MXPA06007094A - Metodos para tratar asma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para agentes utiles para tratar asma. Los metodos incluyen seleccionar agentes que inhiben la produccion de una proteina PKC-?, asi como tambien agentes que inhiben la actividad de cinasa de una proteina PKC-?, o un fragmento funcional de la misma, en donde tales agentes son utiles para tratar el asma. Tambien se incluyen metodos para seleccionar agentes que inhiben la produccion de un producto de gen reportero codificado por una secuencia de acido nucleico operablemente ligada a un promotor de PKC-?. Tambien se describen metodos para tratar asma que incluyen, administrar un agente que inhibe la produccion de una proteina PKC-? funcional o la actividad de cinasa de una proteina PKC-? o un fragmento funcional de la misma. Tambien se describe una celula mastil aislada que carece de la expresion de una PKC-? endogena.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR ASMA Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de biología e inmunología. Específicamente, la invención se refiere al asma y métodos para tratar el asma.

Antecedentes de la Invención El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias caracterizada por episodios recurrentes de obstrucción reversible de las vías respiratorias e hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) . Las vías respiratorias de pacientes con asma son frecuentemente sensibles e inflamadas. Cuando un paciente con asma entra en contacto con un alérgeno o algo que irrita sus vías respiratorias, las vías respiratorias se estrechan (es decir, los músculos alrededor de las paredes de las vías respiratorias se aprietan) , haciendo difícil para el paciente, respirar. El revestimiento de las vías respiratorias se llega a inflamar, conduciendo a la producción de flema y otras manifestaciones clínicas de alergia. Otras manifestaciones clínicas de asma incluyen respiración entrecortada, respiración sibilante, tos y compresión en el pecho, que llegan a poner en riesgo la vida o, en algunos casos, son fatales.

REF. : 172678 Mientras existen terapias enfocadas a reducir los broncoespasmos sintomáticos y la inflamación pulmonar, existe un conocimiento creciente del papel de la remodelación de las vías respiratorias de largo término en el deterioro acelerado del pulmón en asmáticos. La remodelación de las vías respiratorias se refiere a un número de características patológicas que incluyen, músculo liso epitelial e hiperplasia del miofibroblasto y/o metaplasia, fibrosis subepitelial y deposición de matriz. El proceso resulta colectivamente en hasta aproximadamente 300% de grosor de las vías respiratorias en el caso de asma fatal . Debido al progreso considerable que se ha hecho al poner en claro la patofisiología del asma, prevalencia, morbidez y mortalidad de la enfermedad, se ha incrementado durante las pasadas dos décadas. Los últimos datos disponibles indican que aproximadamente 20 millones de personas en los Estados Unidos, y más de 150 millones de personas alrededor del mundo, sufren de asma. En la primer parte de esta década, solo en los Estados Unidos, cerca de 1.9 millones de visitas a salas de emergencia, 454,000 hospitalizaciones y más de 4,000 muertes, fueron directamente atribuidas al asma en una base anual . Se acepta de manera general, que el asma alérgica es iniciada por una reacción inflamatoria inapropiada por alérgenos en el aire. Los pulmones de asmáticos, demuestran una infiltración intensa de linfocitos, células mástil y especialmente eosinófilos. Aunque la investigación actual ha revelado algunas de las interacciones moleculares y celulares complejas que contribuyen a la inflamación observada en asma, existe -todavía un espacio significante de conocimiento. Como un resultado de la búsqueda en las causas del asma, ha llegado a estar disponible una amplia variedad de fármacos para tratar los síntomas del asma. Sin embargo, muchos de los fármacos tienen varias desventajas que los hace menos que ideales para el tratamiento del asma. Por ejemplo, muchos fármacos, tales como epinefrina e isoproterenol, solamente mitigan los síntomas del asma por un periodo corto de tiempo. Adicionalmente, algunos fármacos como corticoesteroídes, tienen varios efectos colaterales, los cuales limitan su uso crónico. Existe una necesidad clara, no solamente para un entendimiento molecular incrementado del asma, sino también para terapéuticos benéficos para el asma. La presente invención dirige estas necesidades .

Sumario de la Invención La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de los inventores, de que la proteína cinasa C theta (PKC-T) , juega un papel en los estados de enfermedad respiratoria, que incluyen asma. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para identificar agentes útiles para tratar asma, métodos para tratar pacientes que sufren de asma o síntomas similares al asma, y células mástil aisladas que carecen de la expresión de la proteína PKC-T endógena . Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para identificar un modulador de una proteína PKC-T. El método incluye poner en contacto una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma con un agente de prueba; y determinar si el agente de prueba modula la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional del mismo, en donde un cambio en la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma en la presencia del agente de prueba, es indicativo de un modulador de una proteína PKC-T. En ciertas modalidades, la etapa de determinación comprende comparar la actividad de cinasa del agente de prueba con relación a la ausencia del agente de prueba. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que reduce la actividad de cinasa, es un inhibidor de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que incrementa la actividad de cinasa es un activador de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la actividad de cinasa de la proteína PKC-T, un fragmento funcional de la misma por al menos dos veces . En ciertas modalidades, la proteína PKC-T es una proteína PKC-T de longitud completa. En algunas modalidades, la proteína PKC-T es una variante funcional de una proteína PKC-T de longitud completa. En modalidades particulares, el fragmento funcional es un dominio de cinasa PKC-T. En algunas modalidades, la etapa de contacto se efectúa proporcionando una mezcla de reacción de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, y el agente de prueba. En ciertas modalidades, la mezcla de reacción está en un amortiguador que comprende una concentración de NaCl que se selecciona del grupo que consiste de 50 mM-100 mM, 100-150 mM, 150-200 mM, y 200-250 mM, y 250-300 mM. En modalidades particulares, la concentración de NaCl es 250 mM. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar asma en un mamífero, tal como un humano. En algunas modalidades, el asma es un asma mediado por IgE. En modalidades particulares, el método además incluye valorar la eficacia del agente de prueba en un modelo de asma in vi tro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficacia incrementada en el modelo de asma in vi tro o in vivo, comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar el asma.

En algunas modalidades, la proteína PKC-T, o un fragmento de la misma, se obtiene a partir de una célula procariótica, tal como una célula bacteriana (por ejemplo, E. coli) . En algunas modalidades, la etapa de contacto se efectúa en una célula. En ciertas modalidades, la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, es la autofosforilación de la proteína PKC-T o el fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID NO:l, seleccionada del grupo que consiste del residuo de serina en la posición 695, el residuo de serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538, y el residuo de treonina en la posición 536. En modalidades particulares, la autofosforilación ocurre en el residuo de tre?nina en la posición 538 de la SEC ID NO:l. En algunas modalidades, el método incluye el contacto de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma con el agente de prueba, así como también un sustrato de PKC-T. En ciertas modalidades, la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, es la fosforilación del sustrato PKC-T. En algunas modalidades, el sustrato PKC-T comprende una porción R-X-X-S o una porción R-X-X-T, en donde R es una arginina, X puede ser un aminoácido desconocido o puede ser cualquier aminoácido, S es serina, y T es treonina. Por ejemplo, el sustrato PKC-T puede tener una secuencia de aminoácido (basada en el código universal de aminoácido de una sola letra) , seleccionada del grupo que consiste de KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 5), FARKGSLRQKN (SEC ID NO: 6), FARKGSLRQ (SEC ID NO: 15), KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 16), QKRPSQRSKYL (SEC ID NO: 17), KIQASFRGHMA (SEC ID NO: 18 ) LSRTLSVAAKK (SEC ID NO: 19), AKIQASFRGHM (SEC ID NO: 20 ) VAKRESRGLKS (SEC ID NO : 21) KAFRDTFRLLL (SEC ID NO: 22 ) PKRPGSVHRTP (SEC ID NO: 23) ATFKKTFKHLL (SEC ID NO: 24 ) SPLRHSFQKQQ (SEC ID NO: 25) KFRTPSFLKKS (SEC ID NO: 26) IYRASYYRKGG (SEC ID NO: 27), KTRRLSAFQQG (SEC ID NO: 28), RGRSRSAPPNL (SEC ID NO : 29), MYRRSYVFQT (SEC ID NO : 30), QAWSKTTPRRI (SEC ID NO: 31), RGFLRSASLGR (SEC ID NO: 32), ETKKQSFKQTG (SEC ID NO: 33), DIKRLTPRFTL (SEC ID NO: 34), APKRGSILSKP (SEC ID NO: 35) MYHNSSQKRH (SEC ID NO: 36), MRRSKSPADSA (SEC ID NO: 37), TRSKGTLRYMS (SEC ID NO: 38), LMRRNSVTPLA (SEC ID NO: 39), ITRKRSGEAAV (SEC ID NO: 40), EEPVLTLVDEA (SEC ID NO: 41), SQKRPSQRHGS (SEC ID NO: 42), KPFKLSGLSFK (SEC ID NO: 43), AFRRTSLAGGG (SEC ID NO: 44), ALGKRTAKYR (SEC ID NO: 45), WRTDSLKGRR (SEC ID NO: 46), KRRQISIRGIV (SEC ID NO: 47), PWQVSLRTRF (SEC ID NO: 48), GTFRSSIRRLS (SEC ID NO: 49), RWGGSLRGAQ (SEC ID NO: 50), LRQLRSPRRTQ (SEC ID NO: 51), KTRKISQSAQT- (SEC ID NO: 52), NKRRATLPHPG (SEC ID NO : 53), SYTRFSLARQV (SEC ID NO : 54), NSRRPSRATWL (SEC ID NO: 55), RLRRLTAREAA (SEC ID NO: 56), NKRRGSVPILR (SEC ID NO: 57), GKRRPSRLVAL (SEC ID NO: 58), QKKRVSMILQS (SEC ID NO : 59), y RLRRLTAREAA (SEC ID NO : 60) . En algunas modalidades, la proteí?a PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, está en una célula, tal como una célula mástil o una célula T CD4+. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un modulador de una proteína PKC-T, que comprende poner en contacto una célula que expresa una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba, y determinar si el agente de prueba reduce la cantidad de proteína PKC-T funcional en la célula, en donde un agente de prueba que reduce la cantidad de proteína PKC-T funcional en la célula, es identificado como un modulador de una proteína PKC-T. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar asma en un mamífero, tal como un humano. En algunas modalidades, el asma es asma mediado por IgE. En modalidades particulares, el método además incluye valorar la eficacia del agente de prueba en un modelo de asma in vi tro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficacia incrementada en el modelo de asma in vi tro o in vivo, comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar asma. En algunas modalidades, el agente reduce la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína PKC-T funcional en la célula. En modalidades particulares, el asma es asma mediada por IgE. En algunas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas 5 modalidades, la proteína PKC-T funcional está en una célula, tal como una célula mástil o una célula T CD4+ (por ejemplo, una célula T TH2) . En ciertas modalidades, el agente reduce la cantidad de un ARN que codifica la proteína PKC-T funcional. 10. En algunas modalidades, el agente inhibe la traducción de un ARN que codifica la proteína PKC-T funcional. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un agente útil para tratar asma en un mamífero, que comprende poner en contacto una secuencia de 15 nucleótido que codifica un producto de gen reportero operablemente ligado a un promotor PKC-T con un agente de prueba y determinar si el agente de prueba reduce la producción del producto de gen reportero, en donde un agente de prueba que reduce la producción del producto de gen 0 reportero es identificado como un agente útil para tratar asma. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen reportero operablemente ligado a un promotor PKC-T, está en una célula (por ejemplo, 5 una célula mástil o célula T CD4+) . En algunas modalidades, la célula mástil carece de expresión de la proteína PKC-T endógena. En ciertas modalidades, el producto de gen reportero es luciferasa, ß-galactosidasa, acetiltransferasa de cloranfenicol, . ß-glucoronidasa, fosfatasa alcalina, o proteína fluorescente verde . - En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un modulador de una proteína PKC-? . El método comprende poner en contacto una célula que expresa la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba; y determinar si el agente de prueba reduce la fosforilación de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma en una célula, en donde un agente de prueba que reduce la fosforilación de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, es identificado como un modulador de una proteína PKC-T. En algunas modalidades, la etapa de determinación comprende comparar la actividad cinasa del agente de prueba con relación a aquella en la ausencia del agente de prueba. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que reduce la actividad cinasa, es un inhibidor de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que incrementa la actividad cinasa, es un activador de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la actividad cinasa de la proteína PKC-?, o un fragmento funcional de la misma, por al menos dos veces . En ciertas modalidades, la proteína PKC-T es una proteína PKC-T de longitud completa. En algunas modalidades, la proteína PKC-T es una variante funcional de una proteína PKC-T de longitud completa.- En modalidades particulares, el fragmento funcional es un dominio de cinasa de PKC-T. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar el asma en un mamífero, tal como un humano. En algunas modalidades, el asma es asma mediado por IgE. En modalidades particulares, el método además incluye valorar la eficacia del agente de prueba en un modelo de asma in vi tro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficacia incrementada en el modelo de asma in vi tro o in vivo, comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar el asma. En algunas modalidades, la célula es una célula procariótica, tal como una célula bacteriana (por ejemplo, E. coli) . En algunas modalidades, la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID NO:l, seleccionado del grupo que consiste del residuo serina en la posición 695, el residuo serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538, y el residuo de treonina en la posición 536. En aún otro aspecto, la invención caracteriza un método para tratar asma, que comprende administrar a un mamífero que sufre de asma o que sufre de un síntoma de asma, un agente que reduce la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, o reduce la producción de una proteína PKC-T funcional. En algunas modalidades, el agente es administrado con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el portador está en la forma de un aerosol . En ciertas modalidades de los métodos inventivos, el agente es administrado por una ruta intravenosa, oral, transdérmica y/o intramuscular. En modalidades particulares, el agente es administrado por inhalación. En algunas modalidades, el asma es asma mediado por IgE. En algunas modalidades, el agente es co-administrado con un fármaco el cual puede ser un agente ß-adrenérgico, un compuesto de teofilina, un corticoesteroide, un anticolinérgico, una antihistamina, un bloqueador de canal de calcio, una cromolina sódica o una combinación de los mismos. En modalidades particulares, el agente es un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína PKC-T o un fragmento del mismo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el agente objetivo es una molécula de ácido nucleico. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido ribonucleico. En algunas modalidades, la molécula de ácido ribonucleico comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una porción de la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID N0:3. En ciertas modalidades, la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, es la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, la autofosforilación de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional del mismo, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID NO:l seleccionado del grupo que consiste del residuo de serina en la posición 695, el residuo de serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538 y el residuo de treonina en la posición 536. En ciertas modalidades, la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, es la fosforilación de un sustrato PKC-T. En algunas modalidades, el sustrato PKC-T comprende una porción R-X-X-S o una porción R-X-X-T, en donde R es arginina, X es ya sea un aminoácido conocido o desconocido, S es serina y T es treonina. Por ejemplo, el sustrato PKC-T puede tener una secuencia de aminoácido (basada en el código universal de aminoácido de una sola letra) , seleccionada del grupo qué consiste de KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 5), FARKGSLRQKN (SEC ID NO: 6) FARKGSLRQ (SEC ID NO: 15), KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 16) QKRPSQRSKYL (SEC ID NO: 17) KIQASFRGHMA (SEC ID NO: 18) LSRTLSVAAKK (SEC ID NO: 19) AKIQASFRGHM (SEC ID NO: 20) VAKRESRGLKS (SEC ID NO: 21) KAFRDTFRLLL (SEC ID NO: 22) PKRPGSVHRTP (SEC ID NO: • 23) ATFKKTFKHLL (SEC ID NO: 24) SPLRHSFQKQQ (SEC ID NO: 25) KFRTPSFLKKS (SEC ID NO: 26) IYRASYYRKGG (SEC ID NO: 27) KTRRLSAFQQG (SEC ID NO: 28) RGRSRSAPPNL (SEC ID NO: 29) MYRRSYVFQT (SEC ID NO: 30) QA SKTTPRRI (SEC ID NO: 31) RGFLRSASLGR (SEC ID NO: 32) ETKKQSFKQTG (SEC ID NO: 33) DIKRLTPRFTL (SEC ID NO: 34) APKRGSILSKP (SEC ID NO: 35) MYHNSSQKRH (SEC ID NO: 36) MRRSKSPADSA (SEC ID NO: 37) TRSKGTLRYMS (SEC ID NO: 38) LMRRNSVTPLA (SEC ID NO: 39) ITRKRSGEAAV (SEC ID NO: 40) EEPVLTLVDEA (SEC ID NO: 41) SQKRPSQRHGS (SEC ID NO: 42) KPFKLSGLSFK (SEC ID NO: 43) AFRRTSLAGGG (SEC ID NO: 44) ALGKRTAKYRW (SEC ID NO: 45) WRTDSLKGRR (SEC ID NO: 46) KRRQISIRGIV (SEC ID NO: 47) WPWQVSLRTRF (SEC ID NO: 48) GTFRSSIRRLS (SEC ID NO: 49) RWGGSLRGAQ (SEC ID NO: 50) LRQLRSPRRTQ (SEC ID NO: 51) KTRKISQSAQT (SEC ID NO: 52) NKRRATLPHPG (SEC ID NO: 53) SYTRFSLARQV (SEC ID NO: 54) NSRRPSRATWL (SEC ID NO: 55) RLRRLTAREAA (SEC ID NO: 56) NKRRGSVPILR (SEC ID NO: 57) , GKRRPSRLVAL (SEC ID NO: 58) QKKRVSMILQS (SEC ID NO: 59), y RLRRLTAREAA (SEC ID NO : 60). En un aspecto adicional, la invención proporciona una -célula mástil aislada que carece de expresión de la proteína PKC-T endógena. En algunas modalidades, la célula expresa la proteína exógena PKC-T, o un fragmento de la misma. Estos y otros aspectos, modalidades y ventajas de la invención, serán aparentes a partir de las descripciones de este documento .

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1C son representaciones fotográficas de análisis de Western blotting que representan la translocación de la membrana de PKC-T y fosforilación de bucle de activación inducible después de la co-estimulación de TCR de células T humanas . Las . Figuras 2A-2C son representaciones fotográficas (Figs. 2A y 2C) y gráficas (Fig. 2B) , que muestran que la autofosforilación del bucle de activación de PKC-T es requerida para determinar la actividad cinasa en células. Las Figuras 3A-3D son diagramas esquemáticos que muestran la caracterización de la autofosforilación del dominio de cinasa PKC-T (PKC-T KD) (Figura 3A) y el producto del espectro de ion, como se determina por espectrometría de masas, del péptido NFpSFMNPGMER (SEC ID NO: 64; en donde ??pS" indica que la serina es fosforilada; posiciones empalmadas 693-703) a m/z 705.52 (Fig. 3B) , el péptido ALINpSMDQNMFR (SEC ID NO: 66 ; posiciones de empalme 681-692) a m/z 760.48 (Fig. 3C) , y el péptido TNTFCGTPDYIAPEILLGQK (SEC ID NO: 66, posiciones empalmadas 536-555) a m/z 1159.71 (Fig. 3D) . Se nota que en la Figura 3D, la cisteína alquilada por yodoacetamida está indicada por # . Las Figuras 4A-4C son análisis de Western blotting de usados de E. coli de la proteína y mutaciones indicadas de PKC-T KD, prueba de blot con PKC-T anti-pT538 (Fig. 4A) , y anti-His para confirmar la expresión equivalente (Fig. 4B) , y una gráfica que muestra la actividad de lisado in vitro de la proteína y mutaciones de PKC-T KD indicadas. Las Figuras 5A-5D son una serie de gráficas que muestran el repunteado de intercepción contra 1/ [Péptidol] a 100 nM de NaCl (Fig. 5A) ; el repunteado de gradiente contra 1/ [Peptidol] a 100 mM de NaCl (Fig. 5B) ; el repunteado de intercepción contra 1/ [Peptidol] a 625 mM de NaCl (Fig. 5C) ; y el repunteado de gradiente contra 1/ [Peptidol] a 625 mM de NaCl (Fig. 5D) . Las Figuras 6A-6C son una serie de diagramas esquemáticos que muestran varios mecanismos por los cuales la PKC-T KD puede comportarse cinéticamente. La Figura 6A muestra un mecanismo de orden secuencial por el cual, el ADP es el producto final liberado; la Figura 6B muestra un mecanismo cinético por medio del cual el ADP es el producto final liberado; y la Figura 6C muestra un mecanismo aleatorio. En las Figuras 6A-6E, WE" permanece para la enzima, UA" permanece para sustrato A, "B" permanece para sustrato B, "P" permanece para producto P, y "Q" es para producto Q . Las Figuras 7A-7D muestran los efectos de viscosidad de solvente en kcat (Figuras 7A y 7C) y kcat/Km (Figuras 7B y 7D) para PKC-T KD. La Figura 7A muestra el efecto kcat con péptido variado 1 con ATP mantenido a 2.0 mM.

La Figura 7B muestra el kcat/Km para el péptido 1 con ATP r mantenido a 0.125 mM. La Figura 7C muestra el efecto kcat con péptido variado 3 con ATP mantenido a 2.0 mM. La Figura 7D muestra el kcat/Km para el Péptido 3 con ATP mantenido a 2.0 .mM. El símbolo de círculo abierto (O) indica 100 mM de NaCl en sacarosa incrementada; el símbolo de triángulo invertido abierto (V) indica 250 mM de NaCl en sacarosa incrementada; el símbolo de círculo cerrado (•) indica 100 mM de NaCl en Ficoll 400 incrementado; y el símbolo de triángulo invertido cerrado (T) indica 250 mM de NaCl en Ficoll 400 incrementado. La línea punteada en las Figuras 7A-7D indica un gradiente de 1. La Figura 8 es un diagrama esquemático que muestra mecanismos diferentes por los cuales los sustratos inhibidores pueden interferir con la actividad catalítica de PKC-T KD. En la Figura 8, "E" permanece para enzima, "A" permanece para sustrato A, "B" permanece para sustrato B, "P" permanece para producto P, y "Q" es para producto Q. Las Figuras 9A-9B son representaciones de una exploración de arreglo peptídico que identifica varias secuencias de sustrato peptídico para PKC-T (Figura 9A) y los péptidos identificados son fosforilados por PKC-T (Figura 9B) . Las Figuras 10A-10B son representaciones fotográficas de análisis de Western blotting que muestran que el bucle de activación de PKC-T es induciblemente fosforilado después de la reticulación del receptor IgE en células mástil derivados de la médula ósea (BMMC) . Las Figuras 11A-11C son representaciones fotográficas de análisis de Western blotting de la fracción de membrana (Figura HA) , la fracción insoluble de detergente (DI) (Figura 11B) , y los extractos celulares completos (WCE) (Figura 11C) , a partir de BMMC reticuladas del receptor IgE que evidencia la translocación de membrana de PKC-T en BMMC estimuladas por el receptor IgE. Las Figuras 12A-12B son representaciones fotográficas de análisis de Western blotting que demuestran que la distribución de PKC-d (Figura 12A) y PKC-ß (Figura 12B) , no se altera significantemente después de la reticulación del receptor IgE en BMMC.

Las Figuras 13A-13B son representaciones histológicas (Figura 13A) y gráficas (Figura 13B) , que ilustran que las BMMC a partir de ratones agénicos PKC-T, contienen algunos granulos que las BMMC de ratones tipo nativo. Los datos a partir de la Figura 13B muestran intensidad de fluorescencia media (MFI) de la célula, como una función del tiempo o como una función de la concentración de DNP-BSA. Las Figuras 14A-14B son representaciones gráficas que demuestran que las células mástil perifonéales a partir de ratones agénicos PKC-T, tienen niveles inferiores de IgE de la superficie celular, que células a partir de ratones tipo nativos (Figura 14A) , pero tienen niveles similares de ckit de la superficie celular (Figura 14B) . Los valores p fueron determinados por la prueba t. Las Figuras 15A-15C son representaciones gráficas que demuestran que los ratones agénicos PKC-T, tienen niveles reducidos de IgE (Figura 15A) e IGgl (Figura 15B) en el suero, comparado con los- ratones de tipo nativo, pero tienen niveles incrementados de IgA (Figura 15C) . Se determinaron los valores p por la prueba t . Las Figuras 16A-16C son representaciones gráficas que indican que, después de la reticulación del receptor IgE, las BMMC derivadas de ratones agénicos PKC-T, son deficientes en la producción de las siguientes citosinas: TNF-a (Figura 16A) , IL-13 (Figura 16B) , e IL-6 (Figura 16C) . Las Figuras 17A-17B son representaciones gráficas que muestran que las células en reposo T CD4+, células TH1, y célula TH2 de ratones agénicos PKC-T, mostraron niveles reducidos de IL-4 (Figura 17A) e IL-5 (Figura 17B) después del cultivo en la ausencia de IL-2, y en la presencia de 9.5 µg/ml de anti-CD3. La Figura 18 es una representación gráfica que evidencia que ratones agénicos PKC-T, no tienen un incremento en la hinchazón de oreja en el modelo de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) descrito en el Ejemplo 7 posterior, en respuesta a un anti-IgE. La hinchazón de la oreja se expresó como el cambio delta a partir de la línea base. Los análisis estadísticos fueron determinados usando la prueba no apareada de t de students. Los valores P muestran comparaciones de animales agénicos de PKC-T contra los de tipo nativo. La Figura 19 es una representación gráfica que demuestra que los ratones agénicos PKC-T, no tienen un incremento en la hinchazón de oreja en el modelo de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) descrito en la presencia de IgE. La hinchazón de la oreja se expresó como el cambio delta a partir de la línea base. Los análisis estadísticos fueron determinados usando la prueba no apareada de t de students . Los valores P muestran comparaciones de animales agénicos de PKC-T contra los de tipo nativo.

