ES2339236T3 - Administracion de fragmentos de anticuerpo f(ab')2 anti-tnf-alfa. - Google Patents

Abstract

Empleo de un fragmento de un anticuerpo F(ab'')2 anti-TNF-α neutralizante, para la preparación de un medicamento para administración tópica para el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-α, la cual se debe al rechazo de un trasplante córneo, en donde dicho medicamento está preparado para la directa aplicación sobre el ojo.

Description

Administración de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha.

Antecedentes de la invención Ámbito de la invención

La presente invención se refiere al empleo de fragmentos del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha de neutralización para la preparación de un medicamento para administración tópica, para el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-\alpha, la cual se debe al rechazo de un trasplante de córnea. Los elementos del anticuerpo están de preferencia substancialmente libres de albúmina y de anticuerpos completos, así como también substancialmente libres de pirógenos, y pueden ser administrados con una cantidad efectiva de un soporte farmacéuticamente aceptable.

Antecedentes

Las citocinas juegan un papel clave en muchos procesos biológicos tales como por ejemplo la inducción de la respuesta inmunológica, el reclutamiento de células inflamatorias, citotoxicidad, actividad antivírica, reparación de heridas, angiogénesis, apoptosis, fiebre y síntesis de proteínas en fase aguda. Las citocinas actúan en una red compleja en la cual pueden inducir la producción y secreción de otras citocinas, modular la expresión de los receptores de citocina, y son capaces de tener efectos sinérgicos o antagonistas sobre otras citocinas. Las citocinas proinflamatorias han sido también implicadas como inductoras del rechazo de un trasplante.

Los anticuerpos son proteínas de un tipo de globulinas conocidas como inmunoglobulinas (Igs) que están presentes en el suero de la sangre como una respuesta del sistema inmunológico a la invasión de algunas substancias u organismos extraños. Se caracterizan por combinarse específicamente con substancias que son extrañas al organismo, para neutralizar y precipitarlas con el propósito de eliminarlas de la circulación. Varias aplicaciones industriales han sido desarrolladas utilizando anticuerpos, como por ejemplo, en diagnósticos, monitorización, prevención y tratamiento de una gran variedad de dolencias.

En regiones en donde, debido a las condiciones climáticas, abundan los animales venenosos, los anticuerpos han sido objeto de un empleo especial para combatir el veneno en tratamientos de pacientes con picaduras o mordeduras de escorpiones, arañas y serpientes. Otro empleo que se está desarrollando es el tratamiento de enfermedades auto-inmunológicas como por ejemplo la artritis reumatoide, la diabetes mellitus inmunodependiente, el AIDS, anemias hemofílicas, fiebre reumática, esclerosis múltiple, tiroiditis y psoriasis, entre otras. En estos casos, los anticuerpos anti-citocina se aplican o bien directamente al paciente o mediante inmunosorción extracorpórea. De forma ideal, dicho tratamiento elimina las citocinas generadas por el organismo en respuesta a una enfermedad, para evitar la muerte o una reacción inmunológica aguda (ver la patente U.S. nº 5.888.511 y 4.940.670).

El concepto de una terapia anti-citocina para combatir una enfermedad humana se originó con el empleo de esteroides en modelos caninos y primates de sepsis. La sepsis, conocida también como el síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) es la respuesta sistémica del anfitrión a una infección de gran envergadura de la corriente sanguínea, por bacterias productoras de toxinas. Puede desarrollarse una severa sepsis en el choque séptico, lo cual tiene lugar cuando una infección de gran envergadura conduce a una baja tensión sanguínea, un bajo flujo de sangre y una disfunción de los órganos.

El choque séptico causa más de 100.000 muertes cada año en Latinoamérica. La patogénesis de la sepsis incluye típicamente la exposición a un elemento nocivo, clásicamente una endotoxina, seguida de una respuesta inflamatoria y anti-inflamatoria inmunológica del anfitrión. Los mecanismos asociados con las lesiones durante el proceso séptico se desencadenan mediante los antígenos bacterianos como por ejemplo los lipopolisacáridos (LPS), lo cual induce la superproducción de citocinas proinflamatorias como por ejemplo el TNF-\alpha. Un choque séptico grave puede dar como resultado el fallo de órganos vitales tales como el cerebro, el corazón, los riñones y el hígado. Aunque la completa neutralización del TNF-\alpha, dará a menudo origen a infecciones bacterianas, dosis bajas de anticuerpos anticitocinas pueden atenuar la respuesta antiinflamatoria temprana, lo cual es beneficioso para la prevención tanto de la sepsis como del choque séptico.

La infusión de enterotoxina (como por ejemplo, veneno) tanto en animales como en hombres, induce una liberación medible de citocinas, tales como el factor alfa de la necrosis tumoral (TNF-\alpha) e interleucina-1 beta (IL-1\beta). Niveles de TNF-\alpha en sangre, en pacientes sépticos han sido correlacionados tanto con la gravedad de la enfermedad como de la mortalidad. La infusión de TNF-\alpha reproduce taquicardia, hipotensión, leucocitosis, coagulopatía, mayor permeabilidad, edema pulmonar, y múltiples fallos de órganos asociados con la sepsis. La terapia con anti-TNF-\alpha en forma de anticuerpos completos específicos al TNF-\alpha ha protegido a animales de la muerte debido a la infusión de endotoxinas. La interleucina-1\beta induce también los signos y síntomas de la sepsis, como por ejemplo, fiebre, anorexia, e hipotensión. El bloqueo de la IL-1\beta empleando un antagonista soluble del receptor de la IL-1 (IL-lRa) ha atenuado la gravedad de la enfermedad y la mortalidad en modelos animales experimentales de choque y sepsis. Así, la neutralización o eliminación de citocinas como por ejemplo, la IL-1\beta y TNF-\alpha, puede impartir resistencia al choque endotóxico.

