KR20150002896A - 결정형 항-ｈＴＮＦ알파 항체 - Google Patents

결정형 항-ｈＴＮＦ알파 항체 Download PDF

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데이빗 더블유. 보하니
볼프강 프라운호퍼
한스-위르겐 크라우제
아네테 쾨니히스도르퍼
게르하르트 빈터
슈테판 고트샬크
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애브비 바이오테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은 산업적 규모의 항-hTNF알파 항체 생산을 가능하게 하는 항-hTNF알파 항체 결정화를 위한 배치 결정화 방법; 상기 방법에 따라 수득되는 항체 결정; 상기 결정을 함유하는 조성물 및 상기 결정 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

결정형 항-ｈＴＮＦ알파 항체{Crystalline anti-hTNFalpha antibodies}
본 발명은 산업적 규모의 항-hTNF알파 항체 생산을 가능하게 하는 항-hTNF알파 항체 결정화를 위한 배치(batch) 결정화 방법; 상기 방법에 따라 수득되는 항체 결정; 상기 결정을 함유하는 조성물 및 상기 결정 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
a) 항체 결정
현재 임상 연구 단계 2 또는 3에서 평가되고 있는 모노클로날 항체는 100가지가 넘는 바, mAb 시장은 가장 촉망받는 생물약제 시장의 하나로 생각될 수 있다. 이러한 약물은 종종 100mg을 초과하는 단일 용량으로 전달되어야 하기 때문에 안정성, 안전성 및 환자 순응도를 만족시키는 적당한 제형 전략을 찾아내는 것이 시급하다.
하지만, 고농축 액체 mAb 제형은 점도 증가를 나타내어, 친환자적인 가느다란 주사바늘을 통한 주사능을 방해한다. 또한, 그러한 고농도에서 mAb 분자의 응집 경향은 중간 농도의 용액에 비해 지수적으로 증가한다. 이것은 안전성 및 안정성 요구와 관련하여 모든 면에서 허용될 수 없다.
즉, 고용량 mAb의 전달은 일반적으로 주입액으로서 전달되어야 하는 대용량에는 제한적이다. 이러한 용량투여 방식은 비용이 많이 들고 환자의 순응도를 크게 저하시킨다.
따라서, 피하 주사를 위해 약제학적으로 적용가능한 소량의 mAb 결정 현탁액이 절실히 희망될 것이다. 이론적으로, mAb 완전성에 영향을 미치는 분해 경로는, 단백질 구조의 움직임이 방해되는 결정 격자의 강성으로 인해 크게 감속되어야 한다. 또한, 고농축 결정 현탁액을 액체 제형과 비교했을 때, 점도 증가가 크게 감소할 것으로 예상할 수 있다. 지연 방출과 관련하여, 환자의 체내로 투여되었을 때 천천히 용해되도록 단백질 결정을 제조하거나 변경시키는 것이 가능할 것이다. 이는 mAb 구조에 유해한 부형제 및 공정의 광범한 사용이 방지될 수 있기 때문에 지연 방출형 제형을 전달하는 매우 훌륭한 방법일 것이다.
단백질 결정을 약물 물질로 사용하는데 있어서의 매우 큰 가능성에도 불구하고, 이 전략을 체계적으로 평가하기 위한 시도는 거의 이루어지지 않았다.
익히 공지된 예외는 수십년전에 성공적으로 결정화된 인슐린이다. 오늘날, 인슐린 결정 현탁액의 사용에 대해서는 충분히 설명되어 있어, 안정한 지속성 제형이 판매되고 있다. 인슐린 결정의 발생과 다른 모든 단백질의 결정화 사이에 차이는 규칙적인 인슐린 응집물이 자연적으로 췌장에서 형성된다는 사실과 관련이 있을 것이다. 즉, 인슐린 결정은 인슐린이 과량의 아연 이온과 접촉되면 쉽게 수득된다. 대부분의 다른 단백질은 결정보다는 비규칙적인 침전물을 형성하는 경향이 있고, 이에 따라 단백질의 결정화 조건을 찾는 것은 시간 소모적이며 자명하지 않은 과제이다.
x선 회절 분석을 위한 단백질 결정의 수득은 큰 관심에도 불구하고 적당한 결정 조건을 찾기 위한 탐색은 모든 단백질이 대체로 다르게 행동하기 때문에 여전히 경험과학이다. 지금까지, 당해의 단백질에 대한 성공적인 결정화 조건을 합리적으로 확실하게 예측할 수 있는 일반적 규칙이 발견된 적은 없다. 따라서, 당해 단백질의 결정을 수득하는 것은 어떠한 의도된 적용이 이후에 계획되더라도 "병목"으로서 간주된다.
특히 더 도전적이게 만드는 것은, 항체가 분자의 유연성으로 인해 결정화하기가 특히 힘들다고 하는 것이다.
그럼에도 불구하고, 면역글로불린 결정의 예는 오랫동안 알려져 왔다. 면역글로불린 결정의 제1 예는 영국 의사인 헨리 벤스 존스(Henry Bence Jones)에 의해서 150년 전에 개시되었으며, 이 사람은 골수종 환자의 소변에서 비정상적인 Ig 경쇄 이량체의 결정을 분리했다(Jones 1848). 이러한 비정상적인 Ig은 그 이후 벤스 존스 단백질로 알려졌다. 1938년에는 골수종 환자의 혈청 유래의 독특한 비정상적 Ig의 자발적인 결정화가 설명되었고(von Bonsdorf, Groth et al. 1938), 이는 분명히 Ig 중쇄 올리고머(MW 200kDa)였다.
정상 구조의 결정형 사람 면역글로불린(2개의 경쇄에 결합된 2개의 중쇄)은 이후 30년이 지나서 기술되었는데, 이 역시 대부분 골수종 환자로부터 분리된 것이었다(Putnam, 1955). 데이비스(Davies)와 동료들은 "Dob"으로 불리는 순수한 사람 골수종 항체의 구조를 x선 결정학을 사용하여 특성규명한 최초의 연구자들이었고(Terry, Matthews, et al. 1971), 1971년에 그 항체의 3차원 구조를 결정했다(Sarma, Silverton et al. 1971). 이들의 혁신적인 연구 이후, 다른 연구들이 후속되어, IgG "Kol"의 결정 구조(Huber, Deisenhofer et al. 1976), IgG "Mcg"의 결정 구조(Rajan, Ely et al. 1983) 및 개의 림프종 IgG2a의 결정 구조(Harris, Larson et al. 1992)가 수득되었다.
면역글로불린의 결정은 재용해시 특유의 면역학적 활성을 유지한다. 니소노프 등(Nisonoff et al.)은 1968년에 토끼 항-p-아조벤조에이트 항체, "X4"에 대해 보고했고, 이는 쉽게 결정화되었다. 항체 X4는 결정화 전에는 물론 결정의 재용해 후에도 집중적으로 특성규명되었다. [125I]-p-요오도벤조에이트는 재용해된 X4에 특이적이며 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌고; 재용해된 결정도 역시 미정제된 토끼 혈청의 전형적인 면역확산 반응인 다수의 특이적인 어크터로니(Ouchterlony) 면역확산 반응을 나타냈다(Nisonoff, Zappacosta et al. 1968). 코넬(Connell)과 동료들은 "Tem"으로 불리는 사람 골수종 감마-면역글로불린-1 카파(IgG-κ)에 대해 기술했으며, 이것은 저온에서 혈청으로부터 자발적으로 결정화되었다(Connell, Freedman et al. 1973). Tem 결정은 모양이 좋고 사방면체 대칭을 보유한 것으로 밝혀졌다. Tem 함유 혈청은 아가로스 면역확산 기술에 의해 광범위하게 특성규명되었다. Tem 결정의 재용해 용액의 전기영동 및 면역확산은 냉침전법에 의해 혈청으로부터 분리된 물질 및 분리된 골수종 단백질과 동일한 것으로 밝혀졌다(Connell, Freedman et al. 1973).
밀즈(Mills)와 동료들은 알부민에 대한 사람 모노클로날 항체로부터 초래되는 이상 결정성한랭글로불린혈증을 보고했다(Mills, Brettman et al. 1983). 여기서, 매우 유사한 입방 결정이 두 환자로부터 분리되었다. 결정의 재용해에 이어 전기영동 및 면역전기영동은 결정이 2가지 단백질 성분인 모노클로날 IgG-람다와 사람 혈청 알부민의 1:2의 비율로 구성되어 있음을 시사했다(Jentoft, Searborn et al. 1982). 이 성분들은 최초의 결정을 용해한 후 컬럼 크로마토그래피하여 제조 규모로 분리했다. 분리된 성분은 자발적으로 결정화되지는 않았지만, 재조합시 최초의 이분성 복합체가 재형성되었고, 그 다음 결정화되었다. 재용해되고 분리된 IgG 및 이의 Fab 단편과 사람 혈청 알부민과의 특이한 침강 특성 및 면역학적 활성에 대한 추가 연구에서, 분리된 IgG 및 이의 Fab 단편과 사람 혈청 알부민은 2개의 재용해 및 분리된 성분의 재결합이 사실상 면역학성이이며, 즉 한번 재용해된 결정성 항체가 자신의 최초 고 특이성(사람 혈청 알부민에 대한) 결합 특징을 여전히 보유한다는 것을 시사했다(Mills, Brettman et al. 1983).
최근, 마골린(Margolin)과 동료들은 결정형 항체의 잠재적인 치료 용도에 대해 보고했다(Yang, Shenoy et al. 2003). 이들은 치료학적 모노클로날 항체 트라스투주마브(trastuzumab)(Herceptin®)가 결정화될 수 있음을 발견했다(Shenoy, Govardhan et al. 2002). 결정형 트라스투주마브 현탁액은 마우스 종양 모델에서 치료학적으로 효능이 있어서, 결정형 트라스투주마브의 생물학적 활성 유지를 입증했다(Yang, Shenoy et al. 2003).
b) 결정화 기술
일부 다른 과학적 또는 공학적 노력과는 다르게, 다양한 단백질의 결정화는 한정된 방법 또는 알고리듬에 의해 성공적으로 수행될 수 없다. 확실히, 단백질 결정화의 세계적으로 유명한 전문가인 에이. 맥퍼슨(A. McPherson)이 특별히 언급한 바와 같이, 지난 20 내지 30년 사이에 상당한 기술적 진보가 이루어졌다. 맥퍼슨은 거대분자의 결정화를 위한 수단, 전략, 시약 및 장치에 대한 광범위한 세부사항을 제공한다. 하지만, 그는 모든 주어진 거대분자가 실제로 성공을 합리적으로 예상하는 당업자에 의해 결정화될 수 있음을 보증하는 방법을 제공하지는 못했다. 맥퍼슨은 예를 들어, "절차가 어떠한 것이든지, 분자 사이의 특이적 결합 상호작용을 도모하고 촉진하며, 일단 형성되면 안정시키기 위해 시스템의 파라미터인 용매와 용질을 개선 및 최적화하는데 있어서 노력을 할애하지 않아야 한다. 그 문제에 대한 후자의 관점은 일반적으로 결정화되는 특정 단백질 또는 핵산의 특이적인 이화학적 성질에 따라 달라진다"(McPherson 1999, p. 159)라고 말한다.
단백질 결정화 기술 분야의 당업자에게 널리 인식되어 있듯이, 당해의 신규 단백질을 취하고 분명한 공정 단계를 적용하여 원하는 결정을 수득하기 위한 알고리듬은 존재하지 않는다.
시판되고 있는 여러 스크리닝 시스템(예컨대, Hampton 1 및 2, Wizzard I 및II)은 마이크로리터 규모에서 특정 단백질의 잠재적으로 적당한 결정화 조건을 스크린할 수 있게 해준다. 하지만, 이러한 스크리닝 시스템에서 수득된 양성 결과는 더 크고 산업적으로 적용가능한 배치 스케일에서도 반드시 성공적인 결정화를 가능하게 하지는 않는다. 마이크로리터 크기 결정화 시도의 산업적 규모로의 전환은 도전적 과제라고 기술하고 있다(Jen et al., 2001 참조).
발독(Baldock) 등(1996)은 결정화 조건의 1차적 스크리닝을 위한 마이크로배치 및 증기 확산법의 비교에 대해 보고했다. 6가지 시판 단백질을 결정화 용액 세트를 이용해서 스크리닝했다. 스크리닝은 신규의 증발 기술을 비롯하여 가장 일반적인 증기 확산법과 3가지 변법인 마이크로배치 결정화법을 이용해서 수행했다. 확인된 58가지 결정화 조건 중에서, 43가지(74%)는 마이크로배치법으로 확인되었고 41가지(71%)는 증기 확산법에 의해 확인되었다. 26가지 조건은 두 방법 모두에 의해 발견되었고 17가지(29%)는 마이크로배치가 전혀 사용되지 않았다면 간과되었을 것이다. 이것은 초기 결정화 스크리닝에 가장 일반적으로 사용되는 증기 확산 기술이 양성 결과를 보장하지 못한다는 것을 시사한다.
c) hTNF알파 항체 결정
사람 TNF알파(hTNF알파)는 수많은 질병의 원인 인자로 생각되고 있다. 따라서, 이러한 hTNF알파 관련 장애를 치료하는 적절한 방법은 절실히 필요로 되고 있다. 한가지 촉망받는 치료학적 시도는 항-사람 TNF알파 항체의 약제학적 유효량을 투여함을 포함한다. 최근 이러한 하나의 항체인, D2E7 또는 일반적으로 아달리무맙은 시판되고 있고, 상표명 HUMIRA®로 상용화되어 있다.
WO-A-02/072636은 전체 완전 항체 리툭시마브(Rituximab), 인플릭시마브(Infliximab) 및 트라스투주마브(Trastuzumab)의 결정화를 개시했다. 결정화 실험의 대부분은 독성이 불분명한 화학물질, 예컨대 이미다졸, 2-사이클로헥실-에탄설포네이트(CHES), 메틸펜탄디올, 황산구리 및 2-모르폴리노-에탄설포네이트(MES)를 사용하여 수행되었다. 대부분의 실시예들은 결정화 개시를 위해 씨드 결정을 사용했다.
WO-A-2004/009776은 여러 결정화 완충액과 D2E7 F(ab)'2 또는 Fab 단편을 동량(1㎕)으로 혼합하여 시팅 드랍 증기 확산(sitting drop vapor diffusion) 기술을 통한 마이크로리터 규모의 결정화 실험을 개시했다. 상기 단편들 각각에 대해 여러 실험 조건들이 보고되었지만, 전체 완전 D2E7 항체의 성공적인 결정화에 대해서는 보고된 것이 없다.
따라서, 임의의 주어진 항-사람 TNF알파 전체 항체, 특히 D2E7의 결정을 제조하는 방법은 이용가능한 것이 없다.
이에, 본 발명에 따라 해결하고자 하는 문제는 항-hTNF알파 항체, 특히 사람 항-hTNF알파 항체 D2E7의 적당한 배치 결정화 조건을 개발하고 산업적 항체 결정 생산과 관련된 용량에도 적용가능한 결정화 공정 조건을 확립하는 것이다. 동시에, 결정화 공정은 상기 항체의 약제학적 이용가능성에 악영향을 미칠 수 있는 독성제를 이용하지 않는 방법이 구축되어야 한다.
전술한 문제점은 놀랍게도, 결정화 유도제로서 생리학적으로 허용되는 무기 포스페이트 염을 적용함으로써 마이크로리터 규모 이상의 배치 결정화 용량에서 완전 항-hTNF알파 항체의 결정을 수득하는 것이 가능하다는 발견에 의해 해결되었다.
