JPH06505629A - ヒト　血小板由来増殖因子レセプター - Google Patents

ヒト　血小板由来増殖因子レセプター

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JPH06505629A JP4506295A JP50629592A JPH06505629A JP H06505629 A JPH06505629 A JP H06505629A JP 4506295 A JP4506295 A JP 4506295A JP 50629592 A JP50629592 A JP 50629592A JP H06505629 A JPH06505629 A JP H06505629A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １０、非−真菌から生じたグリコジル化酵素をさらに含む請求項９に記載の細胞 。
１１、上記セグメントをコードするヌクレオチドが操作できるようにプロモータ ーに連結されている請求項１に記載の核酸。
１２、上記ｈＰＤＧＦ−Ｒセグメントに融合できるヘテロロガスなポリペプチド をさらにコードする請求項１に記載の核酸。
１３、細胞中のＰＤＧＦ−誘導応答の量を対照細胞からの量と比較し、ここで該 ＰＤＧＦ−誘導応答は、該細胞をＰＤＧＦと接触させた後の細胞中のＤＮＡの合 成を測定することにより比較される工程から成る、ｈＰＤＧＦ−Ｒアゴニストま たはアンタゴニストとして機能する化合物の能力を評価する方法。
１４、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）結合能またはチロシンキナーゼ活性を有 する、少なくとも約２０アミノ酸の実質的に純粋なｈＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド 断片。
１５、上記ポリペプチド断片が可溶性である請求項１４に記載の実質的に純粋な ポリペプチド断片。
１６、タイプＢ　ｈＰＤＧＦ−Ｒの約１から始まり約４９９で終止するアミノ酸 を本質的に含み、かつさらに表２に由来する、ｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を有するｈＰ ＤＧＦ−Ｒ断片。
１７、タイプＡ　ｈＰＤＧＦ−Ｒの約１から始まり約５０１で終止するアミノ酸 を本質的に含み、かつさらに表３に由来する、ｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を有するｈＰ ＤＧＦ−Ｒ断片。
１８、非グリコジル化ｈＰＤＧＦ−Ｒ断片を含む組成物。
１９、上記断片が実質的に純粋である請求項１８に記載の組成物。
２０、非−真菌および非−ヒトのグリコジル化パターンを表す、ｈＰＤＧＦ−Ｒ 断片を含む組成物。
２１、上記断片が実質的にタイプＢまたはタイプＡ　ｈＰＤＧＦ−Ｒの細胞外領 域である、請求項２０に記載の組成物。
２２、表２から、または表３からの配列を有する請求項２０に記載の組成物。
２３、ａ）ヒト血小板由来増殖因子レセプターポリペプチド（ｈＰＤＧＦ−Ｒ） 断片；および ｂ）発現時に上記断片をグリコジル化できる非−真菌のグリコジル化酵素、 の混合を含む組成物。
２４、少なくとも約５００ダルトンのｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質断片を上記細胞 に導入する工程から成る方法である、ｈＰ［］ＧＦ−Ｒ活性を細胞に導入する方 法。
２５、試料をｈＰＤＧＦ−Ｒレセプターリガンド結合部位と混合し；そして 該リガンドと該ｈＰＤＧＦ−Ｒレセプターリガンド結合部位との間の結合を検出 する、 工程から成る試料中のＰＤＧＦレセプターについてのりガントの存在をアッセイ する方法。
２６、レセプターキナーゼ挿入領域を含む、約２００より小さい単離ポリペプチ ド。
２７、上記ポリペプチドがリン酸化アミノ酸残基を存する請求項２６に記載の単 離ポリペプチド。
２日、上記ポリペプチドがＰＤＧＦレセプターのキナーゼ挿入セグメントに実質 的にホモロガスな配列を含み、かつ表２または表３からの配列を有する請求項２ ６に記載の単離ポリペプチド。
２９、医薬的に受容できるキャリアーとともにある請求項２６に記載の単離ポリ ペプチド。
３０、第一タンパク質にリン酸化領域のペプチド類似体を加え、ここで該類似体 は該第−タンパク質が第二タンパク質に結合することを阻害する、 工程から成る、該第二タンパク質のリン酸化領域に結合する該第−タンパク質の 生物活性を変調させる方法。
３１、第一分析において、分子の存在下でタンパク質を標的リン酸化ペプチドと 接触させ； 第二分析において、分子の不存在下で該タンパク質を標的リン酸化ペプチドと接 触させ；そして 該分析を比較して該分子の該結合に対する効果を決定する、工程から成る、標的 リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を阻害できる分子を選択する 方法。
３２、上記接触工程が連続して行われる請求項３１に記載の方法。
３３、リン酸化ＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドをＰＩ３キナ ーゼに加え、それによって該ポリペプチドと該ＰＩ３キナーゼとの間の結合を行 う工程から成るＰＩ３キナーゼ活性を変調する方法。
３４、試料をＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドと実質的にホモ ロガスなリン酸化ポリペプチドの類似体に接触させて、それによってタンパク質 を特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる、 工程から成る、試料からＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域セグメントに結合 できるタンパク質を精製する方法。
３５、標識されたリン酸化ＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドを 種々のタンパク質を発現する細胞と混合し、これによって核酸を発現してリン酸 化ポリペプチドに結合するタンパク質を生成するこれらの細胞を標識し、そして これらの標識された細胞を単離する、 工程から成るＰＤＧＦレセプターに結合できるタンパク質をコードする核酸を単 離する方法。
３６、　ＰＤＧＦレセプターに結合できる上記タンパク質がＰＩ３キナーゼまた はｃ−ｅｔａｓである請求項３５に記載の方法。
明細書 ヒト　血小板由来増殖因子レセプター 発明の分野 本発明は診断および治療薬に関し、より詳細には血小板由来増殖因子レセプター に基づく組成物に関する。
発明の背景 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、間充織由来の細胞についての主要なマイト ジェンである。このタンパク質マイトジェンは通常ふたつのポリペプチド鎖Ａお よびＢがジスルフィド結合で連結されてなる３２ｋＤａのタンパク質ヘテロダイ マーである。ＰＩＩＧＦＡＢヘテロダイマーに加えて、ＰＤＧＦのふたつのホモ ダイマ一体（ＡＡおよびＢＢと示される）が同定された。
ＰＤＧＦ−仲介　分裂促進の第一段階は、ＰＤＧＦが細胞膜で、そのレセプター に結合することである。この反応は、レセプター　チロシンキナーゼの活性化、 フォスファチジルイノシトールの代謝回転上昇、ひとつの群の遺伝子の発現増大 、フォスフォリバーゼＡ２の活性化、細胞の変形、細胞内カルシウム濃度の上昇 、細胞内ｐＨの変化、結合したＰＤＧＦの内在化および分解を含む初期の細胞性 応答の多様性の引き金を引く、これらの変化は、次に標的レセプター含有細胞の 増殖速度の上昇へと続く。
ポリペプチドがインビトロで特定細胞タイプの成長を刺激する能力は、それがイ ンビボで同じ機能を果たす証明にはならないが、細胞上の多くの増殖因子の役割 を研究して生物全体における役割が決定される。インビトロで、血小板由来増殖 因子は、繊維芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞のような間充識由来の細胞に ついての血漿中の主要なポリペプチドマイトジェンである。インビボで、ＰＤＧ Ｆは血液中にて自由に循環しないが、循環する血小板のα顆粒中に保有されてい る。血液凝固および血小板の癒着中に顆粒が放出されると、しばしば損傷血管の 部位で、すなわちＰＤＧＦが血管の修復に寄与する。ＰＤＧＦは動脈性平滑筋の 動脈血管の中間から内膜への移動を刺激することができ、ここで筋肉細胞は増殖 できる。これが損傷の初期応答になると思われる。
ＰＩ３ＧＦは研究されて、どのように細胞の増殖が体内で制御されるのかが決定 された。増殖因子は傷の治癒、アテローム硬化症、骨髄増殖性疾患、および細胞 のガン性形質転換（特にＣ−Ｚおよびｃ−ｆｏｓ　）に関与してきた。これゆえ に、ＰＤＧＦアゴニストは傷の治癒の促進に有効となるであろう、　ＰＤＧＦア ンタゴニストはアテローム硬化症の予防、心臓血管の介入後に生じる血管細狭化 、およびガン性の形質転換の阻止に有効となるであろう。
ＰＤＧＦと細胞との相互反応は、部分的にマイトジェンについてのレセプターに より仲介される。　ＰＤＧＦレセブクーはそれゆえに増殖因子によるマイトジェ ン性の刺激における成分としてたいへん重要である。しかしＰＤＧＦとそのレセ プターとの間の、ならびにＰＤＧＦレセプターと細胞性成分との間の直接的な相 互反応を特徴づけることは不可能であるため、異常または所望でないＰＤＧＦの 応答を特徴とする生理状態または疾患を診断または治療するために必要な薬剤の 開発が阻止されてきた。これらの理由により、ＰＤＧＦレセプターの構造的なら びに生理的性室を特徴づける劇的な必要性が存在する。
発明の要約 本発明によれば、ヒト血小板由来増殖因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）ポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が単離され、配列決定された。
ひとつの態様において、分泌または哺乳類細胞の膜に結合できるＰＤＧＦ−レセ プタータンパク質をコードする、ひとつまたそれ以上の配列を含む発現構造物が 提供される。膜結合性レセプターは機能的に野生型と同様または均等であるべき であり、これゆえにレセプターが欠如している細胞に対するＰＤＧＦ感受性のマ イトジェン応答を付与する。構造物は、とりわけ、大量のＰＤＧＦ−レセプター または断片を作るために、細胞のＰＤＧＦ応答を増大するために、ＰＤＧＦ結合 に応答してマイトジェンの信号を形質導入することに関与するポリペプチドレセ プターの領域を決定するために、レセプターの突然変異類似体を提供するために 、薬剤の生理活性を評価するために、そしてレセプター遺伝子の染色体部位に近 い配列の統合性をプロービングするために使用できる。特に、種々の可溶性レセ プターの断片が提供され、その多（がｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質が結合した細胞 の種々の性質を有する。これらの構造物を使用する新規方法も提供される。
本発明は、ヒト血小板由来増殖因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）ポリペプチド 部分をコードする、少なくとも約２４の一連のヌクレオチドを含む約５０Ｋｂｐ より小さい、精製され、単離された組換え核酸を提供する。好ましくはそのセグ メントは可溶性ポリペプチドである。特定の態様において、そのセグメントは本 質的に、ＢタイプまたはＡタイプｈＰＤＧＦレセプター（例えば表２または表３ のポリペプチド配列）の完全長の細胞外領域から成る。他の態様において核酸は リン酸化部位のセグメントをコードする。
普通、コードされたセグメントは約３００アミノ酸よりも小さい（好ましくはＰ ＤＧＦに結合できるであろう）、リン酸化の基質であることができ、またはＰＩ ３キナーゼに結合できる。他の態様において、コードされたセグメントは実質的 に完全な細胞内領域を欠いている。
本発明はまた記載された核酸で形質転換された細胞を包含し、その細胞は典型的 には哺乳類細胞である。特別な態様において、細胞はさらに非−真菌種から発生 したグリコジル化酵素を含有する。
発現ベクターも提供され、特定の態様においては、セグメントをコードする核酸 ヌクレオチドは、プロモーターに作動可能なように連結される。提供される組み 換え核酸はさらに、ｈＰＤＧＦ−Ｒセグメントに融合されるヘテロロガスなポリ ペプチドをコードする。
本発明のもうひとつの観点として、ｈＰＤＧＦ−Ｒアゴニストまたはアンタゴニ ストとして機能する化合物の能力を評価するための方法が提供され、それは対照 の細胞からのＰＤＧＦ−誘導応答の量を、ｈＰＯＧＦ−Ｒペプチド断片をコード する核酸で形質転換した細胞中のものと比較する工程から成る０種々の態様にお いて、ＰＤＧＦ−誘導応答は細胞中のＤＮＡ合成を測定することによって比較さ れる。細胞をＰＤＧＦを持つ細胞と接触させた後。
ポリペプチドの態様には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）結合活性またはチロ シンキナーゼ活性を有する少なくとも約２０のアミノ酸の実質的に純粋なｈＰＤ ＧＦ−Ｒポリペプチド断片を含む、典型的にはこのポリペプチド断片は可溶性で あろう。
他の態様において、タイプＢ　ｈＰＤＧＦ−Ｒの約１から始まり約４９９で終止 するアミノ酸を本質的に含むｈＰＤＧＦ−Ｒ結合活性を有するｈＰＤＧＦ−Ｒ断 片が提供され、これは例えば表２に表したもの、又はタイプＡ　ｈＰＤＧＦ−Ｒ の約１から始まり約５０１で終止するアミノ酸を本質的に含む、例えば表３に表 したものである０本発明は非グリコジル化ｈＰＤＧＦ−Ｒ断片を有する組成物を 包含し、好ましくは断片は実質的に純粋である。他の態様において、ｈＰＤＧＦ −Ｒ断片は、非−真菌および非−ヒトのグリコジル化パターンを表す、特に有用 な組成物は、タイプＢ又はタイプＡ　ｈＰＤＧＦ−Ｒ（例えば表２または表３に 表したもの）、の本質的に細胞外領域のｈＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド断片を有す る。さらなる態様は＝　（ａ）ヒト血小板由来増殖因子レセプター（ｈＰＤＧＦ −Ｒ）断片をコードする組み換え核酸；および（ｂ）発現時に該断片をグリコジ ル化することができる非−真菌のグリコジル化酵素、の組み合わせから成る。
本発明は細胞にｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を導入するための種々の方法を提供し、それ は少なくとも約５００ダルトンのｈＰＤＧＦ−１？タンパク質断片を細胞に導入 する工程から成る。試料中のＰＤＧＦレセプターについてのリガンドの存在をア ッセイするための方法も提供され、それは＝（ａ）試料とｈＰＤＧＦレセプター リガンド結合部位とを混合し；そして（ｂ）リガンドとｈＰＤＧＦレセプターリ ガンドとの間の結合を検出することから成る。
ＰＤＧＦレセプターの細胞内領域に関して、本発明はレセプターキナーゼ挿入領 域を含む約２００アミノ酸より小さい単離ポリペプチドを提供する０種々の態様 において、ポリペプチドはリン酸化アミノ酸残基（例えばホスホチロシン）を有 する０通常ポリペプチドは、ＰＤＧＦレセプターのキナーゼ挿入セグメントに実 質的にホモロガスな配列、例えば表２または表３の配列、を有する０本発明はま たポリペプチドと薬学的に受容できるキャリアーを含有する組成物を提供する。
本発明により種々の方法が提供され、それは第二タンパク質のリン酸化領域に結 合する第一タンパク質の生物活性を変調させるための方法を含むが、この方法は 第一タンパク質にリン酸化領域のペプチド類似体を付加する工程を含み、ここで 類似体は第一タンパク質の第二タンパク質への結合を阻害することができる。標 的リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を阻害できる分子を選択す るための他の方法も提供される。この方法は、第二分析中の分子の不存在下でタ ンパク質を標的リン酸化ポリペプチドに接触させ；そしてこれらの分析を比較し て、結合に対する分子の効果を決定する工程を有する。特定の態様において、こ れらの接触工程は連続して行われる。
提供されるようなＰＩ３キナーゼ活性を変調さるための他の方法は、リン酸化Ｐ ＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドをＰＩ３キナーゼに加え、これ によってポリペプチドとＰＩ３キナーゼとの間の結合を可能にする工程から成る 。
本発明は、試料からＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入セグメントに結合できるタ ンパク質を精製する方法を提供し、それは試料をＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿 入領域ポリペプチドと実質的にホモロガスなリン酸化ポリペプチドの類似体と接 触させることによりタンパク質を特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる工 程からなる。
ＰＤＧＦレセプターに結合できるタンパク質をコードする核酸を単離する方法も 提供され、これは標識したリン酸化ＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペ プチドと種々のタンパク質を発現している細胞とを混合し、それによってリン酸 化ポリペプチドに結合するタンパク質を生産するための核酸を発現する細胞を標 識し；そして標識されたこれらの細胞を単離する工程から成る。この方法は特に 、Ｐｒ３キナーゼまたばｃ−ｆｍｓをコードする核酸を単離するために有効であ る。
発明の詳細な説明 図１は８５ｋＤ／ＰＩ　３キナーゼとタイプＢ　ＰＤＧＦレセプターとの結合を 説明する。リン酸化タンパク質とＰＤＧＦレセプター（ａおよびｂ）およびフォ スフフチジルイノシトール３′キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性（Ｃおよびｄ） との結合が、完全な細胞（ａおよびＣ）とインビトロ（ｂおよびｄ）で研究され た。完全な細胞の実験において、ＰＤＧＦ−刺激（＋）または対照細胞（−）が 可溶化され、レセプターは抗−レセプター抗体を使用して免疫沈降された。レセ プターが結合したリン酸化タンパク質はレセプター−結合タンパク質複合体をＭ ｎＣＩｇおよび７　”Ｐ−ＡＴＰでインキュベーションし、続いてＳＯＳポリア クリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより検出した。
ＰＤＧＦ−刺激レセプターは８５ｋＤおよび１１０ｋＤリン酸化タンパク質およ びＰＩ３キナーゼ活性に結合したが未刺激レセプターはそうではなかった０等量 のレセプターを刺激したおよび未刺激の細胞の溶解物から免疫沈降した。インビ トロ結合は、バキュロウィルス−発現レセプターをＰＤＧＦ−刺激（＋）または 未刺激（−）細胞とインキュベーションすることにより行った。レセプターが結 合したリン酸化タンパク質（ｂ）およびＰＩ３キナーゼ活性（ｄ）を検出した。
　８５ｋＤタンパク質の位置を矢印で示す。
図２は、インビトロで８５ｋＤタンパク質およびＰＩ３キナーゼと、野生型およ びキナーゼ挿入欠損突然変異体レセプターとの結合を説明する。未刺激の３７３ 細胞からの溶解物を、野生型ＰＤＧＦタイプＢレセプターまたはバキュロウィル ス発現系を使用して調製した免疫沈降したキナーゼ挿入欠損突然変異体レセプタ ーと共に混合した。レセプター−結合タンパク質を含有する免疫沈降物を徹底的 に洗浄した。
インビトロタンパク質キナーゼアッセイ（パネルａ）またはＰＩ３キナーゼ活性 は（パネルｂ）をタンパク質について行った。パネル（ａ）の第一列は、細胞溶 解物と混合していないバキュロウィルス−発現レセプターのインビトロタンパク 質キナーゼアッセイを表す。
パネル（ａ）の第二および第三列の最上ふたつのバンドは、バキュロウィルス− 発現レセプター（第二列）または突然変異したレセプター（第三列）からのもの であり、ならびにそれぞれの前駆体である。矢印は８５ｋＤタンパク譬を指示す る。
図３はＰＩ３キナーゼ活性と８５ｋＤタンパク質との結合に、レセプター自己リ ン酸化が必要であることを説明する。　ＰＤＧＦレセプターは、野生型ＰＯＧＦ レセプター組換えバキュロウィルスで怒染させたＳｆ９細胞から免疫沈降した。
リン酸化レセプターを含有する免疫沈降物を可溶化した３Ｔ３細胞溶解物ととも にインキュベーションした。ＰＩ３キナーゼアッセイ（ａおよびｂ）、ならびに インビトロキナーゼアッセイ（Ｃ）を行った。（ａ）ＰＩ３キナーゼ活性とリン 酸化ＰＤＧＦレセプターとの結合は、ジャガイモ酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ 　）またはＰＡＰにオルトバナデートを加えた物とインキュベーションした。
図４は、８５ｋＤリン酸化タンパク質およびＰＩ３キナーゼ活性がレセプターと 結合することをブロックするために、ペプチドの使用を説明する０表ＡＩに掲げ られたペプチドは免疫沈降レセプターとのインキュベーションに先立って、未刺 激の３Ｔ３細胞溶解物とともに予備インキュベージジンされた。レセプター−結 合リン酸化タンパク質（パネルａ）およびレセプター−結合ＰＩ３キナーゼ活性 （パネルｂ）の検出は、図１および２のように行われた。　８５ｋＤタンパク質 を矢印で示す。
図５はペプチドＹ７１９Ｐの濃度依存性ブロッキング活性を説明する。
一連の濃度のペプチドＹ７１９Ｐが、タンパクｆ（パネルａ）またばＰＩ３キナ ーゼ活性（パネルｂ）のバキエロウイルスー発現免疫沈降レセプターへの結合の ブロッキング能力を試験された。矢印は８５ｋＤリン酸化タンパク質を示す、ア ッセイは図１．２および３に記載されるように行われた。
図６はＰＤＧＦレセプターとＰＬＣ−γまたはＧＡＰとの結合が、３Ｔ３未刺激 溶解物とレセプターリン酸化ペプチド、Ｙ７１９Ｐとの予備インキュベーション によっては影響されないことを説明する。ペプチド／溶解物混合物を、免疫沈降 バキュロウィルス−発現レセプターと図１゜２、および３に記載されるようにイ ンキュベーションした。レセプター複合体中のＰＬ（ニー　７およびＧＡＰの存 在をＰＬＣ−ＴおよびＧＡＰ抗体をプローブとしてイムノプロット分析により測 定した。″溶解物”と記した列において、３Ｔ３細胞の粗溶解物は対照としてイ ムノプロットされ、ＰＬＣ−７およびＧＡＰの電気泳動的位置を表した。
図７は、可溶性放射標識レセプターと固定化８５ｋＤタンパク質（ルセプタープ ロット”）との結合を説明する。バキュロウィルスー発現Ｐ［ｌＧＦレセプター をレセプター抗体を使用して免疫沈降させ、レセプターをインビトロで自己リン 酸化により５ｘｐ−標識した。可溶化された放射標識レセプターを使用して、対 照（１，３，４、および５列）またはＰＤＧＦ刺激（２列）細胞からの５Ｏ５− ポリアクリルアミドゲル分画溶解物を含有するニトロセルロースフィルターを釣 り上げた。ペプチド競合実験では（レーン３．４および５）、ペプチドが、放射 標識レセプタープローブと共にニトロセルロースフィルターに添加された。矢印 は８５ｋＤタンパク質の位置を指示する。
図８は、可溶性ｈＰ［１ＧＦ−Ｒ細胞外領域のインビトロ生産を支配したオリゴ ヌクレオチドについての戦略を説明する。使用した省略記号は： ＰＲ−ＰＤＧＦＲｉ完全 Ｐ−ＰＤＧＦＲ；細胞外領域 Ｔ？ｌ−）ランスメンプラン領域 発明の詳細な説明 ヒト血小板由来増殖因子（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）組成物が本発明により提供される。
これらの組成物は完全長の天然形態、天然形態の断片、これらの断片の融合タン パク質、それらを含む各々の修飾形態、ならびに多−タンパク質複合体であろう 、特に、ｈＰＤＧＦ−１？機能を表す可溶性ポリペプチドが、細胞外および細胞 内領域の両方で人手できるように作られる。
ｈＰＤＧＦレセプターに基づくタンパク質組成物の生産法が提供される０種々の ｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質組成物をコードする核酸構造物も開示される。この核 酸構造物は細胞を形質転換させるのに有用となり、商業的に有用な量のタンパク 質組成物を生産するための有効な経済的手段を提供するであろう、これらの細胞 、およびｈＰＤＧＦレセプターを含有する他の物は、診断およびＰＤＧＦのマイ トジェン作用の機構を研究するためにも有効となるであろう、それらは、ＰＤＧ Ｆリガンド結合のシグナル伝達に影響する新しい薬剤の評価のために、ならびに ｈＰＤＧＦレセプターが関与する疾患の治療のために使用されるであろう、構造 物は、細胞をトランスフェクトするために使用でき、機能的に野生型レセプター と均等な膜−結合レセプターを提供し、レセプターを欠く細胞に対してはＰＤＧ Ｆ−感受性マイトジェン応答を付与する。トランスフェクションした細胞を、細 胞のＰＯＧＦ−誘導応答を研究するためのモデルとして使用することができ、Ｐ ＤＧＦリガンド結合に応答してシグナルを伝達することに関与する領域が決定さ れ、それらの生理活性についての薬剤を評価する。コードされたレセプターまた はそれらの結合領域は、ＰＤＧＦｉ［似体を評価するために使用できる。
レセプター断片およびその類似体は、ＰＤＧＦリガンド結合に応答してシグナル を伝達することに関与するレセプターポリペプチドの領域を決定するために使用 されるであろう、特に、′構造的な特徴物（例えば、リガンド結合決定基）の種 々の組み合わせを試験する能力は、リガンド結合親和性に対する重要度、リカ゛ ンド特異性および生理応答を決定するためにレセプターの特徴を精密に吟味する ことを可能にする。
ｈＰ［１ＧＦ−Ｒタンパク質は抗体試薬を製造するためにも使用されることが見 いだされるであろう、これらの試薬はレセプターポリペプチドと相互作用、刺激 、特に分子的相互作用ができるべきである。
ＰＤＧＦ結合能を有する可溶性タンパク質は、診断試料中のＰＤＧＦ定量のため の、リガンド結合のために修飾された決定基と天然、修飾または誘導されたリガ ンドとの間の結合相互作用の可溶性試験のための、そしてｈＰＤＧＦ−Ｒポリペ プチドに対するモノクローナル抗体のスクリーニングのための試薬として、ＰＤ ＧＦ作用の）゛ロッキングにも有効となるであろう。
ＤＮＡ配列は遺伝的異常（例えば、多くの成長−制御遺伝子力く集まる染色体５ の領域、ｃ−ｋｉ　を腫瘍形成遺伝子付近の染色体４の領域における欠損、また は再配列）を検出するプローブ゛として、また４よチロシンキナーゼまたはホモ ロガスな遺伝子をコードする他の遺イ立子を検出するためにも使用されるであろ う。
ＰＤＧＦレセプターの細胞質性領域の特定領域、その中のキナーゼ挿入（Ｋｌ） １Ｎ域は、ＰＤＧＦレセプターを、他の細胞性タンノ寸り質と相互反応（例えば 結合など）させることができる、これらの領域に実質的にホモロガスなペプチド は有！１１ＭｊＱ体分子と同様に、ＰＤＧＦレセプターと他のタンパク質との間 の相互反応を阻害するために、Ｐ［ｌＧＦレセプターが相互反応するタンパク質 を同定、スクリーニングそして精製するために、ならびにこれらのタンノ〈り質 をコードする遺（立子をクローニングするために使用できる。これらのホモロガ スなペフ゛チドは、医薬的な診断薬および治療用薬剤（例えｃｒ、　Ｐ［ｌＧＦ レセプター活性および他のタンパク質とのレセプター相互反応に影響する）とし でも使用されるであろう。
さらには、リン酸化残基のタンパク質−タンパク質相互反応に対する役割を理解 することにより、それは他のレセプターとリン酸化タンパク質に応用される。特 定のポリペプチドセグメントまたは実質的ホモロガスなセグメント（例えば、リ ン酸化部位）の特異的アミノ酸のリン酸化は特に生物学的に重要である。タンパ ク質相互反応のリン酸化部位および領域の同定は、そのような相互反応を阻害す るために有効な試薬を調製するために重要であり、そのようなタンパク質の機能 を変調させることを導く、ペプチド類似体もまた、リン酸化残基と相互反応する タンパク質を同定および精製するために、ならびにこれらのタンパク質をコード する遺伝子を単離およびクローニングするために有用であろう。
概要 ■、一般的説明 Ａ、　Ｐ［１ＧＦ−［＋ １、構造的特徴 ａ、細胞外領域 ｉ、シグナル配列 ｉｉ、１ｇドメイン ｂ、）ランスメンプラン　セグメント Ｃ１細胞内領域 ｉ、チロシン　キナーゼ １１、挿入体 ２１能 ａ、ＰＤＧＦを結合 す、　ＰＤＧＦ−Ｒペプチドを結合 Ｃ，チロシンキナーゼ活性 Ｂ、生理学的機能 １．細胞性 ２、組織分化 ３、生体性 ■、ポリペプチド Ａ、可溶性形態 Ｂ、末端短縮形態 Ｃ０融合タンパク質 り、遺伝的多様性（部位特異的突然変異）Ｅ、タンパク質を含む組成物 ■、核酸 Ａ、単離核酸 ８０組換え核酸 Ｃ６核酸を含む組成物 Ｉｔ／、　ＰＤＧＦ−Ｒの作成法 Ａ、タンパク質精製 ｌ、誘導ＰＤＧＦとの親和性 ２、種々のりガント、同一レセプター リガンドの発現 ■、抗体 ■、使用法 Ａ、＃断 Ｂ、治療 １、」ｌｌ 単離された完全長のヒト血小板由来増殖因子（ｈＰＤＧＦ　）レセプターｙａＲ ＮＡは、膜−全長セグメント（トランスメンプランセグメントと呼ばれる）と同 様な単一の疎水性ポリペプチドセグメントをコードする。トランスメンプランセ グメントに隣接するＰＤＧＦ−！？アミノのこのセグメントは細胞外領域を形成 し、一方トランスメンブランに隣接するカルボキシセグメントは細胞内領域と呼 ばれる。アミノ末端がら、細胞外領域はＭＨＩ−末端疎水性の推定シグナル配列 、ならびに第二、第三、第四および第五免疫グロブリン一様ドメイン（それぞれ Ｉｇｎ、　Ｉｇｌｌｌ、　ＩｇＩＶおよびＩｇＶと呼ばれる）を有する。ｈＰＤ ＧＦ−［１の外部領域中の様々な構造的特徴が同定されているが、この領域が定 める最も重要な機能的性質は、レセプターリガンド（たとえば、ＰＤＧＦファミ リーの員およびその類似体）への結合である。
部分的に細胞内領域が、分割されたチロシンキナーゼ構造ドメインの存在により 特徴づけられる。ヒトタイプロレセプターポリペプチドにおいて、この領域は約 ２４４残基長であり、約１０４アミノ酸の挿入物を有する０表２参照、ヒトタイ プＡレセプターポリペプチドにおいても、このチロシンキナーゼドメインは約２ ４４残基長であり、約１０３アミノ酸の挿入物を有する０表３参照０部分的に機 能的にこのドメインはチロシンキナーゼ活性により定義されており、典型的には リガンドの細胞外領域への結合により変調され、二量体状態で機能するように思 われる。リン酸化のための基質は、レセプターポリペプチド鎖に付随する様々な チロシン残基、およびレセプターに結合した他のタンパク質を含む０部分的にチ ロシンキナーゼドメインも他のチロシンキナーゼ活性含有タンパク質中の同様な ドメインに対するそのホモロジーにより定義されている。　Ｙａｒｄｅｎら（１ ９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　２２６−２３２を参照、実際の境界自体は 、同様なドメインにより定義され、２−３のアミノ酸残基（多分、多くても約７ 残基）により変化してよいが、しかしおそら（約４残基内、もっとも確実には約 １から２残基であろう、タンパク質はそれが原型的に細胞内領域を欠いている場 合、実質的に完全な細胞内領域を欠き、特にチロシンキナーゼドメインを欠いて おり；同様な概念が完全なトランスメンプラン領域の欠損に関しても与えられる 。
典型的なＰＤＧＦ−Ｒ核酸配列は、一過性のＮＨ２−末端疎水性配列をコードし 、これは通常、膜転移過程中に切断される。シグナル配列の古典的な機能は、発 生期のポリペプチド鎖を膜結合リボゾームに向かわせ、これによって膜転移を導 き、引き続きプロセッシングおよびターゲツティング工程が起こる。シグナル配 列は典型的には転移過程で除去されるので、成熟ポリペプチド中にはシグナル配 列は無い、しかし、成熟タンパク質の他のアミン隣接配列の特徴は、レセプター 断片の発現、または正しい配置、または標的にも重要であるかもしれない。
レセプターの種々の領域についての推定境界を表１に示し、これは一部マウスＰ ＤＧＦとホモロガスであるものから誘導された。特に、疎水性セグメントが同定 されて、そしてその構造的ホモロジーと膜全長セグメントの物理的性質の特徴か らトランスメンプランセグメントと命名された。このセグメントは、タンパク質 を細胞外領域と細胞内領域とに分割する。細胞内領域は、チロシンキナーゼ活性 を表すと思われる種々の他のレセプターに対するホモロジーを有し、このレセプ ターは示すように挿入領域を持たないが、他のチロシンキナーゼセグメントに対 して高いホモロジーの領域内にはめ込まれている。