El tratamiento convencional de las mordeduras de serpientes y picaduras de escorpiones, incluye primordialmente el empleo de antivenenos, esteroides y antibióticos. Estos tratamientos deben efectuarse habitualmente dentro de las dos horas después de la mordedura. Posibles complicaciones de mordeduras y picaduras de insectos, incluyen la reacción alérgica, infección, enfermedad y reacción al veneno como por ejemplo la reacción tóxica o choque. Los efectos sobre los tejidos locales varían entre las especies de escorpión (y de araña o serpiente). Otros efectos pueden incluir la hipertensión o hipotensión, dolor respiratorio o pérdida de reflejos protectores de las vías respiratorias, edema pulmonar y varios efectos autonómicos. Muchas de estas complicaciones podrían ser evitadas o minimizadas mediante una inmediata neutralización de las citocinas.

En el pasado, han sido obtenidos "antivenenos" contra mordeduras de serpientes, a partir de caballos hiperinmunizados con veneno de serpiente y a continuación, administrados a individuos mordidos por serpientes venenosas. Aunque los anticuerpos del suero de caballo neutralizaron las toxinas del veneno de serpiente, otros anticuerpos de caballo permanecieron algunas veces en el individuo durante varias semanas. Una condición llamada "enfermedad del suero" apareció algunas veces como respuesta a la inyección del suero (el cual incluye anticuerpos completos), de una especie extraña en un paciente en necesidad de tratamiento. Las diferencias entre la secuencia primaria de aminoácidos de la inmunoglobulina de caballo y la inmunoglobulina humana ocasionaron que el individuo empezara a fabricar anticuerpos contra la inmunoglobulina de caballo, que le era extraña, y otras proteínas de suero presentes en la inyección. La enfermedad del suero empezó a manifestarse por si misma, 7-10 días después de la inyección inicial. En este momento, el individuo empezó a mostrar síntomas como fiebre, escalofríos y algunas veces, nefritis glomerular. Aunque los síntomas se resolvieron por sí mismos después de la eliminación del antígeno extraño de la sangre del individuo, la re-exposición al mismo antígeno dio como resultado síntomas acelerados y potencialmente más graves (es decir, cinéticas similares a una respuesta inmunológica secundaria). Más recientemente, la generación de anticuerpos se ha logrado empleando construcciones de ADN recombinante que expresan péptidos del veneno. Esta tecnología se ha empleado más extensamente contra el grupo de citocinas inflamatorias que incluye los TNF-\alpha, IFN-\gamma, IL-1 y IL-6.

La psoriasis vulgaris es una enfermedad inflamatoria inducida por las células T. La patogénesis de la psoriasis está ligada a la activación de varios tipos de leucocitos que controlan la inmunidad celular y al proceso inflamatorio dependiente de las células T, en la piel, que acelera el crecimiento de las células epidermales y vasculares en las lesiones de psoriasis. Los pasos críticos en la activación inmunológica incluyen la maduración de las células de Langerhans, la activación de las células T, la diferenciación y expansión de células T del tipo 1, el tránsito selectivo de células T activadas a la piel, y la inducción de una cascada de citosina y quemocina inflamatorias en lesiones cutáneas. Tanto el IFN-\gamma como el TNF-\alpha están expresados a mayores niveles en las lesiones psoriáticas, y la expresión de varios genes regulada por el factor nuclear \kappa\beta (transduce las señales del TNF-\alpha) está también aumentada. Debido a que las citocinas secretadas por células T activadas conducen a respuestas inflamatorias y respuestas inmunológicas de etapa-final, una estrategia terapéutica es la de desactivar selectivamente las citocinas específicas con anticuerpos completos. Una vez más, el tratamiento con anticuerpos completos aumenta el riesgo de una reacción inmunológica separada, contra los propios anticuerpos extraños.

Las citocinas proinflamatorias juegan también un importante papel en los procesos biológicos implicados en las respuestas inmunológicas e inflamatorias de la córnea que a menudo están asociadas con el transplante de córnea. Se ha informado de que las células de la córnea son capaces de sintetizar una gran variedad de citocinas y factores de crecimiento, incluyendo las IL-1, IL-6 y TNF-\alpha.

Cuando un tejido o un órgano como por ejemplo, un pedazo de piel o de córnea, se injerta de un animal a otro, el órgano puede ser aceptado por el receptor sin ninguna reacción inmunológica. Alternativamente, el injerto puede ser rechazado por el receptor en proporciones variables que dependen del mecanismo efector que subyace. Un rechazo hiperagudo tiene lugar muy rápidamente en pacientes que ya tienen anticuerpos contra un injerto, y puede ser eludido mediante un emparejamiento ABO y efectuando un emparejamiento cruzado, en el cual el suero a partir de un receptor prospectivo se ensaya para detectar la presencia de anticuerpos anti-dadores citotóxicos. Una reacción aguda requiere días o semanas para manifestarse y se debe a la activación primaria de células T, la cual provoca varios mecanismos efectores incluyendo la producción de citocina. El factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha) juega un papel activo en el rechazo agudo de injertos, lo cual indica que la neutralización o minimización del TNF-alfa podría ayudar a prevenir estos rechazos agudos de injerto. La interleucina-1\alpha ha sido también implicada en la respuesta temprana aloinmunológica a los injertos de córnea, tales como la neutralización o minimización de la IL-1\alpha puede también ayudar a la prevención de rechazos de injerto de córnea (ver Zhu et al., J. Ifn. & Cytokine Rsrch., 19: 661-669 (1999)). El rechazo crónico se atribuye primordialmente a disparidades genéticas entre el donador y el receptor del injerto, y la mayor parte se tratan corrientemente con fármacos inmunosupresores.

