와 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 상대적 위치는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 대한 특정 제제의 최적 결합 기하형태를 찾기 위해 조정할 수 있다. 최적 결합 기하형태는 예컨대 유리한 수소 결합 거리 및 각도, 최대 정전기적 인력, 최소 정전기적 반발력, 수성 환경으로부터 소수성 부(moiety)의 격리 및 입체 충돌의 부재 등을 통해 나타난다. 이러한 최적 기하형태는 사람 IL-13/항체 복합체 또는 사람 IL-13/수용체 복합체의 가능한 기하형태 계열 중 계산된 에너지가 가장 낮은 것일 수 있다. 최적 기하형태는 예를 들어, 분자 역학 또는 분자 동역학 계산을 통해 측정될 수 있다.
사람 IL-13이 여러 제제에 결합된 일련의 표상을 제조할 수 있다. 이와 마찬가지로, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 여러 제제에 결합된 일련의 표상을 제조할 수 있다. 각 표상마다 점수를 계산할 수 있다. 점수는 예컨대 사람 IL-13과 제제 사이 상호작용의 예상 강도일 수 있다. 이러한 점수는 결합 강도에 영향을 미치는 전술한 요인들 중 하나를 반영할 수 있다. 점수는 하나 이상의 제제들을 반영하는 점수의 총합일 수 있다. 여러 제제는 그 점수에 따라 등급이 매겨질 수 있다.
제제 설계의 단계는 기계(예, 컴퓨터)를 통한 자동 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 표상은 후보 제제의 표상과 함께 기계에서 프로그램될 수 있다. 이러한 기계는 수용체 결합 부위에 대한 각 후보 제제의 최적 결합 기하형태를 찾아내고, 점수를 계산하여 일련의 제제 중에서 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 가장 강하게 상호작용할 가능성이 있는 제제를 결정할 수 있다.
소프트웨어 시스템은 이러한 단계들이 용이해지도록 설계 및/또는 실행될 수 있다. 표상을 만들거나 필수적인 피팅 분석을 수행하는데 사용된 소프트에어 시스템(예, 컴퓨터 프로그램)에는 다음과 같은 것이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: MCASS, Ludi, QUANTA, Insight II, Cerius2, CHARMm 및 Modeler(캘리포니아 산디에고 소재의 Accelrys, Inc. 사 제품); SYBYL, Unity, FleXX 및 LEAPFROG(미주리주 세인트루이스 소재의 TRIPOS, Inc. 사 제품); AUTODOCK(캘리포니아 라 졸라 소재의 Scripps Research Institute 사 제품), GRID(영국 옥스퍼드 소재의 옥스퍼드 유니버시티 제품); DOCK(캘리포니아 샌프란시스코 소재의 유니버시티 오브 캘리포니아 제품); 및 Flo+ 및 Flo99(뉴저지 모리스 타운쉽 소재의 Tristlesoft 제품). 다른 유용한 프로그램에는 ROCS, ZAP, FRED, Vida 및 Szybki(뉴멕시코 산타페 소재의 Openeye Scientific Software 제품); Maestro, Macromodel 및 Glide(오레곤 포트랜드 소재의 Schrodinger, LLC 제품); MOE(퀘백 몬트리얼 소재의 Chemical Computing Group 제품), Allegrow(매사츄세츠 보스톤 소재의 Boston De Novo 제품), CNS(Burnger et al., Acta Crystall. Sect. D 54:905-921, 1997) 및 GOLD(Jones et al., J.Mol.Biol. 245: 43-53, 1995)가 있다. 구조 좌표는 또한 MOLSCRIPT, RASTER3D 또는 PYMOL을 사용한 사람 IL-13의 3차원 구조를 가시화는데 사용될 수 있다[문헌참조: Kraulis, J. Appl. Crystallogr. 24: 946-950, 1991; Bacon and Anderson, J. Mol. Graph. 6: 219-220, 1998; DeLano, The PYMOL Molecular Graphics System (2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA].
제제는 예를 들어 적당한 데이터베이스를 선별하여 선택할 수 있고, 미결합된 사람 IL-13 또는 미결합된 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 입체 배열 및 전하 전위를 적당한 소프트웨어 시스템으로 분석하여 새로 설계할 수도 있으며, 및/또는 공지의 사이토킨 리간드의 특징을 사용하여 설계할 수도 있다. 제제는 IL-4Rα 또는 IL-Rα1 폴리펩타이드와 같은 IL-4R 폴리펩타이드에 대한 IL-13의 결합을 차단하는 능력에 대해 검사할 수 있다. 제제는 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 결합하도록 설계할 수 있다. 이 방법은 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 효능제 또는 길항제를 설계하거나 선택하는 데에도 사용할 수 있다. 소프트웨어 시스템은 데이터베이스 탐색 및/또는 제제 선택 및 설계가 용이하도록 설계 및/또는 실행될 수 있다.
제제가 일단 설계되거나 동정되면, 이를 수득하거나 합성한 후, 사람 IL-13 활성 또는 사람 IL-13Rα1 활성에 미치는 영향에 대해 평가할 수 있다. 제제는 사람 IL-13과 접촉시키고 IL-13 생활성을 분석하여 평가할 수 있고, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 IL-13Rα1 생활성을 분석하여 평가할 수도 있다. 제제를 평가하는 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행된 활성 분석을 포함할 수 있다. 활성 분석은 예컨대 세포 기반 분석일 수 있다. 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 미치는 제제의 작용에 따라서, 제제는 사람 IL-13 또는 IL-13Rα1 활성의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 효능제는 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 동일하거나 유사한 활성을 갖게 하며, 길항제는 사람 IL-13 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 정상적인 기능을 억제할 것이다. 제제는 항IL-13 항체(예, mAb13.2 또는 mAb13.2 Fab) 또는 사람 IL-13 수용체(예, 사람 IL-4Rα 폴리펩타이드와 같은 IL-4R 폴리펩타이드, 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 같은 IL-13R 폴리펩타이드)의 존재 하에 사람 IL-13과 접촉하여, 제제가 사람 IL-13 폴리펩타이드에 대한 상기 항체 또는 수용체의 결합을 억제하는지의 여부를 측정할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 제제는 사람 IL-13에 대한 1종류의 수용체의 결합은 억제하지만, 다른 종류의 수용의 결합은 억제하지 않는다. 예를 들어, 제제는 사람 IL-4R 폴리펩타이드(예, IL-4Rα 쇄)에 대한 사람 IL-13 폴리펩타이드의 결합은 억제할 수 있지만, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 대한 결합은 억제할 수 없다. 이와 마찬가지로, 다른 제제는 IL-13Rα1에 대한 사람 IL-13의 결합은 억제할 수 있으나, 사람 IL-4R 폴리펩타이드에 대한 결합은 억제할 수 없다. 다른 양태에 따르면, 제제는 사람 IL-4R 폴리펩타이드(예, IL-4Rα 쇄) 및 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드에 대한 IL-13 폴리펩타이드의 결합을 억제한다. 동정된 제제에 결합된 사람 IL-13을 함유하는 결정은 성장시킬 수 있으며, 그 구조는 X선 결정학으로 측정했다. 제1 제제의 사람 IL-13과의 상호작용에 기초하여 제2 제제가 설계 또는 동정될 수 있다. 다양한 분자 분석 및 적당한 제제 설계 기술은 예컨대 미국 특허 제5,834,228호, 제5,939,528호 및 제5,856,116호 뿐만 아니라 PCT 출원번호 PCT/US98/16879(공개번호 WO99/09148)에 상세히 게시되어 있다.
특정 양태가 기술되었지만 다른 양태들도 가능하다.
일 예로서, 사람 IL-13, mAb13.2 Fab 단편 및 사람 IL-13Rα 폴리펩타이드를 수반한 양태가 기술되었지만, 더욱 일반적으로 임의의 IL-13 폴리펩타이드, 임의의 IL-13Rα1 폴리펩타이드 및/또는 임의의 항IL-13 항체도 사용될 수 있다.
일 예로서, 사람 IL-13 및 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 수반하는 양태가 기술되었지만, 더욱 일반적으로 임의의 IL-13 폴리펩타이드 및 임의의 IL-13Rα1 폴리펩타이드도 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-13 폴리펩타이드 또는 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 포유동물 이외의 종이나 포유동물 종에서 유래하는 것일 수 있다. 사람을 제외한 동물의 예에는 사람을 제외한 영장류(예, 원숭이 또는 꼬리없는 원숭이), 마우스, 래트, 염소, 암소, 황소, 돼지, 말, 양, 멧돼지, 해달, 고양이 또는 개가 포함된다. 포유동물 이외의 종에는 병아리, 칠면조, 새우, 악어 또는 어류가 포함된다.
또한, IL-13 폴리펩타이드 또는 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 일반적으로 IL-13 폴리펩타이드 또는 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 임의의 이소폼 또는 가공된 형태의 전장의 아미노산 서열을 비롯한 전장의 성숙 폴리펩타이드일 수 있다. 이소폼은 1차 구조가 다른 단백질의 임의의 여러 다형태이다. 전장 IL-13은 단백질의 전구체 형태로 불릴 수 있다. 전장 IL-13은 시그널 펩타이드 절단 부위를 갖고 있다. IL-13 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드의 절단 후와 같이 가공된 폴리펩타이드일 수 있다.
사람 IL-13 폴리펩타이드는 전형적으로 수용체 폴리펩타이드(예, IL-4R 폴리펩타이드, IL-13α1 폴리펩타이드)와 상호작용하는 적어도 하나의 활성 부위를 보유한다. IL-13 폴리펩타이드는 2개의 다른 수용체 폴리펩타이드와 상호작용하는 3개의 활성 부위를 포함할 수 있다. 항IL-13 항체는 이러한 활성 부위 중 적어도 하나에 결합할 수 있다. 일반적으로, 활성 부위는 수용체 폴리펩타이드 결합 부위, 또는 인산화, 글리코실화, 알킬화, 아실화 또는 다른 공유 변형 부위를 포함할 수 있다. 활성 부위는 리간드와 상호작용 시 활성에 영향을 미칠 수 있는 실제 결합 부위에 인접하거나 근접한 보조 결합 부위를 포함할 수 있다. 사람 IL-13 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 4의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 4(도 2B)의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Ser7, Thr8, Ala9, Glu12, Leu48, Glu49, Ile52, Asn53, Arg65, Ser68, Gly69, Phe70, Cys71, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 제제는 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 IL-13의 아미노산 Glu49, Asn53, Gly69, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상의 아미노산과 약 2.0Å 이내(예, 약 1.5Å 이내 또는 약 1.0Å 이내)에서 상호작용할 수 있다. 일 대안예에 따르면, 사람 IL-13 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Arg11, Glu12, Leu13, Ile14, Glu15, Lys104, Lys105, Leu106, Phe107 및 Arg108 중 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 대안예에 따르면, 사람 IL-13 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Thr88, Lys89, Ile90 및 Glu91 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 사람 IL-13 폴리펩타이드는 전술한 활성 부위 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함할 수 있다.