Las Figuras 20A-20D son representaciones de gráficas de barras que muestran que células T tanto THl como TH2 a partir de ratones agénicos PKC-T, muestran proliferación reducida a la estimulación anti-CD3 (0.5 µg/ml) que a las células T tanto THl como TH2 a partir de ratones tipo nativo de PKC-T. Células THO, THl, TH2 de ratones tipo nativo de PKC-T (barras ligeramente grises) o de ratones agénicos de PKC-T (barras gris oscuro) , fueron adicionalmente estimuladas con anti-CD28 (Figura 20A) , anti-CD28 más IL-2 (Figura 20B) , sin anti-CD28 y sin IL-2 (Figura 20C) , y con L-2 en la ausencia de anti-CD28 (Figura 20D) . Las Figuras 21A-21D son representaciones de gráfica de barras que muestran que células T tanto THl como TH2 a partir de ratones agénicos PKC-T, muestran proliferación reducida a la estimulación anti-CD3 (0.5 µg/ml) que a las células T tanto THl como TH2 a partir de ratones tipo nativo de PKC-T. Células THO, THl, TH2 de ratones tipo nativo de PKC-T (barras ligeramente grises) o de ratones agénicos de PKC-T (barras gris oscuro) , fueron adicionalmente estimuladas con anti-CD28 (Figura 21A) , anti-CD28 más IL-2 (Figura 21B) , sin anti-CD28 y sin IL-2 (Figura 21C) , y con L-2 en la ausencia de anti-CD28 (Figura 2ID) .

Descripción Detallada de la Invención La invención se basa en el descubrimiento que agentes que modulan la proteína cinasa C theta . (PKC-T) o agentes que modulan la cantidad de proteína PKC-T funcional, son útiles para tratar asma. Para propósitos de promover un entendimiento de los principios de la invención, se hará referencia ahora a las modalidades preferidas y se usará el lenguaje específico para describir la misma. Sin embargo, se entenderá que no se pretende con ello, limitación del alcance de la invención, tales alteraciones y modificaciones adicionales de la invención, y tales aplicaciones adicionales de los principios de la invención como se ilustran en este documento, están contemplados como podrían ocurrir normalmente a uno experto en la técnica ala cual se refiere la invención. La literatura científica y de patente referida en este documento, establece el conocimiento de que está disponible para aquellos expertos en la técnica. En las patentes Estadounidenses emitidas, solicitudes concedidas, solicitudes publicadas (Estadounidenses y extranjeras) y referencias, que incluyen secuencias de base de datos de GenBank, que son mencionadas en este documento, están incorporadas por referencia en la misma extensión, como si cada una fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. La PKC-T es un elemento de la nueva clase independiente de Ca+2 de PKC. Es altamente expresada en células T y músculo. Como se describe en este documento, la proteína PKC-T ha sido descubierta por desempeñar una función en las enfermedades respiratorias, tales como asma y por estar asociada con, por ejemplo, inducción de los síntomas y/o complicaciones asociadas con asma, que incluyen por ejemplo, asma atópica, que incluyen asma mediada por IgE; asma no atópica, asma ocupacional y asma inducida por fármaco. Basados en los hallazgos presentados en este documento, la invención proporciona métodos para identificar agentes para tratar el asma, y métodos para tratar el asma administrando a un mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que modula (por ejemplo, inhibiendo o mejorando) la producción de PKC-T y/o se proporciona la actividad de cinasa. Además, la invención proporciona células mástil aisladas que carecen de la expresión de la proteína PKC-? endógena . En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un modulador de una proteína PKC-T. El método incluye poner en contacto una proteína PKC-T, o un fragmento funcional del mismo con un agente de prueba; y determinar si el agente de prueba inhibe la actividad de cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. Un agente de prueba que reduce la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, es identificado como un modulador de una proteína PKC-T.

Como se usa en este documento, "un agente de prueba" es un compuesto químico (por ejemplo, orgánico o inorgánico) , una molécula pequeña, una molécula de ácido nucleico, un péptido, o una proteína, tal como una hormona, un anticuerpo y/o una porción de la misma. Por "modulador de proteína PKC-T", significa un agente que es capaz de modular, ya sea incrementando o disminuyendo, la actividad cinasa de una proteína de PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, o es capaz de modular la cantidad de proteína PKC-T funcional (por ejemplo, vía transcripción o traducción) . En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que reduce la actividad de cinasa, es un inhibidor de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T que incrementa la actividad cinasa es un activador de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma. En una forma de la invención, los métodos para identificar un modulador de una proteína PKC-T incluyen, poner en contacto una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba y detectar un cambio en la autofosforilación de una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un cambio en la fosforilación de los siguientes residuos de la SEC ID NO: 1 serina en la posición 695, serina en la posición 685, treonina en la posición 538, y treonina en la posición 536) .

En una forma alterna, los métodos incluyen poner en contacto una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba y un sustrato de PKC-T, y detectar un cambio en la fosforilación del sustrato PKC-T. El agente de prueba es uno que se piensa, es efectivo en la modulación (es decir,' inhibiendo o incrementando) • la actividad cinasa de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, o la cantidad de proteína PKC-T funcional (por ejemplo, cambiando la cantidad de ARN o ADN que codifica una proteína PKC-T funcional) . En ciertas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la actividad cinasa de la proteína PKC-?, o el fragmento funcional de la misma, por al menos dos veces. En algunas modalidades, el modulador reduce la actividad cinasa de la proteína PKC-?, o el fragmento funcional de la misma, por al menos cuatro veces, o al menos diez veces. En algunas modalidades, el modulador suprime la actividad cinasa de la proteína PKC-?, o el fragmento funcional de la misma. La actividad de la proteína cinasa PKC-T puede ser cuantificado, por ejemplo, usando técnicas estándares tales como los ensayos de cinasa in vi tro descritos posteriormente. En otra modalidad no limitante de la invención, la cantidad de proteína PKC-T funcional se reduce por el modulador de la proteína PKC-T. Como se usa en este documento, "funcional", significa una proteína PKC-T, o un fragmento de la misma, que funciona normalmente (por ejemplo, tiene -la misma actividad ciñasa como una proteína PKC-T tipo nativa) . Una determinación de sí o no una proteína PKC-T, o un fragmento de la misma es funcional, puede ser fácilmente hecha por el biólogo de habilidad ordinaria en la técnica. Un método no limitante para determinar si una proteína PKC-T, o un fragmento de la misma en cuestión es funcional, es comparar la proteína PKC-T, o un fragmento de la misma, en cuestión de una proteína PKC-T de tipo nativa o un fragmento de PKC-T de tipo nativo en un ensayo de proteína cinasa estándar (véase por ejemplo, Ausubel et al . , eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, New York (1995, más las actualizaciones subsecuentes hasta 2003)), y los ensayos de cinasa descritos posteriormente en los ejemplos. Un ejemplo no limitante de un fragmento funcional de una- roteína PKC-T, es un dominio de cinasa de PKC-T. Como se describe en los ejemplos posteriores (particularmente Ejemplo 3) , el dominio de cinasa de la proteína PKC-T (también llamado "dominio de cinasa de PKC-T", o simplemente "PKC-T KD" ) , es sorprendentemente capaz de autofosforilarse .

Esto es sorprendente, dado que ostras enzimas en esta clase, no se autofosforilan. Como se usa, el término "dominio de cinasa PKC-T", significa el dominio de cinasa de la proteína PKC-T, el cual incluye la porción de la proteína que recorre aproximadamente el residuo de aminoácido 362 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 706. En algunas modalidades, el PKC-T KD de la invención tiene la secuencia de aminoácido proporcionada en la SEC ID NO: 61. En algunas modalidades, la PKC-T KD de la invención, tiene la secuencia de aminoácido proporcionada en la SEC ID NO: 62 (se nota que los primeros dos residuos de aminoácido N-terminal, metionina y glicina de la SEC ID NO: 62, son convenientes para expresar el fragmento de PKC-T KD, pero no ocurre en la proteína PKC-T de longitud completa) . En algunas modalidades, el dominio de cinasa de PKC-T de la invención, es expresado en una célula procariótica tal como bacteria, tal como E. coli . En algunas modalidades, el dominio de cinasa de PKC-T es fosforilado (por ejemplo, por autofosforilación) en uno o más de los siguientes residuos de aminoácido: serina en la posición 695, serina en la posición 685, treonina en la posición 538 y treonina en la posición 536 de la SEC ID NO:l. En ciertas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la cantidad de la proteína PKC-T funcional por al menos dos veces. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la cantidad de la proteína PKC-T funcional por al menos cuatro veces. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T reduce la cantidad de la proteína PKC-T funcional por al menos diez veces. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T suprime la cantidad de la proteína PKC-T funcional. Los niveles de proteína PKC-T funcional, pueden ser cuantificados por ejemplo, usando técnicas estándares tales como análisis de Western blotting descritos posteriormente . En un aspecto adicional, la invención proporciona otro método para identificar un modulador de una proteína PKC-T, que comprende contactar una célula que comprende una proteína PKC-T funcional, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba y determinar si el agente de prueba reduce la cantidad de proteína PKC-T funcional, o fragmento funcional de la misma, en una célula, en donde un agente de prueba que reduce la cantidad de proteína PKC-T funcional, o fragmento funcional de la misma en la célula, es identificado como un modulador de una proteína PKC-T. Tal modulador de una proteína PKC-T puede actuar, por ejemplo, al nivel de la transcripción o traducción. En ciertas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar una enfermedad respiratoria en un mamífero, tal como un humano. Las enfermedades respiratorias incluyen sin limitación, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica) ; bronquitis (por ejemplo, bronquitis crónica) ; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) (por ejemplo, enfisema); condiciones que involucran inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción de moco en exceso, por ejemplo, fibrosis cística, fibrosis pulmonar y rinitis alérgica. En algunas modalidades, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar enfermedades atópicas . "Atópico" se refiere a un grupo de enfermedades en donde existe a menudo una tendencia hereditaria para desarrollar una reacción alérgica. Ejemplos no limitantes de trastornos atópicos incluyen alergia, rinitis alérgica (fiebre de heno, cuyos síntomas incluyen comezón, escurrimiento, estornudo o congestión nasal y comezón en ojos) , dermatitis atópica (también conocido como eczema; una enfermedad crónica que afecta la piel) , asma y fiebre de heno. En modalidades particulares, el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar asma en un mamífero, tal como un humano. "Asma" como se usa en este documento, significa una condición que es marcada por una respiración laboriosa paroximal o continua acompañada por respiración sibilante, por una sensación de compresión en el pecho, a menudo por ataques de tos o jadeos. Cualquiera de estos síntomas está incluido como un "síntoma de asma" . Como se usa en este documento, "asma" incluye, pero no se limita a, asma no alérgico (también llamado asma no atópico o intrínseco) , asma alérgico (también llamado asma atópico o extrínseco) , combinaciones de asma alérgico y no alérgico, asma inducido por ejercicio (también llamado asma combinado) , asma inducido por fármaco, asma ocupacional asma de estado tardía. El asma alérgico o extrínseco incluye incidentes causados por, o asociados con, por ejemplo, alérgenos tales como polen, esporas, hierbas o malezas, caspa de mascotas, polvos, ácaros, etc. Igual que los alérgenos y otros irritantes presentes ellos mismos en posiciones variantes durante el año, estos tipos de incidentes son también referidos como un asma estacional . También incluido en el grupo de asma extrínseco está el asma bronquial y la aspergilosis broncopulmonar alérgica. El asma es un trastorno fenotípicamente heterogéneo asociado con los síntomas de enfermedad respiratoria intermitente, tales como por ejemplo, hiperreactividad bronquial y obstrucción reversible del flujo de aire. Las características inmunohistopatológicas del asma incluyen, por ejemplo, desnudez del epitelio de las vías respiratorias, deposición de colágeno detrás de la membrana basa; edema; activación de células mástil; e infliltración de células inflamatorias (por ejemplo, por neutrófilos, eosinófilos y linfocitos) . La inflamación de las vías respiratorias puede además, contribuir a la hiperreactividad de las vías respiratorias, limitación de flujo de aire, broncoconstricción aguda, formación de tapones mucosos, remodelación de las paredes de las vías respiratorias y otros síntomas de enfermedades respiratorias . El asma puede ser tratado o aliviado por métodos presentes incluidos aquellos causados por agentes infecciosos, tales como virus (por ejemplo, virus de la gripe y del resfriado, virus sincitial respiratorio (RSV) , paramixovirus, rinovirus y virus de la influenza. Las infecciones de RSV, rinovirus y virus de la influenza son comunes en niños, y son una causa conducente de padecimientos del tracto respiratorio en infantes y jóvenes. Los niños con bronquitis viral pueden desarrollas disnea silbilante crónica y asma, la cual puede ser tratada usando los métodos de la invención. También están incluidas las condiciones asmáticas las cuales se pueden llevar a cabo en algunos asmáticos por ejercicio y/o aire frío. Los métodos de la invención son útiles para asmas asociados con exposición a humo (por ejemplo, humo industrial e inducido por cigarro) , así como también exposiciones ocupacionales e industriales, tales como humo, ozono, gases nocivos, dióxido de azufre, óxido nitroso, emanaciones, que incluyen isocianatos, de pintura, plásticos, poliuretanos, barnices, etc., polvos de madera, planta u otros orgánicos, etc. Los métodos son también útiles para incidentes asmáticos asociados con aditivos de alimentos, agentes preservativos o farmacológicos. Los métodos de la invención también son útiles para tratar, inhibir o aliviar los tipos de asma referidos como asma silente o asma variante en tos. Además, los métodos de la presente invención son útiles para el tratamiento y alivio de asma asociado con reflujo gastroesofageal (GERD) , el cual puede estimular la broncoconstricción. En algunas modalidades, el asma es asma mediado por IgE. En modalidades particulares, el método además incluye valorar la eficacia del agente de prueba en un modelo de asma in vi tro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficacia incrementada en el modelo de asma in vi tro o in vivo comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar el asma. Se conocen en la técnica varios modelos de asma.

Por ejemplo, Soler et al . , J. Appl . Physiol . 70 (2) :617-23 (1991) y Long et al . , J. Appl . Physiol . 69 (2) : 584-590 (1990), describen un modelo para broncoconstricción en ovejas. Las ovejas son naturalmente sensibilizadas al parásito ascáride, Ascaris suum. Después de estimular la inhalación con antígeno Ascaris suum, los animales se someten a respuestas de broncoconstricción de fase temprana y fase tardía, similar a la reacción de asmáticos después de la exposición a alérgeno sensibilizante. La estimulación de Ascaris también induce hiperreactividad de las vías respiratorias en las ovejas, la cual es medida como un incremento en la resistencia del pulmón después de la provocación de estimulación con el agonista colinérgico, carbacol . La dosis de carbacol requerida para provocar una respuesta dada disminuye 24 horas después de la estimulación con Ascaris, y es una indicación de la hiperreactividad de las vías respiratorias . Bischof et al . (Clin . Exp. Allergy 33(3): 367-75 (2003)), describe un modelo para asma alérgico en ovejas, en donde las ovejas subcutáneamente inmunizadas con extracto de acaro del polvo doméstico solubilizado, son subsecuentemente dadas con una estimulación bronquial única con el acaro del polvo doméstico. En este modelo, el lavado broncoalveolar (BAL) y los leucocitos de sangre periférica fueron colectados antes y después de la estimulación bronquial de ácaros del polvo doméstico por citometría de flujo, y las muestras de tejido fueron tomadas 48 horas posteriores a la estimulación por análisis de histología e inmunohistoquímicos (Bischof et al . , supra) . Un agente de prueba se piensa es un modular de una proteína PKC-T, particularmente una que se piensa es un inhibidor de la proteína PKC-T, puede ser administrado a la oveja para valorar su capacidad para reducir el número de leucocitos BAL después de la estimulación, comparada con el número de leucocitos BAL en las ovejas no administradas con un agente de prueba de la invención. Aún otro modelo de asma bien conocido es el modelo de primate no humano de Ascaris - inflamación inducida en las vías respiratorias (véase por ejemplo, Gundel et al . , Clin . Exp . Allergy 22(1): 51-57 (1992)). Los monos cinomolgos son naturalmente sensibilizados al parásito ascáride, Ascaris suum, el cual actúa como un alérgeno induciendo una fuerte respuesta IgE. Después de la estimulación intra-traqueal con el antígeno, los animales exhiben inflamación de las vías respiratorias que consiste principalmente de eosinófilos. Esto se puede medir contando el influjo de leucocitos dentro del fluido de lavado bronco-alveolar 24 horas después de la estimulación de alérgeno segmental en el pulmón. Aún otro modelo de asma no limitante es la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por ovalbúmina (OVA) en ratones (véase por ejemplo, Kips et al . , Eur. Respir. J. 22(2): 374-382 (2003); Taube et al . , Int . Arch. Allergy Immunol . 135 (2) : 173-186 (2004); y Reader et al . , Am . J. Pathol . 162(6): 2069-2078 (2003)). En este modelo, los ratones son inmunizados con ovalbúmina (OVA) en alúmina adyuvante, reforzada y después proporcionados con una estimulación en aerosol con OVA. Después de la estimulación, los animales exhiben resistencia incrementada a las vías respiratorias, e infiltración de leucocitos en el fluido de lavado broncoalveolar (BAL) . Además, los niveles de citosina del suero incrementan, y la histología de pulmón muestra la inflamación del tejido y producción de moco.

Otros modelos de asma no limitantes conocidos en a técnica, incluyen el modelo de asma inducido por antígeno Ascaris suum en perros y monos (véase por ejemplo, Hirshman et al . , J. Appl . Physiol . 49: 953-957 (1980); Mauser et al . , Am. J. Respir. Cri t . Care Med. 152(2): 467-472 (1995)). Los modelos de asma in vi tro son también conocidos para un biólogo de habilidad ordinaria. Por ejemplo, para una terapia dirigida a células T, un ejemplo no limitante es la inhibición de la producción de citosina por células TH2. Las células T pueden ser estimuladas en anticuerpos in vitro a CD3 y CD28 para activación mímica mediada por TCR. Esto inducirá producción de citosina, la cual puede someterse a ensayo en el sobrenadante 48 horas después. Las citosinas clave son IL-4 e IL-13. La IL-13 especialmente son un inductor principal de la patogénesis en asma en modelos animales (véase por ejemplo, Wills-Karp M. , Immunol Rev. 202:175-190 (2004)) . Otro ejemplo no limitante en el método in vitro para valorar el efecto de un modulador de proteína PKC-T en asma, es la inhibición de la proliferación de células T o inducción de los factores de transcripción nuclear NF-KB de NFAT en respuesta a anti-CD3 y anti-CD28. La proliferación de células T puede ser sometida a ensayo por ejemplo, por absorción de 3H-timidina (véase métodos, por ejemplo, "en Ausubel et al . , supra) . En respuesta a la activación de células T, los NFAT o NF-KB se someten a translocación nuclear y activación, las cuales se pueden someter a ensayo por Western blotting a partir de lisados celulares. Los inhibidores de proteína PKC-T deben también disminuir la respuesta de TH2 en ratones inmunizados con ovalbúmina, los cuales pueden ser sometidos a ensayo como producción disminuida de IgGl específica de ovalbúmina o IgE total. Los niveles de estos anticuerpos pueden ser sometidos a ensayo por ELISA a partir de suero de ratones. Como se usa en este documento, la proteína PKC-T de la invención puede ser de un humano, y puede tener la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 1 (Acceso de GenBank No :NM-006257) . En otra modalidad, la proteína PKC-T de la invención puede ser de un ratón, y puede tener la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 2 (Acceso GenBank No.NM-008859) . Las proteínas PKC-T útiles en la invención, pueden también ser codificadas por una secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO : 3 (humana) (Acceso de GenBank No: NM_006257) o SEC ID NO: 4 (murina) (Acceso de GenBank No: NM_008859) . Las secuencias de proteínas PKC-T adicionales y secuencias de nucleótidos que codifican estas proteínas son disponibles en el Acceso de GenBank No: NM_178075 (Niino et al . , J. Biol . Chem. 276 (39): 36711-36717 (2001); (ratón)); Acceso de GenBank No. AF473820 (Nonneman and Rohrer, Anim . Genet . 34 (1): 42-46 (2003); cerdos)).