Ha sido investigado el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, incluyendo el SIDA, mediante el bloqueo, inhibición, neutralización o eliminación de los interferones perjudiciales, factores de necrosis tumoral y otros inmunógenos o factores patológicos, pero las investigaciones no han encontrado un extenso éxito debido a las complicaciones surgidas, a menudo asociadas con la inmunoterapia (ver patente U.S. nº 5.888.511). El método de tratamiento descrito, comprende la administración a un paciente de una cantidad efectiva de anticuerpos anti-IFN-\gamma y/o del receptor, para tratar una enfermedad autoinmunológica mediada por IFN-\gamma. Dicho tratamiento con anticuerpos o receptores completos puede ocasionar su propia reacción inmunológica si el paciente reconoce los anticuerpos como extraños lo cual sería contraproducente en la estrategia del tratamiento global para la enfermedad autoinmunológica subyacente.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica corriente, y frecuentemente grave. En la RA, las citocinas están implicadas en casi todos los aspectos de la inflamación sinovial y la destrucción de tejidos articulares, con el factor de necrosis tumoral (TNF) jugando un particular importante papel. La neutralización del TNF en pacientes con RA por medio de una infusión intravenosa de receptores solubles de TNF o anticuerpos anti-TNF, ha mostrado alguna promesa, pero a menudo ha inducido respuestas inmunológicas separadas (ver Fox, D., Arch. Intern. Med. 160: 437-444 (2000)). Así, aunque dichos tratamientos son teóricamente capaces de neutralizar algunas de las citocinas implicadas en la RA, la posibilidad de causar una reacción inmunológica separada ha impedido un amplio éxito de dichos tratamientos. La administración de una composición que comprende fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2}, permite la efectiva neutralización de aquellas citocinas asociadas con la RA, a la vez que decrece substancialmente la posibilidad de una reacción inmunológica separada como se ha descrito más arriba.

La sepsis ha impedido también un éxito consistente del método terapéutico a pesar de que los esfuerzos de ensayos clínicos abarcan más de veinte años. Los agentes esteroides como por ejemplo los corticosteroides han sido ensayados en muchas etapas de la sepsis, pero han fallado para demostrar cualquier beneficio importante del tratamiento (ver Martin, Greg S., CHEST, Current Management Strategies for Severe Sepsis and Septic Shock (``Estrategias corrientes de gestión para la sepsis y choque séptico grave (2001)). La terapia con antibióticos combinada con el control de la fuente y la eliminación de infecciones (cuando es posible) son tratamientos tradicionales que han encontrado un éxito mínimo cuando se han aplicado en las etapas muy tempranas de la sepsis (id.). Los métodos de inmunoterapia que oscilan desde la administración de glucocorticoides a las preparaciones de anticuerpos monoclonales han sido también asociados con efectos adversos como por ejemplo una exagerada reacción inmunológica, por lo cual no han encontrado una extensa utilidad (ver Zeni et al., Crit. Care Med. 25:1095-1100 (1997)).

Skurkovich S, Kasparov A, Narbut N, Skurkovich B: "Treatment of Corneal Transplant Rejection in Humans with Anti-interferon-GAMMA Antibodies" ("Tratamiento del rechazo de trasplante de córnea en humanos con anticuerpos GAMMA anti-interferón"), America Journal of Ophtalmology, vol. 133, nº 6, Junio de 2002 (2002-06), páginas 829-830, describe el tratamiento de un rechazo de trasplante de córnea en humanos, mediante la administración de anticuerpos F(ab')_{2} anti-interferón gamma.

Qian Y: Dekaris I: Yamagami S; Dana M R: "Topical Soluble tumor necrosis factor receptor type I suppresses ocular chemokine gene expression and rejection of allogenic corneal transplants" ("El receptor tipo I del factor de necrosis tumoral soluble, tópico, suprime la expresión ocular del gen de la quemocina y el rechazo de transplantes alogénicos de córnea"), Archives of Ophthalmology, vol. 118, nº 12, 2000, páginas 1666-1671, describe un tratamiento tópico con el receptor soluble de TNF tipo 1 de transplantes de córnea alogénicos.

Sumario de la invención

El tratamiento con fragmentos del anticuerpo F(ab')_{2} anti-citocina, permite la neutralización de un exceso de citocinas a la vez que minimiza el riesgo de una reacción inmunológica separada a los propios fragmentos. En un aspecto, la invención se refiere al empleo de fragmentos del anticuerpo neutralizante F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha, en la preparación de un medicamento para la administración tópica para el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por TNF-\alpha, la cual es debida al rechazo de un transplante de la córnea, en donde el medicamento está preparado para la directa aplicación sobre el ojo.

Descripción detallada de las versiones preferidas

El glosario que sigue a continuación se facilita como una ayuda para comprender ciertos términos empleados en la presente. Las explicaciones que figuran en el glosario se hacen a efectos ilustrativos y no limitan el ámbito de la invención.

Los términos "paciente" e "individuo" se emplean indistintamente para significar un animal de sangre caliente, como por ejemplo un mamífero, que sufre de una mordedura o picadura de un animal venenoso, o bien que sufre de una enfermedad como por ejemplo una enfermedad autoinmunológica o "injerto contra el anfitrión", o está en peligro de un rechazo de un tejido u órgano alogénico trasplantado. Se entiende que los humanos y animales están incluidos dentro del ámbito de los términos "paciente" o "individuo", a no ser que se especifique otra cosa.

Un "inmunógeno" es cualquier célula o molécula que provoca una respuesta inmunológica (a saber, la producción de anticuerpos y/o sensibilización de las células linfoideas), en un individuo inmunológicamente competente.

Una "reacción inmunológica mediada por una citocina", es la respuesta inmunológica y el subsiguiente proceso inflamatorio que se organiza por el grupo de proteínas de bajo peso molecular conocido como citocinas. Esto puede incluir una reacción causada por la mordedura de un animal venenoso, sepsis, choque séptico, así como también una variedad de enfermedades autoinmunológicas como por ejemplo la artritis reumatoide o la psoriasis. Estas reacciones pueden incluir también el rechazo agudo de un tejido, injerto o trasplante de una prótesis.

"Choque anafiláctico" es una forma grave y generalizada de anafilaxis en la cual hay una amplia liberación de histamina y otras substancias vasoactivas que causan un edema, constricción de los bronquiolos, fallo cardíaco, colapso circulatorio, y algunas veces la muerte.