사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드 리간드(예, 사람 IL-13 폴리펩타이드)와 상호작용하는 적어도 하나의 활성 부위를 보유한다. 항IL-13Rα1 항체는 적어도 하나의 활성 부위에 결합할 수 있다. 일반적으로 활성 부위는 폴리펩타이드 리간드 결합 부위 또는 인산화, 글리코실화, 알킬화, 아실화 또는 다른 공유 변형 부위를 포함할 수 있다. 활성 부위는 리간드와 상호작용 시 활성에 영향을 미칠 수 있는 실제 결합 부위에 인접하거나 근접한 보조 결합 부위를 포함할 수 있다. 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 12의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 12의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 잔기 Ile254, Ser255, Arg256, Lys318, Cys320 및 Tyr321 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 대안예에 따르면, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 활성 부위는 서열번호 12의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 잔기 Lys76, Lys77, Ile78 및 Ala79 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드는 이러한 활성 부위 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
사람 IL-13 폴리펩타이드, 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드 및 항IL-13 항체의 중쇄 및 경쇄, 예컨대 mAb13.2Fab에 대한 아미노산의 번호는 본 명세서에 기술된 것과 다를 수 있고, 표 10에 정의된 바와 같은 3차원 구조 ± 1.5Å 이내의 주쇄 원자의 rmsd, 또는 표 11에 정의된 바와 같은 3차원 구조 ± 1.5Å 이내의 주쇄 원자의 rmsd, 또는 표 12에 정의된 바와 같은 3차원 구조 ± 1.5Å 이내의 주쇄 원자의 rmsd를 형성하는 임의의 보존적 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 함유할 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13 가공된 폴리펩타이드의 번호는 도 2B에 기술된 것과 다를 수 있고, IL-13의 서열은 표 11의 좌표에 의해 정의되고 도 3에 도시된 바와 같은 구조, 또는 표 12의 좌표에 의해 정의되고 도 15 내지 17에 도시된 바와 같은 구조를 형성하는 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 다른 이소폼이나 유사체에 존재하는 대응 아미노산 및 보존적 치환은 관련 아미노산 서열의 육안 조사 또는 시중에서 입수할 수 있는 상동성 소프트웨어 프로그램(예, MODELLAR, 캘리포니아 산디에고 소재의 MSI 제품)을 사용하여 용이하게 동정된다.
유사체는 보존적 아미노산 치환이 있는 폴리펩타이드이다. 보존적 치환은 치환된 아미노산과 기능적 또는 구조적으로 등가인 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 극성이 유사하거나 입체 배열이 유사하거나 또는 치환된 아미노산과 동일한 계열(예, 소수성, 산성 또는 염기성)에 속하는 한 아미노산의 다른 아미노산으로 전환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은 폴리펩타이드(예, IL-13 폴리펩타이드, IL-13Rα1 폴리펩타이드)와 상호작용하는 제제의 동정 및 설계, 뿐만 아니라 분자 치환 분석 및/또는 상동성 모델링과 관련하여 항IL-13 항체 또는 사람 IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체 또는 사람 IL-13Rα1 폴리펩타이드/사람 IL-13 폴리펩타이드/항IL-13 항체 복합체의 3차원 구조에 중요하지 않은 영향을 미치는 치환을 포함한다.
실시예에는 마우스 유래의 항IL-13 항체에 대해 설명하고 있지만, 더욱 일반적으로 임의의 항IL-13 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 항IL-13 항체는 사람, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소, 말 또는 병아리에서 유래할 수 있다.
다른 예로서, 항IL-13 항체가 특정 방법에 의해 생산되는 구체예가 설명되었지만, 그 외 방법이 사용되어도 좋다. 예를 들어, 항IL-13 항체는 먼저 재조합 또는 천연 사람 IL-13으로 BABL/c 마우스 암컷을 면역화하여 폴리클로날 항혈청을 제조하여 제조할 수 있다. 혈청은 ELISA와 같은 분석을 통해 사람 IL-13에 결합하는지 선별할 수 있다. 혈청의 항체 역가가 높은 것으로 입증된 마우스 유래의 비장세포를 P3X63_AG8.653 골수종 세포주(ATCC, Manassas, VA)와 같은 골수종 세포주와 융합한 뒤, 선택 배지에 평판배양할 수 있다. 융합체는 한계 희석법으로 서브클로닝을 수회 반복하여 분리할 수 있고, 사람 IL-13에 대해 결합 친화성이 있는 항체의 생산에 대하여 선별할 수 있다. 항IL-13 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. IL-13에 결합하는 항체는 Fab 단편과 같은 항체의 단편일 수 있다.
일반적으로, 면역글로불린으로도 알려진 완전 항체는 각각 약 25kDa인 2개의 경쇄(L)와 각각 약 50kDa인 2개의 중쇄(H)로 구성된 글리코실화된 4량체 단백질이다. 각 경쇄는 N-말단 가변(V) 도메인(VL)과 불변(C) 도메인(CL)으로 구성되어 있다. 각 중쇄는 N-말단 V 도메인(VH), 3개 또는 4개의 C 도메인(CH) 및 힌지 영역으로 구성되어 있다. VH에 가장 가까운 CH 도메인은 CH1로 나타낸다. VH 및 VL 도메인은 프레임워크 영역이라 불리는 비교적 보존적 서열의 4 영역으로 구성되며, 이 영역은 초가변 서열의 3 영역(상보성 결정 영역, CDR)의 발판을 형성한다. CDR은 항원과의 특이적인 상호작용에 역할을 하는 대부분의 잔기를 함유한다. CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 한다. 따라서, 중쇄 상의 CDR 구성요소는 H1, H2 및 H3이라 하고, 경쇄 상의 CDR 구성요소는 L1, L2 및 L3이라 한다(예컨대, 표 4 참조). 여러 계열의 면역글로불린의 서브유닛 구조와 3차원 배열은 당업계에 공지되어 있다. 항체 구조에 대해서는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al.(1988)]을 참조한다. 가장 작은 항원 결합 단편은 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv(Fragment variable)이다. Fab(fragment antigen binding) 단편은 불변 영역 사이에 이황화 결합을 통해 공유 결합된 VH-CH1 및 VL-CL 도메인으로 구성된다.
따라서, 일 관점으로서, 본 발명은 IL-13에 결합하고(하거나) IL-13을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 또한, 항체 또는 이의 단편은 사람, 사람화된, 키메라성 또는 시험관내 생산된 항체일 수 있다. 일 양태에 따르면, 항IL-13 항체 또는 이의 단편은 사람화된 항체이다. 항체는 표 10±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 편차 제곱 평균의 제곱근(RMSD), 표 11±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 RMSD 또는 표 12±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 RMSD에 기술된 CDR의 주쇄 입체형태를 보유한 하나 이상의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개(예컨대, 구체적으로, CDR1에, 또는 적어도 2개의 CDR에, 예컨대 CDR1과 CDR3에, CDR1과 CDR2에, 또는 CDR 3개 모두에)는 RMSD가 각 구조에 상대적으로 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하이다. 일 양태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전체적으로 표 10±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 편차 제곱 평균의 제곱근(RMSD), 표 11±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 RMSD 또는 표 12±1.5, 1.2, 1.1 또는 1.0Å 이하의 RMSD에 기술된 CDR의 주쇄 입체형태를 보유한 가변 도메인을 포함한다. 이러한 가변 도메인은 또한 본 명세서에 기술된 항체, 예컨대 CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역과 적어도 70%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 항체는 본 명세서에 기술된 치료 방법 등에 사용될 수 있다.
항IL-13 항체는 예컨대 미국 가특허출원 60/578,473(2004년 6월 9일 제출), 미국 가특허출원 60/581,375(2004년 6월 22일 제출) 및 이와 동일자로 제출된 미국 특허 출원 번호[][대리인 처리번호:AM101493]에 게시되어 있으며, 상기 특허문헌들은 각각 본원에 참고인용되었다.
이하 실시예는 예시적이며 제한적인 것으로 간주되어서는 아니 된다.
실시예 1. mAb13.2 제조 및 기능 분석.
IL-13을 인식하는 항체를 제조하기 위하여 폴리클로날 항혈청을, 재조합 사람 IL-13(R&D Systems, 미네소타 미네아폴리스 소재)으로 BALB/c 마우스 암컷을 면역화하여 제조했다. 혈청을 ELISA로 사람 IL-13에 대한 결합에 대해 선별했다. 혈청 항체 역가가 높은 것으로 확인된 마우스 유래의 비장세포를 P3X63_AG8.653 골수종 세포주(ATCC, 버지니아주 마나사스 소재)와 융합하고 선택 배지에 평판배양했다. 융합체는 한계 희석법으로 3회 서브클로닝하여 분리하고 사람 IL-13에 대해 결합 친화성이 있는 항체 생산에 대해 선별했다. 3개의 모노클로날 항체가 IL-13에 결합하여 IL-13의 생체 활성을 중화 및/또는 억제할 수 있었다. 모노클로날 항체 mAb13.2(IgG1κ)를 추가 분석에 사용했다.
쥐 모노클로날 항체 mAb13.2가 사람 IL-13에 높은 친화성과 특이성으로 결합하는지를 확인하기 위해 여러 가지 분석을 수행했다. 먼저, Biacore 분석으로 mAb13.2가 사람 IL-13에 대한 결합에 있어서 빠른 개시 속도와 느린 종료 속도 및 높은 친화성이 있음을 확인했다(도 4).
ELISA 분석으로는, 제대혈 T 세포 유래의 천연 IL-13을 비롯한 검사된 사람 IL-13의 모든 형태에 mAb13.2가 결합한다는 것을 확인했다. 재조합 사람 IL-13을 가지고 이 분석을 수행하기 위하여, ELISA 평판을 항FLAG M2 항체로 코팅했다. FLAG 태그된 재조합 사람 IL-13의 결합은 비오틴화된 mAb13.2와 스트렙타비딘-퍼옥시다제로 관측했다. 이러한 결합은 유사분열물질 활성화되고 TH2 편중된 제대혈 단핵세포에서 분리된 천연 사람 IL-13 및 재조합 사람 IL-13과 경쟁할 수 있다(도 5). 재조합 쥐 IL-3은 mAb13.2와의 결합에 대해 경쟁할 수 없었다. 표지되지 않은 mAb13.2와 표지되지 않은 mAb13.2 Fab도 역시 비오틴화된 mAb13.2와 FLAG 태그된 IL-13과의 결합에 대해 경쟁할 수 있었다(도 11A). IL-13 특이적 비중화성 모노클로날 항체 mAb13.8은 비오틴화된 mAb13.2 결합과 경쟁할 수 없었다.
