KR20070013323A

KR20070013323A - 피브리노겐 감마쇄 ｃ-말단 단편에 의해 유도된 내피 세포아폽토시스

Info

Publication number: KR20070013323A
Application number: KR1020067025713A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 다카다; 노부아키 아카쿠라
Original assignee: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2004-05-07
Filing date: 2005-05-06
Publication date: 2007-01-30
Also published as: WO2005116235A2; AU2005248333A1; CA2565794A1; JP2007536274A; US20060019871A1; WO2005116235A8; WO2005116235A9; EP1751301A2

Abstract

본 발명은 내피 세포 증식을 억제하는 데 있어서 피브리노겐 사슬 C-말단 단편과 관련된 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 신규 용도를 제공한다. 폴리펩티드 또는 핵산의 사용 방법을 제공한다. 또한, 상기 폴리펩티드 또는 핵산을 함유하는 조성물 및 이 조성물을 함유하는 키트를 제공한다.

Description

피브리노겐 감마쇄 Ｃ-말단 단편에 의해 유도된 내피 세포 아폽토시스{ENDOTHELIAL CELL APOPTOSIS INDUCED BY FIBRINOGEN GAMMA CHAIN C-TERMINAL FRAGMENT}

관련 특허 출원

본원은 2004년 5월 7일 출원된 미국 가출원 제60/569,002호에 대한 우선권을 주장하고, 상기 가출원의 내용은 이 언급에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

연방정부 지원 연구 및 개발 하에 행해진 발명에 대한 권리에 관한 선언

본 발명은 국립보건원에 의한 허가 제GM49899호 하의 정부 지원으로 행해졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 가진다.

혈관 형성의 과정인 혈관신생은 정상 조직의 기능 및 병든 조직의 기능의 기초를 이루는 많은 생리학적 과정에서 핵심 과정이다. 이러한 혈관 형성 과정은 혈관의 루멘(lumen)에 선을 긋는 내피 세포 증식에 의존한다. 개체발생 동안, 혈관신생은 정상 세포, 조직 및 기관 발달 및 유지에 필요한 혈관망을 확립하는 데 필요하다. 성숙한 유기체에서, 신혈관의 생성은 기관 항산성 예를 들어, 암컷 자궁내막의 주기진행(cycling), 상처 치유 동안의 혈관 성숙, 및 유기체 완전성의 유지에 관여하는 다른 과정에 필요하다. 또한, 예컨대, 체내 및 체외에서의 조직 회복의 촉진, 조직 개조 및 새 조직의 성장에 있어서의 재생 의약을 비롯한 재생 의약에 중요하다.

모든 혈관신생이 유익한 것은 아니다. 부적절한 혈관신생 및 자궁외 혈관신생은 유기체에게 유해할 수 있다. 다수의 병적 증상이 부적절한 혈관의 성장과 관련되어 있다. 이들에는 예컨대, 당뇨성 망막병증, 신생혈관 녹내장, 건선, 수정체후부 섬유증식증, 혈관섬유종 및 염증이 포함된다. 또한, 암성 및 종양성 조직과 관련된 증가된 혈액 공급이 성장을 촉진하여 급속한 종양 확대 및 전이를 초래한다.

혈관신생을 조절하기 위해 많은 방법이 취해져 왔다. 예를 들면, 신혈관신생의 유도는 허혈성 심근 질환, 적절한 혈액 공급의 결핍에 의해 발생되는 다른 병상(condition)(예를 들면, 허혈성 사지, 졸중)의 치료에 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌(Rosengart et al., Circulation, 100(5):468-74, 1999)을 참조한다. 혈관신생은 선조세포 및 간세포로부터의 새로운 조직의 성장을 지지하는 데 필요한 핵심 과정 중 하나이다. 혈관생성이 바람직하지 않은 경우, 예컨대, 암 및 상기 병적 증상의 경우, 혈관신생의 억제는 치료 요법으로서 이용되어 왔다. 예를 들면, 혈관신생의 억제를 위한 조성물 및 방법은 미국 특허 제5,994,388호; 제6,024,688호; 제6,174,861호; 제6,242,481호; 제6,380,203호; 제6,413,513호; 제6,525,019호; 제6,548,477호; 제6,573,096호; 제6,589,979호; 및 제6,673,843호를 참조한다.

정상적으로는 휴지기에 있는 내피 세포를 활성화함으로써, 모세혈관을 발달시키는 화학-유인제로서 작용함으로써, 또는 유전자 발현을 자극함으로써 혈관신생 을 자극하는 다수의 다양한 인자가 확인되어 왔다. 이들 인자에는 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 예컨대, FGF-1 및 FGF-2, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 혈소판-유래의 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF)가 포함된다.

혈관신생의 억제는 약물 예를 들면, TNP-470, 모노클로날 항체, 안티센스 핵산 및 단백질 예컨대, 안지오스타틴 및 엔도스타틴을 사용하여 달성되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Battegay, J. Mol. Med., 73: 333-346 (1995); Hanahan et al., Cell 86: 353-364 (1996); Folkman, N. Engl. J. Med. 333: 1757-1763 (1995)]을 참조한다.

혈관신생의 중요성, 특히 종양 생물학에서 이의 관련성 때문에, 혈관신생을 조절하는 새로운 방법을 개발할 필요가 남아 있다. 본 발명은 이러한 필요성 및 다른 필요성을 해결한다.

본 발명의 간단한 개요

본 발명은 전체 피브리노겐 γ쇄가 아닌 피브리노겐 γ쇄(피브리노겐 γC)의 카르복실 말단 단편이 내피 세포에 대한 항-증식 효과를 가진다는 놀라운 발견에 기초하여, 내피 세포의 증식을 억제하여 원하지 않는 혈관신생을 억제하는 데 유용한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 폴리펩티드는 2가지 염기성 성질을 가진다: 첫째, 본 폴리펩티드는 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 함유하고; 둘째, 본 폴리펩티드는 내피 세포 증식을 억제할 수 있다.

일부 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제한다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6이다. 한 예에서, 이 아미노산 서열은 서열번호 3의 1-249의 서열이다. 일부 실시양태에서, 투여는 국소적으로 예컨대, 내피 세포의 연속된 증식에 의해 악화되는 병상을 앓고 있는 기관 내로의 직접적 전달(예를 들면, 종양 내로의 직접적 주사)로 수행한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 내피 세포 증식을 억제하기 위한 키트의 일부이다.

제2 측면에서, 본 발명은 핵산 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 핵산은 (a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 중식을 억제한다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6이다. 한 예에서, 이 아미노산 서열은 서열번호 3의 하위서열(아미노산 잔기 1-249를 포함함)이다. 다른 실시양태에서, 투여는 국소적으로 수행한다. 다른 실시양태에서, 청구된 본 조성물은 내피 세포 증식을 억제하기 위한 키트의 일부이다.

제3 측면에서, 본 발명은 내피 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 내피세포와 유효량의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 유효량의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 환자 에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이들 두 방법에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 (a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제할 수 있는 것을 특징으로 한다.

다른 실시양태에서, 청구된 본 조성물은 내피 세포 증식을 억제하는 키트의 일부이다. 일부 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제한다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6이다. 한 예에서, 이 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 1-249이다. 다른 실시양태에서, 투여는 국소적으로 수행한다.

제4 측면에서, 본 발명은 내피 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유효량의 핵산과 내피 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유효량의 핵산을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 내피 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이들 두 방법에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 내피 세포 증식을 억제할 수 있다.

일부 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제한다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6이다. 한 예에서, 이 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미 노산 1-249이다. 다른 실시양태에서, 투여는 국소적으로 수행한다.

도 1. 소 동맥 내피( BAE ) 세포의 피브리노겐 γC-유도 성장 정지. BAE 세포는 배양 배지 중의 가용성 천연 피브리노겐, 단편 D 또는 γC(각각 12.5 ㎍/㎖)의 존재 하에 BAE 세포를 웰 당 1 × 10⁴ 세포만큼 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. γC는 도시된 바와 같이 BAE 세포의 증식을 차단하였다(사진은 48시간 후에 촬영한 것임). 천연 피브리노겐 또는 단편 D는 이용된 조건 하에 이러한 효과를 유도하지 못하였다. 단편 D는 검출가능한 아폽토시스 효과를 유도하는 데 보다 더 많은 농도(100 ㎍/㎖)를 필요로 하였다.

도 2. 피브리노겐 γ는 BAE 세포의 증식을 차단하였지만 CHO 세포의 증식을 차단하지는 못하였다. 증식하고 있는 세포의 수는 테트라졸리움 화합물 MTS(CellTiter96^® 분석)를 사용하여 측정하였다. 데이타는 γC가 매우 낮은 수준의 γC(1 ㎍/㎖ 미만)에서 BAE 세포의 증식을 효과적으로 차단한다는 것을 보여준다. 반대로, γC는 CHO 또는 β3-CHO 세포의 증식에 대해 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지않는다. 이는 γC의 항-증식 효과가 내피 세포에 대해 특이적인 것임을 의미한다.

도 3A 및 3B. 피브리노겐 γ는 BAE 세포의 아폽토시스를 유도하였다. BAE 세포를 10 ㎍/㎖의 재조합 가용성 γC 또는 천연 피브리노겐으로 표시된 시간 동안 처리하였다. 아넥신 V 또는 요오드화프로피디움(PI)과 처리된 BAE 세포의 결합을 유세포분류기에서 측정하였다(도 3A). 상부 창 내의 세포(PI-고(high))는 죽은 세포를 나타내고, 하부 우측 창(PI-저(low), 아넥신 V 결합-고) 내의 세포는 초기 아폽토시스 세포를 나타낸다. BAE 세포의 γC-유도 아폽토시스는 2-4시간 내에 검출가능하였다(도 3B). 천연 피브리노겐은 이러한 효과를 유도하지 못하였다.

도 4. MAP 키나제 Erk 1 및 2의 피브리노겐 γC-유도 활성화. 재조합 αvβ3를 발현하는 CHO 세포(β3-CHO 세포)를 30분 동안 표시된 농도에서 가용성 γC와 인큐베이션하고, 항-인산화 Erk 1 및 2를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 MAP 키나제(Erk 1 및 2)의 수준을 측정하였다. 각 레인에서의 총 MAP 키나제의 수준은 필적할만하였다.

도 5. 피브리노겐 γ 및 γC-399 tr 에 의해 유도된 CPAE 증식의 억제. MTS 및 인산염 분석을 이용하여 CPAE 증식을 측정하였다. 10% 혈청-유도 증식은 1×10⁵/㎖ 후에 48시간 계대배양 동안 농도-의존적 방식으로 γC에 의해 억제되었다. γC-399tr은 CPAE 세포의 아폽토시스를 유도하는 데 있어서 대략 3배 더 효율적이다.

도 6. p38 MAPK 억제제 SB -203580은 투여량-의존적 방식으로 γC-399 tr -유도 아폽토시스를 차단한다. 10 μM의 억제제는 포화 농도이다. 다른 MAPK에 대한 억제제는 γC-399tr-유도 아폽토시스를 차단하지 못한다.

