JP2002186490A - ヒト血小板由来増殖因子レセプター - Google Patents

ヒト血小板由来増殖因子レセプター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質の活性を変調させる新規な方法の
提供。 【解決手段】 第一タンパク質にリン酸化領域のペプチ
ド類似体を加え、ここで該類似体は該第一タンパク質が
第二タンパク質に結合することを阻害する、工程を含ん
で成る、該第二タンパク質のリン酸化領域に結合する該
第一タンパク質の生物活性を変調させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は診断および治療薬に関し、より詳細には血小板
由来増殖因子レセプターに基づく組成物に関する。
【０００２】発明の背景 血小板由来増殖因子（PDGF）は、間充織由来の細胞につ
いての主要なマイトジェンである。このタンパク質マイ
トジェンは通常ふたつのポリペプチド鎖ＡおよびＢがジ
スルフィド結合で連結されてなる32kDa のタンパク質ヘ
テロダイマーである。 PDGF ABヘテロダイマーに加え
て、PDGFのふたつのホモダイマー体（AAおよびBBと示さ
れる）が同定された。
【０００３】PDGF−仲介 分裂促進の第一段階は、PDGF
が細胞膜で、そのレセプターに結合することである。こ
の反応は、レセプター チロシンキナーゼの活性化、フ
ォスファチジルイノシトールの代謝回転上昇、ひとつの
群の遺伝子の発現増大、フォスフォリパーゼＡ２の活性
化、細胞の変形、細胞内カルシウム濃度の上昇、細胞内
pHの変化、結合したPDGFの内在化および分解を含む初期
の細胞性応答の多様性の引き金を引く。これらの変化
は、次に標的レセプター含有細胞の増殖速度の上昇へと
続く。
【０００４】ポリペプチドがインビトロで特定細胞タイ
プの成長を刺激する能力は、それがインビボで同じ機能
を果たす証明にはならないが、細胞上の多くの増殖因子
の役割を研究して生物全体における役割が決定される。
インビトロで、血小板由来増殖因子は、繊維芽細胞、平
滑筋細胞およびグリア細胞のような間充識由来の細胞に
ついての血漿中の主要なポリペプチドマイトジェンであ
る。インビボで、PDGFは血液中にて自由に循環しない
が、循環する血小板のα顆粒中に保有されている。血液
凝固および血小板の癒着中に顆粒が放出されると、しば
しば損傷血管の部位で、すなわちPDGFが血管の修復に寄
与する。PDGFは動脈性平滑筋の動脈血管の中間から内膜
への移動を刺激することができ、ここで筋肉細胞は増殖
できる。これが損傷の初期応答になると思われる。
【０００５】PDGFは研究されて、どのように細胞の増殖
が体内で制御されるのかが決定された。増殖因子は傷の
治癒、アテローム硬化症、骨髄増殖性疾患、および細胞
のガン性形質転換（特にc-myc およびc-fos ）に関与し
てきた。これゆえに、PDGFアゴニストは傷の治癒の促進
に有効となるであろう。PDGFアンタゴニストはアテロー
ム硬化症の予防、心臓血管の介入後に生じる血管細狭
化、およびガン性の形質転換の阻止に有効となるであろ
う。
【０００６】PDGFと細胞との相互反応は、部分的にマイ
トジェンについてのレセプターにより仲介される。PDGF
レセプターはそれゆえに増殖因子によるマイトジェン性
の刺激における成分としてたいへん重要である。しかし
PDGFとそのレセプターとの間の、ならびにPDGFレセプタ
ーと細胞性成分との間の直接的な相互反応を特徴づける
ことは不可能であるため、異常または所望でないPDGFの
応答を特徴とする生理状態または疾患を診断または治療
するために必要な薬剤の開発が阻止されてきた。これら
の理由により、PDGFレセプターの構造的ならびに生理的
性質を特徴づける劇的な必要性が存在する。
【０００７】発明の要約 本発明によれば、ヒト血小板由来増殖因子レセプター(h
PDGF-R）ポリペプチドをコードする DNA配列が単離さ
れ、配列決定された。
【０００８】ひとつの態様において、分泌または哺乳類
細胞の膜に結合できるPDGF−レセプタータンパク質をコ
ードする、ひとつまたそれ以上の配列を含む発現構造物
が提供される。膜結合性レセプターは機能的に野生型と
同様または均等であるべきであり、これゆえにレセプタ
ーが欠如している細胞に対するPDGF感受性のマイトジェ
ン応答を付与する。構造物は、とりわけ、大量のPDGF−
レセプターまたは断片を作るために、細胞のPDGF応答を
増大するために、PDGF結合に応答してマイトジェンの信
号を形質導入することに関与するポリペプチドレセプタ
ーの領域を決定するために、レセプターの突然変異類似
体を提供するために、薬剤の生理活性を評価するため
に、そしてレセプター遺伝子の染色体部位に近い配列の
統合性をプロービングするために使用できる。特に、種
々の可溶性レセプターの断片が提供され、その多くが h
PDGF-Rタンパク質が結合した細胞の種々の性質を有す
る。これらの構造物を使用する新規方法も提供される。
【０００９】本発明は、ヒト血小板由来増殖因子レセプ
ター(hPDGF-R）ポリペプチド部分をコードする、少なく
とも約24の一連のヌクレオチドを含む約50Kbp より小さ
い、精製され、単離された組換え核酸を提供する。好ま
しくはそのセグメントは可溶性ポリペプチドである。特
定の態様において、そのセグメントは本質的に、Ｂタイ
プまたはＡタイプ hPDGFレセプター（例えば表２または
表３のポリペプチド配列）の完全長の細胞外領域から成
る。他の態様において核酸はリン酸化部位のセグメント
をコードする。
【００１０】普通、コードされたセグメントは約 300ア
ミノ酸よりも小さい（好ましくはPDGFに結合できるであ
ろう）、リン酸化の基質であることができ、またはPI３
キナーゼに結合できる。他の態様において、コードされ
たセグメントは実質的に完全な細胞内領域を欠いてい
る。本発明はまた記載された核酸で形質転換された細胞
を包含し、その細胞は典型的には哺乳類細胞である。特
別な態様において、細胞はさらに非−真菌種から発生し
たグリコシル化酵素を含有する。
【００１１】発現ベクターも提供され、特定の態様にお
いては、セグメントをコードする核酸ヌクレオチドは、
プロモーターに作動可能なように連結される。提供され
る組み換え核酸はさらに、 hPDGF-Rセグメントに融合さ
れるヘテロロガスなポリペプチドをコードする。
【００１２】本発明のもうひとつの観点として、 hPDGF
-Rアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する化合
物の能力を評価するための方法が提供され、それは対照
の細胞からのPDGF−誘導応答の量を、hPDGF-Rペプチド
断片をコードする核酸で形質転換した細胞中のものと比
較する工程から成る。種々の態様において、PDGF−誘導
応答は細胞中の DNA合成を測定することによって比較さ
れる。細胞をPDGFを持つ細胞と接触させた後。
【００１３】ポリペプチドの態様には、血小板由来増殖
因子（PDGF）結合活性またはチロシンキナーゼ活性を有
する少なくとも約20のアミノ酸の実質的に純粋な hPDGF
-Rポリペプチド断片を含む。典型的にはこのポリペプチ
ド断片は可溶性であろう。
【００１４】他の態様において、タイプ B hPDGF-Rの約
１から始まり約 499で終止するアミノ酸を本質的に含む
hPDGF-R結合活性を有するhPDGF-R断片が提供され、こ
れは例えば表２に表したもの、又はタイプA hPDGF-Rの
約１から始まり約 501で終止するアミノ酸を本質的に含
む、例えば表３に表したものである。本発明は非グリコ
シル化hPDGF-R断片を有する組成物を包含し、好ましく
は断片は実質的に純粋である。他の態様において、 hPD
GF-R断片は、非−真菌および非−ヒトのグリコシル化パ
ターンを表す。特に有用な組成物は、タイプＢ又はタイ
プ A hPDGF-R（例えば表２または表３に表したもの）の
本質的に細胞外領域の hPDGF-Rポリペプチド断片を有す
る。さらなる態様は：（ａ）ヒト血小板由来増殖因子レ
セプター(hPDGF-R）断片をコードする組み換え核酸；お
よび（ｂ）発現時に該断片をグリコシル化することがで
きる非−真菌のグリコシル化酵素、の組み合わせから成
る。
【００１５】本発明は細胞に hPDGF-R活性を導入するた
めの種々の方法を提供し、それは少なくとも約 500ダル
トンの hPDGF-Rタンパク質断片を細胞に導入する工程か
ら成る。試料中のPDGFレセプターについてのリガンドの
存在をアッセイするための方法も提供され、それは： （ａ）試料と hPDGFレセプターリガンド結合部位とを混
合し；そして（ｂ）リガンドと hPDGFレセプターリガン
ドとの間の結合を検出することから成る。
【００１６】PDGFレセプターの細胞内領域に関して、本
発明はレセプターキナーゼ挿入領域を含む約 200アミノ
酸より小さい単離ポリペプチドを提供する。種々の態様
において、ポリペプチドはリン酸化アミノ酸残基（例え
ばホスホチロシン）を有する。通常ポリペプチドは、PD
GFレセプターのキナーゼ挿入セグメントに実質的にホモ
ロガスな配列、例えば表２または表３の配列、を有す
る。本発明はまたポリペプチドと薬学的に受容できるキ
ャリアーを含有する組成物を提供する。
【００１７】本発明により種々の方法が提供され、それ
は第二タンパク質のリン酸化領域に結合する第一タンパ
ク質の生物活性を変調させるための方法を含むが、この
方法は第一タンパク質にリン酸化領域のペプチド類似体
を付加する工程を含み、ここで類似体は第一タンパク質
の第二タンパク質への結合を阻害することができる。標
的リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を
阻害できる分子を選択するための他の方法も提供され
る。この方法は、第二分析中の分子の不存在下でタンパ
ク質を標的リン酸化ポリペプチドに接触させ；そしてこ
れらの分析を比較して、結合に対する分子の効果を決定
する工程を有する。特定の態様において、これらの接触
工程は連続して行われる。
【００１８】提供されるようなPI３キナーゼ活性を変調
さるための他の方法は、リン酸化PDGFレセプターキナー
ゼ挿入領域ポリペプチドをPI３キナーゼに加え、これに
よってポリペプチドとPI３キナーゼとの間の結合を可能
にする工程から成る。
【００１９】本発明は、試料からPDGFレセプターキナー
ゼ挿入セグメントに結合できるタンパク質を精製する方
法を提供し、それは試料をPDGFレセプターキナーゼ挿入
領域ポリペプチドと実質的にホモロガスなリン酸化ポリ
ペプチドの類似体と接触させることによりタンパク質を
特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる工程からな
る。
【００２０】PDGFレセプターに結合できるタンパク質を
コードする核酸を単離する方法も提供され、これは標識
したリン酸化PDGFレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプ
チドと種々のタンパク質を発現している細胞とを混合
し、それによってリン酸化ポリペプチドに結合するタン
パク質を生産するための核酸を発現する細胞を標識し；
そして標識されたこれらの細胞を単離する工程から成
る。この方法は特に、PI３キナーゼまたは c-fmsをコー
ドする核酸を単離するために有効である。
【００２１】ヒト血小板由来増殖因子(hPDGF-R）組成物
が本発明により提供される。これらの組成物は完全長の
天然形態、天然形態の断片、これらの断片の融合タンパ
ク質、それらを含む各々の修飾形態、ならびに多−タン
パク質複合体であろう。特に、 hPDGF-R機能を表す可溶
性ポリペプチドが、細胞外および細胞内領域の両方で入
手できるように作られる。
【００２２】hPDGFレセプターに基づくタンパク質組成
物の生産法が提供される。種々の hPDGF-Rタンパク質組
成物をコードする核酸構造物も開示される。この核酸構
造物は細胞を形質転換させるのに有用となり、商業的に
有用な量のタンパク質組成物を生産するための有効な経
済的手段を提供するであろう。これらの細胞、およびhP
DGFレセプターを含有する他の物は、診断およびPDGFの
マイトジェン作用の機構を研究するためにも有効となる
であろう。それらは、PDGFリガンド結合のシグナル伝達
に影響する新しい薬剤の評価のために、ならびに hPDGF
レセプターが関与する疾患の治療のために使用されるで
あろう。構造物は、細胞をトランスフェクトするために
使用でき、機能的に野生型レセプターと均等な膜−結合
レセプターを提供し、レセプターを欠く細胞に対しては
PDGF−感受性マイトジェン応答を付与する。トランスフ
ェクションした細胞を、細胞のPDGF−誘導応答を研究す
るためのモデルとして使用することができ、PDGFリガン
ド結合に応答してシグナルを伝達することに関与する領
域が決定され、それらの生理活性についての薬剤を評価
する。コードされたレセプターまたはそれらの結合領域
は、PDGF類似体を評価するために使用できる。
【００２３】レセプター断片およびその類似体は、PDGF
リガンド結合に応答してシグナルを伝達することに関与
するレセプターポリペプチドの領域を決定するために使
用されるであろう。特に、構造的な特徴物（例えば、リ
ガンド結合決定基）の種々の組み合わせを試験する能力
は、リガンド結合親和性に対する重要度、リガンド特異
性および生理応答を決定するためにレセプターの特徴を
精密に吟味することを可能にする。
【００２４】hPDGF-Rタンパク質は抗体試薬を製造する
ためにも使用されることが見いだされるであろう。これ
らの試薬はレセプターポリペプチドと相互作用、刺激、
特に分子的相互作用ができるべきである。PDGF結合能を
有する可溶性タンパク質は、診断試料中のPDGF定量のた
めの、リガンド結合のために修飾された決定基と天然、
修飾または誘導されたリガンドとの間の結合相互作用の
可溶性試験のための、そして hPDGF-Rポリペプチドに対
するモノクローナル抗体のスクリーニングのための試薬
として、PDGF作用のブロッキングにも有効となるであろ
う。
【００２５】DNA配列は遺伝的異常（例えば、多くの成
長−制御遺伝子が集まる染色体５の領域、 c-kit腫瘍形
成遺伝子付近の染色体４の領域における欠損、または再
配列）を検出するプローブとして、またはチロシンキナ
ーゼまたはホモロガスな遺伝子をコードする他の遺伝子
を検出するためにも使用されるであろう。
【００２６】PDGFレセプターの細胞質性領域の特定領
域、その中のキナーゼ挿入（KI）領域は、PDGFレセプタ
ーを、他の細胞性タンパク質と相互反応（例えば結合な
ど）させることができる。これらの領域に実質的にホモ
ロガスなペプチドは有機類似体分子と同様に、PDGFレセ
プターと他のタンパク質との間の相互反応を阻害するた
めに、PDGFレセプターが相互反応するタンパク質を同
定、スクリーニングそして精製するために、ならびにこ
れらのタンパク質をコードする遺伝子をクローニングす
るために使用できる。これらのホモロガスなペプチド
は、医薬的な診断薬および治療用薬剤（例えば、PDGFレ
セプター活性および他のタンパク質とのレセプター相互
反応に影響する）としても使用されるであろう。
【００２７】さらには、リン酸化残基のタンパク質−タ
ンパク質相互反応に対する役割を理解することにより、
それは他のレセプターとリン酸化タンパク質に応用され
る。特定のポリペプチドセグメントまたは実質的ホモロ
ガスなセグメント（例えば、リン酸化部位）の特異的ア
ミノ酸のリン酸化は特に生物学的に重要である。タンパ
ク質相互反応のリン酸化部位および領域の同定は、その
ような相互反応を阻害するために有効な試薬を調製する
ために重要であり、そのようなタンパク質の機能を変調
させることを導く。ペプチド類似体もまた、リン酸化残
基と相互反応するタンパク質を同定および精製するため
に、ならびにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を
単離およびクローニングするために有用であろう。
【００２８】概 要 Ｉ．一般的説明 Ａ．PDGF-R １．構造的特徴 ａ．細胞外領域 ｉ．シグナル配列 ii．Igドメイン ｂ．トランスメンブラン セグメント ｃ．細胞内領域 ｉ．チロシン キナーゼ ii．挿入体 ２．機 能 ａ．PDGFを結合 ｂ．PDGF-Rペプチドを結合 ｃ．チロシンキナーゼ活性 Ｂ．生理学的機能 １．細胞性 ２．組織分化 ３．生体性
【００２９】 II．ポリペプチド Ａ．可溶性形態 Ｂ．末端短縮形態 Ｃ．融合タンパク質 Ｄ．遺伝的多様性（部位特異的突然変異） Ｅ．タンパク質を含む組成物
【００３０】III．核 酸 Ａ．単離核酸 Ｂ．組換え核酸 Ｃ．核酸を含む組成物
【００３１】IV．PDGF-Rの作成法 Ａ．タンパク質精製 １．誘導PDGFとの親和性 ２．種々のリガンド、同一レセプター Ｂ．核酸の発現 Ｖ．抗 体 VI．使用法 Ａ．診 断 Ｂ．治 療
【００３２】Ｉ．一般的説明 単離された完全長のヒト血小板由来増殖因子(hPDGF）レ
セプターmRNAは、膜−全長セグメント（トランスメンブ
ランセグメントと呼ばれる）と同様な単一の疎水性ポリ
ペプチドセグメントをコードする。トランスメンブラン
セグメントに隣接するPDGF-Rアミノのこのセグメントは
細胞外領域を形成し、一方トランスメンブランに隣接す
るカルボキシセグメントは細胞内領域と呼ばれる。アミ
ノ末端から、細胞外領域は NH2−末端疎水性の推定シグ
ナル配列、ならびに第二、第三、第四および第五免疫グ
ロブリン−様ドメイン（それぞれIgII, IgIII, IgIVお
よびIgＶと呼ばれる）を有する。 hPDGF-Rの外部領域中
の様々な構造的特徴が同定されているが、この領域が定
める最も重要な機能的性質は、レセプターリガンド（た
とえば、PDGFファミリーの員およびその類似体）への結
合である。
【００３３】部分的に細胞内領域が、分割されたチロシ
ンキナーゼ構造ドメインの存在により特徴づけられる。
ヒトタイプＢレセプターポリペプチドにおいて、この領
域は約 244残基長であり、約 104アミノ酸の挿入物を有
する。表２参照。ヒトタイプＡレセプターポリペプチド
においても、このチロシンキナーゼドメインは約 244残
基長であり、約 103アミノ酸の挿入物を有する。表３参
照。部分的に機能的にこのドメインはチロシンキナーゼ
活性により定義されており、典型的にはリガンドの細胞
外領域への結合により変調され、二量体状態で機能する
ように思われる。リン酸化のための基質は、レセプター
ポリペプチド鎖に付随する様々なチロシン残基、および
レセプターに結合した他のタンパク質を含む。部分的に
チロシンキナーゼドメインも他のチロシンキナーゼ活性
含有タンパク質中の同様なドメインに対するそのホモロ
ジーにより定義されている。Yardenら（1986）Nature 3
23：226-232 を参照。実際の境界自体は、同様なドメイ
ンにより定義され、２−３のアミノ酸残基（多分、多く
ても約７残基）により変化してよいが、しかしおそらく
約４残基内、もっとも確実には約１から２残基であろ
う。タンパク質はそれが原型的に細胞内領域を欠いてい
る場合、実質的に完全な細胞内領域を欠き、特にチロシ
ンキナーゼドメインを欠いており；同様な概念が完全な
トランスメンブラン領域の欠損に関しても与えられる。
【００３４】典型的なPDGF-R核酸配列は、一過性の NH2
−末端疎水性配列をコードし、これは通常、膜転移過程
中に切断される。シグナル配列の古典的な機能は、発生
期のポリペプチド鎖を膜結合リボゾームに向かわせ、こ
れによって膜転移を導き、引き続きプロセッシングおよ
びターゲッティング工程が起こる。シグナル配列は典型
的には転移過程で除去されるので、成熟ポリペプチド中
にはシグナル配列は無い。しかし、成熟タンパク質の他
のアミノ隣接配列の特徴は、レセプター断片の発現、ま
たは正しい配置、または標的にも重要であるかもしれな
い。
【００３５】レセプターの種々の領域についての推定境
界を表１に示し、これは一部マウスPDGFとホモロガスで
あるものから誘導された。特に、疎水性セグメントが同
定されて、そしてその構造的ホモロジーと膜全長セグメ
ントの物理的性質の特徴からトランスメンブランセグメ
ントと命名された。このセグメントは、タンパク質を細
胞外領域と細胞内領域とに分割する。細胞内領域は、チ
ロシンキナーゼ活性を表すと思われる種々の他のレセプ
ターに対するホモロジーを有し、このレセプターは示す
ように挿入領域を持たないが、他のチロシンキナーゼセ
グメントに対して高いホモロジーの領域内にはめ込まれ
ている。
【００３６】 表 １ およそのセグメント境界 タイプＢ タイプＡ XR leu (1) −lys(499) gln (1) −glu(501) TM val(500)−trp(524) leu(502)−trp(526) TK１ arg(572)−his(662) leu(572)−his(664) KI arg(663)−leu(766) lys(665)−leu(767) TK２ ser(767)−phe(919) thr(768)−phe(920)
【００３７】レセプターの細胞内領域はチロシンキナー
ゼ活性を含む。PDGFレセプターは分割された、約 103ま
たは 104アミノ酸の挿入セグメントを持つチロシンキナ
ーゼドメインが特徴である。この挿入セグメントは調節
的な、ならびに以下に詳細に記載する他の性質を有す
る。本発明はPDGFレセプターに関連した単離した核酸お
よびポリペプチドを提供する。単離した分子は実質的に
天然の形態に見いだされる天然に存在する分子の物質か
ら分離されたもののひとつである。
【００３８】例えば、単離されたポリペプチドは天然に
存在するヒト細胞成分（例えば、ヒト核酸、脂質、およ
び他のタンパク質）から実質的に精製されたもののひと
つである。特に目的とするものは遺伝子組換えまたは削
除技術によって分離されるであろうポリペプチドの同一
領域内のセグメントである。すなわち、本明細書におい
て使用されるように、たとえそれがホモロガスな細胞タ
イプ中で発現されようとも単離および操作された遺伝子
配列の発現生成物は単離ポリペプチドである。ホモロガ
スな細胞により発現され、合成的に作成された形態また
は分子は固有の単離分子である。
【００３９】生理学的に、このレセプターは多くの代謝
変化（例えばフォスファチジルイノシトールレベル、p
H、カルシウムイオンレベル、細胞骨格構造、遺伝子発
現、cAMPレベル、およびリガンドレセプターレベル）の
開始の要因である。
【００４０】タイプＡおよびタイプB PDGFレセプター
は、種々の二量体の組み合わせと混合された時、機能的
レセプター複合体を作り、また種々のPDGF形態（例えば
AA, ABおよびBB形）に対して特徴的な結合親和性も有す
る。例えば、ａタイプＢアイソフォームレセプターはBB
アイソフォームPDGFに高い親和性で結合し、ABアイソフ
ォームPDGFにはより低い親和性で結合し、そしてAAアイ
ソフォームPDGFには低い親和性かまた親和性を持たな
い。タイプＡアイソフォームレセプターは、AAアイソフ
ォームPDGFに高い親和性で結合し、ABヘテロダイマーお
よびBBアイソフォームPDGFには低い親和性を持つ。
【００４１】“リガンド”という用語は、通常血小板由
来増殖因子ファミリーの分子を言い、これは増殖因子結