바람직한 양태
제1 관점에서, 본 발명은 항-hTNF알파 항체를 결정화하는 배치 결정화 방법으로서,
a) 상기 항체의 수용액을 결정화제로서의 무기 포스페이트 염과의 혼합물로 제공하되, 예컨대 바람직하게는 용해된 형태로 존재하는 상기 항체의 수용액을 용해된 형태의 결정화제로서의 무기 포스페이트 염을 함유하는 결정화 수용액과 혼합하거나, 또는 고체 형태의 상기 결정화제를 첨가하여 혼합물로 제공하는 단계; 및
b) 상기 수성 결정화 혼합물을 상기 항체의 결정이 형성될 때까지 항온처리하는 단계를 포함하는 결정화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 결정화 방법은 일반적으로 수성 결정화 혼합물의 pH가 약 pH 3 내지 5, 특히 약 3.5 내지 약 4.5, 또는 약 3.7 내지 약 4.2인 범위에서 수행된다.
또한, 상기 수성 결정화 혼합물은 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 특히 주성분으로서 아세테이트 성분, 특히 알칼리 금속 염, 구체적으로 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 상기 염은 산, 특히 아세트산을 첨가함으로써 필요한 pH로 조정된다. 결정화 방법의 바람직한 양태에서, 상기 수성 결정화 혼합물 중의 완충액 농도(총 아세테이트)는 0 내지 0.5M, 또는 약 0.02 내지 약 0.5M, 예컨대 약 0.05 내지 약 0.3M, 또는 약 0.15 내지 약 0.2M이다.
본 발명에 따른 결정화 방법의 또 다른 특정 양태에 따르면, 침전제로서 사용된 포스페이트 염은 하이드로겐 포스페이트 염, 예컨대 모노하이드로겐포스페이트 염 또는 디하이드로겐포스페이트 염, 특히 암모늄 염 또는 알칼리 금속 염, 예컨대 Na+ 또는 K+ 이온을 함유하는 염, 또는 이의 2종 이상의 상이한 염을 포함하는 혼합물 중에서 선택된다. 적당한 예는 NaH2PO4, Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4 및 이들의 혼합물이다.
특히, 결정화 혼합물 중의 포스페이트 염 농도는 약 1 내지 6M 범위, 예컨대 약 1.0 내지 약 4.0M, 또는 약 1.0 내지 약 3.0M, 또는 약 1.5 내지 약 2.8M, 또는 약 2.0 내지 약 2.6M 범위이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 단백질 용액 및 결정화 용액은 약 1:1 비로 배합된다. 따라서, 초기 결정화 용액 중의 완충제/결정화제의 몰농도는 결정화 혼합물에서의 몰비의 약 2배이다.
일반적으로, 결정화 방법은 약 1ml 내지 약 20000 L 범위, 또는 1ml 내지 약 15,000L, 또는 1ml 내지 약 12,000L, 또는 약 1ml 내지 약 10,000L, 또는 1ml 내지 약 6000L, 또는 1ml 내지 약 3,000L, 또는 1ml 내지 약 1,000L, 또는 1ml 내지 약 100L, 예컨대 약 50ml 내지 내지 8000ml, 또는 약 100ml 내지 약 5000ml, 또는 약 1000ml 내지 약 3000ml, 또는 약 1L 내지 약 1000L; 또는 약 10L 내지 약 500L 범위의 배치 용적에서 수행된다.
또한, 본 발명의 결정화 방법은 다음과 같은 결정화 조건 중 적어도 하나가 추가로 달성되도록 수행될 수 있다:
a) 항온처리를 약 1시간 내지 약 60일, 예컨대 약 1 내지 약 30일, 또는 약 2 내지 10일 동안 수행한다;
b) 항온처리를 약 0℃ 내지 약 50℃, 예컨대 약 4℃ 내지 약 37℃의 온도에서 수행한다;
c) 결정화 혼합물 중의 항체 농도(즉, 단백질 농도)는 약 1 내지 200mg/ml 또는 1 내지 100mg/ml 범위, 예컨대 1.5 내지 20mg/ml, 특히 약 2 내지 15mg/ml, 또는 5 내지 10mg/ml 범위이다. 이 단백질 농도는 표준 단백질 측정 절차에 따라 측정될 수 있다.
특히 바람직한 방법에 따르면, 결정화는 다음과 같은 결정화 혼합물의 조건 하에 수행된다:
포스페이트 염: NaH2PO4 1.5 내지 2.5M
완충액: 총 아세테이트 0 내지 0.3M
pH: 3.6 내지 4.2
항-hTNF알파 농도: 3 내지 10mg/ml
온도: 18 내지 24℃
배치 용적: 1 내지 100L
교반: 안함
기간: 4 내지 15일
위에 요약한 바와 같은 결정화 혼합물은 일반적으로 결정화제를 용액 또는 고체로서 단백질 용액에 첨가함으로써 수득된다. 두 용액은 완충될 수 있으나, 반드시 완충되어야 하는 것은 아니다. 초기 결정화 용액의 결정화제 몰비와 완충액 몰비는 일반적으로 단백질 용액으로 "희석된" 상태인 결정화 혼합물에서보다 높다.
추가 양태에 따르면, 본 발명의 결정화 방법은 수득된 결정을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적당한 건조 방법은 증발 건조, 분무 건조, 동결건조, 진공 건조, 유체 층 건조, 분무 동결 건조, 근임계(near critical) 건조, 초임계 건조 및 질소 기체 건조를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결정화 방법은 몰 질량이 약 300 내지 8000 달톤 범위인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG의 혼합물을 함유하는 완충액과 같은 다른 완충액으로 원심분리, 정용여과, 한외여과 또는 다른 통용되는 완충액 교환 기술에 의해 결정화 모액을 교환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 결정화 방법에 의해 수득할 수 있는 항-hTNF알파 항체의 결정, 일반적으로 항-hTNF알파 항체의 결정들에 관한 것이다.
본 발명의 결정은 일반적으로 최대 길이 l이 약 2 내지 500㎛ 또는 약 100 내지 300㎛이고, l/d 비가 약 3 내지 30인 바늘형 형태를 특징으로 하지만, 다른 기하학적 외관을 가질 수도 있다.
이러한 결정은 폴리클로날 항체 또는 바람직하게는 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다.
특히, 상기 항체는 비-키메라 또는 키메라 항체, 사람화된 항체, 비-글리코실화 항체, 사람 항체 및 마우스 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 특히 결정화되는 항체는 항원 결합을 향상시키기 위해 임의로 추가로 처리되는, 비-키메라 사람 항체이다.
상기 결정은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체와 같은 IgG 항체로부터 수득되는 것이 바람직하다. 특히, 상기 항체는 IgG1 그룹의 완전 항-사람TNF알파 항체이다.
바람직한 양태에서, 결정은 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때 1x10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 1x10-9M 이하, 더욱 더 바람직하게는 5x10-10M 이하의 Kd 및 1x10-3 s-1 이하의 Ka 속도 상수로 hTNF알파로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 분석에서 1x10-7M 이하의 IC50으로 hTNF알파 세포독성을 중화시키는 분리된 사람 항체로부터 제조된다.
특히, 상기 결정은 a) 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때 1x10-3 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 TNF알파로부터 해리되고; b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 3으로부터 위치 1, 4, 5, 7 또는 8에서 단일 알라닌 치환에 의해 변형되거나 또는 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 갖고; c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4로부터 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11에서 단일 알라닌 치환에 의해 변형되거나 또는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및/또는 12에서 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인을 갖는 특징을 가진 분리된 사람 항체로부터 제조될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원결합부는 사람 TNF알파로부터 5 x 10-4 s-1 이하의 koff로 해리된다. 더욱 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원결합부는 사람 TNF알파로부터 1x10-4 s-1 이하의 koff로 해리된다.
특히 바람직한 양태에서, 결정은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 보유하는 분리된 사람 항체로부터 제조된다.
WO-A-97/29131에 개시된 바와 같은 항체 D2E7 또는 이의 기능적 등가물로부터 제조된 항체가 가장 바람직하다. 상기 항체는 중국 햄스터 난소 세포에서 재조합 생산되고 서열번호 6에 기재된 중쇄 서열과 서열번호 5에 기재된 경쇄 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항-hTNF알파 항체의 결정 및 (b) 상기 항체 결정을 안정하게 유지시키는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 고체, 액체 또는 반고체 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 (a) 본원에 정의된 바와 같은 항-hTNF 알파 항체의 결정 및 (b) 상기 항체 결정을 포매 또는 봉입하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 고체, 액체 또는 반고체 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 추가로 (c) 상기 항체 결정을 안정하게 유지시키는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 봉입 및 포매가 함께 수행되어도 좋다.
특히, 상기 조성물은 항체 결정 농도가 약 1mg/ml 이상, 특히 약 200mg/ml 이상, 예컨대 약 200 내지 약 600mg/ml, 또는 약 300 내지 약 500mg/ml인 것일 수 있다.
상기 부형제는 하나 이상의 중합체성, 임의로 생분해성인 담체를 포함하거나, 하나 이상의 오일 또는 지질 담체를 포함할 수 있다.
상기 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리(유기)포스파젠, 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 무수 말레산-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화 폴리사카라이드, 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 중합체일 수 있다.
상기 오일(또는 유성 액체)은 유성 아몬드유, 옥수수유, 면실유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 광유, 경질 광유, 옥틸도데칸올, 올리브유, 땅콩유, 퍼식 오일(persic oil), 참깨유, 대두유, 스쿠알렌, 액상 트리글리세라이드, 액상 왁스, 고급 알콜로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 오일(또는 유성 액체)일 수 있다.
상기 지질 담체는 지방산 및 지방산 염, 지방산 알콜, 지방산 아민, 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세라이드, 인지질, 당지질, 스테롤 및 왁스, 및 관련 있는 유사 물질로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택된 지질일 수 있다. 왁스는 천연 및 합성 제품으로 추가 분류된다. 천연 재료에는 식물, 동물 또는 광물 근원에서 수득된 왁스, 예컨대 밀랍, 카나우바 또는 몬탄왁스가 포함된다. 합성 왁스 제품의 예는 염소화된 나프탈렌 및 에틸렌계 중합체이다.
바람직한 양태에서, 조성물은 위에서 정의한 바와 같은 항-hTNF알파 항체 결정을 포함하고, 이 항체 결정의 농도가 약 10 내지 약 400mg/ml 범위 또는 약 50 내지 약 300mg/ml 범위인 주사가능한 조성물이다.
다른 관점에서, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 항-TNF알파 항체 결정을 포함하고 이 항체 결정 농도가 약 100mg/ml 이상, 예컨대 약 150 내지 약 600mg/ml 또는 약 200 내지 약 400mg/ml 범위인 결정 슬러리에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 완전 항-hTNF알파 항체 결정의 유효량 또는 위에서 정의한 바와 같은 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 비경구 경로, 경구 경로 또는 주사로 투여하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 항체 결정의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 피검체의 hTNF알파 관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
특히, 상기 TNF알파 관련 장애는 자가면역질환, 특히 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염 및 통풍성 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신장 증후군; 감염성 질환, 이식거부 또는 이식편-대-숙주 질환, 악성종양, 폐 장애, 장 장애, 심장 장애, 염증성 골 장애, 골흡수 질환, 알콜성 간염, 바이러스 간염, 극증 간염, 응고 장애, 화상, 재관류 손상, 켈로이드 형성, 흉터 조직 형성, 발열, 치주병, 비만, 방사선 독성; 척추관절병증, 폐 장애, 심장장애, 대사장애, 빈혈, 통증, 간 장애, 피부 장애, 손톱 장애 또는 혈관염, 베체트병, 강직성 척추염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 특발성 폐섬유증(IPF), 재협착, 당뇨병, 빈혈, 통증, 크론병 관련 장애, 소아 류마티스성 관절염(JRA), C형 간염 바이러스 감염, 건선, 건선성 관절염 및 만성 플라크 건선, 연령 관련 악액질, 알츠하이머병, 뇌부종, 염증성 뇌손상, 만성 피로 증후군, 피부근육염, 약물 반응, 척수 내 및/또는 척수 주위 부종, 가족성 주기성 발열, 펠티 증후군, 섬유증, 사구체신염(예: 연쇄상구균 감염후 사구체신염 또는 IgA 신장병증), 보철 이완, 현미경적 다발혈관염, 혼합 결합조직 장애, 다발성 골수종, 암 및 악액질, 다발 기관 장애, 골수형성이상 증후군, 고환염 골용해, 췌장염, 예컨대 급성, 만성 및 췌장성 농양, 치주질환 다발성근염, 진행성 신부전, 가성통풍, 괴저농피증, 재발성 다발성 연골염, 류마티스 심장병, 사르코이드증, 경화성 담도염, 뇌졸중, 흉복부 대동맥 동맥류 수복(TAAA), TNF 수용체 관련 주기성 증후군(TRAPS), 황열 백신접종과 관련된 증후군, 귀와 관련된 염증성 질환, 만성 귀염증 또는 소아 귀염증, 포도막염, 좌골신경통, 전립선염, 자궁내막증, 맥락막 혈관신생, 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 습성 황반 변성 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 위에서 정의된 바와 같은 hTNF알파 관련 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 위에서 정의된 바와 같은 전체 항-hTNF알파 항체 결정의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 의약에 사용하기 위한, 위에서 정의한 바와 같은 항-hTNF알파 항체 결정을 제공한다.
도 1: 6일 후 실시예 37 유래의 D2E7 결정.
도 2: 1ml 배치 용적, 주위 온도에서 제조된 D2E7 결정.
도 3: 50ml 배치 용적, 주위 온도에서 제조된 D2E7 결정.
도 4: 10L 배치 용적, 주위 온도에서 제조된 D2E7 결정.
도 5: 본 발명에 따라 제조된 D2E7 결정 및 이의 복굴절.
도 6: 여러 게이지의 바늘을 통해 주사된 여러 농도의 D2E7 결정 현탁액.
도 7: D2E7 결정 현탁액의 FT-IR 분석.
A. 정의
"배치 결정화 방법"은 결정화제를 바람직하게는 용해된 형태로 포함하는 결정화 용액을, 결정화될 항체 용액에 첨가하는 단계를 포함한다.
"마이크로 규모 결정화 방법"은 예컨대 증기 확산을 기초로 할 수 있는 것으로서, 결정화제를 함유하는 저장 완충액과 마이크로리터 범위의 소량의 항체 용액을 혼합하는 단계; 상기 혼합물의 액적을 상기 저장 완충액의 일정량에 인접한 밀봉된 용기에 배치하는 단계; 상기 액적과 저장 완충액 사이에 증기 확산에 의해 용매를 교환시키는 단계를 포함하고, 교환 동안 상기 액적 내의 용매 함량은 변화하여 적당한 결정화 조건에 도달하면 결정화가 관찰될 수 있다.
본 발명의 경우에 포스페이트 염인 "결정화제"는 결정화될 항체의 결정 형성을 유리하게 한다.
"결정화 용액"은 상기 결정화제를 용해된 형태로 포함한다. 이 용액은 수성계이고, 즉 이 용액의 액체 성분은 주로 물로 구성되는 것이 바람직하다. 예컨대, 80 내지 100wt% 또는 95 내지 100wt% 또는 98 내지 100wt%가 물일 수 있다.