"Anafilaxis" es una sensibilidad inmunológica extrema del cuerpo o tejidos a la reintroducción de un antígeno. Es una forma de reacción anamnéstica y va acompañada de cambios patológicos en tejidos u órganos debido a la liberación de substancias fármacológicamente activas como por ejemplo histaminas y/o citocinas.

Las "citocinas" son un grupo variado de proteínas similares a las hormonas, que son producidas y secretadas por las células de mamíferos y tienen actividad autocrina o paracrina. A partir de células diana se producen una variedad de respuestas que dependen de la citocina y de la célula diana. Por ejemplo, las citocinas juegan un papel en la respuesta inmunológica a una infección o a un organismo/agente infeccioso. Las citocinas actúan en una compleja red en la cual pueden inducir la producción y secreción de otras citocinas, modular la expresión de los receptores de citocinas, y son capaces de tener efectos sinérgicos o antagonistas sobre otras citocinas. Así por ejemplo, las citocinas ayudan a regular la intensidad y duración de una respuesta inmunológica.

Un "antígeno", es una molécula que reacciona con un anticuerpo preformado o un fragmento de anticuerpo (como por ejemplo el F(ab')_{2}), y con los receptores específicos sobre células T y B.

Una "respuesta inmunológica" en los animales vertebrados puede definirse como la capacidad adquirida, transferible, de los linfocitos de reaccionar con especificidad y memoria frente a substancias extrañas.

"Linfocitos" son una clase de leucocitos (células blancas de la sangre) que reconocen antígenos específicos por medio de receptores de la superficie de la célula, que ellos mismos han sintetizado.

Una "inmunoglobulina" (Ig) es cualquier miembro de un grupo de proteínas que se encuentran en los animales superiores como componentes principales del sistema inmunológico. Están producidas por células de la serie de los linfocitos, y virtualmente poseen todas una actividad anticuerpo específica. Cada molécula de inmunoglobulina comprende esencialmente cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas idénticas, y dos cadenas ligeras idénticas, unidas entre sí por enlaces disulfuro. Además, todas contienen diferentes cantidades de oligosacáridos ligados. Hay cinco clases de inmunoglobulinas, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Las estructuras primarias de las cadenas pesadas difieren entre las varias clases, y se designan como \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu respectivamente para las clases antes citadas. Existen dos tipos de cadenas ligeras, \kappa y \lambda. Las moléculas de IgA e IgM contienen múltiplos de la unidad de cuatro
cadenas.

El factor de necrosis tumoral alfa ó TNF-\alpha'' (antiguamente llamado catequina), es una citocina que está producida por los macrófagos, monocitos, células endoteliales, neutrófilos, células del músculo de fibra lisa, linfocitos activados, y astrocitos. Se trata de una glicoproteína transmembránica y una citotoxina, y tiene una variedad de funciones, entre las que se incluyen la capacidad de inducir la expresión de genes para factores de crecimiento, citocinas, factores de transcripción, y receptores. Puede causar la citolisis de ciertas líneas celulares tumorales, y ha sido implicado en la inducción de la caquexia. Es un potente pirógeno, que causa fiebre por una acción directa o por estimulación de la secreción de interleucina-1. Puede también estimular la proliferación de las células e inducir la diferenciación celular bajo ciertas condiciones. La molécula es un homotrímero.

Una "interleucina" es un miembro de un grupo heterogéneo de citocinas que tienen la capacidad de actuar como moléculas señalizadoras entre diferentes poblaciones de leucocitos.

"Interleucina-1 ó IL-1" (antiguamente llamada: factor activador de linfocitos (LAF); proteína mitogénica (MP); pico auxiliar-1 (HP-1); factores II y m substitutivos de células T (TRF-III. TRF-M); y factor de activación/diferenciación de células B (BAF, BDF)). La IL-1 está producida primordialmente por macrófagos activados. No es capaz de promover y mantener in vitro a largo plazo, cultivos de células T, pero estimula la proliferación de timocitos, mediante la inducción de la liberación de interleucina-2. Está implicado en la respuesta inflamatoria, y se identifica como un pirógeno endógeno.

La "interleucina-1-alfa ó IL-1-\alpha" es una de las dos formas moleculares de la interleucina-1.

La "interleucina-1-beta ó IL-1-\beta" es la segunda de las dos formas moleculares de la interleucina-1.

La "interleucina-2 ó IL-2" (llamada también: factor mitogénico de timocitos (TMF); factor de crecimiento de células T (TCGF); co-estimulador; factor auxiliar de células asesinas (KHF); factor secundario de inducción de células T citotóxicas (SCIF). La interleucina-2 es una interleucina que está producida por las células T en respuesta a una estimulación mitogénica o antigénica. La IL-2 promueve y mantiene in vitro cultivos a largo plazo de células T. La expresión tanto de la IL-2 como del receptor de la IL-2 por las células T, está inducida por la IL-1.

La "interleucina-6 ó IL-6" (llamada también factor 2 estimulador de células B; interferón \beta-2; y factor de crecimiento del hibridoma). La IL-6 es una interleucina que induce el crecimiento del mieloma, y del plasmacitoma, así como también la diferenciación de células nerviosas. En los hepatocitos, induce los reactantes de fase aguda. La IL-6 actúa en sinergia con la IL-1 y el TNF en muchas respuestas inmunológicas, incluyendo la activación de las células T. El principal efecto de la IL-6 es aumentar las respuestas de las células inmunológicas a otras citocinas.

La "interleucina-12 ó IL-12" (un nombre alternativo es el de factor de maduración de linfocitos citotóxicos). La IL-12 es una interleucina que puede actuar como factor de crecimiento para las células activadas T y las células naturales asesinas (NK). Puede potenciar la actividad lítica de las células asesinas NK activadas por la linfocina, y estimula la producción de interferón-\gamma mediante el PMBC residual. Se trata de un heterodímero unido por enlaces disulfuro, de subunidades de 40 kDa y 35 kDa.