정의

본 명세서에서 사용된 용어 "억제하는" 또는 "억제"는 내피 세포 증식에 대한 임의의 검출가능한 음성 효과를 말한다. 이러한 음성 효과는 세포 증식의 지연 또는 정지뿐만 아니라 세포 사멸의 유도를 포함할 수 있다. 전형적으로, 억제는 대조구와 비교할 때 내피 세포 증식에서 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상의 감소, 또는 내피 세포 아폽토시스에서 10%, 20%, 50% 또는 100% 이상의 증가에서 반영된다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 말한다. 구체적으로 한정하지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합성을 가지며 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 명시하지 않는 한, 구체적인 핵산 서열은 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그(ortholog), SNP 및 상보성 서열뿐만 아니라 명백시 표시된 서열 또한 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 1 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성시킴으로써 달성할 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 코딩된 mRNA와 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드쇄를 생성하는 데 관여하는 DNA 절편을 의미한다. 이는 코딩 영역 앞의 영역 및 코딩 영역 뒤의 영역(리더 및 트레일러)뿐만 아니라 개별 코딩 절편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 말한다. 천연 발생 아미노산은 유전적 코드에 의해 코딩되는 아미노산뿐만 아니라, 추후에 변형되는 아미노산 예컨대, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 가지는, 즉 수소에 결합되는 탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기를 가지는 화합물 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. "아미노산 모사체"는 아미노산의 일반 화학적 구조와는 상이한 구조를 가지지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화합물을 말한다.

비천연 아미노산 유도체 또는 유사체가 부위-지시적 방식으로 폴리펩티드쇄 내로 삽입되게 하는 다양한 공지된 방법이 당분야에 존재한다(예컨대, WO 02/086075를 참조함).

아미노산은 본 명세서에서 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3문자 기호 또는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 말한다. 유전적 코드의 축퇴성 때문에, 상당수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 해당 코돈을 변경시킬 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 당해 핵산의 모든 가능한 침묵 변이 또한 기술하는 것이다. 당업자는 핵산의 각 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외함)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내재되어 있다.

아미노산 서열에 대하여, 당업자는 코딩된 서열에서 하나의 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"(이 경우, 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환됨)라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 보전적으로 변형된 변이체는 부가적인 것이며 상기 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.

하기 8개 군 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌(Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984))을 참조함)

본원에 있어서, 아미노산 잔기는 변형되지 않은 야생형 폴리펩티드 서열에서 번호 1로 매겨진 최좌측 잔기로부터 이들의 상대적 위치에 따라 번호를 매긴다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 2 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 기술하는 면에서 용어 "동일한" 또는 % "동일성"은 비교 창 상에서, 또는 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나 또는 수동 정렬 및 시각적 조사를 이용하여 측정한 표시된 영역 상에서 최대 상응도에 대해 비교되고 정렬된 경우에 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열, 또는 동일한 특정 비율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티 드를 가지는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다(예를 들면, 본 발명의 γC-관련 아미노산 서열은 기준 서열 예를 들면, 서열번호 3, 4 또는 6과 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가짐). 그 후, 이러한 서열은 "실질적으로 동일하다"고 언급된다. 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여, 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 말한다. 바람직하게는, 동일성은 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역 상에서, 보다 바람직하게는 75-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역 상에서 존재한다.

서열 비교의 경우, 전형적으로 한 서열은 시험 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 서열 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 배위체(coordinate)가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트(default) 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열에 비하여 시험 서열에 대한 % 서열 동일성을 계산한다. 핵산 및 단백질과, 피브리노겐 γ 핵산 및 단백질 예컨대, 서열번호 1 및 서열번호 3의 서열 비교를 위해, 하기 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 및 디폴트 파라미터를 이용하였다.

본 명세서에 사용된 "비교 창"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 동일 번호의 인접한 위치의 기준 서열과 비교될 수 있는 20 내지 600, 통상 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택된 인접한 위치의 번호를 가진 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함한다. 비교에 대한 서열의 정렬 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 실시, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사[예를 들면, 문헌(Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement))을 참조함]으로 수행할 수 있다.

% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) and Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]에 기재된 각각 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에 기재된 파라미터와 함께 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 % 서열 동일성을 결정하는 데 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 웹사이트를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이 알고리즘은 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬될 때 일정한 양성-값의 역치 스코어 T와 일치하거나 상기 T를 충족시키는, 검색 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍(HSP)을 첫 번째로 확인하는 단계를 포함한다. T는 인접하는 워드 스코어 역치로서 지칭된다(상기 문헌(Altschul et al.)). 이들 초기 인접 워드 힌트는 이들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하는 데 있어서 시드(seed)로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각 서열에 따라 두 방향으로 연장된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 누적 스코어는 파라미터 M(한 쌍의 일치 잔기에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N(불일치 잔기에 대한 벌칙 스코어; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하는 데 사용된다. 각 방향에서의 워드 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어진 경우; 누적 스코어가 1 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬로 인해 0 이하로 된 경우; 또는 각 서열의 말단에 도달된 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 11의 워드길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 3의 워드길이 및 10의 기대치(E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) 참조) 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.

또한, BLAST 알고리즘은 2개 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다[예를 들면, 문헌(Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993))을 참조함]. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 측정치는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 표시를 제공하 는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 핵산은 시험 핵산과 기준 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 기준 서열에 유사한 것으로 간주된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 의미는 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 하기와 같은 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 따라서, 전형적으로 폴리펩티드는 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 의미는 2개의 분자 또는 이들의 상보체가 하기와 같은 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 의미는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 아미노산 잔기로 된 중합체를 말하는 것으로서 상호교환가능하게 사용된다. 3가지 용어 모두는 1 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용될 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어들은 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 결합된 경우 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산쇄를 포괄하는 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 물질이 투여되는 경우 치료적 효과를 발생시키는 투여된 물질의 양을 말한다. 효과에는 질환/병상의 증상 및 관련 합병증의 진행을 임의의 검출가능한 정도까지 예방하거나, 고치거나, 억제하는 것이 포함된다. 정확한 양은 치료의 목적에 달려 있을 것이고, 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 달성될 것이다[예를 들면, 문헌(Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); and Pickar, Dosage Calculations (1999))을 참조함].

"발현 카세트"는 숙주 세포에서 특정한 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 가진, 재조합적으로 생성되거나 합성적으로 생성되는 핵산 컨스트럭트이다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 결합된, 전사될 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 피브리노겐 γ쇄 C-말단 단편과 관련된 폴리펩티드" 또는 "γC-관련 폴리펩티드"는 일반적으로 피브리노겐 γ쇄 카르복실 말단 단편에 상응하는 코어아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 말하며, 여기서 피브리노겐 γ쇄의 전장은 예컨대, 서열번호 2 또는 5에 의해 예시된다. 이 코어 γC 아미노산 서열은 아미노산 결실, 부가 또는 치환과 같은 일부 변이를 보유할 수 있으나, 내피 세포 증식을 억제할 수 있는 피브리노겐 γ쇄 C-말단 단편(예컨대, 서열번호 3, 4 또는 6)과 실질적인 수준의 서열 상동성(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 이보다 높은 서열 상동성)을 유지해야 한다. 코어 γC 아미노산 서열의 일부 예에는 서열번호 3의 C-말단으로부터 결실된 4개 이상의 아미 노산(AGDV)을 가진 서열이 포함된다. 서열번호 3으로부터의 이러한 결실은 C-말단으로부터 20개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 15개 또는 12개 이하의 아미노산일 수 있다. 한 예시적 코어 서열은 서열번호 3의 1-249 절편이다. 유사하게, 코어 γC 아미노산 서열은 서열번호 4의 C-말단으로부터 4개 이상의 아미노산(AGDV) 및 20개 이하의 아미노산을 결실시킴으로써 서열번호 4로부터 생성시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 12개 또는 15개 이하의 아미노산이 결실될 수 있다.

코어 γC 아미노산 서열 이외에, 본 발명의 γC-관련 폴리펩티드는 기원에서 이종성을 가질 수 있는 추가 아미노산 서열(예를 들면, 에피토프 태그) 또는 기원에서 상동성을 가질 수 있는 추가 아미노산 서열(예컨대, 피브리노겐 γ쇄로부터 유래된 추가 아미노산)을 추가로 보유할 수 있으나, 동일한 기능성을 보유해야, 즉 내피 세포 증식을 억제할 있어야 한다. 본원에 사용된 γC-관련 폴리펩티드는 전장 피브리노겐 γ쇄를 포괄하지는 않는다.

I. 도입

피브리노겐은 2개의 동일한 이황화-결합 서브유니트로 구성된 340 kDa 주 혈장 당단백질이고, 상기 서브유니트 각각은 3가지 상이한 폴리펩티드쇄 α, β 및 γ로 구성되어 있다. 피브리노겐은 혈액 응고, 세포질과 매트릭의 상호작용, 염증, 상처 치유 및 종양과 같은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 피브리노겐과, 세포외 매트릭스 단백질(피브리노겐을 포함함)에 대한 주요 세포-표면 수용체 부류의 일원인 인테그린 αvβ3 사이의 결합은 상처 치유 및 종양발생에서 세포 성장을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌(Brooks et al., Science 264: 569-571, (1994); Clark et al., Am. J. Pathol. 148: 1407- 1421 (1996))을 참조한다. 또한, 피브린(피브리노겐)에 결합된 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)가 내피 세포의 증식을 자극한다는 것도 보고되어 있다(Sahni et al.,J. Biol Chem. 274: 14936-41 (1999)).

인테그린 αvβ3는 피브리노겐에 대한 주 수용체이고 내피 세포를 비롯한 다양한 세포의 표면 상에서 발견된다. 피브리노겐과 인테그린 αvβ3 사이의 상호작용은 종양-유도 혈관신생에 관여한다. 약 250개의 아미노산으로 구성되며 약 30 kDa의 분자량을 가진, 피브리노겐 γ쇄(γC)의 카르복실 말단 도메인은 인테그린 αvβ3와 특이적으로 상호작용하는 것으로서 이전 연구에서 밝혀져 있다(Yokoyama et al., Biochemistry 38: 5872-5877 (1999)).

놀랍게도, 온전한 피브리노겐과는 달리 피브리노겐 γC는 내피 세포에서 성장 중지 및 아폽토시스를 유도한다는 것이 발견되었다. 임의의 특정한 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 내피 세포 사멸로 이끄는 세포 신호는 피브리노겐 γC에 의한 Erk1 및 Erk2와 같은 MAP 키나제의 활성화를 통해 전달되는 것으로 생각된다.

본 발명의 예시적 피브리노겐 γC 폴리펩티드는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가진다. 내피 세포 증식에 대해 본질적으로 동일한 억제 효과를 가진 보다 짧은 폴리펩티드는 용이하게 제조되어 하기 방법에 따라 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 따라서, 이들 보다 짧은 폴리펩티드 또한 본 발명의 예상 내에 있다. 예시적인 보다 짧은 γC 아미노산은 서열번호 3의 아미노산 1-249이고, 본 발명자들은 내피 세포에서 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 데 있어서 이 서열이 놀라울 정도로 효과적이라는 것을 발견하였다. 다른 보다 짧은 서열에는 서열번호 3의 C-말단으로부터 4개 이상의 아미노산 및 20개 이하의 아미노산이 결실되어 있는 서열이 포함된다. 일부 경우에서, γC 아미노산 서열의 이들 변이체는 N-말단 서열에서는 변화시키지 않으면서 C-말단 서열을 변경시킴으로써 서열번호 3, 4 또는 6으로부터 생성시킬 수 있다.

피브리노겐 γC의 활성이 내피 세포 증식을 억제한다는 발견에 있어서, 본 발명은 내피 세포 성장이 중요한 역할을 하는 바람직하지 않은 생리학적 또는 병리학적 과정을 억제하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 과다증식(예컨대, 다양한 유형의 암), 전이, 및 부적절한 혈관의 성장과 관련되어 있는 다른 질환(예를 들면, 당뇨성 망막병증, 신생혈관 녹내장, 건선, 수정체후부 섬유증식증, 혈관섬유종, 염증, 류마티스성 관절염, 연령-관련 망막황반 퇴화 등)을 치료하기 위한 신규 치료법을 제공한다.