表　１ およそのセグメント境界 叉ヱ１旦　叉土グ人 χＲＩｅｕ　（１）　１ｙｓ（４９９）　ｇｉｎ　（１）　−ｇｌｕ（５０１） ＴＭ　ｖａｌ　（５００）　−ｔｒｐ　（５２４）　Ｉｅｕ　（５０２）　−ｔ ｒｐ（５２６）ＴＫ　１　ａｒｇ（５７２）　−ｈｉｓ（６６２）　１ｅｕ（５ ７２）　ｈｉｓ（６６４）ＫＩａｒｇ（６６３）　Ｉｅｕ（７６６）　Ｉｙｓ（ ６６５）−１ｅａ（７６７）ＴＫ　２　ｓｅｒ　（７６７）　−ｐｈｅ　（９１ ９）　ｔｈｒ　（７６８）　−ｐｈｅ　（９２０）レセプターの細胞内領域はチ ロシンキナーゼ活性を含む、　ＰＤＧＦレセプターは分割された、約１０３また は１０４アミノ酸の挿入セグメントを持つチロシンキナーゼドメインが特徴であ る。この挿入セグメントは１ｍ的な、ならびに以下に詳細に記載する他の性質を 有する。
本発明はＰＤＧＦレセプターに関連した単離した核酸およびポリペプチドを提供 する。単離した分子は実質的に天然の形態に見いだされる天然に存在する分子の 物質から分離されたもののひとつである。
例えば、単離されたポリペプチドは天然に存在するヒト細胞成分（例えば、ヒト 核酸、脂質、および他のタンパク質）から実質的に精製されたもののひとつであ る。特に目的とするものは遺伝子組換えまたは削除技術によって分離されるであ ろうポリペプチドの同一領域内のセグメントである。すなわち、本明細書におい て使用されるように、たとえそれがホモロガスな細胞タイプ中で発現されようと も単離および操作された遺伝子配列の発現生成物は単離ポリペプチドである。ホ モロガスな細胞により発現され、合成的に作成された形態または分子は固有の単 離分子である。
生理学的に、このレセプターは多（の代謝変化（例えばフォスファチジルイノシ トールレベル、ｐＨ１カルシウムイオンレベル、細胞骨格構造、遺伝子発現、ｃ ＡＭＰレベル、およびリガンドレセプターレベル）の開始の要因である。
タイプＡおよびタイプＢ　ＰＤＧＦレセプターは、種々の二量体の組み合わせと 混合された時、機能的レセプター複合体を作り、また種々のＰＤＧＦ形態（例え ばＡＡ、　ＡＢおよびＢａ形）に対して特徴的な結合親和性も存する０例えば、 ａタイプＢアイソフオームレセプターは８ＢアイソフオームＰＤＧＦに高い親和 性で結合し、ＡＢアイソフオームＰＤＧＦにはより低い親和性で結合し、そして ＡＡアイソフオームＰＤＧＦには低い親和性かまた親和性を持たない、タイプＡ アイソフオームレセプターは、＾ＡアイソフオームＰＤＧＦに高い親和性で結合 し、ＡＢヘテロダイマーおよびＢＢアイソフオームＰＤＧＦには低い親和性を持 つ。
“リガンド”という用語は、通常血小板由来増殖因子ファミリーの分子を言い、 これは増殖因子結合に関与するセグメントに結合する。また、リガンドはレセプ ターに対する天然のリガンド、またはレセプターの類似体のいずれかを補助する 分子であり、結合するか、天然リガンドの機能的類似体である０機能的類似体は 構造的変更を有するリガンドであってよく、または適当なりガント結合決定基と 相互反応する分子形を有する全く無関係な分子であってもよい、リガンドはアゴ ニストまたはアンタゴニストとして役立ち、これについてはＧｏｏｄｍａｎら（ ［集）（１９９０）　、グツドマンとギルマン：治７、のｆ、−ｈ（Ｄ　−（第 ８版）、パーガモン出版ＣＧｏｏｄｍａｎ　＆　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ　Ｐ ｈａｒ＋５ａｃｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｂａ５ｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃ ｓ　（８ｔｈ　ｅｄ）　ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ）を参照のこと。
■、±ユニ１土上 ＰＤＧＦレセプターは同様なポリペプチドの二量体で、構成ポリペプチドが二量 体化したレセプターのリガンドに対する親和性を決定すると思われる。
ＡＡホモニ量体ＰＤＧＦリガンドは好ましくは高い親和性でｈＰＤＧＦレセプタ ーのひとつの形態により結合し、そしてこの形態はＡレセプター、αレセプター および本明細書中で使用されるように、タイプＡレセプターポリペプチド（＾− ｈＰＤＧＦ−Ｒ）として呼ばれるポリペプチド鎖と関連している。レセプターダ イマーは明らかにタイプＡレセプターポリペプチドのホモダイマーである。
ＢＢホモニ量体ＰＤＧＦリガンドは好ましくは、高い親和性でｈＰＤＧＦ　−レ セプターの二つと結合する。これらの形態は、Ｂレセプター、βレセプターおよ び本明細書中で使用されるように、タイプＢレセプターポリペプチド（Ｂ−ｈＰ ＤＧＦ−Ｒ）として呼ばれる第二ポリペプチド鎖と関連する。これらのふたつの レセプター二量体形態は、明らかにＢレセプターポリペプチドのホモニ量体およ びタイプＢ／タイプＡ形態のへテロニ量体である。
タイプＡおよびタイプＢポリペプチドの命名は、各アイソフオームすべての対立 遺伝子を網羅することを意図している。すなわち、天然に存在するそれぞれの変 異体は本発明に包含され、それらは他の変異体、類似体、および改良された配列 である。
ひとつのタイプＢ−ｈＰＤＧＦ−Ｒ対立遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列のヌク レオチド配列が、推定されるレセプター前駆体のアミノ酸配列と共に表２に説明 されている（配列番号第：１を見よ）、以下の記載は、マウスおよび他の増殖因 子レセプターおよびタンパク質との相似に基づくおおまかな構造的、ならびに機 能的特徴を示すものであ・る。
アミノ酸番号１から始まる配列はヒトＰＤＧＦ−Ｈの成熟形態の推定のアミノ末 端に対応する。初めの３２アミノ酸（−３２から−１と呼ばれる）は、推定され るシグナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメンプラン配列はアミノ 酸残基ｖａ　１　（５００）からｔｒｐ　（５２４）に対応する。Ｎ−グリコジ ル化の可能性部位は対応するアミノ酸配列がａｓｎ（１３）−ｓｅｒ（１５）　 ；　ａｓｎ（５７）−ｔｈｒ（５０）　；　ａｓｎ（７１）−ｓｅｔ（７３）　 ；　ａｓｎ（１８３）−ｓｅｒ（１８５）；ａｓｎ（１９Ｂ）−ｔｈｒ（２００ ）　；ａｓｎ（２６０）−ｔｈｒ（２６２）　；ａｓｎ（２７５）−ｔｈｒ（２ ７７）；ａｓｎ（３２２）−ｔｈｒ（３２４）　；ａｓｎ（３３９）−ｓｅｔ（ ３４１）　；ａｓｎ（４３６）−ｓｅｔ（４３８）；　ａｎｄ　ａｓｎ（４４７ ）−ｔｈｒ（４４９）。
の部位である。推定のチロシンキナーゼドメインは、約ａｒｇ　（６６３）とＩ ｅｕ　（７６６）との間のアミノ酸挿入により中断されている、表１参照。
推定のポリアゾニレ−シロン部位は与えられたｃＤＮ＾配列の３′末端である。
表２．パネルＡ−？ １２４１８−１４デイスクからのタイプＢ　ｈＰＤＧＦ−Ｒの配列、核酸及びポ リペプチド配列の両方の０１表をファイル；ひとつのタイプＡ　ｈＰＤＧＦ−Ｒ 対立遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列が、推定されるレセプ ター前駆体のアミノ酸配列と共に表３に説明されている（配列番号第＝３を見よ ）、記載された構造的特徴は、ここでもマウスおよび他の増殖因子レセプターお よびタンパク質との相似に基づく。
アミノ酸番号１から始まる配列はヒ）　ＰＤＧＦ−Ｒの成熟形態の推定のアミノ 末端に対応する。初めの２３アミノ酸（−２３から−１と呼ばれる）は、推定さ れるシグナルペプチド配列をコードする。推定のトランスメンプラン配列はアミ ノ酸残基１ｅｕ　（５０２）からｔｒｐ　（５２６）に対応する。Ｎ−グリコジ ル化の可能性部位は対応するアミノ酸配列がａｓｎ（１９）−ｓｅｒ（２１）　 ；　ａｓｎ（５３）−ｓｅｒ（５５）　；　ａｓｎ（８０）−ｔｈｒ（８２）　 ；　ａｓｎ（１５６）−ｔｈｒ（１５８）；ａｓｎ（３３０）−ｔｈｒ（３３２ ）　；ａｓｎ（３３６）−ｔｈｒ（３３８）　；ａｓｎ（４３５）−ｔｈｒ（４ ３７）　；　ａｎｄ　ａｓｎ（４４５）−ｓｅｔ（４４７）。
の部位である。推定のチロシンキナーゼドメインは、約１ｙｓ　（６６５）とＩ ｅｕ　（７６７）との間のアミノ酸挿入により中断されている、表１参照。
表３．パネルＡ １２４１Ｂ−１４デイスクからのタイプＡ　ｈＰＤＧＦの配列；０２表をファイ ル；表２および３に見られるように、推定されるタイプＡおよびタイプＢレセプ ターの細胞内チロシンキナーゼドメインは、８０％同一残基を有する。推定され るタイプＡおよびタイプＢレセプターの細胞外領域は約３４−３５％の同一残基 を有し、さらに１４％の残りの残基が保存的に置換されている、すなわち同様な 化学的性質を存するアミノ酸での置換である。明示されたｈｐ口ＧＦレセプター のトランスメンブラン領域は、約４８％の同一残基を育する。その５２％残基は 異なるが、７０％は保存的置換である０表に見られるように、両方のレセプター 配列は約１０３または１０４アミノ酸により推定のチロシンキナーゼ領域を中断 されるアミノ酸の挿入を育する。ふたつのポリペプチド全体のホモロジーは約４ ４％である。
血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）という用語は、ＰＤＧＦ−１１ の特徴的性質を有する組成物を言う、天然のヒｌ−ＰＤＧＦレセプターはＰＤＧ Ｆ−Ｒｓ種の例であり、その配列は表２および３に開示され、ならびに対立遺伝 子変異体である。天然のレセプターは典型的には１８０ｋｄの分子量を有する膜 糖タンパク質である。レセプターは通常は動脈平滑筋細胞、繊維芽細胞、ダリア 細胞に見いだされるが、通常は内皮細胞または血液細胞中には観察されない。
上記のように、ＰＤＧＦレセプターは３つのおもな同定領域を有する。
第一はＰＤＧＦに対するリガンド結合決定基を含む細胞外領域であり、すなわち リガンド結合セグメントである。細胞外領域はまた、上記のような特徴を有する １、−樺ドメインに分割される。第二の主要同定領域はトランスメンブラン領域 であり、そして第三は細胞内領域である。細胞内領域はチロシンキナーゼドメイ ンの特徴的タイプを含有し、キナーゼ挿入（Ｋりセグメントにより干渉されてい る。
“ヒト”なる記載は、組成物の起源について言う、ひとつの使用において、ひと つの点で、組成物中に、ヒトまたはヒト−由来細胞または天然に存在するヒト細 胞からのマイナーな変異体が見い出されることを意味する。タンパク質または核 酸または配列に関しては、天然のヒト遺伝子または遺伝子に密接に関連した遺伝 子によってコードされる組成物を言う、すなわち、本発明はタンパク質およびそ のようなタンパク質をコードする核酸を含む、核酸はＲＮＡ、　ｃＤＮＡ。
ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマー、センスおよびアンチセンス鎖の 両方を含む。すなわち開示された情報からのタンパク質は、たとえ合成的に作成 されても、ヒトの配列であると考えられる。
さらに、各アイソフオームの種々の対立遺伝子もそれぞれヒトＰＤＧＦ−Ｒであ ると考えられる。
したがって本明細書において使用される目的において、用語ヒトＰＤＧＦ−Ｒは 、ポリペプチドに適用された時、タンパク質またはポリペプチドを意味し、これ は表２または３に表されたアミノ酸配列およびそれらの任意の対立遺伝子または それらの断片に実質的にホモロガスである。たいていはｈＰＤＧＦ−Ｒは記載さ れたＰＤＧＦ−Ｒ配列に少なくとも約８０％ホモロガスであり、より好ましくは 約９０％以上、最も好ましくは９５％のホモロジーを持つであろう、レセプター は普通、関連配列により提供されるｈＰＤＧＦ−Ｈに共通の幾つかの生物的活性 を表すであろう、それは例えばＰＤＧＦ結合、チロシンキナーゼ結合活性、フォ スフフチジルイノシトール３′キナーゼ（ＰＩ　３キナーゼ）結合、または免疫 的性質である。ｈＰＤＧＦレセプターは一次構造が共通な分子形態を包含し、化 学的ならびに生物的変更をも包含し、それは例えばグリコジル化、リン酸化、ユ ビキニゼーション（ｕｂｉｑｕｉｎｉｚａｔｉｏｎ）、ジスルフィド結合、およ び基本的な一次構造およびその他の小さな変更である。
特に、グリコジル化の変更が含まれ、これは合成及びプロセッシング、またはさ らなるプロセンシング過程の間になされるポリペプチドのグリコジル化パターン の変更により作られる。特にこれに付随する好ましい手段は、通常そのようなプ ロセッシングに与えられる酵素を提供する細胞由来の酵素（例えば哺乳類グリコ ジル化酵素）にポリペプチドを暴露する。また、リン酸化されたアミノ酸残基で ある同−一次アミノ酸配列の変異体も包含し、これは例えばリン酸化アミノ酸残 基、リン酸化セゾンまたはリン酸化スレオニンなどである。
タイプＢ　ｈＰＤＧＦ−Ｒは、上述した性質のｈＰＤＧＦ−［１ポリペプチドの アイソフオームであり、その配列のすべての対立遺伝子およびそれに由来するわ ずかに変更した配列を含む、一般的にこの用語はタンパク質、特にヒトタイプＢ アイソフオームの特徴である物の断片を含む、対応する意味がタイプＡ　ｈＰＤ ＧＦ−Ｒに関しても意図される。
特定の使用において、この用語は機能的レセプターにも適用されル、説明したよ うに、機能的形態はタイプＡレセプターポリペプチド、またはタイプＢレセプタ ーポリペプチドの二量体複合体、またはへテロニ量体形態であると考えられてい る。
ヘテロロガスな融合タンパク質は、同様な様式で天然に、または非天然に融合し たタンパク質またはセグメントの融合である。すなわち、免疫グロブリンとｈＰ ＤＧＦ−Ｒポリペプチドとの融合生成物は、典型的なペプチド結合で融合された 配列を有する連続的なタンパク質分子であり、典型的には単一の翻訳生成物とし て作られているが、免疫グロブリンとｈＰＤＧＦ−Ｒポリペプチドの両方に依存 した性質を表す、同様な概念がヘテロロガスな核酸配列にも適用される。
ポリペプチド断片またはセグメントは、少なくとも約５アミノ酸のアミノ酸残基 に伸長しており、しばしばそれは少なくとも約７アミノ酸、通常は少なくとも約 ９アミノ酸、より普通には少なくとも約１１アミノ酸、典型的には少なくとも約 １３アミノ酸、より典型的には少なくとも約１５アミノ酸であり、種々の態様に おいて少なくとも約１７アミノ酸である。核酸においては、断片またはセグメン トは少なくとも約６ヌクレオチドのヌクレオチド残基に伸長しており、しばしば それは少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１２ヌクレオチド、よ り普通には少なくとも約１５ヌクレオチド、典型的には少なくとも約１８ヌクレ オチド、より典型的には少なくとも約２１ヌクレオチドであり、種々の態様にお いて少なくとも約２４またはそれより多いヌクレオチドである。
ポリペプチド断片は、天然のポリペプチドまたは断片（例えばＰＤＧＦ−Ｒポリ ペプチド）の活性の特徴に実質的に寄与する時、“生理学的に活性”である。典 型的には、ｈＰＤＧＦ−Ｒポリペプチドは機能的レセプターと結合した時、生物 的状況（例えば生物体内、またはインビトロの生物的状況）においてレセプター により達成される一組の活性を有する。　ｈＰＤＧＦ−Ｒの場合には、機能的断 片はこれらの生理学的活性、またはｈＰＤＧＦ−Ｒレセプターの特徴とする活性 を有し、これはＰＤＧＦ結合、チロシンキナーゼ活性、およびレセプターに仲介 されるマイトジェン性のまたは他の細胞性応答を含む、しかしタンパク質断片は 、生命維持に必要な構造的な拘束のような他の特異的または固有の機能を表すこ ともでき、グリコジル化のための基質部位を提供し、細胞性標的のシグナル配列 に寄与し、マウスＰＤＧＦ−Ｒにおいてｖｆ徴的なエピトープの不在を与え、ま たは固有に所有されている、現在は認識されていない機能を与える。
ポリペプチドの溶解性は、条件およびポリペプチドに依存する。
多くのパラメーターがポリペプチドの溶解性に影響し、それには温度、電解質条 件、ポリペプチドの大きさや分子の特徴、そして溶媒の性質が含まれる。ポリペ プチドが使用される温度は典型的には約４°Ｃから約６５°Ｃの範囲である０通 常は温度は約１８℃よりも高い温度が使用され、より普通には約２２°Ｃよりも 高い、＃断の目的には、温度は通常およそ室温またはより暖かいが、アッセイ中 の成分の変性温度よりは低いであろう。治療の目的には温度は通常は体温であり 、典型的にはヒトには３７°Ｃ，Ｌかし特定の状況においては、温度はその部位 またはインビトロでより高く、または低くてよい。
電解質は通常、およそその場所での生理条件であるが、有利により高い、または 低いイオン強度に変更してよい、実際のイオンは、使用される生理的または分析 状況の標準緩衝液に合うように変更してよい。
ポリペプチドの大きさおよび構造は、一般的に実質的に安定な球状であり、通常 は変性状態ではない、ポリペプチドは、４量体で他のポリペプチドと会合しても よく、例えば溶解性を付与する。
溶媒は通常生物適合性の緩衝液であり、生物活性を保存するために使用され、通 常はおよそ生理的な溶媒であろう、界面活性剤、典型的には緩和な非−変性のも のが加えられる場合もある。
溶解性は通常、スベドベリ単位で測定され、これは特定条件下の分子の沈降速度 の測定である。沈降速度の測定は古典的に分析超遠心法で行われたが、現在では 典型的には標準的な遠心で行われる。
Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ　（１９８２）　髭ｖ護Ａコ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ旦■（第 二版）、　Ｗ、ＨｌＦｒｅｅｍａｎおよびＣａｎ　ｔｏｒおよびＳｃｈｉｍａ＋ ｅｌ　（１９８０）　Ｂｉｏ　ｈ　５ｉｃａｌ　＄、第１−３部、１１．Ｈ，Ｆ ｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、サンフランシスコ、を参照、これらは参照により本 明細書に編入される。大まかな測定として、推定される可溶性ポリペプチドを含 有する試料を標準的な全サイズ超遠心に、約５０Ｋｒｐｍで１０分かけると、可 溶性分子は上澄みに留まるであろう、可溶性粒子またはポリペプチドは典型的に は約３Ｏ３より小さいであろう、より典型的には１５３より小さく、通常的１Ｏ ３より小さく、より通常には約６３より小さいであろう、特定の゛態様において は、好ましくは約４３より小さく、より好ましくは３Ｓより小さいであろう。
本明細書で提供されるＰＤＧＦレセプターまたはレセプターの特別な細胞外領域 は、それぞれのＰＤＧＦへの親和性により精製されて使用することができる。完 全長、または全細胞外領域は、表２のタイプＢレセプターのりガント−結合決定 基を含むが、約１ｅｕ（１）からｌｙｓ　（４９９）に広がる。完全長、または 全細胞外領域は、表３のタイプＡ　ｈＰｌ）ＧＦ−Ｒのリガンド−結合決定基を 含むが、約ｇｉｎ（１）からｇｌｕ（５０１）に広がる。
リガンド−結合決定基は種々のＰＤＧＦレセプター対立遺伝子により変化し、い ずれも全細胞外領域の５％である。リガンド結合に必須な最小量のタンパク質配 列は、細胞外量の種々のセグメントを切り出して、リガンド結合を測定すること により決定される。リガンド−レセプター相互反応の研究は、リガンド−結合領 域がレセプターの細胞外領域に位置していることを指示する。リガンド結合の特 異性に対する種々の残基の効果に関する、より洗練された研究も、本発明の試薬 により可能となる０本出願に使用される時、本発明のＰＤＧＦレセプターまたは ＰＤＧＦ−Ｒリガンド−結合活性は、ＰＤＧＦ、　ＰＤＧＦアゴニストまたはア ンタゴニストまたはｈＰＤＧＦレセプターに特異的な他のりガントに結合できる 能力を持つことを意味する０通常このようなリガンドはＰＤＧＦファミリーの一 員であり、典型的にはヒトからの形態であろう、それゆえに、外部領域は類似体 がアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確立するために有用である。
ＰＤＧＦ−Ｒは、他の多くの増殖因子レセプターと同様に天然に多量体複合体と して見いだされるであろう、二量体形が最も存在すると思われる。即ち、レセプ ターの他の重要領域は、細胞外またはそうではないこれらのセグメントであろう し、これは二量体化またはタンパク質−タンパク質相互反応に関与する。
完全長のポリペプチドに加えて、本発明は生物的に活性なポリペプチドの断片ま たはその類似体を提供し、ペプチドの相互反応を刺激する有機分子を含む、を意 な生物的活性には、リガンド−結合、免疫的性質、二量体会合、キナーゼ基質と しての役割、ＰＩ）ＧＦ−１？タンパク質に特異的結合するための他のメディエ ータ−との相互反応、そしてヒトＰＤＧＦレセプターポリペプチドの特徴である 他の生物的活性がある。免疫的活性には、標的とする免疫系での免疫原性機能を 含み、結合について免疫的エピトープを共をし、ヒトＰＤＧＦレセプターエピト ープについて競合体または置換抗原のいずれかの役割を果たす、これらの免疫的 活性のアッセイは当業界に周知であり、以下の実験法の章を参照にされたい；　 Ｈａｒｌｏ−およびＬａｎｅ　（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　、コールドスプリングハーバ−出版、二、Ｓ −ヨーク；およびＥｓｃｏｂｅｄｏら（１９８８）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　２６３　：１４８２−１４８７　、これらは参照により本明細書に編入される ０例えば、リガンド−結合または他のセグメントは異なる新たな融合ポリペプチ ドまたは断片との間で“交換”できる、すなわち、特異性の新たな組み合わせを 表す新たなキメラポリペプチドがリガンド−結合特異性および細胞内領域との機 能的連結から生じるであろう０例えば、他の関連するポリペプチドからのＩｇド メインが加えられるか、またはこれらのレセプターのＩｇ一様ドメインと置換さ れるであろう、生成したタンパク質はしばしば、ハイブリッド機能および性質を 持つであろう。
免疫的性質に関しては、連続的に反復するポリペプチドセグメントである免疫原 性で作られることができ、これによって高度に免疫原性のタンパク質を作成する 。別法として、そのようなポリペプチドは特異的結合に対する高度に有効な競合 体を提供するであろう。
ｈＰＤＧＦレセプターポリペプチドに対する抗体の生産は以下に記載する。
本発明はＰＤＧＦレセプターの断片およびそれに実質的にホモロガスなポリペプ チドを含む他のポリペプチドも提供する０本発明のレセプターペプチドは一般的 に、天然に存在するｈＰＯＧＦレセプターの配列と少なくとも約８０％のホモロ ジーを表し、典型的には天然のレセプター配列と少なくとも約８５％、より典型 的には少なくとも約９０％のホモロジー、通常は少な（とも約９５％のホモロジ ー、より通常には少なくとも約９７％のホモロジーを存する。比較配列の長さは 一般的には少なくとも約１６アミノ酸を表し、通常は少なくとも約２０残基、よ り通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましく は約３５残基より長い。
ポリペプチドに関するホモロジーは、典型的には配列分析用ソフトウェアを使用 して（例えばウィスコンシン州５３７０５．マジソン。
ユニバージティーアベニュー１７１０、ライスコンシン大学バイオテクノロジー センターのジェネティクス　コンピューター　グループの配列分析ソフトウェア パッケージを参照）測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、 削除、置換および他の修飾が与えられたホモロジーの測定を使用した同様な配列 と合致する。保存的置換は典型的には以下の群内の置換を含むニゲリシン、アラ ニン：バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アス パラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェ ニルアラニン、チロシン。
レセプターと他のホモロガスな、またはヘテロロガスなタンパク質との間の融合 ポリペプチドも提供される。ホモロガスなポリペプチドは種々の増殖因子レセプ ター間で融合されることができ、結果として例えばハイブリッドタンパク質はひ とつのレセプターのりガント特異性ともうひとつの細胞内領域を表し、またはレ セプターは、広がった、または弱められた結合特異性を有することができる。同 様にヘテロロガスな融合は誘導タンパク質の性質または活性の組み合わせを表す ように構成される。典型的な例はレポーターポリペプチド（例えばルシフェラー ゼ）とレセプター（例えばりガント−結合セグメント）のセグメントまたはドメ インとの融合であり、所望のリガンドの存在および位置が容易に決定されること ができる０例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許第４，８５９．６０９　（これは参照 により本明細書に編入される）を参照にされたい、他の遺伝子融合対には、細菌 性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロティンＡ、β−ラクタマーゼ、アルフ ァアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母アルファ融合因子があ る０例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８）　、５ｃｉｅｎｃｅ２４１　：　 ８１２−８１６を参照。
そのようなポリペプチドはリン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分 の付加、特にリン酸基と同様な分子形を有するものにより化学的に改変されたア ミノ酸残基を有してもよい、ある態様においては、改変は試薬を標識するために 、または精製の標的（例えばアフィニティーリガンド）として提供されて有効と なる。
融合タンパク質は典型的には組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれか で作ることができる。核酸操作法に関する技術は−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ）　（第二板）、１−３巻これは参照により本明細書に編入される０ 合成ポリペプチド法に関する技術は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３） 　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｓ、Ｓｏｃ、　８５　：２１４９−２１５６　；Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄ（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：３４１−３４７　；お よびＡｔｈｅｒｔｏｎら　（１９８６）　ｕペプチドＡ　：　・　１′（紐旦ｄ 　Ｐｈａｓｅヱ吐■臼」Ｌ刃関住り上ＶＰｒ　ｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ） 、ＩＲＬ出版、オックスフォード；これらのそれぞれは参照により本明細書に編 入される。
完全なレセプターの断片も本明細書に包含される０種々の断片にはトランスメン プラン　セグメント（これは細胞表面付着機能を付与する）を含む、細胞内また は細胞外セグメントのいずれかが削除されている種々の断片が生産される０例え ば、ＰＤＧＦレセプターまたは他のタンパク質のトランスメンプラン　セグメン トを含む断片はリガンド結合決定基と組合わされて、リガンド結合領域が結合し た膜を提供するであろう。細胞内領域との同様な構造物を調製することができ、 例えばチロシンキナーゼ　セグメントを結合した膜を生成する。
特に、リガンド結合決定基を含む可溶性断片が、遊離のリガンドを吸着するため に作成されるであろう、この可溶性断片は診断および治療の目的でＰＤＧＦ仲介 応答をブロックするために使用できる。
もうひとつの態様において、細胞内断片と類似体が調製されるであろう、チロシ ンキナーゼドメイン中のキナーゼ挿入頭載（Ｋｌ）は特に有用な断片であり以下 に記載される。
タンパク質のリン酸化領域のペプチド類似体は、他のタンパク質のリン酸化領域 とホモロジーな実質的に一次配列を有するペプチドである。そして少なくともひ とつのリン酸化または同様に誘導された残基を、他のタンパク質のリン酸化領域 中の同様なリン酸化領域の対応する位置に有する。そのような領域がふたつまた はそれより多くのリン酸化領域を有する所では、特定の態様において、ペプチド 類似体は唯一のそのようなリン酸化または同様に誘導された残基を有するであろ う、そのようなリン酸化残基は一般的に、フォスフォチロシン、フォスフォセリ ン、またはフォスフォスレオニンがある。このペプチド類似体は、ある場合には 、ひとつまたはそれより多くの非天然アミノ酸を有するであろう、それは例えば ビオチン化、リン酸化、スルホン化、またはグリコジル化により化学的に改変さ れた残基を含む、それは一般的にモノマーまたは反復ペプチド単位のマルチマー であろう、そしてしばしばヘテロロガスなタンパク質またはペプチド断片と結合 するであろう、そのようなヘテロロガスなタンパク質またはペプチドは（例えば 、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラ ーゼ、ｔｒｐＥまたはプロティンＡ）である、　Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８Ｂ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　：　８１２−　−−８１６を参照、そのようなペ プチド類似体は一般的に可溶性、または固相支持体に結合している（例えばニト ロセルロース、ナイロン、カラム充填物質（例えば５ｅｐｈａｒｏｓｅビーズ） 、磁気ビーズ、ガラスウール、細胞または他の物質。
正常タンパク質の機能に重要なタンパク質のリン酸化領域は、しばしば多くの方 法によって同定されるであろう０例えば、欠損や点突然変異でもうひとつのタン パク質に対する結合能力が変化した突然変異タンパク質、改変された酵素活性ま たは他のタンパク質の性質の改良の分析である。方法は当業界において周知であ り、インビボでペプチド領域がリン酸化されているかを決定することができる。
例えば、ＫａｚｌａｕｓｋａｓおよびＣｏｏｐｅｒ　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　 ５８　：　１１２１−１１３３　；１１ｉ１１ｉａｓｓ　（１９８９）　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４３　：　１５６４−１５７０　；およびｌ１ａｈｌら（１９９０ ）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５　：　３９４４を参照、直接的な構造決定 （例えば、Ｘ−線結晶解析または２Ｄ−ＮＭＲ）を使用して位置および相互反応 を測定でき、これはリガンドとエフェクター結合活性の両方のどの改変が相互反 応に影響するかを導く。
種々の細胞外領域中および細胞内領域態様において、断片は一般的に少なくとも 約１２００ダルトン、しばしば少なくとも２４００ダルトン、典型的には少なく とも３０００ダルトン、より典型的には少なくとも３６００ダルトン、そして好 ましい態様の幾つかにおいては少な（とも４２００ダルトンまたはそれより大き い。
ｍ、ＬＪ！ 本発明の核酸組成物は一般的にＲＮＡまたはＤＮＡ形であるが、混合したポリマ ーでもあるだろう、記載されたＤＮＡの態様は、通常ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮ Ａ、合成により調製されたものから由来したものであるか、またはそれらの混合 物であろう、ＤＮＡ組成物は一般的に、ｈＰＤＧＦ−Ｒまたはその断片をコード する完全なコード領域を含み、例えば少なくとも８コドン（２４ｂｐ）　、通常 は少なくとも１２コドン、より通常には少なくとも約１５コドン、典型的には少 なくとも約２０コドン、より典型的には少なくとも約３０コドン、そしてこのま しくはそれより大きい。ひとつまたはそれより多いイントロンが存在してもよい 。