Como se usa en este documento, una secuencia de nucleótido está propuesta para referirse a un arreglo secuencial y lineal sintético o natural de nucleótidos y/o nucleósidos y derivados de los mismos. Los términos "que ' codifica" y "codificante" se refiere al proceso por el cual una secuencia de nucleótido, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, proporciona la información a una célula a partir de la cual una serie de aminoácidos pueden ser montados en una secuencia de aminoácido específica para producir un polipéptido. El proceso para codificar una secuencia específica de aminoácido, puede involucrar secuencias de ADN que tienen uno o más cambios base (es decir, inserciones, supresiones, sustituciones) , que no causan un cambio en el aminoácido codificado, o las cuales pueden involucrar cambios base los cuales pueden alterar uno o más aminoácidos, pero no eliminan las propiedades funcionales del polipéptido codificado por la secuencia de ADN. El descubrimiento de que la PKC-T está asociada con la inducción de síntomas y/o complicaciones de asma, proporciona las secuencias de PKC-T útiles en métodos para identificar agentes de la invención. Tales métodos incluye ensayos de agentes potenciales para determinar la capacidad para modular (por ejemplo, inhibir o mejorar) la actividad cinasa de PKC-T. Las moléculas de ácido nucleico de PKC-T (por ejemplo, secuencias promotoras de PKC-T) y proteínas útiles en los ensayos de la invención incluyen no solamente los genes y polipéptidos codificados descritos en este documento, sino también variantes de los mismos que tienen sustancialmente la misma actividad como los genes de tipo nativo y polipéptidos. "Variantes" como se usa en este documento, incluye polinucleótidos o polipéptidos que contienen una o más supresiones, inserciones o sustituciones, tan pronto como la variante retiene sustancialmente la misma actividad del polinucleótido o polipéptido de tipo nativo. Con respecto a los polipéptidos, las variantes de supresión están contempladas para incluir fragmentos que carecen proporciones del polipéptido no esencial para la actividad biológica, y están contempladas variantes de inserción para incluir polipéptidos de fusión en los cuales el polipéptido de tipo nativo o fragmento del mismo, ha sido fusionado a otro polipéptido. De este modo, en ciertas modalidades, la protelna PKC-T de la invención, es una variante funcional de una proteína de PKC-T de longitud completa. Se entiende por lo tanto, que la proteína de PKC-T no está limitada a ser codificada por las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID NO: 3 ó SEC ID NO : 4. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos variantes, como se discute anteriormente, están dentro del alcance de las secuencias de nucleótidos que codifican a PKC-T. Las modificaciones a una secuencia, tales como supresiones, inserciones o sustitución en la secuencia, las cuales producirán cambios "silentes" que no afectan sustancialmente las propiedades funcionales de la proteína PKC-T, están expresamente contempladas en este documento. Por ejemplo, se entiende que alteraciones en una secuencia de nucleótido las cuales reflejan la- degeneración del código genético, o las cuales resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, están contempladas. De este modo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como glicina o un residuo más hidrofóbico tal como valina, leucina o isoleucina. De manera similar, los cambios los cuales resultan en la sustitución del residuo negativamente cargado por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, también pueden ser experimentados para producir una proteína PKC-T biológicamente equivalente. Para uso en los ensayos descritos en este documento, la proteína PKC-T puede ser adquirida comercialmente por varios proveedores, tales como Panvera (Madison, WI) , o pueden ser producidos por métodos de ingeniería genética y purificación de proteína conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido que codifica una proteína PKC-T de mamífero, puede ser introducida en una célula de hospedero deseado, cultivada, aislada o purificada. Tal secuencia de nucleótido puede ser primero insertada en un vector de expresión recombinante apropiado o de otro modo deseado. Por ejemplo, la secuencia de nucleótido que codifica una proteína PKC-T de mamífero, puede ser sub-clonada en el vector de expresión pcADN3 y expresada en células humanas 293, como se describe en los ejemplos posteriores. La expresión de la proteína PKC-? o dominio de cinasa PKC-T en células procarióticas, también está contemplada. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, la proteína PKC-? o dominio de cinasa PKC-T, puede ser sub-clonada en un vector de expresión bacteriano, tal como pETldb (comercialmente disponible de, por ejemplo, EMD Biosciences/Merck Biosciences, San Diego, CA) , y expresada en células bacterianas . Un "vector" como se usa en este documento y se conoce en la técnica, se refiere a un constructo que incluye material genético designado para dirigir la transformación de una célula objetivo. Un vector puede contener elementos genéticos múltiples posicionalmente y secuencialmente orientados, es decir, operablemente ligados con otros elementos necesarios deseados, de manera que el ácido nucleico en un cásete de ácido nucleico, puede ser transcrito y, si se desea, traducido en la célula transfectad . Los vectores de expresión recombinante pueden ser construidos incorporando las secuencias de nucleótido mencionadas anteriormente en un vector de conformidad con los métodos bien conocidos por un experto en la técnica y como se describen, en Sambrook et al: , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Springs Harbor Laboratory, 2nd ed. , Cold Springs Harbor, New York (1989) . Otras referencias que describen técnicas de ADN recombinante y biología molecular, también están explicadas adicionalmente en, por ejemplo, Clonación de ADN 1 : Técnicas Nucleares (D. N. Glover et al . , eds., IRL Press, 1995); Clonación de ADN 2 : Sistemas de Expresión, (B. D. Hames et al . , eds., IRL Press, 1995); Clonación de ADN3 : Un Procedimiento Práctico, (D. N. Glover et al . , eds., IRL Press, 1995); Clonación de ADN 4 : Sistemas de Mamíferos, (D . N. Glover et al . , eds., IRL Press, 1995); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. , IRL Press, 1992); Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, (S. J. Higgins and B. D. Hames, eds., IRL Press, 1991); Transcription and Translation : A Practical Approach, (S. J. Higgins & B. D. Hames, eds., IRL Press, 1996); R. I. Freshney, Cul ture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (Wiley-Liss, 1986) ; y B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 2nd Edition, (John Wiley & Sons, 1988); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al . , eds., John Wiley & Sons), las cuales son regularmente y periódicamente actualizadas. Se conocen una amplia variedad de vectores que tienen uso en la invención. Vectores adecuados incluyen vectores plásmidos, vectores virales que incluyen, vectores de retrovirus (véase por ejemplo, Miller et al . , Methods of Enzymology 217:581-599 (1993)), vectores de adenovirs (véase por ejemplo, Erzurum et al . Nucleic Acids Res . 21:1607-1612 (1993); Zabner et al . , Nature Genetics 6:75-83 (1994); y Davidson et al . , Nature Genetics 3:219-223 (1993)) vectores de virus adeno-asociados (véase por ejemplo, Flotte et al . , Proc. Nati . Acad . Sci . USA 90:10613-10617 (1993)) y vectores virales del herpes (véase por ejemplo, Anderson et al . , Cell Mol . Neurobiol . 13:503-515 (1993)). Los vectores pueden incluir otros elementos genéticos conocidos necesarios o deseables para la expresión eficiente del ácido nucleico en una célula hospedera especificada, que incluyen elementos reguladores. Por ejemplo, los vectores pueden incluir un promotor y cualquier secuencias mejoradoras necesarias que cooperan con el promotor para lograr la transcripción del gen. "Incrementador" significa elementos de secuencias de nucleótidos los cuales pueden estimular la actividad promotora en una célula, tal como una célula hospedera eucariótica. Como se define en este documento, una secuencia de nucleótido está "operablemente ligada" a otra secuencia de nucleótido cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de nucleótido. Por ejemplo, si una secuencia codificante está operablemente ligada a una secuencia promotora, esto generalmente significa que el promotor puede promover la transcripción de la secuencia codificante. Operablemente ligado significa que las secuencias de ADN que están ligadas son típicamente continuas y, cuando es necesario, se unen dos regiones, contiguas y en estructura lectora, que codifican la proteína. Sin embargo, puesto que los incrementadores pueden funcionar cuando se separan del promotor por varias kilobases y las secuencias de intrón pueden ser de longitudes variables, algunas secuencias de nucleótídos pueden ser operablemente ligadas pero no contiguas . Están disponibles numerosos métodos conocidos en la técnica para introducir la secuencia de nucleótido que codifica una proteína PKC-T, y los cuales pueden estar incluidos en un vector de expresión recombinante, en una célula hospedera. Tales métodos incluyen, sin limitación, métodos mecánicos, métodos químicos, métodos lipifílicos y electroporación. Métodos mecánicos ejemplares incluyen, por ejemplo, microinyección y uso de un disparo de gen con, por ejemplo, un sustrato de partícula de oro para el ADN a ser introducido. Métodos químicos ejemplares incluyen, por ejemplo, uso de fosfato de calcio o DEAE-Dextrano. Métodos lipofílieos ejemplares incluyen uso de liposomas y otros agentes catiónicos para la transfección mediada por lípidos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y muchos de tales métodos se describen en, por ejemplo, Gene Transfer Methods : Introducing DNA into Living Cells and Organisms, (P.A. Norton and L.F. Steel, eds., Biotechniques Press, 2000) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al . , eds., John Wiley & Sons), los cuales son regularmente y periódicamente actualizados. Una amplia variedad de células hospederas pueden ser utilizadas en la presente invención para producir las cantidades deseadas de proteína PKC-T, o fragmento funcional de la misma, para uso en, por ejemplo, los ensayos de selección descritos en este documento. Tales células incluyen células eucarióticas y procarióticas que incluyen, células bacterianas y de mamífero conocidas en la técnica. Numerosas células hospederas son comercialmente disponibles a partir de American Type Culture Collection, Manassas, VA. La proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, puede ser aislada y purificada por técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, técnicas cromatográficas, electroforéticas y centrifugación. Tales métodos son conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Protein Science, J. Wiley and Sons, New York, NY, Coligan et al . (Eds.) (2002); y Harris, E.L.V., y S. Angal in Protein Purif ication Applications : A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY (1990) . Para ayudar en la purificación y detección de una proteína PKC-T recombinantemente producida o un fragmento funcional de la misma, la proteína PKC-T o un fragmento funcional de la misma, pueden ser diseñados por ingeniería, de manera tal que son "etiquetados". En algunos ejemplos siguientes, la proteína PKC-T y el dominio de cinasa PKC-T (un ejemplo no limitante de un fragmento funcional de una proteína PKC-T) son etiquetados con una etiqueta de histidina. Esto permite a la proteína his-etiquetada, ser enlazada a Níquel-NTA, y así ser purificada. En otros ejemplos siguientes, las proteínas PKC-T son etiquetadas con una etiqueta de hemaglutinina (HA) y se expresan en células 293. Otras etiquetas no limitantes, comercialmente disponibles, que pueden ser usadas para ayudar en la purificación y/o detección de una proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) incluyen, sin limitación, la etiqueta myc (enlazado a anticuerpos de etiqueta anti-myc) , la etiqueta GST (enlazada a glutationa-Sefarosa) , y la etiqueta flu (enlazada a anticuerpos tag anti-flu) . Para determinar si un agente de prueba inhibe la actividad de cinasa de una proteína PKC-T o un fragmento funcional de la misma, un ensayo no limitante el cual puede ser empleado, es poner en contacto la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) , con un agente de prueba por un periodo de tiempo suficiente para inhibir la actividad de cinasa de la proteína PKC-T. Este periodo de tiempo puede: variar dependiendo de la naturaleza del inhibidor y la proteína PKC-T o fragmento funcional de la misma seleccionada. Algunas veces puede ser ya determinado por el experto en la técnica sin experimentación indebida. Un agente de prueba no limitante de la invención, es uno que disminuye la actividad de cinasa de la proteína PKC-T (o fragmento funcional de la misma) , aunque los agentes de prueba que inhiben la PKC-T mediante, por ejemplo, enlace a un sustrato de PKC-T, o que inhiben la actividad de cinasa de PKC-T, pueden también estar contemplados por algunos otros mecanismos . Como se describe abajo, la PKC-T es induciblemente fosforilada en al menos uno de los siguientes residuos en BMMC después de la reticulación del receptor IgE; la serina en la posición 695, serina en la posición 685, treonina en la posición 538, o treonina en la posición 536 de la SEC ID NO : 1. De este modo, en una modalidad particular, el agente de prueba puede ser determinado por ser un agente capaz de inhibir la actividad de •cinasa de PKC-T (y de este modo es útil para tratar asma) , por su capacidad para inhibir la autofosforilación de la proteína PKC-T. En algunas modalidades, la autofosforilación de un residuo de aminoácido del bucle de activación de la proteína PKC-T, se inhibe. Se pueden utilizar numerosos ensayos para determinar si el agente de prueba inhibe la actividad de cinasa de la proteína PKC-T. Como la proteína PKC-T es una cinasa, tales ensayos incluyen una medición del efecto del agente de prueba en la capacidad" de la PKC-T para autofosforilarse la misma en el residuo de treonina en la posición 538 en la presencia de una forma de fosfato, tal como trifosfato de adenosina (ATP) , u otra forma de fosforilado la cual puede ser transferida a un sustrato de PKC-T. De manera similar, tal ensayo puede medir el efecto del agente de prueba en la capacidad de PKC-T para fosforilar un sustrato PKC-T en la presencia de una forma de fosfato. Los ensayos a base de radioactivos y ensayos no a base de radioactivos, que incluyen ensayos a base de fluorescencia, pueden ser utilizados. Los ensayos a base de radioactivos miden, por ejemplo, incorporación de [?-32P]-ATP, en un sustrato de PKC-T y la medición por conteo de escintilación líquida. Otros ensayos que emplean fosforilación de sustrato in vi tro y detección colorimétrica a base de anticuerpo u otros métodos de detección, son fácilmente comercialmente disponibles a partir de una variedad de fuentes que incluyen Promega (Madison, WI ; Catálogos Nos. V7470 y V5330) , Calbiochem (San Diego, CA; Catálogos Nos. 539484, 539490, 539491), Panvera Discovery Screening (Madison, WI; Catálogos Nos. P2747 y P2748; los cuales son una subsidiaria de Invitrogen, Carisbad, CA) . Ensayos no radioactivos, los cuales incluyen fosforilación de un sustrato que tiene la porción consenso R-X-X-S/T y medición del sustrato fosforilado por polarización fluorescente, incluyen aquellos vendidos por Panvera (Madison, WI) . En un ejemplo no limitante, las BMMC expuestas al agente de prueba y 32P-ATP, pueden ser estimuladas con anticuerpos del receptor anti-IgE para reticular el receptor IgE. Quince minutos después de la reticulación, las células pueden entonces ser sometidas a lisis. Después, la PKC-T endógena puede ser inmunoprecipitada con anticuerpos comercialmente disponibles (por ejemplo, con el anticuerpo anti-PKC-?, comercialmente disponible de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) , el cual es descrito en los ejemplos siguientes), y resuelta por análisis SDS-PAGE. La PKC-T a partir de una BMMC tratada con un agente de prueba que inhibe la autofosforilación de la PKC-T, mostrará una fosforilación reducida (es decir, incorporación reducida de la 32ATP) , comparada con la PKC-T de células no tratadas. En una alternativa de este ejemplo, las BMMC son expuestas a un agente de prueba en la ausencia de 32P-ATP. Quince minutos después de la reticulación del receptor anti-IgE, las células son sometidas a lisis e inmunoprecipitadas por PKC-T endógenas y resueltas por SDS-PAGE. El gel de SDS-PAGE es entonces sometido a análisis de Western blotting con anticuerpos anti-fosfotreonina (comercialmente disponible de, por ejemplo, Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) . La PKC-T de una BMMC tratada con un agente de prueba que inhibe la autofosforilación de PKC-T mostrará fosforilación reducida (es decir, incorporación reducida de la 32P-ATP) , comparada con la PKC-T de células no tratadas. La actividad de cinasa de PKC-T puede también ser determinada por su capacidad para fosforilar un sustrato. De este modo, una amplia variedad de sustratos oligo-péptidos y peptídicos, pueden ser utilizados en un ensayo para medir la actividad cinasa de PKC-T. Los péptidos útiles en la invención, tienen la porción consenso R-X-X-S/T /en donde R es arginina, X es ya sea un aminoácido desconocido o cualquiera conocido; S es serina y T es treonina) . Otros sustratos de proteína incluyen sin limitación, sustrato de cinasa C rico en alanina miristoilado (MARCKS) (secuencia de aminoácido KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 5), en donde el residuo de serina subrayado es fosforilado) , pseudo-sustrato PKC-T (secuencia de aminoácido FARKGSLRQKN (SEC ID NO: 6) , en donde el residuo de serina subrayado es fosforilado) . Usando una tecnología de arreglo peptídico, se han identificado varios sustratos potenciales para PKC-T, que pueden contener secuencias únicas al sustrato fisiológico de PKC-T y pueden ser un objetivo terapéutico con las mismas aplicaciones como la PKC-T (véase Figura 9 y Ejemplo 4 abajo) . Los sustratos pueden tener varias modificaciones, tan pronto como los sustratos participan en una reacción catalizada por PKC-T. Aún otro método para medir la actividad de cinasa de la PKC-T, es medir su capacidad para autofosforilarse. En los ejemplos descritos abajo, el dominio de cinasa de PKC-T fue sorprendentemente encontrado por ser fosforilado cuando se expresa en células bacterianas. Esta fosforilación fue debido a la autofosforilación porque las células bacterianas no fosforilan las proteínas. De este modo, la invención también proporciona un método para identificar un agente útil para tratar un trastorno inmune en un mamífero, poniendo en contacto una célula que expresa una proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) con un agente de prueba; y determinar si el agente de prueba reduce la autofosforilación de la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) en la célula, en donde un agente de prueba que reduce la autofosforilación de la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) , es identificado como un agente útil para tratar el trastorno inmune. En algunas modalidades, la célula es una célula bacteriana (por ejemplo, E. coli) . En algunas modalidades, el trastorno inmune es asma. De conformidad con la invención, una célula puede ser elaborada para expresar una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, introduciendo en la célula, una secuencia de nucleótido que codifica la proteína PKC-T o el fragmento funcional de la misma. Como se discute anteriormente, la secuencia de nucleótido está operablemente ligada a secuencias regulatorias (por ejemplo, secuencias promotoras e incrementadores) , que permiten a la célula expresar la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) . El experto de habilidad ordinaria, entenderá que los tipos de secuencias regulatorias requeridas para lograr la expresión de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) variarán dependiendo del tipo de célula en la cual la secuencia de nucleótido que codifica la proteína PKC-T (o un fragmento funcional de la misma) ha sido introducida. Por ejemplo, si la célula es una célula bacteriana, entonces las secuencias regulatorias de una célula bacteriana son preferiblemente usadas . Las secuencias regulatorias para numerosos tipos diferentes de células (por ejemplo, insecto, mamífero y bacteriano) , son bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo, Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, la cual es regularmente y periódicamente actualizada) . En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un agente útil para tratar un trastorno inmune tal como asma en un mamífero, poniendo en contacto una proteína PKC-T funcional o un dominio de cinasa PKC-T con un agente de prueba; y determinar si el agente de prueba reduce la autofosforilación de la proteína PKC-T funcional o el dominio de cinasa de PKC-T, en donde un agente de prueba que reduce la autofosforilación de la proteína PKC-? funcional o un dominio de cinasa PKC-T es identificado como un agente útil para tratar el trastorno inmune. En algunas modalidades, el contacto se hace in vitro. En algunas modalidades, el contacto de la proteína PKC-T funcional o dominio de cinasa PKC-T con el agente de prueba, se hace en un amortiguador. En algunas modalidades, el amortiguador tiene una fuerza iónica total elevada con relación a la fuerza iónica encontrada dentro de una célula (aproximadamente 100 mM de NaCl) . Por ejemplo, en algunas modalidades, el amortiguador tiene una fuerza iónica de al menos 100 mM. En algunas modalidades, el amortiguador tiene una fuerza iónica de al menos, 200 mM, o al menos 250 mM. En ciertas modalidades, el amortiguador en el cual la proteína PKC-T funcional o el dominio de cinasa PKC-T, es puesto en contacto con el agente de prueba que contiene NaCl . Por ejemplo, el amortiguador puede contener al menos 50 mM de NaCl (se nota que una sal adicional (es decir, distinta de NaCl) puede estar presente en el amortiguador. En algunas modalidades, el amortiguador contiene al menos 100 mM de NaCl, o al menos 150 mM de NaCl, o al menos 200 mM de NaCl. En algunas modalidades, el amortiguador contiene al menos 250 mM de NaCl. Por supuesto, el experto de habilidad ordinaria entenderá que las sales distintas o en adición a NaCl, pueden ser usadas para obtener un amortiguador con alta fuerza iónica. Algunos ejemplos no limitantes de tales sales incluyen acetato de amonio, acetato de sodio y cloruro de potasio. De conformidad con la invención, un "trastorno inmune" significa un trastorno en el cual una célula del sistema inmune (por ejemplo, una célula T, una célula B, una célula asesina natural, una célula mástil, un neutrófilo y un macrófago), no funcionan normalmente. En algunas modalidades, el trastorno inmune es asma. Otros trastornos inmunes incluyen, sin limitación, enfermedades autoinmunes (tales como diabetes mellitus tipo I y artritis reumatoide) , rechazo a injerto y enfermedades respiratorios, tales como alergia, en los cuales las células inmune juegan un papel. De este modo, la invención proporciona métodos para identificar agentes que son útiles en el tratamiento de trastornos inmunes, tales como asma, identificando agentes que modulan (por ejemplo, disminuyen) , el nivel de proteína PKC-T funcional o agentes que modulan (por ejemplo, disminuyen) la actividad de cinasa PKC-T. Los agentes que modulan (por ejemplo, disminuye) la producción de la proteína PKC-T funcional o actividad de cinasa PKC-T incluyen, sin limitación, compuestos de moléculas pequeñas, químicos, moléculas de ácido nucleico, péptidos y proteínas tales como hormonas y anticuerpos. Los agentes pueden también incluir, por ejemplo, oligonucleótidos o polinucleótidos, tales como ácido ribonucleótido antisentido y ARNs de interferencia menor (siARN) . La secuencia de nucleótido antisentido y ARNsi típicamente incluyen una secuencia de nucleótido que es complementaria a, o es de otro modo, capaz de hibridizar con una porción de la secuencia de nucleótido objetivo. En un ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótido antisentido y/o siARN, hibridizan a la secuencia de nucleótido CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG (SEC ID NO : 7), la cual codifica la secuencia de aminoácido QNMFRNFSFMNP (SEC ID NO: 8) , la cual corresponde a los residuos de aminoácido 688 hasta 699 que contienen el residuo serina en la posición 695 la cual es requerida para la autofosforilación T538. En otro ejemplo no limitante, el ARN antisentido y/o siARN, hidridizan a la secuencia de nucleótido GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT (SEC ID NO : 9), la cual codifica la secuencia de aminoácido GDAKTNTFCGTP (SEC ID NO: 10), la cual corresponde a los residuos de aminoácido 532 hasta 543 que contienen los residuos de treonina en las posiciones 536 y 538, al menos uno de los cuales se requiere para la actividad de cinasa (véase por ejemplo, Figuras 2B y 2C) . Las secuencias de nucleótido antisentido pueden tener una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos, pero pueden variar en longitud desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 200 nucleótidos, o pueden ser la longitud completa del gen objetivo. El experto en la técnica puede seleccionar un objetivo apropiado y una longitud apropiada de ácido nucleico antisentido para tener el efecto terapéutico deseado por procedimientos estándares conocidos en la técnica, y como se describen por ejemplo, en Methods in Enzymology, Antisense Technology, Partes A y B (Volumen 313 y 314) (M. Phillips, ed. , Academic Press, 1999). Ejemplos no limitantes de moléculas antisentido útiles en la presente invención, son aquellas descritas en Bennett et al . , Patente Estadounidense No. 6,190,869 (publicada el 20 de Febrero de 2001) , por este medio incorporada por referencia. El ARN de interferencia se refiere al silenciamiento del gen post-transcripcional, específico de la-secuencia, llevado por fragmentos de ARN de doble hebra de interferencia, pequeños, que son homólogos al gen objetivo silenciado (Lee, N. S. et al., Nature Biotech . 19:500-505 (2002)). Estos siARN podrán dirigirse específicamente y eliminar moléculas de ARNm natural . Los métodos para inhibir la producción de una proteína que utiliza siARN, son bien conocidos en la técnica y descritos en por ejemplo, las Solicitudes Internaciones de PCT Números WO 01/75164; WO 00/63364; WO 01/92513; WO 00/44895; y WO 99/32619. Otros agentes que pueden ser usaos para modular (por ejemplo, disminuir) la producción de proteína PKC-T funcional o modular (por ejemplo, disminuir) la actividad de cinasa PKC-T incluyen, sin limitación, agentes que bloquean la translocación de la PKC-T en la membrana de la superficie celular. Otros agentes que pueden ser utilizados incluyen aquellos encontrados en los ensayos de selección descritos en este documento. Agentes opcionales, o inhibidores o antagonistas de PKC-T incluyen, por ejemplo, anticuerpos y moléculas pequeñas que se enlazan específicamente a la proteína PKC-T o una porción de una proteína PKC-T. Por "se enlaza específicamente" , significa un anticuerpo de la invención, que reconoce y se enlaza a una proteína PKC-T (o una porción de la misma) , con una constante de disociación (KD) de al menos 10"5 M, o con un KD de al menos 10"6 M, o con un KD de al menos 10~7, o con un KD de al menos 10"8, o con un KD de al menos 10~10 M. Métodos estándares para determinar el enlace y afinidad de enlace, son bien conocidos. Por consiguiente, anticuerpos que específicamente se enlazan a la proteína PKC-T, están proporcionados en este documento. Un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína PKC-T como se usa en este documento, pueden ser, sin limitación, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo diseñado por ingeniería genética, un anticuerpo biespecífico, fragmentos de anticuerpos (que incluyen pero no se limitan a "Fv," "F(ab')2," "F (ab) , " y "Dab" ) y cadenas únicas que representan la porción reactiva del anticuerpo. Los métodos para la producción de cada una de las formas de anticuerpos anteriores, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden obtener inyectando la proteína PKC-T de mamífero de ácido purificado en varios animales y aislar los anticuerpos producidos en la corriente sanguínea, como se describe más completamente, por ejemplo, en Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, la cual es regularmente y periódicamente actualizada. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales cuyos métodos de producción son bien conocidos en la técnica. Anticuerpos monoclonales específicos se pueden obtener comercialmente o pueden ser de otro modo, preparados por la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol . 6:511-519 (1976), y mejoramientos o modificaciones de los mismos. Brevemente, tales métodos incluyen preparación de líneas celulares inmortales, capaces de producir anticuerpos deseados.- Las líneas de células inmortales pueden ser producidas inyectando el antígeno de elección en un mamífero, tal como un ratón, cosechando células B a partir del bazo del animal y fusionando las células con células de mieloma para formar un hibridoma. Colonias únicas se pueden seleccionar y probar por procedimientos de rutina en la técnica por su habilidad para secretar anticuerpos de alta afinidad al epítope deseado . Alternativamente, los anticuerpos pueden ser producidos recombinantemente a partir de bibliotecas de expresión por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ADNc puede ser producido de ácido ribonucleico (ARN) que ha sido aislado de -linfocitos, preferiblemente de linfocitos B y preferiblemente de un animal inyectado con un antígeno deseado. El ADNc, tal como aquel el cual codifica varios genes de inmunoglobulina, puede ser amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y clonado en un vector apropiado, tal como un vector de exhibición de fago. Tal vector puede ser agregado a una suspensión bacteriana, preferiblemente una que incluye E. coli , y bacteriófagos o partículas de fagos, puede ser producido exhibiendo el fragmento de anticuerpo correspondiente ligado a la superficie de la partícula del fago. Se puede construir una sub-biblioteca seleccionando partículas de fago que incluyen el anticuerpo deseado por métodos conocidos en la técnica y que incluyen, por ejemplo, técnicas de purificación de afinidad, tales como panoramizado. La sub-biblioteca puede entonces ser utilizada para aislar los anticuerpos a partir de un tipo de célula deseado, tal como células bacterianas, células de levadura o células de mamífero. Los métodos para producir anticuerpos recombinantes como se describen en este documento y modificaciones de los mismos, se pueden encontrar, por ejemplo, en Griffiths, W.G. et al . , Ann . Rev. Immunol . 12:433-455 (1994); Marks, J.D. et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991); Winter, G. and Milstein, C, Nature 349:293-299 (1991); Hoogenboom, H.R. and Winter, G. , J. Mol . J3iol. 227:381-388 (1992). Para uso en la presente invención, la proteína PKC-? puede ser purificada primero antes de ser usada para la generación de anticuerpos por técnicas similarmente conocidas por los expertos en la técnica, como se discute previamente en este documento. Una modalidad adicional de la invención proporciona una forma no limitante para reducir el número de agentes de prueba para pre-seleccionar los agentes de prueba. Por ejemplo, solamente aquellos agentes de prueba que tienen una capacidad para enlazarse a la proteína PKC-T o el promotor que dirige la expresión del gen de la PKC-T, pueden ser usados en los ensayos funcionales de la invención. En un ejemplo no limitante, en donde los agentes de prueba son primero seleccionados por su habilidad para enlazarse a la proteína PKC-T, proteína PKC-T purificada, puede ser aislado y usado para seleccionar agentes de prueba. Por ejemplo, la proteína PKC-T de purificación, puede ser inmovilizada en una .superficie de fase sólida (por ejemplo, una perlilla de sefarosa o plástico) , y los agentes de prueba se llevan en contacto con la proteína PKC-T inmovilizada purificada. En un ejemplo alternativo, después de la exposición de la proteína PKC-T con un agente de prueba, los anticuerpos dirigidos contra la proteína PKC-T, pueden ser agregados y usados para inmunoprecipitar la proteína PKC-T para determinar si un agente de prueba co-inmunoprecipita con la proteína PKC-T. Solamente aquellos agentes de prueba que son capaces de enlazarse a la proteína PKC-T, son usados después en ensayos funcionales para determinar si pueden modular (por ejemplo, reducir) , la actividad de cinasa PKC-T o modular (por ejemplo, reducir) , la cantidad de proteína PKC-T funcional en una célula, tal como una célula mástil o una célula T (por ejemplo, una célula T auxiliadora THl ó TH2) . En un ejemplo no limitante en donde los agentes de prueba son primero seleccionados por su capacidad para enlazarse al promotor PKC-T, la secuencia promotora de PKC-T puede ser inmovilizada, como en un arreglo de microchip de ADN. Diferentes agentes de prueba pueden entonces ser seleccionados por su capacidad para enlazarse al promotor. Solamente aquellos agentes que son capaces de enlazarse al promotor de PKC-T, son entonces usados en ensayos funcionales para Determinar si pueden modular (por ejemplo, reducir) , la cantidad de proteína PKC-T funcional en una célula, tal como una célula mástil o una célula T (por ejemplo, una célula T TH2) . En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un agente útil para tratar asma en un mamífero (por ejemplo, un humano) , que comprende poner en contacto una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen reportero operablemente ligado a un promotor de PKC-T con un agente de prueba, y determinar si el agente de prueba reduce la producción del producto de gen reportero, en donde un agente de prueba que reduce la producción del producto de gen reportero, es identificado como agente útil para tratar asma. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen reportero, operablemente ligado a un promotor de PKC-T, está en una célula (por ejemplo, una célula mástil o una célula T, tal como una célula T auxiliadora THl ó TH2) . La secuencia de nucleótido del promotor de PKC-T, es determinada por métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo no limitante de tal método es seleccionar una biblioteca genómica (por ejemplo, una biblioteca genómica humana YAC) para la secuencia promotora de interés, usando la secuencia de nucleótido de PKC-T como una sonda, y después, aislar la secuencia de nucleótido al 5' de donde se une la sonda. Otro ejemplo no limitante de un método para determinar la secuencia promotora adecuada, es realizar un análisis de manchado Southern del ADN genómico humano, probando electroforéticamente ADN genómico humano resuelto con una sonda (por ejemplo, una sonda que comprende la secuencia de nucleótido que codifica la proteína PKC-T humana o una porción de la misma) y después determinar en donde se hibridiza la sonda de ADNc. Después de determinar la banda en la cual la sonda de hibridiza, la banda puede ser aislada (por ejemplo, cortada del gel) y sometida a análisis de secuencia. Esto permite detección de los fragmentos de nucleótidos de los nucleótidos ATG (es decir, el inicio del sitio de transcripción) . Este fragmento de nucleótido es el promotor de PKC-T, y puede ser sometido a análisis de secuenciamiento. El fragmento de nucleótido puede ser entre aproximadamente 500 hasta 1000 nucleótidos de longitud. Las secuencias de nucleótido que tienen al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90% de identidad a tales secuencias, y que funcionan como promotor, por ejemplo, para dirigir la expresión de un gen que codifica una proteína PKC-T descrita en este documento, están también abarcadas en la invención. Una amplia variedad de genes reporteros pueden ser operablemente ligados al promotor de PKC-T descrito anteriormente. Tales genes pueden codificar por ejemplo, luciferasa, ß-galactosidasa, acetiltransferasa de cloranfenicol, ß-glucuronidasa, fosfatasa alcalina y proteína fluorescente verde u otro producto de gen reportero conocido en la técnica. En una forma de la invención, la secuencia de nucleótido que codifica un gen reportero que es operablemente ligado a un promotor PKC-T, es introducida en una célula hospedera. Como se discute anteriormente, se pueden emplear numerosas células hospederas en la invención. Tal secuencia de nucleótido puede ser primer insertada en un vector dé expresión recombinante deseado o de otro modo, apropiado como se describe previamente en este documento . Los vectores en esta forma de la invención, pueden incluir otros elementos genéticos conocidos necesarios o deseables para determinar la expresión del gen reportero a partir del promotor de PKC-T, que incluye elementos regulatorios en una célula de mamífero. Por ejemplo, los vectores pueden incluir cualquiera de las secuencias incrementadoras necesarias que cooperan con el promotor in vivo, por ejemplo, para lograr la transcripción in vivo del gen reportero . Los métodos para introducir la secuencia de nucleótido en una célula hospedera, son idénticos a aquellos previamente descritos para producir la proteína PKC-T. Después de contactar una secuencia de nucleótido que codifica un gen reportero operablemente ligado a un promotor de PKC-T con un agente de prueba, se determina si el agente de prueba inhibe la producción del producto de gen reportero. Este punto final puede ser determinado garantizando ya sea la cantidad o actividad del producto del gen reportero. El método de cuantificación dependerá del gen reportero que se usa, pero puede involucrar el uso de un ensayo inmunosorbente ligado a la enzima con anticuerpos al producto del gen reportero. Adicionalmente, los ensayos pueden medir la quimioluminiscencia, fluorescencia, decaimiento radioactivo, etc. Si los agentes de prueba inhiben la producción del producto de gen reportero, se clasifican como un agente para tratar el asma. Ensayos para determinar la actividad o cantidad de productos del gen reportero descritos en este documento, se conocen en la técnica y se discuten en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al . , eds., John Wiley & Sons) , la cual es regularmente y periódicamente adaptado. Descripciones adicionales de ensayos para los productos del gen reportero discutidos en este documento, se pueden encontrar por ejemplo, en las siguientes publicaciones: para luciferasa, véase Nguyen, V.T. et al . , Anal . Biochem. 171:404-408 (1988); para ß-galactosidasa, véase, por ejemplo, Martin, C.S. et al . , Bioluminescence and Chemiluminescence : Molecular Reporting wi th Photons pp . 525-528 (J.W. Hastings et al . , eds., John Wiley & Sons, 1997); Jain, V.K. and Magrath, I.T., Anal . Biochem. 199:119-124 (1991) ; para ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa y fosfatasa alcalina, véase por ejemplo, Bronstein, I. et al . Bioluminescence and Chemiluminescence : Fundamentáis and Applied Aspects, pp. 20-23, (A.K. Campbell et al . , eds., John Wiley & Sons, 1994) ; para acetiltransferasa de cloranfenicol, véase Cullen, B., Methods . Enzymol . 152:684 (1987); Gorman, C. et al. Mol . Cell . Biol . 2:1044 (1982); Miner, J.N. et al . , J. Virol . 62:297-304 (1988); Sleigh, M.J., Anal. Biochem . 156:251-256 (1986); Hruby, D.E. and Wilson, E.M., Methods Enzymol . 216: 369-376 (1992). Moléculas pequeñas que inhiben selectivamente la actividad de PKC-T, también son agentes terapéuticos para tratar asma. La selectividad puede ser definida por un IC50 mayor de aproximadamente 20 veces para inhibir la PKC-T sobre otras isoformas de PKC . (El IC50 es definido como la concentración de inhibidor que resulta en cincuenta por ciento de actividad del inhibidor objetivo) . En otro aspecto de la invención, la invención proporciona métodos para tratar el asma que incluyen, administrar a un mamífero (por ejemplo, un humano) que sufre de asma o que sufre de un síntoma de asma, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que reduce la actividad catalítica de PKC-T o reduce la producción de proteína PKC-T funcional. En una modalidad, el mamífero es un humano. En algunas modalidades, el asma es asma mediado por IgE. "Tratamiento" , "tratar" o "tratado" como se usan en este documento, significa prevenir,- reducir o eliminar al menos un síntoma o complicación de asma. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" , representa una cantidad de un agente que es capaz de inhibir o disminuir la producción de una proteína PKC-T funcional o capaz de inhibir o disminuir la actividad de cinasa de una proteína PKC-T, y causar una respuesta clínicamente significante. La respuesta clínicamente significante incluye, sin limitación, un mejoramiento en la condición tratada o en la prevención de la condición. La dosis particular del agente administrado de conformidad con esta invención, por su puesto, será determinada por las circunstancias particulares que rodean el caso, que incluyen el agente administrado, el asma particular a ser tratado y condiciones similares . El asma es tratado por ejemplo, disminuyendo la hiperreactividad de las vías respiratorias, disminuyendo la hiperproducción del moco, disminuyendo los niveles de IgE del suero o disminuyendo la eosinofilia de las vías respiratorias. Los agentes pueden ser administrados a un mamífero por una amplia variedad de rutas, que incluyen, enteral, parenteral y tópica. Por ejemplo, los agentes pueden ser administrados oralmente, intranasalmente, por inhalación, intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravascularmente, intravenosamente, transdérmicamente, subcutáneamente o cualquier combinación de las mismas. Los agentes pueden ser administrados en un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables y sus formulaciones, son bien conocidos y se describen de manera general en, por ejemplo, Remington : The Science and Practice of Pharmacy (20th Edition, ed. A. Gennaro (ed.), Lippincott, Williams & Wilkins, 2000) . En algunas modalidades, el portador farmacéuticamente aceptable está en la forma de un aerosol. Cualquier portador farmacéuticamente aceptable adecuado conocido en la técnica, puede ser usado. Los portadores pueden ser sólidos, líquidos, o una mezcla de un sólido y un líquido. Cuando se presenta como un líquido o una mezcla de un sólido y un líquido, los portadores que solubilizan eficientemente los agentes, son preferidos. Los portadores pueden tomar la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, polvos, grageas, suspensiones, emulsiones o jarabes u otras formas conocidas. Los portadores pueden incluir sustancias que actúan como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, aglutinantes, estabilizadores, agentes desintegradores de tabletas y materiales encapsulantes . Los portadores sólidos o líquidos pueden tomar la forma de un aerosol para suministrar los agentes a su ubicación deseada, tal como cuando se usan en un nebulizador para inhalar el agente. Las tabletas para administración, oral sistémica pueden incluir excipientes, como se conoce en la técnica, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol) , celulosas (por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio) , gomas (por ejemplo, arábica, tragacanto) , junto con otros agentes desintegradores, tales como maíz, almidón o ácido algínico, agentes aglutinantes, tales como gelatina, colágeno, colágeno o acacia y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. En polvos, el portador es un sólido finamente dividido, el cual es mezclado con una cantidad efectiva de un agente inhibidor finamente dividido. En soluciones, suspensiones o jarabes, una cantidad efectiva del agente inhibidor se disuelve o suspende en tal portador como agua estéril, salina o un solvente orgánico, tal como propilenglicol acuoso. Otras composiciones se pueden hacer dispersando el inhibidor en una solución de carboximetilcelulosa de sodio o almidón acuoso o un aceite adecuado conocido en la técnica. Los agentes son administrados a un mamífero en una cantidad terapéuticamente efectiva. Tal cantidad es efectiva para tratar asma o reducir síntomas de asma. Esta cantidad puede variar, dependiendo de la actividad del agente utilizado, si cualquiera de otro agente anti-asmático es coadministrado y la naturaleza de tal agente anti-asmático, la naturaleza del asma y la salud del paciente. Aunque tales cantidades se pueden determinar por el experto en la técnica, cantidades terapéuticamente efectivas típicas incluyen aproximadamente 10 mg/kg/día hasta aproximadamente 100 mg/kg/día. Por supuesto, se pueden necesitar dosificaciones altas o bajas dependiendo del caso específico. Cuando los agentes son combinados con un portador, pueden estar presentes en una cantidad desde aproximadamente 1 por ciento en peso hasta aproximadamente 99 por ciento en peso, el resto está compuesto de un portador farmacéuticamente aceptable . En ciertas modalidades, el agente o inhibidor de la producción de PKC-T o actividad catalítica puede ser coadministrada en, por ejemplo, una composición que incluye uno o más agentes anti-asmáticos . Tales agentes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, agentes ß-adrenérgicos, que incluyen isoproterenol, epinefrina, metaproterenol, y terbutaliña; metilxantinas, que incluyen teofilina, aminofilina y oxtrifilina; corticoesteroides que incluyen beclometasona, betametasona, hidrocortisona y prednisona; anticolinérgicos, que incluyen atropina y bromuro de ipratropio; antihistaminas, que incluyen terfenadina y astemizol; boqueadores del canal de calcio, que incluyen verapamilo, nifedipina; y estabilizadores de células mástil, que incluyen cromolin sódico y nedocromolil sódico. En algunas modalidades, el agente es una molécula de ácido nucleico. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido ribonucleico. En algunas modalidades, la molécula de ácido ribonucleico comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una porción de secuencia de nucleótido mostrada en la SEC ID NO: 3. En ciertas modalidades, el agente reduce la cantidad de ARN que codifica la proteína PKC-T. En algunas modalidades, el agente inhibe la traducción de un ARN que codifica la proteína PKC-T. En modalidades particulares, el agente es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo policlonal, monoclonal, humanizado o quimérico) que específicamente se enlaza a la proteína PKC-T, o una porción de la misma. En un aspecto adicional, la invención caracteriza una célula la cual carece de expresión de PCK-T endógena. En ciertas modalidades, la célula es una célula mástil. Tal célula se puede aislar de, por ejemplo, ratones agénicos PKC-T como se describe abajo (véase también Sun et al . , Nature 404:402-407 (2000)). Métodos para aislar células mástil son bien conocidos (véase, por ejemplo, el método descrito abajo) . Tal célula que carece de expresión de la proteína PKC-T endógena, puede también ser una célula humana, en la cual, el gen que codifica la PKC-T se ha suprimido o mutado, de manera tal que la célula no expresa más tiempo la PKC-T endógena. Una célula mástil que carece de la expresión de proteína PKC-T endógena es útil, por ejemplo, para probar si un agente de prueba es un agente útil para tratar el asma. Como se describe abajo en los ejemplos, una PKC-T (HA) -etiquetada de hemaglutinina se expresó en células 293. La PKC-T HA-etiquetada se puede expresar en células mástil y la actividad y/o cantidad de la proteína PKC-T HA-etiquetada medida en estas células en la presencia de un agente de prueba. Sin embargo, puesto que las células mástil expresan PKC-T endógena, algo del agente de prueba puede afectar la proteína PKC-T endógena, con ello, mutar sus efectos en la proteína HA-etiquetada. Esta mutación no ocurrirá en una célula mástil que carece de la expresión de la proteína PKC-? endógena y que expresa la proteína PKC-T HA-etiquetada. Sin embargo, tales células son útiles para seleccionar aquellos agentes de prueba los cuales afectan la PKC-T HA-etiquetada de forma diferente que las que afectan la PKC-T de tipo nativo. En algunas modalidades, la célula que expresa la PKC-T endógena o un fragmento de la misma. Se hará referencia ahora a ejemplos específicos que ilustran las composiciones y métodos anteriores. Se entenderá que los ejemplos se proporcionan para ilustrar modalidades preferidas y que no limitan el alcance de la invención que se pretende de este modo.