II . 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 획득

A. 일반적인 재조합 기술

재조합 유전학 분야에서의 일반적인 방법 및 기술을 개시하고 있는 기본 교재에는 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)]이 포함된다.

핵산의 경우, 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 나타낸다. 이는 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 시퀀싱된 핵산 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질의 경우, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기 번호로 기재되어 있다. 단백질 크기는 겔 전기영동, 시퀀싱된 단백질, 유도된 아미노산 서열 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.

시판되지 않는 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 문헌[Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)]에 최초로 기재된 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 문헌[Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984)]에 기재된 바와 같은 자동화된 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 문헌[Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)]에 기재된 바와 같이 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 HPLC를 이용하여 수행한다.

피브리노겐 γ쇄 유전자, 피브리노겐 γ쇄 C-말단 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 클로닝 또는 서브클로닝 후에 예를 들면, 문헌[Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981)]의, 이중-가닥 주형을 시퀀싱하기 위한 사슬 종결 방법을 이용하여 입증할 수 있다.

B. 피브리노겐 γC에 대한 코딩 서열의 클로닝 및 서브클로닝

피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열 예를 들면, 진뱅크 등록 번호 BC007044, BC021674, 및 AF118092는 결정되어 있고 시판 공급사로부터 얻을 수 있다.

인간 게놈의 연구에 있어서의 급진전은 이전에 확인된 인간 피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 것과 같은 공지된 뉴클레오티드 서열과 일정한 비율의 서열 상동성을 가진 임의의 유전자 절편에 대해 인간 DNA 서열 데이타베이스를 검색할 수 있는 클로닝 방법을 가능하게 만들었다. 이렇게 확인된 임의의 DNA 서열은 추후에 화학적 합성 및/또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술 예컨대, 중첩 연장 방법으로 얻을 수 있다. 짧은 서열의 경우, 완전한 드 노보(de novo) 합성이면 충분할 수 있는 반면, 합성 프로브를 이용하여 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 전장 코딩 서열을 추가로 단리하는 것이 보다 큰 유전자를 얻는 데 필요할 수 있다.

별법으로, 인간 피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 표준 클로닝 기법을 이용하여 인간 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 단리할 수 있는데, 여기서 상동성에 기초한 프라이머는 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 공지된 핵산 서열로부터 종종 유도될 수 있다. 이러한 목적으로 가장 흔하게 이용되는 기법은 표준 교재 예컨대, 상기 문헌(Sambrook and Russell)에 기재되어 있다.

인간 피브리노겐 γ쇄에 대한 코딩 서열을 얻기에 적합한 cDNA 라이브러리는 상업적으로 입수할 수 있거나 작제할 수 있다. mRNA를 단리하고 역전사로 cDNA를 제조하고 cDNA를 재조합 벡터 내로 라이게이션시킨 다음 이를 증식용 재조합 숙주 내로 형질감염시키고 스크리닝하고 클로닝하는 일반적 방법은 잘 알려져 있다[예를 들면, 상기 문헌(Gubler and Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983); Ausubel et al.)을 참조함]. PCR에 의한 뉴클레오티드 서열의 증폭된 절편을 얻은 경우, 상기 절편은 피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 전장 폴리뉴클레오티드 서열을 cDNA 라이브러리로부터 단리하기 위한 프로브로서도 사용할 수 있다. 적절한 방법의 일반적 설명은 상기 문헌[Sambrook and Russell]에서 발견할 수 있다.

유사한 절차를 밟아 인간 피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 전장 서열 예를 들면, 상기 진뱅크 등록 번호 중 어느 하나를 인간 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 상업적으로 입수할 수 있거나 당 분야에 알려진 다양한 방법에 따라 작제할 수 있다. 일반적으로, 게놈 라이브러리를 작제하기 위해, 피브리노겐 γ쇄가 발견될 것 같은 조직으로부터 DNA를 먼저 추출한다. 그 다음, DNA를 기계적으로 전단시키거나 효소적으로 절단하여 약 12-20 kb 길이의 단편을 수득한다. 그 후, 상기 단편을 구배 원심분리에 의해 원치 않은 크기의 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 분리하고 박테리오파지 λ 벡터에 삽입한다. 이 벡터 및 파지는 시험관 내에서 팩키징한다. 재조합 파지는 문헌[Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (1977)]에 기재된 바와 같이 플라크 혼성화로 분석한다. 콜로니 혼성화는 문헌[Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975)]에 기재된 바와 같이 수행한다.

서열 상동성에 기초하여, 축퇴 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로서 디자인할 수 있고 PCR을 적절한 조건[예컨대, 문헌(White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin and Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994) 참조] 하에 수행하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 뉴클레오티드 서열 절편을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 절편을 프로브로서 이용하여, 피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 전장 핵산을 수득한다.

피브리노겐 γ쇄를 코딩하는 핵산 서열을 얻은 경우, 피브리노겐 γ쇄의 카르복실 말단 영역 예컨대, C-말단 261개 아미노산에 대한 코딩 서열을 제한 엔도뉴클레아제 절단, PCR 및 PCR-관련 방법과 같은 다수의 잘 공지된 기법으로 얻을 수 있다. 그 다음으로, 피브리노겐 γC 폴리펩티드(또는 내피 세포 증식을 억제하는 활성을 보유하는 γC의 단편)를 벡터 예를 들면, 발현 벡터 내에 서브클로닝하여 재조합 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 생성된 컨스트럭트로부터 생성시킬 수 있다. 피브리노겐 γC 코딩 서열에 대한 추가 변형 예컨대, 뉴클레오티드 치환을 추후에 가하여 폴리펩티드의 특성을 변경시킬 수 있다.

C. 피브리노겐 γC 코딩 서열의 변형

피브리노겐 γC 폴리펩티드의 아미노산 서열 예컨대, 서열번호 3, 4 또는 5는 하기 시험관내 또는 생체내 방법으로 측정된 바와 같이, 내피 세포 증식을 억제하는 폴리펩티드의 능력을 유지하거나 또는 증강시키면서 변형시킬 수 있다. 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 가능한 변형에는 보존적 치환; 1 이상의 아미노산 잔기의 결실 또는 부가(예컨대, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해, 6 X His와 같은 태그 서열을 폴리펩티드 한 말단에 부가하는 것); N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 피브리노겐 γ 폴리펩티드의 대략 10개, 20개, 40개, 60개, 80개 또는 100개 아미노산 길이의 단편을 절단시키는 것(truncation); 및 피브리노겐 γC 폴리펩티드 내의 대략 10개, 20개, 40개, 60개, 80개 또는 100개 아미노산 길이의 단편을 절단시키는 것이 포함된다. 이들 절단 변형을 가하기 위한 일반적 방법은 최소한의 절단으로 시작하여 길이에 있어서 대략 100개 이하의 아미노산까지 점차 증가하는 N-말단으로부터의 한 시리즈(series), 및 최소한의 절단으로부터 시작하여 길이에 있어서 대략 100개 이하의 아미노산까지 점차 증가하는 C-말단으로부터의 또 다른 시리즈가 있다. 시험관내 또는 생체내 분석에서 이렇게 생성된 절단된 폴리펩티드의 기능성을 시험한 경우 이러한 시험의 결과에 따라, 당업자는 N-말단 및 C-말단 둘 다가 절단된 또는 내부가 절단된 추가 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 생성시켜 내피 세포 증식의 억제에 대한 이들 폴리펩티드의 능력을 더 조사할 수 있다.

이러한 변형된 γC 아미노산 서열의 여러 예에는 서열번호 3의 C-말단에서 4개 이상 및 20개 이하의 아미노산이 결실되어 있는, 대체적으로 서열번호 3에 상응하는 서열이 포함된다. 예를 들면, 본 발명자들은 서열번호 3의 1-249 단편이 시험관내 분석에서 내피 세포 아폽토시스를 유도하는 데 특히 효과적이라는 것을 발견하였다.

다양한 돌연변이-발생 프로토콜이 당 분야에 확립되어 있고 기술되어 있으며, 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 데 용이하게 사용할 수 있다. 예컨대, 문헌[Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504-4509 (1997); and Stemmer, Nature, 370: 389-391 (1994)]을 참조한다. 이 방법들은 별도로 이용되거나 조합하여 이용되어 핵산 세트의 변이체 및 이에 따른 코딩된 폴리펩티드의 변이체를 생성시킬 수 있다. 돌연변이유발, 라이브러리 작제 및 다른 다양성-발생 방법을 위한 키트가 시판되고 있다.

다양성을 발생시키는 돌연변이 방법에는 예를 들어, 부위-지시적 돌연변이유발(Botstein and Shortle, Science, 229: 1193-1201 (1985)), 우라실-보유 주형을 이용한 돌연변이유발(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)), 올리고뉴클레오티드-지시적 돌연변이유발(Zoller and Smith, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500 (1982)), 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발(Taylor et al., Nucl. Acids Res., 13: 8749-8764 and 8765-8787 (1985)), 및 갭을 가진 이중가닥 DNA를 사용한 돌연변이유발(Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441-9456 (1984))이 포함된다.

돌연변이를 발생시키는 다른 가능한 방법에는 포인트 불일치(point mismatch) 복구(Kramer et al., Cell, 38: 879-887 (1984)), 복구-결손 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4431-4443 (1985)), 결실 돌연변이유발(Eghtedarzadeh and Henikoff, Nucl. Acids Res., 14: 5115 (1986)), 제한-선별 및 제한-정제(Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Land. A, 317: 415-423 (1986)), 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발(Nambiar et al., Science, 223: 1299-1301 (1984)), 이중-가닥 브레이크 회복(Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986)), 폴리뉴클레오티드 사슬 종결 방법에 의한 돌연변이유발(미국 특허 제5,965,408호) 및 에러-프론(error-prone) PCR(Leung et al., Biotechniques, 1: 11-15 (1989))이 포함된다.

D. 숙주 유기체에서의 바람직한 코돈 이용을 위한 핵산의 변형

피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 숙주의 바람직한 코돈 이용과 일치하도록 추가로 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 박테리아 세포의 한 균주의 바람직한 코돈 이용은 본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유도해내는 데 이용될 수 있고 이 균주가 선호하는 코돈을 포함한다. 숙주 세포에 의해 나타나는 바람직한 코돈 이용의 빈도는 숙주 세포에 의해 발현되는 상당수의 유전자에서의 바람직한 코돈 이용의 빈도를 평균하여 계산할 수 있다(예를 들어, 계산 서비스는 Kazusa DNA Research Institute(Japan)의 웹 사이트로부터 이용가능함). 이 분석은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 고도로 발현되는 유전자에 한정된다.

변형의 완료 시, 코딩 서열은 시퀀싱으로 검증한 후 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 재조합 생성에 적합한 발현 벡터 내로 서브클로닝한다.

E. 피브리노겐 γC의 화학적 합성

여러 이소폼(isoform)을 비롯한 피브리노겐 γ쇄의 아미노산 서열은 확립되어 있다(예를 들면, 진뱅크 등록 번호 P02679, AAH07044, AAK19751, AAB59531 및 AAP35744). γ쇄의 C-말단 영역의 결정 구조는 기재되어 있고 이 영역의 아미노산 서열은 예컨대, 진뱅크 등록 번호 1FIB, 1FICB 및 1FID에 기재되어 있거나, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 기재되어 있다.