ｈＰＤＧＦ−Ｒという用語は、核酸に通用された場合、おおざっばにｈＰＤＧＦ −Ｒポリペプチド、断片または変異体を言い、タンパク質融合体または欠損変異 体を含む。配列またはその相補体が、ヌクレオチドトリプレットのユニバーサル コードにより与えられ、ポリペプチドの一次構造に翻訳される時、核酸はポリペ プチドをコードする。
”単離されたｎ核酸は核酸（例えば、ＲＮＡ、　ＤＮＡまたは混合ポリマー）で あり、これは実質的に天然のヒト配列（例えば、リボゾーム、ポリメラーゼおよ び他のヒトゲノム配列）に天然に付随する他のＤＮＡ配列から分離される。この 用語は天然に存在する環境から取り出された核酸を包含し、ならびに＆ｌｌ換え またはクローン化ＩＩＮＡ単離物および化学的に合成された類似体または生物的 にヘテロロガスな系で合成された類似体を含む、実質的に純粋な分子には分子の 単離形態を含む、単離核酸は一般的に分子が均一な組成物だが、ある態様におい てはわずかな異成分を含むだろう、この異質性は典型的にはポリマーの末端また は部分に見いだされ、所望の生物機能または活性には重要ではない。
“コードする”という用語は、一般的に翻訳できる形態中に存在する配列情報を 言い、通常は操作できるようにプロモーターに連結されている０機能的プロモー ターがその配列の翻訳または発現を増大する時、配列は操作できるようにプロモ ーターに連結される。同じ情報内容がすぐにアクセスできる形態に存在し、特に センス鎖の発現を促進する配列に連結されている場合、アンチ−センス饋もその 配列をコードしていると考えられる。情報は遺伝子コードの標準法または改良法 を使用して転換できる０例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）、τｈｅ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　（第４版）、第１お よび２巻、ベンジャミン、メンロパーク　カリフォルニア州（Ｂｅｎｊａｍｉｎ 、　Ｍｅｎｌ。
Ｐａｒｋ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　。
０組換え”という用語は天然には存在しない核酸配列を言い、またはふたつの異 なる分離している配列のセグメントの人工的組み合わせにより作られたものを言 う、この人工的組み合わせはしばしば化学合成手段または核酸の単離セグメント の人工的操作（例えば、遺伝子工学的技術による）による、それは通常、典型的 には配列認識部位に導入または除去して、コドンを同一または保存的アミノ酸を コードする重複するコドンに置き換える。別法として、所望の機能の核酸セグメ ントを一緒に繋いで通常天然には存在しない、所望の機能の組み合わせを含む単 一の遺伝的産物を生成する。制限酵素認識部位はしばしばそのような人工的操作 物の標的であり、例えばプロモーター、ＤＮＡ複製部位、制御配列、コントロー ル配列、または設計により有効な特徴を組み入れることができる。同じ概念は組 換え（例えば融合、ポリペプチド）にも意図される。ホモロガスな配列は、比較 した時、同一性を表す、核酸についてホモロジーに関する基準は、この技術につ いて一般的に使用されるホモロジーについての測定か、またはハイブリダイゼー ション条件のいずれかで表される。ハイブリダイゼーション条件は以下に記載さ れるが、さらに対応するヒトとマウスセグメントとの間のホモロジーにより制限 される。記載したパラメーターに加えて、記載したホモロジー特異性は比較され るセグメントである対応するマウスセグメントが、記載されたヒトセグメントに 適合するための十分な条件によって制限されるように、ホモロジーはヒトとマウ ス配列の間の同一性によって制限されるであろう。
核酸内容物中の実質的なホモロジーとは、比較する場合、セグメントまたはそれ らの相補鎖のいずれかが、適当なヌクレオチド挿入および削除ををして至適に配 列した時に、少なくとも約６０％残基、通常は少なくとも約７０％、より通常に は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは 少なくとも９５−９８％のヌクレオチドの同一性を意味する。択一的に、実質的 なホモロジーはセグメントが選択的条件下において鎖またはその相補鎖、典型的 には表２または３から由来した配列を使用したものにハイブリダイズする時にホ モロジーが存在する。ハイブリダイゼーシヨンの選択性はハイブリダイゼーシヨ ンの発生が特異性が全く無い場合よりもより選択的である時に存在する。典型的 には選択的ハイブリダイゼーシヨンは、少なくとも約１４ヌクレオチドの長さに わたって、少なくとも約５５％のホモロジー、好ましくは約６５％、より好まし くは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％ある時に起こ るであろう、　Ｋａｎｅｈｔｓａ　（１９８４）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、 １２　：２０３−２１３を参照のこと（これは参照により本明細書に編入される ）、記載したようにホモロジーの長さの比較は、より長くてもよく、そして特定 の態様においては、しばしば少なくとも約１７ヌクレオチドの長さにわたり、通 常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチ ド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチドより典型的には少なくとも約３２ ヌクレオチド、そして好ましくは少な（とも約３６ヌクレオチドかそれより長い 、ホモロジーに関するストリンジェント条件は、典型的にハイブリダイゼーショ ン条件において制御された塩、温度、を機溶媒および他のパラメーター条件の組 み合わされたストリンジエンシーになるであろう、ストリンジェントな温度条件 は一般的に３０℃を越える温度、典型的には３７℃を越え、そして好ましくは４ ５°Ｃを越える。ストリンジェントな塩条件は、通常は１１００ｈより低く、典 型的には５００ｍＭより低く、そして好ましくは２００ｍＭよりも低い、しかし パラメーターの組み合わせは任意の単一バラメーターの測定よりもさらにより重 要である。　ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ　（１９６８）　Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、３１　：　３４９−３７０を参照のこと（これは参照により本明細 書に編入される）。
これらの対立遺伝子の野生型タイプが一般的に採用されるが、ある状況において はひとつまたはそれ以上の突然変異、わずかな変更を導入してもよく、それは例 えば削除、置換または挿入のようなものであり、アミノ酸配列の変更を生じ、ア ミノ酸配列またはアミノまたはカルボキシ末端のわずかな突然変異または変更を 与える。
ｈＰＤＧＦ−Ｒともうひとつのタンパク質との間の遺伝子融合、またはタイプＡ とタイプＢ形との間の融合が有効になる状況もある０通常ゲノム性の核酸は、し ばしば約５０ｋｂを越えることは無（、より頻繁には約４０ｋｂを越えることは 無く、典型的には約３０ｋｂを越えることは無く、より典型的には約２０ｋｂを 越えることは無く、通常は約１０ｋｂを越えることはなく、そして種々の１！様 において、好ましくは約６ｋｂを越えないであろう、そのような配列は任意のま たはすべてのイントロンが除去されてよい。
ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ断片は、実質的にｈＰＤＧＦ−Ｒとホモロジ ーを共有する他の種のＰＤＧＦレセプターをコードする［ｌＮＡを単離するため に有用である。細胞内チロシンキナーゼ領域からの断片を使用して他のチロシン キナーゼを単離することができる。少なくとも約１０ヌクレオチド、通常には少 なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約３０ヌクレオチドを有 するＤＮＡ断片の部分、およびｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列からの約 ６ｋｎｔ（キロヌクレオチド）より少ない、通常は約Ｑ、５ｋｎｔより少ない部 分がプローブとして使用される。このプローブはｈＰＤＧＦ−Ｒまたはその断片 をコードするＲＮＡが細胞に存在するかどうかを決定するために使用できる。
加えて、タイプＢヒトＰＩ）ＧＦレセプター遺伝子は染色体５に位置し、ここに は多くの成長制御関連遺伝子が集まっている。すくな（ともひとつの遺伝子疾患 、５ｑマイナス症候群はこの領域の欠損が関与遺伝子に近い染色体４に位置する 。これらの配列はしばしば無欠の遺伝子であり、これらの染色体領域の完全性を 診断するために使用されるであろう、ｈＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子配列の断片は、マー カーとしてゲノムのこれらの重要な構造を釣り上げて、ゲノムのこれら領域に関 連する遺伝子疾患を診断するために使用される。択一的にこの配列は染色体領域 の完全性を試験するための他の断片を単離するために有効である。
本発明の融合タンパク質を製造するために使用される組換え核酸配列は、頻繁に は天然または合成配列から由来するものである。多くの天然遺伝子配列は種々の ライブラリー、ｃＤＮＡまたはゲノムから適当なプローブを使用して入手可能で ある０国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ”ヲ参照、ヒ）　ＰＤＧＦレセプターの 典型的ブローフハ、標準法に従い表２または３の配列から、またはそれらの対立 遺伝子から選択されるであろう、　ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒ ｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｒａ。
Ｌｅｔｔｓ、　２２　：　１８５９−１８６２により記載されたフォスフォアミ グイト法は適当な合成りＮＡ断片を生成するであろう。二重鎖断片は、相補鎖を 合成して適当な条件下で鎖をアニーリングするか、または適当なプライマー配列 ををするＯＮ＾ポリメラーゼを使用して相補鎖を加えることによりしばしば得ら れる。
ＩＶ、ＰＤＧＦレセプ　−　び　るための本発明で提供される新規核酸はｐｏｃ ｐレセプターを作成するために有効である。　ＤＮＡ断片またはそれらの部分は 、ｈＰＤＧＦ−Ｈのための発現構造物を調製するために使用される０発現構造物 は通常は、天然のまたは他のプロモーターの転写制御下でｈＰＤＧＦ−Ｒをコー ドするひとつまたはそれより多いＤＮＡ配列を含む。ｈＰＤＧＦ−Ｒをコードす るひとつより多い配列が構造物中に存在する時、配列はレセプターの同一または 異なる形態（通常は異なる）をコードするであろう０通常プロモーターは哺乳類 細胞で発現するための真核生物プロモーターであり、哺乳類細胞はＰＤＧＦレセ プターがあっても無くてもよい、転写制御配列は典型的にはヘテロロガスなエン ハンサ−またはプロモーターを含み、それは宿主により認識されている。適当な プロモーターの選択は、宿主に依存するが、ｔｒｐ、　ｌａｃおよびファージプ ロモーター、ｔＲＮ＾プロモーターおよびＷ溶解酵素プロモーターのようなプロ モーターが知られている０例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照。
便利なことには、複製システム、転写および翻訳制御配列とともに繊維芽増殖因 子レセプターＤＮＡ配列の挿入部位を含む入手可能な発現ベクターを使用するこ とができる。細胞系と発現ベクターとの作業可能な例は、５ａｓｂｒｏｏｋら（ １９８９）　Ｊｉ上、Ｍｅｔｚｇｅｒら（１９８Ｂ）、Ｎａｔｕｒｅ　３３４　 ：　３１−３６　、それぞれ参照により本明細書に編入される。
特に非−真菌中で発現が起こる場合、非−真菌、プロモーターが好ましい０時に は他の細胞タイプ中で配列を発現させることが有効かもしれないし、適当なプロ モーターを選択できる。そして場合によっては、誘導可能なプロモーターが好ま しい、他の状況では、異なる細胞タイプにより与えられる同様なグリコジル化パ ターンを提供するグリコジル化酵素を同時発現することが望まれる。
原核生物宿主中でＤＮ＾配列を伸ばしたり、またはレセプタータンパク質または その断片を生成したい場合には、好ましいプロモーターは原核生物プロモーター であり、例えばｔｒｐＨａＣおよびｌａｍｂｄａであり、その他の有用な原核生 物プロモーターについてはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい０通 常、強力なプロモーターを使用する高レベルの転写および発現が提供されるであ ろう。
発現構造物はしばしば適当な細胞性宿主中で染色外で安定に存在できるベクター 中に含有されるか、または宿主のゲノム中に統合される０発現構造物は宿主中へ 挿入できる配列によって境界を定めることができ、例えば、トランスポゾン配列 、溶層性のウィルス配列などである０通常マーカーが発現構造物に与えられ、こ れはその発現構造物ををする宿主細胞の選択を可能にする。マーカーは同じＤＮ Ａ分子であってもなくてもよく、好ましくは同じＤＮＮ骨分子ある。
哺乳類細胞において、レセプター遺伝子それ自体が便利なマーカーを提供するで あろう。しかし、原核生物細胞中では細胞毒性剤、原栄養体への栄養要求性宿主 の付与、検出できる生成物の生産などのマーカーがより便利であろう。
発現構造物は目的宿主細胞によって認識される複製系に結合される０種々の複製 系にはウィルス複製系（例えばレトロウィルス、シミアン、ウィルス、ウシパピ ローマウィルス、などのような）を含む、加えて構造物は増幅しうる遺伝子に連 結され（例えばＤＨＰＲ遺伝子）所望のｈＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の多数のコピーを 作ることができる。
５ｃｈｉｓｉｋｅ、　Ｒ，（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　３７　：　７０５−７１３ 　、およびＫａｕｆｍａｎら（１９８５）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ！ｏｆ、　５　 ：　１７５０−１７５９　；それぞれ参照により本明細書に編入される。
特にレセプターポリペプチドを、非真菌のグリコジル化パターンを与える系で発 現させることが望まれる。この場合には通常のパターンはその発現系により自然 に提供されるものとなる。しかしパターンは、ヘテロロガスな発現系に導入され た適当なグリコモル化タンパク質に暴露させることにより、例えば非グリコジル 化形態に変更されるであろう０例えばＰＤＧＦレセプター遺伝子は、哺乳類また は他のグリコジル化酵素（好ましくは非真菌種から、ある態様においては非ヒト 種から生成した）をコードするひとつまたはそれより多くの遺伝子と共に同時ト ランスフエフシランされることができる。
この方法を使用して特定の哺乳類グリコジル化パターンが原核生物または他の細 胞から達成される。
発現構造物を宿主細胞に導入する手段は特定構造および標的宿主により変化する 。導入は任意の便利な手段により達成することができ、それには融合、接合、ト ランスフェクシヨン、形質導入、エレクトロポレーション、注入などが含まれる ０例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、モレキュラークローニングニア　ラ ボラトリ−ガイド、第３巻、コールドスプリングハーバ−出版、これは参照によ り本明細書に編入される。レセプターの種々の形態をコードする構造物の単一細 胞への導入も意図されている。宿主は通常不滅化細胞である（例えば培養中に連 続的に継代生育できる細胞）、大部分、これらの細胞は便利な哺乳類細胞であり 、ｈＰＤＧＦ−Ｒを発現でき、ならびに所望により適当な成熟ポリペプチドを提 供するように操作することができる。
操作により、意図されるものはグリコジル化、ユビキチネーシ町ン、ジスルフィ ド結合形成、一般的な翻訳後修飾などである。通常宿主はｈＰＤＧＦ−１７を細 胞の膜に挿入するためのシグナル配列を認識する。
分泌が望まれる場合は、トランスメンプラン配列を一般的に削除または突然変異 してタンパク質の膜配位を防ぐ。
原核生物および真核生物の両方の広範な宿主がペプチドの発現に使用される。有 用な宿主は細菌、例えばＥ、　Ｃ０Ｉ１．ｌ酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細 胞、典型的には不滅化された種々のマウス細胞系、サル細胞系、チャイニーズハ ムスター卵巣細胞系、ヒト細胞系、それらの誘導物などである。ある場合には、 細胞は悪性宿主誘導細胞で、または野生型細胞はガン遺伝子、腫瘍発生ウィルス などで形質転換されるであろう。
ある状況下においては、例えばシグナル配列およびトランスメンプラン領域が細 胞膜のレセプターペプチドを支配する構造物でＰＤＧＦレセプターを欠（哺乳類 細胞をトランスフェクトすることが望まれる。形質転換またはトランスフェクト した細胞の子孫も包含することを意図する。リンパ球および心筋細胞がレセプタ ー欠如の主な細胞例である。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）　、内 皮細胞系および多くのヒト腫瘍細胞系もＰＤＧＦレセプターを欠く。
ｈＰＤＧＦレセプターおよび断片を含む組成物および細胞は、ｈＰＤＧＦレセプ ターに付随する診断の目的に、ならびに疾患および医学的状況を研究または処置 するために使用できる。可溶性細胞外リガンド結合断片の使用は、既に一般的に 記載されている。加えて、細胞内領域の種々のセグメントは、リン酸化アミノ酸 残基を含む、リン酸化の部位はセグメントと他のポリペプチドとの反応に重要で ある。反応の性質および特異性は、リン酸化の有無および完全なレセプターの断 片、または関連配列に高度に依存しており、反応をｆ：ＵＲするために有効であ る。すなわち、細胞内領域断片には重要な使用目的を見いだす。
明らかな配列を含有するクローニング媒体を発現する細胞は、特定の活性に影響 を与えるために必要なＰＤＧＦレセプターの特異的部位を定めるために使用でき る。別法として、これらの細胞は選択したレセプターが種々のリガンド（ＰＤＧ Ｆおよび類似体）に結合する能力を評価して、これによりＰＤＧＦ−誘導の細胞 応答を促進または阻害するための薬剤の能力を評価する有力な手段を提供する。
完全長の天然ＰＤＧＦ−Ｒ配列を含有するＤＮＡまたはｍＲＮＡをトランスフェ クト、注入、感染またはエレクトロポレーションした細胞は、天然または野生型 レセプターを発現し、従ってしばしば完全長セグメントよりも少ない応答は所望 の同等な機能を有するであろう、精製レセプターまたはレセプターポリペプチド 断片の特異的濃度は、リガンド（ＰＤＧＦ）の天然ＰＤＧＦレセプターへの結合 をブロックするために使用できる。別法として、レセプターまたは断片に対する 抗体も同様の効果を有する。特に、本明細書では細胞外領域のエピトープに対す る抗体がリガンド−レセプター結合をブロックできることを実証した。他の抗体 はレセプターポリペプチドの二量体化をブロックするであろう、そして従ってレ セプター機能を変調するであろう。
均一で明らかなポリペプチドおよびＤＮＡ配列が、抗体上昇とその結合の特異性 を定めるために使用できるであろう、特に、レセプターの特異的領域（例えぼり ガント−結合セグメント）に対する抗体は診断および治療に使用されるであろう 、レセプターの領域に特異的なＰＤＧＦ−Ｒ，ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド、およ び抗体試薬は、ＰＤＧＦ仲介活性の制御を研究するために使用できる。細胞内断 片（特にキナーゼ挿入セグメント）は重要な使用法を有するであろう。
ＰＤＧＦは組織修復、胚形性に役割を持ち、ならびにアテローム硬化症、骨髄増 殖性疾患およびいくつかの癌に関与するらしい、これらの症状の処置は可溶性細 胞外断片または抗体の治療的投与による弱化に対応する０例えばＰＤＧＦアゴニ ストは細胞の増殖的成長を刺激し、ひとつの効果は傷の修復、筋肉再生、および 動脈壁増殖に極めて有効である。ＰＤＧＦアンタゴニストはいくつかの場合は過 剰な応答を遮断するため、またはＰＤＧＦ応答を変調するために使用される。
ヒトＰＤＧＦ−Ｒ細胞外領域からの約５から２００の間の、好ましくは約１０ま たは１５から５０の間の可溶性ＰＤＧＦ−Ｒポリー°ブ千ドを含有する組成物が 記載されている。ひとつの態様において、ポリペプチドは表２のタイプＢヒトＰ ＤＧＦレセプターの残基１から４９９からの、または表３のタイプＡヒトＰＤＧ Ｆレセプターの残基１から５０１からの少なくとも約８０アミノ酸を含有する。
もうひとつの態様において、細胞内領域の断片は種々の使用法を有する。特に、 Ｋｒ１Ｊｊ域は、およびその断片または類似体は、リン酸化領域の相互反応を、 認識相互反応（通常はもうひとつのタンパク質による結合）でブロックまたは変 調するために使用される。これらの相互反応はしばしばさらなるシグナル伝達お よび細胞応答に重要である。
トランスフェクトした細胞により発現されたｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質にも様々 な使用法がある。もしペプチドが分泌されると、ペプチドは典型的には発現宿主 が生育する上澄みから単離されるであろう。
分泌されない場合、典型的にはペプチドは例えば溶解物から単離されるであろう 、このペプチドは一般的には、ＨＰＬＣ１電気泳動、勾配遠心、アフィニティー クロマトグラフィー、（例えばＰＤＧＦカラムクロマトグラフィーを使用する） 、および他のタンパク質生化学に使用されるタンパク質精製法を使用する便利な 技術によって単離され、実質的に純粋な生成！ＩＩＦＩ（例えば特に細胞成分混 入物を含まない）が得られる。例えばＪａｃｏｂｙ　（１９８４）　Ｍｅ旦姐ユ ｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ■、第１０４巻、アカデミツクプレス、ニューヨーク；　 ５ｃｏｐｅｓ　（１９８７）タラ２シ江１生底ユ％　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ。
（第２版）、スプリンガー　ファーシーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ） 　、＝ニーヨーク：ドイツ（ｍ集）　（１９９０）　ンパク　ガイド（Ｇｕ　１ ｄｅｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、　門ｅｔｈｏｄ　ｉ ｎ　Ｅｎｚ　−ｏｌｏ　、　第　１８２ｊＪ！　；　それぞれは参照により本明 細書に編入される。
タイプロレセプターの約１ｅｕ（１）から始まりｌｙｓ　（４９９）のアミノ末 端配列のレセプタータンパク質、またはタイプＡレセプターの約ｇｌｎ（１）か らｇｌｕ（５０１）のアミノ末端配列のレセプタータンパク質アミノ酸は、これ らは全細胞外領域を形成し、そして特にレセプタータンパク質のＰＤＧＦリガン ド結合部位を形成するが、ＰＤＧＦのアフィニティー精製に有用であると思われ る。細胞外領域は、ＰＤＧＦアゴニストおよびアンタゴニストとして有用な薬剤 を定めるために固体支持体に固定するか、または溶液中に自由に存在して使用で きる。
タンパク質の細胞内領域は、タイプロレセプターの約ｖａ　１　（５００）から 始まりカルボキシ末端まで、またはタイプＡレセプターのｌｅｕ　（５０２）か らのカルボキシ末端までであるが、これらも周知技術によるタンパク質リン酸化 のためのチロシンキナーゼとして使用される。加えて、タイプロレセプターのア ミノ末端配列のアミノ酸■ｅｔ（−３２）からＧｌｙ（−１）、およびタイプＡ レセプターの約−ａｔ（−２３）からＣｙｓ　（−１）は、トランスフェクトし た細胞膜を貫通する構造タンパク質を支配するシグナル配列を構成する。これら のシグナル配列はｈＰＤＧＦ−Ｒと共に使用されるが、他のタンパク質と融合さ れる場合は、そのタンパク質と共に使用されると期待される。
ヒトＰＤＧＦレセプターポリペプチド断片は、短縮された核酸配列の直接的発現 またはｈＰＤＧＦレセプターの標準的プロテアーゼ処理のいずれかによって生成 され、好ましくは精製される。いずれの方法のだめの試薬も本明細書で提供され る。
診断目的として、これらの試薬は標的試料中のＰＤＧＦまたはＰＤＧＦレセプタ ーの測定法を提供する。その測定法は：標的試料をｈＰＤＧＦレセプターポリペ プチドセグメントと混合し；そして該ポリペプチドと該試料の間の結合の程度を 決定する、工程からなる。
本発明は形質転換細胞も提供し、これは初代形質転換体の子孫も含み、少なくと もヒトＰＤＧＦレセプターのセグメントにホモロガスなポリペプチドを発現する ことができる。好適な態様は、細胞が実質的にヒトＰＤＧＦレセプターの全細胞 外領域にホモロガスなポリペプチドを発現する場合であり、可溶性タンパク質を 含む。
■、五−生 種々のＰＤＧＦレセプターおよびペプチド断片に対するポリクローナルおよび／ またはモノクローナルも調製できる０合成ペプチドはペプチド合成機で調製でき 、キャリアー分子（例えば、カギ穴巻貝ヘモシアニン）に結合して、数カ月間に わたり、ラビットに注射する。
ラビットの血清をＰＤＧＦレセプタータンパク質または断片に対する免疫性につ いて試験する。モノクローナル抗体は、マウスにｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質、ｈ ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチドまたは高レベルのクローン化ＰＤＧＦレセプターをそ の細胞表面に発現している細胞を注射することによって作成される。モノクロー ナルをＥＬＩＳＡにより検索して、ＰＤＧＦレセプタータンパク質またはそのポ リペプチドとの特異的免疫活性を試験する。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ　（１９ ８８）　、抗体ニア　ラボラトリ−マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）コールトスプリンダハ−バー出版、ニ ューヨークを参照（これは参照により本明細書に編入される）。これらの抗体は アッセイ、または他の薬品として有用である。
一旦、十分量の所望のｈＰＤＧＦレセプターポリペプチドが単離されたら、タン パク質は様々な目的に利用される。典型的な使用法としては、これらのレセプタ ーへ特異的に結合する抗体の生産である。
これらの抗体は、通常ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり、 通常インビトロまたはインビボの技術により（例えば定義され、認識されている 特定抗原決定基またはエピトープの目標に対して）生成される０通常エピトープ は、連続したアミノ酸残基の分子形により与えられるが、連続的に一列でなくて もよく、しかし二次または三次構造により間隔的に接近している。特に、表２ま たは表３に記載された少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列にホモロガスな ペプチドは、免疫原として有効である。最も興味のあるエピトープは、細胞外領 域に見いだされるシグナルセグメントまたは免疫グロブリンドメインからのもの であり、特にＰＤＧＦリガンド結合領域の周りのものである。しかし、他のセグ メントもまた重要であり、それは細胞内領域のリン酸化部位、例えばリン酸化さ れている、またはされていないキナーゼ挿入セグメントである。
ポリクローナル抗体の生産については、適当な標的免疫系が選択され、典型的に はマウスまたはラビットである。実質的に精製された抗原が、免疫学者に周知の 動物′または他のパラメーターに適する方法による様式で免疫系に与えられる。
注射の典型的部位は支脚皿、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、ある 時は他の種、ヤギ、ヒツジ、ウシ、モルモット、およびラットがマウス、ラビッ トに代わるであろう。
免疫応答は普通、イムノアッセイでアッセイされる０通常はそのようなイムノア ッセイは抗原源の精製を含み、例えば同一細胞により抗原が生産されたのと同じ 様式で生産される。イムノアッセイは、場合によってはラジオイムノアッセイ、 酵素−結合アッセイ（ＥＩＪＳＡ）、蛍光アッセイ、または他の多くの任意に選 択されるものであり、その中の多くは機能的に均等であるが、特定条件下で利点 を有するかもしれない。
１０”Ｍ−’、好ましくは１０９から１０Ｉ＠の、またはより強い親和性を持つ モノクローナル抗体は、典型的には、例えばＨａｒｌｏｗおよび１ａｎｅ、抗体 ニア　ラボラトリ−マニュアル、Ｃ３Ｈラボラトリ−（１９８８）　ｉまたはＧ ｏｄｉｎｇ　（１９８６）　、モノクローナル抗体：理論と実ｉ１（第２版）、 アカデミツク　プレス、ニューヨーク；に記載されている標準法に従って作成さ れる。これらのそれぞれの文献は参照により本明細書に編入される。端的には、 適当な動物が選択されて、所望の免疫感作を引き続き行う、適当な期間が経過し た後、その動物の膵臓を取り出して、各肺臓細胞を融合し、典型的には適当な選 択条件下で不滅化したミエローマ細胞と融合する。その後、クローン的に分離し て各クローンについて、所望する抗原の領域に特異的な適当な抗体生産を試験す る。
他の適当な技術には、リンパ球を抗原性ポリペプチドにインビトロ暴露する、ま たは別法としてファージまたは同様なベクター中でのライブラリーの選択がある 。　Ｈｕｓｅら（１９８９）　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａＬａｒｇｅ　Ｃ ｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｆｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉａｍｕｎｏｇｌ ｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎ　Ｐｈａｓｅ　Ｌａｍｂｄａ″５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４６　：　１２７５−１２８１を参照、これは参照により本明細書 に編入される０本発明のポリペプチドおよび抗体は改変して、またはせずに使用 できる。多くの場合、ポリペプチドと抗体は検出しうる信号を与える物質と共有 的または非共有的に結合することにより標識される。広範な標識および結合技術 が周知であり、科学文献および特許明細書に詳細に報告されている。適当な標識 には、放射核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分 、磁気粒子などがある。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第 ３．ＥＨ７，８３７；　３．８５０．７５２；　３，９３９，３５０；３．９９ ６，３４５；　４．２７？、４３７；　４．２７５．１４９；および４，３６６ ．２４１号がある。
また組換え免疫グロブリンも作成され、Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４．８１６ ，５６７号を参照のこと。