合に関与するセグメントに結合する。また、リガンドは
レセプターに対する天然のリガンド、またはレセプター
の類似体のいずれかを補助する分子であり、結合する
か、天然リガンドの機能的類似体である。機能的類似体
は構造的変更を有するリガンドであってよく、または適
当なリガンド結合決定基と相互反応する分子形を有する
全く無関係な分子であってもよい。リガンドはアゴニス
トまたはアンタゴニストとして役立ち、これについては
Goodmanら（編集)(1990) 、グッドマンとギルマン：治
療のための薬学的基礎（第８版）、パーガモン出版(Goo
dman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Ther
apeutics (8th ed) Pergamon Press) を参照のこと。
【００４２】II．ポリペプチド PDGFレセプターは同様なポリペプチドの二量体で、構成
ポリペプチドが二量体化したレセプターのリガンドに対
する親和性を決定すると思われる。AAホモ二量体PDGFリ
ガンドは好ましくは高い親和性で hPDGFレセプターのひ
とつの形態により結合し、そしてこの形態はＡレセプタ
ー、αレセプターおよび本明細書中で使用されるよう
に、タイプＡレセプターポリペプチド(A-hPDGF-R）とし
て呼ばれるポリペプチド鎖と関連している。レセプター
ダイマーは明らかにタイプＡレセプターポリペプチドの
ホモダイマーである。
【００４３】BBホモ二量体PDGFリガンドは好ましくは、
高い親和性で hPDGF−レセプターの二つと結合する。こ
れらの形態は、Ｂレセプター、βレセプターおよび本明
細書中で使用されるように、タイプＢレセプターポリペ
プチド(B-hPDGF-R）として呼ばれる第二ポリペプチド鎖
と関連する。これらのふたつのレセプター二量体形態
は、明らかにＢレセプターポリペプチドのホモ二量体お
よびタイプＢ／タイプＡ形態のヘテロ二量体である。
【００４４】タイプＡおよびタイプＢポリペプチドの命
名は、各アイソフォームすべての対立遺伝子を網羅する
ことを意図している。すなわち、天然に存在するそれぞ
れの変異体は本発明に包含され、それらは他の変異体、
類似体、および改良された配列である。ひとつのタイプ
B-hPDGF-R対立遺伝子をコードするcDNA配列のヌクレオ
チド配列が、推定されるレセプター前駆体のアミノ酸配
列と共に表２に説明されている（配列番号第：１を見
よ）。以下の記載は、マウスおよび他の増殖因子レセプ
ターおよびタンパク質との相似に基づくおおまかな構造
的、ならびに機能的特徴を示すものである。
【００４５】アミノ酸番号１から始まる配列はヒトPDGF
-Rの成熟形態の推定のアミノ末端に対応する。初めの32
アミノ酸（−32から−１と呼ばれる）は、推定されるシ
グナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメン
ブラン配列はアミノ酸残基val(500)からtrp(524)に対応
する。Ｎ−グリコシル化の可能性部位は対応するアミノ
酸配列がasn(13)-ser(15)；asn(57)-thr(50)；asn(71)-
ser(73)；asn(183)- ser(185)；asn(198)-thr(200) ；a
sn(260)-thr(262) ；asn(275)- thr(277)；asn(322)-th
r(324) ；asn(339)-ser(341) ；asn(436)- ser(438)；a
nd asn(447)-thr(449).の部位である。推定のチロシン
キナーゼドメインは、約arg(663)とleu(766)との間のア
ミノ酸挿入により中断されている、表１参照。推定のポ
リアデニレーション部位は与えられたcDNA配列の３′末
端である。
【００４６】表２．パネルＡ--？ 12418-14ディスクからのタイプ B hPDGF-Rの配列、核酸
及びポリペプチド配列の両方の01表をファイル；ひとつ
のタイプ A hPDGF-R対立遺伝子をコードするcDNA配列の
ヌクレオチド配列が、推定されるレセプター前駆体のア
ミノ酸配列と共に表３に説明されている（配列番号第：
３を見よ）。記載された構造的特徴は、ここでもマウス
および他の増殖因子レセプターおよびタンパク質との相
似に基づく。
【００４７】アミノ酸番号１から始まる配列はヒトPDGF
-Rの成熟形態の推定のアミノ末端に対応する。初めの23
アミノ酸（−23から−１と呼ばれる）は、推定されるシ
グナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメン
ブラン配列はアミノ酸残基leu(502)からtrp(526)に対応
する。Ｎ−グリコシル化の可能性部位は対応するアミノ
酸配列がasn(19)-ser(21)；asn(53)-ser(55)；asn(80)-
thr(82)；asn(156)- thr(158)；asn(330)-thr(332) ；a
sn(336)-thr(338) ；asn(435)- thr(437)；andasn(445)
-ser(447).の部位である。推定のチロシンキナーゼドメ
インは、約lys(665)とleu(767)との間のアミノ酸挿入に
より中断されている、表１参照。
【００４８】表３．パネルＡ 12418-14ディスクからのタイプ A hPDGFの配列；02表を
ファイル；表２および３に見られるように、推定される
タイプＡおよびタイプＢレセプターの細胞内チロシンキ
ナーゼドメインは、80％同一残基を有する。推定される
タイプＡおよびタイプＢレセプターの細胞外領域は約34
−35％の同一残基を有し、さらに14％の残りの残基が保
存的に置換されている、すなわち同様な化学的性質を有
するアミノ酸での置換である。明示された hPDGFレセプ
ターのトランスメンブラン領域は、約48％の同一残基を
有する。その52％残基は異なるが、70％は保存的置換で
ある。表に見られるように、両方のレセプター配列は約
103または 104アミノ酸により推定のチロシンキナーゼ
領域を中断されるアミノ酸の挿入を有する。ふたつのポ
リペプチド全体のホモロジーは約44％である。
【００４９】血小板由来増殖因子レセプター（PDGF-R）
という用語は、PDGF-Rの特徴的性質を有する組成物を言
う。天然のヒトPDGFレセプターは PDGF-Rs種の例であ
り、その配列は表２および３に開示され、ならびに対立
遺伝子変異体である。天然のレセプターは典型的には18
0kdの分子量を有する膜糖タンパク質である。レセプタ
ーは通常は動脈平滑筋細胞、繊維芽細胞、グリア細胞に
見いだされるが、通常は内皮細胞または血液細胞中には
観察されない。
【００５０】上記のように、PDGFレセプターは３つのお
もな同定領域を有する。第一はPDGFに対するリガンド結
合決定基を含む細胞外領域であり、すなわちリガンド結
合セグメントである。細胞外領域はまた、上記のような
特徴を有するIg−様ドメインに分割される。第二の主要
同定領域はトランスメンブラン領域であり、そして第三
は細胞内領域である。細胞内領域はチロシンキナーゼド
メインの特徴的タイプを含有し、キナーゼ挿入（KI）セ
グメントにより干渉されている。
【００５１】“ヒト”なる記載は、組成物の起源につい
て言う。ひとつの使用において、ひとつの点で、組成物
中に、ヒトまたはヒト−由来細胞または天然に存在する
ヒト細胞からのマイナーな変異体が見い出されることを
意味する。タンパク質または核酸または配列に関して
は、天然のヒト遺伝子または遺伝子に密接に関連した遺
伝子によってコードされる組成物を言う。すなわち、本
発明はタンパク質およびそのようなタンパク質をコード
する核酸を含む。核酸は RNA, cDNA、ゲノム DNA、合成
形態、および混合ポリマー、センスおよびアンチセンス
鎖の両方を含む。すなわち開示された情報からのタンパ
ク質は、たとえ合成的に作成されても、ヒトの配列であ
ると考えられる。さらに、各アイソフォームの種々の対
立遺伝子もそれぞれヒトPDGF-Rであると考えられる。
【００５２】したがって本明細書において使用される目
的において、用語ヒトPDGF-Rは、ポリペプチドに適用さ
れた時、タンパク質またはポリペプチドを意味し、これ
は表２または３に表されたアミノ酸配列およびそれらの
任意の対立遺伝子またはそれらの断片に実質的にホモロ
ガスである。たいていは hPDGF-Rは記載されたPDGF-R配
列に少なくとも約80％ホモロガスであり、より好ましく
は約90％以上、最も好ましくは95％のホモロジーを持つ
であろう。レセプターは普通、関連配列により提供され
る hPDGF-Rに共通の幾つかの生物的活性を表すであろ
う、それは例えばPDGF結合、チロシンキナーゼ結合活
性、フォスファチジルイノシトール３′キナーゼ（PI３
キナーゼ）結合、または免疫的性質である。 hPDGFレセ
プターは一次構造が共通な分子形態を包含し、化学的な
らびに生物的変更をも包含し、それは例えばグリコシル
化、リン酸化、ユビキニゼーション(ubiquinization)、
ジスルフィド結合、および基本的な一次構造およびその
他の小さな変更である。
【００５３】特に、グリコシル化の変更が含まれ、これ
は合成及びプロセッシング、またはさらなるプロセッシ
ング過程の間になされるポリペプチドのグリコシル化パ
ターンの変更により作られる。特にこれに付随する好ま
しい手段は、通常そのようなプロセッシングに与えられ
る酵素を提供する細胞由来の酵素（例えば哺乳類グリコ
シル化酵素）にポリペプチドを暴露する。また、リン酸
化されたアミノ酸残基である同一一次アミノ酸配列の変
異体も包含し、これは例えばリン酸化アミノ酸残基、リ
ン酸化セリンまたはリン酸化スレオニンなどである。
【００５４】タイプ B hPDGF-Rは、上述した性質の hPD
GF-Rポリペプチドのアイソフォームであり、その配列の
すべての対立遺伝子およびそれに由来するわずかに変更
した配列を含む。一般的にこの用語はタンパク質、特に
ヒトタイプＢアイソフォームの特徴である物の断片を含
む。対応する意味がタイプ A hPDGF-Rに関しても意図さ
れる。特定の使用において、この用語は機能的レセプタ
ーにも適用される。説明したように、機能的形態はタイ
プＡレセプターポリペプチド、またはタイプＢレセプタ
ーポリペプチドの二量体複合体、またはヘテロ二量体形
態であると考えられている。
【００５５】ヘテロロガスな融合タンパク質は、同様な
様式で天然に、または非天然に融合したタンパク質また
はセグメントの融合である。すなわち、免疫グロブリン
と hPDGF-Rポリペプチドとの融合生成物は、典型的なペ
プチド結合で融合された配列を有する連続的なタンパク
質分子であり、典型的には単一の翻訳生成物として作ら
れているが、免疫グロブリンと hPDGF-Rポリペプチドの
両方に依存した性質を表す。同様な概念がヘテロロガス
な核酸配列にも適用される。
【００５６】ポリペプチド断片またはセグメントは、少
なくとも約５アミノ酸のアミノ酸残基に伸長しており、
しばしばそれは少なくとも約７アミノ酸、通常は少なく
とも約９アミノ酸、より普通には少なくとも約11アミノ
酸、典型的には少なくとも約13アミノ酸、より典型的に
は少なくとも約15アミノ酸であり、種々の態様において
少なくとも約17アミノ酸である。核酸においては、断片
またはセグメントは少なくとも約６ヌクレオチドのヌク
レオチド残基に伸長しており、しばしばそれは少なくと
も約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約12ヌクレオチ
ド、より普通には少なくとも約15ヌクレオチド、典型的
には少なくとも約18ヌクレオチド、より典型的には少な
くとも約21ヌクレオチドであり、種々の態様において少
なくとも約24またはそれより多いヌクレオチドである。
【００５７】ポリペプチド断片は、天然のポリペプチド
または断片（例えばPDGF-Rポリペプチド）の活性の特徴
に実質的に寄与する時、“生理学的に活性”である。典
型的には、 hPDGF-Rポリペプチドは機能的レセプターと
結合した時、生物的状況（例えば生物体内、またはイン
ビトロの生物的状況）においてレセプターにより達成さ
れる一組の活性を有する。 hPDGF-Rの場合には、機能的
断片はこれらの生理学的活性、または hPDGF-Rレセプタ
ーの特徴とする活性を有し、これはPDGF結合、チロシン
キナーゼ活性、およびレセプターに仲介されるマイトジ
ェン性のまたは他の細胞性応答を含む。しかしタンパク
質断片は、生命維持に必要な構造的な拘束のような他の
特異的または固有の機能を表すこともでき、グリコシル
化のための基質部位を提供し、細胞性標的のシグナル配
列に寄与し、マウスPDGF-Rにおいて特徴的なエピトープ
の不在を与え、または固有に所有されている、現在は認
識されていない機能を与える。
【００５８】ポリペプチドの溶解性は、条件およびポリ
ペプチドに依存する。多くのパラメーターがポリペプチ
ドの溶解性に影響し、それには温度、電解質条件、ポリ
ペプチドの大きさや分子の特徴、そして溶媒の性質が含
まれる。ポリペプチドが使用される温度は典型的には約
４℃から約65℃の範囲である。通常は温度は約18℃より
も高い温度が使用され、より普通には約22℃よりも高
い。診断の目的には、温度は通常およそ室温またはより
暖かいが、アッセイ中の成分の変性温度よりは低いであ
ろう。治療の目的には温度は通常は体温であり、典型的
にはヒトには37℃、しかし特定の状況においては、温度
はその部位またはインビトロでより高く、または低くて
よい。
【００５９】電解質は通常、およそその場所での生理条
件であるが、有利により高い、または低いイオン強度に
変更してよい。実際のイオンは、使用される生理的また
は分析状況の標準緩衝液に合うように変更してよい。ポ
リペプチドの大きさおよび構造は、一般的に実質的に安
定な球状であり、通常は変性状態ではない。ポリペプチ
ドは、４量体で他のポリペプチドと会合してもよく、例
えば溶解性を付与する。溶媒は通常生物適合性の緩衝液
であり、生物活性を保存するために使用され、通常はお
よそ生理的な溶媒であろう。界面活性剤、典型的には緩
和な非−変性のものが加えられる場合もある。
【００６０】溶解性は通常、スベドベリ単位で測定さ
れ、これは特定条件下の分子の沈降速度の測定である。
沈降速度の測定は古典的に分析超遠心法で行われたが、
現在では典型的には標準的な遠心で行われる。Freifeld
er (1982) Physical Biochemistry (第二版), W.H.Fre
emanおよびCantorおよびSchimmel (1980) Biophysical C
hemistry 、第１−３部、W.H.Freeman & Co., サンフ
ランシスコ、を参照、これらは参照により本明細書に編
入される。大まかな測定として、推定される可溶性ポリ
ペプチドを含有する試料を標準的な全サイズ超遠心に、
約50Krpmで10分かけると、可溶性分子は上澄みに留まる
であろう。可溶性粒子またはポリペプチドは典型的には
約30Ｓより小さいであろう、より典型的には15Ｓより小
さく、通常約10Ｓより小さく、より通常には約６Ｓより
小さいであろう、特定の態様においては、好ましくは約
４Ｓより小さく、より好ましくは３Ｓより小さいであろ
う。
【００６１】本明細書で提供されるPDGFレセプターまた
はレセプターの特別な細胞外領域は、それぞれのPDGFへ
の親和性により精製されて使用することができる。完全
長、または全細胞外領域は、表２のタイプＢレセプター
のリガンド−結合決定基を含むが、約leu(1)からlys(49
9)に広がる。完全長、または全細胞外領域は、表３のタ
イプA hPDGF-Rのリガンド−結合決定基を含むが、約gln
(1)からglu(501)に広がる。リガンド−結合決定基は種
々のPDGFレセプター対立遺伝子により変化し、いずれも
全細胞外領域の５％である。リガンド結合に必須な最小
量のタンパク質配列は、細胞外量の種々のセグメントを
切り出して、リガンド結合を測定することにより決定さ
れる。リガンド−レセプター相互反応の研究は、リガン
ド−結合領域がレセプターの細胞外領域に位置している
ことを指示する。リガンド結合の特異性に対する種々の
残基の効果に関する、より洗練された研究も、本発明の
試薬により可能となる。本出願に使用される時、本発明
のPDGFレセプターまたはPDGF-Rリガンド−結合活性は、
PDGF、PDGFアゴニストまたはアンタゴニストまたはhPDG
Fレセプターに特異的な他のリガンドに結合できる能力
を持つことを意味する。通常このようなリガンドはPDGF
ファミリーの一員であり、典型的にはヒトからの形態で
あろう。それゆえに、外部領域は類似体がアゴニストま
たはアンタゴニストであるかを確立するために有用であ
る。
【００６２】PDGF-Rは、他の多くの増殖因子レセプター
と同様に天然に多量体複合体として見いだされるであろ
う、二量体形が最も存在すると思われる。即ち、レセプ
ターの他の重要領域は、細胞外またはそうではないこれ
らのセグメントであろうし、これは二量体化またはタン
パク質−タンパク質相互反応に関与する。
【００６３】完全長のポリペプチドに加えて、本発明は
生物的に活性なポリペプチドの断片またはその類似体を
提供し、ペプチドの相互反応を刺激する有機分子を含
む。有意な生物的活性には、リガンド−結合、免疫的性
質、二量体会合、キナーゼ基質としての役割、PDGF-Rタ
ンパク質に特異的結合するための他のメディエーターと
の相互反応、そしてヒトPDGFレセプターポリペプチドの
特徴である他の生物的活性がある。免疫的活性には、標
的とする免疫系での免疫原性機能を含み、結合について
免疫的エピトープを共有し、ヒトPDGFレセプターエピト
ープについて競合体または置換抗原のいずれかの役割を
果たす。これらの免疫的活性のアッセイは当業界に周知
であり、以下の実験法の章を参照にされたい；Harlowお
よびLane (1989) Antibodies：A Laboratory Manual 、
コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク；およ
びEscobedoら (1988) J.Biol.Chem. 263： 1482-1487
、これらは参照により本明細書に編入される。例え
ば、リガンド−結合または他のセグメントは異なる新た
な融合ポリペプチドまたは断片との間で“交換”でき
る。すなわち、特異性の新たな組み合わせを表す新たな
キメラポリペプチドがリガンド−結合特異性および細胞
内領域との機能的連結から生じるであろう。例えば、他
の関連するポリペプチドからのIgドメインが加えられる
か、またはこれらのレセプターのIg−様ドメインと置換
されるであろう。生成したタンパク質はしばしば、ハイ
ブリッド機能および性質を持つであろう。
【００６４】免疫的性質に関しては、連続的に反復する
ポリペプチドセグメントである免疫原性で作られること
ができ、これによって高度に免疫原性のタンパク質を作
成する。別法として、そのようなポリペプチドは特異的
結合に対する高度に有効な競合体を提供するであろう。
hPDGFレセプターポリペプチドに対する抗体の生産は以
下に記載する。
【００６５】本発明はPDGFレセプターの断片およびそれ
に実質的にホモロガスなポリペプチドを含む他のポリペ
プチドも提供する。本発明のレセプターペプチドは一般
的に、天然に存在する hPDGFレセプターの配列と少なく
とも約80％のホモロジーを表し、典型的には天然のレセ
プター配列と少なくとも約85％、より典型的には少なく
とも約90％のホモロジー、通常は少なくとも約95％のホ
モロジー、より通常には少なくとも約97％のホモロジー
を有する。比較配列の長さは一般的には少なくとも約16
アミノ酸を表し、通常は少なくとも約20残基、より通常
には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残
基、好ましくは約35残基より長い。
【００６６】ポリペプチドに関するホモロジーは、典型
的には配列分析用ソフトウェアを使用して（例えばウィ
スコンシン州 53705，マジソン，ユニバーシティーアベ
ニュー1710、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセ
ンターのジェネティクス コンピューター グループの
配列分析ソフトウェアパッケージを参照）測定される。
タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、削除、置
換および他の修飾が与えられたホモロジーの測定を使用
した同様な配列と合致する。保存的置換は典型的には以
下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン：バリン、
イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン
酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；
リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシ
ン。
【００６７】レセプターと他のホモロガスな、またはヘ
テロロガスなタンパク質との間の融合ポリペプチドも提
供される。ホモロガスなポリペプチドは種々の増殖因子
レセプター間で融合されることができ、結果として例え
ばハイブリッドタンパク質はひとつのレセプターのリガ
ンド特異性ともうひとつの細胞内領域を表し、またはレ
セプターは、広がった、または弱められた結合特異性を
有することができる。同様にヘテロロガスな融合は誘導
タンパク質の性質または活性の組み合わせを表すように
構成される。典型的な例はレポーターポリペプチド（例
えばルシフェラーゼ）とレセプター（例えばリガンド−
結合セグメント）のセグメントまたはドメインとの融合
であり、所望のリガンドの存在および位置が容易に決定
されることができる。例えば、Dullら、米国特許第 4,8
59,609（これは参照により本明細書に編入される）を参
照にされたい。他の遺伝子融合対には、細菌性β−ガラ
クトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、β−ラクタマー
ゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、および酵母アルファ融合因子がある。例えば、Godo
wskiら (1988) 、Science 241：812-816 を参照。
【００６８】そのようなポリペプチドはリン酸化、スル
ホン化、ビオチン化、または他の部分の付加、特にリン
酸基と同様な分子形を有するものにより化学的に改変さ
れたアミノ酸残基を有してもよい。ある態様において
は、改変は試薬を標識するために、または精製の標的
（例えばアフィニティーリガンド）として提供されて有
効となる。融合タンパク質は典型的には組換え核酸法ま
たは合成ポリペプチド法のいずれかで作ることができ
る。核酸操作法に関する技術は一般的に記載されている
が、例えばSambrookら (1989) 、モレキュラークローニ
ング：ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual)（第二版）、１−３巻これは
参照により本明細書に編入される。合成ポリペプチド法
に関する技術は例えばMerrifield (1963) J.Amer.Chem.