EJEMPLO 1 Fosforilación del Bucle de Activación de Translocación de Membrana PKC-T Después de la Co-estimulación de TCR de Células T Humanas Ratones nulos PKC-T (es decir, agénicos) , son viables, pero las células T maduras son defectivas en la proliferación, producción de IL-2 y activación de NF-?B (Sun et al . , Nature 404:402-407 (2000)). En células mástil - cultivadas humanas (HCMC) se ha demostrado que la actividad cinasa PKC, rápidamente (<5 min) localiza a la membrana después de la reticulación del receptor IgE (Kimata et al . , BBRC 3:895-900 (1999)). Debido a que la PKC-T juega un papel central en la señalización mediada por TCR y tiene un efecto demostrado en células RBL-2H3, una línea de leucemia basofílica de rata (Liu et al., J. Leukocyte Biol. 69:831-840 (2001) ) , se examinó la activación y función de PKC-T en BMMC, células mástil perifonéales y células T. Después de la estimulación con TCR, la PKC-T es rápidamente translocada a la región central del complejo de activación supramolecular en donde permanece por hasta cuatro horas (Huang et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 99:9369-9373 (2002)) . Para determinar si esta translocación corresponde a un cambio en la fosforilación de la proteína PKC-T, células T humanas se purificaron y la PKC-T se translocó y se analizó por autofosforilación. Para purificar células T, se obtuvieron preparaciones de células mononucleares a partir de Biological Specialties (Colmar, PA) . Las .células se estratificaron en Ficoll-Histopaque (comercialmente disponibles de, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St . Lous, MO) y la célula mononuclear de cultivo se colectó después de la centrifugación. Las células se lavaron varias veces en PBS y se cultivaron en RPMI/FCS al 10% a una densidad de 106/ ml .

Las células T fueron purificadas por selección negativa (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) . Las células T purificadas fueron estimuladas con anti-CD3e soluble (5 µg/ml reticulado con 10 µg/ml anti-mlgG) y anti-CD28 soluble (5 µg/ml) por 0, 2, 10, 45 y 60 minutos (tanto el anti-CD3e como anti-CD28 están comercialmente disponibles de BD Biosciences, San José, CA) . Para análisis, las células estimuladas se colectaron por centrifugación y se lavaron una vez en PBS enfriado con hielo. Se prepararon usados celulares completos resuspendiendo las pelotillas celulares en 100 µl de amortiguador hipotónico de lisis [20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM de EDTA, 5 mM de ácido etilen glicol-bis (B-amino-etil éter) -N,N,N' ,N' -tetracético (EGTA), 10 µg cada uno de leupeptina y aprotinina por ml, cóctel de proteasa e inhibidores de fosfatasa] . La suspensión celular se cortó pasando a través de una aguja de calibre 25 por 30 veces, después se centrifugó a 280 x g por 7 minutos para precipitar el núcleo. El extracto celular completo se depuró por centrifugación a alta velocidad (16,000 x g) después se preservó una alícuota para análisis. El extracto citosólico se colectó y las pelotillas de la membrana se lavaron una vez en el amortiguador hipotónico de lisis y después se suspendió nuevamente en el mismo amortiguador con la adición de detergente NP-40 al 1% para lisis en hielo por 30 minutos. La fracción de la membrana soluble del detergente se obtuvo por otra etapa de centrifugación a alta velocidad y la fracción particulada restante fue la fracción de membrana insoluble del detergente (la fracción DI) que contiene microdominios de la membrana. Esta fracción DI se hirvió en amortiguador muestra SDS-PAGE para análisis. Las fracciones de proteína subcelular se analizaron por SDS-PAGE al 4-20%, se transfirieron a nitrocelulosa e prueba de blot con anticuerpo específico PKC-T anti-fosfoT538 (comercialmente disponible de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA) ) en blotto al 5%/TBS-Tween.05% (véase Fig. 1A) . Después, se quitó la mancha de nitrocelulosa y se probó nuevamente con anti-PKC-? E7 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) (véase Fig. IB) . Finalmente, como se muestra en la Fig. 1C, se mostraron cargas iguales en todas las líneas, la mancha se quitó nuevamente y después con anti-actina (comercialmente disponible de Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Como se muestra en la Fig. 1A, la PKC-T es autofosforilada en el bucle de activación de la cinasa en el residuo de treonina en posición 538 después de la estimulación TCR (vía estimulación CD3 y CD28) . El caso de autofosforilación coincide con la translocación de PKC-T a la región central del complejo de activación supramolecular (véase Fig. IB) . Como se muestra en la Fig. 1C, aproximadamente cantidades iguales de actina se encontraron en todas las veces de los tratamientos. Así, estos resultados muestran que la translocación de PKC-T a la región central del complejo de activación supramolecular corresponde a una fosforilación inducible concomitante del bucle de activación de la cinasa en treonina 538 de residuo de aminoácido.

EJEMPLO 2 La Autofosforilación de Bucle de Activación PKC-T es Requerida para Activación de Cinasa Como se describe en el Ejemplo 1, la translocación de la membrana PKC-T corresponde con una fosforilación inducible concomitante del bucle de activación de la cinasa en el residuo de aminoácido treonina 538 sobre la coestimulación del receptor de células T de células T humanas. Esta fosforilación del bucle de activación se ha reportado por ser requerida para la función de cinasa (Liu et al . , Biochemical Journal , 2002, 361-255-265) . Para confirmar este reporte, se subclonó ADNc de longitud completa de PKC-T con un epítope de hemaglutinina (HA) C-terminal etiquetado en el pcADN3 plásmido (comercialmente disponible de Invitrogen) , creando un epítope HA C-terminal etiquetado con PKC-T (WT) de longitud completa (secuencia de nucleótido SEC ID NO: 11; secuencia de aminoácido SEC ID NO: 12) . Se generó también una PKC-T que elimina la cinasa HA-etiquetada mutando la lisina en la posición 409 del aminoácido para triptofano. Esta mutación K409W se generó subclonando productos PCR y se confirmó por secuenciamiento (secuencia de nucleótido SEC ID NO: 13; secuencia de aminoácido SEC ID NO: 14), y se subclonó en el vector de expresión pcAND3. Las células de riñon 293 embriónicas humanas (comercialmente disponibles de la American Type Cultures Collection, Manassas, VA se transfectaron por duplicado con estos constructos de expresión disponibles de Mirus Corporation, Madison WI) . Las células se colectaron 24 ó 72 horas después de las transfecciones para análisis y actividad de Western blotting. Las células cosechadas se lisaron en condiciones hipotónicas de lisis y el núcleo se centrifugó (véase con más detalle métodos del Ejemplo 1) . Los extractos de la célula completa de una replica se corrieron en SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a sonda, primero con anticuerpo específico PKC-T anti-fbsfoT538 (Cell Signaling Technology) , después se retiraron y probaron nuevamente con anticuerpo anti-HA (Santa Cruz) . Como se muestra en la Fig. 2A, se presentó la proteína PKC-T de longitud completa de eliminación de cinasa (como se determinó por su manchado con el anticuerpo anti-HA) , pero no se fosforiló en el residuo de treonina en posición 538 (como se determina por su carencia de teñido con el anticuerpo PKC-T anti-pT538) . Así, como se muestra en los experimentos de transfección en la Fig, 2A, mientras el bucle de activación de cinasa de tipo nativo es efectivamente fosforilado, la versión de eliminación de cinasa (generada mutando la lisina catalítica en posición 409 en la proteína a un triptofano, desde aquí el nombre K409W) no es fosforilada. Aunque la evidencia de otras isoformas PKC indican que la fosforilación en el bucle de activación (es decir, la treonina en posición 538) puede ser atribuida a la cinasa PDK-1 basados en evidencia de otras isoformas PKC, los resultados presentados en este documento indican que la PDK-1 endógena presente en las células de riñon 293 embriónicas humanas no son fosforiladas en el bucle de activación PKC-T. La fosforilación del bucle de activación también se ha mejorado por análisis de manchado fosfo del dominio de cinasa activa bacterialmente expresada, y el análisis del dominio de cinasa purificada (datos no mostrados) . Después, los extractos citosólicos de la misma replica (es decir, aquellos usados en la Fig. 2) se analizaron por actividad de cinasa in vi tro usando un sustrato del péptido. Los extractos citosólicos se analizaron por actividad de cinasa in vi tro en placas de 96 cavidades con 5 µg de proteína cada una con una concentración final de 83 µM de sustrato del péptido biotinilado (secuencia de aminoácido FARKGSLRQ; SEC ID NO: 15), 166 µM ATP, 0.5 µl de P33 ATP (actividad específica 3000 Ci/mmol) , 10 m Ci/ml) , 84 ng/µl de fosfatidilserina, 8.4 ng/µl de diacilglicerol en amortiguador ADBII (20 nM de MOPS, pH 7.2, 25 mM de ß-gliceroaldehído, 1 mM de ortovadato de sodio, lmM DTT, 1 mM de CaCl2) , en un volumen final de 30 µl para 30 minutos a temperatura ambiente . Los ensayos de cinasa se detuvieron con amortiguador que contiene EDTA y se transfirieron a placas de escintilación revestidas de estreptavidina para lavado y detección de radioactividad en un lector en placa. Se sustrajeron reacciones solamente de cinasa y solamente de péptido de conteos finales como en el antecedente . Como se muestra en la Fig. 2B, la proteína PKC-T de longitud completa de eliminación de cinasa tiene actividad de cinasa dramáticamente baja tanto en 24 como en 72 horas después de la transfección en células de riñon 293 embriónicas humanas, comparada con la proteína PKC-? de tipo nativo. Finalmente, la capacidad de la PKC-T de eliminación de cinasa y tipo nativa, que resulta en la fosforilación de un sustrato endógeno, se determinó por IKK (cinasa I?Ba) . Para hacer esto, las células de las series duplicadas se lisaron en amortiguador de lisis NP-40 al 1% y se transfirieron las fracciones de membrana insoluble en detergente a nitrocelulosa. Las manchas de nitrocelulosa se sondearon primero con anti-pIKKa/ß, después se retiraron y se sondearon nuevamente con anti-IKKa, y finalmente se retiraron y sondearon nuevamente con anti-IKKß (finalmente se retiraron y sondearon con anti-IKKß (todos los anticuerpos de Cell Signaling Technology) . Como se muestra en la Fig. 2C, la PKC-? de tipo nativo, pero PKC-T de eliminación de cinasa, resultó en la fosforilación de IKK-ß. Los resultados mostrados en las Figs . 2B y 2C demuestran que la autofosforilación del bucle de activación (es decir, en la treonina a posición 538) se requiere para actividad PKC-T y señalización, como se muestra por la actividad de cinasa de usado celular in vivo usando un sustrato sintético (Fig. 2B) , y fosforilación de IKK endógeno (Fig. 2C) . Estos resultados indican que la cinasa de tipo nativo induce la fosforilación de IKK, mientras que la versión de eliminación de cinasa falla para hacer esto. Estos resultados identifican la autofosforilación de bucle de activación PKC-T como un mecanismo único y nuevo para modulación terapéutica.

