TWI417302B

TWI417302B - 結晶型抗-ｈＴＮＦα抗體

Info

Publication number: TWI417302B
Application number: TW096140427A
Authority: TW
Inventors: David W Borhani; Wolfgang Fraunhofer; Hans-Juergen Krause; Anette Koenigsdorfer; Gerhard Winter; Stefan Gottschalk
Original assignee: Abbvie Biotechnology Ltd
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2013-12-01
Also published as: EP2684895A1; EP2089428B1; ES2442258T3; NZ597676A; HK1129400A1; AU2007318120A1; RU2486296C2; AU2007318120B2; JP2013166758A; IL198223A0; WO2008057240A9; EP2089428A4; UY30662A1; WO2008057240A2; TW200835699A; KR20090101893A; CA2667655A1; CN104072612A; US8436149B2; RU2009119988A

Description

結晶型抗-hTNFα抗體

本發明係關於用於使抗－hTNFα抗體結晶之批次結晶法，其允許以工業規模製備該抗體；如根據該方法獲得之抗體晶體；含有該等晶體之組合物以及該等晶體及組合物之使用方法。

a)抗體晶體目前有超過100種單株抗體正處於臨床研究第2期或第3期評估，mAb市場可視為最具前景之生物醫藥市場之一。由於該等藥物必須以通常超過100 mg之單劑量傳遞，因此急需發現滿足穩定性、安全性及患者順應性之適當調配策略。

然而，高度濃縮之液態mAb調配物展示增加之黏度、阻礙注射器通過患者友好細針之能力。此外，當與中度濃縮之溶液相比時，mAb分子在該等高濃度下之聚集趨勢呈指數增加。總之，就安全性及穩定性要求而言，其不可接受。

因此，高mAb劑量之傳遞受限於大體積，其通常必須經由輸液傳遞。此給藥方式成本高且顯著降低患者之順應性。

因此，高度需要用於皮下注射之醫藥學上可應用之低體積mAb晶體懸浮液。理論上，歸因於蛋白質結構運動受阻之晶格之剛性，影響mAb完整性之降解途徑應顯著減速。此外，可預期當將高度濃縮之晶體懸浮液與液體調配物相比時黏度增加將顯著降低。關於持續釋放，可能以使蛋白質晶體進入患者體內時緩慢溶解之方式產生或改造蛋白質晶體。由於將防止損害mAb結構之賦形劑及方法廣泛應用，因此此舉將為傳遞持續釋放型調配物之極適宜方式。

儘管使用蛋白質晶體作為藥物具有極大潛力，但已進行少數嘗試以系統地評估此策略。

一熟知實例為胰島素，其在數十年以前已成功結晶。現今，已充分描述胰島素晶體懸浮液之用途，其提供已在市場上充分公認之穩定且長效之調配物。開發胰島素晶體與使所有其他蛋白質結晶之間的差異可能與有序胰島素聚集體在胰腺中天然形成之事實有關。因此，當使胰島素與過量鋅離子接觸時，胰島素晶體易於獲得。多數其他蛋白質趨向於形成無序沉澱物而非晶體，且因此發現蛋白質之結晶條件為耗時且不簡單之任務。

儘管對收集蛋白質晶體用於X射線繞射分析已產生極大關注，但由於基本上任何蛋白質均表現不同，因此發現適當結晶條件之探索仍為經驗科學。至今，尚未發現可僅藉由理性可靠地預測所選蛋白質之成功結晶條件的通則。因此，獲得給定蛋白質之晶體始終被稱為稍後無論設計任何預定應用之"瓶頸"。

為使事物甚至更具挑戰性，歸因於分子之可撓性，抗體經描述為尤其硬以便結晶。

然而，長時間以來已知免疫球蛋白晶體之實例。150年前由英國醫師Henry Bence Jones描述免疫球蛋白晶體之第一個實例，其自骨髓瘤患者之尿中分離出異常Ig輕鏈二聚體之晶體(Jones 1848)。自此，該等異常Ig被稱作Bence Jones蛋白質。1938年，來自骨髓瘤患者血清之不同異常Ig之自發結晶得以描述(von Bonsdorf,Groth等人1938)，其顯然為Ig重鏈寡聚物(MW 200 kDa)。

在接下來的三十年裏，描述具有正常結構(兩個重鏈與兩個輕鏈相連接)之結晶型人類免疫球蛋白，其亦主要自骨髓瘤患者(Putnam 1955)分離。Davies及合作者最先使用X－射線晶體繞射表徵稱為"Dob"之完整人類骨髓瘤抗體之結構(Terry,Matthews等人1968)，且在1971年確定其三維結構(Sarma,Silverton等人1971)。其他人繼續其先行工作，得到IgG "Kol"(Huber,Deisenhofer等人1976)、IgG "Mcg"(Rajan,Ely等人1983)及犬淋巴瘤IgG2a(Harris,Larson等人1992)之晶體結構。

免疫球蛋白晶體在再溶解後保留其特殊免疫學活性。Nisonoff等人於1968年報導易於結晶之兔抗－對－氮雜苯甲酸酯抗體"X4"。抗體X4在結晶前以及在晶體再溶解後經廣泛表徵。發現[¹²⁵ I]－對－碘苯甲酸酯與再溶解之X4特異性地且有效結合；再溶解之晶體亦顯示對未純化兔血清典型之多特異性Ouchterlony免疫擴散反應(Nisonoff,Zappacosta等人1968)。Connell及合作者描述稱為"Tem"之人類骨髓瘤γ－免疫球蛋白－1(IgG－)，其在低溫下自血清自發地結晶(Connell,Freedman等人1973)。發現Tem晶體充分形成且具有菱面體對稱。含有Tem之血清經瓊脂糖免疫擴散技術廣泛表徵。Tem晶體之再溶解溶液之電泳及免疫擴散展示其與藉由冷凍沉澱法獲自血清之物質相同且與分離之骨髓瘤蛋白相同(Connell,Freedman等人1973)。

Mills及合作者於1983年報導由白蛋白之人類單株抗體導致的異常晶體冷球蛋白血症(Mills,Brettman等人1983)。此處，自兩個患者中分離到極相似立方形晶體。將晶體再溶解接著進行電泳及免疫電泳指示該等晶體包含兩種比率為1：2之蛋白質組份，單株IgG－λ及人類血清白蛋白(Jentoft,Dearborn等人1982)。藉由溶解原始晶體接著進行管柱層析以製備規模分離該等組份。儘管任一分離組份自身並不結晶，但重組合後原始二分複合物重新形成且隨後結晶。再溶解、分離之IgG及其Fab片段與人類血清白蛋白之獨特沉澱特徵及免疫學反應性之深入研究指示兩個再溶解、分離之組份之重新締合在性質上具有免疫性，亦即結晶型抗體再溶解後仍具有其原生之高度特異性(對於人類血清白蛋白)結合特徵(Mills,Brettman等人1983)。

近來，Margolin及合作者報導結晶型抗體之潛在治療用途(Yang,Shenoy等人2003)。其發現治療性單株抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)可結晶(Shenoy,Govardhan等人2002)。結晶型曲妥珠單抗懸浮液在小鼠腫瘤模型中具有治療功效，因此證明結晶型曲妥珠單抗保留其生物活性(Yang,Shenoy等人2003)。

b)結晶技術不同於某些其他科學或工程學努力，各種蛋白質之結晶不能使用確定之方法或演算法成功進行。當然，如世界著名蛋白質結晶專家A.McPherson所解釋，在最近20－30年間存在極大技術進步。McPherson提供關於大分子結晶之策略、對策、試劑及裝置之廣泛細節。然而其並未提供確保任何給定大分子實際上可藉由熟習此項技術者以合理成功期望值結晶之方法。McPherson說明(例如)："無論任何程序必須投入精力改善並優化系統(包括溶劑與溶質兩者)之參數，以促使且促進分子之間的特異性結合相互作用且使其形成後穩定。問題之此後一方面通常依賴於所結晶的特定蛋白質或核酸之特定化學及物理特性"(McPherson 1999，第159頁)。

蛋白質結晶技術內熟習此項技術者廣泛公認不存在獲得所關注之新蛋白質、應用確定加工步驟且由此獲得所需晶體之演算法。

數種市售篩選系統(例如Hampton 1及2、Wizzard I及II)允許以微升規模篩選特定蛋白質之潛在適當結晶條件。然而，該篩選系統獲得之陽性結果未必允許以較大、工業上可應用之批次規模成功結晶。微升尺度之結晶試驗向工業尺度之轉化經描述為具有挑戰性之任務(參見Jen等人，2001)。

Baldock等人(1996)報導微批次與汽相擴散用於初始篩選結晶條件之比較。使用一組結晶溶液篩選六種市售蛋白質。使用最普通汽相擴散法及三種微批次結晶法之變化形式(包括新穎蒸發技術)進行該等篩選。在所鑑別出之58個結晶條件中43個(74%)由微批次鑑別出，而41個(71%)由汽相擴散鑑別出。26個條件由兩種方法共同發現，且若根本未使用微批次則17個(29%)條件將錯失。此展示最通常用於初始結晶篩選之汽相擴散技術並不保證陽性結果。

c)hTNFα抗體晶體認為人類TNFα(hTNFα)為許多疾病之病原體。因此存在對治療該等hTNFα相關病症之適當方法的巨大需要。一種具有前景之治療方法包含投予醫藥學上有效劑量之抗人類TNFα抗體。近來命名為D2E7或通稱名為阿達木單抗(adalimumab)之一種該抗體已進入市場且以商標HUMIRA銷售。

WO－A－02/072636揭示完全、完整抗體利妥昔單抗(Rituximab)、英利昔單抗(Infliximab)及曲妥珠單抗(Trastuzumab)之結晶。以毒性尚不清楚之化學品進行多數結晶實驗，如咪唑、2－環己基－乙烷磺酸酯(CHES)、甲基戊二醇、硫酸銅及2－嗎啉－乙烷磺酸酯(MES)。多數實例使用晶種以啟始結晶。

WO－A－2004/009776揭示使用沉滴汽相擴散技術藉由混合等體積(1 μl)之不同結晶緩衝液及D2E7 F(ab)'₂ 或Fab片段進行之微升規模之結晶實驗。儘管報導該等片段中之每一者的數種實驗條件，但未報導完全、完整D2E7抗體之成功結晶。

因此不可獲得製備任何給定抗人類TNFα完全抗體、尤其D2E7之晶體的方法。

因此根據本發明待解決之問題為開發用於抗－hTNFα抗體、尤其人類抗－hTNFα抗體D2E7之適當批次結晶條件，且確定可應用於對於工業抗體晶體製備相關之體積之結晶過程條件。同時應確定並不利用可負面影響該等抗體之醫藥適用性的毒性劑之結晶方法。

意外地，藉由以下觀測結果解決上述問題：可能藉由應用生理學上可接受之無機磷酸鹽作為結晶誘導劑，以高於微升規模之批次結晶體積獲得完全抗－hTNFα抗體之晶體。

較佳實施例

本發明之第一態樣係關於用於使抗－hTNFα抗體結晶之批次結晶法，其包含以下步驟：a)如(例如)藉由混合該抗體之水溶液(其中抗體較佳以溶解形式存在)與包含作為結晶劑之呈溶解形式之無機磷酸鹽的水性結晶溶液，或者藉由添加該呈固體形式之結晶劑，提供該抗體與作為結晶劑之無機磷酸鹽混合的水溶液；及b)培育該水性結晶混合物直至形成該抗體之晶體。

通常在約pH 3至約5、尤其約3.5至約4.5或約3.7至約4.2之範圍內的該水性結晶混合物之pH值下執行本發明之結晶方法。

此外，該水性結晶混合物可含有至少一種緩衝劑。該緩衝劑可尤其包含乙酸鹽組份作為主要組份，尤其鹼金屬鹽、尤其乙酸鈉。藉由添加酸、尤其乙酸將該鹽調節至所需pH值。在結晶方法之一較佳實施例中，該水性結晶混合物中之緩衝劑濃度(總乙酸鹽)為0至約0.5 M或約0.02至約0.5 M，例如約0.05至約0.3 M或約0.15至約0.2 M。

在本發明之結晶方法之另一特定實施例中，用作沉澱劑之磷酸鹽係選自磷酸氫鹽，諸如磷酸單氫鹽或磷酸二氫鹽、尤其銨鹽或鹼金屬鹽，例如含有Na^＋或K^＋離子之鹽或其包含至少兩種不同鹽之混合物。適當實例為：NaH₂ PO₄ 、Na₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、K₂ HPO₄ 、NH₄ H₂ PO₄ 、(NH₄ )₂ HPO₄ 及其混合物。

尤其，結晶混合物中之磷酸鹽濃度在約1至約6 M之範圍內，例如約1.0至約4.0 M或約1.0至約3.0 M或約1.5至約2.8 M或約2.0至約2.6 M之範圍內。