Soc. 85 ：2149-2156 ；Merrifield (1989) Science 2
32：341-347 ；およびAthertonら (1986) 固相ペプチド
合成：実践的研究(Solid Phase Peptide Synthesis ：A
Practical Approach) 、 IRL出版、オックスフォー
ド；これらのそれぞれは参照により本明細書に編入され
る。
【００６９】完全なレセプターの断片も本明細書に包含
される。種々の断片にはトランスメンブラン セグメン
ト（これは細胞表面付着機能を付与する）を含む。細胞
内または細胞外セグメントのいずれかが削除されている
種々の断片が生産される。例えば、PDGFレセプターまた
は他のタンパク質のトランスメンブラン セグメントを
含む断片はリガンド結合決定基と組合わされて、リガン
ド結合領域が結合した膜を提供するであろう。細胞内領
域との同様な構造物を調製することができ、例えばチロ
シンキナーゼ セグメントを結合した膜を生成する。
【００７０】特に、リガンド結合決定基を含む可溶性断
片が、遊離のリガンドを吸着するために作成されるであ
ろう。この可溶性断片は診断および治療の目的でPDGF仲
介応答をブロックするために使用できる。もうひとつの
態様において、細胞内断片と類似体が調製されるであろ
う。チロシンキナーゼドメイン中のキナーゼ挿入領域
（KI）は特に有用な断片であり以下に記載される。
【００７１】タンパク質のリン酸化領域のペプチド類似
体は、他のタンパク質のリン酸化領域とホモロジーな実
質的に一次配列を有するペプチドである。そして少なく
ともひとつのリン酸化または同様に誘導された残基を、
他のタンパク質のリン酸化領域中の同様なリン酸化領域
の対応する位置に有する。そのような領域がふたつまた
はそれより多くのリン酸化領域を有する所では、特定の
態様において、ペプチド類似体は唯一のそのようなリン
酸化または同様に誘導された残基を有するであろう。そ
のようなリン酸化残基は一般的に、フォスフォチロシ
ン、フォスフォセリン、またはフォスフォスレオニンが
ある。このペプチド類似体は、ある場合には、ひとつま
たはそれより多くの非天然アミノ酸を有するであろう、
それは例えばビオチン化、リン酸化、スルホン化、また
はグリコシル化により化学的に改変された残基を含む。
それは一般的にモノマーまたは反復ペプチド単位のマル
チマーであろう。そしてしばしばヘテロロガスなタンパ
ク質またはペプチド断片と結合するであろう。そのよう
なヘテロロガスなタンパク質またはペプチドは（例え
ば、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、β−グル
クロニダーゼ、ルシフェラーゼ、trpEまたはプロテイン
Ａ）である。Godowskiら (1988) Science 241：812-81
6 を参照。そのようなペプチド類似体は一般的に可溶
性、または固相支持体に結合している（例えばニトロセ
ルロース、ナイロン、カラム充填物質（例えば Sepharo
seビーズ）、磁気ビーズ、ガラスウール、細胞または他
の物質。
【００７２】正常タンパク質の機能に重要なタンパク質
のリン酸化領域は、しばしば多くの方法によって同定さ
れるであろう。例えば、欠損や点突然変異でもうひとつ
のタンパク質に対する結合能力が変化した突然変異タン
パク質、改変された酵素活性または他のタンパク質の性
質の改良の分析である。方法は当業界において周知であ
り、インビボでペプチド領域がリン酸化されているかを
決定することができる。例えば、KazlauskasおよびCoop
er (1989) Cell 58 ：1121-1133 ； Williams(1989) Sc
ience 243 ：1564-1570 ；およびWahlら (1990) J.Bio
l.Chem. 265：3944を参照。直接的な構造決定（例え
ば、ｘ−線結晶解析または2D-NMR）を使用して位置およ
び相互反応を測定でき、これはリガンドとエフェクター
結合活性の両方のどの改変が相互反応に影響するかを導
く。
【００７３】種々の細胞外領域中および細胞内領域態様
において、断片は一般的に少なくとも約1200ダルトン、
しばしば少なくとも2400ダルトン、典型的には少なくと
も3000ダルトン、より典型的には少なくとも3600ダルト
ン、そして好ましい態様の幾つかにおいては少なくとも
4200ダルトンまたはそれより大きい。
【００７４】III．核 酸 本発明の核酸組成物は一般的に RNAまたは DNA形である
が、混合したポリマーでもあるだろう。記載された DNA
の態様は、通常ゲノム DNAまたはcDNA、合成により調製
されたものから由来したものであるか、またはそれらの
混合物であろう。 DNA組成物は一般的に、 hPDGF-Rまた
はその断片をコードする完全なコード領域を含み、例え
ば少なくとも８コドン（24bp）、通常は少なくとも12コ
ドン、より通常には少なくとも約15コドン、典型的には
少なくとも約20コドン、より典型的には少なくとも約30
コドン、そしてこのましくはそれより大きい。ひとつま
たはそれより多いイントロンが存在してもよい。
【００７５】hPDGF-Rという用語は、核酸に適用された
場合、おおざっぱにhPDGF-Rポリペプチド、断片または
変異体を言い、タンパク質融合体または欠損変異体を含
む。配列またはその相補体が、ヌクレオチドトリプレッ
トのユニバーサルコードにより与えられ、ポリペプチド
の一次構造に翻訳される時、核酸はポリペプチドをコー
ドする。“単離された”核酸は核酸（例えば、RNA, DNA
または混合ポリマー）であり、これは実質的に天然のヒ
ト配列（例えば、リボゾーム、ポリメラーゼおよび他の
ヒトゲノム配列）に天然に付随する他のDNA配列から分
離される。この用語は天然に存在する環境から取り出さ
れた核酸を包含し、ならびに組換えまたはクローン化 D
NA単離物および化学的に合成された類似体または生物的
にヘテロロガスな系で合成された類似体を含む。実質的
に純粋な分子には分子の単離形態を含む。単離核酸は一
般的に分子が均一な組成物だが、ある態様においてはわ
ずかな異成分を含むだろう。この異質性は典型的にはポ
リマーの末端または部分に見いだされ、所望の生物機能
または活性には重要ではない。
【００７６】“コードする”という用語は、一般的に翻
訳できる形態中に存在する配列情報を言い、通常は操作
できるようにプロモーターに連結されている。機能的プ
ロモーターがその配列の翻訳または発現を増大する時、
配列は操作できるようにプロモーターに連結される。同
じ情報内容がすぐにアクセスできる形態に存在し、特に
センス鎖の発現を促進する配列に連結されている場合、
アンチ−センス鎖もその配列をコードしていると考えら
れる。情報は遺伝子コードの標準法または改良法を使用
して転換できる。例えば、Watsonら (1987) 、The Mole
cular Biologyof the Gene （第４版）、第１および２
巻、ベンジャミン，メンロパーク カリフォルニア州(B
enjamin, MenloPark, California）。
【００７７】“組換え”という用語は天然には存在しな
い核酸配列を言い、またはふたつの異なる分離している
配列のセグメントの人工的組み合わせにより作られたも
のを言う。この人工的組み合わせはしばしば化学合成手
段または核酸の単離セグメントの人工的操作（例えば、
遺伝子工学的技術による）による。それは通常、典型的
には配列認識部位に導入または除去して、コドンを同一
または保存的アミノ酸をコードする重複するコドンに置
き換える。別法として、所望の機能の核酸セグメントを
一緒に繋いで通常天然には存在しない、所望の機能の組
み合わせを含む単一の遺伝的産物を生成する。制限酵素
認識部位はしばしばそのような人工的操作物の標的であ
り、例えばプロモーター、 DNA複製部位、制御配列、コ
ントロール配列、または設計により有効な特徴を組み入
れることができる。同じ概念は組換え（例えば融合、ポ
リペプチド）にも意図される。ホモロガスな配列は、比
較した時、同一性を表す。核酸についてホモロジーに関
する基準は、この技術について一般的に使用されるホモ
ロジーについての測定か、またはハイブリダイゼーショ
ン条件のいずれかで表される。ハイブリダイゼーション
条件は以下に記載されるが、さらに対応するヒトとマウ
スセグメントとの間のホモロジーにより制限される。記
載したパラメーターに加えて、記載したホモロジー特異
性は比較されるセグメントである対応するマウスセグメ
ントが、記載されたヒトセグメントに適合するための十
分な条件によって制限されるように、ホモロジーはヒト
とマウス配列の間の同一性によって制限されるであろ
う。
【００７８】核酸内容物中の実質的なホモロジーとは、
比較する場合、セグメントまたはそれらの相補鎖のいず
れかが、適当なヌクレオチド挿入および削除を有して至
適に配列した時に、少なくとも約60％残基、通常は少な
くとも約70％、より通常には少なくとも約80％、好まし
くは少なくとも約90％、そしてより好ましくは少なくと
も95−98％のヌクレオチドの同一性を意味する。択一的
に、実質的なホモロジーはセグメントが選択的条件下に
おいて鎖またはその相補鎖、典型的には表２または３か
ら由来した配列を使用したものにハイブリダイズする時
にホモロジーが存在する。ハイブリダイゼーションの選
択性はハイブリダイゼーションの発生が特異性が全く無
い場合よりもより選択的である時に存在する。典型的に
は選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約14ヌ
クレオチドの長さにわたって、少なくとも約55％のホモ
ロジー、好ましくは約65％、より好ましくは少なくとも
75％、そして最も好ましくは少なくとも約90％ある時に
起こるであろう。Kanehisa(1984) Nuc.Acid Res. 12
：203-213を参照のこと（これは参照により本明細書に
編入される）。記載したようにホモロジーの長さの比較
は、より長くてもよく、そして特定の態様においては、
しばしば少なくとも約17ヌクレオチドの長さにわたり、
通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常には少な
くとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌ
クレオチドより典型的には少なくとも約32ヌクレオチ
ド、そして好ましくは少なくとも約36ヌクレオチドかそ
れより長い。ホモロジーに関するストリンジェント条件
は、典型的にハイブリダイゼーション反応において制御
された塩、温度、有機溶媒および他のパラメーター条件
の組み合わされたストリンジェンシーになるであろう。
ストリンジェントな温度条件は一般的に30℃を越える温
度、典型的には37℃を越え、そして好ましくは45℃を越
える。ストリンジェントな塩条件は、通常は1000mMより
低く、典型的には 500mMより低く、そして好ましくは 2
00mMよりも低い。しかしパラメーターの組み合わせは任
意の単一パラメーターの測定よりもさらにより重要であ
る。WetmurおよびDavidson (1968) J.Mol.Biol. 31 ：
349-370 を参照のこと（これは参照により本明細書に編
入される）。
【００７９】これらの対立遺伝子の野生型タイプが一般
的に採用されるが、ある状況においてはひとつまたはそ
れ以上の突然変異、わずかな変更を導入してもよく、そ
れは例えば削除、置換または挿入のようなものであり、
アミノ酸配列の変更を生じ、アミノ酸配列またはアミノ
またはカルボキシ末端のわずかな突然変異または変更を
与える。hPDGF-Rともうひとつのタンパク質との間の遺
伝子融合、またはタイプＡとタイプＢ形との間の融合が
有効になる状況もある。通常ゲノム性の核酸は、しばし
ば約50kbを越えることは無く、より頻繁には約40kbを越
えることは無く、典型的には約30kbを越えることは無
く、より典型的には約20kbを越えることは無く、通常は
約10kbを越えることはなく、そして種々の態様におい
て、好ましくは約６kbを越えないであろう。そのような
配列は任意のまたはすべてのイントロンが除去されてよ
い。
【００８０】hPDGF-Rをコードする DNA断片は、実質的
に hPDGF-Rとホモロジーを共有する他の種のPDGFレセプ
ターをコードする DNAを単離するために有用である。細
胞内チロシンキナーゼ領域からの断片を使用して他のチ
ロシンキナーゼを単離することができる。少なくとも約
10ヌクレオチド、通常には少なくとも約20ヌクレオチ
ド、より通常には少なくとも約30ヌクレオチドを有する
DNA断片の部分、およびhPDGF-Rをコードする DNA配列
からの約６knt(キロヌクレオチド）より少ない、通常は
約0.5kntより少ない部分がプローブとして使用される。
このプローブは hPDGF-Rまたはその断片をコードする R
NAが細胞に存在するかどうかを決定するために使用でき
る。
【００８１】加えて、タイプＢヒトPDGFレセプター遺伝
子は染色体５に位置し、ここには多くの成長制御関連遺
伝子が集まっている。すくなくともひとつの遺伝子疾
患、５ｑマイナス症候群はこの領域の欠損が関与するこ
とが示された。タイプＡレセプター遺伝子は、 c-kitガ
ン原遺伝子に近い染色体４に位置する。これらの配列は
しばしば無欠の遺伝子であり、これらの染色体領域の完
全性を診断するために使用されるであろう。 hPDGF-R遺
伝子配列の断片は、マーカーとしてゲノムのこれらの重
要な構造を釣り上げて、ゲノムのこれら領域に関連する
遺伝子疾患を診断するために使用される。択一的にこの
配列は染色体領域の完全性を試験するための他の断片を
単離するために有効である。
【００８２】本発明の融合タンパク質を製造するために
使用される組換え核酸配列は、頻繁には天然または合成
配列から由来するものである。多くの天然遺伝子配列は
種々のライブラリー、cDNAまたはゲノムから適当なプロ
ーブを使用して入手可能である。国立衛生研究所のGenB
ankTMを参照。ヒトPDGFレセプターの典型的プローブ
は、標準法に従い表２または３の配列から、またはそれ
らの対立遺伝子から選択されるであろう。Beaucageおよ
びCarruthers (1981) Tetra. Letts. 22 ：1859-1862
により記載されたフォスフォアミダイト法は適当な合成
DNA断片を生成するであろう。二重鎖断片は、相補鎖を
合成して適当な条件下で鎖をアニーリングするか、また
は適当なプライマー配列を有する DNAポリメラーゼを使
用して相補鎖を加えることによりしばしば得られる。
【００８３】IV．PDGFレセプター及び断片を作成するた
めの方法 本発明で提供される新規核酸はPDGFレセプターを作成す
るために有効である。DNA断片またはそれらの部分は、
hPDGF-Rのための発現構造物を調製するために使用され
る。発現構造物は通常は、天然のまたは他のプロモータ
ーの転写制御下で hPDGF-Rをコードするひとつまたはそ
れより多い DNA配列を含む。 hPDGF-Rをコードするひと
つより多い配列が構造物中に存在する時、配列はレセプ
ターの同一または異なる形態（通常は異なる）をコード
するであろう。通常プロモーターは哺乳類細胞で発現す
るための真核生物プロモーターであり、哺乳類細胞はPD
GFレセプターがあっても無くてもよい。転写制御配列は
典型的にはヘテロロガスなエンハンサーまたはプロモー
ターを含み、それは宿主により認識されている。適当な
プロモーターの選択は、宿主に依存するが、trp, lacお
よびファージプロモーター、tRNAプロモーターおよび糖
溶解酵素プロモーターのようなプロモーターが知られて
いる。例えばSambrookら (1989) を参照。便利なことに
は、複製システム、転写および翻訳制御配列とともに繊
維芽増殖因子レセプター DNA配列の挿入部位を含む入手
可能な発現ベクターを使用することができる。細胞系と
発現ベクターとの作業可能な例は、Sambrookら (1989)
同上、 Metzgerら (1988) 、Nature 334：31-36 、それ
ぞれ参照により本明細書に編入される。特に非−真菌中
で発現が起こる場合、非−真菌、プロモーターが好まし
い。時には他の細胞タイプ中で配列を発現させることが
有効かもしれないし、適当なプロモーターを選択でき
る。そして場合によっては、誘導可能なプロモーターが
好ましい。他の状況では、異なる細胞タイプにより与え
られる同様なグリコシル化パターンを提供するグリコシ
ル化酵素を同時発現することが望まれる。
【００８４】原核生物宿主中で DNA配列を伸ばしたり、
またはレセプタータンパク質またはその断片を生成した
い場合には、好ましいプロモーターは原核生物プロモー
ターであり、例えばtrp, lacおよびlambdaであり、その
他の有用な原核生物プロモーターについてはSambrookら
(1989) を参照されたい。通常、強力なプロモーターを
使用する高レベルの転写および発現が提供されるであろ
う。
【００８５】発現構造物はしばしば適当な細胞性宿主中
で染色外で安定に存在できるベクター中に含有される
か、または宿主のゲノム中に統合される。発現構造物は
宿主中へ挿入できる配列によって境界を定めることがで
き、例えば、トランスポゾン配列、溶原性のウイルス配
列などである。通常マーカーが発現構造物に与えられ、
これはその発現構造物を有する宿主細胞の選択を可能に
する。マーカーは同じDNA分子であってもなくてもよ
く、好ましくは同じ DNA分子である。哺乳類細胞におい
て、レセプター遺伝子それ自体が便利なマーカーを提供
するであろう。しかし、原核生物細胞中では細胞毒性
剤、原栄養体への栄養要求性宿主の付与、検出できる生
成物の生産などのマーカーがより便利であろう。
【００８６】発現構造物は目的宿主細胞によって認識さ
れる複製系に結合される。種々の複製系にはウイルス複
製系（例えばレトロウイルス、シミアン、ウイルス、ウ
シパピローマウイルス、などのような）を含む。加えて
構造物は増幅しうる遺伝子に連結され（例えばDHFR遺伝
子）所望の hPDGF-R遺伝子の多数のコピーを作ることが
できる。Schimke, R.(1984) Cell 37 ：705-713 、およ
び Kaufmanら (1985)Mol.Cell.Biol. 5：1750-1759 ；
それぞれ参照により本明細書に編入される。
【００８７】特にレセプターポリペプチドを、非真菌の
グリコシル化パターンを与える系で発現させることが望
まれる。この場合には通常のパターンはその発現系によ
り自然に提供されるものとなる。しかしパターンは、ヘ
テロロガスな発現系に導入された適当なグリコシル化タ
ンパク質に暴露させることにより、例えば非グリコシル
化形態に変更されるであろう。例えばPDGFレセプター遺
伝子は、哺乳類または他のグリコシル化酵素（好ましく
は非真菌種から、ある態様においては非ヒト種から生成
した）をコードするひとつまたはそれより多くの遺伝子
と共に同時トランスフェクションされることができる。
この方法を使用して特定の哺乳類グリコシル化パターン
が原核生物または他の細胞から達成される。
【００８８】発現構造物を宿主細胞に導入する手段は特
定構造および標的宿主により変化する。導入は任意の便
利な手段により達成することができ、それには融合、接
合、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレ
ーション、注入などが含まれる。例えばSambrookら(198
9)、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーガイ
ド、第３巻、コールドスプリングハーバ−出版、これは
参照により本明細書に編入される。レセプターの種々の
形態をコードする構造物の単一細胞への導入も意図され
ている。宿主は通常不滅化細胞である（例えば培養中に
連続的に継代生育できる細胞）。大部分、これらの細胞
は便利な哺乳類細胞であり、 hPDGF-Rを発現でき、なら
びに所望により適当な成熟ポリペプチドを提供するよう
に操作することができる。操作により、意図されるもの
はグリコシル化、ユビキチネーション、ジスルフィド結
合形成、一般的な翻訳後修飾などである。通常宿主は h
PDGF-Rを細胞の膜に挿入するためのシグナル配列を認識
する。分泌が望まれる場合は、トランスメンブラン配列
を一般的に削除または突然変異してタンパク質の膜配位
を防ぐ。
【００８９】原核生物および真核生物の両方の広範な宿
主がペプチドの発現に使用される。有用な宿主は細菌、
例えばE. Coli., 酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細
胞、典型的には不滅化された種々のマウス細胞系、サル
細胞系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ヒト細胞
系、それらの誘導物などである。ある場合には、細胞は
悪性宿主誘導細胞で、または野生型細胞はガン遺伝子、
腫瘍発生ウイルスなどで形質転換されるであろう。
【００９０】ある状況下においては、例えばシグナル配
列およびトランスメンブラン領域が細胞膜のレセプター
ペプチドを支配する構造物でPDGFレセプターを欠く哺乳
類細胞をトランスフェクトすることが望まれる。形質転
換またはトランスフェクトした細胞の子孫も包含するこ
とを意図する。リンパ球および心筋細胞がレセプター欠
如の主な細胞例である。チャイニーズハムスター卵巣細
胞(CHO）、内皮細胞系および多くのヒト腫瘍細胞系もPD
GFレセプターを欠く。hPDGFレセプターおよび断片を含
む組成物および細胞は、 hPDGFレセプターに付随する診
断の目的に、ならびに疾患および医学的状況を研究また
は処置するために使用できる。可溶性細胞外リガンド結
合断片の使用は、既に一般的に記載されている。加え
て、細胞内領域の種々のセグメントは、リン酸化アミノ