, EJEMPLO, 3 Mecanismo de Catálisis del Dominio Cinasa PKC-T Se realizaron estudios adicionales para elucidar el mecanismo catálisis del nuevo dominio de cinasa PKC-T fosforilada (PKC-T KD) . Para hacer esto, se expresó la PKC-T KD catalíticamente activa y se purificó por análisis de los sitios de fosforilación. Para estos estudios, el dominio de cinasa de PKC-T (PKC-T KD, residuos de aminoácido 362 a 706) fue primero expresado y purificado. Para hacer esto, PKC-T KD (residuos de aminoácido 362 a 706) se clonó en un vector de expresión pET16b, introduciendo una etiqueta hexa-histidina al C-término. La secuencia de aminoácido de la PKC-T KD his-etiquetada se proporcionó en la SEC ID NO: 63 (note que la metionina N-terminal y residuos de glicina en la SEC ID NO: 63 no se origina en la PKC-T de longitud completa) . Se usó el plásmido para transformar la cepa BL21-DE3 de E. coli para sobreexpresión. Un cultivo celular de 10 litros a 37°C de una densidad óptica de 0.4, se induce con 0.1 mM de IPTG a 25 °C por 3 horas antes que se colecten y se suspendan nuevamente en amortiguador (25 mM Tris, pH 8.0 , 25 mM de NaCl, 5 mM de 2-mercaptoetanol, 5 mM de imidazol, 50 µM de APT e inhibidores de proteasa) , y se lisaron usando un microfluidizador . Lo lisado se aplicó a 20 ml de resina Níquel-NTA por 1 ora a 4°C. La resina subsecuentemente se vertió como una columna en cromatografía y se lavó extensivamente con el mismo amortiguador incluyendo 25 mM de imidazol . La proteína enlazada a la resina se eluyó con 200 mM de amortiguador de imidazol . La proteína se cargó inmediatamente en un HQ de intercambio aniónico y la columna se lavó con 25 mM de Tris, pH 8.0, 25 mM de NaCl , 5 mM de DTT, 50 µM de ATP antes de ser resuelto por la solicitud de un gradiente lineal de 25 mM a 500 mM de NaCl. Las fracciones que contienen PKC-T KD se seleccionaron por SDS-PAGE, se agruparon y se diluyeron dos veces con 25 mM de Tris, pH 8.0 , 5 mM de DTT y se cargó en una columna de cromatografía de heparina. El flujo fue inmediatamente aplicado a una columna hidroxi-apatito y se lavó extensivamente con 25 mM de Tris, pH 8.0, 50 mM de NaCl, 5 mM de DTT. Un gradiente lineal de fosfato de sodio de 0 a 100 mM eluyó la proteína objetivo. La proteína después se clasificó por tamaño como un monómero en una columna de cromatografía de exclusión tamaño Superdex 200, se dializó durante la noche a 4°C nuevamente 25 mM de Tris, pH 8.0, 50 mM de NaCl, 5 mM de DTT y se concentraron. Después, se realizaron los análisis de espectrometría de masas. Para hacer esto, se corrieron PKC-T KD (en 50 mM de Hepes, pH 7.5, 5 mM de MgCl2, 5 mM de DTT, glicerol al 10% y Brij-35 al 0.0025% a 0.25 µg/µl) en geles Tricina al 10% (Invitrogen) y teñido azul Comassie. Las bandas se cortaron y sometieron a digestión en gel con tripsina (Promega, Madison, WI) en un robot Investigador ProGest (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) . La muestra de volumen se redujo por SpeedVac y se reconstituyó con 0.1M de ácido acético a un volumen final de aproximadamente 30 µl . Los péptidos después se sometieron a análisis nanoLC/EM/EM, Brevemente, las muestras se inyectaron en una columna IntegraFrit 75 µm x 10 cm (New Objectives, Woburn, MA) que se envasó con 10 µm de cuentas C18 (YMC, Wilmington, NC) . El gradiente CLAR se incrementó linealmente de 4 a 60% del solvente B (solvente A, 0.1M de ácido acético/ACN al 1%; solvente B, 0.1 M de ácido acético/ACN al 90%) durante 45 minutos con una proporción de flujo a 250 nL/min. El espectro de masa se colectó usando un espectrómetro de masa que atrapa el ion LCQ DECA XP (ThermoFinnigan, San José, CA) . Los datos EM/EM se investigaron contra PKC-T para modificación de fosforilación diferencial en serina, treonina y tirosina, usando el algoritmo Sequest (ThermoFinnigan, San José, CA) . Para ayudar en el análisis del mecanismo del catalizador por PKC-T KD, se hicieron varias mutaciones en el constructo de expresión PKC-T KD usando sitios de mutagénesis dirigida (usando un kit comercialmente disponible de Stratagene, La Jolla, CA) . Las secuencias de estas mutaciones se confirmaron por secuenciamiento. Los constructos se expresaron como se describe anteriormente para la expresión de PKC-T KD de tipo nativo, y cantidades equivalentes de usados de E. coli se analizaron por prueba de blot y ensayos de cinasa después de la estimulación de proteína por ensayo Bradford (comercialmente disponible de BioRad, Hercules, CA) . Brevemente, los usados se analizaron por SDS-PAGE al 4-20%, se transfirieron a nitrocelulosa y prueba de blot con ya sea el anticuerpo PKC-T anti-pT538 comercialmente disponible de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) o el otro anticuerpo anti-HIS comercialmente disponible de Invitrogen (Carisbad, CA) en blotto al 5%/TBS-Tween al 0.05%. Estudios de espectrometría de masas revelaron que la PKC-T KD es fosforilada. Como la expresión PKC-T KD se llevó a cabo en E. coli , en donde no hay cinasas serina-treonina, la espectrometría de masas encontró que es una secuencia de autofosforilación por la cinasa expresada. La masa predicha basada en la secuencia de aminoácido es 41,615 Daltons, sin embargo, la determinación de masa molecular por ESI-EM fue 42,092 Daltons y 42,173 Daltons (50% de cada especie) , la cual es indicativa de autofosforilación de 5 o 6 aminoácidos en E. coli . Las Figs . 3A-3D son diagramas esquemáticos que muestran la caracterización de autofosforilación PKC-T KD. Como la Fig. 3A muestra, el dominio C2 nuevo se localiza en el término amino de la proteína, seguido por dos cofactores que enlazan los dominios Cl, y después el dominio de cinasa carboxi-terminal . Los sitios de fosforilación conservados (es decir, treonina en posición 538, serina en posición 676, serina en posición 685 y serina en posición 695) se indican abajo en el esquemático de la Fig. 3A, mientras los residuos de aminoácido N-terminal y C-terminal de PKC-T KD (en posiciones 362 y 706, respectivamente) se indican abajo en el esquemático. En el análisis de espectrometría . de masas, la proporción m/z de la proporción masa/carga del péptido, y z (la carga) es 1. Así, la proporción m/z da la masa del fragmento del péptido. El análisis de espectro del ion del producto de espectrometría de masa indica que Ser695 es el sitio de fosforilación. Así, la Fig. 3B muestra el espectro del ion del producto del péptido NFpSFMPGMER (posiciones de expansión 693-703) a m/z 705.52, lo cual confirma que Ser695 es el sitio de fosforilación. La fig. 3C muestra el espectro de ion del producto del péptido ALINpSMDQNMFR (posiciones de expansión 681-692) a m/z 760.48, e indica que SerS85 es el sitio de fosforilación. La Fig. 3D muestra el espectro del ion del producto del péptido TNTFCGTPDYIAPEILLGQK (posiciones de expansión 536-555) a m/z 1159.71. El espectro de ion del producto de la Fig. 3D indica un fosfato en este péptido, y también indica que el sitio de fosforilación es ya sea Thr536 o Thr538. Nótese que el residuo de cisteína en posición 540 (indicado por # en la Fig. 3D) es alquilado por yodoacetamida . Así, la porción Ser695 hidrofóbica y los cambios de porción Ser685 se identificaron como sitios de autofosforilación (véase Figs . 3B y 3C, respectivamente). La espectrometría de masa no detecta alguna fosforilación en residuos de la porción de cambio Ser6S2 y Ser557. Basados en homología con otras porciones de curva PKC, SerS7S es similar para ser autofosforilada, pero no es evidente en estos estudios, al igual que no se detectó Ser676 en un péptido tríptico. Estos estudios además revelan que ya sea Thr536 o Thr538 en el bucle de activación es también autofosforilada (véase Fig. 3D) . La determinación de la estructura de rayos X de la PKC-T KD bacterialmente expresada, confirma que el residuo Thr538 es fosforilado (Xu et al . , J. Biol . Chem. 279(48): 50401-50409(2004)). Este resultado es sorprendente, dado que es contrario a las propuestas previas de que el bucle de activación es fosforilado por PDK-1 (Balendran et al . , FEBS Lett . 484:217-223 (2000); LeGood et al . , Science 281:2042-2045 (1998)). De hecho, estudios previos de la PKC-T mutante K409W de longitud completa de eliminación de cinasa, han mostrado que esta molécula no es fosforilada a Thr538 (Liu et al., Biochem J. 361: 255-265 (2002)). Usando el sistema de expresión heteróloga de la célula HEK293 como se describe en el Ejemplo 2 anterior; la carencia de fosforilación de Thr538 del mutante PKC-T K409W en las células, también se observó (datos" no mostrados) . Este descubrimiento implica carencia de fosforilación de Thr538 debido a la incapacidad mutante de cinasa K409W para autofosforilarse. Además, la fosforilación de Thr538 suprime la molécula PKC-T K409W que correlaciona ambas con la carencia de actividad de cinasa de usado celular in vivo, y fosforilación de IKKa/ß endógena (datos no mostrados) . Debido a que ha sido previamente sugerido que el bucle de activación PKC-T es fosforilado por PDK-1 (Balendran et al . , FEBS Lett, 484: 217-223 (2000); LeGood et al . , Science 281: 2042-2045 (1998)), es sorprendente que los resultados de análisis de espectrometría de masa que indican que ya sea Thrs36 o Thr538 de la PKC-T KD bacterialmente expresada es autofosforilada (véase Figs . 3B-3D) . Esto es en parte explicado por la estructura de rayos X, que revela la Thr538 fosforilada en interacciones de enlace de hidrógeno con la cadena lateral del Thr53e precedente (Xu et al., J. Biol. Chem. 279(48); 50401-50409 (2004)). Esta interacción probablemente además estabiliza las interacciones dentro del bucle de activación y con la aC-hélice, ambas de los cuales tienen relevancia en catálisis (Johnson et al., Cell 85: 149-158 (1996) ) . Estudios previos han sugerido una confirmación competente catalítica para PKC-T en donde el bucle de activación es constitutivamente fosforilado (Newton, A. C, Biochemical Journal. 370: 361-371 (2003)). La PDK-1 fosforila a PKC y otras cinasas de la familia AGC en el bucle de activación del dominio de cinasa, como una modificación requerida que procede la autofosforilación originada en sitios conservados en porciones de cambio (Newton, A. C, Biochemical Journal . 370: 361-371 (2003); Balendran et al . , FEBS Lett, 484: 217-223 (2000)). Los resultados presentados en este documento revelan que contrario a la hipótesis que prevalece, la PKC-T es solamente capaz de autofosforilarse. Los descubrimientos encontrados en este documento en la caracterización de la PKC-T KD, presentan evidencias para soportar que además del hidrofóbico y porciones de cambio dentro del dominio de cinasa, el bucle de activación es también fosforilado (véase Figs . 3B-3D) . Estos estudios no son ninguna regla fura de la posibilidad de que en las células PDK-1 se pueden fosforilar el bucle de activación del bucle de activación PKC-T. Sin embargo, contrario a PKC-T expresado bacterialmente (Smith et al . , J. Biol . Chem. 277: 45866-45873 (2002)), los descubrimientos presentados en este Ejemplo muestran que la PKC-T KD es capaz de autofosforilarse en el bucle de activación PKC-T, y por lo tanto, no es un requerimiento obligatorio la fosforilación de PDK-1. Los datos de espectrometría de masa muestran que la PKC-TKD bacterialmente expresada es autofosforílada en residuos de aminoácido 5 ó 6. Los sitios de fosforilación identificados en estos experimentos incluyen porciones hidrofóbicas Ser695, porción de cambio Ser685, y el bucle de activación Thr538 o ThrS3e . La porción de cambio Ser676 no se detectó en un péptido tríptico, aunque es probablemente también fosforilada basado en homología de secuencia. La Ser685 es un sitio de autofosforilación nuevamente identificado en la porción de cambio. Finalmente, además a los sitios de fosforilación identificados anteriormente, al menos 2 residuos de aminoácido adicionales se autofosforilan pero no se detectan por estas técnicas . El residuo Thr538 de aminoácido en el bucle de activación es requerido para actividad de cinasa (Liu et al . , Biochem. J. 361: 255-265 (2002)). Por lo tanto, varias mutaciones del punto del sitio de fosforilación dentro del dominio de cinasa se examinaron por sus efectos en la fosforilación de Thr538 del bucle de activación. Para realizar esto, se sometieron a ensayo usados de E. coli de la proteína PKC-T KD y varias mutaciones por análisis de Western blotting usando un anticuerpo PKC-T anti-pT538. Como se muestra en la Fig. 4A, solamente la proteína PKC-T KD de tipo nativo y tres fragmentos mutantes probados se fosforilaron en la tirosina en posición 538. Igualmente se determinó el cargado de las líneas retirando la mancha y probando nuevamente con teñido con un anticuerpo anti-His (véase Fig. 4B) . Las fracciones de estos usados de E. coli también se sometieron a ensayos de cinasa de usado. Los ensayos de cinasa se realizaron con una concentración final de 83 µM de sustrato de péptido biotinilado (FARKGSLFQ) , 166 µM de ATP, 0.5 µl de P33 ATP (actividad específica 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) , 84 ng/µl fosfatidilserina, 8.4 ng/µl de diaciglicerol en 20 mM de MOPS pH 7.2, 25 nM • de ß-glicerofosfato, 1 mM de DTT, 1 mM de CaCl2, en 30 µl por 30 minutos a temperatura ambiente. Cinco a diez µl de la reacción se salpicaron en un papel de fosfocelulosa, el cual después se lavó tres veces en ácido fosfórico al 0.75% y una vez en acetona. El cóctel de escintilación se agregó al papel de fosfocelulosa y se detectó en enlace de radioactividad con un contador de escintilación. Como la Fig. 4C muestra, de varios mutantes PKC-T KD probados, solamente la proteína PKC-? KD de tipo nativo y tres fragmentos mutantes fosforilados en treonina 538, mostraron actividad en un ensayo de actividad de cinasa de usado in vi tro. De hecho, la actividad de cinasa de lisado se correlaciona con la magnitud de treonina 538 fosforilada (pThr538) detectada en el lisado para cada mutante expresado (comparando Figs . 4A y 4C.) La serina en posición 695 (Sere95) en la porción hidrofóbica C-terminal de PKC-T KD, también se requiere para autofosforilación del bucle de activación óptimo, . como es evidente por la señal significantemente reducida en el panel de Western blotting anti-pT538 (véase el mutante S695A (es decir, serina en la posición 695 mutada a alanina) en la Fig. 4A) . Así, la serina en posición 695 es obligatoria para la actividad de cinasa PKC-T KD, como se demostró por la carencia de actividad de cinasa del mutante S695A (véase mutante S695A en la Fig. 4C) , tanto como las mutación T539A y K409W de eliminación de cinasa e inactivas, respectivamente (véase Figs . 4A y 4C) . Por el contrario, los residuos Ser662 de porciones de cambio son indispensables tanto para actividad como autofosforilación de THr538 (véase el mutante S662A en la Fig. 4A) , mientras los residuos SErS76 y Ser68? de la porción de cambio tienen un impacto parcial (véase mutantes S676A y S685A en la Fig. 4A) . Así, el análisis de mutación demuestra que tanto Ser676 como Ser685 en la porción de cambio conservada, impactan parcialmente la función de cinasa de la PKC-T KD (véase Figs. 4A y 4C) . Se ha reportado previamente que la mutación S676A en la cinasa de longitud completa no afecta la actividad de cinasa, mientras la mutación S695A en la molécula de longitud completa reduce la actividad de cinasa por 80% (Liu et al . , Biochem . J. 361 : 255-265 (2002)). La actividad residual de la S695A reportada en la PKC-T de longitud completa, es consistente con una señal fosfo-Thr538 modesta en el contexto del dominio de cinasa (véase Fig. 4C, el mutante S695A) . Esto sugiere que la mutación Ser695 resulta en pérdida de autofosforilación Thr538 óptima, de forma consecuente resulta en la disminución de actividad de cinasa. Esta característica es también única para PKC-T entre otras isoformas PKC. En el caso de PKC-T, es probablemente que la autofosforilación de Ser695 y ThrB38 son un poco interdependientes . Una molécula PKC fosforilada en el bucle de activación, se describe como una "conformación competente catalítica" que existe antes del cofactor de enlace, autofosforilación y etapas de catálisis del sustrato (Newton, A.C., Biochemical Journal . 370: 361-371 (2003)). Para función de cinasa PKC-T KD óptima es probable que la autofosforilación de tanto el bucle de activación como porción hidrofóbica contribuya a la "conformación competente catalítica" de PKC-T. Habiendo establecido la relación del sitio de fosforilación de la PKC-T KD activa expresada, se emprendieron estudios adicionales del mecanismo de la enzima detallada para examinar la reducción catalítica de cinasa. Los sustratos de péptido investigados para uso en la determinación del mecanismo de cinética de PKC-T se muestran en la Tabla I .

Tabla I : Péptidos usados en ensayos con PKC-T KD Péptido Secuencia fuente pl 1 FARKGSLRQ Sustrato PKC alfa pseudo- 12.01 sustrato 2 RFARKGSLRQKNV Sustrato PKC alfa pseudo- 12.31 sustrato 3 LKRSLSEM Sustrato Factor de 8.75 Respuesta de Suero RTPKLARQASIELPSM Sustrato Proteína 1 10.84 linfocito específico FARKGALRQ inhibidor PKC alfa pseudo- 12.01 sustrato El péptido 1 y péptido 2 son sustratos derivados de la región pseudosustrato de PKC-a. El péptido 3 y péptido 4 se derivan del sitio de fosforilación en el factor de respuesta del suero (Heidenreich et al . , J. Biol . Chem . 274: 14434-14443 (1999)) y el sitio de fosforilación en la proteína 1 de linfocito específico, respectivamente (Huang et al . , J. Biol . Chem . 272: 17-19 (1997)). Para ensayo cinético de la enzima, ATP, ATP?S, Ficoll-400, sacarosa, ATP, ADT, fosfoenolpiruvato (PEP) , NADH, cinasa de piruvato (PK) , deshidrogenasa de lactato (LDH) , AMP-PNP, acetonitrilo y amortiguador HEPES, fueron adquiridos de Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO) . Los sustratos de péptido, inhibidores y péptidos de sustrato fosforilado se adquirieron de AnaSpec (san José, CA) , SynPep (Dublin, CA) u Open Biosyste a (Huntsville, AL) . La actividad enzimática s,e determinó a 25 °C usando en ensayo PK/LDH acoplado, seguido espectrométricamente a 340 nm en un lector de placas de Molecular Devices. La reacción estándar, excepto en donde se indica, se llevó a cabo en 25 mM de HEPES, pH 7.5, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, TritonXlOO al 0.008%, 100 mM de NaCl, 20 unidades PK, 30 unidades LDH, 0.25 mM de NADH, y 3 mM de PEP, en un volumen final de 0.080 ml . La concentración de PKC-T KD viaria entre 0.156 µg/ml a 0.312 µg/ml . Después, se realizaron estudios de viscosidad del solvente. Se determinaron los parámetros cinéticos del estado estable en el amortiguador descrito anteriormente para los ensayos de cinética de enzima que contienen fuentes variadas (0-35%) o Ficoll 400 (0-8%) . Se determinaron viscosidades del solvente relativo (?rel) por triplicado relativo a 25 mM de HEPES, pH 7.5, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT y 100 mM de NaCl a 25 °C usando un viscométro Ostwald. El amortiguador n viscógeno está indicado con un exponente de 0. El sistema de enzima de acoplamiento no se afectó por la presencia de estos viscógenos. Se analizaron estudios de efecto de tio con ATP?S y estudios de inhibición del producto con ADP, en series CLAR 1100 de Hewlett Packard usando una columna Phenomenes Auga 5 cm C18 124 A° 50 mm X 4.60 mM (00B-4299-E0) . El péptido fosforilado se separó del péptido no fosforilado usando un gradiente de 20 mM de fosfato, pH 8.8/acetonitrilo al 0% hasta 100% (50/50) . Se detectó el péptido etiquetado por fluoresceína por excitación a 485 nm y se monitoreó la emisión de fluorescencia a 530 nm. Se determinaron adicionalmente la cinética del sustrato. Para realizar esto, los datos se fijaron a la ecuación 1 para cinética Michaelis-Manten normal o ecuación 2 para inhibición del sustrato: en donde S es el sustrato, Vmax es la velocidad de enzima máxima, Km es la constante Michaelis y ¡. es la constante de inhibición para la inhibición del sustrato (Adams, J.A., Biochemistry 42: 601-607 )2003)). Las proporciones iniciales obtenidas a varias concentraciones fijas y ATP y se fijaron a la ecuación listada abajo: En las ecuaciones anteriores, [A] y [B] son las concentraciones de ATP y péptido, respectivamente; Ka y K son la Km para ATP y péptido, respectivamente; y Kia es la constante de disociación de A, a partir del complejo EA. Las proporciones de la reacción inicial se obtienen ya sea como una función de la inhibición del producto (ADP o fosfopéptido) o como una función de inhibición final de muerte (AMP-PNP) . En estos estudios, un sustrato se mantiene constante mientras el otro es variado contra las concentraciones incrementadas del inhibidor. En el caso de la inhibición del producto, el sustrato no variado se mantiene en niveles de saturación o no saturación mientras en la inhibición de línea final, el sustrato no variado es mantenido a niveles de saturación. Los datos se fijaron en un modelo de inhibición competitivo (ecuación 5) , un modelo de inhibición con competitivo (ecuación 6) , o un modelo de inhibición sin competir (ecuación 7) : v = ^ [S] O) +<?+3 en donde KÜ y K?s son las constantes de inhibición de intercepción y traslape. Los datos se analizaron usando el Modulo Cinético de la Enzima Sigma Plot 2000 de SPSS Science (Richmond, CA) . La Tabla II proporciona un sumario de los parámetros de cinética de estado listo para los péptidos 1-4, ATP, y ATP en la ausencia del péptido.