完全長ペプチドまたはその一部分は、特定の態様において、ポリクローナルまた はモノクローナルの抗体を生産するために使用される。抗体は適当なを椎動物（ 例えばマウス）を抗体のペプチドまたは断片で、またはアジユバントと混合して 免疫感作することにより作成される０通常、２回又はそれより多い免疫感作が行 われ、血液または膵臓が最終注射の数日後に回収される。ポリクローナル抗血清 については、免疫グロブリンが沈殿し、単離、アフィニティー精製を含んで精製 される。モノクローナル抗体については、肺細胞が不滅化リンパ球（例えばミエ ローマ系）とハイプリドーマに選択的な条件で融合される。ハイブリドーマは一 般的に限定希釈条件下でクローン化され、その上澄みが所望の特異性を有する抗 体について検索される。抗体を生産するための巷毒傘技術は文献で周知であり、 Ｇｏｄｉｎｇ　（１９８６）、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 　：　Ｐｒ１ｎｃｔｐｌｓｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）アカデミツ クプレス、Ｎ、Ｙ、ならびにＨａｒｌｏ−およびＬａｎｅ（１９８８）　１ｌｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　％コールドスプ リングハーバー　ラボラトリ−、ニューヨーク、そして米国特許第４，３８１， ２９２．４．４５１．５７０および４．６１８，５７７に例示されており、これ らは参照により本明細書に編入される。これらにより作成された抗体は種々の細 胞応答の要因であるレセプターの部分を、ならびにレセプター自体の一般的プロ セッシングおよび成熟を詳細に検討するために多（の利用法を有する。抗体アゴ ニストおよびアンタゴニストも生産されるであろう。
免疫原性および結合の特異性を決定するための試薬として役立つ部分および断片 は本明細書にて提供される。
■、１里基 本発明はヒト血小板由来増殖因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）精製法を、細胞 中でＰＤＧＦレセプターを合成する方法と同様に提供するものである。これらの 方法により生産される均一なレセプター、レセプターおよびレセプターの一部分 をコードする核酸配列、これらの配列を含有する発現媒体、ＰＤＧＦ−レセプタ ーを含む細胞そしてレセプターに対する抗体も提供する。特に目的とするものは レセプターの断片であり、これは特定リガンドへの結合を、レセプターと競合す る機能的結合部位を有する０例えば０ｒｃｈａｎｓｋｙら（１９８Ｂ）　″血小 板由来増殖因子レセプターの短縮された形態のフォスファチジルイノシトール結 合（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　Ｌｉｎｋａｇｅ　ｏｆ　Ｔｒ ｕｎｃａｔｅｄ　Ｆｒｏｍ　ｏｆｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　 Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）”Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｍ 。
２６３　：　１５１５９−１５１６５を参照、これはＰＤＧＦレセプターの細胞 外領域がＰＤＧＦリガンドに結合できる証拠を提供する。また、リガンド結合へ の細胞応答に重要な他のタンパク質と反応するリン酸化のためのリン酸化断片お よび部位を提供する。特に可溶性細胞外領域セグメントが提供される。
トランスフェクトされた細胞はＰＤＧＦへの細胞応答を研究するために使用され る。制御された研究のために、ＰＤＧＦレセプターを欠く哺乳類細胞を、ｈＰＤ ＧＦ−Ｒをコードする［ｌＮＡ配列を含む発現構造物でトランスフェクトするこ とができる。レセプターをコードする細胞が生産され、これはしばしば機能的に 野生型タイプレセプターと同等であり、細胞にＰＤＧＦ−感受性マイトジェン性 応答を付与する。このように、天然に存在するＰｒＪＧＦの結合の性質は、断片 および合成化合物についてタンパク質捧および非タンパク質様の両方について分 析される。実施例の章で実証するように、トランスフェクトされた細胞が使用さ れて、ＰＤＧＦのＡＡ形はタイプロレセプターチロシンキナーゼを活性化するこ とが測定された。単−細胞中のタイプＡおよびタイプＢレセプクーポリペプチド の存在は、レセプター結合の性質を研究することを容易にし、そしてレセプター の相互反応さえも研究できるであろう。
ＰＤＧＦ−仲介マイトジェン原性の研究に加えて、トランスフェクトされた細胞 が使用され、ＰＤＧＦアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する薬剤能力 を評価することができる。特に、トランスフェクトされた細胞を、試験薬と接触 させて、応答量を測定する（例えばレセプターチロシンキナーゼ活性またはＤＮ Ａ合成速度をＰ［ｌＧＦまたはその類似体の存在または不存在下での対照細胞と 比較する）、別法として、非治療的な状況において、溶液中に存在するＰＤＧＦ 類似体とＰＤＧＦレセプターとの間の結合の阻害に関する方法が提供される。
この方法はＰＤＧＦレセプターペプチド（例えば表２または表３に記載された配 列とホモロガスなペプチド）を、溶液に加えるか、またはペプチドの突然変異ま たは修飾から成る工程を含む、　ＰＤＧＦ変異体に対する結合親和性もそのよう な細胞により評価される。結合の阻害は、レセプターまたはリガンドについての 競合または結合の妨害により起こる。このアッセイは、試験リガンドの存在また は不存在の比較により使用され、または置換アッセイ（これは置換するりガント を結合が生じた後に加える）による。
しかし、上述したように、ＰＤＧＦレセプターは二量体で機能するようである。
レセプターの可溶性形態は二量体化を妨害し、態様によってはＰＤＧＦリガンド についての競合親和性とは異なる機構によりシグナルの伝達を遮断するのに効果 的であることもある。可溶性、または種々のレセプター形態の細胞内またはトラ ンスメンプラン断片は、二量体化を妨害し、従って少なくともあるタイプのまた はある断片のシグナル伝達を遮断する。
この考察により、ＰＤＧＦレセプターにＰＤＧＦが結合するのを阻害するのに有 効量のＰＤＧＦレセプター遮断薬を患者に投与することから成る、インビボＰＤ ＧＦレセプター調節活性を変調する方法が提供される。ある場合には、レセプタ ー複合体の機能的集合により、またはさらにレセプターと細胞応答に影響する重 要な他のタンパク質（例えばフォスフォチロシン結合相互反応）により遮断がリ ガンド結合のレベルで起こるであろう。上記のごとく、タンパク質のＰＤＧＦフ ァミリーは、多くの重要な生理学的過程を制御する重要な役割を持つ、可溶性Ｐ ＤＧＦ−Ｒポリペプチドはこれらの過程のＰＤＧＦｔｉ節の程度を変調させるの に一般的に効果的である。この理由から、レセプターの可溶性形態はＰＤＧＦの 競合的結合部位として有効である。同様に、短縮されたＰＤＧＦ結合部位、また は突然変異した結合部位（特に記載したヒト形態からのもの）は、場合によって は天然形態のものと同等に効果的で、経費上および投与に際しての医学的副作用 という意味でもより低コストである。
本明細書により提供される試薬は、ＰＤＧＦＩＩ似体、またはレセプターについ てのＰＤＧＦ　−樺リガンド、またはＰＤＧＦレセプターポリペプチド生産の定 量的検出または診断に使用される０種々の医学的状況は、これらのタンパク質の いずれかの異常生産レベルによって指示される（例えば種々の腫瘍状１り、従っ て、今これらの試薬に依存した診断試験が入手できる。
種々のＰＤＧＦタイプで、セグメントをキメラレセプターに組こんで、種々のリ ガンドに関する親和性の多様性を臂する種々のタイプのレセプターを形成する０ 本発明の遺伝子およびタンパク質で、種々の組織タイプに特異的な種々のパター ンおよびレセプタータイプの間の識別が見いだされる。従ってＰＤＧＦレセプタ ー発現の差異に基づく組織マーカーが得られる。
ヒ）　ＰＤＧＦレセプターの細胞外の種々の領域を含有する可溶性断片は、完全 なタイプＢ　ＰＤＣＩ’レセプターと同じく高親和性結合を維持することが示さ れた。ヒトレセプターの細胞外領域はＣＨＯＩＩ胞中で高レベルで発現され、培 地に分泌された。リガンドの存在下では、可溶性細胞外断片は、ＢＢ−ＰＤＧＦ が生理的マイトジェン応答の特徴である応答を開始する能力を遮断する。可溶性 断片は唯−ＢＢ　ＰＤＧＦに結合する高親和性も保持しているが、ＡＡ　ＰＤＧ Ｆによるマイトジェン効果は変化しない、ヒト細胞外領域を使用したさらなる実 験では、この断片はりガントの存在についてアッセイするための（例えば競合に より）結合セグメントとして使用できる。これらの結果は、ＰＤＧＦに過剰に応 答する様々な症状を治療する可能性を示唆し、例えばそれはアテローム硬化症、 骨肉腫、ダリア芽Ｉである。マイトジェン性応答は可溶性細胞外断片の使用を通 じて弱めることができる。
ＰＤＧＦへの生理学的応答の遮断はリガンドのレセプターへの結合を阻害するこ とから生じ、おそらく競合的阻害を通じて行われると思われる。すなわち本発明 のインビトロアッセイは、これらレセプターのりガント結合セグメントまたは固 相基材に結合した断片を含む可溶性断片を一般的に使用する。これらのアッセイ はまた、結合セグメント突然変異および修飾の、またはリガンド突然変異または 修飾（例えばリガンド類似体）の効果の診断用測定を可能にする。
可溶性断片はまた、レセプターと修飾リガンド（例えばビオチン化ＡＡアイソフ オームまたは他のＰＤＧＦ形）との相互作用を試験するためにも使用される。リ ガンド作用を遮断するためのもうひとつの手段は、適当な多タンパク質（ｍｕｌ ｔｉ−ｐｒｏｔｅｉｎ）　レセプター会合（例えば二量体化）、または他のタン パク質との細胞内領域相互作用を妨害する事になろう、特に、特定のリン酸化と いう出来事が他の細胞内機能を媒介する他のタンパク質との相互作用を制御する ことを実証する。このための種々のアッセイが当業界で周知であり、以下に記載 される。
レセプター成分は、同等物または、他のタイプのポリペプチド（例えばタイプＡ およびタイプＢ形からの断片を交換すること）からの、または他の関連ペプチド （例えばマウスレセプターまたは関連レセプター）からの対応する可溶性断片で 置換することができる。
さらに、タイプＡホモニ量体は３つのすべてのＰＤＧＦに結合し、タイプＡ結合 断片はりガント結合の実質的普遍性を表す、タイプＡ結合断片は、−ａ的なＰＤ ＧＦ結合試薬を調製するために有効である。
効果的な治療に必要な薬剤量は、多くの種々の因子に依存し、それには投与手段 、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬剤がある。従って治療投与 量は力価を測定して安全性と効力を至適化すべきである。
典型的にはインビトロで使用される投薬量は、これらの薬剤のその場所での投与 に関して有効な量の手引きを与えることができる。
特定の疾患の治療のために有効投与量の動物試験は、さらにヒトの投薬量に関す る予想を与えるであろう、樺々な考察が、たとえばＧｉｌ＋ｗａｎら（編集＞　 （１９９０）グツドマンおよびギルマン：汁、のための１ヱ五羨菫（並列μｎ　 ａｔ直工ゆ阻肚ユ匝」加り胚剣」山１Ｌ１社り蛙４±ヒ搬−１第８版、パーガモ ン出版（ＰｅｒｇａＩｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ）　；およびレミングトンのヒ　（Ｒ ｅｓｉｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、１ ７版（１９９０）　、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ　Ｐｓｎｎ、）　；それぞれ参 照により本明細書に編入される。投与法についてもその中に述べられており、例 えば経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮的拡散等がある。薬学的に 受容できるキャリアーは、水、塩、緩衝液およびメルクインデ゛ツクス、メルク 社、シーウェイ、ニュージャジー州（Ｍａｃｋ　Ｉｎｄｅｘ　：Ｍｅｒｃｋ　Ｃ ｏ、＋　Ｒａｈｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）に記載された他の成分がある 。
ＰＤＧＦとそのレセプターの高い親和性から、これらの薬剤の低投与量が最初は 有効であると思われる０例えば投薬量範囲は通常１ｍＭ濃度より少ない、典型的 には約１０μＭより少ない、普通は約１１００ｎ濃度より少ない、好ましくは約 １０ｐＭ　（ピコモル）より少ない、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェント モル）より少ない量が適当なキャリアーとともに期待される。徐放性製剤、また は徐放性用装置が連続的な投与にしばしば利用される。レセプターの細胞内セグ メントは、ＰＤＧＦレセプターおよび関連レセプターの両方において、以下に詳 細に記載するさらなる使用に用いられる。
医薬組成物は非経口的、局所的、経口的、または局部的投与により投与され、そ れには例えば予防および／または治療を目的とした噴霧式薬剤または経皮投与を 含む、医薬組成物を、投与法に依存した種々の単位投薬量形態で投与できる０例 えば、経口投与に適する単位投薬量形態には、粉末、錠剤、ビル、カプセルおよ び糖衣錠がある。
薬剤組成物はしばしば静脈内に投与される。従って本発明は、受容できるキャリ アー、好ましくは水溶性キャリアー中に溶解または懸濁した化合物の溶液を含む 静脈投与用の組成物を提供する０種々の水溶性キャリアーが使用でき、例えば水 、緩衝化された水、０．４％塩溶液、などである、これらの組成物は便利で周知 な技術により滅菌されるか、または濾過滅菌することができる。生成した水溶液 は使用のために包装、または凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液 に混合される０組成物は要求されるおよその生理学的条件に必要とされる薬学的 に受容される補助物質（例えばｐＨｔｌ整試薬、緩衝化試薬、強壮剤、湿潤剤な どであり、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ ウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノール アミンなど）を含有してもよい。
固体組成物については、便利な非毒性キャリアーを含有でき、それは例えば薬品 縁のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シェフロース、マグネシウム、 炭酸塩などである。経口投与のためには、医薬的に受容できる非毒性組成物が、 任意の通常使用される賦形剤（例えばすでに記載したようなもの）を混合するこ とによって形成され、その量は一般的に活性成分の１０−９５％、好ましくは約 ２０％（レミングトン、Ｈ上を参照）である。
噴霧式薬剤の投与に関しては、化合物は好ましくは界面活性剤および液体発泡剤 とともに微細に分割された形態で供給される。界面活性剤はもちろん非毒性でな ければならないし、好ましくは液体発泡剤に可溶性である。そのような試薬の代 表として、６から２２個の炭素原子を有するエステルまたは脂肪酸の部分エステ ルがあり、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステア リン酸、ラノリン酸、リノール酸、オレステアリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）と 脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物、例えばエチレングリコール、クリ セロール、エリスルトール、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソル ビトールから誘導されるヘキシトール無水物およびこれらエステルのポリオキシ エチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体がある。しばしば混合エステル、例 えば混合した、または天然のグリセリドを使用する。界面活性剤はある態様にお いて、成分の０．１％−２０重量％、好ましくは０．２５−５％を構成する０組 成物の平衡は通常液体発泡剤である。液化した液体発泡剤は典型的には周囲条件 でガス状であり、加圧下でａＩｌｉＩされる。適当な液化した液体発泡剤のなか で５個までの炭素を含有する、ブタンおよびプロパンのような低級アルカン、　 および好ましくはフッ素化または塩化フッ素化したアルケンである。上記の混合 物も使用される場合がある。噴霧式薬剤を製造するには、適当なバルブを装備し た容器を適当な液体発泡剤で充填し、これには微細に分割された化合物剤と界面 活性剤が含まれる。成分はこのようにバルブの作動まで加圧状態で維持される。
化合物を含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与されるこ とができる。治療的投与には、上記のように組成物はすでに罹患している患者に 投与され、その量は疾患またはその合併症を治癒、または少なくとも部分的に阻 止するために十分な量である。これを達成するための量は“治療に有効な投与量 ”と定義される。これに有効な量は疾患の程度および患者の体重と一般的症状に よる。
予防的投与には、本発明の化合物を含有する組成物が特定の疾患にかかっている と疑われる、または罹患する危険性があると思われる患者に投与される。そのよ うな量は“予防に有効な投与量”として定義される。この使用において、正確な 量はここでも患者の健康状態と体重による。
特に重要な本発明の観点として、大部分の増殖因子が複数の形質発現を調節し、 それが内在するタンパク質チロシンキナーゼ活性を持つ細胞表面のレセプターと の結合及び活性化に依存するという認識がある。チロシンキナーゼ活性を持つ増 殖因子レセプターあるいはレセプターチロシンキナーゼは非常に良く似た分子構 造を示す。
たとえば、それらは大きな細胞外リガンド結合領域、疎水性のトランスメンブレ ン領域、チロシンキナーゼ触媒ドメインを含んだ細胞質すなわち細胞内領域から 構成される。レセプターチロシンキナーゼは一般的にリガンド結合セグメントと タンパク質のチロシンキナーゼ部位から構成され、それらは細胞膜で分離される 。従って、細胞外リガンドの結合によって生ずるレセプターの活性化は、細胞膜 障壁を通して転送され細胞内領域にある機能の活性化を意味する。
本発明は、ポリペプチドセグメントの特定のアミノ酸側鎖のリン酸化が、ある種 のタンパク質問相互作用に大変重要であるという発見を利用している。相互作用 領域あるいは結合領域に存在する側鎖のリン酸化は相互作用を調節する。　ＰＤ ＧＦレセプターとホスファチジルイノシトール３′キナーゼ（ＰＩ　３キナーゼ ）の相互作用の場合には、限定されたキナーゼ挿入配列内のホスホチロシンの存 在がレセプターとＰＩキナーゼ間の相互作用すなわち結合に重要であり、それに よってＰＩ３’キナーゼの活性が発現される。リン酸化されていないに■セグメ ントは、ＰＩ３キナーゼとの結合活性を失う。このような観察は、その他の結合 タンパク質とリン酸化セグメントの相互作用に一般的に応用できる。このような 相互作用の性質と特異性を究明することにより、ペプチドあるいはリン酸化ペプ チドの類似体として機能する有機物などの類似体が調製される。
チロシンキナーゼは大きく２種類に分類され、トランスメンブレンレセプターと 細胞質内の非レセプターキナーゼが相当し、２番目のグループの大部分はチロシ ンキナーゼでもいわゆるｓｒｃファミリーに属する。レセプターキナーゼ遺伝子 は、ＰＤＧＦレセプターを含めて構造的特徴を共有しており、例えばアミン末端 のシグナルペプチドは細胞膜糖タンパク質の特徴を持ち、トランスメンブレンセ グメントはレセプタータンパク質の細胞外及び細胞内領域を限定し分離している 。レセプタータンパク質のアミノ末端部はリガンド結合部位を含む細胞外領域を 構成する。レセプタータンパク質のカルボキシル末端部はレセプターの細胞内領 域を構成し、そこにキナーゼ活性が存在する。レセプターキナーゼは、細胞外領 域のリガンド結合によるシグナルを細胞内区画へ、そして細胞内の二次伝達物質 を通して最終的には核に伝達する機能に関与する。
確立されたレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の−次配列の詳細な比較から サブドメイン構造あるいはセグメントの共有部分と固有部分を同定可能で、それ はｌ？ＴＫファミリーを独立のグループに分類することを可能とし、例えばＹａ ｒｄｅｎ　ａｎｄ　Ｌｌｌｌｒｉｃｈ　（１９８８）　Ａｎｎ、ＲＥｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、５７　：　４４３−４７８およびＵｌｌｒｉｃｈ　ａｒｉｄ　 Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ　（１９９０）Ｃｅｌｌ　６１　：２０３−２１２に 報告されており、それらは参照により本明細書に属人される。
ＰＤＧＦレセプターはそのようなサブクラスの一員である。このようなレセプタ ーは、マクロファージ増殖因子（Ｃ３Ｆ−１−Ｒ）および推定上のレセプターｃ −ｋｉｔを含めて、少な（とも２種類の異なった構造的特徴を共有している。そ れらは細胞外領域のシスティンに冨むレセプタークラスターが欠失しており、別 の保存された反復構造を持ち、その反復構造には５種類の免疫グロブリン様レセ プターが含まれ、このレセプターサブクラスのメンバーのりガント結合領域が持 つ共通構造を示唆している。
それ以上に、ＲＴＫを他のサブクラスと比較した場合、このグループのメンバー の触媒ドメインは、長くそして構造的に固有の、親水的な、プロリンに富んだ７ ７−１０７アミノ酸側鎖の挿入セグメントで中断されている。この“キナーゼイ ンサート″　（ＫＩ）は、キナーゼインサート領域とも見做され、触媒ドメイン を２つのセグメントに分割し、他のチロシンキナーゼドメインとのホモロジーか ら定義される。それぞれのレセプターサブファミリー内でもこれらＫｌ配列は高 度に分化しており、逆にニワトリやネコ、ヒトのような進化的に異なった種間で は強固に保存されている。関連するサブファミリーのメンバーは、ＦＧＦレセプ ターやＬＬＬ及びｂｅｋを含め、細胞外領域に免疫グロブリン様反復配列を同様 に持っているけれども、数としては３回だけであり、１０−１９側鎖のキナーゼ インサート配列がチロシンキナーゼセグメントの対応する部分に位置している。
ＲＴＫリガンドは細胞内で複数の形質発現応答を誘導し、様々な細胞種で細胞周 期の進行、ＯＮ八へ成、細胞増殖を生じさせる。リガンド結合によって、様々な 細胞膜反応が開始され、イオン輸送やグルコース輸送、細胞膜キナーゼ、ピノサ イト−シス、細胞膜の波打ち、そしてそれ以外のｍ胞骨格や形態的な変化がその 中に含まれる。解糖系やポリアミン合成、Ｓ６リポソームタンパク質のリン酸化 を含む一定数の細胞質内経路の活性化によって、このような応答は平行して行な われる。リガンド結合後に、特定の遺伝子（！、！！Ｌやｃ−ｆｏｓなど）の転 写パターンの変更が数分以内に検出され、タンパク質や１２ＮＡ、　ＤＮＡなど の高分子合成の増加が３−２０時間内に観察される。
ＰＤＧＦは独自の能力を持ち、ホスファチジルイノシトールの代謝回転を促進す るプロティンキナーゼＣ１およびタイプＥプロスタグランジンを合成するプロテ ィンキナーゼＡを活性化する。
レセプター機能の正確な制御の重要性が、レセプター由来癌遺伝子に発見された 様々な種類の構造変異体が常に活性化され、結果として分子制御機構の破壊およ びレセプターシグナルの変更をもたらす事実から主張された。ヒト癌に見られる 最も一般的な細胞障害は、レセプターの過剰発現と関連した自己分泌活性を含む 。沢山の癌および癌細胞株では、ＰＩＩＧＦ−Ａ鎖やＰ［１ＧＦ−Ｂ鎖、ＰＤＧ Ｆレセプターポリペプチドを含み、増殖因子とそのレセプターが共に発現されて いることが見つかっている。自己分泌レセプター活性化は、正常な成長制御を破 壊する一つの筋書きを示している。基本的に、チロシンキナーゼ活性を持つ全て のレセプターは、発癌の潜在性を秘めている。突然変異を誘発する更に多くのタ イプが、レセプターチロシンキナーゼの過剰発現のような特定の例と同様に、動 物やヒトの癌で検出されることが予期される。正常な細胞代謝やシグナル伝達の そのような欠損の理解と制御が、癌の診断や治療に重要な役割を演するだろう。
リガンドによって活性化された場合、ＰＤＧＦβ−レセプターはチロシン側鎖に リン酸化を受ける。　ＥＫ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｄｉｎ　（１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ。
２５７　：ｔｏ４ｓｓ　やＦｒａｃｋｌｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９　：　７９０９゜Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ　ａｎｄ 　Ｃｏｏｐｅｒ（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５８　：　１１２Ｌ　Ｙａｒｄｅｎ　 ｅｔ　ａｌ。
（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　２２６−２３２を参照すること、こ の“自動リン酸化”反応の機構は、レセプターのダイマー形成をリガンドが誘導 し、ダイマーのそれぞれ２本のポリペプチド鎖が他の鎖をリン酸化するリン酸基 転移反応に依存すると考えられる。刺激されたＰＤＧＦレセプターの主なリン酸 化部位はチロシンキナーゼドメインのカルボキシル末端部に位置し、ヒトおよび マウス両方のタイプＢレセプターのｔｙｒ（８２５）、およびキナーゼインサー ト領域のヒトおよびマウス両方のタイプＢのｔｙｒ（７１９）で、これはキナー ゼをコードする配列を２つの部分に分離している。自動リン酸化されるその他の 部位がまだ発見されていないことは、十分に可能性がある。
リガンドに誘導されたレセプターの自動リン酸化による結果の１つは、レセプタ ーの細胞内領域の立体構造の変化であると思われる。
このような活性化された状態では、シグナル伝達に大変重要な何種類かの細胞質 分子とレセプターは物理的な相互作用が可能である。
活性化によって、様々なタンパク質のチロシンリン酸化と複合体の形成が達成さ れる。最初に述べるべきであるのは８５ｋＤタンパク質で、ＰＩキナーゼと推定 され、ｐ８１と見做されるタンパク質と同一であり、Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ 、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０　：　１０２１を参照すること、その後、一定 数のその他の蒼白質がＰＤＧＦレセプターと複合体を形成し、ＰＤＧＦの刺激で チロシンリン酸化を受けることが示されている。その中には、複合体で活性化さ れるセリン／トレオニンキナーゼＲａｆ−１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 （１９８９）　Ｃｅ旦５８　：６４９−６５７を参照や、ホスホリパーゼＣ−１ ；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ ｏｌ、１０　：　２３５９−２３６６を参照、ｒａｓ−活性の制＜’Ｈに関与す るＧＴＰａｇｅ活性化タンパク質であるＧＡＰ　；　ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ 、（１９９０）　Ｃｅ旦５８　：　１１２１−１１３３を参照、が含まれる。Ｐ ＤＧＦ処理により、それらタンパク質のいくつかのキナーゼ活性が増加する。
最近、３種類のニファミリーのチロシンキナーゼ（ｐｐ６０−ｃ−ｓｒｃ。
ｐ５９−ｆｙｎ、　ｐｐ６２−ｃ−ｙｅｓ）とｐ８１、ＰＤＧＦレセプターとの 間に一時的な複合体形成が発見された。更に、ＰＤＧＦ処理によってそれらタン パク質のチロシンキナーゼ活性が刺激され、ニファミリーキナーゼがＰＤＧＦと の応答に何らかの役割を担っていることが示唆される。チロシン側鎖のリン酸化 は標的タンパク質の持つ細胞分裂能力を活性化すると思われ、それは酵素活性を 増強させる、あるいは他の細胞質タンパク質との相互作用を変更させることによ って生ずる。
ＳＨ２システムは、ＰＤＧＦレセプターに通用できる特有のメカニズムと特性に 対して、可能と思われる指針を与える。ある種の非レセプターチロシンキナーゼ では１００アミノ酸程度の保存された非触媒領域を共有しており、ｓｒｃホモロ ジー領域２（Ｓｔ（２）ドメインと呼ばれる。ＦｐおよびＳｒｃチロシンキナー ゼのＳＨ２ドメインは、多分に隣接するキナーゼドメインと相互作用して制御す ると考えられ、キナーゼドメインによりリン酸化されたタンパク質との結合サイ トを形成すると考えられる。
ホスホリパーゼＣ−ｒ　（ＰＬＣ−ｒ　）およびｐ２１−ｒａｓ　ＧＴＰａｓｅ 活性化タンパク質（ＧＡＰ）は、２つの隣接した５１１２ドメインを持つ、最近 の研究では、ＳＨ２ドメインがＧＡＰやｖ−Ｃｒｋ、　ｐ６０−ｃ−ｓｒｃのよ うなタンパク質に対して特定のチロシンリン酸化リガンドとの複合体形成能力を 与えることが示された。このような結果とＰＤＧＦ−Ｒとの関連は、未だに不明 確である。具体的なＰＤＧＦレセプターでは、リガンドにより活性化されたＰＤ ＧＦレセプターがＰＬＣ−ＴおよびＲａｆ−１，８５に’Ｄａ　ＰＩ−３キナー ゼを含むシグナル分子複合体形成を引き起こす。
レセプター介在タンパク質として最初に同定されたシグナル分子は、ホスファチ ジルイノシトール−３′キナーゼ（ＰＩ　３キナーゼ）り質、形質転換ｖ−ｓｒ ｃタンパク質と免疫沈降で共沈するキナーゼとして発見された。ＰＩ３キナーゼ 活性もホスホチロシンであり、ＰＤＧＦで活性化された細胞のライセードからレ セプターにより免疫沈降された。細胞増殖の調節におけるＰＩ３キナーゼの役割 はまだ決定されていない、けれども、この酵素は沢山の増殖因子から調節を受け 、増殖因子処理細胞にはイノシトール環の３位にリン酸化を受けたホスホイノシ チドやイノシトールリン酸が高水準で含まれる。ＰＩ３キナーゼと結合しないミ ドルＴ抗原やＰＤＧＦレセプターの変異体は、細胞分裂活性を消失している。Ｐ Ｉ３キナーゼ活性の原因であるタンパク質はまだ十分に特定されていない。しか し、ミドルＴ／ｃ−ｓｒｃ複合体およびＰＤＧＦレセプターと免疫沈降で共沈す る実験の８１−８５ｋ［ｌタンパク質の存在とその酵素活性が緊密に関係してい ることがら、８５ｋＤタンパク質がＰＩ３キナーゼであるかキナーゼの重要なサ ブユニットであることを強く示唆している。
ＰＤＧＦレセプターの限定領域がＰＩ３キナーゼとの相互作用をａｉｍする能力 を持ち、キナーゼインサート（ＸＩ）　８Ｎ域を欠失している変異タイプＢ　Ｐ ＤＧＦレセプターの分析から証明された。このレセプター変異体（ΔＫＩ）は細 胞増殖の刺激およびＰＩ３キナーゼとの結合能力を失っているが、チロシンキナ ーゼ活性やホスホリパーゼＣを経由するＰＩ加水分解を含めたＰＤＧＦ結合に対 するいくつかの応答を刺激した。
最近の研究では、リガンド活性化Δに■変異レセプターはＰＩ３キナーゼとの結 合性は失っているけれども、ＰＬＣ−ｒ及びｃ−Ｒａｆ−１タンパク質とは野生 型のレセプターよりも強固に結合することが示されている。しかし、変異レセプ ターはｃ−Ｒａｆ−１のチロシン側鎖をリン酸化できｆＳＰＬＣ−ｙの結合には レセプターのチロシンリン酸化が要求される。ヒトタイプＢ　Ｐ［ｌＧＦレセプ ター変異体は、キナーゼインサートドメインに１カ所のリン酸化部位を持ってお り、それはヒトタイプＢレセプターと同様にｔｙｒ（７１９）であったが、フェ ニルアラニンに置換された場合には同様にＰＩ３キナ−・ゼとの結合性を失った 。これらの実験は、ＰＩ３キナーゼが直接ｔｙｒ（７１９）を含むキナーゼイン ？−１・領域に結合するのか、あるいはキナーゼインサー１領域と立体的に゛依 存Ｌ／たレセプターの他の部分が結合反応に含まれるのか、いずれかを示してい る。
タイプＢ　ＰＤＧＦレセプターとＰＩ３キナーゼ間の相互作用を直接研究するた めに、η］↓駐ｑシステムを設定した。このシステムでは、ＰＩ３キナーゼとＰ ｉ）ＧＦレセプターの相互作用を阻害する目的で、キナーゼインサ・−（・ドメ インのレセプター配列に由来する合成ペプチドの能力を試験することができた。
相互作用を圀害できたのは、ｔｙｒ（７１９）を含むキナーゼインサートドメイ ンの高度に保存された領域を示すチロシンリン酸化ペプチドであった。しかし、 ＰＩ３キナーゼとＰＤＧＦレセプターの結合を阻害するペプチドは、チロシンが リン酸化された場合に限定された。配列を変更したペプチドでは、チロシンをリ ン酸化しても、阻害活性は認められなかった。これら研究から、特定配列にある ホスホチロシンが細胞質シグナル分子の結合に認識部位を与えていることが示さ れた。