酸残基を含む。リン酸化の部位はセグメントと他のポリ
ペプチドとの反応に重要である。反応の性質および特異
性は、リン酸化の有無および完全なレセプターの断片、
または関連配列に高度に依存しており、反応を変調する
ために有効である。すなわち、細胞内領域断片には重要
な使用目的を見いだす。
【００９１】明らかな配列を含有するクローニング媒体
を発現する細胞は、特定の活性に影響を与えるために必
要なPDGFレセプターの特異的部位を定めるために使用で
きる。別法として、これらの細胞は選択したレセプター
が種々のリガンド（PDGFおよび類似体）に結合する能力
を評価して、これによりPDGF−誘導の細胞応答を促進ま
たは阻害するための薬剤の能力を評価する有力な手段を
提供する。
【００９２】完全長の天然PDGF-R配列を含有する DNAま
たはmRNAをトランスフェクト、注入、感染またはエレク
トロポレーションした細胞は、天然または野生型レセプ
ターを発現し、従ってしばしば完全長セグメントよりも
少ない応答は所望の同等な機能を有するであろう。精製
レセプターまたはレセプターポリペプチド断片の特異的
濃度は、リガンド（PDGF）の天然PDGFレセプターへの結
合をブロックするために使用できる。別法として、レセ
プターまたは断片に対する抗体も同様の効果を有する。
特に、本明細書では細胞外領域のエピトープに対する抗
体がリガンド−レセプター結合をブロックできることを
実証した。他の抗体はレセプターポリペプチドの二量体
化をブロックするであろう、そして従ってレセプター機
能を変調するであろう。均一で明らかなポリペプチドお
よび DNA配列が、抗体上昇とその結合の特異性を定める
ために使用できるであろう。特に、レセプターの特異的
領域（例えばリガンド−結合セグメント）に対する抗体
は診断および治療に使用されるであろう。レセプターの
領域に特異的なPDGF-R、PDGF-Rポリペプチド、および抗
体試薬は、PDGF仲介活性の制御を研究するために使用で
きる。細胞内断片（特にキナーゼ挿入セグメント）は重
要な使用法を有するであろう。
【００９３】PDGFは組織修復、胚形性に役割を持ち、な
らびにアテローム硬化症、骨髄増殖性疾患およびいくつ
かの癌に関与するらしい。これらの症状の処置は可溶性
細胞外断片または抗体の治療的投与による弱化に対応す
る。例えばPDGFアゴニストは細胞の増殖的成長を刺激
し、ひとつの効果は傷の修復、筋肉再生、および動脈壁
増殖に極めて有効である。PDGFアンタゴニストはいくつ
かの場合は過剰な応答を遮断するため、またはPDGF応答
を変調するために使用される。
【００９４】ヒトPDGF-R細胞外領域からの約５から 200
の間の、好ましくは約10または15から50の間の可溶性PD
GF-Rポリペプチドを含有する組成物が記載されている。
ひとつの態様において、ポリペプチドは表２のタイプＢ
ヒトPDGFレセプターの残基１から 499からの、または表
３のタイプＡヒトPDGFレセプターの残基１から 501から
の少なくとも約80アミノ酸を含有する。もうひとつの態
様において、細胞内領域の断片は種々の使用法を有す
る。特に、KI領域は、およびその断片または類似体は、
リン酸化領域の相互反応を、認識相互反応（通常はもう
ひとつのタンパク質による結合）でブロックまたは変調
するために使用される。これらの相互反応はしばしばさ
らなるシグナル伝達および細胞応答に重要である。
【００９５】トランスフェクトした細胞により発現され
た hPDGF-Rタンパク質にも様々な使用法がある。もしペ
プチドが分泌されると、ペプチドは典型的には発現宿主
が生育する上澄みから単離されるであろう。分泌されな
い場合、典型的にはペプチドは例えば溶解物から単離さ
れるであろう。このペプチドは一般的には、HPLC、電気
泳動、勾配遠心、アフィニティークロマトグラフィー、
（例えばPDGFカラムクロマトグラフィーを使用する）、
および他のタンパク質生化学に使用されるタンパク質精
製法を使用する便利な技術によって単離され、実質的に
純粋な生成物（例えば特に細胞成分混入物を含まない）
が得られる。例えばJacoby (1984) Method in Enzymolo
gy、第 104巻、アカデミックプレス、ニューヨーク；Sc
opes (1987) タンパク質生成：理論と実践（Protein Pu
rification：Principle and Practice、（第２版）、ス
プリンガー ファーラーグ(Springer Verlag）、ニュー
ヨーク；ドイツ（編集)(1990) タンパク質精製ガイド
（Guide to Protein Purification)、Method in Enzymo
logy、第 182巻；それぞれは参照により本明細書に編入
される。
【００９６】タイプＢレセプターの約leu(1)から始まり
lys(499)のアミノ末端配列のレセプタータンパク質、ま
たはタイプＡレセプターの約gln (1) からglu(501)のア
ミノ末端配列のレセプタータンパク質アミノ酸は、これ
らは全細胞外領域を形成し、そして特にレセプタータン
パク質のPDGFリガンド結合部位を形成するが、PDGFのア
フィニティー精製に有用であると思われる。細胞外領域
は、PDGFアゴニストおよびアンタゴニストとして有用な
薬剤を定めるために固体支持体に固定するか、または溶
液中に自由に存在して使用できる。
【００９７】タンパク質の細胞内領域は、タイプＢレセ
プターの約val(500)から始まりカルボキシ末端まで、ま
たはタイプＡレセプターのleu(502)からのカルボキシ末
端までであるが、これらも周知技術によるタンパク質リ
ン酸化のためのチロシンキナーゼとして使用される。加
えて、タイプＢレセプターのアミノ末端配列のアミノ酸
met(−32) からGly(−1)、およびタイプＡレセプターの
約met(−23) からCys(−1)は、トランスフェクトした細
胞膜を貫通する構造タンパク質を支配するシグナル配列
を構成する。これらのシグナル配列は hPDGF-Rと共に使
用されるが、他のタンパク質と融合される場合は、その
タンパク質と共に使用されると期待される。
【００９８】ヒトPDGFレセプターポリペプチド断片は、
短縮された核酸配列の直接的発現または hPDGFレセプタ
ーの標準的プロテアーゼ処理のいずれかによって生成さ
れ、好ましくは精製される。いずれの方法のための試薬
も本明細書で提供される。
【００９９】診断目的として、これらの試薬は標的試料
中のPDGFまたはPDGFレセプターの測定法を提供する。そ
の測定法は：標的試料を hPDGFレセプターポリペプチド
セグメントと混合し；そして該ポリペプチドと該試料の
間の結合の程度を決定する、工程からなる。
【０１００】本発明は形質転換細胞も提供し、これは初
代形質転換体の子孫も含み、少なくともヒトPDGFレセプ
ターのセグメントにホモロガスなポリペプチドを発現す
ることができる。好適な態様は、細胞が実質的にヒトPD
GFレセプターの全細胞外領域にホモロガスなポリペプチ
ドを発現する場合であり、可溶性タンパク質を含む。
【０１０１】Ｖ．抗 体 種々のPDGFレセプターおよびペプチド断片に対するポリ
クローナルおよび／またはモノクローナルも調製でき
る。合成ペプチドはペプチド合成機で調製でき、キャリ
アー分子（例えば、カギ穴巻貝ヘモシアニン）に結合し
て、数カ月間にわたり、ラビットに注射する。ラビット
の血清をPDGFレセプタータンパク質または断片に対する
免疫性について試験する。モノクローナル抗体は、マウ
スに hPDGF-Rタンパク質、 hPDGF-Rポリペプチドまたは
高レベルのクローン化PDGFレセプターをその細胞表面に
発現している細胞を注射することによって作成される。
モノクローナルを ELISAにより検索して、PDGFレセプタ
ータンパク質またはそのポリペプチドとの特異的免疫活
性を試験する。Harlow及びLane (1988) 、抗体：アラボ
ラトリーマニュアル（Antibodies：A Laboratory Manua
l)コールドスプリンダハーバー出版、ニューヨークを参
照（これは参照により本明細書に編入される）。これら
の抗体はアッセイ、または他の薬品として有用である。
【０１０２】一旦、十分量の所望の hPDGFレセプターポ
リペプチドが単離されたら、タンパク質は様々な目的に
利用される。典型的な使用法としては、これらのレセプ
ターへ特異的に結合する抗体の生産である。これらの抗
体は、通常ポリクローナルまたはモノクローナルのいず
れかであり、通常インビトロまたはインビボの技術によ
り（例えば定義され、認識されている特定抗原決定基ま
たはエピトープの目標に対して）生成される。通常エピ
トープは、連続したアミノ酸残基の分子形により与えら
れるが、連続的に一列でなくてもよく、しかし二次また
は三次構造により間隔的に接近している。特に、表２ま
たは表３に記載された少なくとも６つの連続したアミノ
酸の配列にホモロガスなペプチドは、免疫原として有効
である。最も興味のあるエピトープは、細胞外領域に見
いだされるシグナルセグメントまたは免疫グロブリンド
メインからのものであり、特にPDGFリガンド結合領域の
周りのものである。しかし、他のセグメントもまた重要
であり、それは細胞内領域のリン酸化部位、例えばリン
酸化されている、またはされていないキナーゼ挿入セグ
メントである。
【０１０３】ポリクローナル抗体の生産については、適
当な標的免疫系が選択され、典型的にはマウスまたはラ
ビットである。実質的に精製された抗原が、免疫学者に
周知の動物または他のパラメーターに適する方法による
様式で免疫系に与えられる。注射の典型的部位は支脚
皿、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、ある
時は他の種、ヤギ、ヒツジ、ウシ、モルモット、および
ラットがマウス、ラビットに代わるであろう。
【０１０４】免疫応答は普通、イムノアッセイでアッセ
イされる。通常はそのようなイムノアッセイは抗原源の
精製を含み、例えば同一細胞により抗原が生産されたの
と同じ様式で生産される。イムノアッセイは、場合によ
ってはラジオイムノアッセイ、酵素−結合アッセイ(ELI
SA)、蛍光アッセイ、または他の多くの任意に選択され
るものであり、その中の多くは機能的に均等であるが、
特定条件下で利点を有するかもしれない。
【０１０５】108Ｍ-1、好ましくは 109から1010の、ま
たはより強い親和性を持つモノクローナル抗体は、典型
的には、例えばHarlowおよびlane、抗体：ア ラボラト
リーマニュアル、 CSHラボラトリー (1988) ；またはGo
ding (1986) 、モノクローナル抗体：理論と実践 (第２
版)、アカデミック プレス、ニューヨーク；に記載さ
れている標準法に従って作成される。これらのそれぞれ
の文献は参照により本明細書に編入される。端的には、
適当な動物が選択されて、所望の免疫感作を引き続き行
う。適当な期間が経過した後、その動物の脾臓を取り出
して、各脾臓細胞を融合し、典型的には適当な選択条件
下で不滅化したミエローマ細胞と融合する。その後、ク
ローン的に分離して各クローンについて、所望する抗原
の領域に特異的な適当な抗体生産を試験する。
【０１０６】他の適当な技術には、リンパ球を抗原性ポ
リペプチドにインビトロ暴露する、または別法としてフ
ァージまたは同様なベクター中でのライブラリーの選択
がある。Huseら (1989) “Generation of aLarge Combi
natorial Library of the Immunoglobulin Repertoire
in Phase Lambda”Science 246：1275-1281 を参照、
これは参照により本明細書に編入される。本発明のポリ
ペプチドおよび抗体は改変して、またはせずに使用でき
る。多くの場合、ポリペプチドと抗体は検出しうる信号
を与える物質と共有的または非共有的に結合することに
より標識される。広範な標識および結合技術が周知であ
り、科学文献および特許明細書に詳細に報告されてい
る。適当な標識には、放射核種、酵素、基質、コファク
ター、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子など
がある。そのような標識の使用を教示する特許には、米
国特許第 3,817,837； 3,850,752； 3,939,350； 3,99
6,345； 4,277,437； 4,275,149；および 4,366,241号
がある。また組換え免疫グロブリンも作成され、 Cabil
lyの米国特許第4,816,567号を参照のこと。
【０１０７】完全長ペプチドまたはその一部分は、特定
の態様において、ポリクローナルまたはモノクローナル
の抗体を生産するために使用される。抗体は適当な脊椎
動物（例えばマウス）を抗体のペプチドまたは断片で、
またはアジュバントと混合して免疫感作することにより
作成される。通常、２回又はそれより多い免疫感作が行
われ、血液または脾臓が最終注射の数日後に回収され
る。ポリクローナル抗血清については、免疫グロブリン
が沈殿し、単離、アフィニティー精製を含んで精製され
る。モノクローナル抗体については、脾細胞が不滅化リ
ンパ球（例えばミエローマ系）とハイブリドーマに選択
的な条件で融合される。ハイブリドーマは一般的に限定
希釈条件下でクローン化され、その上澄みが所望の特異
性を有する抗体について検索される。抗体を生産するた
めの技術は文献で周知であり、Goding (1986), Monoclo
nal Antibodies：Principles and Practice（第２版）
アカデミックプレス、N.Y.ならびにHarlowおよびLane
（1988）Antibodies：A Laboratory Manual 、コールド
スプリングハーバー ラボラトリー、ニューヨーク、そ
して米国特許第4,381,292、4,451,570および 4,618,577
に例示されており、これらは参照により本明細書に編入
される。これらにより作成された抗体は種々の細胞応答
の要因であるレセプターの部分を、ならびにレセプター
自体の一般的プロセッシングおよび成熟を詳細に検討す
るために多くの利用法を有する。抗体アゴニストおよび
アンタゴニストも生産されるであろう。
【０１０８】免疫原性および結合の特異性を決定するた
めの試薬として役立つ部分および断片は本明細書にて提
供される。
【０１０９】VI．使用法 本発明はヒト血小板由来増殖因子レセプター(hPDGF-R)
精製法を、細胞中でPDGFレセプターを合成する方法と同
様に提供するものである。これらの方法により生産され
る均一なレセプター、レセプターおよびレセプターの一
部分をコードする核酸配列、これらの配列を含有する発
現媒体、PDGF−レセプターを含む細胞そしてレセプター
に対する抗体も提供する。特に目的とするものはレセプ
ターの断片であり、これは特定リガンドへの結合を、レ
セプターと競合する機能的結合部位を有する。例えば O
rchanskyら（1988）“血小板由来増殖因子レセプターの
短縮された形態のフォスファチジルイノシトール結合
(Phosphatidylinositol Linkage of Truncated From of
the Platelet-derived Growth Factor Receptor)" J.Bi
ol.Chem. 263：15159-15165 を参照。これはPDGFレセプ
ターの細胞外領域がPDGFリガンドに結合できる証拠を提
供する。また、リガンド結合への細胞応答に重要な他の
タンパク質と反応するリン酸化のためのリン酸化断片お
よび部位を提供する。特に可溶性細胞外領域セグメント
が提供される。
【０１１０】トランスフェクトされた細胞はPDGFへの細
胞応答を研究するために使用される。制御された研究の
ために、PDGFレセプターを欠く哺乳類細胞を、 hPDGF-R
をコードする DNA配列を含む発現構造物でトランスフェ
クトすることができる。レセプターをコードする細胞が
生産され、これはしばしば機能的に野生型タイプレセプ
ターと同等であり、細胞にPDGF−感受性マイトジェン性
応答を付与する。このように、天然に存在するPDGFの結
合の性質は、断片および合成化合物についてタンパク質
様および非タンパク質様の両方について分析される。実
施例の章で実証するように、トランスフェクトされた細
胞が使用されて、PDGFのAA形はタイプＢレセプターチロ
シンキナーゼを活性化することが測定された。単一細胞
中のタイプＡおよびタイプＢレセプターポリペプチドの
存在は、レセプター結合の性質を研究することを容易に
し、そしてレセプターの相互反応さえも研究できるであ
ろう。
【０１１１】PDGF−仲介マイトジェン原性の研究に加え
て、トランスフェクトされた細胞が使用され、PDGFアゴ
ニストまたはアンタゴニストとして機能する薬剤能力を
評価することができる。特に、トランスフェクトされた
細胞を、試験薬と接触させて、応答量を測定する（例え
ばレセプターチロシンキナーゼ活性または DNA合成速度
をPDGFまたはその類似体の存在または不存在下での対照
細胞と比較する）。別法として、非治療的な状況におい
て、溶液中に存在するPDGF類似体とPDGFレセプターとの
間の結合の阻害に関する方法が提供される。この方法は
PDGFレセプターペプチド（例えば表２または表３に記載
された配列とホモロガスなペプチド）を、溶液に加える
か、またはペプチドの突然変異または修飾から成る工程
を含む。PDGF変異体に対する結合親和性もそのような細
胞により評価される。結合の阻害は、レセプターまたは
リガンドについての競合または結合の妨害により起こ
る。このアッセイは、試験リガンドの存在または不存在
の比較により使用され、または置換アッセイ（これは置
換するリガンドを結合が生じた後に加える）による。
【０１１２】しかし、上述したように、PDGFレセプター
は二量体で機能するようである。レセプターの可溶性形
態は二量体化を妨害し、態様によってはPDGFリガンドに
ついての競合親和性とは異なる機構によりシグナルの伝
達を遮断するのに効果的であることもある。可溶性、ま
たは種々のレセプター形態の細胞内またはトランスメン
ブラン断片は、二量体化を妨害し、従って少なくともあ
るタイプのまたはある断片のシグナル伝達を遮断する。
【０１１３】この考察により、PDGFレセプターにPDGFが
結合するのを阻害するのに有効量のPDGFレセプター遮断
薬を患者に投与することから成る、インビボPDGFレセプ
ター調節活性を変調する方法が提供される。ある場合に
は、レセプター複合体の機能的集合により、またはさら
にレセプターと細胞応答に影響する重要な他のタンパク
質（例えばフォスフォチロシン結合相互反応）により遮
断がリガンド結合のレベルで起こるであろう。上記のご
とく、タンパク質のPDGFファミリーは、多くの重要な生
理学的過程を制御する重要な役割を持つ。可溶性PDGF-R
ポリペプチドはこれらの過程のPDGF調節の程度を変調さ
せるのに一般的に効果的である。この理由から、レセプ
ターの可溶性形態はPDGFの競合的結合部位として有効で
ある。同様に、短縮されたPDGF結合部位、または突然変
異した結合部位（特に記載したヒト形態からのもの）
は、場合によっては天然形態のものと同等に効果的で、
経費上および投与に際しての医学的副作用という意味で
もより低コストである。
【０１１４】本明細書により提供される試薬は、PDGF類
似体、またはレセプターについてのPDGF−様リガンド、
またはPDGFレセプターポリペプチド生産の定量的検出ま
たは診断に使用される。種々の医学的状況は、これらの
タンパク質のいずれかの異常生産レベルによって指示さ
れる（例えば種々の腫瘍状態）。従って、今これらの試
薬に依存した診断試験が入手できる。
【０１１５】種々のPDGFタイプで、セグメントをキメラ
レセプターに組こんで、種々のリガンドに関する親和性
の多様性を有する種々のタイプのレセプターを形成す
る。本発明の遺伝子およびタンパク質で、種々の組織タ
イプに特異的な種々のパターンおよびレセプタータイプ
の間の識別が見いだされる。従ってPDGFレセプター発現
の差異に基づく組織マーカーが得られる。
【０１１６】ヒトPDGFレセプターの細胞外の種々の領域
を含有する可溶性断片は、完全なタイプB PDGFレセプタ
ーと同じく高親和性結合を維持することが示された。ヒ
トレセプターの細胞外領域は CHO細胞中で高レベルで発
現され、培地に分泌された。リガンドの存在下では、可
溶性細胞外断片は、 BB-PDGFが生理的マイトジェン応答
の特徴である応答を開始する能力を遮断する。可溶性断
片は唯一 BB PDGFに結合する高親和性も保持している
が、 AA PDGFによるマイトジェン効果は変化しない。ヒ
ト細胞外領域を使用したさらなる実験では、この断片は
リガンドの存在についてアッセイするための（例えば競
合により）結合セグメントとして使用できる。これらの
結果は、PDGFに過剰に応答する様々な症状を治療する可
能性を示唆し、例えばそれはアテローム硬化症、骨肉
腫、グリア芽腫である。マイトジェン性応答は可溶性細
胞外断片の使用を通じて弱めることができる。
【０１１７】PDGFへの生理学的応答の遮断はリガンドの
レセプターへの結合を阻害することから生じ、おそらく
競合的阻害を通じて行われると思われる。すなわち本発
明のインビトロアッセイは、これらレセプターのリガン
ド結合セグメントまたは固相基材に結合した断片を含む
可溶性断片を一般的に使用する。これらのアッセイはま
た、結合セグメント突然変異および修飾の、またはリガ
ンド突然変異または修飾（例えばリガンド類似体）の効
果の診断用測定を可能にする。
【０１１８】可溶性断片はまた、レセプターと修飾リガ
ンド（例えばビオチン化AAアイソフォームまたは他のPD
GF形）との相互作用を試験するためにも使用される。リ
ガンド作用を遮断するためのもうひとつの手段は、適当
な多タンパク質(multi-protein) レセプター会合（例え