상술된 바와 같이, 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 아미노산 서열은 내피 세포 증식을 억제하는 이의 능력을 손상시키지 않으면서 변형시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명의 피브리노겐 γ쇄-관련 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성 프로토콜 또는 당 분야에 잘 알려진 다른 프로토콜을 이용하여 화학적으로 합성할 수도 있다.

폴리펩티드는 문헌[Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N. Y., vol. 2, pp. 3-284 (1980); and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)]에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 고체-상 펩티드 합성법으로 합성할 수 있다. 합성 과정 동안, 측쇄가 보호되어 있는 N-α-보호 아미노산을 C-말단에 의해 결합되는 성장하는 폴리펩티드 사슬 및 고형 지지체 즉, 폴리스티렌 비드에 단계적으로 부가한다. 펩티드는 소정의 시약 예컨대, 디시클로헥실카르보디이미드와 반응시켜 활성화시킨 N-α-보호 아미노산의 α-카르복시 기에 N-α-탈보호 아미노산의 아미노 기를 결합시켜 합성한다. 자유 아미노 기와 활성화된 카르복실의 부착은 펩티드 결합을 형성시킨다. 가장 흔하게 사용되는 N-α-보호 기에는 산 불안정성을 띠는 Boc, 및 염기 불안정성을 띠는 Fmoc가 포함된다.

고형 지지체로서 사용하기에 적합한 물질은 당업자에게 잘 공지되어 있고 할로메틸 수지 예컨대, 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지; 히드록시메틸 수지; 페놀 수지 예컨대, 4-(α-[2,4-디메톡시페닐]-Fmoc-아미노메틸)페녹시 수지; tert-알킬옥시카르보닐-히드라지데이트화 수지 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 수지는 시판되고 있고 이들의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

요약하면, C-말단 N-α-보호 아미노산을 먼저 고형 지지체에 부착시킨다. 그 다음, N-α-보호 기를 제거한다. 탈보호된 α-아미노 기를 다음 N-α-보호 아미노산의 활성화된 α-카르복실레이트 기에 커플링시킨다. 이 방법은 원하는 펩티드가 합성될 때까지 반복한다. 그 다음, 생성된 펩티드를 불용성 중합체 지지체로부터 절단하고 아미노산 측쇄를 탈보호시킨다. 보다 긴 펩티드는 보호된 펩티드 단편의 축합으로부터 유도할 수 있다. 적절한 화학물질, 수지, 보호 기, 보호된 아미노산 및 시약에 관한 상세한 사항은 당 분야에 잘 공지되어 있으므로 본 명세서에서 상세히 논하지 않는다[문헌(Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), and Bodanszky, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag (1993)) 참조].

IV . 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 발현 및 정제

코딩 서열의 검증 후, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기초하여, 재조합 유전학 분야에서의 통상의 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

A. 발현 시스템

본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 고도 발현을 얻기 위해, 당업자는 전형적으로 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 전사/번역 종결자 및 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 보유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적절한 박테리아 프로모터는 당 분야에 잘 공지되어 있고 예컨대, 상기 문헌(Sambrook and Russell) 및 상기 문헌(Ausubel et al.)에 기재되어 있다. 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp .), 살모넬라(Salmonella) 및 카울로박터(Caulobacter)에서 이용할 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 시판되고 있다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵세포 발현 시스템은 당 분야에 잘 공지되어 있고 이 또한 시판되고 있다. 한 실시양태에서, 진핵세포 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.

이종 핵산의 발현을 지시하는 데 이용되는 프로모터는 구체적 적용에 달려 있다. 프로모터는 경우에 따라 그의 천연 셋팅에서 전사 개시 부위로부터 떨어져 있는 거리와 거의 동일한 거리로 이종 전사 개시 부위로부터 떨어져 위치되어 있다. 그러나, 당 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 프로모터 기능의 손실 없이 상기 거리를 다소 변경시킬 수 있다.

프로모터 외에, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 발현에 필요한 모든 추가 요소를 보유하는 전사 유니트 또는 발현 카세트를 포함한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터와, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결에 필요한 신호를 보유한다. 형질전환된 세포에 의한 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 분비를 촉진시키기 위해, 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 전형적으로 절단가능한 신호 펩티드 서열에 결합시킨다. 이러한 신호 펩티드에는 다른 신호 펩티드들 중에서도 조직 플라스미노겐 활성화자(activator), 인슐린 및 신경 성장 인자로부터 유래된 신호 펩티드, 및 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)의 유년기 호르몬 에스터라제가 포함된다. 카세트의 추가 요소에는 인핸서가 포함될 수 있고, 게놈 DNA가 구조 유전자로서 사용되는 경우, 기능성 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 가진 인트론이 포함될 수 있다.

프로모터 서열 외에, 발현 카세트는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조 유전자의 전사 말단 영역 다운스트림 또한 보유해야 한다. 이 종결 영역은 프로모터 서열로서 동일한 유전자로부터 얻을 수 있거나, 상이한 유전자로부터 얻을 수 있다.

유전 정보를 세포 내로 전달하는 데 사용되는 특정 발현 벡터는 특별히 중요하지는 않다. 진핵세포 또는 원핵세포에서의 발현에 사용되는 통상의 벡터 중 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터에는 플라스미드 예컨대, pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 융합 발현 시스템 예컨대, GST 및 LacZ가 포함된다. 통상적인 단리 방법을 제공하기 위해, 에피토프 태그 예컨대, c-myc 또한 재조합 단백질에 부가할 수 있다.

진핵세포 바이러스로부터 유래된 조절 요소를 보유하는 발현 벡터는 전형적으로 진핵세포 발현 벡터 예컨대, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, 및 엡스테인-바 바이러스로부터 유래된 벡터에 사용된다. 다른 예시적 진핵세포 벡터에는 pMSG, pAV009/A⁺, pMT010/A⁺, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵세포에서의 발현에 효과적인 것으로 밝혀진 다른 프로모터 지시 하에 단백질 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.

일부 발현 시스템은 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 디히드로폴레이트 리덕타제와 같은, 유전자 증폭을 제공하는 마커를 가진다. 별법으로, 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 바큘로바이러스 프로모터의 지시 하에 있는 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진, 유전자 증폭을 수반하지 않는 고수율 발현 시스템 예컨대, 곤충 세포 내의 바큘로바이러스 벡터 또한 적합하다.

전형적으로 발현 벡터 내에 포함되는 요소에는 이. 콜라이에서 기능하는 레플리콘(replicon), 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선별을 허용하는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 진핵세포 서열의 삽입을 허용하는, 플라스미드의 비본질적 영역 내의 유일한 제한효소 부위가 포함된다. 선택되는 특정 항생제 내성 유전자는 중요하지 않고, 당 분야에 공지된 많은 내성 유전자들 중 임의의 유전자라면 적합하다. 경우에 따라, 필요하다면 진핵 세포에서 DNA의 복제를 방해하지 않도록 원핵세포 서열을 선택한다. 항생제 내성 선별 마커와 유사하게, 공지된 대사 경로에 기초한 대사 선별 마커 또한 형질전환된 숙주 세포를 선별하기 위한 수단으로서 사용할 수 있다.

재조합 단백질(예를 들면, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드)의 원형질막주위 발현을 원하는 경우, 발현 벡터는 발현될 단백질의 코딩 서열의 5'에 직접 연결된, 분비 신호 예컨대, 이. 콜라이 OppA(원형질막주위 올리고펩티드 결합 단백질) 분비 신호 또는 이의 변형된 버젼을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 이 신호 서열은 세포질에서 생성된 재조합 단백질이 세포막을 통해 원형질막주위 공간 내로 이동하도록 지시한다. 발현 벡터는 재조합 단백질이 원형질막주위 공간으로 들어갈 때 신호 서열을 효소적으로 절단할 수 있는 신호 펩티다제 1에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 재조합 단백질의 원형질막주위 생성에 대한 보다 상세한 설명은 예컨대, 문헌[Gray et al., Gene 39: 247-254 (1985)], 미국 특허 제6,160,089호 및 제6,436,674호에서 찾을 수 있다.

상술한 바와 같이, 당업자는 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 생물학적 활성 예컨대, 내피 세포 증식에 대한 억제 효과를 여전히 보유하면서 다양한 보존적 치환을 임의의 야생형 또는 변형 피브리노겐 γC 단편 또는 이의 코딩 서열에 가할 수 있음을 인식할 것이다. 게다가, 생성된 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 특정한 발현 숙주에서 바람직한 코돈 이용을 수용하도록 폴리뉴클레오티드 코딩 서열의 변형 또한 가할 수 있다.

B. 형질감염 방법

표준 형질감염 방법을 이용하여 상당량의 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 발현시키는 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포주를 생성한 다음, 표준 기술을 이용하여 상기 폴리펩티드를 정제한다[예를 들면, 문헌(Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990))을 참조함]. 진핵세포 및 원핵세포의 형질전환은 표준 기법에 따라 수행한다[예를 들면, 문헌(Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983))을 참조함].

외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 잘 공지되어 있는 방법들 중 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이들 방법에는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공(electroporation), 리포좀, 미세주입(microinjection), 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질을 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 다른 잘 공지되어 있는 방법 중 임의의 방법이 포함된다[예컨대, 상기 문헌(Sambrook and Russell)을 참조함]. 이용된 구체적 유전 공학적 방법이 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 1 이상의 유전자를 성공적으로 도입시킬 수 있으면 족하다.

C. 숙주 세포 내에서의 γC-관련 폴리펩티드의 재조합 발현의 검출

발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입시킨 후, 형질감염된 세포를 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양한다. 그 다음, 상기 세포를 재조합 폴리펩티드의 발현에 대하여 스크리닝한 후, 표준 기법을 이용하여 상기 재조합 폴리펩티드를 배양물로부터 회수한다[예컨대, 문헌(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)); 미국 특허 제4,673,641호; 상기 문헌(Ausubel et al.); 및 상기 문헌(Sambrook and Russell) 참조].

유전자 발현을 스크리닝하기 위한 여러 일반적 방법이 당업자들 사이에 잘 공지되어 있다. 첫째, 유전자 발현은 핵산 수준에서 검출할 수 있다. 핵산 혼성화 기법을 이용하여 구체적으로 DNA 및 RNA를 측정하는 다양한 방법이 통상적으로 이용된다[예컨대, 상기 문헌(Sambrook and Russell) 참조]. 일부 방법은 전기영동 분리(예컨대, DNA 검출을 위한 서던 블롯 및 RNA 검출을 위한 노던 블롯)를 수반하지만, DNA 또는 RNA의 검출은 전기영동 없이도 (예컨대, 도트 블롯으로) 수행할 수 있다. 형질감염된 세포에 있어서 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재는 서열-특이적 프라이머를 이용하여 PCR 또는 RT-PCR로 검출할 수도 있다.

둘째, 유전자 발현은 폴리펩티드 수준에서 검출할 수 있다. 당업자는 다양한 면역학적 분석 특히, 본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드 예컨대, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 관용적으로 이용하여 유전자 생성물의 수준을 측정한다[예컨대, 문헌(Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor, 1988; Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975))을 참조함]. 이러한 기법은 피브리노겐 γC 폴리펩티드 또는 이의 항원성 부분에 대한 높은 특이성을 가진 항체를 선택함에 의한 항체 제조를 필요로 한다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 생성시키는 방법은 잘 확립되어 있고 이들에 대한 설명은 예를 들면, 상기 문헌(Harlow and Lane); 문헌(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976))에서 발견할 수 있다. 본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드에 대한 항체의 제조에 대한 보다 상세한 설명 및 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 검출하는 면역학적 분석의 수행은 후반부에 기재되어 있다.