ｉｎ　ｖｉｔ、ｒｏシステムはＰＤＧＦレセプターとＰＩ３キナ−・ゼの相互作 用の研究に使用された。　ＰＤＧＦレセプターと結合するホスホプロティンば、 ３Ｔ３細胞をＰＤＧＦで刺激し、抗−タイプＢ　ＰＤＧＦレセプター抗体で細胞 ライセードを免疫沈降し、免疫沈降物中のリン酸化されるし七ブター結合タンパ ク質を検出するために免疫沈降物の分析を行なった。
図１ａ″＋”を参照すること。これらのホスホプロティンには、８５ｋＤａタン パク質と最近ＰＩ３キナーゼ活性と関連するとされる１　１０ｋＤａタンパク質 が含まれた。図１Ｇを参照すること。ｉｎ　ｖｉｔｒｎ実験では、タイプＢ　Ｐ ＤＧＦＬ／七ブタ−が昆虫總胞で発現されており、部分子＃製され、抗−レセプ ター抗体とＰｔｒｏｔ、ｅｉｔｉ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｏを使っ７−固定され た。このレセプターは旦遁」把で自動的にリン酸化され、従ってり、−セブター のリガンド活性化状態を模倣する立体構造を持つと思オ）れた。密度制限された ＢＡＬＢ／ｅ　３Ｔ３細胞の細胞ライセードの細胞質をその固定化レセプター・ −と混ぜ、結合体を」−分に洗浄し７た。ＰＩ３−１’ナーゼ活性がレセプター と結合したタンパク質複合体に発見されな（図１ｄ）、レセプター結合性ホスホ プロティンは、”Ｐ−ＡＴＰを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏキカーゼアッセイで検出 された０図１ｂの“−″を参照すること、見かけ」二の分子量が１４０ｋ１１． １２０／１１０ｋｒｌ（時々ダブｊ、・・ットとなる）　、８５ｋＤ、　７４ｋ Ｄの、少なくとも４種類のレセプター結合性タンパク質が放射性標識された（１ ６０ｋｒｌ及び１５０ｋＤばそれぞれｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓで発現されるレセ プターとその前駆体である）。１４０ｋＤのバンドは以前ＰＬＣ−γと同定され ており、７４ｋＤのバンドには二ｆ−１キナーゼ及び多分に他の分子が同様に含 まれるｅ　８５ｋＤのバンドと一緒に移動する８５ｋＤタンパク質は、ＰＤＧＦ 刺激細胞から調製した細胞ライセードの抗−ホスホチロシン免疫沈降では、これ までＰＩ３キナーゼであると考えられていた。　ｂａｅｕｌｏｖｉｒｕｓの発現 レセプターと結合する８５ｋＤ及び１１０ｋＤタンパク質は、銀染色解析でも同 様に観察されていた。細胞ライセードを固定化キナーゼインサート欠損変異体と 反応させた場合、Ｐｒ３キナーゼの結合が見られず、１１０ｋＤ及び８５ｋＤホ スホプロテインが変異レセプターに結合しなかった０図２ａ及び図２ｂを参照す ること、このｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果は、この変異レセプターがインタクトな細 胞ではＰＩ３キナーゼと結合しないとする従来の指標と一致した。
ライセードを作成する前に３Ｔ３細胞をＰＤＧＦで刺激すると、ｉｎ　ｖｉｔｒ 。
でレセプターと結合可能なＰＩ３キナーゼの量が激減しく図１ｄ）、それに伴っ てレセプターと結合する８５ｋＤ及び１１０ｋＤホスホプロテインも減少した（ 図１ｂ“＋”レーン）。けれどもこの現象に対する説明は十分明確になっておら ず、結果として細胞のＰＤＧＦ前処理がｉｎ　ｖｉｔｒｏでのレセプターと細胞 質タンパク質との結合に影響を与えているため、結合はＰＤＧＦに制御される過 程に特徴的であることが指摘される。
自動リン酸化されたＰＤＧＦレセプターは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでジャガイモアシ ッドフォスファターゼ（ＰＡＰ　）によって脱リン酸化され、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ ３ｍ胞ライセード由来のＰＩ３キナーゼ及び８４ｋ［ｌタンパク質との結合性を 失う（図３ｂ及びＣ）、この発見は、ＰＤＧＦレセプターのリン酸化がそれらの タンパク質が相互作用を行なうために必要であったことを示している。
レセプターとＰＩ３キナーゼの相互作用部位を決定するために、リン酸化された 合成ペプチドを作成し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでレセプターと８５ｋＤタンパク質お よびＰＩ３キナーゼ活性との結合を競合させた。従来の賃料では、キナーゼイン サート領域がＰＤＧＦレセプターとＰＩ３キナーゼ活性との結合に含まれること が示唆されていた。マウスとヒトＰＤＧＦタイプＡ及びタイプロレセプターのキ ナーゼインサート領域の配列を精査し、特に配列のホモロジーの高い２０アミノ 酸領域（全キナーゼインサート領域に対して１２％同一性で比較し、ヒトとマウ スのＰＤＧＦタイプＢレセプターでは２０個のうち８個が同一）を発見した。
マウスタイプＢ　Ｐ［ｌＧＦレセプター配列の７０５から７２４までのアミノ酸 を持つペプチド（Ｙ７１９）を合成した。このペプチド配列には２カ所のチロシ ン側鎖Ｙ７０８とＹ７１９が含まれる。マウス配列の７１９番目のチロシンは、 ヒトタイプＢ　ＰＤＧＦレセプターのｔｙｒ（７１９）にも対応し、レセプター の既知の自動リン酸化部位である。
この配列から派生した一連の合成ペプチドのレセプターと８５ｋＤ／ＰＩ３キナ ーゼ活性との相互作用の阻害能力を決定するために、固定化レセプターと混合す る前に３７３細胞ライセードを様々なペプチドで反応させた。これら実験の結果 が図４に示されている０図４ａの最初のレーンには、ペプチドが存在しない条件 で野生型のレセプターと結合したリン酸化タンパク質が示されている。矢印はＰ Ｉ３キナーゼ活性と共に精製される８５ｋＤタンパク質を示している。その他の レーンには、Ｙ７１９ペプチドの派生物が存在する条件でレセプターに結合した タンパク質が示されている０表４を参照すること、レセプターと結合する前に、 ３Ｔ３細胞ライセードとリン酸化されていないＹ７１９ペプチド（Ｙ７１９）を 予め反応させた場合、レセプター結合タンパク質のパターンには変化が見られな かった。対照的に７１９位をリン酸化されたこのペプチドの派生物（Ｙ７１９Ｐ ）をインキュページ式ンに加えた場合、８５ｋＤホスホプロテインの結合を阻害 しく図４ａ）、レセプターとＰＩ３キナーゼ活性との結合を禁止した（図４ｂ） 、７１９位に対応する位置にホスホチロシンを持つけれども一次配列を変更され たこのペプチドの組換え型は、８５ｋＤタンパク質の結合阻止に失敗し、レセプ ターとＰＩ３キナーゼ活性との結合も阻止できなかった。
表４ ＰＤＧＦレセプター合成ペプチド Ｙ７１９Ｐ　ｓｃｒｉｍｂｌｅｄ　ＭＭＤＩＫＶＰＭＤＥＹＭＳＤＹＳＤＬＧＧ アスタリスクげ）はリン酸基の位置を示してし）る。
１４アミノ酸しか含まないＹ７１９ペプチドの短縮型（Ｙ７１９５ｈｏｒｔ）と チロシン７０８を含まない型も８５ｋＤタンノイク質の結合阻害を示しく図４ａ 、レーン４）、レセプターへのＰＩ３キナーゼ活性との結合を阻止した。驚くべ きことに、７１９位にチロシンを持ち７０８位にホスホチロシンを持つペプチド が、レセプターへのＰＩ３キナーゼ活性との結合を阻止した（図４、レーン６） 、この発見は、チロシン７０８がこれまでマツプされなかったレセプターの自動 リン酸化部位の一つである可能性を示唆している。７０８位と７１９位の両方ホ スホチロシンを持つペプチド（Ｙ７０８Ｐ／Ｙ７１９Ｆ）も８５ｋＤタンパク質 の結合を阻害した（図４、レーン８）、Ｙ７０８Ｐの短縮型およびＹ７１９Ｐも 活性を阻害した（図４、レーン４及び９）。
レセプターと８５ｋＤ及びＰＩ３キナーゼ活性の結合を阻止するために必要なペ プチドの量を決定するため、３Ｔ３１１１胞ライセードを様々な濃度のリン酸化 ペプチド（Ｙ７１９Ｐ）と予め反応させた０図５に示されるように、レセプター と８５ｋＤタンパク質（図５ａ）及びＰＩ３キナーゼ活性（図６Ｂ）の結合を５ ０％阻害するためには、５μＭ程度のＹ７１９で十分であった。１００μＭまで の濃度の非リン酸化ペプチドでは、レセプターとＰＩ３キナーゼ活性との結合に 影響を与えながつた。
従って、Ｙ７１９Ｐペプチドによるレセプターと８５ｋＤおよびＰＩ３キナーゼ の共通する阻害は、８５ｋＤタンパク質がＰＩ３キナーゼ酵素のサブユニットで あるとする仮説を支持する。
次に、レセプターに結合するその他のシグナル分子に対するペプチドの阻害能力 を調べた。３Ｔ３細胞ライセードをＹ７１９Ｐペプチドの存在下あるいは非存在 下で反応させ、その後にレセプターの免疫沈降を行なった。レセプターとＰＬＣ −７およびＧＡＰの結合は、特異抗体を用いたイムノプロット解析で決定しく図 ６）、これらの分子が自動リン酸化レセプターと特異的に結合する従来の研究を 支持した。
レセプターとそれらの分子の結合はＹ７１９Ｐリン酸化ペプチドでは影響を受け なかった。従って、Ｙ７１９Ｐペプチドはレセプターと８５ｋＤ／ＰＩ３キナー ゼ活性の結合を特異的に阻害し、ＧＡＰあるいはＰＬＣ−γとレセプターの相互 作用には影響しなかった。
レセプターと８５ｋＤタンパク質の相互作用を性質を決定するために、修飾した ウェスタンプロット法を用いた、ＰＤＧＦレセプターｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓを 感染させたＳｆ９細胞のＰＤＧＦレセプターを抗−レセプター抗体で免疫沈降し てｉｎ　ｖｉｔｒｏで０Ｐ標識し、電気泳動で分離しニトロセルロースに転写さ れた３Ｔ３細胞ライセードのタンパク質に結合するプヮープとした。放射性標＠ ＰＤＧＦレセプターは未刺激の３７３細胞ライセードの８５ｋＤに直接結合した （図７、レーンｌ　）　、　ＰＤＧＦ処理３Ｔ３細胞ライセードでは、放射性標 ｖａＰＤＧＦレセプターと反応させても全く結合が見られず（図７、レーン２　 ）　、ＰＤＧＦ刺激細胞ライセードの８５ｋＤタンパク質は固定化ＰＤＧＦレセ プターと結合できないという発見（図Ｉｂ）と一致した。細胞ライセードタンパ ク質を含むニトロセルロースペーパーをＹ７１９Ｐペプチドと予め反応させると 、放射性標識レセプターは８５ｋＤタンパク質と結合できなかった（図７、レー ン４）。
非リン酸化ペプチド（Ｙ７１９）あるいは組換え型ペプチド（Ｙ７１９ｓｃｒａ ｍｂｌｅｄ）は、レセプターと８５ｋＤタンパク質の結合に影響を与えなかった （図７、レーン３と５）、この実験は８５ｋＤタンパク質を示した（図７、レー ン３と５）、この実験は直接８５ｋＤタンパク質がＰＤＧＦレセプターに結合し 、他の分子の存在を要求しないことを示した。直接の結合反応にはチロシン７１ ９を含むキナーゼインサート領域の２０アミノ酸セグメントを含むと思われこの セグメントのチロシンリン酸化が相互作用には必要であると思われた。
これらの結果は、タイプＢ　ＰＤＧＦレセプターの細胞内領域がシグナル伝達の 役割を演じているような分子と相互作用することを示している。レセプターとＰ Ｉ３キナーゼやＰＬＣ−γ、　ＧＡＰ、ｔａｒ　−１のようなシグナル分子の物 理的な結合は、レセプターのチロシンがリン酸化されたときにのみ生じる０図１ ８を参照すること、レセプターとＰＩ３キナーゼの結合に含まれるレセプターの 領域が限定された。短縮型ペプチドは、ＰＩ３キナーゼとリン酸化レセプターの ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの結合を阻害する目的で使用された。結合を阻害するペプチ ドの最も妥当な説明は、このペプチドがレセプターを模倣し直接ＰＩ３キナーゼ に結合することである。このような方法で、これらは拮抗的なアンタゴニストと して作用する。チロシンリン酸化ペプチドだけが阻害活性を持つという観察から 、ホスホチロシンが直接レセプターとＰＩ３キナーゼの結合に関係していること が示唆される。しかし、ホスホチロシンを持つ組換え型のペプチドがＰＩ３キナ ーゼと相互作用しなかったことから、ホスホチロシン単独では結合に十分ではな い、従ってレセプターのこの部分の一次配列が、レセプターとＰＩ３キナーゼの 結合に要求される構造的情報に必須である。アミノ酸１３個の短いペプチドがＰ Ｉ３キナーゼと正常に結合する本来のレセプター領域を模倣する構造的情報を十 分に含んでいること（表４）は、幾分驚くべきことである。
タイプＢ　ＰＤＧＦレセプターのチロシン７１９が、インタクトな細胞内と同様 にｉｎ　ｖｉｔｒｏでもレセプターの自動リン酸化部位の一つである。
従って、チロシン７１９付近のＫｌドメインの部分は、ｉｎ　ｖｉｖｏでのレセ プターとＰＩ３キナーゼの結合に直接音まれると思われる。ここに示される賃料 は、２個のチロシン側鎖のいずれかをリン酸化（Ｙ７０８ＰあるいはＹ７１９Ｐ ）されたＹ７１９の派生物が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイにおいてレセプターと ＰＩ３キナーゼの結合を効果的に阻害したことを示している。同様の配列と相互 作用が、適当なフラグメント配列による阻害に従う、特に、リン酸化部位として 知られている配列は、これ以外の介在タンパク質との相互作用を阻害する類似体 を選択するために使用されるだろう、ＰＩ３キナーゼはｃ−ｆａｓタンパク質お よびミドルＴ抗原と結合することが知られており、両方のタンパク質は共にｉｎ 　ｖｉｖｏでチロシンがリン酸化されている。ミドルＴ抗原のリン酸化部位（チ ロシン３１５）は、この実験で使用されたＹ７１９ペプチドある程度ホモロガス な配列である（１０個のうち５個が同一）、どのｃ−ｆｓｓタンパク質のチロシ ンリン酸化部位もＹ７１９ペプチドとは明確な頬位性を示さなかった。しかし、 Ｙ７１９ＰペプチドはＰＩ３キナーゼとεニジ−タンパク質の結合をｉｎ　ｖｉ ｔｒｏで阻害した。従って、ｃ−ｆｍｓタンパク質の自動リン酸化部位はＰＤＧ Ｆレセプターの相当するドメインと類似した二次構造を持つ領域である。
これらの発見は、シグナル分子が特定の配列にあるホスホチロシンを認識するこ とを示している。キナーゼインサート欠失変異体とＧＡＰやＰＬＣ−ｒ　＋　ｃ −ｒａｆ−１の相互作用のパターンと、ＧＡＰおよびＰＬＣ−ｒとレセプターの 結合を阻害するためにこの報告で用いられたペプチドの能力欠如は、レセプター の異なった領域、多分に異なった自動リン酸化部位を含む、が特定のシグナル分 子との結合に関与していることを示している。このような分子とレセプターの結 合はシグナル分子を局在化させ、その活性を制御する。レセプターキナーゼによ るその他の細胞タンパク質のチロシンリン酸化は、シグナル分子と結合するタン パク質としてそれらを標的にし、本発明は天然本来のシグナルを効果的に模倣あ るいは妨害する方法および試薬作成のための材料を提供する。たとえば、ｈＰＤ ＧＦレセプターあるいは関連チロシンキナーゼタンパク質のフラグメントは、そ れらの間および機能的に関連するタンパク質の本来の相互作用を効果的に阻害す る。
ここに述べられたリン酸化インサートを持ち、構造と機能共にホモロジーを示す その他の配列およびタンパク質に関しては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９８９）　５ ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１５６４−１５７０やＹａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、 （１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ３２３　：　２２６−２３２．　ＧｅｎＢａｎｋ” を参照すること。
本発見はＫｌセグメントの類似体を生産する方法を導く０例えば、加水分解を受 けない部分を持つ短いペプチドは、リン酸化部位をスルフォン化部位に置換する ことなどにより、しばしば作成される。
あるいは、構造的に十分にホモロジーを持つその他の有機分子が、ＰＩ３キナー ゼあるいはその他の機能調節タンパク質との機能的相互作用のためにしばしば選 択される。更に、ペプチドの一部がキメラ類似体あるいは修飾ペプチド、その他 の部分が相互作用に重要な類似構造の特徴を持つ有機分子などが作成されるだろ う。従って、特定の相互作用的特徴を示す分子が利用可能になり、それらには天 然あるいは合成的に生成された化合物が含まれる。次の実例を参照すれば、本発 明はより良好に理解されるだろう０次の例は、例証を行なうために提示されるの であって、制限を設ける為ではない。
２脹粂往 一般的に、標準的なりＮＡｌ１換え技術が、種々の出版物に述べられており、例 えばＳａｅ＋ｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ １ｏｎｉｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙやＡｕ５ｕｂｅｌ＋ｅｔ　ａｌ、　 （１９Ｂ？）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏ扱ｕ１．ｖｏｌｓ、１ａｎｄ　２　ａｎｄ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ 、　Ｎｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｓａｎ　（ｅｄｓ、）（１９８７）　Ｍｅｔｈｏ ｄｓｉｎ　Ｅｎｚ　ｏｌｏ　Ｖｏｌ、５３　（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ 　Ｐａｒｔ　Ｄ）があり、ここではそれぞれを資料として引用している。これら の方法の間に見られる違いは、あったとしても、極めて小さい。
■、ヒト　λＧＴＩＩ　ｃＤＮＡ　−イブ−１−びヒト　λＧＴＩＯｃＤＮＡ− イブ−１−の ２５０．０００プラークのヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする プローブとして、マウスＰＤＧＦレセプター（ｓＰＤＧＦ−Ｒ）タンパク質をコ ードする全長のＤＮＡ配列を使用した。ニックトランスレージ町ンを用いて１２ 　Ｘ　１０・ｃｐｓ／μｇの比活性を持つプローブを作成した。
３０％フォルムアミド、Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５　Ｘ５ＳＣ，、０ ，０２Ｍリン酸ナトリウムＰＨ６，５，５００μｇ／＋ｗｌのサケ精子ＤＮＡを 含むハイプリダイゼーシツンバッファー中で、フィルターとブロー７’　（１０ ’ｃｐｍ／５ｏ１）を反応させた。４０°Ｃで１４時間のハイプリダイゼーシツ ンの後に、フィルターを５５°Ｃで０，２　Ｘ　ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用 いて４回洗浄し、更に６５℃で０．２　Ｘ　ＳＳＣを用いて２回洗浄した。
全長の−ＰＤＧＦ−Ｒプローブを用いた再スクリーニングの後に、１０個の陽性 クローンを得た０個々のクローンを単離し、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて制限酵 素解析を行なった。ＨＫ−６と命名した最も長し）インサート（２，３ｋｂ）を 含むクローンの特徴を更に調べ、ジデオキシターミネータ−法で塩基配列を解析 した。Ｈに一６クローンにはレセフ。
ターの３５５４塩基から５６９１塩基までとポリＡテールから９塩基を加えた塩 基配列が含まれた。
２．３ｋｂの）！に−６ＤＮＡから調製されたニックトランスレージ町ン処理プ ローブを用いて、２５０，０００プラークのヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングした。このスクリーニングでは厳密性の高６ｑハイブリダイゼーシ ツンで行なった（上述のハイプリダイゼーシツンノイッファーに５０％フォルム アミドを添加）、フィルターを５　Ｘ１０’ｃｐ■／ｍｌのプローブと１４−１ ６時間４２℃で反応させた。フィルターを６５℃で０．１％ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳを用いて４回洗浄した。
ＨＫ−６ブローブを用いた二次スクリーニングの後、７クローンを単離して」匹 Ｒ１制限酵素を用いて制限酵素解析を行なった。４．５ｋｂのインサートを含む クローン（ＨＰ−７）を選択し、特徴を調べた。
このクローンの塩基配列が表２に示されたおり、タイプＢヒトＰＤＧＦレセプタ ー（Ｂ−ｈＰＤＧＦ−Ｒ）をコードしていた。
■、３１こ肇齋亡１４１玄 タイプＢヒトＰＤＧＦレセプターの完全なコーディング領域を含む４．５ｋｂ　 ＤＮＡ断片をＨＰ−７クローンからＥｃｏＲＩ消化により単離した。
ゲルから精製された断片を、ＳＶ４０発現ベクターＰＳＶ７Ｇのポリリンカー領 域にあるＥｃｏＲＩサイトへクローン化した。　ｐｓＶ７ｄ発現ベクターは、υ ｎ１ｖｅｒｓｉＬｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＤａｖｉｓのＰ、Ｌｕｃ ｉ−によって得られたＳＶ４０の初期プロモーター領域（ＳＶ４０の塩基配列５ １９０−５２７０）を含むｐＭＬの派生物で、」並Ｒ１およびＳｅａ　Ｉ　＋　 Ｘ堕１．Ｓ虹Ｉの制限酵素認識部位とそれに続く３つの転写終了コドン（ＴＡＡ ）及びＳＶ４０ポリアデニレーシ！ンシグナル（ＳＶ４０の塩基配列２５５６− ２７７０　）を含む（Ｔｒｕｅｔｔ　ａｔ　ａｌ、　（１９８４）　ＤＮＡ　工 ：　３３３−３４９）、　［ＩＰ−７クローンから得られたｃＤＮＡ配列を含む １ｌｉｃｏＲＩ断片をｐｓＶ７ｄの血Ｒ■サイトに挿入した。得られた発現ベク ターでは、Ｂ−ｈＰＤＧＦ−レセプター遺伝子がＳＶ４０プロモーターの転写制 御を受けた。
ＳＶ４０プロモーターに対してＰＤＧＦレセプターインサート（４，５ｋｂ）が 正しい方向をむいていることを確認するため、レセプター配列の５７３位と発現 ベクターのポリリンカー領域を切断する５ａｅａ　Ｉ制限酵素で陽性クローンを 消化した。
正しい転写向にレセプターを含むクローンからは４．０ｋｂインサートと、発現 ベクターとレセプター５′末端の５７３塩基対を含んだ３．２ｋｂ断片を放出し た。このプラスミドＰＳＶＲＨ５を、抗生物質ネオマイシンの耐性を与えるＰＳ Ｖ２ｎｅｏプラスミドと一緒に細胞へ導入した。
■、　とＣＩＯへの υ、Ｃ，Ｓ、Ｆ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手 したＣＩＯ細胞のＸＩ株を、１０％ＦＣ５（ＵＣ５Ｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）及びペニシリンとストレプトマイシンを含むＨａｍ ’ｓ　Ｆ−１２培地を用いて３７℃と５％Ｃｏｔ／９５％ａｉｒの条件で培養を 行なった。
ｐｓＶＲＨ５プラスミドＤＮＡ（１０μｇ　）とｐｓ！／２ｎｅｏ　（１ｔｌ　 ｇ　）をｌＸｌ０”のＣＩＯ細胞に、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　ｅｔ　ａｌ、　（ １９８０）、　ＭｅｔｂＯｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ。
（１９８０）　６５　：　８２６−８３９のカルシウム沈殿法を用いて導入し、 導入ＤＮＡの分解を防ぐために１０ａｇのクロロキノンニリン酸（ＣＤＰ）を添 加した、１２時間の培養後に細胞をトリプシン処理し、５倍に希釈して再播種し た。２４時間後に、ネオマイシン類似体の抗生物質Ｇ４１８　（ＧＩＢＧＯ）を ４００μｇ／■ｌの濃度になるように培地に加えた０選択を２週間続けた後、独 立したコロニーを取り出して２４穴プレートに移した。コンフルエント状態の培 養に対してＰＤＧＦレセプターの存在を抗−レセプター抗体を用いたイムノプロ ットで確認した。このアッセイで陽性を示すコロニーを最終制限希釈法を用いて 単一細胞にクローン化した。
安定な形質導入クローンに対して、ＲＮＡブロテクシ目ンアンアッセイいた測定 によりタイプＢ　ＰＤＧＦレセプターメツセージの発現を試験し、抗−ホスホチ ロシン抗体を用いてＰＤＧＦで刺激されたレセプタータンパク質の存在を検出し た。
ＩＶ、ＣＨＯでのＢ−ｈＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡのＳＶ４０初期プロモーターの転 写制御を受けるヒトレセプター［ＩＮＡを含むプラスミドＤＮＡを導入したＣＨ Ｏ細胞（ＣＨＯ−ＨＲ５）とマウスレセプターＤＮＡを含む同様のプラスミドを 導入したＣＩＯ細胞（ＣＨＯ−Ｒ１８）を、Ｅｓｃｏｂｅｄｏ　ｅｔ　ａｌ、（ １９８８）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３　：　１４８２−１４８７に以 前示した方法で可溶化した。　Ｅｓｃｏｂｅｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、及びにｅａｔｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２　：　７９３２−７９３７に以前報告した レセプターのカルボキシル末端領域の配列を認識する特異的な抗体を用いて、抽 出物をウェスタンプロット解析で調べた。　１９５ｋＤａタンパク質が本来のレ セプターであり、１６０ｋＤａタンパク質がレセプターの前駆体である。
形質導入細胞でのレセプタータンパク質の発現は、レセプターの細胞内配列を認 識する抗体を用いて行なわれた。ヒトレセプターを最高水準に発現するクローン を以後の研究のために選定した。この形質導入細胞は、以下の競合的結合研究で 示されるように、Ｉ！ＳニーＰＤＧＦで標識されるレセプターを持つ。
■、　な　たフオームのＰ［］ＧＦと　イブＢレセプ　−の　Ａ　ＡタイプＢレ セプターサイトと競合するヒト組換えＡＡおよびＢＢホモダイマーの能力と、＋ ｔＪ標１ｔｉＰ［ｌＧＦ　（調製法は以下に表示）の置換が調べられた。各ホモ ダイマーはイースト発現システムで選択的に作成されてイースト培地から精製さ れ、その他の間充繊細胞増殖因子を含まないため、従ってヒト発現システムに存 在するかも知れない因子による汚染の影響を回避した。
ＢＡＬＶ／ｃ　３７３細胞とＣＨＯ形賞導入細胞（ＣＩＩＯ−８１１５）を、Ａ ＡあルイはＢＢの濃度が増加する状態で”’Ｉ−ＰＤＧＦと反応させた。全細胞 懸濁液中で、３７°Ｃ４５分間の結合を行なった。　Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心で未 結合の放射性標識ＰＤＧＦを除去した。非特異的結合は、ＣＨＯ細胞を”’Ｉ− ＰＤＧＦと反応させることにより決定し、結合放射活性の２５％を占めた。
結合研究は、形質導入細胞がレセプターとｈＰＤＧＦの相互作用を研′究するモ デルとして使用できることを示した。特にこの研究では、形質導入されたタイプ ＢヒトＰＤＧＦレセプターが本来のマウスレセプターと機能的に等しいことが、 次の結果から示された。　ＰＤＧＦのＡＡ及びＢＢフオーム共にヒトレセプター 形質導入物の■Ｉ−ＰＤＧＦ標識部位と競合した。形質導入されたタイプＢヒト ＰＤＧＦレセプターと同様に本来のマウスレセプターは、８Ｂフオームの方がＡ Ａフオームよりも高い親和性を示した。イーストで発現した場合、ＰＤＧＦのＡ Ａフオームは劣った処理を受けるらしく、形質導入細胞及びマウス３Ｔ３細胞の 両者に対してＢＢフオームよりも低い親和性を与えた。競合パターンの一致は、 本来のマウスレセプターと同様にＡＡフオームが形賞導入タイプＢヒトＰＤＧＦ レセプターと相互作用することを示し、これらのレセプターが機能的に等しいこ とを示した。
Ｖｌ、　Ｐ［ｌＧＦレセブ　−チロシンキ　−ゼのタイプＢレセプターチロシン キナーゼを活性化する組換えＡＡ及びＢＢホモダイマーとヒト部分精製ＡＢ　Ｐ ＤＧＦを研究した。イースト由来ＡＡ及びＢＢホモダイマーのフオームと血小板 由来ＡＨフオームは導入されたヒトレセプターの自動リン酸化を刺激した。
ＢＡＬＶ／ｃ　３Ｔ３細胞とｔニー　トＰＤＧＦレセプターを導入されたＣ）Ｉ Ｏ３［Ｉｌ胞（ＣＨＯ−）ＩＲ５）を、異なるフオームのＰＤＧＦ　（ＡＡ、　 ＢＢおよびＡＢ）の増大する濃度で反応させた。引き続いてｓＤｓポリアクリル アミドゲル電気泳動を行ない、リン酸化されたレセプターを抗−ホスホチロシン 抗体を用いたウェスタンプロットで同定した。
レセプタータンパク質は２００ｋＤａ分子量マーカーと一緒に泳動された。導入 されたヒトレセプターの自動リン酸化を刺激するために有効なそれぞれのフオー ムの濃度は、本来のマウス３Ｔ３レセプターあるいは形質導入されたマウスレセ プターに同様の自動リン酸化を与える濃度と同等であった。
ＰＤＧＦのＡＡフオームがタイプＢレセプターのレセプターチロシンキナーゼを 活性化することを、これらの結果は初めて示した。形質導入細胞を使用する以前 には、ＡＡフオームがｈＰＤＧＦ活性を持つがどうか、あるいはタイプＢレセプ ターでも単一レセプターがそれら全てのＰＤＧＦフオームを認識できるのかどう かは示されてぃなかった。更に、マウス３Ｔ３細胞でＰＤＧＦに刺激されるチロ シンキナーゼ活性に対応する野生型レセプターと機能的に等しいタイプＢレセプ ターをヒトｃＤＮＡがコードすることを示した。
従って、形質導入細胞はＰＤＧＦで誘導されるマイトジェン反応を研究するモデ ルとして有用である。
■、　ＣＨＯノ　のＲＮＡ人のＡ ＢＡＬＶ／ｃ　３Ｔ３細胞とタイプＢヒトＰＤＧＦレセプターを導入されたＣＨ Ｏ細胞（ＣＨＯ−ＨＲ５）を、飽和濃度にある３種類のＰＤＧＦフオームで反応 させた。ネガティブ及びポジティブコントロールとして、それぞれ未処理細胞と 牛胎児血清（Ｆｅ２　）で処理した細胞を使用した。　ＤＮＡへ取り込まれる１ Ｈ−チミジンの水準を、前述したように酸不溶性成分の放射活性として決定した 。
タイプＢヒトＰＤＧＦレセプターあるいはタイプＢマウスＰＤＧＦレセプターの ＣＩＯ細胞への導入は、ＰＤＧＦ感受性感受性マイフジエフ反応た。
全てのＰＤＧＦフオームは、タイプＢヒトＰＤＧＦレセプター導入細胞でも本来 のレセプターを産生ずるマウス細胞でもＤＮＡ合成を刺激した。
これらの賃料は、ＡｉＩのホモダイマー及びＢ＠のホモダイマーが、血小板由来 ＡＢフオームと同様に、タイプＢヒトｃＤＮＡ配列によってコードされるレセプ ターを通して作用するマイトジェンであることを示した。マウス３Ｔ３細胞や導 入されたタイプＢヒトレセプターを含　。
むＣＨＯ細胞に対するこれらＰＤＧＦフオームのマイトジェン作用は、機能的に 等しいレセプターで反応が調節されたことを示した。
■、イブへＰＤＧＦレセプ　−の　と タイプＡレセプターが上述したタイプＢレセプターのように単離され、異なる点 は違うプローブを使用したこととハイプリダイゼーシ百ン及びスクリーニングを 厳密性の低い条件で行なったことであり、次のような性質が示される。４Ｉに、 既に公表されているチロシンキナーゼのアミノ酸配列と高度なホモロジーを持つ タイプＢレセプターチロシンキナーゼの領域が同定され、そのアミノ酸配列はＨ ＲＤＬＡＡＲＮであった。チロシンキナーゼ共通配列をコードするオリゴヌクレ オチドを作成し、次のような配列を示した：ＧＴＴ（Ｇ／Ｃ）ＣＧＸＧＣＸＧＣ ＣＡＧＸＴＣ（Ｇ／Ｃ）ＣＧＸＴＧここで、Ｇ／ＣはＧ又はＣのいずれかを示し 、ＸはＡ、　Ｔ、　Ｃ。
Ｇのいずれも使用できることを意味している。ヒト胎盤λＧＴＩＯｃＤＮＡライ ブラリーの上述したようなスクリーニングを、６　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＯ３＋ 　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液を含むバッファーと４２℃の厳密性の低い条 件で次のように行なった。５２℃で２ＸＳＳＣの洗浄を行ない、フィルターのス クリーニングを行なった。タイプＡレセプターをコードするクローンを単離し、 タイプＢレセプター遺伝子で示した方法で塩基配列を決定した。
タイプＡレセプター（Ａ−ｈＰＤＧＦ−Ｒ）をコードする遺伝子のＤＮ＾配列と そこから推定されるアミノ酸配列を表３上に示した。
このベクターを、タイプＢレセプタークローンで述べたように、形質導入ＣＨＯ 細胞に使用した。ベクターがコードする配列の発現により、形質導入１０細胞が ３種類の全Ｐ［ｌＧＦフオームと結合し、ＡＡホモダイマーと優先的に結合する 、機能的なレセプターを産生じた。