在本發明之一較佳實施例中，以約1：1之比率組合蛋白質溶液及結晶溶液。因此，原始結晶溶液中緩衝劑/結晶劑之莫耳濃度約高達結晶混合物中之2倍。

通常，以約1 ml至約20000 l，或1 ml至約15000 l，或1 ml至約12000 l，或約1 ml至約10000 l，或1 ml至約6000 l，或1 ml至約3000 l，或1 ml至約1000 l，或1 ml至約100 l，例如約50 ml至約8000 ml，或約100 ml至約5000 ml，或約1000 ml至約3000 ml，或約1 l至約1000 l，或約10 l至約500 l範圍內之批次體積執行結晶方法。

另外，可執行本發明之結晶方法以便獲得以下其他結晶條件中之至少一種：a)執行培育歷時約1小時至約60天之間，例如約1至約30天或約2至10天；b)在介於約0℃與約50℃之間，例如約4℃及約37℃之溫度下執行培育；c)結晶混合物中之抗體濃度(亦即蛋白質濃度)在約1至200 mg/ml或1至100 mg/ml之範圍內，例如1.5至20 mg/ml，尤其在約2至15 mg/ml或5至10 mg/ml範圍內。可根據蛋白質測定之標準程序測定蛋白質濃度。

根據一尤其較佳方法，在以下結晶混合物之條件下執行結晶：磷酸鹽：NaH₂ PO₄ 1.5至2.5 M緩衝劑：總乙酸鹽 0至0.3 M pH：3.6至4.2抗－hTNFα濃度：3至10 mg/ml溫度：18至24℃批次體積：1至100 l攪拌：無持續時間：4至15天

通常藉由添加在溶液中或呈固體形式之結晶劑至蛋白質溶液中來獲得如上文概述之結晶混合物。兩種溶液可但不必經緩衝。由於結晶混合物經蛋白質溶液"稀釋"，因此原始結晶溶液中之結晶劑莫耳濃度及緩衝劑莫耳濃度通常高於結晶混合物中之濃度。

在另一實施例中，本發明之結晶方法可進一步包含乾燥所得晶體之步驟。適當乾燥方法包含蒸發式乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥、真空乾燥、流化床乾燥、噴霧冷凍乾燥、近臨界乾燥、超臨界乾燥及氮氣乾燥。

在另一實施例中，本發明之結晶方法可進一步包含藉由離心、透濾、超濾或其他常用緩衝液交換技術以不同緩衝液交換結晶母液之步驟，例如含有莫耳質量在約300至8000道爾頓(Dalton)範圍內之聚乙二醇(PEG)或PEG混合物的緩衝液。

本發明亦係關於可藉由如以上所定義之結晶方法獲得的抗－hTNFα抗體之晶體且一般而言係關於抗－hTNFα抗體之晶體。

本發明之晶體之特徵通常在於針狀形態，其最大長度l為約2－500 μm或約100－300 μm，且l/d比率為約3至30，但亦可具有其他幾何外觀。

該晶體可獲自多株抗體或較佳獲自單株抗體。

詳言之，該抗體係選自由非嵌合或嵌合抗體、人類化抗體、非糖基化抗體、人類抗體及小鼠抗體組成之群。詳言之，待結晶之抗體為視情況進一步加工以便改良抗原結合性之非嵌合人類抗體。

較佳地，該等晶體係獲自IgG抗體，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。詳言之，該抗體為群IgG1之完全抗人類TNFα抗體。

在一較佳實施例中，晶體係自分離人類抗體製備，該分離人類抗體藉由表面電漿共振測定以1×10^－8 M或更低、更佳1×10^－9 M或更低且甚至更佳5×10^－10 M或更低之K_d 及1×10^－3 s^－1 或更低之K_a 速率常數與hTNFα解離，且在標準活體外L929檢定中以1×10^－7 M或更低之IC₅₀ 中和hTNFα細胞毒性。

詳言之，該等晶體可自分離人類抗體以以下特徵製備：a)如藉由表面電漿共振測定以1×10^－3 s^－1 或更低之k_off 速率常數與人類TNFα解離；b)具有輕鏈CDR3域，其包含SEQ ID NO：3或藉由在位置1、4、5、7或8經單個丙胺酸取代或藉由在位置1、3、4、6、7、8及/或9經1至5個保守胺基酸取代自SEQ ID NO：3修飾之胺基酸序列；c)具有重鏈CDR3域，其包含SEQ ID NO：4或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11經單個丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12經1至5個保守胺基酸取代自SEQ ID NO：4修飾之胺基酸序列。

更佳地，抗體或其抗原結合部分以5×10^－4 s^－1 或更低之k_off 與人類TNFα解離。甚至更佳地，抗體或其抗原結合部分以×10^－4 s^－1 或更低之k_off 與人類TNFα解離。

在一尤其較佳實施例中，自具有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)之分離人類抗體製備該等晶體。

最佳為如WO－A－97/29131所揭示自抗體D2E7或其功能等效物製備之晶體。該抗體係在中國倉鼠卵細胞(Chinese hamster ovary cell)中重組產生且其包含SEQ ID NO：6之重鏈序列及SEQ ID NO：5之輕鏈序列。

在另一實施例中，本發明係關於固體、液體或半固體醫藥組合物，其包含(a)如請求項15至26中任一項之抗－hTNFα抗體之晶體；及(b)至少一種醫藥學上可接受之穩定維持該等抗體晶體之賦形劑。

本發明之另一態樣係關於固體、液體或半固體醫藥組合物，其包含：(a)如本文中所定義之抗－hTNFα抗體之晶體；及(b)至少一種醫藥學上可接受之囊封或包埋該等抗體晶體之賦形劑。該組合物可進一步包含(c)至少一種醫藥學上可接受之穩定維持該等抗體晶體之賦形劑。此外，可聯合執行囊封及包埋。

詳言之，該等組合物可具有高於約1 mg/ml、尤其約200 mg/ml或更高、例如約200至約600 mg/ml或約300至約500 mg/ml之抗體晶體濃度。

該等賦形劑可包含至少一種聚合型、視情況可生物降解之載劑或至少一種油劑或脂質載劑。

該等聚合型載劑可為選自由以下各物組成之群中之一或多者之聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸－共－乙醇酸)或PLGA、聚(β－羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物。

該等油(或油性液體)可為選自由以下各物組成之群中之一或多者之油(或油性液體)：油性杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、輕質礦物油、辛基十二烷醇、橄欖油、花生油、杏仁油、芝麻油、大豆油、角鯊烷、液體甘油三酯、液體蠟、高級醇。

該脂質載劑可為選自由以下各物組成之群中之一或多者之脂質：脂肪酸及脂肪酸鹽、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸之單甘油酯、甘油二酯及甘油三酯、磷脂、醣脂、甾醇及蠟及相關類似物質。蠟進一步分類為天然及合成產品。天然物質包括獲自植物、動物或礦物來源之蠟，諸如蜂蠟、巴西蠟棕或褐煤蠟。氯化萘及烯系聚合物為合成蠟產品之實例。

在一較佳實施例中，該組合物為包含如以上所定義抗－hTNFα抗體晶體且抗體晶體濃度在約10至約400或約50至約300 mg/ml範圍內之可注射組合物。

在另一態樣中，本發明係關於包含如以上所定義之抗－hTNFα抗體晶體且抗體晶體濃度高於約100 mg/ml、例如為約150至約600 mg/ml或約200至約400 mg/ml之晶體漿液。

本發明亦係關於用於治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投予有效量之如以上所定義完全抗－hTNFα抗體晶體或有效量之如以上所定義組合物之步驟。較佳地，藉由非經腸途徑、經口途徑或藉由注射投予該組合物。

此外，本發明係關於治療個體中hTNFα相關病症之方法，其包含投予治療有效量之如以上所定義之抗體晶體。

詳言之，該hTNFα相關病症係選自：自體免疫疾病，尤其類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎及痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、自體免疫性糖尿病、自體免疫性葡萄膜炎及腎病症候群；感染性疾病、移植物排斥或移植物對抗宿主疾病、惡性疾病、肺部病症、腸道病症、心臟病症、發炎性骨骼病症、骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴發型肝炎、凝血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形成、發熱、牙周疾病、肥胖症及輻射毒性；脊椎關節病、肺部病症、冠狀動脈病症、代謝障礙、貧血、疼痛、肝病症、皮膚病症、指甲病症或脈管炎、白塞氏病(Behcet's disease)、強直性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩氏病(Crohn's disease)相關病症、青年類風濕性關節炎(JRA)、C型肝炎病毒感染、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、慢性斑塊牛皮癬、年齡相關惡病質、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、腦水腫、發炎性腦損傷、慢性疲勞症候群、皮肌炎、藥物反應、脊髓中及/或其周圍水腫、家族性週期性發熱、費爾提氏症候群(Felty's syndrome)、纖維化、絲球體腎炎(例如鏈球菌感染後絲球體腎炎或IgA腎病)、假肢鬆動、顯微鏡下多血管炎、混合型結締組織病症、多發性骨髓瘤、癌症及惡病質、多器官病症、骨髓發育不良症候群、睪丸炎性(orchitism)、骨質溶解、包括急性、慢性及胰膿腫之胰腺炎、牙周疾病、多發性肌炎、進行性腎衰竭、假性痛風、壞疽性膿皮病、復發性多軟骨炎、風濕性心臟病、類肉瘤病、硬化性膽管炎、中風、胸腹主動脈瘤修復(TAAA)、TNF受體相關週期性症候群(TRAPS)、與黃熱病疫苗接種有關之症狀、與耳相關之發炎性疾病、慢性耳部炎症或小兒耳部炎症、葡萄膜炎、坐骨神經痛、前列腺炎、子宮內膜異位、脈絡膜新血管生成、狼瘡、修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)及濕性黃斑退化。

此外，本發明係關於如以上所定義之完全抗－hTNFα抗體晶體用於製備用以治療如以上所定義之hTNFα相關疾病之醫藥組合物的用途。

最後，本發明提供如以上所定義適用於藥物之抗－hTNFα抗體晶體。

A.定義

"批次結晶方法"包含向待結晶之抗體溶液中添加包含較佳呈溶解形式之結晶劑的結晶溶液之步驟。

可基於(例如)汽相擴散之"小規模結晶方法"包含以下步驟：混合微升範圍內小體積之抗體溶液與含有結晶劑之儲液器緩衝液；將一滴該混合物鄰近於該儲液器緩衝液之等分試樣放置於一密封容器中；允許液滴與儲液器之間的溶劑藉由汽相擴散交換，在此期間該液滴之溶劑含量變化且若達到適當結晶條件則可觀測到結晶。

在磷酸鹽存在情況下，"結晶劑"有利於待結晶抗體之晶體形成。

"結晶溶液"含有該呈溶解形式之結晶劑。較佳地，該溶液為水性系統，亦即其液體組份主要由水組成。例如，80至100 wt%或95至100 wt%或98至100 wt%可為水。

抗體"晶體"為該蛋白質之一種固態物質形式，其與第二固體形式(亦即基本上呈無組織、異質固體形式存在之非晶形狀態)不同。晶體具有規則三維結構，通常稱為晶格。抗體晶體包含抗體分子之規則三維陣列。參見Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第二版，第1－16頁，Oxford University Press,New York(1999)。

如根據本發明結晶之"完全"或"完整"抗－hTNFα抗體為能夠在活體外及/或活體內識別其抗原人類TNFα且與其抗原人類TNFα結合的功能抗體。抗體可啟始與抗體與其抗原結合相關的患者之後續免疫系統反應，尤其直接細胞毒性、補體依賴型細胞毒性(CDC)及抗體依賴型細胞毒性(ADCC)。抗體分子具有由兩個彼此共價結合之相同重鏈(MW各為約50 kDa)及兩個各與重鏈中之一者共價結合的相同輕鏈(MW各為約25 kDa)組成之結構。4條鏈以典型"Y"基元排列。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個域(CH1、CH2及CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個域CL組成。VH及VL區可進一步再分成稱為互補判定區(CDR)之高變區，其中散布有稱為框架區(FR)之較保守區域。各VH及VL包含3個CDR及4個FR，其自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。完整抗體分子具有兩個抗原結合部位，亦即其為"二價的"。該兩個抗原結合部位對於一種hTNFα抗原具有特異性，亦即該抗體具有"單特異性"。

"單株抗體"為獲自B淋巴細胞(B細胞)之單純系且識別同一抗原決定子之抗體。完全單株抗體為彼等具有上述包括兩個完整重鏈及兩個完整輕鏈之典型分子結構之抗體。通常藉由融合產生抗體之B細胞與永生骨髓瘤細胞以產生在細胞培養物中持續產生單株抗體之B細胞融合瘤來製備單株抗體。可利用其他製備方法，例如在細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞培養物中使用噬菌體顯示技術表現單株抗體；在諸如已經修飾以含有且表現全部人類B細胞基因組的牛、山羊、豬、兔、雞或轉殖基因小鼠之遺傳修飾之動物中活體內製備；或在諸如煙草及玉米之遺傳修飾之植物中製備。可根據本發明結晶來自所有該等來源之抗－hTNFα抗體。