시험관내에서 IL-13 생활성을 중화시키는 mAb13.2의 능력은 TF1 생물학적 검정법, 사람 말초 혈핵 단핵구 및 사람 말초 혈액 B 세포를 사용하여 확인했다. IL-13을 최적 농도 이하의 농도로 사용할 때, 사람 적백혈병 TF1 세포주의 세포 증식은 IL-13 의존적이 될 수 있다. TF1 세포주에서 사이토킨을 결핍시킨 뒤, 다양한 농도의 정제된 마우스 mAb13.2 또는 가용성 억제제 rhuIL-13Rα2의 존재 하에 최적 이하 농도(3ng/ml)의 재조합 사람 IL-13에 노출시켰다. 세포를 3일 동안 항온배양하고, 마지막 4시간 동안의 3H-티미딘 혼입을 액체 섬광 계수법으로 측정했다. 최적이하의 IL-13 농도(3ng/ml)에서 mAb13.2는 TF1 증식의 용량 의존적 억제를 유발했 다(도 6 및 도 12A). 이러한 영향의 IC50 250pM은 rhuIL-13Rα2의 IC50과 비슷했다. 또한, mAb13.2Fab는 CD23 발현 사람 PBMC를 억제했다.
사람 PBMC는 낮은 친화성 IgE 수용체(CD23)의 세포 표면 발현을 용량 의존적 방식으로 증가시켜 IL-13 또는 IL-14에 반응한다(도 7A 참조). 따라서, IL-13 생활성을 중화시키는 mAb13.2의 능력을 확인하기 위하여 단핵구(CD11b+)를 사용했다. CD11b+ 단핵구를 표시된 농도의 정제된 마우스 mAb13.2의 존재 하에 재조합 사람 IL-13(도 7B) 또는 IL-4(도 7C) 1ng/ml으로 12시간 동안 처리했다. 그 다음, 세포를 수거하여 CyChrome 표지된 항CD11b 항체 및 PE 표지된 항CD23 항체로 염색했다. 표지화 정도는 유동세포측정법으로 관측했다. mAb13.2는 IL-13에 의해 유도된 CD23 발현(도 7B; 또한 도 12B 참조)은 억제하지만, IL-4에 의해 유도된 CD23 발현은 억제하지 않았다(도 7C).
또한, mAb13.2의 효과를 사람 말초 혈액 B 세포에 의한 IL-13 유도 IgE 생산 모델에서도 검사했다. 사람 B 세포는 IL-13 및 T 세포 유사분열물질인, 파이토헤마글루티닌(PHA)에 대한 반응으로, IgE에 대한 Ig 이소타입 전환 재조합을 일으켜, 배양물 중의 IgE 농도가 더 많아지게 된다. 이러한 효과는 IgE 생산성 B 세포의 빈도 증가로 확인할 수 있다. B 세포의 IL-13 의존적 IgE 생산에 미치는 mAb13.2의 효과를 조사하기 위하여, 건강한 제공자의 PBMC를 공급자(feeder)로서의 방사선조사된 자가 PBMC의 존재하에 마이크로역가 웰에서 배양한 뒤, PHA 및 IL-13으로 자극했다. 3주 후, 각 웰을 ELISA로 IgE에 대해 분석했다. PHA + IL-13은 IgE 생산성 B 세포 클론의 빈도를 증가시켰다. 이러한 효과는 mAb13.2에 의해 억제되었으나, mAb13.8(IL-13에 결합하지만, 중화시키지는 않음) 또는 배양된 B 세포에서는 IL-13의 상기 효과를 효과적으로 차단한 무관련 마우스 IgG.mAb13.2에 의해서는 억제되지 않았다(도 8).
마지막으로, IL-13에 대한 초기 세포 반응을 차단하는 mAb13.2의 능력은 전사(STAT) 6 인산화의 시그널 전달인자 및 활성인자에 미치는 효과를 조사하여 검사했다. IL-13과 이의 세포 표면 수용체와 상호작용한 즉시, STAT6은 이량체화하고 인산화되기 시작하며 세포질에서 핵으로 자리이동하고, 여기서 사이토킨 반응성 유전자의 전사를 활성화시킨다(Murata et al., J.Biol.Chem. 270: 30829-36, 1995). 인산화된 STAT6에 대항한 특이적인 항체는 IL-13 노출 30분 안에 웨스턴 블롯이나 유동세포측정법을 통해 상기 활성화를 관측할 수 있다. IL-13 의존적 STAT6 인산화에 미치는 mAb13.2의 효과를 검사하기 위하여, HT-29 사람 상피세포주의 세포를 표시된 농도의 IL-13으로 37℃에서 30분 동안 처리했다. 인산화된 STAT6은 세포 용해물에서 웨스턴 블롯(도 9A)이나 유동세포측정법(도 9B 및 도 9C)으로 관측했다. 도 9B에 예시된 실험에서 세포는 포화 농도의 IL-13으로 37℃에서 30분 동안 처리되었고, 그 다음 고정화, 투과성화 후 인산화된 STAT6에 대항한 Alexa-Fluor 488 표지된 mAb로 염색했다. 도 9C에 예시된 실험에서 세포는 항체의 존재 또는 부재 하에 최적 이하 농도의 IL-13으로 처리되고, 전술한 바와 같이 고정화 후 염색되었다. 유동세포측정 결과, mAb13.2는 STAT6 인산화를 차단하는 반면, mAb13.8과 대조 마우스 IgG1은 어떠한 효과도 없음을 확인했다.
실시예 2: 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2는 생체내에서 IL-13 생활성을 중화시킨다.
생체내에서 IL-13 활성을 중화시키는 마우스 mAb13.2의 능력은 돼지 회충(Ascaris suum)에 본래 알레르기성인 필리핀 원숭이에서의 항원 유도된 기도 염증 모델을 사용하여 검사했다. 이 모델에서 알레르기성 원숭이에게 돼지 회충 항원을 투여하여 염증성 세포, 특히 호산구를 기도 중으로 유입시켰다. 이러한 세포 유입을 차단하는 mAb13.2의 능력을 검사하기 위하여, 돼지 회충 항원을 이용한 투여 24시간 전에 상기 항체를 투여했다. 투여일에 좌측 폐로부터 기준 세척 시료를 채취했다. 그 다음, 상기 항원을 우측 폐로 기관지내 점적주입했다. 24시간 후, 우측 폐를 세척하고, 복수에서 정제된 mAb13.2 8mg/kg이 정맥내 처리된 동물에서 얻은 기관지 폐포 세척(BAL)액을 미처리 동물 유래의 BAL액과 비교했다. 호산구 수는 투여 후 미처리 동물 5마리중 4마리에서 증가한 반면, mAb13.2 처리된 동물에서는 6마리 중 1마리에서 증가했다(도 10). BAL 호산구 백분율은 미처리 그룹에서는 유의적으로 증가했으나(p<0.02), 항체 처리된 그룹에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 알레르기원으로 투여한 알레르기성 동물에서의 기도 호산구 증가증이 mAb13.2에 의해 효과적으로 예방된다는 것을 입증한다.
마우스 mAb13.2의 평균 혈청 반감기는 원숭이에서는 1주 미만이었다. mAb13.2의 모든 흔적이 혈청에서 사라진 3개월 시점에서, mAb13.2 처리된 동물에게 돼지 회충 항원을 재투여하여 각 개체들의 돼지 회충 반응도를 확인했다. 처리된 그룹의 원숭이 6마리 중 2마리가 무반응자인 것으로 관찰되었다.
실시예 3: 쥐 모노클로날 항체 mAb13.2는 IL-4Rα에 정상적으로 결합하는 IL-13 영역에 결합한다.
IL-13 생활성은 IL-13Rα1과 IL-4Rα쇄로 이루어진 수용체 복합체를 통해 매개된다. 이 사이토킨은 먼저 세포 표면에 존재하는 IL-13Rα1과 비교적 낮은 친화성 상호작용을 수행한다. 이 복합체는 그 다음 IL-4Rα를 유입하여 높은 친화성 수용체를 형성한다(Zurawski et al., EMBO J. 12: 2663, 1993; Zurawski et al., J.Biol.Chem. 270: 23869, 1995). IL-4Rα 쇄을 통한 시그널링은 IL-13에 대한 최초 세포 반응 중 하나로서 모니터될 수 있는 STAT6의 인산화를 수반한다(Murata et al., J.Biol.Chem. 270: 30829-36, 1995). 에피토프 지도화, X선 결정학 및 추가 Biacore 분석 등의 여러 접근법을 사용하여 쥐 mAb13.2 항체와 사람 IL-13 사이의 상호작용을 해명하고, 추가로 상기 항체의 IL-13 중화 효과의 기본을 측정했다.
에피토프 지도화 및 X선 결정학 분석은, IL-13 나선 C의 C 말단 영역, 즉 IL-4R 결합 영역(이하 참조)에 mAb13.2가 결합한다는 것을 보여주었다. 이 분석을 확인하기 위하여, mAb13.2와 IL-13 사이의 상호작용을 Biacore 칩으로 분석했다. 이 분석은 여러 방식으로 수행했다. 먼저, IL-4R을 Biacore 칩에 결합시키고, IL-13Rα1을 사전에 결합시킨 IL-13의 복합체를 상기 칩 위로 흘려보냈다. mAb13.2의 부재 시에는 3 분자 복합체의 형성이 확인되었다. 하지만, IL-13Rα1이 사전에 결합된 IL-13의 혼합물에 mAb13.2를 첨가한 경우에는, 칩 상의 IL-4R에 대한 결합이 차단되었다. 둘째, mAb13.2를 칩 상에 고정시키고, 결합된 IL-13을 용액상으로 첨가했다. IL-13Rα1은 결합된 IL-13과 상호작용하는 것으로 관찰되지만, 결합된 IL- 13과 IL-4R의 상호작용을 관측되지 않았다. 셋째, mAb13.2는 칩 상에 고정시킨 IL-13Rα1-Fc 또는 IL-13Rα1 단량체에 결합된 IL-13에 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 관찰들은 mAb13.2가 IL-13Rα1과 IL-13의 상호작용은 억제하지 않지만, IL-4Rα와 IL-13Rα1의 상호작용은 붕괴시킨다는 것을 시사한다. 이러한 붕괴는 IL-13 시그널링 복합체의 형성을 차단하는 것으로 생각되었다. 이러한 관찰은 이 항체의 중화 활성의 모델을 제공했다.