항체 "결정"은 상기 단백질의 물질의 고체 상태 중 하나의 형태이며, 비조직화된 불균일 고체로 대부분 존재하는 무정형 상태인 제2 고체 형태와 구별되는 것이다. 결정은 규칙적인 3차원 구조로, 보통 격자로 불리는 구조를 하고 있다. 항체 결정은 규칙적인 3차원 배열의 항체 분자를 포함한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., pp. 1-16, Oxford University Press, New York(1999)].
본 발명에 따라 결정화된 "전체" 또는 "완전" 항hTNF알파 항체는 시험관내 및/또는 생체 내에서 이의 항원인 사람 TNF알파를 인식하고 결합할 수 있는 기능적 항체이다. 이 항체는 이의 항원에 대한 항체 결합과 관련 있는 환자의 후속 면역계 반응, 특히 직접 세포독성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 개시시킬 수 있다. 이 항체 분자는 서로 공유 결합된 2개의 동일한 중쇄(MW 각각 약 50kDa)와 하나의 중쇄에 각각 공유 결합된 2개의 동일한 경쇄(MW 각각 약 25kDa)로 구성된 구조를 보유한다. 4개의 쇄는 통상적인 "Y" 모티프로 배열되어 있다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(여기에 LCVR 또는 VL이라 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성되어 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라는 더욱 보존된 영역이 산재해 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 다시 나뉠 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 다음과 같은 순서, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있다. 완전한 항체 분자는 2개의 항원 결합 부위을 보유하며, 즉 "2가"이다. 2개의 항원 결합 부위는 하나의 hTNF알파 항원에 특이적이고, 즉 항체는 "단일특이적"이다.
"모노클로날 항체"는 B 림프구(B 세포)의 단일 클론에서 유래된 항체이며, 동일한 항원 결정인자를 인식한다. 완전 모노클로날 항체는 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 위에서 언급한 통상적인 분자 구조를 보유하는 것이다. 모노클로날 항체는 항체 생산성 B 세포를 무한증식성 골수종 세포와 융합시켜, 세포 배양에서 계속해서 모노클로날 항체를 생산하는 B 세포 하이브리도마의 생성을 통해 통상적으로 생산된다. 다른 생산 방법도 이용할 수 있는데, 그 예로는 파지 디스플레이 기술을 이용한 세균, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 배양에서의 모노클로날 항체의 발현; 유전자 변형된 동물, 예컨대 전체 사람 B 세포 게놈을 함유 및 발현하도록 변형된 돌연변이 마우스, 또는 소, 염소, 돼지, 토끼, 닭과 같은 유전자 변형된 동물에서의 생체내 생산; 또는 담배 및 옥수수와 같은 유전자 변형된 식물에서의 생산이 있다. 이러한 모든 근원 유래의 항-hTNF알파 항체는 본 발명에 따라 결정화될 수 있다.
본 발명에 따라 결정화되는 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 유래의 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에 존재하는 대응 서열과 동일하거나 상동성이지만, 그 쇄(들)의 나머지는 다른 종 유래의 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에 존재하는 대응 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항-hTNF알파 항체가 포함된다. 일 예로서, 쥐 항체의 가변성 항원결합부와 사람 항체 유래의 불변부를 포함하는 마우스/사람 키메라를 예로 들 수 있다.
비-사람(예: 쥐) 항-hTNF알파 항체의 "사람화된" 형태도 포함된다. 이 형태는 비-사람 면역글로불린 유래의 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 사람화된 항체는 대부분 사람 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 루프(HVL) 유래의 잔기가 원하는 기능성을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비-사람 영장류 등의 비-사람 종의 CDR 또는 HVL 유래의 잔기로 대체된 사람 면역글로불린이다. 사람 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 항원 결합 친화성을 향상시키기 위해 대응하는 비-사람 잔기로 대체될 수 있다. 또한, 사람화된 항체는 대응하는 사람이나 비-사람 항체 부위에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 효능의 추가 향상에 필수적일 수 있다.
"사람 항체" 또는 "완전 사람 항체"는 사람에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열 또는 재조합 생산된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 사람 생식계열(germline) 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 사람 항체는 CDR 및 특히 CDR3과 같은 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 것이 아닌 아미노산 잔기(예: 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열에서 유래하는 CDR 서열을 사람 프레임워크 서열에 접목시킨 항체를 포함하는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 모든 사람 항체를 포함하는 것으로서, 예를 들면 숙주 세포를 형질감염시킨 재조합 발현 벡터에 의해 발현된 항체, 재조합 조합 사람 항체 라이브러리에서 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물(예: 마우스)에서 분리된 항체[참조: Taylor et al. (1992) Nucl.Acids Res. 20:6287) 또는 다른 DNA 서열에의 사람 면역글로불린 유전자 서열의 연결을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유한다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발 처리되고 (또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자도입된 동물이 사용된 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발 처리되고), 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 관련이 있기는 하지만, 생체내 사람 항체 생식계열 레퍼토리 내에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본 명세서에 사용된 "중화 항체"(또는 hTNFα 활성을 중화시키는 항체")는, hTNFα에 대한 결합이 hTNFα의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 의미하는 것이다. 이러한 hTNFα의 생물학적 활성의 억제는 hTNFα 유도된 세포독성(시험관내 또는 생체내), hTNFα 유도된 세포 활성화 및 hTNFα 수용체에의 hTNFα 결합과 같은 hTNFα 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정하여 평가할 수 있다. hTNFα 생물학적 활성의 상기 지시인자는 당업계에 공지된 하나 이상의 여러 표준 시험관내 또는 생체내 분석법을 통해 평가될 수 있다. hTNFα 활성을 중화시키는 항체의 능력은 L929 세포의 hTNFα 유도된 세포독성의 억제를 통해 평가하는 것이 바람직하다. hTNFα 활성의 추가적 또는 대안적인 파라미터로서, hTNFα 유도된 세포 활성화의 척도로서 HUVEC에서 ELAM-1의 hTNFα 유도된 발현을 억제하는 항체의 능력을 평가할 수도 있다.
"친화성 성숙된" 항-hTNF알파 항체는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화성을 개량시키는 하나 이상의 초가변 영역에 존재하는 하나 이상의 변경을 보유하는 항체이다. 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성 값을 나타낼 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783(1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기술하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌[Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813(1994); Scier et al., Gene 169: 147-155(1995); Yelton et al., J.Immunol. 155: 1994-2004(1995); Jackson et al., J.Immunol. 154(7): 3310-9(1995); and Hawkins et al., J. Mol Biol. 226: 889-896(1992)]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는, 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것이다(예: hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hTNFα 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 하지만, hTNFα에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 TNFα 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "사람 TNFα"(본 명세서에서 hTNFα, 또는 간단히 hTNF로 약칭됨)는 17kDa 분비 형태 및 26kDa 막 결합 형태로서 존재하고, 이의 생물학적 활성 형태가 비공유결합된 분자의 삼량체로 이루어져 있는 사람 사이토카인을 의미한다. hTNFα의 구조는, 예를 들면, 문헌[참조: Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; 및 Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338: 225-228]에 보다 상세히 기술되어 있다. 사람 TNFα란 용어는 표준 재조합 발현법으로 제조할 수 있거나, 시판되는(R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN) 재조합 사람 TNFα(rhTNFα)를 포함하는 의미이다.
본 명세서에 사용된 "Koff"란 용어는 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리되는 해리 속도(off rate) 상수를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "Kd"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
본 발명에 따라 결정화된 특정 "모" 항-hTNF알파 항체의 "기능적 등가물"은동일한 항원 특이성을 나타내지만, 아미노산 수준 또는 글리코실화 수준에서 "모" 항체의 분자 조성과 관련하여 상이한 항체이다. 하지만, 이러한 차이는 단지, 결정화 조건이 본 명세서에 개시된 바와 같은 파라미터 범위에서 벗어나지 않을 정도일 수 있다.
항체 결정의 "봉입"은 혼입된 결정이 코팅 물질의 하나 이상의 층에 의해 개별적으로 코팅된 제형을 의미한다. 바람직한 양태에서, 이와 같이 코팅된 결정은 지속적인 용해 속도를 나타낼 수 있다.
항체 결정의 "포매"는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있는 결정이 고체, 액체 또는 반고체 담체 내에 분산 방식으로 혼입되어 있는 제형을 의미한다. 이와 같이 포매된 결정화된 항체 분자는 담체로부터 조절된 지속적인 방식으로 방출되거나 용해될 수 있다.
B. 결정화 방법
본 발명의 결정화 방법은 본래 모든 항-hTNF알파 항체에 적용할 수 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체 또는 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 이 항체는 키메릭 항체, 사람화된 항체, 사람 항체 또는 비-사람 항체, 예컨대 마우스 항체일 수 있고, 각각 글리코실화되거나 비-글리코실화된 형태일 수 있다. 특히, 본 방법은 D2E7 및 이의 기능적 등가물에 적용할 수 있다.
바람직하게는 상기 항-hTNF알파 항체는 IgG 항체, 특히 IgG1 그룹의 항 사람 TNF알파 항체이다.
달리 언급되지 않은 한, 본 발명의 결정화 방법은 당업계에 공지된 기술적 장치, 화학물질 및 방법을 이용한다. 하지만, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 특정 결정화 조건의 선택, 특히 특정 결정화제의 선택과 해당 제제(완충액, 항체, 결정화제)의 특정 pH 조건 및/또는 농도 범위와의 임의의 추가의 조합을 통해 최초로 hTNF 알파에 대한 항체, 특히 비-키메릭 사람 항체의 안정한 결정을 대량으로 재현가능하게 제조할 수 있고 추가 가공을 통해 우수하고 매우 유익한 약제학적 조성물의 활성 성분을 형성할 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 하고 있다.
결정화 방법을 수행하기 위한 출발 물질은 일반적으로 결정화될 항체의 농축 용액을 포함한다. 단백질 농도는 예컨대 약 5 내지 75mg/ml 범위일 수 있다. 이 용액은 상기 용해된 항체를 안정화시키는 첨가제를 포함할 수 있고, 이 첨가제는 사전에 제거하는 것이 권장된다. 이는 완충액 교환 단계를 수행함으로써 완수할 수 있다.
바람직하게는, 결정화를 수행하기 위한 상기 출발 물질은 pH가 약 3.2 내지 8.2 범위, 또는 약 4.0 내지 8.0 범위, 특히 약 4.5 내지 6.5 범위, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5 범위로 조정된 수용액 중의 항체를 함유한다. pH는 약 1 내지 50mM, 특히 약 1 내지 10mM의 최종 농도로 적용되는 적당한 완충액을 이용하여 조정할 수 있다. 이 용액은 이 용액을 더욱 안정화시키기 위해 염, 당, 당 알콜 및 계면활성제와 같은 첨가제를, 예컨대 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.01 내지 15wt%, 또는 0.1 내지 5wt%, 또는 0.1 내지 2wt%의 비율로 함유할 수 있다. 부형제는 바람직하게는 약제학적 제제에 통상적으로 적용되는 생리학적으로 허용되는 화합물 중에서 선택되어야 한다. 비제한적 예로서, NaCl과 같은 염; 폴리소르베이트 80(Tween 80), 폴리소르베이트 20(Tween 20)과 같은 계면활성제; 슈크로스, 트레할로스와 같은 당; 만니톨, 소르비톨과 같은 당 알콜; 및 포스페이트계 완충 시스템, 예컨대 위에서 정의한 바와 같은 나트륨 및 칼륨 하이드로겐 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, TRIS 완충액, 말레에이트 완충액 또는 석시네이트 완충액, 히스티딘 완충액과 같은 완충제; 히스티딘, 아르기닌 및 글리신과 같은 아미노산을 예로 들 수 있다.
완충액 교환은 통상의 방법을 이용하여, 예컨대 투석 또는 한외여과에 의해 수행할 수 있다.
출발 물질로서 사용된 수용액의 초기 단백질 농도는 약 0.5 내지 약 200mg/ml 범위 또는 약 1 내지 약 50mg/ml 범위이어야 한다.
계획된 최종 배치 크기(1ml 내지 20000(2만) 리터 범위일 수 있다)에 따라서, 항체 수용액의 초기 용적은 유리, 중합체 또는 금속과 같은 불활성재로 제조된 적당한 용기(예: 관, 병 또는 탱크)에 담는다. 상기 수용액의 초기 용적은 최종 배치 크기의 약 30 내지 80%, 보통 약 50%에 해당할 수 있다.
필요하다면, 상기 용기에 충전된 후 용액은 표준화된 조건에 있게 될 것이다. 특히, 온도는 약 4℃ 내지 약 37℃의 범위로 조정될 것이다.
그 후, 적당한 농도로 결정화제를 함유하고, 임의로 항체 용액과 같은 방식으로 예비조성된 결정화 용액은 항체 용액에 첨가된다.
결정화 용액의 첨가는 경우에 따라 두 액체의 혼합을 촉진하기 위해 완만한 진탕 하에 연속적으로 또는 불연속적으로 수행한다. 첨가는 단백질 용액이 교반 하에 준비되어 있고 결정화 용액(또는 고체 형태의 제제)이 조절된 방식으로 첨가되는 조건 하에 수행되는 것이 바람직하다.
항체 결정의 형성은 결정화제로서 위에서 정의한 바와 같은 포스페이트 염, 특히 하이드로겐 포스페이트 염, 및 바람직하게는 알칼리 금속 염 또는 2종 이상의 상이한 알칼리 금속 염의 혼합물을 가함으로써 개시한다. 결정화 용액은 상기 결정화 혼합물에 포스페이트 염의 최종 농도를 약 1 내지 6M의 범위로 제공하기에 충분한 농도로 결정화제를 함유한다.
바람직하게는, 결정화 용액은 추가로 산성 완충액, 즉 항체 용액과 상이한 완충액을 결정화 혼합물의 pH를 약 3 내지 5 범위로 조정하기에 적당한 농도로 함유한다.
상기 결정화 용액을 모두 첨가한 후, 수득되는 혼합물은 다시 약 1시간 내지 약 60일 동안 항온처리하여 항체 결정의 최대 수율을 수득한다. 적당하다면, 혼합물은 예컨대 공지된 방식 대로 진탕하거나, 완만하게 교반하거나, 회전 또는 이동시킬 수 있다.
마지막으로, 수득된 결정은 공지의 방법으로, 예컨대 여과 또는 원심분리, 예컨대 약 200 내지 20000rpm, 바람직하게는 500 내지 2000rpm, 실온 또는 4℃에서의 원심분리를 통해 분리할 수 있다. 남은 모액은 버리거나 추가 처리할 수 있다.
필요하다면, 이와 같이 분리된 결정은 세척한 후 건조할 수 있고, 또는 모액은 현탁되어 있는 항체의 저장 및/또는 최종 사용에 적당한 다른 용매계로 교환할 수 있다.
본 발명에 따라 형성된 항체 결정은 형태가 변화할 수 있다. 형태는 일반적으로 바늘형, 원추형, 구형 및 성게형 형태를 포함할 수 있다. 결정의 크기는 고위 nm 내지 mm 크기(예컨대, 길이) 정도일 수 있다. 일부 양태에서, 결정은 적어도 약 10㎛의 크기로, 육안으로 확인할 수 있다. 치료 투여를 위한 결정의 크기는 투여 경로에 따라 달라질 수 있고, 예컨대 경피 투여 시에 결정의 크기는 정맥내 투여 시보다 더 클 수 있다.
결정의 형태는 단백질 결정 및 저분자량 유기 및 무기 분자의 결정에 대해 이미 설명된 바와 같이 결정화 혼합물에 특정 추가 첨가제를 첨가함으로써 변경시킬 수 있다.