D. 재조합적으로 생성된 γC-관련 폴리펩티드의 정제

형질감염된 숙주 세포에서 재조합 피브리노겐 γC 폴리펩티드가 발현된다는 것이 일단 확인되면, 상기 숙주 세포를 재조합 폴리펩티드의 정제 목적에 적절한 규모로 배양한다.

1. 박테리아로부터의 재조합적으로 생성된 γC 폴리펩티드의 정제

발현이 기본구성적(constitutive) 발현일 지라도, 전형적으로 프로모터 유도 후 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드가 형질전환된 박테리아에 의해 대량으로 재조합 생성되는 경우, 상기 폴리펩티드는 불용성 응집체를 형성할 수 있다. 단백질 인클루전 바디(inclusion body)의 정제에 적합한 여러 프로토콜이 있다. 예를 들면, 응집체 단백질(이하, 인클루전 바디로 불림)의 정제는 예를 들어, 약 100-150 ㎍/㎖의 라이소자임 및 0.1% Nonidet P40, 비-이온성 세제가 함유된 완충제 중에서의 인큐베이션에 의한 박테리아 세포의 파괴에 의한 인클루전 바디의 추출, 분리 및/또는 정제를 전형적으로 수반한다. 세포 현탁액은 폴리트론 분쇄기(Brinkman Instruments, Westbury, NY)를 이용하여 분쇄할 수 있다. 별법으로, 세포는 얼음 위에서 초음파처리할 수 있다. 박테리아를 용해시키는 별법은 상기 두 문헌(Ausubel et al. and Sambrook and Russell)에 기재되어 있고, 당업자에게 자명할 것이다.

세포 현탁액은 일반적으로 원심분리하고 인클루전 바디를 포함하는 펠릿은 인클루전 바디를 용해시키지는 않으나 이를 세정하는 완충제 예컨대, 20 mM 트리스-HCl(pH 7.2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 및 2% 트리톤-X 100, 비-이온성 세제를 함유하는 완충제에 재현탁시킨다. 가능한 많은 세포 데브리스를 제거하기 위해 세정 단계를 반복할 필요가 있을 수 있다. 남은 인클루전 바디 펠릿을 적절한 완충제(예컨대, 20 mM 인산나트륨, pH 6.8, 150 mM NaCl)에 재현탁시킬 수 있다. 다른 적절한 완충제는 당업자에게 자명할 것이다.

세정 단계 후, 인클루전 바디는 강한 수소 수용체 및 강한 수소 공여체 둘 다인 용매(또는 이들 성질 중 하나를 가진 각 용매의 조합물)를 첨가하여 가용화시킨다. 그 후, 인클루전 바디를 형성시킨 단백질은 병용가능한 완충제로 희석시키거나 투석하여 재생시킬 수 있다. 적절한 용매에는 우레아(약 4 M 내지 약 8 M), 포름아미드(약 80% 이상, 부피/부피 기준), 및 구아니딘 염산염(약 4 M 내지 약 8 M)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 응집체-형성 단백질을 가용화시킬 수 있는 몇몇 용매 예컨대, SDS(황산도데실나트륨) 및 70% 포름산은 이 과정에서 사용하기에 부적합할 수 있는데, 이는 면역원성 및/또는 활성의 결핍을 동반하는 단백질의 비가역적 변성 가능성 때문이다. 구아니딘 염산염 및 유사한 시약이 변성제일 지라도, 이 변성은 비가역적일 수 있고, (예를 들면, 투석에 의한) 변성제의 제거 또는 희석 시 당해 면역학적 및/또는 생물학적 활성 단백질의 재형성을 허용하는 재생이 일어날 수 있다. 가용화 후, 단백질은 표준 분리 기법으로 다른 박테리아 단백질로부터 분리할 수 있다. 박테리아 인클루전 바디로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하는 것에 관한 추가 설명은 예컨대, 문헌(Patra et al., Protein Expression and Purification 18: 182-190 (2000))을 참조한다.

별법으로, 박테리아 원형질막주위공간(periplasm)으로부터 재조합 폴리펩티드 예컨대, 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 재조합 단백질이 박테리아의 원형질막주위공간 내로 운반되는 경우, 박테리아의 원형질막주위공간 분획은 당업자에게 공지된 다른 방법 이외 냉 삼투성 충격(cold osmotic shock)으로 단리할 수 있다(예컨대, 상기 문헌(Ausubel et al.) 참조). 원형질막주위공간으로부터 재조합 단백질을 단리하기 위해, 박테리아 세포를 원심분리하여 펠릿을 형성한다. 이 펠릿은 20% 수크로스가 함유된 완충제에 재현탁시킨다. 세포를 용해시키기 위해, 박테리아를 원심분리하고 펠릿을 빙냉 5 mM MgSO₄에 현탁시키고 대략 10분 동안 냉욕조에서 유지시켰다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 따라 두었다. 이 상청액에 존재하는 재조합 단백질은 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 분리 기법으로 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.

2. 정제를 위한 표준 단백질 분리 기법

재조합 폴리펩티드 예를 들면, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 숙주 세포에서 가용성 형태로 발현시키는 경우, 이의 정제는 하기 표준 단백질 정제 방법에 다라 수행할 수 있다. 이 표준 정제 방법은 피브리노겐 감마쇄의 화학적 합성 또는 효소적 절단으로부터 얻은 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 정제하는 데에도 적합하다.

i. 가용성 분획화

단백질 혼합물이 결합체인 경우 종종 초기 단계로서 초기 염 분획화는 당해 재조합 단백질 예컨대, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드로부터 많은 원치않는 숙주 세포 단백질(또는 세포 배양 배지로부터 유래된 단백질)을 분리시킬 수 있다. 바람직한 염은 황산암모늄이다. 황산암모늄은 단백질 혼합물 중의 물의 양을 효과적으로 감소시켜 단백질을 침전시킨다. 그 다음, 단백질은 이의 가용성에 기초하여 침전된다. 단백질이 보다 높은 소수성을 나타낼수록, 단백질은 보다 낮은 황산암모늄 농도에서 침전될 가능성이 높다. 전형적인 프로토콜은 포화된 황산암모늄을 단백질 용액에 첨가하여 결과적으로 황산암모늄 농도가 20-30%가 되게 하는 것이다. 이는 가장 소수성이 높은 단백질을 침전시킬 것이다. 침전물은 버리고(원하는 단백질이 소수성을 띠지 않는 경우), 당해 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도로 황산암모늄을 상청액에 첨가한다. 그 다음으로, 침전물을 완충제에서 가용화시키고, 필요하다면 투석 또는 정용여과를 통해 과량의 염을 제거한다. 단백질의 용해도에 의존하는 다른 방법 예컨대, 냉각 에탄올 침전은 당업자에게 잘 공지되어 있고 결합체 단백질 혼합물을 분획화하는 데 이용할 수 있다.

ii. 크기 감별 여과

계산된 분자량을 기초로 하여, 상이한 공극 크기의 막(예컨대, Amicon 또는 Milipore 막)을 통한 한외여과를 이용하여 보다 큰 크기의 단백질과 보다 작은 크기의 단백질을 단리할 수 있다. 제1 단계로서, 당해 단백질 예를 들면, 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 분자량보다 더 낮은 분자량 컷-오프를 가진 공극 크기의 막을 통해 단백질 혼합물을 한외여과한다. 그 후, 당해 단백질의 분자량보다 더 큰 분자량 컷-오프를 가진 막에 대해 한외여과의 체류물을 한외여과한다. 재조합 단백질은 막을 통과하여 여액으로 들어갈 것이다. 그 다음으로, 여액을 상술한 바와 같이 크로마토그래피로 분리할 수 있다.

iii. 컬럼 크로마토그래피

당해 단백질(예컨대, 본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드)은 이의 크기, 순 표면 전하, 소수성, 리간드에 대한 친화성에 기초하여 다른 단백질들로부터 분리할 수도 있다. 또한, 피브리노겐 γC 단편에 대해 생성된 항체는 컬럼 매트릭스에 컨쥬게이션시켜, 피브리노겐 γ 폴리펩티드를 면역정제할 수 있다. 이들 방법 모두는 당 분야에 잘 공지되어 있다

크로마토그래피 기법을 임의의 규모로 많은 다양한 제조사(예컨대, Pharmacia Biotech)의 장치를 이용하여 수행할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

V. 재조합 피브리노겐 γC 발현의 검출을 위한 면역분석

재조합 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 생성을 확인하기 위해, 면역학적 분석을 이용하여 상기 폴리펩티드의 발현을 샘플에서 검출할 수 있다. 면역학적 분석은 재조합 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 발현 수준을 정량하는 데에도 유용하다. 피브리노겐 γC 폴리펩티드에 대한 항체는 이들 면역학적 분석을 수행하는 데 필요하다.

A. 피브리노겐 γC 폴리펩티드에 대한 항체의 생성

당해 면역원과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다[예컨대, 문헌(Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, 1991; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, and references cited therein; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY, 1986; and Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975) 참조]. 이러한 기법에는 파지 또는 유사한 벡터 내의 재조합 항체 라이브러리로부터 항체를 선별함으로써 항체를 제조하는 방법이 포함된다[예컨대, 문헌(Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; and Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)을 참조함].

원하는 특이성을 가진 항체를 보유하는 항혈청을 생성하기 위해, 당해 폴리펩티드(예를 들면, 본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드) 또는 이의 항원성 단편을 이용하여 적절한 동물 예컨대, 마우스, 토끼 또는 영장류를 면역화시킬 수 있다. 표준 면역보강제(adjuvant) 예컨대, 프로인트(Freund's) 면역보강제를 표준 면역화 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 별법으로, 특정 폴리펩티드로부터 유래된 합성 항원성 펩티드를 캐리어 단백질에 컨쥬게이션시킨 후 면역원으로서 사용할 수 있다.

면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응은 시험 품종을 고려하고 당해 항원에 대한 반응성 역가를 결정함으로써 모니터링한다. 항원에 대한 항체의 적절히 높은 역가를 얻은 경우, 동물로부터 혈액을 채취하여 항혈청을 준비하였다. 그 후, 항원에 대한 특이적 반응성을 가진 항체를 풍부하게 하기 위한 항혈청의 분획화 및 항체의 정제를 수행할 수 있고(상기 문헌(Harlow and Lane) 참조), 단백질 정제에 대한 일반적 설명은 상술되어 있다.

모노클로날 항체는 당업자에게 익숙한 다양한 기법을 이용하여 얻는다. 전형적으로, 원하는 항원으로 면역화시킨 동물로부터 얻은 비장 세포는 통상 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화된다[문헌(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976)을 참조함]. 불멸화의 별법에는 예컨대, 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스, 종양유전자 또는 레트로바이러스를 사용한 형질전환, 또는 당 분야에 잘 공지되어 있는 다른 방법이 포함된다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 항원에 대한 원하는 특이성 및 친화성을 가진 항체의 생성에 대해 스크리닝하고, 이러한 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강주위강(peritoneal cavity) 내로의 주입을 비롯한 다양한 기법으로 증강시킬 수 있다.

추가로, 모노클로날 항체는 상기 문헌(Huse et al.)에 요약된 일반적 프로토콜에 따라 인간 B 세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 원하는 특이성을 가진 항체 또는 이러한 항체의 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열을 확인하는 경우에 재조합적으로 생성시킬 수도 있다. 상기 재조합 폴리펩티드의 생성에 대한 일반적 원리 및 방법은 재조합 방법에 의한 항체 생성에 적용할 수 있다.