Un "interferón ó IFN" es un miembro de un grupo de proteínas que forman un grupo fuertemente relacionado de proteínas no víricas que están producidas y liberadas por células animales después de la exposición a una variedad de agentes inductores. No están normalmente presentes en las células no inducidas. Las células humanas producen tres tipos principales de interferón: interferón alfa (IFN-\alpha), interferón beta (IFN-\beta), e interferón gamma (IFN-\gamma). El interferón alfa y beta están clasificados como interferones tipo I, y el interferón gamma está clasificado como un interferón del tipo II.

Un "interferón tipo II" (llamado también interferón gamma, ó IFN-\gamma) está producido por linfocitos activados mediante antígenos específicos o mitógenos. Además de la actividad antivírica, tiene importantes funciones inmuno-reguladoras, como por ejemplo la activación de macrófagos. El interferón gamma es una glicoproteína que está en forma de heterodímero. El término "substancialmente libre" se refiere a la ausencia de material pirógeno y de proteína extraños a los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2}, como por ejemplo albúmina o anticuerpos completos, de acuerdo con la farmacopea mejicana.

El término "condiciones asépticas" se refiere a las medidas o métodos de precaución empleados en la manipulación de los diferentes productos de cada paso para evitar la contaminación del cultivo o medios estériles y la infección por microorganismos extraños o contaminantes.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un compuesto en la dosis unitaria de la composición, depende de un número de factores. Incluidos entre estos factores están la cantidad de otros ingredientes empleados y la tolerancia del ingrediente activo de la composición. Cantidades efectivas de ingrediente activo oscilan desde aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 50% en peso basado sobre el peso total de la composición. La cantidad de preparación de anti-citocina F(ab')_{2} que hay que administrar depende de las especies de las cuales se ha recogido el veneno. Para las composiciones contra los escorpiones, la preparación de F(ab')_{2} que hay que llenar en cada frasco, es la cantidad necesaria para neutralizar desde aproximadamente 135 hasta aproximadamente 220 dosis letales del 50% (LD50s) de veneno. Para composiciones contra la araña viuda negra, la cantidad necesaria para la neutralización es desde aproximadamente 540 hasta aproximadamente 880 dosis letales del 50% (LD50s) del veneno. Para composiciones contra la serpiente de coral, la cantidad necesaria para la neutralización es desde aproximadamente 360 hasta aproximadamente 660 dosis letales del 50% (LD50s) del veneno. Para las composiciones contra el i-Bothrops y el crótalo, se llenan los frascos con la cantidad necesaria para neutralizar desde aproximadamente 700 hasta aproximadamente 1100 dosis letales del 50% (LD50s) del veneno.

"Administración tópica" incluye la aplicación de substancias medicinales sobre la piel o varios orificios corporales. Las medicaciones pueden aplicarse en diferentes formas como por ejemplo en forma de líquido, semisólido o sólido. La aplicación tópica de la medicación puede suministrar un ingrediente activo localmente así como sistémicamente.

"Emolientes" son substancias blandas, grasas o oleaginosas que pueden aplicarse localmente, particularmente sobre la piel, y también sobre las membranas mucosas o tejidos erosionados. Las substancias irritantes solubles en agua, el aire y las bacterias transportadas por el aire, quedan excluidas mediante una capa de emoliente. Algunos ejemplos de emolientes corrientes son el aceite de ricino, el aceite de ricino sulfatado, la manteca de cacao, el aceite de coco, la crema cutánea, aceite de de maíz, aceite de algodón, ungüento hidrofílico, aceite de sésamo, y aceite de teobroma.

Un "soporte farmacéuticamente aceptable" o un "soporte dermatológicamente aceptable", es una carga sólida o líquida, un coadyuvante, aditivo, excipiente o substancia que puede emplearse con seguridad en la administración tópica. Una variedad de soporte farmacéuticamente aceptable ya bien conocido en la técnica, incluye las cargas sólidas o líquidas, diluyentes, emolientes, hidrotropos, agentes tensioactivos, y substancias encapsulantes. La cantidad de soporte empleado juntamente con los fragmentos de F(ab')_{2} es una cantidad que es suficiente para proporcionar una cantidad práctica de material por dosis unitaria de composición.

Los soportes farmacéuticamente aceptables específicos, para la administración tópica que pueden incorporarse a la composición de la invención incluyen disolventes, como por ejemplo, el agua, alcoholes, alquil metil sulfóxidos, pirrolidonas, laurocaprama, y mezclas de disolventes, como por ejemplo, acetona, dimetil acetamida, dimetilformamida.

Algunos de los posibles componentes de las formulaciones tópicas, transdermales y transmucosales, y dispositivos de administración, incluyen agentes solubilizantes, agentes para suspensiones, agentes dispersantes, conservantes, grasas animales y vegetales, aceites o ceras, agentes estabilizantes, agentes espesantes o gelificantes, agentes tamponantes, agentes adhesivos, coadyuvantes y aditivos, emulsionantes y agentes para potenciar la penetración. Algunos ejemplos de conservantes convencionales son el metilparaben, la propil y butil imidazolidinilurea, metilcloroisotiazolinona y metilisotiazolinona.

Ejemplos de coadyuvantes y aditivos que puede añadirse a composiciones para administración tópica incluyen bactericidas, fungicidas, virucidas, substancias filtrantes ligeras, ingredientes activos con una acción enfriante, antioxidantes, extractos vegetales, antiinflamatorios, substancias que promueven la curación de heridas, substancias surfactantes, emulsionantes, emolientes, humidificantes, humectantes, grasas, aceites, ceras, alcoholes, polioles, polímeros, estabilizantes de la espuma, disolventes orgánicos, derivados de silicio o agentes quelantes.

Aceites o ceras adecuados para emplear en composiciones dermatológicas incluyen aceites minerales (parafina líquida de), aceites vegetales (fracción líquida de la manteca de karite, aceite de girasol), aceites animales (perhidro-escualeno), aceites sintéticos (aceite de purcellin), aceites o ceras de silicio y aceites fluorados.

Algunos emulsionantes que son adecuados para emplear en composiciones dermatológicas incluyen el estearato de glicerilo, polisorbato 60, y monoestearato de sorbitano.