ば二量体化）、または他のタンパク質との細胞内領域相
互作用を妨害する事になろう。特に、特定のリン酸化と
いう出来事が他の細胞内機能を媒介する他のタンパク質
との相互作用を制御することを実証する。このための種
々のアッセイが当業界で周知であり、以下に記載され
る。
【０１１９】レセプター成分は、同等物または、他のタ
イプのポリペプチド（例えばタイプＡおよびタイプＢ形
からの断片を交換すること）からの、または他の関連ペ
プチド（例えばマウスレセプターまたは関連レセプタ
ー）からの対応する可溶性断片で置換することができ
る。さらに、タイプＡホモ二量体は３つのすべてのPDGF
に結合し、タイプＡ結合断片はリガンド結合の実質的普
遍性を表す。タイプＡ結合断片は、一般的なPDGF結合試
薬を調製するために有効である。効果的な治療に必要な
薬剤量は、多くの種々の因子に依存し、それには投与手
段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬
剤がある。従って治療投与量は力価を測定して安全性と
効力を至適化すべきである。
【０１２０】典型的にはインビトロで使用される投薬量
は、これらの薬剤のその場所での投与に関して有効な量
の手引きを与えることができる。特定の疾患の治療のた
めに有効投与量の動物試験は、さらにヒトの投薬量に関
する予想を与えるであろう。様々な考察が、たとえばGi
lmanら（編集)(1990) グッドマンおよびギルマン：治療
のための薬学的基礎（Goodman and Gilman; The Pharma
cological Bases of Therapeutics)、第８版、パーガモ
ン出版(Pergaman Press)；およびレミングトンの薬化学
（Remington's Pharmaceutical Science) 、17版（199
0）、マック出版社、イーストン，ペンシルバニア州(Ma
ckPublishing Co., Easton Penn.) ；それぞれ参照によ
り本明細書に編入される。投与法についてもその中に述
べられており、例えば経口、静脈内、腹腔内、または筋
肉内投与、経皮的拡散等がある。薬学的に受容できるキ
ャリアーは、水、塩、緩衝液およびメルクインデック
ス、メルク社、ラーウェイ，ニュージャジー州 (Mack I
ndex： Merck Co., Rahway,New Jersey) に記載された
他の成分がある。
【０１２１】PDGFとそのレセプターの高い親和性から、
これらの薬剤の低投与量が最初は有効であると思われ
る。例えば投薬量範囲は通常１mM濃度より少ない、典型
的には約10μＭより少ない、普通は約 100nM濃度より少
ない、好ましくは約10pM（ピコモル）より少ない、そし
て最も好ましくは約１fM（フェントモル）より少ない量
が適当なキャリアーとともに期待される。徐放性製剤、
または徐放性用装置が連続的な投与にしばしば利用され
る。レセプターの細胞内セグメントは、PDGFレセプター
および関連レセプターの両方において、以下に詳細に記
載するさらなる使用に用いられる。
【０１２２】医薬組成物は非経口的、局所的、経口的、
または局部的投与により投与され、それには例えば予防
および／または治療を目的とした噴霧式薬剤または経皮
投与を含む。医薬組成物を、投与法に依存した種々の単
位投薬量形態で投与できる。例えば、経口投与に適する
単位投薬量形態には、粉末、錠剤、ピル、カプセルおよ
び糖衣錠がある。
【０１２３】薬剤組成物はしばしば静脈内に投与され
る。従って本発明は、受容できるキャリアー、好ましく
は水溶性キャリアー中に溶解または懸濁した化合物の溶
液を含む静脈投与用の組成物を提供する。種々の水溶性
キャリアーが使用でき、例えば水、緩衝化された水、
0.4％塩溶液、などである。これらの組成物は便利で周
知な技術により滅菌されるか、または濾過滅菌すること
ができる。生成した水溶液は使用のために包装、または
凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液に混
合される。組成物は要求されるおよその生理学的条件に
必要とされる薬学的に受容される補助物質（例えばpH調
整試薬、緩衝化試薬、強壮剤、湿潤剤などであり、例え
ば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビ
タン、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含有し
てもよい。
【０１２４】固体組成物については、便利な非毒性キャ
リアーを含有でき、それは例えば薬品級のマンニトー
ル、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコー
ス、シュクロース、マグネシウム、炭酸塩などである。
経口投与のためには、医薬的に受容できる非毒性組成物
が、任意の通常使用される賦形剤（例えばすでに記載し
たようなもの）を混合することによって形成され、その
量は一般的に活性成分の10−95％、好ましくは約20％
（レミングトン、同上を参照）である。
【０１２５】噴霧式薬剤の投与に関しては、化合物は好
ましくは界面活性剤および液体発泡剤とともに微細に分
割された形態で供給される。界面活性剤はもちろん非毒
性でなければならないし、好ましくは液体発泡剤に可溶
性である。そのような試薬の代表として、６から22個の
炭素原子を有するエステルまたは脂肪酸の部分エステル
があり、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、ラノリン酸、リノール
酸、オレステアリン酸(olesteric）と脂肪族多価アルコ
ールまたはその環状無水物、例えばエチレングリコー
ル、グリセロール、エリスルトール、アラビトール、マ
ンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導され
るヘキシトール無水物およびこれらエステルのポリオキ
シエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体がある。
しばしば混合エステル、例えば混合した、または天然の
グリセリドを使用する。界面活性剤はある態様におい
て、成分の 0.1％−20重量％、好ましくは0.25−５％を
構成する。組成物の平衡は通常液体発泡剤である。液化
した液体発泡剤は典型的には周囲条件でガス状であり、
加圧下で凝縮される。適当な液化した液体発泡剤のなか
で５個までの炭素を含有する、ブタンおよびプロパンの
ような低級アルカン、および好ましくはフッ素化または
塩化フッ素化したアルケンである。上記の混合物も使用
される場合がある。噴霧式薬剤を製造するには、適当な
バルブを装備した容器を適当な液体発泡剤で充填し、こ
れには微細に分割された化合物剤と界面活性剤が含まれ
る。成分はこのようにバルブの作動まで加圧状態で維持
される。
【０１２６】化合物を含有する組成物は、予防および／
または治療処置のために投与されることができる。治療
的投与には、上記のように組成物はすでに罹患している
患者に投与され、その量は疾患またはその合併症を治
癒、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量
である。これを達成するための量は“治療に有効な投与
量”と定義される。これに有効な量は疾患の程度および
患者の体重と一般的症状による。
【０１２７】予防的投与には、本発明の化合物を含有す
る組成物が特定の疾患にかかっていると疑われる、また
は罹患する危険性があると思われる患者に投与される。
そのような量は“予防に有効な投与量”として定義され
る。この使用において、正確な量はここでも患者の健康
状態と体重による。
【０１２８】特に重要な本発明の観点として、大部分の
増殖因子が複数の形質発現を調節し、それが内在するタ
ンパク質チロシンキナーゼ活性を持つ細胞表面のレセプ
ターとの結合及び活性化に依存するという認識がある。
チロシンキナーゼ活性を持つ増殖因子レセプターあるい
はレセプターチロシンキナーゼは非常に良く似た分子構
造を示す。たとえば、それらは大きな細胞外リガンド結
合領域、疎水性のトランスメンブレン領域、チロシンキ
ナーゼ触媒ドメインを含んだ細胞質すなわち細胞内領域
から構成される。レセプターチロシンキナーゼは一般的
にリガンド結合セグメントとタンパク質のチロシンキナ
ーゼ部位から構成され、それらは細胞膜で分離される。
従って、細胞外リガンドの結合によって生ずるレセプタ
ーの活性化は、細胞膜障壁を通して転送され細胞内領域
にある機能の活性化を意味する。
【０１２９】本発明は、ポリペプチドセグメントの特定
のアミノ酸側鎖のリン酸化が、ある種のタンパク質間相
互作用に大変重要であるという発見を利用している。相
互作用領域あるいは結合領域に存在する側鎖のリン酸化
は相互作用を調節する。PDGFレセプターとホスファチジ
ルイノシトール３′キナーゼ（PI３キナーゼ）の相互作
用の場合には、限定されたキナーゼ挿入配列内のホスホ
チロシンの存在がレセプターとPIキナーゼ間の相互作用
すなわち結合に重要であり、それによってPI３′キナー
ゼの活性が発現される。リン酸化されていないKIセグメ
ントは、PI３キナーゼとの結合活性を失う。このような
観察は、その他の結合タンパク質とリン酸化セグメント
の相互作用に一般的に応用できる。このような相互作用
の性質と特異性を究明することにより、ペプチドあるい
はリン酸化ペプチドの類似体として機能する有機物など
の類似体が調製される。
【０１３０】チロシンキナーゼは大きく２種類に分類さ
れ、トランスメンブレンレセプターと細胞質内の非レセ
プターキナーゼが相当し、２番目のグループの大部分は
チロシンキナーゼでもいわゆるsrc ファミリーに属す
る。レセプターキナーゼ遺伝子は、PDGFレセプターを含
めて構造的特徴を共有しており、例えばアミノ末端のシ
グナルペプチドは細胞膜糖タンパク質の特徴を持ち、ト
ランスメンブレンセグメントはレセプタータンパク質の
細胞外及び細胞内領域を限定し分離している。レセプタ
ータンパク質のアミノ末端部はリガンド結合部位を含む
細胞外領域を構成する。レセプタータンパク質のカルボ
キシル末端部はレセプターの細胞内領域を構成し、そこ
にキナーゼ活性が存在する。レセプターキナーゼは、細
胞外領域のリガンド結合によるシグナルを細胞内区画
へ、そして細胞内の二次伝達物質を通して最終的には核
に伝達する機能に関与する。
【０１３１】確立されたレセプターチロシンキナーゼ(R
TK) の一次配列の詳細な比較からサブドメイン構造ある
いはセグメントの共有部分と固有部分を同定可能で、そ
れはRTKファミリーを独立のグループに分類することを
可能とし、例えばYarden andUllrich (1988) Ann.REv.
Biochem.57：443-478 およびUllrich and Schlessinger
(1990) Cell 61 ：203-212 に報告されており、それら
は参照により本明細書に編入される。
【０１３２】PDGFレセプターはそのようなサブクラスの
一員である。このようなレセプターは、マクロファージ
増殖因子(CSF-1-R) および推定上のレセプターc-kit を
含めて、少なくとも２種類の異なった構造的特徴を共有
している。それらは細胞外領域のシステインに富むレセ
プタークラスターが欠失しており、別の保存された反復
構造を持ち、その反復構造には５種類の免疫グロブリン
様レセプターが含まれ、このレセプターサブクラスのメ
ンバーのリガンド結合領域が持つ共通構造を示唆してい
る。
【０１３３】それ以上に、 RTKを他のサブクラスと比較
した場合、このグループのメンバーの触媒ドメインは、
長くそして構造的に固有の、親水的な、プロリンに富ん
だ77−107 アミノ酸側鎖の挿入セグメントで中断されて
いる。この“キナーゼインサート”（KI）は、キナーゼ
インサート領域とも見做され、触媒ドメインを２つのセ
グメントに分割し、他のチロシンキナーゼドメインとの
ホモロジーから定義される。それぞれのレセプターサブ
ファミリー内でもこれらKI配列は高度に分化しており、
逆にニワトリやネコ、ヒトのような進化的に異なった種
間では強固に保存されている。関連するサブファミリー
のメンバーは、 FGFレセプターやfig 及びbek を含め、
細胞外領域に免疫グロブリン様反復配列を同様に持って
いるけれども、数としては３回だけであり、10−19側鎖
のキナーゼインサート配列がチロシンキナーゼセグメン
トの対応する部分に位置している。
【０１３４】RTKリガンドは細胞内で複数の形質発現応
答を誘導し、様々な細胞種で細胞周期の進行、 DNA合
成、細胞増殖を生じさせる。リガンド結合によって、様
々な細胞膜反応が開始され、イオン輸送やグルコース輸
送、細胞膜キナーゼ、ピノサイトーシス、細胞膜の波打
ち、そしてそれ以外の細胞骨格や形態的な変化がその中
に含まれる。解糖系やポリアミン合成、Ｓ６リボソーム
タンパク質のリン酸化を含む一定数の細胞質内経路の活
性化によって、このような応答は平行して行なわれる。
リガンド結合後に、特定の遺伝子（c-myc やc-fosなど)
の転写パターンの変更が数分以内に検出され、タンパ
ク質やRNA, DNAなどの高分子合成の増加が３−20時間内
に観察される。PDGFは独自の能力を持ち、ホスファチジ
ルイノシトールの代謝回転を促進するプロテインキナー
ゼＣ、およびタイプＥプロスタグランジンを合成するプ
ロテインキナーゼＡを活性化する。
【０１３５】レセプター機能の正確な制御の重要性が、
レセプター由来癌遺伝子に発見された様々な種類の構造
変異体が常に活性化され、結果として分子制御機構の破
壊およびレセプターシグナルの変更をもたらす事実から
主張された。ヒト癌に見られる最も一般的な細胞障害
は、レセプターの過剰発現と関連した自己分泌活性を含
む。沢山の癌および癌細胞株では、PDGF-A鎖やPDGF-B
鎖、PDGFレセプターポリペプチドを含み、増殖因子とそ
のレセプターが共に発現されていることが見つかってい
る。自己分泌レセプター活性化は、正常な成長制御を破
壊する一つの筋書きを示している。基本的に、チロシン
キナーゼ活性を持つ全てのレセプターは、発癌の潜在性
を秘めている。突然変異を誘発する更に多くのタイプ
が、レセプターチロシンキナーゼの過剰発現のような特
定の例と同様に、動物やヒトの癌で検出されることが予
期される。正常な細胞代謝やシグナル伝達のそのような
欠損の理解と制御が、癌の診断や治療に重要な役割を演
ずるだろう。
【０１３６】リガンドによって活性化された場合、PDGF
β−レセプターはチロシン側鎖にリン酸化を受ける。EK
and Heldin (1982) J.Biol.Chem. 257 ：10486 やFra
cklton et al. (1981) J.Biol.Chem. 259：7909, Kazla
uskas and Cooper(1989) Cell 58 ：1121, Yarden et a
l. (1986) Nature 323：226-232 を参照すること。この
“自動リン酸化”反応の機構は、レセプターのダイマー
形成をリガンドが誘導し、ダイマーのそれぞれ２本のポ
リペプチド鎖が他の鎖をリン酸化するリン酸基転移反応
に依存すると考えられる。刺激されたPDGFレセプターの
主なリン酸化部位はチロシンキナーゼドメインのカルボ
キシル末端部に位置し、ヒトおよびマウス両方のタイプ
Ｂレセプターのtyr(825)、およびキナーゼインサート領
域のヒトおよびマウス両方のタイプＢのtyr(719)で、こ
れはキナーゼをコードする配列を２つの部分に分離して
いる。自動リン酸化されるその他の部位がまだ発見され
ていないことは、十分に可能性がある。
【０１３７】リガンドに誘導されたレセプターの自動リ
ン酸化による結果の１つは、レセプターの細胞内領域の
立体構造の変化であると思われる。このような活性化さ
れた状態では、シグナル伝達に大変重要な何種類かの細
胞質分子とレセプターは物理的な相互作用が可能であ
る。
【０１３８】活性化によって、様々なタンパク質のチロ
シンリン酸化と複合体の形成が達成される。最初に述べ
るべきであるのは85kDタンパク質で、PIキナーゼと推定
され、ｐ81と見做されるタンパク質と同一であり、Kapl
an et al.(1987) Cell 50 ：1021を参照すること。その
後、一定数のその他の蛋白質がPDGFレセプターと複合体
を形成し、PDGFの刺激でチロシンリン酸化を受けること
が示されている。その中には、複合体で活性化されるセ
リン／トレオニンキナーゼRaf-1;Morrison etal.(1989)
Cell 58 ：649-657 を参照や、ホスホリパーゼＣ−
γ；Morrison etal.(1990) Mol.Cell.Biol.10：2359-23
66を参照、ras 活性の制御に関与するGTPase活性化タン
パク質である GAP；kaplan et al.(1990) Cell 58 ：11
21-1133を参照、が含まれる。PDGF処理により、それら
タンパク質のいくつかのキナーゼ活性が増加する。
【０１３９】最近、３種類のsrc ファミリーのチロシン
キナーゼ(pp60-c-src,p59-fyn, pp62-c-yes)とｐ81、PD
GFレセプターとの間に一時的な複合体形成が発見され
た。更に、PDGF処理によってそれらタンパク質のチロシ
ンキナーゼ活性が刺激され、src ファミリーキナーゼが
PDGFとの応答に何らかの役割を担っていることが示唆さ
れる。チロシン側鎖のリン酸化は標的タンパク質の持つ
細胞分裂能力を活性化すると思われ、それは酵素活性を
増強させる、あるいは他の細胞質タンパク質との相互作
用を変更させることによって生ずる。
【０１４０】SH２システムは、PDGFレセプターに適用で
きる特有のメカニズムと特性に対して、可能と思われる
指針を与える。ある種の非レセプターチロシンキナーゼ
では100アミノ酸程度の保存された非触媒領域を共有し
ており、 srcホモロジー領域２（SH２）ドメインと呼ば
れる。Fpおよび SrcチロシンキナーゼのSH２ドメイン
は、多分に隣接するキナーゼドメインと相互作用して制
御すると考えられ、キナーゼドメインによりリン酸化さ
れたタンパク質との結合サイトを形成すると考えられ
る。
【０１４１】ホスホリパーゼＣ−γ（PLC-γ）およびp2
1-ras GTPase活性化タンパク質(GAP) は、２つの隣接し
たSH２ドメインを持つ。最近の研究では、SH２ドメイン
が GAPやv-Crk, p60-c-srcのようなタンパク質に対して
特定のチロシンリン酸化リガンドとの複合体形成能力を
与えることが示された。このような結果とPDGF-Rとの関
連は、未だに不明確である。具体的なPDGFレセプターで
は、リガンドにより活性化されたPDGFレセプターがPLC-
γおよびRaf-1, 85kDa PI-3キナーゼを含むシグナル分
子複合体形成を引き起こす。
【０１４２】レセプター介在タンパク質として最初に同
定されたシグナル分子は、ホスファチジルイノシトール
−３′キナーゼ（PI３キナーゼ）であった。この酵素は
元々ポリオーマミドルＴ抗原やc-src タンパク質、形質
転換v-src タンパク質と免疫沈降で共沈するキナーゼと
して発見された。PI３キナーゼ活性もホスホチロシンで
あり、PDGFで活性化された細胞のライセートからレセプ
ターにより免疫沈降された。細胞増殖の調節におけるPI
３キナーゼの役割はまだ決定されていない。けれども、
この酵素は沢山の増殖因子から調節を受け、増殖因子処
理細胞にはイノシトール環の３位にリン酸化を受けたホ
スホイノシチドやイノシトールリン酸が高水準で含まれ
る。PI３キナーゼと結合しないミドルＴ抗原やPDGFレセ
プターの変異体は、細胞分裂活性を消失している。PI３
キナーゼ活性の原因であるタンパク質はまだ十分に特定
されていない。しかし、ミドルＴ／c-src 複合体および
PDGFレセプターと免疫沈降で共沈する実験の81−85kDタ
ンパク質の存在とその酵素活性が緊密に関係しているこ
とから、85kDタンパク質がPI３キナーゼであるかキナー
ゼの重要なサブユニットであることを強く示唆してい
る。
【０１４３】PDGFレセプターの限定領域がPI３キナーゼ
との相互作用を調節する能力を持ち、キナーゼインサー
ト（KI）領域を欠失している変異タイプB PDGFレセプタ
ーの分析から証明された。このレセプター変異体（ΔK
I）は細胞増殖の刺激およびPI３キナーゼとの結合能力
を失っているが、チロシンキナーゼ活性やホスホリパー
ゼＣを経由するPI加水分解を含めたPDGF結合に対するい
くつかの応答を刺激した。最近の研究では、リガンド活
性化ΔKI変異レセプターはPI３キナーゼとの結合性は失
っているけれども、PLC-γ及び c-Raf-1タンパク質とは
野生型のレセプターよりも強固に結合することが示され
ている。しかし、変異レセプターは c-Raf-1のチロシン
側鎖をリン酸化できず、PLC-γの結合にはレセプターの
チロシンリン酸化が要求される。ヒトタイプB PDGFレセ
プター変異体は、キナーゼインサートドメインに１ヵ所
のリン酸化部位を持っており、それはヒトタイプＢレセ
プターと同様にtyr(719)であったが、フェニルアラニン
に置換された場合には同様にPI３キナーゼとの結合性を
失った。これらの実験は、PI３キナーゼが直接tyr(719)
を含むキナーゼインサート領域に結合するのか、あるい
はキナーゼインサート領域と立体的に依存したレセプタ
ーの他の部分が結合反応に含まれるのか、いずれかを示
している。
【０１４４】タイプB PDGFレセプターとPI３キナーゼ間
の相互作用を直接研究するために、in vitroシステムを
設定した。このシステムでは、PI３キナーゼとPDGFレセ
プターの相互作用を阻害する目的で、キナーゼインサー
トドメインのレセプター配列に由来する合成ペプチドの
能力を試験することができた。相互作用を阻害できたの
は、tyr (719) を含むキナーゼインサートドメインの高