ＩＸ、ＳＶ−３ＲＸＭ　ヘク　−（７）　Ｐ［１ＧＦ−Ｒ’　と１　いたＤＵＫ Ｘ−Ｂｌｌ　の） 分泌される冨歯類ＰＤＧＦタイプＢレセプター（タイプＢ　ＰＤＧＦ−Ｒ）細胞 外領域（ＸＲ）を発現させるため、蓋歯類ＰＤＧＦ−ＲのｃＤＮＡクローンを変 異させてコドン５００と５０１の間に５ｔｕＩ制限酵素認識部位を導入し、コド ン５００をバリンからアルギニンに変更した。　１．７ｋｂの−ＥｃｏＲ１−３ ｔｕｌ断片を、フレーム内プロリンコドンの次にＣ末端の停止コドンを加えられ たｐｌＢＩ−２５（１８１）に挿入した。１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　 Ｉ断片をｐｓＶ−７ＤＩＩＰＲニ転送し、ソコテはＸＲ発現が５Ｖ−４０初期プ ロモーターで制御され、アデノウィルスメジャー後期プロモーターで制御される 増幅用マーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）転写ユニットが含まれ る。完全なプラスミドはシグナル配列とＰＤＧＦ−Ｈの最初の４９９アミノ酸（ 細胞外領域）、続いてアルギニン、プロリン、停止コドンをコードする。
ｃＤＮ真の発現には、ｄｈｆｒ欠失ＣＯＯ突然変異細胞のＤＵＫＸ−Ｂｌｌを用 いた。
１０ｃｍの組織培養プレートで５μｇのｐｓＶ−３ＲＸ１ｄプラスミドを用いて ＤＵＫＸ−Ｂｌｌ細胞の形質導入を行ない、１０％透析仔牛血清と２００．ｃｒ ｇ／園ｌプロリン、１００Ｕ／霧ｌペニシリン、１００μｇ／饋ｌストレプトマ イシンを添加した核酸を含まないＭＥＭ−α（ＧＩＢＣＯ）を用いて発現の選択 を行なった。コロニーを抽出し、コンディシッンドメディウムに対してＳＤＳ電 気泳動とレセプター細胞外領域に対して作用するポリクローナルＰＤＧＦ−Ｒ抵 抗（Ａｂ７７）によるウェスタンブロッティングを用いて解析しスクリーニング を行なった。
メトトレキサート　いた　リ　の　−ｑ道Ｎ陽性の形質導入細胞を、最初に１． 　２．　５．１０ｎＭとして、メトトレキサート濃度を増加しながら順に処理し た。最高濃度にあるコロニーを、次にメトトレキサート濃度を１０倍（２０，５ ０，１０１００ｎに上げて処理を行なった。最高濃度にあるコロニーを再び取り 出して更に高濃度のメトトレキサート濃度で処理を行なった。それぞれの段階に あるコロニーのコンディションドメディウムをＳＯＳ電気泳動と抗−ＰＤＧＦ− Ｒ抗体（Ａｂ７７　）を用いたウェスタンブロッティングで解析を行ない、細胞 外領域タンパク質の発現を調べた。最も大量に細胞外領域タンパク質を分泌する メトトレキサート（５μＭ）耐性細胞を、ＤＰＸＲ（ＤＵＫ−ＰＤＧＦ−Ｒ細胞 外領域）細胞と命名した。Ｏ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ、　 ）とＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ　（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ、）を用いて、細胞外領 域タンパク質の酵素処理を行なった。簡単に説明を行なうと、小麦胚芽アグルチ ニン（ＷＧＡ）アフィニティークロマトグラフィー（５０ｎＭ。
２０−Ｍリン酸ナトリウム、ｐｈｉ　７．４）を用いて部分精製した細胞外領域 タンパク質をＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ　（１０Ｕ　／　ｍｌ　）を用いて一晩３ ７℃で処理し、更に０−ｇｌｙｃａｎａｓｅ　（２ｍｕ／　ｓ＋１　）で２時間 処理した０次にサンプルを５分間煮沸し、ＳＯ５電気泳動とＡｂ７７を用いたウ ェスタンブロッティングで解析を行なった。
ユＸｉラシとＬＺ上ｊ３−化１人 ９５％コンフルエントなりＰＸＲ細胞を、無血清ＤＭＥ　８２１培地で２回洗浄 した。１０％ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ　Ｓｅｒｕｍ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　 （υＣ３Ｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ）を添加した４１のＤ ＭＥ　Ｈ２１培地を１０ｃｍ培養プレートに移した。様々なアッセイに使用され た奮歯類細胞外領域ポリペプチドを含むコンディシッンドメデイウムを、特に指 定のない限り、４８時間ＤＰＸＲ細胞を培養した後に回収した。
２μ二眼」四シ因ｌ裂 ８Ｂ−ＰＤＧＦ（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの贈り物）をヨウ 素化した。簡単に説明を行なうと、シリコン処理を行なったポリプロピレンチュ ーブ内で２．５μｇのＢＢ−ＰＤＧＦをロータリーエバーボレーターで処理した 。　８Ｂ−ＰＤＧＦを１０μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，５）に溶 解した。　１富Ｓ［−モノヨードＢｏｌｔｏｎ　Ｈｕｎｔｅｒ試薬（５００ａ　 Ｃｉ　；　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を窒素雰囲気で乾固した。前もって１１！してお いたＢＢ−ＰＤＧＦを乾燥Ｂｏｌｔｏｎ　Ｈｕｎｔｅｒ試薬に加え、１５分間４ ℃で反応させた。５０！ｇのクエンチ溶液（０，１Ｍホウ酸ナトリウム、０．２ ＭグリシンｐＨ８，５）を反応混合物に加え、更に１０分間４°Ｃで反応させた 。　ｌａｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　（ＩＣＮＢｉｏｃｂｅｓ＋１ｃａｌｓ　）を含む０ ．１Ｍ酢酸で平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に反応混合物 全体を添加し、同一バッファーで溶出した。
Ｘ３箱ｊターＥ１± ＰＤＧＦレセプターポリペプチドの可溶性断片の生産、及びそれらを用いたアッ セイに関して、Ｋｔｍｂａｌｌ　ａｎｄ　Ｗａｒｒｅｎ　（１９８４）　Ｂｉｏ ｃｈｉｍ。
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ　７７１　：　８２−８８やｖａｎ　ｄｅｒ　５ｃｈ ａａｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、１４０　：　４８−５５．　ｖａｎ　Ｄｒｉｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８９）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　：９５３３−９５３８． 　Ｈｅ１ｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、　７　：　１３８ ７−１３９３．１１ｉ１Ｈａｍｓｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ’ｌ　＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　：５８６７−５８７０．　Ｗｉｌｌｉ ａｍｓｅｔ　ａｔ、　（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９　：　 ５２８７−５２９４　、そして特に０ｒｃｈａｎｓｋｙｅｔ　ａｔ、（１９８Ｂ ）　“Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　Ｌｉｎｋａｇｅ　ｏｆ　ａ τｒｕｎｃａｔｅｄＦｏｒｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅ ｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ″　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、２６３　：　１５１５９−１５１６５に技術及び結果が報告されてお り、従ってここではそれぞれの資料を賃料として含める。特に０ｒｃｈａｎｓｋ ｙの報告には、ＰＤＧＦレセプターの細胞外領域全体が、律および細胞内領域と 分離された後でも、未だにＰＤＧＦリガンドと結合能力を保持していることが示 されている。
細胞全体の結合アッセイでは、ＰＢＳ／ＥＤＴ＾（２ｌＭ）で浮遊させた２Ｘ１ ０’Ｒ１８細胞（ＰＤＧＦタイプＢレセプター導入Ｃ■０ＩｉＩ胞）を１０！！ １の血小板を殆ど含まない血清とＰＢＳ／　Ｈｏｐｅｓ（２５ｇ＋Ｍ最終ｐＨ７ ，４）で反応させた。　１２．５μｌから２００μｌのＤＰＸＲｉ！胞コンディ シッンドメディウム（上述の方法で収集）を、最終容量を２５０ｐｌとして２０ から１．２５倍希釈となるように結合混合物に加えた。混合物を一晩４℃で攪拌 し、７５０μｍのＦｉｃｏ１１勾配（ＰＯ３中に２８．５％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ ｑｕａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて４℃で遠心した。上清を吸引し、細胞 沈殿物の放射活性をガンマカウンターで測定した。
８Ｂ−ＰＤＧＦへの親和性を測定するため、細胞外領域タンパク質をプラスチッ ク表面に吸着させて固定した。　ＨＧ＾アフィニティークロマトグラフィー精製 された５０μｌの細胞外領域（約８０ｎＭ、銀染色より推定）を１０ｍ１の２５ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ＋　７５ｍＭ　ＮａＣ１＋　２０ｍＭ　Ｎ■ａＨｃＯｓ、 ｐＨ７，５溶液で希釈し、１００ｐｌづつを９６穴ＥＬＩＳ八マイクロタイター プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ、）の各ウェルに分注し た。４℃で一晩の反応後、そのプレートを１回洗浄し１００ｓ＋Ｍ　ＮａＣ１， ２５ｍＭ■ｅｐｅｓ、　ｐＨ７，３５に溶解した０、５％ゼラチンで３時間４° Ｃでブロックした０次にプレートを結合バッフｙ　−（０，３％ゼラチン、１０ ０５Ｍ　ＮａＣ１，２５＋ｗＭ　ＦＩｅｐｅｓ＋ｐｉｆ７．３５）で２回洗浄し た。　”’Ｉ−ＢＢ−ＰＤＧＦおよび／あるいは未標識のＢＢ−ＰＩ）ＧＦを最 終容量１００μｌとなるようにウェルに加え、プレートを４℃で１６時間反応さ せ、恒常状態の結合とした。プレートを再び結合バッファーで３回洗浄し、ガン マカウンターで測定するために２００μｌの１％５０５．　０．５％ＢＳ＾溶液 を用いて抽出した。
泉盪叉囲 特に−ＧＡクロマトグラフィーで精製された細胞外領域ポリペプチド（２５μｍ 　、　〜５０ｎｌ’ｌ）とＱ４μＣｉの”Ｉ−ＢＢ−ＰｔｌＣＦ　（最終濃度２ Ｊ）および各濃度の未標１１　ＢＢ−ＰＤＧＦを、最終容量を１００ｕｌに調整 して４℃３時間反応させた。
次に細胞外領域タンパク質とリガンドを、１■Ｍ　ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃ ｉｎｉｍｉｄｙｌ）　５ｕｂｅｒａｔｅ　（ＢＳ”）（ｃａｔ、　＃２１５７９ ＋　ＰｉｓｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉｎｏｉ ｓ）を用いて室温で３０分間の架橋を行なった。２５■Ｍ　Ｔｒｉｓバッファー ｐｉ　７．４を添加して５分間放置し、反応を停止した。レセプター抗体（＾ｂ ７７）を用いて細胞外領域タンパク質を免疫沈降し、ＳＯ３電気泳動で解析した 。
ｉン　アッセイ 細胞外領域タンパク質（１ｍｌ）を含むコンディションドメデイウムをＢＢ−Ｐ ＤＧＦと４℃で３時間反応させた。混合物を静止期のヒトＰＤＧＦ＾−レセプタ ー導入ＣＨＯ細胞あるいはＢＡＬＶ／ｃ　３Ｔ３細胞の単層細胞シートを含むＦ ａｌｃｏｎ　Ｓ大組織培養プレート（「１／ウェル）に加えた。ｍ胞と混合物を １０分間３７°Ｃで反応させ、次に血清を含まないＤＭＥ培地で洗浄し、Ｒｉｐ ａｎｄ溶解バッファーで溶解した。細胞ライセードを５ｏｓｔ気泳動と抗−ホス ホチロシン抗体を用し）たウェスタンブロッティングで解析した。
ヱユ」」へＬ上置性 ＢＡＬＶ／ｃ　３Ｔ３細胞を９６穴組織培養プレートで３日間培養し、Ｑ−培地 （１ｍｇ／畷１インシュリン及び２μｇ／鶴ｌトランスフエＩＪン、０．５ｍｇ ／ｓ＋ｌ　ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）で２４時間処理し静止期を作成した。細胞外 ｔｌ域タンパク質を含むコンディションドメディウムを新鮮なり！’ＩＢ　１１ ２１培地を用いて２倍の連続希釈を行ない、２μＭ　ＢＢ−ＰＤＧＦと４℃で３ 時間反応させた後、ＢＡＬＶ／ｃ　３Ｔ３細胞に加えた（２００．１／ウエル） 。
細胞を３７℃で１８時間培養した。ｌμＣｉの〔３Ｈ〕−チミジン（５０μｌ） を各ウェルに加え、４時間放置した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、冷トリクロ ル酢酸溶液（ＴＣＡ、５％）で固定した。沈殿した細胞破砕物を十分に冷ＴＣＡ （５％）で洗浄し、シンチレーシッン測定のために０．２５Ｎ　Ｂａ０Ｈ溶液に 溶解した。
Ｘｌ、旦上豊■五亘菫 ヒトレセプターに対する構成方法や発現、可溶性細胞外レセプター断片の切断あ るいは欠失類似体生理学的効果の決定は、ここに述べられた核酸やポリペプチド 、その他の試薬類を用いて行なわれた。
ヒト　および ＰＤＧＦ−Ｒ構成体 ＭｐｌＢＰＲを作成するために、ヒトタイプＢ　ｈＰＤＧＦ−［１の３．９ｋｂ 二Ｒ１−血ｄ　ＩＩＩ　ｃＤＮ＾断片をＭ１３Ｍｐ１８の」並Ｒ１−上ｄｌ［［ サイトにサブクローンした。技術に関しては、この賃料に引用しであるＭａｎｔ ａｔｔｓｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２Ｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　Ｎ、Ｙ、を参照すること、サブクローニングの認識を、制限酵素切断解 析とＳａｎｇｅｒ　ａｔ　ａｌ、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　７４　：　５４６３に述べられているジデオキシチェインターミネーシ ッンシークエンシングを用いて行なった。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異に用いるオリ ゴヌクレオチドはＫｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｈａｇ　ｍｏｌ。
１５４　：　３６７の方法に従って作成した。オリゴヌクレオチドを用いたＭｐ ｌＢＰＲのｉｎ　ｖｉｔｒｏ欠失変異体を作成する戦略に関しては、図８に概５ 　略を示した。簡単に説明すると、欠失変異により可溶性タイプＢ　ｈＰＤＧＦ レセプター細胞外領域を作成するためにオリゴヌクレオチドを設計した。ヒトＰ ＤＧＦレセプターの適当な領域に合致する変異オリゴヌクレオチドを、欠失体を 生成するために使用した。変異作成全体を通してアンチセンス饋を使用した。Ｐ Δ１の変異にはテンプレートとしてＭｐｌＢＰＲを用いた。ＰΔ１は４１ｂｐの オリゴマーをＤ５のリシン４９９（Ｎ４９９）の後にあるＴＡＧ停止コドンに導 入され、トランスメンブレン（ＴＭ）および細胞内キナーゼドメイン（Ｋ）を除 去されており、Ｍｐ１８ＰΔ１を生成した。ＰΔ１は５３０．、１４８．、前駆 タンノ寸り質をコードしている。
ヒトＰＤＧＦレセプター構成体はその後、Ｔａｋａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ Ｂ）　Ｍｏ１ｅｃ。
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８　：　４６６に述べられているｐｃＯＬ−３Ｒα２９ ６の派生物ｐＢＪ１のＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄ　ｍサイトにサブクローンされ、５ ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄＢｅｒｇ　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎ 、、　１：３２７に述べられているｐｓＶ２Ｎｇ。
と−緒にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）　ＩＩ胞に導入された。
構成体の機能は、次のように示された。
０．３３ｎＭ　ＰＤＧＦ　ＢＢリガンドサンプルを４℃で１時間以下の条件で前 処理した。
１、ポリクローナル抗−ヒトＰＤＧＦ抗体（この抗体はヒトＰＤＧＦ　ＡＡおよ びＰＤＧＦ　ＢＢ、　ＰＤＧＦ　ＡＢを認識する）２、１８ｎＭ（ＰＤＧＦ　Ｂ Ｂに対しモル比で６０倍）ヒトタイプＢ　ＰＤＧＦレセプター ３、レセプターと抗体を含んだリン酸平衡化生理食塩水（ＰＢＳ）、あるいは ４、リガンドだけを含むリン酸平衡化生理食塩水（ＰＢＳ　）実験の重複セント で、０．３３ｎＭ　ＰＤＧＦ　ＡＡを３種類の前処理条件即ち上述２．３．４． 　で処理した。ヒトタイプＢ　ＰＤＧＦレセプターは余りＰＤＧＦ　ＡＡを認識 しないけれども、以前としてこのリガンドがＮ１１１３τ３細胞に発現されるヒ トタイプＡ　ＰＤＧＦレセプターを活性化するため、ヒトタイプＢ　ＰＤＧＦレ セプター及びＰＤＧＦ　ＢＢ−依存性活性化に対する細胞毒性などの非特異的で 一般的な細胞効果のコントロールとなる。
前処理した材料は最終容量を０．５＋ｍｌとした。それらを６ウ工ル組織培養デ ィッシェの各ウェルに加え、各ウェルには４℃に冷却されたＮＩＨ３τ３細胞の 血清飢餓（静止期）にあるコンフルエントレイヤーが含まれた。１ｓ胞と反応混 合物を攪拌、即ち４℃で２時間揺り動かした０次に４℃のリン酸平衡化生理食塩 水で２回洗浄した。ｌウェル当たり４０μｍの１２５ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｈｙ ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）　ａｗｉｎｏ　ｓ＊ｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ）、　ｐ Ｈ６，８，２０％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、２％（ｗ／ｖ）　ドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＯ３）　、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、ａｎｄ　０．０ ０１％ブロモフェノールブルー＜ＳＯＳサンプルバッファーとして知られる）を 加え、次に４０μｌの１００５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，３０■ｈピロリン 酸ナトリウム、５０５Ｍぶつ化ナトリウム、５■ｎエチレンジアミン４酢酸（Ｅ ＤＴＡ）　、５ｓＭ　ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ　（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉ ｔｒｉｌｉｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、１％（ｗ　／　ｖ　）　５ ０３％１００５Ｍジチオトレイトール、２ｍＭぶつ化フェニルメチルスルフォニ ル（ＰＩ’１ＳＦ）　、２００ＭＭバナジン酸ナトリウム溶液を細胞に加えた。
ｍ胞は可溶化され、その可溶化物に更に４０μｌのＳＤＳサンプルバッファーを 加えた。この材料を５分間煮沸し、７．５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ ルアミドゲルの単一サンプルウェルに添加した。細胞性タンパク質を電気泳動で 分離した。
分離されたタンパク質をニトロセルロースへ電気的に転写し、得られた“ウェス タンプロット”を０．５％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、５＋＊ｇ／ｍｌウシ血清 アルブミン、５０ｍＭ↑ｒｉｓ　、　ｐＨ７，５溶液（ブロッキングバッファー と命名）を用いて室温で２０分間の処理を３回繰り返した。ブロッキングバッフ ァーで１　／１０００希釈したＰＹ２０　（市販されているホスホチロシンに対 するモノクローナル抗体（ＩＣＮ　）　）を用いてプロットを４℃で一晩反応し た。プロットを３回洗浄し、それぞれ室温で２０分間ブロッキングバッファーを 使用した。プロットに対して４ｐｃｉの”’Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　（Ａｍｅ ｒｓｈａｓ）を含むブ０７キングバツフ１−を用いて室温で１時間反応させ、３ 回の洗浄を室温でそれぞれ２０分間ブロッキングバッファーを用いて行なうた。
１枚のインテンシファイングスクリーンを用いてプロットをＸ線フィルムに一７ ０℃で４８時間感光させ、通常の試薬で現像を行なった。
Ｘ■８皿射１コ公二ＬヱヱｊΔ− ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎｔ　Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓｅ）をタイプＢヒトＰＤＧＦレセプターの細胞外領域断 片（上述）でコートし、１ウエル当たり１０−１１００ｎのこのタンパク質を１ ００μｌの２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　７５ｍＭ　ＮａＣｌ５ｐＨ７，３５溶液で添 加した。このタンパク質は形質導入Ｃ）ＩＯ１ｉｌ胞で発現され、無血清培地（ ＧＩＢＣＯＭＥＭα）に０．２−１　ｕ　ｇ　／ｍＬ総タンパク質量として１５ ０−３００　ｕ　ｇ／ｍｔの濃度で回収された。ヒトタイプＢ　ＰＤＧＦレセプ ターの細胞外領域断片の濃縮と部分精製を行なうため、小麦胚芽アプロチニンー ５ｅｐｈａｒｏｓｅへ４℃で培地を（４８ｍｌ／ｈで）　１＋ｗＭ　ＰＭＳＦの 存在下に添加した。十゛分な洗浄後、タンパク質を０．３Ｍ　Ｎ−アセチル−グ ルコ−サミン、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　１００５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＰＭ ＳＦ、　ｐＨ７，４溶液で溶出した。この分画を０．１５Ｍ重炭酸アンモニウム ｐｌ！　７．９溶液で平衡化された５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）に添加した。レセプター（３−１０ｎｇ／　ｔｔ　ｌ　）を含む 分画をＳＤＳ電気泳動とレセプター細胞外領域のペプチドに結合するウサギポリ クローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。これらの分画（ ３−１０ｎｇ／μｌ）を用いて、上述したようにマイクロタイタープレートのコ ーティングを行なった０次にウェルから溶液を除去し、それぞれ２００μｌの０ ．５％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　ＥＩＡ　ｇｒａｄｅ）　、２５ｍＭ　Ｈｅ ｐｅｓ＋　１００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，４溶液を用いて１回洗浄し、１５０ μｌの同一溶液で４℃で３時間放置した。
ウェルから溶液を除去し、０．３％ゼラチン、２５ｍＦＩ　Ｈｅｐｅｓ＋　１０ ９＠ＭＮａＣ１、ＰＨ７，４溶液（各１５０μｌ）で２回洗浄した。プレートを 氷の上に置き、９０μｌのこの０．３％ゼラチン溶液を各ウェルに加えた（非特 異的結合の試験に用いるウェルには８０μｌだけを加え、次に１０〃ｌの０．０ １ｍｇ／ｍｌ未１［１１ｉＰＤＧＦを含む０．３％ゼラチン溶液を加えた）。
ショートＢｏｌｔｏｎ　Ｈｕｎｔｅｒ試薬（八ｍｅｒｓｈａｍ）を用いて５２． ＯＯＯＣＰＭ／　ｎｇとなるように４°ＣでＰＤＧＦ　ＢＢ　（Ａａ＋ｇｅｎ） をヨウ素化し、約４０．　ＯＯＯＣＰＭを１ウエル当たりに加え、１０μｌのＱ 、０２４％ＢＳＡ、０．４％ゼラチン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　８０ｍＭ　Ｎ ａＣｌ、　７０ｓ＋Ｍ酢酸、ｐＨ７，４溶液とした。プレートを４°Ｃで４時間 放置し、その後それぞれ１５０μｌの０．３％ゼラチン、２５ｍＭ　ｆｆｅｐｅ ｓ、　ｌｏｏｓＭ　ＮａＣ１，、ｐＨ７，４ｔａ液を用いて４℃で３回洗浄した 。
ウェルに２００μＩの１％ＳＤＳ、　０．０５％ＢＳＡ溶液を加えて残存する結 合放射活性を可溶化し、ガンマカウンターで測定した。非特異的結合を１５０倍 過剰の未標識ＰＤＧＦ　ＢＢ　（Ａ■ｇｅｎ）の存在下に決定し、総結合”’Ｉ −ＰＤＧＦの約７％であった。
これらの研究は他の増殖因子混入を除去した増殖因子の調整を利用することを可 能にし、測定されたＰＤＧＦ反応の全体をこの単−形賞導入しセブターＤＮＡに 寄与させるレセプター発現システムの使用を１　く　可能にした。
ｘｍ、鼠朧血皿鳳 および　えｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＢＡＬＢ　ｃ／３Ｔ３細胞のクローンＡ３１．　Ｃ，Ｄ、５ｃｈｅｒ、　Ｃｈｉ ｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌｏｆ　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ、 から入手を、１０％牛血清とペニシリン及びストレプトマイシン（各５０μｓ／ ｍｌ）を添加したダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。　Ｓ　 ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ　（Ｓｉ９）　Ｉ胞（Ｍ、Ｓｕ＋ｕ＋ ｅｒｓ＋　ＴｅｘａｓＡ＆Ｍ、　ＴＸより）を、１０％生胎児血清、３．３ｇ／ Ｉイーストレイト、３．３　ｇ　／　ｌラクトアルブミン加水分解物及びペニシ リンとストレプトマイシン各５０μｇ／■ｌを添加したＧｒａｃｅ’ｓ培地で増 殖させた。＆Ｉｌ換えタイプＢ　ＰＤＧＦレセプター及びＰＤＧＦタイプＢレセ プターΔに！変異ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓベクターを通常方法に従って作成した ０組み替えｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓを感染後４８−６０時間のＳｉ９細胞の上清 から回収し、感染多重度（ＭＯＩ）を１とした。
、マイトジェン　ペプチド 細胞外領域に位置する合成ペプチド（アミノ酸４２５−４４６）を認識する抗− タイプＢ　ＰＤＧＦレセプター抗体（Ａｂ７７）を使用した。モノクローナル抗 −ＰＬＣ−７抗体はＳ、Ｇ、Ｒｈｅｅ、　ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＯか ら親切にも提供を受け、抗−ＧＡＰ抗体はＦ、ＭｃＣｏｒ＋ｗｉｃｋ、　Ｃｅｔ ｕｓ　Ｃｏｒｐ、。
Ｅｓｅｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから提供を受けた０組換えＢＢ −ＰＤＧＦはＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐ、Ｅｓｅｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒ ｎｉａに所属するＣ、Ｇ、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏから提供を受けた。結合実験に 使用したペプチドは従来のペプチド合成装置で調整し、千ロジンリン酸化ペプチ ドを合成するためにリン酸化チロシン（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−０−（ＰＯ３Ｂ２ １ｇ）　、　Ｐｅｒ＋１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｈｅｌｍｏｎｔ 。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を使用した。
藍豆ヱユ皇ヱ ｔｎ　ｖｔｖｏ結合をＭｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８９）　Ｃｅ旦 ５８　：６４９−６５７に従って行なワた。血清飢餓培養ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３ 細胞（１０７細胞）を、２ｎＭ　ＰＤＧＦの存在下あるいは非存在下で培養した ０ｗｉ胞ライセードを抗−レセプター抗体あるいは抗−ホスホチロシン抗体を使 って免疫沈降した。免疫複合体を、ＰＩ３キナーゼ活性の存在を検出し、レセプ ターに結合したタンパク質を決定するアッセイに使用した。ｎｖｉｔｒｏ結合実 験をＭｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）あるいはＭｏｒｒｆｓｏｎ 　ｅｔａｌ、　（１９９０）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０　：２３５ ９−２３６６に従って行なった。
代表的には、シａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現タイプＢ　ＰＤＧＦレセプターを、感 染（ＭＯＩ　：　１０）後４８−６０時間のＳｉ９細胞から抗−レセプター抗体 を用いた免疫沈降で回収した。感染細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの溶解 パンファー（１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ↑ｒｉｓ　（ｐＨ８，０）、　１７３ｍ Ｍ　ＮａＣｌ、　１０％グリセリン、２ｍＭＥＤＴＡ　、　１ｍＭぶつ化フェニ ルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）　、アプロチニン（０，１５Ｕ／園１）　、 ２０μＭロイペプチン、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）を用いて４℃で２ ０分間の振とうにより溶解した。大部分の実験（図３の説明に示した場合を除い て）では、免疫沈降されたレセプターをｉｎ　ｖｉｔｒｏで自動リン酸化するた めに、２０＠Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、　２０ｍＭ　ＭｎＣ１，１１００ ｔ１　ＡＴＰを含むバッファー中に２５°Ｃで１５分間放置した。ライセードを １３．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心し、不溶性物質を除去した。ライセードを抗− レセプター抗体、／−（１：５００希釈）と４℃で４時間反応した。レセプター −抗体複合体をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｓｉｇｍａ）を用 いて沈殿させ、洗浄を順にＲＩＰＡバッファー（０，１％ＳＯ３を含む溶解バッ ファー）、洗浄バッファー１（０，５％ＭＰ−４０，０，５Ｍ　ＬｉＣ１，５０ ＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，４）　）　、１０ｗＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，４） を用いて行なった。ＰＩ３キナーゼ結合アッセイを行なうため、固定化レセプタ ーをＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞ライセードと４°Ｃで３時間反応させた。免疫複 合体を順に冷ＰＢＳ、０．５％ＭＰ−４０，０，５Ｍ　ＬｉＣ１ａｎｄ　５０ｓ ＋Ｍ　Ｔｒｔｓ　（ｐＨ７，４）溶液で洗浄した。ペプチドを使用する実験では 、ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞ライセードをそのペプチド（５０μＭ）と４°Ｃで ３０分間予め反応させておき、それから昆虫細胞システムに発現されるＰＤＧＦ レセプタータンパク質と反応させた。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏキ　−ゼ　びＰＩ３キ　−ゼ・ｉｎ　ｖｉｔｒｏプロティンキ ナーゼ活性を測定するため、免疫沈降物をプロティンキナーゼバッフｙ　−（３ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐｆｌ　７．４）、　１０ｇＭ　ＭｎＣＩｔ）とｌＯμＣ ｉの（ｒ　−”Ｐ）　−ＡＴＰ　３，０００Ｃｉ／ｍ■０１中で２５℃１５分間 反応させた＊　４　ＸＬａｅ＋ｗｓｌｉ添加ゲルバッファーを加えて反応を停止 した。