Ejemplos de disolventes para emplear en composiciones tópicas, incluyen los alcoholes inferiores como por ejemplo el etanol, isopropanol y propilenglicol.

Los agentes gelificantes hidroxílicos que puede emplearse en composiciones tópicas incluyen los polímeros de carboxivinilo, los copolímeros acrílicos, las poliacrilamidas, los polisacáridos, las gomas naturales y arcillas. Los agentes gelificantes lipofílicos incluyen las arcillas modificadas, las sales metálicas de ácidos grasos (como por ejemplo los estearatos de amonio), y la sílice hidrofóbica, etilcelulosa o polietileno.

``Copolímeros en bloque de polioxialquileno son copolímeros en bloque no iónicos de óxido de etileno y de óxido de propileno. El segmento poli(oxietileno) es hidrofílico y el segmento poli(oxipropileno) es hidrofóbico.

Como se ha descrito brevemente más arriba, existen cinco clases principales de inmunoglobulinas, las cuales se designan por IgM, IgG, IgA, IgE, e IgD. Las cadenas pesadas de las moléculas de Ig dentro de cada clase, se designan por \gamma (gamma), \mu (mu), \alpha (alfa), \varepsilon (épsilon) y \delta (delta) para las clases IgG, IgM, IgA, IgE, e IgD, respectivamente. Una molécula de proteína de inmunoglobulina típica (Ig) tiene un coeficiente de sedimentación de aproximadamente 7S y un peso molecular de aproximadamente 150.000 daltons. La forma global de una molécula de Ig viene representada por la letra Y. Todas las inmunoglobulinas tienen la misma estructura general. Están compuestas de cuatro cadenas de polipéptido, dos que son pesadas (H) y dos ligeras (L). Las dos cadenas pesadas se unen entre sí mediante dos puentes disulfuro conocidos como región bisagra, la cual está aproximadamente a medio camino a lo largo de las cadenas. Pegada a la región amino terminal, cada cadena pesada está unida por un puente de disulfuro con una cadena ligera. Cada cadena pesada tiene tres regiones constantes, C_{HI}, C_{H2} y C_{H3}, de las cuales las dos últimas están en la región del carboxilo terminal (antes de la región bisagra) y la primera está en la región amino terminal (inmediatamente después de la región bisagra). Cada cadena pesada tiene pues una región variable (VH) en el extremo amino terminal. Hay cuatro regiones constantes en las clases IgM e IgE. Cada cadena ligera tiene solamente una región constante, CL, en el extremo carboxilo terminal, y una región variable, VL, en el extremo amino terminal. Dentro de una misma clase de inmunoglobulina, todas las regiones constantes tienen secuencias de aminoácidos homólogas. Las cadenas pesadas \mu y \varepsilon carecen de regiones bisagra y contienen un dominio constante extra en su región
central.

Cuando la IgG se digiere enzimáticamente, pueden obtenerse diferentes fragmentos, en función de la enzima empleada. Si se emplea la papaína, se obtienen tres fragmentos, el fragmento de cristalización (Fc), y dos fragmentos de unión al antígeno (Fab). Si se emplea la pepsina, se obtiene un fragmento F(ab')_{2}, mientras que el fragmento de cristalización es digerido (ver solicitud de patente pub. U.S. nº 2002/0164327). Esto es debido al hecho de que la papaína corta las cadenas pesadas inmediatamente después de la región bisagra (hacia la región amino terminal), mientras que la pepsina las corta antes de la región bisagra (hacia la región carboxilo terminal). Los Fab y F(ab')_{2} son fragmentos que conservan su capacidad para unir específicamente al antígeno que dio origen a los mismos. El
F(ab')_{2} precipitará todavía los antígenos, mientras que la fracción de anticuerpo Fc actúa normalmente como una señal marcadora para macrófagos y en la activación de los linfocitos para el reconocimiento y la fagocitosis del complejo antígeno-anticuerpo.

El fragmento Fc comprende los determinantes antigénicos del anticuerpo de manera que, cuando se administran a un paciente, los anticuerpos enteros generados en un animal de otra especie, el paciente genera una respuesta inmunológica contra estos determinantes antígenos. Esto da origen a una variedad de respuestas secundarias adversas que pueden incluir incluso un choque anafiláctico. Estos problemas se reducen significativamente cuando los anticuerpos están digeridos con papaína o pepsina, y solamente se administran los fragmentos de Fab o F(ab')_{2} purificados resultantes. Esto es debido al hecho de que estos fragmentos carecen de determinantes antigénicos lo cual haría que el organismo de los pacientes los reconociera como extraños.

El empleo de fragmentos de Fab ó F(ab')_{2} tiene otras ventajas con respecto al volumen de distribución. El volumen de distribución es el volumen del cuerpo en el cual se disuelve un determinado fármaco. Este volumen se puede referir solamente a la sangre circulante, como es el caso de la IgG, ó puede incluir una gran parte del agua corporal, como es el caso de los fragmentos. Debido al hecho de que los Fab y F(ab')_{2} tienen un mayor volumen corporal, pueden neutralizar las toxinas alojadas en varios tejidos, y de esta forma no están restringidas a viajar a través de la sangre. Son también capaces de atravesar la barrera sangre/cerebro en ambas direcciones y pueden emplearse por lo tanto para neutralizar o eliminar las neurotoxinas.

El empleo de los F(ab')_{2} tiene una particular ventaja sobre los Fa, y es que son retenidos mucho más tiempo en el paciente. Esto es debido al hecho de que los fragmentos F(ab')_{2} tienen un peso molecular doble del peso molecular de los Fabs, conservan su capacidad para precipitar el antígeno en condiciones fisiológicas, y mantienen un tamaño que les permite acceder a un volumen de distribución que es suficiente para la finalidad del tratamiento.