度に保存された領域を示すチロシンリン酸化ペプチドで
あった。しかし、PI３キナーゼとPDGFレセプターの結合
を阻害するペプチドは、チロシンがリン酸化された場合
に限定された。配列を変更したペプチドでは、チロシン
をリン酸化しても、阻害活性は認められなかった。これ
ら研究から、特定配列にあるホスホチロシンが細胞質シ
グナル分子の結合に認識部位を与えていることが示され
た。
【０１４５】in vitroシステムはPDGFレセプターとPI３
キナーゼの相互作用の研究に使用された。PDGFレセプタ
ーと結合するホスホプロテインは、3T3細胞をPDGFで刺
激し、抗−タイプB PDGFレセプター抗体で細胞ライセー
トを免疫沈降し、免疫沈降物中のリン酸化されるレセプ
ター結合タンパク質を検出するために免疫沈降物の分析
を行なった。図１ａ“＋”を参照すること。これらのホ
スホプロテインには、85kDa タンパク質と最近PI３キナ
ーゼ活性と関連するとされる110kDaタンパク質が含まれ
た。図１ｃを参照すること。in vitro実験では、タイプ
B PDGFレセプターが昆虫細胞で発現されており、部分精
製され、抗−レセプター抗体とPtroteinA Sepharoseを
使って固定された。このレセプターはin vitroで自動的
にリン酸化され、従ってレセプターのリガンド活性化状
態を模倣する立体構造を持つと思われた。密度制限され
たBALB／c 3T3 細胞の細胞ライセートの細胞質をその固
定化レセプターと混ぜ、結合体を十分に洗浄した。PI３
キナーゼ活性がレセプターと結合したタンパク質複合体
に発見された（図１ｄ）。
【０１４６】レセプター結合性ホスホプロテインは、
32P-ATPを用いたin vitroキナーゼアッセイで検出され
た。図１ｂの“−”を参照すること。見かけ上の分子量
が140kD, 120／110kD(時々ダブレットとなる）、85kD,
74kDの、少なくとも４種類のレセプター結合性タンパク
質が放射性標識された(160kD及び 150kDはそれぞれbacu
lovirusで発現されるレセプターとその前駆体であ
る）。140kDのバンドは以前PLC-γと同定されており、7
4kDのバンドにはraf-1 キナーゼ及び多分に他の分子が
同様に含まれる。85kDのバンドと一緒に移動する85kDタ
ンパク質は、PDGF刺激細胞から調製した細胞ライセート
の抗−ホスホチロシン免疫沈降では、これまでPI３キナ
ーゼであると考えられていた。 baculovirusの発現レセ
プターと結合する85kD及び 110kDタンパク質は、銀染色
解析でも同様に観察されていた。細胞ライセートを固定
化キナーゼインサート欠損変異体と反応させた場合、PI
３キナーゼの結合が見られず、 110kD及び85kDホスホプ
ロテインが変異レセプターに結合しなかった。図２ａ及
び図２ｂを参照すること。このin vitroの結果は、この
変異レセプターがインタクトな細胞ではPI３キナーゼと
結合しないとする従来の指標と一致した。
【０１４７】ライセートを作成する前に 3T3細胞をPDGF
で刺激すると、in vitroでレセプターと結合可能なPI３
キナーゼの量が激減し（図１ｄ）、それに伴ってレセプ
ターと結合する85kD及び 110kDホスホプロテインも減少
した（図１ｂ“＋”レーン）。けれどもこの現象に対す
る説明は十分明確になっておらず、結果として細胞のPD
GF前処理がin vitroでのレセプターと細胞質タンパク質
との結合に影響を与えているため、結合はPDGFに制御さ
れる過程に特徴的であることが指摘される。
【０１４８】自動リン酸化されたPDGFレセプターは、in
vitroでジャガイモアシッドフォスファターゼ(PAP）に
よって脱リン酸化され、BALB／c 3T3細胞ライセート由
来のPI３キナーゼ及び84kDタンパク質との結合性を失う
（図３ｂ及びｃ）。この発見は、PDGFレセプターのリン
酸化がそれらのタンパク質が相互作用を行なうために必
要であったことを示している。
【０１４９】レセプターとPI３キナーゼの相互作用部位
を決定するために、リン酸化された合成ペプチドを作成
し、in vitroでレセプターと85kDタンパク質およびPI３
キナーゼ活性との結合を競合させた。従来の資料では、
キナーゼインサート領域がPDGFレセプターとPI３キナー
ゼ活性との結合に含まれることが示唆されていた。マウ
スとヒトPDGFタイプＡ及びタイプＢレセプターのキナー
ゼインサート領域の配列を精査し、特に配列のホモロジ
ーの高い20アミノ酸領域（全キナーゼインサート領域に
対して12％同一性で比較し、ヒトとマウスのPDGFタイプ
Ｂレセプターでは20個のうち８個が同一）を発見した。
マウスタイプB PDGFレセプター配列の 705から 724まで
のアミノ酸を持つペプチド（Y719）を合成した。このペ
プチド配列には２ヵ所のチロシン側鎖Y708とY719が含ま
れる。マウス配列の 719番目のチロシンは、ヒトタイプ
B PDGFレセプターのtyr(719)にも対応し、レセプターの
既知の自動リン酸化部位である。
【０１５０】この配列から派生した一連の合成ペプチド
のレセプターと85kD／PI３キナーゼ活性との相互作用の
阻害能力を決定するために、固定化レセプターと混合す
る前に 3T3細胞ライセートを様々なペプチドで反応させ
た。これら実験の結果が図４に示されている。図４ａの
最初のレーンには、ペプチドが存在しない条件で野生型
のレセプターと結合したリン酸化タンパク質が示されて
いる。矢印はPI３キナーゼ活性と共に精製される85kDタ
ンパク質を示している。その他のレーンには、Y719ペプ
チドの派生物が存在する条件でレセプターに結合したタ
ンパク質が示されている。表４を参照すること。レセプ
ターと結合する前に、 3T3細胞ライセートとリン酸化さ
れていないY719ペプチド（Y719）を予め反応させた場
合、レセプター結合タンパク質のパターンには変化が見
られなかった。対照的に 719位をリン酸化されたこのペ
プチドの派生物(Y719P）をインキュベーションに加えた
場合、85kDホスホプロテインの結合を阻害し（図４
ａ）、レセプターとPI３キナーゼ活性との結合を禁止し
た（図４ｂ）。719位に対応する位置にホスホチロシン
を持つけれども一次配列を変更されたこのペプチドの組
換え型は、85kDタンパク質の結合阻止に失敗し、レセプ
ターとPI３キナーゼ活性との結合も阻止できなかった。
【表１】 アスタリスク（*）はリン酸基の位置を示している。
【０１５１】14アミノ酸しか含まないY719ペプチドの短
縮型（Y719 short）とチロシン 708を含まない型も85kD
タンパク質の結合阻害を示し（図４ａ、レーン４）、レ
セプターへのPI３キナーゼ活性との結合を阻止した。驚
くべきことに、 719位にチロシンを持ち 708位にホスホ
チロシンを持つペプチドが、レセプターへのPI３キナー
ゼ活性との結合を阻止した（図４、レーン６）。この発
見は、チロシン 708がこれまでマップされなかったレセ
プターの自動リン酸化部位の一つである可能性を示唆し
ている。 708位と 719位の両方ホスホチロシンを持つペ
プチド(Y708P／Y719P)も85kDタンパク質の結合を阻害し
た（図４、レーン８）。 Y708Pの短縮型および Y719Pも
活性を阻害した（図４、レーン４及び９）。
【０１５２】レセプターと85kD及びPI３キナーゼ活性の
結合を阻止するために必要なペプチドの量を決定するた
め、 3T3細胞ライセートを様々な濃度のリン酸化ペプチ
ド(Y719P）と予め反応させた。図５に示されるように、
レセプターと85kDタンパク質（図５ａ）及びPI３キナー
ゼ活性（図６Ｂ）の結合を50％阻害するためには、５μ
Ｍ程度のY719で十分であった。 100μＭまでの濃度の非
リン酸化ペプチドでは、レセプターとPI３キナーゼ活性
との結合に影響を与えなかった。従って、 Y719Pペプチ
ドによるレセプターと85kDおよびPI３キナーゼの共通す
る阻害は、85kDタンパク質がPI３キナーゼ酵素のサブユ
ニットであるとする仮説を支持する。
【０１５３】次に、レセプターに結合するその他のシグ
ナル分子に対するペプチドの阻害能力を調べた。 3T3細
胞ライセートを Y719Pペプチドの存在下あるいは非存在
下で反応させ、その後にレセプターの免疫沈降を行なっ
た。レセプターとPLC-γおよび GAPの結合は、特異抗体
を用いたイムノブロット解析で決定し（図６）、これら
の分子が自動リン酸化レセプターと特異的に結合する従
来の研究を支持した。レセプターとそれらの分子の結合
は Y719Pリン酸化ペプチドでは影響を受けなかった。従
って、 Y719Pペプチドはレセプターと85kD／PI３キナー
ゼ活性の結合を特異的に阻害し、 GAPあるいはPLC-γと
レセプターの相互作用には影響しなかった。
【０１５４】レセプターと85kDタンパク質の相互作用を
性質を決定するために、修飾したウェスタンブロット法
を用いた、PDGFレセプターvaculovirusを感染させたSf
９細胞のPDGFレセプターを抗−レセプター抗体で免疫沈
降してin vitroで32Ｐ標識し、電気泳動で分離しニトロ
セルロースに転写された 3T3細胞ライセートのタンパク
質に結合するプローブとした。放射性標識PDGFレセプタ
ーは未刺激の 3T3細胞ライセートの85kDに直接結合した
（図７、レーン１）。PDGF処理 3T3細胞ライセートで
は、放射性標識PDGFレセプターと反応させても全く結合
が見られず（図７、レーン２）、PDGF刺激細胞ライセー
トの85kDタンパク質は固定化PDGFレセプターと結合でき
ないという発見（図１ｂ）と一致した。細胞ライセート
タンパク質を含むニトロセルロースペーパーを Y719Pペ
プチドと予め反応させると、放射性標識レセプターは85
kDタンパク質と結合できなかった（図７、レーン４）。
非リン酸化ペプチド（Y719）あるいは組換え型ペプチド
（Y719 scrambled）は、レセプターと85kDタンパク質の
結合に影響を与えなかった（図７、レーン３と５）。こ
の実験は85kDタンパク質を示した（図７、レーン３と
５）。この実験は直接85kDタンパク質がPDGFレセプター
に結合し、他の分子の存在を要求しないことを示した。
直接の結合反応にはチロシン 719を含むキナーゼインサ
ート領域の20アミノ酸セグメントを含むと思われこのセ
グメントのチロシンリン酸化が相互作用には必要である
と思われた。
【０１５５】これらの結果は、タイプB PDGFレセプター
の細胞内領域がシグナル伝達の役割を演じているような
分子と相互作用することを示している。レセプターとPI
３キナーゼやPLC-γ, GAP, raf -1のようなシグナル分
子の物理的な結合は、レセプターのチロシンがリン酸化
されたときにのみ生じる。図１ａを参照すること。レセ
プターとPI３キナーゼの結合に含まれるレセプターの領
域が限定された。短縮型ペプチドは、PI３キナーゼとリ
ン酸化レセプターのin vitroでの結合を阻害する目的で
使用された。結合を阻害するペプチドの最も妥当な説明
は、このペプチドがレセプターを模倣し直接PI３キナー
ゼに結合することである。このような方法で、これらは
拮抗的なアンタゴニストとして作用する。チロシンリン
酸化ペプチドだけが阻害活性を持つという観察から、ホ
スホチロシンが直接レセプターとPI３キナーゼの結合に
関係していることが示唆される。しかし、ホスホチロシ
ンを持つ組換え型のペプチドがPI３キナーゼと相互作用
しなかったことから、ホスホチロシン単独では結合に十
分ではない。従ってレセプターのこの部分の一次配列
が、レセプターとPI３キナーゼの結合に要求される構造
的情報に必須である。アミノ酸13個の短いペプチドがPI
３キナーゼと正常に結合する本来のレセプター領域を模
倣する構造的情報を十分に含んでいること（表４）は、
幾分驚くべきことである。
【０１５６】タイプB PDGFレセプターのチロシン 719
が、インタクトな細胞内と同様にin vitroでもレセプタ
ーの自動リン酸化部位の一つである。従って、チロシン
719付近のKIドメインの部分は、in vivo でのレセプタ
ーとPI３キナーゼの結合に直接含まれると思われる。こ
こに示される資料は、２個のチロシン側鎖のいずれかを
リン酸化(Y708PあるいはY719P)されたY719の派生物が、
in vitroアッセイにおいてレセプターとPI３キナーゼの
結合を効果的に阻害したことを示している。同様の配列
と相互作用が、適当なフラグメント配列による阻害に従
う。特に、リン酸化部位として知られている配列は、こ
れ以外の介在タンパク質との相互作用を阻害する類似体
を選択するために使用されるだろう。PI３キナーゼはc-
fms タンパク質およびミドルＴ抗原と結合することが知
られており、両方のタンパク質は共にin vivo でチロシ
ンがリン酸化されている。ミドルＴ抗原のリン酸化部位
（チロシン 315）は、この実験で使用されたY719ペプチ
ドある程度ホモロガスな配列である（10個のうち５個が
同一）。どのc-fms タンパク質のチロシンリン酸化部位
もY719ペプチドとは明確な類似性を示さなかった。しか
し、 Y719PペプチドはPI３キナーゼとc-fms タンパク質
の結合をin vitroで阻害した。従って、c-fmsタンパク
質の自動リン酸化部位はPDGFレセプターの相当するドメ
インと類似した二次構造を持つ領域である。
【０１５７】これらの発見は、シグナル分子が特定の配
列にあるホスホチロシンを認識することを示している。
キナーゼインサート欠失変異体とGAPやPLC-γ, c-raf-1
の相互作用のパターンと、 GAPおよびPLC-γとレセプタ
ーの結合を阻害するためにこの報告で用いられたペプチ
ドの能力欠如は、レセプターの異なった領域、多分に異
なった自動リン酸化部位を含む、が特定のシグナル分子
との結合に関与していることを示している。このような
分子とレセプターの結合はシグナル分子を局在化させ、
その活性を制御する。レセプターキナーゼによるその他
の細胞タンパク質のチロシンリン酸化は、シグナル分子
と結合するタンパク質としてそれらを標的にし、本発明
は天然本来のシグナルを効果的に模倣あるいは妨害する
方法および試薬作成のための材料を提供する。たとえ
ば、 hPDGFレセプターあるいは関連チロシンキナーゼタ
ンパク質のフラグメントは、それらの間および機能的に
関連するタンパク質の本来の相互作用を効果的に阻害す
る。ここに述べられたリン酸化インサートを持ち、構造
と機能共にホモロジーを示すその他の配列およびタンパ
ク質に関しては、Williams (1989) Science 243：1564
-1570 やYarden et al.(1986) Nature 323：226-232, G
enBankTMを参照すること。
【０１５８】本発見はKIセグメントの類似体を生産する
方法を導く。例えば、加水分解を受けない部分を持つ短
いペプチドは、リン酸化部位をスルフォン化部位に置換
することなどにより、しばしば作成される。あるいは、
構造的に十分にホモロジーを持つその他の有機分子が、
PI３キナーゼあるいはその他の機能調節タンパク質との
機能的相互作用のためにしばしば選択される。更に、ペ
プチドの一部がキメラ類似体あるいは修飾ペプチド、そ
の他の部分が相互作用に重要な類似構造の特徴を持つ有
機分子などが作成されるだろう。従って、特定の相互作
用的特徴を示す分子が利用可能になり、それらには天然
あるいは合成的に生成された化合物が含まれる。次の実
例を参照すれば、本発明はより良好に理解されるだろ
う。次の例は、例証を行なうために提示されるのであっ
て、制限を設ける為ではない。
【０１５９】実験条件 一般的に、標準的な DNA組換え技術が、種々の出版物に
述べられており、例えばSambrook et al.(1989) Molecu
lar Cloning ：A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory やAusubel,et al. (1987) Current Pr
otocols in Molecular Biology, vols.1and 2 and supp
lements, Wu and Grossman (eds.)(1987) Methods in E
nzymology Vol.53 (Recombinant DNA Part D)があり、
ここではそれぞれを資料として引用している。これらの
方法の間に見られる違いは、あったとしても、極めて小
さい。
【０１６０】Ｉ．ヒト腎臓λGT11 cDNA ライブラリー及
びヒト胎盤λGT10 cDNAライブラリーの検索 250,000プラークのヒト腎臓cDNAライブラリーをスクリ
ーニングするプローブとして、マウスPDGFレセプター(m
PDGF-R）タンパク質をコードする全長の DNA配列を使用
した。ニックトランスレーションを用いて12×108cpm／
μｇの比活性を持つプローブを作成した。30％フォルム
アミド、１×Denhardt's溶液、５×SSC,. 0.02Ｍリン酸
ナトリウムpH6.5 、 500μｇ／mlのサケ精子 DNAを含む
ハイブリダイゼーションバッファー中で、フィルターと
プローブ（105cpm／ml）を反応させた。40℃で14時間の
ハイブリダイゼーションの後に、フィルターを55℃で
0.2×SSC 及び 0.1％ SDSを用いて４回洗浄し、更に65
℃で 0.2×SSC を用いて２回洗浄した。
【０１６１】全長の mPDGF-Rプローブを用いた再スクリ
ーニングの後に、10個の陽性クローンを得た。個々のク
ローンを単離し、 EcoR Ｉ制限酵素を用いて制限酵素解
析を行なった。HK−６と命名した最も長いインサート
(2.3kb）を含むクローンの特徴を更に調べ、ジデオキシ
ターミネーター法で塩基配列を解析した。HK−６クロー
ンにはレセプターの3554塩基から5691塩基までとポリＡ
テールから９塩基を加えた塩基配列が含まれた。
【０１６２】2.3kbのHK-6 DNAから調製されたニックト
ランスレーション処理プローブを用いて、 250,000プラ
ークのヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングし
た。このスクリーニングでは厳密性の高いハイブリダイ
ゼーションで行なった（上述のハイブリダイゼーション
バッファーに50％フォルムアミドを添加）。フィルター
を５×105cpm／mlのプローブと14−16時間42℃で反応さ
せた。フィルターを65℃で 0.1％ SSC及び 0.1％ SDSを
用いて４回洗浄した。
【０１６３】HK−６プローブを用いた二次スクリーニン
グの後、７クローンを単離して EcoR Ｉ制限酵素を用い
て制限酵素解析を行なった。 4.5kbのインサートを含む
クローン（HP−７）を選択し、特徴を調べた。このクロ
ーンの塩基配列が表２に示されたおり、タイプＢヒトPD
GFレセプター(B-hPDGF-R）をコードしていた。
【０１６４】II．発現ベクターの作成 タイプＢヒトPDGFレセプターの完全なコーディング領域
を含む4.5kb DNA断片をHP−７クローンから EcoR Ｉ消
化により単離した。ゲルから精製された断片を、SV40発
現ベクター PSV7Cのポリリンカー領域にある EcoR Ｉサ
イトヘクローン化した。 pSV7d発現ベクターは、Univer
sity of California, Davis のP.Luciwによって得られ
たSV40の初期プロモーター領域（SV40の塩基配列5190−
5270）を含む pMLの派生物で、 EcoR Ｉおよび SmaＩ,
XbaＩ, SalＩの制限酵素認識部位とそれに続く３つ
の転写終了コドン(TAA）及びSV40ポリアデニレーション
シグナル（SV40の塩基配列2556−2770）を含む(Truett
et al. (1984) DNA ４：333-349)。HP−７クローンか
ら得られたcDNA配列を含む EcoR Ｉ断片を pSV7dの Eco
R Ｉサイトに挿入した。得られた発現ベクターでは、 B
-hPDGF−レセプター遺伝子がSV40プロモーターの転写制
御を受けた。
【０１６５】SV40プロモーターに対してPDGFレセプター
インサート(4.5kb）が正しい方向をむいていることを確
認するため、レセプター配列の573位と発現ベクターの
ポリリンカー領域を切断する SmaＩ制限酵素で陽性クロ
ーンを消化した。正しい転写向にレセプターを含むクロ
ーンからは 4.0kbインサートと、発現ベクターとレセプ
ター５′末端の 573塩基対を含んだ3.2kb断片を放出し
た。このプラスミドPSVRH5を、抗生物質ネオマイシンの
耐性を与えるPSV2neo プラスミドと一緒に細胞へ導入し
た。
【０１６６】III．細胞培養と CHO細胞への導入 U.C.S.F. Tissue Culture Facilityから入手した CHO細
胞のKI株を、10％ FCS(UCSF Tissue Culture Facilit
y）及びペニシリンとストレプトマイシンを含むHam's F
-12培地を用いて37℃と５％ CO2／95％ airの条件で培
養を行なった。pSVRH5プラスミドDNA(10μｇ）とpSV2ne
o （１μｇ）を１×106の CHO細胞に、Van der Eb et a
l. (1980), Methods in Enzymology (1980) 65：826-83
9 のカルシウム沈殿法を用いて導入し、導入DNAの分解
を防ぐために10μｇのクロロキノン二リン酸(CDP）を添
加した。12時間の培養後に細胞をトリプシン処理し、５
倍に希釈して再播種した。24時間後に、ネオマイシン類
似体の抗生物質G418(GIBCO)を 400μｇ／mlの濃度にな
るように培地に加えた。選択を２週間続けた後、独立し
たコロニーを取り出して24穴プレートに移した。コンフ
ルエント状態の培養に対してPDGFレセプターの存在を抗
−レセプター抗体を用いたイムノブロットで確認した。
このアッセイで陽性を示すコロニーを最終制限希釈法を