待根據本發明結晶之單株抗體包括"嵌合"抗－hTNFα抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與獲自特定物種或屬於特定抗體類別或子類的抗體之相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與獲自另一物種或屬於另一抗體類別或子類的抗體之相應序列一致或同源。舉例而言，可提及含有鼠類抗體之可變抗原結合部分及獲自人類抗體之恆定部分的小鼠/人類嵌合體。

亦涵蓋非人類(例如鼠類)抗－hTNFα抗體之"人類化"形式。其為含有獲自非人類免疫球蛋白的最小序列之嵌合抗體。在很大程度上，人類化抗體為使來自人類免疫球蛋白之互補決定區(CDR)或高變環(HVL)的殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物的非人類物種之具有所需功能性之CDR或HVL的殘基置換之人類免疫球蛋白。人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基可經相應非人類殘基置換以改良抗原結合親和力。此外，人類化抗體可包含相應人類或非人類抗體部分中均不存在之殘基。該等修飾對於進一步改良抗體功效而言可為必需的。

"人類抗體"或"完全人類抗體"為具有對應於由人類產生或重組產生之抗體之胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。如本文中所用，術語"人類抗體"意欲包括具有獲自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變及恆定區之抗體。本發明之人類抗體可在例如CDR且尤其CDR3中包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如在活體外藉由隨機或位點特異性突變誘發或在活體內藉由體細胞突變而引入的突變)。然而，如本文中所用，術語"人類抗體"不欲包括已將獲自諸如小鼠之另一哺乳動物物種之生殖系的CDR序列接枝於人類框架序列上之抗體。

如本文中所用，術語"重組人類抗體"意欲包括藉由重組方法製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染入宿主細胞之重組表現載體表現之抗體，自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體，自人類免疫球蛋白基因轉殖基因動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor,L.D.，等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287－6295)，或藉由任何其他涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有獲自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區。然而在某些實施例中，該等重組人類抗體係經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列轉殖基因動物時，則為活體內體細胞突變誘發)且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為當獲自人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列相關時在活體內可不天然存在於人類抗體生殖系庫內之序列。

如本文中所用，"中和抗體"(或"中和hTNFα活性之抗體")意欲指與hTNFα之結合引起hTNFα之生物活性受抑制的抗體。可藉由量測hTNFα生物活性之一或多種指標評估hTNFα生物活性之該抑制，該或該等指標諸如hTNFα誘發之細胞毒性(活體外或活體內)、hTNFα誘發之細胞活化及hTNFα與hTNFα受體之結合。可藉由在此項技術中已知之數種標準活體外或活體內檢定中之一或多者評估hTNFα生物活性之該等指標。較佳地，藉由抑制L929細胞中hTNFα誘發之細胞毒性來評估抗體中和hTNFα活性之能力。作為hTNFα活性之另一或替代性參數，可評估抗體抑制hTNFα誘發之ELAM－1在HUVEC上表現的能力，以作為hTNFα誘發細胞活化之量度。

"親和力成熟"抗－hTNFα抗體為一或多個高變區中具有一或多種使得與親本抗體相比抗體對抗原之親和力改良的變化之抗體。親和力成熟抗體對標靶抗原將具有奈莫耳或甚至皮莫耳之親和力值。藉由在此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。Marks等人，Bio/Technology 10：779－783(1992)描述藉由VH及VL域改組進行親和力成熟。Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809－3813(1994)；Scier等人，Gene 169：147－155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994－2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310－9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol Biol.226：889－896(1992)描述CDR及/或框架殘基之隨機突變誘發。

如本文中所用，"分離抗體"意欲指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合hTNFα之分離抗體大體上不含特異性結合除hTNFα以外之抗原的抗體)。然而特異性結合hTNFα之分離抗體可對其他抗原(諸如來自其他物種之hTNFα分子)具有交叉反應性。此外，分離抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學品。

如本文中所用，術語"人類TNFα"(本文中縮寫為hTNFα或簡寫為hTNF)意欲指以17 kDa分泌形式及26 kDa膜結合形式存在之人類細胞激素，其生物學活性形式包含非共價結合分子之三聚體。hTNFα之結構進一步描述於(例如)Pennica,D.，等人(1984)Nature 312：724－729；Davis,J.M.，等人(1987)Biochemistry 26：1322－1326；及Jones,E.Y.，等人(1989)Nature 338：225－228中。術語人類TNFα意欲包括重組人類TNFα(rhTNFα)，其可藉由標準重組表現方法製備或在市面上購得(R&D Systems，目錄號210－TA,Minneapolis,MN)。

如本文中所用，術語"k_off "意欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。

如本文中所用，術語"K_d "意欲指特定抗體－抗原相互作用之解離常數。

如根據本發明結晶之特異性"親本"抗－hTNFα抗體之"功能等效物"為展示相同抗原特異性，然而關於"親本"抗體在胺基酸水平或糖基化程度方面分子組成不同之抗體。然而，該等差異可僅使得結晶條件並未偏離如本文中揭示之參數範圍。

抗體晶體之"囊封"係指所併入晶體經至少一層塗層物質個別塗佈的調配物。在一較佳實施例中，該等塗佈晶體可具有持續溶解速率。

抗體晶體之"包埋"係指經囊封或未經囊封之晶體以分散方式併入固體、液體或半固體載劑中之調配物。該等包埋結晶抗體分子可以受控、持續方式自載劑中釋放或溶解。

B.結晶方法

本發明之結晶方法原則上可適用於任何抗－hTNFα抗體。該等抗體可為多株抗體或較佳為單株抗體。該抗體可為嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或例如小鼠抗體之非人類抗體，其各呈糖基化或非糖基化形式。該方法尤其適用於D2E7及其功能等效物。

較佳地，該抗－hTNFα抗體為IgG抗體，尤其群IgG1之抗人類TNFα抗體。

除非另作說明，否則本發明之結晶方法利用在此項技術中熟知之技術設備、化學品及方法。然而，如上文所說明，本發明係基於以下意外觀測結果：特定結晶條件之選擇、尤其特定結晶劑之選擇視情況進一步與特定pH條件及/或相應試劑(緩衝劑、抗體、結晶劑)之濃度範圍組合首次允許可再現地且以大規模製備針對hTNFα之抗體、尤其非嵌合人類抗體之穩定晶體，其可經進一步加工以形成優良、高度有利醫藥組合物之活性成份。

執行該結晶方法之起始物質通常包含待結晶抗體之濃縮溶液。蛋白質濃度可(例如)在約5至75 mg/ml範圍內。該溶液可含有使該溶解抗體穩定之添加劑，且預先移除該等添加劑可為明智的。可藉由執行緩衝液交換步驟實現此舉。

較佳地，該用以執行結晶之起始物質含有於具有經調節在約3.2至8.2或約4.0至8.0、尤其約4.5至6.5、較佳約5.0至5.5範圍內之pH值的水溶液中之抗體。可藉助於以約1至50 mM、尤其約1至10 mM之最終濃度應用之適當緩衝劑調節pH值。該溶液可含有如鹽、糖、糖醇及界面活性劑之添加劑，例如其比例以溶液之總重量計為約0.01至15或0.1至5或0.1至2 wt%，以進一步穩定溶液。賦形劑較佳選自生理上可接受之通常應用於醫藥製劑之化合物。非限制性實例可提及鹽，如NaCl；界面活性劑，如聚山梨醇酯80(吐溫80)、聚山梨醇酯20(吐溫20)；糖，如蔗糖、海藻糖；糖醇，如甘露糖醇、山梨糖醇；及緩衝劑，如磷酸鹽基緩衝系統(如以上所定義之磷酸氫鈉及磷酸氫鉀緩衝液)、乙酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、TRIS緩衝液、順丁烯二酸鹽緩衝液或丁二酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液；胺基酸，如組胺酸、精胺酸及甘胺酸。

可藉助於例如滲析或超濾之常規方法執行緩衝液交換。

用作起始物質之水溶液之初始蛋白質濃度應在約0.5至約200或約1至約50 mg/ml範圍內。

視預定最終批次量(其可在1 ml至20000(二萬)公升範圍內)而定，將初始體積之該水性抗體溶液置於由惰性材料(例如玻璃、聚合物或金屬)製成之適當容器(例如管狀容器、瓶或槽)中。該水溶液之初始體積可對應於最終批次量之約30至80%、通常約50%。

必要時，填充入該容器後可使溶液達至標準化條件下。尤其，將溫度調節為在約4℃及約37℃範圍內。

接著將視情況以與抗體溶液相同之方式預先調節的含有適當濃度之結晶劑之結晶溶液添加至抗體溶液中。

視情況在適度攪拌下持續或間斷地進行結晶溶液之添加以促進兩種液體之混合。較佳地，在振盪下在提供蛋白質溶液之條件下進行添加且以受控方式添加結晶溶液(或呈固體形式之結晶劑)。

藉由應用如以上所定義之磷酸鹽、尤其磷酸氫鹽且較佳鹼金屬鹽或至少兩種不同鹼金屬鹽之混合物作為結晶劑來起始抗體晶體之形成。結晶溶液含有濃度足以在該結晶混合物中提供範圍在約1至6 M內的磷酸鹽之最終濃度之結晶劑。

較佳地，結晶溶液另外含有酸性緩衝劑，亦即不同於抗體溶液之緩衝劑之緩衝劑，其濃度適於允許將結晶混合物之pH值調節至約3至5之範圍內。

在該結晶溶液之添加完成後，可將因此獲得之混合物進一步培育約1小時至約60天以獲得最高產量之抗體晶體。若適當，則混合物可(例如)經攪拌、適度攪拌、橫搖或以本身已知之方式移動。

最後，可藉由已知方法、例如過濾或離心分離所獲得之晶體，例如藉由在室溫或4℃下在約200－20000 rpm、較佳500－2000 rpm下離心。可拋棄或進一步處理剩餘母液。

若必要，則可洗滌且隨後乾燥因此所分離之晶體，或可以適於儲存及/或最終使用懸浮於其中之抗體的不同溶劑系統交換母液。

根據本發明形成之抗體晶體形狀可變化。形狀通常可包括針狀、錐狀、球狀及海膽狀形狀。晶體之尺寸可為高於nm至mm尺寸級(例如長度)。在一些實施例中，晶體尺寸為至少約10 μm且裸眼可見。對於治療性投藥，晶體之尺寸將視投藥途徑而不同，例如對於皮下投藥，晶體之尺寸可大於用於靜脈內投藥之晶體尺寸。

如先前關於蛋白質晶體及低分子量有機及無機分子之晶體所描述，可藉由向結晶混合物中添加特定其他添加劑來改變晶體之形狀。

若必要，則可驗證晶體實際上為該抗體之晶體。可以顯微鏡分析抗體之晶體之雙折射。一般而言，除非為立方體內部對稱晶體，否則晶體將使偏振光之偏振平面旋轉。在另一方法中，可分離、洗滌、再溶解且藉由SDS－PAGE分析晶體且視情況以抗Fc受體抗體將晶體染色。視情況，亦可使用標準檢定測試再溶解抗體與其hTNFα之結合。

如根據本發明獲得之晶體亦可彼此交聯。該交聯可增強晶體之穩定性。交聯晶體之方法描述於(例如)美國專利第5,849,296號中。可使用諸如戊二醛之雙官能試劑交聯晶體。交聯後，可將晶體冷凍乾燥且儲存以用於(例如)診斷或治療性應用中。

在一些情況下，可需要乾燥晶體。可藉助於如氮氣之惰性氣體、真空爐乾燥、冷凍乾燥、蒸發、盤式乾燥、流化床乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥或滾筒乾燥來乾燥晶體。適當方法為熟知的。

可將根據本發明形成之晶體維持於原始結晶溶液中，或其可經洗滌且與如惰性載劑或成份之其他物質組合，以形成包含本發明晶體之組合物或調配物。該等組合物或調配物可用於(例如)治療性及診斷應用中。

一較佳實施例為以使得調配物之晶體經賦形劑包埋或囊封之方式組合適當載劑或成份與本發明之晶體。適當載劑可取自以下非限制性群：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸－共－乙醇酸)或PLGA、聚(β－羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物、SAIB、脂肪酸及脂肪酸鹽、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸之單甘油酯、甘油二酯及甘油三酯、磷脂、醣脂、甾醇及蠟及相關類似物質。蠟進一步分類為天然及合成產品。天然物質包括獲自植物、動物或礦物來源之蠟，諸如蜂蠟、巴西蠟棕或褐煤蠟。氯化萘及烯系聚合物為合成蠟產品之實例。