Tabla II . Sumario de los Parámetros de Cinética de Estado Listo Variedad de appKm %cat K± péptido Kcat Km sustrato3 (µM) (seg--i) (µm) (M_1S_1) Péptidol 6.5 + 0.8 18 + 1 > 2000 2 700 000 Péptido2 4.3 + 0.8 16 + 1 306 + 57 3 600 000 Péptido3 420 + 21 21 + 1 51 000 Péptido4 240 + 16 14 + 1 58 000 ATPb 49 + 5 18 + 1 360 000 ATPC 59 + 8 0.16 + 0. 01 2 600 aPéptidol y péptido2 se fijan a la ecuación (2) ; péptido3, péptido4 y ATP se fijan a la ecuación (1) Péptidol está presente en este ensayo cno hay péptidos presentes en este ensayo Como se muestra en la tabla II, en la ausencia del sustrato de péptido, PKC-T KD se hidroliza ATO 110 veces más lentas (0.16 seg-1) que cuando el péptido está presente (18 sec"1) . La Km para ATP de 59 µM (sin péptido) y 49 µM (en péptido 1 de partida) muestran que no hay diferencias significantes en el enlace de ATP en la presencia del sustrato del péptido. Los parámetros de cinética de estado listo para PKC-T a saturación de ATP se listan en la Tabla II. El péptido 3 y péptido 4 muestran la Km más alta para PKC-T, con valores de 420 µM y 240 µM, respectivamente. En contraste, el péptido 1 y péptido 2 tienen valores Km de 6.5 µl y 4.3 µM, respectivamente, y causan inhibición de la enzima a concentraciones altas (Tabla II) . Los valores más bajos de los péptidos más básicos 1 y 2, implican una preferencia de péptido del sustrato de aminoácido para PKC-T. De forma interesante, la inhibición del sustrato observado con el péptido 2 básico más grande, es más pronunciada que para el péptido 2 más corto (Tabla II) . Por lo tanto, los parámetros de cinética para PKC-T (péptido 1 y ATP) , fueron examinados a concentraciones incrementadas de NaCl. Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla III . Tabla III . Efectos de NaCl en Parámetros de Cinética de Estado Listo de PKC-T KD [NaCl] appKmAtpa'b kcatb C?pKm peptidol 0 Ki peptidol c mM (µM) (seg-1) (µM) (µM) 0 25 ± 5 7.5 + 0.8 6.4 + 4.2 129 ± 64 50 58 ± 8 18 ± 1 6.7 + 2.8 201 ± 85 100 76 ± 7 22 ± 1 3.2 + 1.0 > 2000 250 121 ± 16 24 ± 1 9.0 + 1.2 - a a 0.2 mM peptidol b ajustado a la ecuación (1) c ajustado a la ecuación (2) Como se muestra en la Tabla III, como la concentración de NaCl se incrementa, tanto la Km para ATP como el cambio de la enzima incrementan, mientras la Km para el péptido 1 permanece relativamente constante. Los efectos de fuerza iónica en PKC-T también fueron investigados, examinando el efecto de NaCl en la inhibición del sustrato que ocurre cuando el sustrato se combina con la enzima en un complejo no productivo o de línea final. La inhibición del sustrato se observó para los péptidos 1 y 2 básicos preferidos, pero no se observó para los péptidos 3 y 4 menos óptimos (véase Tabla II) . Además, la inhibición del sustrato también se encontró por ser dependiente de la fuerza iónica del amortiguador. La inhibición del sustrato con el péptido 1, disminuye conforme la concentración de NaCl se incrementa a 250 mM (véase Tabla III) . Así, la Tabla III muestra que incrementos en la concentración de NaCl en el amortiguador, incrementan la PKC-T KD Kn para ATP y el cambio de enzima. También se observó una fuerza iónica en la inhibición del sustrato peptídico 1. Como la concentración de NaCl se incrementa, la inhibición del sustrato observada con el péptido 1 se disminuye (véase Tabla III) . La naturaleza de la sal (NaCl) y su efecto en la formación del par iónico, puede dar discernimiento a estas observaciones. De conformidad con las series Hofmeister de cationes y aniones, el NaCl falla en el punto medio de cosmotropos y caotropos (Cacace et al . , Quarterly Reviews of Biophysics 30: 241-277, 1997). Por lo tanto, el NaCl no debe salar la enzima ni desnaturalizar la enzima. Sin embargo, incrementos en la fuerza iónica del amortiguador, podrían tener un efecto en la formación de pares iónicos (Park C. R. R. , J. Am. Chem. Soc. 123: 11472-11479 (2001) ) . Con la Csk de tirosina cinasa, la adición de 50 mM de NaCl, tiene el efecto de incrementar la Km para el sustrato poli (Gly, Tyr) un sustrato negativamente cargado; sin embargo, no hubo efecto en la K^ para la ATP en el cambio de la enzima (Colé et al . , J. Biol . Chem. 269: 30880-30887, 1994). En el caso de la PKC-T KD, el incremento en Km por ATP, puede resultar de dos posibilidades: 1) a 250 mM de NaCl, existe más enlace productivo del péptido 1 en el complejo de enzima-ATP binario, y el Km observado es una reflexión del Km actual por ATP; o 2) el incremento en la fuerza iónica afecta el ATP, un sustrato cargado en la misma manera como el péptido 1. Es posible que el incremento observado en Km es un resultado de una combinación de las dos posibilidades anteriores. Con la formación de par iónico, del sustrato de péptido 1 (interacciones Colúmbicas) , puede ser importante el enlace de este sustrato a la enzima. A pH 7.5, un péptido básico tal como el péptido 1, podría tener una carga positiva pura. Por lo tanto, incrementar la concentración de NaCl, podría resultar en un ambiente menos favorable para la formación de par iónico (Park C, R. R. , J. Am. Chem. Soc. 123: 11472-11479 (2001)). Si la formación de par iónico contribuye a la inhibición del péptido 1, entonces disminuir la inhibición del sustrato con incrementos de NaCl, es consistente con el - debilitamiento de las interacciones Colúmbicas . Determinando el mecanismo cinético de PKC-T, la velocidad inicial de la reacción con ATP variado se determinó contra las concentraciones variadas fijas del sustrato peptídico a 100 mM de NaCl. El ensayo se hizo primer con el péptido 1, sin embargo, el gráfico de Lineweaver-Burk resultante, fue difícil interpretar debido a la inhibición del sustrato de péptido 1 (datos no mostrados) . Después, los relineamientos de separación e intercepción de gráficos de Lineweaver-Burk (no mostrados) , fueron realizados contra el péptido 1. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, los relineamientos de separación e intercepción, respectivamente, contra el péptido 1 a 100 mM de NaCl, no fueron lineales. Los ensayos de velocidad inicial también se realizaron usando el péptido 3 bajo condiciones idénticas. Las' concentraciones de ATP variadas contra las concentraciones del péptido 3 variadas fijas, resultaron en un patrón de intersección en un gráfico de Lineaweaver-Burk (datos no mostrados) , que indican un mecanismo de cinética secuencial. El valor K¡.a para ATP fue de 61 + 22 µM y el Ka para ATP fue de 118 + 17 µM. El patrón de velocidad inicial con el péptido 1 fue entonces determinado a 625 mM de NaClj igual que la concentración de sal incrementada que disminuye la inhibición del sustrato por el péptido 1 (véase Tabla III) . Los gráficos de Lineaweaver-Burk producen un patrón de intersección también (datos no mostrados) , consistentes con un mecanismo cinético secuencial cuando el péptido 1 es el sustrato. A concentraciones elevadas de NaCl, -los relineamientos de intercepción y separación del gráfico de Lineaweaver-Burk (no mostrado) contra el péptido 1, fueron lineales (véase Figuras 5C y 5D) . El valor Kia para ATP de 66 + 32 µM obtenido a NaCl elevado, se encontró por ser similar al valor K¡.a para ATP de 61 + 22 µM con el péptido 3 a 100 mM de NaCl. Esto indica que la fuerza iónica incrementada, no afecta la constante de disociación de ATP a partir del complejo de enzima-ATP. El Ka de ATP obtenido a 625 mM de NaCl, fue 321 + 19 µM, contrario al Ka de ATP a 100 mM de NaCl de 118 + 17 µM. Esto es consistente con un incremento en Km por ATP conforme la fuerza iónica se incrementa (véase Tabla III) . Los estudios de definición de término final identifican ATP como el primer sustrato para enlazarse a PKC-T KD. Por consiguiente, el sustrato enlazado en orden del mecanismo catalítico secuencial, fue después determinado. El AMP-PNP, un análogo de ATP no hidrolizable, y el péptido 5 con una serina a alanina, cambiado a partir del péptido 1 (véase Tabla 1) , fueron usados para estudios de inhibición. Los resultados de los estudios de inhibición se muestran en la Tabla IV.

Tabla IV: Patrones de Inhibición y Constantes8 inhibidor Tipo Sustrato patrónb K-is ?tt Ecuación0 µM µM ADP producto ATP C 291 + 5 24 ADP Producto Péptidol - ADP Producto Péptidold nc 494 ± 200 + 6 72 29 Fosfopéptido 1 Producto ATPe uc 1600 + 7 100 Fosfopéptido 1 Producto Péptido3f nqc 1700 + 1200 + 6 1100 800 Fosfopéptido 1 Producto Péptido3d'f uc 2000 + 7 400 AMP-PNP Término ATP c 228 + 5 -final 29 AMP-PNP Término Péptidol - . - -final Péptido5 Término Péptidol c 10 ± 3 5 -final Péptido5 Término ATP uc 1100 + 7 -final 100 Péptido5 Término Péptido3 c 4.4 + 5 -final 0.3 Concentración de NaCl mantenida a 100 mM bc, competitivo; nc sin competitivo; uc no competitivo; - sin inhibición observada cdatos ajustados al número de ecuación dATP mantenido a 0.1 mM epéptido3 mantenido a 0.5 MM, péptido3 usado debido al bajo Km del péptidol fpéptido3 usado debido a la inhibición de sustrato observada con el péptidol. Como se muestra en la Tabla IV, se encontró el AMP-PNP por ser un inhibidor competitivo de ATP con un valor Ki de 228 µM. No se observó inhibición con AMP-PNP contra el péptido a ATP de saturación. El péptido inhibidor, el péptido 5, se mostró por ser un inhibidor competitivo al péptido 1 así como también al péptido 3 con valores K¡.s de 10 µM y 4.4 µM, respectivamente (Tabla IV) . El péptido 5 se encontró además, por ser un inhibidor no competitivo contra el ATP con valores KÜ de 1100 µM (véase Tabla IV) . Estos resultados son consistentes con una adición secuencial ordenada de sustratos para PKC-T en donde ATP se asocia primero con la enzima seguida por el péptido. Debido a que el ensayo se cinasa acoplada PK/LDH consume el producto catalítico ADP, se usó un ensayo de CLAR para determinar los patrones de inhibición con ADP (véase Tabla IV) . Se encontró el ADP por ser un inhibidor competitivo contra el ATP a péptido 1 de saturación con un Kj.s de 291 µM. No se observó inhibición cuando el ADP se sometió a ensayo contra el péptido 1, a ATP de saturación. Cuando se realizó el ensayo a ATP sin saturación (0.1 M), se observó un patrón no competitivo con un K?s de 494 µM y un KÜ de 200 µM (véase Tabla IV) . Estos resultados con ADP eliminan un mecanismo aleatorio, como se representa esquemáticamente en la Figura 6C, pero son consistentes con ya sea un mecanismo cinético de orden secuencial (representado esquemáticamente como Figura 6A) o por Theorell-Chance (representado esquemáticamente como Figura 6B) , en donde el ADP es el producto final liberado. Para estimular además el mecanismo cinético, se realizaron los ensayos con fosfopéptido 1. Debido a al inhibición del sustrato observada con el péptido 1, se hicieron los ensayos de inhibición de producto con el péptido 3. El fosfopéptido 1 fue un inhibidor no competitivo del péptido 3 con un Kis de 1700 µM, y un KÜ de 1200 µM, a una concentración de ATP de saturación (Tabla IV) . En ATP sin saturación, se observó un patrón no competitivo, con un Ku de 2000 µM. El fosfopéptido 1 fue un inhibidor no competitivo contra ATP, un péptido 3 sin saturación (0.5 mM) , con un KÜ de 1600 µM. Los resultados anteriores son más consistentes con un mecanismo Bi-Bi de orden secuencial, con ADP como el producto final liberado (véase Figura 6A) . La proporción de la etapa de fosfo-transferencia en el catalizador, se investigó usando el análogo tio de ATP, ATP?S, y los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla V.

Tabla V: Efecto Tio después de PKC-T KD Parámetro [NaCl] mM ATP a ATP?S a Proporción cinético ATP/ATP?S appKm (µM) 100 251 + 24 120 ± 9 2.1 appKm (µM) 250 234 ± 19 130 ± 5 1.8 . , b proporción 100 179 ± 5 1.6 ± 0.1 112 proporci .ó,n b 250 190 ± 4 1.3 ± 0.1 146 Como se muestra en la tabla V, la sustitución de ATP?S para ATP, resulta en un cambio grande en el Kcat de la reacción. La reacción de ATP?S comparado con la reacción con ATP, es 112 veces y 146 veces más lenta en 100 mM de NaCl y 250 mM de NaCl, respectivamente. Sin embargo, la Km para ATP y APT?S obtenida usando CLAR, solamente difiere dos veces (Tabla V) . Para determinar si la etapa química es el único contribuyente a la velocidad de la reacción, se determinó el efecto de viscosidad del solvente en los parámetros de cinética de estado listo para PKC-T. Dos tipos de viscogenes fueron empleados en este estudio, la sacarosa de microviscogen y el Ficoll-400 de macrobviscogen. Los microviscogenes, afectan directamente la difusión de moléculas pequeñas las cuales, al mismo tiempo causan el efecto de viscosidad observado con un viscómetro (Blacklow et al . , Biochemistry 27: 1158-1167 (1988)). Los macroviscogenes causan efectos de viscosidad vistos con un viscómetro, pero no afectan significantemente la velocidad de difusión de las moléculas pequeñas, con ello, sirve como un control para el efecto de microviscosidad observado en el ensayo (Colé et al . , J. Biol . Chem . 269: 30880-30887 (1994). Los parámetros de cinética de estado listo del péptido 1, péptido 3 y ATP, fueron determinados incrementando la viscosidad del solvente y a dos diferentes fuerzas iónicas. El efecto relativo de la viscosidad del solvente en los ' parámetros cinéticos kca /Km, fueron trazados contra la viscosidad relativa del amortiguador y ajustados a una regresión lineal. Las Figuras 7A-7D, muestran los efectos de viscosidad del solvente en kcat y "kcat/Km para PKC-T KD. La Figura 7A muestra el efecto de kca con péptido 1 variado con ATP mantenido a 2.0 mM. La Figura 7B muestra kcat/Km para ATP a 0.125 mM de péptido 1. La Figura 7C muestra el efecto de kcat con el péptido 3 variado con ATP mantenido a 2.0 mM. La Figura 7D muestra el kcat/Km para el péptido 3 a 2.0 mM de ATP. Para las figuras 7A-7D, el símbolo de círculo abierto (0) indica 100 mM de NaCl en sacarosa incrementada; el símbolo de triángulo invertido abierto (V) indica 250 mM de NaCl en sacarosa incrementada; el símbolo de círculo cerrado (•) indica 100 mM de NaCl en Ficoll 400 incrementado; y el símbolo de triángulo invertido cerrado (T) indica 250 mM de NaCl en Ficoll 400 incrementado. Las líneas punteadas en las Figuras 7A-7D, indican una separación de 1. Una separación de 1 indica el efecto máximo del microviscogen en el parámetro cinético. Hubo poco efecto en la proporción enzimática en la presencia de macroviscogen. Como la microviscosidad del solvente se incrementa, hubo un efecto moderado visto en el valor de (kcat) ? . Esto se observó como un decremento lineal en la proporción observada de la enzima con los tres sustratos estudiados a 100 mM de NaCl y 250 mM de NaCl. La separación [(-fccat)? 1 obtenida bajo todas las condiciones, variaron desde 0.38 hasta 0.54, implicando que el producto liberado es parcialmente limitante de la proporción (Figuras 7A y 7C) . Un valor de 0.8 a 1, indica que el producto liberado es el etapa limitante de la proporción catalítica (Adams, J. A. , Biochemistry 42: 601-607 (2003)). La adherencia de un sustrato se puede determinar por análisis de viscosidad. Brevemente, para un sustrato pegajoso, la velocidad de formación de producto es más rápida que la velocidad de disociación del sustrato, mientras un sustrato no pegajoso se disociará de la enzima más rápido que la velocidad de formación del producto (Cleland, W. W. (1986) Investigations of Rates and Mechanisms of Reactions, Vol. 6, Wiley-Interscience Publications, John Wiley & Sons, New York, NY) . El efecto relativo de la microviscosidad de solvente incrementada en kcat/Km, es trazado contra la viscosidad relativa del solvente (Figuras 7B y 7D) . Cuando el efecto de la microviscosidad se trazó contra la viscosidad relativa del solvente para el péptido 1, la separación tuvo un valor (kcat/Km)? de 0.86 en 250 mM de NaCl (datos no mostrados) . Los datos no se obtuvieron a 100 mM de NaCl para el péptido 1, debido a la inhibición del sustrato observada a baja intensidad iónica. El péptido 3 por otro lado, no mostró efecto de viscosidad solvente en cualquier fuerza iónica (Figura 7D) . Estos estudios implican que el péptido 1 es un sustrato pegajoso, mientras el péptido 3 no es pegajoso. Se han reportado mecanismos de cinética para varias cinasas (véase, por ejemplo, Wu et al . , Biochemistry 41: 1129 - 1139 (2003); Trauger et al . , Biochemistry 41: 8948 - 8953 (2003); Chen et al . , Biochemistry 39: 2079 - 2087 (2000)). Los trazos de velocidad inicial de PKC-T KD, con ambos sustratos peptídicos a fuerza iónica alta y baja, resultan en gráficas con líneas que se intersectan a la izquierda y por debajo de la ordenada. El patrón es una indicación clara de un mecanismo secuencial que permanece inafectado por la fuerza iónica del amortiguador. Además, no hubo diferencia en los valores K¡.a de ATP, 61 µM para el péptido 3 a 100 mM de NaCl y 66 µM para el péptido 1 a 625 mM de NaCl, indicando además, que la disociación de ATP a partir del complejo de enzima-ATP no fue afectado por la fuerza iónica. Bajo ambas condiciones, el valor K¡.a se encontró por ser menor que el valor de Ka de 118 µM y 321 µM, respectivamente, eliminando un mecanismo de rápido equilibrio. Estudios de inhibición de término final e inhibición de producto (véase Tabla IV) , son consistentes con un mecanismo de orden secuencial, en donde el ATP es el primer sustrato a enlazarse . El inhibidor peptídico (péptido 5 en la Tabla 1) , es competitivo contra ambos sustratos peptídicos y no competitivo contra ATP. Mientras el análogo de ATP AMP-PNP se encontró por ser competitivo contra ATP, no hubo inhibición observada contra el péptido 1 hasta 2.0 MM de AMP-PNP a ATP de saturación. Se observó un patrón competitivo cuando el ATP es variado contra el ADP y no hubo inhibición observada cunado el péptido 1 es variado contra el ADP a ATP de saturación. Se observó un patrón no competitivo cuando el péptido 1 es variado contra el ATP a ATP sin saturación. Estos estudios de inhibición eliminan un mecanismo aleatorio para PKC-T y demuestran que el ADP es el producto último liberado como se muestra en la Figura 6A. Los experimentos de velocidad inicial a 100 mM de NaCl con el péptido 1, dan algún discernimiento en el tipo de inhibición de sustrato observada. Brevemente, hubo tres tipo de inhibición de sustrato observados en un sistema direactivo ordenado (Segel, I. H. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Whiely-Interscience, 1975), mostrado en la Figura 8. Dos son inhibiciones de sustrato en las cuales, el sustrato B forma un complejo EB de término final o el sustrato A forma un complejo de término final EAA. El tercero es una inhibición de sustrato en la cual, B forma un complejo de término final EWQ. La formación del complejo de término final EAA, es eliminada, debido a que el primer sustrato para asociar es ATP y no se observa inhibición del sustrato con ATP. Las Figuras 5A-5D muestran los relineamientos de los datos de velocidad inicial a 100 mM de NaCl y 625 mM de NaCl para el péptido 1. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, el efecto de inhibición es visto en tanto los relineamientos de intersección como separación a 100 mM de NaCl (es decir, los relineamientos no son lineales) . Sin embargo, a 625 mM de NaCl (como se muestra en las Figuras 5C y 5D) , los relineamientos llegan a ser lineales, indicando que la inhibición es abolida en la fuerza iónica elevada hasta 0.5 mM del péptido 1. El efecto de inhibición de sustrato en los relineamientos de separación e intercepción, es consistente con la inhibición no competitiva del sustrato (Cleland, W. W., Methods Enzymol . 63: 500-513 (1979)). La inhibición no competitiva del sustrato, en un mecanismo de orden secuencial, sugiere la formación de los siguientes tipos de complejos de enzimas no productivas. Dos están representadas en la Figura 8, el complejo EB y EBQ. Una tercera posibilidad podría ser un complejo EAB no productivo. Esta es una posibilidad distinta, debido a que a 0 M de NaCl, la inhibición del sustrato es potente (0.129 mM) y la concentración de ATP es ~80 x Km (0.025 mM a 0 mM de NaCl) . En un mecanismo de orden secuencial en el cual el ATP se enlaza primero, podría haber poca enzima libre presente para formar el complejo de término final EB. Los fosforotioatos son usados para estudiar diferentes tipos de reacciones de fosfotransferencia enzimática. La velocidad de reacción ATP?S, ocurre 15 a 20 veces más lenta que la reacción de ATP en el caso de cinasa Csk (Colé et al., J". Biol . Chem. 269 : 30880-30887 (1994)). De manera similar, en los estudios de mecanismos enzimáticos de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PLC) , la reacción se mostró 105 partes cuando el oxígeno no puenteado se sustituyó con azufre ( (Kravchuk et al . , Biochemistry 40: 5433-5439 (2001)) . Con respecto a cual análogo de ATP se usa, ATP ó ATP?S, el producto ADP es idéntico. De este modo, la velocidad catalítica permanecerá inafectada por la liberación del producto. El efecto tio observado para PKC-T KD, implica una contribución de la química de fosfo-transferencia a la proporción total de la reacción enzimática. Además, el mayor efecto tio observado con PKC-T, se argumenta contra un mecanismo cinético de orden secuencial Theorell-Chance, representado en la Figura 6B ( (McKay et al . , Biochemistry 35: 8680-8685 (1996) ) . Con un mecanismo de cinética de Theorell-Chance, el complejo ternario es de vida corta, por lo tanto, implicando que la etapa química es muy rápida. El efecto de viscosidad de solvente es una herramienta valiosa en la determinación de la etapa limitante de la velocidad en una reacción enzimática. El efecto de viscosidad incrementada de solvente es viso en las etapas no químicas, tales como difusión del producto a partir de la enzima y difusión de los sustratos en el sitio activo de la enzima ( (Blacklow et al . , Biochemistry 27, 1158-1167 (1988)), y no en una etapa unimolecular . tal como la etapa de fosfotransferencia (Adams , J. A., Bi ochemi s try 42: 601-607 (2003)) . Los estudios de efecto de viscosidad del solvente de PKC-T reportados en este documento, indican que liberación de producto es una etapa parcialmente limitante de la velocidad en el catalizador . i Los estudios presentados en este documento, ilustran características de catalizadores de enzima PKC y mecanismos cinéticos, proporcionando con ello, discernimiento en las isoformas PKC y/o la cinasas de la familia AGC que son superiormente similares a PKC. Los resultados presentados son consistentes con un mecanismo de orden secuencial en el cual, el ATP se enlaza primero y libera ADP después . El fosfopéptido liberado y la fosfotransferencia , contribuyen a las etapas limitantes de la velocidad. De manera importante, las características potencialmente únicas para PKC-T, son reveladas en los estudios de fosforilación del dominio de cinasa presente en este documento. Tomados junto con las características estructurales de PKC-T (véase Xu et al . , J. Bi ol . Chem . 279(48) : 50401-50409 (2004)), estos hallazgos tienen implicaciones significantes en el avance del objetivo selectivo de esta cinasa para terapias de enfermedades .