用いて単一細胞にクローン化した。
【０１６７】安定な形質導入クローンに対して、 RNAプ
ロテクションアッセイを用いた測定によりタイプB PDGF
レセプターメッセージの発現を試験し、抗−ホスホチロ
シン抗体を用いてPDGFで刺激されたレセプタータンパク
質の存在を検出した。
【０１６８】IV． CHO細胞でのB-hPDGF-R cDNAの発現 SV40初期プロモーターの転写制御を受けるヒトレセプタ
ー DNAを含むプラスミド DNAを導入した CHO細胞(CHO-H
R5）とマウスレセプター DNAを含む同様のプラスミドを
導入した CHO細胞(CHO-R18）を、Escobedo et al.(198
8) J.Biol.Chem.263：1482-1487 に以前示した方法で可
溶化した。 Escobedo et al. (1988) J.Biol.Chem.及び
Keating et al. (1987) J.Biol.Chem. 262：7932-7937
に以前報告したレセプターのカルボキシル末端領域の配
列を認識する特異的な抗体を用いて、抽出物をウェスタ
ンブロット解析で調べた。195kDaタンパク質が本来のレ
セプターであり、160kDaタンパク質がレセプターの前駆
体である。
【０１６９】形質導入細胞でのレセプタータンパク質の
発現は、レセプターの細胞内配列を認識する抗体を用い
て行なわれた。ヒトレセプターを最高水準に発現するク
ローンを以後の研究のために選定した。この形質導入細
胞は、以下の競合的結合研究で示されるように、125I-P
DGFで標識されるレセプターを持つ。
【０１７０】Ｖ．異なったフォームのPDGFとタイプＢレ
セプターの競合的結合 タイプＢレセプターサイトと競合するヒト組換えAAおよ
びBBホモダイマーの能力と、 125Ｉ標識PDGF（調製法は
以下に表示）の置換が調べられた。各ホモダイマーはイ
ースト発現システムで選択的に作成されてイースト培地
から精製され、その他の間充織細胞増殖因子を含まない
ため、従ってヒト発現システムに存在するかも知れない
因子による汚染の影響を回避した。
【０１７１】BALV／c 3T3 細胞と CHO形質導入細胞(CHO
-HR5）を、AAあるいはBBの濃度が増加する状態で 125I-
PDGFと反応させた。全細胞懸濁液中で、37℃45分間の結
合を行なった。Ficoll勾配遠心で未結合の放射性標識PD
GFを除去した。非特異的結合は、 CHO細胞を 125I-PDGF
と反応させることにより決定し、結合放射活性の25％を
占めた。結合研究は、形質導入細胞がレセプターと hPD
GFの相互作用を研究するモデルとして使用できることを
示した。特にこの研究では、形質導入されたタイプＢヒ
トPDGFレセプターが本来のマウスレセプターと機能的に
等しいことが、次の結果から示された。PDGFのAA及びBB
フォーム共にヒトレセプター形質導入物の 125I-PDGF標
識部位と競合した。形質導入されたタイプＢヒトPDGFレ
セプターと同様に本来のマウスレセプターは、BBフォー
ムの方がAAフォームよりも高い親和性を示した。イース
トで発現した場合、PDGFのAAフォームは劣った処理を受
けるらしく、形質導入細胞及びマウス 3T3細胞の両者に
対してBBフォームよりも低い親和性を与えた。競合パタ
ーンの一致は、本来のマウスレセプターと同様にAAフォ
ームが形質導入タイプＢヒトPDGFレセプターと相互作用
することを示し、これらのレセプターが機能的に等しい
ことを示した。
【０１７２】VI．PDGFレセプターチロシンキナーゼの活
性化 タイプＢレセプターチロシンキナーゼを活性化する組換
えAA及びBBホモダイマーとヒト部分精製 AB PDGFを研究
した。イースト由来AA及びBBホモダイマーのフォームと
血小板由来ABフォームは導入されたヒトレセプターの自
動リン酸化を刺激した。
【０１７３】BALV／c 3T3 細胞とヒトPDGFレセプターを
導入された CHO細胞 (CHO-HR5）を、異なるフォームのP
DGF（AA, BBおよびAB）の増大する濃度で反応させた。
引き続いて SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、リン酸化されたレセプターを抗−ホスホチロシン抗
体を用いたウェスタンブロットで同定した。
【０１７４】レセプタータンパク質は200kDa分子量マー
カーと一緒に泳動された。導入されたヒトレセプターの
自動リン酸化を刺激するために有効なそれぞれのフォー
ムの濃度は、本来のマウス 3T3レセプターあるいは形質
導入されたマウスレセプターに同様の自動リン酸化を与
える濃度と同等であった。
【０１７５】PDGFのAAフォームがタイプＢレセプターの
レセプターチロシンキナーゼを活性化することを、これ
らの結果は初めて示した。形質導入細胞を使用する以前
には、AAフォームが hPDGF活性を持つかどうか、あるい
はタイプＢレセプターでも単一レセプターがそれら全て
のPDGFフォームを認識できるのかどうかは示されていな
かった。更に、マウス 3T3細胞でPDGFに刺激されるチロ
シンキナーゼ活性に対応する野生型レセプターと機能的
に等しいタイプＢレセプターをヒトcDNAがコードするこ
とを示した。従って、形質導入細胞はPDGFで誘導される
マイトジェン反応を研究するモデルとして有用である。
【０１７６】VII． CHO形質導入細胞の RNA合成の割合 BALV／c 3T3 細胞とタイプＢヒトPDGFレセプターを導入
されたCHO細胞(CHO-HR5）を、飽和濃度にある３種類のP
DGFフォームで反応させた。ネガティブ及びポジティブ
コントロールとして、それぞれ未処理細胞と牛胎児血清
(FCS）で処理した細胞を使用した。 DNAへ取り込まれる
3Ｈ−チミジンの水準を、前述したように酸不溶性成分
の放射活性として決定した。
【０１７７】タイプＢヒトPDGFレセプターあるいはタイ
プＢマウスPDGFレセプターの CHO細胞への導入は、PDGF
感受性マイトジェン反応を与えた。全てのPDGFフォーム
は、タイプＢヒトPDGFレセプター導入細胞でも本来のレ
セプターを産生するマウス細胞でも DNA合成を刺激し
た。これらの資料は、Ａ鎖のホモダイマー及びＢ鎖のホ
モダイマーが、血小板由来ABフォームと同様に、タイプ
ＢヒトcDNA配列によってコードされるレセプターを通し
て作用するマイトジェンであることを示した。マウス 3
T3細胞や導入されたタイプＢヒトレセプターを含む CHO
細胞に対するこれらPDGFフォームのマイトジェン作用
は、機能的に等しいレセプターで反応が調節されたこと
を示した。
【０１７８】VIII．タイプA PDGFレセプターの発現と単
離 タイプＡレセプターが上述したタイプＢレセプターのよ
うに単離され、異なる点は違うプローブを使用したこと
とハイブリダイゼーション及びスクリーニングを厳密性
の低い条件で行なったことであり、次のような性質が示
される。特に、既に公表されているチロシンキナーゼの
アミノ酸配列と高度なホモロジーを持つタイプＢレセプ
ターチロシンキナーゼの領域が同定され、そのアミノ酸
配列はHRDLAARNであった。チロシンキナーゼ共通配列を
コードするオリゴヌクレオチドを作成し、次のような配
列を示した： GTT(G／C)CGXGCXGCCAGXTC(G／C)CGXTG
【０１７９】ここで、Ｇ／ＣはＧ又はＣのいずれかを示
し、ＸはＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれも使用できることを意
味している。ヒト胎盤λGT10 cDNAライブラリーの上述
したようなスクリーニングを、６×SSC, 0.1％ SDS, ５
×Denhardt's溶液を含むバッファーと42℃の厳密性の低
い条件で次のように行なった。52℃で２×SSC の洗浄を
行ない、フィルターのスクリーニングを行なった。タイ
プＡレセプターをコードするクローンを単離し、タイプ
Ｂレセプター遺伝子で示した方法で塩基配列を決定し
た。
【０１８０】タイプＡレセプター(A-hPDGF-R）をコード
する遺伝子の DNA配列とそこから推定されるアミノ酸配
列を表３上に示した。このベクターを、タイプＢレセプ
タークローンで述べたように、形質導入 CHO細胞に使用
した。ベクターがコードする配列の発現により、形質導
入 CHO細胞が３種類の全PDGFフォームと結合し、AAホモ
ダイマーと優先的に結合する、機能的なレセプターを産
生した。
【０１８１】IX． pSV-SRX1d発現ベクターの細胞外齧歯
類PDGF-R断片構造と齧歯類細胞外領域を用いたDUKX-B11
細胞の形質導入 分泌される齧歯類PDGFタイプＢレセプター（タイプB PD
GF-R) 細胞外領域（XR）を発現させるため、齧歯類PDGF
-RのcDNAクローンを変異させてコドン 500と 501の間に
StuＩ制限酵素認識部位を導入し、コドン 500をバリン
からアルギニンに変更した。 1.7kbの EcoRＩ− StuＩ
断片を、フレーム内プロリンコドンの次にＣ末端の停止
コドンを加えられたpIBI-25 (IBI) に挿入した。 1.7kb
のEcoRＩ− XbaＩ断片を pSV-7DHFRに転送し、そこでは
XR発現が SV-40初期プロモーターで制御され、アデノウ
ィルスメジャー後期プロモーターで制御される増幅用マ
ーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）転写ユニッ
トが含まれる。完全なプラスミドはシグナル配列とPDGF
-Rの最初の 499アミノ酸（細胞外領域）、続いてアルギ
ニン、プロリン、停止コドンをコードする。
【０１８２】cDNAの発現には、dhfr欠失 CHO突然変異細
胞のDUKX-B11を用いた。10cmの組織培養プレートで５μ
ｇの pSV-SRX1dプラスミドを用いてDUKX-B11細胞の形質
導入を行ない、10％透析仔牛血清と 200μｇ／mlプロリ
ン、 100Ｕ／mlペニシリン、100μｇ／mlストレプトマ
イシンを添加した核酸を含まないMEM-α(GIBCO）を用い
て発現の選択を行なった。コロニーを抽出し、コンディ
ションドメディウムに対して SDS電気泳動とレセプター
細胞外領域に対して作用するポリクローナルPDGF-R抵抗
（Ab77）によるウェスタンブロッティングを用いて解析
しスクリーニングを行なった。
【０１８３】メトトレキサートを用いた齧歯類細胞外領
域の発現の増幅 陽性の形質導入細胞を、最初に１，２，５，10nMとし
て、メトトレキサート濃度を増加しながら順に処理し
た。最高濃度にあるコロニーを、次にメトトレキサート
濃度を10倍(20, 50, 100nM) に上げて処理を行なった。
最高濃度にあるコロニーを再び取り出して更に高濃度の
メトトレキサート濃度で処理を行なった。それぞれの段
階にあるコロニーのコンディションドメディウムを SDS
電気泳動と抗−PDGF-R抗体（Ab77）を用いたウェスタン
ブロッティングで解析を行ない、細胞外領域タンパク質
の発現を調べた。最も大量に細胞外領域タンパク質を分
泌するメトトレキサート（５μＭ）耐性細胞を、DPXR
(DUK-PDGF-R細胞外領域) 細胞と命名した。O-glycanase
(Genzyme Co.）とN-glycanase (Genzyme Co.）を用い
て、細胞外領域タンパク質の酵素処理を行なった。簡単
に説明を行なうと、小麦胚芽アグルチニン(WGA) アフィ
ニティークロマトグラフィー（50nM、20mMリン酸ナトリ
ウム、pH 7.4）を用いて部分精製した細胞外領域タンパ
ク質を N-glycanase（10Ｕ／ml）を用いて一晩37℃で処
理し、更に O-glycanase（２mU／ml）で２時間処理し
た。次にサンプルを５分間煮沸し、 SDS電気泳動とAb77
を用いたウェスタンブロッティングで解析を行なった。
【０１８４】コンディションドメディウム 95％コンフルエントなDPXR細胞を、無血清 DME H21培地
で２回洗浄した。10％protein-free Serum Substitute
(UCSF Cell CultureFacility）を添加した４mlの DME H
21培地を10cm培養プレートに移した。様々なアッセイに
使用された齧歯類細胞外領域ポリペプチドを含むコンデ
ィションドメディウムを、特に指定のない限り、48時間
DPXR細胞を培養した後に回収した。
【０１８５】 125I-BB-PDGFの調製 BB-PDGF(Chiron Corporationからの贈り物）をヨウ素化
した。簡単に説明を行なうと、シリコン処理を行なった
ポリプロピレンチューブ内で 2.5μｇの BB-PDGFをロー
タリーエバーポレーターで処理した。 BB-PDGFを10μｌ
の 0.1Ｍホウ酸ナトリウム（pH 8.5）に溶解した。 125
Ｉ−モノヨード Bolton Hunter試薬(500μCi；Amersha
m)を窒素雰囲気で乾固した。前もって調製しておいた B
B-PDGFを乾燥 Bolton Hunter試薬に加え、15分間４℃で
反応させた。50μｇのクエンチ溶液(0.1Ｍホウ酸ナトリ
ウム、 0.2ＭグリシンpH 8.5）を反応混合物に加え、更
に10分間４℃で反応させた。１mg／ml BSA (ICNBiochem
icals）を含む 0.1Ｍ酢酸で平衡化した PD-10カラム (P
harmacia) に反応混合物全体を添加し、同一バッファー
で溶出した。
【０１８６】Ｘ．結合アッセイ PDGFレセプターポリペプチドの可溶性断片の生産、及び
それらを用いたアッセイに関して、Kimball and Warren
(1984) Biochim. Biophys.Acta 771：82-88やvan der
Schaal et al.(1984) Anal. Biochem. 140：48-55, van
Driel et al.(1989) J.Biol.Chem. 264： 9533-9538,
Heldin et al. (1988) EMBO J. 7：1387-1393, William
set al. (1982) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 79 ：5867-
5870,Williamset al. (1984) J.Biol.Chem. 259：5287-
5294 、そして特にOrchanskyet al. (1988) "Phosphati
dylinositol Linkage of a Truncated Form of the Pla
telet-derived Growth Factor Receptor" J.Biol. Che
m. 263：15159-15165に技術及び結果が報告されてお
り、従ってここではそれぞれの資料を資料として含め
る。特に Orchanskyの報告には、PDGFレセプターの細胞
外領域全体が、TMおよび細胞内領域と分離された後で
も、未だにPDGFリガンドと結合能力を保持していること
が示されている。
【０１８７】細胞全体の結合アッセイでは、 PBS／EDTA
（２mM）で浮遊させた２×104 Ｒ18細胞（PDGFタイプＢ
レセプター導入CHO細胞）を10μｌの血小板を殆ど含ま
ない血清と PBS／Hepes(25mM最終pH 7.4）で反応させ
た。12.5μｌから 200μｌのDPXR細胞コンディションド
メディウム（上述の方法で収集）を、最終容量を 250μ
ｌとして20から1.25倍希釈となるように結合混合物に加
えた。混合物を一晩４℃で攪拌し、 750μｌのFicoll勾
配(PBS中に28.5％ Ficoll-Paque (Pharmacia))を用いて
４℃で遠心した。上清を吸引し、細胞沈殿物の放射活性
をガンマカウンターで測定した。
【０１８８】BB-PDGFへの親和性を測定するため、細胞
外領域タンパク質をプラスチック表面に吸着させて固定
した。 WGAアフィニティークロマトグラフィー精製され
た50μｌの細胞外領域（約80nM、銀染色より推定）を10
mlの 25mM Tris-Cl, 75mM NaCl, 20mM NH4HCO3、pH 7.5
溶液で希釈し、 100μｌづつを96穴 ELISAマイクロタイ
タープレート(Dynatech Products Co.）の各ウェルに分
注した。４℃で一晩の反応後、そのプレートを１回洗浄
し 100mM NaCl, 25mM Hepes, pH7.35に溶解した 0.5％
ゼラチンで３時間４℃でブロックした。次にプレートを
結合バッファー(0.3％ゼラチン、100mM NaCl, 25mM Hep
es, pH7.35）で２回洗浄した。125I-BB-PDGFおよび／あ
るいは未標識のBB-PDGFを最終容量 100μｌとなるよう
にウェルに加え、プレートを４℃で16時間反応させ、恒
常状態の結合とした。プレートを再び結合バッファーで
３回洗浄し、ガンマカウンターで測定するために200μ
ｌの１％ SDS, 0.5％ BSA溶液を用いて抽出した。
【０１８９】架橋実験 特に WGAクロマトグラフィーで精製された細胞外領域ポ
リペプチド（25μｌ，〜50nM）と 0.2μCiの125I-BB-PD
GF（最終濃度２nM）および各濃度の未標識 BB-PDGFを、
最終容量を 100μｌに調整して４℃３時間反応させた。
次に細胞外領域タンパク質とリガンドを、１mM bis (su
lfosuccinimidyl) suberate (BS3)(cat. ＃21579, Pier
ce Chemicals, Rockford, Illinois）を用いて室温で30
分間の架橋を行なった。 25mM TrisバッファーpH 7.4を
添加して５分間放置し、反応を停止した。レセプター抗
体（Ab77）を用いて細胞外領域タンパク質を免疫沈降
し、 SDS電気泳動で解析した。
【０１９０】自動リン酸化アッセイ 細胞外領域タンパク質（１ml）を含むコンディションド
メディウムを BB-PDGFと４℃で３時間反応させた。混合
物を静止期のヒトPDGF A−レセプター導入 CHO細胞ある
いはBALV／c 3T3 細胞の単層細胞シートを含む Falcon
６穴組織培養プレート（１ml／ウェル）に加えた。細胞
と混合物を10分間37℃で反応させ、次に血清を含まない
DME培地で洗浄し、Ripand溶解バッファーで溶解した。
細胞ライセートを SDS電気泳動と抗−ホスホチロシン抗
体を用いたウェスタンブロッティングで解析した。
【０１９１】マイトジェン活性 BALV／c 3T3 細胞を96穴組織培養プレートで３日間培養
し、Ｑ−培地（１mg／mlインシュリン及び２μｇ／mlト
ランスフェリン、0.5mg／ml BSAを含むDMEM）で24時間
処理し静止期を作成した。細胞外領域タンパク質を含む
コンディションドメディウムを新鮮なDME H21培地を用
いて２倍の連続希釈を行ない、２nM BB-PDGFと４℃で３
時間反応させた後、BALV／c 3T3 細胞に加えた(200μｌ
／ウェル）。細胞を37℃で18時間培養した。１μCiの
〔 3Ｈ〕−チミジン（50μｌ）を各ウェルに加え、４時
間放置した。細胞を冷 PBSで２回洗浄し、冷トリクロル
酢酸溶液(TCA, ５％）で固定した。沈殿した細胞破砕物
を十分に冷 TCA（５％）で洗浄し、シンチレーション測
定のために0.25Ｎ HaOH 溶液に溶解した。
【０１９２】ＸＩ．ヒト細胞外領域 ヒトレセプターに対する構成方法や発現、可溶性細胞外
レセプター断片の切断あるいは欠失類似体生理学的効果
の決定は、ここに述べられた核酸やポリペプチド、その
他の試薬類を用いて行なわれた。
【０１９３】ヒト欠失および切断構成体 PDGF-R構成体 Mp18PRを作成するために、ヒトタイプ B hPDGF-Rの3.9k
b EcoR Ｉ− Hind III cDNA 断片を M13Mp18の EcoR
Ｉ− Hind III サイトにサブクローンした。技術に関し
ては、この資料に引用してあるManiatiset al., Molecu
lar Cloning ：A Laboratory Manual (1982), Cold Spr
ing Harbor, N.Y.を参照すること。サブクローニングの
認識を、制限酵素切断解析と Sanger et al. (1977) Pr
oc.Nat'lAcad.Sci. USA 74 ：5463に述べられているジ
デオキシチェインターミネーションシークエンシングを
用いて行なった。in vitro変異に用いるオリゴヌクレオ
チドは Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol., 1
54：367 の方法に従って作成した。オリゴヌクレオチド
を用いたMp18PRのin vitro欠失変異体を作成する戦略に
関しては、図８に概略を示した。簡単に説明すると、欠
失変異により可溶性タイプB hPDGFレセプター細胞外領
域を作成するためにオリゴヌクレオチドを設計した。ヒ
トPDGFレセプターの適当な領域に合致する変異オリゴヌ
クレオチドを、欠失体を生成するために使用した。変異
作成全体を通してアンチセンス鎖を使用した。ＰΔ１の
変異にはテンプレートとしてMp18PRを用いた。ＰΔ１は
41bpのオリゴマーをＤ５のリシン499（K499）の後にあ
る TAG停止コドンに導入され、トランスメンブレン（T
M）および細胞内キナーゼドメイン（Ｋ）を除去されて
おり、 Mp18PΔ1 を生成した。ＰΔ１は 530aa 148aa前
駆タンパク質をコードしている。
【０１９４】ヒトPDGFレセプター構成体はその後、Taka
be et al.(1988) Molec. Cell Biol. 8：466 に述べら
れている pCDL-SRα296 の派生物pBJ1の EcoR Ｉ− Hin
d IIIサイトにサブクローンされ、Southern andBerg (1
982) J.Mol.Appl.Gen., 1：327 に述べられている pSV2
NEOと一緒にチャイニーズハムスター卵巣(CHO）細胞に
導入された。構成体の機能は、次のように示された。0.