C.組合物

本發明之另一態樣係關於包含抗－hTNFα抗體晶體與至少一種載劑/賦形劑組合之組合物/調配物。

該等調配物可為固體、半固體或液體。

藉由以懸浮液形式混合具有必要純度之抗體與生理上可接受之添加劑，如載劑、賦形劑及/或穩定劑(參看例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980))，以適於儲存及/或使用之形式製備本發明之調配物，以另一方式凍乾或乾燥。亦可視情況併入其他活性成份，例如不同抗體、生物分子、化學合成或酶促合成之低分子量分子。

可接受之添加劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性。其非限制性實例包括：－酸化劑，如乙酸、檸檬酸、反丁烯二酸、鹽酸、蘋果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸。

－氣溶膠推進劑，如丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、異丁烷、丙烷、三氯單氟甲烷。

－空氣置換劑，如二氧化碳、氮；－醇變性劑，如甲基異丁基酮、蔗糖八乙酸酯；－鹼化劑，如氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、二異丙醇胺、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、硼酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、三乙醇胺；－消泡劑，如二甲聚矽氧烷、聚二甲矽氧烷。

－抗菌防腐劑，如氯苄烷銨、氯苄烷銨溶液、氯苄硫銨、苯甲酸、苄醇、對羥基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡錠、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯鈉、苯酚、苯乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鈉、苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、丙酸鈉、山梨酸、硫柳汞、瑞香草酚。

－抗氧化劑，如抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酯、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、單硫代甘油、沒食子酸丙酯、甲醛合次硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、二氧化硫、生育酚、生育酚賦形劑；－緩衝劑，如乙酸、碳酸銨、磷酸銨、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、檸檬酸鉀、偏磷酸鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、組胺酸。

－螯合劑，如依地酸二鈉、乙二胺四乙酸及鹽、依地酸；－塗佈劑，如羧甲基纖維素鈉、乙酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、乙基纖維素、明膠、醫藥包糖衣、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯鄰苯二甲酸酯、蟲膠、蔗糖、二氧化鈦、巴西棕櫚蠟、微晶蠟、玉米蛋白、聚胺基酸、如PLGA等之其他聚合物及SAIB。

－著色劑，如氧化鐵。

－錯合劑，如乙二胺四乙酸及鹽(EDTA)、依地酸、龍膽酸乙醇醯胺、硫酸羥基喹啉。

－乾燥劑，如氯化鈣、硫酸鈣、二氧化矽。

－乳化及/或增溶劑，如阿拉伯膠、膽固醇、二乙醇胺(助劑)、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、單甘油酯及甘油二酯、單乙醇胺(助劑)、油酸(助劑)、油醇(穩定劑)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧化乙烯50硬脂酸酯、聚烴氧35蓖麻油、聚烴氧40氫化蓖麻油、聚烴氧10油基醚、聚烴氧20十六基十八基醚、聚烴氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、單硬脂酸丙二醇酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蠟。

－助濾劑，如粉末狀纖維素、純化之矽藻土。

－香料及芳香劑，如大茴香腦、苯甲醛、乙基香蘭素、薄荷腦、水楊酸甲酯、麩胺酸單鈉、橙花油、胡椒薄荷、薄荷油、薄荷精、玫瑰油、濃玫瑰水、瑞香草酚、吐魯香脂酊、香草、香草蘭酊、香蘭素。

－助流劑及/或防結塊劑，如矽酸鈣、矽酸鎂、膠狀二氧化矽、滑石。

－保濕劑，如甘油、己二醇、丙二醇、山梨糖醇；－軟膏基質，如羊毛脂、無水羊毛脂、親水性軟膏、白色軟膏、黃色軟膏、聚乙二醇軟膏、石蠟、親水性石蠟、白色石蠟、玫瑰水軟膏、角鯊烷。

－增塑劑，如蓖麻油、羊毛脂、礦物油、石蠟、甲酸苄基苄酯、氯丁醇、鄰苯二甲酸二乙酯、山梨糖醇、二乙醯化單甘油酯、鄰苯二甲酸二乙酯、甘油(glycerin、glycerol)、單－乙醯化單甘油酯及二－乙醯化單甘油酯、聚乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯、檸檬酸三乙酯、乙醇。

－多肽，如低分子量多肽(少於約10個殘基)；－蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；－聚合物膜，如乙酸纖維素膜。

－溶劑，如丙酮、醇、稀醇、水合戊烯、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉籽油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、異丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基異丁基酮、礦物油、花生油、聚乙二醇、碳酸丙二酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、無菌注射用水、無菌沖洗水、純水、液體甘油三酯、液體蠟、高級醇。

－吸附劑，如粉末狀纖維素、炭、純化之矽藻土、二氧化碳吸附劑、氫氧化鋇、石灰、鹼石灰。

－硬化劑，如氫化蓖麻油、十六醇十八醇混合物、十六烷醇、十六基酯蠟、硬脂、石蠟、聚乙烯賦形劑、十八烷醇、乳化蠟、白蠟、黃蠟。

－栓劑基質，如可可脂、硬脂、聚乙二醇；－懸浮及/或增黏劑，如阿拉伯膠、瓊脂、褐藻酸、單硬脂酸鋁、膨潤土、純化膨潤土、岩漿膨潤土、卡波姆(carbomer)934p、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈉12、角叉菜膠、微晶及羧甲基纖維素鈉纖維素、糊精、明膠、瓜爾膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、矽酸鎂鋁、甲基纖維素、果膠、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、丙二醇海藻酸酯、二氧化矽、膠狀二氧化矽、海藻酸鈉、黃蓍膠、三仙膠；－甜味劑，如阿斯巴甜糖、葡萄糖結合劑、右旋糖、賦形劑右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精鈣、糖精鈉、山梨糖醇、溶液山梨糖醇、蔗糖、可壓縮糖、糖果店之糖、糖漿；－錠劑黏合劑，如阿拉伯膠、褐藻酸、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、糊精、乙基纖維素、明膠、液體葡萄糖、瓜爾膠、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯酮、預膠凝化澱粉、糖漿。

－錠劑及/或膠囊稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸氫二鈣、磷酸三鈣、硫酸鈣、微晶纖維素、粉末狀纖維素、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖賦形劑、果糖、高嶺土、乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、澱粉、預膠凝化澱粉、蔗糖、可壓縮糖、糖果店之糖；－錠劑崩解劑，如褐藻酸、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚乙烯吡咯酮、陽離子交換樹脂、羥乙酸澱粉鈉、澱粉、預膠凝化澱粉。

－錠劑及/或膠囊潤滑劑，如硬脂酸鈣、蘿酸甘油酯、硬脂酸鎂、輕質礦物油、聚乙二醇、硬脂醯反丁烯二酸鈉、硬脂酸、純化硬脂酸、滑石、氫化植物油、硬脂酸鋅；－張力劑，如右旋糖、甘油、甘露糖醇、氯化鉀、氯化鈉－媒劑：調味及/或增甜芳香酏劑、混合苯甲醛酏劑、異酒精性酏劑、薄荷水、山梨糖醇溶液、糖漿、葉魯香脂糖漿。

－媒劑，如油性杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、十四烷酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、輕質礦物油、十四烷醇、辛基月桂醇、橄欖油、花生油、杏仁油、芝麻油、大豆油、角鯊烷；固體載劑糖球體；無菌抑菌注射用水、抑菌氯化鈉注射液、液體甘油三酯、液體蠟、高級醇。

－防水劑，如環甲聚矽氧烷、二甲聚矽氧烷、聚二甲矽氧烷；－濕潤及/或增溶劑，如氯苄烷銨、苄索氯銨、氯化十六烷基吡錠、多庫酯鈉、壬苯醇醚9、壬苯醇醚10、辛苯昔醇9、泊洛沙姆、聚烴氧35蓖麻油、聚烴氧40、氫化蓖麻油、聚烴氧50硬脂酸酯、聚烴氧10油基醚、聚烴氧20、十六基十八基醚、聚烴氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂基硫酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、泰洛沙泊(tyloxapol)；晶體可與聚合型載劑組合以提供穩定性及/或持續釋放。該等聚合物包括生物相容性及可生物降解之聚合物。聚合型載劑可為單一聚合物類型或其可由聚合物類型之混合物組成。上文已描述聚合型載劑之非限制性實例。

較佳成份或賦形劑之實例包括：－諸如甘胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、組胺酸之胺基酸的鹽；－單醣，諸如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；－二醣，諸如乳糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖；－多醣，諸如麥芽糖糊精、葡聚糖、澱粉、糖原；－醛醇，諸如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇；－葡糖醛酸、半乳糖醛酸；－環糊精，諸如甲基環糊精、羥丙基－(3－環糊精)；－無機鹽，諸如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鈉及鉀之磷酸鹽、硼酸碳酸銨及磷酸銨；－有機鹽，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、乳酸鹽；－乳化或增溶劑，如阿拉伯膠、二乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯及其他脫水山梨糖醇衍生物、聚烴氧衍生物、蠟、聚氧化乙烯衍生物、脫水山梨糖醇衍生物；及－增黏試劑，如瓊脂、褐藻酸及其鹽、瓜爾膠、果膠、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纖維素及其衍生物、碳酸丙二酯、聚乙二醇、己二醇及泰洛沙泊。

本文中所描述之調配物亦包含有效量之結晶抗體。尤其，本發明之調配物可包括"治療有效量"或"預防有效量"之本發明之抗體晶體。"治療有效量"係指在必要劑量下及歷時必要時間實現所需治療結果有效的量。抗體晶體之"治療有效量"可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重之因素及抗體在個體中引發所需反應之能力而不同。治療有效量亦為治療有利效應優於抗體之任何毒性或不利效應的量。"預防有效量"係指在必要劑量下及歷時必要時間實現所需預防結果有效的量。通常，因為預防劑量在疾病之前或疾病早期用於個體，因此預防有效量將低於治療有效量。

使用標準方法可易於確定適當劑量。抗體可一次或經一系列治療適當地投予患者。視上述因素而定，約1 μg/kg至約50 mg/kg，例如0.1－20 mg/kg之抗體為用於投予患者之初始備選劑量，無論(例如)藉由一或多次獨立投藥或藉由連續輸液。視病狀而定，典型日劑量或週劑量可在約1 μg/kg至約20 mg/kg或更多之範圍內，重複治療直至出現疾病病症之所需抑制。然而，其他給藥方案可為適用的。在一些情況下，當再溶解時調配物包含至少約1 g/L或更大之抗體濃度。在其他實施例中，當再溶解時，抗體濃度為至少約1 g/L至約100 g/L。

抗體之晶體或包含該等晶體之調配物可單獨投予或作為醫藥製劑之一部分投予。其可藉由非經腸、經口或局部途徑投予。例如其可藉由經口、肺部、經鼻、經耳、肛門、皮膚、眼部、靜脈內、肌肉內、動脈內、腹膜內、黏膜、舌下、皮下、經皮、局部或顱內途徑投予或投予至頰腔中。投藥技術之特定實例包含肺部吸入、病灶內應用、針注射、乾粉劑吸入、皮膚電穿孔、氣溶膠傳遞及無針注射技術，包括無針皮下投藥。

現將藉助於以下非限制性、說明性實例更詳述地說明本發明。熟習之閱讀者在說明書之概括部分指導下且基於其常識，將能夠提供本發明之其他實施例而無需不當實驗。

實驗部分 A.材料

a)蛋白質冷凍單株抗體(mAb)D2E7係獲自Abbott實驗室。自原始mAb濃度為50 mg/mL之藥品批量執行所有實驗。

b)精製化學品乙酸鈉係獲自Grssing GmbH,Filsum。不同聚合度之聚乙二醇係獲自Clariant GmbH,Sulzbach。此外，商業結晶篩及試劑(Hampton Research,Nextal Biotechnologies)係用於某些微量實驗。所有其他化學品係來自Sigma－Aldrich,Steinheim或Merck,Darmstadt。