EJEMPLO 4 Identificación de Sustratos de PKC-T Se realizó después, un arreglo de exploración de péptido, para identificar sustratos peptídicos para PKC-T. Para hacer esto, como se describe en el Ejemplo 3, el dominio de cinasa catalítica de PKC-T a partir del residuo 362 hasta el residuo 706, se clonó en el vector de expresión pET-16b. Este vector introduce en estructura, una etiqueta hexa-Histidina C-terminal al clon de expresión. El plásmido se transformó en la cepa de E. coli BL21-DE3 para sobre-expresión. Un cultivo celular de 10 litro, inicialmente se hizo crecer a 37°C hasta un O.D. de 4, después la temperatura se cayó a 25°C, antes de inducir la expresión con 0.1 mM de IPTG. Las células se hicieron crecer por unas 3 horas adicionales antes de colectarlas. Las células se resuspendieron y se sometieron a lisis usando un microfluidizador en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 25 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, imidazol 5 mM, ATP 50 µM e inhibidores de proteasa. El lisado fue aplicado por 1 hora a 4°C por el método de lotes a 20 ml (lecho) de resina Níquel-NTA. La resina fue subsecuentemente vertida como una columna de cromatografía y se lavó extensivamente con el mismo amortiguador con imidazol, disminuyendo a 25 mM. La etapa de elución se realizó" con un amortiguador de 200 mM de imidazol. La proteína fue entonces cargada inmediatamente sobre un intereambiador aniónico HQ y la columna se lavó con Tri 25 mM pH 8.0, NaCl 25 mM, DTT 5 MM, ATP 50 µM, antes de ser resuelta por la .aplicación de gradiente lineal de NaCl hasta 500 mM. Las fracciones seleccionadas de SDS-PAGE, se combinaron y diluyeron dos veces con Tris 25 mM pH 8.0, DTT 5 mM y se cargaron sobre una columna de cromatografía de Heparina. La fracción de proteína que fluye, fue inmediatamente aplicada sobre una columna de hidroxiapatito y se lavó extensivamente con Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, DTT 5 mM. Un gradiente lineal de fosfato de sodio a partir de 0 a 100 mM, eluye la proteína objetivo. La proteína fue entonces clasificada como un monómero en una cromatografía de exclusión de tamaño superdex 200, dializada durante la noche con Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, DTT 5 mM y se concentró. Para síntesis de manchado de péptido, las membranas de celulosa modificadas con polietilenglicol y aminoácidos Fmoc-protegidos, fueron adquiridas de Intavis. La Fmoc-alanina protegida fue adquirida de Chem-Impex (Wood Dale; IL) . Los arreglos fueron definidos en las membranas acoplando un espaciador ß-alanina y los péptidos fueron sintetizados usando química de acoplamiento DIC/HOBt estándar (diisopropildiimida/hidroxibenzotriazol) , como se describe previamente (véase, Molina et al . , Peptide Research 9: 151-155 (1996); and Frank, R., Tetrahedron 48: 9217-9232 (1992)). Los aminoácidos activados fueron manchados usando un robot Abimed ASP 222. Las etapas de lavado y desprotección se hicieron manualmente, y los péptidos de acetilaron N-terminalmente después del ciclo de síntesis final. Después de la síntesis peptídica final y desprotección de cadena lateral, se realizaron ensayos de cinasa. Para estos ensayos, las membranas fueron lavadas en metanol por 10 minutos y amortiguador de ensayo (20 mM de HEPES pH 7.5, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 100 mM de NaCl y 20 µM de ATP) por 10 minutos. Las membranas fueron entonces incubadas con 50 nM de PKC-T (residuos 362-706 de aminoácido del dominio de cinasa), Hi-etiquetadas C-terminal, expresadas en E. coli y purificada) , en amortiguador de ensayo que contiene 0.33 Ci/mMol ?-32P-ATP por 1 hora. Las membranas fueron entonces lavadas 5 veces con 200 mM de fosfato de sodio que contiene 0.1% de Triton-X y 100 µM de ATP frío y 3 veces con metanol. Después, las membranas fueron secadas y formaron imágenes usando un Biorad Fx. Usando estos métodos, se probaron las secuencias peptídicas 384. La fosforilación de estos péptidos se muestra en la Figura 9A. D estas 384 secuencias peptídicas, se muestran las siguientes por ser sustratos para PKC-T. FARKGSLRQKN (SEC ID NO : 6) KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 16) QKRPSQRSKYL (SEC ID NO : 17) KIQASFRGHMA (SEQ ID NO: 18) LSRTLSVAAKK (SEQ ID NO : 19) AKIQASFRGHM (SEQ ID NO : 20) VAKRESRGLKS (SEQ ID NO: 21) KAFRDTFRLLL (SEQ ID NO: 22) PKRPGSVHRTP (SEQ ID NO: 23) ATFKKTFKHLL (SEQ ID NO : 24) SPLRHSFQKQQ (SEQ ID NO : 25) KFRTPSFLKKS (SEQ ID NO: 26) IYRASYYRKGG (SEQ ID NO : 27) KTRRLSAFQQG (SEQ ID NO : 28) RGRSRSAPPNL (SEQ ID NO : 29) MYRRSYVFQT (SEQ ID NO : 30) QAWSKTTPRRI (SEQ ID NO: 31) RGFLRSASLGR (SEQ ID NO: 32) ETKKQSFKQTG (SEQ ID NO : 33) DIKRLTPRFTL (SEQ ID NO : 34) APKRGSILSKP (SEQ ID NO : 35) MYHNSSQKRH (SEQ ID NO : 36) MRRSKSPADSA (SEQ ID NO : 37) TRSKGTLRYMS (SEQ ID NO : 38) LMRRNSVTPLA (SEQ ID NO : 39) ITRKRSGEAAV (SEQ ID NO : 40) EEPVLTLVDEA (SEQ ID NO : 41) SQKRPSQRHGS SEQ ID NO: 42) KPFKLSGLSFK SEC ID NO: 43) AFRRTSLAGGG SEC ID NO: 44) ALGKRTAKYRW SEC ID NO: 45) WRTDSLKGRR SEC ID NO: 46) KRRQISIRGIV SEC ID NO: 47) WPWQVSLRTRF SEC ID NO: 48) GTFRSSIRRLS SEC ID NO: 49) RWGGSLRGAQ SEC ID NO: 50) LRQLRSPRRTQ SEC ID NO: 51) KTRKISQSAQT SEC ID NO: 52) NKRRATLPHPG SEC ID NO: 53) SYTRFSLARQV SEC ID NO: 54) NSRRPSRATWL SEC ID NO: 55) RLRRLTAREAA SEC ID NO: 56) NKRRGSVPILR SEC ID NO: 57) GKRRPSRLVAL S?C ID NO: 58) QKKRVSMILQS SEC ID NO: 59) RLRRLTAREAA SEC ID NO: 60) Algunos de estos péptidos se muestran en la Figura 9B, con la serina fosforilada por PKC-T indicado en tipo de negritas . Estas secuencias peptídicas fosforiladas por PKC-T pueden estar contenidas dentro del (los) sustrato (s) fisiológicos de PKC-T y como tales, pueden ser un método para probar la actividad biológica de inhibidores sometiendo a prueba la inhibición de la fosforilación del sustrato en células o in vivo. Además, el (los) sustrato(s) fisiológico (s) que contienen cualquiera de estos residuos de aminoácido, pueden ser un objetivo terapéutico potencial para inhibición o modulación en el tratamiento del asma en virtud de ser un mecanismo en la trayectoria de señalización de la PKC-T.

EJEMPLO 5 El Bucle de Activación de PKC-T es Induciblemente Fosforilado y Ocurre la Translocación de Membrana de PKC-T Después de la Reticulación del Receptor IgE En BMMC Para observar el efecto de la autofosforilación de PKC-T en el bucle de activación (es decir, en treonina 538) , en respuestas alérgicas y de asma, la autofosforilación de PKC-T en el bucle de activación se determinó siguiendo la reticulación del receptor IgE en BMMC. Para estos estudios, se aislaron BMMC. Para hacer esto, la médula ósea se extrajo de los huesos (fémur y tibia) de ratones C57 B1/6J (comercialmente disponibles de The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) , después fueron colocados en placas a 5xl05 células/ml en Hl FCS al 10% en DMEM + PS/gln y 50 µM de ßME + 20 ng/ml de murina IL-3 recombinante y 50 ng/ml de murina SCF recombinante (comercialmente disponible de R&D Systems, Minneapolis, MN) . Las células se pasaron cada 3-7 días.

Después de 4 semanas, los cultivos fueron de >95% de células mástil (determinada por la expresión del receptor IgE y expresión c-kit) . En este punto, las células fueron cultivadas en el medio anterior con murina L-3 solamente a 50 ng/ml . Las BMMC aisladas fueron tratadas con IgE anti-DNP (Dinitrofenilo) durante la noche en cultivo (aproximadamente 16 horas) . Al siguiente día, se activaron reticulaciones del receptor IgE con la adición de DNP-BSA a los cultivos por 0, 2, 5, 30 y 90 minutos. Después, las BMMC tratadas fueron sometidas a lisis en amortiguador de lisis NP-40 al 1% y los extractos citosólicos (preparados como se describe en el Ejemplo 1) , se corrieron en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los manchados de nitrocelulosa fueron probados primero con anticuerpo específico de PKC-T anti-fosfoT538 (Cell Signaling Technology) , después se retiraron y probaron nuevamente con anti-PKC-T (comercialmente disponible de Santa Cruz) . Como se muestra en la Figura 10A, en el contexto de la función efectora de célula mástil en alergia y asma, se encontró que la PKC-T es rápidamente fosforilada en treonina 538 en la médula ósea derivada de células mástil mucosales después de la reticulación del receptor IgE (Figura 9A) . Se nota que todas las BMMC expresan cantidades aproximadamente equivalentes de PKC-T, con respecto al régimen de tratamiento (véase Figura 10B) . Distinta de la fosforilación sostenida observada en células T (véase Figuras 1A-1C) , la fosforilación en este sitio en células mástil, se encontró por ser rápida y temporal (Figura 10A) . Como se muestra en la Figura 10A, la fosforilación de bucle de activación se encontró ocurrir tan pronto como 2 minutos después de la reticulación del receptor IgE, y regresar a la línea base después de 30 minutos de reticulación. Para determinar si la translocación de membrana de PKC-T ocurre después de la reticulación del receptor IgE en BMMC, las BMMC (aisladas como se describe anteriormente) , fueron tratadas con IgE anti-DNP durante la noche en cultivo y estimuladas con la adición de DNP-BSA por 0 minutos, 2 minutos, 5 minutos o 30 minutos. Las células entonces se sometieron a lisis y se dividieron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. La fracción de membrana, la fracción insoluble en detergente (DI) , y los extractos de células completas (WCE) , fueron resueltos por SDS-PAGE y después transferidos a nitrocelulosa. Los manchados de nitrocelulosa fueron entonces probados primero con anti-PKC-? (Santa Cruz) , después retirados y sometidos a sonda con subunidad anti-FceRI ? por la membrana y fracciones DI, y con anti-actina (Santa Cruz) por WCE para confirmar cantidades equivalentes de expresión del receptor IgE (es decir, la subunidad FceRl?) en la membrana y fracciones DI y confirmar cantidades equivalentes de la proteína celular, actina, en los WCE. Como se muestra en la Figura HA, se puede encontrar PKC-T en la fracción de la membrana de BMMC después de 2 minutos de reticulación del receptor IgE, y es claramente evidente después de 30 minutos de reticulación. Similarmente, como se muestra en la Figura 11B, aunque la PKC-T puede ser observada a niveles bajos en la fracción DI en BMMC no estimuladas (es decir, 0 minutos en la Figura 11B) , la cantidad de proteína presente se incrementa después de la reticulación del receptor IgE . Se nota " que las cantidades equivalentes del receptor IgE estuvieron presentes en todas las líneas de células mostradas en las Figuras HA y 11B. De este modo, similar a la señalización en las células T, la PKC-T se encontró por translocarse rápidamente en la fracción insoluble en detergente de la membrana después de la reticulación del receptor IgE en células mástil. La Figura 11C confirma que este resultado no fue simplemente debido a una diferencia en la cantidad de PKC-T en las líneas diferentes, debido a que todas las líneas de BMMC tienen cantidades equivalentes de PKC-T en sus extractos celulares completos.

EJEMPLO 6 La Distribución de PCK-d y PKC-ß no es Significantemente Alterada Después de la Reticulación del Receptor IgE en BMMC Dos elementos adicionales de la familia PKC, PKC-d y PKC-ß, han sido implicados en mediar la función de las células mástil después" de la reticulación del receptor IgE (Nechushtan et al . , Blood 95:1752-1757 (2000); Kalesnikoff et al . , J .

Immunol . 168: 4737-4746 (2002) . Para determinar si otros miembros de la familia PKC fueron translocados a la membrana en BMMC después de la reticulación del receptor IgE, las fracciones del experimento descrito en el Ejemplo 5 cuyos resultados están presentados en las Figuras 11A-11C (es decir, fracciones de membrana, DI y WCE) , fueron sometidas a análisis de Western blotting con el manchado siendo probado por PKC-d y PKC-ß (en lugar de PKC-T) , usando anti-PKC-d (Figura 12A) . y anti-PKC- ßl / ßll (Figura 12B) (ambos de Santa Cruz Biotechnology Inc.) . Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, la translocación inducible de la membrana no fue detectada por PKC-ß (Figura 12A) y PKC-d (Figura 12B) , como ambas están presentes en el citosol, membrana y fracciones insolubles en detergente en cantidades equivalentes antes y después de la estimulación (es decir, reticulación del receptor IgE) . Estos re sultados demue stran una di f erenc i a import ant e en la regulac ión de PKC - T a part ir de tant o PKC- ß como PKC - d en la señalización del receptor IgE en células mástil .

EJEMPLO 7 Células Mástil a partir de Ratones Agónicos PKC-T, son Diferentes que las Células Mástil a partir de Ratones Tipo Nativos Estudios de ratones agénicos PKC-T, han mostrado que la PKC-T es necesaria para la activación de células T mediadas por TCR (Sun et al . , Nature 404:402-407 (2000)). Se hizo una determinación de si las BMMC de ratones agénicos PKC-T fueron diferentes de las BMMC de ratones tipo nativo. Para hacer esto, se obtuvieron ratones agénicos PKC-T y se confirmaron los defectos de la proliferación de células T, de conformidad con los métodos descritos en Sun et al . , Nature 404:402-407 (2000) (datos no mostrado). Los efectos de la deficiencia de PKC-T fueron examinados tanto en células mástil mucosales (MMC) como en células mástil del tejido conectivo (CTMC) . Estos distintos fenotipos de células mástil, difieren en composición y contenido mediador de los granulos y en su distribución anatómica (véase Beil et al . , Histol Histopathol . 15:937-946 (2000)). Las MMC se encontraron en mucosa intestinal y del pulmón, y contienen niveles elevados de la triptasa proteasa. Sus granulos son ricos en el sulfato de condoritina proteoglicano, permitiendo a las células ser teñidas con azul alcian. Por el contrario, las CTMC encontradas en el intestino, piel y cavidad peritoneal, expresan niveles elevados de tanto triptasa como quimasa y niveles relativamente superiores de liberación de histamina que las MMC. Sus granulos contienen el sulfato heparan proteoglicano, permitiéndoles ser teñidos con azul de toluidina pero no con azul alcian. Estas dos subseries de células mástil fenotípicamente distintas, son probablemente deferentes en su función y regulación in vivo (véase por ejemplo, Miller and Pemberton, Immunology 105:375-90 (2002)), pero la naturaleza exacta de estas diferencias está todavía bajo investigación. Para investigar completamente los efectos de PKC-T en células mástil, cada subserie de células mástil se examinó en ratones agénicos PKC-T. Las MMC fueron derivadas in vi tro a partir de los progenitores de médula ósea. Por el contrario, las CTMC podrían ser recuperadas en la forma madura a partir de la cavidad peritoneal del ratón. Primero, las CTMC y BMMC de ratones agénicos PKC-T y de tipo nativo, fueron fenotípicamente comparadas. Para hacer esto, las CTMC fueron aisladas por lavado peritoneal, revueltas sobre laminillas de microscopio usando una citocentrífuga y teñidas con azul de toluidina, después contra teñidas con safranina. Alternativamente, las células fueron teñidas con Wright-Geimsa. Cualquier protocolo de teñido identificará los granulos de células mástil. NO fueron aparentes diferencias entre los ratones agénicos PKC-T y de tipo nativo en el número de porcentaje de células mástil perifonéales, o en la densidad del granulo o la distribución por células (datos no mostrados) . Las BMMC de ratones agénicos PKC-T y tipo nativo, fueron aisladas como se describe en el Ejemplo 5 y revueltas en laminillas de microscopio usando una Citocentrífuga, después teñidas con azul alcian al 1% en ácido acético al 3% por 5 minutos para teñir los granulos. Las células fueron contra teñidas con safranina. Como se muestra en la Figura 13A, las BMMC de ratones tipo nativo, mostraron más granulación que las BMMC de ratones agénicos PKC-T. Después, para cuantificar las diferencias en la granulación en BMMC después de la reticulación del receptor IgE, se empleó el teñido con anexina de la superficie celular. El teñido con anexina de la superficie celular se incrementa con la desgranulación, de conformidad con la fusión de membrana del granulo y exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática. Para análisis de la expresión de anexina de la superficie celular, las BMMC derivadas de ratones agénicos PKC-T o de tipo nativo, fueron cargadas con anti-DNP de IgE siendo tratadas durante la noche con 0.2 µg/ml de anti-DNP de IgE. Al siguiente día, las células fueron colectadas y lavadas en amortiguador de PACM. La FITC-anexina fue agregada e incubada con las células por 3 minutos a 37°C. La adquisición de datos basados en el tiempo, se inició en un FASCan equipado con cámara de muestra a 37°C, interrumpida por adición de la concentración indicada de DNP-BSA, para inducir la desgranulación, y después resumida por 10 minutos por muestra. Así, las células fueron inducidas para desgranularse en la presencia de anexina FITC-etiquetada. La expresión de anexina en la superficie celular es indicativa de la fusión de la membrana del granulo con la membrana celular después de la desgranulación. La intensidad de fluorescencia media se trazó como una función de tiempo (Figura 13B) . Como se muestra en la Figura 13B, comparadas con el tipo nativo, las BMMC de ratones agénicos PKC-T, mostraron menos teñido de anexina de la superficie celular después de la desgranulación, lo cual es consistente con su contenido de granulo inferior por teñido de azul alcian (véase Figura 13A) .

EJEMPLO 8 Ratones Agénicos de PKC-T Tienen Niveles Reducidos de IgE Los niveles del receptor IgE en CTMC a partir de ratones agénicos PKC-T y de tipo nativo, fueron después comparados. Para hacer esto, cavidades perifonéales de ratones agénicos PKC-T y tipo nativo, fueron lavadas con amortiguador PIPES-EDTA. Las células de los lavados perifonéales no fraccionados de ratones individuales, fueron lavadas en PBS que contiene BSA al 1% (PBS-BSA) , e incubadas por 30 minutos en hielo con 5 µg/ml de anti-DNP de IgE o sin anticuerpo. Las células fueron lavadas en PBS-SA, después teñidas con IgE anti-ratón etiquetado con FITC y anti-ckit PT-etiquetado (BD-Pharmingen) . Se cuantificó la intensidad de fluorescencia media por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 14A, comparados con el tipo nativo, ratones agénicos PKC-T tienen niveles significantemente reducidos de IgE unido a la superficie de CTMC. Por el contrario, no hubo diferencia en el nivel de expresión de ckit (Figura 14B) . El nivel de IgE unido a la superficie de los receptores de IgE de CTMC, está relacionado con los niveles de circulación de IgE en el animal. La IgE unida a la célula mástil reducida en CTMC, sugiere que los ratones agénicos PKC-T, pueden tener niveles inferiores de IgE en el suero. Sin embargo, se observaron diferencias significantes entre los niveles de anticuerpo del suero de ratones agénicos PKC-T y ratones tipo nativo. Para estos estudios, las muestras de suero de ratones agénicos PKC-T y de tipo nativo, fueron sometidas a ensayo para determinar su contenido de IgE, IgG e IgA. Para hacer esto, placas ELISA Maxi-Sorp (comercialmente disponibles de Nunc, Rochester, NY) , fueron revestidas con IgE anti-ratón (comercialmente disponible de Pharmingen, San Diego, CA) , cadena ligera kappa anti-ratón (comercialmente disponible de Sigma, St . Louis, MO) para IgA, o IgG anti-ratón (específico de Fab; Sigma) para IgGl . Las placas fueron lavadas con PBS que contiene Tween-20 al 0.05% (PBS-Tween) , después bloqueadas con gelatina al 0.5% en PBS por 2 horas a temperatura ambiente. Las diluciones de suero se agregaron en PBS-Tween e incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Se detectó enlace usando anticuerpos biotinilados específicos dirigidos contra el IgE o IgA anti-ratón (comercialmente disponible de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) o IgGl (Pharmingen) , seguido por HRP-Estreptavidina (Southern Biotechnology Associates) y sustrato de peroxidasa Sure-Blue (comercialmente disponible de Kirkegaard and Perry Labs.). Los niveles de Ig fueron cuantificados usando estándares purificados para el isotipo apropiado (Pharmingen) . De este modo, las muestras de suero a partir de ratones individuales fueron sometidas a ensayo para determinar los niveles del isotipo de anticuerpo apropiado usando ELISA específico y cuantificado por comparación con los estándares purificados. Como se muestra en la Figura 15A, los niveles IgE fueron significantemente reducidos en ratones agénicos PKC-T. El IgGl el cual es a menudo coordinadamente regulado con IgE, también se redujo (Figura 15B) . Por el contrario, niveles IgA fueron superiores en ratones agénicos PKC-T, comparados con el tipo nativo (Figura 15C) . Sin embargo, las CTMC de ratones agónicos PKC-T, se encontraron tener menos granulación in vi tro con anti-IgE (datos no mostrados) , consistentes con los niveles disminuidos de IgE de circulación y IgE disminuido unido a la célula mástil (véase Figuras 14A y 15A) . Distinto de los defectos de activación de células T reportados en ratones agénicos PKC-T, se observaron defectos funcionales de células mástil in vi tro significantes, en BMMC a partir de ratones agénicos PKC-T (datos no mostrados) . Debido a que estas células son derivadas in vi tro de progenitores en la médula ósea, no fueron afectadas por niveles in vivo de IgE, y pueden ser cargadas con anti-DNP IgE exógeno in vi tro . Los estudios fueron después realizados para determinar si, después de la reticulación del receptor IgE con DNP-BSA, las BMMC de ratones agénicos PKC-T, son desgranulados, generan leucotrienos y producen citosina a niveles similares a aquellos producidos por BMMC a partir de ratones tipo nativo. Para estos estudios, los siguientes métodos, células mástil, fueron colocados en placas durante la noche en Hl FCS al 10% en DMEM + PS/gln y 50 µM de ßME + 50 ng/ml de murina recombinante IL-3 + 0.1 µg/ml de anti-DNP-Ig? (Sigma) . Las células fueron lavadas en PACM (25 mM de PIPES, pH 7.2 que contiene 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de CaCl2, 2 M de MgC12, y BSA al 0.05%) y se colocaron en placas a una concentración final de 2.5 x 10s células/ml sobre una titulación de DNP-BSA (comercialmente disponible de Calbiochem, San Diego, CA) , para reticular el receptor IgE o Ionomicina. Para estudios de producción de histamina, B-hexosiminidasa y leucotrieno, se cultivaron células por 30 minutos a 37°C en la presencia de DNP-BSA ó Ionomicina, y después, los sobrenadantes fueron colectados ya se aprobados inmediatamente o congelados. Los resultados de los experimentos de producción de leucotrieno y desgranulación, muestran que la BMMC de ratones agénicos PKC-T tienen niveles normales de producción de leucotrieno y desgranulación (datos no mostrados) . La desgranulación máxima se determinó sometiendo a lisis una alícuota de células con 0.1% de Tritón X-100. Para beta-hexosaminidasa, se incubaron sobrenadantes durante la noche a 37°C con p-nitrofenil N-acetil B-D glucosaminida (Sigma) en 0.08 M de citrato de sodio a pH 4.5. Después de 12-18 horas, las reacciones se detuvieron por adición de NaOH ÍN, y se cuantificó de beta-hexosaminidasa leyendo la absorción a 405 nm en un espectrofotómetro. No se observaron diferencias significantes sobre la desgranulación máxima (datos no mostrados) . Para ensayos de producción de citosina, las células cultivadas durante la noche en anti-DNP-IgE, fueron incubadas con DNP-BSA para activar la reticulación del receptor IgE por 6 horas antes de la colecta de sobrenadantes . Los sobrenadantes fueron sometidos a ensayo por leucotrieno, usando un ELISA específico para LT(C4/D4(E4) (comercialmente disponible de ALPCO (Windham, NH) , o para IL-6, IL-3 ó GMS-CSD, usando un ensayo ELISA específico (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Como se muestra en las Figuras 16A-16C, las BMMC de ratones agénicos PKC-T, fueron consistentemente producidas disminuyendo los niveles de las citosinas TNF-a (Figura 16A) , IL-13 (Figura 16B) e IL-6 (Figura 16C) que las BMMC de ratones tipo nativos. Después, los bazos de ratones C57BL/6 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se hicieron en una suspensión celular única y se aislaron células CD4+ por perlillas magnéticas anti-CD4, seguidas por Detach-A-bead (Separar-A-lecho) (Dynal Biotech) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron ya sea sometidas a ensayo como células T de reposo, o activadas para generar células efectoras . Las células efectoras fueron generadas colocando en placas 6 xlO5 células CD4+/ml en medio DMEM suplementado con FCS al 10%, 2 mM de L-glutamina, 5xlO"5M de 2-mercaptoetanol, penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales (todos de Gibco Life Technologies, una subsidiaria de Invitrogen, Carisbad, CA) , en placas de 24 cavidades que han sido revestidas con anticuerpos 1 µg/ml de anti-CD3 y 4 µg/ml de anti-CD28. Las células T sesgadas Thl, fueron cultivadas en la presencia de 39 ng/ml de rmIL-12 (Wyeth, Cambridge, MA) , 10 U/ml de rhIL-2 (Invitrogen, Carisbad, CA) , y 5 µg/ml de anticuerpos IL-4 anti-ratón. Las células T sesgadas TH-2, fueron cultivadas en la presencia de 40 ng/ml de rmIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) , 10 U/ml de rhIL-2 (Invitrogen) , y 5 µl/ml de anticuerpos IFN-? anti-ratón. Después de tres días de estimulación, las células fueron expandidas en la ausencia de IL-2 (5 U/ml) por 3-4 días adicionales. Las células T CD4+ de reposo o células efectoras Thl ó TH2 , fueron colocadas en placas a 1 x 105 células/cavidad en placas de fondo plano de 96 cavidades que han sido revestidas con 0.5 µg/ml de anti-CD3 (2C11) . Todos los anticuerpos fueron de B-D PharMingen, San José, CA. Después de 3 días el sobrenadante de cultivo celular fue colectado y sometido a ensayo por IL-4 e IL-5 por ensayo de lecho de citosina (FACS) . Como se muestra en las Figuras 17A y 17B, los datos de citosinas de células T, a partir de ratones agénicos PKC-?, mostraron que estos ratones producen niveles reducidos de ambas de estas citosinas . Estos resultados muestran que los ratones agénicos PKC-T nativos, son deficientes en los niveles de IgE e IgGl de circulación, son consistentes con una función para PKC-T en el mantenimiento de los niveles homeostáticos de IL-4 in vivo. El IL-3 es una citosina Th2 la cual tiene una función en la interrupción de gen de Ig (inmunoglobulina) , resultando en síntesis de IgE e IgGl (véase, Bacharier and Geha, J.