33nM PDGF BBリガンドサンプルを４℃で１時間以下の条
件で前処理した。
【０１９５】１．ポリクローナル抗−ヒトPDGF抗体（こ
の抗体はヒト PDGF AAおよびPDGF BB, PDGF ABを認識す
る） ２．18nM(PDGF BBに対しモル比で60倍）ヒトタイプB PD
GFレセプター ３．レセプターと抗体を含んだリン酸平衡化生理食塩水
(PBS）、あるいは ４．リガンドだけを含むリン酸平衡化生理食塩水(PBS） 実験の重複セットで、0.33nM PDGF AAを３種類の前処理
条件即ち上述２．３．４．で処理した。ヒトタイプB PD
GFレセプターは余りPDGF AAを認識しないけれども、以
前としてこのリガンドがNIH 3T3細胞に発現されるヒト
タイプA PDGFレセプターを活性化するため、ヒトタイプ
B PDGFレセプター及び PDGF BB−依存性活性化に対する
細胞毒性などの非特異的で一般的な細胞効果のコントロ
ールとなる。前処理した材料は最終容量を 0.5mlとし
た。それらを６ウェル組織培養ディッシュの各ウェルに
加え、各ウェルには４℃に冷却された NIH 3T3細胞の血
清飢餓（静止期）にあるコンフルエントレイヤーが含ま
れた。細胞と反応混合物を攪拌、即ち４℃で２時間揺り
動かした。次に４℃のリン酸平衡化生理食塩水で２回洗
浄した。１ウェル当たり40μｌの125mM Tris (hydroxym
ethyl) amino methane (Tris), pH 6.8, 20％（ｖ／
ｖ）グリセリン、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS）、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、
and 0.001％ブロモフェノールブルー(SDSサンプルバッ
ファーとして知られる）を加え、次に40μｌの100mM Tr
is, pH 8.0、30mMピロリン酸ナトリウム、50mMふっ化ナ
トリウム、５mMエチレンジアミン４酢酸（EDTA）、５mM
ethylenebis (oxyethylenenitrilio)tetraacetic aci
d，１％（ｗ／ｖ） SDS、 100mMジチオトレイトール、
２mMふっ化フェニルメチルスルフォニル（PMSF）、 200
μＭバナジン酸ナトリウム溶液を細胞に加えた。細胞は
可溶化され、その可溶化物に更に40μｌの SDSサンプル
バッファーを加えた。この材料を５分間煮沸し、 7.5％
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの単一
サンプルウェルに添加した。細胞性タンパク質を電気泳
動で分離した。
【０１９６】分離されたタンパク質をニトロセルロース
へ電気的に転写し、得られた“ウェスタンブロット”を
0.5％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、５mg／mlウシ血清ア
ルブミン、50mM Tris 、pH 7.5溶液（ブロッキングバッ
ファーと命名）を用いて室温で20分間の処理を３回繰り
返した。ブロッキングバッファーで１／1000希釈したPY
20（市販されているホスホチロシンに対するモノクロー
ナル抗体〔ICN 〕）を用いてブロットを４℃で一晩反応
した。ブロットを３回洗浄し、それぞれ室温で20分間ブ
ロッキングバッファーを使用した。ブロットに対して４
μCiの125I-Protein A〔Amersham〕を含むブロッキング
バッファーを用いて室温で１時間反応させ、３回の洗浄
を室温でそれぞれ20分間ブロッキングバッファーを用い
て行なった。１枚のインテンシファイングスクリーンを
用いてブロットをＸ線フィルムに−70℃で48時間感光さ
せ、通常の試薬で現像を行なった。
【０１９７】ＸII．PDGFプレートアッセイ ポリスチレンマイクロタイタープレート（Immulon, Dyn
atechLaboratorise）をタイプＢヒトPDGFレセプターの
細胞外領域断片（上述）でコートし、１ウェル当たり10
−100ng のこのタンパク質を 100μｌの25mM Tris, 75m
M NaCl、pH7.35溶液で添加した。このタンパク質は形質
導入 CHO細胞で発現され、無血清培地(GIBCO MEMα)に
0.2−１μｇ／ml、総タンパク質量として 150−300 μ
ｇ／mlの濃度で回収された。ヒトタイプB PDGFレセプタ
ーの細胞外領域断片の濃縮と部分精製を行なうため、小
麦胚芽アグルチニン−Sepharoseへ４℃で培地を（48ml
／ｈで）１mM PMSF の存在下に添加した。十分な洗浄
後、タンパク質を 0.3Ｍ Ｎ−アセチル−グルコーサミ
ン、25mM Hepes, 100mM NaCl, 1mM PMSF、pH 7.4溶液で
溶出した。この分画を0.15Ｍ重炭酸アンモニウムpH 7.9
溶液で平衡化されたSephacrylS-200 HR(Pharmacia）に
添加した。レセプター（３−10ng／μｌ）を含む分画を
SDS電気泳動とレセプター細胞外領域のペプチドに結合
するウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロ
ッティングで検出した。これらの分画（３−10ng／μ
ｌ）を用いて、上述したようにマイクロタイタープレー
トのコーティングを行なった。次にウェルから溶液を除
去し、それぞれ 200μｌの 0.5％ゼラチン（Bio-Rad, E
IA grade）、25mM Hepes, 100mM NaCl、pH 7.4溶液を用
いて１回洗浄し、 150μｌの同一溶液で４℃で３時間放
置した。ウェルから溶液を除去し、 0.3％ゼラチン、25
mM Hepes, 109mMNaCl、pH 7.4溶液（各 150μｌ）で２
回洗浄した。プレートを氷の上に置き、90μｌのこの
0.3％ゼラチン溶液を各ウェルに加えた（非特異的結合
の試験に用いるウェルには80μｌだけを加え、次に10μ
ｌの0.01mg／ml未標識PDGFを含む 0.3％ゼラチン溶液を
加えた)。ジヨード Bolton Hunter試薬（Amersham）を
用いて 52,000CPM／ngとなるように４℃でPDGF BB (Amg
en）をヨウ素化し、約 40,000CPMを１ウェル当たりに加
え、10μｌの 0.024％ BSA、 0.4％ゼラチン、20mM Hep
es, 80mM NaCl、70mM酢酸、pH 7.4溶液とした。プレー
トを４℃で４時間放置し、その後それぞれ 150μｌの
0.3％ゼラチン、25mM Hepes, 100mM NaCl、pH 7.4溶液
を用いて４℃で３回洗浄した。ウェルに 200μｌの１％
SDS, 0.05％ BSA溶液を加えて残存する結合放射活性を
可溶化し、ガンマカウンターで測定した。非特異的結合
を 150倍過剰の未標識PDGF BB (Amgen) の存在下に決定
し、総結合125I-PDGF の約７％であった。
【０１９８】これらの研究は他の増殖因子混入を除去し
た増殖因子の調整を利用することを可能にし、測定され
たPDGF反応の全体をこの単一形質導入レセプター DNAに
寄与させるレセプター発現システムの使用を可能にし
た。
【０１９９】ＸIII．細胞内領域 細胞培養および組換え vaculovirus BALB c／3T3 細胞のクローンA31, C.D.Scher, Childre
n's Hospitalof Philadelphia, PA.から入手を、10％牛
血清とペニシリン及びストレプトマイシン（各50μｇ／
ml）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で
培養した。Spodoptera fruqiperda (Sf9) 細胞（M.Summ
ers, Texas A&M, TXより）を、10％牛胎児血清、 3.3ｇ
／ｌイーストレイト、 3.3ｇ／ｌラクトアルブミン加水
分解物及びペニシリンとストレプトマイシン各50μｇ／
mlを添加した Grace's培地で増殖させた。組換えタイプ
B PDGFレセプター及びPDGFタイプＢレセプターΔKI変異
vaculovirusベクターを通常方法に従って作成した。組
み替え vaculovirusを感染後48−60時間のSf９細胞の上
清から回収し、感染多重度(MOI）を１とした。
【０２００】抗体、マイトジェン、ペプチド 細胞外領域に位置する合成ペプチド（アミノ酸 425−44
6)を認識する抗−タイプB PDGFレセプター抗体（Ab77）
を使用した。モノクローナル抗−PLC-γ抗体はS.G.Rhe
e, NIH, Bethesda, MDから親切にも提供を受け、抗−GA
P 抗体はF.McCormick, Cetus Corp., Emeryville, Cali
forniaから提供を受けた。組換え BB-PDGFはChiron Cor
p.Emeryville, Californiaに所属するC.G.Nascimentoか
ら提供を受けた。結合実験に使用したペプチドは従来の
ペプチド合成装置で調整し、チロシンリン酸化ペプチド
を合成するためにリン酸化チロシン（N-Boc-Tyr-O-〔PO
3Bzl2〕, Peninsula Laboratory, Belmont, Californi
a）を使用した。
【０２０１】結合アッセイ in vivo 結合を Morrison et al. (1989) Cell 58 ：64
9-657 に従って行なった。血清飢餓培養BALB／c 3T3 細
胞(107細胞）を、２nM PDGF の存在下あるいは非存在下
で培養した。細胞ライセートを抗−レセプター抗体ある
いは抗−ホスホチロシン抗体を使って免疫沈降した。免
疫複合体を、PI３キナーゼ活性の存在を検出し、レセプ
ターに結合したタンパク質を決定するアッセイに使用し
た。in vitro結合実験を Morrison et al. (1989) ある
いは Morrison et al. (1990) Mol.Cell.Biol. 10 ：23
59-2366 に従って行なった。代表的には、 vaculovirus
発現タイプB PDGFレセプターを、感染 (MOI：10）後48
−60時間のSf９細胞から抗−レセプター抗体を用いた免
疫沈降で回収した。感染細胞を冷 PBSで２回洗浄し、１
mlの溶解バッファー（１％ NP-40, 20mM Tris (pH 8.
0), 173mM NaCl、10％グリセリン、２mM EDTA 、１mMふ
っ化フェニルメチルスルフォニル（PMSF）、アプロチニ
ン（0.15Ｕ／ml）、20μＭロイペプチン、１mMオルトバ
ナジン酸ナトリウム）を用いて４℃で20分間の振とうに
より溶解した。大部分の実験（図３の説明に示した場合
を除いて）では、免疫沈降されたレセプターをin vitro
で自動リン酸化するために、20mM Tris (pH 7.5), 20mM
MnCl, 100μＭ ATPを含むバッファー中に25℃で15分間
放置した。ライセートを13,000Xgで10分間遠心し、不溶
性物質を除去した。ライセートを抗−レセプター抗体
（１：500 希釈）と４℃で４時間反応した。レセプター
−抗体複合体をProtein-A Sepharose (Sigma) を用いて
沈殿させ、洗浄を順にRIPAバッファー(0.1％ SDSを含む
溶解バッファー）、洗浄バッファー１〔 0.5％ NP-40,
0.5Ｍ LiCl, 50mM Tris (pH 7.4) 〕、10mMTris (pH
7.4) を用いて行なった。PI３キナーゼ結合アッセイを
行なうため、固定化レセプターをBALB／c 3T3 細胞ライ
セートと４℃で３時間反応させた。免疫複合体を順に冷
PBS、 0.5％ NP-40, 0.5Ｍ LiCl and 50mM Tris (pH
7.4)溶液で洗浄した。ペプチドを使用する実験では、BA
LB／c 3T3 細胞ライセートをそのペプチド（50μＭ）と
４℃で30分間予め反応させておき、それから昆虫細胞シ
ステムに発現されるPDGFレセプタータンパク質と反応さ
せた。
【０２０２】in vitroキナーゼ及びPI３キナーゼ活性 in vitro プロテインキナーゼ活性を測定するため、免疫
沈降物をプロテインキナーゼバッファー（30mM Tris (p
H 7.4), 10mM MnCl2)と10μCiの〔γ-32P〕-ATP 3,000C
i／mmol中で25℃15分間反応させた。４×Laemmli 添加
ゲルバッファーを加えて反応を停止した。SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーを
用いてサンプルを解析した。PI３キナーゼ活性はKaplan
et al.(1986) Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 83 ：362-36
4 に示された方法で解析した。免疫複合体をPI３キナー
ゼバッファー（30mM Hepes (pH 7.3), 30mM MgCl2、 20
0μＭアデノシン、40μＭ ATP）及び0.2mg／mlの超音波
処理ホスホイノシトール（PI）、10μCi〔γ-32P〕-ATP
(3,000Ci／mmol）で25℃10分間反応させた。アデノシン
をPI３キナーゼアッセイに加えたのは、混入するPI４キ
ナーゼ活性を完全に阻害するためである。 100μｌの塩
酸を加えて反応を停止した。反応生成物をクロロフォル
ムで抽出し、薄相クロマトグラフィーで分離した。PIか
ら PIPへの変換を測定するため、 TLCプレートをＸ線フ
ィルムに２−３時間露光した。
【０２０３】レセプターの脱リン酸化 １mMオルトバナジン酸の存在下及び非存在下で、レセプ
ター免疫沈降物を４μｇのジャガイモアシッドホスファ
ターゼと30℃で30分間反応させた、 Morrisonet al. (1
989) を参照すること。 RAP処理後に免疫沈降物を１mM
オルトバナジン酸ナトリウムを含むRIPAバッファーで３
回洗浄し、それから 3T3細胞ライセートと反応させた。
【０２０４】PDGFレセプタープローブを用いた85kDタン
パク質の“ブロッティング” ニトロセルロースメンブレンに転写した細胞ライセート
タンパク質を用いて、PDGFレセプターと直接結合するそ
れらタンパク質の能力を解析し、その操作をニトロセル
ロースメンブレンに対して32Ｐ−標識PDGFレセプターを
プローブとして行なった。放射性標識レセプタープロー
ブを調製するため、 baculovirus−発現レセプターを10
6 Sf９細胞から免疫沈降した。免疫複合体を洗浄し、上
述の自動リン酸化によって標識した。標識レセプターを
免疫複合体から解離させるため、100℃の可溶化バッフ
ァー(0.4％ SDS, 100mM NaCl,２mM EDTA 、２mM β−
メルカプトエタノール、50mMトリエタノールアミン、pH
7.4）で繰り返し処理を行なった。抽出物を集め、β−
メルカプトエタノールを含まず10mMヨードアセトアミド
と１％Triton X-100を加えた可溶化バッファーで希釈し
た。 SDSポリアクリルアミド電気泳動とそれに続くオー
トラジオグラフィーによるこの物質の解析から、レセプ
ターが単独で存在することが呈示された。BALB／c 3T3
細胞ライセートを調製し SDS電気泳動を行なった。SDS
の非存在下でタンパク質をニトロセルロースフィルター
に電気的に転写した。フィルターを放射性標識PDGFレセ
プターと４℃で12時間反応させ、２％ Triton X-100 を
含みβ−メルカプトエタノールを含まない可溶化バッフ
ァーで洗浄した。ペプチド競合実験のために、フィルタ
ーを32Ｐ−標識レセプタープローブ及び 2.5μＭの指定
ペプチドと上述の方法で反応させた。
【０２０５】本明細書中のすべての文献および特許出願
は、それぞれの個別の文献および特許出願が特別にかつ
別個に参照により編入されるのと同程度に、参照により
編入される。本発明はいま完全に記載され当業者にとっ
て、これの多くの変更及び修飾が添付の請求の範囲の精
神および範囲から逸脱することなく可能であることが明
らかである。
【０２０６】
【配列表】
【０２０７】
【表２】
【０２０８】
【表３】
【０２０９】
【表４】
【０２１０】
【表５】
【０２１１】
【表６】
【０２１２】
【表７】
【０２１３】
【表８】
【０２１４】
【表９】
【０２１５】
【表１０】
【０２１６】
【表１１】
【０２１７】
【表１２】
【０２１８】
【表１３】
【０２１９】
【表１４】
【０２２０】
【表１５】
【０２２１】
【表１６】
【０２２２】
【表１７】
【０２２３】
【表１８】
【０２２４】
【表１９】
【０２２５】
【表２０】
【０２２６】
【表２１】
【０２２７】
【表２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は85kD／PI３キナーゼとタイプB PDGFレセ
プターとの結合を説明する。リン酸化タンパク質とPDGF
レセプター（ａおよびｂ）およびフォスファチジルイノ
シトール３′キナーゼ（PI３キナーゼ）活性（ｃおよび
ｄ）との結合が、完全な細胞（ａおよびｃ）とインビト
ロ（ｂおよびｄ）で研究された。完全な細胞の実験にお
いて、PDGF−刺激（＋）または対照細胞（−）が可溶化
され、レセプターは抗−レセプター抗体を使用して免疫
沈降された。レセプターが結合したリン酸化タンパク質
はレセプター−結合タンパク質複合体を MnCl2およびγ
32P-ATP でインキュベーションし、続いて SDSポリアク
リルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより検出し
た。PDGF−刺激レセプターは85kDおよび 110kDリン酸化
タンパク質およびPI３キナーゼ活性に結合したが未刺激
レセプターはそうではなかった。等量のレセプターを刺
激したおよび未刺激の細胞の溶解物から免疫沈降した。
インビトロ結合は、バキュロウィルス−発現レセプター
をPDGF−刺激（＋）または未刺激（−）細胞とインキュ
ベーションすることにより行った。レセプターが結合し
たリン酸化タンパク質（ｂ）およびPI３キナーゼ活性
（ｄ）を検出した。85kDタンパク質の位置を矢印で示
す。
【図２】図２は、インビトロで85kDタンパク質およびPI
３キナーゼと、野生型およびキナーゼ挿入欠損突然変異
体レセプターとの結合を説明する。未刺激の 3T3細胞か
らの溶解物を、野生型PDGFタイプＢレセプターまたはバ
キュロウイルス発現系を使用して調製した免疫沈降した
キナーゼ挿入欠損突然変異体レセプターと共に混合し
た。レセプター−結合タンパク質を含有する免疫沈降物
を徹底的に洗浄した。インビトロタンパク質キナーゼア
ッセイ（パネルａ）またはPI３キナーゼ活性は（パネル
ｂ）をタンパク質について行った。パネル（ａ）の第一
列は、細胞溶解物と混合していないバキュロウイルス−
発現レセプターのインビトロタンパク質キナーゼアッセ
イを表す。パネル（ａ）の第二および第三列の最上ふた
つのバンドは、バキュロウイルス−発現レセプター（第
二列）または突然変異したレセプター（第三列）からの
ものであり、ならびにそれぞれの前駆体である。矢印は
85kDタンパク質を指示する。
【図３】図３はPI３キナーゼ活性と85kDタンパク質との
結合に、レセプター自己リン酸化が必要であることを説
明する。PDGFレセプターは、野生型PDGFレセプター組換
えバキュロウイルスで感染させたSf９細胞から免疫沈降
した。リン酸化レセプターを含有する免疫沈降物を可溶
化した 3T3細胞溶解物とともにインキュベーションし
た。PI３キナーゼアッセイ（ａおよびｂ）、ならびにイ
ンビトロキナーゼアッセイ（ｃ）を行った。（ａ）PI３
キナーゼ活性とリン酸化PDGFレセプターとの結合は、ジ
ャガイモ酸性フォスファターゼ(PAP）または PAPにオル
トバナデートを加えた物とインキュベーションした。
【図４】図４は、85kDリン酸化タンパク質およびPI３キ
ナーゼ活性がレセプターと結合することをブロックする
ために、ペプチドの使用を説明する。表ＡＩに掲げられ
たペプチドは免疫沈降レセプターとのインキュベーショ
ンに先立って、未刺激の3T3細胞溶解物とともに予備イ
ンキュベーションされた。レセプター−結合リン酸化タ
ンパク質（パネルａ）およびレセプター−結合PI３キナ
ーゼ活性（パネルｂ）の検出は、図１および２のように
行われた。85kDタンパク質を矢印で示す。
【図５】図５はペプチド Y719Pの濃度依存性ブロッキン
グ活性を説明する。一連の濃度のペプチド Y719Pが、タ
ンパク質（パネルａ）またはPI３キナーゼ活性（パネル
ｂ）のバキュロウイルス−発現免疫沈降レセプターへの
結合のブロッキング能力を試験された。矢印は85kDリン
酸化タンパク質を示す。アッセイは図１，２および３に
記載されるように行われた。
【図６】図６はPDGFレセプターとPLC-γまたは GAPとの
結合が、 3T3未刺激溶解物とレセプターリン酸化ペプチ
ド、 Y719Pとの予備インキュベーションによっては影響
されないことを説明する。ペプチド／溶解物混合物を、
免疫沈降バキュロウイルス−発現レセプターと図１，
２、および３に記載されるようにインキュベーションし
た。レセプター複合体中のPLC-γおよび GAPの存在をPL
C-γおよび GAP抗体をプローブとしてイムノブロット分
析により測定した。“溶解物”と記した列において、 3
T3細胞の粗溶解物は対照としてイムノブロットされ、PL
C-γおよび GAPの電気泳動的位置を表した。
【図７】図７は、可溶性放射標識レセプターと固定化85
kDタンパク質（“レセプターブロット”）との結合を説
明する。バキュロウイルス−発現PDGFレセプターをレセ
プター抗体を使用して免疫沈降させ、レセプターをイン
ビトロで自己リン酸化により32Ｐ−標識した。可溶化さ
れた放射標識レセプターを使用して、対照（１，３，
４、および５列）またはPDGF刺激（２列）細胞からの S
DS−ポリアクリルアミドゲル分画溶解物を含有するニト
ロセルロースフィルターを釣り上げた。ペプチド競合実
験では（レーン３，４および５）、ペプチドが、放射標
識レセプタープローブと共にニトロセルロースフィルタ
ーに添加された。矢印は85kDタンパク質の位置を指示す
る。
【図８】図８は、可溶性 hPDGF-R細胞外領域のインビト
ロ生産を支配したオリゴヌクレオチドについての戦略を
説明する。使用した省略記号は： PR＝PDGFR ；完全 Ｐ＝PDGFR ；細胞外領域 TM＝トランスメンブラン領域 Ｋ＝キナーゼ Ｓ＝シグナル配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ｃ１２Ｎ 9/12 17/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 35/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 9/12 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/64 (72)発明者 ウィリアムス，ルイス ティー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94920, ティブロン，アベニダ ミラフロレス 114 (72)発明者 エスコベド，ジャイム エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，＃３，アッパー テラ ス 455 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 FB08 4B024 AA11 AA20 BA10 BA63 CA04 DA02 GA11 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ79 QR07 QR48 4C084 AA01 AA06 AA07 CA59 DB55 DC32 MA52 MA55 NA14 ZA361 ZA451 ZA511 ZA891 ZB261

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一タンパク質にリン酸化領域のペプチ
    ド類似体を加え、ここで該類似体は該第一タンパク質が
    第二タンパク質に結合することを阻害する、工程を含ん
    で成る、該第二タンパク質のリン酸化領域に結合する該
    第一タンパク質の生物活性を変調させる方法。
  2. 【請求項２】 第一分析において、分子の存在下でタン
    パク質を標的リン酸化ペプチドと接触させ；第二分析に
    おいて、分子の不存在下で該タンパク質を標的リン酸化
    ペプチドと接触させ；そして該分析を比較して該分子の
    該結合に対する効果を決定する、工程を含んで成る、標
    的リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を
    阻害できる分子を選択する方法。
  3. 【請求項３】 上記接触工程が連続して行われる請求項
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 リン酸化PDGFレセプターキナーゼ挿入領
    域ポリペプチドをPI３キナーゼに加え、それによって該
    ポリペプチドと該PI３キナーゼとの間の結合を行う工程
    を含んで成るPI３キナーゼ活性を変調する方法。
  5. 【請求項５】 試料をPDGFレセプターキナーゼ挿入領域
    ポリペプチドと実質的にホモロガスなリン酸化ポリペプ
    チドの類似体に接触させて、それによってタンパク質を
    特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる、工程を含
    んで成る、試料からPDGFレセプターキナーゼ挿入領域セ
    グメントに結合できるタンパク質を精製する方法。
  6. 【請求項６】 標識されたリン酸化PDGFレセプターキナ
    ーゼ挿入領域ポリペプチドを種々のタンパク質を発現す
    る細胞と混合し、これによって核酸を発現してリン酸化
    ポリペプチドに結合するタンパク質を生成するこれらの
    細胞を標識し、そしてこれらの標識された細胞を単離す
    る、工程を含んで成るPDGFレセプターに結合できるタン
    パク質をコードする核酸を単離する方法。
  7. 【請求項７】 PDGFレセプターに結合できる上記タンパ
    ク質がPI３キナーゼまたは c-fmsである請求項６に記載
    の方法。
JP2001298110A 1991-01-31 2001-09-27 ヒト血小板由来増殖因子レセプター Expired - Fee Related JP3710404B2 (ja)

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