IL-13 및 IL-13Rα1과 mAb13.2의 복합체에 관한 시험관내 확인은 세포 표면에서 수용체에 결합된 IL-13에 mAb13.2가 잠재적으로 결합할 수 있다는 것을 암시한다. 포화량의 수용체 결합된 IL-13의 조건 하에서 세포 결합된 mAb13.2가 관측될 수 있는지 측정하기 위해, HT29 사람 상피 세포주에 4℃에서 IL-13을 적재하고, 항체 결합에 대해 검사했다. 유동세포측정을 통해 어떠한 세포 결합된 mAb도 관측할 수 없었다. 이러한 관찰은, mAb13.2가 IL-13 생활성의 효과적인 중화인자라는 증거와 함께 IL-13 수용체의 정상적인 기능이 mAb13.2에 의해 붕괴된다는 것을 시사했다.
실시예 4: 항IL-13 항체 mAb13.2Fab 단편의 결정 구조
마우스 복수 유래의 모노클로날 항체 mAb13.2는 단백질 A 친화성 컬럼을 사용하여 정제했다. 마우스 복수를 단백질 A 결합 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 8.0)으로 2X 희석하고, 0.2mm 여과 장치를 통해 여과했다. 여과된 용액을, 결합 완충액으로 평형화시킨 Poros Protein A 컬럼(Applied Biosystems, 매사츄세츠주 프라밍햄 소재)에 4℃에서 적용했다. 컬럼을 결합 완충액으로 세척하고, 100mM 글리신(pH 3.0)을 사용하여 IgG를 용출시켰다. 용출된 IgG는 1M Tris-HCl(pH 8.0)로 즉시 중화시켰다.
Fab 단편은 IL-13 모노클로날 IgG를 활성화된 파파인(Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재)으로 분해하여 제조했다. 파파인은 효소 스톡 용액을 얼음 상에서 분해 완충액(50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 20mM EDTA 및 20mM 시스테인, pH 7.5)으로 최종 파파인 농도가 1mg/ml가 되도록 희석하여 활성화시켰다. IgG의 절단은 파파인 분해 완충액 중에서 활성화된 파파인과 100:1 w/w의 비율로 37℃에서 7 내지 8시간 동안 항온배양하여 수행했다. 반응 정지는 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 중에서 4℃에서 하룻밤 동안 투석하여 수행했다. 투석된 용액을, 4℃에서 50mM Tris-HCl(pH 7.5)로 평형화된 직렬 Poros HS/Protein A 컬럼 상에 적재하여 파파인과 Fc 단편을 제거했다. Fab 단편을 함유하는 직렬 컬럼의 유통물(flow-through)은 그 다음 1mM 인산나트륨과 20mM Tris-HCl(pH 7.5)로 평형화된 하이드록실아파타이트 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA) 위에 적재하고, 1mM부터 125mM 까지의 인산나트륨 농도 구배로 25℃에서 용출시켰다. 용출된 Fab 단편 용액을 4℃, 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 하룻밤 동안 투석했다. 투석 후, 용액을 50mM Tris-HCl(pH 8.0)로 평형화된 Poros HQ 컬럼 위에 적재했다. 유통물을 수집하고, 황산암모늄을 최종 농도가 1.5M이 되도록 조정한 후 폴리프로필 아스파트아미드 컬럼(Nest Group, 매사츄세츠주 사우스보로우 소재) 위에 적재했다. 이 컬럼으로부터 1.5M에서 0M의 황산암모늄 농도 구배를 25℃에서 사용하여 Fab 단편을 용출시켰다. 이 단백질을 4℃, 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 투석했다.
분리한 mAb13.2 항체와 mAb13.2 Fab 단편을 IL-13 생활성 억제 능력에 대해 검사했다. 제1 분석으로, 정제된 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편을 ELISA 분석에서 비오틴화된 mAb13.2와 결합 경쟁 능력에 대해 검사했다. ELISA 평판에 항FLAG M2 항체를 코팅했다. FLAG-사람 IL-13의 결합은 비오틴화된 mAb13.2와 스트렙타비딘-퍼옥시다제로 관측했다. 완전 항체 및 Fab 단편은 결합 경쟁할 수 있었고, 이에 반해 IL-13 특이적 비중화성 항체 mAb13.8은 결합 경쟁할 수 없었다(도 11A 및 도 11B).
제2 분석으로, 정제된 mAb13.2 및 mAb13.2 Fab 단편을 IL-13 의존적 TF1 세포 증식 및 PBMC 상에서의 IL-13 의존적 CD23 발현 능력에 대해 검사했다. TF1 세포를 실시예 1에 기술한 바와 같은 재조합 사람 IL-13 3ng/ml와 함께 항온배양했다. 이 세포를 그 다음 점증 농도의 정제된 mAb13.2 또는 mAb13.2Fab로 처리하고, 앞에 기술한 바와 같이 세포 증식을 모니터했다. 완전 항체 및 Fab 단편은 모두 IL-13 의존적 TF1 세포 증식을 억제했다(도 12A). 상기 분리된 단백질이 CD23 발현에 미치는 효과를 검사하기 위하여, PBMC를 실시예 1에 기술한 바와 같은 재조합 사람 IL-13 1ng/ml와 함께 항온배양했다. 상기 단핵구를 점증 농도의 mAb13.2 또는 mAb13.2 Fab로 처리하고, CD23 발현을 전술한 바와 같은 유동세포측정법으로 모니터했다. 정제된 완전 항체 및 정제된 Fab 단편은 각각 IL-13 의존적 CD23 발현을 억제할 수 있었다(도 12B).
결정화를 위해, 정제된 mAb13.2Fab를 50mM Tris(pH 8.0)와 50mM NaCl의 용액 중에 12.6mg/ml의 농도로 제조했다. 이 단백질 용액 1㎕를 결정화 용액(20% PEG3350, 200mM K2SO4)(Hampton Research, Aliso Viejo, CA) 1㎕와 혼합하고, 증기 확산의 현수 적가법을 이용하여 약 18℃에서 결정을 형성시켰다.
mAb13.2 Fab 단편 결정을 가지고 ADSC Quantum-4 CCD 검출기를 이용하는 Advanced Light Source(ALS)(캘리포니아주 버클리 소재)의 방사광관(beamline) 5.0.2에서 데이터를 수집했다. 각 데이터 세트마다 -180℃에서 유리화시킨 단결정을 사용했다. 데이터 처리는 DENZO 및 Scalepack(Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. 276: 307-326, 1997)을 사용하여 실시하고 데이터 수집과 데이터 개량의 통계치는 각각 이하 표 1과 표 2에 정리했다.
mAb13.2 Fab의 구조는 프로그램 AMORE(Navaza, Acta Crystallogr. A50: 157-163, 1994)를 사용하여 분자 치환을 통해 규명했다. 모노클로날 2E8 Fab 항체 단편(PDB code 12E8)의 구조는 프로브로서 사용했다. 개량 전에, 데이터의 5%를 무작위로 선택하여 개량 과정을 모니터하기 위한 Rfree 검사 세트로 정했다. mAb13.2Fab 구조를 일련의 생략 지도를 사용하여 QUANTA(Accelrys, 캘리포니아주 산디에고 소재) 안에서 재구축했다. CNS를 이용한 개량(Brunger et al., Acta Crystallogr. D54: 905-921, 1998) 및 QUANTA를 이용한 재구축을 6회 순환한 후, 개량 결과는 Rcryst 25.9%와 Rfree 30.7%인 mAb13.2 Fab와 41개 물 분자를 함유하는 모델로 수렴되었다. 구조 개량 통계는 표 2에 제시했다. 결정 구조 좌표는 표 10에 제시했다.
실시예 5. mAb13.2 Fab/IL-13 복합체의 결정 구조.
결정화를 위해 재조합 IL-13(Swiss-Prot 수탁번호 P35225) 및 mAb13.2 Fab를 정제했다. 재조합 IL-13은 다음과 같은 정제했다. 이 콜리 K12 균주 GI934를 사람 IL-13의 발현에 사용했다. GI934는 2가지 이 콜리 프로테아제 ompT 및 ompP에 특이적인 결합부를 함유하는 GI724의 ilvG 유도체이다(LaVallie et al., Bio/Technology 11: 187-193, 1993). 구체적으로, 이 균주는 염색체 ampC 유전자좌에 안정하게 통합된 박테리오파지 1 억제인자(cI) 유전자를 함유한다. cI 유전자는 합성 살로멜라 티피뮤리엄 trp 프로모터에 의해 전사 조절된다. pAL-781의 유도체인 이 콜리 발현 벡터 pAL-981(Collins-Racie, et al., Bio/Technology 13: 982-987, 1995)은 사람 IL-13 발현 벡터의 작제에 기초로 사용했다.
사람 IL-13 유전자의 cDNA는, 이 콜리 코돈으로 최적화되고 유전자의 5' 말단에 AT 함량이 증가된 사람 IL-13 cDNA(수탁 번호 NM_002188)로부터 침묵 변화를 보유하도록 설계한 합성 올리고뉴클레오타이드 이본쇄로부터 만들었다. 사람 IL-13 아미노산(서열번호 3)(도 2A)의 아미노산 Gly21 내지 Asn132에 대응하는 합성 올리고뉴클레오타이드의 3가지 상보성 이본쇄 세트를 사용하여, 가공된 IL-13의 아미노산 서열(서열번호 4)인 사람 IL-13의 성숙 영역을 작제했다. 이본쇄 1의 이 콜리 최적화된 상보성 올리고뉴클레오타이드는
5'-TATGGGTCCAGTTCCACCATCTACTGCTCTGCGTGAACTGATTGAAGAACTGGTTAACATCACCCAGAACCAGAAAGCTCCGCTGTGTAACGGTTCCATGGTTTGGTCCATCAACCTG-3'(서열번호 6)이고, 이의 상보체는
5'-CAGCGGTCAGGTTGATGGACCAAACCATGGAACCGTTACACAGCGGAGCTTTCTGGTTCTGGGTGATGTTAACCAGTTCTTCAATCAGTTCACGCAGAGCAGTAGATGGTGGAACTGGACCCA-3'
(서열번호 7)이며; 이본쇄 2는
5'-ACCGCTGGTATGTACTGTGCAGCTCTGGAATCCCTGATCAACGTTTCTGGTTGCTCTGCTATCGAAAAAACCCAGCGTATGCTGTCTGGTTTCTGCCCGCACAAAGTTTCCGCTGGTCAG-3
(서열번호 8)이고, 이의 상보체는
5'-GAGGAGAACTGACCAGCGGAAACTTTGTGCGGGCAGAAACCAGACAGCATACGCTGGGTTTTTTCGATAGCAGAGCAACCAGAAACGTTGATCAGGGATTCCAGAGCTGCACAGTACATAC-3
(서열번호 9)이며; 이본쇄 3은
5'-TTCTCCTCTCTGCACGTTCGTGACACCAAAATCGAAGTTGCTCAGTTCGTAAAAGACCTGCTGCTGCACCTGAAAAAACTGTTCCGTGAAGGTCGTTTCAACTAATAAT-3
(서열번호 10)이고, 이의 상보체는
5'-CTAGATTATTAGTTGAAACGACCTTCACGGAACAGTTTTTTCAGGTGCAGCAGCAGGTCTTTTACGAACTGAGCAACTTCGATTTTGGTGTCACGAACGTGCAGA-3
(서열번호 11)이다.