Allergy Clin . Immunol . 105(2 Pt 2):S547-58 - (2000); y Bergstedt-Lindqvist et al . , Eur. J. Immunol . 18:1073-1077 (1988)) . La expresión de células T de constructos dominantes de gen negativo, demuestra que la PKC-T activa la transcripción del gen IL-4, en sinergia con el factor de intercambio GDP/GTP Vav (véase Hehner et al . , J. Immunol . 164:3829-3836 (2000)).

EJEMPLO 9 Ratones Agénicos PKC-T, no Tienen Incremento en la Hinchazón de Oreja en Respuesta a Anti-IgE, o en el Modelo PCA en la Presencia de IgE exógeno Para determinar si la PKC-T está involucrada en la activación de células mástil mediada por IgE, se evaluaron ratones agénicos PKC-T en un modelo de ratón con enfermedad respiratoria, observando una anafilaxis de fase cutánea (PCA) . Así, para determinar si la PKC-T está involucrada en activación de células mástil mediadas por IgE, se estimularon intradermalmente , controles de ratones PKC-T -/- (es decir, agénico PKC-T) y tipo nativo C57BL/6, en la oreja izquierda con anti IgE (Pharmingen; 0.5 µg/kg en 20 µl de PBS) . Como un control, los animales recibieron 20 µl de PBS en la oreja derecha contralateral . Previo al estímulo anti-IgE, el grosor de la oreja de línea base, fue determinado usando un micrómetro diseñado por ing niería, Upright Dial Gauge (comercialmente disponible de Mitutoyo (Japón) ) , midiendo descendentemente a .0001". Después de la estimulación, las mediciones del grosor de la oreja fueron colectadas a 1 hora, 2 horas, 4 horas y 6 horas y expresadas como incremento arriba de las lecturas de línea base. Como se muestra en la Figura 18, ratones agénicos PKC-T, no tienen incremento en la hinchazón de la oreja en respuesta a anti-IgE . Sin embargo, siguiendo la estimulación anti-IgE, la hinchazón de la oreja fue aproximadamente 2.5 veces mayor en los animales de tipo nativo a 1 hora de punto de tempo, comparada con los animales agénicos PKC-T (Figura 18) . La respuesta a la hinchazón en la oreja disminuida en estos ratones, es consistente con la superficie celular y los niveles de IgE de circulación. Como se describe anteriormente, la deficiencia de PKC-T resulta en algunos granulos de células mástil (Figuras 13A y 13B) y niveles inferiores de IgE. (Figura 14A) . Estos efectos son probablemente en parte debido a los efectos dependientes de las células T atenuadas en la modificación de las funciones de la célula mástil (Boyce, J. Allergy Clin . Immunol . 111: 24-32 (2003) ) . Para tratar si la PKC-T está involucrada en la señalización de las células mástil mediadas por IgE, ratones deficientes en células mástil Ki tw/ Ki tw'v (comercialmente disponibles de Jackson Laboratory) , fueron selectivamente reparados de su deficiencia de células mástil con ya sea células mástil derivadas de ratones tipo nativo o tipo agénico PKCr-?. En otras palabras, las células mástil de ratones agénicos PKC-T o normales, ratones tipo nativos, fueron transferidos en el ratón Ki tw/ Ki tw'v (esta técnica de transferencia adoptiva es revisada en Galli and Lantz, Allergy. In Fundamental Immunology, W.E. Paul (ed.), pp. 1137-1184, Lippincott-Raven Press, Philadelphia PA 1999; y Willia and Galli, J. Allergy Clin . Immunol . 105(5): 847-859 (2000)). Brevemente, 1 x 10)). Brevemente, 1 x 10s BMMC de ratones tipo nativo o agénico PKC-T, fueron resuspendidas en 20 µl de DMEM e inyectadas en tanto las orejas izquierda como derecha (1 x 106 BMCMC/oreja) de ratones Kitw/ Ki tw'v deficientes en células mástil de 7 semanas de edad (10 animales/grupo) . Después de doce semanas (un periodo de tiempo apropiado para permitir a las células mástil adoptivamente transferidas, madurar dentro del tejido conectivo) , los ratones fueron sensibilizados por inyección intradermal en la oreja izquierda con anti-DNP IgE (5 µg/kg) . Como un control, los animales recibieron 0.9% de salina en la oreja derecha. Veinticuatro horas después, los animales fueron estimulados intravenosamente con DNP HSA (10 mg/kg) .

Las mediciones de la oreja de línea base, fueron colectadas antes de la estimulación y a 1 hora, 2 horas, 4 horas y 6 horas posteriores a la estimulación. Los resultados mostraron que ratones Kitw/ Ki tw'v , los cuales fueron reconstituidos con células mástil, que carecen de PKC-T, no mostraron diferencias en términos de hinchazón de oreja, comparado con ratones Ki tw/ Ki tw'v tratados idénticamente, que fueron reconstituidos con células -.-- mástil de tipo nativo (datos no mostrados) . Estos resultados sugieren que la deficiencia de hinchazón en la oreja e ratones PKC-T, es más probable debido a la función efectora dependiente de las células T directamente, y/o indirectamente en otros tipos de células inmunes. Algunas citosinas de células T que son inhibidas e impactan en la función de las células inmunes, incluyen IL-4, IL-5, TNF-a (Fígs. 17A, 17B, y datos no mostrados) . Sin embargo, los datos de células mástil sugieren que la inhibición de PKC-T puede modular directamente las respuestas de las células mástil . Como se discute anteriormente, se encontró que la PKC-T llega a ser rápidamente fosforilada en el bucle de activación sobre la reticulación del receptor IgE (véase Figuras 10A-10B) . La distribución sub-celular de PKC-T, y no PKC-d o PKC-ßl/ßlI, se altera después de la reticulación del receptor IgE (véase Figuras HA, 12B) . De manera más importante, existe una producción atenuada de citosinas por BMMC agénicas PKC-T, en respuesta a IgE (Figuras -16A-16C) . Estas células son derivadas in vi tro a partir de progenitores en la médula ósea y no son afectadas por los niveles in vi tro de IgE . En otro experimento, controles de ratones agénicos PKC-T (es decir, PKC-T -/-) y C57B/6 de tipo nativo, fueron pasivamente sensibilizados por inyección en la oreja izquierda con anti-DNP monoclonal (Sigma; 5 µg/kg en 20 µl de salina al 0.9%) 24 horas previo a la estimulación. Como un control, los animales recibieron 20 µl de salina al 0.9% en orejas derechas contralaterales . Veinticuatro horas después, se colectaron las mediciones de la oreja en línea base y después los animales fueron sometidos a estimulación i.v. con DNP-HSA (10 mg/kg en 100 µl de salina al 0.9%). Durante el siguiente periodo de 6 horas (es decir, lecturas a 1 hora, 2 horas, 4 horas, y 6 horas posteriores a la estimulación) , se colectaron las mediciones del grosor de la oreja como se describe anteriormente . Como se muestra en la Figura 19, ratones agénicos PKC-T, tienen hinchazón de oreja significantemente menor, comparada con las contrapartes de tipo nativo tratadas idénticamente. Los resultados de estos estudios de PCA (Figuras 18 y 19) , soportan el uso de una molécula pequeña de PKC-T antagonista en alergia y asma en un modelo de enfermedad animal.

EJEMPLO 10 Células T THl y TH2 de Ratones Agénicos PKC-T Muestran Proliferación Reducida en Respuesta a Estímulos Comparadas con Ratones de Tipo Nativo PKC-T . Para determinar si células T diferenciadas de ratones agénicos PKC-T fueron normales en su capacidad para responder al estímulo, células del bazo de ratones agénicos PKC-T y de tipo nativo, fueron diferenciadas in vi tro a poblaciones de THl ó TH2 para valorar los defectos de proliferación de las subseries auxiliadoras T, en la ausencia de expresión de PKC-T. Para estos experimentos, las células T no experimentadas fueron aisladas, y se generaron células efectoras THl y TH2. Para hacer esto, los bazos de ratones C57/B6 (comercialmente disponible de Taconic, Germantown, NY) , fueron elaborados en una suspensión celular única. Células rojas de la sangre (RBC) fueron sometidas a lisis con amortiguador de lisis RBC (0.3 g/L de cloruro de amonio en 0. OM de amortiguador Tris-HCl pH 7.5) y lavadas dos veces. Las células CD4+ fueron aisladas por partículas magnéticas anti-CD4, seguida por Detach-A-Bead (Separación-A-Lecho) (Dynal) por las instrucciones del fabricante (Dynal Biotech, Oslo, Norway) . Las células fueron ya sea sometidas a ensayo como células- T no experimentadas, o activadas para generar células efectoras.

Las células efectoras fueron generadas activando células T no experimentadas, colocando en placas 6xl05 aislados CD4+/ml en medio DMEM suplementado con FCS al 10%, 2-mM de L-glutamina, 5xl05 M de 2 -mercaptoetanol , penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales (todos de Gibco life Technologies) en placas de 24 cavidades que han sido revestidas con 1 µg/ml de anti-CD3 y 4 µg/ml de anti-CD28. Las células T sesgadas THl, (es decir, una población de células T, la mayoría de las cuales son células THl) , fueron generadas cultivando las células en' la presencia de 30 ng/ml de murina recombinante IL-12 (Wyeth, Cambridge, MA) , 10 U/ml de IL-2 humana recombinante (Invitrogen, Carisbad, CA) , y 5 µg/ml de IL4 anti-ratón por 3 días. Las células T sesgadas TH-2, fueron generadas cultivando las células en la presencia de 40 ng/ml de IL-4 murína recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) , 10 U/ml de IL-2 humana recombinante (Invitrogen), y 5 µl/ml IFN-gamma anti-ratón por 3 días.

Todos los anticuerpos fueron de B-D-PharMingen, San José, CA. Para ensayos de proliferación, las células efectoras THl ó TH2 , fueron colocadas en placas a 1 x 105 células/0.2 ml/cavidad, en placas de fondo plano de 96 cavidades, que han sido revestidas con varias concentraciones de anti-CD3 (2C11) y en la presencia o ausencia de 5 µg/mol soluble de anti-CD28 (clon 37.51) y/o 10 U/ml de IL-2 humano recombinante como se indica. Al día 2, los cultivos fueron pulsados con 0.5 µ Ci de [3H] timidina (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) y colectadas 6-8 horas después en filtros, usando un colector de placa de 96 cavidades. La radioactividad incorporada se midió usando un contador de escintilación líquida (Wallac, Gaithersburg, MD) . Todos los anticuerpos fueron de B-D PharMingen, San . José, CA. Como se muestra en las Figuras 20 y 21, las células THl y TH2 de ratones agénicos PKC-T, fueron significan eme te reducidas en las respuestas "de proliferación a la estimulación de TCR en intensidades de señal anti-CD3 tanto óptimas (0.5 µg/ml) como sub-óptimas (0.05 µg/ml) (Figura 20C y Figura 21C, respectivamente), así como también, sobre la co-estimulación de TCR/CD28 (Figura 20A y Figura 21A, respectivamente) . La adición de IL-2 exógeno para soportar la proliferación de células T por una trayectoria independiente de PKC-T, supera 0 parcialmente las respuestas de proliferación inducidas de células THO, THl y TH2 no experimentadas, a partir de ratones agénicos PKC-T, pero solamente en conjunto con coestimulaciones TCR/CD28 en la señal anti-CD3 óptima 0.5 µg/ml (Figura 20B con anti-CD28 y Figura 20D sin anti- 25 CD28) . A 0.05 µg/ml de anti-CD23, la co-estimulación con CD28 falla para superar casi la carencia completa de proliferación de células a partir de ratones agénicos PKC-T (Figura 21A) . En estas condiciones, existe un efecto muy modesto de IL-2 exógeno (Figuras 2IB y 2ID) , con proliferación de células TH2 a partir de ratones agénicos PKC-T, que permanece aproximadamente 30% de proliferación de células TH2 de ratones de tipo nativo . Estos resultados, junto con la inhibición de la producción de IL-2 por células T agénicas PKC-T (véase por ejemplo, Sun et al . , Nature 404:402-407 (2000)), sugieren que la proliferación inducida por la estimulación de TCR, no puede ser sostenida por células THO, THl y TH2 , si la actividad PKC-T es inhibida en estas células. En conjunto con la producción reducida de citosina TH2 , estas células auxiliadoras T por lo tanto, no funcionarán como células efectoras óptimas mediando las trayectorias dependientes de las células T en la fisiología del asma y enfermedades alérgicas. De estos hallazgos, un aspecto adicional de la invención es dirigir PKC-T en células T TH2. De este modo, la invención además, proporciona una intervención terapéutica para prevenir y/o aliviar los síntomas del asma dirigiendo PKC-T en células TH2 T. Mientras la invención ha sido ilustrada y descrita en detalle en las figuras y la descripción mencionada anteriormente, la misma es considerada como ilustrativa y no restrictiva en carácter, siendo entendido que solamente las modalidades preferidas han sido mostradas y descritas y que todos los cambios y modificaciones que llegan dentro del alcance de la invención son deseados para ser protegida.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Método para identificar un modulador de una proteína PKC-T, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma con un agente de prueba, y (b) determinar si el agente de prueba modula la actividad de cinasa de la proteína PKC-T o el fragmento funcional de la misma, en donde un cambio en la actividad de cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, en la presencia del agente de prueba, es indicativo de un modulador de una proteína PKC-T. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una proteína PKC-T que reduce la actividad de cinasa, es un inhibidor de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una proteína PKC-T que incrementa la actividad de cinasa, es un activador de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína PKC-T es una proteína PKC-T de longitud completa. 5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína PKC-T es una variante funcional de una proteína PKC-T de longitud completa. 6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento funcional es un dominio de cinasa PKC-T. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de determinación comprende comparar la actividad de cinasa del agente de prueba, con relación a la ausencia del agente de prueba. 8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de contacto se efectúa proporcionando una mezcla de reacción de la proteína de PKC-?, o el fragmento funcional de la misma, y un agente de prueba . 9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la mezcla de reacción está en un amortiguador que comprende una concentración de NaCl que se selecciona del grupo que consiste de 50 mM-100 mM, 100-150 mM, 150- 200 mM, y 200-250 mM, y 250-300 mM. 10. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración de NaCl es 250 M. 11. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína PKC-T, o un fragmento de la misma, se obtienen de una célula procariótica. 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula procariótica es E. coli . 13. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de contacto se efectúa en una célula. 14 ~ Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar asma en un mamífero. 15. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el mamífero es un humano. 16. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el asma es asma mediado por IgE. 17. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad de cinasa es la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma. 18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID N0:1, seleccionado del grupo que consiste del residuo de serina a la posición 695, el residuo de serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538, y el residuo de treonina en la posición 536. 19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la autofosforilación ocurre en el residuo de serina en la posición 538 de la SEC ID N0:1. 20. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (a) además comprende poner en contacto la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba y un sustrato de PKC-T. 21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la actividad de cinasa es la fosforilación del sustrato PKC-T. 22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sustrato de PKC-T comprende una porción R-X-X-S o una porción R-X-X-T, en donde R es arginina, X es ya cualquier aminoácido conocido o desconocido, y S es serina y T es treonina. 23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el sustrato PKC-T tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 5), FARKGSLRQKN (SEC ID NO : 6), FARKGSLRQ (SEC ID NO: 15), KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 16), QKRPSQRSKYL (SEC ID NO 17), KIQASFRGHMA (SEC ID NO: 18), LSRTLSVAAKK (SEC ID NO 19), AKIQASFRGHM (SEC ID NO: 20), VAKRESRGLKS (SEC ID NO 21), KAFRDTFRLLL (SEC ID NO : 22), PKRPGSVHRTP (SEC ID NO 23), ATFKKTFKHLL (SEC ID NO: 24), SPLRHSFQKQQ (S?C ID NO 25), KFRTPSFLKKS (SEC ID NO: 26), IYRASYYRKGG (SEC ID NO 27), KTRRLSAFQQG (SEC ID NO: 28), RGRSRSAPPNL (SEC ID NO 29), MYRRSYVFQT (SEC ID NO : 30), QAWSKTTPRRI (SEC ID NO : 31) RGFLRSASLGR (SEC ID NO: 32) ETKKQSFKQTG (SEC ID NO: 33) DIKRLTPRFTL (SEC ID NO: 34) APKRGSILSKP (SEC ID NO: 35) MYHNSSQKRH (SEC ID NO: 36), MRRSKSPADSA (SEC ID NO: 37) TRSKGTLRYMS (SEC ID NO : 38) LMRRNSVTPLA (SEC ID NO: :39) ITRKRSGEAAV (SEC ID NO: 40) EEPVLTLVDEA (SEC ID NO: 41) SQKRPSQRHGS (SEC ID NO: 42) KPFKLSGLSFK (SEC ID NO: 43) AFRRTSLAGGG (SEC ID NO: 44) ALGKRTAKYRW (SEC ID NO: 45) WRTDSLKGRR (SEC ID NO: 46) KRRQISIRGIV (SEC ID NO: 47) WPWQVSLRTRF (SEC ID NO: 48) GTFRSSIRRLS (SEC ID NO: 49) RWGGSLRGAQ (SEC ID NO : 50) LRQLRSPRRTQ (SEC ID NO: 51) KTRKISQSAQT (SEC ID NO: 52) NKRRATLPHPG (SEC ID NO: 53) SYTRFSLARQV (SEC ID NO: 54) NSRRPSRATWL (SEC ID NO: 55) RLRRLTAREAA (SEC ID NO: 56). NKRRGSVPILR (SEC ID NO: 57) 'GKRRPSRLVAL (SEC ID NO : 58), QKKRVSMILQS (SEC ID NO: 59), y RLRRLTAREAA (SEC ID NO : 60) . 24. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el modulador de una proteína PKC-T, reduce la actividad de cinasa de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, por al menos dos veces. 25. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, está en una célula. 26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula mástil y una célula T CD4+. 27. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende valorar la eficacia del agente de prueba identificado en la etapa (b) en un modelo de asma in vi tro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficiencia incrementada en el modelo de asma in vitro o in vivo, comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar el asma. 28. Método para identificar un modulador de una proteína PKC-T, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una célula que expresa una proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, con un agente de prueba; y (b) determinar si el agente de prueba reduce la autofosforilación de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma en una célula, en donde un cambio en la autofosforilación de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma, en la presencia del agente de prueba, es indicativo de un modulador de una proteína PKC-T. 29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el modulador de una proteína PKC-T que reduce la actividad de cinasa, es un inhibidor de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. 30. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el modulador de una proteína PKC-T que reduce la actividad de cinasa, es un activador de la proteína PKC-T, o el fragmento funcional de la misma. 31. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la proteína PKC-T es una proteína PKC-T de longitud completa. 32. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la proteína PKC-T es una variante funcional de una proteína PKC-T de longitud completa. 33. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el fragmento funcional es un dominio de cinasa PKC-T. 34. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la etapa de determinación comprende comparar la actividad de cinasa del agente de prueba, con relación a la ausencia del agente de prueba. 35. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el modulador de una proteína PKC-T es útil para tratar asma. 36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque además comprende valorar la eficacia del agente de prueba identificado en la etapa (b) en un modelo de asma in vitro o in vivo, en donde un agente de prueba que muestra una eficiencia incrementada en el modelo de asma in vitro o in vivo, comparado con un agente de control, es identificado por ser útil para tratar el asma. 37. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la célula es una célula procariótica. 38. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula procariótica es E. coli . 39. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la autofosforilación de la proteína PKC-?, o un fragmento funcional de la misma, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID N0:1, seleccionado del grupo que consiste del residuo de serina a la posición 695, el residuo de serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538, y el residuo de treonina en la posición 536. 40. Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la autofosforilación ocurre en el residuo de treonina en la posición 538 de la SEC ID NO:l. 41. El uso de un agente que reduce la actividad cinasa de una proteina PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, o reduce la producción de una proteína PKC-T funcionalpara preparar un medicamento para tratar asma. 42. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es administrado en un portador farmacéuticamente adecuado. 43. Uso de conformidad con la reivindicación 42, en donde el portador está en la forma de un aerosol. 44. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es administrado por una ruta seleccionada del grupo que consiste de intravenosamente, oralmente, transdérmicamente e intramusculármente . 45. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es administrado por inhalación. 46. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el asma es asma mediado por IgE. 47. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es co-administrado con un fármaco seleccionado del grupo que consiste de agentes ß-adrenérgicos, compuestos de teofilina, corticoesteroides, anticolinérgicos, antihistaminas, bloqueadores del canal de calcio y cromolin sódico. 48. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína PKC-T o un fragmento funcional de la misma. 49. Uso de conformidad con la reivindicación 48, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. 50. Uso de conformidad con la reivindicación 48, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 51. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el agente es una molécula de ácido nucleico. 52. Uso de conformidad con la reivindicación 51, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido ribonucleico . 53. Uso de conformidad con la reivindicación 52, en donde la molécula de ácido ribonucleico comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una porción de la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 3. 54. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde la actividad de cinasa es la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma. 55. Uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la autofosforilación de la proteína PKC-T, o un fragmento funcional de la misma, ocurre en un residuo de aminoácido de la SEC ID N0:1, seleccionado del grupo que consiste del residuo de serina a la posición 695, el residuo de serina en la posición 685, el residuo de treonina en la posición 538, y el residuo de treonina en la posición 536. 56. Uso de conformidad con la reivindicación 55, en donde la autofosforilación de la proteína PKC-T o el fragmento funcional de la misma ocurre en el residuo de serina en la posición 538 de la SEC ID N0:1. 57. Uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde la actividad de cinasa es la fosforilación del sustrato PKC-T. 58. Uso de conformidad con la reivindicación 57, en donde el sustrato de PKC-T comprende una porción R-X-X-S o una porción R-X-X-T, en donde R es arginina, X es ya sea cualquier aminoácido conocido o desconocido, y S es serina y T es treonina. 59. Uso de conformidad con la reivindicación 58, en donde el sustrato PKC-T tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 5), FARKGSLRQKN (SEC ID NO: 6), FARKGSLRQ (SEC ID NO: 15), KKRFSFKKSFK (SEC ID NO: 16), QKRPSQRSKYL (SEC ID NO: 17), KIQASFRGHMA (SEC ID NO: 18), LSRTLSVAAKK (SEC ID NO: 19), AKIQASFRGHM (SEC ID NO: 20) VAKRESRGLKS (SEC ID NO: 21), KAFRDTFRLLL (SEC ID NO: 22) PKRPGSVHRTP (SEC ID NO: 23), ATFKKTFKHLL (SEC ID NO: 24) SPLRHSFQKQQ (SEC ID NO: 25), KFRTPSFLKKS (SEC ID NO: 26) IYRASYYRKGG (SEC ID NO: 27), KTRRLSAFQQG (SEC ID NO: 28) RGRSRSAPPNL (SEC ID NO: 29), MYRRSYVFQT (SEC ID NO: 30), QAWSKTTPRRI (SEC ID NO: 31), RGFLRSASLGR (SEC ID NO: 32), ETKKQSFKQTG (SEC ID NO: 33), DIKRLTPRFTL (SEC ID NO: 34) APKRGSILSKP (SEC ID NO: 35), MYHNSSQKRH (SEC ID NO: 36) MRRSKSPADSA (SEC ID NO: 37), TRSKGTLRYMS (SEC ID NO: 38), LMRRNSVTPLA (SEC ID NO: 39), ITRKRSGEAAV (SEC ID NO: 40), EEPVLTLVDEA (SEC ID NO: 41), SQKRPSQRHGS (SEC ID NO: 42), KPFKLSGLSFK (SEC ID NO: 43), AFRRTSLAGGG (SEC ID NO: 44), ALGKRTAKYRW (SEC ID NO: 45), WRTDSLKGRR (SEC ID NO: 46), KRRQISIRGIV (SEC ID NO: 47), WPWQVSLRTRF (SEC ID NO: 48), GTFRSSIRRLS (SEC ID NO: 49), RWGGSLRGAQ (SEC ID NO: 50), LRQLRSPRRTQ (SEC ID NO: 51), KTRKISQSAQT (SEC ID NO: 52), NKRRATLPHPG (SEC ID NO : 53), SYTRFSLARQV (SEC ID NO: 54), NSRRPSRATWL (SEC ID NO: 55), RLRRLTAREAA (SEC ID NO: 56), NKRRGSVPILR (SEC ID NO: 57), GKRRPSRLVAL (SEC ID NO: 58), QKKRVSMILQS (SEC ID NO: 59), y RLRRLTAREAA (SEC ID NO : 60) . 60. Célula mástil aislada, caracterizada porque carece de la expresión de la proteína PKC-T endógena. 61. Célula mástil de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la célula expresa una proteína PKC-T exógena o un fragmento de la misma.