B. 재조합 피브리노겐 γC 발현을 검출하기 위한 면역분석

본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 일단 이용할 수 있는 경우, 샘플 예컨대, 세포 용해물 중의 폴리펩티드의 양은 당업자에게 질적 및 양적 결과를 제공하는 다양한 면역분석 방법으로 측정할 수 있다. 일반적인 면역학적 및 면역분석 방법에 대한 검토를 위해서는 상기 문헌(Stites); 미국 특허 제4,366,241호; 제4,376,110호; 제4,517,288호; 및 제4,837,168호를 참조한다.

1. 면역분석에서의 표지화

면역분석은 항체와 표적 단백질에 의해 형성된 결합체에 특이적으로 결합하여 이를 표지화하기 위해 표지화제를 종종 사용한다. 표지화제는 그 자체가 항체/표적 단백질 결합체를 포함하는 잔기(moiety) 중 하나일 수 있거나, 항체/표적 단백질 결합체에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체와 같은 제3의 잔기일 수 있다. 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있다. 예에는 자기 비드(예컨대, Dynabeads^TM), 형광 안료(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사선표지(예컨대, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 효소(예를 들면, 호오스 라디쉬 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것들), 및 비색성 표지 예컨대, 콜로이드 골드 또는 착색된 유리 또는 플라스틱(예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 락테스 등) 비드가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

몇몇 경우, 표지화제는 검출가능한 표지를 보유하는 제2의 항체이다. 별법으로, 제2의 항체는 표지를 가지지 않을 수 있으나 그 대신 제2의 항체가 유래된 종의 항체에 특이적인 표지화된 제3의 항체에 결합될 수 있다. 제2의 항체는 제3의 표지화된 분자 예컨대, 효소-표지화 스트렙타비딘이 특이적으로 결합할 수 있는 검출가능한 잔기 예컨대, 바이오틴을 사용하여 변형시킬 수 있다.

면역글로불린 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질 예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G를 표지화제로서 사용할 수도 있다. 이들 단백질은 스트렙토코칼 박테리아의 세포벽의 정상적 구성성분이다. 이들은 다양한 종으로부터 유래된 면역글로불린 불변 영역과의 강한 비-면역원적 반응성을 나타낸다[예를 들면, 일반적으로 문헌(Kronval, et al. J. Immunol., 111: 1401-1406 (1973); and Akerstrom, et al., J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985))을 참조함].

2. 면역분석 포맷

샘플로부터 당해 표적 단백질(예를 들면, 피브리노겐 γC 폴리펩티드)을 검출하기 위한 면역분석은 경쟁적 또는 비경쟁적 면역분석일 수 있다. 비경쟁적 면역분석은 포획된 표적 단백질의 양이 직접 측정되는 분석이다. 예를 들면, 한 바람직한 "샌드위치" 분석에서, 표적 단백질에 대해 특이적인 항체는 항체가 고정화되는 고형 지지체에 직접 결합시킬 수 있다. 그 후, 이 항체는 시험 샘플 중의 표적 단백질을 포획한다. 따라서, 항체/표적 단백질 결합체는 상기 표지화제 예컨대, 표지를 보유하는 제2 또는 제3의 항체와 결합한다.

경쟁 분석에서, 샘플 중의 표적 단백질의 양은 샘플 중에 존재하는 표적 단백질에 의해 표적 단백질에 대해 특이적인 항체로부터 치환되어 나온 첨가된(외래) 표적 단백질의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정한다. 이러한 분석의 전형적인 예에서, 항체는 고정화되고 외래 표적 단백질은 표지화된다. 항체에 결합된 외래 표적 단백질의 양이 샘플에 존재하는 표적 단백질의 농도에 역비례하기 때문에, 샘플 중의 표적 단백질 수준은 항체에 결합되어 고정화된 외래 표적 단백질의 양에 기초하여 결정할 수 있다.

일부 경우에서, 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석을 이용하여 샘플 중의 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 존재를 검출하고 정량한다. 이 기법은 일반적으로 분자량에 기초한 겔 전기영동에 의한 샘플 단백질의 분리, 적절한 고형 지지체(예를 들면, 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터 또는 유도체화 나일론 필터)로의 분리된 단백질의 전달, 및 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 샘플의 인큐베이션을 포함한다. 이들 항체는 직접 표지화할 수 있거나, 피브리노겐 γC 폴리펩티드에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 표지화된 항체(예를 들면, 표지화된 양 항-마우스 항체)를 사용하여 추후에 검출할 수 있다.

다른 분석 포맷에는 특정 분자(예컨대, 항체)에 결합하여 캡슐화된 물질 또는 마커를 방출하도록 고안된 리포좀을 이용하는 리포좀 면역분석(LIA)이 포함된다. 그 다음으로, 방출된 화학물질은 표준 기법에 따라 검출한다[예컨대, 문헌(Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev., 5: 34-41 (1986))을 참조함].

III . 기능 분석

A. 시험관내 분석

조직 배양물 중의 피브리노겐 γC 폴리펩티드 0.1-20 ㎍/㎖에 0.5-48시간 동안 노출시킨 후, 직접적 세포 수 카운팅, BrdU 또는 H³-티미딘 삽입, 테트라졸리움 염 3,[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 세포 증식 분석, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일]-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움(MTS) 세포 증식 분석, 닭 배아 융모요막(CAM) 분석, TUNNEL 분석, 아넥신 V 결합 분석 등과 같은 방법을 이용하여 내피 세포 증식/생존 상태에 대해 내피 세포를 조사한다. 세포 증식에서의 통계학적으로 유의한 감소가 10% 이상, 보다 바람직하게는 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상인 것으로 발견되는 경우 억제 효과가 검출된다. 유사하게, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상의 프로그래밍된 세포 사멸에서의 임의의 통계학적으로 유의한 증가는 세포 사멸을 촉진하는 것에 대한 양성 효과로서 인식된다.

B. 생체내 분석

본 발명의 피브리노겐 γC 폴리펩티드의 억제 효과는 생체내 분석에서도 입증될 수 있다. 예를 들면, 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트로 형질감염되어 분비 형태의 폴리펩티드를 발현시키는 챠이니스 햄스터 난소(CHO) 세포를 손상된 면역 시스템을 가진 동물(예컨대, 누드 마우스, SCID 마우스 또는 NOD/SCID 마우스) 내로 주입할 수 있다. 종양 발달은 피브리노겐 코딩 서열이 없는 발현 카세트로 형질감염된 암세포만을 제공받은 동물 대조군과 비교하여 모니터링한다. 억제 효과는 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 음성 효과가 시험 군에서 확립된 경우에 검출된다. 바람직하게는 음성 효과는 10% 이상의 감소이고; 보다 바람직하게는, 감소는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이다.

IV . 약학 조성물 및 투여

본 발명은 예방 및 치료 용도에 있어서 내피 세포 증식을 억제하기 위한, 유효량의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드 또는 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 또한 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기에 적합하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 검토를 위해서는 문헌[Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)]을 참조한다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로 예를 들면, 경구, 피하, 경피, 근육내, 정맥내 또는 복강내로 투여할 수 있다. 약학 조성물을 투여하는 바람직한 경로는 70 kg의 성인의 경우 하루에 약 0.01 - 5000 mg, 바람직하게는 5-500 mg의 1일 투여량으로 피브리노겐 γC 폴리펩티드를, 내피 세포 증식(예컨대, 종양)에 의해 악화되는 병상을 앓고 있는 기관 또는 조직에 국소 전달하는 것이다. 적당한 투여량은 단회 1일 투여량으로서 또는 적절한 간격으로 예컨대, 하루에 2회, 3회, 4회 이상의 하위투여량으로 제공되는 분할 투여량으로서 투여할 수 있다.

피브리노겐 γC 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물의 제조를 위한 경우, 불활성 및 약학적으로 허용가능한 담체를 사용한다. 약학적 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태의 제제에는 예를 들면, 산제, 정제, 분산가능한 과립제, 캡슐제, 카세제 및 좌약제가 포함된다. 고형 담체는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁화제, 결합제 또는 정제 붕해제로서도 작용할 수 있는 1 이상의 물질일 수 있고; 이는 캡슐화 물질일 수도 있다.

산제에 있어서, 담체는 일반적으로 미분된 활성 성분 예컨대, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드와 혼합된 상태의 미분된 고체이다. 정제에 있어서, 활성 성분(피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드)은 적절한 비율로 필요한 결합 특성을 가진 담체와 혼합되어 원하는 형태 및 크기로 압축된다.

좌약제 형태의 약학 조성물을 제조하기 위해서는, 지방산 글리세라이드와 코코아 버터의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 먼저 용융시키고 활성 성분을 예컨대, 교반하여 내부에 분산시킨다. 이어서, 용융된 균질 혼합물을 통상의 크기의 주형에 붓고 냉각시키고 고체화시킨다.

산제 및 정제는 바람직하게는 약 5 중량% 내지 약 70 중량%의 활성 성분 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 함유한다. 적절한 담체에는 예를 들면, 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 탈크, 락토스, 당, 펙틴, 덱스트린, 전분, 트라가칸쓰, 메틸 셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이 포함된다.

약학 조성물은 (다른 담체와 함께 또는 다른 담체 없는) 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드가 담체에 의해 둘러싸여 담체가 화합물과 결합되어 있는 캡슐제를 제공하는 담체로서의 캡슐화 물질과 함께 활성 화합물 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 함유하는 제제를 포함할 수 있다. 유사한 방식으로, 카세제 또한 포함될 수 있다. 정제, 산제, 카세제 및 캡슐제는 경구 투여에 적합한 고체 투약 형태로서 사용할 수 있다.

액상 약학 조성물에는 예를 들면, 경구 또는 비경구 투여에 적합한 용액, 현탁액, 및 경구 투여에 적합한 에멀전이 포함된다. 활성 성분(예컨대, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드)의 멸균 수용액, 또는 물, 완충수, 생리수, PBS, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 용매 중의 활성 성분의 멸균 용액은 비경구 투여에 적합한 액상 조성물의 예이다. 조성물은 생리학적 조건에 접근하는 데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질 예컨대, pH 조절제, 완충제, 강직성 조절제, 습윤제, 세제 등을 함유할 수 있다.

멸균 용액은 활성 성분(예컨대, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드)을 원하는 용매 시스템에 용해시킨 후, 생성된 용액을 막 필터에 통과시켜 이를 여과하거나 멸균하거나, 또는 멸균 조건 하에 멸균 화합물을 미리 멸균시킨 용매에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 생성된 수용액은 그 자체로서 사용하기 위해 포장할 수 있거나, 동결건조할 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 혼합한다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 7 내지 8일 것이다.

피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물은 예방 및/또는 치료를 위해 투여할 수 있다. 치료적 용도에 있어서, 조성물은 내피 세포의 증식 예를 들면, 종양 성장을 지지하는 혈관신생에 의해 악화될 수 있는 병상을 이미 앓고 있는 환자에게 병상 및 이의 합병증을 예방하거나, 치유하거나, 회복시키거나, 또는 적어도 부분적으로는 지연시키거나 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양은 "치료 유효량"으로서 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 질환 또는 병상의 심각도, 환자의 체중 및 환자의 일반적 상태에 달려 있을 것이지만, 일반적으로는 70 kg의 환자의 경우 하루에 약 0.1 ㎎ 내지 약 2,000 ㎎의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드 범위 내에 있고, 70 kg의 환자의 경우 하루에 약 5 mg 내지 약 500 mg의 상기 폴리펩티드의 투여량이 보다 통상적으로 이용된다.