필요하다면, 결정이 상기 항체의 실제 결정인지를 확인할 수 있다. 항체의 결정은 복굴절에 대해 현미경으로 분석할 수 있다. 일반적으로, 결정은 입방적 내부 대칭이 없는 한 편광의 편광면을 회전시킬 것이다. 또 다른 방법으로서, 결정은 SDS-PAGE에 의해 분리, 세척, 재용해 및 분석될 수 있고, 경우에 따라 항-Fc 수용체 항체로 염색될 수 있다. 경우에 따라, 재용해된 항체는 표준 분석법으로 hTNF알파에 대한 결합성에 대해 시험될 수도 있다.
본 발명에 따라 수득된 결정은 서로 가교될 수도 있다. 이러한 가교는 결정의 안정성을 향상시킬 수 있다. 결정의 가교 방법은 예컨대 미국 특허 5,849,296에 기술되어 있다. 결정은 글루타르알데하이드와 같은 이작용기성 시약을 사용하여 가교시킬 수 있다. 일단 가교되면, 결정을 동결건조시키고 진단이나 치료 용도 등에 사용하기 위해 보관해 둘 수 있다.
일부 경우에, 결정은 건조하는 것이 바람직할 수 있다. 결정은 질소 기체와 같은 불활성 기체를 이용해서, 진공 오븐 건조, 동결건조, 증발, 트레이 건조, 유동상 건조, 분무건조, 진공건조 또는 롤러 건조에 의해 건조할 수 있다. 적당한 방법은 익히 공지되어 있다.
본 발명에 따라 형성된 결정은 초기 결정화 용액에 유지시키거나 또는 세척하여 다른 물질, 예컨대 불활성 담체 또는 성분과 배합해서 본 발명의 결정을 함유하는 조성물 또는 제형을 형성할 수 있다. 이러한 조성물 또는 제형은 치료 및 진단 용도 등에 사용될 수 있다.
바람직한 양태는 적당한 담체 또는 성분을 본 발명의 결정과 배합하되, 제형의 결정이 부형제에 의해 포매되거나 봉입되도록 배합한다. 적당한 담체는 다음과 같은 비제한적 그룹 중에서 선택할 수 있다: 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리(유기)포스파젠, 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 무수 말레산-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화 폴리사카라이드, 이의 배합물 및 공중합체, SAIB, 지방산 및 지방산 염, 지방산 알콜, 지방산 아민, 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세라이드, 인지질, 당지질, 스테롤 및 왁스, 그리고 관련된 유사 물질. 왁스는 다시 천연 및 합성 제품으로 분류된다. 천연 재료는 밀랍, 카나우바 또는 몬탄왁스와 같은 식물, 동물 또는 광물 근원에서 수득된 왁스를 포함한다. 합성 왁스 제품의 예는 염소화된 나프탈렌 및 에틸렌계 중합체이다.
C. 조성물
본 발명의 다른 관점은 항-hTNF알파 항체를 하나 이상의 담체/부형제와 함께 함유하는 조성물/제형에 관한 것이다.
이 제형은 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다.
본 발명의 제형은 필요한 정도의 순도를 가진 항체를 생리학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 담체, 부형제 및/또는 안정화제와 현탁액 형태로 혼합하고, 동결건조하거나 다른 방식으로 건조하여 보관 및/또는 사용에 적당한 형태로 제조한다(예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edn., Osol, A. Ed.(1980)). 경우에 따라, 추가 활성 성분, 예컨대 다른 항체, 생체분자, 화학적 또는 효소적 합성된 저분자량 분자도 첨가될 수 있다.
허용되는 첨가제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 이의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 포함된다:
- 산성화제, 예컨대 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 염산, 말산, 질산, 인산, 희석된 인산, 황산, 타르타르산.
- 에어로졸 분사제, 예컨대 부탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이소부탄, 프로판, 트리클로로모노플루오로메탄.
- 공기 치환제, 예컨대 이산화탄소, 질소;
- 알콜 변성제, 예컨대 메틸 이소부틸 케톤, 슈크로스 옥타아세테이트;
- 알칼리화제, 예컨대 암모니아 용액, 탄산암모늄, 디에탄올아민, 디이소프로판올아민, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 붕산나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 트롤아민;
- 소포제, 예컨대 디메티콘, 시메티콘.
- 항미생물성 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 용액, 벤즈엘토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알콜, 부틸파라벤, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 크레졸, 데하이드로아세트산, 에틸파라벤, 메틸파라벤, 메틸파라벤 나트륨, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 아세테이트, 페닐머큐릭 니트레이트, 벤조산칼륨, 소르브산칼륨, 프로필파라벤, 프로필파라벤 나트륨, 벤조산나트륨, 나트륨 데하이드로아세테이트, 나트륨 프로피오네이트, 소르브산, 트리메로살, 티몰.
- 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 포름알데하이드 설폭실레이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 티오설페이트, 이산화황, 토코페롤, 토코페롤 부형제;
- 완충제, 예컨대 아세트산, 탄산암모늄, 인산암모늄, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산, 시트르산칼륨, 중인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨 용액, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 히스티딘.
- 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 디나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 염, 에데트산;
- 코팅제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 약제학적 글레이즈, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체, 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셀락, 슈크로스, 이산화티탄, 카나우바 왁스, 미세결정형 왁스, 제인, 폴리아미노산, 다른 중합체, 예컨대 PLGA 등, 및 SAIB.
- 착색제, 예컨대 산화제이철.
- 착화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 및 염(EDTA), 에데트산, 젠티스산 에탄올아미드, 옥시퀴놀린 설페이트.
- 탈수제, 예컨대 염화칼슘, 황산칼슘, 이산화규소.
- 유화제 및/또는 용해제, 예컨대 아카시아, 콜레스테롤, 디에탄올아민(보조약), 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 알콜, 레시틴, 모노- 및 디-글리세라이드, 모노에탄올아민(보조약), 올레산(보조약), 올레일 알콜(안정화제), 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥실 35 피마자유, 폴리옥실 40 수소화된 피마자유, 폴리옥실 10 올레일 에테르, 폴리옥실 20 세토스테아릴 에테르, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 스테아레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 스테아르산, 트롤아민, 유화성 왁스.
- 여과 보조제, 예컨대 분말형 셀룰로스, 정제된 백토.
- 향미제 및 향료, 예컨대 아네톨, 벤즈알데하이드, 에틸 바닐린, 멘톨, 메틸 살리실레이트, 모노나트륨 글루타메이트, 등화유, 페퍼민트, 페퍼민트 오일, 페퍼민트 주정제, 로즈 오일, 강한 로즈워터, 티몰, 톨루발삼 팅쳐, 바닐라, 바닐라 팅쳐, 바닐린.
- 활택제 및/또는 고화방지제, 예컨대 규산칼슘, 규산마그네슘, 콜로이드성 이산화규소, 탈크.
- 보습제, 예컨대 글리세린, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 소르비톨.
- 연고 베이스, 예컨대 라놀린, 무수 라놀린, 친수성 연고, 백색 연고, 황색 연고, 폴리에틸렌 글리콜 연고, 바셀린, 친수성 바셀린, 백색 바셀린, 로즈워터 연고, 스쿠알렌.
- 가소제, 예컨대 피마자유, 라놀린, 광유, 왁스, 벤질 베닐 포르메이트, 클로로부탄올, 디에틸 프탈레이트, 소르비톨, 디아세틸화된 모노글리세라이드, 디에틸 프탈레이트, 글리세린, 글리세롤, 모노- 및 디-아세틸화된 모노글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리아세틴, 트리에틸 시트레이트, 에탄올.
- 폴리펩타이드, 예컨대 저분자량(잔기 약 10개 미만); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린;
- 중합체 막, 예컨대 셀룰로스 아세테이트 막.
- 용매, 예컨대 아세톤, 알콜, 희석된 알콜, 아밀렌 하이드레이트, 벤질 벤조에이트, 부틸 알콜, 사염화탄소, 클로로포름, 옥수수유, 면실유, 에틸아세테이트, 글리세린, 헥실렌 글리콜, 이소프로필 알콜, 메틸 알콜, 염화메틸렌, 메틸 이소부틸 케톤, 광유, 땅콩유, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 카보네이트, 프로필렌 글리콜, 참깨유, 주사용수, 주사용 멸균수, 세척용 멸균수, 정제수, 액상 트리글리세라이드, 액상 왁스, 고급 알콜.
- 흡착제, 예컨대 분말상 셀룰로스, 차콜, 정제된 백토, 이산화탄소 흡착제, 수산화바륨 석회, 소다석회.
- 경화제, 예컨대 수소화된 피마자유, 세토스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 세틸 에스테르 왁스, 경질 지방, 파라핀, 폴리에틸렌 부형제, 스테아릴 알콜, 유화 왁스, 백색 왁스, 황색 왁스.
- 좌제용 베이스, 예컨대 코코아버터, 경질 지방, 폴리에틸렌 글리콜;
- 현탁화제 및/도는 점도 증가제, 예컨대 아카시아, 한천, 알긴산, 알루미늄 모노스테아레이트, 벤토나이트, 정제된 벤토나이트, 마그마 벤토나이트, 카르보머 934p, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 12, 카라기난, 미세결정형 및 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 셀룰로스, 덱스트린, 젤라틴, 구아검, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 메틸셀룰로스, 펙틴, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 포비돈, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 이산화규소, 콜로이드성 이산화규소, 알긴산나트륨, 트라가칸트, 잔탄검.
- 감미제, 예컨대 아스파탐, 덱스트레이트, 덱스트로스, 덱스트로스 부형제, 과당, 만니톨, 사카린, 칼슘 사카린, 나트륨 사카린, 소르비톨, 소르비톨 용액, 슈크로스, 압축 당, 제과점 당, 시럽.
- 정제 결합제, 예컨대 아카시아, 알긴산, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 미세결정형 셀룰로스, 덱스트린, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 액상 글루코스, 구아검, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 옥사이드, 포비돈, 예비젤라틴화된 전분, 시럽.
- 정제 및/또는 캡슐 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 삼염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정형 셀룰로스, 분말형 셀룰로스, 덱스트레이트, 덱스트린, 부형제 덱스트로스, 과당, 카올린, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 슈크로스, 압축 당, 제과점 당.
- 정제 붕해제, 예컨대 알긴산, 미세결정형 셀룰로스, 크로스카멜로스 나트륨, 코스포비돈, 포라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 전분, 예비젤라틴화된 전분.
- 정제 및/또는 캡슐 윤활제, 예컨대 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 베헤네이트, 마그네슘 스테아레이트, 경질 광유, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 스테아르산, 정제된 스테아르산, 탈크, 수소화된 식물유, 스테아르산아연.
- 장성제, 예컨대 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 염화칼륨, 염화나트륨 비히클: 가미 및/또는 감미된 방향족 엘릭시르, 화합물 벤즈알데하이드 엘릭시르, 이소알콜성 엘릭시르, 페퍼민트 워터, 소르비톨 용액, 시럽, 톨루발삼 시럽.
- 비히클, 예컨대 유성 아몬드유, 옥수수유, 면실유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 광유, 경질 광유, 미리스틸 알콜, 옥틸도데카놀, 올리브유, 땅콩유, 퍼식 오일, 참깨유, 대두유, 스쿠알렌; 고형 담체 당 구상체; 주사용 멸균 정균수, 정균성 염화나트륨 주사제, 액상 트리글리세라이드, 액상 왁스, 고급 알콜.
- 발수제, 예컨대 사이클로메티콘, 디메티콘, 시메티콘;
- 습윤제 및/또는 가용화제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 도큐세이트 나트륨, 노녹시놀 9, 노녹시놀 10, 옥토시놀 9, 폴록사머, 폴리옥실 35 피마자유, 폴리옥실 40, 수소화된 피마자유, 폴리옥실 50 스테아레이트, 폴리옥실 10 올레일 에테르, 폴리옥실 20, 세토스테아릴 에테르, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 나트륨 라우릴 설페이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 틸록사폴.
이러한 결정은 안정성 및/또는 지연 방출성을 구비하기 위해 중합체 담체와 배합될 수 있다. 이러한 중합체는 생체적합성 및 생분해성 중합체를 포함한다. 중합체 담체는 단일형 중합체이거나, 또는 중합체 혼합물형으로 구성되기도 한다. 중합체 담체의 비제한적 예는 이미 전술한 바와 같다.
바람직한 성분 또는 부형제의 예는 다음과 같은 것을 포함한다:
- 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 프롤린, 히스티딘과 같은 아미노산의 염;
- 단당류, 예컨대 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 자일로스, 리보스;
- 이당류, 예컨대 락토스, 트레할로스, 말토스, 슈크로스;
- 다당류, 예컨대 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 글리코겐;
- 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 소르비톨;
- 글루쿠론산, 갈락투론산;
- 사이클로덱스트린, 예컨대 메틸 사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-(3-사이클로덱스트린)
- 무기 염, 에컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 나트륨 및 칼륨의 인산염, 붕산 암모늄 카보네이트 및 인산암모늄;
- 유기 염, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 아스코르베이트, 락테이트;
- 유화제 또는 가용화제, 예컨대 아카시아, 디에탄올아민, 글리세릴 모노스테아레이트, 레시틴, 모노에탄올아민, 올레산, 올레일 알콜, 폴록사머, 폴리소르베이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 스테아르산, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테아레이트 및 다른 소르비탄 유도체, 폴리옥실 유도체, 왁스, 폴리옥시에틸렌 유도체, 소르비탄 유도체; 및
- 점도 증가 시약, 예컨대 한천, 알긴산 및 이의 염, 구아검, 펙틴, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌옥사이드, 셀룰로스 및 이의 유도체, 프로필렌 카보네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜 및 틸록사폴.
또한, 본 명세서에 기술된 제형은 결정형 항체의 유효량을 포함한다. 특히, 본 발명의 제형은 본 발명의 항체 결정의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 달성하기에 필요한 시간 동안 투여량에서 효과적인 양을 의미한다. 항체 결정의 "치료학적 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도해내는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 항체의 임의의 독성 또는 유해 효과를 치료학적 유익 효과가 능가하는 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 달성하기에 필요한 시간 동안 투여량에서 효과적인 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질병 전이나 질병의 초기 단계에서 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
적당한 투여량은 표준 방법을 사용해서 쉽게 결정할 수 있다. 항체는 환자에게 1회 또는 일련의 치료로 적당하게 투여한다. 위에서 언급한 요인에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 50mg/kg, 예컨대 0.1 내지 20mg/kg의 항체는 1회 또는 그 이상의 분리 투여이든지 또는 연속 주입이든지 간에 환자에게 투여하는 초기 후보 투여량이다. 통상적인 1일 또는 주간 투여량은 병태에 따라 약 1㎍/kg 내지 약 20mg/kg 이상 범위일 수 있고, 치료는 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복한다. 하지만, 다른 투여량 체계가 유용할 수 있다. 일부 경우에, 제형은 재용해되었을 때 적어도 약 1g/L 이상의 항체 농도를 포함한다. 다른 양태에 따르면, 항체 농도는 재용해되었을 때 적어도 약 1g/L 내지 약 100g/L 범위이다.
항체의 결정, 또는 이러한 결정을 함유하는 제형은 단독으로 투여되거나 또는 약제학적 제제의 일부로서 투여할 수 있다. 이들은 비경구, 경우 또는 국소 경로로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구, 폐, 비강, 귀, 항문, 피부, 눈, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 점막, 설하, 피하, 경피, 국소 또는 두개내 경로로 투여되거나 또는 구강내로 투여할 수 있다. 투여 기술의 구체적 예는 폐 흡입, 병변내 적용, 바늘 주사, 무수 분말 흡입, 피부 전기침투, 에어로졸 전달 및 무바늘 주사 기술, 예컨대 무바늘 피하 투여를 포함한다.