B.通用方法

a)將D2E7藥物解凍在25℃下於攪動水浴中將D2E7解凍。

b)緩衝液交換－方法A將D2E7溶液之等分試樣吸入30 KDa MWCO Vivaspin 20濃縮器(Vivascience)中。以新緩衝液以1：10之比率稀釋蛋白質樣品且藉由在5,000×g在4℃下離心(Sigma 4 K 15實驗室離心機)，使樣品體積返回至原始樣品體積。重複稀釋/離心步驟一次，使得原始樣品緩衝液之稀釋度為1：100。調節蛋白質濃度後，將溶液經0.2 μm注射器驅動之過濾單元無菌過濾。

b)緩衝液交換－方法B將D2E7溶液之等分試樣置於SLIDE－A－LYZER透析卡匣(Pierce Biotechnology Inc.)中。將透析卡匣置於含有所選緩衝液之燒杯中，且在4℃在攪拌下隔夜進行緩衝液交換。調節蛋白質濃度後，經0.2 μm注射器驅動之過濾單元將該溶液無菌過濾。

c)OD280－蛋白質濃度量測使用ThermoSpectronics UV1裝置，在280 nm之波長下，應用1.39 cm² mg^－1 之消光係數評估蛋白質濃度。出於此目的，在14,000 rpm下離心結晶漿料之等分試樣且測定上清液中之殘餘蛋白質濃度。

d)pH值量測藉由使用Mettler Toledo MP220 pH計進行pH值量測。使用Inlab 413電極及Inlab 423微電極。

e)結晶方法e1)微量結晶－使用Hydra II結晶機器人及Greiner 96孔板(三個滴孔，Hampton Research)進行沉滴汽相擴散Hydra II初始結晶篩選。設置板後，以Clearseal薄膜(Hampton Research)密封各孔。

e2)微量結晶－懸滴汽相擴散分別使用VDX板(具有密封劑，Hampton Research)及OptiClear塑料蓋玻片(方形，Hampton Research)或矽化玻璃蓋玻片(圓形，Hampton Research)進行懸滴汽相擴散實驗。製備儲液器溶液後，在蓋玻片上將一滴儲液器溶液與一滴蛋白質溶液混合，且以翻轉蓋玻片以使得液滴懸在儲液器上之方式將孔密封。

e3)批次結晶－方法A(24孔板)藉由於孔中混合蛋白質溶液與等量之結晶緩衝液(500 μl)進行批次結晶。隨後以膠帶密封孔以防止水蒸發。

e4)批次結晶－方法B(Eppendorff反應管)藉由於1.5 mL或2 mL Eppendorff反應管中混合蛋白質溶液與等量之結晶緩衝液進行批次結晶。

e5)批次結晶－方法C(Falcon管，攪動)藉由於50 mL Falcon管中混合蛋白質溶液與等量之結晶緩衝液進行批次結晶。恰在封閉後，將管置於實驗室震盪器(GFL 3013或GFL 3015)上或者藉由翻轉攪動。藉由應用該等方法，避免將攪拌器引入樣品中。

e6)批次結晶－方法D(1公升聚丙烯容器)藉由於殺菌之1公升聚丙烯瓶中混合蛋白質溶液與等量之結晶緩衝液進行批次結晶。恰在封閉後，在無攪動情況下，將容器儲存在環境溫度下。藉由應用該等方法，避免將攪拌器引入樣品中。

f)SDS－PAGE藉由將蛋白質濃度調節至8 μg/20 μL製備樣品。以含有溴酚藍之SDS/Tris/甘油緩衝液稀釋樣品。

使用Invitrogen NuPage 10% Bis－Tris凝膠、NuPage MES SDS電泳緩衝液及Mark 12寬範圍蛋白質標準進行定性SDS PAGE分析。將20 μL樣品吸入凝膠凹槽中。使凝膠電泳且以乙酸/甲醇試劑固定後，使用Novex膠狀藍染色套組進行染色。使用Invitogen凝膠－乾燥乾燥溶液乾燥凝膠。

g)光學顯微術使用Zeiss Axiovert 25或Nikon Labophot顯微鏡觀測晶體。後者裝備有偏振光濾器組及JVC TK C1380彩色攝像機。

h)SE－HPLC藉由SE－HPLC評估D2E7樣品之聚集程度。使用Dionex P680泵、ASI－100自動進樣器及UVD170U偵測器裝置。藉由Amersham Bioscience Superose 6 10/300 GL凝膠過濾管柱，應用生效之Abbott標準方案(CL16－PS－02，阿達木單抗純度)將聚集之物質與單體分離。

C.汽相擴散結晶實驗

以下實例中所給出之濃度值為關於抗體溶液及儲液器溶液之兩種溶液混合前的初始值。

若未另外描述，則所有pH值係指乙酸鹽緩衝儲備液在其與如結晶劑之其他物質組合前之pH值。

若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指在通常使用冰乙酸進行之pH值調節前的儲備溶液中之乙酸鈉濃度。

實例1－以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水(充分脫鹽且視情況預先蒸餾)製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000以2%梯級自約6% w/v變化至約28% w/v。pH值始終為約5.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例2－以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處理條件與實例1相同。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例3－以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 400以2%梯級自約30% w/v變化至約40% w/v。pH值始終為約5.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之12個孔未觀測到晶體。

實例4－以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處理條件與實例3相同。

結果： 自所評估之12個孔未觀測到晶體。

實例5－以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 10,000/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 10,000以2%梯級自約4% w/v變化至約14% w/v。pH值始終為約5.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之12個孔未觀測到晶體。

實例6－以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之PEG 10,000/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至45至55 mg/mL，較佳為50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處理條件與實例5相同。

結果： 自所評估之12個孔未觀測到晶體。

實例7－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 10,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 400為約32% w/v及約34% w/v。pH值為約4.2、4.7、5.2、5.7、6.2或6.7。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例8－以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度及設置進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處理條件與實例7相同。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例9－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，所用乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為約0.025 M、0.05 M、0.075 M、0.15 M、0.2 M或0.25 M。PEG 400自約32% w/v變化至約34% w/v。pH值為約5.7或4.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之48個孔未觀測到晶體。

實例10－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，所用乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為約0.025 M、0.05 M或0.1 M。PEG 400為約28% w/v或約30% w/v。pH值為約5.2、5.7、6.2或6.7。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之48個孔未觀測到晶體。

實例11－以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 400組合PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000以2%梯級自約4% w/v變化至約8% w/v。同時，將濃度為約24% w/v、26% w/v、28% w/v或30% w/v之PEG 400添加至PEG 4,000/乙酸鹽溶液中。pH值始終為約5.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例12－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400組合PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000以2%梯級自約4% w/v變化至約8% w/v。同時，將濃度為約30% w/v、32% w/v、34% w/v或36% w/v之PEG 400添加至PEG 4,000/乙酸鹽溶液中。pH值始終為約4.2。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之24個孔未觀測到晶體。

實例13－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000以2%梯級自約4% w/v變化至約26% w/v。所用乙酸鹽緩衝液之pH值與相應蛋白質緩衝液相同。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例14－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

除恆定保持於約0.2 M(沉澱緩衝液之莫耳濃度)之乙酸鹽緩衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例15－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

除恆定保持於0.1 M(沉澱緩衝液之莫耳濃度)之乙酸鹽緩衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例16－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

除恆定保持於約0.4 M(沉澱緩衝液之莫耳濃度)之乙酸鹽緩衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例17－PEG 4,000/乙酸鈉大量實驗

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.5之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。

將各500 μL之4份等分試樣吸入4個Eppendorff反應管中。將於0.1 M乙酸鈉緩衝液(pH 5.5)中之24% PEG 4,000溶液滴定至蛋白質溶液中直至溶液變得稍微不透明。隨後，將水吸至溶液中，直至溶液恰好再次變得澄清。該方法稱為大量結晶。在環境溫度下對兩個樣品進行滴定且在4℃下對兩個其他樣品進行滴定。隨後，將各對樣品中之一者分別儲存在環境溫度或4℃下。在接下來之一週內多次進行樣品之1 μL等分試樣之顯微鏡觀察。

結果： 該4個樣品未出現晶體。

實例18－以懸滴汽相擴散模式、不同溫度進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

實驗條件與實例13相同。然而，管設置且儲存在4℃下。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例19－以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

除蛋白質濃度經調節至5 mg/mL外，實驗條件與實例13相同。

結果： 自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例20－以懸滴汽相擴散模式進行之硫酸銨/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、硫酸銨貯備液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且硫酸銨濃度以0.25 M為梯級自0.5 M變化至2.5 M。乙酸鹽緩衝液之pH值始終為約5.5。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且儲存在環境溫度下。在接下來之兩週內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之18個孔未觀測到晶體。 實例21－以懸滴汽相擴散模式進行之氯化鈉/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、氯化鈉貯備液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且氯化鈉濃度以0.5 M為梯級變化，自1.5 M變化至2.5 M。乙酸鹽緩衝液之pH值始終為約5.5。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且儲存在環境溫度下。在接下來之兩週內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之6個孔未觀測到晶體。

實例22－以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選，清潔劑之影響

將D2E7緩衝入含有約0.1 M乙酸鈉pH值為約5.5之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000以2%為梯級自約10% w/v變化至約20% w/v。乙酸鹽緩衝液之pH值始終為約5.5。此外，將聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛尼克(Pluronic)F 68分別以濃度0%、0.02%及0.1%添加至如上所述之任何所得緩衝液中。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且儲存在環境溫度下。在接下來之兩週內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體混合物之液滴。

結果： 自所評估之84個孔未觀測到晶體。可觀測到所評估之清潔劑對結晶系統之行為無影響。

實例23－以懸滴汽相擴散模式進行之乙酸鋅/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、乙酸鋅儲備液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且乙酸鋅濃度以約0.2 M為梯級自0.1 M變化至0.9 M。乙酸鹽緩衝液之pH值始終為約5.5。以雙重複評估各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且儲存在環境溫度下。在接下來之兩週內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。

實例24－以汽相擴散模式廣泛篩選條件

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液(pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、10 mg/mL或20 mg/mL。

使用Hydra II結晶機器人，使用數種市售結晶篩，將96孔Greiner板設置在環境溫度下。以約1：1、較佳1：1之比率混合蛋白質溶液與結晶劑。

使用以下篩：Hampton晶體篩1及2(Hampton Research)；Hampton Index篩(Hampton Research)；Hampton SaltRX篩(Hampton Research)；Nextal The Classics、The Classics Lite、The PEGs、The Anions、The pH clear及The Ammonium Sulfate(均來自Nextal Biotechnologies)。

向結晶劑中添加蛋白質(每個條件三滴，含有如上所述之三種不同蛋白質濃度)後，以Clearseal薄膜將板密封。以四重複設置各板且隨後分別儲存在環境溫度、4℃、27℃及37℃下。分別在5天及12天後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之864個商業條件，在至少兩週後，2個在如下所定義之蛋白質濃度及溫度下產生晶體。

－0.1 M無水乙酸鈉pH 4.6、0.9 M磷酸二氫鈉、0.9 M磷酸二氫鉀(＝Nextal The Anions，E3)、10或20 mg/mL及27℃，或20 mg/mL及37℃。

－0.1 M Bis－Tris丙烷pH 7.0、1.5 M硫酸銨(＝Hampton SaltRX，F2)、5、10或20 mg/mL及27℃。晶體展示針狀叢集狀形態學。

市售篩之以下條件並未產生晶體。對於詳細溶液組成請參閱www.hamptonresearch.com及www.nextalbiotech.com：Hampton晶體篩1－所有條件(48)Hampton晶體篩2－所有條件(48)Hampton Index篩－所有條件(96)Hampton Salt RX篩－除"F2"外之所有條件(95)Nextal－The Classics－所有條件(96)Nextal－The Classics Lite－所有條件(96)Nextal－The PEGs－所有條件(96)Nextal－The Anions－除"E3"外之所有條件(95)Nextal－The pH Clear－所有條件(96)Nextal－The Ammonium Sulfate－所有條件(96)

實例25－以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000濃度以2%為梯級自4%變化至26%。pH值始終為約5.5。以如上所述之三種蛋白質濃度設置各條件。在圓形矽化蓋玻片上混合約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液，且以翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。6天後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之72個孔未觀測到晶體。

實例26－應用Hampton清潔劑篩之懸滴汽相擴散實驗

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液(pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。

使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M，且PEG 4,000濃度為約12% w/v或14% w/v。pH值始終為約5.5。在圓形矽化蓋玻片上混合約4 μL蛋白質溶液與Hampton篩之約1 μL特定清潔劑溶液。隨後將液滴與5 μL特定儲液器溶液混合，且以翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。6天後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果：自所評估之144個孔未觀測到晶體。

實例27－使用Hampton PEG/Ion篩之懸滴汽相擴散

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液(pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL或10 mg/mL。

使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。將500 μL 48種緩衝液調配物中之每一者吸入孔中且分別與250 μL Milli Q水混合。將約1 μL蛋白質樣品吸於蓋玻片上且隨後與約1 μL特定孔之儲液器溶液混合。以翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之7天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所測試之96種條件未觀測到晶體。

實例28－使用Hampton PEG/Ion篩、不同設置之懸滴汽相擴散

實驗條件與實例27相同，其例外情況為將500 μL 48種緩衝液調配物中之每一者吸入孔中且分別與500 μL Milli Q水混合。

結果： 自所測試之48種條件未觀測到晶體。

實例29－使用Hampton低離子強度篩之懸滴汽相擴散

使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。將1 mL 24% w/v PEG 3,350脫水劑溶液分別吸入108個孔中。將約2 μL蛋白質樣品吸於蓋玻片上且隨後與約1 μL 18種特定緩衝試劑中之一者混合。此後，將約2.5 μL六種不同濃度之一之PEG 3,350沉澱劑添加至液滴中。以翻轉蓋玻片密封孔，產生108種不同懸滴實驗。

將板儲存在環境溫度下。在接下來之7天內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所測試之108種條件未產生晶體。