이본쇄 1과 2의 상보체 가닥(하부) 및 이본쇄 2와 3의 상부 가닥을 각각 인산화했다. 상보성 가닥을 합하고, 각 이본쇄 혼합물을 90℃까지 가열한 다음, 이본쇄가 어닐링되도록 서서히 냉각했다. 이본쇄 1과 이본쇄 3은 각각 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 XbaI을 암호화하여, NdeI, XbaI 분해되고 겔 정제된 발현 벡터 pAl-981에 클로닝했다. 제한 분해, 올리고뉴클레오타이드의 효소적 인산화, DNA 단편 분리 및 연결은 모두 문헌[Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 기술된 바와 같이 수행했다. 연결 혼합물로 일렉트로컴피턴트 GI934를 게시된 바와 같이(LaVallie et al., Methods Mol Biol. 205: 119-140, 2003) 형질전환시켰다. pAL-981에 상기 3가지 올리고뉴클레오타이드 이본쇄 세트의 연결을 통해 플라스미드 pALHIL13-981을 수득했다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 모두 발현 벡터에 클로닝 후 확인된 서열이었다.
결과적으로 수득된 플라스미드 pALHIL13-981을 가지고 GI934를 형질전환시켰다. 플라스미드 pALHIL13-981로부터 사람 IL-13을 생산하기 위한 배양물의 최적 증식 온도는 실험적으로 결정했다. 발효조 배지는 1% 카스아미노산, 1.75% w/v 글루코스, 50mM KH2PO4, 15mM(NH4)2SO4, 30mM Na3.구연산염.2H2O, 20mM MgSO4, 100㎍/ml 앰피실린, DM 미량금속(300μM FeCl3, 29μM ZnCl3, 36μM CoCl2, 25μM Na2MoO4, 20μM CaCl2, 22μM CuCl2, 24μM H3BO3)을 함유했고, NH4OH로 pH 7로 조정했다. 30℃하에 발효조 배지에서 증식된 pALHIL13-981을 함유한 GI934 새 배양물을 10L 발효조에 A550이 0.00005가 되도록 접종했다. 발효조 배양은 30℃에서 A550이 1.2가 될 때까지 증식시킨 다음, 온도를 37℃로 조정한 후 A550이 7.5가 될 때까지 배양물을 증식시켰다. 배양물에 트립토판을 500㎍/ml이 되게 첨가하여 pL 프로모터로부터 단백질 합성을 유도했다. 배양물을 37℃에서 4.25시간 동안 증식시킨 다음 원심분리하여 세포를 수거했다. 발현 벡터의 서열은 도 13에 제시했다(서열번호 5).
단백질은 본질적으로 불용성이었다. 따라서, 세포를 미세유동화기(microfluidizer)를 사용하여 파쇄하고, 불용성 IL-13을 수거하여 50mM Ches(pH 9), 6M 구아니딘-HCl, 1mM EDTA, 20mM DTT에 약 2mg/ml 농도로 용해했다. 이 용액을 50mM Ches(pH 9), 3M 구아니딘-HCl, 100mM NaCl, 1mM 산화된 글루타치온에 20배 희석하고 10배 용량의 20mM Mes(pH 6)에 대하여 2회 투석했다. 원심분리로 정화시킨 후, IL-13을 SP-세파로스에 흡착시키고 Mes 완충액 중의 NaCl 농도 구배를 사용하여 용출시켰다. 최종 정제는 Superdex 75 상에서 40mM 인산나트륨, 40mM NaCl을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 수행했다.
mAb13.2 Fab는 실시예 4에 기술한 바와 같이 정제했다.
Fab:IL-13 복합체는 이 둘을 약 1:1의 몰비로 혼합하여 제조했다. IL-13(40mM MES와 40mM NaCl, pH 6.0 중에 50μM) 및 mAb13.2 Fab(50mM Tris.HCl, pH 8.0 중에 50μM)를 혼합하여 최종 복합체 농도 50μM을 만들었다. 이 복합체를 25℃에서 50mM Tris-HCl과 300mM NaCl, pH 8.0으로 평형화된 Superdex 75 크기 배제 컬럼(Amersham Biosciences, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 통해 추가 정제했다. 정제된 복합체를 50mM Tris-HCl과 50mM NaCl, pH 8.0에서 투석한 뒤, 결정화를 위해 준비했다.
결정화를 위해, 정제된 mAb13.2 Fab/IL-13 복합체를 50mM Tris(pH 8.0)와 50mM NaCl 용액에 11.3mg/ml 농도로 제조했다. 단백질 용액 1㎕를 결정화 용액(20% PEG3350, 50mM ZnOAc)(Hampton Research, 캘리포니아주 알리소 비에조 소재) 1㎕와 혼합했다. 결정은 현수 적가법에 의해 증기 확산을 통해 18℃에서 형성되었다.
mAb13.2 Fab/IL-13 복합체 결정의 데이터는 ADSC Quantum-4 CCD 검출기를 이용하는 ALS(캘리포니아주 버클리 소재)의 방사광관(beamline) 5.0.2에서 수집했다. 각 데이터 세트마다 -180℃에서 유리화시킨 단결정을 사용했다. 데이터 처리는 DENZO 및 Scalepack(Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. 276: 307-326, 1997)을 사용했다. 데이터 개량의 통계는 표 2에 정리했다. 결정 구조 좌표는 표 11에 제시했다.
이원성 mAb13.2Fab/IL-13 복합체 결정은 싱크로트론 방사선을 이용할 때 1.8Å으로 회절했다. 이 복합체의 구조를 프로그램 AMORE를 사용한 분자 치환과 프로브로서 mAb13.2 Fab(실시예 4에 기술된 것)의 결정 구조를 통해 규명했다. 개량 전에, 데이터의 5%를 무작위로 선택하여 개량 과정을 모니터하기 위한 Rfree 검사 세트로 정했다. mAb13.2Fab 구조를 일련의 생략 지도를 사용하여 QUANTA 안에서 재구축했다. 이 과정동안 초가변 영역 부근에서 초과 밀도가 관찰되었고, 이 영역은 각 재구축 사이클 후마다 예리해졌다. Fab 단편을 재구축한 후, IL-13의 NMR 구조(Moy et al., J.Mol.Biol. 310: 219-230, 2001)를 상기 초가변 영역 인접이 밀집되게 회전시켰다. CNS(Accelrys, 캘리포니아주 산디에고 소재)를 이용한 개량 및 QUANTA 안에서의 재구축을 3회 순환한 후, 개량 결과는 Rcryst 20.3%와 Rfree 23.5%인, mAb13.2 Fab 1분자, IL-13 1분자, 아세트산염 1분자, 아연 이온 3개 및 물 분자 465개를 함유한 모델로 수렴되었다. 개량 통계는 표 2에 제시했다.
mAb13.2/IL-13 결정성 복합체에서, Fab 경쇄의 잔기 1-211은 관찰가능한 반면, 잔기 212, 213 및 214는 밀집 부위에서 관찰되지 않았다. 중쇄의 경우, 잔기 1-127 및 133-210은 밀집되게 모델링했고, 잔기 128 내지 132는 전혀 밀집되지 않았다. IL-13의 경우 잔기 7-21, 26-78 및 81-109는 관찰가능했고, 잔기 1-6, 22-25, 79 및 80은 불규칙적이었다. 몇몇 잔기는 부적당한 전자 밀도 X선 실험으로 인해 더 작은 잔기로 모델링되었다(표 5 참조).
이 구조에서 결합된 상태로 발견된 것은 결정화 완충액 중의 3개의 아연 분자였다. 이들 중 어떠한 분자도 IL-13과 Fab 분자 사이의 상호작용에 관여하지 않았다. 아연 분자 중 2개는 비대칭 단위의 분자와 이 단백질의 대칭 관련 카피 간의 접촉에 관여했고, 따라서 이 복합체의 결정화에 중요한 역할을 했다. 아연 1은 Fab 경쇄 잔기 Glu27 및 Glu97, 및 경쇄의 대칭 관련 카피의 잔기 Glu189 및 His193에 배위결합했다(아미노산 번호는 서열번호 1(도 1A)에 따름). 아연 2는 IL-13 잔기 His84 및 Asp87과 IL-13의 대칭 관련 카피 잔기 Asp98 및 His102에 배위결합했다. 아연 3은 IL-13 잔기 Glu12 및 Glu15와 다른 리간드로서 물 분자에 배위결합했다(아미노산 번호는 서열번호 4(도 2B)에 따름).
mAb13.2 Fab 단편과 상호작용하는 IL-13의 잔기는 나선 C의 C 말단 단부에 위치했다(잔기 68-74). 도 3은 항체의 CDR 루프와 IL-13의 C 알파 나선의 상호작용을 도시한 것이다. Fab와 IL-13 잔기 Glu49, Asn53, Gly69, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 사이에는 수소 결합 상호작용이 관찰되었다. 나선 A의 N 말단 끝은 Fab 단편의 반데르발스 작용 거리 이내였다. 이러한 상호작용은 표 3과 4에 요약했다.
도 3은 사람 IL-13과 mAb13.2Fab의 공동 결정 구조를 예시한 리본 다이아그램이다. mAb13.2 Fab의 경쇄는 어두운 음영으로 표시하고 중쇄는 밝은 음영으로 표시했다. IL-13 구조는 우측에 나타냈다. 이 도면은 항체의 CDR 루프와 IL-13의 C 알파 나선의 상호작용을 나타낸다. IL-13과 수소 결합 접촉을 형성하는 mAb13.2 중쇄의 주요 잔기는 SER50(CDR2), SER53(CDR2), TYR101(CDR3) 및 TYR102(CDR3)이다. IL-13과 반데르발스 접촉을 형성하는 mAb13.2 중쇄의 주요 잔기는 ILE30(CDR1), SER31(CDR1), ALA33(CDR1), TRP47, SER50(CDR2), SER52(CDR2), SER53(CDR2), TYR58(CDR2), LEU98(CDR3), ASP99(CDR3), GLY100(CDR3), TYR101(CDR3), TYR102(CDR3) 및 PHE103(CDR3)(표 4 참조; 아미노산 번호는 서열번호 2(도 1B)의 번호매김에 따른 것이다)이다.