예방적 용도에 있어서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물은 내피 세포 증식이 바람직하지 않은 질환 또는 병상에 민감한 환자 또는 상기 질환 또는 병상을 발달시킬 위험에 있는 환자에게 증상의 발병을 지연시키거나 저해하기에 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "예방 유효량"으로서 정의된다. 이 용도에 있어서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 정확한 양은 다시 환자의 건강 상태 및 체중에 달려 있지만, 일반적으로는 70 kg의 환자의 경우 하루에 약 0.1 mg 내지 약 2,000 mg의 상기 폴리펩티드이고, 보다 통상적으로는 70 kg의 환자의 경우 하루에 약 5 mg 내지 약 500 mg의 양이다.

상기 조성물의 단회 투여 또는 다회 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 투여량 수준 및 패턴에 따라 행할 수 있다. 어떠한 경우이든, 약학 제제는 치료적 또는 예방적으로 환자에서 내피 세포 증식을 효과적으로 억제하기에 충분한 양의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 제공해야 한다.

V. 핵산을 사용한 치료적 적용

코딩 서열이 전사되어 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드가 세포 내에서 생성되도록 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 상기 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는 치료적 방법으로 다양한 질환을 치료할 수 있다. 이 방법에 의해 치료될 수 있는 질환에는 광범위한 범위의 고형 종양, 연속된 혈액 공급에 의존하여 신혈관의 형성을 필요로 하는 생존 및 성장이 포함된다. 유전적 질환 및 후천적 질환의 치료에 대한 유전자 요법의 적용에 대한 논의는 문헌[Miller Nature 357: 455-460 (1992); and Mulligan Science 260: 926-932 (1993)]을 참조한다.

A. 유전자 전달을 위한 벡터

세포 또는 유기체에 전달하기 위해, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 내에 삽입시킬 수 있다. 이러한 목적에 사용되는 벡터의 예에는 표적 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 플라스미드가 포함된다. 다른 경우, 벡터는 바이러스 벡터 시스템인데, 여기서 폴리뉴클레오티드는 표적 세포를 형질감염시킬 수 있는 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 바람직한 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원하는 표적 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 발현 및 조절 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 따라서, 당업자는 표적 세포에서 적절한 조건 하에 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

B. 유전자 전달 시스템

피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 발현에 유용한 바이러스 벡터 시스템에는 예를 들어, 천연 발생 또는 재조합 바이러스 벡터 시스템이 포함된다. 구체적 용도에 따라, 적합한 바이러스 벡터에는 복제 능력을 가진 바이러스 벡터, 복제 능력이 결핍된 바이러스 벡터, 및 조건에 따라 복제하는 바이러스 벡터가 포함된다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 인간 또는 소 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 마우스의 마이뉴트(minute) 바이러스(MVM), HIV, 신드비스 바이러스 및 레트로바이러스(라우스 육종 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 MoMLV의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 당해 유전자(예를 들면, 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 유전자)를 이러한 벡터 내에 삽입하여 전형적으로 동반된 바이러스 DNA와 함께 유전자 컨스트럭트가 팩키징되게 한 후, 민감성 숙주 세포에 감염시키고 당해 유전자를 발현시킨다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유전자 전달 시스템"은 본 발명의 핵산을 표적 세포로 전달하기 위한 임의의 수단을 말한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 핵산은 적절한 결합 잔기 예컨대, DNA 결합 잔기를 통해, 촉진된 섭취(예를 들면, 코팅된 피트(pit)의 함입 및 엔도좀(endosome)의 내부화)를 위한 세포 수용체 리간드에 컨쥬게이션시킨다(Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988); WO 92/06180). 예를 들면, 핵산은 간세포의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein)에 대한 리간드인 아시알로-오로뮤코시드에 폴리라이신 잔기를 통해 결합시킬 수 있다.

유사하게, 본 발명의 핵산을 포함하는 유전자 컨스트럭트를 팩키징하는 데 사용되는 바이러스 외피(envelope)는 수용체에 대해 특이적인 수용체 리간드 또는 항체를 부가하여 변형시킴으로써 특정 세포 내로의 수용체-매개 세포내이입(endocytosis)을 허용할 수 있다(예를 들면, WO 93/20221, WO 93/14188, 및 WO 94/06923 참조). 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 DNA 컨스트럭트는 바이러스 단백질 예를 들면, 아데노바이러스 입자에 결합시켜 세포내이입을 촉진시킨다(Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 8850-8854 (1991)). 다른 실시양태에서, 본 발명의 분자적 컨쥬게이트에는 마이크로튜불 억제제(WO/9406922), 합성 펩티드 모사 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Plank et al., J. Biol. Chem. 269: 12918-12924 (1994)), 및 SV40 T 항원과 같은 핵 위치화 신호(W093/19768)가 포함된다.

레트로바이러스 벡터는 본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드의 코딩 서열을 표적 세포 또는 유기체로 도입시키는 데 유용할 수도 있다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스를 유전적으로 개조하여 제조한다. 레트로바이러스의 바이러스 게놈은 RNA이다. 감염 시, 이 게놈 RNA는 DNA 카피로 역전사되고, 이 DNA 카피는 고도의 안정성 및 효율로 형질도입된 세포의 염색체 DNA 내로 삽입된다. 삽입된 DNA 카피는 프로바이러스로서 지칭되고, 임의의 다른 유전자와 마찬가지로 딸 세포에 의해 유전된다. 야생형 레트로바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는 3종의 유전자 즉, gag, pol 및 env 유전자를 가진다. gag 유전자는 내부 구조(뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩하고; pol 유전자는 RNA 지시 DNA 폴리머라제(역전사효소)를 코딩하고; env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 데 기여한다. 5' LTR에 인접하여 게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 입자 내로의 바이러스 RNA의 효율적인 캡슐화에 필요한 서열(Psi 부위)이 있다[문헌(Mulligan, In: Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983); Cone and Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81: 6349-6353 (1984)) 참조].

레트로바이러스 벡터의 디자인은 통상의 기술을 가진 당업자에게 잘 공지되어 있다. 캡시드화(encapsidation)(또는 감염성 비리온 내로의 레트로바이러스 RNA의 팩키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 제거되는 경우, 그 결과는 게놈 RNA의 캡시드화를 방해하는 시스 작용 결함이다. 그러나, 생성된 돌연변이체는 여전히 모든 비리온 단백질을 합성시킬 수 있다. 이들 서열이 결실되어 있는 레트로바이러스 게놈뿐만 아니라, 염색체 내로 안정하게 삽입된 돌연변이체 게놈을 함유하는 세포주 또한 당 분야에 잘 공지되어 있고 레트로바이러스 벡터의 작제에 사용된다. 레트로바이러스 벡터의 제조 및 이의 용도는 예를 들면, 유럽 특허 출원 EPA 0 178 220; 미국 특허 제4,405,712호, 문헌(Gilboa Biotechniques 4: 504-512 (1986)); 문헌(Mann et al., Cell 33: 153-159 (1983)); 문헌(Cone and Mulligan Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349-6353 (1984)); 문헌(Eglitis et al. Biotechniques 6: 608-614 (1988)); 문헌(Miller et al. Biotechniques 7: 981-990 (1989)); 상기 문헌(Miller (1992)); 상기 문헌(Mulligan (1993)); 및 WO 92/07943를 비롯한 많은 공개문헌에 기재되어 있다.

레트로바이러스 벡터 입자는 원하는 뉴클레오티드 서열을 레트로바이러스 벡터 내로 재조합 삽입하고 팩키징 세포주를 사용하여 벡터를 레트로바이러스 캡시드 단백질로 팩키징함으로써 제조한다. 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 숙주 세포에서 복제할 수 없지만, 원하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 프로바이러스 서열로서 숙주 세포 게놈 내로 삽입될 수 있다. 그 결과, 환자는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티들 생성시켜 세포를 정상 표현형으로 회복시킬 수 있다.

레트로바이러스 벡터 입자를 제조하는 데 사용되는 팩키징 세포주는 전형적으로 팩키징에 필요한 필수 바이러스 구조 단백질을 생성시키지만 감염성 비리온을 생성시킬 수 없는 재조합 포유동물 조직 배양 세포주이다. 다른 한편으로, 사용되는 결핍성 레트로바이러스 벡터는 상기 구조 유전자를 결핍하고 있지만 팩키징에 필수적인 나머지 단백질들을 코딩한다. 팩키징 세포주를 제조하기 위해, 당업자는 팩키징 부위가 결실되어 있는 원하는 레트로바이러스의 감염성 클론을 작제할 수 있다. 이 컨스트럭트를 포함하는 세포는 모든 구조 바이러스 단백질을 발현시킬 것이지만, 도입된 DNA는 팩키징될 수 없다. 별법으로, 팩키징 세포주는 적절한 코어 및 외피 단백질을 코딩하는 1 이상의 발현 플라스미드로 세포주를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 이들 세포에서, gag, pol 및 env 유전자는 동일한 레트로바이러스 또는 상이한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 적합한 다수의 팩키징 세포주 또한 선행기술에서 이용가능하다. 이들 세포주의 예에는 Crip, GPE86, PA317 및 PG13이 포함된다[문헌(Miller et al., J. Viral. 65: 2220-2224 (1991)) 참조]. 다른 팩키징 세포주의 예는 문헌[Cone and Mulligan Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81: 6349-6353 (1984)]; 문헌[Danos and Mulligan Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85: 6460-6464 (1988)]; 상기 문헌(Eglitis et al. (1988)); 및 상기 문헌(Miller (1990))에 기재되어 있다.

키메라 외피 단백질을 가진 레트로바이러스 벡터 입자를 생성시킬 수 있는 팩키징 세포주를 사용할 수 있다. 별법으로, PA317 및 GPX 팩키징 세포주에 의해 생성되는 것과 같은 양생성(amphotropic) 또는 친이종성(xenotropic) 외피 단백질을 사용하여 레트로바이러스 벡터를 팩키징할 수 있다.

C. 약학 제제

약학적 목적을 위해 사용되는 경우, 피브리노겐 γC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 일반적으로 적절한 완충제 중에서 제제화하고, 이 완충제는 약학적으로 허용가능한 완충제 예컨대, 인산염 완충 생리수 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 멸균수, 및 당업자에게 공지된 다른 완충제 예컨대, 문헌(Good et al. Biochemistry 5: 467 (1966))에 기재된 완충제일 수 있다.

조성물은 안정화제, 증강제, 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들면, 본 발명의 핵산 및 임의의 관련 벡터를 안정화시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 예를 들어, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타치온과 같은 항산화제, 킬레이팅제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제가 포함될 수 있다. 다른 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 미생물의 성장 또는 작용을 방해하는 데 특히 유용한 습윤제, 유화제, 분산제 또는 방부제가 포함된다. 다양한 방부제가 잘 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 담체, 안정화제 또는 보조제의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 찾을 수 있다.

D. 제제의 투여

본 발명의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 제제는 통상의 기술을 가진 당업자에게 공지된 임의의 전달 방법을 이용하여 임의의 조직 또는 기관으로 전달할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 점막, 국소 및/또는 협측 제제, 특히 점막점착성 겔 및 외용 겔 제제 형태로 제제화된다. 경피 전달을 위한 예시적 투과 증강 조성물, 중합체 매트릭스 및 점막점착성 겔 제제는 미국 특허 제5,346,701호에 개시되어 있다.

본 발명의 핵산을 함유하는 제제를 세포에게 전형적으로 투여한다. 상기 세포는 조직의 일부로서, 예컨대 상피막의 일부로서, 또는 단리된 세포로서 예컨대, 조직 배양물 중의 단리된 세포로서 제공될 수 있다. 상기 세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 제공될 수 있다.