實例30－以懸滴汽相擴散模式進行之硫酸銨/Bis－Tris丙烷柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由在各孔中混合硫酸銨儲備溶液、Bis－Tris丙烷儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，硫酸銨莫耳濃度為約0.5 M、1 M、1.5 M或2 M。Bis－Tris丙烷莫耳濃度始終為0.1 M且Bis－Tris丙烷緩衝液pH值為約5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。以如上所述之三種蛋白質濃度且分別以在環境溫度下儲存或在約27℃下儲存評估所得24種條件。在圓形矽化蓋玻片上將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液混合且以翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。三天後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所測試之144種條件三天後未產生晶體。

實例31－以懸滴汽相擴散模式進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵格篩選

使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由在各孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1、4.6、5.1或5.6。

應用磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀之以下組合：－約0.3 M磷酸二氫鈉與約0.3 M磷酸二氫鉀；－約0.6 M磷酸二氫鈉與約0.6 M磷酸二氫鉀；－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀；－約1.8 M磷酸二氫鈉，－約2.1 M磷酸二氫鈉，－約2.4 M磷酸二氫鈉。

以如上所述之三種蛋白質濃度設置各條件。將約1 μL蛋白質溶液與約1 μL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之一個月內多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。

結果： 自所評估之72個孔，以下結晶緩衝液產生呈針叢集形狀之晶體：－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀，pH值為約4.1；－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.6。

在所有三種蛋白質濃度下以該等條件均得到晶體。

實例32－以懸滴汽相擴散模式、在不同溫度下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵格篩選

除儲存溫度增至30℃外，實驗條件與實例31相同。

結果： 自所評估之72個孔，以下結晶緩衝液產生呈針叢集形狀之晶體：蛋白質濃度為約5 mg/mL：－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀，pH值為約4.1；－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.1。

－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.6。

－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約5.1。

蛋白質濃度為約10 mg/mL：－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀，pH值為約4.1；－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.6。

－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約5.1。

蛋白質濃度為約20 mg/mL：－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀，pH值為約4.1；及－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.1。

汽相擴散結晶實驗結果之討論： 最初使用充分描述之小規模方法進行結晶實驗。由於PEG 4,000/乙酸鈉緩衝液條件經研究不同抗原特異性或來源的不同抗體之其他發明者描述為具有前景之結晶條件，因此決定以該等試劑起始。廣泛實驗後發現至少在所研究之影響結晶之因素(蛋白質濃度、沉澱劑濃度、緩衝液離子強度及pH值、溫度)的組合下，於乙酸鹽緩衝液中之PEG 4,000並不提供晶體，且因此決定繼續廣泛結晶篩選，由此將多種化學品引入篩選過程。最後，意外地發現乙酸鹽緩衝液中之磷酸二氫鈉對於D2E7為強有力之結晶劑，其並不引入任何自醫藥觀點來看不可接受之毒性試劑。

D.批次結晶實驗

以下實例中所給出之濃度值為關於抗體溶液及結晶溶液之兩種溶液混合前的初始值。

若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指通常使用冰乙酸進行之pH值調節前儲備溶液中之乙酸鈉濃度。

實例33－在800 μL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉批次結晶

藉由在1.5 mL Eppendorff反應管中混合約400 μL之各蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備400 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。使用磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀之以下組合：約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀。將反應管儲存在環境溫度下。11天後進行1 μL等分試樣之顯微鏡觀察。

結果： 11天後未觀測到晶體。

實例34－在600 μL批次體積下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液(pH 7.4)中。將蛋白質濃度調整至10 mg/mL。

藉由在1.5 mL Eppendorff反應管中混合約300 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備300 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。磷酸二氫鈉莫耳濃度分別為約1.5 M、1.8 M、2.1 M及2.4 M。將反應管儲存在環境溫度下。11天後進行1 μL等分試樣之顯微鏡觀察。

結果： 11天後未觀測到晶體。

實例35－在1 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵格篩選批次結晶

在不交換緩衝液情況下使用D2E7。因此，初始組合物為D2E7 50/mL、甘露糖醇12 mg/mL、聚山梨醇酯80 1 mg/mL、檸檬酸單水合物1.305 mg/mL、檸檬酸鈉0.305 mg/mL、磷酸氫二鈉二水合物1.53 mg/mL、脫水磷酸二氫鈉0.86 mg/mL及氯化鈉6.16 mg/mL，pH 5.2。

藉由以Milli Q水稀釋使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1、4.6、5.1或5.6。使用磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀之以下組合：－約0.7 M磷酸二氫鈉與約0.7 M磷酸二氫鉀；－約0.9 M磷酸二氫鈉與約0.9 M磷酸二氫鉀；－約1.8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，－約2.1 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，－約2.4 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽。

製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。4天後進行板之顯微鏡觀察。

結果： 4天後未觀測到晶體。

實例36－在1 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵格篩選批次結晶

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液(pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1或4.6。分別應用以下磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀之組合：－約1.8 M磷酸二氫鈉與約0.8 M磷酸二氫鉀；－約2.2 M磷酸二氫鈉與約0.6 M磷酸二氫鉀；－以0.2 M為梯級自約2.6 M磷酸二氫鈉至約4.4 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽。

製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。在接下來之一週內多次進行板之顯微鏡觀察。此外，藉由OD280測定三個批次之晶體產量。在14,000 rpm下離心懸浮液之等分試樣且評估上清液中之蛋白質濃度。

結果： 於以下8個批次中發現針叢集狀晶體：－乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約3.6 M至約4.4之磷酸二氫鈉莫耳濃度(0.2 M梯級)；－乙酸鹽緩衝液pH 4.6及約4.0 M至約4.4之磷酸二氫鈉莫耳濃度(0.2 M梯級)。

評估乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約4.0 M至約4.4 M之磷酸二氫鈉莫耳濃度的批次之晶體產量。5天後如藉由OD280自上清液中剩餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。

組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在於該等批次中(乳狀懸浮液，典型光學顯微照片)。由於5天後未觀測到沉澱物質，推斷先前沉澱物質重新排列成結晶物質。蛋白質在結晶混合物中高度過飽和且蛋白質立即沉澱。一些蛋白質仍可溶解，現僅稍微過飽和或許甚至低於飽和。晶體形成，由此進一步降低溶解蛋白質之濃度。此外，沉澱物質明顯隨時間再溶解且併入生長之晶體中。

實例37－在1 mL批次體積、不同蛋白濃度下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉柵格篩選批次結晶

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1或4.6。磷酸二氫鈉莫耳濃度以0.2 M之梯級自約2.6 M磷酸二氫鈉變化至約4.4 M磷酸二氫鈉。製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。在接下來之一週內多次進行板之顯微鏡觀察。此外，藉由OD280測定一個特定批次之晶體產量。在14,000 rpm下離心懸浮液之等分試樣且評估上清液中之蛋白質濃度。

結果： 於以下6個批次中發現針叢集狀晶體：－乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約3.4 M至約4.4之磷酸二氫鈉莫耳濃度(0.2 M梯級)。

評估乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約4.2 M之磷酸二氫鈉莫耳濃度的批次之晶體產量。8天後如藉由OD280自上清液中剩餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。

組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在於該等批次中(乳狀懸浮液，典型光學顯微照片)。由於6天後未觀測到沉澱物質，推斷相變出現，其中先前沉澱物質重新排列成結晶物質。

實例38－在2 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶

藉由在2 mL Eppendorff反應管中混合約1 mL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備1 mL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。磷酸二氫鈉莫耳濃度為約4.0 M、4.2 M或4.4 M。將反應管儲存在環境溫度下。在接下來之1週內多次進行1 μL等分試樣之顯微鏡觀察。

結果： 6天後在所有批次中發現針叢集狀晶體。

組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在於該等批次中(乳狀懸浮液，典型光學顯微照片)。如實例36中所述，先前沉澱物質重新排列成結晶物質。

實例39－在1 mL批次體積、不同蛋白質濃度下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉柵格篩選批次結晶

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。磷酸二氫鈉莫耳濃度以0.2 M之梯級自約0.2 M變化至約4.4 M。製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。在接下來之一週內多次進行板之顯微鏡觀察。此外，藉由OD280測定批次之晶體產量。在14,000 rpm下離心懸浮液之等分試樣且評估上清液中之蛋白質濃度。

結果： 於以下2個批次中發現針叢集狀晶體：－約3.4 M及約3.6 M之磷酸二氫鈉莫耳濃度。

沉澱物質及油性沉澱相亦存在於含有該等晶體之批次中。

實例40－在20 mL批次體積、攪動下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由以Milli Q水稀釋使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在50 mL Falcon管中混合約10 mL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在管中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備10 mL結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。磷酸二氫鈉莫耳濃度為4.2 M。將管儲存在環境溫度下，於實驗室震盪器上攪動該批次。在接下來之一個月內多次進行1 μL溶液之等分試樣的顯微鏡觀察。

結果： 該批次中觀測到沉澱物質。

實例41a－在100 mL批次體積、無攪動下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由以Milli Q水稀釋使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在乾淨1 L聚丙烯瓶中混合約50 mL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在管中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備50 mL結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。磷酸二氫鈉莫耳濃度為4.2 M。將容器儲存在環境溫度下。在接下來之一個月內多次進行溶液之1 μL等分試樣的顯微鏡觀察。

結果： 7天後觀測到針叢集狀晶體。7天後如藉由OD280自上清液中剩餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。

組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質存在於該等批次中(乳狀懸浮液，典型光學顯微照片)。由於7天後未觀測到沉澱物質，推斷相變出現，其中先前沉澱物質重新排列成結晶物質。

實例41b－在1 mL、50 mL及10 L批次體積、無攪動下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶

亦藉由在10 L聚丙烯容器(Nalgene)中組合1 L於阿達木單抗商業緩衝液調配物pH 5.2(參見實例35)中之50 mg/mL D2E7與4 L注射用水(WFI)進行D2E7之大規模結晶。藉由輕輕震盪使溶液均質化。接著將該5 L D2E7溶液(10 mg/mL)與5 L沉澱劑溶液(5 M磷酸二氫鈉，4,400 mL；1 M乙酸鈉緩衝液pH 4.1，500 mL；WFI(Ampuwa)100 mL)混合。以500 mL份添加沉澱劑溶液。添加各部分後，藉由輕輕旋轉/翻轉瓶使溶液均質化。添加約2,500至3,000 mL沉澱劑溶液後，白色沉澱出現。立即全部添加剩餘沉澱劑。接著再次將晶體製劑均質化(輕輕旋轉/翻轉)。

批次製造後(亦即混合5 L D2E7溶液與5 L沉澱劑後)立即分為1 mL(填充入低容量Eppendorf樣品小瓶中)及50 mL等分試樣(填充入50 mL Falcon試樣管中)且鄰近於10 L容器儲存以便控制且評估批量大小對D2E7結晶之影響。如圖2至4所概述，批次體積(亦即分別1 mL、50 mL及10 L)對D2E7晶體針/針叢集尺寸無影響。

論述批次結晶實驗之結果： 由於所應用小規模技術(參見上文D部分)對於大規模生產蛋白質晶體不可行，因此將由該等小規模方法發現之結晶條件轉移至可縮放批次模式中。

D2E7以最終高產率(>95%)及再現性在100 mL批次體積下成功結晶，表明該結晶系統適用於工業處理。藉由SDS－PAGE分析，證明晶體之蛋白質特徵。對再溶解晶體之SE－HPLC分析僅展示聚集物質稍微增加。藉由使用含有磷酸二氫鈉之乙酸鹽緩衝液(於約0.1 M乙酸鈉pH值為約4.1中之約4.2 M磷酸二氫鈉)洗滌晶體為可能的。如藉由OD280所分析，無可量測之D2E7晶體溶解性在該洗滌緩衝液中出現，晶體之回收率大於90%。

以上批次實驗之實驗條件概括於下表1中：

E.晶體處理及分析之方法 實例42－洗滌晶體

晶體形成後，不使晶體再溶解之洗滌步驟係有利的。因此，結晶過程完成後，將結晶漿液轉移入離心管中且在500至1000×g下離心二十分鐘。在4℃下進行離心但亦可在其他可行溫度、例如室溫下進行。離心後，丟棄上清液且將晶體顆粒再懸浮於在約0.1 M乙酸鈉pH值為約4.1中含有約4.2 M磷酸二氫鈉之緩衝液中。如藉由OD280所分析，無可量測之D2E7晶體溶解性在洗滌緩衝液中出現。隨後將離心/再懸浮步驟重複1至3次，且在此洗滌程序後，將顆粒再懸浮且儲存於在約0.1 M乙酸鈉pH值為約4.1中含有約4.2 M磷酸二氫鈉之緩衝液中。

實例43－藉由SDS－PAGE分析晶體

為證實晶體之蛋白質特徵，以如實例42中所述之洗滌緩衝液洗滌晶體。藉由OD280確保在離心後不再有溶解之蛋白質存在於上清液中後，丟棄上清液且隨後將晶體溶解於蒸餾水中。該溶液之OD280量測揭示晶體基本上由蛋白質組成，此係由於現樣品之吸光率顯著高於殘餘洗滌緩衝液。當與原始D2E7樣品相比較時，再溶解晶體之該溶液之SDS－PAGE分析展示相同圖案。