Un camino por el cual puede prepararse una composición farmacéutica de anticuerpos F(ab')_{2}, es mediante la inmunización de grupos de animales separadamente con el veneno de serpientes, escorpiones, arañas u otras criaturas venenosas y el subsiguiente sangrado de los animales para obtener los anticuerpos producidos en respuesta a la inmunización. El plasma de la sangre de diferentes animales inmunizados contra el mismo veneno polivalente, se mezcla entre sí, y los fragmentos del anticuerpo F(ab')_{2} se recogen después de una digestión con pepsina y la precipitación con sulfato de amonio. El F(ab')_{2} purificado obtenido para cada uno de los venenos de los diferentes géneros, se mezcla en proporciones iguales antes de ser formulado, dosificado y/o liofilizado en frascos.

Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} específicos para una citosina particular pueden también ser producidos por híperinmunización con una citosina específica como se ha descrito más arriba, seguido por la precipitación con pepsina y sulfato amónico, pero sin mezclar el fragmento de anticuerpo anti-citocina F(ab')_{2} purificado con fragmentos que son específicos para otras citocinas. Por ejemplo, el F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha, puede producirse mediante la inmunización de un animal con TNF-\alpha, y seguidamente el método descrito más arriba. El F(ab')_{2} purificado específico para una citosina puede también ser formulado como dosificado y/o liofilizado en frascos para el almacenamiento.

Un "humano en necesidad de dicho tratamiento" puede incluir una persona que ha entrado en contacto con, o bien ha sido inyectado con, una toxina como por ejemplo el veneno de una criatura venenosa. Un humano en necesidad de tratamiento puede también incluir una persona que sufre de enfermedades inflamatorias inducidas por otras citocinas como por ejemplo la psoriasis vulgaris o la artritis reumatoide. Un "humano en necesidad de dicho tratamiento" puede también incluir una persona que ha recibido un injerto o un trasplante de un órgano, el cual puede experimentar una reacción inmunológica inducida por una citocina como por ejemplo el rechazo agudo de un trasplante.

La presente invención se refiere a las reacciones asociadas con otros tratamientos anti-veneno, posiblemente relacionados con la presencia de una actividad anticomplemento (es decir anticuerpos completos) o a la falta de pureza.

Los fragmentos de anticuerpos están de preferencia libres de albúmina y de anticuerpos completos, así como también están substancialmente libres de pirógenos, y pueden ser administrados con una cantidad efectiva de un soporte oftalmológicamente aceptable.

Los fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2} anti-citocinas, pueden ser administrados en diferentes vehículos de suministro, los cuales pueden incluir, pero sin limitarse a: líquidos fluidos, ungüentos, emolientes, cremas, lociones, geles, toallitas, soluciones, sprays, polvos, parches transdérmicos, bioadhesivos, apósitos y pastas.

Otra versión comprende un medicamento para la administración tópica de un vehículo líquido dermatológicamente aceptable, el cual comprende 0,1%-50% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión de un medicamento para administración tópica de un vehículo líquido dermatológicamente aceptable el cual comprende un 8%-35% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión comprende un medicamento para administración tópica de un vehículo líquido dermatológicamente aceptable, el cual comprende un 10%-25% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. En una versión preferida, el medicamento comprende la aplicación tópica de un vehículo líquido dermatológicamente aceptable el cual comprende un 15%-20% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha.

Otra versión comprende un medicamento para la administración tópica de un vehículo gel dermatológicamente aceptable el cual comprende un 0,1%-50% en peso de fragmentos de anti-cuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión comprende un medicamento para administración tópica de un vehículo gel dermatólogicamente aceptable el cual comprende un 8%-35% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión comprende un medicamento para administración tópica de un vehículo gel dermatológicamente aceptable el cual comprende un 10%-25% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. En una versión preferida, el medicamento comprende la aplicación tópica de un vehículo gel dermatológicamente aceptable el cual comprende un 15%-20% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha.

Otra versión comprende un medicamento para la administración tópica de un vehículo semisólido dermatólogicamente aceptable el cual comprende un 0,1%-50% en peso de fragmentos del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión comprende un medicamento para administración tópica de un vehículo semisólido dermatólogicamente aceptable el cual comprende un 8%-35% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. Otra versión comprende un medicamento para la administración tópica de un vehículo semisólido dermatólogicamente aceptable el cual comprende un 10%-25% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha. En una versión preferida, el medicamento comprende la aplicación tópica de un vehículo semisólido dermatólogicamente aceptable el cual comprende un 15%-20% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha.

En una versión, el medicamento se aplica dentro de las 24 horas de un transplante o injerto. En otra versión, el medicamento se aplica dentro de las 12 horas después de un transplante o injerto. En otra versión el medicamento se aplica dentro de las 2 horas después de un transplante o injerto. En una versión preferida el medicamento se aplica dentro de los 30 minutos después de un transplante o injerto.

Ya es bien conocido por las personas corrientemente expertas en la técnica, que la liberación del fármaco a partir de su vehículo es una función de la concentración, solubilidad en el vehículo y lugar del receptor. La absorción percutánea del fármaco puede también ser potenciada mediante el empleo de técnicas oclusivas o mediante el empleo de potenciadores de la penetración.

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Ejemplos

Con el fin de ilustrar mejor el empleo de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos específicos para ayudar al lector en los varios aspectos de la práctica de la presente invención. Dado que estos ejemplos específicos son meramente ilustrativos, nada de las siguientes descripciones debe ser entendido como limitante de la invención en cualquier caso. Todos los porcentajes de los componentes que comprenden la invención se refieren en la presente a su peso en cada composición como un todo, a no ser que se especifique otra cosa.

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Ejemplo 1

Base farmacéutica tópica con fragmentos F(ab')_{2}. La composición administrada en este ejemplo tiene la forma de una crema tópica. La composición comprende: (a) aproximadamente del 1% al 40% en peso de urea; (b) aproximadamente del 0,01% a aproximadamente el 1% en peso de un astringente como por ejemplo el acetato de calcio, el sulfato de amonio o una mezcla de los mismos; (c) aproximadamente del 0,01% a aproximadamente el 1% en peso de un agente anestésico y excipientes dermatológicamente aceptables; y (d) del 0,1% al 50% en peso de fragmentos de anticuerpo anti-IFN-\gamma-anti-citocina F(ab')_{2}.