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーを用いてサ ンプルを解析した。ＰＩ３キナーゼ活性はＫａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｔ。
（１９８６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８３　 ：　３６２−３６４に示された方法で解析した。免疫複合体をＰＩ３キナーゼバ ッファー（３０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐ）１７．３）、３０ｍＭ　ＭｇＣ１１，２ ００μＭアデノシン、４０μＭ　ＡＴＰ）及び０．２Ｄ／ｍｌの超音波処理ホス ホイノシトール（ＰＩ）　、１０μＣｉ　Ｃｒ−”ｐ〕−＾ＴＰ（３，０ＱＯＣ ｉ／ｗｗｏｌ）で２５℃１０分間反応させた。アデノシンをＰＩ３キナーゼアッ セイに加えたのは、混入するＰＩ４キナーゼ活性を完全に阻害するためである。
１００μｌの塩酸を加えて反応を停止した。
反応生成物をクロロフォルムで抽出し、溝相クロマトグラフィーで分離した。Ｐ ＩからＰＩＦへの変換を測定するため、ＴＬＣプレートをＸ線フィルムに２−３ 時間露光した。
レセブ　−の　リン　ヒ １ｍＭオルトバナジン酸の存在下及び非存在下で、レセプター免疫沈降物を４μ ｇのジャガイモアシッドホスファターゼと３０℃で３０分間反応させた、Ｍｏｒ ｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）を参照すること、ＲＡＰ処理後に免疫 沈降物を１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含むＲＩＰＡバッファーで３回洗 浄し、それから３７３ｉ１胞ライセードと反応させた。
ＰＤＧＦレセプ　−プローブを　いた８５ｋ［ｌタンパク　の“プロッティング ニトロセルロースメンブレンに転写した細胞ライセードタンパク質を用いて、Ｐ ＤＧＦレセプターと直接結合するそれらタンパク質の能力を解析し、その操作を ニトロセルロースメンブレンに対して５ｔＰ−標ＩＩＩＰＤＧＦレセプターをプ ローブとして行なった。放射性標識レセプタープローブを調製するため、ｂａｃ ｕｌｏｖｉｒｕｓ−発現レセプターを１０”　Ｓｆ９細胞から免疫沈降した。免 疫複合体を洗浄し、上述の自動リン酸化によって標識した。標識レセプターを免 疫複合体から解離させるため、１００℃の可溶化バフ７７　（０，４％ＳＯ５， １００ｍＭ　ＮａＣ１゜２ｍＭ　ＩＥＤＴＡ　、２閤ｈ　β−メルカプトエタノ ールルアミン、ｐＩ（　７．４）で繰り返し処理を行なった．抽出物を集め、β −メルカプトエタノール Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を加えた可溶化バッファーで希釈した．　ＳＯＳポリ アクリルアミド電気泳動とそれに続くオートラジオグラフィーによるこの物質の 解析から、レセプターが単独で存在することが呈示された。
ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞ライセードを調製しＳＯＳ電気泳動を行なった．ｓＤ ｓの非存在下でタンパク質をニトロセルロースフィルターに電気的に転写した． フィルターを放射性標識ＰＤＧＦレセプターと４℃で１２時間反応させ、２％Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含みβ−メルカプトエタノールを含まない可溶化バッ ファーで洗浄した．ペプチド競合実験のために、フィルターをｓｔｐ　＠＠レセ プタープローブ及び２．５μＭの指定ペプチドと上述の方法で反応させた。
本明細書中のすべての文献および特許出願は、それぞれの個別の文献および特許 出願が特別にかつ別個に参照により編入されるのと同程度に、参照により編入さ れる．本発明はいま完全に記載され当業者にとって、これの多くの変更及び修飾 が添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが明 らかである。
配列の列挙 （１）一般情報： （１）出願者：　ｌｌｉｌｌｉａｍｓ，　Ｌｅｗｉｓ　Ｔ。
Ｅｓｃｏｂｅｄｏ，　Ｊａｉｍｅ　Ａ。
（ｉｉ）発明の表現：血小板由来増殖因子レセプター（ｉｉｉ）配列の数　：５ （ｔｖ）通信住所　： Ｔ”ＣＣＴＣＣ！：Ｔ　ＡＡＴ　ＯＡＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　τｒ ｃ　ＡＴＣＴｒｒ　ｅＴＣ入ｃｃａλ＾　ＡτＡ　６１２Ｐｈ＠　Ｌａｕ　Ｐｒ ｏ　＾ｌｌｎ　Ｍｐ　Ａｌａ　Ｇｉｕ　ｃＪｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈａ　工１＠　Ｐ Ｍ　Ｌａｕ　丁ｈｒ　ＧＬｕ　工ｉｓ１コＱｌコ５１４０ ＡＣＴ　ＧＡＧ　入ｉＣＡＣｅ　ＡＴＴ　ｅｅＡ　ＴＣＣＣＣＪｋ　ＧＴＡ　Ａ ＣＡ　ＧｋＣｅｅＡ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＣＴＧ　６６O Ｔｈｒ　Ｇｌｕ工１＠Ｔｈｒ　！ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＶａＬＴｈｒ 　Ａｓｐ　ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｖ＆工Ｖａ１ＣＡｅ　ＣＭ　ｅＧＴ　ＧＧ Ｃ丁ＴＴ　ＴｅＴ　ＧｃＴ　ＡＴＣｆｆＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡ９　ＡＧｅ　ＴＡ ＣＡＴＣＴＧ：　フ５６１４ｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　 Ｇｌｙ　工１ｍ　Ｐｈａ　ＧＬｕ　ＡＩＩＰ　Ａｒｑ　ｍ＠ｒ　Ｔｙｒ　ＸＬ＠ 　（Aｙ、： Ｌ７５　１１０　１８５ ＡＡＡ　Ａｃｅ　ＡｅＣＡｆｒ　ＧＧＣＧｋＣＡＧＧ　ｅ；ＡＧ　（ＴＣＣＡＴ 　？Ｃ’ｒ　ＧｋＴ　ＧＣＣＴＡＣＴＡＴ　Ｇ’ＴＣ”４Ｌｙｍ　Ｔｈｒ　Ｔｈ ｒ　エエｓ　Ｏｌｙ　ＡＩＩＰ　ｋｒｑ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　５＠ｒ　Ａ ｍｐ　Ａｌａ　’ｒｙｒ　’ｆＹｒ　uａｌ ↓９５　２００　２０５ Ｔｒｅ　ＡＡＡ　ＧＡＣ：　ＡＡＣＣＣｃ　Ａｃｅ　ＣＴＧＧＣＣＧＡＣＴＣＣ ＡＧＣＧＣＴ　ＣＡＣＧＡ）、　ＡＴｃＧＣＣ１２ｎ４Ｐｈａ　Ｌｙｇ　Ａｍｐ 　Ａｇｎ　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５＠ｒ　Ｓａｒ　入１ａ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　工１鎗　＾１ａコ５５　コロ０　コロ５ ＡＴｅ、ＴＣＧ　ＴｃＴ　ＧＣＣＴＣｅ　ＡＧｋ　ＣＡＣＣ”ｒｅ　入＾＾　Ａ ＧＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ｅＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＣＧ　１Tフ２ １１ａ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　入ｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｐｒ口ｊ：ｃ　ＣＡＴ　Ｇ ＣＣＴＣＣＧＡｅ　ＧＡＧ　ｋＴｃ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　Ａｒｃ　ＡＴＧ　ＣＡＧ 　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＧＯＧＡＡ　３０１Q ＾ｌａ　ＨＬｓ＾ｌａ　ｓｉｒ　Ａｍｐ　Ｇｌｕ工ｌａ　Ｔｙｔ　Ｇｌｕ　Ｉ工 ａ　ＭｓＣＧｉｎ　Ｌ、ｙｍ　Ｃｙｓτｙ　ＧＬｕ９コＯＳコ５９４０ ＧＡＧＡＡ６ＴＴＴＧｋＧ入’ｒ？ＣＣ３ＣＣＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣｅＡＣＣＴ Ｇｅ−ＴＧＣＴＧＣτＴＣτｃｉｏａ。
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Ｌｏｓｓ　１ｏａｏ　１０！５　１０７０ＧｋＧＣＣＡＧｋＧＣＣＣＣＡＧＣ？ ？ＧＡＧｅＴｃＣλＧＣ；ＴＧＧＡＧＣ（：ＯＧλＧＣｅＣＧ＾ａＣｒｃコ４４ ４Ｃ１ｕＰｒｏＧｉｕＰｒｏＧｉｎＬａｕＧｌｕｔＪｕＧｉｎＶａｔＧＬｕＰｒ ｏＧ工ｕｐｒｏＧｌｕＬａｕＬＯ７Ｓ　１０１０　ＬＯａ５ ＧＡＡ　ｅＡｌ：　〒丁ｃ；　ＣｅＣＧｋＴ　ＴＣＧ　ＧＧＧ　ＴＧＣＣｒ　Ｃ ，ＣＧ　（：！：？　ｅｃｃ　にＣｏ　ＧＡ、％　ＧＣＡ　bＡＧ　コ４９２ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ＩＪｕ　Ｐｒｏ　Ｍｐ　５ａｒ　（Ａｙ　Ｃｙｓ　Ｐ：ｏ　Ａ Ｌａ　Ｐｒｏ　入ｒ９　人工ａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＬＯ９Ｑ　Ｌｏｓｓ　 ＬλｏＯ ＡＧＣＡＡＧ？ｌ：（ＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴに　ＴＣｃＴＴｃＡＧＧｃ　ＣＣＡ ＴＣＡＧＴＣＣＴＣ；ＧＧＧＣＴｆｆｒ　？ＣＴττＡＴＣ■b４２６４ ｃｃτ口λＣτ；τ丁　入ＡＴｅＣＡ？ＣＣＡ　Ｃｅ入ＣＡＧ？ＣＴλ　Ｇ入＾ ｃａｃロＡＧ＾　Ｃ（ＡＧＣＣＣ：Ｃｅ；Ｃ　λｆｌ丁Ｇ入嘯b　４コ２４ （２）配列番号２についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ７　１１０６個のアミノ酸 （Ｂ）型　：アミノ酸 （Ｄ）トボロジー：直鎖状 （　ｉｉ　）配列の種Ｍ：タンパク質 （χｉ）配　列：配列番号２： Ｍａｔ　入ｔｑ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＧＬＹ　Ａｌａ　Ｈ＠ｔ　Ｐｒｏ　入１ａ　 ＸＪｕ　Ａｌａ　Ｌ４ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌ４ｕＬ　５　１０　１５ Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌ４ｕ　Ｓ＠ｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌ４ｕ　 Ｇｌｕ　ｐｒｏ　Ｇ工ｎ　工ｌｓ　５ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ２０　２５　コＯ Ｌａｕ　Ｖａｌ　ＶＪＩＩ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ 　′ＬＡｕ　Ｖａ工　Ｌａｕ　ｘｓｎ　Ｖａｌ　５ｇｒ　Ｓ翌■ コ５　４０　４５ τｈｒ　ＰＭ　ＶＪＩＩ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ＣＹ！ｌ　Ｓａｒ　Ｇｌ’ｆ　Ｓａ ｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　入窒X Ｍａｔ　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｅｏ　Ｑｌｎ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　 入１ａ　Ｌｙｓ　入ユａ　Ｇ工ｒ＋　Ｍｐ　ＧＩＹ　Ｔｈｒ６５　フＯ　７５　 ＠Ｏ Ｐｈｅ　５ｅｒ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ＸＡｕ　ｒｈｒ　ｘｓｎ　 Ｌａｕ　ｒｈｒ　Ｇｌｙ　−ｕ　ＡｓｐτＭ　ＧＬｙａ５　９０　９５ ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｐｌ’ｌ＠　ＣＹｓ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓａ ｒ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　入ｓｐ　Ｇ撃■ Ｗｏｏ　１０５　１１０ ｋｒｑ　Ｌｙｓ　ｋｒｑ　ＬＡｕ　’ｒｙｒ工Ｌｍ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈ１：　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＊　Ｌａ■ ＬＬ５　１２０　１２５ Ｐｒｏ　Ａｇｎ　Ａｓｐ　入１ａ　ＧＬｕ　Ｇｉｕ　Ｌａｕ　ＰＭ　工ｌ＠　Ｐ ｈ＊　Ｌａｕ　τｈｒ　ＧＬｕ　工ｌｍ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ１コｏ　１コ５　１４ ０ 工ｌｍ　Ｔｈｒ　！ｌ＠　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　入１ｑ　Ｖａ１　’ｒ；．：　＾＃ Ｐ　ｌｌ’ｒｏ　Ｇｌｒｓ　Ｌ６ｕ　Ｖａｌ　Ｖａ工　Ｔｌfｌｒ　９ｕ １４５　１５０　１５５　Ｌ６０ 五ｉｓ　ＧＬ＊　Ｌｙｉ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　入ｌａ　ＬＪｕ　 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　’ｒｙｒ　入ｓｐ　Ｈｉ．ｓ　Ｇ奄■ １５５　Ｌ７０　１フ５ 人ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｚｌ＠　Ｐｈ＠　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ａｒｑ　Ｓｉｒ　Ｔｙｒ　Ｅｌｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　τｈ；゛　τｈ；　工Ｌ＠ 　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇユｕ　Ｖａｌ　入ｓｐ　５ａｒ　Ｍｐ　入１ａ　 Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　Ｔａｒ　入ｒ■ １９５　Ｚｏｏ　２０５ しａｕ　ＣＬｎ　Ｖａｔ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　＝１１１　＾ｓｎ　ＶａＬ　Ｓｅｒ 　Ｖａｌ　入ｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａ■ ２１０　２１５　２２ロ Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｍｎ　工１−　τｈｒ　Ｌ＊ｕ　Ｍ ａｔ　Ｃｙｓ　工ｌ＠　Ｖａｌ　工ｌｍ　Ｇ１ｙ　ｋｅｎ２２５　２コ０　２コ ５ 人ｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　＾ｍｎ　ＰＭ　Ｇｌｕ　Ｔｒ’ｐ　Ｔｈ＝　？ｌ／ｒ 　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｓｕｒ　ＧＬｙ　入ｒ■ ＩＪｕ　ｖａｌ　Ｇ工ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠　Ｌａｕ　 Ｌ＠ｕ　入ｇｐ　Ｍ＠ｔ＝　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｈ工Ｓ　工１■ ２６０　２６５　２フ０ ＾１ｑ　Ｓ＠＝　二ｌｍ　Ｌｓｕ　Ｈｉｓ　工ｌ＠　Ｐｒｏ　Ｓｍ＝　入１ａ　 Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈ＝２７５　２ａ０　２ ８５ ？ｙ＝　τ！′Ｉ＝　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　τｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｖａ ｌ　入ｓｎ　＾ｓｐ　｝Ｉｉｓ　Ｇｉｎ　入ｓｐＧ工ｕ　ＬxＩＩ ２９０　２９５　コＯＯ 人Ｌａ　Ｚｌａ　入ｓｎ　工ｌｍ　Ｔｌ’ｌｒ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｇｌｕ　５＠ ｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ｖａ１　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇ撃■ ）０５　３１０　１Ｌ５　）２０ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈ一　人１ａ　Ｇｌｕ　 Ｌａｕ　１｛ｉｓｉ　入ｒｑ　Ｓａｒ　ｋｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌ≠■ コ２５　ココＯ　ココ５ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＰＭ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌ＊ｕ　Ｔｒｐ　ＰＭ　Ｌｙｓコ４０　コ４５　コ５０ 人１ｐ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ｓ＠ｒ　Ｓ＠７： 　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　工１−　人１ａ　Ｌａｕ　Ｓａ■ コ５５　コ６０　コ６５ でｈ＝　＾ｒｑ　入ｓｎ　ＶａＬ　Ｓ＠ｒ　ＧＬｕ　Ｔ社　λｔｑ　↑ｙｒ　Ｖ ａｌ　３健ｒ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ｔａｕ　Ｖａｌコ７ｏ　コフ５　コＢ Ｏ ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　λｌａ　Ｇｌｕ　入Ｌａ　ＧＬｙ　Ｈｉｓ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｍｔ　Ａｒｇ　＾ｌａ　Ｐｈ＠　Ｈ工Ｓコ８５　コ９ｏ　コ９ ５　４００ ａｌｕ　Ｍｐ　λｌａＧ工ｕ　Ｖａｌ　（ｉｎ　Ｌｅｕ　５ａｒ　Ｐｈ＊　Ｇｉ ｎ　Ｌｍｕ　Ｇｉｎ　工ＩＣ　入ｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｙ：ロＶａｌ　入ｒｑ　Ｖａ ｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　入ｓ ｐ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇ工ｎ４２０　４２５　４コＯ Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｚｌｅ　５ａｒ　入１ａ　 工ｌｍ　Ｌａｕ　λｌａ　Ｌａｕ　ｖａＬ　Ｖａｌ　Ｌａｕ５コ０　５コ５　５ ４ｏ τｈｒ　工ｉ’ｓ　工ｌａ　Ｓｕｒ　Ｌａｕ　Ｚｌａ　工１●　Ｌａｕ　ｍｉｓ 　Ｍ−セ　Ｌ４ｕ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　ＬＹ＄　Ｌｙｓ　ｐｒ■ ５４５　５５０　５５コ　５６０ 八ｒｑ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｚｌａ　Ａｒｑ　Ｔ５　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ｍｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　ＳｔＩｒ：　５＠ｒ　Ａ！ＩＰ　ＧhＹ 阻ｓ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　工Ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｃ　Ｇ ｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｔｙｒ　ｋ＊ｐ　Ｓｉｒ：　Ｔｈｒ５ｇ０　５８５　５ ９０ Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌ＊ｕ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　 Ｌａｕ　（；Ａｙ　Ａｒｇ　？ｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｓｓ■ ｃｘｙ　＾工ａ　Ｐｌ’＋●　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　入１ ａ　Ｔｈｒ　＾工ａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　Ｈ奄■ Ｓａｒ　Ｇｉｎ　入Ｌａ　ＴＭ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　λｌａ　Ｖａｌ　Ｌ ｙｓ　ｓｅｅ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓ＠：　Ｔ？１”　入１ａ人ｒｇ　Ｓａｒ　Ｓ ａｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｍａｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌ ａｕ　ＬＹＳ　工１ａ　Ｍｔ　Ｓｅｒ論　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　ＨＬｓ　Ｔ ＪＬｕ　＾ａｎ　ＶａＬ　ＶａＬ　λｓｎ　Ｌ＊ｕ　Ｌ＊ｕ　Ｇｕｙ　入Ｌａ　 ａｙｓ　τｈｒ６ｇ０　６６５　６７０ Ｌｙｓ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工１ａ　ＴＹｒ　工ｌｍ　工１＠　τｈｒ　 Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ｈｒｑ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ６７５　６８０　６ ａ５ Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔ′Ｙｒ　Ｌ４ｕ　Ｈｉｓ＾ｒ９＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｈ ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｌ４１ｕ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｈ工Ｓ５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌ ｙｓ　Ａｒｇ　入ｒｇ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ｓａｒ　入Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔ ｙｒ　Ｓ＠ｒ　入ｓｎ　入１ａ　Ｌａｕ７０５　７１０　７１５　フ２０ Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＬＪｕ　ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　Ｈｉｓ　 Ｖａｌ　Ｓｅｚ”　Ｌｓｕ　τｈｒ　Ｇｌｙ　ＧＷ　Ｓｓ：７２５　７コｏ　７ ３５ ５１１ｒ　Ａｇｎ　ＴＹｒ　Ｍｅ　入Σａ　Ｐｒｏ　’１７ｒ　＾ｓｐ　入ｓｎ 　Ｔｙｒ　ＶａＬ　ｈｏ　Ｓｅｒ　入Ｌａ　ｉ’ｒｏ　Ｇｌ■ フ７ｏ　フフ５　フＢＯ Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｃｙｓ　Ａｒｑ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｌ４ｕ　Ｚｌ＠　Ａｌｎ　 Ｇｌｕ　ｓｅｒ　Ｐｒ６　Ｖａｎ　Ｌｇｕ　Ｓ＠Ｉ：　Ｔｙ■ ７Ｂ５　７９０　７９５　１１ＱＯ Ｍ１　人Ｓｐ　Ｌ４ｕ　Ｖｎｌ　ＧＡＹ　ＰＭ　５ｓｌｌ−　ＴＹｒ　Ｇｉｎ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　（；ｌｕ　Ｐｈ唐■ ｇｏｓ　ｓｚｏ　ｓ１ｓ Ｌａｕ　入１ａ　Ｓ＠τ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＨＬｓ　Ａｒｑ　 Ａｓｐ　Ｌａｕ　入１ａ　入１ａ　入ｒｑ　Ａｓｎ　Ｖａ１λｒｇ　Ａｓｐ　工 ｌｅ　Ｍｔ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　’ｒ’ｙｒ　工１＠　Ｓａｒ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５偲？　τｈｒ　Ｐｈ■ ａ５０　Ｂ５５　８６０ Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌ＊ｕ　Ｌｙｍ　Ｔｒｐ　Ｍｅｌｔ　λ工ａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ 　Ｓａｒ　工１＠　Ｐｈ＊　入ｓｎ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｔｙ■ で？．：　Ｔ？．ｒ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　τ？Ｐ　Ｓ＋ａｒ　Ｐ ｈａ　Ｇ’ｈＹ　工１ａ　Ｌａｕ　Ｌ＊ｕ　τｒｐ　Ｇｌｕ@＝ｌ一 ！１８５　８９０　８９５ ＰＭ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕシｔｕ　Ｐｒｏ　Ｍｔ＾ａｎ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ？Ｍ　？ｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌ ａ　工１＠　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｑ　Ｍ−セ　入１ａＧ工ｎ 　ｐｒｏ　入Ｌａ　Ｈｉｓ人１ａ　Ｓ＠ｒ　λｓｐ　（；ｌｕ　工１＊　？ｙｒ 　Ｇ１ｕ　工ｌ＊　Ｍ＠ｔ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｍ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｌｙ■ ９３０　９コ５　９４０ Ｐｈ＠　Ｇｌｕ　工Ｌ−　＾ｒｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　５＊ｒ　Ｇｉｎ　 Ｌｊｌｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ＩＡｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ｘｒ■ Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　（；ｌｕ　（；ｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｔｙ＝　ＧＬｎ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　入ｓｐ　Ｃｌｕ　Ｃ撃■ ？ｈ＠　Ｌ４ｕ　ｋｒｑ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　ＦｌｉＳ　ｐｒｏ　Ａｌａ　工１ａ 　Ｌａｕ　八ｒｇ　Ｓｅｓｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌ≠■ ？ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ｈｉｓ　Ｃｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　５ｅｒ　ＶａＬ　ＬａｕＴｙｒ　Ｔｈｒ　入 Ｌａ　ＶａＬ　ＧＬｎ　Ｉ’ｒｏ　＾ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ａ！ＩＰ　Ｔｙｒ　工ｌｍ　工１４　Ｐ窒■ Ｌ−ｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＬＹＳ　Ｐｒｏ　Ｇ工ｕ　Ｖａｌ　入ｌａ　 入ｓｐ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　ｕｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ１０２５　１０１０　 ’１０コ５　１０４０ｓａｒ　Ｐｒｏ　５＋ａｒ　Ｌ４ｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ｓ ｔｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａ１　人＄ｎτｈｒ　Ｓａｗ　Ｓｅ ｒτｈｒ　Ｘｌ鎗　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ 　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ．：：＝ｕ　Ｐｒ ｏ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｖ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　（；ｌｕ　fＬｉ １０７５　１０ｇ０　１０８５ Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｍｐ　Ｓｅｒ　（Ｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａ工ａ　Ｐｒｏ　＾ ｒｑ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｉｒ：（２）配列番号３に ついての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　４１００個の塩基対 （Ｂ）型　：核酸 （Ｃ）鎮　：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種ｌ！Ｉ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｔｉ）ハイポセティ カル二Ｎ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　Ｉｌｏｗｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｖｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ラムダｇｔｌ。
（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位　置：　１２９．．３３９５ （Ｄ）他の情報： （ｘｉ）配　列：配列番号３： Ａｃａ　ｃ＝　７τＧ　ＴＡＣＡＣ’Ｔ　ＴＣ，ご　ＴＸＴ　ＴＡＣＡＡＣＣＡ ＣＡＣ”　ＣλＣＡＣ＾　ＧＡＡ　ＣＡＧ　入＾丁　く■′？″Ｘ；Ｃλｙ　Ｌ ａｕ　’３゛：τ丁Ｃｖｌ　智：　Ｔ’、”：　Ａｌｎ　ＨＬｍτｈ＝　Ｇｌｎ τｈｒＧλｕ　ＧＬｕ＾５ｎＧＡＧ　Ｃ？Ｔ　ＧＡＡ　ＧＧＣＡＧＧ　ＣＡ（： 　Ａ’Ｘ＋ｒ　ＴＡＣ：　ＡＴＣＴＡＴ　０ＴＧ　ＣＣＡ　ＧＡＣＣＣＡ　Ｇ入 で　ＣＴ`　ＳＯＳ （ｉｉｕＬａｕＧｌｕＧｌｙＡｒｑＨＬｍＺｌｓＴＹＴＸ１＠↑ｙｒｖａｌＰｒ ｏ＾５ｐｐｒｏ入５ｐＶａ１１１５　工２０　１２５ ＣＣ：　Ｔττ　ＣＴＡ　Ｃ（Ｔ　ＣＴＡ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＡｃＧ　ＧＡＴ　 ＴＡＴ　Ｔτｋ　Ｃ；ＴＣＡＴＣ０ＴＧ　ＧＡＳ　ＣＡＴ　T５４ ＾ｌａＰＭνｍｌＰｒｏＬａｕＧｌｙＭａｔＴｈｒ＾”ｐ’ｒｙｒｔａｕｖａλ 工１ｍＶｍｌＧｌｕ＾１ｐ１コ０１３５１４０ ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＣＡτＴ　入τ＾　ＣＣＴ　ＴＧＴ　Ｃ（ｉＣＡ ｅＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣ’ｒ　U０Ｌ ＾ｓｐ　Ａｓｐ　５＊ｒ　＾ニー　エエａ　Ｘｌ＠　Ｐｒｏ　Ｃｙ奮　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。