F.其他實例

若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指通常使用冰乙酸進行之pH值調節前儲備溶液之乙酸鈉濃度。

實例44－固體結晶劑

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之乙酸鹽緩衝液(0.1 M，pH值分別為4.1或4.6)進行批次結晶。隨後，以六種不同比率將固體磷酸二氫鈉二水合物添加至各pH值環境中：約0.23 g、0.27 g、0.30 g、0.33 g、0.36 g及0.39 g。因此，在結晶劑之溶解完成後，濃度為約1.5至2.5 M，以0.2 M為梯級。隨後密封孔且在實驗室震盪器上攪動板直至結晶劑完全溶解。此後，在無振盪下將24孔板儲存於環境溫度下。5天後進行板之顯微鏡觀察。

結果： 於以下7個批次中發現針叢集狀晶體：－乙酸鹽緩衝液pH 4.1及分別為約2.1 M、2.3 M及2.5 M之磷酸二氫鈉莫耳濃度。

－乙酸鹽緩衝液pH 4.6及分別為約1.9 M、2.1 M、2.3 M及2.5 M之磷酸二氫鈉莫耳濃度。

實例45－不同緩衝液製備方案及晶體之製備

在該實例中，如以下所述製備乙酸鹽緩衝液：以約42 mL純水稀釋3 g冰乙酸。以氫氧化鈉溶液調節pH值且將體積調節至50 mL。在此情況下，總乙酸鹽量固定在1 M(結晶溶液中100 mM或結晶混合物中50 mM)且藉由pH值調節而擴大。

在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。

藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。

藉由在24孔板之孔中混合約500 μL蛋白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備500 μL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為0.1 M且乙酸鹽緩衝液pH值分別為約4.1及4.6。磷酸二氫鈉莫耳濃度以0.2 M之梯級自約3.4 M變化至約4.4 M。製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。5天後進行板之顯微鏡觀察。

結果： 於以下9個批次中發現針叢集狀晶體：－乙酸鹽緩衝液pH 4.1及以0.2為梯級約3.6至4.4之磷酸二氫鈉莫耳濃度。

－乙酸鹽緩衝液pH 4.6及以0.2為梯級約3.6至4.2之磷酸二氫鈉莫耳濃度。

實例46－製備囊封晶體

如使用Malvern Instruments Zetasizer nano經由Z電位量測所測定，實例41中獲得之晶體帶正電荷。

洗滌晶體且懸浮於保留結晶性且具有保持晶體帶電荷的pH值之含有賦形劑之緩衝液中。隨後，將適當囊封劑添加至晶體懸浮液中。在此情況下，適當囊封劑為具有低毒性、生物可降解性及抗衡離子特徵之(聚合型)物質。歸因於該抗衡離子特徵，該物質被吸引至晶體且允許塗佈。藉由該技術，晶體在並不含有任何其他維持結晶性的賦形劑之介質中之溶解較佳得以保持。

實例47－囊封/包埋晶體之製備

如實例41中所述獲得晶體。

洗滌晶體且將其懸浮於含有保留結晶性之賦形劑的緩衝液中。

晶體可隨後：－藉由乾燥晶體且藉由例如壓縮、熔體分散等組合該等乾燥晶體與載劑來包埋。

－藉由組合晶體懸浮液與不可與水混溶之載劑溶液來囊封/包埋。移除載劑之溶劑後載劑沉澱。隨後，乾燥材料。

－藉由組合晶體懸浮液與可與水混溶之載劑溶液來囊封/包埋。當混合物中載劑超過其溶解度極限時載劑沉澱。

－藉由組合乾燥晶體或晶體懸浮液與可與水混溶之載劑溶液來包埋。

－藉由組合乾燥晶體與不可與水混溶之載劑溶液來包埋。

G.晶體表徵

概述經執行以確定晶體物質在再溶解後結晶單株抗體D2E7是否保留從未結晶之D2E7的生物活性特徵之以下實驗部分。

G1.利用鼠類L－929細胞之生物活性測試 a)一般方法測定D2E7溶液對抗重組人類TNF(rHuTNF)之細胞毒性效應的中和效應。此包括在37℃下在96孔微量滴定盤中在各種D2E7濃度存在下將作為指示劑之小鼠L－929細胞與確定量之rHuTNF一起培育48小時。以結晶紫(crystal violet)將存活細胞染色。藉由分光光度測定法在微量滴定盤之個別孔中量測顏色強度且對其加以評估。量測IC₅₀ 值，亦即使rHuTNF對L－929細胞之細胞毒性效應降低以使得50%之細胞存活的D2E7之濃度。

在獨立稀釋框中，對於樣品及參考標準由1 μg蛋白質/毫升稀釋液起始，在稀釋管中分別製備9力價曲線量測點(曲線稀釋)。

以培養基稀釋欲使用之L－929細胞懸浮液以提供每毫升60,000個細胞之濃度。隨後，將每孔100 μL之各別細胞濃度吸入測試板之第1－11行。第12行之孔各自僅含有100 μL之培養基。在測試板中在37℃及5%(v/v)CO₂ 下培育24小時。

培育24小時後，對於參考標準或樣品將50 μL之9力價曲線稀釋液之每一者自稀釋框轉移至測試板，亦即對於參考標準，轉移至第1－9行第A－D列之孔且對於樣品轉移至第1－9行第E－H列之孔。

將50 μL培養基吸入第10行；且將100 μL各自吸入第11及12行。

將50 μL之TNF參考標準(12.5 ng蛋白質/毫升培養基)吸入第1至10行第A至H列之孔，由此第10行對應於100%溶胞值(TNF對照)。

第11行為100%生長對照，且第12行不含有細胞物質且因此充當空白。每孔最終體積為200 μL。

在37℃下且以5% CO₂ 將測試板培育48小時。培育2天後，藉由迅速翻轉且給予單次有力向下震盪拋棄測試板孔中之液體。接著將50 μL結晶紫溶液(0.75%結晶紫、0.35%氯化鈉、32.4%乙醇及8.6%甲醛)吸入各孔。將溶液保持在孔中15分鐘且隨後如上所述丟棄。接著洗滌板且在室溫下乾燥約30分鐘。隨後，將100 μL試劑溶液(50%乙醇及0.1%乙酸)吸入各孔。攪動板(在約300 rpm下15 min)在各孔中產生均勻有色溶液。

在板光度計中在620 nm下量測測試板孔中染料之吸光率。在圖表上繪製個別值，以吸光率(y軸)對抗體之個別稀釋度或濃度ng/mL(x軸)作圖。自4參數曲線圖，讀出半數細胞存活且半數死亡之濃度(IC₅₀ 值)。藉由曲線資料之4參數函數之參數3計算此濃度。計算參考標準濃度之平均值。藉由將參考標準之平均IC₅₀ 值除以樣品之個別IC₅₀ 值且乘以100%計算樣品之相對生物活性。接著將相對活性平均化。

b)D2E7晶體之相對活性進行該測試以比較樣品與參考標準之生物活性。相對D2E7之濃度繪示且藉由4參數非線性回歸評估之吸收值揭示藉由抗體抑制TNF作用之IC₅₀ 值。由於兩種樣品均以四重複在一個微板上進行，因此對於D2E7參考標準及樣品此舉分別得到4個IC₅₀ 值。隨後，計算參考標準IC₅₀ 值之平均值且藉由將參考標準之平均IC₅₀ 值除以樣品之相關IC₅₀ 值且乘以100%評估樣品之各重複之相對活性。

樣品之測試(如實例36中所述製備之晶體懸浮液2.7 mg/mL)揭示111%之相對生物活性。

因此，可認為樣品具有完全生物學活性。

G2.微觀表徵 在以下提供關於D2E7晶體之微觀表徵的資料。

a)mAb晶體批次樣品之光學分析均化後，將1至10 μL樣品體積之等分試樣吸於目標固持板上且以蓋玻片覆蓋。分別使用裝備有E－PI 10倍目鏡及10倍、20倍及40倍物鏡之Zeiss Axiovert 25倒轉光學顯微鏡評估晶體製劑。使用數位攝影機(Sony Cybershot DSC S75)拍攝照片。

b)汽相擴散實驗之光學分析、近似晶體尺寸之評估及雙折射之偵測對於此目的，分別使用裝備有CFW 10倍目鏡及4倍、10倍、20倍及40倍物鏡之Nikon Labophot顯微鏡。

對於評估汽相擴散實驗，篩選24孔板中之樣品液滴。

藉由藉助於JVC TK C1380彩色攝像機將顯微照片轉移於電腦屏幕上且藉由量測代表性針狀或針叢集狀晶體之長度或直徑，應用JVC Digital Screen Measurement Comet軟體版本3.52a評估晶體尺寸。此外，顯微鏡裝備有濾光器組(偏光器及分析器)以評估樣品之雙折射行為。

若偏光器及分析器濾光器之偏振方向相對於彼此設置在90°角度("正交偏光器")，則光不會穿過顯微鏡目鏡；影像將呈現深色或黑色。若現在置於正交偏光器之間的光束中之樣品能夠使光之偏振面旋轉，則相對於深色背景將觀察到樣品之獨特微光。此行為稱為"雙折射"，使有序結晶型(各向異性)物質與無序非晶形物質區分開。由於雙折射為各向異性物質之特徵，因此此微光出現證明晶體物質之存在。然而，雙折射之缺乏並不排除晶體物質之存在，此係因為晶體亦可顯示立體對稱且因此如非晶形物質般為各向同性的。

c)結果在附圖1至4中提供D2E7晶體之代表性照片。

圖1展示藉由小規模批次結晶根據實例37在室溫下6天後獲得之D2E7晶體(5 mg/mL最終蛋白質濃度；結晶緩衝液：於0.1 M乙酸鈉(pH 4.1)中之4.2 M磷酸二氫鈉)。晶體顯示雙折射。

圖2至4展示藉由大規模批次結晶根據實例41b獲得之D2E7晶體。

可注射性：併入晶體中且於含有20%(m/v)PEG 4,000之緩衝液中調配之D2E7晶體懸浮液200 mg/mL蛋白質可經由27 1/2 G針注射。

G3.雙折射 為證明阿達木單抗結晶實際上提供結晶物質，分析其雙折射。

蛋白質： 以雙蒸餾水將於調配緩衝液中之70 mg/mL阿達木單抗稀釋至10 mg/mL。

沉澱劑： 4 M NaH₂ PO₄ (於雙蒸餾水中之溶解粉末)

方法： 於具有2 mL隔室孔之懸滴盤中微批次結晶，混合500 μL蛋白質溶液與500 μL蛋白質；溶液中無NaOAc。

溫度：24℃。

用於雙折射量測之技術設備： 裝備有Nikon CoolPix CCD攝影機之Nikon SMZ1500立體解剖顯微鏡。在正交偏光器下拍攝晶體雙折射。放大倍數為約200倍。

相應顯微圖展示於圖5A中。觀測到阿達木單抗之針狀晶體之叢集之顯著雙折射。當晶體針軸之方向相對於光偏振方向旋轉時，晶體之彩色自藍色變化至紅色，接著回到藍色。

另一組顯微圖描述於圖5B、C及D中。

以Nikon Eclipse E600 POL顯微鏡及Nikon DXM 1200數位攝影機拍攝所有影像。放大倍數為約40倍。

以水平極拍攝到圖5B之影像(灰色)且其展示顆粒形態。黑色背景上之白色晶體(圖5D)展示雙折射且係以交叉極獲得。紫色背景上之藍色及橙色晶體(圖5C)展示雙折射且係以交叉極及紅色補償器或四分之一波片獲得。

H.晶體可注射性

在以下部分，進行實驗以測定單株抗體D2E7之結晶懸浮液(於PEG中)(10－200 mg/mL)使用不同號針之可注射性。

PEG緩衝液：20% PEG 4,000 m/v 12 mg/mL甘露糖醇0.1 mg/mL聚山梨醇酯80 1.305 mg/mL檸檬酸單水合物0.305 mg/mL檸檬酸鈉1.53 mg/mL脫水磷酸氫二鈉0.86 mg/mL脫水磷酸二氫鈉pH值以氫氧化鈉調節至5.2

由於注射器在投藥過程中藉由患者手動，因此進行注射器排空(1 mL填充體積)。評估20－27.5G針尺寸。

注射器：20/23/26G： Henke Sass Wolf GmbH 1 mL Norm－Ject注射器，其裝備有：－Henke Sass Wolf GmbH Fine－Ject20G針－Terumo23G針－Neopoint26G針

27.5G： BD HyPak SCF^TM 1 mL長注射器，其裝備有27.5G RNS針38800 Le Pont du Claix

結果(圖6)表明較大號針在高濃度下提供晶體之較慢傳遞。

I.穩定性資料(SE HPLC、FT－IR)