이제, 본 발명은 이하 비제한적인 예시적 실시예를 통해 더 상세하게 설명될 것이다. 본 명세서의 개론적 부분의 도움을 받고 당업자의 일반적인 지식에 기초하면, 과도한 실험 없이 본 발명의 추가 양태를 제공할 수 있을 것이다.
[실시예]
실험 부분
A. 재료
a) 단백질
동결된 모노클로날 항체(mAb) D2E7은 애보트 레보러토리즈(Abbott Laboratories)에서 입수했다. 모든 실험은 초기 mAb 농도가 50mg/ml인 약품 로트를 사용해서 수행했다.
b) 정밀 화학물질
아세트산 나트륨은 그뤼싱 게엠베하(Grussing GmbH, Filsum)에서 입수했다. 여러 중합도의 폴리에틸렌글리콜은 클라리언트 게엠베하(Clariant GmbH, Sulzbach)에서 입수했다. 또한, 시판 결정화 스크린 및 시약(Hampton Research, Nextal Biotechnologies)은 특정 소규모 실험에 사용했다. 모든 다른 화학물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Steinheim) 또는 머크(Merck, Darmstadt)에서 입수했다.
B. 일반 방법
a) D2E7 약물의 해동
D2E7은 교반 수조, 25℃에서 해동시켰다.
b) 완충액 교환 - 방법 A
일정량의 D2E7 용액을 30kDa MWCO Vivaspin 20 농축기(Vivascience)에 피펫 주입했다. 이 단백질 샘플을 새로운 완충액으로 1:10의 비로 희석하고, 4℃, 5000xg(Sigma 4K 15 실험실 원심분리기)에서 원심분리하여 샘플의 용적을 다시 원래의 용적으로 만들었다. 희석/원심분리 단계를 한번 더 반복하여 원래 샘플 완충액의 1:100 희석물을 얻었다. 단백질 농도를 조정한 후, 용액을 0.2㎛ 주사기 여과 장치로 멸균 여과했다.
b) 완충액 교환 - 방법 B
일정량의 D2E7 용액을 SLIDE-A-LYZER 투석 카세트(Pierce Biotechnology Inc.)에 담았다. 이 투석 카세트를 선택된 완충액이 담긴 비이커에 놓고, 4℃에서 교반하에 하룻밤 동안 완충액 교환을 수행했다. 단백질 농도를 조정한 후, 용액을 0.2㎛ 주사기 여과 장치로 멸균 여과했다.
c) OD280 - 단백질 농도 측정
ThermoSpectronics UV1 장치를 사용해서 280nm 파장에서 1.39cm2mg-1의 흡광계수를 적용하여 단백질 농도를 평가했다. 이를 위해, 결정화 슬러리의 일정량을 14,000rpm에서 원심분리하고 상청액 중의 잔류 단백질 농도를 측정했다.
d) pH 측정
pH 측정은 Mettler Toledo MP220 pH 미터를 이용해서 수행했다. Inlab 413 전극과 Inlab 423 마이크로전극을 이용했다.
e) 결정화 방법
e1) 소규모 결정화 - 시팅 드랍 증기 확산 하이드라 II(Sitting drop vapor diffusion Hydra II)
최초의 결정화 스크린은 Hydra II 결정화 로봇과 Greiner 96 웰 플레이트(3 방울 웰, Hampton Research)를 사용하여 수행했다. 플레이트를 조립한 후, 웰을 클리어씰 필름(Hampton Research)으로 밀봉했다.
e2) 소규모 결정화 - 행잉 드랍 증기 확산(Hanging drop vapor diffusion)
행잉 드랍 증기 확산 실험은 VDX 플레이트(실란트 보유, Hampton Research) 및 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드(직사각형, Hampton Research) 또는 실리콘처리된 유리 커버 슬라이드(원형, Hampton Research)를 각각 사용해서 수행했다. 저장 용액을 제조한 후, 저장 용액 한 방울과 단백질 용액 한 방울을 커버 슬라이드 위에서 혼합하고, 이 커버 슬라이드를 뒤집어 웰을 밀봉해서 상기 방울이 저장소 위에 매달려 있도록 했다.
e3) 배치 결정화 - 방법 A (24웰 플레이트)
배치 결정화는 웰에서 동량의 결정화 완충액(500㎕)과 단백질 용액을 혼합해서 수행했다. 이어서, 수분 증발을 방지하기 위해 접착 테이프로 웰을 밀봉했다.
e4) 배치 결정화 - 방법 B (에펜도르프 반응 튜브)
배치 결정화는 단백질 용액과 동량의 결정화 완충액을 1.5mL 또는 2mL 에펜도르프 반응 튜브에서 혼합해서 수행했다.
e5) 배치 결정화 - 방법 C (팔콘 튜브, 교반)
배치 결정화는 단백질 용액과 동량의 결정화 완충액을 50mL 팔콘 튜브에서 혼합하여 수행했다. 튜브를 밀봉한 직후, 튜브를 실험실용 진탕기(GFL 3013 또는 GFL 3015)에 놓거나 또는 텀블링 교반했다. 이 방법을 사용함으로써, 샘플에 스터러를 넣지 않아도 되었다.
e6) 배치 결정화 - 방법 D (1 리터 폴리프로필렌 용기)
배치 결정화는 멸균된 1리터 폴리프로필렌 병에서 단백질 용액과 동량의 결정화 완충액을 혼합하여 수행했다. 용기는 밀봉한 직후, 교반 없이 주위 온도에 보관했다. 이 방법을 사용함으로써, 샘플에 스터러를 넣지 않아도 되었다.
f) SDS-PAGE
샘플은 단백질 농도를 8㎍/20㎕로 조정하여 제조했다. 샘플은 브로모페놀블루를 함유하는 SDS/Tris/글리세린 완충액으로 희석했다.
정성적 SDS PAGE 분석은 Invitrogen NuPage 10% Bis-Tris Gels, NuPage MES SDS 전개 완충액 및 Mark12 광범위 단백질 표준물질을 사용하여 수행했다. 샘플 20㎕를 겔 포켓에 피펫으로 주입했다. 겔을 전개시키고 아세트산/메탄올 시약으로 고정화한 후, 염색은 Novex Colloidal Blue Stain Kit를 이용하여 수행했다. 겔은 인비트로겐 Gel-Dry 건조 용액으로 건조시켰다.
g) 광학현미경
결정은 Zeiss Axiovert 25 또는 Nikon Labopot 현미경을 이용해서 관찰했다. 후자에는 편광 필터 세트와 JVC TK C1380 컬러 비디오 카메라가 장착되어 있었다.
h) SE-HPLC
D2E7 샘플의 응집 수준은 SE-HPLC로 평가했다. Dionex P680 펌프, ASI-100 오토샘플러 및 UVD170U 검출기를 사용했다. 응집된 종은 검증된 애보트 표준 프로토콜(CL16-PS-02, 아달리무맙 순도)을 적용하여 Amersham Bioscience Superose 6 10/300 GL 겔 여과 컬럼에 의해 단량체로부터 분리했다.
C. 증기 확산 결정화 실험
이하 실시예에 제시된 농도값은 두 용액을 혼합하기 전에 항체 용액과 저장 용액에 관한 초기 값이다.
모든 pH 값은 별다른 언급이 없는 한, 다른 물질, 예컨대 결정화제와 배합되기 전인 아세테이트 완충액 스톡의 pH를 의미한다.
모든 완충액 몰농도는 다른 언급이 없는 한, 일반적으로 빙초산을 이용해서 수행하는 pH 조정 전의 스톡 용액 중의 아세트산나트륨 농도를 의미한다.
실시예 1 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4000 용액 및 Milli Q 워터(완전 탈염처리되고 경우에 따라 사전증류된 것)를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000은 약 6w/v%부터 약 28w/v%까지 2%씩 변화시켰다. pH는 시종일관 약 5.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 2 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 단백질 농도에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 50mg/ml로 조정했다. 이 단백질 농도를 제외한 모든 공정 조건은 실시예 1과 동일했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 3 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 400 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 400은 약 30w/v%부터 약 40w/v%까지 2%씩 변화시켰다. pH는 시종일관 약 5.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 12웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 4 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 단백질 농도에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 50mg/ml로 조정했다. 이 단백질 농도를 제외한 공정 조건은 실시예 3과 동일했다.
결과: 평가된 12웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 5 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 PEG 10,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 400 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 10,000은 약 4w/v%부터 약 14w/v%까지 2%씩 변화시켰다. pH는 시종일관 약 5.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 12웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 6 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 단백질 농도에서 PEG 10,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 45 내지 55mg/ml, 바람직하게는 50mg/ml로 조정했다. 이 단백질 농도를 제외한 공정 조건은 실시예 5와 동일했다.
결과: 평가된 12웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 7 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 10,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 400은 약 32w/v%와 약 34w/v%였다. pH는 약 4.2, 4.7, 5.2, 5.7, 6.2 또는 6.7이었다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 8 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 단백질 농도 및 셋업에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 50mg/ml로 조정했다. 이 단백질 농도를 제외한 공정 조건은 실시예 7과 동일했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 9 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 400 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.025M, 0.05M, 0.075M, 0.15M, 0.2M 또는 0.25M로 사용했다. PEG 400은 약 32w/v%에서 약 34w/v%로 변화시켰다. pH는 약 5.7 또는 4.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 48웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 10 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 400/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 400 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.025M, 0.05M 또는 0.1M로 사용했다. PEG 400은 약 28w/v% 또는 약 30w/v%였다. pH는 약 5.2, 5.7, 6.2 또는 6.7이었다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 48웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 11 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 PEG 400 + PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000은 약 4w/v%부터 약 8w/v%까지 2%씩 변화시켰다. 이와 동시에, PEG 400을 약 24w/v%, 26w/v%, 28w/v% 또는 30w/v%의 농도로 PEG 4,000/아세테이트 용액에 첨가했다. pH는 시종일관 약 5.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 12 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 400 + PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.2인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000은 약 4w/v%부터 약 8w/v%까지 2%씩 변화시켰다. 이와 동시에, PEG 400을 약 30w/v%, 32w/v%, 34w/v% 또는 36w/v%의 농도로 PEG 4,000/아세테이트 용액에 첨가했다. pH는 시종일관 약 4.2였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 24웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 13 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5 또는 4.0인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000은 약 4w/v%부터 약 26w/v%까지 2%씩 변화시켰다. 사용된 아세테이트 완충액의 pH는 상응하는 단백질 완충액과 동일했다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕는 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 30일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 14 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
실험 조건은, 아세테이트 완충액 몰농도를 약 0.2M(침전 완충액의 몰농도)로 일정하게 유지시킨 것을 제외하고는 실시예 13과 동일했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 15 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
실험 조건은, 아세테이트 완충액 몰농도를 약 0.1M(침전 완충액의 몰농도)로 일정하게 유지시킨 것을 제외하고는 실시예 13과 동일했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 16 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
실험 조건은, 아세테이트 완충액 몰농도를 약 0.4M(침전 완충액의 몰농도)로 일정하게 유지시킨 것을 제외하고는 실시예 13과 동일했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 17 - PEG 4,000/아세트산나트륨 벌크 실험
D2E7은 pH 약 5.5에서 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
4개의 각각 500㎕ 일정량을 4개의 에펜도르프 반응 튜브에 피펫 주입했다. 이 단백질 용액에 pH 5.5의 0.1M 아세트산나트륨 완충액 중의 24% PEG 4,000 용액을 용액이 약간 불투명해질 때까지 단백질 용액에 대해 적정했다. 이어서, 용액이 다시 투명해질 때까지 용액에 물을 첨가했다. 이 방법은 벌크 결정화라고 불린다. 적정은 2개의 샘플에 대해서는 주위 온도에서 수행하고 다른 2개의 샘플에 대해서는 4℃에서 수행했다. 이어서, 샘플의 각 쌍 중에서 하나씩은 주위 온도 또는 4℃에서 보관했다. 그 이후 주 동안 샘플 1㎕ 일정량을 여러번 현미경 검사했다.
결과: 4개의 샘플에서는 결정이 관찰되지 않았다.
실시예 18 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 온도에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
실험 조건은 실시예 13과 동일했다. 하지만, 튜브를 셋업하여 4℃에 보관했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 19 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 단백질 농도에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
단백질 농도를 5mg/ml로 조정한 것 외에 실험 조건은 실시예 13과 동일했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 20 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 황산암모늄 /아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.5인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 황산암모늄 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, 황산암모늄 농도는 0.5M부터 2.5M까지 0.25M씩 변화시켰다. 아세테이트 완충액의 pH는 시종일관 약 5.5였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕를 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트를 셋업하여 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 2주 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 18웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 21 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 염화나트륨/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.5인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 염화나트륨 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 1.5M부터 2.5M까지 0.5M씩 변화시켰다. 아세테이트 완충액의 pH는 시종일관 약 5.5였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕를 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트를 셋업하여 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 2주 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 6웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 22 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 세제 영향에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.5인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000은 약 10w/v%부터 약 20w/v%까지 2%씩 변화시켰다. 아세테이트 완충액의 pH는 시종일관 약 5.5였다. 또한, 전술한 바와 같이 수득되는 임의의 완충액에 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 플루로닉 F 68을 각각 0%, 0.02% 및 0.1%의 농도로 첨가했다. 단백질 용액 약 1㎕를 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트를 셋업하여 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 2주 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 84웰에서 결정은 관찰되지 않았다. 평가된 세제는 결정화 시스템의 작용에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
실시예 23 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 아세트산아연 /아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH가 약 5.5인 약 0.1M 아세트산나트륨을 함유하는 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 아세트산아연 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, 아세트산아연 농도는 0.1M부터 0.9M까지 약 0.2M씩 변화시켰다. 아세테이트 완충액의 pH는 시종일관 약 5.5였다. 각 조건은 이반복으로 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕를 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트를 셋업하여 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 2주 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 12웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 24 - 증기 확산 방식에서 조건의 광범위 스크리닝
D2E7은 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액(pH 7.4)으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml, 10mg/ml 또는 20mg/ml로 조정했다.
Hydra II 결정화 로봇을 사용하여 96웰 그라이너 플레이트를 여러 시판되는 결정화 스크린을 이용하여 주위 온도에서 셋업했다. 단백질 용액과 결정화제는 약 1:1의 비, 바람직하게는 1:1로 혼합했다.
다음과 같은 스크린을 사용했다:
Hampton Crystal Screen 1&2(Hampton Research),
Hampton Index Screen(Hampton Research),
Hampton SaltRX Screen(Hampton Research),
Nextal The Classics, The Classics Lite, The PEGs, The Anions, The pH clear and The Ammonium sulfate(모두 Nextal Biotechnologies 제품).
단백질을 결정화 시약에 첨가한 후(전술한 바와 같이 3가지 다른 단백질 농도를 함유하는, 조건당 세 방울), 플레이트를 클리어씰 필름으로 밀봉했다. 각 플레이트를 4반복으로 셋업한 뒤, 주위 온도, 4℃, 27℃ 및 37℃에서 각각 보관했다. 5일과 12일 후에 각각 방울의 현미경검사를 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 864가지 상용 조건 중에서 2가지 조건만 적어도 2주 후에 이하에 정의된 바와 같은 단백질 농도와 온도에서 결정을 제공했다.