제제는 다양한 방법으로 생체내 또는 생체외에서 당해 조직 내로 도입할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 미세주입, 인산칼슘 침전, 리포좀 융합, 초음파, 전기영동 또는 유전자총(biolistics)과 같은 방법으로 세포 내로 도입한다. 추가 실시양태에서, 핵산은 당해 조직에 의해 직접 섭취된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 환자로부터 외식된 세포 또는 조직으로 생체외 투여한 후 환자에게 돌려보낸다. 치료적 유전자 컨스트럭트의 생체외 투여의 예에는 문헌[Nolta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (6): 2414-9 (1996); Koc et al., Seminars in Oncology 23(1): 46-65 (1996); Raper et al., Annals of Surgery 223(2): 116-26 (1996); Dalesandro et al., J. Thorac. Cardi. Surg., 11(2): 416-22 (1996); and Makarov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1): 402-6 (1996)]이 포함된다.

제제의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 및 투여되는 다른 의약을 비롯한 매우 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 따라서, 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있을 것이다. 투여되는 벡터의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 사용된 구체적 핵산, 진단받은 질환 상태; 환자의 연령, 체중 및 전체적 상태, 순환하는 혈장 수준, 벡터 독성, 질환의 진행, 및 항-벡터 항체의 생성을 평가해야 한다. 또한, 투여량 정도는 특정 벡터의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 본 발명을 실시하기 위해, 환자 당 약 10 ng - 1 g, 100 ng - 100 mg, 1 ㎍ - 10 mg, 또는 30 - 300 ㎍ DNA 범위 내의 투여량이 전형적이다. 투여량은 일반적으로 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 50 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg 또는 1회 주사 당 약 10⁸ - 10¹⁰ 또는 10¹² 입자의 범위 내이다. 일반적으로, 벡터로부터 노출된 핵산의 투약 등가량은 전형적인 70 kg의 환자의 경우 약 1 ㎍ - 100 ㎍이고, 레트로바이러스 입자를 포함하는 벡터의 투여량은 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드를 코딩하는 등가량의 핵산을 생성시키도록 계산한다.

VI . 키트

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 내피 세포 증식을 억제하기 위한 키트 또한 제공한다. 상기 키트는 전형적으로 유효량의 피브리노겐 γC-관련 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진 약학 조성물뿐만 아니라, 치료될 수 있는 환자의 유형(예를 들면, 진행된 종양 덩어리를 발전시킬 위험에 있는 사람), 스케쥴(예컨대, 투여량 및 투약 빈도) 및 투여 경로에 대한 설명 등을 비롯하여 약학 조성물을 분배시키는 방법에 대한 설명서를 포함하는 정보 자료를 포함하는 용기를 포함한다.

하기 실시예는 단지 예시로서 제공된 것이지 본 발명을 한정하기 위해 제공된 것이 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 이끌어내도록 변화시키거나 변형시킬 수 있는 다양한 비-임계적 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.

실시예 1 피브리노겐 γC는 내피 세포의 아폽토시스를 유도한다.

피브리노겐 γC-쇄 C-말단 도메인(서열번호 3에 기재된 γC로 지칭된 서열, 30 Kd, 약 250개 아미노산 잔기)은 인테그린 αvβ3에 대한 주 결합 부위를 보유한다. 인테그린과의 결합 시 증식 신호를 생성시키는 천연 피브리노겐과 반대로, γC는 배양된 소 동맥 내피(BAE) 세포의 증식을 효과적으로 차단하였다. BAE 세포의 γC 유도 아폽토시스는 아넥신 V 결합 분석에서 입증되었다.

γC가 대규모의 MAP 키나제 활성화를 유도하기 때문에, γC는 (다른 인테그린 리간드와 세포의 결합을 차단하기보다는) 아폽토시스를 이끌어 내는 세포내 신호를 활발히 도입시킬 가능성이 높다. 이 관찰결과는 새로운 것이고 피브리노겐으로부터의 신호를 이해하는 데 중요하고, 특히 새로운 신규 항-혈관신생 방법을 개발하는 데 유용하다.

γC는 내피 세포 증식을 억제한다.

단리된 γC 도메인(이는 단편 D의 일부임)은 1 ㎍/㎖ 미만의 농도로 BAE 세포의 증식을 차단하였다(도 1). 천연 피브리노겐 또는 단편 D는 이용된 조건 하에서 BAE 세포의 증식에 영향을 주지 않았다.

상기 γC 도메인은 MTS 분석에서 BAE 세포의 증식 또한 차단하였다(도 2). 이 증식 억제는 BAE 세포에서는 관찰되었지만, CHO 또는 β3-CHO 세포에서는 관찰되지 않았는데, 이는 γC의 항-증식 효과가 내피 세포에 특이적임을 의미한다.

γC는 BAE 세포 아폽토시스를 유도한다.

γC 도메인은 아넥신 V 결합 분석에 의해 검출된 바와 같이 2-4시간 내에 BAE 세포의 아폽토시스를 유도하였다(도 3). 반대로, 천연 피브리노겐은 이와 동일한 효과를 나타내지 못하였다.

γC는 MAP 키나제 활성화를 유도한다.

가용성 γC는 극도로 낮은 농도(배지 중의 1 ㎍/㎖ 미만)에서 MAP 키나제 활성화를 강하게 유도하였음이 밝혀졌다. 이는 γC-유도 아폽토시스가 세포-세포외 상호작용의 차단 때문이라기 보다는 γC-유도 세포내 신호의 직접적 효과 때문일 수 있다는 것을 암시한다(도 4). γC가 길항제로서 작용하고 인테그린과의 결합에 대해 경쟁함으로써 다른 인테그린 리간드로부터의 신호전달을 차단할 가능성이 남아 있다.

γC는 CPAE 세포에서 아폽토시스를 유도하고 캐스파제(Caspase)의 활성화를 유도한다.

피브리노겐 γC는 소 폐 동맥 내피(CPAE) 세포에서 아폽토시스를 유도하였다. 증가된 단백질 발현 수준 및 증가된 효소 활성 수준 둘 다에서의, γC에 의한 캐스파제-3 및 캐스파제-7의 활성화는 γC-유도 내피 세포 아폽토시스가 캐스파제에 의해 매개된다는 것을 암시한다.

실시예 2 피브리노겐 γC는 동물에서 종양 성장을 억제한다.

문헌[Yonou et al. (Cancer Res., 2001, 61 (5): 2177-2182)]에 기재된 바와 같은 인간 이종이식 마우스는 생체내에서 피브리노겐 γC의 종양 억제 활성을 입증하기 위한 동물 모델로서 사용하였다. 인간 유방 선암종 BT20 세포를 7-9-주 연령의 수컷 비-비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍증(NOD/SCID) 마우스 내로 피하 주사하였다. 동물을 각각 5마리 동물로 구성된 4개 군으로 나누었다. 각 동물은 주사로 2 × 10⁶ 세포를 투여받았다. 처리 군인 군 1-3은 재조합 γC로 매일 복강내 주사하였다. 대조군인 군 4는 동일한 부피의 PBS를 매일 주사받았다. 종양의 치수를 측정하고 종양 부피를 계산하였다. 2주의 치료 후, 동물을 희생시키고 종양을 절개하고, 절단한 다음 조직학적으로 평가하였다. 종양 혈관계를 검사하기 위해, 종양 절편을 CD31 항-마우스 모노클로날 항체(PharMingen, San Diego, CA)로 염색하였다. 종양 크기 및 종양 혈관계의 정도는 모든 처리 군과 대조군 사이에서 비교하였다.

실시예 3 분비된 γC를 발현하는 암 세포의 종양유발성

차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포는 피브리노겐 γC의 발현 및 분비를 지시하는 분비 벡터 pSEC태그로 먼저 형질감염시켰다. 대조군 세포 또한 γC에 대한 코딩 서열 없이 빈 pSEC태그 벡터로 CHO 세포를 형질감염시켜 확립하였다. 형질감염된 암 세포를 확립하였을 때, 세포를 실시예 2에 기재된 NOD/SID 마우스 내로 도입시켰다. 종양 부피는 실험군 및 대조군 둘 다의 동물에서 종양의 3 치수를 측정함으로써 주마다 2회 내지 3회 모니터링하였다. 실험을 시작한 지 2주일 후, 모든 동물을 희생시키고 종양을 절개하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 종양의 부피 및 혈관계에 대해 검사하였다.

실시예 4 γC-399 tr 에 의한 내피 세포증식의 억제

(서열번호 3의 아미노산 1-249를 가지는) γC-399tr로 불리는 γC의 C-말단으로부터 12개의 아미노산이 절단된 γC의 결실 돌연변이체를 재조합적으로 생성하고 정제하였다. CPAE 증식에 대한 이 돌연변이체의 효과는 야생형 γC와 함께 시험하였다(도 5). γC-399tr은 CPAE 세포에서 아폽토시스를 유도하기에 놀라울 정도로 효과적인 즉, 야생형 γC의 효능의 약 3배 정도인 것으로 밝혀졌다.

γC-399tr에 의해 유도된 내피 세포 아폽토시스가 p38 MAP 키나제 억제제 SB-203580에 의해서는 차단될 수 있으나 일부 다른 MAP 키나제 억제제에 의해서는 차단될 수 없다는 것이 추가로 관찰되었다. 도 6은 MAPK 억제제의 일부 예 및 γC- 399tr-유도 아폽토시스를 차단하는 데 있어서의 이들의 능력을 보여준다.

실시예 5 γC-399 tr 은 동물에서 종양 성장을 억제한다.

실시예 2에 기재된 일반적 방법 후, DLD-1 인간 결장 선암종 세포를 SCID 마우스에 주사하였다. 그 후, 처리 군 마우스에게 PBS 중의 재조합 γC-399tr을 주사한 반면, 대조군에게 PBS를 주사하였다. 실험 전체를 통해, 종양 크기는 처리 군과 대조 군을 비교하였다. γC-399tr 처리는 일관적으로 종양 크기를 감소시켰다.

본원에서 인용된 진뱅크 등록 번호를 비롯한, 모든 특허, 특허 출원 및 다른 공개문헌은 모든 목적을 위해 언급에 의해 그 전체가 참고로 포함되는 것이다.

Claims

폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 4인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 6인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1-249인 것인 조성물.
핵산 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서, 상기 핵산은 (a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열 을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
제7항에 있어서, 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제하는 것인 조성물.
제7항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3인 것인 조성물.
제7항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 4인 것인 조성물.
제7항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 6인 것인 조성물.
제7항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1-249인 것인 조성물.
제7항에 있어서, 핵산은 발현 카세트인 것인 조성물.
내피 세포와 유효량의 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 내피 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식 을 억제하는 것인 방법.
유효량의 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 내피 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제하는 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3인 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 4인 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 6인 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1-249인 것인 방법.
제15항에 있어서, 투여는 국소적으로 수행하는 것인 방법.
제1항의 조성물을 포함하는, 내피 세포 증식을 억제하기 위한 키트.
(a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유효량의 핵산과 내피 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 내피 세포 증식을 억제하는 방법.
(a) 서열번호 3, 4 또는 6의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 내피 세포 증식을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유효량의 핵산을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제하는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시험관내 분석에서 내피 세포 증식을 억제하는 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3인 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 4인 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 6인 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1-249인 것인 방법.
제24항에 있어서, 투여는 국소적으로 수행하는 것인 방법.
제7항의 조성물을 포함하는, 내피 세포 증식을 억제하기 위한 키트.