서열번호 1(도 1A)의 아미노산 번호매김에 따라, IL-13과 수소 결합 접촉을 하는 mAb13.2 경쇄의 주요 잔기는 ASN31(CDR1), TYR32(CDR1), LYS34(CDR1), ASN96(CDR3) 및 ASP98(CDR3)이다. IL-13과 반데르발스 접촉을 하는 mAb13.2 경쇄의 주요 잔기는 ASN31(CDR1), TYR32(CDR1), LYS34(CDR1), ARG54(CDR2), ASN96(CDR3), ASP98(CDR3) 및 TRP100(CDR3)(표 4 참조)이다.
항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 나타내기 위하여 다양한 번호매김 체계를 사용했다. 카벳과 초시아 체계는 폴리펩타이드의 일정 CDR 영역에서 직선의 잔기로 인정되는 아미노산을 번호매기며, 삽입체가 특별히 표시된다. 카벳 체계(Kabat et al., NIH Publ.No. 91-3242, 5th ed., vols 1-3, Dept. of Health and Human Services, 1991)는 서열 변이성에 따라 중쇄 및 경쇄 CDR의 위치를 정의하는 반면, 초시아 체계(Al-Lazikani et al., Jour. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997)는 루프 영역을 통해 상기 위치를 정의한다. CDR 삽입체의 다른 배치로 인해, 중쇄 및 경쇄에 존재하는 아미노산의 번호매김은 두 시스템 간에 다를 수 있다. 아미노산 삽입부의 표시는 이러한 각 번호매김 시스템과 직선 번호매김 체계에 차이를 만든다. 표 6과 7에는 이러한 3가지 다른 번호매김 체계(카벳, 초시아 및 직선 번호매김)에 따른 mAb13.2 Fab의 경쇄 및 중쇄 각각의 아미노산 서열을 정렬시켜 제시했다.
실시예 6. 인터루킨-13, IL-13 수용체 α1 삼량 복합체의 결정 구조 및 억제 항체 mAb13.2 Fab의 결합 도메인
IL-13Rα1의 세포외 도메인(잔기 27-342; 도 14 참조)을, C-말단에 융합된 6x His 태그와 함께 발현시켰다(Aman et al., J.Biol.Chem. 271: 29265-29270, 1996). 발현은 효모 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris)에서 수행했다. 재조합 단백질은 NiNTA-아가로스(Qiagen) 상에서의 친화성 크로마토그래피 이후 HiTrap Q Sepharose HP(Pharmacia, Amersham Pharmacia Biotech, UK) 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 및 Superdex-75(Pharmacia) 상에서의 겔 여과 크로마토그래피를 통해 균질할 때까지 정제했다.
사람 IL-13(아미노산 잔기 1 내지 113)(서열번호 4)은 실시예 5에 기술된 바와 같이 발현시켜 정제했다.
IL-13 및 IL-13Rα1을 함유하는 복합체는 이 수용체와 약간 과량의 IL-13을 혼합하여 제조했다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 복합체 형성을 확인한 후, 복합체를 엔도글리코시다제 Hf(endoHf)(25,000유닛/mL)로 37℃에서 90분 동안 처리했다. 탈글리코실화된 복합체를 콘카나발린 A(conA)-세파로스 컬럼에 적용하여 올리고사카라이드가 절단되지 않은 단백질을 제거하고, 남은 복합체를 NiNTA 컬럼에 적용하여 EndoHf를 제거했다. 정제한 복합체를 Superdex-200(GE Healthcare(구 Amersham Biosciences) 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서의 겔 여과 크로마토그래피로 균질할 때까지 정제했다. IL-13과 IL-13Rα1 1:1 복합체 형성은 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피로 확인한 후 결정 선별을 수행했다.
mAb13.2 Fab는 실시예 4에 기술된 바와 같이 정제했다.
IL-13, IL-13Rα1 및 mAb13.2 Fab 복합체의 결정은 단백질 복합체 10mg/ml, 13% PEG-MME 2000 및 100mM HEPES(pH 7.0)을 함유하는 현수 점가 증기 확산법을 통해 18℃에서 성장시켰다. 수 주가 지나자 결정이 나타났지만, 수 개월 동안에도 최대 크기에 도달하지는 않았다. 결정은 단위 셀 치수가 a=164.9Å, b=164.9Å, c=74.8Å이고 스페이스 그룹 I4의 대칭이었다. 데이터 수집 전, 결정을 10% 에틸렌 글리콜과 모액으로 순간 이동시키고 액체 질소 중에서 급속 냉각시켰다. 데이터 수집 동안, 결정은 100K에서 유지시켰다. 데이터는 캘리포니아주 버클리에 소재하는 어드밴스드 라이트 소스의 5.0.1 방사광관에서 수집했다. 강도를 합산하여 DENZO(Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. 276: 307-326, 1997) 및 SCALA("CCP4", Acta Cryst D50: 760-763, 1994)를 사용하여 평가했다.
구조는 mAb13.2 Fab/IL-13 복합체의 좌표를 사용하여 분자 치환법으로 분석했다(표 11). 초기 상은 CCP4("CCP4", Acta Cryst D50: 760-763, 1994)에서 수행된 바와 같은 솔로몬(Solomon)을 이용한 용매 편평화법으로 향상되었다. 초기 모델을 수득하기 위해서는 CCP4 내의 강체 개량을 사용했다. 연속된 밀도를 보유한 실험 지도가 수득되었고, QUANTA(Accelrys, Inc., 캘리포니아주 산디에고 소재)를 사용하여 초기 모델을 제작했고, CNS(Brunger et al., Acta Cryst., D54: 905-921, 1998)를 이용하여 30 내지 2.2Å의 데이터에 대하여 개량했다. 최종 개량 모델은 IL-13Rα1(잔기 6-314), mAb13.2 Fab(경쇄 잔기 1-213 및 중쇄 잔기 1-213) 및 IL-13(잔기 6-112)의 폴리펩타이드 쇄 뿐만 아니라 123개 물 분자를 함유하며, Rwork 값은 24.4%이고 Rfree 값은 27.2%였다. 데이터 수집 및 개량의 통계치는 표 8과 9에 제시했다. 라마챈드런 플롯의 허용 영역 외측에 속하는 주쇄 비틀림각은 전혀 없었다. 구조 형상은 PYMOL(DeLano, "The PYMOL Molecular Graphics System"(2002) DeLano Scientific, 캘리포니아주 산카를로스 소재) 및 Ribbons(Carson, J.Appl.Cryst. 24: 958-961, 1991)를 사용하여 만들었다. 구조 좌표는 표 12에 제시했다. 다음과 같은 IL-13Rα1의 잔기에는 C-베타 원자 이상의 밀도가 없었고, 각 좌표들에 모호성을 반영하기 위해 일부를 생략했다: 81E, 93R, 104T, 105N, 111S, 112I, 122E, 124D, 150R, 151T, 157N, 165R, 168E, 169K, 174E, 195S, 196S, 197F, 305D, 306T, 339K, 110P, 200Q, 203Q, 204I, 209N, 212K, 213I, 214K, 240N, 279E, 284N 및 293N.
IL-13과 IL-13Rα1 사이에는 실질적인 상호작용점이 2군데 있다. 그 하나는 Ig 도메인 1과 사이토킨의 나선 C와 D를 연결하는 루프의 일부 간의 상호작용이고, 다른 하나는 수용체의 Ig 도메인 3과 IL-13의 나선 A와 D 사이의 상호작용이다(도 15 참조).
IL-13Rα1의 Ig 도메인 1과 IL-13 사이의 상호작용은 두 분자 사이를 연결하는 확장된 베타 시트를 형성시킨다. IL-13(서열번호 4)의 잔기 Thr88, Lys89, Ile90 및 Glu91은 수용체(서열번호 12)의 잔기 Lys76, Lys77, Ile78 및 Ala79와 상호작용하는 베타 가닥을 형성한다(도 16 참조). 또한, IL-13의 Met33의 측쇄는 이의 인접 가닥의 측쇄에 의해 형성된 소수성 포켓 안으로 뻗어있다.
Ig 도메인 3과 상호작용의 주요 특징은 수용체 IL-13Rα1의 Ig 도메인 3에 있는 소수성 포켓으로의 IL-13의 소수성 잔기(Phe107)의 삽입이다. IL-13Rα1의 소수성 포켓은 잔기 Leu319, Cys257, Arg256 및 Cys320의 측쇄에 의해 형성된다(도 17). IL-13의 Phe107과의 상호작용은 IL-13Rα1(서열번호 12)의 아미노산 잔기 Ile254, Ser255, Arg256, Lys318, Cys320 및 Tyr321과 IL-13의 아미노산 잔기 Arg11, Glu12, Leu13, Ile14, Glu15, Lys104, Lys105, Leu 106, Leu107, Phe107 및 Arg108 사이에 광범한 반데르발스 상호작용 세트를 형성시킨다(도 17 참조).
기타 다른 양태들도 이하 청구의 범위에 속한다.