- 0.1M 아세트산나트륨 무수물 pH 4.6, 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트(= Nextal The Anions, E3), 10 또는 20mg/ml 및 27℃, 또는 20mg/ml 및 37℃.
- 0.1M Bis-Tris 프로판 pH 7.0, 1.5M 황산암모늄(= Hampton SaltRX, F2), 5, 10 또는 20mg/ml 및 27℃.
결정은 바늘 클러스터형 형태를 나타냈다.
시판되는 스크린 사용시 다음과 같은 조건은 결정을 제공하지 못했다. 상세한 용액 조성은 www.hamptonresearch.com 및 www.nextalbiotech.com을 참조한다.
Hampton Crystal Screen 1 - 모든 조건(48)
Hampton Crystal Screen 2 - 모든 조건(48)
Hampton Index Screen - 모든 조건(96)
Hampton SaltRX Screen - "F2"에도 불구하고 모든 조건(95)
Nextal - The Classics - 모든 조건(96)
Nextal - The Classics Lite - 모든 조건(96)
Nextal - The PEGs - 모든 조건(96)
Nextal - The Anions - "E3"에도 불구하고 모든 조건(95)
Nextal - The pH Clear - 모든 조건(96)
Nextal - The AmmoniumSulfate - 모든 조건(96)
실시예 25 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 셋업에서 PEG 4,000/아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml, 10mg/ml 또는 20mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000 농도는 약 4%부터 약 26%까지 2%씩 변화시켰다. pH는 시종일관 약 5.5였다. 각 조건은 전술한 바와 같은 3가지 단백질 농도로 셋업했다. 단백질 용액 약 1㎕는 원형 실리콘처리된 유리 커버 슬라이드에서 약 1㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 6일 후 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 72웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 26 - 햄프턴 세제 스크린을 적용한 행잉 드랍 증기 확산 실험
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 50w/v% PEG 4,000 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액의 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시켰고, PEG 4,000 농도는 약 12w/v 또는 14w/v%였다. pH는 시종일관 약 5.5였다. 단백질 용액 약 4㎕를 원형 실리콘처리된 유리 커버 슬라이드에서 햄프턴 스크린의 특정 세제 용액 약 1㎕와 혼합했다. 이어서, 방울을 약 5㎕의 특정 저장 용액과 혼합했고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 6일 후 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 144웰에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 27 - 햄프턴 PEG /이온 스크린을 이용한 행잉 드랍 증기 확산
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml 또는 10mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드를 사용했다. 48개의 완충액 제형을 각각 500㎕씩 웰에 피펫 주입하고 Milli Q 워터 250㎕와 각각 혼합했다. 단백질 샘플 약 1㎕를 커버 슬라이드 위에 피펫팅하고 이어서 특정 웰의 저장 용액 약 1㎕와 혼합했다. 이 웰을 뒤집은 커버 슬라이드로 봉인해서 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 7일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 검사된 96가지 조건에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 28 - 햄프턴 PEG /이온 스크린, 여러 셋업을 이용한 행잉 드랍 증기 확산
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml로 조정했다.
실험 조건은 48개의 완충액 제형을 각각 500㎕씩 웰에 피펫 주입하고 Milli Q 워터 500㎕와 각각 혼합한 것을 제외하고는 실시예 27과 동일했다.
결과: 검사된 48가지 조건에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 29 - 햄프턴 저이온 농도 스크린을 이용한 행잉 드랍 증기 확산
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드를 사용했다. 24w/v% PEG 3,350 탈수제 용액 1ml를 108 웰에 각각 피펫주입했다. 단백질 샘플 약 2㎕를 커버 슬라이드 위에 피펫팅하고 약 1㎕의 18개의 특별 완충액 시약 중 하나와 혼합했다. 그 후, 6가지 다른 농도의 하나의 PEG 3,350 침전제 약 2.5㎕를 방울에 첨가했다. 뒤집은 커버 슬라이드로 웰을 봉인하여 108개의 다른 행잉 드랍 실험을 조성했다.
플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 7일 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 검사된 108가지 조건에서 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 30 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 황산암모늄 / 비스 - 트리스 프로판 격자 스크린
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml, 10mg/ml 또는 20mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 황산암모늄 스톡 용액, 비스-트리스 프로판 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 황산암모늄 몰농도는 약 0.5M, 1M, 1.5M 또는 2M이었다. 비스-트리스 프로판 몰농도는 시종일관 0.1M이었고, 비스-트리스 프로판 완충액 pH는 약 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 또는 8.0이었다. 수득되는 24가지 조건을 전술한 바와 같은 3가지 단백질 농도 모두를 이용해서 주위 온도에서 보관하거나 또는 약 27℃에서 보관하여 평가했다. 단백질 용액 약 1㎕를 원형 규소처리된 유리 커버 슬라이드 위에서 특정 저장 용액 약 1㎕와 혼합하고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인하여 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 3일 후에 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 검사된 144가지 조건에서 3일 후 결정은 관찰되지 않았다.
실시예 31 - 행잉 드랍 증기 확산 방식에서 나트륨 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 격자 스크린
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml, 10mg/ml 또는 20mg/ml로 조정했다.
그리스처리된 VDX 플레이트와 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드를 사용했다. 특정 저장 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 각 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 약 0.1M로 일정하게 유지시키고 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1, 4.6, 5.1 또는 5.6이었다.
나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 칼륨 디하이드로겐 포스페이트의 다음과 같은 조합을 적용했다:
- 약 0.3M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 및 약 0.3M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트;
- 약 0.6M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 및 약 0.6M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트;
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 및 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트;
- 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 약 2.1M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 약 2.4M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트.
각 조건은 전술한 바와 같은 3가지 단백질 농도로 셋업했다. 단백질 용액 약 1㎕를 직사각형 OptiClear 플라스틱 커버 슬라이드 위에서 특정 저장 용액 약 1㎕와 혼합하고, 뒤집은 슬라이드로 웰을 봉인하여 행잉 드랍 실험을 조성했다. 플레이트는 주위 온도에서 보관했다. 방울의 현미경검사는 이후 한 달 동안 여러번 수행했다. 상태는 투명 방울, 임의의 침전물을 함유하는 방울, 결정을 함유하는 방울 및 침전물 종과 결정의 혼합물을 함유하는 방울로 분류했다.
결과: 평가된 72가지 조건에서 다음과 같은 결정화 완충액이 바늘 클러스터형의 결정을 형성시켰다:
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 및 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1;
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.6
이러한 조건 하에 3가지 단백질 농도 모두에서 결정이 수득되었다.
실시예 32 - 행잉 드랍 증기 확산 방식, 여러 온도에서 나트륨 칼륨 디하이드로겐 포스페이트/아세트산나트륨 격자 스크린
실험 조건은 저장 온도를 30℃로 증가시킨 것을 제외하고는 실시예 31과 동일했다.
결과: 평가된 72웰에서 다음과 같은 결정화 완충액은 바늘 클러스터형의 결정을 형성시켰다:
약 5mg/ml의 단백질 농도:
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1.
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1.
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.6.
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 5.1.
약 10mg/ml의 단백질 농도:
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1.
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.6.
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 5.1.
약 20mg/ml의 단백질 농도:
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1 및
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1.
증기 확산 결정화 실험 결과의 고찰:
결정화 실험은 처음에는 공지된 소규모 방법을 이용해서 수행했다. 다른 항원 특이성 또는 기원의 여러 항체를 다루는 다른 발명자들은 유망한 결정화 용액으로 PEG 4,000/아세트산나트륨 완충액 조건을 기술한 바 있기 때문에 이 제제를 이용해서 실험을 시작하기로 결정했다. 예의 실험 결과, 아세테이트 완충액 중의 PEG 4,000은 결정화에 영향을 미치는 요인들(단백질 농도, 침전제 농도, 완충액 이온 농도 및 pH, 온도) 중 적어도 조사된 조합에서 결정을 제공하지 못했고, 이에 따라 계속해서 광범위 결정화 스크린으로 실험하기로 결정하여, 스크리닝 공정에 다양한 화학성분을 도입했다. 결국, 아세테이트 완충액 중의 나트륨 디하이드로겐 포스페이트가 D2E7의 강력한 결정화제이며, 이는 약제학적 관점에서 허용되지 않는 어떠한 독성 시약도 아니라는 놀라운 결과를 발견했다.
D. 배치 결정화 실험
다음 실시예에 주어진 농도 값은 두 용액을 혼합하기 전의 항체 용액과 결정화 용액에 관한 초기 값이다.
모든 pH 값은 별다른 언급이 없다면 결정화제와 같은 다른 물질과 배합되기 전의 아세테이트 완충액 스톡 용액의 pH를 의미한다.
모든 완충액 몰농도는 다른 언급이 없다면 보통 빙초산으로 수행하는 pH 조정 전의 스톡 용액의 아세트산나트륨 농도를 의미한다.
실시예 33 - 800㎕ 배치 용적에서 나트륨 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 5mg/ml, 10mg/ml 또는 20mg/ml으로 조정했다.
배치 결정화는 1.5ml 에펜도르프 반응 튜브에서 각 단백질 용액 약 400㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 400㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 다음과 같은 배합의 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 칼륨 디하이드로겐 포스페이트를 사용했다: 약 0.9M 나트륨디하이드로겐 포스페이트와 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트. 반응 튜브는 주위 온도에서 보관했다. 1㎕ 일정량의 현미경검사는 11일 후에 수행했다.
결과: 11일 후 관찰되는 결정은 없었다.
실시예 34 - 600㎕ 배치 용적에서 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml으로 조정했다.
배치 결정화는 1.5ml 에펜도르프 반응 튜브에서 단백질 용액 약 300㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 300㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 각각 약 1.5M, 1.8M, 2.1M 및 2.4M이었다. 반응 튜브는 주위 온도에서 보관했다. 1㎕ 일정량의 현미경검사는 11일 후에 수행했다.
결과: 11일 후 관찰되는 결정은 없었다.
실시예 35 - 1 mL 배치 용적에서 나트륨 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 격자 스크린 배치 결정화
D2E7은 완충액을 교환하지 않고 사용했다. 즉, 초기 조성물은 D2E7 50mg/ml, 만니톨 12mg/ml, 폴리소르베이트 80 1mg/ml, 시트르산 일수화물 1.305mg/ml, 시트르산나트륨 0.305mg/ml, 디나트륨 하이드로겐 포스페이트 이수화물 1.53mg/ml, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 탈수제 0.86mg/ml 및 염화나트륨 6.16mg/ml, pH 5.2였다.
D2E7은 Milli Q 워터로 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1, 4.6, 5.1 또는 5.6이었다. 다음과 같은 배합의 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 칼륨 디하이드로겐 포스페이트를 사용했다:
- 약 0.7M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.7M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 약 0.9M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.9M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 칼륨염 없이 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 칼륨염 없이 약 2.1M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 칼륨염 없이 약 2.4M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트.
결정화 혼합물의 제조 후 수분 증발을 방지하기 위해 웰을 밀봉했다. 플레이트의 현미경검사는 4일 후에 수행했다.
결과: 4일 후 관찰되는 결정은 없었다.
실시예 36 - 1 mL 배치 용적에서 나트륨 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 격자 스크린 배치 결정화
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml으로 조정했다.
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1 또는 4.6이었다. 다음과 같은 배합의 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 칼륨 디하이드로겐 포스페이트를 사용했다:
- 약 1.8M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.8M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 약 2.2M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트와 약 0.6M 칼륨 디하이드로겐 포스페이트,
- 각각 칼륨염 없이 약 2.6M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트부터 약 4.4M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트까지 0.2M 간격으로.
결정화 혼합물의 제조 후 수분 증발을 방지하기 위해 웰을 밀봉했다. 플레이트의 현미경검사는 그 다음 주 동안 여러번 수행했다. 또한, 3 배치의 결정 수율은 OD280으로 측정했다. 일정량의 현탁액은 14,000rpm에서 원심분리하고 상청액 중의 단백질 농도를 측정했다.
결과: 다음과 같은 8개의 배치에서 바늘 클러스터형 결정이 관찰되었다:
- 아세테이트 완충액 pH 4.1 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 3.6M 내지 약 4.4M(0.2M 간격으로),
- 아세테이트 완충액 pH 4.6 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 4.0M 내지 약 4.4M(0.2M 간격으로).
결정 수율은 배치마다 아세테이트 완충액 pH 4.1과 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 4.0M 내지 약 4.4M로 평가했다. 상청액 중의 잔류 단백질 농도로부터 OD280에 의해 측정된 결정 수율은 5일 후 95% 이상이었다.
침전물 종은 단백질 용액과 결정화 용액을 배합한 직후에 상기 배치들에 분명하게 존재했다(우유빛 현탁액, 전형적인 광학현미경 영상). 5일 후 관찰되는 침전물 종은 없었는 바, 앞서 침전된 종이 결정형 종으로 재배열된 것으로 결론지었다. 단백질은 결정화 혼합물에서 매우 과포화되어 있으며, 단백질은 즉시 침전한다. 일부 단백질은 여전히 용해되어 있거나, 이제 약간만 과포화되어 있거나 또는 심지어 포화 미만일 수 있다. 결정이 형성되어, 용해된 단백질의 농도가 더 낮아졌다. 또한, 침전된 종은 시간이 경과함에 따라 분명히 재용해되어 성장 결정에 혼입된다.
실시예 37 - 1 mL 배치 용적에서 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 격자 스크린 배치 결정화
D2E7은 완충액 교환없이 사용했다(실시예 35 참조).
D2E7은 Milli Q 워터로 액체를 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1 또는 4.6이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 약 2.6M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트부터 약 4.4M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트까지 0.2M씩 변화시켰다. 웰은 결정화 혼합물의 제조 후 수분 증발을 방지하기 위해 밀봉했다. 플레이트의 현미경검사는 그 다음 주 동안 여러번 수행했다. 또한, 특별한 한 배치의 결정 수율은 OD280으로 측정했다. 일정량의 현탁액은 14,000rpm에서 원심분리하고 상청액 중의 단백질 농도를 측정했다.
결과: 다음과 같은 6개의 배치에서 바늘 클러스터형 결정이 관찰되었다:
- 아세테이트 완충액 pH 4.1 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 3.6M 내지 약 4.4M(0.2M 간격으로).
결정 수율은 아세테이트 완충액 pH 4.1 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 4.2M인 배치에서 평가했다. 상청액에 존재하는 잔류 단백질 농도로부터 OD280에 의해 측정된 결정 수율은 8일 후에 95% 이상이었다.
침전물 종은 단백질 용액과 결정화 용액을 배합한 직후 상기 배치들에 분명하게 존재했다(우유빛 현탁액, 전형적인 광학현미경 영상). 6일 후 관찰되는 침전물 종은 없었는바, 앞서 침전된 종이 결정형 종으로 재배열된 상 전이가 일어난 것으로 결론지었다.
실시예 38 - 2 mL 배치 용적에서 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7은 pH 7.4인 20mM HEPES/150mM 염화나트륨 완충액으로 완충처리했다. 단백질 농도는 10mg/ml으로 조정했다.
배치 결정화는 2mL 에펜도르프 반응 튜브에서 단백질 용액 약 1ml를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 1ml는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 약 4.0M, 4.2M 또는 4.4M이었다. 반응 튜브는 주위 온도에서 보관했다. 1㎕ 일정량의 현미경검사는 그 다음 주에 여러번 수행했다.
결과: 바늘 클러스터형 결정이 6일 후 모든 배치에서 관찰되었다.