在以下部分，進行實驗以測定單株抗體D2E7之結晶懸浮液(50及200 mg/mL)經在2－8℃下儲存12個月之穩定性。

晶體懸浮於如可注射性研究中所用之介質中：20% PEG 4,000 m/v 12 mg/mL甘露糖醇0.1 mg/mL聚山梨醇酯80 1.305 mg/mL檸檬酸單水合物0.305 mg/mL檸檬酸鈉1.53 mg/mL無水磷酸氫二鈉0.86 mg/mL無水磷酸二氫鈉pH以氫氧化鈉調節至5.2

SE－HPLC 50 mg/mL阿達木單抗晶體懸浮液在2－8℃下隨時間之穩定性

200 mg/mL阿達木單抗

使用Dionex HPLC系統(P680泵、ASI 100自動進樣器、UVD170U)以藉由SEC進行穩定性分析。應用0.5 mL/min之流速，在GE Superose6柱上分離D2E7樣品。在214 nm之波長下進行UV定量(偵測)。電泳緩衝液由於0.02 M磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中之0.15 M氯化鈉組成。以Confocheck系統在Bruker Optics Tensor 27上記錄IR光譜。使用MicroBio－lytics AquaSpec單元分析液體樣品。在25℃下進行至少兩次120至500掃描之量測，評估各樣品。分別自蛋白質光譜中減去空白緩衝液光譜。藉由傅裏葉變換(Fourier transformation)產生蛋白質二階導數光譜且自1580－1720 cm^－1 將載體正規化以用於相對比較。晶體之再溶解係如下執行：以Humira商業緩衝液將晶體懸浮液稀釋至10 mg/mL蛋白質濃度。藉由降低PEG濃度使晶體再溶解。

藍色－標準，冷凍/解凍後之Humira紅色－在25℃、50 mg/mL儲存6個月後之再溶解晶體綠色－在25℃、200 mg/mL儲存6個月後之再溶解晶體結果：圖7說明在25℃下儲存6個月後不存在構形差異

J.形態學

在2－8℃儲存12個月後，藉由光學顯微術分析晶體未觀測到顯著形態變化。

將1至10 μL樣品體積之等分試樣吸於目標固持板上，以調配緩衝液(20% PEG)稀釋且用蓋玻片覆蓋。分別使用裝備有E－PI 10倍目鏡及10倍、20倍及40倍物鏡之Zeiss Axiovert 25倒轉光學顯微鏡評估製劑。

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圖1 6天後實例37之D2E7晶體。

圖2 以1mL批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。

圖3 以50mL批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。

圖4 以10L批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。

圖5 根據本發明製備之D2E7晶體及其雙折射。

圖6 經由不同號針注射之不同濃度之1mL D2E7晶體懸浮液(20% PEG緩衝液)之耗盡時間。

圖7 D2E7晶體懸浮液之FT-IR分析。

<110> 百慕達商亞培生物科技公司<120> 結晶型抗－hTNFα抗體<130> 8216 <140> 096140427 <141> 2007－10－26 <150> 60/855,104 <151> 2006－10－27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7輕鏈之可變區<400> 1<210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7重鏈之可變區<400> 2<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7輕鏈CDR3區<220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa為Thr或Ala <400> 3<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7重鏈CDR3區<220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa為Tyr或Asn <400> 4<210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7輕鏈序列<400> 5 <210> 6 <211> 451 <212> PRT <213> 人工<220> <223> D2E7重鏈序列<220> <221> MISC_FEATURE <222> (451)..(451) <223> Xaa缺失或為Lys <400> 6

(無元件符號說明)

Claims

一種IgG之人類抗hTNFα抗體之晶體，其包含各分子量為約50kDa之兩個重鏈及含有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)，其中該晶體具有針狀形態，其長度為約2-500μm且l/d比率為約3至30。
如請求項1之晶體，其中該抗體係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4抗體組成之群。
如請求項1之晶體，其中該抗體係IgG1抗體。
如請求項1之晶體，其中該抗體係阿達木單抗(adalimumab)(D2E7)。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項1之抗-hTNFα抗體之晶體，及(b)至少一種醫藥賦形劑；其中該組合物係以固體、半固體或液體調配物形式提供，各調配物含有呈結晶形式之該抗體。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項1之抗-hTNFα抗體之晶體，及(b)至少一種包埋或囊封該抗體之晶體之醫藥賦形劑。
如請求項5之醫藥組合物，其中該組合物具有大於約1mg/ml之抗體濃度。
如請求項5之醫藥組合物，其中該組合物具有大於約200mg/ml之抗體濃度。
如請求項5之醫藥組合物，其中該賦形劑包含至少一種聚合型視情況生物可降解之載劑或至少一種油性或脂質載劑。
如請求項9之醫藥組合物，其中該聚合型載劑為選自由以下各物組成之群中的一或多者之聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(β-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物。
一種可注射液體組合物，其包含如請求項1之抗-hTNFα抗體之晶體，且具有在約10至400mg/ml範圍之抗體濃度。
一種晶體漿液，其包含如請求項1之抗-hTNFα抗體之晶體，其具有大於約100mg/ml之抗體濃度。
一種用於使抗-hTNFα抗體結晶之批次結晶方法，其包含以下步驟：(a)提供該抗體與作為結晶劑之無機磷酸鹽混合的水溶液以獲得水性結晶混合物，其中該水性結晶混合物具有約pH 3至5之pH值；及(b)培育該水性結晶混合物直至形成該抗體之晶體，其中該抗-hTNFα抗體為含有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)之IgG之人類抗hTNFα抗體，且其中該晶體具有針狀形態，其長度為約2-500μm且l/d比率為約3至30。
如請求項13之結晶方法，其中該水性結晶混合物含有緩衝劑。
如請求項14之結晶方法，其中該緩衝劑包含乙酸鹽緩衝劑。
如請求項15之結晶方法，其中該緩衝劑包含乙酸鈉。
如請求項14之結晶方法，其中該水性結晶混合物中之該緩衝劑濃度為0M至0.5M。
如請求項15之結晶方法，其中該水性結晶混合物中之該緩衝劑濃度為0M至0.5M。
如請求項16之結晶方法，其中該水性結晶混合物中之該緩衝劑濃度為0M至0.5M。
如請求項13之結晶方法，其中該磷酸鹽為磷酸氫鹽。
如請求項13之結晶方法，其中該磷酸鹽為鹼金屬鹽或至少兩種不同鹼金屬鹽之混合物。
如請求項13之結晶方法，其中該結晶混合物中之該磷酸鹽濃度在約1至6M之範圍。
如請求項22之結晶方法，其中該結晶混合物中之該鹽濃度在約1.0至3.0M之範圍。
如請求項13之結晶方法，其中以下之其他結晶條件中之至少一者要符合： a)執行培育歷時約1小時至約60天；b)在約4℃與約37℃的溫度下執行培育；c)該抗體濃度在約0.5至約100mg/ml之範圍。
如請求項24之結晶方法，其進一步包含乾燥該等晶體之步驟。
如請求項24之結晶方法，其進一步包含以不同緩衝液交換結晶母液之步驟。
如請求項24之結晶方法，其中該批次包含在約1ml至20,000公升之範圍之批次體積。
一種完整的阿達木單抗之晶體，其中該晶體具有針狀形態，其長度為約2-500μm且l/d比率為約3至30。
如請求項28之晶體，其中該抗體係非糖基化抗體。
一種組合物，其包含如請求項28之晶體。
如請求項30之組合物，其中該組合物具有大於約1mg/ml之抗體濃度。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項28之晶體，及(b)至少一種醫藥賦形劑。
如請求項32之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係以固體、半固體或液體調配物形式提供。
如請求項33之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有大於約200mg/ml之抗體濃度。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項28之晶體，及(b)至少一種包埋或囊封該抗體之晶體之醫藥賦形劑。
如請求項35之醫藥組合物，其中該賦形劑包含至少一種聚合型載劑或至少一種油性或脂質載劑。
如請求項36之醫藥組合物，其中該聚合型載劑為選自由以下各物組成之群中的一或多者之聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(β-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物。
一種可注射液體組合物，其包含如請求項28之晶體，其中該組合物具有在約10至400mg/ml範圍之抗體濃度。
一種晶體漿液，其包含如請求項28之晶體，其中該漿液具有大於約100mg/ml之抗體濃度。
一種包含D2E7抗體(阿達木單抗)之晶體之組合物，該組合物係由批次結晶方法獲得，其中該晶體具有針狀形態，其長度為約2-500μm且l/d比率為約3至30。
如請求項40之組合物，其中該抗體係非糖基化抗體。
如請求項40之組合物，其中該組合物具有大於約1mg/ml之抗體濃度。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項40之組合物，及(b)至少一種醫藥賦形劑。
如請求項43之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係以固體、半固體或液體調配物形式提供。
如請求項43之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有大於約200mg/ml之抗體濃度。
一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項40之組合物，及(b)至少一種包埋或囊封該抗體之晶體之醫藥賦形劑。
如請求項46之醫藥組合物，其中該賦形劑包含至少一種聚合型載劑或至少一種油性或脂質載劑。
如請求項47之醫藥組合物，其中該聚合型載劑為選自由以下各物組成之群中的一或多者之聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(縮肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(β-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二噁酮)、聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多醣、其摻合物及共聚物。
一種用於使IgG之人類抗hTNFα抗體結晶之批次結晶方法，其包含以下步驟：(a)混合該抗體、無機磷酸鹽及乙酸鹽緩衝劑之水溶液以獲得水性結晶溶液，其中該水性結晶混合物具有約pH 3至5之pH值、具有0M至0.5M之緩衝劑濃度、具有約 1至6M之磷酸鹽濃度、及具有約0.5至100mg/ml之抗體濃度；及(b)在約4℃至37℃的溫度下培育該水性結晶混合物直至形成該抗體之晶體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)，且其中該晶體具有針狀形態，其長度為約2-500μm且l/d比率為約3至30。
如請求項49之結晶方法，其中該抗體係D2E7抗體(阿達木單抗)。
如請求項49或50之結晶方法，其進一步包含乾燥該等晶體之步驟。
如請求項49或50之結晶方法，其進一步包含以不同緩衝液交換結晶母液之步驟。
如請求項49或50之結晶方法，其中該方法係在批次體積在約1ml至20,000公升之範圍執行。
一種如請求項1至4、28及29中任一項之晶體之用途，其係用於製備治療哺乳動物之藥劑。
一種如請求項5至10、32至37及43至48中任一項之醫藥組合物、如請求項11或38之液體組合物或如請求項40至42中任一項之組合物之用途，其係用於製備治療哺乳動物之藥劑。
如請求項54或55之用途，其中該藥劑係藉由非經腸途徑、經口途徑或藉由注射投予。
一種如請求項1至4、28及29中任一項之晶體之用途，其係用於製備治療個體中TNFα相關病症之藥劑。
如請求項57之用途，其中該TNFα相關病症係選自由以下各病症組成之群：自體免疫疾病，尤其類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎及痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎及腎病症候群；感染性疾病、移植物排斥或移植物對抗宿主疾病、惡性疾病、肺部病症、腸道病症、心臟病症、發炎性骨骼病症、骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴發型肝炎、凝血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形成、發熱、牙周疾病、肥胖症及輻射毒性；脊椎關節病、肺部病症、冠狀動脈病症、代謝障礙、貧血、疼痛、肝病症、皮膚病症、指甲病症或脈管炎、白塞氏病(Behcet's disease)、強直性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩氏病(Crohn's disease)相關病症、青年類風濕性關節炎(JRA)、C型肝炎病毒感染、牛皮癬、牛皮癬性關節炎及慢性斑塊牛皮癬、年齡相關惡病質、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、腦水腫、發炎性腦損傷、慢性疲勞症候群、皮肌炎、藥物反應、脊髓中及/或其周圍水腫、家族性週期性發熱、費爾提氏症候群(Felty's syndrome)、纖維化、絲球體腎炎(例如鏈球菌感染後絲球體腎炎或IgA腎病)、假肢鬆動、顯微鏡下多血管炎、混合型結締組織病症、多發性骨髓瘤、癌症及惡病質、多器官病症、骨髓發育不良症候群、睪丸炎性(orchitism)、骨質溶解、包括急性、慢性及胰膿腫之胰腺炎、牙周疾病、多發性肌炎、進行性腎衰竭、假性痛風、壞疽性膿皮病、復發性多軟骨炎、風濕性心臟病、類肉瘤病、硬化性膽管炎、中風、胸腹主動脈瘤修復(TAAA)、TNF受體相關週期性症候群(TRAPS)、與黃熱病疫苗接種有關之症狀、與耳相關之發炎性疾病、慢性耳部炎症或小兒耳部炎症、葡萄膜炎、坐骨神經痛、前列腺炎、子宮內膜異位、脈絡膜新血管生成、狼瘡、修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)及濕性黃斑退化。
如請求項1至4、28及29中任一項之之晶體，其係用作藥物。