１４５　１５０　Ａｓ５ Ｃ丁＾　入Ｃ：　ττ＾　ＣＡＣ入＾；　ＡＣＴ　ＧｋＣＧＧＧ　Ｃ：ＴＣ−Ｃ ；ＴＡ　ｅｃＴ　ＣＣＣ？Ｃ：　ＴＡＣＣＡＣＡＧＣ６ＳＧＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｌ ａｕ　Ｈｌｍ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　入 １ａ　ｍａｒ　ＴＹｒ　Ａｓｐ　５ｓｒＡＧＡ　ＣＡＧ　Ｇ；Ｃ丁ＴＴ　＾＾丁 　ＧＣＧ　ＡＣ：　ＴｒＣＡＣＴ　ＣＴＡ　（ＪＧ　Ｃｕｅ　ＴＡＴ　へ丁Ｃ丁 στＧＡ０　６９８人ｒｑＧ上ｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈ・　Ａｓｎ　（ｌｙ　Ｔｈｒ　 ＰＭ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒ口　智ｒ　工λ・　Ｃｙｓ　ＧｌｕＬ７！ 　ｌａｏ　１８５　１９０ ＧＣ；　＾ａｃ　０ＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　入ＡＧ　入＾ＧＴτＣｃＡＧ　Ａｃ ｅ　ＡＴＣＣｅＡ　ＴＴ’Ｔ　ＡＡＴ　Ｃ丁Ｔ？入丁　フ４U λＬａτ９ｒ　Ｖａ上Ｌｙ露Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＊　ＧＬｎ　Ｔｈｒ 　Ｉｌａ　Ｐｒｅ　Ｐｈ＊　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＴＹｒｋＣＣＣ：ｒＣτ入τ　入 ＾Ｇ　ＴｅＡ　ＧＧ３　ＧＡＡ　ＡＧＧ　へ丁Ｔ　ＯＴＣ０ＴＧ　Ａｃｅ　ＴＧ Ｔ　ＣＣＴ　Ｃττ　τττ　８S２ ？？Ｉｒ　Ｖａｌ　ＴＹｒ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　ａｌｙ　ａＬｕτｌｔｒ　Ｘｌａ 　Ｖａｌ　ＶａＬ↑ｈｒ　Ｃｙｓ　＾工ａ　ＶａＬ　Ｐｈ＊２２Ｓ２コ０２コ５ ＾ＴＴ　６ＴＧ　ＡＡＧ　入丁ｅ？ｃテ　ｃ、ｘｃ　ＴＴ７　ｃｃｃ　ｃτＧ　 ＧＣＣ＾ＧＡＧ入Ｃ入丁Ｃ＾丁ｃｃλτ　ＧＡＴ　２６６６Ｘ１ｍ　ＶａＬ　Ｌ ｙｓ工Ｌｍ　ｃ’ｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈ＊　Ｇｌｙ　Ｌａｕ＾ｌａ　ＡＡＡｓｐ　 Ｈｌｍ　Ｍ・ｃ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ８１５　＠４０　ａ４５ Ｃ’ＴＣＣＴστＣｉＣＣＡＣＣＣ入τａｃｃＴｃ〒ＣＧＬＣＴＣｋ（ａＣＡＡ ？ＧＣＪτＸＣ入τＴｍコａＳＳＰｒｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　入１ａ　Ａｒｇ　Ｍ ｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｊａｒ　＾ｓｐ　Ａｓｎ　ＡＬａ　τＹＦ　Ｅｌ ｓ　Ｇｌｙ９７５　９１１０　９＠Ｓ　９９０ Ｃ？：　入ＣＣ　？ＡＣ　入入Ａ　ＡＡＣ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＧＡＣ　入ＡＧ　 ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧλＣｒａｔ；　ａ＾Ｇ　ＧＧＴ　Ｃ．Ｇ噤@】１４６ ＶａλＴＭ　Ｑｒ　Ｌｙｓ　ｘｓｎ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ＾ｓｐ　Ｌｙｅ　ｔａｕム ｙｓ　ｍｐ　Ｔｒｐ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ（：τｃ　ＧＡ丁　ＧＡＧ　Ｃｋ Ｇ　ＡＣＡ　Ｃ丁＝　Ａａ：　ａｃｔ　ａＡｅ　＾ａ’ｒ　ａａｃ　τ入Ｃ　入 τＣ　＾τ？ｅｅフ　Ｃτb　コ１９４ Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｇ工ｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌ＊ｕ　ｍａｒ　入ｌａ　Ａｓｐ　 ｍａｒ　ｃｘｙ　↑１１　Ｘｌａ　ｒｌ＠　ｐｒｏ　Ｌａｕ１０１０　ＬＯＬ５ 　ＬＯＺＯ ＣＣＴ　ＧＡＣ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣｃＴ　ＣＴＣ　ｌ：（：？　ＣＡＧ　Ｇｋ Ｇ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　Ｃ’ｍ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　入`Ｃ　３２４２ ｐｒａ　入ｓｐ　工Ｌａ　入ｓｐ　Ｐｒｏ．Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＣＬｕ　ＧＬｕ　 Ｇ↓Ｕ　入蓼ｐ　Ｌａｕ　ＧＩＹ　Ｌ’／ｆｉ　八ｒｇ　入Pｎ １０２５１０）ＯＬｏｓｓ ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＧＣ　ＴＣＯ　ＣＡＧ　Ａｌ：′：＋　τ口τ　Ｃ入ＡＣλ Ｃ　ＡＧＴ　ｅ：ｃｃ　ＡＴ？　Ｇ入Ｇ　ＡｅＧ　６ＧＴ　sＣＣ　コ２９０ Ａｒｑ　Ｈｉｍ　Ｓ＠ｒ　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｔｒｏｔ　Ｓ＠ｔ：　Ｇｌｕ　ｄｌ ｕ　Ｓ＠ｒ　ＡＬａ　ｎ唸　ＣＬｕ　τｈｒ　６Ｌｙ　Ｓａ■ １０４０　１０４５　１０５Ｇ 人ＧＣ　ＡＧ丁　τＣ；　＾ＣＣ　Ｔ？Ｃ　Ａτ；　入Ｍ；　Ａ（；Ａ　ＧλＧ 　ＧＡＣ　ＧＡＣ　入ＣＣ　入Ｔｒ　Ｇ入入　ＧＡＣ　Ａ丁b　コココａ Ｓ＠ｒＳａｔ：Ｓｌ１ｒＴｈｒＰｈｅＺＬ＊Ｌｙｍ入ｒ９ＣｌｕＡｓｐＧｌｕτ ｈｒｘ工電Ｇｌｕ人１ｐエエｅｌｏｓｓ１０６０ＬＯ６ＳＬ（ｌフＯ ＧＡＣ　入τＧ　入ＴＯＧ入Ｃ　ＧＡＣ　＾τＣ　ａＳ：　＾τ＾　ＣＡＣ　τ Ｃフ　τＣ入　Ｇ＾ＣＣτＧ　ＣＴＧ　Ｇλ入　Ｃ入Ｃ　】R８６ 人ｆｉｐ　Ｍ＠ｔ　Ｍ＠ｕ　Ａｌｌｐ　Ａｓｐ　工１＠　Ｇｌｙ　ｒｉｍ　八ｓ ｐ　Ｂａｒ　Ｓａｒ　入ｓｐ　Ｌａｕ　Ｖａ工　ＧＬｕ　入唐■ ＬＯ７Ｓ　ＬＯＢＯ　Ｌｏａｍ ｈａｃ？ＴＣＣＴＧＴ入入ＣτＣ＊：：：λτＴＣＣλＧ＝＝’ｉｃｅ’＝ｃロ λ；〒〒ｃｒａａａｃｃｃコ４コ５Ｓｓ：　Ｐｈａ　Ｌａｕ （２）配列番号４についての情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１０８９個のアミノ酸 （Ｂ）型　：アミノ酸 （Ｄ）トボロジ一二直Ｍ杖 （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配　列：配列番号４： Ｍ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　入Ｌａ　Ｐｈ唸　Ｌａｕ　 ＶａＩ　Ｌａｕ　ＧＡＹ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｔｈ＝Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓ ａｒ　Ｌａｕ　工］Ｊ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｉｘｕ　Ｐ ｒｏ　Ｓａｒ　工ｌｍ　Ｌａｕ　！’ｒ■ ２０　２５　コ０ 人ｓｎＧ工ｕ　Ａｌｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＬＡｕ　 入ａｎ　ｓｕｒ　Ｓａｒ　Ｐｈ嚇　Ｓｃａｒ　Ｌ龜ｕ　入ｒ■ コ５　４０　４５ Ｃｙｓ　Ｐｈ＊　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｔ：　Ｔｒｐ 　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｃ　Ｓａｒ　ＧＬｕ　ＧＬ■ Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　入ｓｐ　ＶａＬ　Ｇｌｕ　エエ＊　Ａｒｑ　Ａｓｎ　 Ｇ工ｕ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　入ｓｎ　Ｓａｙ　Ｃｌｙ　ＬａｕＰＭ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｖａｌ　ＴＡｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　５＠ｒ　Ｓｉｒ　入１ａ　Ｓｉｒ　入１ ａ　入１ａ　ＨＬｓ　τｈｒＧ↓ＹＸＪｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ｃｙｓ　ＴＹｒ　 Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｈ４ｓ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　ｒｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌ＋Ｊ　ｋｌｌ ｎ　Ｇｌｕ　Ｌ|ｕ Ｇｌｕ　ＧＡＹ　入ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｉｌ＠　Ｔｙｒ　Ｚｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａ１　人１ａ　ＰｈａＬｌ５　１２０　１ ２５ Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｖ ａｌ　工１＠　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　入ｓｐ　入ｇｐ１３０　Ｌコ５　１４ ｏ Ｓｅｔ　入１ａ　エエ−　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＴｈｒＬａｕ　Ｈｉｍ＾ｓ ｎ　Ｓｉｒ　（；工ｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ＾ｌｍ　Ｓｉｒ　Ｔｙ ｒ　Ｍｐ　Ｓｓｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ１６５　１フ０　１７５ Ｇｌｙ　ＰＭ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｔｙｒ工１＠　ｅｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ１８０　Ｌａ５　１９０ Ｖａｌ　Ｌｙ＊　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＊　Ｇ工ｎ　Ｔｈ：　工ｌｍ　 Ｐｒｏ　ＰＭ　＾一ｎ　Ｖａｎ　ｔｙｒ　入Ａｍ　ＬａｕＬｙｓ　入１ａ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌ＊　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌ＊ｕ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　入工 ａ　Ｌ峨ｕ　Ｌｙｓ　↑ｈｒ　Ｖａｌ２１０　２１５　２フＱ ？ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＠　Ｖａｌ　Ｖａ１　 τｈｒ　Ｃｙｓ　入工ａ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ２２５　２コ０　２ コ５　２４０ Ｇｌｕ　ＶａＩ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＧＩＹエエａ　’ｎｏ ｒ　Ｍ＠ｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｃｌｕ工１ａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　Ｓａｒ 　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ＶａｌＴｙ＝　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ｈｓｐ　ｓｓｒ　ｃｘｙ　 Ａ！ＩＰ　Ｔｙ■ ２７５　２８０　り５ Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｖａ１　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｍ＠ｔ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｘ ｉ＠　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　（；ｌｙ　Ｐｈ＠　工１＠　 ＧＬｕ　工１＠　ＬＹＳ　Ｐｒｏ　τｈG コ０５　コ１０　）ＬＳ　１２０ ＰＭ　Ｓ＠ｒ　Ｇ工ｎ　Ｌ４ｕ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｖａｌ　入ａｎ　Ｌａｕ　Ｈ ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　ＰＭ　Ｖａｌコ２５　ココ０　ココ５ Ｖａｌ　（，Ｌｕ　Ｖａｌ　人ｒｇ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ 　入ｒ９　工ｉｓ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｌｙ襲　入ｓ■ コ４０　コ４５　１５０ 入ｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　：ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 （；ｌｕ　工１会　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ コ５５　コ６ｏ　コ６ラ Ｌｙｓ　工１＠　Ｇｉｎ　（；ｌｕ　工１＠　入ｒｑ　Ｔｙｒ　入ｒｇ　Ｓ＠ｒ 　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　工１＊　Ａｒｇ　Ａｌ■ コ７０　コ７５　コ８０ ＬＹｓ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　 工ｌ＠　Ｖａｎ　入１ａ　Ｇｉｎ　ｋｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ人１ａ　Ｖａｌ　Ｌ ｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ：ｏ　Ｔｈｒ　人１１１　人ｒｇ　Ｓａｒ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　入PΔ ６２５　６コ０　６コ５　６４０ ＩＪｕ　Ａｊｐ　工ｌｍ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　入１ａ　 入ｓｐ　Ｇｌｕ　５ａｒ　Ｔｈｒ　＾ｒｇ　５ａｒ　ＴｙｒＶａｌ　工１ａ　Ｌ ４ｕ　Ｓａｒ　Ｐｈ＊　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌｉｐ　Ｔｙｒ　 Ｈ＠ｔ−　人ｇｐ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｇ奄■ ７２５　７コ０　７コ５ 人工ｍ　Ａｉｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　 Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｓｉｒフ４０　７４５　７ ５０ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　工ｌ！　（Ｊｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　 Ｔｙｒ　入ｓｐ　入ｉ　ｐｒｏ　入工ａ　Ｓｅｔ　Ｔｙｒ７５５　７６０　フ６ ５ ＬＹ！Ｉ　Ｌｙｓ　Ｌｙｉ　Ｓａｒ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　入ｓｐ　５ａｒ　Ｇｌｕ 　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　＾！ｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓｍｒ　入ｓ■ フ７０　フ７５　フ８０ 人ｓｐ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｐｈ―　τｈｒ　↑ｙｒＧｉｎ　Ｖａｌ　入 Ｌａ　Ａｒｇ　Ｃｌｙ　Ｍ＠ｔ　Ｇ工ｕ　Ｐｈ＠　Ｌ＠ｕ　入１ａ　Ｓａｒ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｎ　ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＨｉｓＭｑ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　入１ａ　入ｌａ 　Ａｒ９　λｉｎ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ 　エエ＊　Ｖａｌ８２０　．　８２５　ＩＩコＯ ＬＹｓ　工１＠　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｒｑ　 Ａｓｐ　工１＠　Ｍｅ　Ｈｉｓ　＾ｓｐ　ｓｍｒ　入ｓｎＴｙｒ　Ｖａｌ　５ａ ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙ ｓ　Ｔｒｐ　Ｍａｔ　入上ａ　ＰｒｏＧｌｕ　Ｓａｒ　工１ａ　Ｐｈｅ　ｈｓｐ 　Ａｉｎ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　５ｅｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ 　Ｔｒｐ　５ａｒ？″ｙｒ　ＧＩＹ　工Ｌ＠　一ｕ　Ｌａｕ　Ｔｒ′ｐＧｌｕ　 工１＠Ｐｈａ　５ａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌ’／　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＰ ｒｏ　Ｇｌｌ／　Ｍｔ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　入ｓｐ　５ａｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｔ ｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　工１ａ　Ｌｙｓ　Ｓｕｒ　Ｇｌｙ’ｆｆｒ　Ａｒｑ　Ｍ ＊％　λ工ａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ｋｌＩｐ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇ工Ｕ　工Pｅ Ｍｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　ＰＭ　Ｔｙτ９コ０　９コ５　９４０ ｏｉｓ　Ｌ４ｕ　ｓａｒ　Ｇ工Ｕ　工１ａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　 Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ｇｉｎ　ｙｒ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＳ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙｉ　Ｘｌ瞠　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅ ｒ　入ｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　入１ａＶａｌ　入ｌ＆　入ｒｑ　Ｍａｔ　入ｒｇ 　Ｖａｌ　入！Ｉｐ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　入１ａ　Ｔｙｒ　工１＠　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｔｈ■ 丁ｙｒ　Ｌｙｓ　ｋｍｎ　ＧＷ　（Ｌｕ　ｋｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｐ　τｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ｃｌｙ　Ｌａｕ　λ寥ｐＧｌｕ　Ｇｉｎ　入ｒ ｇ　Ｌ４ｕ　Ｓ＠ｒ　入１ａ　入ｓｐ　ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　工ｌｓ　工ｌ ｅ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　入ｓｐ工０１０　１０１５　ＬＯ２０ 工１−　八ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｌｕ　Ａｓｐ　 Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａ＊ｎ　へｒｇ　ＨＬｓ５ｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇ ｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇ１＊　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ａｌａ　工１ａ　Ｇ１冨Ｔｈ ｒ　（；ｌｙ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　５ｇｒＬＯ４５　１０５０　１０５５ Ｓ＠ｔ　Ｔｈｒ　Ｐｈ電　ｕ＠　ＬＹＳ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔ ｈｒ　Ｚｌ＠　Ｇ工Ｕ　Ａｓｐ　工１＊　Ａｓｐ　Ｍａｔ：＋４ａｔ　Ａｓｐ　 入ｇｐ　工ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｘ１ａ　入ｓｐ　ｓｉｒ　ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　５＊ｒ　ＰｈT （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ？　６３７５個の塩基対 （Ｂ）型　：核酸 （Ｃ）鎖　：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｓＲＮ＾（ｉｉ）ハイボセティカル： Ｎ （１ｖ）アンチセンス：Ｎ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　ｓａｐ＋ｅｎｓ（ｖｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ラムダｇ　ｔｉ。
（ｔｘ）特＠： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位　置：　１２９．．３３９５ （Ｄ）他の情報：注＝“この配列のヌクレオチド番号１は、前の４１００個の長 さの配列のヌクレオチド番号１と同一である” （ｘｉ　）配　列：配列番号５； ＣｅＡにＡＯＣＴ入Ｔ　ＧＧＧＧｋＣＴＴＣ：　ＣｋＴＣＣＣＧＣＧＴ　ＴＣＣ ＴＧＣ；ＴＣ１’Ｔ　ＡＧＧｅ？ＧτＣＴ？　Ｃ１１’Ｃ入b＾ｃｃｃｅ　ｕ。
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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。
ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ ＦＩ （７２）発明者　エスコベド、ジャイム　ニー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１１７゜サンフランシスコ、＃３．アッ パー　テラス４５５

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. １．ヒト血小板由来増殖因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）ポリペプチドセグメ ントをコードする少なくとも約２４の連続的に並んだヌクレオチドを含む約５０ ｋｂｐより小さい精製され、単離された核酸。
  2. ２．上記セグメントが可溶性ポリペプチドである請求項１に記載の核酸。
  3. ３．上記セグメントが、ＢタイプおよびＡタイプｈＰＤＧＦレセプターの完全長 細胞外領域を本質的に含み、さらに表２および表３のポリペプチド配列を有する 請求項１に記載の核酸。
  4. ４．上記セグメントがリン酸化部位を含む請求項１に記載の核酸。
  5. ５．上記セグメントが約３００アミノ酸より小さい請求項１に記載の核酸。
  6. ６．上記セグメントがＰＤＧＦと結合できる請求項１に記載の核酸。
  7. ７．上記セグメントがリン酸化の基質である請求項１に記載の核酸。
  8. ８．上記セグメントがＰＩ３キナーゼと結合できる請求項１に記載の核酸。
  9. ９．細胞が哺乳類細胞である、請求項６に記載の核酸で形質転換した細胞。
  10. １０．非−真菌から生じたグリコシル化酵素をさらに含む請求項９に記載の細胞 。
  11. １１．上記セグメントをコードするヌクレオチドが操作できるようにブロモ−タ ーに連結されている請求項１に記載の核酸。
  12. １２．上記ｈＰＤＧＦ−Ｒセグメントに融合できるヘテロロガスなポリペプチド をさらにコードする請求項１に記載の核酸。
  13. １３．細胞中のＰＤＧＦ−誘導応答の量を対照細胞からの量と比較し、ここで該 ＰＤＧＦ−誘導応答は、該細胞をＰＤＧＦと接触させた後の細胞中のＤＮＡの合 成を測定することにより比較される工程から成る、ｈＰＤＧＦ−Ｒアゴニストま たはアンタゴニストとして機能する化合物の能力を評価する方法。
  14. １４．血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）結合能またはチロシンキナーゼ活性を有 する、少なくとも約２０アミノ酸の実質的に純粋なｈＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド 断片。
  15. １５．上記ポリペプチド断片が可溶性である請求項１４に記載の実質的に純粋な ポリペプチド断片。
  16. １６．タイプＢｈＰＤＧＦ−Ｒの約１から始まり約４９９で終止するアミノ酸を 本質的に含み、かつさらに表２に由来する、ｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を有するｈＰＤ ＧＦ−Ｒ断片。
  17. １７．タイプＡｈＰＤＧＦ−Ｒの約１から始まり約５０１で終止するアミノ酸を 本質的に含み、かつさらに表３に由来する、ｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を有するｈＰＤ ＧＦ−Ｒ断片。
  18. １８．非グリコシル化ｈＰＤＧＦ−Ｒ断片を含む組成物。
  19. １９．上記断片が実質的に純粋である請求項１８に記載の組成物。
  20. ２０．非一真菌および非−ヒトのグリコシル化パターンを表す、ｈＰＤＧＦ−Ｒ 断片を含む組成物。
  21. ２１．上記断片が実質的にタイプＢまたはタイプＡｈＰＤＦ−Ｒの細胞外領域で ある、請求項２０に記載の組成物。
  22. ２２．表２から、または表３からの配列を有する請求項２０に記載の組成物。
  23. ２３．ａ）ヒト血小板由来増殖因子レセプターポリペプチド（ｈＰＤＧＦ−Ｒ） 断片；および ｂ）発現時に上記断片をグリコシル化できる非−真菌のグリコシル化酵素、 の混合を含む組成物。
  24. ２４．少なくとも約５００ダルトンのｈＰＤＧＦ−Ｒタンパク質断片を上記細胞 に導入する工程から成る方法である、ｈＰＤＧＦ−Ｒ活性を細胞に導入する方法 。
  25. ２５．試料をｈＰＤＧＦ−Ｒレセプターリガンド結合部位と混合し；そして 該リガンドと該ｈＰＤＧＦ−Ｒレセプターリガンド結合部位との間の結合を検出 する、 工程から成る試料中のＰＤＧＦレセプターについてのリガンドの存在をアッセイ する方法。
  26. ２６．レセプターキナーゼ挿入領域を含む、約２００より小さい単離ポリペプチ ド。
  27. ２７．上記ポリペプチドがリン酸化アミノ酸残基を有する請求項２６に記載の単 離ポリペプチド。
  28. ２８．上記ポリペプチドがＰＤＧＦレセプターのキナーゼ挿入セグメントに実質 的にホモロガスな配列を含み、かつ表２または表３からの配列を有する請求項２ ６に記載の単離ポリペプチド。
  29. ２９．医薬的に受容できるキャリアーとともにある請求項２６に記載の単離ポリ ペプチド。
  30. ３０．第一タンパク質にリン酸化領域のペプチド類似体を加え、ここで該類似体 は該第一タンパク質が第二タンパク質に結合することを阻害する、 工程から成る、該第二タンパク質のリン酸化領域に結合する該第一タンパク質の 生物活性を変調させる方法。
  31. ３１．第一分析において、分子の存在下でタンパク質を標的リン酸化ペプチドと 接触させ； 第二分析において、分子の不存在下で該タンパク質を標的リン酸化ペプチドと接 触させ；そして 該分析を比較して該分子の該結合に対する効果を決定する、工程から成る、標的 リン酸化ポリペプチドに結合するタンパク質の結合を阻害できる分子を選択する 方法。
  32. ３２．上記接触工程が連続して行われる請求項３１に記載の方法。
  33. ３３．リン酸化ＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドをＰＩ３キナ ーゼに加え、それによって該ポリペプチドと該ＰＩ３キナーゼとの間の結合を行 う工程から成るＰＩ３キナーゼ活性を変調する方法。
  34. ３４．試料をＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドと実質的にホモ ロガスなリン酸化ポリペプチドの類似体に接触させて、それによってタソバク質 を特異的にリン酸化ポリペプチドに結合させる、 工程から成る、試料からＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域セグメントに結合 できるタンパク質を精製する方法。
  35. ３５．標識されたリン酸化ＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入領域ポリペプチドを 種々のタンパク質を発現する細胞と混合し、これによって核酸を発現してリン酸 化ポリペプチドに結合するタンパク質を生成するこれらの細胞を標識し、そして これらの標識された細胞を単離する、 工程から成るＰＤＧＦレセプターに結合できるタンパク質をコードする核酸を単 離する方法。
  36. ３６．ＰＤＧＦレセプターに結合できる上記タンパク質がＰＩ３キナーゼまたは 。ｃ−ｆｍｓである請求項３５に記載の方法。
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