침전물 종은 단백질 용액과 결정화 용액을 배합한 직후에 상기 배치들에 분명하게 존재했다(우유빛 현탁액, 전형적인 광학현미경 영상). 실시예 36에서 기술한 바와 같이 앞서 침전된 종은 결정형 종으로 재배열되었다.
실시예 39 - 1 mL 배치 용적, 여러 단백질 농도에서 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 격자 스크린 배치 결정화
D2E7은 완충액 교환없이 사용했다(실시예 35 참조).
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 약 0.2M부터 약 4.4M까지 0.2M씩 변화시켰다. 웰은 결정화 혼합물의 제조 후 수분 증발을 방지하기 위해 밀봉했다. 플레이트의 현미경검사는 그 다음 주 동안 여러번 수행했다. 또한, 배치의 결정 수율은 OD280으로 측정했다. 일정량의 현탁액은 14,000rpm에서 원심분리하고 상청액 중의 단백질 농도를 측정했다.
결과: 다음과 같은 2개의 배치에서 바늘 클러스터형 결정이 관찰되었다:
- 약 3.4M 및 약 3.6M의 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도.
침전물 종 및 유성 침전상이 또한 이 결정 함유 배치에 존재했다.
실시예 40 - 20 mL 배치 용적, 교반 하에서 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7은 완충액 교환없이 사용했다(실시예 35 참조).
D2E7은 Milli Q 워터로 액체를 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 50ml 팔콘 튜브에서 단백질 용액 약 10ml를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 결정화 용액 10ml는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 튜브에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 4.2M이었다. 튜브는 실험실용 진탕기에서 배치를 진탕시키면서 주위 온도에 보관했다. 이 용액의 1㎕ 일정량의 현미경검사는 그 다음 달 동안 여러번 수행했다.
결과: 이 배치에서 침전물이 관찰되었다.
실시예 41a - 100 mL 배치 용적에서 교반 없이 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 /아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7은 완충액 교환없이 사용했다(실시예 35 참조).
D2E7은 Milli Q 워터로 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 깨끗한 1L 폴리프로필렌 병에서 단백질 용액 약 50ml를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 결정화 용액 50ml는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 튜브에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고, 아세테이트 완충액 pH는 약 4.1이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 4.2M이었다. 용기는 주위 온도에서 보관했다. 이 용액의 1㎕ 일정량의 현미경검사는 그 다음 달 동안 여러번 수행했다.
결과: 7일 후에 바늘 클러스터형 결정이 관찰되었다. 결정 수율은 상청액에 남은 단백질 농도로부터 OD280으로 측정했을 때 7일 후에 95% 이상이었다.
침전된 종은 단백질 용액과 결정화 용액을 배합한 직후에 이 배치에서 관찰되었다(우유빛 현탁액, 전형적인 광학 현미경 영상). 7일 후에는 침전된 종이 관찰되지 않았으므로, 이전 침전된 종이 결정형 종으로 재배열되어 상 전이가 일어난 것으로 결론지었다.
실시예 41b - 1 mL , 50 mL 및 10L 배치 용적에서 교반 없이 나트륨 디하이드로겐 포 스페이트/아세트산나트륨 배치 결정화
D2E7의 대량 결정화 역시 아달리무맙 시판 완충액 제형 pH 5.2 중의 50mg/ml D2E7(실시예 35 참조) 1L와 주사용수(WFI) 4L를 10L 폴리프로필렌 용기(Nalgene®)에서 배합하여 수행했다. 이 용액은 완만한 진탕으로 균질화시켰다. 이 D2E7 용액(10mg/ml) 5L를 그 다음 침전제 용액(5M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, 4,400ml, 1M 나트륨아세테이트 완충액, pH 4.1, 500ml, WFI(Ampuwa), 100ml) 5L와 혼합했다. 침전제 용액은 500ml씩 첨가했다. 각 분취량을 첨가한 후, 용액은 병을 완만하게 회전/역위시켜 균질화시켰다. 침전제 용액 약 2,500 내지 3,000ml를 첨가한 후, 백색 침전물이 나타났다. 남은 침전제는 한번에 모두 첨가했다. 그 다음 결정 제조물을 다시 균질화시켰다(완만한 회전/역위).
배치 제조 직후(즉, 5L D2E7 용액과 5L 침전제를 혼합한 후), 1ml(소량 에펜도르프 샘플 바이알 주입용) 및 50ml 분취량(50ml 팔콘 샘플 튜브 주입용)을 뽑아 대조용으로 및 D2E7 결정화에 미치는 배치 크기의 영향의 평가용으로 10L 용기 부근에 보관했다. 도 2 내지 4에 개략된 바와 같이, 배치 용적(즉, 1ml, 50ml 및 10L 각각)은 D2E7 결정 바늘/바늘 클러스터 크기에 아무런 영향도 미치지 않았다.
배치 결정화 실험 결과의 고찰:
적용된 소규모 기술(상기 섹션 D 참조)이 대규모 단백질 결정 생산에 적합하지 않은 바, 상기 소규모 방법에서 발견한 결정화 조건을 확대축소가 가능한 배치 방식에 전가시켰다.
D2E7은 마침내 높은 수율(>95%)과 재현성으로 100ml 배치 용적에서 성공적으로 결정화되었고, 이는 이 결정화 시스템이 산업 공정에도 적용할 수 있음을 시사한다. SDS-PAGE 분석으로 결정의 단백질 특성을 증명했다. 재용해된 결정의 SE-HPLC 분석은 응집된 종의 미량 증가만을 나타냈다. 결정의 세척은 나트륨 디하이드로겐 포스페이트를 함유하는 아세테이트 완충액, 즉 약 0.1M 아세트산나트륨 중의 약 4.2M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, pH 약 4.1을 사용하여 가능했다. 이러한 세척 완충액에서 D2E7 결정의 용해성은 OD280으로 분석했을 때 측정할 수 없었으며, 이는 결정의 90% 이상의 회수를 나타낸다.
상기 배치 실험의 실험 조건은 이하 표 1에 정리했다:
[표 1]
Figure pat00001

E. 결정 가공 및 분석 방법
실시예 42 - 결정 세척
결정의 형성 후, 결정의 재용해가 없는 세척 단계가 바람직하다. 따라서, 결정화 공정이 완료된 후, 결정 슬러리는 원심분리관으로 옮겨 500 내지 1000 x g에서 20분 동안 원심분리했다. 원심분리는 4℃에서 수행했지만, 다른 적당한 온도, 예컨대 실온에서 수행할 수도 있다. 원심분리 후, 상청액은 버리고, 결정 펠릿은 pH 4.1인 약 0.1M 아세트산나트륨 중의 약 4.2M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트를 함유하는 완충액에 재현탁시켰다. 세척 완충액에서 D2E7 결정의 용해성은 OD280으로 분석했을 때 측정할 수 없었다. 원심분리/재현탁 단계는 이어서 1 내지 3회 반복했고, 이 세척 절차 이후, 펠릿은 pH 약 4.1인 약 0.1M 아세트산나트륨 중의 약 4.2M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트를 함유하는 완충액에 보관했다.
실시예 43 - SDS - PAGE 에 의한 결정 분석
결정의 단백질 특성을 증명하기 위해, 결정은 실시예 42에 기술한 바와 같은 세척 완충액으로 세척했다. OD280으로, 원심분리 후 상청액에는 용해된 단백질이 더 이상 존재하지 않는 것으로 확인한 후, 상청액을 버리고 결정을 다시 증류수에 용해했다. 이 용액의 OD280 측정은, 샘플의 흡광도가 잔류 세척 완충액에서만큼 현저히 높았기 때문에, 결정이 대부분 단백질로 이루어져 있음을 나타냈다. 재용해된 결정의 용액에 대한 SDS-PAGE 분석은 초기 D2E7 샘플과 비교했을 때 동일한 패턴을 나타냈다.
F. 기타 실시예
이하 실시예에 제시된 농도 값은 두 용액을 혼합하기 전의 항체 용액과 결정화 용액에 관한 초기 값이다.
모든 pH 값은 별다른 언급이 없다면 결정화제와 같은 다른 물질과 배합되기 전의 아세테이트 완충액 스톡 용액의 pH를 의미한다.
모든 완충액 몰농도는 다른 언급이 없다면 보통 빙초산으로 수행하는 pH 조정 전의 스톡 용액의 아세트산나트륨 농도를 의미한다.
실시예 44 - 고체 결정화제
D2E7은 완충액 교환없이 사용했다(실시예 35 참조).
D2E7은 Milli Q 워터로 액체를 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 아세테이트 완충액(0.1M, pH 4.1 또는 4.6, 각각)과 혼합하여 수행했다. 이어서, 고체 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 이수화물을 각 pH 셋팅에 6가지 다른 비율로 첨가했다: 약 0.23g, 0.27g, 0.30g, 0.33g, 0.36g 및 0.39g. 따라서, 결정화제의 완전한 용해 후, 농도는 0.2M 간격으로 약 1.5M 내지 2.5M이었다. 이어서, 웰은 밀봉하고 플레이트는 결정화제가 완전하게 용해될 때까지 실험용 진탕기에서 진탕시켰다. 그 후, 24웰 플레이트는 진탕 없이 주위 온도에서 보관했다. 플레이트의 현미경검사는 5일 후에 수행했다.
결과: 바늘 클러스터형 결정은 다음과 같은 7가지 배치에서 발견되었다:
- 아세테이트 완충액 pH 4.1 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 2.1M, 2.3M 및 2.5M 각각.
- 아세테이트 완충액 pH 4.6 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 1.9M, 2.1M, 2.3M 및 2.5M 각각.
실시예 45 - 여러 완충액 제조 프로토콜 및 결정 제조
본 실시예에서 아세테이트 완충액은 다음에 기술하는 바와 같이 제조했다: 빙초산 3g을 약 42ml의 정제수로 희석했다. pH는 수산화나트륨 용액으로 조정하고 용적은 50ml로 조정했다. 이 경우에, 총 아세테이트 양은 1M로 고정되었고(결정화 용액 중 100mM, 또는 결정화 혼합물 중 50mM) pH 조정에 의해 증량되지 않았다.
D2E7은 완충액 교환 없이 사용했다(실시예 35 참조).
D2E7은 Milli Q 워터로 액체를 희석하여 약 10mg/ml의 농도로 만들었다.
배치 결정화는 24웰 플레이트의 웰에서 단백질 용액 약 500㎕를 동량의 결정화 용액과 혼합하여 수행했다. 특정 결정화 용액 500㎕는 아세테이트 완충액, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 스톡 용액 및 Milli Q 워터를 웰에서 혼합하여 제조했다. 이 실시예에서, 아세테이트 완충액 몰농도는 0.1M이고 아세테이트 완충액 pH는 각각 약 4.1 및 4.6이었다. 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도는 약 3.4M부터 약 4.4M까지 0.2M씩 변화시켰다. 이어서 웰은 결정화 혼합물을 제조한 후 수분 증발을 방지하기 위해 밀봉했다. 플레이트의 현미경검사는 5일 후에 수행했다.
결과: 바늘 클러스터형 결정은 다음과 같은 9개의 배치에서 발견되었다:
- 아세테이트 완충액 pH 4.1 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 3.6 내지 4.4M, 0.2M 간격으로.
- 아세테이트 완충액 pH 4.6 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 몰농도 약 3.6 내지 4.2M, 0.2M 간격으로.
실시예 46 - 봉입된 결정의 제조
실시예 41에서 수득된 결정은 Malvern Instruments Zetasizer nano를 사용한 제타 전위 측정을 통해 측정된 바와 같이 양전하를 띤다.
이 결정을, 결정도를 보존하는 부형제를 함유하고 하전을 띤 결정을 유지시키는 pH인 완충액으로 세척하고 현탁시켰다. 이어서, 적당한 봉입화제를 결정 현탁액에 첨가했다. 이 상황에서, 적당한 봉입화제는 독성이 낮고 생분해성이며 반대 이온 특성을 보유한 물질(중합체)이다. 이러한 반대이온 특성 때문에 이 물질은 결정에 유인되고 코팅을 허용한다. 이러한 기술에 의해, 결정도를 유지시키는 어떤 다른 부형제도 함유하지 않는 매질 중의 결정의 용해가 지속되는 것이 바람직하다.
실시예 47 - 봉입/ 포매된 결정 제조
결정은 실시예 41에 기술된 바와 같이 수득했다.
결정은 결정도를 보존하는 부형제 함유 완충액으로 세척하고 현탁시켰다.
이어서, 결정은,
- 결정을 건조시키고, 이렇게 건조된 결정을 담체와 압축, 융융 분산 등에 의해 배합함으로써 포매될 수 있다.
- 결정 현탁액을 물과 비혼화성인 담체 용액과 배합하여 봉입/포매시킬 수 있다. 담체는 담체의 용매의 제거 후 침전한다. 이어서, 물질을 건조시킨다.
- 결정 현탁액을 물과 혼화성인 담체 용액과 배합하여 봉입/포매시킬 수 있다. 담체는 그 용해성 한계가 혼합물에서 초과할 때 침전한다.
- 건조된 결정 또는 결정 현탁액을 물과 혼화성인 담체 용액과 배합하여 포매시킬 수 있다.
- 건조된 결정을 물과 비혼화성인 담체 용액과 배합하여 포매시킬 수 있다.
G. 결정 특성규명
이하 섹션에서는 결정형 모노클로날 항체 D2E7이 결정형 물질의 재용해시에 비결정형 D2E7의 생물활성 특징을 유지하는지를 측정하기 위해 수행한 실험을 정리했다.
G1 . 쥐 L-929 세포를 이용한 생물활성 검사
a) 일반 방법
재조합 사람 TNF(rHuTNF)의 세포독성 효과에 대한 D2E7 용액의 중화 효과가 측정되었다. 이것은 96웰 미세역가 플레이트에서 지시자로서 마우스 L-929 세포를 다양한 D2E7 농도의 존재 하에 정해진 양의 rHuTNF와 37℃에서 48시간 동안 항온배양하는 것을 수반했다. 생존 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 색의 강도는 미세역가 플레이트의 각 웰에서 분광법으로 측정하고 평가되었다. IC50, 즉 L-929 세포에 미치는 rHuTNF의 세포독성 효과를 감소시켜 세포의 50%가 생존하도록 하는 D2E7의 농도를 측정했다.
별도의 희석 박스에서 1㎍ 단백질/ml 희석율부터 시작해서 9개의 역가 곡선 측정점(곡선 희석물)을 샘플과 참조 표준물질에 대해 희석 튜브에 각각 제조했다.
사용되는 L-929 세포 현탁액은 배지로 60,000 세포/ml의 농도로 희석했다. 이어서, 각 세포 농도를 웰당 100㎕씩 시험 플레이트의 종렬 1 내지 11에 피펫팅했다. 12열의 웰에는 각각 100㎕의 배지만을 주입했다. 항온배양은 시험 플레이트에서 37℃, 5%(v/v) CO2 에서 24시간 동안 수행했다.
24시간 항온처리 후, 9개의 역가 곡선 희석물을 각각 50㎕씩 희석 박스로부터 참조 표준물질 또는 샘플용 시험 플레이트, 즉 참조 표준물질은 종렬 1 내지 9의 횡렬 A-D의 웰로, 샘플은 종렬 1 내지 9의 횡렬 E-H의 웰로 전달했다.
종렬 10에는 배지 50㎕를 피펫팅하고, 종렬 11과 12에는 각각 100㎕씩 피펫팅했다.