<110> Wyeth
<120> Anti-IL-13 antibodies, crystals of anti-IL-13 antibodies and complexes comprising
them
<130> 16163-029WO1
<150> US 60/578,736
<151> 2004-06-09
<150> US 60/578,473
<151> 2004-06-09
<150> US 60/581,375
<151> 2004-06-22
<160> 12
<170> KopatentIn 1.7
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Ala Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro
180 185 190
Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
210 215
<210> 3
<211> 132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys
35 40 45
Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu
65 70 75 80
Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala
100 105 110
Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu
115 120 125
Gly Arg Phe Asn
130
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe
65 70 75 80
Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val
85 90 95
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe
100 105 110
Asn
<210> 5
<211> 3560
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 5
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagaatt gatctctcac ctaccaaaca atgcccccct gcaaaaaata 2100
aattcatata aaaaacatac agataaccat ctgcggtgat aaattatctc tggcggtgtt 2160
gacataaata ccactggcgg tgatactgag cacatcagca ggacgcactg accaccatga 2220
aggtgacgct cttaaaaatt aagccctgaa gaagggcagc attcaaagca gaaggctttg 2280
gggtgtgtga tacgaaacga agcattggcc gtaagtgcga ttccggatta gctgccaatg 2340
tgccaatcgc ggggggtttt cgttcaggac tacaactgcc acacaccacc aaagctaact 2400
gacaggagaa tccagatgga tgcacaaaca cgccgccgcg aacgtcgcgc agagaaacag 2460
gctcaatgga aagcagcaaa tcccctgttg gttggggtaa gcgcaaaacc agttccgaaa 2520
gattttttta actataaacg ctgatggaag cgtttatgcg gaagaggtaa agcccttccc 2580
gagtaacaaa aaaacaacag cataaataac cccgctctta cacattccag ccctgaaaaa 2640
gggcatcaaa ttaaaccaca cctatggtgt atgcatttat ttgcatacat tcaatcaatt 2700
gttatccaag aaggagatat acatatgggt ccagttccac catctactgc tctgcgtgaa 2760
ctgattgaag aactggttaa catcacccag aaccagaaag ctccgctgtg taacggttcc 2820
atggtttggt ccatcaacct gaccgctggt atgtactgtg cagctctgga atccctgatc 2880
aacgtttctg gttgctctgc tatcgaaaaa acccagcgta tgctgtctgg tttctgcccg 2940
cacaaagttt ccgctggtca gttctcctct ctgcacgttc gtgacaccaa aatcgaagtt 3000
gctcagttcg taaaagacct gctgctgcac ctgaaaaaac tgttccgtga aggtcgtttc 3060
aactaataat ctagagtcga cctgcagtaa tcgtacaggg tagtacaaat aaaaaaggca 3120
cgtcagatga cgtgcctttt ttcttgtgag cagtaagctt ggcactggcc gtcgttttac 3180
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 3240
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 3300
gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 3360
tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 3420
ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3480
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3540
gtcatcaccg aaacgcgcga 3560
<210> 6
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 6
tatgggtcca gttccaccat ctactgctct gcgtgaactg attgaagaac tggttaacat 60
cacccagaac cagaaagctc cgctgtgtaa cggttccatg gtttggtcca tcaacctg 118
<210> 7
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 7
cagcggtcag gttgatggac caaaccatgg aaccgttaca cagcggagct ttctggttct 60
gggtgatgtt aaccagttct tcaatcagtt cacgcagagc agtagatggt ggaactggac 120
cca 123
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 8
accgctggta tgtactgtgc agctctggaa tccctgatca acgtttctgg ttgctctgct 60
atcgaaaaaa cccagcgtat gctgtctggt ttctgcccgc acaaagtttc cgctggtcag 120
<210> 9
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 9
gaggagaact gaccagcgga aactttgtgc gggcagaaac cagacagcat acgctgggtt 60
ttttcgatag cagagcaacc agaaacgttg atcagggatt ccagagctgc acagtacata 120
c 121
<210> 10
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 10
ttctcctctc tgcacgttcg tgacaccaaa atcgaagttg ctcagttcgt aaaagacctg 60
ctgctgcacc tgaaaaaact gttccgtgaa ggtcgtttca actaataat 109
<210> 11
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide
<400> 11
ctagattatt agttgaaacg accttcacgg aacagttttt tcaggtgcag cagcaggtct 60
tttacgaact gagcaacttc gattttggtg tcacgaacgt gcaga 105
<210> 12
<211> 427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Trp Pro Ala Arg Leu Cys Gly Leu Trp Ala Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln
20 25 30
Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val
35 40 45
Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu
50 55 60
Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro
65 70 75 80
Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu
85 90 95
Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile
100 105 110
Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala
115 120 125
Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys
130 135 140
Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile
165 170 175
Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp
195 200 205
Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser
210 215 220
Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn
225 230 235 240
Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg
245 250 255
Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His
260 265 270
Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu
275 280 285
Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro
290 295 300
Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys
305 310 315 320
Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile
325 330 335
Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val
340 345 350
Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys
355 360 365
Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys Ile
370 375 380
Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys
385 390 395 400
Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val
405 410 415
Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln
420 425
Claims (182)
- 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 결정형 항체.
- 제1항에 있어서, 스페이스 그룹(space group) P212121을 갖는 결정형 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단위 셀 치수가 a=54.4, b=98.0, c=108.5 및 α=β=γ=90°인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 유래인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스, 래트, 토끼 또는 염소 유래인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 결정형 항체.
- 제6항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, mAb13.2인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, mAb13.2 Fab 단편인 결정형 항체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 IL-13 영역에 결합할 수 있는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표 10의 구조 좌표 +/- 알파 탄 소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근(root mean square deviation) 1.5Å 이하를 포함하는 결정형 항체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,항체의 경쇄가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고,항체의 중쇄가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며,약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시키는 결정형 항체.
- 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 결정형 조성물.
- 제17항에 있어서, 하나 이상의 물 분자를 추가로 포함하는 결정형 조성물.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 염 또는 아연을 추가로 포함하는 결정형 조성물.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항IL-13 항체 또는 Fab 단편에 결합된 IL-13 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 결정형 조성물.
- 제20항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 결정형 조성물.
- IL-13 폴리펩타이드 및항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체를 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항에 있어서, 스페이스 그룹 P213을 갖는 결정형 복합체.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 단위 셀 치수가 a=b=c=125.3Å 및 α=β=γ=90°인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 포유동물 유래인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 마우스 유래의 항체인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 포유동물 유래인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 사람 유 래인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2 Fab 단편인 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 영역에 결합된 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 영역을 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Ser7, Thr8, Ala9, Glu12, Leu48, Glu49, Ile52, Asn53, Arg65, Ser68, Gly69, Phe70, Cys71, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Asn31, Tyr32, Lys34, Arg54, Asn96, Asp98 및 Trp100, 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 Ile30, Ser31, Ala33, Trp47, Ser50, Ser52, Ser53, Tyr58, Leu98, Asp99, Gly100, Tyr101, Tyr102 및 Phe103 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 표 11의 구조 좌표 +/- 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 결정형 복합체.
- 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 결정형 복합체.
- IL-13Rα1 폴리펩타이드 및IL-13 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체.
- 제42항에 있어서, 스페이스 그룹 I4를 갖는 결정형 복합체.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 단위 셀 치수가 a=b=164.9Å, c=74.8Å이며 α=β=γ=90°인 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체를 추가로 포함하는 결정형 복합체.
- 제45항에 있어서, 항체가 포유동물 유래인 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 항체가 마우스 유래인 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 포유동물 유래인 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 사람 유래인 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 항체가 mAb13.2인 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 항체가 mAb13.2 Fab 단편인 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 항체가 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 영역에 결합된 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 영역을 포함하는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13Rα1 폴리펩타이드가 포 유동물 유래인 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13Rα1 폴리펩타이드가 사람 유래인 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13Rα1 폴리펩타이드가 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 결정형 복합체.
- 제44항 또는 제46항에 있어서, 항체가 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Ser7, Thr8, Ala9, Glu12, Leu48, Glu49, Ile52, Asn53, Arg65, Ser68, Gly69, Phe70, Cys71, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Asn31, Tyr32, Lys34, Arg54, Asn96, Asp98 및 Trp100, 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 Ile30, Ser31, Ala33, Trp47, Ser50, Ser52, Ser53, Tyr58, Leu98, Asp99, Gly100, Tyr101, Tyr102 및 Phe103 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 폴리펩타이드가 서열번호 12의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Ile254, Ser255, Arg256, Lys318, Cys320, Tyr321, Lys76, Lys77, Ile78 및 Ala79 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13Rα1 폴리펩타이드가 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 잔기 Arg11, Glu12, Leu13, Ile14, Glu15, Thr88, Lys89, Ile90, Glu91, Lys104, Lys105, Leu106, Phe107 및 Arg108 중 하나 이상과 상호작용하는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체.
- 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 표 12의 구조 좌표 +/- 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 결정형 복합체.
- 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제(agent)를 설계하는 것을 포 함하는 방법.
- 제65항에 있어서, 3차원 모델이 항체의 CDR을 포함하는 방법.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 항체가 항IL-13 항체의 Fab 단편인 방법.
- 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
- 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2인 방법.
- 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2 Fab 단편인 방법.
- 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 항체 원자들의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제71항에 있어서, 구조 좌표가 실험적으로 측정된 좌표인 방법.
- 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 서열번호 1의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Asn31, Tyr32, Lys34, Arg54, Asn96, Asp98 및 Trp100, 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 Ile30, Ser31, Ala33, Trp47, Ser50, Ser52, Ser53, Tyr58, Leu98, Asp99, Gly100, Tyr101, Tyr102 및 Phe103의 원자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 영역에 결합하는 방법.
- 제74항에 있어서, IL-4R 폴리펩타이드가 IL-4Rα 폴리펩타이드인 방법.
- 제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
- 제76항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- IL-13 폴리펩타이드의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 방법.
- 제78항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드에 결합된, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체를 추가로 포함하는 방법.
- 제79항에 있어서, 3차원 모델이 항체 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드에 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 영역을 포함하는 방법.
- 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 IL-4R 폴리펩타이드에 대한 IL-13 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 방법.
- 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제83항에 있어서, 구조 좌표가 실험적으로 측정된 좌표인 방법.
- 제83항 또는 제84항에 있어서, 구조 좌표가 표 11의 구조 좌표 +/- 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 방법.
- 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 IL-13 폴리펩타이드의 아미노산 Glu49, Asn53, Ser68, Gly69, Phe70, Cys71, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86의 원자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 제87항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13Rα1 폴리펩타이드 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- IL-13Rα1 폴리펩타이드에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 3차원 모델을 사용하여 상기 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 방법.
- 제89항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드에 결합된, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체를 추가로 포함하는 방법.
- 제89항 또는 제90항에 있어서, 제제가 IL-4R 폴리펩타이드에 대한 IL-13 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 방법.
- 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 모델이 IL-13 폴리펩타이드 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- 제92항에 있어서, 구조 좌표가 실험적으로 측정된 좌표인 방법.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 구조 좌표가 표 12의 구조 좌표 +/- 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 방법.
- IL-13 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체의 3차원 구조를 사용하여 이상적인 약물 설계를 수행하여 제제를 선별하는 단계;이러한 제제와 IL-13 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계; 및상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합하는 상기 제제의 능력을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
- 제95항에 있어서, 3차원 구조의 결정형 복합체가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체를 추가로 포함하는 방법.
- 제96항에 있어서, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편이 생체내에서 IL-4R 폴리펩타이드가 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 컴퓨터 모델링을 통해 선별되는 방법.
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 구조가 표 11의 구조 좌표 ± 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 방법.
- 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 구조의 결정형 복합체가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 구조가 표 12의 구조 좌표 ± 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 방법.