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Ejemplo 2

Administración con penetración potenciada e irritación reducida. El sistema potenciador de penetración de la composición aplicada en el método de este ejemplo potencia efectivamente el suministro transdérmico de los fragmentos F(ab')_{2} anti-citocina, a la vez que se reduce la irritación de la piel. La composición comprende: (a) fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-citocina (agente activo) con 0,1-50 por ciento en peso de la composición total; (b) un sistema potenciador de la penetración que consiste esencialmente en (i) una membrana fluidizante que comprende ácido oleico; (ii) un alcohol de 1 a 4 átomos de carbono; e (iii) un glicol con un pH entre 4 y 8. La composición administrada en el método del presente ejemplo puede también prepararse con un agente gelante para aumentar la viscosidad.

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Ejemplo 3

El método del presente ejemplo permite la eficiente y continua liberación de los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-citocina sobre la superficie de la piel y potencia la penetración al interior de la epidermis y los tejidos subyacentes dérmicos y subcutáneos. La composición comprende: (a) aproximadamente el 1% de laureth-4 (u otro agente reductor de la tensión superficial); (b) aproximadamente el 2% de propilenglicol (o alternativamente un agente hidratante de la piel); (c) aproximadamente el 0,5% de dimetilsorbide (o alternativamente un agente copulante hidrofílico-lipofílico; (d) del 0,1% al 50% de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-citocina; y (e) un diluyente farmacéuticamente aceptable que comprende una mezcla de agua y etanol.

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Ejemplo 4

Prevención del rechazo de un trasplante de un tejido. Este ejemplo describe un método de prevención del rechazo de un tejido trasplantado causado por las citocinas proinflamatorias que están implicadas en la respuesta alo-inmunológica. El TNF-\alpha es una de dichas citocinas. Así por lo tanto, una composición como se ha descrito en el ejemplo 1, 2, ó 3, que comprende alrededor del 40% en peso de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha, se aplica tópicamente al receptor de un injerto, 3 veces al día durante 8 semanas empezando 24 horas después del transplante. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha, se absorben en el tejido alrededor del injerto así como el propio tejido del injerto para neutralizar las citocinas tales como el TNF-\alpha, y promueven la curación con un rechazo pequeño o sin ningún rechazo del injerto.

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Ejemplo 5

Prevención del rechazo del trasplante de córnea. Este ejemplo describe un método para la prevención del rechazo de un tejido trasplantado, específicamente del tejido de la córnea, causado por citocinas proinflamatorias que están implicadas en la respuesta aloinmunológica. La composición como se describe en los ejemplos 1, 2 ó 3, comprende, 20-30 mg/ml de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha,, fragmentos de anticuerpo en una suspensión oftálmica, y se aplica directamente al ojo. Dentro de las 24 horas de la cirugía de transplante de córnea, se aplica la primera dosis de la composición. Con un vehículo de solución salina tamponado, el cual puede incluir también agentes antimicrobianos y estabilizantes, el primer paso es de empujar suavemente el párpado inferior hacia abajo y dejar caer unas gotas de la composición en el párpado inferior. El párpado inferior se suelta y el parpadeo debe evitarse durante por lo menos 30 segundos. Este proceso se repite cada 2 a 3 horas durante hasta ocho semanas para prevenir el rechazo del injerto de córnea.

Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} pueden suministrarse a través de una suspensión oftálmica o un ungüento. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha, se ponen en suspensión en condiciones estériles y se aplican dentro de las primeras 24 horas de la cirugía del transplante de la córnea. Esta suspensión se almacena típicamente en un tubo plegable que puede emplearse para administrar el ungüento directamente en el ojo. Con el fin de aplicar el ungüento, empujar suavemente el párpado inferior hacia abajo. A la vez que se mira hacia arriba (si es posible), estrujar el tubo para sacar una pequeña cantidad de ungüento (aproximadamente 1/2 pulgadas a 1/4 pulgadas) dentro del párpado inferior. Cerrar el ojo y mover suavemente el globo ocular en todas direcciones manteniendo el ojo cerrado. Puede aparecer temporalmente una visión borrosa. El párpado cerrado puede frotarse muy suavemente con un dedo para distribuir el fármaco a través del fornix. Este proceso puede repetirse cada 10 a 12 horas durante hasta 8 semanas para prevenir el rechazo del injerto de córnea. La administración del ungüento oftálmico debe limitarse a una instilación en el momento de acostarse cuando los ungüentos interfieren con la visión.

Claims (6)

1. Empleo de un fragmento de un anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha neutralizante, para la preparación de un medicamento para administración tópica para el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-\alpha, la cual se debe al rechazo de un trasplante córneo, en donde dicho medicamento está preparado para la directa aplicación sobre el ojo.

2. El empleo de la reivindicación 1, en donde dicho fragmento de anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha está libre de albúmina, de anticuerpos completos, y/o pirógenos.

3. El empleo de la reivindicación 1, en donde el medicamento comprende un soporte oftalmológicamente aceptable.

4. Fragmento del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha neutralizante, para emplear en el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-\alpha, la cual es debida al rechazo de un transplante de córnea, en donde el fragmento del anticuerpo está comprendido en un medicamento de administración tópica, y en donde el medicamento está preparado para la directa aplicación sobre el ojo.

5. Fragmento del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha neutralizante, de la reivindicación 4, para emplear en el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-\alpha, la cual es debida al rechazo de un transplante de córnea, en donde dicho fragmento del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha está libre de albúmina, anticuerpos completos y/o pirógenos.

6. Fragmento del anticuerpo F(ab')_{2} anti-TNF-\alpha neutralizante, de la reivindicación 4, para emplear en el tratamiento de una reacción inmunológica inducida por el TNF-\alpha, la cual es debida al rechazo de un transplante de córnea, en donde el medicamento comprende un soporte oftalmológicamente aceptable.