종렬 1 내지 10, 횡렬 A 내지 H의 웰에는 TNF 참조 표준물질(12.5ng 단백질/배지 ml) 50㎕를 첨가했고, 이로써 종렬 10은 100% 용해값에 상응했다 (TNF 대조군).
종렬 11은 100% 성장 대조군이고, 종렬 12는 어떠한 세포 물질도 첨가하지 않아서 블랭크로 작용했다. 웰당 최종 용적은 200㎕였다.
시험 플레이트의 항온처리는 37℃, 5% CO2 하에 48시간 동안 수행했다. 2일 동안 항온처리한 후, 시험 플레이트 웰의 액체는 빠르게 변해서 1회 강력 하향 교반을 수행하여 제거했다. 그 다음, 크리스탈 바이올렛 용액(0.75% 크리스탈 바이올렛, 0.35% 염화나트륨, 32.4% 에탄올 및 8.6% 포름알데하이드) 50㎕를 각 웰에 피펫팅했다. 이 용액을 웰에서 15분 동안 방치한 후 전술한 바와 같이 제거했다. 그 후, 플레이트는 세척하고 실온에서 약 30분 동안 건조시켰다. 이어서, 각 웰에 시약 용액(50% 에탄올과 0.1% 아세트산) 100㎕를 각 웰에 피펫팅했다. 플레이트를 교반(약 300rpm에서 15분)하여, 각 웰에서 균일한 색의 용액이 생성되었다.
시험 플레이트 웰에 존재하는 염료의 흡광도는 620nm에서 플레이트 광도계로 측정했다. 각 값을 그래프에 플롯팅하여, 흡광도(y 축)는 항체의 각 희석률 또는 농도 ng/ml(x 축)에 대해 플롯팅했다. 4파라미터 플롯으로부터 세포 절반은 생존하고 절반은 죽는 농도(IC50 값)를 판독했다. 이 농도는 곡선 데이터의 4파라미터 함수 중 파라미터 3에 의해 계산했다. 참조 표준물질 농도의 평균값을 계산했다. 샘플의 상대적인 생물학적 활성은 참조 표준물질의 평균 IC50 값을 샘플의 각 IC50 값으로 나누고 100%를 곱하여 계산했다. 그 후, 상대적 활성을 평균했다.
b) D2E7 결정의 상대적 활성
이 시험은 샘플의 생물학적 활성과 참조 표준물질의 생물학적 활성을 비교하여 수행했다. D2E7의 농도에 대해 플롯팅하고 4파라미터 비선형 회귀법으로 평가한 흡수 값은 항체에 의한 TNF 효과의 억제에 대한 IC50 값을 나타냈다. 두 샘플을 하나의 마이크로플레이트에서 4반복으로 실험하여, D2E7 참조 표준물질과 샘플의 각각 4개의 IC50 값을 산출한다. 이어서, 참조 표준물질의 IC50 값의 평균을 계산하고 각각 반복되는 샘플의 상대적 활성은 참조 표준물질의 평균 IC50 값을 이와 관련된 샘플의 IC50 값으로 나누고 100%를 곱하여 평가했다.
샘플(실시예 36에 기술된 바와 같이 제조된 결정 현탁액 2.7mg/ml)의 시험 결과 111%의 상대적 생물학적 활성이 나타났다.
즉, 샘플은 완전히 생물학적으로 활성인 것으로 생각될 수 있다.
G2 . 현미경적 특성분석
이하에 D2E7 결정의 현미경적 특성분석에 대한 데이터가 제시될 것이다:
a) mAb 결정 배치 샘플의 광학적 분석
균질화 후, 샘플 1 내지 10㎕ 용적의 일정량을 물체 고정 플레이트 위에 피펫팅하고 유리 커버 슬라이드로 덮었다. 결정 제조물은 E-PI 10x 접안렌즈, 10x, 20x 및 40x 대물렌즈가 각각 장착된 Zeiss Axiovert 25 도립 광학 현미경으로 평가했다. 사진은 디지털 카메라(Sony Cybershot DSC S75)로 촬영했다.
b) 증기 확산 실험의 광학적 분석, 대략적인 결정 크기의 측정 및 복굴절의 검출
이 시험을 위해, CFW 10x 접안렌즈 및 4x, 10x, 20x 및 40x 대물렌즈가 각각 장착된 Nikon Labophot 현미경을 사용했다.
증기 확산 실험을 평가하기 위해 24웰 플레이트의 샘플 방울들을 스크리닝했다.
결정 크기는 JVC TK C1380 컬러 비디오 카메라를 이용하여 현미경 사진을 컴퓨터 스크린에 올리고, 대표적인 바늘형 또는 바늘 클러스터형 결정의 직경 길이를 측정한 뒤, JVC Digital Screen Measurement Comet 소프트웨어 버젼 3.52a를 사용해서 평가했다. 또한, 현미경에 필터 세트(편광기 및 분석기)를 장착해서 샘플의 복굴절 작용을 평가했다.
편광기 및 분석기 필터의 편광 방향이 서로에 대해 90°각을 이룬다면("교차 편광기"), 빛은 현미경 접안렌즈를 통과하지 못할 것이며; 이미지는 어둡거나 검게 나올 것이다. 이제 교차 편광기 사이의 광선에 배치된 샘플이 광의 편광면을 회전시킬 수 있다면, 어두운 배경에 대해 샘플의 독특한 미광이 관찰될 것이다. 이러한 작용은 "복굴절"이라는 것으로, 규칙적인 결정형(이방성) 물질과 비규칙적인 무정형(등방성) 물질을 구별한다. 복굴절은 이방성 물질의 특징인 바, 이러한 미광 외관은 결정형 물질의 존재를 증명한다. 하지만, 복굴절의 부재는 결정이 입방적 대칭을 나타낼 수 있어서 무정형 물질과 같이 등방성일 수도 있기 때문에 결정형 물질의 존재를 배제하는 것은 아니다.
c) 결과
첨부된 도 1 내지 4에는 D2E7 결정의 대표적인 사진을 제시했다.
도 1은 실온에서 6일 후에 실시예 37에 따라 소규모 배치 결정화에 의해서 수득된 D2E7 결정을 도시한 것이다 (5mg/ml 최종 단백질 농도; 결정화 완충액: 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.1 중의 4.2M 나트륨 디하이드로겐 포스페이트). 결정은 복굴절을 나타냈다.
도 2 내지 4는 실시예 41b에 따라 대규모 배치 결정화에 의해 수득된 D2E7 결정을 도시한 것이다.
주사능: 결정에 혼입되고 20%(m/v) PEG 4,000을 함유하는 완충액에 조제된 D2E7 결정 현탁액 200mg/ml 단백질은 27 1/2 G 바늘을 통해 주사가능하다.
G3 . 복굴절
아달리무맙 결정화가 실제로 결정형 물질을 제공하는지를 입증하기 위해 복굴절을 분석했다.
단백질: 제형 완충액 중의 70mg/ml 아달리무맙을 2차 증류수로 10mg/ml로 희석했다.
침전제: 4M NaH2PO4(2차 증류수에 용해된 분말)
방법: 2ml 구획 웰을 구비한 행잉-드랍 트레이에서 마이크로배치 결정화, 단백질 용액 500㎕를 단백질 500㎕와 혼합했다; 용액에 NaOAc 무함유.
온도: 24℃.
복굴절 측정을 위한 기술적 장치: Nikon CoolPix CCD 카메라가 장착된 Nikon SMZ1500 스테레오 해부현미경. 결정의 복굴절은 교차 편광기 하에 사진촬영했다. 배율은 약 200x였다.
상응하는 현미경사진은 도 5a에 제시했다. 아달리무맙 바늘형 결정의 클러스트들의 현저한 복굴절이 관찰되었다. 결정의 색은 결정 바늘 축의 배향이 광 편광 방향에 대해 회전할 때 청색에서 적색으로, 다시 청색으로 변했다.
또 다른 현미경사진 세트는 도 5b, 5c 및 5d에 제시했다.
모든 사진은 Nikon Eclipse E600 POL 현미경과 Nikon DXN 1200 디지털 카메라로 촬영했다. 배율은 약 40x였다.
도 5b(회색)의 이미지는 평면 편광기로 촬영했고 입자 형태를 나타낸다. 흑색 배경 위의 백색 결정(도 5d)은 복굴절을 나타내고 교차 편광기로 촬영했다. 자주색 배경 위의 청색 및 오렌지색 결정(도 5c)은 복굴절을 나타내고 교차 편광기 및 적색 보상판 또는 1/4 파장판으로 촬영했다.
H. 결정 주사능
다음 섹션에서는 모노클로날 항체 D2E7(10-200mg/ml)의 결정형 현탁액(PEG 중에)의 주사능을 여러 게이지의 바늘로 측정하기 위한 실험을 수행했다.
PEG 완충액:
20% PEG 4,000 m/v
12mg/ml 만니톨
0.1mg/ml 폴리소르베이트 80
1.305mg/ml 시트르산 일수화물
0.305mg/ml 시트르산나트륨
1.53mg/ml 디나트륨 하이드로겐 포스페이트 탈수물
0.86mg/ml 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 탈수물
pH는 수산화나트륨으로 5.2로 조정했다.
주사기 소모(1ml 충전 용적)는 투여 동안 환자에 의해서 수동으로 이루어질 수 있는 바와 같이 수행했다. 20 내지 27.5G 바늘 크기가 평가되었다.
주사기:
20/23/26G:
Henke Sass Wolf GmbH 1ml Norm-Ject 주사기,
- Henke Sass Wolf GmbH Fine-Ject® 20G 바늘
- Terumo® 23G 바늘
- Neopoint® 26G 바늘 장착됨.
27.5G:
BD HyPak SCF™ 1ml 긴 주사기, 27.5G RNS 바늘 38800 Le Pont du Claix 장착됨
결과(도 6)는 게이지가 높은 바늘은 고농도의 결정 전달을 더 느리게 한다는 것을 시사한다.
I. 안정성 데이터( SE HPLC , FT - IR )
다음 섹션에서는 12개월 동안 2 내지 8℃에서 보관한 후의 모노클로날 항체 D2E7(50 및 200mg/ml)의 결정형 현탁액의 안정성을 측정하는 실험을 수행했다.
결정은 주사능 연구에서 사용한 바와 같은 배지에 현탁시켰다:
20% PEG 4,000 m/v
12mg/ml 만니톨
0.1mg/ml 폴리소르베이트 80
1.305mg/ml 시트르산 일수화물
0.305mg/ml 시트르산나트륨
1.53mg/ml 디나트륨 하이드로겐 포스페이트 탈수물
0.86mg/ml 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 탈수물
pH는 수산화나트륨으로 5.2로 조정했다.
SE - HPLC
Figure pat00002

Figure pat00003

Dionex HPLC 시스템(P680 펌프, ASI 100 오토샘플러, UVD 170U)은 SEC에 의한 안정성 분석에 사용했다. D2E7 샘플은 0.5ml/min의 유속 하에 GE Superose® 6 컬럼에서 분리시켰다. UV 정량(검출)은 214nm 파장에서 수행했다. 전개 완충액은 0.02M 인산나트륨 완충액 pH 7.5 중의 0.15M 염화나트륨을 함유했다. IR 스펙트럼은 Bruker Optics Tensor 27 상의 Confocheck 시스템으로 기록했다. 액체 샘플은 MicroBiolytics AquaSpec 셀을 이용하여 분석했다. 각 샘플은 25℃에서 120 내지 500 스캔을 2회 이상 측정하여 평가했다. 단백질 스펙트럼에서 각각 블랭크 완충액 스펙트럼을 감산하였다. 단백질 2차 파생 스펙트럼은 상대적 비교를 위해 1580-1720 cm-1까지 정규화된 푸리에 변환 및 벡터를 이용하여 작성했다. 결정의 재용해는 다음과 같이 수행했다: 결정 현탁액은 Humira® 시판 완충액으로 10mg/ml 단백질 농도로 희석했다. PEG 농도를 감소시켜 결정을 재용해시켰다.
청색 - 표준물질, 동결/해동 후의 Humira®
적색 - 25℃에서 6개월 보관 후 재용해된 결정, 50mg/ml
녹색 - 25℃에서 6개월 보관 후 재용해된 결정, 200mg/ml
결과: 도 7은 25℃에서 6개월간 보관하는 동안 형태적 차이가 없었음을 예증한다.
J. 형태
2 내지 8℃에서 12개월 보관한 후, 결정을 광학 현미경으로 분석한 결과 유의적인 형태적 변화는 관찰되지 않았다.
1 내지 10㎕ 샘플 용적의 일정량을 물체 고정 플레이트에 피펫팅하고, 제형 완충액(20% PEG)으로 희석한 뒤, 유리 커버 슬라이드로 덮었다. 제조물은 E-PI 10x 접안렌즈와 10x, 20x 및 40x 대물렌즈가 각각 장착된 Zeiss Axiovert 25 도립 광학 현미경으로 평가했다.
참고문헌:
Figure pat00004
Figure pat00005
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Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D2E7 light chain CDR3 region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr or Ala <400> 3 Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D2E7 heavy chaim CDR3 region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Tyr or Asn <400> 4 Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D2E7 light chain sequence <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val 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sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (451)..(451) <223> Xaa is missing or is Lys <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Xaa 450

Claims (21)

  1. 길이가 약 2 내지 500㎛이고 l/d 비가 약 3 내지 30인, 바늘 형태를 갖는 완전한 (intact) D2E7 (아달리무맙) 항체의 결정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 비-글리코실화 항체인, 결정.
  3. 제1항의 결정을 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 조성물이 약 1mg/ml 초과의 항체 농도를 갖는, 조성물.
  5. (a) 제1항에 따른 결정 및 (b) 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 약제학적 조성물이 고체, 반고체 또는 액체 제형으로 제공되는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 약제학적 조성물이 약 200mg/ml 초과의 항체 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
  8. (a) 제1항에 따른 결정 및 (b) 상기 결정을 포매 또는 봉입하는 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 부형제가 하나 이상의 중합체 담체 또는 하나 이상의 오일 또는 지질 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 중합체 담체가 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리(유기)포스파젠, 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 무수 말레산-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화 폴리사카라이드, 및 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 중합체인, 약제학적 조성물.
  11. 약 10 내지 400mg/ml 범위의 항체 농도를 갖는, 제1항에 따른 결정을 포함하는 주사가능한 액체 조성물.
  12. 제1항에 따른 결정을 포함하는 결정 슬러리로서, 당해 슬러리가 약 100mg/ml 초과의 항체 농도를 갖는, 결정 슬러리.
  13. 배치 결정화 방법에 의해 수득될 수 있고, 길이가 약 2 내지 500㎛이고 l/d 비가 약 3 내지 30인 바늘 형태를 갖는 D2E7 (아달리무맙) 항체의 결정을 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가 비-글리코실화된 것인, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 조성물이 약 1mg/ml 초과의 항체 농도를 갖는, 조성물.
  16. (a) 제13항에 따른 조성물 및 (b) 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 약제학적 조성물이 고체, 반고체 또는 액체 제형으로 제공되는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 약제학적 조성물이 약 200mg/ml 초과의 항체 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
  19. (a) 제13항에 따른 조성물 및 (b) 결정을 포매 또는 봉입하는 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 부형제가 하나 이상의 중합체 담체 또는 하나 이상의 오일 또는 지질 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 중합체 담체가 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리(유기)포스파젠, 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 무수 말레산-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화 폴리사카라이드, 및 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상 중에서 선택되는 중합체인, 약제학적 조성물.



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