- 제95항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 제제를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제95항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,IL-13 폴리펩타이드와 제제를 포함하는 보강용 결정형 복합체를 수득하는 단계;상기 보강용 결정형 복합체의 3차원 구조를 측정하는 단계;상기 보강용 결정형 복합체의 3차원 구조를 사용하여 이상적인 약물 설계를 수행함으로써 제2 제제를 선별하는 단계;선별된 제2 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계 및상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합하는 상기 제2 제제의 능력을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제103항에 있어서, 제2 제제가 컴퓨터 모델링을 통해 선별되는 방법.
- 제103항 또는 제104항에 있어서, IL-13 활성을 억제하는 제2 제제의 능력을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- IL-13 폴리펩타이드를, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체와 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계 및이 조성물을 결정화하여 상기 항체가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합되어 있는, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제106항에 있어서, 증기 확산의 사용을 포함하는 방법.
- 제106항 또는 제107항에 있어서, 항체가 mAb13.2인 방법.
- 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2 Fab 단편인 방법.
- IL-13 폴리펩타이드를, 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드와 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계 및이 조성물을 결정화하여 상기 항체 및 상기 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 각각 결합되어 있는, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제110항에 있어서, 증기 확산의 사용을 포함하는 방법.
- 제110항 또는 제111항에 있어서, 항체가 mAb13.2인 방법.
- 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 mAb13.2 Fab 단편인 방법.
- 컴퓨터 시스템이 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조에 관한 정보를 수용하고, 후보 제제에 관한 정보를 수용하며, 상기 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제 에 관한 정보를 기초로 상기 IL-13 폴리펩타이드에 대한 상기 후보 제제의 결합 특성을 측정하도록 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제114항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조가 결정 구조인 소프트웨어 시스템.
- 제115항에 있어서, 결정 구조가 표 11의 구조 좌표 ± 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제117항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드와 이 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드의 구조가 결정 구조인 소프트웨어 시스템.
- 제118항에 있어서, 결정 구조가 표 12의 구조 좌표 ± 알파 탄소 원자의 편차 제곱 평균의 제곱근 1.5Å 이하를 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제114항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 컴퓨터 시스템이 후보 제제 에 관한 데이터베이스 유래의 정보를 적용하여, 상기 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제에 관한 정보를 기초로 하여 IL-13 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 후보 제제를 상기 데이터베이스에서 동정하게 하는 명령을 추가로 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제114항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 컴퓨터 시스템이 후보 제제와 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 모델링하게 하는 명령을 추가로 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서가,항IL-13 폴리펩타이드 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고;후보 제제에 관한 정보를 수용하며;상기 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제에 관한 정보를 기초로 상기 IL-13 폴리펩타이드에 대한 상기 후보 제제의 결합 특성을 측정하게 하는 복수의 명령이 저장된 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램.
- 제122항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하는 단계 및상기 IL-13 폴리펩타이드와 후보 제제의 결합 특성을 모델링하는 단계를 포함하는, 소프트웨어 시스템에 의해 실행되는 방법.
- 제124항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, 후보 제제의 데이터베이스 유래의 정보를 적용하여 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제에 관한 정보를 기초로 IL-13 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 후보 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서가항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고,후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 모델링하게 하는, 복수의 명령이 저장되어 있는 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램.
- 제127항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 제127항 또는 제128항에 있어서, 하나 이상의 프로세서가 데이터베이스 유래의 후보 제제에 관한 정보를 적용하고, IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 기초로 IL-13 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 후보 제제를 당해 데이터베이스에서 동정하게 하는 명령을 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프로세서가 IL-13 폴리펩타이드와 후보 제제의 결합 특성을 모델링하게 하는 명령을 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 컴퓨터 시스템이 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편을 포함하는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고;상기 IL-13 폴리펩타이드와 후보 제제의 결합 특성을 모델링하게 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제131항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 소프트웨어 시 스템.
- IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 결정형 항체.
- IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결정형 조성물.
- IL-13 폴리펩타이드 및IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결정형 복합체.
- IL-13 폴리펩타이드,IL-13Rα1 폴리펩타이드 및IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결정형 복합체.
- IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 항체의 3차원 모델을 사용하여 IL-13 폴리펩타이드와 상호작용하는 제제를 설계하는 방법.
- 제137항에 있어서, 3차원 모델이 항체 원자의 구조 좌표를 포함하는 방법.
- IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체와 IL-13 폴리펩타이드를 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계 및이 조성물을 결정화하여 상기 항체가 IL-13 폴리펩타이드에 결합되어 있는, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
- IL-13 폴리펩타이드와, IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체 및 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 접촉시켜 조성물을 형성시키는 단계 및이러한 조성물을 결정화하여 상기 항체 및 상기 IL-13Rα1 폴리펩타이드가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 각각 결합되어 있는, 약 3.5Å 이상의 분해능으로 X선을 회절시킬 수 있는 결정형 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
- 컴퓨터 시스템이, IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고,후보 제제에 관한 정보를 수용하며,상기 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 상기 후보 제제에 관한 정보를 기초로 상기 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 측정하게 하는 명령을 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제141항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서가, IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고,후보 제제에 관한 정보를 수용하며,IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보와 후보 제제에 관한 정보를 기초로상기 후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 측정하게 하는 복수의 명령이 저장된 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램.
- 제143항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하는 단계 및후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하는 단계를 포함하는, 소프트웨어 시스템에 의해 실행되는 방법.
- 제145항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조가 상기 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서가,IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고,후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특징을 모델링하게 하는 복수의 명령이 저장된 컴퓨터 판독 매체에 설치된 컴퓨터 프로그램.
- 제147항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 컴퓨터 시스템이,IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드의 부위에 결합할 수 있는 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드의 구조에 관한 정보를 수용하고,후보 제제와 상기 IL-13 폴리펩타이드의 결합 특성을 모델링하게 하는 명령 을 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 제149항에 있어서, 항체에 결합된 IL-13 폴리펩타이드 구조가 IL-13 폴리펩타이드에 결합된 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 소프트웨어 시스템.
- 이상적인 약물 설계를 사용하여 IL-13 활성을 조절할 수 있는 제제를 선별하는 단계 및이러한 제제의 치료적 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 검체의 IL-13 활성을 조절하는 방법.
- 제151항에 있어서, 이상적인 약물 설계가 IL-13 폴리펩타이드를 포함하는 결정형 복합체의 3차원 구조를 사용하는 것을 포함하는 방법.
- 제152항에 있어서, 결정형 복합체가 항IL-13 항체 또는 항IL-13 항체의 Fab 단편인 항체를 추가로 포함하는 방법.
- 제152항 또는 제153항에 있어서, 결정형 복합체가 IL-4R 폴리펩타이드가 생체내에서 결합하는 IL-13 폴리펩타이드 부위에 결합할 수 있는 항체를 추가로 포함하는 방법.
- 제152항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 결정형 복합체가 IL-13Rα1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 이상적인 약물 설계를 사용하여 IL-13 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제를 선별하는 단계 및상기 제제의 치료적 유효량을 치료를 요하는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-13 활성과 관련된 증상을 보유한 검체의 치료방법.
- 제156항에 있어서, 증상이 천식인 방법.
- 제156항 또는 제157항에 있어서, 증상이 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식인 방법.
- 제156항에 있어서, 증상이 암, 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증, 과도한 점액 생산, 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 염증, 및 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 자가면역 증상으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 방법.
- 제156항에 있어서, 증상이 만성 폐색성 폐병, 낭성 섬유증, 폐 섬유증, 알레르기 비염, 아토피 피부염, 염증장병, 크론병, 경화증, 피부경화증 및 호지킨스 림 프종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 방법.
- 검체가 IL-13 활성과 관련된 증상에 민감한지를 측정하는 단계;이상적인 약물 설계를 사용하여 IL-13 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제를 선별하는 단계 및상기 제제의 치료학적 유효량을 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-13 활성과 관련 있는 증상에 민감한 검체의 예방적 치료방법.
- 제161항에 있어서, 증상이 천식인 방법.
- 제161항 또는 제162항에 있어서, 증상이 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식인 방법.
- 제161항에 있어서, 증상이 암, 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증, 과도한 점액 생산, 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 염증, 및 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 자가면역 증상으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 방법.
- 제161항에 있어서, 증상이 만성 폐색성 폐병, 낭성 섬유증, 폐 섬유증, 알레르기 비염, 아토피 피부염, 염증장병, 크론병, 경화증, 피부경화증 및 호지킨스 림 프종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 방법.
- 제161항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Glu49, Asn53, Gly69, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상과 약 2.0Å 내에서 상호작용하여 IL-13 폴리펩타이드에 결합하는 방법.
- IL-13 활성과 관련된 증상의 예방 또는 치료에 유용한 약제의 제조에서, 제64항 내지 제97항, 제129항 또는 제130항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 설계되거나 선별된 제제의 용도.
- 제167항에 있어서, 제제가 IL-13 활성을 억제할 수 있는 용도.
- 제167항 또는 제168항에 있어서, 제제가 IL-13 활성을 생체내에서 억제할 수 있는 용도.
- 제167항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 천식인 용도.
- 제167항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식인 용도.
- 제167항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 암, 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증, 과도한 점액 생산, 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 염증, 및 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 자가면역 증상으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 용도.
- 제167항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 만성 폐색성 폐병, 낭성 섬유증, 폐 섬유증, 알레르기 비염, 아토피 피부염, 염증장병, 크론병, 경화증, 피부경화증 및 호지킨스 림프종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 용도.
- 제167항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Glu49, Asn53, Gly69, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상과 약 2.0Å 내에서 상호작용하여 IL-13 폴리펩타이드에 결합하는 용도.
- IL-13 활성과 관련된 증상의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제65항 내지 제105항, 제129항 또는 제130항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 설계되거나 선별된 제제.
- 제175항에 있어서, IL-13 활성을 억제할 수 있는 제제.
- 제175항 또는 제176항에 있어서, IL-13 활성을 생체내에서 억제할 수 있는 제제.
- 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 천식인 제제.
- 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 알레르기성 천식 또는 비알레르기성 천식인 제제.
- 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 암, 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증, 과도한 점액 생산, 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 염증, 및 피부, 위장 기관, 혈관 또는 결합 조직의 자가면역 증상으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 제제.
- 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 만성 폐색성 폐병, 낭성 섬유증, 폐 섬유증, 알레르기 비염, 아토피 피부염, 염증장병, 크론병, 경화증, 피부경화증 및 호지킨스 림프종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 증상을 포함하는 제제.
- 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 아미노산 Glu49, Asn53, Gly69, Pro72, His73, Lys74 및 Arg86 중 하나 이상과 약 2.0Å 내에서 상호작용하여 IL-13 폴리펩타이드에 결합하는 제제.
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